Metaloproteinaze Matriceale

Cuprins

Introducere

CAPITOLUL I

1.1.Principiile invaziei tumorale și ale procesului metastazic

1.2.Etapele ce intervin în procesul metastazării

1.2.1. Proliferarea tumorală necontrolată și detașarea celulelor din

tumora primară

1.2.2. Invazia matricei extracelulare

1.2.2.a. Adeziunea celulară

Molecule de adeziune celulară și receptorii lor

Caderine

Integrine

Imunoglobuline

67-KDa receptori ai laminei

CD 44 și variante izoforme

Galectine

1.2.2.b. Distrugerea proteolitică a membranei bazale

Caracterizarea proteazelor implicate în degradarea ECM

Serin proteaze

Cistein proteaze

Endoglicozidaze

Metaloproteinaze matriceale

1.2.2.c. Migrarea celulelor maligne prin membrana bazală

în stromă

1.2.3. Angiogeneza

1.2.3.a. Factori pro-angiogenici

1.2.3.b. Factori anti-angiogenici

1.2.4. Pătrunderea celulelor tumorale în vasele de sange și limfatice (intravazare

1.2.5. Circulația celulelor tumorale în sange și vase limfatice și

oprirea lor în organe aflate la distanță

1.2.5.a. Metastaze limfatice

1.2.5.b. Metastaze hematogene

1.2.6. Extravazarea celulelor tumorale și formarea tumorilor secundare

CAPITOLUL II

2.1. Metaloproteinaze matriceale- generalități

2.2. Clasificarea metaloproteinazelor matriceale

2.3. Structura de domeniu a metaloproteinazelor matriceale

2.4. Reglarea activității metaloproteinazelor matriceale

2.4.1.Reglarea la nivel transcripțional

2.4.2. Activarea metaloproteinazelor matriceale

2.4.3. Inhibiția metaloproteinazelor matriceale

2.4.3.a. Inhibitorii tisulari ai metaloproteinazelor matriceale

2.4.3.b. Alți inhibitori ai metaloproteinazelor matriceale

2.4.3.c. Inhibitori sintetici ai metaloproteinazelor matriceale (MMPI

2.4.3.c1. MMPI utilizati in studii clinice

2.4.3.c2. Utilizari ale MMPIs în combinație cu chimioterapia

CAPITOLUL III

3.1. Rolul metaloproteinazelor matriceale în invazia tumorală și metastaze

3.2. Implicarea metaloproteinazelor matriceale în inițierea tumorii

3.3. Implicarea metaloproteinazelor matriceale în stadii specifice ale metastazelor tumorale

3.4. Rolul metaloproteinazelor matriceale în angiogeneza tumorală

3.5. Localizarea metaloproteinazelor matriceale la suprafața celulară

mecanism de control al dezvoltarii tumorale

3.6. Sumar ELIMINI

CAPITOLUL IV –Mutat la inhibitia MMP

4.2. Inhibitori sintetici MMPIs

4.2.1. Date preclinice în dezvoltarea MMPIs

4.2.2. Date clinice în dezvoltarea MMPIs

Concluzii

INTRODUCERE

Cancerul reprezintă o succesiune cronologică de evenimente celulare ce conduc la nașterea tumorii maligne. Cascada de evenimente ce transformă o celulă normală, de obicei o celulă clonogenă (celulă stem), într-un cancer este descrisă prin termenul de carcinogeneză. Acest proces multistadial, determinat de apariția de leziuni genetice și epigenetice, conduce la modificări ireversibile ale celulelor gazdei, cu dobândirea în final a unui fenotip malign. Sumarea temporală a acestor procese este numită istorie naturală a cancerelor sau progresie biologică a cancerului.

Pe parcursul timpului au fost formulate mai multe definiții ale cancerului. Una dintre cele mai populare a fost aceea a lui Willis (1951) ce definea neoplazia ca „o masă anormală de țesut a cărei creștere se produce în exces față de normal, este necontrolată și în neconcordanță cu cea a țesuturilor normale și care continuă în același mod progresiv după încetarea stimulului care a determinat-o”. (Cowdry, 1955)

Pentru medic cuvântul cancer înseamnă evoluția unei tumori care distruge local și la distanță organele sănătoase ale individului atins de această boală. Pentru histolog sau anatomopatolog, cancerul reprezintă țesut de neoformație care infiltrează structurile sănătoase din care s-a dezvoltat. Pentru biolog înseamnă o modificare a sistemelor de reglare a creșterii și diferentierii celulelor normale care devine periculoasă pentru restul celulelor. (www.romaniancancerleague.org/ro/aboutcancer.php)

Cancerul este o boală genetică. Progresia de la un țesut normal spre un cancer invaziv are loc în decurs de 5-20 de ani și este influențată de factori genetici ereditari precum și de modificări genetice somatice. Astfel, unele modificări oncogenice contribuie la instalarea creșterii necontrolate și pierderea senescenței. Altele determină creșterea necontrolată prin activarea semnalelor stimulatorii de creștere și a cailor de transducție. Creșterea necontrolată poate fi determinată prin dereglarea nivelelor factorilor de transcripție ADN sau prin alterarea punctelor de control din cadrul ciclului celular. Alte modificări genetice (în afara celor ce determină creșterea necontrolată) sunt necesare pentru instaurarea fenotipului invaziv și metastazant. Procesele de invazie și metastazare includ cascade multistadiale ce implică căi de reglare pozitive și negative. Invazia tumorala și angiogeneza sunt procese fiziologice necontrolate. Instabilitatea genică predispune la diseminarea malignă, ea având loc atât la nivel macrosomal (cariotipul cromosomial) cât și la nivel microsomal (secvența ADN, copiere, fidelitatea reparării).

Tumorile maligne posedă mai multe caracteristici care le diferențiază de cele benigne (tabel 1). Majoritatea cancerelor umane derivă din epitelii. Celulele tumorale se pot dezvolta din orice țesut al corpului care conține celule capabile de diviziune, acestea dezvoltându-se fie mai repede, fie mai lent dar cu o rată de creștere ce o depășește pe aceea a țesuturilor înconjurătoare.

Celulele maligne invadează și distrug țesuturile normale din jur. Ele cresc prin expansiune și sunt în mod obișnuit încapsulate, fără infiltrarea țesuturilor vecine, pe care însă le pot comprima, prin efectul de masă, cu consecințe negative asupra funcției acestora. Metastazarea se realizează prin vasele de sânge, limfatice sau pe calea seroaselor în marile cavități în cazul tumorilor canceroase, în vreme ce tumorile benigne rămân localizate și nu metastazează.

Tabel 1: Diferențe între tumorile benigne și cele maligne

Din punct de vedere clinic, cancerele prezintă o fază preclinică (perioadă de latență) și o fază clinică (simptomatică). Perioada de latență are o durată variabilă: de la foarte scurtă, de câteva luni după inițiere (de exemplu în limfomul Burkitt), la câțiva ani (cancere de plămân, colon, vezică urinară). S-a apreciat că perioadă preclinică medie pentru cele mai multe cancere este de 15-20 de ani putând atinge chiar 40-50 ani. În timpul perioadei preclinice nu este posibilă evidențierea unor anomalii moleculare sau celulare, pacientul nu prezintă semne de boală. Fază preclinică durează circa 75% din durata totală a istoriei naturale a dezvoltării unui cancer. Natura asimptomatică a fazei preclinice permite dezvoltarea unei tumori până la dimensiuni de 1cm3, ce conține circa 1 bilion de celule canceroase, înainte de apariția simptomelor, ce permit diagnosticul. Sunt necesare circa 30 de dublări ale volumului tumoral, din momentul nașterii primei celule inițiate, pentru a produce o tumoră detectabilă clinic. Se apreciază că decesul pacientului se corelează cu acumularea unui număr de 1012 celule maligne. În timpul fazei preclinice cancerele pot dezvolta micrometastaze în orice organ sau țesut al gazdei. Perioada clinică începe odată cu momentul diagnosticarii deoarece la acest nivel apar simptomele clinice și este necesară începerea tratamentului. Perioada clinică reprezintă 25% din istoria naturală a unei neoplazii. Dacă cancerul nu este sau nu poate fi tratat curativ în timpul acestei faze, pacientul va deceda prin evoluția neoplasmului.

În ultimii ani, cancerul a luat o amploare fără precedent, promițând un progres continuu în domeniul medicinei și o dezvoltare a societății umane, căci orice descoperire este pusă în slujba umanității.

CAPITOLUL I

1.1.Principiile invaziei tumorale și ale procesului metastazic

Invazia tumorală și metastazarea reprezintă fenomenele biologice definitorii ale cancerului, fiind cauzele majore ale eșecului tratamentului și a deceselor în cazul pacienților cu cancer. Aproximativ 30% din pacienții cu tumori recente manifestă metastaze în momentul diagnosticării. Dintre cei 70% rămași, care sunt din punct de vedere clinic fără metastaze, numai 50% pot fi vindecați cu ajutorul unor tratamente locoregionale (chirurgie și radioterapie); din datele prezentate anterior rezultă că aproximativ 60% din bolnavi prezintă micrometastaze în momentul tratamentului tumorii primare. (Castells et al, 2002)

Metastazarea este procesul de răspândire (diseminare) a celulelor maligne din tumora primară în alte compartimente (organe, țesuturi, umori) ale organismului sau transferul bolii maligne de la un organ (sau de la o parte a acestuia) la un alt organ sau țesut cu care acesta nu este în contact anatomic.

Dezvoltarea metastazelor este privită astăzi ca un proces dinamic și complex ce constă într-o multitudine de etape interconectate rezultate din interacțiunea între gazdă și celulele tumorale.

Din punct de vedere biologic, metastazarea este un proces puțin eficient, fapt demonstrat de observațiile clinice și experimentale. Studiul celulelor tumorale murine cu anticorpi marcați a arătat că mai puțin de 0,1% din totalitatea celulelor maligne intrate în circulație supraviețuiesc și devin capabile să formeze tumori secundare metastatice. De asemenea, studiile efectuate au indicat că, deși metastazele au o origine clonală (provin dintr-o singură celulă), nu toate celulele sunt capabile să parcurgă toate etapele necesare pentru a da naștere tumorilor metastatice. Etapa considerată a fi cea mai importantă pentru eficacitatea metastazarii este supraviețuirea celulelor tumorale în circulația limfatică sau sanguină. Relativ puține celule ajung la organul țintă după ce au supraviețuit sechestrarii inițiale și distrucției circulatorii precum și altor interacțiuni potențial letale puse în acțiune de organismul gazdă.

Înțelegerea bazelor moleculare ale metastazarii reprezintă un moment crucial pentru dezvoltarea și utilizarea clinică a unor noi mijloace terapeutice destinate prevenirii metastazelor și, implicit, vindecării pacienților.

Este important de subliniat că nici unul dintre procesele implicate în metastazare nu este străin de mecanismele normale existente în organism. Celulele maligne utilizează aceleași mecanisme degradative și invazive care sunt utilizate în procese normale precum migrarea celulară și remodelarea tisulară din cursul dezvoltării embrionare, a cicatrizării tisulare sau a invaziei trofoblastului în peretele uterin. Diferența între aceste procese normale și cele maligne este că, în timp ce primele sunt precis reglate de mecanismele genetice de control, cele maligne reprezintă o amplificare a proceselor normale și lipsite de control.

Figura 1- Stadiile formării tumorii primare și ale metastazării (a) apariția unei singure celule

modificate în țesut; (b) celula modificată se divide, deși celulele din jur nu, rezultând o tumoră

localizată; această tumoră este încă benignă; (c) în cursul progresiei spre malignizare tumora

invadează lamina bazală; (d) celulele tumorale invadează vasele de sânge diseminând astfel la

distanță

Trecerea de la creșterea tumorală “în situ”, la faza metastazică este definită prin abilitatea celulelor tumorale din situl primar de a invada țesuturile locale și de a trece de barierele tisulare. Procesul metastazic nu se desfășoară la întâmplare, el reprezintă o cascadă de pași legați secvențial, fiecare dintre aceștia prezentând multiple interacții gazdă-tumoare. Pentru inițierea pr nu este în contact anatomic.

Dezvoltarea metastazelor este privită astăzi ca un proces dinamic și complex ce constă într-o multitudine de etape interconectate rezultate din interacțiunea între gazdă și celulele tumorale.

Din punct de vedere biologic, metastazarea este un proces puțin eficient, fapt demonstrat de observațiile clinice și experimentale. Studiul celulelor tumorale murine cu anticorpi marcați a arătat că mai puțin de 0,1% din totalitatea celulelor maligne intrate în circulație supraviețuiesc și devin capabile să formeze tumori secundare metastatice. De asemenea, studiile efectuate au indicat că, deși metastazele au o origine clonală (provin dintr-o singură celulă), nu toate celulele sunt capabile să parcurgă toate etapele necesare pentru a da naștere tumorilor metastatice. Etapa considerată a fi cea mai importantă pentru eficacitatea metastazarii este supraviețuirea celulelor tumorale în circulația limfatică sau sanguină. Relativ puține celule ajung la organul țintă după ce au supraviețuit sechestrarii inițiale și distrucției circulatorii precum și altor interacțiuni potențial letale puse în acțiune de organismul gazdă.

Înțelegerea bazelor moleculare ale metastazarii reprezintă un moment crucial pentru dezvoltarea și utilizarea clinică a unor noi mijloace terapeutice destinate prevenirii metastazelor și, implicit, vindecării pacienților.

Este important de subliniat că nici unul dintre procesele implicate în metastazare nu este străin de mecanismele normale existente în organism. Celulele maligne utilizează aceleași mecanisme degradative și invazive care sunt utilizate în procese normale precum migrarea celulară și remodelarea tisulară din cursul dezvoltării embrionare, a cicatrizării tisulare sau a invaziei trofoblastului în peretele uterin. Diferența între aceste procese normale și cele maligne este că, în timp ce primele sunt precis reglate de mecanismele genetice de control, cele maligne reprezintă o amplificare a proceselor normale și lipsite de control.

