Nevropatia Diabetica

Medicina

Nevropatia Diabetica

Byadmin ianuarie 1, 2024

Listă cu abrevieri și simboluri

AGE – advanced glycosilation end-products/ produșii finali de glicozilare avansată;

BCR – boală cronică de rinichi;

BRC – boală renală cronică;

CV – coeficient de variație;

DZ – diabet zaharat;

hsPCR – proteina C reactivă înalt sensibilă;

HTA – hipertensiune arterială;

IECA – inhibitori ai enzimei de conversie ai angiotensinei II;

IQR – interquartile range;

IRC – insuficiență renală cronică;

KIM1 – kidney injury molecule;

LDL colesterol – low density lipoprotein colesterol;

MB – membrana bazală;

ND – nefropatie diabetică;

NGAL – neutrophile gelatinase-associated lipocalin;

RD – retinopatie diabetică;

RFG – rata de filtrare glomerulară;

TAD – tensiunea arterială diastolică;

TAS – tensiunea arterială sistolică;

TG – trigliceride;

TGFβ– factorul β de creștere;

TP – tub proximal;

UACR – raportul albumină/creatinină urinară;

p: indice de semnificație statistică (analiza ANOVA a varianței pentru diferențele dintre grupurile 1, 2 și 3; semnificația statistică a fost stabilită a fost setată la 0.00625)

p = 0,05 → semnificativ statistic;

p = 0,01 → înalt semnificativ;

p = 0,001 → foarte înalt semnificativ;

p < 0,001 → prag de semnificație de 99,9 %;

p*: Bonferroni’s t-test pentru diferențele dintre grupurile 1 și 3;

p**: Bonferroni’s t-test pentru diferențele dintre grupurile 2 și 3;

p***: Bonferroni’s t-test pentru diferențele dintre grupurile 2 și 3;

#: variabilele corelate cu alpha1/creatinină;

*: variabilele corelate cu KIM-1/creatinină;

§: variabilele corelate cu VEGF/creatinină;

ᶠ: variabilele corelate cu nefrină/creatinină;

##: analiza regresivă multivariată pentru alpha1/creatinină urinară;

**: analiza regresivă multivariată pentru KIM-1/creatinină;

§§: analiza regresivă multivariată pentru VEGF/creatinină;

ᶠᶠ: analiza regresivă multivariată pentru nefrină/creatinină;

Mulțumiri d-nei Conf. dr. Ligia Petrica și, de asemenea, medicului rezident Villa Angheloiu pentru ajutorul acordat în redactarea prezentei lucrări de licență

INTRODUCERE

Nefropatia diabetică (ND) este o boală renală cronică, progresivă, care apare la aproximativ 1/3 dintre pacienții cu diabet zaharat (DZ). Clinic, exprimă proteinuria, HTA și reducerea progresivă a funcției renale, iar substratul său histologic caracteristic este reprezentat de glomeruloscleroză. ND, una dintre consecințele DZ, a devenit principala cauză a stadiului final al bolii renale la nivel mondial, fiind, deseori, asociată cu boala cardiovasculară. În prezent, până la 20-40% dintre cazurile referite terapiilor de substituție renală se datorează diabetului zaharat, atât în țările dezvoltate, cât și în cele în curs de dezvoltare [1].

Deoarece numărul de pacienți cu diabet zaharat este foarte mare (382 milioane la nivel mondial), iar incidența bolii cronice de rinichi (BRC) ca urmare a nefropatiei diabetice este în creștere, tema dezbătută în această lucrare este de interes actual, aducând în prim plan un subiect încă controversat și anume, mecanismele albuminuriei în nefropatia diabetică timpurie.

În prezent, există o dezbatere pentru a stabili dacă nefropatia diabetică (ND) incipientă din cadrul DZ tip 2 poate fi atribuită glomerulului sau tubului proximal (TP), aceasta făcând subiectul a numeroase studii și experimente.

De-a lungul timpului, au existat păreri diferite legate de patogenia albuminuriei: conceptul clasic referitor la mecanismele albuminuriei din cadrul nefropatiei diabetice se bazează pe defectele de la nivelul barierei de filtrare glomerulară, iar o teorie modernă incriminează disfuncția tubulară proximală în producerea nefropatiei incipiente [1, 2]. Se presupune, așadar, că albuminuria este cauzată mai ales de preluarea tubulară perturbată de albumină intactă, decât de o permeabilitate crescută a barierei de filtrare glomerulară.

În lucrări anterioare efectuate la pacienții normoalbuminurici cu DZ tip 2 s-a demonstrat că disfuncția TP precede apariția de albuminurie, iar acest fenomen poate fi întârziat de rosiglitazonă și pioglitazonă.

Teste screening pentru albuminurie ar trebui efectuate anual, începând la 5 ani de la stabilirea diagnosticului de DZ de tip 1 sau, chiar mai devreme, în prezența unui control metabolic deficitar. La pacienții cu DZ tip 2 testele screening ar trebui efectuate cu ocazia diagnosticării, iar după aceea anual. Pacienții cu albuminurie incipientă sau clinic manifestă ar trebui supuși testelor care identifică prezența comorbidităților precum retinopatia diabetică și macroangiopatia diabetică [2].

PARTEA GENERALĂ

DIABETUL ZAHARAT: DEFINIȚIE, EPIDEMIOLOGIE, CLASIFICARE

DEFINIȚIE

Diabetul zaharat este un sindrom caracterizat prin valori crescute ale concentrației

glucozei în sânge (hiperglicemie) și dezechilibrarea metabolismului (modificări lipidice

și proteice la fel de importante), cuprinzând un grup heterogen de tulburări, care pot

avea o etiologie diferită [3].

EPIDEMIOLOGIE

Diabetul zaharat se cunoaște din antichitate, dar date epidemiologice propriu-zise există numai din prima parte a acestui secol. În lume, în prezent trăiesc peste 380 milioane diabetici, dintre care 30 milioane insulino-dependenți. În țara noastră primele date privind frecvența diabetului zaharat datează din 1942, când a luat ființă la București „Centrul antidiabetic“, unde a fost creat un registru al pacienților din acest oraș în care au fost înregistrate multe dintre cazurile cunoscute. În prezent, numărul pacienților înscriși depășește 70 000. Acest registru are avantajul că au fost incluși în el atât pacienții insulino-dependenți, cât și cei insulino-independenți, de ambele sexe și de toate vârstele. Deși aproape toate studiile epidemiologice efectuate în diferite țări subliniază creșterea continuă a diabetului în ultimele decenii, care a fost paralelă cu creșterea standardului de viață (în SUA, de exemplu, procentul de diabetici s-a dublat în ultimele 2 decenii), în țara noastră ritmul de creștere reală a frecvenței bolii a fost mult mai lent decât cel înregistrat în țările industrializate [4].

CLASIFICARE

Clasificarea diabetului zaharat se face în diabet zaharat tip 1, care se caracterizează printr-o deficiență absolută de insulină, și diabet zaharat tip 2 – afecțiune metabolică cu nivel ridicat al glicemiei, în contextul unei rezistențe la insulină, respectiv unei deficiențe relative de insulină.

Diabetul zaharat de tip 1 se caracterizează prin distrugerea celulelor beta pancreatice producătoare de insulină din insulele Langerhans ale pancreasului. Principala cauză este o reacție autoimună mediată de limfocitele T. Diabetul zaharat tip 1 reprezintă aproximativ 10% din cazurile de diabet zaharat din Europa și America de Nord. Majoritatea pacienților prezintă debutul în plină sănătate, frecvent la vârsta copilăriei (deși poate să apară la orice vârstă). Sensibilitatea la insulină este normală, mai ales în stadiile incipiente.

Diabetul zaharat de tipul 2, cunoscut în trecut ca diabet zaharat non-insulinodependent (NIDDM) sau diabetul adultului, este opus diabetului zaharat de tipul 1, în care există o deficiență absolută de insulină, cauzată de distrugerea celulelor insulare din pancreas. În DZ tip 2 se întâlnește un deficit relativ de insulină și/sau o rezistență la insulină. Simptomele clasice sunt setea exagerată, urinarea frecventăși senzația constantă de foame. Diabetul zaharat de tip 2 reprezintă aproximativ 90% din cazurile de diabet, în timp ce restul de 10% sunt reprezentate în principal de diabetul zaharat tip 1și diabetul gestațional. Se crede că obezitateaconstituie cauza principală a diabetului de tip 2 la persoanele predispuse genetic la această boală [5].

COMPLICAȚIILE DIABETULUI ZAHARAT

COMPLICAȚIILE ACUTE ALE DIABETULUI ZAHARAT

Pacientul diabetic este susceptibil la numeroase complicații acute, atât medicale cât și chirurgicale. Cele medicale pot fi și ele împărțite în organice și metabolice, specifice pacientului diabetic.

COMPLICAȚII CHIRURGICALE:

• nespecifice: apendicită acută, ocluzie intestinală, ulcer hemoragic etc.

• specifice:gangrenă diabetică, hemoragie vitreană, cataractă diabetică etc.

COMPLICAȚII MEDICALE:

• organice: infarct miocardic acut, accident vascular acut, pneumopatii acute, tuberculoză

pulmonară etc.

• metabolice: cetoacidoză diabetică severă („comă diabetică"), comă hiperosmolară, acidoză lactică, comă hipoglicemică

Situațiile special întâlnite la pacienții diabetici sunt: intervențiile chirurgicale și sarcina.

