Noi Directii de Valorificare a Unor Produse Vegetale (glycine Max) In Industria Farmaceutica

CUPRINS

LISTA TABELELOR

Tabelul 1.1. Surse animale, vegetale și alimentare de vitamina E

Tabelul 1.2. Surse de vitamina E din alimentația curentă

Tabelul 2.1. Structura derivaților de tocoferol și tocotrienol

Tabelul 3.1. Fluidele și punctele lor supercritice

Tabelul 3.2. Concentrațiile omologiilor tocoferolului

Tabelul 3.3. Precizia și exactitatea metodei de extracție Soxhlet

LISTA FIGURILOR

Figura 1.1. Capsule de vitamina E

Figura 2.1. α-tocoferol

Figura 2.2. Mecanismul de acțiune ca antioxidant al vitaminei E

Figura 2.3. Structura trienolică a α-tocoferolului

Figura 2.4. Structura acetatului de tocoferil

Figura 2.5. Structura succinatului de vitamina E

Figura 2.6. Structura tocofersolanului

Figura 3.1. Tancuri de percolare deschise

Figura 3.2. Schema unui extractor Soxhlet

Figura 3.3. Instalație pentru extracție accelerată cu solvent

Figura 3.4. Instalație de laborator pentru extracția sub presiune a manitolului din frunze de măslin

Figura 3.5. Diagrama de fază

Figura 3.6. Instalație pilot de extracție cu fluide supercritice

Figura 3.7. Reprezentarea schematică a unei instalații mici de laborator pentru extracția cu fluide supercritice

Figura 3.8. Omogenizator Polytron

Figura 3.9. Coloană LiChrosorb SI60

Figura 3.10. Rezultatul analizei cromatografiei ȋn strat subțire pentru amestecurile standard și a concentratului de vitamina E din soia

Figura 3.11. Cromatograma amestecului standard de tocoferoli (αT, yT si δT) (A) și

a concentratului de VE din soia (B)

Figura 4.1. Calea sintetică a constituentului principal croman R-7

Figura 4.2. Sinteza celui de-al doilea constituentului principal 17

Figura 4.3. Etapele finale de sinteză a RRR-α-tocoferol

SUMAR EXECUTIV

În 1922-1925 lucrările lui H. M. Evans și B. Sure au stabilit existența unei substanțe care protejează animalele de sterilitate și de tulburări ale funcțiilor de reproducere. Această substanță a fost denumită inițial ”factorul X”, denumirea de vitamina E fiindu-i atribuită 2 ani mai tarziu odată cu demonstrarea acțiunii sale vitaminice.

Vitamina E este esențială reproducerii, numindu-se și factorul antisterilității.

Această lucrare prezintă informații despre vitamina E, izolarea din uleiul de soia, structura acesteia, derivatii săi, obținerea prin intermediul sintezei organice și metodele instrumentale de analiză.

Conținutul acestei lucrări este structurat în 4 capitole.

Introducere – acest capitol prezintă informații despre soia, uleiul de soia și sursele de vitamina E.

În capitolul “Studiul relației structura – activitate biologică” este prezentată structura chimică a α-tocoferolului, proprietățile fizico-chimice, activitatea biologică, utilizările precum și derivații acestuia.

Capitolul “Metode instrumentale de analiză” conține diferite tehnici de extracție a vitaminei E din uleiul de soia, o comparație a 3 de extracție, precum și separarea tocoferolilor prin diferite metode instrumentale de analiză.

În capitolul “Sinteza organică avansată” este prezentată o metodă de obținere a α-tocoferolului prin sinteză organică.

1. INTRODUCERE

1.1. Soia (SUA) sau boabele de soia (Regatul Unit) sunt o specie de leguminoase native din Asia de Est, larg răspândită pentru boabele sale comestibile, care au numeroase utilizări.

Boabe de soia (Glycine max L.) sunt o sursă excelentă de grăsimi polinesaturate cȃt și proteine de calitate ȋnaltă, de asemenea, conțin un nivel ridicat de vitamina E liposolubilă, în special de tocoferoli, una dintre cele mai importante clase de antioxidanți care apar natural în uleiurile vegetale.

Utilizări

Tofu și sos de soia;

Uleiul de soia;

Laptele de soia;

Carnea de soia japoneză;

O alternativă din soia a cremei de branză cu arpagic.

Aproximativ 85% din recolta de soia din lume este transformată în făină de soia și ulei vegetal. Soia poate fi în linii mari clasificată ca o "legumă" de grădina sau câmp (ulei). Legumele se gătetesc mult mai ușor, au o aromă ușoară, au gust de nucă, textura mai bună, sunt mai mari ca dimensiune, mai bogate în proteine decât uleiul.

Producătorii de branză tofu și de lapte de soia preferă cultivarele mai mari de proteine ​​vegetale din soia crescute inițial, care au fost introduse în Statele Unite la sfârșitul anilor 1930. Dintre leguminoase, soia, clasificată drept oleaginoasă, este proeminentă pentru conținutul ridicat de proteine ​​(38-45%) și de ulei (20%).[1]

1.2. Uleiul de soia este un ulei vegetal extras din semințele de soia (Glycine max). Este unul dintre cele mai consumate uleiuri de gătit. Ca un ulei de uscare, uleiul de soia prelucrat este, de asemenea, utilizat ca bază pentru cerneluri tipografice (cerneală de soia) și vopsele de ulei. Pentru a produce ulei de soia, boabele de soia sunt crăpate, ajustate pentru conținutul de umiditate, încălzite între 140 și 190 ° F, laminate în fulgi, și extrase cu solvent. Uleiul este apoi rafinat, amestecat pentru diferite aplicații, și, uneori, hidrogenat. Uleiurile de soia, atât lichide cât și parțial hidrogenate sunt vândute ca "ulei vegetal", sau sunt folosite ca ingrediente într-o varietate largă de alimente prelucrate. Cele mai multe dintre reziduurilor rămase (făină de soia), sunt folosite ca furaj pentru animale. În 1946 s-a descoperit în uleiul de soia existența vitaminei E.[2]

1.3.Vitamina E

În ultimele decenii s-au realizat progrese deosebit de importante în domeniul vitaminelor:

s-a demonstrat importanța vitaminelor pentru organismul uman și s-a stabilit necesitatea lor în alimentație;

au fost cercetate sursele de vitamine din regnul vegetal și cel animal;

au fost puse la punct metodele de sinteză precum și metodele de obținere a concentratelor naturale;

au fost elaborate metode de determinare cantitativă etc.

În 1922-1925 lucrările lui H. M. Evans și B. Sure au stabilit existența unei substanțe care protejează animalele de sterilitate și de tulburări ale funcțiilor de reproducere. Această substanță a fost denumită inițial ”factorul X”, denumirea de vitamina E fiindu-i atribuită 2 ani mai tarziu odată cu demonstrarea acțiunii sale vitaminice.

O succintă monografie, apărută în 1927, descrie experiențele efectuate pe șoareci de laborator, autorii dovedind că animalele care nu primeau hrană semințe germinate sau frunze de salată verde în perioada gestației erau supuse fenomenului de deces al fătului și resorbția lui. Astfel a fost dovedit faptul că vitamina E este esențială reproducerii, numindu-se și factorul antisterilității.

Surse de vitamina E

Vitamina E se găsește pe piață sub diferite variante. Astfel d,l-α-tocoferolul, forma obținută prin sinteză, este cea mai ieftină și se comercializează sub formă de ester acetat, amestecul racemic fiind cel mai ușor de obținut. Forma de sinteză nu este la fel de activă ca tocoferolul natural, însă în ceea ce privește efectele secundare ale utilizării amestecului racemic, studiile sunt încă în desfășurare. Unii cercetători consideră că forma sintetică are foarte puține contribuții la prevenirea bolilor de inimă, bolilor sistemului circulator și a cancerului.

Figura 1.1. Capsule de vitamina E

Forma de semisinteză constă în transformarea izomerilor β, y și δ-tocoferol în esteri, cu

ajutorul acidului acetic sau acidului succinic și adăugarea unor grupări metilice pentru obținerea esterilor de tipul d-α-tocoferol acetat sau d-α-tocoferol succinat. Aceste forme sunt stabile și ușor de introdus în complexele vitaminice.

Deoarece numai α-tocoferolul este considerat ca fiind vitamina E, sunt considerabile eforturile producătorilor de a esterifica și metila ceilalți izomeri tocoferolici d-β, d-y și d-δ-tocoferol la d-α-tocoferol acetat sau succinat. În organismul uman forma semisintetică este dezesterificată ușor, în câteva zile în ficat.

Producția mondială anuală de vitamina E depășește 20000 t, iar vitamina E de sinteză reprezintă aproximativ 90% din producția totală. O mare parte din cantitatea produsă este destinată hranei animalelor, numai un sfert fiind atribuită utilizării umane.

Principala problemă o reprezintă pastrarea stabilității α-tocoferolului până la utilizare. Cel mai adesea se utilizează α-tocoferol acetatul, care trebuie să ajungă în tubul digestiv pentru a se scinda la α-tocoferol. O abordare mai recentă se referă la fosforilarea tocoferolului, care este un proces natural, α-tocoferol fosfatul găsindu-se atât în alimente cât și în organismul uman. Studiile au indicat efectul antioxidant ce se obține în urma transferului unei grupări fosforice –PO3H2 la gruparea hidroxilică de pe nucleul aromatic. Noul compus formează o barieră pentru transferul radicalilor liberi de la un substrat la altul.

Doza zilnică recomandată se referă la α-tocoferol, deoarece este forma cea mai activă, și se încadrează între 3 – 10 mg/zi pentru copii și 20 mg/zi pentru adulți. Organismul uman nu poate sintetiza acest compus, de aceea necesarul de vitamina E trebuie acoperit printr-o dietă echilibrată, bogată în legume, margarine și uleiuri vegetale, fructe uscate dar și surse animale precum ficatul, gălbenușul de ou și untul.

