Sindromul X Fragil

SINDROMUL X FRAGIL

Cuprins

INTRODUCERE

CAPITOLUL 1: REVIUL LITERATURII

Domeniul de studiu al epigeneticii

Analiza profilului SXF în diverse țări.

Gena FMR1. Mecanismul epigenetic de formare a mutației.

Premutația genei FMR1

1.4.1. Insuficiența ovariană asociată cu X fragil

1.4.2. Sindromul de ataxie/tremor intențional

Produsul proteic al genei FMR1

Metodele utilizate pentru depistarea SXF

CAPITOLUL 2: MATERIALE ȘI METODE

2.1.Materiale de cercetare

2.2. Metode de cercetare

2.2.1. Metode molecular-genetice

2.2.1.1. Metoda de extragere a ADN din sânge

2.2.1.2. Metode genetice. Metoda PCR (Reacția de polimerizare în lanț).

2.2.1.3. Metilarea ADN

2.2.1.4. Vizualizarea probelor în gel

CAPITOLUL 3: REZULTATE ȘI CONCLUZII

3.1. Analiza rezultatelor în urma aplicării metodei PCR pentru depistarea mutației.

3.2. Analiza datelor rezultate în urma metilării a ADN.

3.3. Profilul clinic al FXS. Profilaxie.

3.4. Concluzii.

Introducere

Factorii epigenetici reglează o mare parte din funcțiile celulelor corpului, determinând care gene vor fi active și care nu, respectiv creșterea și dezvoltarea organismului. Impactul acestora asupra structurilor celulare poate contribui la dezvoltarea unor disfuncții fenotipice.

În genomul uman sunt identificați circa 10 000 loci de microsateliți, compuși din unități repetitive dispuse în tandem, acestea din urmă fiind alcătuite din 1-5 perechi de nucleotide. Extinderea unor loci alcătuiți din secvențe trinucleotidice, prin creșterea numărului de unități peste un anumit prag, este asociată cu manifestarea unor boli grave. Microsateliții în acești loci sunt instabili, adică numărul de unități trinucleotidice poate să crească de la o generație la alta, acest fenomen fiind numit mutație dinamică. [2,5]. În dependență de localizarea microsateliților, expansiunea secvențelor trinucleotidice poate să se facă în regiunea netranscribilă – gena FMR1. Bolile genetice cauzate de mutații dinamice au o specificitate de transmitere generaților următoare – anticipația, adică penetranța bolii sporește în generațiile următoare în cadrul unei familii, ca o consecință a unor noi amplificări a unităților nucleotideice. O dată cu creșterea în severitate a manifestărilor clinice, scade vârsta de debut a bolii. În cadrul FXS, mutațiile dinamice sunt reflectate la nivel de mărire a numărului de repetiții trinucleotidice CGG și pierdere a funcției genei.

După cum a fost menționat anterior, secvențele formate din repetări simple în tandem sunt susceptibile de a suferi modificări ale numărului de copii din care sunt alcătuite, respectiv a lungimii lor . De obicei, variațiile numerice ale microsateliților sunt lipsite de efecte fentipice. Excepțiile le constituie expansiunile repetărilor trinucleotidice CCG și AGC, unicele repetiții de acest gen (din cele 10 posibile) la care a fost demonstrată încadrarea în tipul mutațiilor dinamice ce rezultă în instalarea bolilor genetice. Repetițiile AGC, ce sunt implicate în câteva boli neuronale și repetițiile CGG care sunt responsabile de un grup de situri fragile pe cromozomi și poate să se extindă la un număr de copii foarte mare, până la 1000.(5) De precizat că în funție de variațiile în gena FMR1, numărul normal de repetiții CGG, care sunt la o persoană sănătoasă, este de la 6 la 54 de triplete, nu se atestă metilarea. Premutația este caracterizată de expansiunea tripletelor între 55 și 200, deasemenea gena nu este metilată, însă cu există riscul de recurență. Persoana purtătoare de premutație este clinic sănătoasă, totuși expansiunea trinucleotidelor generează tardiv unele afectiuni, la femei – insuficiența ovariană asociată cu X fragil și la bărbați – sindromul de ataxie/tremor intențional. Expansiunea tripletelor mai mult de 200 provoacă metilarea regiunii. Acest fenomen este atribuit modificărilor epigenetice ce constau în studiul schimbărilor intervenite în expresiea genelor fără a influența consecutivitatea materialului ereditar.

Astfel, mutațiile dinamice ale tripletelor CCG conduc la formarea unor situsuri fragile asociate cu întârziere mentală și apariția unor afecțiuni neurodegenerative. Asocierea între situsul fragil de pe cromozomul X – FRAXA (FRA – situs fragil, cromozomul X pe care se observă, ordinea descrierii A – F[1] și retardul mental a fost semnalată în 1969, semnificația observației a devenit evidentă abia către sfârșitul anilor ’70 când, ca urmare a dezvoltării tehnicilor de identificare a cromozomului X fragil, o serie de investigații au consemnat incidența înaltă a FRAXA la indivizii cu deficit intelectual. [5]

Actualitatea acestei teme este condiționată de necesitatea implementării metodei molecular-genetice în practica medicală de rutină pentru depistarea mutației.

Sindromul X fragil reprezintă o cauză fracventă, a doua după sindromul Down și principala formă genetică de autism. Incidența acestuia se estimează a fi de 1/4000 bărbați și 1/7000 femei, aceste date sunt relative, persoanele afectate fiind probabil mai numeroase. Frecvența premutațiilor în populația generală este de 1/130-250 femei și 1/250-800 bărbați. Sindromul este identificat la cca 2% dintre baieții cu retard mental și mai mult de 1/3 dintre familiile în care este identificat un caz de retard mental legat de cromozomul X. Aceste date impun necesitatea de a implementa măsuri de prevenire a sindromului precum screening al femeilor în perioada de fertilitate și prenatal pentru elucidarea prezenței sau absenței premutației, numărului de repetiții, respectiv a posibilității de convertire a acesteia în mutație în următoarea generație. Spre exemplu, în Israel, sunt efectuate screenig-uri prenatale la toate femeile însărcinate, fapt datorat frecvenței ridicate a premutaților în cadrul populației cauzate de efectul fondatorului. Formularea corectă a diagnosticului implică planificarea corectă a familiei. Cauza moleculară ce provoacă sindromul este mutația dinamică a trinucleotidelor CCG în regiunea (UTR) 5’ netranslată a genei , numărul de repetiții generând formarea unui situs fragil sensibil la folat. Hipermetilarea repetițiilor CGG și a insulei CpG în amonte duce în instalarea sileonțiozității transcripționale a genei. În consecință, produsul său proteic, proteina FMR ce are rol în reglarea conexiunilor sinaptice, nu se sintetizează.

FXS fiind o anomalie monogenică dominantă legată de cromozomul X prezintă anumite particularități de transmitere – afectează ambele sexe, însă cu o penetranță și o incidență mai mare sexul masculin. Ca rezultat, majoritatea băieților afectați, prezintă un retard mental moderat și sever, pe când doar 55% din fete pot manifesta un retard mental lejer sau moderat. Diagnosticul se formulează în baza studiului clinic si efectuării cercetării molecular genetice pentru o depistare precisă a prezenței sindromului și acordarea unui tratament specific bolii.

Conform criteriilor de efectuare a sceening-ului prenatal, în special din cauza morbidității și prevalenței, sindromul X fragil prezintă o problemă de sănătate de ordin public. Testarea moleculară permite identificarea timpurie a mutației înnascute. Cercetările preliminare sugerează posibilitatea economică de a efectua sceening-ul purtătorilor de premutație. În unele țări precum Finlanda și Israel este acceptabil testul purtătorilor de premutație.

Totuși, depistarea prezenței sindromului nu este o soluție pentru bolnavii ce manifestă mutația completă.

Un alt neajuns este lipsa aprobării unanime, în majoritatea statelor, pentru perioada optimă de efectuat screening. Screening-ul nou-născuților va permite identificarea copiilor afectați care sunt eligibili pentru pentru aplicarea serviciilor timpurii de intervenire. Identificarea unei persoane afectate deasemenea va permite detectarea familiilor de risc. Deși aceste familii pot beneficia de consult genetic, screeningul nou-născuților nu este eficient pentru detectarea a unei mari părți din familiile de risc pentru sindromul X fragil în populația generală. Multe alte probleme precum informarea cadrelor sanitare și populației despre sindrom, evaluarea impactului psihologic pentru statutul în carieră și menținerea confidențialității familiale trebuie cercetat detaliat și rezolvat adecvat înainte de implementarea oricărui tip de screening pentru sindromul X fragil în populația generală.(tab.1)

Scopul lucrării:

Identificarea pe cale molecular genetică a numarului de repetiții CGG a genei FMR1 drept cauză principală a sindromului X-fragil (retardului mental) în populația Republicii Moldova

Obiectivele:

Studierea noțiunii de epigenetică și profilul ei în formarea sindromuli X fragil în baza literaturii de specialitate;

Elucidarea aspectelor clinice și molecular genetice ale sindromului X fragil, în baza literaturii de specialitate;

Determinarea numarului de repetiții CGG în gena FMR1 la grupul de cercetare constituit din pacienți ce suferă de retard mental.

CAPITOLUL 1: REVIUL LITERATURII

1.1 Domeniul de studiu al epigeneticii

Caracterul genelor unei persoane nu depinde doar de consecutivitatea de nucleotide în molecula de ADN, deasemenea sunt implicați factorii numiți epigenetici. Schimbările intervenite în cadrul acestor factori pot provoca diferite afecțiuni.

Efectele mediului extern pot influența produsul proteic al genelor, fiind cauza anumitor maladii și câteva dintre acestea pot fi moștenite în descendență. Studiile ce au avut drept scop investigarea impactului factorilor externi asupra genomului descendenței individului nu sunt simplu de structurat. Oricum, în diferite regiuni ale lumii în care sistemele sociale sunt înalt centralizate, informația din exterior ce a influențat familii poate fi obținută. Spre exemplu, cercetătorii suedezi au investigat modul în care nutriția afectează rata morții asociată cu bolile cardiovasculare și cu diabetul zaharat și modul în care aceste maladii au fost transmise în descendență. Aceste cercercetări au estimat cât de mult indivizii au avut acces la mâcare, examinând recordurile de recoltă anuală și prețurile la alimente în Suedia de-a lungul a trei generații. Aceste cercetării au ilustrat că dacă tatăl nu se alimenta suficient în perioada critică a dezvoltării sale înainte de pubertate, probabilitatea ca fii săi să decedeze din cauza bolilor cardiovasculare era mai mică. De remarcat că un procentaj mai sporit de persoane suferinde de diabet zaharat a fost stabilit la cei a căror bunei pe linia paternă a avut o alimentație suficientă, pe când un risc redus de a dezvolta diabet a fost identificat la peroanele a căror tată a avut un regim îndestulat în peioada de dezvoltare înainte în copilărie. Aceste constatări sugerează că dieta poate cauza schimbări în gene care sunt trecute mai departe în descendență la bărbații din familie și aceste alterări pot fi susceptibile pentu oricare boală. Dar cum sunt aceste schimbări și cum sunt ele memorate poate fi rezultatul efectului epigeneticii.

Epigenetica implică controlul genelor de către alți factori decât secvența nucleotidică individuală de ADN. Factorii epigenetici pot interveni în structura genelor și să detemine care proteină va fi transcrisă. (2) Epigenetica se referă la studiul schimbărilor moștenite în expresia genelor care are loc fără a provoca schimbări în consecutivitatea materialului ereditar. Mecanismele epigenetice includ toate tipurile de control tanscripțional care determină modul în care vor fi exprimate pe parcursul dezvoltării și diferențierii, dar și în celulelece răspund stimulilor externi.