Figura 1- Stadiile formării tumorii primare și ale metastazării (a) apariția unei singure celule

modificate în țesut; (b) celula modificată se divide, deși celulele din jur nu, rezultând o tumoră

localizată; această tumoră este încă benignă; (c) în cursul progresiei spre malignizare tumora

invadează lamina bazală; (d) celulele tumorale invadează vasele de sânge diseminând astfel la

distanță

Trecerea de la creșterea tumorală “în situ”, la faza metastazică este definită prin abilitatea celulelor tumorale din situl primar de a invada țesuturile locale și de a trece de barierele tisulare. Procesul metastazic nu se desfășoară la întâmplare, el reprezintă o cascadă de pași legați secvențial, fiecare dintre aceștia prezentând multiple interacții gazdă-tumoare. Pentru inițierea procesului metastazic, trebuie ca celulele neoplazice să penetreze membrana bazală și să invadeze apoi stroma interstițială prin activarea procesului protolitic. După aceea, este necesară invazia celulelor tumorale în membrana bazală subendoterială. Dezvoltarea fenotipului malign este de asemenea asociată cu angiogeneza indusă tumoral, un proces care nu numai că permite creșterea tumorală ci și liberul aces către comportamentul vascular, favorizând răspăndirea hematogenică. Pentru stabilirea unei colonii metastazice, celulele neoplazice circulante trebuie să supraviețuiască procesului de recunoaștere imunologică și să oprească la distanță procesul vascular. În final, celulele trebuie să invadeze și să prolifereze în organul secundar, urmărind un proces similar cu cel descris pentru situl primar, în care câțiva factori de creștere joacă un rol important. Întreruperea cascadei metastazice la oricare din acești păși poate preveni dezvoltarea unei metastaze evidente clinic. (Castells, et al, 2002)

Distribuția metastazelor poate fi parțial prevăzută prin modelul drenajului limfatic sau venos regional. Totuși, tumorile metastazează către locații distincte, imprevizibile, astfel că celulele neoplazice prezintă specificitate față de un organ. Baza celulară și moleculară a sitului tumoral metastazic specific presupune cel puțin trei mecanisme majore :

Primul numit creștere selectivă, susține că celulele tumorale cresc selectiv doar în organele cu factori de creștere sau cu mediul extracelular matriceal asemănători. În acest sens, datele recente au arătat că micromediul organului poate modula expresia genelor celulelor tumorale, inclusiv reglarea creșterii în situl metastazic al organului specific.

Al II lea mecanism sugerează fixarea selectivă de suprafața endotelială a situsului organului de ghidare. Adeziunea celulară poate facilita motilitatea celulară și astfel, poate intensifica invazia celulelor tumorale în parenchimul organului.

În final, un al III lea mecanism include degradarea matricei și motilitatea celulară.

Abilitatea celulelor tumorale de a degrada componentele extracelulare ale membranei bazale sau țesuturile de legatură, prin eliberarea enzimelor degradative, este corelată pozitiv cu potențialul metastazic. Multe din aceste fragmente produse prin acțiunea enzimelor derivate din tumoră ar putea deveni factori chemotactici pentru celulele tumorale metastazice, favorizând astfel migrarea celulară. (Castells et al, 2002)

Figura 2: Mecanismele moleculare implicate în procesul creșterii tumorale și al metastazării. (http://www.wentek.com/jean/method.jpg)

1.2. Etapele ce intervin în procesul metastazării

Transformarea celulei normale într-o celulă malignă depinde de mutațiile ce au loc în genele ce controlează progresia normală a ciclului celular. Descoperirea în 1970 a oncogenelor și a supraexpresiei acestora a indus concepția că celulele anormale sunt rezultatul unui semnal de proliferare intens. Descoperirea în 1980 a genelor supresoare de tumori a sugerat că anomaliile de creștere survin și prin scăderea intensității semnalelor celulare ce se opun proliferării.

1.2.1. Proliferarea tumorală necontrolată și detașarea celulelor din tumora primară

Proliferarea tumorală necontrolată este rezultatul proceselor de carcinogeneză care se desfășoară în cursul etapelor premalignă (inițierea și promoția) și malignă (progresia tumorală). În cursul promoției, celulele inițiate expansionează clonal în detrimentul celulelor normale. Oncogenele structurale (dominante) și genele supresoare mutante determină acțiuni biologice ce dereglează ciclul celular și mecanismele sale de control. În mod normal, celulele sunt promovate în ciclul celular de către complexe kinazice. Punctele de control ale ciclului celular sunt numeroase. Aceste puncte sunt perturbate funcțional, astfel încât celulele având defecte genetice (activări anormale ale protooncogenelor) scapă controlului și se pot replica.

Celulele canceroase pot dobândi astfel trăsături fenotipice anormale precum: pierderea diferențierii, creșterea motilității, invazivitatea sau scăderea sensibilității la citostatice. Transformarea unei celule normale într-o celulă malignă „instabilă genetic” și deci capabilă să „achiziționeze” proprietățile fenotipului invaziv și metastazant, pare să fie rezultatul mutațiilor survenite în genele care controlează progresia celulelor de-a lungul ciclului celular.

1.2.2. Invazia matricei extracelulare

Invazia matricei extracelulare este reprezentată de pătrunderea celulelor maligne prin membrana bazală și invazia structurilor adiacente. Organismul mamiferelor este alcătuit dintr-o serie de compartimente tisulare separate unele de altele prin matricea extracelulară. Matricea extracelulară este formată din membrana bazală (MB) și stroma interstițială. MB este o barieră biologică foarte eficace, fiind alcătuită din:

Porțiunea colagenică (ce conține colagen de tip IV, rar de tip V);

Porțiunea necolagenică formată din fibronectină, laminină și proteoglicani (lanțuri

de glicozaminoglicani legați la un nucleu protidic; în MB principalul glicozaminoglican

întâlnit este heparanul).

O particularitate a celulelor maligne este că prezintă un echipament enzimatic complet, atât împotriva componentei colagenice (colagenaze), cât și împotriva celei necolagenice.

1.2.2.a. Adeziunea celulară

Atașarea celulei maligne la structurile MB se face în mod normal prin intermediul unor structuri specializate numite „molecule de adeziune” (adhesion molecules). Dintre moleculele de adeziune exprimate la suprafața unei celule normale, care se regăsesc și pe suprafața celulelor maligne, cele mai cunoscute sunt:

Receptorul lamininei (67 kDa)

Lamina este o glicoproteină de greutate moleculară mare, și o componentă majoră a membranei bazale. Participă la numeroase activități biologice, inclusiv adeziunea celulară, diferențierea, proliferarea și migrarea. S-a observat că interacțiile între celulele canceroase și lamină joacă un rol critic în timpul invaziei tumorale și metastazei.

Receptorii pentru laminină sunt proteine cu rol în adeziunea celulară. Mai multe proteine diferite de suprafata celulară care se leagă de lamină au fost recent descrise. Printre acestea, proteina 67KDa ,de mare afinitate, a fost asociată cu fenotipul metastazic al celulelor canceroase. S-a demonstrat că celulele canceroase înalt metastazice exprimă pe suprafața lor un număr semnificativ mai mare de receptori ai laminei de 67KDa, decât omologii lor benigni. Similar, expresia acestui receptor este semnificativ mai mare în cele mai multe tumori solide decât în țesutul normal corespunzător. În cancerul gastric și cel de colon, a existat o corelare pozitivă între expresia receptorului 67KDa din tumoarea primară și potențialul metastazic al leziunii. Aceste rezultate sugerează că receptorul 67KDa este un produs genetic și expresia crescută a acestuia participă la formarea fenotipului metastazic. (Castells et al, 2002)

Integrine

Integrinele sunt o a doua clasă de receptori de adeziune la matricea extracelulară. Rolul integrinelor este alinierea proteinelor de adeziune de la suprafața celulei precum fibronectina cu componentele citoscheletului cum sunt talina sau actina, ducând la modificarea formei celulei. (Castells et al, 2002)

Caderine

Caderinele sunt glicoproteine transmembranare care mediază adeziunea celulară calciu dependentă. Până acum au fost identificate peste 20 de clase de caderine. 3 dintre acestea: E-(epiteliale), N-(neurale) si P-caderinele(placentare) prezintă o structură de bază comună dar și o distribuție tisulară unică. E-caderinele sunt cele mai studiate cu privire la rolul lor în invazia cancerului, fiind implicate în inhibarea potențialului de invazivitate locală. (Castells et al, 2002)

Superfamilia imunoglobulinelor

Superfamilia imuglobulinelor cuprinde o varietate de molecule care prezintă arhitectura de bază a imunoglobulinelor. Câțiva membri ai acestei familii au fost implicați în metastazele tumorale. Cel mai important membru exprimat în celulele tumorale gastrointestinale pare să fie ICAM-1 molecula de adeziune intercelulară. ICAM-1 este o glicoproteină consecutiv exprimată de către celulele endoteliale și de către câteva leucocite.

CEA(antigenul carcinoembrionic), un marker clinic folositor pentru recidiva bolii în cancerul colorectal, aparține de asemenea de familia imuglobulinelor. S-a arătat că CEA ar putea functiona ca moleculă de adeziune intercelulară pe suprafața celulelor din carcinomul de colon. Totuși, nu este incă cunoscut dacă dereglari ale acestei molecule conduc la detașarea celulelor tumorale din tumoarea primară și la răspândirea lor către țesuturi aflate la distanță. (Castells et al, 2002)

CD44 și variante izoforme

În cancerele umane, variante CD44 sunt frecvent exprimate în stadii avansate ale genezei tumorale. Nivele CD44 serice au fost văzute ca indicatori ai încărcăturii tumorale și a răspândirii metastazice, observându-se un nivel mai mare de CD44 la pacienții cu carcinoame gastrice sau colorectale fața de pacienții normali. (Castells et al, 2002)

Galectine

Galectinele reprezintă o familie de molecule cu capacitate de legare a β-galactosidelor, cu implicații importante în invazia tumorală și in metastaze.

Fenomenul de atașare a celulelor prin intermediul moleculelor de adeziune se manifestă și în timpul circulației celulelor tumorale în vasele de sânge și al extravazării acestora. (Castells et al, 2002)

1.2.2.b. Distrugerea proteolitică a membranei bazale

În timpul metastazării există o serie de bariere structurale prin care celulele tumorale trebuie să treacă. Proteoliza barierelor tisulare nu este o proprietate unică a celulelor tumorale, fiind utilizată și în procese normale precum implantarea trofoblastului, morfogeneza embrionară, remodelarea tisulară sau angiogeneza, dar este limitată ca durată și ca intensitate și este controlată la mai multe nivele.

După atașarea celulelor tumorale la membrana bazala (MB), acestea secretă enzime hidrolitice (sau determină celulele locale să secrete aceste enzime) ce vor degrada matricea extracelulară (inclusiv glicoproteinele de adeziune). Liza MB are loc într-o porțiune localizată foarte aproape de zona de adeziune celulară, unde cantitatea de enzime proteolitice o depășește pe aceea a inhibitorilor proteazici prezenți în matrice și ser. Enzimele proteazice sunt direcționate spre cele două componente ale MB: porțiunea colagenică și porțiunea necolagenică. Sistemele enzimatice implicate în proteoliză se pot împărți în:

Serin proteaze

Serin proteazele participă la invazia locală prin acțiunea asupra componentei necolagenice a membranei bazale. Tumorile maligne determină activarea factorilor plasmatici printre care și activatorii plasminogenului. Acesta din urmă se prezintă sub doua forme: activatorul plasminogen de tip urokinază (descoperiți în urina umană) și activatori tisulari (extrași din țesuturile umane). S-a demonstrat o activitate crescută a serin proteazelor în fibrosarcoame, melanoame, cancerele pulmonare și mamare. (Castells et al, 2002)

Cistein proteazele

Cistein-proteazele sunt reprezentate de catepsinele B, L și D care sunt enzime lizozomale, implicate în multe funcții fiziologice datorită activității lor proteolitice. Catepsina D a fost intens studiată pentru rolul ei potențial în invazia tumorală și metastază. Supraexpresia de catepsina D a fost aratată în multe neoplasme umane inclusiv în carcinoame gastrice și de colon. În ciuda acestei aparente asocieri, rolul ei adevărat în invazia cancerului este încă nesigur.

Catepsina B este o endopeptidază cu un spectru larg care ar putea să degradeze eficient matricea extracelulara(ECM). Catepsina B poate asista de asemenea la degradarea ECM prin activarea altor serin-proteaze. S-a demonstrat de asemenea că există o asociere între expresia catepsinei B și proliferarea celulelor endoteliale, în anumite tumori. De aceea, catepsina B pare a fi implicată în descompunerea membranei bazale și în promovarea angiogenezei tumorale. De fapt, expresia catepsinei B s-a găsit a fi corelată nu numai cu gradul tumorii și metastazele din nodulii limfatici, cât și cu supravietuirea generală și cu recidiva bolii în anumite tumori. De exemplu, carcinoamele gastrice cu răspândire metastazică au aratat nivele mai mari de catepsină B față de carcinoamele fără metastaze. În tumorile pancreatice însă, supraexpresia catepsinei B pare a fi relaționată cu comportamentul invaziv, dar nu cu răspândirea metastazică. (Castells et al, 2002)

Endoglicozidaze

Endoglicozidazele sunt enzime cu acțiune asupra proteoglicanilor din structura matricei extracelulare. Activitatea endoglicozidazelor a fost evidențiată, în mod particular, în celulele de melanom. Într-un interval de două până la opt ore după adeziunea la MB, la punctul de contact cu celula malignă se produce sub acțiunea acestor enzime o degradare localizată.

Metaloproteinaze matriceale

Metaloproteazele (MMP) sunt o familie de proteine capabile să distrugă în anumite condiții matricea extracelulară și MB. Activitatea MMP este înalt reglată la mai multe nivele de către factori biologici activi precum factorii de creștere, hormonii, oncogenele sau promotorii tumorali.

