Proiectarea Moleculara a Unor Compusi Inhibitori Ai Enzimei Pi3k cu Potential Anticanceros

CUPRINS

Partea teoretică 3

1. Introducere 4

2. Calea de semnalizare mTOR 5

2.1. Semnalizarea celulară PI3K via mTOR 5

2.2. Justificarea direcționării terapeutice către mTOR 5

2.3. Structura proteinei mTOR 6

3. Inhibitorii mTOR 6

3.1 Rapamicina și rapalogii. SAR 6

3.2. A doua generație de inhibitori mTOR 6

Partea experimentală 16

1. Introducere 16

2. Materiale și metode 17

3. Rezultate 24

4. Concluzii 35

Bibliografie 36

1.Introducere

Cancerul reprezintă o problemă mondială de sănătate și ocupă al doilea loc ca și cauză de deces în rândul populației. Cauzele multiple și variate ce determină apariția cancerului constituie un obstacol în cadrul instituirii unui tratament eficient[1].

Conform GLOBOCAN[2], ultimele date, înregistrate oficial în anul 2012, arată la nivel mondial (exluzând cancerele cutanate non-melanomice) 14.1 milioane cazuri noi diagnosticate cu cancer, 8.1 milioane decese prin cancer și 32.6 milioane persoane aflate în intervalul de supraviețuire de 5 ani de la diagnostic. Până în 2030, numărul mondial al cazurilor de cancer va ajunge la 21.64 milioane. De asemenea, în România în ultimele două decenii s-a observat o creștere sistematică a mortalității prin cancer, aceasta reprezentând circa 13-14% din totalul deceselor[3] și ocupând locul doi după bolile cardiovasculare, conform tendinței mondiale[1]. Mortalitatea prin cancer în România va continua să crească. Față de 2012, în 2015 și 2030 indicii mortalității vor crește cu 3%, respectiv 17%[2].

Odată cu descoperirea secvențelor genomului uman, cercetătorii afirmau faptul că o nouă era a cunoașterii a fost deschisă în domeniul medical, în particular în domeniul oncologiei, unde se preconizează o investigare amănunțită la nivel molecular a mecanismelor ce determină neoplazia[4].

Dereglarea căilor biologice de semnalizare fiziologică, prin mutații genetice sau evenimente epigenetice dă naștere unei replicări necontrolate a celulelor, concomitent cu o diviziune excesivă. Odată cu suprimarea sau exagerbarea funcțiilor anumitor gene cu rol reglator ale proliferării, supraviețuirii și diferențierii celulare, celulele maligne își creează propriile căi de semnalizare, independente și autonome, numite în literatura de specialitate „căile cancerului”[3].

Actual, este recunoscut faptul că numărul de căi majore de semnalizare implicate in cancer nu este nelimitat, dezvăluind o nouă direcție de cercetare. Metabolismul reprogramat al celulelor canceroase și fiecare dintre semnele distinctive ale acestora, în fapt evenimentele moleculare cheie fac obiectul unor noi ținte terapeutice[3].

Aceste date motivează eforturile actuale și viitoare de implementare a unor strategii eficace în prevenția, diagnosticarea și tratamentul cancerului. În direcția descoperirii de noi medicamente anticanceroase, cea mai efervescentă ramură o reprezintă în prezent terapia moleculară țintită, cu mare potențial în viitor[5].

Termenul „terapie moleculară țintită” desmnează o nouă generație de chimioterapice, care interferă cu căi specifice moleculare, cu ajutorul cărora celulele maligne se dezvoltă și supraviețuiesc[5]. Spre deosebire de chimioterapia clasică, ce acționează în principal asupra diviziunii celulare rapide, afectând și celule sănătoase, terapia țintită blochează molecule „target” specifice dezvoltării tumorale[6]. Cu toate acestea, terapia țintită nu tinde să înlocuiască complet chimioterapicele clasice. Scopul este de a crea șanse reale de succes terapeutic în cazul unor cancere identificate genetic ca fiind responsive la o anumită terapie moleculară[5].

Cele mai dezvoltate terapii țintite actuale sunt anticorpii monoclonali și „moleculele mici” sau inhibitori tirozinkinazici și multikinazici[3]. Cea de-a doua categorie vizează în mod special blocarea semnalizării celualare via receptor și blocarea semnalelor de transductie intracelulară[7]. Corelat cu actuala temă, calea PI3K-Akt-mTOR (Fosfoinozitol-3-kinaza-Protein kinaza B-mammalian target of rapamycin) reprezintă o cale de semnalizare frecvent și aberant hiperactivată în cadrul tumorigenezei și fiecare dintre elemente constituie o țintă atractivă pentru studii generatoare de inhibitori. Cei mai studiați în acest context sunt inhibitorii căii mTOR[3], studiu de care se ocupă și prezenta lucrare, respectiv proiectarea moleculară a unor molecule inhibitoare ale enzimei mTOR, cu potențial rol anticanceros.

MTORkinaza a fost descoperită la mamifere ca fiind ținta rapamicinei, ulterior studiilor pe drojdii. Rapamicina, o macrolidă izolată în 1975 și primul inhibitor al mTOR a servit cercetării funcționale ale enzimei, iar în 1999 a fost aprobată de către FDA (Food and Drug Administration) drept agent imunosupresor indicat în prevenția rejetului de organ în transplantul renal. Investigații următoare au subliniat activitatea antiproliferativă în diferite tipuri de cancere și au încurajat derivatizarea rapamicinei, obținându-se rapalogii, cu propritetăți farmacocinetice mai favorabile și capacitate inhibitorie mai mare. Datorită etapelor clinice variabile în diferite tipuri de cancer ale rapalogiilor, noi molecule au fost dezvoltate[8].

Partea generală, teoretică a prezentei lucrări tratează generațiile de inhibitori ai enzimei mTOR, dar și importanța acestora în tratamentul unor cancere rare sau cu prognostic nefavorabil, cât și relațiile strucutră-activitate biologică ale acestora.

Partea experimentală constă în formarea unei baze de compuși, prin derivatizarea unui nucleu de bază și prelucrarea acestora prin metode computaționale, ce va fi folosită pentru andocare moleculară cu proteina 4JSX (PDB ID (cod Potein Data Bank)), iar ulterior rezultatele vor fi interpretate sub formă QSAR (quantitative structure–activity relationship).

PARTEA TEORETICĂ

2. Calea de semnalizare mTOR

2.1. Semnalizarea celulară PI3K via mTOR în cancer

Înțelegerea mecanismelor prin care celulele maligne primesc și integrează semnale extracelulare, declanșatoare a unei cascade intracelulare de semnalizare ce determină o creștere celulară aberantă, este esențială pentru dezvoltarea unei terapii antineoplazice precis direcționată. Un astfel de mecanism este calea de semnalizare mTOR situată în aval de calea PI3K[8].