Termenul „epigenetics” a fost inventat de către Conrad Waddington în anul 1942, atunci nu era cunoscută natura exactă a genelor și rolul acestora în ereditate și în regularea transcripțională, el a folosit termenul drept un model concepțional despre cum ar putea genele interacționa pentru a produce fenotipul. Termenul este dezvoltat de la cuvântul epigeneză (diferențierea celulelor de la starea lor inițilă, totipotentă în dezvoltari factori decât secvența nucleotidică individuală de ADN. Factorii epigenetici pot interveni în structura genelor și să detemine care proteină va fi transcrisă. (2) Epigenetica se referă la studiul schimbărilor moștenite în expresia genelor care are loc fără a provoca schimbări în consecutivitatea materialului ereditar. Mecanismele epigenetice includ toate tipurile de control tanscripțional care determină modul în care vor fi exprimate pe parcursul dezvoltării și diferențierii, dar și în celulelece răspund stimulilor externi.

Termenul „epigenetics” a fost inventat de către Conrad Waddington în anul 1942, atunci nu era cunoscută natura exactă a genelor și rolul acestora în ereditate și în regularea transcripțională, el a folosit termenul drept un model concepțional despre cum ar putea genele interacționa pentru a produce fenotipul. Termenul este dezvoltat de la cuvântul epigeneză (diferențierea celulelor de la starea lor inițilă, totipotentă în dezvoltarea embrionului) și geneză. Doar în 2008, consensul a fost îmbogățit, noțiunea de epigenetică fiind explicată drept fenotip stabil moștenit, rezultând în schimbări în cromozomi fără alterarea secvenței în ADN. Din greacă, prefixul epi- se referă la trăsăturile care sunt înaintea geneticii, acestea sunt toate schimbările stabile dar reversibile ale ADN-ului, ARN-ului și proteine ce reglează expresia genelor și permite celulelor ce posedă același AND să realiza diferite produse proteice în momente diferite.

Schimbările genetice și epigenetice sunt mereu interconectate. Oricum, poate fi făcută o distincție între acele condiții în care anormalitățile epigenetice (epimutații) sunt globale și acelea în care este local.

Altfel spus, mecanismele epicenetice includ orice tip de control trascripțional care regulează expresia genelor, dacă în timpul dezvoltării și diferențierii sau celulele mature raspund mediului extern. Schimbările epigenetice pot fi moștenite și să fie relativ stabile, dar deseori sunt rapid impuse sau îndepărtate de pe un locus în confirmitate cu necesitățile celulei. Au fost identificate 4 domenii de reglare epigenetică: metilarea citozinei: (1)Metilarea ADN este un proces în care se adaugă o grupă metil la molecula de ADN. Este specific pentru zonele unde nucleotida ce conține citozină este localizată lângă una ce conține guanină ce este legată de fosfat, acest situs este numit insula CpG. Situsurile CpG sunt metilate de una din trei enzime numite ADN metiltransferaze (DNMTs). Modificarea histonelor: se produce paralel cu metilarea ADN pentru a asigura că regiunea de ADN oferită nu este accesibilă nici pentru transcripție sau silențiere prin condensarea cromatinei. Regiunile active de cromatină posedă ADN nemetilat și un nivel ridicat de histone acetilate, în timp ce regiunile inactive ale cromatinei conțin ADN metilat și histone deacetilate. Remodelarea cromatinei: proces asistat de enzime ce facilitează accesul ADN-ului nucleosomal, remodelând stuctura, compoziția și poziția nucleosomilor. Accesul la ADN-ul nucleosomal este controlat de două clase majore de proteine complexe: modificarea covalentă a complexelor histonice și complexele remodelate de cromatină ATP-dependente. Silențiozitatea ARN-asociată: genele pot fi inactivate de către molecula de ARN atunci când este sub forma unui transcript antisens, ARN necodificator sau ARN interferență. Moleculele de ARN pot afecta expresia genelor cauzând formarea heterocromatinei, sau declanșând modificarea histonelor și metilarea ADN.(1)

Pe scurt, schimbările dinamice în structura cromatinei influențează expresia genelor: starea silențioasă a genelor este indusă atunci când cromatina este condensată (heterocromatină), ele se expresează atunci când cromatina este decondensată (eucromatina) și factorii convenționali transcripționali sunt disponibili. Silențierea epigenetică este o cale de inhibiție a genelor și poate contribui expresiei diferite. Silențiozitatea deasemenea poate explica din ce cauză gemenii nu sunt identici fenotipic. Adițional, factorii epigenetici prezintă importanță pentru inactivarea cromozomului X la femelele din clasa mamifere, fapt necesar pentru ca femelele să nu aibă dublu produs genic asemenea bărbațior. Astfel, semnificația inactivării genelor de către chimbările epigenetice este evidentă. În celule sunt trei sisteme care pt interacționa unul cu altul pentru a produce strea silențioasă a genei: metilarea ADN, modificarea histonelor, silențiozitatea ARN-asociată.

Schimbările epigenetice pot fi induse de deterioarea ADN dar și de factorii externi, aceștia promovând o conexiune între exterior și ADN, care este bibilioteca genetică unde toate răspunsurile moleculare sunt stocate. Modificarea epigenetică este stabilizată în următoarele generații și nu poate fi stopată de diviziunea meiotică.

Operând cu enzime care adaugă sau îndepărtează tag-uri chimice la ADN sau histone, este o alternativă atractivă pentu a modula expresia genelor, în special dacă medicamente eficiente pot fi dezvoltate pentru scop. Epigenetica este un domeniu dezvoltat rapid, oferind oportunități interesante pentru a stabili diagnoza și tratamentul bolilor clinice complexe, incluzând cancerul.

Rezultat al schimbărilor epigenetice este și sindromul X fragil este cauzat de mutația de pierdere a funcției genei FMR1, localizată în Xq27.3, care corespunde cu poziția sitului sensibil la folat FRAXA observat citogenetic la bărbații afectați. Gena conține 17 exoni de 38 kb cu o insulă CpG și o repetiție CGG instabilă în amonte regiunii promotorului și codifică proteină ce leagă ARN. Prezența întreruperilor AGG în regiunilor de repetiție par să stablizeze repetițiile trinucleotidice, în timp ce absența lor rezultă în creșterea variabilității mărimii pe parcursul transmiterii meiotice.

Alelele premutaționale pot să se extindă până la 200 repetiții pe linie maternă, ceea ce cauzează represia transcripțională a FMR1 prin intermediul modificațiilor epigenetice, numita: metilarea citozinei din extinderea secvenței și a insulei CpG, deacetilarea histonelor 3 și 4, demetilarea lizinei 4 și histonei 3 (H3K4), metilarea lizinei 9 din histona 3 (H3K9) și tri-metilarea lizinei lizinei 27 în histona 3 (H3K27). S-a reportat creșterea metilării lizinei 20 în histona 4 (H4K20) lângă expansiunea CGG. Toate aceste schimbări epigenetice rezultă în heterocromatinizarea locusului de pe FMR1, prevenind transcripția și rezultând în absența proteinei FMRP. Câțiva pacienți cu sindromul X fragil au deleții sau mutații punctiforme pe gena FMR1, rezultând în pierderea funcției FMRP.

1.2. Analiza profilului SXF în diverse țări.

Pentru populația caucaziană, concluzia estimată în urma efectuării a opt studii, sugerează prevalența sindromului X fragil care variază între 1 din 3,717 la 1 din 8, 918 bărbați din populația generală. Problema evidențiată de aceste studii în extrapolarea prevalenței în aspect fenotipic în populația țință. Deasemenea, este complicată compararea studiilor din cauza diferențelor în definițiile populației țintă. De exemplu, un studiu ce examinează persoanele clinic menționate identifică o prevaleță înaltă pentru sindromul X fragil în populația țintă în comparație cu un studiu care examinează persoane cu probleme de vorbire. Atribuind fenotipul clinic sindromului, aceste diferențe sunt preconizate între prevalența în populației țintă.

Pentru a evita această interferență în sesizările clinice, alte studii ce implică un număr mai mare de oameni, au definit în sens larg populația ce manifesta retard mental în tentativa de a selecta toți bărbații ce manifestă sindromul. Două dintre aceste studii au extins definiția pentru a include persoanele să beneficieze de educație specială indiferent de statutul retardului mental. Deși este rezonabil să se considere că aceste studii au ilustrat estimări concrete referitor la prevalența sindromului în populația generală , unele speculații în vederea că prevalența este în realitate mai mare. Doar screening-ul populației în rândul nou-născuților va rezolva această problemă cu precizie.

Rezultateale unor studii disponibile sugerează diferențele în limitele diverselor populații de exemplu, este demostrat că majoritatea cazurilor de X fragil în Israel sunt din descendenții evreilor tunisieni. Precizat că majoritatea populației Israelului este descendentă din Așkenazi, cercetătorii au propus faptul că prevaența sindromului X fragil este des întâlnit la evreii tunisieni în comparație cu caucazienii de 10 ori. (tab1) În urma efectuării unor studii s-a observat că este o incidență sporită a numărului înat de repetiții CGG în gena FMR1 cu lipsa punctațiilor AGG în populația normală de evrei tunisieni. Prevalența bolii printre evreii tunisieni se consideră a fi atribuită efectului de fondator al acestui haplotip rar, care este compet lipsit de punctațiile AGG. Absența acestor întreruperi în structura etnică a evreilor tunisieni cauzează o instabilitate sporită a repetițiilor CGG, ceea ce duce la sporirea frecvenței aparției mutației (1/154), se evidențiază fenomenul de drift genetic. Acesta incidență sporită impune efectuarea screening-urilor coprehensive în populație.(tab3) Deasemenea, s-a observat absența expansiunii largi de trinucleotide CGG în populația americană nativă și prevalența redusă a sindromului în populații. Similar, în populația Bască spaniolă s-a reportat a fi o prevalență redusă la bărbații cu sindromul X fragil în originea pură bască a populațiilor cu retard mental și o frecvență redusă a repetițiilor extinse de CGG în comparație cu populația caucaziană a descendenților nord europeni. Cercetările din Noua Scoție au raportat absența cazurilor de sindrom X fragil în populația bolnavă de retard mental.

Cu toate că sunt sugestive, nici unul dintre aceste studii nu au fost desfășurate pe larg în populații. Doar două au fost în baza screening-ului populațional pentri ne-caucazieni, ambele au fost desfășurate în populații africane-derivate, unde s-a observat prevalența de 1 la 2,500 în populația generală, ceea ce este mai mult decât a fost observat în populațiile caucaziene.

Mai puțin este cunoscut despre prevalența mutației complete în rândul femeilor, cu toate că mutația se amplifică și transmite pe linie maternă, femeile identificate ca având mutație completă este de 1 la 8,462, rezultat obținut în urma unui screening populațional în Israel.

Deasemenea, în rândul populațiilor caucaziene s-a cercetat prevalența premutației. În urma efectuării a două studii în rândul bărbaților, s-a stabilit prevalența de aproximativ 1 bărbat la 1000, în populația generală. Femeile sau dovedit a fi înalt purtătore de premutație, limitele variind între 1 din 246 și 1 din 468 în populația generală caucaziană. Rezultatele estimate din studii vaste a diferitor populațiii din Israel diferă, intervalele pentru ambele estimări se suprapun foarte puțin: 1 în 271 vs. 1 în 468.

Screening-ul sidromului

Nu esistă programe de rutină, vaste pentru screening-ul în cazul sindromului X fragil. Drept rezultat, multe cazuri sunt diagnosticate prin sesizare pentru testare. În 1994, un grup de lucru pentru Colegiul American de Genetică Medicală au publicat orientări în efectuarea sesizărilor pentru testarea sindromului X fragil. Aceasta include testarea fiecărei persoane ce prezintă retard mental inexplicabil, deficiențe de dezvoltare sau autism, în special dacă caracteristicile fizice sau comportamentale asociate cu SXF sunt evidente. Grupul de lucru, deasemenea a recomandat testarea în baza anamnezei familiale a retardului mental inexplicabil. La baza acestor recomandări, de la 1% la 2% din probe referitaoare la testarea moleculară pentru sindromul X fragil s-au dovedit a fi pozitive pentru sindrom.

Dincolo de sistemele de sesizare, investigatorii din Marea Britanie, Statele Unite ale Americii și Olanda au implementat sisteme active de screening orientate spre copii de vârstă școlară cu retard mental și alte dificultăți de învățare, indiferent de anamneza familială. Decizia pentru testarea SXF printre popolația sesizată neclinic, diferă printre studii. De exemplu, studiile din Regatul Unit și Olanda au testa copii cu retard mental și dificultăți de învățare cu etiologie necunoscută și studiile din Statele Unite au facut sreening-ul tuturor copiilor eligibili indiferent de etiologia părinților. În ciuda diferențelor în decizia de testare, toate trei teste au identificat sindromul X fragil la copii nediagnosticați de vârstă școlară.

