Rezistenta Si Toleranta In Biofilm

Rezistență și toleranță în biofilm

Descoperirea vaccinurilor și a antibioticelor a condus la tratarea afecțiunilor microbiene acute (exceptând cazurile de infecție cu tulpini rezistente la antibiotice), însă tratamentul implică în special biofilmele microbiene și în mai mică măsură biofilmele bacteriene.

Cu ajutorul microscopului electronic s-a putut observa prezența biofilmelor bacteriene pe suprafața exterioară a dispozitivelor medicale, pe țesuturile ce fuseseră prelevate de la pacienți având infecții cronice neasociate unor dispozitive medicale, bacteriile fiind înglobate într-o matrice foemată din polizaharide extracelulare. În cazul infecțiilor cauzate de biofilmele bacteriene, pot fi implicate una sau chiar mai multe specii bacteriene ori fungice (Tabelul 1).

Tabelul 1. Infecții asociate biofilmelor pe țesuturi vii

Biofilmele bacteriene au capacitatea de a se dezvolta în mod preferențial pe suprafețele inerte ori pe țesuturile moarte și uneori pe dispozitivele medicale, inclusiv pe cele implanto-protetice (Tabelul 2).

Tabelul 2. Infecțiile asociate biofilmelor pe dispozitivele medicale

Celulele bacteriene sesile au abilitatea de a elibera antigene și de a stimula producerea anticorpilor, însă acești anticorpi nu sunt eficienți în ceea ce privește recunoșterea și îndepărtarea bacteriilor existente în biofilm și pot determina formarea unor complexe imune, punerea în funcțiune a sistemului complement local și producerea unor leziuni pe țesuturile integre.

Chiar și în cazul persoanelor imunocompetente, infecțiile produse de biofilmele microbiene sunt foarte rar „rezolvate” de către mecanismele de apărare ale gazdei. Terapia prin antibiotice reduce simptomele produse de către celulele planctonice eliberate din cadrul biofilmului microbian, însă nu reușește să distrugă sau să elimine biofilmul în totalitate (reușește în majoritatea cazurilor doar o dezorganizare a biofilmului microbian), și din aceste considerente, infecțiile asociate biofilmelor microbiene au o tendință de cronicizare, prezentând simptome recurente chiar după câteva cicluri de terapie cu antibiotice, până în momentul în care populația bacteriană sesilă este complet îndepărtată- în mod chirurgical din organism.

Chimioterapia antibacteriană folosită, de exemplu, în afecțiunile parodonțiului marginal, atinge 4 obiective, și anume:

Stopează multiplicarea sau produce distrugerea florei microbiene patogene;

Diminuează semnificativ rata de recurență a infecției ;

previne generalizarea sistemică a infecției în faza acută ;

își adduce aportul la refacerea echilibrului microbian normal existet în cavitatea orală.

Pentru a fi cât mai eficientă, chimioterapia antimicrobiană trebuie neapărat asociată de controlul plăcii bacteriene și cu măsuri de înlăturare a acesteia împreu cu igienizarea locală.

Diferit de celula microbiană liberă, o celulă care este inclusă în biofilmul microbian beneficiază de apărarea oferită de bariera de difuzie exercitată de matricea, și/sau de creșterea foarte lentă a celulei datorată sărăciei de nutrienți existentă în profunzimea biofilmului, fapt care întârzie pătrunderea antibioticului, și în acest mod este posibil ca celulele din cadrul biofilmului să acumuleze în matrice anumite enzime detoxifiante, care sunt capabile să raspundă acțiunii agenților antimicrobieni prin intermediul distrugerii celulelor planctonice.

Celulele care sunt incluse în biofilmul microbian prezintă o puternică rezistență la antibiotice, fapt care conduce la existența unor subpopulații de supraviețuitori ai populației microbiene a biofilmului într-o proporție relativ mică, însă aceste câteva celule supraviețuitore vor iniția o stare de maximă protecție, asemănătoare în mare măsură cu cea a sporilor.

Diferența existent între comunitățile planctonice și cele integrate ale biofilmului microbian, constă în faptul că frecvența supraviețuitorilor este cu mult mai mare la microorganismele biofilmului.

Ipoteza acestor supraviețuitori a fost demonstrată prin efectuarea unor măsuratori ale distrugerii bifazice din biofilmele microbiene în cadrul cărora cea mai mare parte a populației microbiene este eliminată rapid, însă rămâne o fracție din celule care nu este atinsă nici măcar după un tratament prelungit cu diverse antibiotice.

Faptul că bacteriile biofilmului microbian au capacitatea de a manifesta o susceptibilitate foarte redusă la antibioterapie, cunoscută sub denumirea de rezistență fenotipică comportamentală chiar și în cazul biofilmelor puțin dezvoltate, poate fi explicat doar prin intermediul acestor supraviețuitori.

