Membrii Familiei Enterobacteriaceae

CAPITOLUL II

Membrii familiei Enterobacteriaceae sunt deseori implicați în diferite boli infecțioase gastrointestinale, inclusiv intoxicații alimentare, care pot fi fatale în cazul pacienților imunodeprimați în absența unui tratament corespunzător.

Scopul acestei lucrări a fost caracterizarea la nivel fenotipic și genotipic unor tulpini aparținând familiei Enterobacteriaceae, izolate din produse alimentare, sau de la nivelul suprafețelor de procesare a acestora, cu rolul de a evalua riscul microbiologic al acestor tulpini în sănătatea publică.

În vederea atingerii scopului propus, obiectivele acestei lucrări au fost următoarele:

izolarea și identificarea tulpinilor din alimente și de pe suprafețele de procesare a acestora;

evidențierea fenotipică a expresiei factorilor de virulență enzimatici produși de tulpinile izolate;

determinarea capacității de aderență a tulpinilor testate la substrat inert și formare de biofilme;

testarea capacității de aderență a tulpinilor analizate la substrat celular;

determinarea patternului de rezistență al acestor tulpini la antibiotice.

2.1. MATERIALE ȘI METODE

MATERIALE

Materialul biologic

Materialul biologic a fost reprezentat de tulpini bacteriene izolate din alimente și de pe suprafețe de procesare a acestora, provenite de la Direcția de Sănătate Publică, București.

Alte materiale:

coloranți și reactivi: soluție Violet de Gențiană, soluție Lugol, soluție alcool – acetonă, soluție fuxină/ safranină, soluție cristal violet, soluție Giemsa, Tween 80, metanol, acid acetic glacial, NaOH 0,05N, SDS

Apă, TFS

Ulei de imersie

Medii: geloză sânge, geloză cu adaos de cazeină și gelatină, agar cu adaos de 1%Tween, agar cu esculină și citrat de fer, agar cu gălbenuș de ou, agar cu amidon, Muller – Hinton

Gel de agaroză

Mix de reacție PCR

Hârtie filtru, hârtie filtru pentru testul oxidazei

Tampoane vată sterile

Lame, plăci Petri, plăci plastic cu 96 de godeuri, tuburi Eppi

Ansă metalică, ansă cu fir de platină

Tanc cu dezinfectanți

Discuri antibiotice: CN (10μg), STX (1.25/23.75μg), AMP (10μg), AMC (20/10μg), TE (30Μg), CTX (30μg), CAZ (30μg), IMP (10μg), AK (30μg), TOB (10μg), CIP (5μg), MA (30 μg)

Galerii API rapid ID 32 E

Hotă cu UV

Microscop optic

Butelie gaz (butan/ propan)

Spectrofotometru TECAN Apollo LB 911 Berthold

Termostat

METODE

a) Izolarea și identificarea tulpinilor de enterobacterii din alimente și de pe suprafețele de procesare ale acestora

Izolarea tulpinilor bacteriene a fost realizată în concordanță cu standardele: SR ISO 18593:2007 (Metode orizontale privind tehnicile de eșantionare de pe suprafețe folosind plăci de contact și tampoane), SR ISO 4831:2009 (Metodă orizontală pentru detectarea și enumerarea bacteriilor coliforme. Tehnica numărului cel mai probabil), SR ISO 4832:2009 și SR ISO 21528-2:2007 (Metoda orizontală pentru detecția și enumerarea Enterobacteriaceaelor. Partea 2: Metoda de enumerare a coloniilor) și nu în ultimul rând SR ISO 16649-2:2007 (Metoda orizontală pentru enumerarea coloniilor de Escherichia coli beta-glucuronidază pozitive. Tehnica de numărare a coloniilor la 44°C, folosind membrane și 5-bromo-4-cloro-3-indolil beta-D-glucuronat) (Mitache, 2010).

Identificarea tulpinilor bacteriene – s-a realizat pe baza examinării caracterelor de cultură și colonie (morfologia coloniilor, dimensiunea), determinarea caracterului Gram, identificarea unor caractere biochimice folosind teste biochimice convenționale (oxidaza) și sisteme de identificare biochimică standardizate API (bioMérieux, Franța).