Atât complicațiile chirurgicale, cât și cele medicale organice, reprezintă, de regulă, factori de declanșare a unei decompensări metabolice de tip coma cetoacidozică, comă hiperosmolară sau acidoză lactică. În fapt, complicațiile metabolice sunt rareori „pure", relativ frecvent sunt „forme mixte“ – ca de exemplu, о cetoacidoză asociată cu hiperosmolaritate sau о acidoză lactică asociată cu cetoză și hiperosmolaritate. Multe dintre urgențele metabolice survin la vârstnici care prezintă complicații cronice multiple și sunt declanșate de о afecțiune medicală acută.

COMPLICAȚIILE CRONICE ALE DIABETULUI ZAHARAT

NEFROPATIA DIABETICĂ (ND). Nefropatia diabetică este un sindrom clinic caracterizat prin prezența la un pacient cu diabet zaharat a unei albuminurii peste 200μg/min sau mai mare de 300mg/24h, care e confirmată cel puțin la 2 determinări la o distanță de 3-6

luni, cu declin continuu al ratei de filtrare glomerulare (RFG) și creșterea TA. Valorile

de mai sus ale albuminuriei echivalează cu o proteinurie mai mare de 500 mg/24h.

Diagnosticul definitiv se stabilește histologic. ND se poate manifesta ca și o complicație

atât a DZ insulino-dependent, unde este mai frecventă (30-40% din pacienți), cât și a DZ

insulino-independent (20-30% din pacienți). Există și o susceptibilitate genetică. În SUA

se constată o incidență mai crescută la populația de culoare. Bărbații au un risc mai mare

de a dezvolta o nefropatie de diabetică. Diabeticii cu un control necorespunzător al

glicemiei, cu perioade lungi de hiperglicemie, prezintă mai frecvent ND [6].

RETINOPATIA DIABETICĂ (RD). Retinopatia diabetică reprezintă, în țările industrializate, principala cauză de cecitate la subiecții cu vârste sub 60 de ani, afectând atât pacienții cu DZ tip 1, cât și pe cei cu DZ tip 2. RD este о expresie a microangiopatiei diabetice, constituind unul dintre primele semne de afectare vasculară.

Alte complicații cronice ale DZ sunt reprezentate de: neuropatia diabetică, gangrena și macroangiopatia diabetică [4].

NEFROPATIA DIABETICĂ: DEFINIȚIE, PATOGENIE, STADIALIZARE

DEFINIȚIE

Nefropatia diabetică (ND) este o boală renală cronică, progresivă, care apare la

aproximativ 1/3 dintre pacienții cu diabet zaharat, determinând scăderea progresivă a RFG și conducând la IRC [7].

Definiția clasică cataloghează nefropatia diabetică ca o proteinurie > 0.5 g/24 h. Acest

stadiu este de fapt stadiul de nefropatie clinic manifestă, proteinurie clinic manifestă, sau

stadiul de macroalbuminurie [8].

PATOGENIE

În producerea ND sunt incriminate mai multe mecanisme patogenice:

hiperfiltrarea glomerulară cu hipertensiunea glomerulară; în producerea leziunilor fibrotice un rol important se atribuie angiotensinei II (s-a observat că blocarea angiotensinei II are și un efect antifibrotic);

hiperglicemia poate induce direct expansiunea și leziunea regiunii mezangiale; glicozilarea proteinelor tisulare joacă un rol important în producerea leziunilor renale și a microangiopatiei în general;

un rol important se atribuie produșilor de glicozilare avansată (advanced glycosylation end products – AGE);

citokinele și în principal TGF-beta au, de asemenea, un rol important; TGF-beta este incriminat în procesele de hipertrofie tisulară și de sinteză de colagen, fiind implicat în producerea leziunilor de glomeruloscleroză;

perturbări ale expresiei nefrinei – proteină transmembranară exprimată de podocite;

susceptibilitatea genetică; [6]

STADIALIZARE

La începutul anilor 1980 studii efectuate în Europa au arătat că prezența în urină a unor cantități mici de albumină, care în mod normal nu pot fi detectate prin metode convenționale, erau predictorii pentru dezvoltarea ulterioară a proteinuriei clinic manifeste la pacienții cu DZ tip 1 și 2. Acest stadiu de implicare renală a fost denumit stadiul de nefropatie incipientă sau stadiul de microalbuminurie [9].

Tabel 1. Stadiile nefropatiei diabetice: valori izolate ale albuminuriei pentru diagnostic și

principalele caracteristici clinice

*Într-o mostră de urină: măsurarea proteinelor urinare totale (≥500 mg/24h sau ≥430 mg/l) poatefi de asemenea utilizată pentru a defini acest stadiu.

Interesul pentru depistarea afectării renale în stadiile ei precoce rezultă din constatarea că în această etapă, prin măsuri specifice, tulburările pot fi reversibile sau atenuate ca viteză de evoluție, un control metabolic bun putând preveni instalarea ND, ca și a altor complicații diabetice cronice. În general, filtratul glomerular scade cu circa 1 ml/mm/lună. Mogensen a propus în 1988 о stadializare a ND care pune accentul pe fazele precoce și reversibile ale interesării renale [4]:

STADIUL I este caracterizat prin hiperfuncție renală (filtrat glomerular > 150 ml/min/73 m², hipertrofie renală vizibilă uneori ecografic), datorată creșterii presiunii intraglomerulare și a suprafeței de filtrare. Eliminarea albuminei urinare este, de regulă, normală, ea putând, totuși, crește în condiții de efort, aport proteic crescut etc. Tulburările din acest stadiu sunt, de regulă, reversibile.

STADIUL II, de asemenea ,,silențios“, este caracterizat prin îngroșarea membranei

bazale a capilarelor glomerulare și expansiunea mezangială (absente în stadiul I).Prezența leziunilor specifice acestui stadiu nu poate fi evidențiată decât prin puncție biopsie renală. În acest stadiu, eliminarea urinară de albumină este și ea normală în condiții bazale, dar poate crește în unele circumstanțe (efort, diete hiperproteice, perioade de dezechilibru metabolic). Stadiul are potențial de reversibilitate, fie spontan, dar mai ales prin adoptarea unor măsuri terapeutice.

STADIUL III este reprezentat de „nefropatia diabetică incipientă" si se caracterizează prin valori anormale ale eliminării de albumină urinară, între 30 și 200 µg /min, asociate de cele mai multe ori cu un filtrat glomerular crescut (peste 140 ml/min). Apar primele obstrucții glomerulare însoțite (și agravate) de presiunea intraglomerulară crescută.

STADIUL IV, „nefropatia diabetică patentă" – cuprinde trei etape: precoce (caracterizată printr-o albuminurie > 200 µg/min/ >300 mg/24h), intermediar și avansat. În stadiul precoce filtratul glomerular mai poate fi crescut (peste 130 ml/min), dar scade progresiv sub 100 ml/min (stadiul intermediar) sau sub 70ml/min (stadiul avansat). De menționat că după intrarea în etapa intermediară a ND patente, declinul filtratului glomerular se face cu circa 1 ml/min/lună. Tensiunea arterială este constant crescută, aceasta accentuându-se în medie cu 7 mmHg/аn în absența tratamentului hipotensor.

Stadiiile IV, intermediar și avansat, sunt marcate de apariția IRC, retenția azotată inițial fiind ,,fixă“ (sub 100mg/dl), apoi progresivă. Retenția hidrosalină poate sau nu să fie prezentă.

STADIUL V, de „insuficiență renală terminală" (uremic), se caracterizează prin scăderea extremă a filtratului glomerular sub 10 ml/min/1,73m2. Tensiunea arterială este aproape constant crescută, iar obstrucția glomerulară aproape totală. Eliminarea urinară de albumină poate scădea (din cauza distrucției nefronice). Durata evoluției acestui stadiu este de ordinul lunilor [4; 6].

TEORIA TUBULARĂ A NEFROPATIEI DIABETICE – TUBULOPATIA DIABETICĂ

Conceptul clasic referitor la mecanismele albuminuriei din cadrul nefropatiei diabetice se bazează pe defectele de la nivelul barierei de filtrare glomerulară atribuite în special modificărilor biologiei podocitelor, ale membranei bazale glomerulare și disfuncției endoteliului glomerular [10; 11].

Se consideră că albuminuria rezultă din severitatea leziunilor glomerulare, dar această corelație nu este absolută pentru debutul albuminuriei, aspect demonstrat pe biopsiile renale repetate la pacienții cu DZ tip 2 [12].

BARIERA DE FILTRARE GLOMERULARĂ

Glomerulii renali sunt ghemuri de capilare situate între arteriola aferentă si eferentă, susținute de țesut interstițial (mezangiu). Mezangiul este compus din: celule mezangiale și o matrice extracelulară, în contact direct cu endoteliul capilar.

Bariera de filtrare glomerulară este alcătuită din 3 straturi:

1. Stratul endotelial (lamina fenestrata) care formează o rețea cu ochiuri laxe – barieră eficientă numai pentru elementele figurate ale sângelui;

2. Membrana bazală (MB) – este alcătuită din 3 straturi: lamina rara internă, lamina densa și lamina rara externă; are o structură densă de gel hiperhidratat de 300-400 nm grosime și cu un conținut de 90% apă; constituie o barieră pentru proteinele cu GM > 500.000 D;

3. Stratul epitelial alcătuit din podocite, celule cu prelungiri citoplasmatice (pedicele sau procese podocitare) cu ajutorul cărora se fixează pe MBG. Între pedicelele podocitelor se delimitează spații tuneliforme care comunică cu capsula Bowman și care sunt acoperite cu o matrice polianionică (încărcată electric negativ) numită glicocalix. Glicocalixul este o bariera eficientă pentru proteinele cu GM de 150.000 D și albumine (care au GM de cca. 70.000 D, iar la pH-ul sanguin normal sunt disociate ca anioni = respingere electrostatică) [13].