Identificarea cazurilor noi de SXF în rândul copiilor de vârstă școlară, suerează nediagnosticarea sindromului prin sistemul de sesizare. În ciuda combinării dintre retardul mental și profilul specific al comportamentului și aspectului fizic asociat cu SXF, dezvoltarea controalelor clinice structurate în vederea depistării copiilor bolnavi de sindrom au fost îngreunate din cauza unor factori. În primul rând, caracteristicile fizice la masculii adulți afectați pot să nu fie identificate la masculii mai tineri. Macroorhidismul de obicei este absent până la vârsta pubertară. Și unele caracteristici ale feței, precum proeminența maxialarului poate fi specific de etnie sau rasă. În al doile rând, gradul retardului mental și perturbărilor de dezvoltare variază în limite largi printre bărbații afectați. Deseori, sunt testați pentru SXF bărbații ce prezintă retard mental sever decât cei cu retard mental moderat și redus.

Screening-ul purtătorilor

În sensul identificării purtătorilor de sindrom, sunt analizate femeile susceptibile pentru alelel cu premutație și mutație completă, pentru că ambele sunt în categoria de risc pentru transmiterea mutației complete la urmași. Grupul de lucru pentru Colegiul American de Genetică Medicală nu au recomandat efectuarea screeningului populației purtătoare. În Statele Unite, nu există programe de screening pentru sindromul X fragil a femeilor la vârsta reproductivă. Literatura coține rapoarte de studii de screening înguste pentru retard mental în istoria familială.

Spre deosebire de studiile de screening performate în Statele Unite, investiganții în Finlanda au implementat un program larg de screening populațional pentru identificarea purtătorilor de premutație. Acest program a permis testarea gratuită pentru gena FMR1 în scopul verificării tuturor femeilor însărcinate în cercetare de îngrijire prenatală din iulie 1995 până în decembrie 1996. Printre femeile fără antecedente familiale cu SXF, 1,477 (85%) au optat pentru testarea genetică. Dintre aceste femei, șase au fost identificate drept purtătoare de premutație și toate aceste femei au ales testul prenatal.

Precum în Finlanda, testarea purtătorilor este pe larg implementată și acceptată în Israel. Cel puțin trei grupuri au publicat rezultatele obținute din programele vaste de screening. Spre doesebire de programul din Finlanda, aceste programe sunt oferite contra plată și nu se bazează nici pe sesizare personală sau fizică pentru testare.(tab1) Gena mutantă se întâlnește în rândul femeilor din Israel cu o frecvență de 1:80 – 1:120 oameni. Metodologia determinării afecțiunii începe cu analiza sângelui, care se preia de la femeile însărcinate. În cazul în care rezultatul depistează gena mutantă, la 10-12 săptămâni de sarcină se desfășoara analiza vilozităților corionice placentare, ceea ce permite stabilirea diagnosticului copilului pentru sindrom. Tehnicile moleculare de diagnostic au o precizie de 95%. În cazul în care la femei se identifică simptome de mutație genetică, pacientei i se prescrie consultație genetică pentru a planifica în detaliu acțiunile viitoare.

Prevalența premutației.

Numărul femeile sănătoase, purtătoare de premutație este destul de redicat. Conform unui studiu, la femeile franceze-canadiene, din 10 624, 41 au fost identificate ca fiind purtătoare de premutație, reprezentând o prevalență de 1 la 259. În Israel, din 14 334 de femei la vârsta fertilă, au fost identificate 127 cu repetiții CGG în limita premutației, incluzând trei femei asimtomatice cu mutație completă, prezentând o prevalență de 1 la 113. În SUA, din 2 300 femei cercetate, prevalența mutației sa dovedit a fi de 1 la 372 și a alelelor intermediar – de 1 la 143.(tab 6)

1.3. Gena FMR1. Mecanismul epigenetic de formare a mutației.

Caracteristica definitorie a mutațiilor dinamice o constituie instabilitatea lor, exprimată prin creșterea numărului de copii trinucleotidice. [1] Instabilitatea se manifestă cu ocazia diviziunilor pe care le realizează celula purtătoare, mecanism realizat în timpul transmiterii de la părinți la descendenți – instabilitate meiotică, sau prin procesul mitotic, producâd variații de mărime în țesuturile unui individ afectat – mozaicism somatic. Instabilitatea se exprimă clinic prin unele anomalii, sub pragul critic, sunt determinate polimorfisme ADN benigne. Din nou, în procesul meiotic, se mărește numărul de repetiții, fiind transmis descendenților, fenomen numit – anticipație.

Intensitatea de manifestare a bolii la descendenți este proporțională cu dimensiunile secvenței amplificate și depinde de sexul părintelui. Potrivit „Genetică medicală” de Sandovici et bărbații cu expansiune trinucleotidică semnificativă a unicului lor cromozom X vor fi afectați. Ei nu vor transmite mutația completă la băieții lor, ci vor transmite premutația fiicelor din cauză că bărbații cu mutație completă în celulele sanguine au premutație în celulele spermatice și expansiunea premutație – mutație completă nu este posibil de realizat prin transmitere paternă.

Femeile ce moștenesc de la tată cromozomul X cu expansiunea FMR1 vor fi heterozigote, datorită fenomenului de inactivare, ele vor prezenta unele simtome sau vor fi normale. Ele vor transmite X fragil la băieți sau la fete; băieții ce primesc X fragil au risc de boală, iar fetele vor fi normale sau cu dizabilități intelectuale. Astfel penetranța bolii este de 80% în cazul bărbaților și 30% în cazul femeilor. Dacă femeia este purtătoare a unei mutații complete, ea o va transmite la 50% dintre băieți și la 50% dintre fete, dar nu se poate aticipa dacă fiicele cu mutație completă vor avea manifestări clinice și dacă da, care va fi severitatea acestora. Deși rar, au fost raportate femei cu mutații complete care au avut copii cu reversii sau alele cu dimensiuni de premutație. Riscul unei femei purtătoare de premutație de a transmite cromozomul X la copii este de 50%.

Mecanismul expansiunii nu se cunoaște exact, probabil se produce prin fenomenul de glisare, determinat de alinierea greșită și împerecherea decalată a repetițiilor trinucleotidice. S-a sugerat că regiunile cu repetiții trinucleotidice pot forma, dincolo de un anumit prag de lungime, structuri spațiale anormale de ADN care perturbă replicarea și favorizează derapajul replicativ. [1]

Gena FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) localizată pe locusul FRAXA în poziția Xq27.3 (fig.1) expansiunea trinucleotidică generând situsuri fragile sensibile la folat.(fig.2)[1,2,3,5,7].

(Fig.1) Localizarea genei FMR1 pe brațul distal al cromozomului X

Gena FMR1 prezintă 17 exoni cu o lungime de 38 kb și 16 introni și este înalt conservată în scara animală. La nivelul primului exon, în regiunea netranscripțională se găsește un microstelit care conține între 6-52 secvențe trinucleotidice CGG la persoanele normale, spre o insulă CpG nemetilată de 1-2 kB. Extinderea segmentului de microsateliți până la 200 unități repetitive prezintă premutația, convertirea acesteia în mutație, adică în cazul în care unitățile repetitive depășesc 200, ajungând la 2000, fiind provoacată metilarea genei și dezacetilarea histonelor. [3] Printre indivizii normali, repetiția CGG este înalt polimorfică în lungime și conține dese intercalări de triplete criptice AGG, deseori întâlnite repetate în pozițiile 10 și 20. Variația lungimii repetiției CGG este găsită la capătul și pare că tripletele AGG joacă un rol crucial în menținerea stabilității repetițiilor. Majoritatea alelelor premutaționale nu au triplete AGG sau doar un singur AGG la capătul al repetiției. Pierderea acestor punctații duce la crearea alelelor cu repetiții numeroase și perfecte de CGG respectiv, acestea sunt dispuse către premutație ce este instabilă și se poate extinde, formându-se mutația completă. Lungimea CGG intercalată de repetiții AGG fiind n<30 – lungimea optimală pentru sinstetizarea fragmentelor Okazaki, reducerea numărului de intercalări și n>30 provoacă sintetizarea unui fragment Okazaki doar cu repetiții CGG ce nu se supune transcripției. [17] se instalează starea silențioasă a genei.

Fig.2 Situsul fragil ce apare ca o constricție secundară pe brațul lung al cromozomului X

FMR1 este intens exprimată în viața embrionară, funcția acesteia continuând și postembrionar cu precădere în uter, testicule și creier. S-a demonstrat că ARNm al FMR1 este expresat în creierul fetal la un stadiu incipient de dezvoltare în proliferarea și migrarea celulelor sistemului nervos, retinei, structurilor cartilaginoase și ficat. În creierul fetusului de 23 săptămâni, ARNm al FMR1 este produs în cantități mari în neuronii colinergici ai nucleilor bazali magnocelulari și în neuronii piramidali din hipocampus. Transcripția timpurie și distribuția genei sugerează că alterarea expresiei genei FMR1 contribuie la patogeneza sindromului X fragil, în special retardul mental. Abitbol et al. (1993)

După cum am menționat anterior, sindromul X fragil este cauzat de o anormalitate apărută în gena FMR1. Indivizii ce prezintă mai mult de 200 de repetiții CGG, maifestă simptome sindromului. Prea multe repetiții CGG cauzează metilarea insulelor CpG din regiunea promotorului genei FMR1, în mod normal acestea nu sunt metilate. Această metilare inactivează genele , stopând producerea proteinei FMRP (fragile X mental retardation protein) de către gena FMR1. pierderea acestei proteine specifice determina apariția sindromului X fragil. Deși mare atenție a fost atribuită mutației cauzate de expansiunea nucleotidelor CGG drept cauza sindromului, schimările epigenetice asociate cu metilarea genei FMR1 este adevăratul vinovat de apariția sindromului.

Metilarea ADN reprezintă un termen generic pentru procesele de modificare a resturilor de baze azotate (adenina, citozina, guanina) din cadrul ADN. Modificarea constă într-o reacție de de adiție a grupei funcționale metil: -CH3 la nivelul bazelor azotate. În urma reacției, gruparea metil substituie un atom de hidrogen, aflat inițial într-o legătură covalentă cu un atom de C, O sau N. Așadar, metilarea este un proces de transformare a bazelor majore din macromolecula de ADN în baze minore. (epi)

(1)Metilarea ADN este un proces specific pentru zonele unde nucleotida ce conține citozină este localizată lângă una ce conține guanină ce este legată de fosfat, acest situs este numit insula CpG. În genomul haploid uman se înregistrează 23 495 insule CpG nemetilate, numărul lor total fiind de 350 000. Insulele CpG sunt asociate cu promotorul multor gene inclusive cu genele ce realizează funcția reglatoare. Insulele CpG pot fi dispuse atât intr- cât și extragenic. În mare parte, se supun metilării insulele interioare CpG. (rus).

Situsurile CpG sunt metilate de una din trei enzime numite ADN metiltransferaze (DNMTs). Sunt descrise trei grupe de de ADN metiltransferaze: DNMT1, DNMT2 și DNMT3. Funcția de bază a DNMT1 o prezintă menținerea stării metilate a ADN. Activitatea DNMT1 este identificată în focusul de replicație în faza S a ciclului celular. În procesul replicării ADN-ului metilat complet se formează forma semimetilată cu o catenă nemetilată nou-sintetizată. Metilând resturile de citozină, dispuse în catena nou sintetizată, enzima asigură manifestarea caracterului de bază metilând ADN-ul din catenele-fice după fiecare rundă de replicație.

Substratul pentru metiltransferaze DNMT3 este ADN nemetilat. Metilazele DNMT3a și DNMT3b sunt responsabile pentru imaginea metilării de novo, necesare pentru asigurarea condițiilor specifice structurale-funcționale a cromatinei în ontogeneză. Expresia genelor acestor ADN metiltransferaze se desfășoară, în principal, în celulele embrionare și gameți. ADN metiltransferaza DNMT2 posedă activitate de metilare a ARN și poate metila specific citozina în poziția 38 a buclei anticodon ARNt asparaginei.