Colorația Gram:

Principiul metodei: se utilizează coloranții bazici (violetul de Gențiană), care pătrund în celula bacteriană și reacționează cu componentele citoplasmatice acide, formând după tratarea cu soluție Lugol un complex intracelular macromolecular, care rămâne sechestrat pe durata decolorării cu alcool – acetonă în interiorul celulelor Gram – pozitive, în timp ce la bacteriile Gram – negative complexul intracelular se elimină, probabil prin porii rezultați în urma solubilizării lipidelor din structura peretelui celular sub acțiunea agentului decolorant. Astfel, celulele Gram – negative trebuie recolorate cu un colorant de contrast (fuxină sau safranină) pentru a putea fi vizualizate.

Etapele colorației sunt următoarele:

 Realizarea unui frotiu dintr – o cultură bacteriană tânără în vârstă de 18 – 24h (culturile vechi își pierd afinitatea pentru coloranți) fixat la flacără;

 Se acoperă frotiul cu soluție de violet de Gențiană (soluție hidroalcoolică fenicată 1%) și se lasă să acționeze 2 minute, după care preparatul se spală cu apă de robinet;

 Se mordansează frotiul cu soluție Lugol 1:2:300 (I2:KI:apă distilată) care acționează un timp dublu față de violetul de Gențiană (4 minute); frotiul nu se spală înainte de etapa următoare;

 Decolorarea cu amestec alcool: acetonă (3:1, vol:vol), ce acționează un timp foarte scurt (5 – 7 secunde), după care acțiunea decolorantului este oprită prin spălare abundentă cu apă de robinet;

 Recolorare cu safranină sau fuxină 1/10 (diluția colorantului se va face extemporaneu) timp de 1 minut;

 Preparatul se usucă la temperatura camerei/cu hârtie de filtru și se examinează la microscop cu obiectivul de imersie.

Interpretarea colorației: dacă frotiul este realizat dintr-o suspensie mixtă de microorganisme sau provine dintr – un produs patologic, în urma colorației Gram se vor observa pe frotiu elemente colorate diferit: elementele Gram – pozitive apar colorate în violet, iar elementele Gram – negative apar colorate în roșu (decolorate și recolorate cu colorantul de contrast).

Teste biochimice convenționale

Testul oxidazei

Prin intermediul testului oxidazei se detectează citocromul c, o enzimă localizata în membrana plasmatică ce face parte din lanțul respirator.

Banda de hârtie de filtru impregnată cu oxalat de dimetil – parafenilen – diamină (aceeptor final de e-) se depune pe o lamă microscopică curată și se adaugă apă fiziologică sterilă. Ulterior, cu ajutorul ansei cu fir de platină sau al unei pipete Pasteur închise (se evită folosirea ansei cu fir metalic), se depune sub formă de spot cultura bacteriană dezvoltată pe un mediu fără zaharuri.

Apariția culorii albastre într-un interval de cel mult 30 de secunde, indică o reacție pozitivă. Virarea culorii hârtiei de oxidază tardiv în albastru nu se consideră reacție pozitivă.

Identificare cu ajutorul galeriilor API rapid ID 32 E. Aceste sisteme permit identificarea concomitentă a unui număr mare de caractere biochimice cu consum minim de materiale și de inocul microbian.

Galerii Api conțin 32 de microtuburi cu substraturi deshidratate pentru punerea în evidență a activității enzimatice sau a fermentației zaharurilor. Pe parcursul incubării au loc reacții metabolice și datorită acestora se produc modificări ale culorii evidențiate prin virajul indicatorului de pH sau prin adăugarea de reactivi suplimentari. Virajul direct al culorii mediului sau după adăugarea anumitor reactivi denotă pozitivitatea testelor, bazate pe principiul testelor biochimice clasice.

Microtuburile au fost inoculate cu 55 μl suspensie microbiană 0,5 McFarland realizată dintr-o cultură de 24 de ore și incubate timp de 4 ore la 37°C.

Interpretarea rezultatelor s-a realizat cu ajutorul Tabelului de citire, identificarea fiind obținută prin consultarea Index Profil Analitic.

