Notiuni de Citogenetica a Cromozomului Philadelphia

Notiuni de citogenetica a cromozomului Philadelphia

In 1960 Nowell si Hungerford publica in revista Science primul articol despre cromozomul Philadelphia ca prima anomalie cromozomiala asociata unui tip specific de leucemie ceea ce a fost un punct de cotitura in biologia cancerului.Au trebuit 13 ani ca sa se demonstreze ca acesta este rezultatul translocatiei reciproce intre bratele lungi ale cromozomilor 9 si 22 si apoi inca 10 ani pentru a se demonstra ca translocatia implica protooncogena ABL de pe cromozomul 9 si o gena necunoscuta de pe cromozomul 22 numita mai tarziu gena BCR.

Cromozomul Philadelphia este intalnit in celulele liniei mieloide ,eritroide ,megacariocitare si celulele linei limfoide B ceea ce demonstreaza ca aceasta afectiune este o afectiune monoclonala.

Cromozomul Philadelphia este un cromozom 22 mai scurt si este un marker pentru leucemia mieloida cronica fiind decelat la 95% din pacienti. Este de asemenea intalnit in 5% la copii si la 15-30% din adultii cu leucemie acuta limfoblastica si in 2% dintre leucemiile acute mieloblastice nou diagnosticate.

Transloca segmentul 3’ al genei ABL de pe cromozomul 9 in partea 5’a genei BCR de pe cromozomul 22 formand o gena hibrida BCR-ABL care se transcrie in ARN –m .Punctul de ruptura in gena ABL apare cel mai frecvent in exonul a2 .In cele mai frecvente cazuri de leucemie mieloida cronica gena ABL de pe cromozomul 9 transloca in punctul major de rupere (M-bcr) de pe cromozomul 22 dand nastere la fuziunea BCR-ABL ARN-m cu b2a2 sau b3a2 in proteina de fuziune p210 .In foarte rare cazuri de de leucemie mieloida cronica sau de leucemie acuta mieloblastica dar in 50% din leucemiile Ph+ ale adultului si in 80% din leucemiile limfoblastice Ph+ ale copilului punctul de ruptura se gaseste in regiunea m-bcr (punctul minor de rupere) transcripul format fiind p190.

Gena BCR-ABL de pe cromozomul Philadelphia este exprimata la toti pacientii cu leucemie mieloida cronica dar gena ABL-BCR de pe cromozomul 9q+ derivat este exprimata numai in 70% din cazuri. De mare interes este observatia ca aproape 20% din pacientii cu leucemie mieloida cronica au deletii ale materialului cromozomial de diferite dimensiuni pe cromozomul derivat 9q+si ca pacientii care au asemenea deletii au o durata de viata semnificativ scazuta decat ceilalati pacienti.Deletiile apar probabil in acelasi timp cu formarea cromozomului Philadelphia si recunoasterea lor are un important prognostic de supravietuire.Absenta genei ABL-BCR care include regiunea deletata prin sine insasi nu are acelasi implicatie de prognostic .

In general se considera ca, clona Ph+ are o susceptibilitate crescuta la modificari moleculare aditionale care favorizeaza progresia bolii.In criza blastica 60-80% din pacienti au modificari citogenetice aditionale:mai ales trisomia 8,cromozom Philadelphia aditional,trisomia 19,inversia cromozomului 17q care determina activarea unor oncogene sau supresia unor gene oncosupresoare cu rezultat final transformarea din faza cronica in faza avansata a bolii.Oricum intr-un numar mic de cazuri s-a decelat expresia alterata a unor gene mai ales:p53,p16, rb,EVI_1 fara sa se deceleze un pattern specific.

Majoritatea pacientilor cu leucemie mieloida cronica au cromozomul Philadelphia in varianta clasica si transcriptul BCR-ABL.Aproape o treime din pacientii cu leucemie mieloida cronica care au cariotip normal au o gena BCR-ABL oculta care este localizata pe aparent normalul cromozom 22 dar ocazional pe cromozomul 9.La pacientii ramasi la care boala este descrisa ca Ph- si BCR-ABL negativ bazele moleculare ale bolii nu sunt cunoscute..Exista un numar foarte mic de pacienti care au o forma care se aseamana cu leucemia mieloida cronica si care au modificari citogenetice in cele mai multe cazuri translocatii altele decat cromozomul Ph.Cele mai commune nonPh translocatii sunt:translocatia (5;12)(q33;p13) si translocatia (8;13) (p11;q12).Ambele translocatii genereaza gene de fuziune cu o componenta care este o gena care codifica pentru un receptor de tirozinkinaza numit plateled derived growth factor receptor beta in t(5;12) si factorul de crestere pentru fibroblaste receptor 1 in t(8;13).Studii functionale au aratat ca aceste gene de fuziune sugereaza ca si cauza a leucemiei mieloide cronice cai de semnalizare patologice apropiate de caile activate de oncoproteina BCR-ABL.

La aprox 50-80% din pacienti in timpul crizei blastice sau a fazei accelerate apar modificari citogenetice si moleculare aditionale .Modificarile citogenetice minore includ :monosomia cromozomului 7,17 si Y,trisomii ale cromozomilor 17 si 21 si translocatii t(3;21)(q26,q22).Modificarile majore includ ;trisomia cromozomului 8 ,isocromozomul I(17q),trisomia 19 si dublul cromozom Philadelphia.

Trisomia 8 este cea mai comuna si isocromozomul I(17q) apar aproape exclusiv in criza blastica mieloida.

Anomaliile citogenetice corespund unor modificari moleculare.Acestea includ anomalii p53(pe cromozomul 17),p130,RB1(13q14),c-MYC (8q24);p169INK 4 A(9p21);RAS si AML-EVI1 o gena de fuziune care rezulta din translocatia t(3;21) (q26;q22).Alterari ale p 53 (deletii,rearanjamente si mutatii) apar in 20-30% din pacientii cu leucemie mieloida cronica si sunt asociate exclusiv cu transformarea mieloida pe cand anomaliile RB 1 sunt associate mai mult cu transformarea limfoida .Mutatiile p53 in progresia leucemiei mieloide cronice sunt asociate cu o metilare aberanta al statusului celulelor leucemiei mieloide cronice.Introducerea unui grup metil in gena care codifica pentru calcitonina a fost gasita la pacientii care trec din faza cronica in criza blastica.Mai mult decat 50% dintre pacientii cu transformare limfoida au deletie homozigota a p16INK4A.Alterarea RB1 amplificari ale c-MYC si mutatii RAS sunt mai putin frecvente.