Calea de semnalizare intracelulară PI3K-Akt-mTOR controlează major, multiple funcții celulare ca supreviețuirea, proliferarea, progresia în ciclul celular, neovascularizația și este implicată în majoritatea cancerelor umane. În cadrul tumorigenezei apare, cel mai adesea, o hiperactivare aberantă a cascadei de semnale transmise[3].

Calea PI3K-Akt-mTOR este activată inițial prin fosforilarea tirozinei domeniului intracelular al RTK (receptori tirozin-kinazici), drept urmare a interacțiunii acestora cu liganzi la suprafața membranară. RTK recunosc liganzi din familia GF (factori de creștere) ca IGF (factor de creștere insuli-like), EGF (factor de creștere epidermal), IGF-1 (somatonedin C), citokine și inclusiv interleukine[9].

Rapamicina este o moleculă cu nucleu macrolidic, lipofilă, izolată și purificată din micelii de Streptomyces hydroscopicus în 1972. Studii microbiologice au relevat acțiunea sa antifungică asupra Candida albicans, Trichophyton granulosum și Microsporum gypseum. Ulterior s-a descoperit acțiunea imunosupresoare a rapamicinei în cadrul cercetării de către NCI (National Institute of Cancer) și în cele din urmă, efectul citostatic pentru o serie de tumori canceroase, testat in vivo, cât și in vitro. Cercetările s-au încheiat în 1982, rezultatele testărilor preclinice fiind publicate abia în 1988[9].

Investigații imediat următoare ale proprietăților, dar mai ales ale mecanismului de acțiune al rapamicinei au dus la identificare țintei biologice inițial la drojdii, fiind numită TOR (ținta rapamicinei). Studii de screening genetic au identificat ținta omoloagă TOR în diverse specii de mamifere, primind numele de mTOR [10,11,12].

Gena TOR se regăsește în toate celulele mamifere, dar este deosebit de importantă în celulele canceroase, ce proliferează și invadează agresiv[8].

MTOR a fost caracterizată drept o serin/treonin kinază din familia PIKK (kinaze înrudite cu fosfatidil-kinaze) din care fac parte și PI3K, Akt. PIKK, împreună cu proteinele ribozomale P70S6K (kinaza P70S6K), ATM (ataxia teleangiectsia mutated), ATR (serin/treonin kinaza ATR), componente ale complexelor histon-deacetilazelor, sunt implicate în puncte cheie ale ciclului celular, repararea de ADN (acid dezoxiribonucleic), reglarea lungimii telomerelor și în controlul apoptozei[13].

În cele două decenii de la izolarea mTOR s-au făcut eforturi în a caracteriza semnalizarea celulară ce implică mTOR. Este unanim acceptat faptul că mTOR acționează subordonat PI3K-azei și dovezi solide consolidează faptul că reprezintă un comutator al catabolismului celular în favoarea anabolismului[9].

Cea mai comună deficiență și cea mai bine descrisă genetic a unei GST (gene de stabilitate) în malignitatea umană este mutația PTEN (proteina omologă fosfatazei și tensinei). Această mutație este asociată cu un spectru larg de neoplazii umane, incluzând cancerul de prostată, pulmonar, endometrial, tiroidian, cancere hematologice, carcinomul renal, melanomul[14]. O altă GST deficitară implicată în 50% din cancere este p53 (tumor protein), care este o proteină reglatoare a apoptozei, prin activarea fosfatazei PTEN, totodată principalul antagonist al kinazei PI3K[(13]. Prin urmare, activitatea exagerată a PI3K duce la supraexprimarea mTOR, considerată un nod central al tumorigenezei[15].

Fiziologic, calea PI3K este activată de cuplarea RTK cu GF sau IGF. Aceasta catalizează formarea PIP3 (fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfat) membranar, prin fosforilarea grupării hidroxil a PIP2 (fosfatidilinozitol-4,5-difosfat) din poziția 3 a inelului inozitolic. PIP3 servește drept situs de legare al proteinelor cu domeniu PH (pleckstrin homology). O astfel de proteină este Akt recrutată spre membrana celulară și activată parțial prin fosforilare de catre PIP3. Activarea finală este întreprinsă de către PDK1 (protein-kinaza1 3-fosfoinozitol-dependentă)[8].

Akt în stare activă are ca substraturi GSK3 (kinaza glicogen sintetazei), BAD (Bcl-2-associated death promoter, FOXO (proteina forhead box) și TSC2 (tuberin). Fosforilarea TSC2 împiedică formarea complexului TSC1 (hamartin)/TSC2, fapt ce permite GTPazei Rheb (Ras homolog enriched in brain) să rămână activă, finalizând activarea mTORC1 (complexul 1 al mTOR).De asemenea, Akt fosforilează PRAS40 (substratul subdomeniului 40kDa Akt bogat în prolină), componentă a mTORC1 cu rol inhibitor al acestuia, suprimând controlul său. Reglarea mTOR de către Akt este un proces complex și multistadial, complicat de existența mTORC2 (complexul 2 al mTOR), care fosforilează direct Akt în restul Ser473[16].

Din contră, activitatea prelungită a mTORC1 creează o buclă de feed-back negativ în amonte de PI3K-Akt, nefiind evident cărui fapt se datorează efectul[17].

Presupunând că există un echilibru între cele două complexe, se conturează ipoteza blocării parțiale a mTORC1, rezultat al hiperactivității PI3K-Akt prin țintirea ambelor complexe. Cel puțin în principiu, blocarea unică a mTORC1 are ca rezultat activarea Akt de către mTORC2, iar invers rolul autonom al mTORC2 nu este dovedit deplin, exceptând controlul menționat care a fost ilustrat prin studii genetice in vitro și in vivo pe culturi celulare de Drosophila[13,18].

Descoperirea mTORC2 a răspuns întrebărilor legate de ineficiența terapeutică a rapamicinei, care reușește inhibiția parțială a efectelor mTOR, și nu totală[16,18].

Revenind la TSC2, un alt mecanism este implicat în reglarea sa pozitivă, și anume calea controlată de proteinele Ras-ERK. Tirozin-kinaza ERK fosforilează TSC2, cu aceeași implicație. Calea alternativă intervine mai ales când mTORC1 este inhibat sau nivelele de activitate sunt joase. Studii realizate au arătat nivele crescute ERK la pacienți cu tumori solide ce primeau tratament cu inhibitori mTOR, dar și oportunitatea de a folosi o terapie combinată capabilă de inhibiția simultană a celor două căi paralele și interconectate[19].