Tabelul 1.1. Surse animale, vegetale și alimentare de vitamina E

Tabelul 1.2. Surse de vitamina E din alimentația curentă

(*CZR – cantitatea zilnică recomandată pentru adulți, pentru vitamina E este de 20 mg/zi, existând variații în funcție de vârstă, starea de sănătate etc.)

Suplimentele vitaminice pot conține vitamina E exprimată și în UI. Astfel, o unitate internațională de vitamina E corespunde la 0,67 mg de α-tocoferol sau la 1 mg de d,l-tocoferol acetat. [3]

2. Vitamina E – Studiul relației structura-activitate biologică

2.1. Structura chimică a vitaminei E

Vitamina E reprezintă un grup de compuși formați dintr-un inel de cromanol substituit cu un lanț lateral saturat de C16 ȋn cazul tocoferolului și cu 3 duble legături ȋn cazul tocotrienolului. Denumirea generică de vitamina E indică un grup de compuși liposolubili, cu structură asemănătoare, reprezentat de 8 izomeri. Structurile tocoferolice și cele tocotrienolice se deosebesc prin existența unor duble legături în unitățile izoprenice.[3]

Structurile derivate existente se datorează posibililor substituenți din pozițiile 5, 6, 7 și 8 ale nucleului aromatic. Structura chimică a tocoferolului este următoarea:

Figura 2.1. α-tocoferol

Această vitamină este relativ stabilă la caldură, lumină și mediu acid, dar foarte sensibilă la oxidare în mediul bazic, este distrusă la temperaturi extreme sau în prezența fierului, a clorului și a uleiurilor minerale.

2.2. Rolul vitminei E

Acțiune antioxidantă

În scopul descoperirii mecanismului prin care α-tocoferolul acționează ca antioxidant a fost studiată oxidarea acestuia la chinone și intermediarii corespunzători.

Rolul vitaminei E în organism este de a întrerupe reacțiile radicalilor liberi, prin preluarea acestora, ceea ce îi oferă proprietatea de antioxidant. Gruparea hidroxilică liberă de pe nucleul aromatic este responsabilă de acest efect antioxidant deoarece prin atomul de hidrogen pe care aceasta îl cedează radicalului liber R, rezultă într-o formă relativ stabilă radicalul liber al vitaminei.

Figura 2.2. Mecanismul de acțiune ca antioxidant al vitaminei E[4]

Reacția radicalului tocoferoxil cu peroxizii lipidici conduce la produși instabili de substituție, numiți α-tocoferoxizi: alchildioxi-tocoferone sau hidroxi-tocoferone.

În acest mod antioxidanții ca vitamina E protejează celulele de acțiunea radicalilor liberi, care pot cauza distrugeri ale celulelor, tulburări ale metabolismului, dezvoltarea maladiilor cardiovasculare și a cancerului.

Vitamina E contribuie la stabilizarea membranelor celulare, menține activitatea unor enzime, unele studii indică chiar și o încetinire a îmbătrânirii celulelor în prezența acestui compus.

Acțiune benefică asupra sistemului circulator

Numeroase studii au indicat faptul că vitamina E poate fi utile fi utilizată pentru prevenirea și tratarea unor tulburări ale sistemului circulator. Modificările oxidative ale LDL-colesterolului facilitează blocajele în arterele coronariene lucru ce poate duce la ateroscleroză sau infarct, însă vitamina E intervine în sens pozitiv prin limitarea oxidării LDL-colesterolului, contribuind astfel la prevenirea tulburărilor coronariene și la prevenirea formării cheagurilor de sânge care pot provoca infarct miocardic.

Luptă împotriva cancerului

Vitamina E poate bloca formarea nitrozaminelor, formate în stomac ca urmare a consumului de nitriți.

Ameliorează simptomele bolii Alzheimer

Studii recente indică faptul că în cazul pacienților cărora le-a fost administrată vitamina E (400-1000 UI) în combinație cu vitamina C (500-1000 UI) în doze zilnice ridicate s-a observat o ameliorare a simptomelor bolii în proporție de 64 – 78%.

Întărește sistemul imunitar

Unele studii asociază administrarea vitaminei E în doze mari cu scăderea incidenței cancerului la prostată, precum și a cancerelor la sân și la colon.

Intervine în metabolismul intermediar

Vitamina E intervine în metabolismul proteic; studiile efectuate au arătat că administrarea unor cantități mari de vitamina E, asociată cu un regim proteic, împiedică apariția simptomelor ce survin după regimul sărac în proteine.

Această vitamină intervine și în metabolismul acizilor nucleici, în cazul carenței de vitamina E, apare in mușchi și maduva spinarii, o biosinteza și o degradare accentuata de ADN, iar în urină sunt eliminați fosfați de riboza si alantoina, care sunt elemente ale catabolismului acizilor nucleici.

Intervine în unele procese enzimatice

Carența tocoferolilor lezează mitocondriile și măreste fragilitatea lizozomului, precum și cantitatea de hidrolaze acide eliberate, care acționează asupra constituenților celulari (proteine, acizi nucleici) ducând la simptomul de distrofie musculară. De asemenea, carența determină o scădere a încorporarii fosforului în acizii nucleici, lezând proteinogeneza și mitoza celulară. [6]

2.3. Derivați ai tocoferolului

2.3.1. Tocotrienolii, sintetizați pentru prima dată în 1976 aparțin aceluiași grup de compuși ca și tocoferolii, ceea ce îi deosebește fiind catena nesaturată.

Figura 2.3. Structura trienolică a α-tocoferolului

Studii realizate începând din 1986 au confirmat rolul de agent hipocolestemiant al tocotrienolului și efectul său puternic antioxidant. În plus cercetările arată ca α-tocotrienolul are și un efect antitrombic și antitumoral, ceea ce ar putea servi la utilizarea sa în prevenire și în tratamentul bolilor cardiovasculare și a cancerului.

Inserarea unor substituenți (grupări metil) pe nucleul aromatic conduce la compuși aparținând aceleiași serii de substanțe, conform tabelului 2.1.

Tabelul 2.1. Structura derivaților de tocoferol și tocotrienol

Tocotrienolii sunt antioxidanți mai puternici decât tocoferolii. Acești compuși sunt ușor absorbiți de piele și sunt folosiți în loțiuni. O sursă de tocotrienoli este uleiul de stereoizomeri ai α-tocoferol.[7]

Tocotrienolii sunt forme naturale de vitamina E, care poate proteja ȋmpotriva deteriorării celulelor creierului și reduce colesterolul.

Tocoferolii au o largă răspândire în natură, având rol de antioxidanți naturali și de vitamină E. Tocotrienolii sunt mai puțin răspândiți fiind prezenți în uleiul de palm, orez, cereale și legume. Doar uleiul de palm prezintă activitate vitaminică datorită prezenței trienolilor în concentrații mai mari decât în alte surse naturale. Tocoferolii și tocotrienolii sunt reținuți în timpul rafinării uleiului comestibil deoarece, în caz contrar, unii dintre ei pot dispărea în timpul procesului de dezodorizare. [8]

2.3.2. Acetatul de tocoferil

Figura 2.4. Structura acetatului de tocoferil

Denumirea IUPAC

[(2 R) -2,5,7,8-tetrametil-2-[(4 R, 8 R) -4,8,12-trimetiltridecil] croman-6-il] acetat

Alte denumiri: acetat de vitamina E.

Masă moleculară: 472.743 g/mol

Proprietăti:

stare solidă;

densitate 0.95 g/cm3;

puct de topire 28 °C;

punct de fierbere 224 °C;

solubilitate: insolubil ȋn apă;

punct de inflamabilitate 210 °C;

punctul de autoaprindere 303 °C.[10]

Acetatul de tocoferil, de asemenea, cunoscut sub numele de acetat de vitamina E, este un supliment de vitamină cu formula moleculară C 31 H 52 O 3. Este esterul acidului acetic și al tocoferolului (vitamina E). Acesta este adesea folosit în produsele dermatologice, cum ar fi cremele de piele. Acetat de tocoferol nu este oxidant și poate pătrunde prin piele în celule vii, unde circa 5% este transformat în tocoferol liber și oferă efecte benefice antioxidante.

Acetatul de tocoferil este folosit ca o alternativă la tocoferolul ȋn sine, deoarece gruparea hidroxi-fenolică este blocată, oferind un produs mai puțin acid, cu un termen de valabilitate mai lung. [9]

2.3.3. Succinatul de Vitamina E

Figura 2.5. Structura succinatului de vitamina E

Sinonime:

D-alfa-tocoferil succinat; Vitamina E succinat; tocoferol succinat, α-tocoferol succinat.

Formula moleculară: C33H54O5.

Masa moleculară: 530.78.

Proprietăți:

D-alfa tocoferil succinatul este o pulbere albă, cristalină, făra miros sau gust;

Punct de topire 73-78 O C;

Aciditate 18.0-19.3ml.

Rol: este destinat utilizării ca vitamina E în suplimente dietetice, ȋn industria alimentară și farmaceutică. D-alfa tocoferil succinatul este un analog al ​​alfa-tocoferolul (vitamina E), cu proprietăți biologice unice. Spre deosebire de compusul-mamă, el nu are

un potențial redox și nu este, prin urmare, un antioxidant. Capacitatea sa de a prelungi ciclul celular, induce apoptoza, și acționează ca un radiosimțitor fiind un compus de mare interes ȋn ȋngrijirea cancerului. [10]

2.2.4. Tocofersolanul

Figura 2.6. Structura tocofersolanului

Formula moleculară: C 35 H 58 O 6

Masa moleculară: 574.8314

Sinonime: d-alfa-tocoferol polietilenă de acid glicol succinat; 2-hidroxietil 2,5,7,8-tetrametil-2-(4,8,12-trimethyltridecyl) -3,4-dihidro-2H-cromen-6-il butandioate.