Biologia moleculara a cromozomului Philadelphia

Pe langa leucemia mieloida cronica care implica prezenta cromozomului Philadelphia exista si alte boli mieloproliferative cronice in care sunt implicate translocatii care activeaza tirozinkinaze.

Tabel

Anomalii citogenetice care implica tirozinkinaze in boli mieloproliferative cronice

FGFR1-factorul 1 de crestere pentru fibroblaste ,PDGFRA-factorul de crestere pentru receptorul de trombocite alfa,ZNF198-proteina zinc-finger 198,FOP FGRF1 partener oncogenic,CEP110-proteina 110 asociata centrozomului,HERV-K proteina endogena aretrovirusului uman (familia K),TEL –translocatia E26 transformatoare a proteinei leucemicspecifice,PDGFRB receptorul de crestere beta legat de trombocite,HIP 1 proteina 1care interactioneaza cu huntignina,RAB5-rabapina 5,H4-histona 4,JAK2 janus kinaza 2

Structurile si functiile celor doua componente de fuziune

Proteina BCR/ABL este efectul translocatiei reciproce echilibrate intre cromozomii 9 si 22.Cromozomii 9 si 22 se fractureaza la nivelul bratelor lungi in zonele unde sunt plasati locii protooncogenei ABL(la 9q34) si genei BCR1(la 22q11).

Gena ABL este omologul uman al oncogenei v-abl care este raspunzatoare de leucemia murina Abelson (A-MuLV) si codifica un nonreceptor de tirozinkinaza. ,masoara 230 Kb si contine 12 exoni dintre care primii 2 sunt numiti 1b si 1a deoarece in procesul de maturare al ARN m pot fii excizati alternativ.Produsul sau este o poteina de 145 Kda (p145) exprimata ubiquitar ce face parte din familia tirozin-kinazelor nonreceptori si are doua izoforme care rezulta din splicingul alternativ al primului exon.

Figura……

Structura proteinei ABL:Tipul Ia de izoforma este usor mai scurt decat tipul Ib care contine un sit myr care este un loc de atasare la membrana plasmatica.De notat cele3 domenii SRC de omologie(SH) situate aproape de capatul NH2 terminal.Y393 este locul major de autofosforilare intre domeniile kinazice iar fenilalanina 401(F401)este conservata in partea SH1.Mijlocul fiecarei proteine este dominata de regiunile bogate in prolina capabile sa se lege de domeniile SH 3.Capatul carboxiterminal contine ADN care apartin domeniilor G si F actinic.Sunt vizualizate locurile de fosforilare Alm,cdc2 si PKC.Sageata indica pozitia punctului de rupere in proteina de fuziune BCR-ABL

Contine mai multe domenii functionale insiruite in directia NH2-COOH ; trei domenii SRC (SH3-SH2-SH1) localizate aproape de capatul NH2 terminal.,trei domenii bogate in prolina (ab1,ab2,ab3),un domeniu cu rol de semnal de localizare nucleara (NLS),un domeniu de atasare actina .SH1 contine activitatea tirozinkinazica.Celelalte doua domenii SH si domeniile ab servesc la cuplarea proteinei ABL la secventele specifice sau complementare din structura altor molecule partenere:SH2 cu fosfotirozine ,SH3 cu segmente bogate in prolina .Secventele bogate in prolina din centrul moleculei pot sa interactioneze cu domeniile SH3 ale altor proteine ca Crk.Apoape de capatul 3 se gasesc locuri pentru semnale nucleare ,locuri de legare pentru ADN,si locuri de legare pentru actina.

Proteina normala ABL este implicata in reglarea ciclului celular ,in raspunsul la stresul genotoxic si in transmiterea informatiilor de la micromediu celular prin calea integrinelor.De asemenea se pare ca proteina ABL are un rol complex ca modul celular care integreaza semnalele de la surse variate extra si intracelulare care influenteaza deciziile cu privire la ciclul celular si la apoptoza.De remarcat ca aceste date sunt bazate pe studii in vitro pe fibroblaste si nu pe celule hematopoietice astfel incat sunt inca controversate.

Punctele de ruptura ale genei ABL in regiunea 9q34 pot apare oriunde pe o portinune de 300kb la capatul 5 terminal la nivelul exonului 2.mai sus decat primul exon alternativ Ib si mai jos de al doilea exon alternativ Ia mai frecvent intre cele doua.

Materialul genetic situat in aval de punctual de rupere migreaza pe cromozomul 9 .Punctele de rupere ale genei ABL sunt plasate catre extremitatea 5 ‘,inaintea exonului 2.Fragmentul distal al genei care migreaza pe cromozomul 22 cuprinde exonii 2-11(marcati cu “a”).Prin rearanjarea pe cromozomul 22 fragmentul distal al genei abl fuzioneaza cu segmental proximal din gena bcr ramas pe loc

Gena BCR ca si gena ABL este exprimata ubicuitar si codifica pentru o proteina de 160 kd. Gena BCR 1 este inclusa intr-un megalocus complex in care sunt insiruite in directia centromer-telomer 8 gene :BCR2-gena pentru sindromul di George,BCR5,BCR4 gena pentru lantul  de imunoglobulina ,BCR1 -BCR3-BCR6 .