MTOR controlează răspunsul celular prin activarea componentelor inițiatoare ale sintezei proteice, în principal S6KP70 (kinaza proteinelor ribozomale) și 4EBP1 (eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1). Prin capacitatea sa de kinază, mTOR fosforilează P70S6K, a cărei funcție este activarea traducerii de ARNm (ARNmesager). 4EBP1, eliberând eIF-4e factor 4E-binding protein (factor 4E-binding protein) realizează decuplarea apoptozei sub controlul mTOR. De asemenea, mTOR crește producția unor proteine-cheie în reglarea ciclului celular. Inhibiția la acest nivel are ca rezultat „arestarea celulelor” în faza G2 a ciclului celular, eveniment care în procesul malign devine extrem de scurt, favorizând proliferarea rapidă[3,9].

Astfel, mTOR domină creșterea și proliferarea celulară, procese vitale în cadrul tumorigenezei[9].

2.2. Justificarea direcționării terapeutice către mTOR

Cea mai frecvent mutată kinază ce apare în cancerele umane este PIK3CA (subunitatea catalitică p110α a PI3K): 40% cancere ovariene, 25% dintre cancerele de sân, 32% CCR (cancer colo-rectal), 25% CG (cancer gastric), 4% CBP (cancer bronho-pulmonar). Aceste mutații cresc activitatea kinazei în aval, cu o stimulare aberantă a efectorilor căii. Date de secvențiere genomică a probelor din HCC dovedesc mutația PIK3CA la 50% dintre pacienții cu un prognostic defavorabil evaluați. Studii multiple dovedesc că inhibarea directă și globală a PI3K poate afecta grav funcționarea normală a organismului, fiind necesară blocarea elementelor eferente acestei căi[20,21].

Suprimarea GST, PTEN duce la ruperea centromerelor, favorizând instabilitatea cromozomială. Akt și mTOR sunt supraexprimate frecvent în cancerul ovarian și endometrial, datorită pierderii funcției supresoare a PTEN. Virusurile hepatice protejează hepatocitele de apoptoză prin down-regularea PTEN, crescând alterările genetice favorabile fenotipului malign[22]. Celulele canceroase cu deficit PTEN sunt considerate a fi ținte majore ale inhibitorilor mTOR[8].

Mutații ale Akt sunt de asemenea posibile. Akt1 este izoforma cel mai frecvent mutată în 6% din CCR. Alterarea sa se corelează cu un prognostic defavorabil și apare în cancer de pancreas și prostată. Câștigul de funcție al oncogenei Akt se asociază în mod firesc cu nivele ridicate ale fosforilării mTOR, p70S6K, 4EBP-1 analizate în LMA (leucemie limfoidă acută)[23].

Nivele crescute ale funcției mTOR au fost descrise și în cancerul de vezică, însă activitatea Akt a fost redusă, probabil de feed-back-ul negativ exprimat de excesul mTOR. În acest caz este evident faptul că Akt nu este singurul reglator al mTOR, ci căi paralele intervin în exprimarea sa aberantă, în țesuturi maligne[23].

Cele mai multe cancere includ procese multiple, complexe și interconectate. Abordarea evenimentelor chimioterapic și radioterapic sunt eficiente în tratamentul unor tumori. Cu toate acestea, malignitatea tinde să devină rezistentă și/sau recurentă acestei intervenții, din lipsă de specificitate. Vizarea unor procese individuale, și nu exhaustive ar putea fi răspunsul succesului în tratarea cancerului. În această direcție, inhibitorii mTOR reprezintă o țintă terapeutică cu perspective încurajatoare.

2.3. Structura proteinei mTOR

La mamifere, calea de semnalizare mTOR este mediată prin două complexe: holoenzimele mTORC1 și mTORC2[24]. Acestea diferă atât structural, prin subunitățile cu care se asociază, cât și funcțional. Subunitățile de reglementare dictează localizarea, funcționalitatea și specificitatea de substrat a mTOR. Ambele complexe multiproteice conțin subunitatea catalitică mTOR[2].

MTORC1 este compus din mTOR, RAPTOR (proteina reglatoare asociată mTOR), mLST8 (omologul mamiferelor al TOR din drojdii), PRAS40 și DEPTOR (domeniul DEP de interacțiune al mTOR). În principal RAPTOR și mLST8 stabilizează și au efect pozitiv asupra mTOR, făcând posibile interacțiunile din aval. Din contră, PRAS40 a fost indentificat ca fiind un reglator negativ al mTOR, în absența acțiunii Akt sub influența GF. Akt fosforilează PRAS40 direct la Tre246, declanșând eliberarea mTOR de sub efectului inhibitor. Totuși, PRAS40 reprezintă substratul de fosforilare al însuși mTOR, care prin intermediul RAPTOR, fosforilează Ser183, Ser212, Ser221. RAPTOR răspunde pozitiv la insulină, abundența nutrienților și a energiei. De asemenea se supune controlului negativ al AMPK (adenozin-monofosfat-kinaza) atunci când celula nu prezintă suficiente resurese[25,26].

MTORC2 grupează și el mTOR, DEPTOR și mLTS8, însă RAPTOR este înlocuit cu RICTOR (companion mTOR insensibil la rapamicină), însoțit de PROTOR (proteina observată cu RICTOR), iar PRAS40 cu mSin1 (copmlexul kinazei sensibil la stres-proteina1). Fiind mai recent descoperit decât mTORC1, mTORC2 implică funcții mai puțin înțelese. Cele mai bine cunoscute roluri ale mTORC2 sunt fosforilarea Akt și PKCα (protein-kinaza Cα), traducându-se prin controlul metabolismului glucidic, al apoptozei și al organizării și stabilității actinei în citoscheletul celular[27].

MTOR face parte din superfamilia de proteine PIKK și prezintă o omologie structurală a lanțului C-terminal cu domeniul catalitic al PI3K. Proteina mTOR conține 2549 aa (aminoacizi), are o GM (greutate moleculară) prezisă de 288892 Da(daltoni). Capătul N-terminal este compus din două unități repetitive HEAT (domeniul de interacțiune al proteinelor Huntington, Elongation factor3, PR65/A și mTOR). Fiecare motiv HEAT conține două α-helixuri compuse din 40 aa, structură ce favorizează interacțiunea cu alte proteine, inclusic RAPTOR(32). În continuare se regăsește domeniul FAT (domeniu caracteristic FRAP, ATM, TRAP), învecinat cu domeniul de legare al compexului FKBP-12-rapamicină(FRB). Domeniul imediat următor reprezintă situsul catalitic al mTOR kinazei puternic conservat(KD). Ultimele domenii sunt reprezentate de NR (domeniu reglator negativ) și FATC (FAT C-terminal), dispuse la capătul C-terminal. Domeniile FATC și FAT sunt dispuse astfel încât, prin interacțiune să expună KD al mTOR (Fig. 1)[24].

