Matrice de Microelectrozi Pentru Determinarea Impendatei Celulelor Melanom

CUPRINS

INTRODUCERE

CAPITOLUL 1 NOȚIUNI TEORETICE

1.1 Anatomia și fiziologia tegumentului

1.1.1 Epidermul

1.1.2 Dermul

1.1.3 Melanocitul

1.2 Melanomul

1.2.1 Generalități și statistici

1.2.2 Factori de risc

1.2.3 Diagnostic

1.3.2 Proprietățile mediilor biologice

1.4 Biosenzor

1.4.1 Principiul de funcționare

1.4.2 Stadiul actual al biosenzorilor

1.5 Spectroscopia de impedanță electrochimică

1.5.1 Metoda spectroscopiei de impedanță electrochimică

1.5.2 Elemente de impedanță și circuite simple

1.5.3 Circuite echivalente

CAPITOLUL 2 DESCRIEREA DATELOR

2.1 Proiectarea și modelarea biosenzorului

2.1.1 Modelarea fizică a senzorului

2.2 Proiectarea tehnologiei de fabricație

CAPITOLUL 3 DESCRIEREA METODEI

3.1 Montajul experimental

3.2 Aparatura utilizată

CAPITOLUL 4 REZULTATE

CAPITOLUL 5 CONCLUZII ȘI DISCUȚII

BIBLIOGRAFIE

ANEXA I

ANEXA II

LISTĂ FIGURI

Figură 1.1 – Anatomia pielii [1] 4

Figură 1.2- Structura melanocitului în stadiul normal [3] 7

Figură 1.3- Date statistice pentru melanom [6] 8

Figură 1.4- Regula ABCDE pentru detectarea melanomului [8] 10

Figură 1.5- Modul de propagare a frecvențelor [15] 12

Figură 1.1.6– Definiția clasică a unui biosenzor [19] 16

Figură 1.7- Definiția impedanței [45] 23

Figură 1.8- Diagramele Bode și Nyquist a unui circuit în serie și unul în paralel [45] 25

Figură 1.9- Circuitul Randles [45] 26

Figură 2.1– Modelarea senzorului impedimetric (SEMulator 3D) 30

Figură 2.2- Realizarea măștilor 32

Figură 2.3- Masca M1- Definirea ariei utile senzorului 33

Figură 2.4 – Masca M2- Depunere metal (Aur)- definrea geometriilor electrozilor (RE, WE1, WE2, CE) 33

Figură 2.5- Masca M3- Depunere metal (Argint), electrodul de referință (RE) 33

Figură 2.6- Masca M4- Pasivare chimică 34

Figură 2.7- Masca M5- Canal microfluidic 34

Figură 2.8 – Camera de reacție 35

Figură 2.9- Semnele de aliniere utilizate pentru cele 5 măști 36

Figură 2.10- Senzorul impedimetric obținut 39

Figură 3.1- Montaj experimental: A- soluția de celule, B- ieșirile electrozilor (WE, CE, RE), C- electrozii de conectare specifici spectrometrului de impedanță, D- Spectrometru electric de impedanță, E- preluarea datelor pe un monitor 40

Figură 3.2- Spectrometru de Impedanță Electrochimică 41

Figură 4.1- Diagrama Nyquist 44

Figură 4.2- Circuitul Randles 44

Figură 4.3 – Diagrama Bode și faza în funcție de frecvență: cu albastru: variația modulului impedanței în funcție de frecvență, iar cu portocaliu variația fazei în funcție de frecvență 45

Figură 4.4 – Diagrama Cole-Cole 48

Figură 4.5 -Variația experimentală a impedanței în funcție de frecvență 49

Figură 4.6- Variația permitivității în funcție de frecvență 50

Figură 4.7 – Modelarea experimentală a comportamentului unui mediu redox și a unui mediu celular prin variația factorului Clausius – Mossotti cu frecvența 51

Figură 4.8 – Modelarea experimentală a indicelui de refracție 52

Figură 5.1- Preluare date cu modulul LMP9100 și controllerul SPIO-4 54

LISTĂ TABEL

Tabel 1-Articole bazate pe utilizarea biosenzorilor de electrochimici în aplicații clinice [24] 20

Tabel 2 – Elemente de impedanță utilizate pentru un sistem electrochimic [45] 27

Tabel 3 – Rezultate preluate- probă 61

Tabel 4 – Rezultate preluate- celule 62

Tabel 5 – Parametrii calculați- probă 63

Tabel 6 – Parametrii calculați- celule 64

LISTĂ ABREVIERI

INTRODUCERE

Pe parcursul acestei lucrări urmărim evoluția tehnologiei electronice ce își îndreaptă tot mai mult viziunea spre îmbunătățirea domeniului sănătății: diagnostic, monitorizare, terapie.

Nanotehnolgiile reprezintă forme fizice de exprimare a științelor la nivel nano, cu orientări vaste către domeniul biomedical, prin aplicații destinate diagnosticului.

Ingineria biomedicală înglobează principiile fizicii, chimiei, matematicii și pe cele inginerești cu scopul de a studia biologia și medicina cu aplicabilitate în aria sănătății. Bioingineria reprezintă un domeniu care elaborează concepte fundamenteale și cunoștințe de la nivel molecular până la nivel sistemic cu rolul de a dezvolta noi produse biologice, materiale, procese, implanturi, dispozitive electronice pentru diagnosticul, prevenirea și tratarea unor procese biologice anormale.

Ingineria medicală asociază un grup vast de subdomenii: biomecanică, biomateriale, electronică, mecatronică, biofizică, imagistică medicală, telemedicină, nanotehnologie, inginerie celulară tisulară și genetică. Mulțumită acestei diversități, bioinginerul are oportunitatea de a-și îndrepta atenția către un anumit subdomeniu. Aplicațiile bioinginerești, pe lângă multitudinea de arii de dezvoltare se axează și pe realizarea unor dispozitive medicale de diagnostic sau tratament.

Un dispozitiv medical este utilizat atât în diagnosticarea unor boli sau alte afecțiuni ale funcțiilor fiziologice, cât și în prevenirea sau tratarea unor boli. Imagistica medicală este un domeniu care permite investigarea unor părți din organism care nu pot fi vizibile cu ochiul uman, folosind mijloace ca: fluoroscopie, rezonanță magnetică nucleară, tomografie computerizată, ecografie, microscopie electronică, microscopie optică.

Scopul acestei lucrări constă în studiul experimental al fabricării unui dispozitiv pe baza unei matrici de microelectrozi, utilizat pentru investigarea impedanței celulare. În prima parte a lucrării voi prezenta partea teoretică a problematicii abordate, urmând ca în cea de a doua parte să definesc metoda abordată, proiectarea și modelarea senzorului utilizat și determinarea proprietăților dielectrice ale unor celule canceroase. Primul pas constă în evaluarea funcționării corecte a acestuia, urmând mai apoi investigarea diferitelor tumori melanom, extrase chirurgical. Țesutul biologic are proprietăți diferite în condiții medicale diferite. Metoda utilizată pentru caracterizarea proprietăților electrice este EIS: Spectroscopia de impedanță electrochimică, metodă care se bazează pe determinarea unei impedanțe totale atunci când este aplicat un curent alternativ, cu diferite frecvențe.

Capitolul 1 face referire la noțiunile generale privind teoria de bază necesară aplicației practice. Senzorul impedimetric obținut va fi utilizat pentru măsurători pe celule melanom, de aceea în prima parte a capitolului 1 am menționat partea de anatomie și fiziologie a pielii, incluzând și partea de melanocit. Am caracterizat câteva aspecte legate de cancerul de piele, deoarece munca viitoare se bazează pe diagnosticarea în timp real a melanomului. În continuarea acestui capitol de teorie, am amintit despre impedanța electrică a țesuturilor, partea de rezultate fiind axată pe măsurători de impedanță și tot aici am amintit proprietățile mediilor biologice, utile la analiza și interpretarea rezultatelor.