Testele pozitive primesc un anumit punctaj. Prin însumarea acestui punctaj pe grupe de teste se obține un număr final, alcătuit din mai multe cifre, care corespunde în catalogul de identificare unei anumite specii bacteriene.

b) Evidențierea capacității de aderență a tulpinilor testate la substrat inert și formarea de biofilme

100 µl suspensie bacteriană 0,5 McFarland din culturi de 24 ore a fost inoculată în plăci de plastic cu 96 de godeuri și incubată la 37°C timp de 24h, 48h și respectiv 72h. După incubare, conținutul godeurilor a fost îndepărtat, godeurile au fost spălate de 3 ori cu tampon fosfat steril (TFS), fixate 5 minute cu metanol rece, uscate la temperatura camerei și colorate cu soluție cristal violet timp de 30 de minute. Resuspendarea colorantului s-a realizat cu acid acetic glacial, iar intensitatea culorii a fost cuantificată prin citirea absorbanței la 490 nm, utilizând spectrofotometrul TECAN Apollo LB 911 Berthold.

c) Evidențierea capacității de aderență la substrat celular ( celule HeLa)

Culturile de celule HeLa au fost furnizate de Institutul de Virusologie Ștefan S. Nicolau din București. Au fost utilizate celule diploide umane (HeLa), menținute în cultură în mediu DMEM (Dulbecco’s Modified Essential Medium-Sigma-Aldrich, SUA), suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (Sigma-Aldrich, SUA) și incubate la 37°C în atmosferă umedă.

S-a adăugat câte 1 ml de suspensie bacteriană (la densitate standard 0,5 McFarland) peste monostratul celular, după îndepărtarea mediului de creștere și spălarea (de 3ori) cu mediu fără antibiotice.

După repartizarea suspensiilor bacteriene peste monostratul celular, godeurile au fost incubate 2 ore la 37°C, timp în care bacteriile au aderat la suprafața celulelor substratului. Ulterior, monostratul celular a fost spălat de trei ori cu tampon fosfat salin (TFS), fixat 5 minute cu metanol și colorat cu soluție Giemsa (1:10). Plăcile au fost examinate la microscopul optic (100X). S – a determinat patternul de aderență (localizat, difuz sau agregativ) și indicele de aderență reprezentat prin raportul dintre numărul de celule care prezintă bacterii aderate și numărul total de celule.

d) Evidențierea fenotipică a expresiei de factori enzimatici solubili implicați în virulență

Expresia factorilor enzimatici solubili de virulență a fost determinată cu ajutorul a opt teste enzimatice care au urmărit punerea în evidență a următoarelor enzime: hemolizine, amilază, cazeinază, gelatinază, producerea de esculinază, DN-ază, lipază și lecitinază.

Producerea de hemolizine

Hemolizinele sunt substanțe de origine vegetală, animală, microbiană sau de natură imună, caracterizate prin proprietatea de a descompune și dizolva globulele roșii, eliberând astfel hemoglobina. Tulpinile au fost însămânțate pe geloză cu adaos de 5 % sânge de oaie și incubate la 37°C, timp de 24 h. După incubare, apariția unei zone de hemoliză în jurul culturii microbiene, indică producerea de hemolizine.

Producerea de proteaze (cazeinază și gelatinază)

Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză cu adaos de cazeină 15% , respectiv gelatină 3%. După incubare la 37° C, timp de 72h, producerea de proteaze a fost indicată de apariția în jurul spoturilor de cultură a unor zone de precipitare datorită formării paracazeinatului de calciu și respectiv de halouri transparente datorită lichefierii gelatinei.

Producerea de lipază

Tulpinile bacteriene au fost însămânțate în spot pe agar cu adaos de 1% Tween 80 și incubate 72h la 37°C. Prezența unei zone opace de precipitare în jurul spotului de cultură a fost considerată reacție pozitivă. Apariția acesteia este determinată de formarea cristalelor de oleat de calciu insolubile (cristale formate între acizii grași eliberați și Ca 2+).

Hidroliza esculinei

Esculina este hidrolizată la glucoză și esculetol. În prezența citratului de Fe (FeC6H5O7) din mediu, esculetolul eliberat sub acțiunea unei beta-galactozidaze generează formarea unui precipitat negru de esculetină ferică, compus din Fe fenolic cu structură chimică incertă. Tulpinile au fost însămânțate în spot pe mediu cu adaos de 1% esculină și cu citrat de fier. După incubare la 37°C, timp de 72 de ore, în urma hidrolizei esculinei, se formează esculetolul care, combinându-se cu sărurile de fier din mediu (citrat feric amoniacal 1%), determină înnegrirea mediului.