Figura 1. Structura proteică mTOR[27]

Rapamicina, după pătrunderea în celulă formează un complex cu FKBP12, căruia ii inhibă activitatea de imunofilină și migrează către FRB, inhibând alosteric activitatea catalitică mTOR[27]. Complexul ternar uman FKBP12, rapamicina și FRB au fost izolate prin tehnici de cristalizare prima oară în 1996[28], făcând posibilă studierea interacțiunii exacte a rapamicinei cu mTOR, și ulterior a rapalogilor(analogii rapamicinei) și a mecanismului inhibitor. În prezent, este posibilă analiza acestora prin microscopie electronică de înaltă rezoluție, iar structura tridimensională se obține prin cristalografie cu raze X[24].

3. Inhibitorii mTOR

Inhibitorii mTOR folosiți actual în terapeutică, aprobați sau în testări clinice pot fi clasificați în 3 clase, conform Tab.1:

Tabelul 1. Inhibitorii mTOR(8,27)

3.1. Rapamicina și rapalogii. SAR (Relații structură-activitate)

Rapamicina (Fig. 2) face parte din clasa macrolidelor, cu formula moleculară C51H79NO13, iar denumire IUPAC este: (3S, 6R, 7E, 9R, 10R, 12R, 14S, 15E, 17E, 19E, 21S, 23S, 26R, 27R, 34aS) – 9, 10, 12, 13, 14, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 32, 33, 34, 34a-hexadecahidro-9,27-dihidroxi-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-hidroxi-3-methoxiciclohexil]-1-metiletil]-10, 21-dimethoxi-6, 8, 12, 14, 20, 26-hexametil-23,27-epoxi-3H-pirido[2, 1-c][1, 4]-oxaazaciclohentriacontine-1, 5, 11, 28, 29 (4H,6H,31H)-pentonă[29].

Macrociclul lactonic este format din 31 de atomi, a cărui biosinteză pleacă de la subunitatea acid 4,5-dihidroxo-1-ciclohexen carboxilic. Aceasta va fi condensată succesiv cu resturi malonil sau metil-malonil, rezultând o poliketidă liniară la capătul căreia se adaugă acid L-pipecolic. Urmează ciclizarea poliketidei, rezultând prerapamincina, al cărei macrociclu este modificat în vederea obținerii rapamicinei prin metilare la C16, C39; hidroxilare la C27 urmată de O-metilare; introducerea unei grupări carbonil la C9[30,31].

Figura 2. Structura chimică a rapamicinei, proprietăți fizico-chimice, SMILE

Modificări la gruparea hidroxil din poziția 40 au dus la obținerea rapalogilor.

Temsirolimus este esterul dihidroxi-metil-propionic al rapamicinei, fiind un pro-drug al acesteia. A fost aprobat în 2007 de FDA și AEM (Agenția Europeană a Medicamentului) pentru tratamentul carcinomului renal cu celule clare (CCR). Temsirolimus are o solubilitate mai mare decât rapamicina în apă și este administrat pe cale i.v. (intravenoasă)[32].

Everolimus, al doilea analog al rapamicinei are ca substituent o grupare hidroxi-metil la gruparea 40. Acesta a fost dezvoltat pentru creșterea biodisponibilitații orale a rapamicinei. În 2009 a fost aprobat de FDA pentru tratmentul CCR după eșecul tratamentului cu sunitinib, sorafenib, al astrocitomului subependimar cu celule gigant (SEGA) asociat cu scleroză tuberoasă (ST) și tumori neuroendocrine progresive de origine pancreatică. În 2012, două noi indicații au fost aprobate: cancerul de sân HER-2 negativ în asociere cu exemestan și SEGA. În cadrul EMA au fost aprobate aceleași indicații[31,32].

Deferolimus este analogul dimetil-fosfinat al rapamicinei, dar nu este pro-drug al acesteia. Se administrează i.v. sau p.o. (per os) în cadrul tratamentului sarcoamelor osoase[32].

Orice modificare a structurii rapamicinei poate duce la afectarea activității inhibitoare a mTOR, direct sau indirect prin pierderea capacității de cuplare cu FKBP12. Regiunea pipecolat a rapamicinei pare să joace un rol important în formarea complexului rapamicină-FKBP12 și este necesară pentru legarea acestuia de mTOR[32,33].

Afinitatea mare de legare a rapamicinei (Kd=0,2nM (constantă disociere exprimată nanomoli) de FKBP12 este dată de un număr de legături de hidrogen realizate între cele două. Elementele importante pentru această interacțiune sunt:

Regiunea pipecolat

Regiunea tricarbonilică C8-C10

Gruparea lactonică din C1[32,33].

Cele mai importante legături de hidrogen formate sunt cele formate între:

Gr. lactonică din C1 și gr. aminică a Ile56(a FRBP12)

Gr. amidică din C8 și gr. fenolică din cadrul Tyr82

Gr. hidroxil din C10 gr. ceto a Asp37[32,33].

Interacțiunea cpx. FRBP12-rapamicină cu FRB(2025-2114aa) este caracterizată de hidrofobicitate și de absența legăturilor de hidrogen. Domeniul rapamicinei care realizează această interacțiune este:

Regiunea trienică C16-C23 (contact cu resturi aromatice ale FRB-Phe2039, Trp2101, Tyr2105, Phe2108)

Gr. metil atașsate C23, C29, C31

Gr. metoxi atașată C16[32,33].

În absența rapamicinei nu s-a observat nici o interacțiune proteină-proteină (FKBP12-FRB al mTOR), dovedind astfel importanța legăturilor van der Wals existente între rapamicină și FRB, cât și a inhibiției allosterice a activității mTORC1 influențată de legarea acesteia de FKBP12 [33].

Față de compusul părinte, rapamicina, rapalogii prezintă proprietăți farmacocinetice mai favorabile, însă afinitatea de legare a FKBP12 și activitatea inhibitorie mTOR sunt mai reduse[32,33].

3.2. A doua generație de inhibitori mTOR

Odată cu descoperirea mTORC2, observarea lipsei sale de sensibilitate la acțiunea rapamicinei, s-a dorit dezvoltarea unor inhibitori mTOR care să acționeze și la acest nivel. Dezvoltarea acestora a fost facilitată datorită eforturilor enorme de a dezvolta inhibitori PI3K, dintre care ulterior au fost caracterizați inhibitori duali ai celor două enzime. mTOR este încadrat ca membru al Clasei IV PI3K, pe baza similarității secvenței de aa[34].