Metilarea ADN este o reacție enzimatică de introducere a grupei metil în poziția C-5 a inelului pirimidinic a citozinei. Reacția este catalizată de enzima ADN (citozina-5)-metiltransferaza.

Acțiunea enzimatică presupune etapele:

Recunașterea și legarea specifică a celor două componente esențiale ale reacției de metilare enzimatică: substratul-citozina (în cadrul structurii sale, ph-ul acid determină redistribuirea efectelor electronice, cu favorizarea unui atac nucleofil în poziția C-5) și donorul de grupe metil-S-adenozil metionina (Ado Met sau SAM), la nivelul căruia are loc labilizarea specifică a legăturii implicând grupa –CH3.

Clivarea și transferul –CH3 din structura donorului în poziția C-5 a inelului pirimidinic

Stabilizarea legăturii covalente formate într-o nouă structură (5-meticitozina), eliberarea S-adenozil homocisteinei (SAH) și a enzimei.

Inserția grupelor metil schimbă aparența și structura moleculei de ADN, modificând interacțiunile genei cu echipamentul transcripțional din nucleul celulei. Metilarea ADN este utilizată în unele gene pentru a diferenția copia cărei gene este moștenită pe cale maternă și care pe ale paternă, fenomen numit impriting.(1)

(2) Metilarea ADN este cel mai cunoscut marker epigenetic utilizat de către celule pentru a opri transcrierea genelor. Aceasta influențează procesul de transcripție pe cale schimbării eficacității legăturii dintre factori pozitivi și negative ai transcripției cu regiunile reglatoare ale genelor, precum și prin formarea regiunilor inactive ale cromatinei. Potrivit primului mecanism, 5-metilcitozina inhibă legarea AND cu factorii de transcripție, piedica acestora fiind conținutul de dinucleotide CpG. În realizarea celulilalt mecansim, participă proteinele care se leagă specific cu dinucleotide specifice CpG și inhibă atașarea la molecula de ADN a foctorilor de transcripție. Rolul pricipal în cadrul acestui proces îl reprezintă complexul de legare al metilcitozinei ce este constituit din 5 proteine de bază: MBD1 – MBD4 și MeCP2. Toate proteinele acestui complx, cu excepția MBD4, îndeplinsec funcție represivă prin schimbarea structurii cromatinice:proteina MBD4 participă la repararea și previne schimbările mutaționale ale metilcitozinei: proteina MeCP2 posedă un domen petru recunoașterea insulei CpG metilată și un domen de represie a transcripției. Prin atașarea proteinei MeCP2 la dinucleotidele CpG, efectul de represie se extinde la câteva sute de perechi de nucleotide. (?)

Astfel, metilarea suprimează expresia genei FMR1 și translarea produsului proteic. Printre bărbații ce au mutația X fragil, există un grup cu mutație mozaicată ce prezintă mărimi difeite a expansiunilor repetitive în celule diferite. Astfel, unele celule la bărbații cu tipaj mozaic al mutației poartă o repetiție exstinsă complet cu mai mult de 200 copii, în timp ce alte celule poartă o repetiție parțială – premutație cu 60-200 copii. Acești indivizi prezintă cea mai comună formă de mozaicism printre bărbații cu formă mozaicată. În adiție, există bărbați care sunt purtători de mutație completă atât în formă metilată, cât și nemetilată. Deasemenea, au fost identificate femei cu formă mozaicată, însă cu o frecvență mult mai redusă. Originea mozaicismului este considerată a fi din cauza expansiunii repetițiilor CGG până la mutația completă în unele celule în timp ce în altele celule, numărul repetițiilor stopează, ramânând la stadiu de premutație. Acest fapt este precedat de faptul că mutația completă se formează la un stadiu timpuriu de dezvoltare după ce ovulul fertilizat s-a divizat doar de câteva ori. În cazurile excepționale de metilare mozaicată, dintr-un motiv oarecare, expansiunea completă a repetițiilor nu reușește să se supună metilării sau poate fi incompletă. Identificarea statutului mozaicat al ADN poate fi elucidată utilizând metodele de reacție în lanț a polimerazei și analiza Southern blot. Pentru a identifica prezența mozaicismului la un individ, ambele metode pot fi aplicate. Analiza Southern blot este utilizată pentru a determina mărimea expansiunii și prezența metilării la un site ce nu se supune metilării la mutația completă. Utilizarea metodei de reacție în lanț a polimerazei nu elucidează statutul metilat. Astfel, analiza Southern blot este indicată pentru a determina mozaicismul. Incidența statutului mozaicat identificat prin analiza Southern blot la bărbații afectați în numeroase studii s-a doveit a fi de 12%-41% . s-a observat că 19% dintre bărbații afectați de sindrom au statut mozaicat. Deoarece bărbații cu statut mozaicat au o parte de repetiții ce determină premutația pe lângă cele cu mutație completă, proteina FMRP este produsă într-o anumită cantitate. În acest fel, mozaicismul poate fi determinat prin prezența proteinei FMRP în celulele individuale. În ciuda faptului că la bărbații cu statut mozaicat se sintetizează o oarecare cantitate de proteină, există tulburări de dezvoltare. O explicație poate fi că contingentul de FMRP este insuficient pentru a permite dezvoltarea normală. Alternativ, pentru că studiile ADN pentru determinarea satutui X fragil sunt efectuate în celulele sanguine, aceste rezultate nu pot reflecta cu precizie modelul molecular în creier. La unii indivizi s-a investigat mozaicismul în țesuturi precum sângele și pielea. Pentru unii bărbați, un model similar a fost identificat tât în sânge cât și în piele, la alții notându-se variații extreme. Astfel, este dificil de prezis dacă mozaicismului din sânge corelează cu cel din creier. Unele studii au încercat să explice legătura dintre prezența mozaicismului și funcționarea creierului la bărbații cu statut mozaicat și la cei cu staut metilat complet. A fost examinată relația dintre IQ și mozaicismul, nereușind să demonstreze nici un fel de asociație. Odată ce bărbații cu X fragil sunt simplu de agitat și dificil de testat, aceste rezultate nu sunt surprinzătoare. Ulterior, s-a evaluat corelația dintre mozaicism și capacitatea de adaptare mai degrabă decât IQ. în urma studiului, s-a concluzionat ca mozaicismul sporește funcționarea creierului față de cazul indivizilor cu mutație completă. Alte studii au demostrat raportul direct dintre cantitatea de proteină sintetizată și IQ-ul persoanei. Și în acest caz mozaicismul s-a dovedit a ameliora simptomele bolii. (tab 3)

1.4. Premutația genei FMR1

1.4.1. Insuficiența ovariană asociată cu X fragil

Altă anomalie cauzată de modificarea genei FMR1 este insuficiența ovariană asociată cu X fragil (FXPOI). Condiția respectivă implică nefuncționarea ovarelor la capacitatea lor maximă în cazul unui purtător de premutație. Simtomele includ absența sau iregularitatea menstruației, simptome ale menopauzei și infertilitate.

Unul din simptomele instalării menopauzei precoce este creșterea nivelului de hormon foliculostimulant. Majoritatea cazurilor de instalare a menopauzei este sporadică, frecvența instalării acesteia la femeile cu garnitura de cromozmi 46 XX este în medie 1%, este demonstrată dereglarea ca fiind rezutatul vârstei înaintate. Totuși, 10-15% dintre femeile cu insuficiență ovariană prezintă antecedente în anamneza familială. În etiologia afecțiunii pot fi elucidate două mecanisme de bază: micșorarea numărului de foliculi și disfuncția acestora. Cauzele ce provoacă dezvoltarea afecțiunii pot fi: genetice, autoimune, fermentative, de natură infecțioasă, psihologică. În ultimii ani, o atenție deosebită este acordată aspectului molecular-genetic, din cauză că sunt identificate un set de gene responsabile de dezvoltarea sindromului. Schimbările survenite în gena FMR1 fiind cauză a instalării menopauzei timpurii. Premutația determinată de expansiunea tripletelor CGG, generează apariția disfuncției. La femeile cu o formă sporadică de FXPOI, frecvența premutației variază între 0,8 – 7,5%, pe când formele familiale ale bolii poate atinge 13%. S-a elucidat faptul că femeile purtătoare de premutație, mai des suferă de oligomenoree (38%) spre deosebire cazurile în rândul populației sănătoase (6%).(tab 5)

În cazul FXPOI, ovarele nu își exercită funcția asemenea în perioada menopauzei. Cu toate că simptomele se asemănă, există unele diferențe precum faptul că femeile cu FXPOI pot să rămână însărcinate în unele cazuri, deoarece ovarele pot funcționa ocazional, însă există pericolul convertirii premutației în mutație în cadrul descendenței; sunt posibile menstruații; purtătoarele de premutație a genei FMR1 prezintă menopauză precoce (40-45 ani) menopauza normală survenind la 45-50 ani. [11,15]

FXPOI se manifestă la 20-25% din femeile purtătoare de premutație, deasemenea a fost identificat la adolescentele purtătoare. [11]

Studiile genetice epidemiologice sugerează că severitatea disfuncției ovariene asociată cu FXPOI este varibilă și poate fi modulată de numărul de repetiții CGG și, adițional, de factori genetici și ambientali. [15] . Este presupus faptul că premutația la nivel de FMR1 poate provoca reducerea numărului de foliculi ovarieni, dar neafectând foliculii primari, provoacă alterarea nivelului unor hormoni precum FSH, LH, deasemenea gena ce induce secreția de LH inducător de ovulație este specific alterată. Rolul potențial al genei FMR1 în controlul fertilității femele este, probabil explicat de prezența ARNm al FMR1 și al produsului proteic al acesteia în celulele granuloase și oocite. Astfel, insuficieța complexului de ARNm și FMRP poate provoca dereglări la nivelul foliculilor ovarieni și a secreției de hormoni sexuali.

Premutația maternă poate fi convertită în mutație la generația următoare, provocând manifestarea sindromului X fragil, premutația paternă fiind stabilă. În multe alele ale FMR1 sunt identificate punctuațiile AGG, dispuse între sectoarele repetitive CGG. Se presupune funcția stabilizatoare a acestor punctuații, diminuând riscul expansiunii în următoarele generații. În cazul lipsei acestor întreruperi, sporește probabilitatea statutului instabil al genei și transmiterea mutației în generațiile următoare. (tab 5) În 4%-6% din cazurile de POI s-a identificat premutația genei FMR1. (tab 6) S-a demonstrat că riscul de a deyvolta POI și numărul de repetiții este nelinear. Afecțiunea se dezvoltă, în special, când numărule repetiții CGG este între 79 și 99, riscul fiind mult mai redus atunci când repetițiile variază între 55 și 88 și în jur de 100. Mărimea repetițiilor între expansiunea normală și premutație este numită o zonă intermediară sau “zonă gri” de (41-54 repetiții). Unele studii au elucidat sporirea riscului de dezvoltarea POI pentru femeile cu repetiții în zona intermediară. O explicație plauzibilă a acestei concordanțe dintre menopauza precoce și statutul premutațional al genei este că transcripția de la alelele premutante este sporită. Repetițiile înter 55 și 79 , pe de altă parte, duc la creșterea nivelului de FMRP. Deoarece FMRP este înalt expresată în celulele germinative în ovarul fetal, acumalarea de FMRP poate deteriora expresia genelor necesare pentru dezvoltarea oocitului. Repetițiile mai lungi pot fi translate mai puțin efficient. Deoarece expresarea genei FMR1 a fost observată deasemenea în GC în maturarea foliculilor, acumularea de ARNm al FMR1 poate avea acțiune toxică pentru o anumită perioadă, favorizând atreyia foliculilor. Acest mecanism se evidențiază în alte cazuri de de acțiuni nefaste ale premutației, precum sindromul de ataxie și tremor intențional (FXTAS) .