În consecință, la nivelul MBG, în mod normal, se filtrează doar proteine cu masă moleculară mică (sub 60.000 D și diametrul de sub 4 nm), care apoi sunt reabsorbite în tubul proximal în proporție de 99%, rezultând o proteinurie fiziologică minimă.

PODOCITELE

Celulele podocitare sunt dispuse pe versantul extern al membranei bazale glomerulare de care se fixează prin intermediul proceselor podocitare, între aceste procese găsindu-se membrana cu fantă, prin care trec proteinele în spațiul de filtrare. Aceste celule au un rol important în procesele inflamatorii imune de la nivelul glomerulilor, iar lezarea lor prezintă consecințe în producerea proteinuriei, cât și a procesele de fibroză glomerulară. Celulele podocitare acoperă suprafața glomerulară, dar ele nu sunt capabile să se dividă. În caz de afectare a podocitelor, spațiul ocupat de celula podocitară care a suferit un proces de apoptoză (moarte celulcară programată) rămâne gol și permite adeziunea membranei bazale glomerulare de capsula Bowman, dezvoltându-se la acest nivel un proces de fibroză. Podocitele produc factorul de creștere derivat din celulele endoteliale – VEGF, eliberarea lui fiind inhibată de IL4 [6]. Injuria la nivelul celulelor podocitare determină alterarea barierei de filtrare glomerulară cu urmări precum albuminuria/proteinuria. Podocitele au încarcatură electrică negativă la polul lor apical datorită amino-proteinelor precum podocalixina și podoendina, ceea ce împiedică pasajul albuminelor macromoleculare care sunt, de asemenea, încărcate negativ. Membrana cu fantă expune pori de dimensiuni mici care sunt permeabili pentru apă

și soluții, dar impermeabili pentru proteinele plasmatice. Nefrina este o componentă importantă amembranei cu fantă, a cărei alterare duce la limitarea selectivitații de mărime a acesteia [13; 14]. Scăderea numărului de podocite are ca și consecință proteinuria prin pierderea încarcăturii electrice negative și prin modificarea arhitecturii normale a filtrului glomerular.

În concluzie, numărul și densitatea redusă a podocitelor, îngroșarea membranei bazale glomerulare și scăderea expresiei nefrinei din membrana cu fantă reprezintă principalele trăsături ale podocitopatiei, care este responsabilă de albuminurie/proteinurie în cadrul DZ.

Evenimentele menționate mai sus sunt influențate direct de angiotensina II, care

stimulează sinteza de VEGF de către podocite, suprimă expresia nefrinei la nivelul membranei cu fantă și induce expresia factorului beta de creștere (TGFβ), conducând la apoptoza podocitelor și dezvoltarea consecutivă a glomerulosclerozei [15].

Teoria tradițională de prelucrare a albuminelor urinare are la bază ideea că instalarea albuminuriei din cadrul DZ este o consecință directă a creșterii permeabilității glomerulare (care determină consecutiv creșterea cantității de albumine filtrate).

Pe de altă parte, la nivelul tubului proximal se identifică 2 căi distincte de prelucrare a albuminelor, iar alterarea lor este tot mai mult considerată a fi implicată în stadiile incipiente ale nefropatiei diabetice. Astfel, albumina filtrată este recuperată la marginea în perie a tubului proximal de către receptorul megalină/cubilină prin endocitoză [16; 17]. De la acest nivel, albumina este procesată rapid de o cale cu capacitate crescută prin transcitoză și returnată în sânge [18] și de o cale cu capacitate scăzută care direcționează albumina către lizozomi unde este supusă degradării, urmată de excreția finală [19].

Poate fi înțeles faptul că aceste căi de reabsorbție și prelucrare a albuminei din tubul proximal reprezintă un mecanism de sortare a albuminei plasmatice intacte de albumina modificată structural, care este direcționată către lizozomi pentru degradare finală și excreție urinară [18].

Modelul tubular al albuminuriei prezentat anterior reprezintă de fapt, un model cu 2

receptori:

– un receptor cu capacitate crescută și afinitate scăzută – cubilină – cunoscută ca și cale de recuperare a albuminelor filtrate; acest receptor preia și returnează în sânge albuminele intacte, prin transcitoză la nivelul celulelor tubului proximal.

– un receptor cu afinitate crescută și capacitate scăzută – megalină – cunoscut ca și cale de degradare, care cedeazălizozomilor albuminele filtrate alterate, iar peptidele rezultate sunt returnate înapoi în lumenul tubular pentru excreția finală [19; 20; 21; 22].

Conform acestui model cu 2 receptori ai prelucrării albuminelor filtrate la nivel glomerular se consideră că în cadrul DZ lezarea căii de recuperare a albuminelor duce la albuminurie de nivel scăzut și de tip nefritic, în timp ce defecte ale căii de degradare a albuminelor produc nivele ale albuminuriei de peste 30 mg/zi, pană la 1-3 g/zi (micro- și macroalbuminuria).

Nivele crescute de angiotensina II produc alterări la nivelul căii de recuperare a albuminelor, determinând modificări în organizarea citoscheletului celulelor tubului proximal [18], un fenomen reversibil prin blocajul activității angiotensinei II [23; 24]. Disfuncția căii de degradare a albuminelor în cadrul DZ este legată de disfuncția lizozomală produsă de angiotensina II și TGF-β. Producția intrarenală de angiotensină II și TGF-β este crescută în cadrul DZ din cauza hiperglicemiei, dar și consecutiv intervenției albuminei glicate de la nivelul tubului proximal [20]. Scăderea albuminuriei reprezintă un deziderat care poate fi atins prin administrarea de inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei II (IECA), fapt care duce la scăderea albuminei urinare prin activarea procesării albuminelor de către lizozomi (ca urmare a inhibării producției de angiotensină II) [19; 25; 26].

Un studiu recent efectuat pe modele experimentale de șobolani a arătat că disfuncția tubului proximal este responsabilă de eliminarea urinară crescută de albumine în cadrul ND incipiente. Albumina fluorescentă filtrată a fost cu ușurință preluată de către celulele tubului proximal in rinichii normali, dar la șobolanii cu DZ indus calea de recuperare a fost afectată, rezultând inițial peptidurie crescută, urmată de albuminurie [21].

Peptiduria evidențiată în acest studiu a fost indusă de hiperglicemia de lungă durată și a fost îmbunătățită de controlul strict al glicemiei. Rezultatele acestui studiu edificator relevă 2 aspecte majore:

• instalarea albuminuriei nu se corelează cu modificări ale permeabilității glomerulare;

• albuminuria cu albumine intacte este precedată de peptidurie compusă din peptide derivate din albumine (sugerând faptul că mai întâi este afectată calea de degradare a albuminelor la nivelul celulelor tubului proximal, apoi cea de recuperare); această albuminurie nu se corelează cu modificări în permeabilitatea peretelui capilarelor glomerulare, ci cu schimbări de prelucrare a albuminelor la nivelul tubului proximal în contextul unei hiperglicemii cronice.

BIOMARKERI URINARI IMPLICAȚI ÎN DIAGNOSTICUL DISFUNCȚIEI TUBULUI PROXIMAL ȘI DE LEZIUNE PODOCITARĂ

Evaluarea tubului proximal din cadrul DZ cuprinde un panel de biomarkeri urinari, ce permit stabilirea unui diagnostic precoce sau chiar prevenirea bolii renale cronice, aceștia putând fi depistați inclusiv încă din stadiul de normoalbuminurie. Creșterea nivelului acestor biomarkeri are o valoare de predictor al dezvoltării ND precoce. Teoria tubulară legată de mecanismul albuminuriei, din cadrul DZ, susține că disfuncția tubului proximal poate fi prezentă chiar și la pacienții cu normoalbuminurie și precede, deci, instalarea albuminuriei, fapt ce atestă beneficiul substanțial al biomarkerilor urinari de disfuncție tubulară proximală în diagnosticarea și urmărirea progresului ND. Un număr vast de studii clinice și experimentale asociază biomarkerii urinari ai disfuncției tubului proximal cu normoalbuminuria și cu utilitatea lor în urmărirea transformării normoalbuminuriei în microalbuminurie și viceversa [17].

Alpha1-microglobulina urinară

Alpha1-microglobulina urinară este un marker al disfuncției precoce a tubului proximal folosit în cadrul mai multor boli renale, inclusiv ND. Alpha1-microglobulina este filtrată sub formă liberă la nivel de glomeruli și reabsorbită la nivelul tubului proximal [27]. Creșterea nivelului de alpha1-microglobulină urinară a fost semnalată la pacienții cu DZ tip 1 [28; 29] și cu DZ tip2 [30; 31; 32].

Ar trebui subliniat faptul că această creștere a nivelului de alpha1-microglobulină urinară precede instalarea microalbuminuriei la pacienții cu DZ tip 1 și 2, un fapt care susține intervenția definitoare a tubului proximal în cadrul prelucrării albuminelor filtrate la nivel glomerular. Astfel,deși leziunile renale pot fi prezente la nivel glomerular înaintea leziunilor tubulo-interstițiale, microalbuminuria nu devine detectabilă atât timp cât tubul proximal își menține integritatea structurală și funcțională. Este bine cunoscut până în prezent că rolul tubului proximal în prelucrarea albuminelor filtrate glomerular este fundamental în contextul căilor de degradare și recuperare a albuminelor de la nivelul tubului proximal [29; 30; 31; 32].

Kidney injury molecule 1 (KIM-1)

KIM-1 este o glicoproteină membranară tip 1 care nu este detectabilă în urina normală, dar este exprimată în cantitate mare în caz de leziuni ale tubului proximal (marker de disfuncție tubulară proximală), leziuni din cadrul mai multor boli renale sau datorate acțiunii nefrotoxice a diferitelor toxine [27;36]. Nivele crescute de KIM-1 au fost demonstrate și la pacienții cu DZ tip 2, la care tranziția de la micro- la normoalbuminurie a fost acompaniată de o scădere a expresiei urinare KIM-1. Această observație constituie un argument în favoarea fapului că disfuncția tubului proximal precede leziunea glomerulară în cursul DZ tip 2 [32; 33].