Primul compus inhibitor PI3K, căreia i s-a atribuit și capacitate inhibitorie mTOR este PI103, derivat morfolino-chinazolinic. Acesta inhibă competitiv legarea ATP-ului, blocând activitatea protein-kinazei. PI103 (Fig.3) a demonstrat activitate anti-proliferativă împotriva unor varietăți de linii celulare maligne localizate la nivel cutatnat, pulmonar, mamar, însă nu a fost evaluat clinic datorită profilului „drug-like” scăzut, rămânand etalon (lead) pentru compușii duali, dar selectivi mTOR: WYE354, KU-0063794[34,35].

Figura 3. Structura chimică a inhibitorilor duali PI3K/mTOR

PI103 inhibă activitatea mTOR la IC50 situată între 20-83nM. Situs-ul de legare al acestuia este comun cu restul inhibitorilor ATP-competitivi ai kinazelor. Acesta poate fi divizat structural în trei regiuni: o parte centrală ocupată nativ de adenozină ce formează două legături de hidrogen cu partea centrală a kinazelor(Val882 N-H și Glu880 C=O), două buzunare din care unul prezintă hidrofobicitate crescută. Structura de raze X cristalizată a PI103, comparativ cu un alt compus inhibitor PI3K sugerează că: PI103 formează legături de hidrogen cu regiunea centrală a kinazei prin intermediul oxigenului morfolinic și ocupă de asemenea buzunarul hidrofob cu ajutorul legăturii de hidrogen formate între Asp841 și gruparea fenolică, crescând astfel potența și selectivitatea acestui compus asupra PI3K. Pe baza acestor considerente s-au dezvoltat inhibitorii selectivi mTOR[35].

NVPBEZ235 (Fig.3), derivat triciclic de imidazol-chinolină prezintă IC50 mTOR=20nM (concentrație inhibitorieși activitate anti-proliferativă superioară, consecutiv inhibiției PI3K și mTOR. Gruparea farmacoforă a derivatului propusă este azotul chinolinic, care ii conferă eficacitate mărită față de rapalogi sau inhibitori selectivi PI3K. Principalele afecțiuni în care datele clinice ilustrează beneficii nete sunt: glioamele maligne și cancerul de prostată[34,35,36].

XL765 (Fig.3), o benzo-pirazină (chinoxalin) nu prezintă o IC50 favorabilă, pentru inhibarea mTOR, fapt pentru care s-a folosit în studii clinice datorită acțiunii inhibitoare PI3K în combinație cu erlotinib. Cele mai bune rezultate clinice s-au obținut în cadrul mezenteliomului metastatic, cu o stabilizare de nouă săptămâni, urmând extinderea studiilor[36].

Inhibitorii selectivi mTOR au fost concepuți cu scopul de a direcționa activitatea inhibitorie a acestora spre ambele compexe mTOR, prin derivatizarea unor molecule cu afinitatea mare pentru acestea, dar nu și pentru PI3K[36].

Figura 4. Structura chimică a unor inhibitori selectivi mTOR

Primul inhibitor selectiv al mTOR a fost PP242 (Fig. 4), derivat din seria pirazol-pirimidinelor. Datorită strucurii asemănătoare cu adenina (imidazol-pirimidină), împiedică fosforilarea multor protein-kinaze, iar IC50 mTOR=8 nM face ilustru faptul că afinitatea și selectivitaea pentru mTOR sunt excelente. Studiile realizate au evidențiat că un inhibitor catalitic al mTOR blochează proliferarea celulară malignă și fosforilarea substratului mTORC1 (4EBP1) mult mai eficace decât rapamicina. În plus, compusul inhibă și activitatea mTORC2 și implicit, fosforilarea Ser473 și a Thr450 ale Akt, fără a o mai supraactiva, beneficiu net în defavoarea rapalogilor (pentru toți inhibitorii selectivi)[36].

KU0063794 (Fig. 4) a fost dezvoltat folosind ca „lead compund” PI103 și este un derivat biciclic piridino-pirimidinic 4-substituit cu un ciclu morfolinic. Design-ul molecular pe baza aceluiași nucleu, pentru optimizarea farmacocineticii a dus la obținerea AZD8055 (Fig. 4). Acesta inhibă selectiv mTOR la IC50=0.8 nM și este derivatizat la poziția 2 a biciclului, cu 3-metil-4-morfolină (gruparea metil crește stabilitatea legăturii cu bunzunarul hidrofob al kinazelor). De asemenea, ciclul morfolinic inițial din poziția 4 este substituit cu grupare metil în poziția 3. Față de compusul inițial, KU0063794, cu două grupări metil la ciclul morfolinic din poziția 2 (2,6-metil-4-morfolino), AZD80055 are o activitate crescută[36,37].

Existența celor două cicluri morfolinice sporesc considerabil potența compusului, însă radicalul din poziția 7 (2-metoxi-fenilmetanol) a nucleului piridino-pirimidinic induce o gravă toxicitate hepatică. În continuare pentru a înlătura acest inconvenient, s-a inlocuit acest radical cu N-metil-benzamidă, obținându-se AZD2014 (Fig. 4). Activitatea inhibitorie a derivatului este clar mai scăzută, însă toxicitatea și proprietățile farmacocinetice sunt mult mai favorabile decât ale lui KU0063794. Acești compuși au fost primii inhibitori selectivi mTOR ce au intrat în trialuri clinice (în desfășurare)[34,37].

Derivații pirazol-pirimidinici, WAY001 și WAY354 (Fig.5) formează prin intermediul grupului morfolinic o legătura de hidrogen cu Val2240 a mTOR, dezvăluind importanța acestui ciclu, care recent a fost înlocuit cu 3,6-dihidro-piran. Astfel a fost obținut un compus inhibitor mTORC1 și mTORC2 foarte potent și selectiv.

Torin1 este un inhibitor mTOR al ambelor complexe, derivat de 1-(4(4-propionilpiperazină-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1,6-naftidrin-2-onă. Activitatea acestuia a fost demonstrată prin inhibarea fosforilării substraturilor S6K1 (mTORC1) și Ser473 a Akt (mTORC2), la o IC=2-10nM[37].

Figura 5. Structura chimică a unor inhibitori selectivi mTOR

Studiile de andocare moleculară ale compușilor au fost realizate, în principal folosind modele de omologie structurală ale mTORkinazei bazate pe structuri cristalizate ale PI3K-gamma (PBD ID: 1E8X, 2WXF)[38]. După elucidarea secvențierii mTOR și publicării structurii 3D a acesteia, atât în repaus, cât și a complexului format cu liganzii Torin2 (PDB ID: 4JSX)(Fig.6) și PI103(PDB ID: 4JS6) au fost folosite aceaste forme pentru screnning-ul altor compuși, prin studii de andocare moleculară[39,40].