O noțiune specifică acestui proiect este biosenzorul, a cărui principiu de funcționare este important de menționat. Stadiul actual al dezvoltării în domeniul abordat este axat în principal pe aplicațiile medicale ale senzorilor electrochimici atât pe plan internațional cât și pe plan național. Privită în ansamblu, tema abordată presupune modelarea, simularea și fabricarea unui senzor impedimetric pentru aplicarea ulterioară în determinarea proprietăților unei soluții de celule melanom. Având în vedere cercetările anterioare și problemele apărute sau altfel spus nivelul actual de dezvoltare al biosenzorilor, am ajuns la concluzia că cel mai bun model ar fi un senzor impedimetric de tip IDMEA ( arie de microelectrozi interdigitați), valabil pentru caracterizarea celulelor prin metoda spectroscopiei de impedanță electrochimică.

Capitolul 2 este trecerea la partea practică a proiectului, în carea am menționat datele necesare utilizate la modelarea, simularea și fabricarea senzorului impedimetric. Partea practică a proiectului a fost realizată în cadrul Institutului Național de Cercetare și Dezvoltare IMT București. Am parcurs principalii pași folositori pentru varianta finală a IDMEA. Partea de simulare a fost realizată într-un modul Coventor și anume: SEMulator 3D, în care am schițat modelul senzorului dorit. Partea de modelare a fost realizată în programul CleWin5, unde am avut posibilitatea de a crea layout-uri necesare pentru procesul de fabricare. După stabilirea geometriei finale, a dimensiunilor și măștilor necesare, acest proiect de layout-uri se urmărește la proiectarea tehnologiei de fabricație, parte realizată automat, cu aparatura specifică, de către specialiștii din domeniu.

În capitolul 3 am menționat descrierea metodei de măsurare prin exemplificarea montajului experimental și caracterizarea aparaturii utilizate: Spectrometru de impedanță.

Capitolul 4 este rezultatul obținut în urma prelucrării datelor preluate prin metoda descrisă la capitolul anterior și explicarea acestora pe baza teoriei și a fenomenelor observate din graficele corespunzătoare.

Capitolul 5, de concluzii și discuții, stabilește stadiul actual la care am ajuns și planurile viitoare de aplicare a senzorului obținut.

Penultima parte cuprinde bibliografia studiată pe parcursul realizării acestui proiect de diplomă.

În final, am adăugat 2 anexe: Anexa I în care am prezentat caracteristicile principale ale aparaturii utilizate pentru procesul automat de microfabricație al senzorului, iar Anexa II folosită pentru a marca tabele cu rezultatele obținute.

. NOȚIUNI TEORETICE

Anatomia și fiziologia tegumentului

Tegumentul reprezintă interfața organismului cu mediul extern, cu o suprafață de 1,5-1,8 mp. Pielea, aflată într-un proces constant de reînnoire, reprezintă mai mult decât un simplu înveliș conjunctivo-epitelial, fiind cel mai greu organ al corpului uman: 3-4 kg.

Principalele funcții sunt de:

Protecție: protejează corpul împotriva agresiunilor de natură mecanică, fizică, chimică sau microbiană (provenite din mediul exterior) cu ajutorul mecanismelor imunologice și celulare, datorită permeabilității, rezistivității și flexibilității sale.

Transmisie: transmite informații între corp și exterior prin terminațiile nervoase (stimuli tactili, termali, de durere).

Termoreglare: reglarea temperaturii corpului (eliminarea căldurii, evaporarea sudorii și a substanțelor nocive)

Structura tegumentului este reprezentată de un strat bilamelar: epiderm și derm, sub care se află țesutul celular subcutanat.

Figură 1.1 – Anatomia pielii [1]

Epidermul

Epidermul este stratul extern, avascular. Acest strat este subțire, are în general o grosime de 0.005-0.5mm (grosimea variază cu zona corporală) și poartă rolul de barieră împotriva radiației, microbilor, speciilor chimice și în special împotriva pierderilor de apă. Epidermul este alcătuit dintr-un epiteliu stratificat și pavimentos, celulele sale fiind în permanentă regenerare, ciclul de înlocuire totală fiind de 28 de zile.

Este lipsit de vase de sânge, nutriția celulelor are loc prin difuzarea limfei interstițiale din derm, prin intermediul membranei bazale și prin spațiile înguste.

Epiderma este compusă în principal din keratinocite a căror funcție principală este de a emite keratină. Stratul intern este alcătuit din celule bazale ordonate corespunzător, iar la un număr de aproximativ 10 celule se află un melanocit- celulă producătoare de pigment. Unele celule bazale migrează către suprafața pielii formând stratul exterior- stratul cornos. Stratul cornos (SC) este stratul cel mai superficial. Grosimea stratului cornos variază în funție de zona corpului fiind aproximativ 15µm. Acesta are rolul de protecție datorită faptului că este compus din melanocite. Melanocitele elaborează pigment melanic, care, eliberat din ele, este stocat în celulele epidermice (stratul bazal) cît și în macrofagele dermice, devenind melanofore. La rasa neagră, melanocitele se află în tot stratul epidermic. Datorită acestui strat de melanocite radiațiile UV sunt absorbite și transformate în căldură, protejând astfel ADN-ul de efectele dăunătoare a radiației UV, care, la o expunere îndelungată conduce la formarea melenomului malign sau a altor tipuri de cancer de piele. Melanocitele nu se divid, iar odată cu vârsta numărul lor scade [1].

Celulele Langerhans – iși au originea în măduva hematogenă și sunt dispuse la nivelul epidermului. Pe suprafața lor există antigene ale complexului major de histocompatibilitate, cu funcția imunologică principală: captează și procesează antigenele exogene și le prezintă limfocitelor pentru activarea sistemului imun.

Celulele Merckel – își au originea în creasta neurală și pot fi localizate în diferite zone: fața volară a degetelor, patul unghial, zona genitală. Secretă factori nervoși de creștere (cele de la nivelul epidermului) și exprimă receptori pentru aceștia (cele de la nivelul dermului). Au ca funcție principală percepția senzațiilor fine [2].

Dermul

Dermul este o matrice alcătuită din fibre de colagen și elastină, fibroblaști, vase de sânge și structuri senzoriale, oferind pielii rezistență mecanică și elesticitate. Dermul este compus din 2 straturi: dermul papilar și dermul reticular. Populația celulară a dermului este constituită din fibroblaste, mastocite și limfocite.

Dermul papilar este subțire, alcătuit din țesut conjunctiv, capilare de sânge, fibre de elastină, reticulină și colagen.

Dermul reticular este format dintr-un strat gros de țesut conjunctiv, vase mari de sânge, fibre de colagen și elastină.

Fibroblastele sunt celulele cele mai numeroase din derm, cu rolul principal de producere a fibrei de colagen, elastină, reticulină, glicozaminoglicani, fibronectină.

Impedanța pielii poate fi măsurată neinvaziv între doi electrozi aplicând o tensiune scăzută în două puncte, se măsoară curentul și se compară cu tensiunea dată la intrare cu ajutorul legii lui Ohm.

Adâncimea de pătrundere a curentului în piele depinde de frecvență, distanța dintre electrozi, dimensiunea acestora și de proprietățile fizice ale țesutului studiat [2].

Melanocitul

Melanocitul este o celulă derivată din creasta neurală și migrează spre epiderm, ureche, ochi. Pot fi identificate în epiderm prin colorații imunohistochimice încă din săptămâna a 8-a de gestație și începând cu săptămâna 10 conțin melanozomi. Melanozomii care au în componența lor melanină, pot fi evidențiați prin microscopie electronică în timpul celei de-a 4-a luni de sarcină. Melanocitul arată ca o celulă stelată ce conține: aparat Golgi, mitocondrii, ribozomi, reticul endoplasmatic (Figură 1.2). La sfârșitul gestației, melanocitele active dermice dispar, iar unele sunt localizate pe cap, gât sau regiunea dorsală a extremităților distale. Melanocitul este localizat la nivelul stratului bazal, dar poate fi localizat și la nivelul dermului. Melanozomii sunt alcătuiți dintr-o membrană de care este atașată tirozinaza, iar în interior este stocată melanina de-a lungul unor striații fibroase [3].