Tocofersolan este o formă sintetică a vitaminei E solubilă în apă. Formele naturale de vitamina E sunt liposolubile, dar nu solubile în apă. Tocofersolan este derivat polietilenglicon al α-tocoferolului, care permite solubilitatea în apă.

Tocofersolan este folosit ca un supliment de vitamina E sau pentru tratarea deficitului de vitamina E la persoanele care nu pot absorbi grăsimile din cauza bolii.

La data de 24 iulie 2009 Agenția Europeană pentru Medicamente a aprobat tocofersolan sub numele comercial de Vedrop 50 mg / ml soluție orală pentru tratarea deficitului de vitamina E din cauza malabsorbției digestive la copii și adolescenții care suferă de colestază cronică congenitală sau ereditară, de la naștere (la nou-născuții la termen) la vârsta de 16 sau 18 ani (în funcție de regiune).[11]

3. METODE INSTRUMENTALE DE ANALIZĂ

Plantele reprezintă un rezervor imens pentru noi descoperiri ale unor principii active care pot fi folosite în medicină, cosmetică sau în alimentație (alimente nutraceutice, de exemplu). Înainte de a fi izolate și purificate substanțele utile trebuie extrase din matricea vegetală, obținându-se ceea ce se numește un extract primar. Odată ce metaboliții au fost identificați în extractul primar se poate continua cu extracția primară la scară mai mare folosind o cantitate mare de material vegetal. Prima problemă care trebuie rezolvată este alegerea celei mai eficiente metode de extragere primară a metaboliților din materialul vegetal. Metodele folosite pot fi metode de laborator și metode industriale. Unele metode de laborator au devenit în timp metode industriale, altele au rămas doar la scară de laborator.

3.1. Operații preliminare pentru pregătirea materialului vegetal

Metaboliții secundari ai plantelor se pot acumula în diferite părți ale plantei, părți care trebuie colectate separat. Uneori, pentru a obține o caracterizare a metaboliților reprezentativi trebuie colectată întrega plantă. De asemenea, metaboliții secundari variază atât calitativ, cât și cantitativ între speciile de plante înrudite, ca și între membrii aceleiași populații. Există suficiente referințe în domeniu care descriu toate etapele de la identificarea regiunii în care se face recoltarea și până la etichetarea materialului vegetal cules. Din punct de vedere ingineresc interesează, mai ales, etapele în care intervin operații unitare cum ar fi: uscarea și măcinarea.

3.1.1. Uscarea și măcinarea materialului vegetal

Se recomandă uscarea materialului vegetal la temperaturi mai mici decât 300°C pentru a evita descompunerea compușilor termolabili. Uneori materialul trebuie protejat de lumina solară, deoarece există riscul inițierii unor reacții chimice sub acțiunea radiațiilor ultraviolete. Pentru îndepărtarea umidității și pentru a preveni supraîncălzirea materialului, se recomandă asigurarea unei bune circulații a aerului. Din acest motiv materialul vegetal nu trebuie uscat în strat compact. Când se folosește material vegetal proaspăt este de preferat o extracție rapidă cu solvenți organici, cum ar fi etanol sau metanol, care dezactivează enzimele prezente în plantă. Extractul va conține și o anumită cantitate de apă. Dacă se dorește separarea părții apoase se poate utiliza un solvent organic nemiscibil cu apa, produșii existenți în extractul primar hidroalcoolic repartizându-se între cele două faze nemiscibile. În ceea ce privește măcinarea, este deja cunoscut că un grad mare de mărunțire a oricărui material mărește suprafața de transfer și conduce la micșorarea cantității de solvent necesar. Cu toate acestea, la materialele vegetale trebuie considerate și alte aspecte, cum ar fi necesitatea măcinării materialului într-o soluție tampon sau solvent tamponat, pentru a preveni reacțiile de hidroliză din cauza schimbărilor de pH care apar atunci când acizii organici prezenți în celulă vegetală sunt eliberați. Ca alternativă se recomandă congelarea materialului sau păstrarea sa în alcool. De asemenea, pentru materialele vegetale nu se recomandă măcinarea chiar până la pulbere, deoarece dacă particulele sunt prea fine pot pluti în solvent fără a mai fi în contact foarte bun cu acesta, în plus, în timpul măcinării se mai pot pierde din substanțele volatile, iar compușii mai sensibili se pot degrada termic (din cauza căldurii care se degajă prin frecare), sau se pot oxida. Pentru extracția compușilor volatili din plante se recomandă antrenarea cu abur și mărunțirea materialului prin tăiere.

3.2. Metode de extracție primară

Plantele sunt matrici complexe conținând o mare diversitate de metaboliți secundari, care și ei la rândul lor au structuri și proprietăți dintre cele mai variate. Acești compuși au diferite polarități și solubilități mai mari sau mai mici în diverși solvenți. De aceea, extracția cu solvenți trebuie să exploateze aceste caracteristici.

Ca o primă clasificare, în funcție de modul de operare, există procedee continue și discontinue. În procedeele continue solventul curge continuu prin materialul vegetal. Pe măsură ce compușii activi difuzează în solvent acesta devine saturat, dar datorită curgerii solventului chiar dacă acesta se satureză, o nouă cantitate de solvent proaspăt îi va lua locul. În cazul metodelor discontinue solventul este alimentat în șarje.

Când solventul s-a saturat atunci extracția trebuie oprită și solventul recuperat prin decantare. În cazul extracțiilor repetate se va alimenta peste același material vegetal o nouă cantitate de solvent. Extractul obținut trebuie filtrat pentru a se îndepărta particulele vegetale foarte fine. Nu se recomandă păstrarea extractelor vegetale la temperatura camerei și nici la lumina soarelui, deoarece crește riscul unor reacții nedorite de descompunere a unor compuși sau deizomerizare a altora. Dacă se dorește concentrarea extractului primar, acest lucru se poate realiza prin evaporare sau distilare. Ambele operații se pot efectua la presiune obișnuită, sau la depresiune, dacă extractul conține mulți compuși valoroși termolabili. Pentru concentrările din laborator se recomandă evaporatorul rotativ, deoarece are loc o evaporare în film, mult mai avantajoasă decât evaporarea din întreaga masă a unei soluții. La folosirea unui evaporator rotativ se recomandă temperaturi de maxim 400°C pentru a proteja compuși intermolabili. Solventul recuperat prin condensare, atât la evaporare, cât și la distilare poate fi refolosit, dar pentru același material vegetal, pentru a se evita contaminările nedorite.

Ca tehnici de extragere primară a metaboliților secundari se pot enumera:

Macerarea;

Percolația;

Extracția cu Soxhlet;

Extracția cu solvent presurizat (extracție accelerată cu solvent);

Extracția cu reflux;

Distilarea cu abur și hidrodistilarea;

Extracția cu fluide supercitice.

La aceste categorii principale se adaugă diverse tehnici de intensificare a extracției cum ar fi extracția în câmp ultrasonor, extracția asistată cu microunde. Există și tendința, justificată, de reducerea costurilor, de a realiza extracția și separarea compușilor în aceeași etapă combinând operații unitare cunoscute deja.

3.2.1. Alegerea solventului și a metodei de extracție

O problemă importantă, indiferent de metoda de extracție, este alegerea solventului sau a antrenantului. Ideal ar fi ca prin metoda și solventul ales să se obțină numai metabolitul sau amestecul de metaboliți de interes, iar operația să fie simplă, rapidă, reproductibilă și să se desfășoare cu costuri cât mai mici. Pentru atingerea acestui ideal, primul pas este alegerea solventului. Metodele tradiționale folosesc apă caldă sau rece, alcool sau amestecuri hidro-alcoolice pentru a obține preparate care se pot administra intern (ceaiuri, infuzii, decocturi). Infuzia se referă la fierberea solventului și picurarea acestuia peste materialul vegetal; dacă planta se introduce în solvent la fierbere atunci se obține un decoct. Selectarea solventului și a metodei vor fi determinate de natura și cantitatea materialului care trebuie extras. Ca solvenți se pot folosi atât solvenți apoși, cât și solvenți organici. Solventul trebuie să asigure o bună solubilitate a solutului de interes, și dacă se poate să fie și selectiv. În plus, trebuie să fie netoxic, neinflamabil, ușor de recuperat prin distilare și să aibă preț de cost scăzut. Dintre solvenții organici care se utilizează deja se pot aminti: hidrocarburi alifatice sau clorurate, esteri, alcooli cu masa moleculară mică. În ordinea creșterii polarității, cei mai cunoscuți solvenți pentru extracția primară sunt: n-hexan, diclormetan, n-butanol, iso-propanol, cloroform, acetat de etil, acetonă, metanol, etanol și apă. În continuare vor fi prezentate pe scurt principalele tehnici de obținere a extractelor primare din material vegetal.

3.2.2. Macerarea

Macerarea este o tehnică foarte simplă și încă destul de utilizată pentru eliberarea metabolițulor secundari din matricea vegetală. Materialul vegetal mărunțit se lasă într-un solvent în recipiente închise la temperatura camerei. Metoda se aplică pentru o extragere inițială în sistem discontinuu. Ocazional se mai poate folosi agitarea pentru a avea un amestec omogen și pentru a crește viteza de extracție. Extracția se oprește la atingerea echilibrului metabolitului între extract și materialul vegetal. O primă separare grosieră se poate face prin decantare, urmată de cele mai multe ori de filtrare. Centrifugarea este necesară numai dacă materialul vegetal este format din particule foarte fine. Peste materialul vegetal rămas (numit marc) se mai poate adăuga o cantitate proaspătă de solvent. Noul filtrat obținut se poate amesteca cu cel obținut prima dată. Dezavantajul macerației este consumul mare de solvent și a duratei mari de timp în care are loc, de la câteva ore la câteva săptămâni. De asemenea, pot avea loc pierderi de metabolit și de material vegetal. Metaboliții care au solubilitate scăzută la temeperatura camerei nu pot fi extrași prin această metodă.