1-FAP (PDB ID) reprezintă structura co-cristalizată a lanțului B al mTOR, fragmentul FRB, cu complexul rapamicină-FKBP12 (Fig. 6)[28].

Figura 6. Structura 3D a complexului FKBP12-rapamicină-FRB a mTOR[28]

Partea experimentală.

4. Introducere

4.1. Scopul realizării studiului

În ultimii ani a existat un interes tot mai dezvoltat în a identifica noi compuși moleculari inhibitori mTORC1/mTORC2, datorită faptului că rezultatele clinice ale inhibitorilor existenți sunt modeste și eficace doar în anumite forme de cancer rare.

Scopul prezentei lucări este de a forma o mini-bază de date cu derivați naftodiantronici și testarea, prin metode computaționale, în vederea selectării unor potențiali liganzi cu activitate inhibitorie asupra enzimei mTOR. Baza de date creată poate contribui la bazele de compuși existente cu activitate anticanceroasă. În continuare, derivații obținuți vor putea fi sintetizați și testați pentru activitatea menționată,.

4.2. Obiective

Modularea structurală a unor derivați antracenici (formarea bazei de date)

Screnning virtual al derivațiilor obținuți cu diferite programe de proiectare moleculară

Studiul QSAR al rezultatelor obținute ulterior docking-ului molecular al derivațiilor cu proteina-receptor mTOR (PDB ID: 4JSX)

4.3. Premise

Antraderivații reprezintă derivații fenolici ai antracenului, care se regăsesc în natura mai ales sub formă oxidată (antrachinone), formă redusă (antrone, diantrone, antranoli) și frecvent glicozidate. Acestea sunt principiile active din Frangulae cortex, Rhei rhizoma, Sennae folium et fructus, Aloe. Compușii antracenici de importanță terapeutică sunt aceia hidroxilați în pozițiile 1 și 8 ale nucleului 9,10-antrachinonic. În mod normal, acești radicali imprimă activitatea laxativă ale antrachinonelor hidroxilate[41].

Existența unor substituenți (metil, hidroxil, hidroxi-metilen, carboxil) în pozițiile 3 și 6, concomitent cu grupările hidroxil din pozițiile 1 și 8 extind aria acțiunii farmacologice ale compușilor naturali, ca de exemplu emodina, aloe-emodina, frangulaemodina, reina, fisciona. Aceștia și-au dovedit acțiunea antimicrobiană, antiinflamatoare, antitumorală, antivirală și actual sunt studiați intens în vederea elucidării mecanismului anticanceros[41].

În prezent, este intens cercetat mecanismul antiproliferativ si antiangiogenic al derivațiilor antrachinonici substituiți în pozițiile 3 și 6, în special emodina, aloe-emodina, reina și hipericina prezentând potențial de inhibitori ai protein-kinazelor, fapt ce vine în sprijinul justificării unei alegeri raționale a clasei chimice alese spre derivatizare. Acești compuși naturali sunt derivați ai 1,8-antrachinonei și se diferențiază doar prin radicalii menționați.

Hipericina, o naftadiantronă, derivat antrachinonic natural, constituie pricipiul activ al sunătorii (Hypericum perforatum) și prezintă de asemenea proprietăți antitumorale[42].

Conform tendințelor actuale de a găsi noi acțiuni ale compușilor naturali, cu scopul de a evita sinteza totală, și implicit costurile ridicate, moleculele studiate în prezenta lucrare își justifică deplin obiectivele.

Drept compuși ce urmează a fi derivatizați s-au ales reina și hipericina. Acestea vor fi modelate chimic la nivelul grupărilor carboxil (reina), respectiv hidroxil (ambele), cu obținerea bazei de compuși andocați în continuare cu proteina de interes.

5. Materiale și metode

În vederea formării bazei de date cu liganzi, aceștia s-au reprezentat grafic cu ajutorul ACD/Chem Sketch Freeware, un program oferit gratuit. Acesta permite reprezentarea structurilor chimice, incluzând compuși organici și polimeri. De asemenea este posibilă calcularea unur propietăți moleculare ale compusului, vizualizarea și optimizarea structurală 3D a acestuia, generarea nomenclaturii pentru compuși constituiți din mai puțin de 50 de atomi și 3 inele[43]. Compușii au fost salvați în format .mol pentru a fi posibil ulterior transformarea acestora în format .pdb.

Compușii s-au obținut prin următoarele modificări funcționale:

Pentru reină ( acid 4,5-dihidroxi-9,10-dioxoantracen-2-carboxilic)(Fig.7) s-a intervenit simultan la nivelul grupărilor funcționale carboxil din poziția 2 și hidroxil din poziția 4, obținând esteri și amide.

Pentru hipericină (1,3,4,6,8,13-hexahidroxi-10,11-dimetilfenantro(1,10,9,8-opqra)perilen-7,14-diona)(Fig.8) s-a modulat gruparea hidroxil din poziția 3 și s-au obținut de asemenea esteri.

Figura 7. Structura chimică a reinei

Figura 8. Structura chimică a hipericinei

În Figura 9 este prezentată structura generală a celor două tipuri de derivați, iar derivații funcționali ai acestora sunt reprezentați în Tabelul 2. Identificarea compușilor se realizează prin numerotarea acestora, derivații cu ID 6 corespund esterilor funcționali ai hipericinei, iar derivații ID 1-5 reprezintă esterii și amidele reinei.

Figura 9. Structura generală a derivațiilor reinei si hipericinei

Tabelul 2. Structura substituenților derivațiilor reinei și hipericinei

Liganzii bazei de date astfel obținute au fost salvați în format .pdb cu ajutorul unui program accesibil online: http://cactus.nci.nih.gov/translate/ ce permite facil importarea de fișiere .mol, dar nu numai, cât și exportarea acestora într-un timp foarte scurt. Fișierele salvate în format .pdb au fost folosite în modulul Open Babel al programului PyRx 0.8, cu scopul de a optimiza geometria moleculară a fiecărui compus, obținând conformația cu cea mai scăzută energie. În continuare, fiecare compus este convertit în format .pdbqt, ca ligand în Pyrx, cu ajutorul funcției Autodock (Make Ligand). PyRx este un program dezvoltat cu scopul de a descoperi potențiali liganzi ai diferitelor proteine țintă, prin metode de chimie computațională, pentru dezvoltarea unor noi medicamente[44].

Andocarea liganzilor cu proteina s-a efectuat cu Autodock Vina, din cadrul PyRx. Acest program folosește doar formatul .pdbqt al liganzilor și al proteinei. În plus, docking-ul se realizează utilizând doar coordonatele și dimensiunile ce caracterizează situs-ul de legare[45].