Aceste enzime proteolitice au fost implicate în remodelarea tesuturilor conjunctive, care au loc în multe procese fiziologice precum creșterea și dezvoltarea embrionară, ovulația, menstruația și vindecarea rănilor. Mai mult, producția anormală a acestor proteaze ar putea contribui la un număr de condiții patologice precum: artrite reumatoide, boli cardiovasculare și progresia cancerului.

Secreția și activarea metaloproteinazelor sunt bine controlate în țesuturile normale de către inhibitorii naturali ai proteazelor denumiți TIMP (Tissue Inhibitor of Metalloproteinases). Inhibitorii naturali ai proteazelor, precum inhibitorii tisulari ai metaloproteinazelor (TIMP) sau inhibitorii activatorilor de plasminogen, inhibitorii sintetici precum si alte molecule cu rol inhibitor pot funcționa ca proteine supresoare ce inhibă invazia tumorală și metastazarea. (Castells et al, 2002)

1.2.2.c. Migrarea celulelor maligne prin membrana bazală în stromă

Migrarea celulelor maligne prin membrana bazală în stromă este un proces de mare importanță, nu numai în invazia locală dar și în migrarea la distanță a celulelor maligne. În etapa invaziei locale, celulele tumorale se deplasează prin MB spre stromă, la nivelul zonei de proteoliză.

Migrarea celulelor tumorale se realizează prin intermediul unor factori diferiți ca origine, derivați din tumoră și din țesuturile gazdei:

Fragmente de colagen

Fragmente de complement

Factori de creștere tumorală: FGF, PDGF, TGFβ, IFNα si β, autotaxina, etc

Fragmente sau molecule intacte din matrice precum: fibronectina, laminina si colagenul.

Celulele maligne pot să-și secrete și proprii lor factori de stimulare a locomoției: „autocrine motility factors” (AMF) ce implică activarea fosfolipazelor C și A2. Sinteza de AMF este controlată de produsul oncogenei H–ras. În cursul etapelor invaziei locale (atașare, proteoliză și locomoție) se selectează o populație de celule ce aparțin fenotipului invaziv, adică celule capabile să reacționeze prin adeziune la colagenul de tip IV, fibronectină și laminină și să migreze puternic ca răspuns la gradientul de laminină și fibronectină solubile și insolubile.

Figura 3: Mecanismele formării metastazelor hematogene (trimiterea bibliografica)

1.2.3. Angiogeneza

Proliferarea și supraviețuirea celulelor tumorale este dependentă de un aport corespunzător de oxigen și substanțe nutritive. Procesul de angiogeneză (neovascularizație) este indus de tumoră printr-o varietate de factori care au ca rezultat formarea unor noi vase de sânge în jurul unei tumori.

Angiogeneza este un sistem dinamic care joacă un rol important în variate procese patologice, cat și fiziologice precum: dezvoltarea placentei, vascularizația organelor și vindecarea rănilor.

Studiul angiogenezei și rolul acesteia în biologia tumorală a condus la un vast bagaj teoretic precum și la unele rezultate în tratamentul cancerului prin studii clinice ale unor medicamente cu efect angiogenic. Acest proces este văzut ca fiind un factor cheie în progresia și invazia tumorală. Căile care conduc la instaurarea unui fenotip angiogenic în tumori sunt complexe și puțin descrise, incluzând hipoxia, mutațiile genice și intervenția celulelor stromale și inflamatorii. În multe tumori, inclusiv în cancerul mamar, arii cu o populație crescută de celule tumorale se asociază cu arii cu o densitate vasculară crescută (“puncte fierbinți”).

Mecanismele angiogenezei tumorale sunt asemănătoare cu cele normale, dar sunt necontrolate și activate aleator. Procesul de formare a unor noi vase de sânge cuprinde 3 etape:

Modificări la nivelul matricei extracelulare

Proliferarea celulelor endoteliale

Migrarea celulelor endoteliale

Inducerea acestui proces este determinată de balanța dintre factorii care stimulează neovascularizația și de cei care o inhibă. Analize histologice și ultrastructurale ale vaselor tumorale au arătat diferențe pronunțate între acestea și vasele normale găsite în țesuturile mature. Distincția include diferențe la nivelul compoziției celulare a vaselor tumorale, la nivelul compoziției și integrității membranei bazale și diferențe de permeabilitate. Datorită MB discontinue, vasele tumorale sunt ușor penetrabile de către celulele canceroase care intră în circulație. (Liotta et al,)

1.2.3.a.Factori pro-angiogenici

Proteinele angiogenice pot fi exprimate de către celulele tumorale, de matricea extracelulară și de către celulele gazdă (ex macrofagele). Câteva proteine angiogenice au fost identificate (tabel 1). (Castells et al, 2002)

VEGF este un factor major de reglare a neovascularizației fiziologice cât și a celei patologice. Acesta a fost întâi izolat ca factor vascular de permeabilitate și consecutiv, ca un factor de creștere ce poate induce proliferarea celulelor endoteliale. VEGF stimulează celulele endoteliale să degradeze matricea extracelulară, să migreze și să formeze tuburi în vitro. În vivo, el funcționează ca reglator al permeabilității vasculare care e considerată importantă pentru inițierea angiogenezei. Supraviețuirea celulelor endoteliale în noile vase formate, este dependentă de VEGF. Corespunzător cu rolul lui în supraviețuirea celulelor, VEGF induce expresia proteinelor anti-apoptotice în celulele endoteliale. (Castells et al, 2002)

FGF constitutie o familie mare de factori de creștere relaționați din punct de vedere structural. FGF de bază (bFGF), este membrul cel mai bine caracterizat, o polipeptidă 18-kDa cu o puternică funcție angiogenică. Este implicat în proliferarea celulară, motilitatea si diferențierea celulară, cât și în angiogeneză. Funcționarea FGF presupune și legarea lui de receptori tirozin-kinazici similari cu alți receptori ai factorilor de creștere. (Castells et al 2002)

HGF este secretat de fibroblaste. Efectul paracrin al HGF este mediat de legarea lui la tipuri de receptori tirozin-kinazici codificați de oncogene c-met. O expresie crescută a proteinelor c-met a fost corelată cu progresia tumorii în cancerul colorectal, cele mai înalte nivele fiind corespunzătoare metastazelor ficatului. Expresia proteinelor în carcinoamele gastrice a fost de asemenea corelată cu implicarea nodurilor limfatice și a metastazelor peritoneale. (Castells et al, 2002)

MMPs contribuie de asemenea în procesul angiogenezei. MMPs ajută la degradarea proteinelor implicate în menținerea solidă a peretțlor vaselor de sânge. Aceasta proteoliză permite eliberarea celulelor endoteliale în matricea interstițială. (Castells et al, 2002)

1.2.3.b.Factori anti-angiogenici

Angiogeneza e un proces complex și înalt reglat. Până acum, peste 25 de inhibitori au fost identificați, printre aceștia numărându-se inhibitori metaloproteazici, angiostatina și endostatina. Datorită rolului potențial în tratamentul cancerului, cei mai mulți dintre ei sunt sub investigație în fazele I/II. În anii recenți, s-a demonstrat că terapia sistemică cu angiostatine sau endostatine cauzează supresia aproape completă a angiogenezei indusă tumoral, ceea ce rezultă într-o puternică activitate antitumorală. (Castells et al, 2002)

Tabel1: Factori cu rol angiogenic și antiangiogenic

Tumora malignă primară secretă peptide cu rol atât angiogenetic cât și anti-angiogenetic, ce acționează asupra endoteliului vascular, stimulându-l să producă noi factori angiogenetici. Aceste peptide stimulează celulele endoteliale să prolifereze și să formeze noi vase. Mici depozite de celule tumorale, desprinse din tumora primară invadează matricea extracelulară; aceste celule intră în circulație printre celulele endoteliale și extravazează la distanță. Metastazele tumorale subendoteliale secretă proprii factori angiogenetici promovând producerea de noi peptide angiogenetice și proliferarea celulelor endoteliale, asigurând astfel neovascularizația metastazei.

Figura 4: Procesul angiogenezei și formarea metastazelor

(http://www.nccr-oncology.ch/scripts/index.aspx?idd=110)

1.2.4. Pătrunderea celulelor tumorale în vasele de sânge și limfatice (intravazare)

Odată aflată în stroma interstițială, tumora întâlnește vasele limfatice și sanguine ale gazdei (venule, capilare limfatice) sau vasele de neovascularizație cu pereți usor de invadat datorită grosimii reduse și a pierderii joncțiunilor intercelulare. Celulele tumorale metastazează prin invazia vaselor de sânge și limfatice. Arteriolele și arterele, cu pereții mai grosi și mai bogați în colagen și fibre elastice, sunt mai rar invadate de tumoră.

Mecanismele de invazie ale celulelor tumorale prin pereții vasculari și limfatici nu sunt bine cunoscute, dar se presupune că participă aceleași mecanisme mecanice și enzimatice invocate la invazia tumorală locală. Pe masură ce tumora crește, presiunea exercitată asupra vaselor de sânge, limfatice și asupra țesuturilor sporește și contribuie la „forțarea” spațiilor intercelulare, dar aceste mecanisme nu sunt suficiente pentru a contribui la intravazare.

1.2.5. Circulația celulelor tumorale în sânge și vase limfatice și oprirea lor în organe aflate la distanță

Diseminarea celulelor neoplazice se face pe calea vaselor limfatice și sanguine unde acestea întalnesc un mediu ostil, 80% dintre celulele tumorale fiind distruse la acest nivel. Restul celulelor tumorale circulă agregate între ele (agregare homeotipică) sau atașate de trombocite, eritrocite, limfocite (agregare heterotipică). Aceste noduri tumorale prezintă fibrină cu rol de protecție.

Prezența celulelor tumorale în sânge (citemia) nu semnifică neaparat metastazarea și are mică valoare ca factor prognostic pentru metastazele clinice. Distrugerea celulelor tumorale în timpul citemiei se poate datora caracteristicilor celulelor tumorale: deformabilitatea, agregabilitatea de suprafatță și moleculele de adeziune, cât și datorită unor factori din mediul gazdă precum turbulențele sanguine, celulele NK, macrofagele și trombocitele.

1.2.5.a.Metastaze limfatice

Vasele limfatice sunt ușor de penetrat pentru că au o MB subțire. Diseminarea se produce prin migrarea celulelor maligne sub forma unor noduri metastazice compacte ce invadează limfaticele din aproape în aproape (permeația limfatică).

1.2.5.b.Metastaze hematogene

Acestea se dezvoltă în etape secvențiale:

Penetrarea în vasele de sânge

Eliberarea celulelor tumorale și circulația acestora (citemia)

Multiplicarea și creșterea in stroma vasculară

Expansiunea tumorală

După ce celulele tumorale invadează vasele limfatice și sanguine, acestea formează un nod metastazic prin interacțiunea cu alte celule tumorale și cu celulele sanguine precum și prin stimularea depunerii de fibrină.

1.2.6. Extravazarea celulelor tumorale si formarea tumorilor secundare

Etapa finală a cascadei metastazice este reprezentată de proliferarea tumorală în sediile secundare. În cursul procesului metastazic, interacțiunea dintre celulele metastazice și organismul gazdă este continuă. Semnalele biologice stimulează sau inhibă celulele tumorale în direcția proliferării, ca urmare a echilibrului pozitiv sau negativ între reglatori.

Factorii autocrini și paracrini ce controlează repararea leziunilor tisulare sunt implicați în stimularea proliferării în sediile secundare. Între aceștia au fost identificați: TGFα și factorul de creștere al hepatocitelor (HGF). Acești factori eliberați de țesuturi determină și creșterea celulelor tumorale. Celule tumorale invadează stroma organului gazdă și dezvoltă o rețea vasculară prin fenomenul angiogenezei, iar apoi reintră în circulație, determinând metastaze secundare.

Figura 5: Formarea metastazelor

(http://www.answers.com/topic/metastasis?cat=health)

CAPITOLUL II

2.1. Metaloproteinaze matriceale- generalități

Cercetări importante au fost direcționate către cascada evenimentelor implicate în procesul invaziei tumorale și în cel al metastazelor, pe definirea evenimentelor genetice care stau la baza acestor procese și nu în ultimul rand pe genele efectoare și produsii proteici responsabili de schimbările fenotipice.

Enzimele proteolitice au fost continuu relaționate cu fenotipul metastazic. MMPs, cunoscute și sub numele de matrixine, sunt asociate cu degradarea membranei extracelulare (ECM), inclusiv a membranei bazale, care este o matrice specializată, compusă din colagene de tip IV, lamină, proteoglicani, glicoproteine și alte componente minore. Această membrană servește ca barieră între compartimentele tisulare. În timpul tranziției de la comportamentul benign la cel malign, au loc schimbări la nivelul integrității membranei bazale. Distrugerea acestei integrități, caracteristică a tumorilor invazive, permite răspândirea locală și către alte organe aflate la distanță.

Inițial, s-a crezut că MMPs, prin spargerea barierelor fizice, sunt implicate în invazia tumorală, intrarea și ieșirea celulelor tumorale în și din circulație, cât și în migrarea locală către situri metastazice. Studiile realizate de-a lungul timpului atestă faptul că, MMPs prezintă un rol mai mare, de vreme ce sunt importante în crearea și menținerea unui micromediu care facilitează creșterea și angiogeneza tumorilor către situri primare și metastazice. (fig. 1)

Întelegerea acestor procese și a enzimelor necesare progresiei tumorale, a determinat o extindere a țintelor posibile pentru intervenții terapeutice. În același timp a venit și realizarea că, un control al fenotipului cancerului poate aduce semnificativ mai multe beneficii pacienților, față de încercarea de eradicare a celulele afectate.

Figura 1: Implicarea MMPs în progresia tumorală.(Nelson et al, 2000)

2.2. Clasificarea metaloproteinazelor matriceale

Primul raport referitor la MMPs a fost publicat în 1962 de către Jerome Gross și Charles Lapiere. De atunci peste 20 de enzime întâlnite la oameni cât și la alte specii, clasificate drept MMPs, au fost caracterizate.