3.2.3. Percolarea

Percolarea, care se mai numește și spălare extractivă, este frecvent utilizată pentru obținerea extractelor primare. Materialul solid vegetal și solventul de extracție se contactează discontinuu în vase (tancuri) de percolare închise sau deschise și care pot fi în strat fix, sau chiar vase cu agitare. În figura 3.1. sunt prezentate două tancuri de percolare în strat fix. Percolarea este recomandată pentru extracția la scară mare. Ca și la macerare se pot face mai multe treceri ale solventului peste materialul vegetal, operația desfăsurându-se în regim nestaționar. Gradul de mărunțire, temperatura și timpul de staționare influențează randamentul operației. De exemplu, materialele prea fin divizate, cele rășinoase sau alte materiale vegetale care se gonflează excesiv (cele care conțin mucilagii) pot înfunda percolatorul. Dacă materialul nu este distribuit uniform în tanc (de exemplu, dacă este prea dens) atunci solventul nu poate intra în contact cu o suprafață mare a materialului și extracția va fi incompletă. Temperatura mai mare favorizează procesul de extracție, dar în același timp poate distruge metaboliții termolabili. Alte dezavantaje ale percolării sunt consumul mare de solvent și durata mare de timp a operării.

Figura 3.1. Tancuri de percolare deschise; a.–prezentare generală; b.–operare cu alimentare continuă de solvent 1.- corpul tancului; 2.- placa perforată; 3.- pânza filtrantă; 4.- pompă recirculare; 5.- gură încărcare solid; 6.- gură descărcare solid; 7.- strat solid care se gonflează excesiv (cele care conțin mucilagii) pot înfunda percolatorul.

3.2.4. Extracția cu Soxhlet

Extractorul Soxhlet, a fost utilizat de către chimiști pentru extracția compușilor chimici dintr-o probă solidă încă de la mijlocul secolului al XIX-lea. Figura 3.2 prezintă schema unui extractor Soxhlet. În extractor se introduce solidul care conține substanțele de interes. Proba solidă este introdusă mai întâi într-un cartuș de hârtie de filtru. Dispozitivul este prevăzut cu un vas pentru solvent și două tuburi laterale de sticlă care fac legătura între extractor și vasul cu solvent. Tubul pentru circulația vaporilor este cuprins între partea superioară a vasului cu solvent și partea superioară a extractorului în care se introduce cartușul cu proba. Tubul pentru recircularea solventului leagă și el cele două părți componente; începe de la baza extractorului, se continuă până la jumătatea corpului extractorului și apoi coboară brusc și intră în vasul cu solvent. Extractorul Soxhlet lucrează în cicluri. Solventul fierbe în vas și se formează vapori care ajung la condensator unde condensează, iar condensul curge peste și prin probă și se colectează la partea inferioară. În acest moment solventul va conține o concentrație mică de substanțe extrase din probă. Nivelul lichidului crește simultan în “camera” de extracție și în tubul lateral de recirculare. Când tubul se umple, sub acțiunea gravitației, lichidul se scurge rapid înapoi în vasul cu solvent, acesta fiind sfârșitul unui ciclu. Acestui tip de aparat i s-au adus de-a lungul timpului modificări care vor fi prezentate în continuare. Unele dintre ele au condus la denumiri noi ale aparatelor proiectate.

Figura 3.2. Schema unui extractor Soxhlet

3.2.5. Extracția cu solvent presurizat

Extracția accelerată cu solvent este o tehnică de extracție din probe solide sau semisolide cu solvenți lichizi obișnuiți, care utilizează temperaturi și presiuni ridicate pentru a crește eficiența procesului de extracție. Această tehnică poate înlocui extracția cu Soxhlet, extracția cu lichide la fierbere, extracția cu agitare, extracția asistată de ultrasunete sau alte tehnici de extracție. Utilizarea temperaturilor ridicate conduce la creșterea solubilității soluților, la depășirea efectelor de matrice, scăderea vâscozității solvenților, creșterea vitezelor de desorbție, creșterea coeficientului de difuziune prin matricea solidă. Presiunea ridicată ajută la menținerea solvenților în stare lichidă la temperaturi ridicate și grăbește umplerea celulelor. Se mărește astfel viteza de extracție și crește randamentul extracției. Etapele de lucru sunt, în general, următoarele:

se introduce proba în celula de extracție;

se umple celula cu solvent;

se aduce celula la presiunea și temperatura corespunzătoare;

se menține proba la temperatura și presiunea prestabilite;

se pompează solvent în celula cu probă;

se purjează solventul din celulă cu gaz inert.

În urma acestor etape rezultă extractul pentru analiză.

Avantajele extracției accelerate cu solvent sunt următoarele:

este o tehnică de extracție mai rapidă decât alte tehnici convenționale de extracție; necesită cantități mai mici de solvent;

nu permite manifestarea efectelor de matrice;

utilizează solvenți de extracție convenționali, ceea ce conferă simplitate acestei tehnici;

poate fi programată, ceea ce crește reproductibilitatea datelor;

deoarece materialul după extracție este uscat, se poate repeta extracția cu același solvent b sau cu alți solvenți de polaritate crescătoare.

Figura 3.3. Instalație pentru extracție accelerată cu solvent

Ca exemplu de aplicare a acestei tehnici se poate menționa extracția manitolului din frunze de măslin la 3-11 MPa, la 60-1500 C și la viteze de curgere foarte mici ale solventului (Ghoreishiși Gholami Shahrestani, 2009).

Figura 3.4 . Instalație de laborator pentru extracția sub presiune a manitolului din frunze de măslin

1-rezervor de solvent,2-filtru de teflon, 3-pompă de presiune înaltă, 4-manometru,5-valvă, 6-serpentină de preîncălzire, 7-coloană de extracție, 8- filtru din fibre de bumbac, 9-cuptor, 10- indicator-regulator de temperatură,12-conatiner de extract (după Ghoreishi și Gholami Shahrestani, 2009).

Instalația de laborator folosită în acest scop este prezentată în figura 3.4.

Alte exemple sunt: extracția unor derivați de terpene din frunze de Ginko biloba (Langși Wai, 2003), extracția uleiurilor esențiale din semințe de coriandru (Eikani și colab., 2007), ca și extracția glicirizinei din  Radix glycyrrhizae (rădăcină de cicoare) și a efedrinei din Ephedra sinica (Eng și colab., 2007).

3.2.6. Distilarea cu abur și extracția la reflux

În extracția la reflux, materialul vegetal este imersat în solvent într-un balon cu fund rotund, conectat la un condensator. Solventul este încălzit până la temperatura de fierbere. Pe măsură ce vaporii condensează, solventul se reîntoarce în balonul de extracție. Distilarea cu abur este un proces similar și care se aplică, mai ales, pentru uleiurile esențiale (amestecuri complexe de constituienți volatili). Materialul vegetal, proaspăt sau uscat, este acoperit cu apă într-un balon și este conectat la un condensator. Pe măsură ce balonul este încălzit vaporii (un amestec de uleiuri esențiale și apă) condensează, distilatul, care se separă în două straturi nemiscibile, este colectat într-un cilindru gradat conectat la condensator. Faza apoasă se recirculă în balonul de extracție, în timp ce uleiul volatil se colecteză separat. Principalul dezavantaj al acestor moduri de operare este că se pot degrada compușii termolabili.

3.2.7. Extracția cu solvenți în stare supercritică

Preocupările privind protecția mediului au determinat o nouă perspectivă și asupra chimiei, învinuită de producerea unui număr mare de deșeuri toxice. Așa a apărut ceea ce se numește la ora actuală "chimie verde". În domeniul extracției, unde se folosesc cantități mari de solvenți organici, ar trebui redusă cantitatea acestora și unii chiar ar trebui înlocuiți. O alternativă nepoluantă este considerată aplicarea extracției cu fluide supercritice. Punctul critic al unei substanțe pure este definit ca cea mai înaltă temperatură și presiune la care substanța există în echilibru lichid-vapori. La temperaturi și presiuni mai mari decât acest punct se formează un fluid omogen numit fluid supercitic. Aceste aspecte se potobserva pe diagrama de fază a unei substanțe oarecare, diagramă prezentată în figura 3.5. În punctul triplu coexistă trei faze. Curba de coexistență a fazelor gaz-lichid este curba de fierbere. Deplasându-ne în sus pe curba de fierbere prin creșterea atât a presiunii cât și a temperaturii, lichidul devine mai puțin dens datorită expansiunii termice, iar gazele mai dense datorită creșterii presiunii. În cele din urmă, densitățile celor două faze converg către aceeași valoare, devenind identice, diferența dintre gaz și lichid dispare iar curba de fierbere se sfârșește în punctul critic.

Capacitatea de solvatare a gazelor supercritice crește proporțional cu creșterea presiunii și a densității. Ceea ce face ca fluidele supercritice să fie considerate solvenți atractivi, este faptul că densitatea gazelor devine mult mai mare la presiuni ridicate, în timp ce vâscozitatea și difuzivitatea au valori apropiate de cele la presiune atmosferică.