Screening-ul virtual al bazei de liganzi s-a realizat prin andocarea acestora cu structura 3D co-cristalizată a complexului mTOR-mLST8-Torin2 (PDB ID proteină: 4JSX) (Fig.10), disponibilă în baza de date a Protein Data Bank (www.rcsb.org). Această structură conține atât domeniul FRB (lanțul C, D reprezentat de mLST8), cât și situsul catalitic al serin-treonin kinazei (lanțul A,B) și permite cuplarea cu inhibitori competitivi ai ATP-ului, nu doar cuplarea cu inhibitori alosterici, ca rapamicina. Astfel, se măresc șansele ca printre derivații bazei de date să existe un potențial inhibitor mTORkinazei.

Figura. 10. Structura 3D a complexului co-cristalizat mTORdeltaN-mLST8-Torin2 (PDB ID: 4JSX) prelucrată în Accelerys Discovery Studio

Proteina a fost prelucrată folosind Accelerys Discovery Studio pentru înlăturarea ligandului Torin2, iar apoi a fost convertită în format .pdbqt, folosind din nou PyRx și funcția Autodock (Make Macromolecule), format ce păstrează doar hidrogenii polari ai proteinei.

Pentru validarea metodei s-a andocat inițial ligandul Torin2 al structurii co-cristalizate, urmând aceiași pași descriși, cu obținerea unei

Au fost stabilite coordonatele centrului grilei de căutare și dimensiunile grilei și parametrul de exhaustivitate (conformeri generați pentru fiecare ligand):

Coordonate centru folosite: X= -19, Y= -32, Z= -54

Dimensiuni grilă: X= 20, Y= 16, Z= 20

Valoarea parametrului de exhaustivitae folosită este 8.

După acești pași se generează conformeri ai liganzilor andocați, cu diferite afinități față de proteina receptor, exprimată în energie liberă de legare (ΔG exprimată în kcal/mol) a fiecăruia. Pentru obținerea rezultatelor se selectează pentru fiecare ligand, conformerul cu cea mai joasă energie liberă, în vederea generării unui fisier .pdbqt. În acest fișier este codificată conformația ligandului cu cea mai mare afinitate pentru receptor și coordonatele 3D ale acestuia.

Pentru vizualizarea interacțiunilor ligand-receptor, necesare interpretării QSAR a derivațiilor, este necesară conversia fișierului obținut în format .pdb, folosit în Accelerys Discovery Studio. Sunt posibile analiza interacțiunilor hidrofobice, legături de hidrogen.

6. Rezultate și discuții

În urma andocării celor 60 de derivați ai reinei și a celor 11 ai hipericinei, pentru fiecare compus au fost obținuți 8 conformeri (conform parametrului de exhaustivitate stabilit), însă în interpretarea rezultatelor se va ține cont de valoarea cea mai mică a energiei libere (kcal/mol) a fiecărui ligand, corelată cu cea mai mare afinitate pentru proteina folosită.

În continuare, rezultatele obținute vor fi reprezentate tabelar, separat pentru derivații acidului 4,5-dihidroxi-9,10-dioxoantracen-2-carboxilic (Tab.4) și derivații hipericinei (Tab.3). Împreună cu aceștia au fost docate și moleculele originale supuse derivatizării, dar și ligandul Torin2, așadar și rezultatele lor vor fi incluse, drept punct de referință pentru demonstrarea unor posibile afinități mai mari a derivațiilor, cât și pentru analiza QSAR a derivaților. În tabel este reprezentat doar R1 pentru cei doi compuși originali și valoarea energiei libere (evidențiată cu roșu pentru compușii cu valori mai mici decât ale Torin2).

Tabelul 3. Energiile de legare ale derivațiilor hipericinei și a Torin2

În urma esterificării (teoretice) hipericinei s-au obținut 11 compuși, dintre care 9 au înregistrat energie liberă mai mică decât Torin 2, în urma docking-ului cu proteina mTOR.

După cum se poate observa din rezultatele obținute, hipericina (6) nederivatizată prezintă o energie de legare considerabil mai mică decât a Torin 2. Conform datelor obținute, energia de legare a Torin 2 are valoarea: -11,2kcal/mol, iar hipericina depășește negativ acest prag. Datorită existenței a 6 grupări hidroxil grefate pe nucleele condensate de antracen, hipericina este foarte potentă în a realiza legături intermoleculare, inclusiv cu situsul catalitic al mTOR.

Referindu-ne la derivații obținuți, se poate observa că cea mai mare afinitate o au compușii esterificați, la gruparea 3-hidroxil a hipericinei, cu catene scurte, alifatice, ramificate și hidrofobe, de exemplu esterificarea cu acid 2-metil-propanoic pentru obținerea compusului 6.8, acid 2,2-dimetil-propanoic pentru 6.9 (Fig.11), acid trifluoro-acetic pentru compusul 6.10 (Fig.12).

Trisubstituirea cu flor a unei catene scurte de radical acetat duce la scăderea afinității față de compusul 6.9 și hipericină, aceasta rămânând totuși crescută față de derivatul 6.8 și față de Torin2.

Fig. 11. Structra compusului 6.9 Fig.12. Structura compusului 6.10

De asemenea compusul 6.1 (Fig. 13), esterificat cu alanină, prezintă o catenă mai scurtă comparativ cu ceilalți aa folosiți și, de asemenea energie liberă mai mică decât Torin2, rămânând valabilă premisa utilizării radicalilor nevoluminoși pentru creșterea afinității față de proteină. Dintre toți esterii hipericinei, derivați de aa, acest compus are cea mai mare afinitate față de proteina mTOR.

Figura 13. Structura compusului 6.1

Compușii cu cele mai mici afinității sunt derivații 6.5 și 6.6 cu R1 reprezentat de metionină și arginină. Aceștia au ca substituneți o catenă lungă, cu amină monosubstituită pentru 6.5, care ,în plus, prezintă în catenă sa sulfanil. Compusul 6.6 prezintă în catena laterală rest 1-(4-amino-5-oxohexil) guanidină, radical polar . Acești compuși nu sunt mai potenți decât Torin2, și evident nu prezintă interes.

Derivații cu energie liberă intermediară (între hipericină și Torin2) sunt reprezentați de către compușii 6.2, 6.3, 6.4 care au aceeași valoare a energiei libere, -11,4 și prezintă catene mai lungi, hidrofobe, cu excepția 6.4. Acesta are ca R1, un rest cu nucleu aromatic, de 2-amino-3(4-hidroxifenil) propan-1-onă care se pare ca nu influențează afinitatea prin polaritatea sa.