Producerea de lecitinază

Tulpinile au fost însămânțate în spot pe agar conținând gălbenuș de ou (2,5%) și incubate 72 de ore la 37°C. Apariția unei zone clare în jurul culturii microbiene a fost notată drept reacție pozitivă (producere de lecitinază).

Producerea de amilază

Amilazele se detectează utilizând o geloză simplă la care se adaugă amidon, iar hidroliza se relevă prin inundarea plăcii cu soluție Lugol (inel galben în jurul spotului de cultură, în timp ce restul mediului se colorează în albastru). Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză suplimentată cu 1% amidon. După incubare la 37°C, timp de 72 de ore, s-a realizat citirea plăcilor prin adăugare de soluție Lugol. Apariția unui inel galben în jurul spoturilor de cultură

s-a observat în cazul tulpinilor pozitive.

Producerea de DN-ază

DN-azele bacteriene acționează asupra ADN bacterian, eliberând mono- sau di-nucleotidele. Tuplinile au fost însămânțate în spot pe agar cu ADN (Merck, Germania) și albastru de toluidină și incubate la 37°C, timp de 72 de ore. Producerea de DN-aze a fost indicată de apariția unui halou roz în jurul culturii microbiene.

e) Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice al tulpinilor analizate

Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor analizate luate în studiu, s-a efectuat prin aplicarea metodei disc difuzimetrice Kirby-Bauer, urmând recomandările standardului Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2015. Pentru antibiogramă s-a folosit mediul Muller-Hinton turnat în plăci Petri (grosime 3-4 mm, pH= 7,2). Drept inocul a fost folosită o suspensie bacteriană realizată în apă fiziologică sterilă, cu o densitate de 0,5 Mc Farland= 1.5 UFC/ml efectuat dintr-o cultură de 18-24 de ore.

Mediul pentru antibiogramă a fost însămânțat ”în pânză” cu ajutorul tamponului de vată steril. Tamponul îmbibat în inocul, rotit și presat ușor pe pereții interiori ai tubului pentru îndepărtarea excesului de inocul, a fost descărcat pe suprafață prin mișcări orizontale și apoi verticale, finalizate cu descrierea unui cerc marginal.

Cu ajutorul unei pense sterile, discurile impregnate cu antibiotic au fost plasate pe suprafața mediului la o distanță de cel puțin 30 mm între centrele a două discuri vecine și la 15 mm de marginea plăcii. După depunere, discul a fost presat ușor cu pensa pentru a face contact intim cu suprafața mediului. Incubarea plăcilor se realizează timp de 16-18 h la 37°C cu capacul în jos.

Citirea rezultatelor s-a realizat prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție generate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. În cazuri de urgență clinică, se poate realiza o primă citire la 6-8 h de la incubare.

Interpretarea rezultatelor se face în funcție de dimensiunea zonelor de inhibiție, exprimând rezultatul cu termenii de sensibil (S), rezistent (R), sau intermediar (I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate și corespunzătoare metodei de lucru.

Termenii S, I, R definesc de fapt categoriile clinice de antibiotice, după cum urmează:

Categoria S, înseamnă ca există o mare probabilitate ca antibioticul respectiv, administrat în doze obișnuite, să elimine infecția (C.M.I are valori net inferioare celor ale concentrațiilor umorale obținute în urma administrării unei doze obișnuite);

Categoria I, înseamnă că există probabilitatea ca antibioticul respectiv să fie eficient in vivo prin administrarea locală sau prin realizarea de concentrații active mari la nivelul unor organe sau țesuturi (rinichi, ficat, căi biliare) la nivelul cărora a apărut procesul infecțios;

Categoria R înseamnă că, cel mai probabil, administrarea antibioticului respectiv nu va determina eliminarea agentului infecțios din organism (Lazăr și colab., 2004).

Antibioticele testate prin metoda difuzimetrică sunt prezentate în tabelul de mai jos (tabel 15).