Penetrarea mult mai redusă a antibioticelor care are loc la nivelul biofilmelor microbiene, din cauza unuia sau poate a mai multor factori este insuficientă pentru a putea explica rezistența bacteriilor agregate. Dintr-un alt punct de vedere însă, proprietățile fizico-chimice și cele farmacologice ale unui antibiotic nu garantează în niciun fel pătrunderea sa în biofilmul microbian.

Pătrunderea antibioticului în profunzimea biofilmului microbian se poate întârzia destul de mult, în momentul în care el este inactivat pe cale enzimatică ori sechestrat prin legare, cum este cazul atunci când difuzează în biofilm (matricea deține proprietățile unei rășini schimbătoare de ioni).

O asemenea interrelație reacție-difuzie este oarecum suficientă pentru a putea împiedica penetrarea unui antibiotic de tipul penicilinei într-un biofilm format din bacterii β-lactamaza.

În cea mai mare parte a cazurilor s-a demonstrat prin teste experimentale în vitro, că neutralizarea ori adsorbția antibioticelor nu este una suficient de rapidă și că antibioticele capătă astfel abilitatea de a pătrunde în biofilm.

Au fost observate de asemenea pătrunderi semnificativ limitate în interiorul biofilmului microbian numai pentru antibioticele β-lactamice si aminoglicozide. În momentul în care antibioticul pătrunde lent în biofilmul microbian, toate enzimele care inactivează ori modifică antibioticul capătă un rol decisiv.

Aceste enzime sunt β-lactamazele, enzimele pentru modificare ale aminoglicozidelor, cloramfenicolului, acetiltransferazele.

În marea majoritate a exemplelor în care s-a demonstrat pătrunderea efectivă a antibioticelor, a fost de asemenea raportată o supraviețuire a microorganismului respectiv, fapt ce dovedește că atunci când pătrunderea antibioticului în interiorul biofilmului reușește, mecanismele de protecție par a fi cumva pregătite.

Procesul prin care are loc aderența microbiană “in vitro” este influențat de o mulțime de factori dependenți de substrat,printer care se numără: structura fizico-chimică, hidrofobicitatea, energia existent la suprafață, celula bacteriană (virulența și hidrofobicitatea suprafeței celulare), mediul (compoziția și pH-ul mediului de cultură).

În scopul prevenirii acestor infecții, se încearcă diminuarea capacității de aderare a microorganismelor la anumite suprafețe prin reducerea porozității acesteia și prin realizarea unor materiale care să fie din ce în ce mai biocompetente.

Pentru a putea identifica tulpinile microbiene din cadrul biofilmelor implicate în etiologia anumitor infecții ale cavității orale este foarte necesară efectuarea unor studii aprofundate în ceea ce privește mecanismele de formare a biofilmelor în cadrul plăcii bacteriene pe suprafețele dentare sau pe dispozitivele de reabilitare implanto-protetică, este foarte necesară stabilirea prin studii diverse experimentale, a dinamicii de apariție a acestor biofilme dentare, a structurii și a caracteristicilor fizico-chimice proprii diferitelor materiale de restaurare, cât și a speciilor microbiene colonizatoare, fiind extreme de utilă determinarea rezistenței acestora la diverse antibiotice.

Staphylococcus aureus și Pseudomona aeruginosa

Staphylococcus aureus și Pseudomona aeruginosa sunt două dintre bacteriile cele mai frecvent izolate din infecțiile nosocomiale, fiind patogeni oportuniști responsabili de infecții severe la pacienții imunocompromiși.

Fig… Stafilococus aureus și Pseudomona aeruginosa. Sursa: http://eyemicrobiology.upmc.com/PhotoGalleryBiofilms.html

Emergența tulpinilor de Stafilococus aureus și Pseudomona aeruginosa multirezistente la antibiotice determină dezvoltarea de noi strategii pentru înțelegerea mecanismelor utilizate de către aceste bacterii în diferite faze ale procesului infecțios în scopul realizării unui control mai eficient al infecțiilor determinate de aceste bacterii.

Staphylococcus aureus și Pseudomona aeruginosa realizează o expresie coordonată a anumitor factori de virulență ca răspuns la contactul cu celulele eucariote ale gazdei sensibile, rezultatul interacțiunilor bacterie-gazdă fiind influențat de densitatea celulară și reglat prin QS, sistem de semnalizare chimică implicat în reglarea unor procese fiziologice extrem de variate dependente de densitatea celulară (bioluminiscența, sinteza de factori de virulență, sporulare, transfer plasmidic).

Unul dintre cele mai importante roluri ale mecanismelor de QS, atât la bacteriile Gram-negative, cât și la cele Grampozitive este reprezentat de reglarea expresiei coordonate a factorilor de virulență și evitarea mecanismelor de apărare antiinfecțioase ale gazdei.