Figură 1.2- Structura melanocitului în stadiul normal [3]

Principala funcție a melanocitelor este de a produce pigment melanic pe care îl transferă prin prelungirile dendritelor și are capacitatea de a sintetiza tirozina. Dimensiunile melanozomilor sunt cuprinse între 200 nm la indivizii albi și 1μm la negrii, însă expunerea excesivă la UV induce apariția unor melanozomi mari și la albi.

Principala funcție a melaninei este de a proteja pielea împotriva radiațiilor UV. Receptorii melanocitari, prezenți la nivelul membranei celulare sau intracelulare au rolul de a transmite un semnal la nivel celular în momentul legării cu diferiți liganzi. Transformarea malignă a melanocitelor este datorată și perturbării controlului prin anumite mecanisme ale keratinocitelor.

În procesul de melanomogeneză au loc 5 mecanisme importante și anume:

Scăderea interacțiunii cu keratinocitele

Perturbarea căii de semnalizare Notch

Creșterea numărului de receptori M-CaN, cu rol în proliferea necontrolată a melanocitelor

Creșterea activității metaloproteinazelor

Desprinderea melanocitelor de pe membrana bazală

Moleculele produse de keratinocit, care interacționează cu melanocitul sunt: αMSH (stimulează melanogeneza și protejeză melanocitele de efectele negative ale oxidului nitric), endotelinele (polipeptide cu rol de stimulare a mitozelor melanocitelor), βFGF (factor de creștere fibroblastic), SCF (citokină cu rol de ligand pentru receptorul c-Kit), HGF (factor de creștere hepatocitar). Melanocitele tumorale prezintă pe suprafață receptori pentru chemokine- molecule semnal pentru leucocite [3].

Melanomul

Generalități și statistici

Cancerul de piele sau altfel spus melanomul malign cutanat reprezintă o diviziune necontrolată a melanocitelor, ce sunt caracterizate de capacitatea de a invada alte țesuturi sănătoase din organism, atât prin invazie (creșterea directă pe țesuturi învecinate) cât și prin metastază (migrația celulelor spre zone mai îndepărtate din organism). Corpul uman este alcătuit din țesuturi, acestea fiind formate la rândul lor din milioane de celule. Fiecare țesut are arhitectura și structura celulară proprie și celulele sunt dispuse ordonat. Cancerul apare ca rezulatat al multiplicării dezordonate a celulelor. Celulele canceroase se divid în mod necontrolat și sunt incapabile să se organizeze, se înmulțesc și duc la creșterea în masă a țesutului, formând astfel tumora ce va avea caracteristicile unui țesut anormal [4].

Cancerul cutanat (de piele) a devenit cel mai frecvent tip de cancer întânlit la om. Statisticile arată că în ultimii 30 de ani, în Europa și SUA numărul cazurilor de melanom a crescut de aproximativ 4 ori. În stadiul de început melanomul este perfect vindecabil. În fază avansată, dacă melanomul este descoperit târziu, doar 15% din pacienți au o rată de supraviețuire de aproximativ 5 ani, iar când melanomul a metastazat în alte organe, pacienții au posibilitatea de supraviețuire doar până la 9 luni [5].

Figură 1.3- Date statistice pentru melanom [6]

În Figură 1.3 este observabil faptul că, în urma expunerii UV crește rata de incidență și sunt înregistrate tot mai multe decese.

Melanomul este clasat în urma studiilor ca fiind cel mai periculos cancer de piele și este responsabil de peste 75% din decesele cauzate de cancerul de piele. Rata incidenței în România este de 4,5 la 100.000 de persoane, iar rata incidenței pentru Europa este de 11,1 la 100.000 de persoane. Rata incidenței melanomului malign cea mai ridicată din Europa este în Elveția: 25,8 la 100.000 de persoane.

În România, în ceea ce privește rata mortalității datorită melanomului malign al pielii, au fost înregistrate în anul 2012, 364 de decese dintre care 189 de bărbați și 175 de femei, iar în anul 2014, au fost depistate 1.121 de cazuri de melanom malign.

Deși în ultimii ani rata de incidență a melanomului a crescut progresiv, mortalitatea a rămas la același nivel, datorită noilor metode de diagnostic dintre care dermatoscopia, biopsia, dar și a tratamentului chirurgical corect realizat [4].

De-a lungul anilor, în urma cercetărilor cu privire la melanom, a fost demonstrat faptul că, deși asprina nu este recomandată pentru prevenirea cancerului, există un risc scăzut de apariție a melanomului pentru femeile care luau aspirină în fiecare zi (American Cancer Society- Martie 2013).

Conform statisticilor înregistrate de Societate Americană de Cancer, în 2015 au fost diagnosticate 73.870 de noi cazuri de melanom invaziv. Tot în acest an, un număr de 9.940 de oameni au murit din cauza melanomului, dintre care 6.640 bărbați și 3.300 femei [5].

Factori de risc

Melanocitul normal are funcția principală de producere a pigmetului melanic, iar transformarea malignă a melanocitelor duc la formarea melanomului [7].

Principalii factori de risc în apariția melanomului cutanat sunt:

Prezența nevilor (aluniță) pigmentari: riscul dezvoltării melanomului este mai crescut la persoanele care au 100 de nevi decât la cele cu 10 nevi.

Factori de mediu: expunerea la razele solare UV sau utilizarea saloanelor de bronzat, cresc riscul de apariție al melanomului cu atât mai mult cu cât expunerea are loc în copilărie.

Factori ereditari: istoric familial de melanom- apariția melanomului la o rudă de gradul I crește riscul de a avea melanom.

Vârsta: riscul apariției melanomului crește odată cu vârsta, dar în același timp poate fi diagnosticat și la persoane cu vârsta sub 30 de ani.

Diagnostic

Diagnosticul se stabilește pe baza criteriilor clinice, după regulile ABCD ale Societății Americane a Cancerului de piele: A- asimetrie (o jumătate de aluniță nu se suprapune peste cealaltă), B- margini neregulate (marginile sunt zdrențuite, pătate), C- schimbarea culorii, D- diametru, prin aspectul histopatologic evidențiat de biopsie. Stadiul tumoral este foarte important și se poate determina cu ajutorul microscopului, evidențiind doi parametrii importanți: indicele Breslow- reprezintă grosimea melanomului și nivelul de invazie Clark- reprezintă adâncimea până la care a pătruns melanomul în țesut [8].

Figură 1.4- Regula ABCDE pentru detectarea melanomului [8]

Principala metodă de tratare a melanomului, cunoscută până în momentul de față o reprezintă îndepărtarea chirurgicală. Aceasta nu este cea mai bună metodă deoarece nu se cunoaște o bună delimitare a zonei nesănătoase și astfel, pentru siguranță, se îndepărtează și din zona țesutului sănătos [9].

Cercetătorii, de-a lungul timpului, au încercat să scadă rata mortalității datorită cancerului de piele, prin diferite încercări de diagnosticare timpurie și sigură. Mai mult decât atât, pe piață, au apărut câteva dispozitive pentru diagnosticarea melanomului, însă nu reprezintă o metodă precisă:

SIAscope: o tehnică neinvazivă de analiză spectrofotometrică intracutanată: dispozitivul de tip spectrofotometru emite lumină în vizibil și infraroșu, energia luminoasă este absorbită și cromoforii din straturile pielii răspund acestui stimul luminos cu emiterea unui anumit spectru de lumină, lumina reflectată este receptată de spectrofotometru, analizată de un program software ce are ca sarcină calculul cantității de lumină absorbită la diferite lungimi de undă. Melanina absoarbe lumina ultravioletă. Analiza imaginii preluate presupune observații cu privire la vasele de sânge și melanină. De exemplu, melanocitele identificate în adâncimea țesutului, pot indica posibilitatea apariției melanomului. Din măsurătorile spectrale, SIAscope extrage informații despre localizarea, cantitatea și distribuția de melanină, de colagen și hemoglobină din straturile pielii. Datele obținute sunt afișate pe ecranul SIAgraphs ca reprezentări grafice a informației digitale. Melanomul are un grafic caracteristic, astfel că, în funcție de graficul obținut acesta poate fi interpretat în comparație cu graficul pentru melanom sau pentru țesutul normal. Analiza imaginii nu oferă un diagnostic clinic complet, ci doar evidențierea unor informații ajutătoare pentru dermatologi [10].