Tabel 15. Antibioticele testate

f) Identificarea unor gene de virulență existente în tulpinile testate prin multiplex PCR

Tuplinile de enterobacterii au fost analizate pentru detecția genelor pldA și HelD cu rol în virulență. Secvența primerilor și condițiile de reacție sunt prezentate în tabelul 16 (Panus, 2012). S-a utilizat 20μl mix de reacție (PCR Master Mix 2x, Thermo Scientific) ce conține 1 μl ADN obținut în urma lizei termice a suspensiei bacteriene.

Etape PCR: Realizarea mixului de PCR prin amestecul într-un tub Eppi a 20 μl NaOH 0,05N cu soluție SDS 0,25%, ulterior adăugandu-i-se suspensia bacteriană;

Punerea amestecului in Termocycler timp de 15 min la 95°C;

Adaugarea a 180 μl tampon TE;

Centrifugarea timp de 3 minute la 13000 rpm;

Recuperarea supernatantului;

Depozitarea la temperatura de 4°C.

Tabel 16. Secvența primeri-lor utilizați pentru screening-ul unor factori de virulenta

2.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

2.2.1. Identificarea tulpinilor izolate din alimente și de pe suprafețele de procesare ale acestora

În urma testelor efectuate, cele 6 tulpini au fost identificate ca aparținând genului Citrobacter (2 tulpini) și genului Enterobacter (4 tulpini) (tabel 17, figura nr. 1).

Tabel 17. Caracteristicile tulpinilor supuse identificării

Fig. nr.1. Profilul biochimic al tulpinilor analizate a –d: Citrobacter sp., e,f: Enterobacter sp.

2.2.2. Evidențierea capacității de aderență a tulpinilor testate la substrat inert și celular și formarea de biofilme

Biofilmele reprezintă populații de microorganisme care aderă la o suprafață, fiind învelite de o matrice extracelulară alcatuită în principal din exopolizaharide, uneori legate de proteine și ADN extracelular. Existența microorganismelor sub forma biofilmelor conferă acestora rezistență la agenții antimicrobieni. Procesul de formare a biofilmelor este unul dinamic și care se desfășoară treptat, după cum urmează: (i) aderarea bacteriilor la suprafață, (ii) atașarea ireversibilă a acestora, (iii) dezvoltarea arhitecturii biofilmului, (iv) maturizarea agregatelor formate și (v) difuziunea acestuia. Formarea și dezvoltarea biofilmelor depind de: speciile bacteriene implicate, proprietățile suprafeței la care acestea aderă și de factorii extrinseci precum: cantitatea de nutrienți disponibilă, pH și temperatură (Donlan, 2002) pdf biofilm.

Importanța biofilmelor atât în domeniul medical, cât și în cel industrial reiese din frecvența infecțiilor survenite în urma formării acestora. De exemplu, în Statele Unite ale Americii, 80% dintre infecții sunt produse de biofilme (Janssens si colab., 2008).

În industria alimentară, biofilmele reprezintă o problemă mai ales în unitățile de producere și procesare a hrănii precum: procesarea și ambalarea fructelor de mare, procesarea laptelui, cărnii de pui și porc, și nu în ultimul rând la fabricarea berii, determinând numeroase pierderi economice. Acest lucru se datorează capacității bacteriilor de a adera la suprafețele ce intră în contact cu materiile prime, dar și rezistenței crescute la dezinfectanți. Formarea biofilmelor în unitățile din industria alimentară constituie un risc major întrucât standardele actuale nu prevăd norme de eradicare a acestora, fără a fi afectate alimentele procesate.

Controlul formării biofilmelor în unitățile de producere și procesare a alimentelor cuprinde atât metode convenționale, bazate pe utilizarea agenților chimici (dezinfectante, hipoclorit de sodiu), cât și metode moderne precum: ultrasonicarea, utilizarea enzimelor pentru distrugerea agregatelor și a bacteriofagilor.

Biofilmele prezintă un interes deosebit în contextul igienei produselor alimentare, de aceea s-au realizat multe studii pentru întelegerea mecanismelor care stau la baza formării lor și mai ales pentru a le preveni (Kumar și Anand, 1998). Tipul de materiale folosite pentru suprafețele cu care alimentele intră în contact (de exemplu, oțel inoxidabil, sticlă, cauciuc, poliuretan, teflon, cauciuc nitrilic butil și lemn), ar putea influența capacitatea de aderență a microorganismelor. Pe langă materialul în sine alte aspecte de design, cum ar fi sudura, articulații, colțuri, și designul echipamentului ar putea fi, de asemenea, factori importanți care influențează formarea biofilmelor. În afara acestor factori extrinseci, răspunsul specific al fiecărei tulpini bacteriene în raport cu un substrat se datorează probabil unor factori intrinseci legați de peretele bacterian, ca de ex. adezine, proteine ale peretelui celular, polimeri extracelulari (Srey si colab., 2013 ).