Tratamentele tradiționale ale bolilor infecțioase bazate pe compuși cu acțiune microbicidă sau microbiostatică au condus, datorită suprautilizării, la selectarea și emergența fenomenelor de rezistență și multirezistență la antibiotice.

Descoperirea sistemelor de QS, a permis deschiderea unor noi perspective de tratament și prevenire a infecțiilor bacteriene, prin găsirea unor blocanți ai mecanismului de QS bacterian, reprezentați de compuși naturali sau obținuți prin sinteza chimică.

Staphylococcus aureus este un patogen important, mai ales ca urmare a emergenței în întreaga lume a tulpinilor care sunt rezistente la toate antibioticele utilizate în clinică (tulpinile MRSA, VRSA – meticillin – and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus).

Având în vedere importanța și incidența înaltă a infecțiilor invazive cu S. aureus meticilino-rezistent (33,3% în 2008) (date furnizate prin participarea a 35 de spitale din țară la rețeaua europeană EARSS-(European Antimicrobial Resistance Surveillance System) (www.earss.rivm.nl ), găsirea unor noi strategii terapeutice pentru infecțiile stafilococcice reprezintă o prioritate și la nivel național.

Pseudomona aeruginosa reprezintă în România unul dintre agenții oportuniști cu prevalența cea mai mare dintre bacteriile Gram-negative implicate în etiologia infecțiilor nosocomiale și cea a infecțiilor severe la pacienții imunodeprimați și la cei cu dispozitive protetice. Severitatea și cronicizarea infecțiilor cu Pseudomona aeruginosa se datorează rezistenței multiple la antibiotice, precum și abilității de a forma biofilme atât pe suprafețe abiotice (dispozitive medicale) cât și biotice (țesuturi).

Staphylococcus aureus reprezintă un patogen major care colonizează și infectează atât pacienții spitalizați cu imunitate scăzută, cât și indivizii imunocompetenți din comunități. Fosele nazale constituie rezervorul major pentru S. aureus. Astfel, 20% dintre indivizi sunt colonizați persistent la nivelul foselor nazale, 60% sunt purtători intermitenți, în timp ce 20% nu sunt niciodată purtători de S. aureus.

Statutul de purtător de S. aureus constituie un factor de risc pentru dezvoltarea infecțiilor invazive. Alte situsuri de colonizare ale S. aureus sunt reprezentate de: pliuri ale pielii, perineu, axile, vagin și tractul gastrointestinal.

S. aureus posedă cea mai largă varietate de mecanisme de virulență dintre toate microorganismele patogene pentru om și astfel reprezintă un model pentru studiul patogenezei bolilor infecțioase. Patogenitatea S. aureus este multifactorială, fiind dependentă de:

repertoriul bogat de factori de virulență pe care îi exprimă această specie bacteriană

imunitatea organismului gazdă

factorii de mediu (dispozitive medicale de tipul cateterelor intravasculare)

competiția bacteriană.

Factorii de virulență sunt exprimați în mod coordonat în cursul diferitelor etape ale infecțiilor pe care le determină la om. S. aureus produce o diversitate de proteine secretate, ce aparțin la unul dintre următoarele tipuri: receptine, toxine și enzime.

Principalele etape ale patogenezei infecțiilor cu S. aureus sunt:

colonizarea

internalizarea

invazia și diseminarea sistemică

toxigeneza.

Atât infecțiile localizate, cum sunt abcesele de la nivelul țesuturilor moi, cât și bolile sistemice ce pun în pericol viața, cum este septicemia, apar ca urmare a capacității patogenului de a se atașa la țesuturi sau celule, de a scăpa de mecanismele imune înnăscute și dobândite ale gazdei, de a produce enzime extracelulare și exotoxine care determină lezarea celulară și tisulară favorizând diseminarea S. aureus în organismul gazdă .

Rezistența la penicilinele stabile la penicilinaze a fost denumită în trecut rezistența la meticilină. În prezent se folosește termenul MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus) sau S. aureus rezistent la oxacilină.

Se cunosc două tipuri principale de mecanisme de rezistență la meticilină a S. aureus:

mediat de gena cromosomală mecA, care specifică sinteza unei proteine anormale de legare a penicilinei, denumită PBP2a sau PBP2'

mecanisme mediate de sinteza unor beta-lactamaze.

Primul mecanism este cel mai frecvent responsabil de apariția pattern-ului de rezistență MRSA. Complexul genei mecA conține situsuri de inserție pentru plasmide și transpozoni, ceea ce facilitează achiziția de gene de rezistență și la alte clase de antibiotice. Astfel, tulpinile MRSA frecvent prezintă rezistență încrucișată la antibiotice non- -lactamice, cum ar fi: eritromicina, clindamicina, gentamicina, trimetroprim-sulfametoxazol/ cotrimoxazol și ciprofloxacin.