Pot fi definite cateva structuri. Prima cu exon N -terminal codifica pentru o serintreoninkinaza.Singurul substrat pentru aceasta kinaza este Bap-1 un membru al familiei de proteine 14-3-3 si posibil BCR insusi.Domeniul coiled-coin al capatului N terminal BCR permite formarea de dimeri in vivo.Centrul moleculei contine o regiune cu asemanator pleckstrinei (PH) care stimuleaza schimbul de guanidintrifosfat (GTP) si guanidinbifosfat (GDP) pe factorii de schimb Rho guanidine care in schimb poate activa factorii de transcriptie ca NF-kB.Capatul C terminal are activitate GTPazica pentru Rac si o activitate GTP-azica scazuta pentru superfamilia Ras care regleaza polimerizarea actinei si activitatea NADPH oxidazei in celulele fagocitare.

De asemenea BCR poate fi fosforilat de cateva reziduri de tirozina mai ales tirozina 177 care leaga Grb-2 o molecula importanta implicata in activarea caii Ras.De remarcat ca ABL s-a dovedit ca fosforileaza BCR in celulele COS1 ceea ce determina o reducere a activitatii kinazice a BCR.Aceste date sunt argument pentru rolul BCR in transductia semnalelor dar rolul ei biologic ramane sa fie dovedit.

Figura…

Structura proteinei BCR:de notat domeniul de dimerizare(DD) de la capatul NH2 terminal si cele doua domenii de omologie de 2 ciclic adenozin monofosfat kinaze la capatul N terminal.Y177 este locul crucial de autofosforilare pentru a lega la Grb-2.Centrul moleculei contine o regiune de omologie cu Rho guanidin,nucleotid exchange factor(Rho-GEF) ca si cu domeniile dbl-like si plekstrin omolog domeniu.Aproape de capatul C terminal este un loc punctiform pentru schimbarile ……..

Proteina BCR se poate autofosforila sau mai multe tirozine din structura sa pot servi ca substrate pentru tirozinkinaze din diverse surse moleculare.

Spre deosebire de gena Abl in care punctul de ruptura este la nivelul exonului 2 gena BCR are trei mari puncte de ruptura asa numitele breakpoint cluster region (BCR).

In LMC si in aproximativ o treime din cazurile de leucemie acuta limfoblastica Ph+ linia de ruptura a genei BCR 1 se produce intr-o zona mica de 5,8 Kb denumita M-bcr (Major- breakpoint cluster region) care cuprinde aria exonilor 12-16 (denumiti si b1-b5). Gena de fuziune (5’ BCR/ABL 3’) care se asambleaza pe cromozomul Ph 1 se transcrie intr-un ARN m hibrid primar.Acesta poate suferi excizii alternative ale exonilor BCR 13 (b2) sau 14 (b3) care au ca rezultata variante de fuziune b2a2 sau b3a2.Acestea sunt traduse in proteina himerica P 210 .gena de fuziune transcriptul hibrid si proteina himerica constituie pecetea diagnosticului la nivel molecular al LMC.

Saglio si colab au descris o noua pozitie pentru punctul de rupere al genei BCR care este localizat in directie 3’ fata de punctual major M-bcr intre exonii e19 si e 20 creind un nou transcript de fuziune e19a2.Acest transcript contine o parte din gena BCR si codifica pentru o proteina de fuziune p230.

Mecanismele care provoaca t (9:22)(q34;q11) nu sunt cunoscute in detaliu.Translocatia nu reprezinta evenimentul per se al leucemogenezei.analizand expresia G6PD in celulele bolnavilor cu LMC Fialkow si colab . aduc argumente in sprijinul originii clonale a bolii si a faptului ca proliferarea clonala precede apritia translocatiei.Cu ajutorul RT-PCR s-a demonstrat ca celulele sanguine al unor persoane normale pot exprima titruri mici de ARNm hybrid BCR/ABL(cca.1-10 transcripte /10 8 celule )cu o frecventa individuala care creste paralel cu varsta .In anumite conditii experimentale s-au indus fuzionari ale genelor BCR si ABL.S-au inregistrat diverse variante hibride dintre care numai unele indeplineau conditiile corecte de respectare a cadrului de lectura care permit in continuare transcriptia si translatia .S-a sugerat ca fuzionarea BCR/ABL ar putea avea loc in vivo in mod continuu in celulele hematopoietice primitive normale dar ca numai fuzionarile corecte s-ar traduce in formarea proteinei himerice functionale si s-ar asocial in acest mod cu un avantaj selectiv soldat cu expansiunea clonala.S-ar parea ca recombinarea celor doua gene nu ar fi doar un eveniment intamplator .In nuclei celulelor CD 34+ ele sunt dispuse la distanta destul de mica una fata de cealalta ,iar momentul tranzitiei S-G2 ajung chiar sa se invecineze ceea ce ar favoriza producerea translocatiei.In faza cronica de debut a LMC translocatia afecteaza numai cate un cromozom ai perechilor 9 si 22.Conform unor argumente de ordin citogenetic s-a sugerat ca participantii la schimbul de material genetic ar fii cromozomul 9 de provenienta paterna si cromozomul 22 de origine materna.

Fragmentul distal al genei care migreaza pe cromozomul 22 cuprinde exonii 2-11(marcati cu “a”).Prin rearanjarea pe cromozomul 22 fragmentul distal al genei abl fuzioneaza cu segmental proximal din gena bcr ramas pe loc.Tranlocatia reciproca 9;22 se soldeaza cu o pierdere mare de material genetic din zestrea primara a cromozomului 22 care se stramuta pe cromozomul 9.Morfologic cromozomul 22 rearanjat apare micsorat ca si cum ar fi suferit o deletie (22q-).Nowell si Hungerford au fost primii care au sesizat in 1960 anomalia de talie a cromozomului 22 pe care l-au denumit cromozomul Philadelphia (ph1) fiind corespondentul citogenetic al LMC.

Proteina P 210 genereaza fenotipul LMC prin domeniile functionale ale proteinelor primare (BCR si ABL) care se regasesc in produsul de fuziune .Doua zone ale componentei BCR (codificate in primul exon al genei) contribuie in mod decisiv la capacitatea transformatoare a proteinei himerice .Prima ,care cuprinde aminoacizii 1-63 de la capatul aminoterminal (corespunzand domeniului DD al genei) produce homodimerizarea proteinei BCR/ABL si este implicata in activarile unor functii ale componentei ABL:Tk si atasarea de actina.Cea de-a doua ,ce corespunde aminoacizilor 176-426 contine secventele necesare pentru legarea la domenii SH2 si pentru atasarea adaptorului Grb 2.Functiile specifice ABL esentiale pentru activarea Tk (fosforileaza tirozine din diverse substrate si tirozine proprii – efect autoactivator)de conservarea intacta a domeniului SH2 si de activarea domeniului de atasare la actina.