Efectuarea screeningului penttru premutația în cadrul sindromului X fragil este recomandat pentru prelucrarea de rutină pentru fiecare femeie ce manifestă POF. Motivul pentru a face asta este că circa 5% dintre femeile cu POF pot concepe și această posibilitate poate fi și mai pronunțată în subgrupul cu premutație. Femeile trebuie atenționate de riscul de a avea un copil suferind de sindromul X fragil. Deasemenea, identificarea famiililor unde repetițiile CGG în gena FMR1 sunt extinse pot duce la identificarea membrilor de familie ai altei femei corelat cu riscul de a transmite SXF sau POI. Identificarea unui caz ar trebui să declanșeze sfatul genetic pentru urmași.(S1)

1.4.2. Sindromul de ataxie/tremor intențional

Altă maladie asociată X fragil este sindromul de ataxie /tremor intențional (FXTAS) este o tulburare neurodegenerativă întâlnită mai des la bărbați decât la femei. Se manifestă la vârsta de 50 ani. S-a estimat că aproximativ un bărbat din 3000 și un număr redus de femei din populația generală vor dezvolta FXTAS la o vârstă anumită în perioada vieții lor, simtomul de ataxie devenind cea mai frecventă tulburare neurodegenerativă cu debut tardiv conexată cu o singură genă.(tab 10) Simptomele FXTAS sunt ataxie, tremor intențional, probleme de memorie, iritabilitate, instabilitate psihică, simptome Parkinsoniene, demență, declin cognitiv[12] dereglări ale funcțiilor cognitive , neuropatie periferică, disautonomie și disfuncții autoimune, la femei în particular.(tab 10) Maladia este indusă de premutația FMR1, numărul de repetiții nucleotidice depășind 70 CGG, a fost sugerat că penetranța crește odată cu mărirea numărului de repetiții, deasemenea – cu înaintarea în vârstă, 50% în cazul bărbaților cu vârstă cuprinsă între 70 șo 90 ani. Oricum, nu toți purtătorii de premutație prezintă sindromul de ataxie. Este observat că odată cu mărirea dimensiunii premutației, nivelul de FMRP scade. Reducerea nivelului este considerat a reflecta o dereglare translațională a ARNm al FMR1, tripletelor CGG. (start tab 10) Observația că FXTAS este limitat pentru purtătorii de alele în statut premutațional sugerează că gena FMR1 poate fi transcripțional activă pentru formarea bolilor. Observațiile privind creșterea nivelului de ARNm al FMR1 în statut premutațional împreună cu modelul de câștig de funcție al ARN propus pentru distrofia miotonică, susține inițierea pe bază de ARN a unei disregulări celulare care stă la baza sindromului de ataxie. În cazul ambelor maladii repetițiile extinse sunt necodificatoare. Unele studii au elucidat acțiunea toxică al ARN. Mare majoritate a acestor studii a identificat proteine specifice inclusiv elemente bogate în purină ce leagă proteina A (Pur α), ribonucleoproteina nucleară heterogenică A2/B1 (hnRNP A2/B1), repetiția tripletului CUG cu proteina 1 de legare a ARN (CUGBP1), etc. Bazate pe interacția acestora cu repetițiile CGG și a demonstrat eliberarea parțială al fenotipului de bază prin expresarea peste măsură a proteinei în contextul extinderii repetițiilor CGG. Impactul repetițiilor CGG în patogeneza FXTAS are o mare influență asupra intervenției terapeutice ulterioare. Cu toate că există necesitatea unei clarificări mai detaliate și un mecanism mai precis pentru implicarea ARN, devine mai clar că multe trăsături ale patogenezei celulare pot fi induse de către repetiția CGG însuși, la excluderea regiunii codificatoare a proteinei FMRP sau promotorului FMR1, sau o formă vădită de transcript antisens. Această concluzie se bazează pe observația că ambele formațiuni de incluzie și alte aspecte ale neuropatologiei poate avea loc în absența proteinei codificatoare sau în contextul promotorului. o cauză posibilă a implicării repetițiilor CGG este faptul că acționează drept declașator, probabil din cauza structurii sale secundare, din cauza căilor de răspuns la stres. În timp ce rolul direct al moleculei dublucatenare de ARN indus de protein-kinază a fost redus, principiul mecanismului declanșator rămâne o variantă alternativă. În timp ce preponderența punctelor evidente a mecanismului de toxicitate al ARN în cazul patogenezei sindromului de neuroataxie, este indus faptul că neurotoxicitatea necesită transripție și faptul că deficiența toxică (tab 10) De îndată ce nici unul dintre aspectele clinice nu a fost observat la persoanele cu mutație completă, unde este exprimată o cantitate infimă sau lipsa proteinei FMRP, rezultă ca sindromul este cauzat de o deficiență proteică. [16] S-a estimat că 2%-4% intre bărbații cu debut tardiv al ataxiei cerebrale care reprezintă cazuri simple, au premutație în gena FMR1. (tab 6)

Diagnosticul definit al FXTAS implică prezența premutației în gena FMR1 și lezarea materiei albe la rezonanța magnetică la pendunculii cerebelari de mijloc și în trunchiul cerebral cu manifestare de tremor și ataxie.(tab 6) Aceste schimbări sunt însoțite de pierdere axonilor și a mielinii, activări semnificative subcorticale astrogliale și pierderea celulelor cerebelare Purkinje. În plus, colorația imunocitochimică a țesutului cranian al cazurilor de FXTAS post-mortem a relevat prezența incluziunilor intranucleare solitare pozitiv-ubiquitare în neuroni și astrocite în marea majoritate a regiunilor creierului, numărul incluziunilor corelând evident cu numărul de repetiții CGG. Mai mult de douăzeci de proteine au fost identificate în incluziuni. S-a cercetat și propus faptul că incluziunile cresc atât numeric cât și în dimensiune odată cu vârsta.(tab10) Alte criterii minore neuroimagistice includ leziuni ale materiei albe sau atrofie moderată a acesteia. Alte simptome sunt parkinsonismul, deficite variabile de memorie sau deficiențe cognitive (Tabelul 1.4.1). (tab 6)

Tabelul 1.4.1

Criterii mojore și minore de diagnostic

1.5.Produsul proteic al genei FMR1

Sindromul X fragil este o cauză frecventă a retardului mintal din cauza absenței proteinei FMRP – produsul de sinteză a genei FMR1.(S2) FMRP este localizată în citoplasmă, îndeplinind roluri importante în metabolismul celular al ARN. [5] Datorită splicingului alternativ rezultă patru izoforme ale proteinei FMRP prezente în citoplasmă în cazul funcționării normale a genei FMR1. (Verheij et al. (1993)).

FMRP este una dintre familiile de proteine ce leagă ARN-ul cunoscute drept ribonucleoproteine nucleare heterogene (hnRNP) care sunt implicate în diverse aspecte ale metabolismului ARNm. Unele sunt implicate în exportul ARNm din nucleu și localizarea lor subcelulară în citoplasmă. Izoformele FMRP sunt parte a unui complex larg de ribonucleoproteine mesager (mRNP) care este implicat în transportul și translarea ARNm în neuroni.

FMRP prezintă două domenii KH (K Homology), o boxă RGG (un cluster din resturi de arginină și glicină) și un terminus amino (N) ce are o afinitate înaltă pentru ARN. [6,14] Modulele KH sunt o secvență conservată evolutiv care a fost originar identificată în ribonucleoproteinele heterogene umane (hnRNP) K proteină. Domeniile KH se leagă preferențial la ARN specific, deși pot să se lege și de ADN. Boxa RGG este un domeniu de legare a ARN ce consistă din repetiții ARG-Gly-Gly. Este întâlnită în proteine hnRNP, proteine nucleare implicate în metabolismul ARN și unele proteine virale. Boxa RGG este considerată a avea un rol accesoriu în legarea ARN care promovează desfăsurarea structurii secundare a ARN. Domeniul terminal –N al FMRP deasemenea leagă ARN, dar nu este omolog la nici un ARN liant cunoscut.

Proteina FMRP leagă diferite molecule de ARNm neuronal recunoscând anumite structuri precum structura cvartet G, sau o expansiune poliuracilică. De asemenea, MRP poate lega indirect ARNm prin secvențe mici necodificatoare de ARN citoplasmatice din creier ARN1 (BC1) sau micro ARN (miARN) elF2C2, factor de inițiere a translației la eucariote ,2. [6,13]

Expresia genei în neuroni implică transportul ARNm în afara corpului celular și sinteza locală a proteinelor în dendrite. Acești doi pași sunt necesari pentru a stabiliza și a menține plasticitatea sinapsei, deasemnea sunt implicați în realizarea procesului de învățare și memorare. Dificultățile de învățare și memorare întâlnite la pacienții cu X fragil sunt probabil datorate alterării metabolismului ARN ce este important pentru structura și funcția sinapsei. [6,13,14]

FMRP participă în transportul ARNm în sinapse și localizarea sintezei proteinelor în dendrite, totuși atât proteina FMRP și ARNm a acesteia au fost identificate în dendrite, inclusiv spinii acestora. În dendrite și spini, FMRP și ARNm al FMR1 se localizează în granule, mișcarea cărora în dendrite este intensificată de activarea neuronală prin mGluRs. Astfel, FMR1 și FMRP sunt transportate în granule până la locație prin dendrite, unde translarea ARNm însoțitor este reglată de activarea sinapsei. În absența FMRP, activarea receptorului de tip glutamat – mGluR (receptor metaboglutaric) nu împiedică creșterea sintezei proteinelor în sinaptoneurosomi. [6]

Pacienții cu X fragil prezintă spini dendritici mai alungiți, mai subțiri și mai mulți spini pe o anumită poțiune de dendrită decât la persoanele sănătoase. Spinii sunt structuri dinamice care pot regula multe procese neurochimice raportate la transmisia sinaptică și la eficacitatea acesteia. Dezvoltarea și modificarea conexiunilor sinaptice implcă integrarea mecanismelor intracelulare și informației extracelulare. Sinapsele sunt regulate de proteine structurale, unele dintre care sunt sintetizate și degradate local. Astfel, spinii imaturi și dereglarea plasticității sinapselor este indusă de nesinteza proteinelor structurale modulate de FMRP, deasemenea lipsa proteinei nu permite transportul selectiv al complexului stabilizator la sinapsele active, dar și la cele inactive, în mod echitabil ceea ce provoacă o dezvoltare anormală a spinilor dendritici și crearea unei morfologii imature[6] (fig.3) , respectiv, soldându-se cu funcționarea anormală a sinapselor și reflectarea deficiențelor cognitive.

Fig.3 Morfologie anormală a spinilor dendritici

1.6. Metodele utilizate pentru depistarea SXF

Aplicarea metodelor de depistare moleculară a mutației în gena FMR1 se efectuează în dependență de obiectul cercetat: cantitatea de proteină FMRP, numărul de repetiții CGG în gena FMR1 sau metilarea promotorului genei (Tabelul 2.1). (tab 6)

Tabelul 2.1

Testarea moleculară a mutației în gena FMR1

– Reacția în lanț a polimerazei (PCR) specifică pentru regiunea repetitivă din gena FMR1. Permite depistarea numărului de repetiții, respectivă premutația sau numărul normal de repetiții (până la 120 de repetiții în dependență testul de laborator). Oricum, utilizarea metodei tradiționale de PCR este puțin efectiv în cazul mutațiilor complete, neamplificându-le.

– Analiza Southern blot detectează toate alelele genei FMR1, toate variațiile repetitive CGG, până la mutația completă și mai este sensibilă pentru detectarea statutului metilat al regiunii promotorului genei FMR1. Hipermetilare anonormală a genei FMR1 este cauză a silențiozității transcriptive și este critic pentru a evalua alelele cu premutație sau mutație. Cu toate că analiza Southern blot oferă o rezoluție mică a numărului de repetiții, totuși utilizarea atât a PCR-ului tradițional cât și Southern blot soluționează mai detaliat analiza moleculară. Ultima intervenție pentru îmbunătațirea metodei PCR permite depistarea completă a repetițiilor, scâzând necesitatea în utilizarea analizai Southern blot.