Compusul 6.11 este un ester al acidului fosforic , cu o activitate mai bună decât cea a Torin2, inhibitor ATP-competitiv al mTOR. Probabil gruparea R1 mimează destul de bine restul de trifosfat din structura ATP, dar și creează interacțiuni cu proteina, dovedind astfel o afinitate destul de bună: -11,6kcal/mol.

Derivatul 6.7, cu R1 constituit din 2-amino-3-(1H-indol-3-il)-propan-1-onă are o energie, liberă mai mică doar cu o subunitate decât a Torin2. Substituirea cu radicali aromatici, grefați pe o catenă alifatică duc la îmbunătățirea afinității, mai ales dacă aceștia includ și grupări fenolice, așa cum este cazul compusului 6.4 (Fig.14).

Figura 14. Structura compusului 6.4

În concluzie, cea mai mare afinitate de legare o au compușii 6.9, 6.10, 6.1 și 6.8 (în ordine descrescătoare). Acești compuși au în comun substituenți alifatici, și nevoluminoși și au valori mai mici ale energiei libere, comparativ cu Torin2, însă nici un derivat nu a obținut date mai bune decât hipericina. Comparativ, compușii cu catene lungi, aromatice ca 6.3 și 6.4 își pastrează afinitatea crescută, peste cea a Torin2, dar mai mică decât a primiilor menționați.

În tabelul 4 sunt prezentate energiile libere de legare ale derivațiilor acidului 4,5-dihidroxi-9,10-dioxoantracen-2-carboxilic. R1 pentru fiecare clasă este reprezentat în tabel (esterificare), iar în funcție de R derivații vor fi clasificați în 5 clase:

Amină nesubstituită: amide (1)

Amină terțiară, substituită cu 2 radicali metil : n,n-dimetilamină (2)

Ciclul 1-piperazil (3)

Ciclul 4-morfolino (4)

Radical oxi-benzen-amida: esteri (5).

Din datele obținute se poate observa, faptul că niciunul dintre derivații acidului 4,5-dihidroxi-9,10-dioxantracen-2-carboxilic nu are afinitate mai mare decât Torin2.

Acest lucru se datorează, cu certitudine faptului că reina, nu prezintă energie liberă destul de mare, astfel încât prin derivatizarea sa să se obțină compuși mai activi decât Torin2. În discutarea influenței radicaliilor ne vom referi, comparativ, la compușii cu energie liberă mai mare decât a compusului original, neexistând posibilitate etalonării față de Torin2. Energiile cu valori mai mici decât -10kcal/mol sunt evidențiate, în vederea analizării celor mai optimi derivați.

Tabelul 4. Energiile libere ale derivațiilor reinei

Din clasa 1, compusul 1.7 (Fig.15) prezintă cea mai mică energie de legare (-10,1kcal/mol), prin introducerea unui rest de triptofan la R1. Acest radical are o influență diferită asupra hipericinei, crescându-i energia liberă, dar pentru derivații amidici ai reinei reprezintă un substituent efficient.

Figura 15. Structura compusului 1.7

Se poate observa că, pentru celelalte 4 clase, substituția cu același radical nu influențează energia de legare a compușilor în aceeași manieră.

Clasa 2, derivați amidici, în care gruparea amino este trisubstituiă, nu a obținut valori notabile ale energiei libere (sub -10kcal/mol), dovadă ca această grupare nu reprezintă un substituent R favorabil. Cea mai mare afinitate o prezintă compusii 2.9 și 2.10 (Fig.16) ce au în comun, aceeași substituențiți R1 alifatici: 2-trifluoro-metil-1-etanonă (2.10), 2,2-dimetil-1-propanonă (2.9), cu derivații cei mai activi ai hipericinei.

Figura 16. Structura compusului 2.10

Din clasa 3, cea mai mică energie liberă o prezintă compusul 3 (Fig. 17), derivatizat doar la gruparea carboxilică a reinei (R) cu ciclu piperazinic. Ceilalți substituenți utilizați pentru R1, au generat compuși care au au valori ale energiei libere peste -10kcal/mol. În imediata vecinătatea a 3.1, din punct de vedere al afinității, se clasează compușii 3.9 și 3.10, cu energie liberă identică: -9,9 kcal/mol. Din nou acești substituenți, 2-trifluoro-metil-1-etanonă, 2,2-dimetil-1-propanonă au fost găsiți favorabili.

Figura 17. Structura compusului 3

Clasa 4 grupează compuși cu R reprezentat de inelul morfolinic, foarte favorabil pentru scăderea energiei libere a derivațiilor. Cei mai potenți substituenți pentru R1 sunt reprezentați de fenilalanină și tirozină, în compușii 4.3(Fig. 18) și 4.4, ce au o energie liberă de -10,3kcal/mol, respective 9,9kcal/mol. Derivatul 4.3, ce conține un ciclu aromatic nesubstituit, are energia de legare mai mică față de compusul 4.4, care este p-substituit cu o grupare fenolică. Având în vedere că aceeleași substituții ale R1 pentru derivații 3.3 și 3.4, în prezența unui alt ciclu pentru R conținând azot(piperazină) duce la scăderea afinității acestora pentru proteină, vom considera acest heterociclu(morfolinic) ca substituent favorabil. De subliniat este importanța existenței concomitente a unui ciclu aromatic la nivelul R1, cu a unui heterociclu conținând azot și oxigen.

Figura 18. Structura compusului 4.3

Clasa 5, cu R reprezentat de salicil-amidă are doi compuși ce au energia liberă sub -10kcal/mol. Compusul 5.10(Fig.19), al cărui R1 este, din nou, trifluoro-etanaonă are energia liberă mai mare cu o subunitate decât compusul 5.8, substituit cu 2-metil-etandionă. Pentru scăderea afinității compusului 5.8 față de proteină, probabil este responsabil efectul puternic inductiv al grupărilor fluoro grefate la capătul catenei scurte, alchilice, manifestând astfel capacitate atrăgătoare de electroni mai mare decât grupările metil ale 5.8.

Figura 19. Structura compusului 5.8

Analizând substituenții ce reprezintă R, pentru compușii cu R1 hidrogen, putem afirma faptul că nucleul piperazinic introdus este deosebit de potent. Compusul 3 are o energie de legare cu proteina egală cu -10,3kcal/mol, valoare maximă obținută pentru compușii derivați de reină.

În continuare, vor fi descrise interacțiunile realizate cu proteina mTOR, ale compușiilor cu cea mai mică energie de legare obținuți în prezenta lucrare. Aceștia sunt derivați ai hipericinei, care însă față de compusul indigen scad afinitatea nucleului de bază, obtinându-se totuși valori mai bune decât ligandul original, Torin2.