Aceste proprietăți fac ca mobilitatea și puterea de solvatare a fluidelor supercritice să fie unice. Deaceea, fluidele supercritice sunt candidați foarte buni pentru extracția unor substanțe active deorgine vegetală, și nu numai. În plus, fluidele supercritice pot avea proprietăți chiar surprinzătoare față de fluidele din care provin și pe care le cunoaștem în condiții normale de presiune și temperatură.

Figura 3.5. Diagrama de fază

Apa supercritică este un exemplu interesant de proprietăți neașteptate ale fluidelor supercritice. În mod normal, sărurile sunt ușor solubile în apă, în timp ce uleiul și apa nu se amestecă. În condiții supercritice, sărurile sunt insolubile în apă, pe când uleiurile și substanțele organice sunt complet miscibile cu apa. Această proprietate a dus la dezvoltarea unui proces de purificare a apelor reziduale prin amestecarea acestora cu apă și aer aflate în condiții supercritice. Substanțele organice sunt oxidate, formează gaze și apă, în timp cesărurile precipită. Astfel de schimbări drastice apar și în cazul amestecurilor de lichide, pe măsura apropierii de punctul critic al amestecului.

Alte proprietăți care se modifică drastic în apropierea punctului critic sunt conductivitatea termică, tensiunea superficială, capacitatea calorică și vâscozitatea. Densitatea, conductivitatea termică și difuzivitatea unei substanțe aflate în stare supercritică sunt mai mari decât cele ale aceleași substanțe în stare lichidă, vâscozitatea este mult mai mică, în timp ce tensiunea superficială și căldura de vaporizare dispar complet.

Proprietățile termice și fizice ale fluidelor supercritice sunt intermediare între cele ale gazelor și ale lichidelor. Densitatea fluidelor supercritice depinde puternic de presiune și temperatură. Coeficientul de difuziune este mult mai mare decât cel al lichidelor, și din acest motiv, fluidele supercritice penetrează mult mai ușor solidele poroase și fibroase. În tabelul 3.1 sunt prezentate câteva fluide și punctele lor supercritice. Cel mai utilizat fluid în stare supercritică este CO2.

Tabelul 3.1. Fluidele și punctele lor supercritice

Punctul critic al dioxidului de carbon este caracterizat de presiunea de 73.8 bar și temperatura de 31.10 C. Se mai pot utiliza etan, butan, pentan, oxid deazot, amoniac, triflormetan și apă. Unele dintre aceste fluide prezintă unele dezavantaje evidente care vor fi amintite în continuare.

De exemplu, solvenții organici sunt explozivi și instalațiile în care aceștia ar putea fi utilizați trebuie asigurate împotriva acestui pericol. Hidrocarburile cloro-fluorurate sunt restricționate ca utilizări din cauza efectului lor negativ asupra stratului de ozon atmosferic.

Cu toate acestea există o serie de avantaje ale extracției cu fluide supercritice care decurg din proprietățile acestora:

deoarece puterea de solvatare poate fi modificată prin modificarea presiunii sau temperaturii, separarea solutului de solvent este mai rapidă și mai ușoară;

adăugând modificatori fluidelor supercritice (ex: metanol în CO2), polaritatea acestora se poate modifica, făcându-le mai selective;

în procesele industriale din industria alimentară sau farmaceutică nu apar  probleme legate de solvenți reziduali, ca în cazul utilizării solvenților organici clasici;

în general, fluidele supercritice sunt mai ieftine, mai simple și mult mai sigure.

Costurile de depozitare sunt mult mai mici, deoarece pot fi ușor recirculate și regenerate.

Unul din principalele avantaje ale extracției cu fluide supercritice este eliminarea solvenților organici, în acest mod reducându-se problemele legate de depozitare. Mai mult, câteva protocoale legislative (ex: EPA Pollution Prevention Act în SUA) impun reducerea utilizării solvenților organici care ar putea fi dăunători mediului înconjurător.

Principalul dezavantaj al acestei tehnici este necesitatea folosirii de utilaje care lucrează sub presiune (pentru a menține fluidul în stare critică). Un alt dezavantaj este faptul că randamentul de extracție depinde mult de mărimea particulelor de material vegetal și decantitatea de apă conținută în acesta. Cel mai utilizat solvent supercritic este dioxidul de carbon, deoarece este ieftin, netoxic, iar punctul supercritic poate fi atins ușor. Un proces de extracție cu CO2 supercritic conține două etape principale:

extracția cu fluid supercritic (ex: extracția cafeinei din boabele verzi de cafea);

recuperarea CO2 -ului și recircularea acestuia, atunci când este avantajos.

Cea de a doua etapă se poate realiza în mai multe moduri:

decomprimarea gazului, permițând materialului extras să părăsească amestecul aflat sub presiune; este o operație simplă și utilă atunci când sunt implicate volume mari de extract, dar scumpă, deoarece este necesară recomprimarea gazului pentru recirculare.

adsorbția pe materiale cum este cărbunele activ. Este ușor de realizat și este utilizată pentru separarea cafeinei de CO2 supercritic. Ca și în cazul cafeinei, recuperarea materialului extras de pe suprafața adsorbantului poate fi dificilă.

absorbția materialului extras într-un solvent adecvat.

În figura 3.6 este prezentată o instalație pilot pentru extracția cu fluide supercritice.

Chiar dacă este de capacitate foarte mică (<10 Kg), ea conține toate elementele care apar și în instalațiile industriale de acest tip. Componentele sale esențiale sunt: vasul de extracție și cel de separare, condensatorul și pompa de presiune înaltă.

Dioxidul de carbon este depozitat la presiunea sa de vapori în condensator ca lichid aproape în stare critică.

Figura 3.6. Instalație pilot de extracție cu fluide supercritice

Starea fizică a dioxidului de carbon în etapele de extracție-separare (fluid supercritic, lichid aproape supercritic sau gaz) este determinată de presiunea și temperatura din cele două vase. Temperatura este controlată cu ajutorul unui lichid de termostatare care circulă prin mantaua fiecărui vas, iar presiunea este menținută de valvele de presiune.

Parametrii ca temepartura, presiunea și debitul de curgere sunt tot timpul măsurați în punctele strategice ale instalației. Când are loc un proces de extracție, materialul vegetal este alimentat în vasul de extracție, care este întâi purjat cu CO2 pentru a scoate aerul din sistem.

Extracția începe prin pomparea dioxidului de carbon lichid printr-un schimbător de căldură în vasul de extracție. Debitul decurgere, care este reglat de pompă, se menține la o valoare mică, astfel încât timpul destaționare în vasul de extracție să fie suficient pentru a se atinge echilibrul. Soluția rezultată trece apoi în vasul de separare unde se realizează condițiile eliberării componenților extrași prin varierea condițiilor de presiune și temperatură.

Dioxidul de carbon gazos trece apoi în condensatorul care este răcit și unde este condensat și menținut în stare lichidă. O asemenea instalație care operează între 2-10 L este utilă atunci când e necesar să se extragă cantități mici de material. Totuși, pentru a face experiențe preliminare se recomandăsă se folosească instalații mici de laborator. Unul dintre tipurile posibile este prezent în figura 3.7.

Figura 3.7. Reprezentarea schematică a unei instalații mici de laborator pentru extracția cu fluide supercritice: 1-vas de amestecare și de pre-extracție; 2-vasul de extracție; 3-vasul decolectare a extractului; 4-valvă de reglare a presiunii; 5a și b-termocuple; 6-debitmetru.

Instalația din figura 3.7 are o capacitate de 10-100 mL și nu mai recuperează dioxidulde carbon pentru recirculare, ceea ce reprezintă o simplificare considerabilă a configurației acesteia. Fiind vorba de folosirea unor cantități mici de gaz, acesta poate fi purjat ȋn atmosferă la sfârșitul ciclului de extracție-separare. O pompă mică de aer poate fi utilizată pentru presurizarea sistemului și pentru a transporta dioxidul de carbon direct din butelia de gaze în vasul de extracție. Cu ajutorul valvei 4 se poate regla presiunea dioxidului de carbon până la valoarea presiunii atmosferice. Separarea extractului de dioxidul de carbon se face într-un vas de sticlă răcit de tip Buchner (3). Gazul care se separă trece printr-un debitmetru și iese apoiîn atmosferă.

Operarea unei astfel de instalații este simplă. Există doar o complicație dată derăcirea care acompaniază destinderea dioxidului de carbon și care trebuie compenstă de încălzirea valvei de destindere. Dacă această încălzire nu este suficientă, se pot depune depozite de gheață carbonică care vor stânjeni curgerea. Dacă această încălzire este prea puternică atunci se pot produce degradari ale extractului.[12]

3.3. Compararea metodelor de extractie pentru determinarea de tocoferoli din soia

Extracția de tocoferoli din proba este etapa cea mai importantă și de durată în cuantificarea de tocoferoli în produsele alimentare utilizând atât HPLC cu fază inversă cȃt și cea normală. În funcție de natura probei, diverse metode de extracție, inclusiv saponificarea, extracția Soxhlet și extracția directă cu solvent, au fost folosite pentru a elibera vitamina E.

Saponificarea a fost utilizată pe scară largă pentru extragerea tocoferolilor din multe alimente, inclusiv nuci, legume, carne, fructe, și alimente pentru sugari .

Cu toate acestea, Lee, Landen, Phillips cȃt și Eitenmiller au comparat cele trei metode de extracție și au constatat că extracția directă cu solvent a fost cea mai bună metodă pentru extragerea tocoferolilor din arahide și din unt de arahide, indicând faptul că valorile pot varia în funcție de analiză cu metoda de extracție.

Prin urmare, am evaluat eficacitatea metodelor de extracție diferite, inclusiv extracția Soxhlet, saponificarea, și extracția directă cu solvent în extragerea tocoferolilor din boabe de soia.

În plus, am calculat parametrii de metodă analitică de validare, inclusiv exactitatea, precizia, liniaritatea, și specificitatea, pentru a asigura validitatea celor mai eficiente proceduri testate.