Desi pare sa fie clar rolul proteinei P210 in procesul de leucemogeneza exista numeroase intrebari fara raspuns.

Singurul factor cunoscut ca fiind predispozant il reprezinta radiatiile ionizante.Pentru cei mai multi pacienti nu se identifica un factor predispozant iar cauza translocatiei cromozomiale este obscura.De asemenea este greu de inteles mecanismul prin care apare inevitabil progresia din faza cronica in faza accelerata si criza blastica fatala.Heterogenitatea clinica a acestei boli este inca neexplicata.Cu terapie standard durata medie de supravietuire este de 6 ani dar exista pacienti care mor in primul an de la diagnostic iar altii supravietuiesc mai mult de 20 de ani.La unii pacienti boala debuteaza cu o faza cronica agresiva iar la altii boala este indolenta.Ce face diferenta?

Tirozinkinaza BCR-ABL determina leucemia mieloida cronica.Logic trebuie sa activeze una sau mai multe cai de transmitere a semnalului catre un fenotip malign dar nu s-a decelat o cale bine definite

Mecanisme de leucemogeneza

Ideea ca leucemia mieloida cronica ca si alte cancere este rezultatul unei evolutii secventiale patogenice multistep este cunoscuta de aproximativ 20 de ani dar nu se stie foarte mult despre modificarile moleculare care preced aparitia cromozomului Philadelphia.Se pare ca generarea unei gene BCR-ABL in celula stem pluripotenta apare in conditiile reducerii supravegherii imunologice .Opinia ca aparitia genei de fuziue BCR-ABL este primul pas in geneza leucemiei mieloide cronice este sustinuta si de experimentele efectuate pe soarece la care transfectarea de celule stem cu gena BCR-ABL produce o boala asemanatoare cu leucemia mieloida cronica.Odata debutata afectiunea faza cronica a bolii variaza de la pacient la pacient si trebuie sa fie influentata de alti factori.

Mecanismul prin care apare cromozomul Philadelphia si modul in care se ajunge la afectiune este necunoscut.S-a ipotizat ca apropierea genelor BCR si ABL in celulele hematopoietice in interfaza poate favoriza translocatiile intre cele doua gene.Recent s-a identificat un duplicon (doua copii de ADN repetitiv )de 76 kb pe cromozomul9 aproape de genaABL si pe cromozomul 22 aproape de gena BCR care poate fi implicat in translocatie dar mecanismul ramane actual pur speculativ.

Oricare ar fi mecanismul initial este cunoscut ca are loc cresterea masei mieloide atat celule mature cat si precursori mieloizi .Pana in anii 80 nu era foarte clar daca exista celule mieloide stem Ph- la pacientii nou diagnosticati.Oricum cercetarile facute au demonstrat prezenta progenitorilor mieloizi normali in maduva osoasa si s-a observat ca progenitorii Ph- pot fi identificati dupa doze mari de chimioterapie sau dupa scheme de tratament care includeau Interferon.Concluzia a fost ca clona mieloida Ph+ inlocuieste celulele hematopoietice normale dar nu distruge celulele stem normale reziduale.

In general se crede ca leucemia mieloida cronica se dezvolta dintr-o singura celula stem pluripotenta care achizitioneaza un cromozom Philadelphia cu gena de fuziune BCR-ABL care confera celulelor progenitoare avantaje de proliferare fata de elementele hematopoietice normale.

Aceasta clona Ph+ cu timpul disloca hematopoieza normala reziduala.Nu se cunosc mecanismele moleculare si citogenetice prin care apare de fapt boala.De asemenea bazele moleculare ale acestui avantaj de proliferare nu sunt bine cunoscute dar pot fi legate in parte de expresia in progenitorii leucemici a factorilor de crestere mai ales interleukina 3 si factorul de crestere al coloniilor mieloide.Oricum celulele leucemice supravietuiesc mai mult decat cele normale ca rezultat al defectului apoptotic care le impiedica maturizarea si moartea fiziologica.

Modificarea cea mai importanta in leucemia mieloida cronica o reprezinta prezenta proteinei himerice BCR/ABL P210 in celulele leucemice.P 210 induce trei mecanisme cu importanta majora in leucemogeneza;activarea sistemelor de transmitere intracelulara a semnalelor care promoveaza proliferarea ,reducerea adeziunii celulelor leucemice in micromediul celular(celulele stromale si matricea extracelulara) si inhibitia apoptozei.

Potentialul transformator al proteinei BCR/ABL se datoreste activitatii de tirozinkinaza a segmentului ABL din componenta sa.Activitatea tirozinkinazica este promovata de unele secvente ale segmentului BCR.BCR actioneaza prin promovarea dimerizarii oncoproteinei astfel incat cele doua molecule adiacente BCR-ABL fosforileaza fiecare un reziduu tirozinic si astfel activitatea sa creste.Activitatea kinazica a BCR-ABL devine necontrolabila astfel incat uzurpa functiile fiziologice ale enzimei normale ABL si interactioneaza cu o varietate de efectori si proteine rezultatul final fiind dereglarea activitatii celulare proliferative cu scaderea aderentei celulare in maduva osoasa si reducerea raspunsului apoptotic la stimulii oncogeni mutageni.Din pacate contributia relativa a acestor efecte la desfasurarea fazei cronica a leucemiei mieloide cronice este putin cunoscuta.

BCR-ABL tirozinkinaza provoaca activarea unor substrate prin transferul unor grupari fosfat (provenite din ATP) la diverse tirozine din structura acestora.

Proteina BCR/ABL activeaza prin acest mecanism mai multe proteine intracelulare (molecule adaptoare ,factori de transcriptie,proteine ale scheletului celular ,enzime si in plus poseda capacitatea de autoactivare prin fosforilarea unor tirozine proprii(autofosforilare).