Melafind: dispozitiv multispectral care se bazează pe algoritmi de clasificare a tumorii, după care implică procesul de biopsie pentru tumorile maligne. Tehnologia dispozitivului Melafind se bazează pe experiența medicilor dermatologi, deoarece oferă informații obiective despre leziunele cutanate pigmentate ce sunt analizate mai apoi de către specialiști. Acest dispozitiv este proiectat pentru a oferi medicilor informații suplimentare înaintea biopsiei și nu este un dispozitiv care poate determina un diagnostic clinic complet al melanomului. Leziunile sunt clasificate în pozitive (biopsie) sau negative (implică monitorizare). Dispozitivul poate fi utilizat pe alunițe cu dimensiunea între 2-22mm. Este o tehnică neinvazivă. Specialistul analizează imaginile și poate astfel interpreta gradul de dezorganizare și adâncimea aluniței, utile în determinarea pasului următor având în vedere diagnosticarea melanomului. Melafind este pus în practică în 125 de centre din U.S și 25 de centre din Germania. Costurile practicii medicale ce presupun închirierea și instruirea dispozitivului Melafind ajung la 7,500$ [11], [12].

Nevisense: primul dispozitiv bazat pe metoda spectroscopiei de impedanță electrică ce oferă un diagnostic obiectiv, prin detectarea neinvazivă a melanomului malign. Implică aplicarea unui curent electric neinvaziv la suprafața pielii. EIS (spectroscopia de impedanță electrică) este sensibilă la schimbări ale structurii celulare, orientarea celulelor, dimensiunea și tipul de celule. Țesutul biologic are proprietăți electrice diferite la diferite afecțiuni medicale, fiind astfel posibilă detectarea melanomului. Spectroscopia de Impedanță Electrică SciBase este o tehnologie brevetată, studiată timp de 20 de ani la Institutul Karolinska Stockholm. Este o metodă îmbunătățită de extragere a informațiilor spectrale din profunzimea țesutului, cu ajutorul unui sistem de electrozi neinvaziv, care faciliteaza preciza colectării și analizei datelor. Acest dispozitiv este utilizat pentru a obține informații suplimentare, atunci când medicul are informații clinice și istorice caracteristice melanomului. Este o metodă ajutătoare pentru a ști dacă este nevoie de excizie, oferind informații referitoare la modificările structurale ale țesutului investigat [13], [14].

Caracteristici de bază ale țesutului

Impedanța electrică a țesutului

Impedanța electrică reprezintă o măsură de opoziție a unui material la fluxul curentului electric alternativ de frecvențe diferite. Impedanța electrică la nivel biocelular reflectă starea clinică a țesutului investigat. Țesutul anormal diferă de cel normal prin: forma celulelor, mărime și orientare, aceste proprietăți influențând capacitatea țesutului de a stoca energia electrică [15].

În general, impedanța la frecvențe joase este caracteristică în special proprietăților electrice ale mediilor extracelulare, pe când impedanța la frecvețe înalte este caracteristică pentru proprietățile electrice ale mediilor atât intra cât și extracelulare, dar și pentru proprietățile capacitive ale membranei celulare.

Membrana din jurul celulelor vii se comportă ca o membrană electrochimică, fiind semipermeabilă și permite doar anumitor ioni să treacă prin aceasta. Acest lucru face ca membrana să se comporte ca un capacitor. Mai mult decât atât, mediul intra și extracelular este alcătuit din electroliți și au ca și caracteristică principală proprietățile electrice. Astfel, atât suspensia celulară cât și țesutul biologic au proprietăți capacitive și rezistive, iar impedanța țesutului biologic depinde foarte mult de frecvență [15].

Diferite biomateriale dispun de proprietăți electrice caracteristice: structura țesutului și compoziția chimică a materialului biologic pot corela cu proprietățile electrice și astfel biomaterialele au caracteristici de frecvență diferite.

Spectrul de impedanță electrică a materialului biologic conține regiuni de frecvență unde impedanța descrește cu creșterea frecvenței și regiuni unde impedanța este constantă. Panta unde impedanța descrește cu frecvența corespunde procesului electrochimic specific sau științific vorbind, fenomenului de dispersie. Spectrul de bio-impedanță este reprezentat în diagrama Nyquist [16].

Impedanța la frecvențe joase (săgețile roșii) determină proprietățile rezistive ale mediului extracelular, iar impedanța la frecvențe înalte (săgețile albastre) este caracteristică atât pentru mediul extracelular cât și pentru definirea proprietățior capacitive ale mediului intracelular [15].

Figură 1.5- Modul de propagare a frecvențelor [15]

În Figură 1.5, se observă în primul rând diferența dintre țesutul normal și cel anormal, datorită gradului de ordonare al celulelor dar în același timp și aspectului celulelor: marime, formă.

Impedanța electrică a fost utilizată într-o gamă largă de aplicații clinice: diferențierea diferitelor tipuri de cancer, tomografie, compoziția corpului.

Impedanța electrică a țesuturilor vii cuprinde, în general, trei regiuni de frecvență unde impedanța electrică scade odată cu creșterea frecvenței separată de regiunea în care impedanța electrică este constantă.

Proprietățile mediilor biologice

Câmpul electric produs de o sarcină punctiformă în mediu omogen și izotrop

Poate fi reprezentat prin:

Suprafețele echipotențiale – suprafețe de potențial electric V constant, dispuse în jurul sarcinii, ortogonale pe liniile de câmp

Spectrul liniilor de câmp – fascicul de semidrepte care își au originea în locația sarcinii, orientarea fiind datorată polarității sarcinii.

Intensitatea câmpului electric E- mărime vectorială, orientată tangențial la linia de câmp.

[V] (1.3.2.1)

[V/m] (1.3.2.2)

q = sarcina electrică [C]

ε = permitivitatea electrică a mediului [F/m]

r = distanța: locația sarcinii punctiforme punctul de calcul

er = versorul orientat radial, ca și liniile de câmp

Câmpul electric produs de două sarcini punctiforme este deformat datorită interferenței cu spectrul celeilalte sarcini, fiind afectată și forma suprafețelor echipotențiale [17].

Dipolul electric: o perche de sarcini punctiforme egale și de polarități opuse, +q și –q aflate la o distanță d (destul de mică).

Momentul dipolar: produsul dintre sarcina electrică q și distanța dintre sarcini d, orientat de la sarcina negativă la cea pozitivă:

[Cm] (1.3.2.3)

q = sarcină punctiformă

d = distanța dintre sarcini

Câmp electric uniform

Produs între două plăci care sunt încărcate cu sarcini de polarități opuse, liniile de câmp sunt paralele și echidistante.

Intensitatea câmpului electric, E este constantă în tot spațiul dintre plăci.

Capacitatea dintre plăci:

[F] (1.3.2.4)

Între cele două plane avem un câmp electric:

(1.3.2.5)

Conducția electrică este fenomenul conform căruia atunci când este aplicat un câmp electric, electronii se deplasează în mod ordonat, în sens opus câmpului electric, sub acțiunea unor forțe Columbiene (F= -e E). Fluxul de sarcini formează un curent electric, iar intensitatea curentului electric este definită de viteza de variație a sarcinii în unitatea de timp printr-o suprafață transversală la direcția fluxului de sarcini.

[ (1.3.2.6)

Conductivitatea electrică (σ) reprezintă proprietatea materialelor de a dispune de purtători liberi de sarcină electrică. Conductivitatea electrică depinde de frecvența de variație în timp a câmpului electric (la frecvențe înalte mișcarea este dirijată, la frecvențe joase este împrăștiată), de mobilitatea purtătorilor de sarcină, numărul de electroni și temperatura materialului [17].