– genotiparea repetițiilor trinucleotidice AGG. Genotiparea AGG este efectuată ca un test separat pentru a determina numărul și locația intercalărilor AGG în repetițiile CGG, în FMR1. Numărul și pozițiile repetițiiilor trinucleotidice AGG sunt cunoscute xca având un rol important în stabilizarea repetițiilor CGG. Unele rezultate au raportat repetițiile de CGG neîntrerupte în secțiunea 3’ la stabilitatea acestora și reducerea riscului de extindere. Acest tip de testare este propus pentru femeile purtătoare de alele intermediare și premutaționale.

– statutul metilat poate fi evaluat prin metode bazate pe utilizarea reacției în lanț a polimerazai, totuși fără a verifica numărul repetițiilor CGG.

– analiza secvențială oferă rezultate imprecise, doar câțiva pacienți cu X fragil fiind diagnosticați prin această metodă, depistând mutația intragenică în FMR1.

– Analiza duplicațiilor/delețiilor. Mai puțin de 1% din indivizii cu X fragil au o deleție parțială sau completă a genei FMR1. Obstacolelel în amplificarea prin PCR în precedarea analizei secvențiale poate sugera existența unei deleții exonice sau a genei în întregime pe cromozomul X la ărbații afectați. Astfel, confirmarea se va face prin aplicarea analizai de duplicare/deleție. Oricum, delețiile ce nu sunt localizate în regiunea repetitivă a genei poate eșua la bărbați sau testarea clinic de rutină prin PCR pentru expansiunea trinucleotidelor CGG. Delețiile se identifică de obicei ca a doua constatare, după ce repetiția trinucleotidică a fost cercetată cu metoda Southern blot, FISH, sau altă metodă.(tab 6)

CAPITOLUL 2: MATERIALE ȘI METODE

2.1. Materialul biologic de cercetare

Lucrarea a fost efectuată în Centrul Național de Sănătate a Reproducerii și Genetică Medicală, secția științifică, timp de un an și jumătate în laboratorul molecular, secția Științifică sub conducerea doamnei Doctor în medicină Sacară Victoria.

Cercetarea a fost efectuată pe monstrele de ADN extrase din leucocitele sîngelui periferic. Studiul a vizat un contingent de 106 pacienți suspectați clinic drept suferind de sindromul X fragil,

2.2. Reactivi, enzime, biopreprate

În cercetare au fost utilizate următoarele reactive, enzime, biopreparate: ADN-polimeraza termostabilă (Dream Taq), dezoxinucleotidtrifosfați, primeri oligonucleotidici, green buffer 10X, TBE tris-borat EDTA, poliacrilamida (29:1), TEMED, PSA- persulfat de amoniu, Betaine etc.

2.3. Metode de cercetare

2.2.1 Metoda de extragere a ADN din sânge

1. Din eprubeta cu EDTA în care a fost colectat, sîngele este transferat în eprubetă sterilă de 15 ml (eprubetă de lucru).

2. Se adaugă soluție tampon Erylysis (Erylysis-Buffer) până la 15 ml, se agită ușor.

3. Probele se lasă în stativ și periodic se agită ușor până se observă o schimbare a culorii (culoare roșie metalică).

4. Se centrifughează timp de 10 minute la 4500r/min.

5. Se aruncă supernatantul, dar se păstrează „granula” (acestea sunt celulele albe din sînge).

6. Se adaugă din nou pînă la 15 ml soluție tampon Erylysis și se resuspendează ’’granula’’ de pe fundul eprubetei.

7. Probele se lasă în stativ 10 minute, aproximativ la fiecare 2 min se agită ușor.

8. Se centrifughează timp de 10 min la 4500r/min.

9. Se varsă supernatantul dar se păstreză „granula”.

10. Se adaugă din nou soluție tampon Erylysis pînă la volumul de 15 ml și ușor se resuspendă „granula” de pe fundul eprubetei.

11. Probele se lasă timp de 10 minute în stativ, la fiecare 2 min se agită ușor.

12. Se centrifughează timp de 10 min la 4500 r/min.

13. Se varsă supernatantul și se păstreză „granula”.

14. Se adaugă: 1 ml proteinaza K buffer, se dezbate „granula” , 50 μl SDS (20%), 5 μl proteinaza K (25mg/ml).

15. Se vortexează 15-20sec.

16. Probele se incubează la 37oC peste noapte.

17. Se adaugă 300 μl NaCl 5M, se agită vortexează 15 sec.

18. Se centrifughează 10 min la 4500 r/min.

19. Se transferă supernatantul într-un tub nou de 15 ml.

20. Se adaugă 4 ml de etanol 96%, se agită ușor imediat prin răsturnarea ușoară a eprubetei.

21. ADN-ul alb ”se pescuiește” cu pipeta și se transferă într-un tub de 2 ml. În timpul acestei etape se transferă cît mai puțin etanol.

22. În tubul cu ADN se adaugă 1ml etanol 70%, se centrifughează la 14.000 r/min, se decantează cît mai mult etanol posibil. ADN-ul se usucă aproximativ 15 min.

23. Se dizolvă ADN-ul în 200 μl soluție tampon TE (TE-Buffer), se dizolvă peste noapte, iar apoi se lasă în frigider la 4oC cîteva zile Apoi ADN-ul este depozitat în cutii special destinate pentru păstrarea ADN.

2.2.2 Metoda PCR (Reacție de polimerizare în lanț)

Metoda PCR permite amplificarea in vitro a unor fragmente ADN de interes, utilizând primeri specifici. Aceasta metodă a fost indrodusă în anul 1983 de Kary Mullis. Realizarea PCR se efectuează cu ajutorul ADN polimerazei (TaqPolimerase), rezistentă la temperaturi înalte, extrasă fiind din bacteria Thermus Aquaticus (bacterie extremofilă).

Ciclul de amplificare include trei etape: denaturarea, alinierea și elongarea. Denaturarea prezintă ruperea legăturilor de hidrogen dintre catenele moleculei de ADN, proces efectuat la temperatura de . Alinierea la temperatura de prezintă alipirea primerilor la catena matriță de ADN și elongarea la temperatura de , când polimeraza adaugă dNTP la capătul al primerilor.

Astfel, în fiecare ciclu are loc dublarea numarului de copii sintetizate ale sectorului ADN ales pentru amplificare, iar conținutul de ADN în soluție crește în progresie geometrică.(Fig.1)

Fig.1 Reacția de polimerizare în lanț

http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

În cercetarea curentă reacția de polimerizare în lanț a fost efectuată în microtuburi de tip Eppendorf în amplificatorul Eppendorf MastercyclerPro utilizând regimul termic:

-3min, 35 cicluri:

– 30 sec.,

– 30 sec.,

– 30 sec.,

– 5 min.

PCR mix pentru gena FMR1 s-a efectuat în 25 µl soluție de reacție cu următoarea compoziție: : H2O nucleaze-free – 6,75 μl 0.2mM de fiecare dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)(Fermentas) – 2 μl , 0.6-0.7 U DreamTaq DNA Polymerase (Fermentas) – 0,8 μl, 0.5-1 μg de ADN matriță – 1 μl, de fiecare oligonucleotid (forward primer și reverse primer) (Fermentas) – o,25 μl de fiecare primer, 2.5μl de 10X DreamTaq™ Green Buffer (Fermentas) – 2,5 μl care conține: KCl, (NH4)2SO4, Betaine (Sigma, Life Science) – 11 μl.

Secvența oligonucleotidelor utilizate pentru PCR sunt reprezentate în tabel

2.2.1.3. Metilarea ADN

Expansiunea trinucleotidelor CGG cauzează metilarea promotorului genei FMR1. Pentru a evalua statutul metilat al genei, s-a propus utilizarea reacției în lanț a plimerazei sensibilă metilării, strategie ce combină lungimea repetiției cu statutul metilat al repetițiilor CGG, promotorului genei FMR1 și al genei XIST. Metilarea alelică din urmă se opune celui al promotorului FMR și servește drept un control intern și standart pentru analizele semicantitative. Acest sistem permite conturarea a 11 paternuri diferite identificate la indivizii neafectați, purtători, la femeiile și bărbații afectați. de îndată ce promotorul genei XIST este metilat în foma activă a cromozomului X, metilarea sa alelică se opune celei ale FMR1. Prin urmare, promotorul genei XIST oferă un standart intern pentru compararea semicantitativă al raportului metilarii XIST/FMR1, care, în același timp, servește drept un control intern optimal. Combinarea metodelor de depistarea a mărimii repetiției și peternul metilat a genei FMR1 în reacții pentru evaluarea promotorului și a regiuniloor repetitive permite stabilirea diagnosticului. Pentru a distinge secvențele metilate de cele nemetilate, se ia în calcul posibilitatea conversiei citozinei în uracil prin deaminare chimică cu sodium bisulfit.(Fig.1)(articol) Incubarea ADN-ului țintă cu sodium bisulfit rezultă în conversia citozinelor nemodificate în uracil, lăsând bazele modificate intacte. Pasul cel mai critic în analiza prin metoda metilării este conversia completă a toate citozinele nemodificate. (Fig.2) Acest lucru este posibil datorită alternării ciclurilor de denaturare termală cu reacții de incubare.

Figura 1. Deaminarea Citozinei până la uracil

http://www.diagenode.com/en/catalog/dna-methylation-65/bisulfite-conversion-70/product/magbisulfite-kit-2237

Figura 2. Citozinele metilate sunt protejate și rămân neschimbate, în timp ce celelalte nemetilate sunt deaminate până la uracil după tratamentul cu sodium bisulfit.

EpiMark Bisulfite Conversion Kit

Prepararea reagentului

Metoda de conversie bisulfidică s-a efectuat conform procolului din manualul de instrucțiune "EpiMark Bisulfite Conversion Kit", utilzând ADN extras din leucocitele sângelui periferic, prin metoda explicată mai sus, a 20 pacienți suspecți pentru X fragil.

Prepararea mixului bisulfit se efectuează adăugând 650 μl de H2O (nuclease-free water) și 250 μl de Solubilization Buffer la sodium metabisulfit în stare solidă, în tucul prevăzut. Se vortexează până la dizolvarea completă a mixului bisulfit, de obicei între 2 și 5 minute. Dacă unele particole albe nu sunt complet dizolvate , se încălzește soluția la temperatura de 55o-60oC timp de câteva minute și se vortexează.

Reacția de conversie bisulfidică – pasul I

Se mixează prin pipetare.

Reacția de conversie bisulfidică – pasul II

Tuburile de reacție dunt transferate în termociclu și se începe ciclu:

Reacția de desufonare și curățarea probelor – pasul III

După completare reacției de conversie, se transferă mixul reacției în tuburi de 1,5 ml, se adaugă 550 μl de ADN Binding Buffer și se mixează petru o perioadă scurtă de timp.

Se încarcă toată proba într-o coloană de spin, având atașat un tub de colectare de 2 ml. Se centrifugheză coloanele la 15.000 rotații pentru 1 minut și se arungă lichidul.

Se adaugă 500 μl de Wash Buffer, după care se centrifughează coloanele la 15.000 rotații pentru 1 minut și se aruncă lichidul.

Se adaugă 500 μl de Buffer e eacție pentru desulfonare (Desulphonation Reaction Buffer) în fiecare coloană și se incubează la temperatura camerei (18-20oC) pentru 15 minute. Se pune capacul coloanelor pe perioada de incubație.

Se centrfughează coloanele la 15.000 rotații timp de 1 minut și se aruncă lichidul.

Se adaugă 500 μl de Wash Buffer, se centrifughează coloanele la 15.000 rotații pentru 1 minut și se aruncă lichidul. Se repetă procedura de spălare.

Se centrifughează coloanele la 15.000 rotații pentru 1 minut și se îndepărtează Wash Buffer-ul din coloane.

Coloanele de spin se plasează în tuburi sterile de 1,5 ml. Se adaugă 20 μl de Ellution Buffer, se incubează pentru 1 minut și se centrifughează la 15.000 rotații pentru 1 minut. Se adaugă adițional 20 μl de Elution Buffer și se rotește din nou pentru 30 secunde la 15.000 rotații.

ADN-ul este pregatit pentru efectuarea analizei de metilare prin PCR.(protocol)

Reactivii utilizați pentru PCR …

2.2.3 Vizualizarea probelor în gel

Pentru separarea fragmentelor de ADN de diferită lungime s-a utilizat electroforeza în gel de poliacrilamidă în cameră verticală de lungimea 20-25cm.