Proteina BCR/ABL :rol intre structura si functii

Structura proteinei BCR-ABL si rolul sau au fost intens studiate.Cunostinte despre rolul si

functiile domeniilor continute care deriva de la cele doua proteine initiale BCR si ABL sunt utile

pentru a intelege rolul proteinei de fuziune rezultate.Tirozinkinaza codificata de domeniul SH1 al

componentei ABL a fuziunii BCR este importanta pentru transformarea oncogenetica .Alte

domenii impotante ale portiunii ABL sunt proteinele de interactiune SRC homology 2(SH2) si

domeniile C –terminale legate de actina.

Proteina P210 contine elementele necesare pentru activarea directa a componentelor

functionale ale cailor de semnalizare:proteine adaptoare,enz ime si factori de transcriptie in

plus fosforileaza sau regleaza proteine componente ale scheletului celular si proteine

reglatoare ale apoptozei.Prin aceste proprietati P210 se substituie etapei de initiere a

semnalelor care implica in celule normale asocierea citokinelor cu receptorii.Se pare ca in

aceasta substitutie functionala nu este perfecta intrucat s-a demonstrat asocierea proteinei

BCR/ABL cu lantul c al rceptorului IL3.Segmentul intracitoplasmatic al c functioneaza ca

transductor de semnale ( prin atasarea Jak si PI-3K pe zona sa proximala submembranara) si

ca promotor al viabilitatii ( prin atasarea Shc pe zona distala si activarea via Raf a factorilor

de tranzitie jun si fos).

Domeniile structurale ale proteinei BCR/ABL au o contributie nuantata in inducerea transfor-

marii celulelor mutante:1)domeniul de oligomerizare NH2 terminal este necesar pentru

fosforilarea secventei TK si pentru autofosforilare; -autofosforilarea implica o autoactivare a

la longue independenta de stimularea prin citokine si totodata fosforilarea tir care devine situl

de recrutare a Grb2,in esenta BCR/ABL se comporta ca o tirozinkinaza

nonreceptor; 2)domeniul SH3 ( care in proteina nativa c-ABL inhiba activitatea TK) este

inhibat in proteina de fuziune fie printr-o autoinhibitie legata de o rearanjare conformationala

dupa fuzionarea ABL cu BCR fie ca urmare a formarii homodimerilor BCR/ABL;3)domeniul

SH2 este necesar pentru transformarea tumorala prin BCR/ABL in diverse modele experimentale in vivo.Activarea Myc indusa de BCR/ABL este dependenta de domeniul SH2.Semnalul ar fi transmis prin intermediulRas/Raf si al factorilor de transcriptie care activeaza promoterul oncogenei c-myc ;4)domeniul TK (SH1) este esential pentru inducerea transformarii maligne.Situl enzimatic este integrat intr-o bucla de activare.Activarea Tk produce printre altele autofosforilarea unor Tir din componenta buclei.In P210 autofosforilarea Tir este esentiala pentru stabilizarea buclei in conformatie activa intrucat mutatia sa compromite efectul transformator al BCR/ABL;5) domeniul de prindere la actina mediaza localizarea proteinei BCR/ABL la nivelul membranei celulare.BCR/ABL induce cresterea numerica a moleculelor de F-actina ,anomalii in organizarea scheletului celular si in expresia receptorilor pentru integrine.Asocierea BCR/ABL cu F-actina induce tirozinfosforilarea proteinelor citoscheletale si a unor molecule de adeziune focala(paxilina,tensina,vinculina,talina,FAK-“focal adhesion kinase”,cas-“Crk associated substrate ,Hef 1)care se asociaza in complexe multimerice.Legarea acestor complexe multimoleculare cu proteina BCR/ABL se produce prin intermediul paxilinei si al unei proteine adaptoare denumita Crkl.Legarea Crkl de proteina BCR/ABL este atat directa -la secventele bogate in prolina ale acesteia cat si indirecta prin intermediul altei proteine,Cbl care se fixeaza pe domenilu SH2 al BCR/ABL si pe Grb2 atasata de Tir.Crkl este un substrat de importanta majora al proteinei BCR/ABL intrucat creaza legaturi functionale si sustine activarea altor adaptori(Shc,SOS,Grb2) sau enzyme (PI-3K)cu functii in transductia semnalelor sau ataseaza proteinele Cas si hef 1 implicate in functia receptorilor pentru integrine.Crkl joaca deci rolul central in orchestrarea semnalelor intracelulare induse de BCR/ABL si in recrutarea acesteia la scheletul cellular.

Proteina BCR/ABL :rolul in leucemogeneza

Trei mecanisme majore ar fi implicate in transformarea maligna indusa de proteina BCR/ABL:activarea semnalelor de proliferare,reducerea adeziunii celulelor progenitoare mutante la stroma si la matricea extracelulara si deprimarea apoptozei.

Proteina BCR/ABL este capabila sa activeze direct proteine care mijlocesc conectarea sa cu caile de semnalizare Ras si PI-3K 1)Shc si Grb 2 care initiaza calea ras-MAPK si calea PI-3K prin complexa Shc/PI-3k,2) Crkl care formeaza complexele multimerice cu proteinele BCR/ABL,Cbl si Grb2 prin care se deschide calea SOS-Ras_MAPK,3)PI-3K activata direct (in complexele cu Crkl-BCR/ABL) conectata cu Ras in amonte si Akt in aval,4) proteina 14-3-3 care interactioneaza cu Raf.