MMPs reprezintă o familie relativ mare și în continuă creștere de endopeptidaze dependente de Zn, care mediază clivarea celor mai multe (dacă nu a tuturor) proteinelor ECM. Cu excepția MMPs care conțin secvența RXKR (stromelizina 3 și MT-MMPs), toți membrii acestei familii sunt secretați că proenzime inactive (zimogene) și se presupune că sunt activați în țesut prin clivarea propeptidei. Toți MMPs conțin Zn2+ la situl catalitic și, mai mult, necesită Ca2+ pentru stabilitate și activitate. (Souza et al, 2002)

MMPs sunt clasificați în 6 clase, pe baza specificității substratului lor și pe baza omologiei structurale: colagenaze, gelatinaze, stromelizine, matrilizine, MMPs de tip membranar (MT-MMPs) și alte MMPs(metaloelastaze).

Aceste enzime au un nume descriptiv (ex: colagenaze interstițiale, o enzimă găsită în spațiul interstițial, care degradează colagene fibrilare) și un număr (ex: MMP-1 pentru colagenaza interstițială).

Colagenaze

Din această categorie fac parte MMP-1, MMP-8, MMP-13 și MMP-18. Trăsătura comuna a acestor enzime constă în abilitatea lor de a degrada colagene interstițiale de tip I, II și III la un sit specific, situat la ¾ de domeniul N-terminal. Colagenazele pot de asemenea să digere alte molecule ECM și non-ECM. (Visse et al, 2003)

Gelatinazele

Gelatinaza A (MMP-2) și gelatinaza B (MMP-9) aparțin acestui grup. Ele digeră rapid colagene denaturate, gelatine inclusiv colagenul de tip IV. Aceste enzime prezintă 3 repetiții ale domeniului fibronectină de tip II înserate în domeniul catalitic, care se leagă de gelatine, colagene și lamine. MMP-2, dar nu și MMP-9 digeră colagene de tip I, II și II. Deși soarecii care prezintă MMP-2 se dezvoltă fără nicio anormalitate vizibilă, mutațiile MMP-2 la oameni cu MMP-2 (care duc la absența enzimelor active), sunt corelate cu forma recesivă autozomală a osteolizei multicentrice (o boală genetică rară care cauzează distrugerea și resorbția oaselor afectate). Acest fapt sugerează că la oameni, MMP-2 este importantă pentru osteogeneză. (Visse et al, 2003)

Stromelizine

Stromelizina 1 (MMP-3) și stromelizina 2 (MMP-10) prezintă specificitate similară de substrat, însă MMP-3 are, în general, o activitate proteolitică mai mare decât MMP-10. În afară de degradarea componentelor ECM, MMP-3 activează un numar de pro-MMPs și acțiunea sa asupra pro-MMP-1 parțial procesată este critică pentru generarea de MMP-1 complet active. MMP-11 este numită stromelizina 3 dar este de obicei grupată cu “alte MMPs” pe baza faptului că secvența și specificitatea substratului se deosebesc de cele ale MMP-3. (Visse et al, 2003)

Matrilizine

Matrilizinele sunt caracterizate prin lipsa domeniului hemopexină. Matrilizina 1 (MMP-7) și matrilizina 2 (MMP-26), numite și endometaze, sunt membri ai acestei clase. MMP-7 procesează, în afară de componentele ECM, molecule de suprafață celulară precum: pro-α-defensina, ligandul Fas, (TNF)-α (pro-tumor necrosis factor) și E-caderine. Matrilizina 2 digeră câteva componente ECM. (Visse et al, 2003)

Metaloproteinaze matriceale de tip membranar

Există 6 MMPs de tip membranar (MT-MMPs) : 4 sunt proteine trasmembranare de tip I (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-24) și 2 sunt proteine glicozilfosfatidilinozitol (GPI) ancorate (MMP-17 si MMP-25). Cu excepția MT-4-MMP, toate sunt capabile de activarea pro-MMP-2. Aceste enzime pot de asemenea să digere câteva molecule ECM, iar MT-1-MMP prezintă o activitate colagenolitică pe colagenele de tip I, II si III. Șoarecii care prezintă MT-1-MMP manifestă anormalități de tip scheletal în timpul dezvoltării post-natale, care sunt probabil datorate lipsei de activitate colagenolitică. MT-1-MMP joacă un rol important și în angiogeneză. MT-5-MMP este specifică creierului și este exprimată în cerebel. MT-6-MMP este exprimată aproape exclusiv în leucocitele sângelui periferic și în glioblastoame, dar nu și în meninge. (Visse et al, 2003)

Alte metaloproteinaze matriceale

Șapte MMPs nu sunt clasificate în categoriile de mai sus. Metaloelastaza MMP-12 este exprimată în principal în macrofage și este esențială pentru migrarea macrofagică. În afară de elastină ea digeră și alte câteva proteine.

MMP-19 a fost identificat prin clonarea ADNc din ficat și ca autoantigen derivat de la celulele T , la pacienții cu artrite reumatoide (RASI) .

Enamelizina (MMP-20), care digeră amelogenina, este localizată în principal între smalțul dintilor nou formați. Amelogenin imperfecta , boală genetică cauzată de formarea defectuoasă a smalțului, se datorează mutațiilor la siturile de clivare MMP-20.

MMP-22 a fost prima dată clonată din fibroplaste de pui și un omolog uman al acesteia a fost identificat pe baza secvențelor EST. Funcția acestei enzime nu este încă cunoscută.

MMP-23 este exprimată în principal în țesuturile reproductive. Enzima nu prezintă domeniul hemopexină însă prezintă un domeniu cisteinic urmat de un domeniu asemantor imunoglobulinic. Este propusă spre a fi considerată o proteină membranară de tip II având în vedere domeniul transmembranar din regiunea N-terminală a propeptidei. Deoarece prezintă un motiv de recunoaștere a furinei în propeptidă este clivată în aparatul Golgi și eliberată ca o enzimă activă în spațiul extracelular.

MMP-28 este exprimată în general în keratinocite. Este sugerat faptul că MMP-28 ar funcționa în homeostazia tisulară și la vindecarea rănilor. (Visse et al, 2003)

Tabel 1: Principalele MMPs și substraturile lor

În afară de MMPs prezentate mai sus, este important de recunoscut și existența unei familii secundare de proteine cu activitate metaloproteinazică. Aceste proteine sunt cunoscute drept ADAMs (A Desintegrin and Metalloproteinase). După cum sugerează și numele, aceste proteine nu conțin numai regiuni asemănătoare enzimelor, dar și o regiune tip dezintegrină care mediază adeziunea celulară și evenimentele de fuziune. Deși ADAMs reprezintă o familie cu 30 de membri, se crede că numai 16 dintre ele prezintă activitate metaloproteinazică. Dintre inhibitorii endogeni, numai TIMP-3 poate inhiba eficient proteazele ADAM. Deoarece aceste proteine pot fi inhibate de către mulți inhibitori sintetici dezvoltați pentru MMPs, ele sunt importante atunci când sunt evaluate efectele administrării inhibitorilor MMP sintetici (MMPI). (Nelson et al, 2000)

Familiile MMPs sunt denumite drept: astacine, reprolizine (ADAMs), seralizine, aceste 3 familii constituind „metzicinele”.

2.3. Structura de domeniu a metaloproteinazelor matriceale

MMPs sunt fie secretate (MMPs 1-13 si 18-20), fie ancorate la membrana celulară printr-un domeniu transmembranar (MT-MMPs 14-17).

Toate MMPs prezintă o structură comună a domeniului (figura 2) deși nu toate domeniile sunt reprezentate la toți membrii familiei. Toate enzimele prezintă un prodomeniu, un domeniu catalitic și un domeniu al sitului activ, bine conservat.

Domeniul sitului activ conține un motiv HEXGHXXGXXH unde trei resturi histidinice constituie trei liganzi de Zn iar restul de acid glutamic, situl activ. (Stamenkovic, 2000)

Domeniul propeptidic (aprox 80 aminoacizi) are o secventă unică PRCG(V/N)PD conservată. Cys din secvența “Cys switch”, leagă zincul catalitic pentru a menține în stare latentă pro-MMPs (pentru latența zimogenelor). Această secvență lipsește la MMP-23. Stromelizina 3 (MMP-11), MT-MMPs, MMP din Xenopus și MMP-23 au o secvență proproteină RX/(K/R)R la capătul C-terminal al propeptidei, iar MMP-11 și MMP-14 au fost arătate ca activate intracelular de către furină. (Nagase et al, 1999)

Domeniul catalitic (aprox 170 de aminoacizi) conține un motiv HEXXHXXGXXH de legare a zincului și o metionina conservată , care formează o structura unică “Met-turn”. Acest domeniu are 5 structuri pliate de tip , trei α-helixuri și punți de legatură. Aceste structuri impreună cu secvențele “Met-turn” sunt similare și la membrii altor familii MMPs. Acest domeniu al matrixinelor prezintă un ion structural de zinc adițional și 2-3 ioni de calciu, care sunt necesari pentru stabilittatea și expresia activității enzimatice. Doi membri ai familiei, MMP-2 și MMP-9, prezintă trei repetițtii ale domeniului fibronectină tip II înserate în domeniul catalitic. Aceste repetiții interacționează cu colagenele și gelatinele. (Nagase et al, 1999)

Cu excepția MMP-7, toate MMPs conțin un domeniu hemopexină, despre care se crede că promovează interacțiile cu substraturile, contribuind astfel la specificitatea substratului (Stamenkovțc, 2000). Domeniul C-terminal hemopexină-like (aprox 210 aminoacizi) prezintă o formă de disc elipsoidal cu 4 structuri β-propeller cu lame; fiecare lamă fiind constituită din 4 structuri β-pliate antiparalele si un α-helix. Domeniul hemopexină este absolut necesar pentru colagenaze pentru a cliva colagene interstițiale triplu-elicale, în ciuda faptului că domeniul catalitic singur reține activitatea proteolitică către alte substrate. Domeniul hemopexină al MMP-2 este de asemenea necesar pentru activarea la suprafața celulară a pro-MMP-2 de către MT1-MMP. Funcția peptidei de legatură bogată în prolină, care conectează domeniul catalitic și domeniul hemopexină, nu este cunoscută, deși interacția ei cu tipul de colagene triplu-elice este presupusă pe baza modelării moleculare. MMP-23 prezintă regiuni bogate în prolină, cisteină și regiuni asemănătoare receptorului IL-1 în locul domeniului hemopexină. (Nagase et al, 1999)

5 membri MMPs, cunoscuți drept MT-MMPs, au un domeniu transmembranar C-terminal după domeniul hemopexină. Acesta ancorează enzimele MT-MMPs la suprafața celulară.(Stetler-Stevenson et al, 2001)

Fig.2 Structura de domeniu a familiei MMP. Toate MMPs prezintă aceeași structură a domeniului de bază( constituit din pro-domeniu cu un locus conservat de activare), un domeniu catalitic cu un situs conservat de legare a zincului și un domeniu hemopexină (PEX). Există o excepție, MMP-7, cel mai mic membru cunoscut al familiei MMP, căruia îi lipsește domeniul PEX. Alte domenii care sunt adăugate sau înserate în structura de bază sunt : domeniul de legare a gelatinelor care este înserat în domeniul catalitic și prezent la membrii MMP-2 și MMP-9 din subgrupul gelatinazelor ; secvența de recunoaștere a furinei prezentă la MMP-11(stromelizina 3) și MT-MMPs care este înserată în pro-domeniu; și domeniul transmembranar care este unic pentru MT-MMP. (Stetler-Stevenson et al, 2001)

2.4. Reglarea activității metaloproteinazelor matriceale

Activitatea MMP este reglată la cel putin trei nivele: transcripție, activarea proteolitică a formei zimogene, și inhibiția enzimei active de către inhibitorii lor naturali. MMPs sunt exprimate în țesuturi în diferite stadii de dezvoltare, dar sunt absente în celulele normale ale organismului adult. În mod similar, expresia lor de bază este mică în cele mai multe celule în cultură. Totuși, un număr mare de citokine, factori de creștere și schimbări în interacțiile celulă-celulă și celulă-ECM, asigură stimuli care pot induce rapid expresia MMP. Expresia MMP este în principal reglată la nivel transcripțional. Regiunile reglatoare din extremitatea 5’ ale MMPs-urilor inductibile conțin un element reglator cis AP-1 în vecinătatea promotorului, aproximativ 70 de nucleotide înaintea sitului de inițiere a transcripției. Regiunile promotoare ale MMPs sensibile la AP-1 conțin un situs PEA3 (polyoma virus enhancer 3), alt element cis important care leagă membrii familiei factorilor de transcripție ETS și cooperează cu motivul AP-1 pentru activarea optimă a promotorilor metaloproteinazelor-1, -3 și -9. Expresia ETS-1 a fost observată în fibroblastele stromale din vecinătatea celulelor tumorale invadatoare și în celulele endoteliale vasculare angiogenice. (Stamenkovic, 2000)

În vreme ce MMPs sunt sintetizate de novo, MMP-8 și MMP-9 sunt stocate în granulele secretoare ale neutrofilelor și eozinofilelor, iar MMP-7 este stocată în celulele epiteliale secretoare ale diferitelor țesuturi, inclusiv în piele, tractul gastrointestinal și sistemul respirator. (Stamenkovic, 2000)

2.4.1.Reglarea la nivel transcripțional

În majoritatea tipurilor celulare, exprimarea genelor MMPs este mai degrabă inductibilă decât constitutivă. Totuși mRNA lor poate fi indus de către o serie de agenți ca: hormoni, factori de creștere, citokine, stimuli chimici și fizici. O supraexprimare dramatică a genelor MMPs are ca rezultat distrugerea țesuturilor conjunctive în nenumărate procese patologice inclusiv AR și OA. Prin urmare, un control riguros al genelor MMPs este deosebit de important pentru menținerea homeostaziei țesuturilor normale. Până în prezent, s-au relizat puține studii pe condrocite referitoare la reglarea exprimării genelor MMPs, cele mai multe date provenind din studiile realizate pe alte tipuri celulare (Matrisian et al., 1992).