VEGF – factorul de creștere a endoteliului vascular

VEGF este un factor pro-angiogenetic, produs în principal de podocite, acționând asupra acestor celule printr-un mecanism autocrin, și care poate traversa membrana bazală glomerulară, asigurând supraviețuirea celulelor endoteliale și, astfel, creșterea permeabilității endoteliului glomerular [27].

În stadiile precoce ale nefropatiei diabetice, expresia VEGF este mărită în special la nivelul podocitelor. În stadiile mai avansate ale nefropatiei diabetice, expresia VEGF scade, un fenomen ce secorelează cu albuminuria [29] și care este legat de alterări severe ale numărului și structurii podocitelor [30].

Excreția urinară de VEGF poate crește chiar în etapa de normoalbuminurie, fapt ce sugerează că VEGF urinar poate fi folosit ca un biomarker de leziune podocitară, sensibil în diagnosticul precoce al ND.

Nefrina

Nefrina, o proteină transmembranară din superfamilia imunoglobulinelor, este o componentă importantă a membranei cu fantă, situată între procesele podocitare ale podocitelor. Alterarea podocitelor conduce la scăderea selectivității legate de mărime a membranei cu fantă.

Importanța nefrinei ca marker al leziunii podocitare și totodată ca biomarker al nefropatiei diabetice timpurii derivă din rezultatele furnizate de mai multe studii care arată că nivelurile crescute de nefrinurie pot fi găsite la pacienți normalbuminurici cu diabet zaharat tip 1 și tip 2, fapt care demonstrează că nefrinuria poate precede microalbuminuria [33].

Produșii de glicozilare avansată (AGE)

AGE se formează prin reacția de bază non-enzimatică Maillard, reacție între zaharuri și proteine. AGE cu masă moleculară mică sunt filtrați de glomeruli și apoi reabsorbiți și metabolizați de către TP. AGE cu masă moleculară mare sunt, de asemenea, livrați la TP în stadiile proteinurice. AGE se consideră a fi implicați în patogeneza tubulopatiei diabetice, o entitate în curs de conturare, care implică mecanisme multiple, inclusiv AGE.Cel mai probabil, disfuncția TP este inițiată prin diverse tipuri de fragmente peptidice, dintre care peptidele glicozilate au o importanță majoră. Există o dezbatere continuă, în ceea ce privește albumina în sine, dacă este nefrotoxică și dacă modificarea sa și a moleculelor sale, cum ar fi albumina glicozilată, induc un grad de nefrotoxicitate.

Un alt scop al studiului prezentat în această lucrare a fost și de a investiga toxicitatea peptidelor glicozilate asupra TP și endoteliului glomerular la pacienții cu DZ tip 2[34; 35].

Cistatina C serică

Cistatina C este o proteină non glicozilată, ale cărei valori sunt crescute atât la pacienții cu nefropatie incipientă, cât și la cei aflați în programul de dializă. Ca urmare a masei moleculare mici și a sarcinii electrice pozitive, cistatina C este filtrată liber la nivel glomerular și reabsorbită complet în tubii proximali unde este și metabolizată. Astfel, în absența unei leziuni tubulare, cistatina C nu este prezentă în urina finală. Datorită acestor caracteristici cistatina C reprezintă un marker endogen al ratei filtrării glomerulare (RFG), corelația fiind invers proporțională: valorile crescute indică o rată scăzută a filtrării glomerulare, într-un mod similar creatininei serice, dar cu specificitate mai mare (numărul rezultatelor fals-pozitive este mai mic) [36; 37]. Cistatina C poate reprezenta un marker precoce de alterare a funcției renale, înainte de debutul albuminuriei, deoarece valorile serice crescute ale cistatinei C la pacienții cu DZ de tip 2 pledează pentru un anumit grad de insuficiență renală, chiar și atunci când albuminuria și RFG sunt încă în limite normale. Totodată, cistatina C se asociază cu biomarkeri ai disfuncției TP și cu leziunea podocitară la pacienții cu DZ tip 2 [39; 40].

PARTEA SPECIALĂ

INTRODUCERE

Diabetul zaharat (DZ) reprezintă principala cauză a bolii cronice de rinichi terminale la nivel mondial și îi pot fi atribuite până la 20-40% dintre cazurile referite terapiilor de substituție renală, atât în țările dezvoltate, cât și în cele în curs de dezvoltare [41, 42]. În prezent, există o dezbatere perpetuă pentru a stabili dacă nefropatia diabetică incipientă (ND) din DZ tip 2 poate fi atribuită glomerulului sau tubului proximal (TP). Se presupune că albuminuria este cauzată mai ales de preluarea perturbată de albumină intactă de către tubul proximal, decât de o permeabilitate crescută a barierei de filtrare glomerulară [31, 43].

Interesul pentru implicarea TP în apariția timpurie a nefropatiei diabetice derivă din

observația că pacienții cu DZ tip 2 pot afișa un declin constant al funcției renale și pot evolua spre stadii mai avansate de boală cronică de rinichi (BCR) în ciuda faptului că ei rămân normoalbuminurici pe termen lung [44].

Conceptul clasic cu privire la mecanismele albuminuriei în ND se bazează pe defecte în bariera de filtrare glomerulară [45, 46]. Conform acestei ipoteze, se consideră că albuminuria este determinată de severitatea leziunilor glomerulare, dar acestă corelație nu este strictă înainte de debutul albuminuriei, fapt demonstrat de repetate biopsii renale realizate la pacienții cu tip 2 de DZ [14].

Podocitele sunt celule diferențiate terminal din punct de vedere ontogenetic, situate pe versantul extern al membranei bazale glomerulare. Nefrina, o proteină transmembranară din super-familia imunoglobulinelor, este o componentă importantă a membranei cu fantă, situată între procesele podocitare ale podocitelor. Alterarea podocitelor conduce la scăderea selectivității legate de mărime a membranei cu fantă [45].

Importanța nefrinei ca biomarker al nefropatiei diabetice timpurii derivă din

rezultatele furnizate de mai multe studii care arată că niveluri crescute de nefrinurie pot fi întâlnite la pacienți normalbuminurici cu diabet zaharat tip 1 și tip 2, fapt care demonstrează că nefrinuria poate precede microalbuminuria [14,24].

Factorul de creștere al endoteliului vascular (VEGF – Vascular Endothelial Growth Factor) este un factor pro-angiogenic, produs în principal de podocite, și acționează asupra acestor celule printr-un mecanism autocrin.

În stadiul incipient de DN, expresia VEGF este crescută în podocite, ceea ce duce la

creșterea permeabilității endoteliale și a efectelor autocrine ale VEGF asupra podocitelor, cu creșterea consecutivă a proteinuriei. Excreția urinară de VEGF poate crește chiar în etapa de normoalbuminurie, fapt ce sugerează că VEGF urinar poate fi folosit ca un biomarker sensibil în diagnosticul precoce al ND.

Teoria tubulară privind albuminuria în cursul DZ tip 2 prevede că albuminuria este cauzată în principal de afectarea absorbției tubulare a albuminei intacte, mai degrabă decât de pierderile crescute ale barierei de filtrare glomerulară [31; 43]. În lucrări precedente realizate la pacienții normoalbuminurici cu DZ tip 2 s-a demonstrat că disfuncția TP precede apariția

albuminuriei, un fenomen care ar putea fi întârziat de rosiglitazonă [27] și pioglitazonă [28].

Printre alți factori cauzatori ai disfuncției TP, produșii de glicozilare avansată (AGE – advanced glycosilation end-products) au fost implicați în patogenia tubulopatiei diabetice, o entitate în curs de dezvoltare [35].

Scopul acestui studiu este de a evalua o potențială relație între disfuncția TP și excreția de nefrină urinară, respectiv VEGF urinar, la pacienții cu DZ tip 2 normalbuminurici, comparativ cu cei microalbuminurici.

De asemenea, a fost investigată posibilitatea asocierii acestei relații cu intervenția AGE, care pot influența atât TP, cât și podocitele. S-a demonstrat faptul ca în DZ tip 2 există o asociere între disfuncția TP și biomarkerii de leziune podocitară chiar și în stadiul normoalbuminuric. Această observație sugerează potențialul rol al TP în procesarea nefrinei și VEFG urinar în ND incipientă. Biomarkerii de leziune podocitară și disfuncție tubulară ar putea fi, așadar, validați ca o abordare practică în diagnosticul DN incipiente. Un alt obiectiv al acestui studiu a fost de a investiga toxicitatea peptidelor glicozilate asupra TP și endoteliului glomerular la pacienții cu DZ tip 2.

Toți pacienții au fost investigați în legătură cu alpha1-microglobulina urinară și KIM-1 urinară ca biomarkeri ai disfuncției TP, nefrina urinară și VEGF urinar ca markeri ai leziunii podocitului, peptidele AGE plasmatice și urinare, UACR și cistatina C serică.

MATERIAL ȘI METODĂ

Un total de 70 de pacienți cu DZ tip 2 (38 pacienți cu normalbuminurie – grupul 1 și 32 pacienți cu microalbuminurie – grupul 2) din cadrul Clinicii de Diabet și Boli Metabolice și 21 subecți de control sănătoși (grupul 3) au fost înrolați într-un studiu cross-sectional. Criteriile de includere au fost durata DZ mai mare de 5 ani, normoalbuminuria [raportul albumină/creatinină urinară = UACR < 30 mg/g] pentru grupul 1 și microalbuminurie [UACR între 30 și 300 mg/g], terapie cu medicamente antidiabetice orale, inhibitori ai enzimei de conversie și/sau blocanți ai receptorilor de angiotensină și statine. Comisia de Etică a Spitalului a aprobat protocolul și fiecare pacient a furnizat în scris consimțământul informat înainte de înrolare în cadrul studiului.