De asemenea proteina BCR/ABL poate activa direct ( eludand etapa jak) si proteinele STAT 1 si 5 prin intermediul domeniilor sale SH2 si SH3.Activarea STAT 5 ar contribui la transformarea maligna in experimente cu unele linii celulare.Efectele acestor activari in vivo sunt greu de disecat intrucat majoritatea observatiilor au fost facute pe celule transfectate cu proteine BCR/ABL mutante la care s-a indus deficienta unor segmente constitutive.Se accepta insa ideia conform careia BCR/ABL activeaza mai multe cai prin intermediul proteinelor Ras ,STAT si Akt pentru a genera semnale multidirectionale ce stimuleaza continuu proliferarea si supravietuirea.Unul dintre acesti stimulatori ar putea fi c-Myc care este produsa in cantitate mare in celulele BCR/ABL positive .Activarea Myc este dependenta de domeniul SH2 al BCR?ABL .In experimente cu cellule normale Myc poate elibera semnale de proliferare sau semnale proapoptotice in functie de conditiile create.In leucemia mieloida cronica semnalele apoptotice sunt insa neutralizate cel ma I probabil prin intermediul caii PI-3K.

Apoptoza ( moartea programata a celulelor ) este un proces fiziologic care opereaza in faza G1 a ciclului celular cand in functie de stimuli ambientali celulele opteaza pentru trecerea in faza S sau pentru moarte.Sistemul este reglat de proteinele familiei BCL2 Bcl-xL si din promotoare ale apoptozei (Bax,Bak,Bik Bad) Unele proteine ale familiei (Bcl2,Bcl-xL,Bax,Bad ) sunt localizate pe membrana mitocondriala .Celulele BCR/ABL pozitive sunt mai rezistente la apoptoza decat cele normale.Sunt discutate mai multe posibilitati;1) activadrea Bcl 2 prin intermediul cailor Ras si IP-3K/Akt;2)stimularea transcriptiei Bcl-xL de catre STAT 5 posibil prin intermediul Crkl care poate functiona ca un adaptor pentru STAT5;3)fosforilarea Bad indusa de Akt si Raf;4) blocarea eliberarii citocromului C din mitocondrii. De asemenea alt mecanism antiapoptotic ar fi inhibitia unei proteine de legare a IFN  ,ICSBP( interferon consensus secquence binding protein).

Aderenta celulelor progenitoare din LMC la structurile stromei medulare este mult diminuata.Aceasta explica descarcarea in sangele periferic a precursorilor granulocitari.Celulele hematopoietice normale exprima receptori din familiile integrinelor (21,41,51) si selectinele (E -selectina sau ELAM 1)care se cupleaza cu moleculele adeziotrope expuse pe cellule ale stromei (VCAM 1,ICAM 2) sau constituiente ale matricei extracelulare ( fibronectina,trombospondina ,vitronectina,laminina ,colagenul).Aceste legaturi slabesc progresiv in cursul maturarii celulelor normale ceea ce permite desprinderea acestora si diabaza.Contactul celulelor primitive cu elementele adeziotrope stromale influenteaza semnificativ unele functii celulare cum ar fii proliferarea,transductia semnalelor si organizarea scheletului cellular.In culturi de lunga durata s-a observat inhibarea proliferarii progenitorilor normali sub influenta productelor stromale.Mecanismul ar fii mediat de interactiunea dintre receptorii integrinei si fibronectina.Dupa stimulare receptorii integrinici se aglomereaza in manunchiuri si formeaza complexe multimoleculare cu elemente citoscheletale iar PI-3K ar fi implicata in rearanjarea actinei si in formarea complexelor citate.Interactiunea receptorului integrinic influenteazza atat legarea sa cu liganzii externi cat si transmiterea unor semnale in celule.

Celulele leucemice prezinta defecte in expresia pe suprafata a moleculelor de integrine si selectine iar aderarea lor la fibronectina ,laminina si colagen (tipul IV) este diminuata.Ele exprima o varianta moleculara a lanturilor 1 de integrina care inhiba partial adeziunea lor la stroma si prezinta o mobilitate crescuta pe fibronectina.Defectul cuplarii integrina-fibronectina poate fi corectat experimental prin inhibitia exprimarii genei BCR/ABL cu ajutorul oligonucleotidelor antisens ceea ce demonstreaza legatura intre defectul genetic si cel al adeziunii.Proteina P 210 se ataseaza de membrana celulara prin intermediul legaturii sale cu actina si induce :defect de grupare a recptorului integrinic ,deficienta formarii complexelor receptorului cu proteinele citoscheletului,polimerizarea defectuoasa a actinei si afectarea transferului semnalelor de reglare a proliferarii.Exista relatii intre proteina P210 si Crkl .se pare ca Crkl influnteaza o retea de influnte prin care proteina BCR/ABL ar altera functional receptorii integrinici.Crkl induce fosforilarea directa a uni numar mare de proteine:paxilina,talina,vinculina,FAK,Cas,Hef 1 si Cbl.Shc activata de Cbl produce impreuna cu FAK fosforilarea PI-3K care la randul sau activeaza proteina Rac implicata in reglarea interactiunilor dintre scheletul cellular si integrine si in generarea anomaliilor motilitatii celulelor BCR/ABL+.Aceste anomalii pot fi annihilate de catre interferonul .

Figura….

Mecanismele de transformare celulara induse de BCR-ABL pot fi grupate in :

1)deregalrea activitatii tirozinkinazice a proteinei Abl

2)Actiunea pe caile de transmitere intracelulara

Dereglarea activiatii tirozinkinazice a ABL

Proteina himerica BCR-ABL are o activitate tirozin-kinazica mai mare fata de a proteinei p145 ABL.Diverse zone ale proteinei himerice sunt esentaiale pentru transformarea celulara.In ABL acestea implica domeniul SH1,SH2 si domeniul de legare al actinei.In BCR sunt importante domeniul coiledcoil de oligomerizare care contine aminoacizii 1-63,tirozina in pozitia 177 si secventele bogate de fosfoserina-treonina intreaminoacizii 192-242 si 298-413.Formele carora le lipseste situl tirozinkinazic sau care au mutatii in domeniul SH1 de autofosforilare a partii ABL nu au potential transformator.

Kinaza ABL este srtict reglata in conditii fiziologice fie de mecanisme care actioneaza in pozitie cis fie de mecanisme care actioneaza in pozitie trans.Domeniul SH3 are un rol cheie in procesul de inhibitie deoarece deletia sa sau orice alterare pozitionala activeaza kinaza.