Materiale și metode

Probele și pregătirea standardului

Probele au fost obținute de la Departamentul de Crop Science, în anul 2006. Standardele de tocoferol și tocotrienol au fost obținute de la Merck. Puritatea și stabilitatea standardelelor au fost monitorizate de valori E1 1cm%, măsurată cu ajutorul unui spectrofotometru.

Metoda directă de extracție

O probă de 2,0 g de boabe de soia pulbere a fost adăugată intr-un flacon de sticlă cu fund rotund de 125 ml și amestecată cu 4 ml de apă fierbinte (80 C), după care 10 ml izopropanol a fost adăugat amestecului. Aproximativ 5 g sulfat de magneziu anhidru a fost adăugată, urmat de 25 ml hexan / acetat de etil solvent de extracție (85: 15, vol. / vol) care conțin 0,01% butilhidroxitoluen (BHT).

Amestecul a fost omogenizat cu ajutorul unui omogenizator Polytron timp de 1 min, și Polytron a fost clătit cu 5 ml de solvent de extracție. Amestecul a fost separat printr-un cu filtru de sticlă cu porozitate medie utilizând un aparat de filtrare cu clopot din sticlă ȋn vid.

Turtă de filtrare a fost ruptă și spălată cu 5 ml de solvent de extracție și transferată către același flacon de sticlă de 125 ml cu fund rotund pentru o extracție repetată (25 ml solventul de extracție).

Filtratul combinat a fost transferat într-un balon cotat de 100 ml și diluat pȃnă la semn cu solvent de extracție, după care a urmat filtrarea printr-o membrană cu filtru din nailon cu diametru de 0.45 mm (MSI Inc, Westboro, MA, Statele Unite ale Americii). 2.0 ml din filtratul combinat au fost evaporați cu azot și apoi s-a realizat concentrația corespunzătoare analizei ce conține faza mobilă.

Toate etapele au fost efectuate sub lumină galbenă și toți solvenții au fost determinati prin HPLC.

Figura 3.8. Omogenizator Polytron

Metoda de extracție prin saponificare

10 ml etanol conținând pirogalol (PG, 6%, greutate / vol) au fost adaugați ȋn 3,0 g pulbere boabe de soia într-un vas de saponificare. Amestecul este supus sonicării timp de 5 min, după care sunt adăugați 5 ml de hidroxid de potasiu 60%, iar vasul este spălat cu azot timp de 1 min. După atașarea unui condensator de aer, conținutul au fost determinat prin digerate la 70 °C timp de 50 de minute pe baie de apă sub agitare. După răcirea pe baie de gheață, 20 ml de clorură de sodiu 2% au fost adaugați, și amestecul a fost extras de trei ori cu 20 ml solvent de extracție, hexan / acetat de etil (85: 15, vol./vol), cu 0,01% BHT. Extractele au fost colectate și diluate până la 50 ml, după care a urmat filtrarea printr-o membrană cu filtru din nailon cu diametru de 0.45 mm.

Metoda de extracție Soxhlet

5 g pulbere de boabe de soia au fost introduse într-un aparat Soxhlet și extrase utilizând ca solvent de extracție hexan / acetat de etil (85: 15, vol. / vol), cu 0,01% BHT. Extracția a fost făcută sub lumina galbenă timp de 24 de ore. Extractele au fost diluate până la 100 ml, după care a urmat filtrarea printr-o membrană cu filtru din nailon cu diametru de 0.45 mm.

Cuantificarea prin metoda HPLC fază normală a sistemului HPLC constă într-o pompă de transportare a solventului (M930), dotată cu un detector spectrofluorometric (LC305) și o coloană LiChrosorb SI60 (25,064 mm, 5 mm).

Figura 3.9. Coloană LiChrosorb SI60

Analiza isocratică a fazei mobile conține 1,3% izopropanol în n-hexan. Debitul a fost de 1,0 ml / min. Lungimile de undă au fost fixate la 290 nm pentru excitare și 330 nm timp de emisie pentru identificarea și cuantificarea tocoferolilor și tocotrienoli.

Picurile tocoferolului și tocotrienolului au fost identificate făcȃnd o comparație ȋntre timpii de retenție ai compușilor cu cei standard.

Validarea metodelor și analiza statistică

Metodelor de extracție au fost validate prin determinarea acurateței (recuperare), preciziei (repetabilitatea și reproductibilitatea), linearității, și specificității (puritate de vârf). Analiza de variație a fost efectuată cu versiunea SAS 8.1 (SAS Institut, Cary, NC, Statele Unite ale Americii). Mijloacele au fost comparate cu ajutorul testelor Duncan, cu un nivel de semnificație de 0,01.

Rezultate și discuții

Trei metode de extracție, și anume de saponificare, extracție directă și extracția Soxhlet au fost comparate pentru cuantificarea tocoferolilor din soia (Tab. 3.2)

Tabelul 3.2. Concentrațiile omologiilor tocoferolului

†Valorile care sunt urmate de aceeași literă în cadrul rândurilor nu sunt semnificativ diferite (p< 0,01).

(mg / 100 g de probă în funcție de greutatea uscată; înseamnă 6 abateri standard, n = 3), în soia măsurate prin trei metode diferite de analiză.

Tocotrienoli nu au fost detectați în probe de soia. Valorile analitice realizate au fost comparabile cu cele ale altor studii efectuate. Eitenmiller și Lee, au elaborat noțiunea de tocoferol și tocotrienol pentru uleiuri de soia din surse de literatura de specialitate în principal după 1980, în care metodele cromatografiei de lichide au fost folosite și raportate ca 8.2, 1.0, 69.3, 28.1 și mg/100 g de ulei de soia pentru α-, β-, y-, și δ-tocoferol. Ujiie și al. au raportat compoziția tocoferol din soia, în intervale de 0.49-4.26, 2.65-6.93, 1.09-5.35 mg/100g pentru α -, y -, și δ -tocoferol. Au găsit diferențe semnificative între cele trei metode de extracție ȋn cuantificarea omologiilor tocoferolului (p<0,01).

Valorile cele mai mari ale analizei s-au observat utilizând extracția Soxhlet iar cele mai mici valori utilizând saponificarea. Valorile y -tocoferolului obținute utilizând extracția Soxhlet erau mai mari decât cele care utilizează extracția directă cu solvenți și saponificarea respectiv cu 12,9 și 53,0% .

Lee si al., au comparat aceste trei metode de extracție pentru cuantificarea tocoferolilor din arahide și unt de arahide și au constatat că extracția directă cu solvent a dat valori mai ridicate pentru fiecare omolog al tocoferolului față de celelalte două metode. Cu toate acestea, probele au fost extrase într-un aparat Soxhlet timp de numai 4 ore, care a fost probabil o durată suficientă pentru extragerea tocoferolilor din probe. În schimb, probele de soia au fost extrase timp de 24 de ore la întuneric.

Saponificarea a fost folosită pentru extragerea din mai multe tipuri de probe, inclusiv eritrocite, țesuturi și organe de animale, plante, hrana pentru animale, și alimente, în special semințe . Cu toate acestea, saponificarea poate duce la formarea unor emulsii cu probleme atunci când probele au un conținut ridicat de grăsimi.

De asemenea, în cazul în care parametrii și condițiile din timpul saponificarii nu sunt controlate corespunzător, degradarea substanței analizate poate să apară rapid. Mulți factori afectează extracția tocoferolilor în timpul saponificarii. Ueda și Igarashi au constatat că concentrația etanolului trebuie să fie păstrată sub 30% în timpul saponificarii și că nivelul de grăsime coexistentă a scăzut recuperarea extractului de tocoferolii. Au constatat că valorile saponificarii au fost cele mai mici dintre cele trei metode ale extracție chiar dacă a avut grijă să păstreze conținut scăzut de grăsime, prin scăderea masei probei și menținerea concentrației etanolului sub 30% în timpul extracției.

Au calculat parametrii de validare ai metodei analitice, cum ar fi exactitatea, precizia, liniaritatea, și specificitatea folosind metoda de extracție Soxhlet și cromatografia ȋn fază normală, pentru validarea procedurii de analiză completă a tocoferolului pentru probele de soia (Tab. 3.3).

Tabelul 3.3. Precizia și exactitatea metodei de extracție Soxhlet

§Precizia este o metoda de măsurare a celui mai apropiat grad al rezultatului analizei la adevărata valoare determinată prin analizarea unui probe ținta.
$Repetabilitatea a fost evaluată prin intermediul a cinci analize diferite de probele identice efectuate pe o anumită zi.
#Reproductibilitate a fost evaluată prin intermediul a cinci analize diferite de probel identice efectuate în zile diferite.
‡ n= 5, mg/100 g de probă în funcție de greutatea uscată.
†Deviația standard.
¥Coeficientul de variație.

Repetabilitatea și reproductibilitatea (valoarea coeficientul de variație, % CV) a fost de obicei mai mică de 5%, cu excepția β-tocoferolului. Cea mai mare valoare a CV pentru β- tocoferolul ar fi putut fi cauzată de conținutul său mic în probe. Exactitatea a fost evaluată prin analizarea a cinci probe cu concentrații cunoscute ale fiecărui tocoferol care au fost adăugate înainte de extracție.

Procentul de recuperare pentru 6 abateri standard (n = 5) a fost 103.2 ± 1.21, 109.8 ± 4.18, 93.8 ± 1.12, și 106.9 ± 1,54% pentru α-, β-, y-, și δ-tocoferol. Picurile purității au fost determinate folosind procedura descrisă de către Haroon și al. pentru reacțiile fluorescenței. Picurile tocoferolului au fost determinate la lungimi de undă de excitație de 270, 280, și 290 nm, păstrând lungimea de undă de emisie constantă la 330 nm.