Sinteza MMPs în cultură poate fi crescută de prezența a numeroși mediatori: a) citokine: IL-1, IL-1, factorul necrozei tumorale (TNF-); b) factori de creștere: fibroblastic (FGF), epidermal (EGF), tumoral- (TGF-derivat din plachete (PDGF), interferoni (IFN-, - și -); prostaglandine E (PGEs) și anumiți agenți chimici (forbol esteri, citochalasina B, colchicina, etc.) (Matrisian, 1990). Citokinele și factorii de creștere acționează prin legarea lor de receptorii specifici prezenți pe suprafața celulelor țintă.

Regiunile promotor ale genelor ce codifică MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-9 și MMP-10 au regiuni reglatoare comune ce sunt activate de 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetat (TPA), IL1 și TNF-. Ele conțin elemente TATA și situsuri AP-1 (situsul de legare a proteinei activator-1) și PEA-3 (polyoma virus enhancer 3), care singure sau împreună cu alte situsuri, reglează transcripția bazală și indusă. Factorii transcripționali de activare includ proto-oncogenele c-fos și c-jun (care pot transactiva elementul AP-1) și c-ets (care transactivează elementul PEA-3). Genele ce codifică MMP-2 și MMP-8 nu conțin însă elementul TATA și situsurile AP-1 ci un element sensibil la proteina adenovirală E1A și 2 regiuni care funcționează ca “silencer” (Frisch et al., 1990).

Exprimarea MMPs poate fi modulată negativ de către următorii agenți: glucocorticoizi, retinoizi, hormoni (estrogeni, progesteron, etc.), TGF-IFN-indometacin, etc. Inhibarea transcripției MMP-1 de către glucocorticoizi rezultă din legarea receptorului hormonal cu c-JUN, împiedicând astfel interacția între AP-1 și elementul de răspuns la TPA (TRE), o secvență 5’-TGAGTCA-3’ ce leagă proteinele AP-1 (JUN și FOS) (Jonat et al., 1990).

Este cunoscut că diferite combinări ale produșilor protooncogeni FOS și JUN se leagă la situsuri identice cu afinități diferite, legarea complexului cu afinitatea cea mai mică având ca rezultat o transcripție mai puțin eficientă.

Acidul all-trans retinoic represează inducerea exprimării genei colagenazei și stromelizinei1 de către IL-1 și forbol esteri prin inhibarea inducerii FOS (Lafyatis et al., 1990). Totuși, concentrații fiziologice de acid retinoic s-au dovedit a induce expresia stromelizinei 3. Aceasta se datorează faptului că promotorul proximal al genei sale diferă de cel al celorlalte MMPs studiate, prin absența situsului de legare AP-1 și prin prezența unui element de răspuns la acidul retinoic (RARE) ce poate fi transactivat de către receptorii acidului retinoic și retinoizilor (RARs/RXRs) într-o manieră dependentă de ligand în fibroblaste umane și celule de origine mezodermală (GUERIN et al., 1997).TGF- inhibă transcripția MMP-3 printr-un mecanism FOS-dependent care implică elementul inhibitor TGF-(TIE)(Edwards et al,1987).

Studii pe condrocite primare izolate din cartilajul articular uman au evidențiat că mRNA colagenazei 3 este indus de către IL-1 și TNF- dar nu de către forbol 12-miristat-13-acetat (PMA) și numai în mică măsură de către factorii de creștere PDGF și EGF. De asemenea, citokinele au indus expresia colagenazei 1 și stromelizinei 1 printr-un mecanism c-FOS dependent, în timp ce PMA a fost inductor doar al colagenazei-1. Inducerea expresiei colagenazei 3 de către IL-1 și TNF- se realizează prin interacția situsului AP-1 din promotorul genei sale cu FRA-1 (un membru al familiei factorilor de transcripție c-FOS) (Borden et al., 1996).

2.4.2. Activarea metaloproteinazelor matriceale

Cele mai multe MMPs sunt secretate ca precursori în stare latentă (zimogene) și sunt activate în spațiul extracelular. Gruparea sulfhidril-cisteinică a motivului PRCGXPDV din alcatuirea domeniului propeptidic, se leagă la situl activ al atomului de zinc, prevenind astfel activarea. Întreruperea acestei interacții prin mijloace fizice sau chimice constituie primul pas în activarea MMP, care este urmată de scindarea proteolitică a capătului COOH-terminal al sitului PRCGXPDV , cu pierderea ireversibilă a resturilor de cisteină. (Stamenkovic, 2003)

În timp ce activarea majorității MMPs are loc în afara celulei, mai multe MMPs (inclusiv MMP-11, MMP-28 și MMPs de tip membranar) pot fi activate de serin proteaze intracelulare asemănătoare furinei înainte de a ajunge la suprafața celulară. În vitro, MMPs pot fi activate și de către alte MMPs, fiind capabile chiar și de autoactivare. De exemplu, MMP-1 poate activa MMP-2 aflat în stare latentă. MMP-13 poate fi activat de către MT-1-MMP, MMP-3, MMP-10 și MMP-12. (Stamenkovic, 2000)

Totuși, cu o excepție, mecanismele activarii extracelulare pentru majoritatea MMPs, rămân să fie elucidate. Excepția o reprezintă activarea MMP-2. S-a demonstrat că MMP-14 se leagă la inhibitorii tisulari ai metaloproteinazei matriceale-2 (TIMP-2) la suprafața celulară și recrutează MMP-2, care se leagă la TIMP-2 imobilizat prin intermediul domeniului hemopexină. MMP-14 fără TIMP este apoi recrutat în complex și clivează propeptida din MMP-2, fapt care duce la activarea parțială a MMP-2; această activare este completată de către un MMP-2 activ, învecinat. (Stamenkovic, 2003)

2.4.3. Inhibiția metaloproteinazelor matriceale

Se pune problema modului în care sunt controlate metaloproteinazele matriceale dupa ce ele au fost eliberate în spațiul extracelular. Expunerea ECM la degradarea necontrolată reprezintă un risc. De fapt celula nu pierde controlul MMPs după ce acestea au fost secretate. În primul rând celulele nu eliberează MMPs într-o manieră necontrolată, ci doar ca răspuns la semnale bine definite care apar în momentul în care degradarea este corespunzătoare. În al doilea rand cele mai multe MMPs rămân în vecinătatea celulei, legate la suprafața celulară sau legate de componente ale matricei. În al treilea rând, enzimele se găsesc frecvent într-o proformă inactivă care necesită activare. Aceste procese sunt controlate de către celulă, de ex: prin intermediul MMPs de la suprafața celulară precum MMP-14, care activează MMP-2 la suprafață, sau prin legarea urokinazei și activarea plasminogenului la plasmină, care activează în schimb proMMP. În final există inhibitori generali ai MMPs care blochează rapid acțiunea MMPs. Printre aceștia se numară α2-macroglobulina și inhibitorii tisulari ai metaproteinazelor matriceale(TIMPs). Aceștia din urmă sunt produși de către celulele locale, cel mai adesea de celulele care eliberează MMPs. Astfel celula poate inhiba activitatea MMPs.

TIMPs au fost prima dată identificați în 1975 (Verstappen et al, 2006) și 4 omologi TIMPs au fost caracterizați până acum.

Tabel 2: Proprietăți generale ale TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 și TIMP-4.

TIMPs sunt proteine mici cu greutate moleculară între 21 KDa și 28 KDa care sunt secretate de multe tipuri de celule și care blochează specific activitatea MMPs prin legarea la situsul de legare a zincului din structura MMPs. Toate TIMPs impart trăsături structurale comune inclusiv subdomeniile N-terminal și C-terminal, stabilizate de 3 legături disulfurice. Fiecare TIMP prezintă 12 resturi de cisteină care contribuie la structura secundară și la capacitatea lor de a inhiba MMPs. Domeniul amino-terminal al moleculelor se află în stransă legatură cu activitatea inhibitorie formând un complex 1:1 necovalent cu centrul catalitic al MMPs active (figura 2). Legarea la MMPs latente are loc într-o manieră stoichiometrică 1:1 la regiunea C-terminală a MMPs individuale.

Figura 3: Complexul TIMP-1/MMP-3

Reprezentare “ribbon” a structurii complexului TIMP-1/MMP-3: domeniul N-terminal al TIMP-1 (resturile 2-126) este colorat în galben, domeniul C-terminal în purpuriu, MMP-3 este albastru, zincul catalitic este roșu și seleniu este portocaliu. Doar domeniul N-terminal al moleculei TIMP-1 realizează interacții cu proteina MMP-3 din complex. (Magdolen et al, 2002)

Domeniul C-terminal al membrilor TIMP este variabil și este implicat în interacțiile cu proMMPs. Mai mult de atât, acest domeniu ar putea să nu fie responsabil de funcțiile biologice adiționale ale TIMPs în proliferare, angiogeneză și apoptoză. Aceste efecte sunt independente de funcția inhibitorie a TIMPs. Totuși, mecanismele acestor acțiuni nu sunt încă înțelese.

Figura 4: Reprezentarea schematică a structurii TIMP-1 .TIMP-1 conține 12 resturi de cisteină care formează 6 structuri buclă prin intermediul legăturilor disulfurice. Domeniul N-terminal al TIMPs 1-4 se leagă la domeniul catalitic al celor mai multe MMPs active și inhibă funcția acestora. Domeniul C-terminal al TIMP-1 și TIMP-2 se leagă la domeniul hemopexină al proMMP-2 și proMMP-9; legarea reglează funcția acestora. http://www.abcam.co.jp/index.html?pageconfig=resource&rid=11034&pid=10628

TIMPs sunt produse de o varietate de celule, inclusiv keratinocite, fibroblaste, osteoblaste și celule endoteliale (Stamenkovic, 2000).

TIMP-1 formează complexe necovalente 1:1 de mare afinitate cu toate MMPs active, dar preferă colagenazele interstițiale, stromelizina-1 și gelatinaza A, active.

TIMP-2 formează preferențial complex 1:1 cu gelatinaza A, iar domeniul C-terminal va lega puternic progelatinaza A.

TIMP-3 este o proteină cu activitate inhibitorie împotriva gelatinazelor A și B, colagenazei-1 și stromelizinei-1. Acesta blochează spre deosebire de ceilalți omologi și activitatea adamalizinelor ADAM-17 (tumor necrosis factor alpha converting enzyme, TACE), ADAM-10, ADAM-12 și agrecanazelor ADAMTS-4 și ADAMTS-5. TIMP-3 este unică și datorită faptului că e insolubilă și strâns legată de matricea extracelulară prin domeniul C-terminal. Mai mult, TIMP-3 este corelat cu distrofia Sorsby’s, o boală autozomală dominantă cauzată de o singură mutație la nivelul domeniului C-terminal care are ca rezultat pierderea ireversibilă a vederii.

TIMP-4 poate lega domeniul C-terminal al gelatinazei A și al progelatinazei A. Transcripția TIMPs este reglată de hormoni, citokine, agenți anti-inflamatori și promotori tumorali. (Cox et al, 1998)

Alte câteva proteine au fost raportate că inhibă MMPs.

Printre moleculele capabile să regleze activitatea proteolitică a MMPs se numară și trombospondina. Trombospondina-2 leagă MMP-2 într-un complex care facilitează endocitoza și eliberarea mediate de receptori scavenger, în vreme ce trombospondina-1 se leagă la proMMP-2 și -9 și blochează direct activarea lor. În mod interesant, a fost raportat faptul că trombospondina-1 mărește și activarea MMP-2 și -9. (Stamenkovic, 2003)

Un alt inhibitor este receptorul de suprafață celulară cunoscut drept RECK (reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs). RECK este o glicoproteină GPI ancorată care scade nivelele de MMP-9 și de MMP-2 active și supresează procesul angiogenic, care duce la moartea celulelor și inhibă activitatea proteolitică a MMP-2, MMP-9 și MT1-MMP. (Stamenkovic, 2003)

MMP-2 este inhibat de clorotoxină, o toxină din scorpioni care prezintă efecte anti-invazive asupra celulelor glioma.

Totuși, mecanismele inhibiției MMPs de către aceste proteine nu sunt cunoscute încă.