În cercetare preparăm gelul folosind bufferul 10XTris-Borat-EDTA (TBE) cu următoarea compoziție: 0.89M tris-aminometan, 0.89M H3BO3, 0.02M EDTA, pH 8.0 cu adăugarea a soluției de 30% Acrilamid/Bisacrilamid (29:1), 10% (NH4)2S2O8 și TEMED. În cercetare am utilizat gel de poliacrilamidă de 7.5% de lungimea 20cm, iar în calitate de buffer am folosit 10xTBE.

În buzunărașele gelului introducem probele de ADN (9 µl). În același gel introducem și markerul masei moleculare (Marker molecular leader 100 pb). ADN, fiind încărcat negativ, migrează spre polul pozitiv situat la celălalt capăt al gelului.

CAPITOLUL 3: REZULTATE ȘI CONCLUZII

3.1. Analiza rezultatelor în urma aplicării metodei PCR petru depistarea mutației

Identificarea frecvenței mutațiilor genei FMR1 la pacienții bolnavi de retard mental.

A fost efectuată cercetarea frecvenței mutației la nivelul genei FMR1 a unui grup de 106 de pacienți, etnici modoveni, diagnosticați cu retard mental.

În urma vizualizării electroforegramei am identificat persoanele purtătoare de mutație. Astfel, prezența în electroforeză a fragmentelor amplificate indică n<30, în cazul absenței fragmentului, n> repetițiilor CGG, adică prezența mutației. (Fig.3.1)

Fig.3.1 Electroforegrama analizei polimorfismului genei FMR1: M – marker molecular leader 100pb; 1 – mutant (probă control), n>30; 2,3,4 – sănătoși, n<30.

Astfel, din 106 pacienți cercetați, 3 au fost depistați cu mutație completă, respectiv frecvența de 2, 83%

3.3. Profilul clinic al FXS. Profilaxie.

Simptomele sindromului X fragil în copilărie nu sunt înalt nespecifice cu întârziere în dezvoltare ce se întâlnește la toți indivizii afectați. Toți copii ce manifestă probleme în vorbire, liimbaj sau subdezvoltare motorie de orice natură, trebuie de investigat petru sindromul X fragil, în special dacă sunt identificate antecedente în familie de dizabilitate intelectuală, perturbări fizice și de comportament. Testarea mleculară a sindromului într-un anumit grup de bărbați cu profil autist, prevalența sindromului este relativ redusă (3%-6%).

Deoarece anormalitățile citogenetice au fost identificate la fel de frecvent sau mai frecvent decât mutațiile în FMR1 în cazul tulburărilor de dezvoltare sau intelectuale referitoare la testarea pentru FXS, ar trebui aplicată analiza cromozomală ca parte componentă din testarea în laborator. (tab 6)

În cazul bărbatului adult, expansiunea trinucleotidică este asociată cu un retard mental sever sau moderat, fața alungită cu urechi mari și macroorhidie. Oricum, 40% dintre pacienți nu prezintă manifestările fenotipice sus-menționate. În 10% din cazuri, există un retard mental moderat, macroorhidie făra dismorfie și în 25-30% din cazuri, macroorhidia este absentă. Uneori, retardul mental poate fi unica simptomă. [1,3]

În cazul băieților, simptomele sunt cu mult mai puțin specifice și dismorfia facială poate fi absentă sau atipică. Având o vârstă de 5 ani, diagnoza poate fi evocată potrivit unei dereglări de limbaj, o deficiență psihomotorie sau tulburări de comportament. Între vârsta de 5-10 ani, dereglări de vorbire sunt predominante, asociate tulburărilor de atenție, un comportament hiperkinetic (60%) și simtome de autism (30%). Acești copii sunt deseori agresivi, prezintă o stare de anxietate. În general, toate simptomele clinice sunt inconstante și nici unul nu este patognomonic. Coeficientul de inteligență al baieților este în declin o dată cu înaintarea în vârstă. [9]

Tabelul 2 redă unele simtome ale bolii, care însă sunt relative în dependență de bolnavi, specificitatea acestora variază în limite foarte largi, de la fenotipuri aparent normale la forme severe, dar care nu realizează niciodată tablouri clinice complete. Rezultatele înregistrate la testul de inteligență de cele mai multe ori prezintă cazuri cu deficit intelectual moderat (IQ: 50-70), fiind și bolnavi cu handicap sever (IQ: 20), precum și cazuri situate la limita inferioară a normalului. Comportamentul anormal generează dificultăți mai mari în educarea copiilor decât deficiența intelectuală, din care cauză este necesară asistență medicală. [5]

Tabelul 2

Fenotipul X fragil la bărbați

În cazul femeilor, expresia clinică este foarte variabilă și apare doar în cazul unei mutații complete. Femeile heterozigote prezintă o simtomatologie mai redusă decât în cazul bărbaților hemizigoți din cauza că dintre cei doi cromozomi X, unul este inactivat prin lyonizare: dat fiind caracterul aleatoriu al lyonizării, în 50% dintre celule cromozomul X activ transcripțional este cel purtător al alelei normale. Prin produsul ei proteic, suplinește parțial sintetizarea proteinei FMRP. [5] Dintre femeile femeile purtătoare de mutație completă:

40% sunt normale

60% prezintă un retard psihomotor lejer până la moderat (IQ: 55-75- doar în 30% din cazuri, restul sunt aparent normale), probleme de atenție și o coordonare spațială, tulburări de de comportament și de relații sociale.

Diagnosticul, deasemenea este dificil de stabil doar după fenotip. [9]

Până în prezent nu au fost identificate homozigote pentru mutația respectivă, modificările heterozigotelor fiind menționate mai sus. Pe lângă acestea, mai rar se întâlnesc distrofii craniofaciale asemănătoare cu cele observate la bărbații afectați, precum și semne geneate de displazia țesutului conjunctiv. Intensitatea exprimării acestor seme se corelează cu gradul deficitului intelectual. [5]

Premutațiile se găsesc la bărbații transmițători normali și la majoritatea femeilor purtătoare fără retard mental. [1,5] Potrivit idelor expuse în „Genetică medicală” de Sandovici, majoritatea indivizilor cu premutație au inteligență normală, barbații fiind predispuși la probleme de atenție, disfuncții executive, deficite sociale și comportament obsesiv – compulsiv. Circa 20% dintre femeile purtătoare de premutație prezintă menopauză precoce (înainte de 40 de ani), deasemenea, chiar dacă au ciclu menstrual au nivel crescut de FSH comparativ cu femeile sănătoase, iar cele cu CGG>70 au nivele scăzute de hormon anti-mullerian. Penetranța și vârsta de debut a insuficienței ovariene primare, ca și creșterea nivelelor de FSH se corelează non-liniar cu lungimea repetiției CGG (expansiunile mai mari sunt asociate cu un risc mai mic).

Unele dintre femeile cu premutație și peste 1/3 dintre bărbații cu premutaii pot prezenta un sindrom de neurodegenerare progresivă cu ataxie cerebeloasă și tremor intențional (FXTAS) care debutează la 50-60 de ani și este caracterizat prin deficite de memorie, manifestări parkinsoniene, reducerea sensibilității la nivelul exremităților inferioare, ataxie și atrofie cerebrală. Acest fenotip este clinic și neuropatologic complet de diferit de FXS, fiind rezultatul unui câștig de funcție, întrucât bărbații cu premutații prezintă o creștere a nivelului de transcripție a FMR1. nivelul final de FMRP este aproape normal și se pare că tabloul clinic înregistrat la persoanele cu premutație se datorează toxicității induse de nivelul crescut de ARNm. Luând în considerare prevalența alelelor cu pemutații în populația generală, s-a estimat că 1/3.000 de bărbați peste 50 de ani din populația generală vor dezvolta simptome de FXTAS. Se pare că penetranța crește direct proporțional cu vârsta și cu lungimea CGG.

Pentru a stabili nivelul de afectarea a individului diagnosticat cu SXF, este recomantat de a evalua gradul de dezvoltare și educație posibilă, incluzând evaluarea limbajului și vorbirii pentru planificarea educațională; evaluarea comportamentală și psihologică pentru a determina prezența și intensitatea dereglărilor de concentrare, atenție, anxietate, dereglări obsesiv-convulsive, agresie și depresie; la copii se va evalua posibilitatea refluxului gastroesofagian; examinare fizică pentru a evalua hipotonia, și starea articulațiilor; se va efectua examen cardiac pentru evaluarea prezenței prolapsului de valvă mitrală; evaluare pentru hipertensiune; existența accesurilor epileptice, evaluare oftalmologică pentru posibil strabism;

În cazul bolnavilor de FXTAS este recomandat de a examina profilul eurologic; evaluarea psihologică și comportamentală; evaluarea neuroradiologică.

Pentru diagnosticul cu POI, este necesară evaluarea ginecolocică, inclusiv cea hormonală și ultrasonografică. (tab 6)

Cunoscând aspectul clinic și molecular-genetic, pot fi aplicate unele metode de ameliorare fenotipică a maladiei. Intervenție psihofarmacologică asociată cu terapie ocupațională de integrare senzorială, tratament logopedic și educație specială. Copii ce suferă de sindrom au nevoie de atenție specială, evitarea stimulării excesive pentru a ameliora dificultățile de comportament. (tab 6)

Cercetările recente pentru descoperirea unor ține terapeutice sunt direcționate pe patogenia bolii și rolurile FMRP. Stabilirea faptului că FMRP funcționează prin fixarea pe diferite molecule de ARNm și că multe simptome sunt produse probabil prin activarea mGluR5, folosirea unor blocanți pentru acest receptor ar putea fi o soluție terapeutică. [1]

Dozele mari de acid folic diminuează procentul cromozomilor X markeri și ameliorează comportamentul persoanelor blnave, diminuează hiperactivitatea, diminuează activitatea motorie, atenuează tulburările de limbaj. După încetarea tratamentuli, incidența celulelor cu cromozom X marker crește din nou, tratamentul poate fi continuat foarte mult timp.

O altă metodă de profilaxie este modificarea mediului, dat fiind că mai multe tulburări ereditare se dezvoltă în condiții de mediu particulare. Farmacogenetica ilustrează elocvent interrelația dinte ereditate și mediu. Modificarea mediului înseamnă evitarea factorilor favorizanți. [4]

Pentru FXPOI nu este disponibil nici un tratament specific. Este posibil de evaluat starea ginecologică și endocrinologică, conform căreia poate fi elaborat un tratament terapeutic și sfaturi genetice pentru opțiuni de reproducere.

În cazul FXTAS, deasemenea nu se menționează un tratament adecvat. Ameliorarea simptomelor în legătură cu mersul sau deficiențele cognitive, poate solicita asistență pentru viața de zi cu zi.

Concluzii

Studiul literaturii a elucidat că sindromul X fragil este o cauză frecventă a retardului mental. Frecvența premutațiilor în populație este mai redusă. Transformarea premutației în mutație completă se efectuează exclusiv pe cale maternă în procesul ovogenezei. Riscul formării acestea depinde de dimensiunea fragmentului premutațional. Deasemenea, în procesul ovogenezei poate avea loc convertirea mutației în premutație. Identificarea sindromului permite efectuarea profilaxiei ce va diminua caracterul insuficientei intelectuale, deasemenea pacienții purtători de mutație necesită o ngrijire deosebită, dat fiind faptul că manifestarea sindromului este reflectată pe lângă sistemul nervos central și asupra sistemului circulator, locomotor, reproductiv. Astfel, bolnavilor li se acordă sfat genetic în dependență de gradul de intensitate a sindromului.

În cercetarea efectuată, am observat că manifestarea retardului mental datorat sindromului X fragil este identificat cu o frecvență redusă în grupul de cercetare din populația Republicii Moldova, rata mutațiilor fiind de 2,83%.

Pe viitor se intentează introducerea metodei metilării regiunii promotorului genei FMR1 pentru depistarea mai precisă a sindromului. Analiza corectă molecular-genetică va face posibilă implementarea acesteia în practica medicală de rutină și, pe viitor, efectuarea screening-ului prenatal.