Pacienții au fost evaluați în raport cu alfa1-microglobulina urinară și cu KIM-1, ca biomarkeri pentru difuncția TP; în raport cu nefrina urinară și VEGF urinar, ca markeri de leziune podocitară; în raport cu AGE din plasmă și urină, cistatina C serică și raportul albumină:creatinină urinară (UACR).

Biomarkerii serici și urinari au fost determinați în probele congelate la -80 ° C și dezghețate înainte de analiză. Personalul laboratorului care a efectuat evaluările nu a fost informat cu privire la tratamentul pacienților înrolați în studiu.

BCR a fost definită conform Ghidului KDIGO de Evaluare și Management al BCR (2009 CKD-EPI creatinine equation).

Cistatina C a fost evaluată în ser cu N Latex- Cystatina C Kit (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germania), prin imunonefelometrie folosind Sistemul BNProSpec. Intervalul de referință a fost calculat non-parametric și a fost stabilit ca 0.53-0.95mg/l. Precizia intra-test a avut un coeficient de variație (CV) de 2,5%, iar precizia inter-test a avut un CV de 2,0%, cu un total de 2,8% CV. Sensibilitatea analitică a fost calculată ca două deviații standard peste semnalul mediu de 20 repetări de N diluant și a fost determinată a fi 0.005 mg/l. O detecție tipică pentru N Latex Cystatin C este de 0,05 mg/l.

Alpha1-microglobulina urinară a fost evaluată în cea de a doua probă de urină de dimineață cu N α1-Microglobulin Kit (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germania), prin imunonefelometrie cu particule cu ajutorul Sistemului BNProSpec. Intervalul de referință a fost de 12mg/l sau 0.07-5mg/g creatinină.Precizia intra-test a avut un CV de 2.9-5.2%, în timp ce precizia inter-test a fost de 7.4-13.2% CV.

KIM-1 a fost evaluată în cea de-adoua probă de urină de dimineață cu KIM-1 ELISA test kit pentru detectarea KIM-1 în urina umană (Cat No. H-RENA-E-001, Bio Assay Works, Ijamsville, MD, USA). A fost folosit un anticorp uman împotriva KIM-1, iar nivelul de detecție a fost stabilit ca 0.150 ng/ml pentru KIM-1 urinară.

Albuminuria a fost măsurată în cea de-a doua probă de urină de dimineață, cu ajutorul imunonefelometriei pe Sistem BNProSpec, cu N antiser de albumină umană (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germania). Microalbuminuria a fost definită de raportul albumină/creatinină urinară între 30 și 300 mg/g, iar normalbuminuria de UACR < 30 mg/g. N Antiserul de Albumină umană a fost evaluat pentru testul de urină pe un Sistem BN și a generat un CV intra-test de 2,2% și un CV total de 2,6%, cu o medie de 79 mg/l. Rezultatele (zece executări cu patru determinări per executare) au fost evaluate prin analiza de varianță. Uroculturile au fost negative pentru bacteriurie la toți pacienții.

Nefrina a fost evaluată în cea de-a doua probă de urină de dimineață cu human NPHN (Nephrin) ELISA kit (Cat No. E-EL-H1901Elabscience Biotech Co. Ltd, Wuhan, Hubei Province, China). A fost utilizat un anticorp uman anti-nefrină. Sensibilitatea evaluării a arătat că doza minimă detectabilă de nefrină umană este 0.1 ng/ml. Intervalul de detecție este 0.16–10 ng/ml. Repetibilitatea testului a afișat un CV <10%.

VEGF a fost determinat din cea de-a doua probă de urină de dimineață cu VEGF human ELISA kit, pentru detecția VEGF urinar (CatNo. ab100663, Abcam, Cambridge, MA, USA). A fost utilizat un anticorp uman anti-VEGF și s-a determinat că doza minimă detectabilă a VEGF este uzual sub 10 pg/ml. Reproductibilitatea intra-test a avut un CV < 10%, iar reproductibilitatea inter-test a avut un CV < 12%.

Peptidele AGE plasmatice și urinare au fost evaluate în două probe de urină pe 24 ore, prin metoda ELISA cu Human Advanced Glycosilation End-Products (anticorpi policlonali anti-AGE) Kit ELISA (E01A0002), (Shanghai BlueGene Biotech Co, Shanghai, China). Sensibilitatea acestei determinări, măsurată în două probe de urină pe 24 ore, a fost de 1,0 pg/ml. Acest test are sensibilitate ridicată și specificitate excelentă pentru AGE și conține anticorpi policlonali care evaluează AGE legați de proteine. Sistemul folosit permite evaluarea atât a speciilor moleculare mici, cât și a speciilor moleculare mari de AGE. Nu a fost observată o reacție încrucișată sau interferență între AGE și analogi.

ANALIZĂ STATISTICĂ

Datele clinice și biologice sunt prezentate ca mediane, IQR (interquartile range) și variabile cu distribuție dispersată. Au fost folosite testul ANOVA și testul Bonferroni pentru comparații multiple. De asemenea, am folosit analize de regresie liniară simplă și multiplă. R-square și R-square corectat au fost raportate în rezultatele prezentate. Valorile p pentru toate testele de ipoteze au fost two-sided, iar semnificația statistică a fost stabilită la p < 0.00625. Toate analizele au fost efectuate cu Stata 9.2 (Statacorp, Texas, SUA).

Declarație de etică:

Comisia etică din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgență Timișoara (Catedra de Studii Umane) a aprobat protocolul (aprobare nr. 3/5 Ianuarie 2014) și fiecare pacient a semnat un consimțământ informat înainte de înrolarea în cadrul studiului.

REZULTATE

Toți pacienții și subiecții de control au fost incluși în analiză.

Datele demografice, clinice și de laborator ale pacienților și ale subiecților de control sunt prezentate în Tabelul 1. Conform criteriilor de includere în studiu, toți pacienții erau în tratament cu inhibitori ai enzimei de conversie și/sau blocanți ai receptorilor de angiotensină și statine. Prin urmare, parametrii aceștia nu au fost introduși în Tabelul 1 sau în analizele uni-/multivariate. Diferențe importante au fost găsite între grupurile 1 și 2 în ceea ce privește proteina C reactivă înalt sensibilă (hsPCR) (p<0.0001), UACR (p<0.0001), cistatina serică C (p=0.020), alpha1-microglobulina urinară (p<0.0001), KIM-1 urinară (p=0.003), nefrina urinară (p<0.0001), VEGF urinar (p<0.0001), peptidele AGE urinare (p<0.0001) și plasmatice (p<0.0001).

De asemenea, diferențe semnificative au fost întâlnite între grupurile 1 și 3 și respectiv, între grupurile 2 și 3, cu privire la aceiași parametri, inclusiv cistatina C (Tabel1).

Tabel 1: Datele clinice și biologice ale pacienților studiați

DZ – diabet zaharat;

IMC- indicele de masă corporală;

TAS – tensiunea arterială sistolică;

TAD – tensiunea arterială diastolică;

Hb – hemoglobina;

RFGe – rata de filtrare glomerulară estimată;

hsPCR – proteina C reactivă înalt sensibilă;

UACR – raportul albumină pe creatinină urinară;

alpha1/creat. urinară:raportul alpha1-microglobulină pe creatinină;

KIM-1/creat. urinară: raportul kidney injury molecule-1 pe creatinină;

VEGF/creat. urinară: raportul dintre factorul de creștere endotelială și creatinină;

nefrină/creat. urinară: raportul nefrină pe creatinină;

AGE: advanced glycation end-products;

grup 1: pacienți cu normalbuminurie;

grup 2: pacienți cu microalbuminurie;

grup 3: subiecți de control sănătoși; parametrii sunt exprimați ca și mediane și IQR, ca variabilele cu distribuție dispersata;

p*: Bonferroni’s t-test pentru diferențele dintre grupurile 1 și 3;

p**: Bonferroni’s t-test pentru diferențele dintre grupurile 2 și 3;

p***: Bonferroni’s t-test pentru diferențele dintre grupurile 2 și 3;

p: analiza ANOVA a varianței pentru diferențele dintre grupurile 1, 2 și 3; semnificația statistică a fost stabilită a fost setată la 0.00625;

În cadrul analizei regresive univariate, alpha1-microglobulina urinară și KIM-1 urinară au fost corelate direct cu UACR, nefrinuria, VEGF urinar, peptidele AGE urinare, cistatina serică C și invers proporțional cu rata de filtrare glomerulară estimată (RFGe).

Nefrinuria și VEGF urinar au fost corelate direct cu alpha1-microglobulina urinară, KIM-1 urinar, UACR, peptidele AGE urinare, cistatina serică C și invers proporțional cu RFGe (Tabel 2).

Tabel 2: Analiza regresivă univariată pentru biomarkerii urinari

KIM-1/creat.- raportul dintre kidney injury molecule și creatinină;

alpha1/creat.- raportul dintre microglobulina alpha1 urinară și creatinină;

nefrină/creat. – raportul dintre nefrină și creatinină;

VEGF/creat.- raportul dintre factorul de creștere endotelială și creatinină;

RFGe- rata de filtrate glomerulară estimată;

AGE- advanced glycation end-products;

UACR- raportul dintre albumina urinară și creatinină;

*- datele pentru KIM-1/creat.;

#: datele pentru alpha1 urinară/creat.;

§- datele pentru nefrină/creat.;

ᶠ- datele pentru VEGF/creat.;

În cadrul analizei regresive multivariate, alpha1-microglobulina urinară a fost corelată

direct cu KIM-1 urinară, peptidele AGE urinare, nefrinurie, VEGF urinar, cistatina C serică și invers proporțional cu RFGe.