Un mecanism recent identificat care controlează activitatea MMP este localizat la suprafața celulară. S-a tot sugerat că MMPs funcționează în vecinătatea sau la suprafața celulară. Dovezi acumulate sugerează faptul că asocierea cu suprafața celulară ar fi critică pentru o funcție optimă a MMPs. Mai mult, se recunoaște că un numar tot mai mare de MMPs secretate sunt localizate la suprafața celulară, cel mai adesea în asociere cu receptori de adeziune sau proteoglicani de suprafața celulară. În acest fel, MMP-1 se asociază cu integrine și EMMPRIN (un membru al familiei imunoglobulinelor care induce expresia MMP). În plus, la complexul MMP-14/TIMP-2, MMP-2 interacționează cu αvβ3-integrina prin domeniul hemopexină. MMP-7 leagă HSPG (heparan sulphate proteoglicani) de suprafața celulară, inclusiv izoforme HSPG ale receptorului CD44. MMP-9 leagă mai mulți receptori celulari inclusiv CD44, ICAM-1 și integrine. MMP-13 leagă HSPG iar MMP-19 se localizează la suprafața celulară printr-un mecanism necunoscut încă. (Stamenkovic, 2003)

Inhibitorii sintetici (conform cuprinsului)

CAPITOLUL III

3.1. Rolul metaloproteinazelor matriceale în invazia tumorală și metastaze

Invazia tumorală și metastazele necesită depasirea barierelor tisulare, membrana bazală fiind cea care realizează alinierea celulelor endoteliale vasculare și care constituie un obstacol permanent în calea metastazării. După cum demonstrează examinarile histopatologice realizate pe secțiuni tisulare, defecte ale membranei bazale din vecinătatea tumorilor maligne susțin noțiunea conform căreia, celulele tumorale produc mecanismele proteolitice necesare pentru a înlătura barierele naturale și pentru a realiza invazia. (Stamenkovic, 2000)

Rolul MMPs în cancer a fost prima dată susținut de Liotta et al la începutul anilor ’90, când aceștia au identificat proteoliza ca fiind unul din cele trei etape esențiale în invazia tumorală și când a identificat colagenazele tip IV ca fiind implicate în invazia și metastazarea melanocitelor. La scurt timp după clonarea primelor MMPs, a devenit clar că această activitate putea fi atribuită gelatinazei A și/sau B. Deși inițial s-a crezut că celula tumorala era cea care produce MMPs, cercetări ulterioare au demonstrat că celulele stromale gazdă răspund la celulele tumorale prin inducerea MMPs. Acest concept de expresie a MMPs de către celulele stromale a fost adus în prim-plan prin identificarea stromelizinei-3 ca metaloproteinază stromală asociată cu cancerul de sân. Analizele care au urmat, realizate prin hibridizare in situ, au arătat că expresia MMPs de către celulele stromale este în general mai întalnită decât expresia lor de catre celulele tumorale. (Nelson et al, 2000)

Asocierea MMPs cu invazia tumorală și procesul metastazic este demonstrată de numeroase cercetări realizate în cursul anilor și de rezultatele acestor studii. Prima MMP izolata cunoscuta și sub numele de transin era indusa de oncogene și de factori de creștere. Transin s-a dovedit a fi un omolog al colagenazelor interstițiale și a fost considerat membru prototipic al familiei MMP, capabil chiar să codifice o protează exprimată în tumorile maligne de piele la șoarece. (Stamenkovic, 2000)

3.2. Implicarea metaloproteinazelor matriceale în inițierea tumorii

MMPs par a fi implicate în initierea tumorii. Folosind un sistem de expresie inductibil, pe bază de tetraciclină, Sternlicht et al (anul) au arătat că expresia MMP-3 este corelată cu celulele epiteliale mamare normale, în timp ce în absența MMP-3, se dezvoltă structuri glandulare care formează tumori mezenchimale invazive. Odată formate, aceste tumori nu mai sunt dependente de expresia MMP-3. S-a observat de asemenea că MMP-3 promovează producerea unor leziuni spontane premaligne în glandele mamare la șoareci transgenici. Natura schimbarilor dependente de MMP-3 a dus la ideea că MMP-3 ar putea induce instabilitate genomică în celule. Un mecanism propus în cazul inițierii tumorigenității mediate de MMP-3 este inducerea căii E-caderina/β-catenina, această cale fiind corelată cu tranziția de la epitelial la mezenchimal, cu invazia și instabilitatea genomică. MMP-3 leagă E-caderină rezultând nu numai pierderea adeziunii celulare, ci și generarea unor semnale care induc invazia celulelor tumorale și metastazarea. (Stamenkovic, 2000)

Alte câteva observații susțin ideea că MMPs ar putea fi implicate în dezvoltarea inițială a cancerului. Deleția MMP-7 la soarecii purtătoti de mutație Apcmin, duce la formarea adenomului intestinal, iar supraexpresia MMP-7 în glandele mamare accelerează tumorigenitatea mamară, la soarecii purtători de transgene MMTV-neu. (Stamenkovic, 2000)

Figura 1: MMPs promovează creșterea celulelor canceroase prin interacția cu molecule ECM și integrine. MMPs promovează angiogeneza prin creșterea biodisponibilității factorilor de creștere pro-angiogenici. MMPs reglează invazia și metastazarea prin degradarea componentelor structurale ale ECM- în principal prin clivarea lamininei-5, a TGF-β, a factorului de necroză tumorală și a receptorului interleukinei-6. http://140.116.60.1/lin5612/microimm/93semi/clee.htm

3.3. Implicarea metaloproteinazelor matriceale în stadii specifice ale metastazelor tumorale

S-a crezut că rolul principal al MMPs în procesul metastazării este crearea unei căi pentru colonizarea țesuturilor gazdă de către celulele tumorale prin intermediul capacitatii lor de degradare a ECM. MMPs ar putea fi implicate în medierea procesului de extravazare a celulelor tumorale și distrugerea membranei bazale facilitând astfel invazia. Numeroase studii in vitro susțin această noțiune. Totuși, celulele tumorale metastazice trebuie să depaseasca numeroase bariere și rămâne încă de stabilit dacă MMPs reglează anumite etape sau etape multiple în procesul metastazic. (Stamenkovic, 2000)

Una din principalele probleme existente în cercetările convenționale realizate pe metastazare e că se cunosc numai parametri precum numărul de celule injectate și prezența (și cantitatea) sau absența tumorilor metastazice. Când expresia unei anumite molecule crește sau reduce capacitatea celulelor tumorale de a forma tumori metastazice, în aceste studii, este imposibil de aflat cu exactitate care etapa din procesul metastazic este afectat. Datorită capacității MMPs de a degrada membrana bazală și proteinele ECM, extravazarea celulelor tumorale este corelată cu MMPs, și studiile făcute in vitro furnizează dovezi în acest sens. (Stamenkovic, 2000)

Doua studii recente susțin ideea că MMPs joacă un rol major în extravazarea celulelor tumorale. Unul dintre aceste studii se bazează pe analize ale mecanismelor care permit celulelor tumorale să invadeze peretele vascular și să penetreze lumenul vascular, proces cunoscut ca intravazare. Celălalt studiu se bazează pe observarea evenimentelor care preced creșterea metastazică folosind microscopie intravitală (IVVM). (Stamenkovic, 2000)

Examinarea rolului potențial al diferitelor enzime a sugerat implicarea activatorului plasminogenului de tip urokinazic (uPA) și a receptorului acestuia în metastazele tumorale și nu în ultimul rând implicarea MMP-9. Se poate presupune implicarea uPA/sistem plasminic în activarea MMP-9, acesta din urmă reglând la rândul lui evenimente relaționate cu invazia și migrarea celulelor tumorale. (Stamenkovic, 2000)

Există totuși indicații că MMPs ar putea promova dezvoltarea tumorală prin alte mecanisme decăt cele legate de migrarea celulelor tumorale și invazie. Cercetări făcute asupra funcțiilor MMP-7 și MMP-11 au indicat că pierderea funcției acestora nu pare să afecteze invazivitatea in vitro. Modularea expresiei ambelor enzime a dus însă la alterarea tumorigenității celulelor dar nu și la alterarea invazivității și a potențialului metastazic. Aceste observații sugerează că activitatea unor MMPs ar putea avea o legatură directă cu relația dintre celulele tumorale și stroma tesutului gazdă. (Stamenkovic, 2000)

Studii cu microscopie IVVM aplicată pe modele metastazice tumorale au permis observarea microcirculației in vivo. Astfel interacțiile dintre celulele tumorale și țesuturile gazdă au putut fi observate în timp real iar efectul moleculelor exogene exprimate a putut fi rapid cuantificat. Microscopia IVVM a condus la rezultate conform cărora MMPs sunt în principal implicate în stabilirea coloniilor netastazice și la rezultate care atestă că extravazarea nu constituie o etapa critica în metastazarea tumorală și provoacă ideea dezvoltării metastazice ca eveniment intravascular. Există și dovezi că MMPs pot fi produse de celulele stromale ca raspuns la invazia tumorală și că activitatea acestora ar putea influența semnificativ dezvoltarea tumorală ulterioară. Celulele inflamatorii care infiltrează situri ale invaziei tumorale pot produce de asemenea MMPs și studiile realizate prezintă carcinoame ale celulelor scuamoase capabile de a degrada ECM înconjurătoare și de a stimula angiogeneza. Celulele tumorale prezintă capacitatea de a stimula expresia MMPs în celulele țesuturilor gazdă, care ar putea servi la amplificarea remodelării ECM favorizând astfel tumorigenitatea. Rezultate importante sugerează ca: a) ECM este implicată în diferite căi de semnalizare care orchestrează homeostazia tisulară și b) remodelarea ECM mediată de proteaze este o componentă importantă a răspunsului tisular la diferiți stimuli fiziologici. Baza acestei noțiuni este întărită de numeroase cercetări care atestă că ECM manifestă o influență majoră în dezvoltarea epiteliala mamară și ca prin remodelarea ECM, proteazele controlează fiziologia epiteliala mamară. Capacitatea celulelor tumorale de a modifica funcția normală a ECM în țesuturile gazdă prin producerea MMPs ar putea fi o etapa importanta în dezvoltarea tumorală. (Stamenkovic, 2000)

3.4. Rolul metaloproteinazelor matriceale în angiogeneză

Un nou concept în domeniul cercetării procesului angiogenic atestă faptul că diferiți inhibitori endogeni ai angiogenezei sunt generați prin modificări proteolitice ale componentelor ECM deja prezente în matrice. Activitatea proteazică asupra acestor substraturi determină apariția situsurilor criptice (cunoscute ca ’’situsuri matricriptice”) care funcționează pentru modularea răspunsului celular. (Stetler-Stevenson et al, 2001)

MMPs participă la inițierea procesului angiogenic prin cel puțin 2 mecanisme: prin degradarea barierelor ce are ca rezultat invazia celulelor endoteliale și prin eliberarea factorilor care promovează sau mențin fenotipul angiogenic.

Dovezi ale implicării MMPs în neovascularizație sunt date de inhibitori ai MMPs, atât endogeni cât și sintetici, care inhibă răspunsul angiogenic atât in vitro cât și in vivo. Mai mult, studii recente au arătat că șoarecii deficienți în MMP prezintă răspunsuri angiogenice întarziate sau diminuate în timpul dezvoltării. În vreme ce aceste studii implică activitatea MMP în angiogeneză, există încă incertitudini cu privire la posibilele ținte moleculare implicate în acest proces și rolul lor precis în angiogeneză. Mecanismele care controlează și integrează activitatea MMP cu alte funcții ale celulelor endoteliale sunt încă foarte puțin cunoscute. (Stetler-Stevenson,1999)

Înțelegerea a ce, unde, când și cum activitatea MMP este implicată în fenotipul angiogenic are implicații deosebite în terapia cancerului deoarece angiogeneza este necesară pentru creșterea tumorală și metastazare. Abordarile terapeutice curente ce vizeaza activitatea MMP utilizează inhibitori selectivi însa nu și specifici pentru anumiti membri ai familiei MMP. Acest lucru a dus la complicații musculoscheletale severe dar reversibile. Această experiență demonstrează nevoia de a înțelege rolul precis al unor MMPs în răspunsul angiogenic. (Stetler-Stevenson,1999)

Figura 3: Angiogeneza și factori care contribuie la modificarile fenotipice http://www.scielo.br/img/revistas/jbpml/v43n6/a09fig01.gif

Mecanismele moleculare care stau la baza evenimentelor celulare din procesul angiogenic au fost examinate folosind diferite modele in vitro. Acestea au fost de ajutor în examinarea rolului proteazelor în angiogeneză. În foarte multe studii incipiente, matricea extracelulară a fost vazută ca o barieră împotriva invaziei celulelor endoteliale. Rolul principal al activității MMP a fost de a înlătura această barieră și de a permite migrarea celulelor endoteliale. Studiile recente au pus la îndoială această afirmație și au sugerat că interacții celulă-matrice extracelulară influențează profund comportamentul celular. Aceste interacții nu numai că influențează producerea MMP dar sunt subiectul modulării și reglării de către activitatea MMP. În acest fel, activitatea MMP poate media direct și indirect răspunsul angiogenic. (Stetler-Stevenson,1999)

Studiile s-au focusat pe rolul MT-1-MMP ca activator al MMP-2, în răspunsurile celulelor endoteliale la stimularea angiogenică. Totuși, rezultate recente sugerează că, asemanator serin-proteazelor, rolul unor MMPs specifice ar putea fi contextual. Weiss et al (anul) au folosit un sistem combinat in vitro și in vivo pentru a studia invazia celulelor endoteliale prin barierele fibrinice. Aceștia au observat ca neoangiogeneza în matricea fibrinică a fost complet independentă de uPA, tPA sau plasminogen, dar a fost blocată de inhibitori MMPs: TIMP-2. Caracterizarea profilului MMP exprimat de celulele endoteliale în condiții de stimulare angiogenică au arătat că nu numai MT-1-MMP prezintă activitate fibrinolitică semnificativă. Expresia MT-1-MMP pe anumite linii celulare (celule MDCK) a conferit acestor celule potențial invaziv. Aceste constatări sugerează că rolul specific al MMPs în invazia celulelor endoteliale s-ar putea datora degradarii matricei extracelulare. (Stetler-Stevenson,1999)

Cercetări atente referitoare la rolul MMPs în procesul neovascularizației s-au axat pe asocierea MMP-2 cu receptorul αvβ3 al vitronectinei. Pentru prima dată s-a stabilit o legătură între activitatea proteazică și interacțiile celulă-matrice. Brooks et al (anul) au fost primii care au raportat colocalizarea MMP-2 și αvβ3 în vase supuse remodelării active ca raspuns la stimuli angiogenici. Acesti autori au descris o interacție directă între MMP-2 și αvβ3 cu implicarea domeniului hemopexină al MMP-2. Totuși, mecanismele legării domeniului PEX la αvβ3 rămân neclare din cauza secvenței RGD lipsă din structura MMP-2 care este comună liganzilor acestui receptor. Rămâne de asemenea neclar dacă domeniul PEX este singurul domeniu al MMP-2 implicat în legare. (Stetler-Stevenson,1999)

MMP-2 ar putea facilita invazia celulelor endoteliale prin înlăturarea barierelor matriceale sau prin inițierea căilor de semnalizare care promovează sau sprijină fenotipul angiogenic. Recent s-a demonstrat că activitatea MMP-2 ar putea genera fragmente de degradare a matricei extracelulare generand semnale necesare supraviețuirii celulelor și/sau migrării. Acțiunea selectivă a MMP-2 asupra lamininei 5 a condus la migrarea celulelor epiteliale mamare. Acest lucru a sugerat posibilitatea ca produși similari de degradare ai matricei extracelulare, generați de MMP să influențeze comportamentul celulelor endoteliale. Integrina αvβ3 este cunoscută ca mediator al supraviețuirii celulelor endoteliale prin mecanisme NF-κB–dependente. (Stetler-Stevenson,1999)