Raporturile dintre înălțimile picurilor probelor au fost comparate cu raporturile maxime ale standardelor obținute la aceleași lungimi de undă. Valori foarte similare au fost obținute de la probele care au folosit metoda de extracție Soxhlet și standardele pentru α-, β-, y-, și δ-tocoferol, indicând puritatea picurilor.

Testul linearității pentru cuantificare a fost efectuat pe intervalele de 0.4-10.0, 0.2-4.0, 2.0-16.0 și 0.4-10.0 mg / ml pentru α-, β-, y-, și δ-tocoferol. Analiza de regresie a arătat o relație liniară excelentă (R2 >0.998).

Concluzii

Am comparat trei metode diferite de extracție, și metoda de extracție Soxhlet s-a dovedit a fi cea mai bună metodă de cuantificare a tocoferolilor din probele de soia. În general, rezultatele validării parametrilor au fost fiabile și satisfăcătoare.[13]

3.4. Metode instrumentale de analiză

3.4.1. Separarea tocoferolilor individuali dintr-un distilat de soia prin cromatografia pe coloană cu presiune scăzută

Distilat deodorant de soia este una dintre sursele importante pentru prepararea de tocoferoli naturale. Concentratul de VE din soia este, de obicei, preparat dintr-un distilat deodorizant prin extracția cu solvent și prin distilarea moleculară. Puritate mare a αT se poate obține prin metilarea non alfa-T. Alți non- alfa-T sunt, de obicei, separați prin metode cromatografice, cum ar fi cromatografia în strat subțire (TLC), cromatografie de lichide de înaltă performanță (HPLC), etc. Abidi și Ruperez au analizat metodele cromatografice publicate pentru separarea și purificarea de tocoferolilor individuali. Dintre aceste metode, separarea cu ajutorul metodei HPLC este cea mai bună. Cu toate acestea, echipamentul este costisitoar, iar costurile de operare și întreținere sunt ridicate. Dezavantajele sunt dificultățile de detecție și recuperarea produsului. Prin urmare, TLC și HPLC nu au fost adecvate pentru purificarea de αT, βT, yT și δT în procesele industriale, cu costuri reduse.

Comparand metodele HPLC și TLC, cu cromatografie pe coloană de joasă presiune (LPCC) prezintă un randament mare pentru producția industriala ca urmare a funcționării sale simple, cu un cost scazut și cu un randament mare. În această lucrare, vom încerca să separam tocoferolii individuali din concentratul de VE de soia folosind LPCC și să exploram efectele procentului de solvent, debitul și cantitatea de încărcare cu privire la eficiența separării.

Experimentul
Materiale și substanțe chimice

Concentratul natural de VE din soia (53% puritate, 8,8% αT, , 31,6% yT, și 12,6% δT ) a fost furnizat de către Wuhan Kaidi Fine Chemical Industrial Co, Ltd (Wuhan, China). Standardele de αT (SIGMA, 95% puritate), yT și δT (SUPELCO, 95% puritate) au fost achiziționate de la Superior-chimice & Co Instrumentul, Ltd (Beijing, China). Ciclohexanul, etanolul și diclormetan, acetonitrilul și metanolul, au fost obținute de la Tianjin Kermel Reactiv Co chimice, Ltd (Tianjin, China). Silica gelul (100-200 ochiurilor de plasă, neregulate), utilizat pentru cromatografie pe coloană și silica gel G folosit pentru TLC au fost obținute de la Haiyang Chemical Group (Qingdao, China). Apa folosită în această lucrare a fost bidistilată.

Metodă analitică cromatografia ȋn strat subțire

La cromatografia ȋn strat subțire a fost folosită o placăcuță de silica-gel G (75 mm x 25 mm) cu o grosime de 0,5 mm. Diclormetanul a fost folosit ca solvent de extracție, și vapori de iod ca indicatori de culoare. Probele au fost spotate la 5 mm deasupra nivelului solventului, a cărui înălțime a fost de 10 mm ȋncepand din partea de jos. Migrarea a fost realizată atunci cand solventul a ajuns la marginea superioară a plăcuței cromatografice. Apoi, placa a fost uscată și pulverizată cu vapori de iod.

Metoda analitică HPLC

Acetonitril (0.1% acid formic, v / v) a fost folosit ca fază mobilă, filtrat și degazat înainte de utilizare. Debitul a fost setat la 1 ml / min. Volumul de încărcare a fost de 100 μl și detecția lungimii de undă a UV a fost de 210 nm. Analizele cantitative au fost efectuate prin utilizarea unei standard extern bazat pe înălțimea picului. Concentrațiile soluțiilor standard de calibrare au fost de 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.17, 0,25 și 0,33 mg / ml în metanol.

Pregătirea probei

S-a dizolvat o sută de grame de concentrat Concentratul de VE din soia în ciclohexan (concentrația a fost de 1 g / ml).

Pregătirea coloanei cromatografice de joasă presiune

Un tub de sticlă de 500 mm x 25 mm a fost folosit ca și coloană cromatografică preparativă cu o pompa cu flux constant pentru a controla debitul eluentului. Aproximativ 100 g de silicagel a fost ȋntrodus într-un cuptor de uscare la 120 °C timp de 60 de minute, iar apoi suspensia a fost obținută utilizând ciclohexan ca solvent și apoi a fost introdusă în coloană.

Procedură cromatografiei în coloană

Separarea de tocoferoli a fost efectuată pe o coloana cromatografică echipată cu silica gel, și lungimea de undă a detectorului de ultraviolete a fost ajustată la 290 nm. După ce sistemul de separare a fost echilibrat, proba a fost injectată și după s-au obținut rezultatele.

După apariția primului pic, eluatul a fost colectat la fiecare 10 ml până când acesta a revenit la linia de bază. Toate fracțiunile au fost analizate cu ajutorul cromatografiei de lichide.

Fracțiunile care conțin aceeași tocoferoli individuali au fost colectate împreună.
Solvenții fracțiunilor combinate au fost eliminați cu ajutorul unui evaporator rotativ la temperatura de 30 ° C sub vid iar reziduul a fost cântărit (W). O cantitate a reziduu a fost luată și cântărită (w), și apoi dizolvată într-un balon ȋmpreună cu metanol pentru analiza cantitativă a HPLC.

Puritatea și recuperarea au fost calculate conform ecuației următoare:

unde P și R se refera la puritate și recuperare, n a fost concentrația dobândita in urma analizei cantitative prin HPLC; v a fost volumul vasului de măsurare și w a fost greutatea substanței din vasul de măsurare; W a fost greutatea reziduului, N, a fost concentrația probei (1 g / ml), V, a fost volumul injectat; mi se refera la conținutul de αT, yT și δT din concentratul de VE din soia (8,8% αT, 31,6% yT, și 12,6% δT).

Puritate și recuperarea au fost doi dintre indicii pentru separarea preliminară. În această lucrare, trei produse din αT, yT și δT au fost obținute în anumite condiții, și doi indici (puritatea și recuperarea), necesari pentru a fi evaluati pentru fiecare produs. Astfel, evaluarea eficienței de separare a fost foarte dificilă. Pentru rezolvarea acestei probleme, funcția de membru-nava a fost introdus:

unde Yi a fost valoarea globală pentru evaluarea eficienței de separare a celor trei tocoferoli individuali; i a fost indicele care reprezintă condițiile diferite; 1/3 a fost media eficienței de separare pentru cele trei produse; Xαi, Xyi și Xδi au fost valoarea funcție membru-nava a puritatății și a recuperării αT, yT și δT, respectiv, fiecare X a fost calculat conform ecuației următoare:

unde XP și XR se refera la valoarea funcției membru-nava a puritatății (P) și recuperarea (R) pentru fiecare tocoferol individual, care a fost etalonată în intervalul de 0-1 conform ecuațiilor (5) și (6), 1/2 menționat la puritate și recuperare fiind la fel de important pentru evaluare.

unde Pmin, Rmin, Pmax și Rmax se refera la minimum și maximum purității și recuperării în toate condițiile de investigație pentru un anumit produs.

Efectul condițiilor cromatografice privind eficiența separarii

Efectul eluentului, debitul și volumul de încărcare privind eficiența separării au fost cercetate prin schimbarea raportului volumului de ciclohexan-etanol (v/v), la 100:0, 99.9:0.1, 99.8:0.2, 99.7:0.3, 99.6:0.4 și 99.5:0.5; debit la10, 20, 30 și 40 ml/min și cantitatea de încărcare la 1, 2, 3 și 4 ml (concentrația probei a fost de 1 g/ml). Procedurile au fost aceleași ca mai sus și valoarea globală (Y) a fost calculată conform ecuațiilor

(1) – (6).

Optimizarea parametrilor cromatografiei pe coloană sub presiune scăzută pentru separarea tocoferoli individuale din soia.

Procentul eluentului, debitul și valoarea încărcării au fost factorii ce urmează a fi optimizați prin concepția de testare ortogonală. Nivelele investigării fiecărui factor au fost selectate în funcție de rezultatele experimentale. Puritatea și recuperarea au fost folosite ca indici pentru evaluarea eficienței de separare.

Rezultate și discuții

Rezultatul cromatografiei ȋn strat subțire și HPLC

Când se utilizează diclormetan ca solvent, trei tocoferoli individuali (αT, yT si δT) pot fi separați complet pe placa de silica-gel a cromatografiei ȋn strat subțire. Analiza tocoferolilor standard și concentratului de vitamine E din soia sunt ilustrate în figura 3.9.

Figura 3.10. Rezultatul analizei cromatografiei ȋn strat subțire pentru amestecurile standard și a concentratului de vitamina E din soia.