Din punct de vedere al conducției electrice, materialele se clasifică în: conductoare, semiconductoare, izolatoare, dielectrici și electroliți.

Electroliții sunt formați din ioni- particule stabile încărcate pozitiv sau negativ, iar acești ioni se află într-un mediu electrolitic (dizolvarea unei substanțe: sare într-un solvent). În soluția de electrolit, ionii se deplasează cu ușurință, sub acțiune forțelor electrice.

Legea inducției electrice exprimă legătura dintre densitatea curentului electric de conducție J și intensitatea câmpului electric E, prin intermediul conductivității (respectiv a rezistivității).

[A/m] (1.3.2.7)

Densitatea de putere a unui material este datorată legii de transformare a energiei materialelor conductoare parcurse de curent.

[W/m3] (1.3.2.8)

Polarizarea electrică se referă la fenomenul de producere a unor dipoli electrici prin separarea de sarcini sau prin orientarea dipolilor existenți, datorate câmpului electric. Dielectricii sunt materiale care, sub acțiunea unui câmp electric aplicat din exterior, își modifică așezarea sarcinilor electrice în sensul producerii de dipoli orientați în direcția aplicării câmpului electric [17].

Apare polarizația electrică P și intervine în teoria de câmp asociată polarizării directe:

[C/m2] (1.3.2.9)

= 0 r = permitivitatea electrică a unui mediu [F/m] Pp = polarizație permanentă

0 = permitivitatea electrică a vidului Pt = polarizație temporală

r = permitivitatea electrică relativă sau constanta dielectrică: r = 1 + e

e – susceptivitatea electrică este o proprietate caracteristică fiecărui material

Mediile biologice sunt bune conductoare, conductivitatea lor variază în funcție de temperatura mediului, de frecvența câmpului electric aplicat și de conținutul de apă din țesut. Din punct de vedere al permitivității electrice mediile biologice (105-106) sunt medii dielectrice [17].

Dispersia electrică este corespondența permitivității cu frecvența.

Atunci când un curent electric străbate interfața dintre 2 medii dielectrice apare fenomenul de relaxare interfacială numit Maxwell- Wagner, derivata unei soluții analitice cu conductivitate , dintr-o suspensie diluată cu particule sferice. Ca un rezultat al fenomenului Maxwell- Wagner, apare factorul Clausius- Mossotti ce indică polarizabilitatea relativă a celulei în raport cu mediul ei de suspendare.

(1.3.3.0)

= permitivitatea complexă a particulei

= permitivitatea complexă a mediului

K > 0 permitivitatea mediului este mai mare decât permitivitatea particulei (celulei), particulele sunt atrase de câmpul electric cu o intensitate maximă.

K < 0 permitivitatea particulelor este mai mare decât permitivitatea mediului, particulele cunt atrase de câmpul electric cu o intensitate minimă.

Biosenzor

Principiul de funcționare

În momentul actual putem să afirmăm faptul că trăim în secolul vitezei. Timpul costă bani și de cele mai multe ori sănătate. Datorită acestor constrângeri a apărut nevoia de a investiga rapid și cât mai sigur organismul uman. Corpul uman a fost înzestrat cu o varietate de senzori specifici pentru menținerea unui echilibru fiziologic și metabolic având în vedere interacțiunea cu mediul înconjurător. Modificările ambientale și ascensiunea societății spre tehnologie, implicarea abuzivă a omului asupra naturii, au condus la un dezechilibru al biosistemelor care nu mai poate fi reglat de proprii senzori ai ființelor vii. Apare astfel necesitatea senzorilor artificiali pentru a îndeplini funcția de interfață a monitorizării și schimbării [18].

Un biosenzor este un dispozitiv analitic complex, care transformă o mărime fizică într-o mărime electrică, cu o serie de avantaje esențiale: sensibilitate, timp de răspuns rapid, costuri scăzute, portabilitate și manevrabilitate ușoară (utilizarea acestora la domiciliu fără a avea nevoie de un specialist). Pe parcursul anilor, a fost demonstrat faptul că biosenzorii pot salva vieți și pot rezolva problemele medicale legate de diagnosticul în timp real.

Elementul de recunoaștere Traductor

biocelulară

Semnalul

De ieșire

Receptori Electrochimic

Enzime

Celule

Anticorpi

Figură 1.1.6– Definiția clasică a unui biosenzor [19]

Noțiunea de biosenzor a fost definită pentru prima dată de către cercetătorul Karl Camman, în 1977, definiție care nu a fost acceptată de către comisia IUPAC.

Comisia IUPAC, alcătuită din: D.R. Thevenot, K. Toth, R.A. Durst and G.S. Wilson au definit biosenzorul ca fiind un dispozitiv integrat, independent, care are capacitatea de a furniza informația analitică specifică cantitativ sau semi-cantitativ utilizând un element de recunoaștere biologică, această informație fiind păstrată în spațiul unde are loc legarea directă cu traductorul. Elementul de recunoaștere biologică se bazează pe reacțiile chimice care pot avea loc, în urma imobilizării macromoleculelor [20].

Biosenzorii pot fi clasificați în funcție de substanța de analizat sau de reacția de interes în:

Monitorizarea directă: depinde de concentrația analitului sau de reacția produsă.

Monitorizarea indirectă: depinde de elementul de recunoaștere biocelulară.

Pentru o analiză adecvată, biosenzorul trebuie să facă parte dintr-un sistem bine stabilit, având în vedere analiza ulterioară a mărimii de ieșire date de biosenzor. Este important ca sistemul de control și măsurare al senzorului să conțină un modul de afișaj, pentru o interpretare ușoară și sigură. Portul de comunicație este de asemenea fundamental având în vedere utilizarea tot mai largă a telemedicinei. Este necesar ca atunci când apare o modificare în parametrii care sunt monitorizați, aceasta să fie sesizată de un medic și să intervină în timp util pentru soluționarea problemei.

Semnalul preluat de la un senzor trece printr-un Buffer- amplificator operațional, cu impedanță mare de intrare și cu rol de protecție. După amplificarea semnalului, acesta va trece printr-un Convertor Analog-Digital (ADC) care va transforma semnalul analog în digital, pentru a fi stocat, afișat și transmis prin rețeaua de comunicații spre alte locații [18].

Stadiul actual al biosenzorilor

Evoluția biosenzorilor

Senzorul și traductorul sunt cuvinte utilizate în domeniul sistemelor de măsurare. În Europa este utilizată noțiunea de traductor, pe când noțiunea de senzor este utilizată în America.

Senzorii electrochimici se bazează pe detecția curentului sau a schimbărilor de potențial datorate interacțiunii cu interfața traductorului. Anticorpii, receptorii, enzimele sunt elemente de recunoștere care, împreună cu suprafața solidă a electrodului (Au, Ag, grafit), reacționează cu impulsul electric oferind ca răspuns un potențial electric. Atunci când mediatorul redox este inclus în soluție, schimbările speciilor electrochimice sunt legate direct de elementul de recunoaștere moleculară. Biosenzorii electrochimici au avut de-a lungul anilor rezultate foarte bune pentru aplicațiile medicale datorită proprietăților excepționale: sensibilitate mare, ușurință în utilizare și cost redus în compartație cu alți traductori, ca de exemplu, traductorul optic.

Intervine problema imobilizării celulelor datorită posibilității de pierdere a proprietăților celulare în timp. Pentru rezolvarea acestei probleme se pot realiza sisteme electrochimice de tip “label-free” [21].

Un biosenzor de impedanță poate detecta o gamă largă de specii analitice prin utilizarea diferitelor probe. Biosenzorul de impedanță este utilizat și analizat datorită caracteristicilor importante îndeplinte: cost scăzut, reducerea dimensiunilor, diagnosticare rapidă și ușoară atât la spital cît și la domiciliu (monitorizare) [22].