În mod interesant, activitatea MMP este acum considerată ca principala activitate proteazică responsabilă de generarea inhibitorului angiogenezei, angiostatin. MMPs pot degrada plasminogenul pentru a genera un fragment N-terminal care să inhibe proliferarea celulelor endoteliale, cunoscut ca angiostatin. Acestea includ MMP-3, MMP-7, MMP-9 și MMP-12. MMP-12 este cel mai important în generarea de angiostatin, care inhibă proliferarea celulelor endoteliale vasculare in vitro. Producția de angiostatin este de asemenea corelată cu sinteza MMP-12 în macrofagele din tumorile pulmonare, la șoareci Lewis. Un alt inhibitor recent identificat al angiogenezei este endostatin, un fragment proteoltic de colagen XVIII. Nu se știe încă dacă activitatea MMP contribuie la generarea activității endostatinului. (Stetler-Stevenson, 2001)

Pe langa degradarea barierelor tisulare conjunctive, MMPs sunt implicate și în alte procese necesare pentru formarea unor noi vase sau în progresia celulelor tumorale. Ele ajută la promovarea angiogenezei și prin reglarea adeziunii celulelor endoteliale, proliferare, migrare și creștere, fie direct, fie prin eliberarea factorilor de creștere izolați în matricea extracelulară. Mai mult, dovezi noi sugerează faptul că MMPs ar putea genera sau elibera inhibitori ai angiogenezei precum angiostatin din matricea extracelulară. MT-1-MMP și MMP-2 sunt implicate în turnover-ul matricei și reglează interacțiile celulă-matrice extracelulară. Aceste schimbări mediate de MMPs în compoziția sau structura matricei extracelulare ar putea avea ca rezultat schimbări fenotipice asociate cu răspunsul angiogenic. S-ar putea ca și alte celule diferite de celulele tumorale, din stroma tumorală sau de celulele endoteliale, să secrete MMP (ex: macrofagele secretă MMP-9 sau MMP-12). Acțiunea acestor proteaze ar putea influența indirect comportamentul celulelor endoteliale prin eliberarea factorilor de creștere, a situsurilor criptice sau a factorilor pro-angiogenici, prin distrugerea inhibitorilor angiogenezei sau prin generarea unor fragmente matriceale care inhibă proliferarea celulelor tumorale, migrarea sau angiogeneza. (ex angiostatin sau endostatin). (Stetler-Stevenson, 2001)

Activitatea MMP este un eveniment recent în răspunsul angiogenic și rezultatele obtinute în ultimii ani sugerează că această activitate ar putea influența direct comportamentul celulelor endoteliale. Dovezi noi demonstrează că MMPs ar putea facilita angiogeneza la fel cum ar putea genera inhibitori angiogenici. Eforturi deosebite sunt direcționate spre identificarea MMPs care mediază răspunsul angiogenic cu scopul utilizarii lor ca ținte terapeutice in vederea modularii activității lor pentru a întrerupe astfel neovascularizația tumorală și diseminarea ulterioară (formarea metastazelor). În lumina rezultatelor recente care demonstrează rolul dual al MMPs în angiogeneză, este imperativă identificarea corectă a MMPs de interes pentru eliminarea efectelor secundare potențiale. Cercetari suplimentare sunt necesare pentru implementarea unei strategii terapeutice eficiente. (Stetler-Stevenson,1999)

3.5. Localizarea metaloproteinazelor matriceale la suprafața celulară-mecanism de control al dezvoltarii tumorale

Localizarea enzimelor proteolitice la suprafața celulară este recunoscută ca fiind importantă în reglarea capacitatii celulelor de a se adapta și de a realiza schimbări în mediul înconjurător. Pe lângă MT-MMPs, majoritatea membrilor familiei ADAM ai metaloproteinazelor implicate în fertilizare și dezvoltare, sunt legate de membrană.Membrii familiei ADAM interacționează cu integrinele și sunt implicați în degradarea proteolitică a moleculelor de suprafață celulară. Cel puțin câteva ADAMs ar putea juca un rol important în comunicarea dintre celule, în semnalizare și probabil în migrare. (Stamenkovic, 2000)

Migrarea celulară, eveniment important în metastazarea tumorală, se bazează pe adeziunea celulelor dependentă de receptori și pe eliberarea acestora din substrat. Reglarea adeziunii și a detașării celulelor se consideră a fi mediată, cel puțin în parte, de enzimele proteolitice, ceea ce implică cooperarea dintre receptorii de adeziune și proteaze. (Stamenkovic, 2000)

O paradigmă a cooperării dintre receptoriii de adeziune și proteaze este dată de receptorul activatorului plasminogenului de tip urokinazic (u-PAR). Se consideră că u-PAR facilitează migrarea celulară datorită capacitatii sale de a concentra activitatea plasminei la suprafața celulară, ceea ce ar putea duce la degradarea barierelor fizice promovând astfel migrarea și desprinderea celulelo tumorale de alte celule și din ECM. Mai multe observații sugerează că u-PAR ar putea trimite semnalele necesare pentru adeziune și migrare, ceea ce arată că sistemul urokinaza/u-PAR/plasmina prezintă capacitate proteolitică pericelulară și de reglare a adeziunii celulare. (Stamenkovic, 2000)

S-a demonstrat că u-PAR este un receptor de înaltă afinitate pentru vitronectină. u-PAR formează un complex cu β1-integrinele și calveolinele, acestea din urmă fiind considerate responsabile de adeziunea și semnalizarea mediate de complex. Componentele complexului ar putea în schimb să regleze adeziunea dependentă de integrine. Mai multe dovezi bazate pe asocierea dintre integrine și u-PAR demonstrează că semnalele dependente de integrine reglează expresia sistemului urokinaza/u-PAR. Astfel, sistemul proteazic urokinaza/plamina și sistemul de adeziune mediat de integrine sunt reglati coordonat pentru a promova adeziunea și migrarea.

Figura 2: Diagrama schematică a interacțiunii dintre celulele tumorale și cele stromale cu focusare asupra rolului MMPs (http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11034&pid=10628)

Câteva studii sugerează că activitatea proteolitică a MMPs ar putea fi localizată la suprafața celulară prin receptorii de adeziune și că MMPs secretate și MMPs legate de membrană ar putea fi localizate împreună cu receptorii de adeziune în structuri membranare specializate. Pro-MMP-2 se găsește la suprafața celulară prin legarea la complexul MT-1-MMP/TIMP-2 care facilitează clivarea proteolitică a prodomeniului acesteia. În celulele tumorale agresive, s-a observat că MT-1-MMP se găsește în protruziile membranei plasmatice (invadapodii), care par să concentreze activitatea proteolitică de la suprafața celulară, constituind structuri celulare care favorizează invazia. Înlăturarea domeniului citoplasmatic al MT-1-MMP determina suprimarea capacitatii de a se localiza în invadapodii și de a promova invazia, însă nu și capacitatea de a activa pro-MMP-2. MT-1-MMP realizează astfel un rol dual prin promovarea invaziei tumorale și prin activarea pro-MMP-2. De cealaltă parte, MMP-2 este localizat la suprafața celulelor tumorale și la suprafața celulelor endoteliale normale prin integrine αvβ3. Această asociere a fost observată în invadapodii și se pare că ar avea un rol în invazia tumorală și în angiogeneză, prin promovarea invaziei celulelor endoteliale din stromă. (Stamenkovic, 2000)

MMP-9 este localizată la suprafața unor celule tumorale, un studiu sugerând că localizarea MMP-9 la suprafața celulelor epiteliale mamare este mediată de colagene de tip IV. Alte două studii au demonstrat o asociere între receptorul CD44 și MMP-9 la suprafața celulelor epiteliale din carcinom mamar și la suprafața keratinocitelor normale. CD44 mediază interacțiunea cu alte celule și cu ECM prin legarea acidului hialuronic (HA), o componentă majoră a ECM și a matricei pericelulare. Cercetările realizate pe celule TA3 din carcinom mamar de soareci au arătat pierderea funcției MMP-9 la suprafața celulară, aceasta ducând la reducerea degradării colagenelor de tip IV și la pierderea potențialului invaziv și metastazic al celulelor TA3. Proprietățile colagenoltice, invazive și metastazice ale acestor celule puteau fi redobândite prin expresia unei proteine membranare MMP-9/CD44. Supraexpresia MMP-9 în aceste celule însă, nu a dus la redobândirea potentialului invaziv in vitro sau in vivo. Aceste observații sugerează că MMP-9 ar putea promova mai eficient invazia atunci când activitatea proteolitică este concentrată la suprafața celulară. (Stamenkovic, 2000)

Asocierea dintre CD44 și MMP-9 nu s-a observat în toate celulele care exprimă ambele molecule. În anumite cazuri, s-a constatat că MMP-9 poate fi asociată cu suprafața celulară în absența CD-44. Aceste studii sugerează că modificări specifice de tip celular ale CD44 și/sau MMP-9 ar fi necesare pentru a avea loc interacția, sau că diferite molecule care nu sunt exprimate în toate tipurile de celule ar putea fi implicate în formarea complexului CD44/MMP-9 la suprafața celulară. (Stamenkovic, 2000)

Alte observații atestă faptul că localizarea si concentrarea activității MMP la suprafața celulară ar putea fi relevante pentru comportamentul celulelor tumorale. MMP-1, care este implicata în dezvoltarea tumorii primare și contribuie la agresivitatea tumorii, este considerată a fi ancorată la suprafața celulară prin receptori ai superfamiliei Ig, EMMPRIN, care pare să fie implicat în activarea MMP-1. În final, într-un studiu bazat pe celule MDCK, Weiss et al. (anul) au arătat că MT-1-, MT-2- și MT-3-MMP trebuie să fie asociate cu suprafața celulară pentru a promova degradarea substratului mediată celular. Expresia MT-MMPs care nu prezentau domeniul transmembranar a avut ca rezultat pierderea invazivității celulelor. (Stamenkovic, 2000)

Localizarea MMPs proteolitic active la suprafața celulară prin intermediul receptorilor de adeziune ar putea explica aspecte importante ale comportamentului MMP. Conceptual, pare să aibă sens ideea că MMPs ar trebui să funcționeze la suprafața celulară. Prin asocierea MMPs cu receptori ECM, celula poate degrada ECM la puncte de contact precum invadapodiile. Pentru susținerea acestor argumente, s-a raportat că degradarea colagenelor de către MMP-1 în celulele de melanom conduce la expunerea unor noi domenii criptice care pot lega integrine αvβ3 exprimate la suprafața acestor celule și care pot declanșa semnale de supraviețuire celulara. Mai mult de atât, asocierea cu receptorii de adeziune ar putea furniza un mecanism pentru controlul activității MMP, pentru protecția enzimelor proteolitic active împotriva inhibiției de către TIMPs și alți inhibitori și pentru activarea proteolitică a altor substraturi, precum factorii de creștere latenti din vecinătatea propriilor receptori de suprafață celulară. (Stamenkovic, 2000)

3.5. Sumar (elimini acest subcapitol)

Câteva studii au extins înțelegerea noastră cu privire la rolul MMPs în creșterea tumorii, invazie și metastaze. Folosirea studiilor bazate pe invazia membranei corionice și pe IVVM au adus numeroase evidențe că MMPs sunt implicate în cel puțin două momente critice din procesul metastazic: intravazare și evenimente care succed extravazarea. Combinarea acestor două studii a dus la susținerea noțiunii că MMPs joacă un rol crucial în extravazarea celulelor tumorale. Aplicarea cu succes a IVVM reprezintă un salt biologic în domeniul metastazelor tumorale deoarece permite vizualizarea unui proces complex, care până nu demult era limitat. Rolul diferitelor molecule în diseminarea tumorală poate fi acum pus în practică în experimente realizate în timp real. Cercetările făcute pe șoareci transgenici au demonstrat că MMPs ar fi implicate în stadii primare ale dezvoltării tumorale, cât și în angiogeneză. Mai mult de atât, aceste cercetări au furnizat bazele noțiunii că MMPs ar ajuta la declanșarea instabilității genomice în tumori. (Stamenkovic, 2000)

Alte observații ne-au arătat mecanismele prin care MMPs reglează dezvoltarea tumorii. Se pare că nu numai MT-MMPs, ci și alte MMPs secretate promovează mai eficient invazia atunci când sunt ancorate la membrana celulară prin receptorii de adeziune. Asocierea dintre MMPs și receptorii de adeziune ar putea avea câteva consecințe funcționale. Pe lângă concentrarea activității proteolitice a MMPs în puncte de contact dintre celulă și ECM, precum invapodia, asocierea ar putea proteja MMPs proteolitic active de inhibiția de către TIMPs sau alți inhibitori. (Stamenkovic, 2000)

Un alt important efect al localizării proteolizei dependente de MMPs la suprafața celulară este activarea factorilor de creștere latentă din vecinătatea receptorilor de suprafață celulară. Descoperirea că MMP-9 împreună cu CD-44, la suprafața celulară, poate activa TGF-β latent, ar putea explica măcar în parte observația că MMP-9 ar fi implicat în angiogeneză. De vreme ce TGF- β poate promova agresivitatea în tumori care nu răspund la semnale lor inhibitorii de creștere, activarea TGF- β latent, dependentă de MMP-9, ar putea furniza un mecanism care stă la baza caracterului malign în câteva tipuri de tumori. (Stamenkovic, 2000)

Recentele rezultate ridică o nouă serie de intrebari care ar putea constitui cercetări interesante în viitor și care ne-ar putea aduce mai aproape de un posibil efect terapeutic.