Luând în considerare aspectele economice ale problemei și având în vedere amploarea preocupărilor în acest domeniu, cu toate că nu reprezintă un indicator prevăzut de standardele aplicate astăzi, studiul capacității de adeziune a tulpinilor bacteriene izolate de pe suprafețele de prelucrare a alimentelor este în mod clar o necesitate pentru cercetare.

Toate tulpinile de Enterobacteriaceae izolate din alimente și de pe suprafețele de procesare ale acestora, din studiul nostru au prezentat într-o măsura mai mare sau mai mică capacitatea de a adera la un substrat inert și de a dezvolta biofilme (figura nr.2). Dintre tulpinile analizate, cele de Citrobacter sp. (cod 60 si 62) au fost mai slab aderente fata de restul tulpinilor. În ceea ce privește dinamica biofilmelor, se observă că pentru toate tulpinile analizate, biofilmul (bacteriile aderate și fixate la suportul inert) a atins gradul maxim de dezvoltare la 72 ore .

Fig. nr. 2. Reprezentarea grafică a dezvoltării biofilmelor la 24, 48 și 72 de ore

Capacitatea de aderare la un substrat a fost observată de asemenea și în cazul substratului celular, reprezentat de linia celulara HeLa. Toate tulpinile de enterobacterii analizate au fost capabile să adere la celulele HeLa, diferența înregistrându-se la nivelul patternului de aderență și al indexului de aderență. Patternul predominant este cel difuz, sau difuz-localizat (figura nr. 3, tabel 18), iar indicele de aderență înregistrat a prezentat valori diferite cuprinse între 10 si 100% (tabel 18).

Fig. nr. 3. Aderența la celule HeLa: (a) Control- celule HeLa; (b) Aderență difuză; (c) Aderență difuz-localizată

Tabel 18 Patternul și indicele de aderență al tulpinilor testate

Și în literatura de specialitate sunt prezentate informații cu privire la existența unor tulpini de E. coli care dezvoltă un pattern de aderență difuz (DAEC- diffusly adherent E. coli). Acestea reprezintă un grup heterogen de microorganisme cu un grad diferit de virulență și care se divid în 2 clase: tulpini ce prezintă adezine fimbriale (AFA) și cele care posedă o adezină implicată în aderența difuză și care constituie o potențială cauză a diareei infantile (O’Sullivan si colab., 2007).

De asemenea, se pare că tulpinile de DAEC, în mod similar tulpinilor de E. coli enteroagregative (EAEC- enteroaggregative E. coli) induc sinteza de IL-8 de către celulele epiteliale, o interleukina cu un rol important în declanșarea sindromului diareic, în mod special la copii, datorita efectului chemoatractant fata de neutrofile (Meraz si colab., 2007).

2.2.3. Evidențierea fenotipică a expresiei de factori enzimatici solubili implicați în virulență

Analiza factorilor enzimatici solubili demonstrează că tulpinile de enterobacterii analizate pot fi virulente și pot prezenta un risc pentru sanatate prin prezența următoarelor enzime: esculinază (83% dintre tulpini), urmată de cazeinază (33% dintre tulpini), a lecitinazei, lipazei, amilazei și beta-hemolizinelor (16%) (figura nr.4, tabel 19).

Fig. nr. 4 Reprezentarea producerii factorilor enzimatici de virulență de către tulpinile analizate

Tabel 19. Prezentarea factorilor enzimatici implicați în virulență

absenta enzimei, + -expresia enzimei, ++ nivel crescut de expresie a enzimei

Majoritatea tulpinilor testate au produs esculinază, enzima cu rol important în identificare. Prezența esculinazei este folositoare în mod special în identificarea familiei Enterobacteriaceae, dar și în diferențierea Listeriei și a streptococului de grup D de alți agenti patogeni.