Biosenzorul de impedanță are ca scop principal măsurarea impedanței electrice a unei interfețe, aflată în curent alternativ cu posibilitatea de a regla condițiile de polaritate pentru un curent continuu, prin identificarea curentului de intrare, datorat frecvenței utilizate. Impedanța rezultă din raportul curentului la tensiune, utilizând astfel tehnica spectroscopiei de impedanță electrochimică (EIS) [23].

Biosenzorul impedimetric anulează nevoia unui fenomen redox activ, având loc încărcarea cu bioreceptori (anticorpi, acizi nucleici, celule). Un astfel de biosenzor oferă o serie de avantaje, cum ar fi: cost scăzut, senzitivitate ridicată și ușurința în miniaturizare, dar nu în ultimul rând reprezintă o metodă favorabilă pentru diagnosticare.

Studiul actual de dezvoltare în domeniul senzorilor presupune integrarea și digitizarea tuturor componentelor. Algoritmii de calcul au fost implementați în unitatea de achiziție și procesare, fenomen ce a dus la fabricarea unor sisteme moderne de măsurare și transmitere a mărimilor fizilogice.

Biosenzorii au fost dezvoltați pentru prima oară în anul 1960, iar primul biosenzor a fost utilizat de către Clark și Lyions în 1962 la Spitalul Clinic de Copii Cincinnati, pentru monitorizarea unei operații cardiovasculare. Această metodă presupunea utilizarea unui electrod de oxigen cu enzima oxido-glucoză fixat pe membranele semipermeabile de dializă. Electrodul măsura consumul de oxigen în timpul reacției enzimei, oferind ca rezultat concentrația de glucoză (Clark and Lyons, 1962). Erorile apărute în timpul monitorizării se datorau variației nivelului de O2 din soluție, fenomen ce ducea la formarea unei reacții cu producere de peroxid de hidrogen, produs care devenea mărime de interes. Astfel, a fost descoperită prima generație de senzori amperometrici ce măsurau direct speciile de enzime electroactive produse sau consumate. Cercetătorii vorbesc despre a doua generație de senzori în anul 1980, ca răspuns al cerințelor tot mai mari pentru măsurarea potențialului ridicat, având în vedere determinarea speciilor electroactive, dar cu dezavantajul scăderii sensibilității (Wang, 2001).

Utilizarea ferocianurii ca electrod intermediar pentru schimbul de electroni de la enzimă la electrod, a fost un pas important în eliminarea interferențelor produse de alte specii redox fără interes. A treia generație de biosenzori (1990) a marcat dezvoltarea tehnologiei biosenzoriale, care permitea schimbul direct de electroni, în centrul enzimei redox și pe suprafața electrodului de lucru [24].

Biosenzorii implantabili sunt în curs de dezvoltare, fiind un domeniu destul de problematic datorită contactului direct cu corpul pacientului și a caracterului invaziv.

În ultima perioadă, cercetătorii își îndreaptă tot mai mult atenția către biosenzorii enzimatici, având în vedere o gamă largă de bioreceptori: ADN, anticorpi și utilizarea unor metode de măsurare optice, piezoelectrice și accentul este pus pe metodele electrochimice bazate pe măsurători de impedanță (Song et al., 2006). Inginerii urmăresc miniaturizarea senzorilor și integrarea acestora în suprafețe cât mai optime pentru permiterea schimbului de electroni, dar și pentru imobilizare moleculară.

Stadiul actual al dezvoltării senzorilor electrochimici la nivel național

Primii pași ai cercetării în domeniul producției de senzori electrochimici, la nivel național au fost parcurși în 1974. Dr. Elena Hopirtean (1939-2006) și-a desfășurat activitatea științifică spre electrozii de sticlă pentru măsurarea pH-ului. În anul 1976 a reușit să producă primul electrod comercial de sticlă pentru măsurarea pH-ului în Romania [25].

În anul 2010, românca Prof.dr.Raluca Ioana van Staden, a fost premiată la Salonul Internațional de Invenții de la Geneva pentru senzorul ce este de mărimea unui ac și care are ca principiu de funcționare depistarea cancerului în șase minute [26]. Oamenii de știință din cadrul Asociației comunității științifice românești Ad Astra suțin faptul că principiul de funcționare și capacitatea senzorului de detectare a markerilor tumorali sunt „neinteligibile”. Cercetarea însă continuă și sunt la stadiul de înglobare al senzorului într-un aparat pentru detecția markerilor tumorali cu eficiență maximă [27].

Stadiul actual al dezvoltării senzorilor electrochimici la nivel internațional

Începând cu anul 1980, biosenzorii au apărut ca o rezolvare pentru întrebările din lumea analitică. Astfel că atât în domeniul industriei (monitorizarea și controlul alimentației), domestic (monitorizarea neinvazivă la domiciliu), armată (detectarea soluțiilor nocive) cât și în domeniul medicinei (diagnosticare, monitorizare), problemele legate de analiza proceselor ce nu pot fi vizibile de om au cunoscut o îmbunătățire favorabilă. Printre cei mai utilizați biosenzori comercializați se numără testul de sarcină și testul de determinare a glucozei din sânge, pentru diabetici [18], [28].

În ultimii zece ani, biosenzorii au fost în atenția cecetătorilor, cunoscând un real succes în aplicațiile biomedicale: operații realizate în cadrul medicinei generaliste, în determinarea diagnosticului sau pentru monitorizarea stării de sănătate a diabeticilor.

Primul și cel mai cunoscut biosenzor a fost cel de monitorizare a glucozei din sânge utilizat de diabetici pentru măsurarea zahărului din sânge [19]. Biosenzorii pentru aplicații medicale sunt construiți special pentru a detecta substanța de interes din proba prelevată în prealabil de la pacient: urină, sânge, salivă. Au fost studiate și fabricate dispozitive de tip biosenzor pentru detecția substanțelor volatile din aer: nasul electronic (e-noses), detecția celulelor canceroase, pentru produse farmaceutice, alimentație și agricultură.

Tabel 1- Articole bazate pe utilizarea biosenzorilor de electrochimici în aplicații clinice [24]

În tabelul anterior am evidențiat unele dintre cele mai importante articole care au ca direcție de cercetare tehnologia senzorilor electrochimici bazată pe metoda de spectroscopie de impedanță electrochimică, cu aplicații în domeniul biomedical, pentru diagnosticarea diferitelor patologii prin detecția anumitor parametrii caracteristici.

Cercetările la nivel internațional au luat amploare în ceea ce privește diagnosticarea rapidă a paciențior, astfel, în 2014, echipa de cercetători condusă de J.Claudel, de la Institutul Jean Lamour (UMR), Franța, au făcut public un sistem microelectromecanic (MEMS), care utilizează tehnica de spectroscopie de impedanță pentru aplicații în domeniul biomedical cu scopul principal de diagnosticare a țesuturilor, bazată pe răspunsul electric al țesuturilor. Nevoia actuală este reprezentată în principal de caracterizarea probelor microscopice cu o sensibilitate cât mai bună. Cercetările actuale utilizează pentru caracterizarea probelor mici electrozii interdigitiați [24].

Un alt domeniu al medicinei în care se studiază utilizarea biosenzorilor îl reprezintă infectarea cu HIV. Costurile ridicate și nevoia tot mai mare de determinare a virusului au determinat cercetătorii să își îndrepte atenția spre biosenzorii electrochimici, electrochimia oferind câteva avantaje deosebite: sensibilitate ridicată, posibilitatea de miniaturizare și costuri relativ scăzute. HIV este virusul imunodeficienței umane ce are proprieteatea de a se dezvolta lent și care provoacă SIDA. Numărul pacienților ce suferă de SIDA este într-o creștere continuă, în anul 2014 fiind înregistrate peste 34 de milioane de persoane infectate.