In vivo exista diverse proteine care leaga ABL.Abi-1 si Abi-2 (proteinele de interactie ABL) activeaza functia inhibitorie a domeniului SH3.

Un alt inhibitor al ABL este Pag/Msp23 care in urama expunerii celulelor la stress oxidativ ca radiatii,este oxidat si se disociaza de ABL.Aceasta sugereaza ca inhibitia constitutiva deriva din mecanisme ….In alternativ domeniul SH3 poate lega intern regiunea bogata in proline al centrului proteinei ABL determinanad o modificare conformationala care inhiba interactiunea cu substratele.Fuziunea secventei 5” a BCR cu domeniul SH3 al ABL elimina functia fiziologica inhibitorie.

Anumite studii au demonstrat ca secvente ale genei BCR sunt esentaiale pentru autofosforilarea in vivo a P210 si pentru a-i conferi o capacitate transformanta.se presupune ca este implicata o interactiune directa intre secvente de aminoacizi codificate de primul exon al BCR si domeniul reglator tirozin-kinazic SH2 al ABL.Secventa BCR poate substitui din punct de vedere functional miristilarea si sau deletia domeniului SH3 in activarea oncogenei ABL.

Regiunile cele mai importante sunt cele care cuprind aminoacizii 1-63 si amoniacizii 176-242.

Prima regiune are o structura de elice care determina formarea unui complex tetramolecular in proteina nativa.In proteina hibrida p210 partea care apartine c_abl care are o structura monomerica sufera un proces de tetramerizare tocmai in aceasta regiune cu fosforilari sonsecutive intermoleculare ale reziduurilor tirozin-kinazice.

Aceasta oligomerizare creste activitatea legaturii dintrwe ABL si proteina F-actinica conferindu-i p210 posibilitatea sa interactioneze cu proteinele care la randul lor leaga moleculele de adeziune avand functia de a transmite semnalele de inhibitie a cresterii si diferentierii.

A doua regiune aminoacidica a primului exon BCR se leaga cu mare afinitate de domeniul SH” al c-ABL crescand eficienta de interactiune cu regiunile tirozin-fosforilate.

Substratele BCR-ABL pot fi regrupate in functie de rolul lor fiziologic in adaptorii moleculari ca Crkl si p62 care sunt proteine implicate in organizarea citoscheletului si a menmbranei celulare ca paxilina, talina si proteine cu functie catalitica ca Fas.

Alegerea substratelor depinde de contextul celular –de exemplu Crkl este proteina fosforilata de neutrofile in timp ce p62 este fosforilata mai ales in celulele progenitoare.

Se suspicioneaza ca BCR-ABL poate avea un rol in instabilitatea genomica si transformarea leucemieie granolociatre cronice in criza blastica .

Cu timpul clona leucemica isi pierde capaciatea de diferentiere si apar anomalii cromozomiale secundare care duc inevitabil la criza blastica.

Caile si mecanismul de actiune a BCR-ABL

Exista trei mecanisme importante care sunt implicate in transformarea maligna sin partea BCr-ABL

1)alterarea adeziunii la celulele stromale si la matricea extracelulara

2)activarea semnalului mitogen

3)inhibarea apoptozei

impreuna aceste procese duc la alterarea maturarii celulare care caracterizeaza leucemia mieloida cronica

Alterarea proprietatilor adezive

In leucemia mieloida cronica celulele progenitoare au o adeziune diminuata a celulelor la stroma medulara si la matricea extracelulara.

A fost evidentiata in mod paticular o adeziune diminuata intre celulele care au p210 si fibronectinacare reprezinta una dintre cele mai importante molecule ale microambientului medular.

Adeziunea la stroma medulara este in general reglata in contratimp cu proliferarea celulara dar celulele leucemice se sustrag acestui mecanism de reglare in virtutea alterarii propritatilor lor adezive.In interactiunea intre stroma si celulele progenitoare un rol impotant il au integrinele .

In leucemia mieloida cronica celulele exprima o varianta a integrinei 1 care este inhibitoare a adeziunii care nu este prezenta in celulele normale.

Integrinele legandu-se de receptorii lor sunt in gradul de a induce semnalul normal de transductie din exteriorul in interiorul celulei.sepoate deci presupune ca transferul semnalului care inhiba proliferarea in leucemia granulociatara cronica este impiedicat.

P 210 fosforileaza diverse proteine implicate in mecanismele de adeziune celulara printre care paxilina ,FAK si Crkl provocand o alterare a activitatii lor.Modificarile propritatilor de adeziune celulara in celula Ph + se exprima prin eliberarea in circulatie a precursorilor hematopoietici cu infiltrarea organelor nonhematopoietice ca splina si cu pierderea inhibitiei de contact.

Tratamentul cu Interferon sau cu inhibitori specifici ai funtiei tirozin-kinazice (imatinib) a p210 determina revenirea la un comportament adeziv normal din partea celulelor Ph+ si o reducere a mobilitatii cu regasirea capacitatii de legare cu integrinele.

Activarea semnalului mitogenic

Ras si cascada MAP/kinazelor

Au fost evidentiate diverse legaturi intre BCR-Abl si Ras.Mecanismul de activare a Ras este mediat de proteine adaptatoare ca Grb-2 si SHC.Autofosforilarea Tyr177 furnizeaza un loc de ancorare pentru adaptorul molecular Grb-2 care apoi fiind legat de proteina Sos stabilizeaza Ras in forma sa activa care leaga GTPul.

De asemenea alti doi adaptori moleculari ca SHC si Crkl pot sa activeze Ras ambii find substrate ale proteinei BCR-ABL si o pot lega cu domeniile SH2(SHC) si SH3(Crkl).Dovada ca activarea Ras este importanta pentru patogeneza leucemiei granolocitare cronice deriva din observatia ca in leucemia granulociatara cronica mutatiile Ras sunt absente chiar si in faza blastica a boliispre deosebire de alte tumori in care aceasta mutatie este mai frecvent intalnita.Aceasta inseamna ca calea Ras este constitutiv activa si nu exista mutatii ulterioare.

Stimularea receptorilor de citokine ca Interleukina 3 (IL-3)determina activarea ras si la recriutarea serin-treonin kinazei Raf pe membrana celulara.