Esculinaza sau beta-D-glucozidaza hidrolizează esculina la esculetin și glucoză. Esculetinul se remarcă prin legarea de ionii de fier și astfel se formează un complex cu implicații însemnate atât în creșterea bacteriilor, cât și în virulența acestora. Fierul este un compus esențial creșterii și virulenței microorganismelor. În mediul extracelular, fierul se află într-o formă care nu poate fi asimilată de către celula bacteriană, pentru absorbția acestuia fiind necesari sideroforii (precum transferina). S-a dovedit că agenții chelatori ai fierului pot fi fixați de esculetol, așa că esculinaza are un rol important în asimilarea fierului necesar activării unor gene bcteriene și exprimării unor factori de virulență (Chifiriuc si colab., 2011).

Cazeinaza este o enzimă proteolitică care hidrolizează cazeina, principala proteină din lapte. Numeroase studii au arătat că proteazele sintetizate de microorganismele patogene pot contribui la simptomele severe ale infecției.

Amilaza este o enzimă produsă de către numeroase microorganisme, capabilă de hidroliza amidonului. Aceasta este implicată în ruperea legăturilor diglucidice, rezultând astfel monozaharidele, necesare atât colonizării oricărui tip de substrat, dar și supraviețuirii bacteriilor.

Lecitinazele, lipazele și beta-hemolizinele se remarcă prin rolul lor de toxine formatoare de pori. Acestea acționează asupra structurii peretelui și membranei bacteriene, cu formare de pori, mecanism prin care are loc diseminarea infecției în organismul uman.

Însumate, prezența acestor enzime cresc potențialul patogen al bacteriei, fapt pentru care se impune efectuarea unui control riguros.

2.2.4. Determinarea patternului de rezistență al tulpinilor analizate

În ultimul deceniu, rata infecțiilor severe provocate de Enterobaceriaceae a crescut, determinând și o mărire a rezistenței tulpinilor față de antibioticele utilizate. Astfel, au fost izolate tot mai des, din spitale, mediu înconjurator, din locuințe și chiar din alimente tulpini caracterizate prin multirezistență la antibiotice (MDE-multidrug resistant Enterobacteriaceae).

Multirezistența enterobacteriilor asociată cu capacitatea de a produce beta-lactamaze de spectru larg (ESBL), nu fac decât să contribuie la formarea pan- rezistenței tulpinilor.

Deși bacteriile producătoare de ESBL de obicei erau izolate din mediul spitalicesc, recent s-a descoperit că acestea sunt prezente și în comunitate.

În ceea ce privește tulpinile MDE, s-a constat că rezervorul principal în cadrul habitatelor îl reprezintă atât omul, cât și animalele, în special cele care se află sub un tratament antimicrobian. Astfel, contaminarea apei și a alimentelor se poate face cu ușurință, ceea ce explică frecvența crescută a infecțiilor cu tulpini MDE, în urma consumului hranei preparate în casă (Pitout si colab., 2005). pdf MDE

Rezistența microorganismelor crește de cele mai multe ori concomitent cu schimbările vremii. În acest sens, este posibil să apară noi patogeni.

În consecință, având în vedere toate aceste aspecte, unul din obiectivele acestei lucrari a fost reprezentat de testarea rezistenței la antibiotice a tulpinilor izolate utilizând 12 antibiotice diferite, atât pentru a observa prevalența rezistenței sau sensibilității tulpinilor testate, cât și pentru identificarea celor care prezintă multirezistență. Tulpinile testate au fost însă sensibile la majoritatea antibioticelor, cu exceptia cefotaximului, la care 66% dintre tulpinile analizate au fost rezistente și amoxacilină-acid clavulanic, la care 33% dintre tulpini au prezentat rezistență (figurile nr. 5, 6).

CTX (cefotaxim), o cefalosporina de generația a treia, cu un spectru de activitate extins, este utilizat îndeosebi în cazul tulpinilor rezistente la penicilină. AMC (amoxacilina și acidul clavulanic), comercial denumit Augmentin este un tip de penicilină ce are efect bacteriostatic. Este utilizat în tratamentul a numeroase infecții bacteriene, însă utilizarea acestuia la scară largă a condus la creșterea rezistenței microorganismelor țintă.