Transferul orizontal al genei mecA la tulpinile MSSA se pare că reprezintă cel mai important mecanism de răspândire a rezistenței la meticilină la tulpinile de S. aureus. Rezistența S. aureus la macrolide poate fi datorată efluxului activ (codificat de gena msrA) sau modificării țintei ribozomale când apare mecanismul de rezistență MLSb (macrolidelincosamide-streptogramin B), care este codificat de genele erm (ermA sau ermC).

Gena msrA conferă tulpinilor purtătoare rezistență numai la macrolide și la steptograminele de tip B. Genele erm (ermA, ermB) codifică enzimele care conferă rezistența inductibilă sau constitutivă la agenții MLSb. Rezistența constitutivă la MLSb apare prin metilarea ARNr 23S, ceea ce conduce la scăderea legării agenților MLSb la ribozomi.

Tulpinile care prezintă rezistență constitutivă la MLSb manifestă in vitro rezistență la toți acești agenți. Rezistența MLSb inductibilă se instalează după expunerea la un macrolid. Tulpinile cu rezistență MLSb inductibilă prezintă in vitro rezistență la membrii grupului de macrolide ce au inelul lactonic central cu 14-atomi (eritromicina, claritromicina) și 15-atomi (azitromicină), în timp ce rămân sensibile la membrii macrolidelor cu 16 – atomi (josamicina, spiramicina, rokitamicina), la lincosamide și la steptograminele de tip B.

Ps. aeruginosa este patogenul oportunist Gram-negativ cel mai frecvent identificat în infecțiile nosocomiale, deoarece ~ 50% din pacienții spitalizați prezintă un risc crescut de colonizare cu acest agent.

Această bacterie infectează în primul rând indivizii imunocompromiși (pacienții cu cancer, SIDA sau transplant de maduvă osoasă), sau cei la care barierele normale sunt lezate datorită arsurilor, dispozitivelor medicale (catetere), sau utilizării prelungite a antibioticelor cu spectru larg.

Astfel, Ps. aeruginosa determină apariția unor infecții nosocomiale severe, infecții care pun în pericol viața pacienților imunocompromiși, precum și infecții cronice la pacienții cu fibroză chistică.

Pacienții spitalizați ventilați din unitățile de îngrijire intensivă frecvent manifestă o sensibilitate crescută la colonizarea cu Ps. aeruginosa în tractul respirator superior (gât și/sau trahee).

Tranziția de la colonizare la infecția cu Ps. aeruginosa este frecvent observată în cazurile de imunosupresie a mecanismelor de apărare ale gazdei, cum sunt cele care apar la pacienții cu cancer, aflați sub chemoterapie, când nivelurile sangvine ale neutrofilelor PMN sunt sub 100/mm3 . Capacitatea Ps. aeruginosa de a determina un număr impresionant și divers de infecții acute și cronice se datorează unui arsenal de factori de virulență (asociați celulei bacteriene și factorilor extracelulari) pe care această bacterie îi posedă.

Tulpinile de Ps. aeruginosa manifestă rezistență naturală la numeroase antibiotice active față de bacilii Gram-negativi: aminopeniciline, cefalosporine de generația I (cefalotin, cefazolin) și generația II (cefamandol, cefuroxim), precum și la unele cefalosporine de 10 generația III (cefotaxim și moxalactam).

Fenotipul sensibil de Ps. aeruginosa (așa-numitul tip sălbatic) prezintă sensibilitate la antibioticele -lactamice anti-pseudomonadale [carboxipeniciline (carbenicilina, ticarcilina), ureidopeniciline (azlocilina, piperacilina), la unele cefalosporine de generație III (cefsulodin, cefoperazonă și ceftazidim), la toate cefalosporinele de generație patru, la monobactami (aztreonam) și la carbapenemi (imipenem și meropenem)].

Rezistența intrinsecă a celulelor de Ps. aeruginosa la agenții antimicrobieni este mult mai accentuată când microorganismul crește într-un biofilm. Anumite tulpini sălbatice de Ps. aeruginosa pot dobândi rezistență în cursul tratamentului cu antibiotice -lactamice. Astfel, tulpinile de Ps. aeruginosa pot prezenta rezistență dobândită la -lactami prin unul din următoarele mecanisme:

inactivarea enzimatică a antibioticului datorită sintezei de – lactamaze

permeabilitate redusă a membranei externe și/sau

expresia crescută a transportorilor de reflux.

De asemenea, au apărut tulpini de Ps. aeruginosa la care pot exista simultan sau în diferite combinații toate aceste mecanisme de rezistență la -lactami.