Raf induce cascada de semnale prin intermediul serin-treonin kinazelor Mek1/Mek2 si Erk care in final duc la activarea transcriptiei genice.

Semnalul Ras poate fi transmis pe cale aRac care este un factor de schimb al GDP-ului cu GTP-ul si a Gckr(germinal center kinase related) si in final Jnk/Sapk.

Este posibil ca BCR-ABL sa utilizeze cai ale factorilor de crestere in mod direct.S-a observat asocierea cu subunitatea c al receptorului interleukinei 3 cu receptorul c-kit.

Calea Jak-Stat

In celulele BCr-ABL pozitive exista o fosforilare constitutiva afactorilor de transcriptie Stat (Stat 1 si Stat 5) si in mod depsebit activarea Stat 5 pare sa contribuie la transformarea maligna.Se stie ca functia fiziologica a Stat5 este pleiotropica si efectul sau pe celulele transformate este in principal antiapoptotic si implica activarea trascriptionala a Bcl-Xl.

In mod normal in urma stimulilor fiziologici kinazele Janus fosforileaza factorii transcriptionali STAT activandu-i.Proteina BCR-ABL poate activa Stat1 si Stat5 fara o fosforilare precedenta.

Pentru a explica rolul jucat de caile Ras si Jak-Stat in raspunsul celular e importanta observatia ca BCr-ABL este capabila sa faca independente liniile celulare care sunt dependente de factorii de crestere.

In timpul fazei cronice a leucemiei mieloide cronice celulele progenitoare sunt dependente pentru supravietuirea lor si proliferarea lor de factorii de crestere externi in mica masura fata de celulele normale.

Calea fosfoinozitol-3-kinazei(PI 3 -kinaza)

Activitatea PI 3 kinazei este ceruta de proliferarea celulelor BCr-ABL pozitive.PI13 kinazele fosforileaza fosfatidilinozitolul (PI) in pozitia D3 in vivo si produce in principal PI-(3,4)-bifosfat si PI-(3,4,5)-trifosfat care pot sa functioneze ca mesageri secundari.PI3K este implicata in reglarea functionala a proteinei Akt(supravietuire si crestere) ,Rac(motilitate si supravietuire),S6K(sinteza proteica).

PI3K poate de asemenea sa fie rweglata de Ras si poate sa regleze ea insasi functia Ras.Proteina BCr-ABL formeaza complexe multimerice cu PI3-kinaze si cu moleculele adaptatoare Crk si Crkl care o activeaza.

Succesiv substratul activat in aceasta cascada este serin-treonin kinaza Akt implicata in semnalul antiapoptotic.

Proteina proapoptotica Bad este substratul cheie al Akt.

Cand bad este fosforilata si inactiva nu este capabila sa lege proteine apoptoitce ca Bclxl.

BCR-ABL este in grad sa fosforileze activand doua tipuri de inozitolfosfataza ,Ship1 si Ship2 care sunt fiziologic activat in raspunsul la factorii de crestere.

Se pare ca actiunea principala a proteinei Ship nu este aceea de a pune in stricta relatie actiunea fosfatazica care ar fi constitutional activata cand interactionanad prin intermediul domeniului SH2 si prin regiune abogata in prolina cu alte proteine de semnal ca SHC ,SHP2 si Grb-2 care ar duce la efectul final antitumoral.

Calea MYC

Gena Myc este supraexprimata in multe tipuri de tumori umane,codifica pentru o proteina de 439kda localizata mai ales in nucleu.

MYC este un factor transcriptional care poate lega ADN-ul prin intermediul domeniului sau “leucin zipper” si motivul “elice –loop-elice”.

Aceasta proteina poate regla expresia genelor tinta reglandu-se de secvente de ADN dupa dimerizare cu o alta proteina ca MAX.

Complexul MYC/MAX activeaza si promoveaza proliferarea si transformarea celulei.

Activarea MYC din partea BCr-ABL nu este inca bine cunoscuta si depinde de domeniul SH2.

Rezultatele obtinute din studiul celulelor transformate cu v-ABL sugereaza ca semnalul este transmis prin intermediul kinazei ciclice dependente (cdks) ca Ras/Raf si factori de trasncriptie ca e2F care activeaza promotorul MYC.

Mutatiile in domeniul SH2 si in regiunea de legatura cu Grb-2 ,domenii implicate in activarea c-MYC determina o pierdere a potentialului transformant al p210 care poate fi restabilit prin intermediul unei expresii crescute a c-Myc.

Inhibarea apoptozei

Expresia BCR-ABL determina apoptoza in relatie directa cu activitatea tirozin-kinazica si prin intermediul activarii Ras.

Mai multe studii au evidentiat ca celulele Ph+ sunt rezistente la apoptoza indusa de leziunile ADN-ului.

Mecanismele biologice ale acestui efect nu sunt inca bine stiute .BCr-ABL poate bloca eliberarea citocromului C din mitocondrii si deci sa impiedice activarea caspazelor.aceasta ar putea fi mediata de proteinele din familia Bcl2 in dependenta Ras sau PI3K.

O alta legatura intre inhibitia apoptozei si BCr-ABL ar putea fi fosforilarea proteinei proapototice bad.

Bad are functie antiapoptotica si determina moartea celulara.Semnalele de supravietuire mediate de cuitokine ca IL-3 ,NGF(nerve growth factor) sau IGF(insului-like growth factor) determina fosforilarea Bad in doua reziduuri (Ser112 si Ser136) prin intermediul unei cai dependente de PI3K/Akt.Consecinta fosforilarii si inhibitiei legaturii Bcl-XI este sechestrul in citoplasma.

E posibil ca BCR-ABL sa inhibe apoptoza prin intermediul subreglarii proteinei legate de secventa consens a interferonului(ICSBP).

Astfel soarecii knockout pentru ICSBP dezvolta un sindrom mieloproliferativ.Rezulatetle obtinute prin sisteme celulare transfectate sugereaza ca BCr-ABL inhiba apoptoza prin intermediul Fas/FasL.