Un studiu efectuat de Spitalul Universitar din Osijek(Croația) demonstrează că utilizarea excesivă și irațională a AMC-ului a determinat creșterea rezistenței membrilor familiei Enterobacteriaceae, în mod special în cazul speciei E.coli (50% dintre tulpini).

Fig. nr. 5. Patternul de rezistenta al tulpinilor analizate

Fig. nr. 6 Prezentarea tulpinilor rezistente la AMC și CTX.

2.2.5. Expresia la nivel molecular a unor factori de virulență

Studiul nostru la nivel genetic a vizat detectarea a două gene (pldA și helD) la 6 tulpini bacteriene care aparțin familiei Enterobacteriaceae, izolate din produse alimentare sau de pe suprafețele de procesare ale acestora.

Gena pldA codifică pentru o proteină de 35.0 KDa omoloagă cu o fosfolipază extramembranară de la Escherichia coli. Studiile realizate pe această genă au evidențiat faptul că ea codifică pentru fosfolipaza A extramembranară la Campylobacter coli.

Secvența de aminoacizi a enzimei PLA este compusă din 269 de resturi de AA și o secvență semnal de 20 AA, care orientează proteina prin membrană în timpul exportului sau transportului. Această enzimă hidrolizează legăturile acil-ester ale fosfolipidelor, având activitate de PLA1 și PLA2 și de asemenea are activitate de 1-acil și 2-acillizofosfolipază, precum și mono- și diacilglicerid lipază (Horrevoets și colab., 1989).

Gena HelD-helicaza codifică pentru helicaza IV bacteriană. Studiile realizate de Mendonca și colab (an). au arătat că aceasta nu este esențială pentru viabilitatea celulei bacteriene. Un studiu realizat pe o tulpină de E. coli defectivă pentru cele 2 gene: HelD și uvrD, a arătat că bacteriile care aveau gena HelD deletată nu au manifestat sensibilitate crescută la UV, însă au fost mai puțin rezistente la methylmetanosulfat (MMS) decât tulpina sălbatică. Experimentul a inclus și o supraexpresie a genei HelD care a semnalat faptul că supraexpresie medie a acestei gene este letală pentru celulă.

Proteina pldA poate fi privita ca un important factor de virulență, deoarece conferă bacteriei capacitatea de a liza diferite tipuri de celule ale gazdei, în timp ce helicaza IV, produsul genei helD facilitează diseminarea bacteriei prin degradarea AND extracelular acumulat în secretiile vâscoase (G. P. Ronald, 1994).

Pentru identificarea genelor pldA și helD, am efectuat electroforeza în gel de agaroză. În urma electroforezei, la niciuna din cele 6 tulpini nu a fost evidențiată bandă de migrare, ceea ce denotă ca genele vizate nu sunt exprimate de către acestea.

CONCLUZII

1. Tulpinile izolate din alimente si de pe suprafetele de procesare ale acestora au apartinut familiei Enterobacteriaceae.

2. Toate tulpinile analizate au avut capacitatea de a adera la substrat inert și celular și de a exprima anumiți factori de virulență, dovedind astfel ca pot fi responsabile de colonizarea unei gazde și determinarea unei infecții cronice, cât și de diseminarea infecției și ocuparea de noi nișe. Expresia factorilor de virulență nu a fost susținută și la nivel genetic.

3. Tulpinile analizate au prezentat rezistență doar față de amoxicilina – acid clavulanic și cefotaxim, fiind sensibile la restul antibioticelor testate.

Rezultatele studiului au arătat că tulpinile izolate din produsele alimentare și de pe suprafețele de prelucrare a acestora au potențial de a iniția o infecție în organismul gazdă, uman sau animal (datorită prezenței anumitor factori de virulență), precum și capacitatea de a persista în lanțul alimentar, datorita capacității lor de a adera la substratul inert și celular. Acest lucru crește riscul apariției unei boli gastrointestinale pe de o parte, iar pe de altă parte contribuie, prin alterarea produselor alimentare, la pierderi economice substanțiale. Deși aceste tulpini nu au prezentat un profil semnificativ de rezistență la antibiotice, se impune totuși monitorizarea eficientă a tuturor etapelor lanțului alimentar, pentru a se asigura că produsele care intră pe piață prezintă un risc minim pentru a produce o infecție la consumatori.