Concluzii

Diseminarea neoplazică este un proces complex și înalt reglat care implică multiple interacții tumora-gazdă. Printre acestea, creșterea tumorală, angiogeneza, adeziunea celulară și proteoliza sunt mecanismele cele mai importante și cele mai bine caracterizate. Datorită informației în acest domeniu din ultimii ani, s-a inițiat întelegerea semnificației matrixinelor în biologie și patologie. Acțiunile matrixinelor in vitro sunt complexe și diverse, ele nu sunt rezumate la simplul colaps al ECM, ci chiar mai mult, ele ar putea releva funcții biologice criptice ale macromoleculelor ECM. Ambele concepte trebuie luate în considerare pentru întelegerea alterării la timp a mediilor celulare necesare în dezvoltarea normală și morfogeneza. Se anticipează de asemenea descoperirea unor noi reprezentanti MMPs, care vor introduce complexitate în catabolismul matricei extracelulare. O astfel de descoperire ne va ajuta la elucidarea unor mecanisme mai precise ale turnoverului matricei tisulare. Analize structurale și funcționale detaliate ale MMPs au condus la dezvoltarea unui număr mare de potențiali inhibitori sintetici ai matrixinelor, și câțiva se află încă în studii clinice. Astfel de agenți ar putea fi de o mare importanță terapeutică, dar grija oamenilor de stiinta si clinicienilor este orientata spre consecințele sistemice ale inhibiției matrixinelor funcționale biologic și al ADAMs înrudite. Studii alternative sunt oferite de terapia genică pe țesuturi ce au drept țintă TIMPs care inhibă selectiv MMPs specifice.

Astfel de agenti ar fi de mare importanță nu numai pentru înțelegerea biologiei de bază a matrixinelor și a turnoverului lor, dar și pentru intervenția în diferite boli rezultate din degradarea aberantă a ECM.

Care este deci viitorul inhibitorilor MMP în tratamentul cancerului? În acest moment, soarta lor pare să fie în mâinile companiilor farmaceutice, implicate in toate deciziile de a investi în teste clinice costisitoare. Un lucru este însă clar, e nevoie de multă muncă. Cercetătorii trebuie să facă eforturi deosebit de mari pentru dezvoltarea și validarea încercărilor de identificare a unor tumori care să exprime enzimele de interes, și pentru evaluarea eficacității unor compuși specifici și a unor doze optime care să reducă activitățile proteolitice asociate tumorilor. Ei trebuie să continue cu studiile preclinice, pentru a determina rolul specific al MMPs în stadii specifice ale progresiei tumorii. Deasemenea, au oportunitatea de a folosi date clinice disponibile deja, pentru evaluarea valabilității unor noi modele de tip animal cu boli studiate (precum cancer pulmonar cu celule mari), cu scopul de a prevedea rezultatul clinic. Cercetătorii clinicieni trebuie să-și focuseze atenția asupra îmbunătățirii modului de desfășurare a testelor, pentru a ajuta agenții cu activitate de distrugere a celulelor tumorale. În cele din urmă, agențiile guvernamentale precum NIH sau Institutul Național de Cancer, care conduc cele mai multe teste clinice, sau FDA (Food Drug Administration) care reglează procesele de implementare clinică a medicamentelor, trebuie să recunoască nevoia de obținere a unor rezultate clinice relevante. Aceste agenții trebuie să continue efortul lor de implementare a unor terapii împotriva cancerului, cat și munca adresată creșterii numărului de pacienți care intră în testele clinice. Lacunele existente momentan între cercetători, industria farmaceutică și alte agenții, se pot închide printr-o comunicare eficientă și prin realizarea faptului că toți aspirăm la un țel comun. Dacă MMPIs vor deveni într-adevăr un tel în terapia cancerului, nu se știe încă sigur. Lecțiile învățate însă din experimentele cu MMPI sunt folositoare pentru a avansa în aplicarea de noi generații de terapii citostatice în tratamentul cancerului.

BIBLIOGRAFIE

Borden P, Solymar D, Sucharrczuc, Lindman B, Cannon P, Heller RA, Cytokine control of interstitial collagenase and collagenase-3 gene expression in human chondrocytes. J Biol Chem, 271, 23577-23581, 1996 Asa trebuie

Cao Jian, Zucher Stanley, Biology and Chemistry of MMPs

Castells Antoni, Rustgi Anil K , Tumor Invasion and Metastasis, 2002

Coussens M. Lisa, Fingleton Barbara, Matrisian M. Lynn, Matrix Metalloproteinases Inhibitors and Cancer:Trials and Tribulations, 2002

Cowdry, 1955

Cox G., Steward W.P., O’Byrne K.J., The plamsin cascade and matrix metalloproteinases in non-small cell lung cancer, 1999

De Souza Ana Paula , Peres Line Sergio Roberto, The Biology of Matrix Metalloproteinases, 2002

Edwards DR, Murphy G, Reynolds JJ. , Transforming growth factor beta modulates the expression of collagenase and metalloproteinase inhibitor. EMBO J, 6, 1899-1904, 1987

Frisch SM, Reich R, Collier IE, Genrich LT, Martin G, Goldberg GI, Adenovirus E1A represses protease gene expression and inhibits metastasis of human tumor cells. Oncogene, 5, 75-83, 1990

Giavazzi R., Garofalo A., Ferri C. et al, Batimastat, a synthetic inhibitor of matrix metalloproteinases, potentiates the antitumor activity of cisplatin in ovarian carcinoma xenografts, Clin Cancer Res 4:985-992, 1998

Guerin E, Ludwig MG, Basset P, Anglard P., Stromelysin-3 induction and interstitial collagenase repression by retinoic acid. J Biol Chem, 272, 11088-11095, 1997

Herold Tiffany, Metalloproteinases, 2002

Hijova E., Matrix metalloproteinases: their biological functions and clinical implications,127-132, 2005

Hoekstra R., Eskens F.A.L.M., Verweij J., Matrix Metalloproteinases Inbitors:Current Developments and Future Prospects, 2001

Jackon Chris , Matrix Metalloproteinases and Angiogenesis, 2002

Jonat C, Rahmsdorf HJ, Park KK., Antitumor promotion and antiinflammation: Down-modulation of AP-1 (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone. Cell, 62, 1189-1194, 1990

Lafyatis R, Kim SJ, Angel P, Roberts AB, Sporn MB, Karin M, Wilder RL, Interleukin-1 stimulates and all-trans-retinoic acid inhibits collagenase gene expression through its 5’ activator protein-1-binding sites. Mol Endocrinol, 4, 973-980, 1990

Liotta A. Lance, Kohn C. Elise, Invasion and Metastasis, Revista, volumul, pagini, anul

Magdolen Ulla, Krol Janna, Sato Sumito, Mueller M. Markus, Sperl Stefan, Kruger Achim, Schmitt Manfred, Magdolen Viktor, Natural inhibitors of tumor-associated proteses,2002

Mareel Marc , Leroy Ancy, Clinical, Cellular and Molecular Aspects of Cancer Invasion, 2002

Matrisian LM, Metalloproteinases and their inhibitors in matrix remodeling. Trends Genet, 6, 121-125, 1990

Matrisian LM, The matrix-degrading metalloproteinases. Bioessays, 14, 455-463, 1992

Nagase Hideaki, Frederick Woessner J., Matrix Metalloproteinases, 1999

Nelson R. Amy, Fingleton Barbara , Rothenberg L. Mace, Matrisian M. Lynn, MMPs:Biologic Activity and Clinical Implication, 2000

Rothenberg L. Mace, Nelson, R. Amy, Hande R. Kenneth, New Drugs on the Horizon:Matrix Metalloproteinases Inhibitors, 1998

Stamenkovic Ivan , MMPs in tumor invasion and metastasis, 2000

Stamenkovic Ivan , ECM remodelling:the role of MMPs, 2003

Stetler-Stevenson G. William, MMPs in angiogenesis:a moving target for therapeutic intervention, 1999

Stetler-Stevenson G. William, Anita E.Yu, Proteases in invasion:MMPs,2000

Strongin Alexander, MMPs:Spatial and Temporal Control of ECM Proteolysis in Cancer,2002

Van den Steen E. Philippe, Opdenakker Ghislain, Wormald R. Mark, Dwek A. Raymond, Rudd M. Pauline, Matrix remodelling enzymes, the protease cascade and glycosylation, 2001

Verstappen, J.W.von den Hoff, TIMPs:their biological functions and involvement in oral disease, 2006

Visse Robert, Nagase Hideaki, MMPs and Tissue Inhibitors of MMPs, 2003

Walker B., J.E.Lynos, Strategies for the inhibition of serine proteases, 2001

http://www.abcam.co.jp/index.html?pageconfig=resource&rid=11034&pid=10628

www.romaniancancerleague.org/ro/aboutcancer.php

http://en.wikipedia.org/wiki/Angiogenesis

http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer

http://en.wikipedia.org/wiki/Metastasis

http://www.nccr-oncology.ch/scripts/index.aspx?idd=110

http://www.scielo.br/img/revistas/jbpml/v43n6/a09fig01.gif

http://www.wentek.com/jean/method.jpg

http://www.answers.com/topic/metastasis?cat=health

http://140.116.60.1/lin5612/microimm/93semi/clee.htm

BIBLIOGRAFIE

Borden P, Solymar D, Sucharrczuc, Lindman B, Cannon P, Heller RA, Cytokine control of interstitial collagenase and collagenase-3 gene expression in human chondrocytes. J Biol Chem, 271, 23577-23581, 1996 Asa trebuie

Cao Jian, Zucher Stanley, Biology and Chemistry of MMPs

Castells Antoni, Rustgi Anil K , Tumor Invasion and Metastasis, 2002

Coussens M. Lisa, Fingleton Barbara, Matrisian M. Lynn, Matrix Metalloproteinases Inhibitors and Cancer:Trials and Tribulations, 2002

Cowdry, 1955

Cox G., Steward W.P., O’Byrne K.J., The plamsin cascade and matrix metalloproteinases in non-small cell lung cancer, 1999

De Souza Ana Paula , Peres Line Sergio Roberto, The Biology of Matrix Metalloproteinases, 2002

Edwards DR, Murphy G, Reynolds JJ. , Transforming growth factor beta modulates the expression of collagenase and metalloproteinase inhibitor. EMBO J, 6, 1899-1904, 1987

Frisch SM, Reich R, Collier IE, Genrich LT, Martin G, Goldberg GI, Adenovirus E1A represses protease gene expression and inhibits metastasis of human tumor cells. Oncogene, 5, 75-83, 1990

Giavazzi R., Garofalo A., Ferri C. et al, Batimastat, a synthetic inhibitor of matrix metalloproteinases, potentiates the antitumor activity of cisplatin in ovarian carcinoma xenografts, Clin Cancer Res 4:985-992, 1998

Guerin E, Ludwig MG, Basset P, Anglard P., Stromelysin-3 induction and interstitial collagenase repression by retinoic acid. J Biol Chem, 272, 11088-11095, 1997

Herold Tiffany, Metalloproteinases, 2002

Hijova E., Matrix metalloproteinases: their biological functions and clinical implications,127-132, 2005

Hoekstra R., Eskens F.A.L.M., Verweij J., Matrix Metalloproteinases Inbitors:Current Developments and Future Prospects, 2001

Jackon Chris , Matrix Metalloproteinases and Angiogenesis, 2002

Jonat C, Rahmsdorf HJ, Park KK., Antitumor promotion and antiinflammation: Down-modulation of AP-1 (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone. Cell, 62, 1189-1194, 1990

Lafyatis R, Kim SJ, Angel P, Roberts AB, Sporn MB, Karin M, Wilder RL, Interleukin-1 stimulates and all-trans-retinoic acid inhibits collagenase gene expression through its 5’ activator protein-1-binding sites. Mol Endocrinol, 4, 973-980, 1990

Liotta A. Lance, Kohn C. Elise, Invasion and Metastasis, Revista, volumul, pagini, anul

Magdolen Ulla, Krol Janna, Sato Sumito, Mueller M. Markus, Sperl Stefan, Kruger Achim, Schmitt Manfred, Magdolen Viktor, Natural inhibitors of tumor-associated proteses,2002

Mareel Marc , Leroy Ancy, Clinical, Cellular and Molecular Aspects of Cancer Invasion, 2002

Matrisian LM, Metalloproteinases and their inhibitors in matrix remodeling. Trends Genet, 6, 121-125, 1990

Matrisian LM, The matrix-degrading metalloproteinases. Bioessays, 14, 455-463, 1992

Nagase Hideaki, Frederick Woessner J., Matrix Metalloproteinases, 1999

Nelson R. Amy, Fingleton Barbara , Rothenberg L. Mace, Matrisian M. Lynn, MMPs:Biologic Activity and Clinical Implication, 2000

Rothenberg L. Mace, Nelson, R. Amy, Hande R. Kenneth, New Drugs on the Horizon:Matrix Metalloproteinases Inhibitors, 1998

Stamenkovic Ivan , MMPs in tumor invasion and metastasis, 2000

Stamenkovic Ivan , ECM remodelling:the role of MMPs, 2003

Stetler-Stevenson G. William, MMPs in angiogenesis:a moving target for therapeutic intervention, 1999

Stetler-Stevenson G. William, Anita E.Yu, Proteases in invasion:MMPs,2000

Strongin Alexander, MMPs:Spatial and Temporal Control of ECM Proteolysis in Cancer,2002

Van den Steen E. Philippe, Opdenakker Ghislain, Wormald R. Mark, Dwek A. Raymond, Rudd M. Pauline, Matrix remodelling enzymes, the protease cascade and glycosylation, 2001

Verstappen, J.W.von den Hoff, TIMPs:their biological functions and involvement in oral disease, 2006

Visse Robert, Nagase Hideaki, MMPs and Tissue Inhibitors of MMPs, 2003

Walker B., J.E.Lynos, Strategies for the inhibition of serine proteases, 2001

http://www.abcam.co.jp/index.html?pageconfig=resource&rid=11034&pid=10628

www.romaniancancerleague.org/ro/aboutcancer.php

http://en.wikipedia.org/wiki/Angiogenesis

http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer

http://en.wikipedia.org/wiki/Metastasis

http://www.nccr-oncology.ch/scripts/index.aspx?idd=110

http://www.scielo.br/img/revistas/jbpml/v43n6/a09fig01.gif

http://www.wentek.com/jean/method.jpg

http://www.answers.com/topic/metastasis?cat=health

http://140.116.60.1/lin5612/microimm/93semi/clee.htm