Bibliografie

C. Maximilian, Doina Maria Ioan. Genetica medicală. București. Editura medicală, 1986. 512p.

Dragoș T. Ștefănescu, George A Căln, Fulvia C. Ștefănescu. Genetică medicală progrese recente. București. Editura Tehnică, 1998. 192 p.

Ion Rogoz, Ludmila Perciuleac. Genetică Umană. Chișinău. Cardidact, 2002. 273p.

Marius Bembea et alii. Genetică medicală și clinică. Oradea. Editura Universității din Oradea, 2000. 240 p.

Mircea Covic, Dragoș Ștefănnescu, Ionel Sandovici. Genetică medicală. București. Polirom, 2011. 712 p.

Ruxanda Achim, Gabriela Anton et alii. Genomica, un tratat despre genom, de la virusuri la om, Vol.I. București. Editura Enciclopedică, 2003.

Andreas Weinhausel, Oskar A Hass. Evaluation of the fragile X (FRAXA) syndrome with methylationn-sensitive PCR. Human Genetics, 2001.

Bob Weinhold. Epigenetics: the science of change. Environmental health perspectives, 2006.

Claudia Bagni William T. Greenough. From mRNP trafficking to spine dysmorphogenesis: the roots of fragile X syndrome. Nature Publishing Group, May, 2005.

Cuiling Lu et alii. Fragile X premutation RNA is sufficient to cause primary ovarian insufficiency in mice. Human Molecular Genetics, 2012.

Danielle Simmons. Epigenetic influences and disease. Nature Education, 2008.

Dayir I Pretto et alii. CGG allele size somatic mosaicism and methylation in FMR1 premutation alleles. Journal of Medical Genetics, 2013.

Dolores Garcia-Arocena et alii. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics, 2010.

Dana C Crawford et alii. FMR1 and the fragile X syndrome: Human genome epidemiology review. Genetics in Medicine, 2001

Derek E. Eberhart, Henry E. Malter et alii. The fragile X mental retardation protein is a ribonucleoprotein containing both nuclear lacalization and nuclear export signals. Human Molecular Genetics, 1996.

Davis E. Godler, Yoshimi Inaba et alii. Relationships between age and epi-genotype of the FMR1 exon 1/intron 1 boundary are consistent with non-random X-chromosome inactivation in FM individuals, with the selection for the unmethylated state being most significant between birth and puberty. Human Molecular Genetics, Vol. 22, 2013.

David Eugeny Godler, Flora Tassone et alii. Methylation of novell markers of fragile X alleles is inversely correlated with FMRP expression and FMR1 activation ratio. Human Molecular Genetics, Vol. 19, No. 8, 2010.

David E. Godler et alii. Fragile X mental retrdation 1 intron 1 methylation in in blood predicts verbal cognitive impairment in female carriers of expanded FMR1 alleles: evidence from a pilor study. Molecular Diagnosis and Genetics, 2012.

E. Flori, B. Doray. Syndrome de l’X- Fragile. Faculte de Medicine de Strasbourg – Item 31. Mars 2004.

Elisabetta Tabolacci, Pietro Chiurazzy. Epigenetics, fragile X syndrome and transcriptional therapy. American Journal of Medical Genetics Part A, 2013.

Francesca Zalfa et alii. Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) Binds Specifically to the Brain Cytoplasmic RNAs BC1/BC200 via a Novel RNA-binding Motif. The Journal of Biological Chemistry, 280, July, 2005. http://www.jbc.org/content/280/39/33403.long

Flora Tassone et alii. A rapid polymerase chain reaction-based screening method for identification of all expnded alleles of the fragile X (FMR1) gene in newborn and high-risk populations. Jurnal of Molecular Diagnotics, Vol 10. January 2008

Grant R. Sutherland, Robert I. Richards. Simple tandem DNA repeats and human genetic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 3636-3641, April 1995

Ingeborg Blancquaert, Lorraine Caron. Le syndrome de l’X fragile: la place du diagnostic moleculaire et du depistage dans une approche integree des services. Montreal. AETMIS, 2001. 191p.

Jean-Pierre Issa. Epigenetic Variation and Human Disease. The journal of nutrition, 2002.

Judith Rixt Brower. The Molecular Basis of FXTAS. Erasmus Universiteit Rotterdam, 2008. 180 p.

Kimberly M. Huber, Sean M. Gallagher et alii. Altered synaptic plasticity in a mouse model of fragile X mental retardation. PNAS, 2002. www.pnas.org/content/99/11/7746.long

Luca Persani et alii. Genes involved in human premature ovarian failure. Journal of Molecular Endocrinology, 2010.

M. Mila, S. Castellvi-bel et alii. Mosaicism for the fragile X syndrome full mutation and deletions within the CGG repeat of the FMR1 gene. Journal of Molecular Genetics, 1996.

National fragile X foundation. FXPOI. http://www.fragilex.org/fragile-x-associated-disorders/fxpoi/

National fragile X foundation. FXTAS. http://www.fragilex.org/fragile-x-associated-disorders/fxtas/

Peter K. Todd, Kenneth J. Mack et alii. The fragileX mental retardation protein is required for type-I metabotropic glutamate receptor-dependent translation of PDS-95. PNAS, 2003. www.pnas.org/content/100/24/143.full

Peng Jin, Stephen T. Warren. Understanding the molecular basis of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics, 2000.

Robert A Saul et alii. FMR1-Related disorders. GeneReviews, 2012. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1384

Stela Filipovic-Sadic et alii. A novel FMR1 PCR method for the routine detection of low abundance expanded alleles and full mutations in fragile X syndrome. Molecular Diagnosis and Genetics, Vol. 9, 2010.

Steven D. Sheridan et alii. Epigenetic characterisation of the FMR1 gene and aberrant neurodevelopment in human induced pluripotent stem cell models of fragile X syndrome. PLOS ONE, 2011.

Zhenzhong Li et alii. The fragile X mental retardation protein inhibits translation via interacting with mRNA. Nucleic Acids Research, 2001 http://nar.oxfordjournals.org/content/29/11/2276.full

Ефимова О.А., Пендина А.А. Метилирование ДНК – основнои механизм репрограммирования и регуляции генома человека. Медицинская генетика, 2012.

Bibliografie

C. Maximilian, Doina Maria Ioan. Genetica medicală. București. Editura medicală, 1986. 512p.

Dragoș T. Ștefănescu, George A Căln, Fulvia C. Ștefănescu. Genetică medicală progrese recente. București. Editura Tehnică, 1998. 192 p.

Ion Rogoz, Ludmila Perciuleac. Genetică Umană. Chișinău. Cardidact, 2002. 273p.

Marius Bembea et alii. Genetică medicală și clinică. Oradea. Editura Universității din Oradea, 2000. 240 p.

Mircea Covic, Dragoș Ștefănnescu, Ionel Sandovici. Genetică medicală. București. Polirom, 2011. 712 p.

Ruxanda Achim, Gabriela Anton et alii. Genomica, un tratat despre genom, de la virusuri la om, Vol.I. București. Editura Enciclopedică, 2003.

Andreas Weinhausel, Oskar A Hass. Evaluation of the fragile X (FRAXA) syndrome with methylationn-sensitive PCR. Human Genetics, 2001.

Bob Weinhold. Epigenetics: the science of change. Environmental health perspectives, 2006.

Claudia Bagni William T. Greenough. From mRNP trafficking to spine dysmorphogenesis: the roots of fragile X syndrome. Nature Publishing Group, May, 2005.

Cuiling Lu et alii. Fragile X premutation RNA is sufficient to cause primary ovarian insufficiency in mice. Human Molecular Genetics, 2012.

Danielle Simmons. Epigenetic influences and disease. Nature Education, 2008.

Dayir I Pretto et alii. CGG allele size somatic mosaicism and methylation in FMR1 premutation alleles. Journal of Medical Genetics, 2013.

Dolores Garcia-Arocena et alii. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics, 2010.

Dana C Crawford et alii. FMR1 and the fragile X syndrome: Human genome epidemiology review. Genetics in Medicine, 2001

Derek E. Eberhart, Henry E. Malter et alii. The fragile X mental retardation protein is a ribonucleoprotein containing both nuclear lacalization and nuclear export signals. Human Molecular Genetics, 1996.

Davis E. Godler, Yoshimi Inaba et alii. Relationships between age and epi-genotype of the FMR1 exon 1/intron 1 boundary are consistent with non-random X-chromosome inactivation in FM individuals, with the selection for the unmethylated state being most significant between birth and puberty. Human Molecular Genetics, Vol. 22, 2013.

David Eugeny Godler, Flora Tassone et alii. Methylation of novell markers of fragile X alleles is inversely correlated with FMRP expression and FMR1 activation ratio. Human Molecular Genetics, Vol. 19, No. 8, 2010.

David E. Godler et alii. Fragile X mental retrdation 1 intron 1 methylation in in blood predicts verbal cognitive impairment in female carriers of expanded FMR1 alleles: evidence from a pilor study. Molecular Diagnosis and Genetics, 2012.

E. Flori, B. Doray. Syndrome de l’X- Fragile. Faculte de Medicine de Strasbourg – Item 31. Mars 2004.

Elisabetta Tabolacci, Pietro Chiurazzy. Epigenetics, fragile X syndrome and transcriptional therapy. American Journal of Medical Genetics Part A, 2013.

Francesca Zalfa et alii. Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) Binds Specifically to the Brain Cytoplasmic RNAs BC1/BC200 via a Novel RNA-binding Motif. The Journal of Biological Chemistry, 280, July, 2005. http://www.jbc.org/content/280/39/33403.long

Flora Tassone et alii. A rapid polymerase chain reaction-based screening method for identification of all expnded alleles of the fragile X (FMR1) gene in newborn and high-risk populations. Jurnal of Molecular Diagnotics, Vol 10. January 2008

Grant R. Sutherland, Robert I. Richards. Simple tandem DNA repeats and human genetic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 3636-3641, April 1995

Ingeborg Blancquaert, Lorraine Caron. Le syndrome de l’X fragile: la place du diagnostic moleculaire et du depistage dans une approche integree des services. Montreal. AETMIS, 2001. 191p.

Jean-Pierre Issa. Epigenetic Variation and Human Disease. The journal of nutrition, 2002.

Judith Rixt Brower. The Molecular Basis of FXTAS. Erasmus Universiteit Rotterdam, 2008. 180 p.

Kimberly M. Huber, Sean M. Gallagher et alii. Altered synaptic plasticity in a mouse model of fragile X mental retardation. PNAS, 2002. www.pnas.org/content/99/11/7746.long

Luca Persani et alii. Genes involved in human premature ovarian failure. Journal of Molecular Endocrinology, 2010.

M. Mila, S. Castellvi-bel et alii. Mosaicism for the fragile X syndrome full mutation and deletions within the CGG repeat of the FMR1 gene. Journal of Molecular Genetics, 1996.

National fragile X foundation. FXPOI. http://www.fragilex.org/fragile-x-associated-disorders/fxpoi/

National fragile X foundation. FXTAS. http://www.fragilex.org/fragile-x-associated-disorders/fxtas/

Peter K. Todd, Kenneth J. Mack et alii. The fragileX mental retardation protein is required for type-I metabotropic glutamate receptor-dependent translation of PDS-95. PNAS, 2003. www.pnas.org/content/100/24/143.full

Peng Jin, Stephen T. Warren. Understanding the molecular basis of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics, 2000.

Robert A Saul et alii. FMR1-Related disorders. GeneReviews, 2012. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1384

Stela Filipovic-Sadic et alii. A novel FMR1 PCR method for the routine detection of low abundance expanded alleles and full mutations in fragile X syndrome. Molecular Diagnosis and Genetics, Vol. 9, 2010.

Steven D. Sheridan et alii. Epigenetic characterisation of the FMR1 gene and aberrant neurodevelopment in human induced pluripotent stem cell models of fragile X syndrome. PLOS ONE, 2011.

Zhenzhong Li et alii. The fragile X mental retardation protein inhibits translation via interacting with mRNA. Nucleic Acids Research, 2001 http://nar.oxfordjournals.org/content/29/11/2276.full

Ефимова О.А., Пендина А.А. Метилирование ДНК – основнои механизм репрограммирования и регуляции генома человека. Медицинская генетика, 2012.