KIM-1 urinar a fost corelat direct cu alpha1-microglobulina urinară, peptidele AGE urinare, nefrinurie, VEGF urinar, cistatina C serică și invers proporțional cu RFGe.

Nefrinuria a fost corelată direct cu UACR, cu peptidele AGE urinare și cu VEGF urinar, în timp ce VEGF urinar a fost corelat direct cu peptidele AGE urinare, cistatina C serică, alpha1-microglobulina urinară și invers proporțional cu RFGe. Datorită faptului că inflamația crește expresia VEGF și gradul de leziune podocitară din cursul ND, proteina C reactivă înalt sensibilă a fost, de asemenea, introdusă în cadrul analizei regresive multivariate. După introducere proteinei C reactive înalt sensibilă în analiza multivariată, asocierea dintre disfuncția tubulară proximală și markerii de leziune podocitară a rămas semnificativă (Tabel 3).

Tabel 3: Analiza regresivă multivariată pentru biomarkerii urinari

Alpha1/creat. urinară: raportul albumină pe creatinină urinară;

KIM-1/creat.: raportul dintre kidney injury molecule-1 și creatinină;

VEGF/creat.:raportul dintre factorul de creștere endotelială și creatinină;

nefrină/creat.: raportul nefrină pe creatinină;

RFGe -rata de filtrare glomerulară estimată;

AGE – advanced glycation end-products;

hsPCR – proteina C reactivă cu sensibilitate crescută;

UACR –raportul albumină pe creatinină urinară;

#: variabilele corelate cu alpha1/creat.;

*: variabilele corelate cu KIM-1/creat.;

§: variabilele corelate cu VEGF/creat.;

ᶠ: variabilele corelate cu nefrină/creat.;

##: analiza regresivă multivariată pentru alpha1/creat. urinară;

**: analiza regresivă multivariată pentru KIM-1/creat.;

§§: analiza regresivă multivariată pentru VEGF/creat.;

ᶠᶠ: analiza regresivă multivariată pentru nefrină/creat.;

DISCUȚII

Biomarkerii de leziune podocitară au fost discutați în relație cu biomarkerii de leziune a

TP, iar accentul a fost pus pe preluarea și procesarea nefrinei și a VEGF-ului de către TP

în ND timpurie. Secundar, a fost investigată, de asemena, implicarea peptidelor AGE, datorită faptului că acestea pot influența atât podocitul, cât și TP. Rezultatele prezentului studiu au documentat faptul că disfuncția TP precede debutul albuminuriei, un fenomen ce sugerează o disociere de disfuncția endotelială glomerulară. Totodată, în ceea ce privește efectul nefrotoxic presupus al peptidelor glicozilate, AGE urinare s-au corelat cu biomarkeri ai disfuncției TP studiate.

La pacienții cu DZ tip 2 a fost găsită, în urma studiului efectuat, o asociere între disfuncția tubului proximal și biomarkerii podocitari, un fenomen care a fost independent de nivelul albuminuriei sau al funcției renale.

Biomarkerii disfuncției TP sunt crescuți în ND incipientă și se corelează cu peptidele AGE urinare

Teoria tubulară privind mecanismele albuminuriei în ND timpurie afirmă că există o scădere a reabsorbției albuminei la nivelul TP și că această deteriorare precede leziunea glomerulară [31]. Peptidele AGE modificate indică efecte tubulotoxice ce conduc la răspunsuri fiziopatologice descrise ca și tubulopatie diabetică [35].

Markerii disfuncției TP sunt puternic asociați cu nivelurile plasmatice și urinare ale peptidelor AGE [25, 40].

În acest studiu, s-a descoperit o relație semnificativă a peptidelor AGE plasmatice și urinare cu biomarkerii de disfuncție a TP, așa cum sunt alpha1-microglobulina urinară și KIM-1 urinară.

Alpha1-microglobulina urinară și KIM-1 urinară sunt biomarkeri sensibili în detecția disfuncției TP în ND timpurie, chiar și la pacienții normalbuminurici. Datele furnizate de mai multe studii realizate pe pacienți normalbuminurici cu DZ tip 2, care aveau nivele ridicate de alpha1-microglobulină urinară [27, 28] și KIM-1 urinară arată că defectele funcționale tubulare preced debutul albuminuriei. Într-un alt studiu realizat la pacienți cu DZ tip 2, markerii tubulari urinari au fost asociați în mod independent cu albuminuria în primele stadii ale ND.

Nivele mai înalte ale KIM-1 urinară au fost găsite la pacienții cu DZ tip 2 cu hiperfiltrare glomerulară, comparativ cu pacienții cu RFGe normală, indicând faptul că acest fenomen glomerular este un “trigger” al disfuncției TP în ND timpurie.

În studiul acesta, nivelele de KIM-1 urinară au fost crescute atât la pacienții normalbuminurici, cât și la pacienții microalbuminurici, dar semnificativ mai mari în cazul grupului cu microalbuminurie. Aceste date sunt în concordanță cu rezultatele obținute în studiul realizat de Vaidya și colaboratori la pacienții cu DZ tip 1, unde nivelele scăzute de KIM-1 și N-acetil-beta-D glucozaminidază au fost asociate cu regresia microalbuminuriei spre normalbuminurie.

Nivelele urinare ale celor doi biomarkeri de leziune tubulară au fost semnificativ crescute la pacienții cu microalbuminurie, comparativ cu pacienții cu normalbuminurie sau cu subiecții de control sănătoși [47].

In cadrul lotului, alpha1-microglobulina urinară și KIM-1 urinară au fost corelate cu UACR chiar și la nivele normal-înalte ale UACR, ridicând astfel posibilitatea ca injuria TP să preceadă debutul microalbuminuriei. Trebuie subliniat faptul că în studiul prezentat, alpha1-microglobulina urinară și KIM-1 urinară au fost corelate cu peptidele AGE urinare. Într-un alt studiu experimental recent, s-a arătat că șoarecii diabetici au avut un nivel renal mai mare de peptide AGE, fapt ce s-a corelat cu UACR, cu hiperfiltrarea și cu eliberarea renală de KIM-1. Se poate, deci, presupune existența unui impact al peptidelor AGE asupra TP în stadiile incipiente ale DN, fapt ce explică nivelele urinare crescute de alpha1-microglobulină și KIM-1 la pacienții cu DZ tip 2, normoalbuminurici.

Până în prezent, teoria tubulară privind mecanismele albuminuriei în ND incipientă afirmă că există o diminuare în calea de recaptare a albuminei în TP și această insuficiență precede deteriorarea glomerulară. Albumina per se este considerată nefrotoxică, iar modificările de albumină, cum ar fi carbametilarea și glicarea, măresc capacitatea albuminei de a exercita proprietăți nefrotoxice și de a cauza disfuncția TP și fibroză peritubulară.

Rinichiul filtrează și excretă albumină glicozilată în defavoarea albuminei nemodificate. Astfel, prelucrarea albuminei anormale de către TP poate fi consecința diferențelor dintre albumina normală și AGE-modificată – albumină anormală. Printre peptidele AGE-modificate, albumina glicozilată prezintă efecte tubulotoxice și duce la efecte fiziopatologice ce pot fi descrise ca tubulopatie diabetică. Datele furnizate de acest studiu arată că peptidele glicozilate urinare (cel mai probabil fragmentele lor) pot prezenta efecte toxice asupra TP, chiar și la pacienții normoalbuminurici.

Disfuncția TP indusă de AGE este susținută de mai multe studii care arată că biomarkerii disfuncției TP sunt puternic asociați cu nivelurile de peptide AGE plasmatice și urinare [25; 40].

Similar, în studiul prezent a fost găsită o relație semnificativă între peptidele AGE urinare și plasmatice și biomarkerii disfuncției TP, cum ar fi alfa1-microglobulina urinară și KIM-1. La pacienții normoalbuminurici cu DZ tip 2, nivelele crescute ale biomarkerilor disfuncției tubulare, printre care alfa1-microglobulina urinară, susțin teoria conform căreia defectele funcționale tubulare preced debutul albuminuriei.

În prezentul studiu, toți markerii de disfuncție a TP au fost asociați cu RFG și cistatina C, independent de albuminurie. Nivelul urinar al markerilor de disfuncție tubulară evaluat la pacienții din cadrul studiului s-a corelat cu nivelul peptidelor AGE plasmatice și urinare, fapt care susține ipoteza conform căreia componentele albuminei modificate pot prezenta efecte tubulotoxice, așa cum s-a demonstrat prin studii privind proteinele care ajung în lumenul tubular [31; 32].

Astfel, se presupune că disfuncția TP indusă de fragmentele peptidelor glicozilate este unul dintre factorii cheie ce poate face diferența dintre pacienții normo-și microalbuminurici. Aceste date indică faptul că disfuncția TP este disociată de disfuncția endotelială glomerulară în DN incipientă, pe care o și precede totodată.

În altă ordine de idei, deteriorările tubulare pot precede implicarea glomerulară, deoarece mai multe proteine tubulare si enzime sunt detectabile chiar înainte de apariția albuminuriei și a creșterii creatininei serice, fapt care explică de ce funcția renală poate prezenta un declin constant la pacienții normoalbuminurici cu DZ tip 2.

La pacienții cu DZ tip 2, nefrinuria și VEGF urinar evoluează în paralel cu disfuncția TP

Nefrina este o proteină specifică podocitelor, iar prezența ei în urină se corelează cu leziunile podocitare, de-a lungul nefropatiei diabetice.