Un alt studiu bazat pe tehnica spectroscopiei de impedanță urmărește detectarea imunoglobulinei A umane, cu ajutorul unor electrozi interdigitați (IDE). „Ryuzo Ohno et al.” au urmărit performanța acestui senzor de IgA cu ajutorul măsurătorilor de spectroscopie de impedanță, prin imersarea acestuia într-o soluție de PBS amestecată cu o mixtură de 2mM K4[Fe(CN)6], 2mM K3[Fe(CN)6] și 0.1 M KCl. Spectrul EIS a fost obținut în urma stabilirii unui potențial de echilibru datorat unei tensiuni de polarizare, cu o frecvență de 0.1-105Hz, o amplitudine de 10 mV, cu ajutorul programului Autolab PGSTAT128N. Biosenzorul IgA de tip label-free, a fost funcționalizat pe suprafața IDE cu anti-IgA, rezultatele oferind o sensibilitatea ridicată pentru IgA, iar prin investigațiile de Spectroscopie de Forță Atomică a fost demonstrată absorbția IgA pe suprafața anti-IgA. Concluzia acestei echipe de cercetători afirmă utilitatea combinației dintre electrozii interdigitizați și EIS în aplicații ale biosenzorilor [43].

Spectroscopia de impedanță electrochimică

Metoda spectroscopiei de impedanță electrochimică

Spectroscopia de impedanță electrochimică (EIS) reprezintă, după cum îi spune și denumirea, o tehnică electrochimică care urmărește schimbările ce apar datorită transferului de masă al rezistenței sau al capacității, la suprafața biosenzorului după legarea analitului cu elementul de biorecunoaștere. Tehnica de impedanță este utilizată începând cu secolul XIX (Heaviside, 1894), însă aplicarea acesteia pentru biosenzori a fost realizată începând cu anul 1980 (Newman et al., 1986).

Spectroscopia de impedanță electrochimică reprezintă o metodă de studiu a proceselor de electrod, în curent alternativ. Scopul acestei metode este, în principal, analiza răspunsului electrodului la aplicarea unui curent alternativ de amplitudine mică: 5 -10mV.

Prin modificarea frecvențelor semanlului aplicat se obține impedanța sistemului, dependentă de frecvență. Impedanța Z a unui sistem este determinată prin aplicarea unei tensiuni perturbatoare de amplitudine mică și va avea ca răspuns detecția curentului.

Prin definiție, impedanța este coeficientul funcției tensiune în timp ce are ca rezultat funcția curentului în timp.

(2.5.1.1)

Impedanța este o valoare complexă întrucât curentul nu diferă doar prin amplitudine, poate avea și un defazaj φ în comparație cu funcția tensiunii în timp. Datorită acestor precizări, valoarea impedanței poate fi descrisă prin modulul│Z│și defazajul φ sau alternativ prin partea reală ZR și partea imaginară ZI a impedanței [44], [45], [46].

Figură 1.7- Definiția impedanței [45]

Rezultatul măsurătorilor impedanței poate fi ilustrat prin două moduri:

Diagrama Bode: este utilizat modulul impedanței │Z│ și defazajul φ dependente de frecvență.

Diagrama Nyquist: vor fi utilizate impedanța imaginara Zim și impedanța reală Zre.

Spectrul de impedanță poate fi analizat cu ajutorul unui circuit echivalent. De obicei pentru a reprezenta proprietățile fizico-chimice ale unui sistem investigat, acest circuit poate fi alcătuit din rezistențe și capacități. Descrierea circuitului este determinată cu ajutorul funcției de transfer, derivate din legile de bază ale proceselor caracteristice sistemului.

Elemente de impedanță și circuite simple

În cazul spectroscopiei de Impedanță electrochimică, în care soluția de electrolit este o componenetă a sistemului țintă , descrierea comportamentului impedanței poate fi realizată cu ajutorul a patru mărimi caracteristice:

Rezistența ohmică R: apare în spectrul impedanței atunci când are loc procesul de migrare a electronilor de la interfață în interiorul materialului. O rezistență ohmică care nu produce defazaj între tensiune în curent alternativ și curentul în curent alternativ produce rezultate ale impedanței ce nu depind de frecvență.

Capacitatea C: apare atunci când electronii sunt separați printr-un dublu strat electrochimic (interfață, membrane). O capacitate rezultată în urma unui defazaj de -90 corespunzătoare funcției de curent în timp comparată cu funcția de tensiune, va oferi ca rezultate măsurători ale impedanței puternic dependente de frecvență. În mod particular, atunci când vorbim de o frecvență joasă, impedanța capacitivă corespunzătoare va avea valori mari.

Elementul de fază constantă (CPE- constant phase element): este utilizat atunci când capacitorul ideal nu produce un defajaz la -90. Din punct de vedere electrochimic acest element apare datorită modificărilor unor proprietăți de material (sau a cantității de apă din membrana polimerică).

Impedanța Warburg W- este întânlită în sistemele în care apare fenomenul de difuzie. În aceste sisteme curentul va fi limitat de difuzia substanțelor. Vorbim despre impedanță Warburg la frecvențe mici, unde va avea un comportament liniar, evidențiată în diagrama Nyquist cu o pantă de 45.

Elementele de impedanță pot fi conectate în serie sau în paralel. Pentu un circuit serie impedanța totală este suma tuturor componentelor. Pentru un circuit în paralel, putem defini admitanța sau inversul impedanței ca fiind suma inverselor elementelor din circuit. Într-un circuit paralel, curentul are două căi de trecere prin sistem, însă va parcurge calea în care impedanța este mai scăzută.

Figură 1.8- Diagramele Bode și Nyquist a unui circuit în serie și unul în paralel [45]

Circuite echivalente

Circuitele echivalente sunt utilizate pentru aproximarea măsurătorilor de impedanță experimentale, cu impedanța ideală amintită în Figură 1.8, atât pentru sistemele aranjate în serie cât și pentru cele parelele. Sistemele electrochimice sunt analizate cu ajutorul acestei metode.

Atunci când un electrod este imersat într-o soluție de electrolit, în urma aplicării unui curent alternativ, acesta trebuie să pătrundă în soluție, să treacă prin interfața dintre electrozi și faza de conducere a ionilor. Circuitul echivalent este evidențiat în Figură 1.9 și poartă denumirea de circuit Randles. În literatura de specialitate a teoriei electrochimice este menționat faptul că fluxul curentului are loc datorită încărării și descărcării stratului dublu de la interfață sau datorită procesului de oxido-reducere a substanței provenite de la electrod sau de la soluția utilizată. Modelul interfeței este un circuit paralel între capacitatea dublului strat Cdl și rezistența transferului de sarcină Rct.

La frecvențe joase, unde transferul de sarcină se poate produce mai rapid decât difuzia substanței cu electrodul, pentru a descrie impedanța corespunzătoare este nevoie să introducem o impedanță suplimentară, numită în literatura de specialitate impedanța Warburg W în serie cu rezistența transferului de sarcină Rct.

Din diagrama Nyquist putem determina rezistența transferului de sarcină Rct. Capacitatea dublului strat Cdl poate fi determinată de la maximul frecvenței semicercului: w=2f=1/RctCdl. Într-un proces electrochimic, produsul dintre Rct și Cdl este definit de o constantă în timp T. Linia la 45 indică comportamentul limitat al impedanței Warburg ce poate fi extrapolat la axa reală.

Figură 1.9- Circuitul Randles [45]

În circuitul de mai sus este reprezentat circuitul Randles. Capacitatea dublului strat Cdl rezultă datorită posibilității de stocarea a sarcinii în dublu strat de la interfață. Rezistența transferului de sarcină Rct rezultă datorită trecerii curentului prin reacțiile redox, de la interfață, iar impedanța Warburg rezultă datorită procesului de difuzie cu interfața ce produce o limitare a fluxului de curent. Rs este rezistența soluției dată în urma concentrației de ioni și de geometria celulei. Din diagrama Nyquist se pot determina ușor Rct și Rs. La frecvențe mici, spectrul de impedanțe este dominat de impedanța Warburg.