Absorbant, silicagel G; soluție de extracție, diclormetan; amestec standard de αT, yT si δT; probă, concentratul de VE din soia (53% puritate)

Valoarea Rf a fost utilizată pentru evaluarea separării cu ajutorul cromatografiei ȋn strat subțire, care reprezintă raportul distanței dintre spotul probei și linia de start. Valorile Rf pentru αT, yT si δT au fost 0.67, 0.55 și respectiv 0.43.

Cromatograma amestecului standard de tocoferoli (αT, yT si δT) și a concentratului soia obținută cu ajutorul HPLC este prezentată în figura 3.10 (A și B). Există o relație liniară bună pentru fiecare tocoferol individual, atunci când concentrația se află ȋn intervalul de 0.01-0.33 mg/ml.

Figura 3.11. Cromatograma amestecului standard de tocoferoli (αT, yT si δT) (A) și a concentratului de VE din soia (B).

Coloana, cu 150 mm x 4.6 mm cu 5-μm; faza mobilă, acetonitril (0.1% acid formic); detectarea lungimii de undă, 210 nm; volumul de injecție, 100 μl; debit, 1 ml / min. Picuri: (1) δT, (2) yT; (3) αT.[14]

SINTEZĂ ORGANICĂ AVANSATĂ

4.1. Prima sinteză totală a SRR- și RRR-α-tocoferol

Prima sinteză a RRR-1 și SRR-1 a fost publicată de Mayer și al. în 1963. Din
celelalte abordări, care au fost descrise până atunci în literatura de specialitate, a rezultat
că produsele C(2)-racemic cu trimetilhidrochinona și fitol natural, sunt materie primă.

Problema generatoare de configurare drepta a C (2) a fost rezolvată prin rezoluția optică. Calea sintetică pentru constituentul principal cromanul este descrisă în figura 4.1.[15]

Figura 4.1. Calea sintetică a constituentului principal croman R-7.

Trimetilhidrochininona (1) a fost transformată în benzaldehida 2 printr-o reacție Duff.[16]
Acetilarea și reacție cu compusul 3 a dat α, β – cetone nesaturate 4, care au fost hidrogenate la cetonă saturată 5.

O reactie Grignard cu bromură de etinil magneziu a dat alcoolul corespunzător, care ar putea cicliza la inelul de croman după îndepărtarea acidă a gruparilor acetate protectoare.

Fenolul liber a fost protejat cu anhidridă acetică pentru a produce compusul 6. O grupare carboxil a fost introdusă printr-o reactie de deprotonizare a compusului 6 cu CO2 pentru a forma compusul 8. Etapa cheie a sintezei este separarea enantiomerilor acidului 34, care a fost obtinut prin rezoluția optică a sărurilor corespunzatoare chininei pentru a da compusul optic pur 9, precum și enantiomerul S. Hidrogenarea catalitică parțială care utilizează catalizatorul Lindlar a dat compusul 10. Esterificarea cu MeOH urmată de acetilare a dat compusul 11 care a fost transformat în izomerul pur al componentului bloc R-7 prin ozonoliză.

Al doilea component principal, C15 – 17, a fost obținut prin degradare (2E, 7R, 11R) a fitolului natural 12 cum se arată în figura 4.2..

Figura 4.2. Sinteza celui de-al doilea constituentului principal 17

Aldehidă R-7 a fost cuplată cu sarea fosfoniu 17 printr-o reacție Wittig. Aceasta a fost urmată de reducerea cuplajului produsului 18 pentru a da RRR-α- tocoferol (figura 4.3).

Figura 4.3. Etapele finale de sinteză a RRR-α-tocoferol.

În anii precedenti, multe dintre schemele de sinteză au fost folosite pentru sinteza stereoselectivă a izomerilor de α-tocoferol (1), în special RRR-1.[13] Patru strategii generale au fost urmărite:

(1) Rezoluția optică clasică care da constituentul principal croman.

(2) Biocataliza (de către microorganisme și enzime izolate) oferă acces la intermediari chiral.
(3) Cataliză asimetrică deschide calea către o varietate de produse.

(4) Materiile prime și auxiliare chirale se utilizează în cantități stoichiometrice .

Extinderea pe scară largă a acestor metode de sinteză este complexă. Limitările legate de timpul de reacție și de randament precum și formarea unor cantități excesive de produși secundari constituie motivul pentru care o sinteză economică industrială a RRR-1 nu a fost găsită până astăzi.[17]

CONCLUZII

"Ipoteza potrivit căreia antioxidanții precum vitamina E joacă un rol ȋn etiologia declinului funcțiilor fizice a fost confirmată de studiile noastre precedente și de alte lucrări. O creștere a stresului oxidativ provoacă distrugeri la nivel muscular sau al ADN-ului, agravează ateroscleroza și contribuie la degenerarea neuronilori, a declarat Benedetta Bartali, profesor la Facultatea de medicina din cadrul Universitatii Yale din Conneticut. Autorii studiului recomanda alimente bogate ȋn vitamina E, și nu suplimentele. "Organisumul are nevoie zilnic de 15-30 de miligrame de alfa tocoferol, un compus al vitaminei E ce se găsește ȋn alimente de bază precum migdale, sos de roșii și semințe de floarea-soarelui, afirma medicii. O parte din beneficiile acestei vitamine se datorează capacității sale de a ȋmpiedica oxidarea vitaminelor A si C, menținandu-le astfel potențialitatea. Intrebuințările ei sunt numeroase, noi funcții și utilizari fiind descoperite tot timpul.

Poate reduce stresul oxidativ ce se soldează cu efecte secundare nefaste ȋn cazul diabetului, al afectiunilor vasculare și al aterosclerozei, iar datorită puterii sale de antioxidare și de stopare a procesului de irigare a tumorilor are acțiune anticancerigenă. Vitamina E se gaseste ȋn cereale, și mai ales ȋn cele germinate, ȋn uleiuri vegetale, salate, spanac,soia, pătrunjel, mazăre, polen.

BIBLIOGRAFIE

www.sanatatea.secretul.ro/soia.htm

www.medicina-naturista.ro/alimentatie/uleiul-de-soia.html

www.tratamente-naturiste.ro/multivitamine-suplimente-naturale/tocoferol.htm

C.D. Nenițescu, Chimia organică vol.1, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1966

C.D. Nenițescu, Chimia organică vol.2, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1966

D. Bedelean, I. Manta, Biochimie medicală, Ed. Dacia, 1985

Kamal-Eldin A, Appelqvist LA (July 1996). "The chemistry and antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols". Lipids 31 (7): 671–701.

Nesaretnam K (October 2008). "Multitargeted therapy of cancer by tocotrienols". Cancer Letters 269 (2): 388–95.

Beijersbergen van Henegouwen G, Junginger H, de Vries H (1995). "Hydrolysis of RRR-alpha-tocopheryl acetate (vitamin E acetate) in the skin and its UV protecting activity (an in vivo study with the rat)". J Photochem Photobiol B 29 (1): 45–51.

http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB8483476.htm

http://www.webmd.com/drugs/drug-149234-Tocophersolan+Oral.aspx?Drugid=149234 &drugname=Tocophersolan+Oral

Ho Lim1, Sunhee Woo2, Hong Sig Kim2, Seung-Keun Jong2, Junsoo Lee1,* “European Journal of Lipid Science and Technology”, volume 109, Issue 11, pages 1124–1127, No. 11, November 2007

Jianchun Wan, Weinong Zhang, Bo Jiang, Yonghong Guo and Chuanrong Hu, “Journal of the American Oil Chemists' Society” ,Volume 85, Number 4 (2008), 331-338.

H. Mayer, P. Schudel, R. Rüegg, O. Isler, Helv. Chim. Acta 1963, 46, 650.

J. C. Duff, E. J. Bills, J. Chem. Soc. 1945, 276.

L. N. Ferguson, Chem. Rev. 1946, 38, 227.

BIBLIOGRAFIE

www.sanatatea.secretul.ro/soia.htm

www.medicina-naturista.ro/alimentatie/uleiul-de-soia.html

www.tratamente-naturiste.ro/multivitamine-suplimente-naturale/tocoferol.htm

C.D. Nenițescu, Chimia organică vol.1, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1966

C.D. Nenițescu, Chimia organică vol.2, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1966

D. Bedelean, I. Manta, Biochimie medicală, Ed. Dacia, 1985

Kamal-Eldin A, Appelqvist LA (July 1996). "The chemistry and antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols". Lipids 31 (7): 671–701.

Nesaretnam K (October 2008). "Multitargeted therapy of cancer by tocotrienols". Cancer Letters 269 (2): 388–95.

Beijersbergen van Henegouwen G, Junginger H, de Vries H (1995). "Hydrolysis of RRR-alpha-tocopheryl acetate (vitamin E acetate) in the skin and its UV protecting activity (an in vivo study with the rat)". J Photochem Photobiol B 29 (1): 45–51.

http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB8483476.htm

http://www.webmd.com/drugs/drug-149234-Tocophersolan+Oral.aspx?Drugid=149234 &drugname=Tocophersolan+Oral

Ho Lim1, Sunhee Woo2, Hong Sig Kim2, Seung-Keun Jong2, Junsoo Lee1,* “European Journal of Lipid Science and Technology”, volume 109, Issue 11, pages 1124–1127, No. 11, November 2007

Jianchun Wan, Weinong Zhang, Bo Jiang, Yonghong Guo and Chuanrong Hu, “Journal of the American Oil Chemists' Society” ,Volume 85, Number 4 (2008), 331-338.

H. Mayer, P. Schudel, R. Rüegg, O. Isler, Helv. Chim. Acta 1963, 46, 650.

J. C. Duff, E. J. Bills, J. Chem. Soc. 1945, 276.

L. N. Ferguson, Chem. Rev. 1946, 38, 227.