Într-un studiu condus de Pätäri și colaboratorii, în urina pacienților cu DZ tip 1 nefrina a fost evidențiată la 30% dintre pacienții normalbuminurici, la 17% dintre cei cu microalbuminurie, la 28% dintre cei cu macroalbuminurie și la 28% dintre cei cu debut recent de albuminurie. Detecția nefrinuriei la pacienții normoalbuminurici este înalt predictivă pentru dezvoltarea DN [48].

Rezultatele studiului prezentat în lucrare dovedesc faptul că nefrinuria este crescută la pacienții cu DZ tip 2, chiar și în stadiile de normalbuminurie. Au fos găsite în cazul acestui studiu nivele ridicate de nefrinurie, corelate cu biomarkerii de disfuncție tubulară proximală, cu peptidele AGE urinare, UACR, cistatina C și RFGe. Aceste corelații nu s-au menținut în cazul subiecților sănătoși, fapt ce întărește puterea diagnostică predictivă a nefrinuriei în DN incipientă.

Nivele înalte de nefrinurie, care au evoluat paralel cu nivelele crescute ale markerilor de disfuncție a TP, ca și NGAL sau heart-fatty acid binding protein, au fost relevate și într-un studiu efectuat la șoareci, la care s-a indus DZ tip 1 și ND timpurie cu ajutorul streptozocinei.

Într-un studiu realizat la pacienți cu DZ tip 2, a fost evidențiată o corelație independentă între nefrinurie și UACR, respectiv RFGe. Nefrinuria a fost asociată semnificativ cu nivele scăzute ale RFGe chiar și la pacienții normalbuminurici, aceasta sugerând că nefrinuria poate fi implicată în dezvoltarea insuficienței renale în stadiul de normalbuminurie.

Rezultatele prezentului studiu sunt în concordanță cu acele date care indică faptul că pacienții cu DZ tip 2 și normalbuminurie sunt deseori percepuți ca un grup de pacienți cu risc scăzut de dezvoltare a BRC [24].

În alt studiu efectuat la pacienți cu DZ tip 2, nefrinuria a fost detectată la 54% dintre pacienții normalbuminurici, sugerând potențialul rol al nefrinei urinare ca biomarker precoce al ND. În raportul acelui studiu, nefrinuria era corelată semnificativ cu albuminuria și arăta o corelație inversă cu RFGe [50].

Deși aceste date sugerează că alterări ale membranei bazale glomerulare pot fi prezente în stadiile incipiente ale ND, nefrinuria este evidențiată numai la un procent redus de pacienți, fenomen exprimat atunci se produce disfuncția TP.

Reabsorbția albuminei de către tubul proximal prin mecanisme endocitare specifice care utilizează complexul receptor megalină/cubilină explică întârzierea apariției microalbuminuriei chiar și la pacienții cu nefrinurie detectabilă. S-a presupus că TP poate fi implicat nu doar în recuperarea albuminei, dar și a nefrinei în cursul ND, chiar și în stadiile sale incipiente [24].

În prezentul studiul, nefrinuria a fost corelată cu biomarkerii disfuncției TP, fapt ce confirmă faptul că TP ar putea întârzia expresia implicării glomerulare în ND incipientă prin coordonarea absorbției și procesării nefrinei.

În studiul lui Kim și al colaboratorilor, VEGF urinar a fost crescut la pacienții cu DZ tip 2 în stadiile incipiente ale ND și corelat cu albuminuria. Excreția urinară de VEGF a crescut pe măsură ce ND a avansat, aceasta sugerând că VEGF urinar este un biomarker sensibil al ND, predictiv pentru progresia bolii.

În studiul prezentat în lucrarea de față, VEGF urinar a fost corelat cu nefrinuria și UACR, dar și cu biomarkerii disfuncției tubulare proximale, peptidele AGE urinare, cistatina C și RFGe. Ca și în cazul nefrinuriei, aceste corelații nu au fost găsite și în cazul subiecților de control sănătoși.

Se presupune că această observație documentează asocierea TP cu preluarea și procesarea VEGF urinar, fapt susținut de corelația strânsă dintre biomarkerii disfuncției TP și VEGF urinar, chiar și la pacienții normalbuminurici.

Cel mai probabil, așa cum a fost cazul și cu nefrina urinară, TP interferează cu expresia markerilor de leziune podocitară în ND incipientă.

Corelația VEGF-ului urinar cu peptidele AGE urinare corespunde cu observația că peptidele AGE induc expresia crescută a VEGF de către podocite in vivo și in vitro.

La pacienții din cadrul acestui studiu, au fost prezente nivele ridicate de VEGF urinar, atât la cei normo-, cât și la cei microalbuminurici, fapt ce conduce la ipoteza conform căreia o expresie crescută a VEGF de către podocite, indusă de AGE, poate apărea în stadiile incipiente ale DN.

Studiile performate pe biopsiile renale provenite de la șoareci diabetici și de la pacienți cu DZ tip 2 [49] arată că nivelele crescute de albumină glicată se asociază cu expresia renală anormală de nefrină și VEGF, chiar și în stadiile incipiente ale ND.

La pacienții cu DZ tip 2, cistatina C este asociată cu biomarkerii disfuncției TP și de leziune podocitară

În studiul prezent, UACR, alpha1-microglobulina urinară, KIM-1, nefrina urinară, VEGF urinar și peptidele AGE plasmatice și urinare au fost corelate direct cu cistatina C serică și invers proporțional cu eRFG.

Alte studii au demonstrat asocierea independentă de albuminurie dintre biomarkerii de leziune a TP, RFGe și cistatina C. Datele rezultate din prezentul studiu au documentat, de asemenea, o corelație a nefrinei urinare și VEGF-ului urinar cu cistatina C și RFGe, chiar și la pacienții normalbuminurici, aceasta sugerând că biomarkerii de leziune podocitară pot fi asociați cu declinul funcției renale independent de albuminurie, dar cel mai probabil în legătură cu disfuncția TP.

A fost demonstrat faptul că o RFGe scăzută se poate corela cu gradul albuminuriei între valorile normale ale acesteia. Similar cu rezultatele din acest studiu, modificări ușoare ale funcției renale la pacienții cu DZ tip 2, evaluate prin intermediul cistatinei C, pot apărea concomitent cu gradul albuminuriei, chiar și în cazul nivelelor normal-înalte ale acesteia. În studiul de față au fost identificate nivele scăzute ale RFGe și în cazul pacienților normoalbuminurici, fapt ce poate fi atribuit disfuncției TP.

Aceste date sunt echivalente cu studii care arată un declin constant al funcției renale la pacienții normalbuminurici cu DZ tip 2 [44].

CONCLUZII ȘI CONTRIBUȚII PROPRII

Așadar, rezultatele studiului nostru, efectuat pe pacienții cu DZ tip 2, au evidențiat următoarele: disfuncția TP precede debutul albuminuriei, fapt argumentat de nivelele crescute ale biomarkerilor de leziune a TP la pacienții cu DZ tip 2 aflați încă în stadiul de normoalbuminurie, peptidele glicate se asociază cu disfuncția TP la pacienții cu DZ tip 2, funcționalitatea TP întârzie expresia modificărilor glomerulare induse de peptidele glicate, iar cistatina C ar putea reprezenta un marker precoce de alterare a funcției renale, înainte de debutul albuminuriei, deoarece valorile crescute ale cistatinei C la pacienții cu DZ de tip 2 pledează pentru un anumit grad de insuficiență renală, chiar și atunci când albuminuria și RFGe sunt încă în limite normale.

Acest studiu are însă, unele limite. În primul rând, numărul mic de subiecți implicați în studiu afectează puterea statistică a studiului.

În al doilea rând, este un studiu cross-sectional care are nevoie de validare printr-un studiu longitudinal pentru a demonstra cauzalitatea dintre nefrina urinară, excreția VEGF urinar și difuncția TP la pacienții cu DZ tip 2.

În al treilea rând, în ciuda corelațiilor semnificative dintre biomarkerii studiați în cadrul analizei multivariate, interpretarea datelor ar putea fi interferată de către factori reziduali de confuzie, cum ar fi gradul de leziune tubulointerstitială. Diferențele între grupuri în ceea ce privește proteina C reactivă înalt sensibilă pot avea ca și cauză multiplele comorbidități de natură inflamatorie, înregistrate la pacienții cu DZ tip 2 și microalbuminurie.

Punctul forte al studiului prezentat se bazează pe documentarea unei asocieri între biomarkerii de disfuncție a TP și biomarkerii de leziune podocitară la pacienții cu DZ tip 2, relație care a fost independentă de nivelul albuminuriei și de nivelul funcției renale.

În concluzie, la pacienții cu DZ tip 2, există o asociere între disfuncția TP și markerii de leziune a podocitelor, chiar și în stadiul de normalbuminurie. Această observație ridică posibilitatea unui presupus rol al TP în reglarea excreției nefrinei urinare și a VEGF urinar în ND incipientă. Mai mult, conduce la ipoteza conform căreia leziunea podocitară și disfuncția TP pot precede debutul microalbuminuriei.

Peptidele AGE pot avea impact atât asupra TP, cât și a glomerulului în stadiile incipiente ale ND, aceasta explicând nivelele crescute de nefrină urinară și VEGF urinar la pacienții normalbuminurici cu DZ tip 2.

Este posibil ca la începutul ND, biomarkerii disfuncției TP să fie succesiv crescuți înainte de creșterea biomarkerilor de leziune podocitară în stadiul normalbuminuric.

Este probabil ca TP să interfereze cu expresia leziunii glomerulare din ND incipientă prin coordonarea absorbției și procesării albuminei, nefrinei și VEGF urinar. Aceste date indică faptul că biomarkerii de leziune podocitară și de disfuncție a TP ar putea fi validați ca și o metodă practică de diagnosticare a ND incipiente, prin intermediul unor viitoare studii prospective pe loturi mai mari de subiecți.

Contribuțiile autorului: a contribuit la conceperea și punerea în aplicare a experimentelor, la analiza datelor și rezultatelor, a scris și a revizuit lucrarea, ținând cont de importanța conținutului intelctual.

BIBLIOGRAFIE:

Obineche EN, Adem A. Update in Diabetic Nephropathy. Interantional Journal of Diabetes & Metabolism (2005) 13: 1-9.

Gross JL, De Azevedo MJ, Silveiro SP et al.Diabetic Nephropathy: Diagnosis, Prevention, and Treatment. Diabetes Care, 28:176 –188, 2005

Arun C, Stiddart J, Mackin P et al. Significance of microalbuminuria in longduration type 1 diabetes. Diabetes Care 2003; 26:2144-49

Medicină internă – vol. II, Bolile cardiovasculare și metabolice, Gherasim L, Editura Medicală București, 1996, Diabetul zaharat, 1175-1177, 1215, 1242-1243

http://ro.wikipedia.org/wiki/Diabet_zaharat

Manual de nefrologie clinica, Gluhovschi Gh,Editura Mirton, Timișoara 2008, 27-28, 219, 220-221

Obineche EN, Adem A. Update in Diabetic Nephropathy. Interantional Journal of Diabetes & Metabolism (2005) 13: 1-9

Caramori ML, Fioretto P, Mauer M.The need for early predictors of diabetic nephropathy risk: is albumin excretion rate sufficient? Diabetes49:1399 –1408, 2000

Mogensen CE, Christensen CK.Predicting diabetic nephropathy in insulindependentpatients. N Engl J Med 311:89 –93, 1984

Aksun SA, Ozmen D, Ozmen B et al.Beta2-microglobulin and cystatin C in type 2 diabetes: assessment of diabetic nephropathy. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2004; 112:195-200

Amsellem S, Gburek J, Hamard G et al.Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. J Am Soc Nephrol 2010; 21:1859-1867

Baelde HJ, Eikmans M, Lappin DW et al.Reduction of VEGF-A and CTGF expression in diabetic nephropathy is associated with podocyte loss. Kidney Int 2007; 71:637-645

Aksun SA, Ozmen D, Ozmen B et al.Beta2-microglobulin and cystatin C in type 2 diabetes: assessment of diabetic nephropathy. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2004; 112:195-200

Fioretto P, Mauer M. Histopathology of diabetic nephropathy. Semin Nephrol 2007; 27:195-207

Foster RR, Hole R, Anderson K et al. Functional evidence that vascular endothelial growth factor may act as an autocrine factor on human podocytes. Am J Physiol Renal Physiol 2003; 284:F1263-F1273

Jerums G, Panagiotopoulos S, Premaratne E et al.Integrating albuminuria and GFR in the assessment of diabetic nephropathy. Nat Rev Nephrol 2009; 5:397-406

Jerums G, Premaratne E, Panagiotopoulos S et al.The clinical significance of hyperfiltration in diabetes. Diabetologia 2010; 53:2093-2104

Koltun M, Comper WD. Retention of albumin in the circulation is governed by saturable renal cell-mediated process. Microcirculation 2004; 11:351-360

Korpinen E, Teppo AM, Hukkanen L et al.Urinary transforming growth factor-β1 and α1-microglobulin in children and adolescents with type 1 diabetes. Diabetes Care 2000; 23:664-660

Jarad G, Miner JH. Albuminuria, wherefore art thou? J Am Soc Nephrol 2009; 20:455-457

Kralik PM, Long Y, Song Y et al.Diabetic albuminuria is due to a small fraction of nephrons distinguished by albumin-stained tubules and glomerular adhesions. Am J Pathol 2009; 175:500-509

Merchant ML, Klein JB. Urinary Proteomics and Candidate Biomarker Discovery for Diabetic Nephropathy, in Edelstein CL. Biomarkers in Kidney Disease,Academic Press, Elsevier (Amsterdam-Boston-Heidelberg-London-New York-Oxford-Paris-San Diego-San Francisco-Singapore-Sydney-Tokyo), 2011

Meyer TW, Bennett PH, Nelson RG. Podocyte number predicts long-term urinary albumin excretion in Pima Indians with Type II diabetes and microalbuminuria. Diabetologia 1999; 42:1341-1344

Ng DPK, Tai BC, Tan E et al. Nephrinuria associates with multiple renal traits in type 2 diabetes. Nephrol Dial Transplant 2011; 26:2508-2514

Kern EF, Erhard P, Sun W et al. Early urinary markers of diabetic kidney disease: a nested case-control study from the Diabetes Control and Complications Trial (DCCT). Am J Kidney Dis 2010; 55:824-834

Nielsen SE, Sugaya, Hovind P et al. Urinary livertype fatty acid-binding protein predicts progression to nephropathy in type 1 diabetic patients. Diabetes Care 2010; 33:1320-1324

Petrica L, Petrica M, Vlad A et al. Nephro- and neuroprotective effects of rosiglitazone versus glimepiride in normoalbuminuric patients with type 2 diabetes mellitus: a randomized controlled trial. Wien Klin Wochenschr 2009; 121:765-775

Petrica L, Vlad A, Petrica M et al. Pioglitazone delays proximal tubule dysfunction and improves cerebral vessels endothelial dysfunction in normoalbuminuric patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract 2011; 94(1):22-32

Pfleiderer S, Zimmerhackl LB, Kinne R et al. Renal proximal and distal tubular function is attenuated in diabetes mellitus type 1 as determined by the renal excretion of alpha 1-microglobulin and Tamm-Horsfall protein. Clin Investig 1993; 71:972-977

Russo LM, Del Re E, Brown D et al. Evidence for a role of transforming growth factor (TGF)-beta1 in the induction of postglomerular albuminuria in diabetic ephropathy: amelioration by soluble TGF-beta type II receptor. Diabetes 2007; 56:380-388

Russo LM, Sandoval RM, Campos SB et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nepropathy. J Am Soc Nephrol 2009; 20:489-494

Russo LM, Sandoval RM, McKee M et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: Retrieval is dissrupted in nephrotic states. Kidney Int 2007; 71:504-513

Satchell SC, Tooke JE. What is the mechanism of microalbuminuria in diabetes: a role for the glomerular endothelium? Diabetologia 2008; 51:714-725

Stehouwer CD, Gall MA, Twisk JW et al. Increased urinary albumin excretion, endothelial dysfunction, and chronic lowgrade inflammation in type 2 diabetes: progressive, interrelated, independently associated with risk of death. Diabetes 2002; 51:1157-1165

Tang SC, Leung JC, Lai KN. Diabetic tubulopathy: an emerging entity. Contrib Nephrol 2011; 170:124-134

Thongboonkerd V. Searching for Novel Biomakers and New Therapeutic Targets of Diabetic Nephropathy Using Proteomics Approaches, in Thongboonkerd V. Proteomics in Nephrology – Towards Clinical Applications, Karger (Basel-Freiburg-Paris-London-New York-Bangalore-Bangkok-Shanghai-Singapore-Tokyo-Sydney), 2008

Tojo A, Onozato ML, Ha H et al. Reduced albumin reabsorption in the proximal tubule of early-stAGE diabetic rats. Histochem Cell Biol 2001; 116:269-276

Vaidya VS, Ford GM, Waikar SS et al. A rapid urine test for early detection of kidney injury. Kidney Int 2009; 76:108-114

Van den Born J, Pisa B, Bakker MA et al. No change in glomerular heparan sulfate structure in early human and experimental diabetic nephropathy. J Biol Chem 2006; 281:29606-29613

Ozdemir AM, Hopfer U, Erhard P et al. (2005)Processing advanced glycation end product-modified albumin by the renal proximal tubule and the early pathogenesis of diabetic nephropathy. Ann N Y Acad Sci 1043:625–636

Schernthaner G. Kidney disease in diabetology: lessons from 2010. Nephrol Dial Transplant. 2011; 26:454-457

US Renal Data System (2008) USRDS 2008 Annual Data Report. Available: http://www.usrds.org. Accessed 11 February 2014.

Comper WD, Haraldsson B, Deen WM. Resolved: normal glomeruli filter nephrotic levels of albumin. J Am Soc Nephrol. 2008; 19:427-432

MacIsaac RJ, Tsalamandris C, Panagiotopoulos Set al.(2004) Nonalbuminuric renal insufficiency in type 2 diabetes. Diabetes Care 27:195–200

Jefferson JA, Shankland SJ, Pichler RH (2008) Proteinuria in diabetic kidneydisease: a mechanistic viewpoint. Kidney Int 74: 22–36.

Nakagawa T, Tanabe K, Croker BP et al. (2011)Endothelial dysfunction as a potential contributor in diabetic nephropathy. NatRev Nephrol 7: 36–44.

Vaidya VS, Niewczas MA, Ficociello LH et al. (2011)Regression of microalbuminuria in type 1 diabetes is associated with lower levels of urinary tubular injury biomarkers, kidney injury molecule-1, and N-acetyl-b-D-glucosaminidase. Kidney Int 79: 464–470.

Pätäri A, Forsblom C, Havana Met al. (2003)Nephrinuria in diabetic nephropathy of type 1 diabetes. Diabetes 52: 2969–2974.

Doublier S, Salvidio G, Lupia Eet al. (2003)Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy. Evidence for adistinct role for glycated albumin and angiotensin II. Diabetes 52: 1023–1030.

Jim B, Ghanta M, Qipo Aet al. (2012) Dysregulatednephrin in diabetic nephropathy of type 2 diabetes: a cross sectional study. PLoSOne 7(5): e36041.