Tabel 2- Elemente de impedanță utilizate pentru un sistem electrochimic [45]

w- frecvența unghiulară

Spectroscopia de impedanță electrică (EIS) este utilizată pe scară largă pentru evaluarea stării de sănătatea a diferitelor țesuturi. Această metodă este utilă pentru a caracteriza modificările celulare din punct de vedere cantitativ.

EIS oferă informații de impedanță în raport cu o gamă largă de frecvențe. A fost utilizată de cercetători atât pentru a le oferi infomații despre diagnostic, monitorizare dar și pentru a înțelege care sunt proprietățile electrice și dielectrice ale țesuturilor și efectul impulsurilor electrice asupra acestora (stimulare electrică) [16].

. DESCRIEREA DATELOR

Proiectarea și modelarea biosenzorului

În literatura de specialitate a fost demonstrat faptul că majoritatea bioreacțiilor catalitice dintr-o soluție produc sau consumă specii ionice conducând la schimburi de conductivitate. Soluțiile electrolitice au proprietăți deosebite dintre care cea mai importantă este capacitatea lor de a transporta curent electric. Compușii care prezintă o puternică legătură polară disociază în solvenți care au o constantă dielectrică ridicată, rezultat observat datorită anionilor încărcați pozitiv și cationilor încărcați negativ. Inserarea a doi electrozi similari într-o astfel de soluție cu un potențial aplicat conduce la procesul de migrare a ionilor la electrozii încărcați cu sarcină electrică de semn opus [16], [47].

Dispozitivul dezvoltat în cadrul acestui proiect de licență este compus dintr-un senzor impedimetric cu microelectrozi interdigitați și un sumator microfluidic. Biosenzorul impedimetric este realizat pe o plachetă de siliciu monocristalin, alcătuit din 2 microelectrozi interdigitați, fiecare cu câte 64 de digiți, un electrod de referință și un electrod auxiliar. Sumatorul microfluidic este realizat jumătate pe placheta cu senzorul impedimetric, iar cealaltă jumătate pe o plachetă de sticlă Corning 7740, reprezentând capacul dispozitivului.

Primii pași au fost de modelare și simulare a dispozitivului, fabricarea fiind realizată automat, în cadrul Institutului Național de Cercetare și Dezvoltare IMT București, de specialiști, urmând apoi realizarea unor măsurători de impedanță, realizate cu ajutorul spectrometrului de impedanță electrochimică. Senzorul a fost astfel dezvoltat pentru a fi aplicat în determinarea proprietăților celulelor tumorale. Am realizat măsurători de impedanță pe celulele tumorale, extrase în urma unei excizii chirurgicale de melanom la Spitalul Universitar de Urgență București, iar celulele au fost separate din tumoră la departamentul de histopatologie al Institutului Național de Cercetare – Dezvoltare în Domeniul Patologiei și Științelor Biomedicale Victor Babeș București. Am determinat spectre de impedanță electrochimice cu ajutorul cărora am determinat proprietățile dielectrice ale celulelor: capacitatea stratului dublu electric, rezistența transferului de sarcină, impedanța de difuzie Warburg, diagrama Nyquist a permitivităților dielectrice, polarizabilitatea celulelor și variația factorului Clausius- Mossotti a celulelor. Pentru realizarea măsurătorilor de referință și determinarea stabilității senzorului am utilizat ca specie redox: [Fe(CN)(6)](3-/4-).

Pentru realizarea senzorului impedimetric am ales versiunea mai amplă a perechilor de electrozi interdigitați (IDMEA) pentru a avea o amplificare directă a semnalului de ieșire.

IDMEA este alcătuit dintr-un set de electrozi interdigitați, asemănătoare unor degete. Potențialul fiecărui set de microelectrozi interdigitați poate fi controlat în mod independent de celelalte seturi ale aceluiași electrod de referință. Dimensiunile electrozilor și a spațiilor mici dintre ei, folosirea unei matrici de microelectrozi interdigitați, au ca rezultat o eficiență de peste 98% în ceea ce privește detectarea cantităților foarte mici de specii electroactive.

Modelarea fizică a senzorului

Matricea de microelectrozi interdigitați (IDMEA) este realizată prin tehnici de microfabricație specifice tehnologiei IC (circuite interdigitate). Principiul de funționare se bazează pe detecția electrochimică, metodă larg folosită pentru determinarea compușilor organici și anorganici oxidabili și reductibili. Microelectrozii necesită curenți mici de încărcare, o diferență mică de potențial și ajung rapid la saturație. Procesul de oxido-reducere depinde foarte mult de distanța dintre electrozi. Un alt parametru important în procesul de fabricare a matricei de microelectrozi este deasemenea lățimea electrozilor, reacția electrochimică fiind mai bună cu cât lățimea este mai mică [16]. Dimensiunea minimă a electrozilor produce perturbări minime în probele analizate, ceea ce permite monitorizarea evenimentelor într-o singură celulă. În cazul a două reacții cinetice controlate , potențialul celulei este corelat cu intensitatea curenților prin anod și catod și este dată de ecuația Butler- Volmer, pentru electrozi interdigitați:

(2.1.1.1)

(2.1.1.2)

wa = wc = lățimea anodului (generator) și a catodului (colector)

wg = lățimea spațiului dintre doi electrozi vecini

k = numărul total de electrozi interdigitați

b = lungimea electrozilor

F = constanta Faraday

C* = concentrația speciilor reduse (ia) sau oxidate (ic) din volumul electrolitului

D = coeficientul de difuzie

n = numărul de electrozi transferați

Primul pas în realizarea senzorului electrochimic a constat în alegerea unei geometrii și modelarea 3D a structurii biosenzorului, în vederea obținerii unei imagini de ansamblu a rezultatului dorit.

Modelarea a fost realizată cu ajutorul platformei software Coventor, modulul SEMulator 3D.

Coventor este liderul de piață în ceea ce privește soluționarea automată a design-ului unor produse de tip MEMS (sisteme micro-electromecanice) sau a dispozitivelor semiconductoare.

SEMulator 3D este un modul al fabricării virtuale în micro și nanotehnologie. Modul de lucru a presupus urmărirea modelului senzorului dorit prin trasarea geometriilor corespunzătoare, adăugarea straturilor necesare fiecărui element în parte, utile procesului de fabricare propriu-zis.

În figura de mai jos avem o captură a ideii de bază de la care am pornit având în vedere fabricarea unui senzor impedimetric. Cu roșu avem stratul de fotorezist SU8, cu galben este identificat Aurul, cu gri- Argintul, cu albastru- Siliciu, verde închis- SiO2, verde deschis- SiO2 termic.

Figură 2.1– Modelarea senzorului impedimetric (SEMulator 3D)

2.1.2 Proiectarea măștilor fotolitografice

Măștile fotolitografice au fost proiectate în CleWin, după care urmează pașii principali de fabricație tehnologică. Inițial, pentru fabricarea acestui senzor se utilizează 5 măști transparente suprapuse. Suportul pe care se va realiza implementarea tehnologică constă într-o plachetă de Siliciu monocristalin cu un diametru de 100mm. Cipul realizat are dimensiunea de 10 x 25 mm2. Pentru o achiziție ușoară și precisă a datelor, a fost dorită implementarea unei zone de conectare la un USB de tip SATA II male, la ieșirea traseelor metalice ale electrozilor, cu o arie de 10 x 5 mm2.

Pasul următor constă în evidențierea măștilor realizate în CleWin, urmând ca în subcapitolul 2.1.3 să fie exemplificați pașii urmați în procesul de fabricație propriu-zisă a măștilor, după acest proiect de layout-uri din Figură 2.2.

Proiectarea măștilor a fost realizată prin utilizarea unui fișier.cif, salvat în CleWin, adăugarea de Layere necesare și realizarea modelului, trimis ulterior la nivelul următor, fabricarea.

CleWin reprezintă cel mai puternic editor de layout cu caracteristici bine dezvoltate. Varianta utilizată a fost CleWin5. Fiecare mască definită printr-un layout, o anumită culoare și o anumită geometrie, poartă, în fișierul.cif denumirea procesului prin care va fi proiectată în etapa de fabricare a senzorului.

Masca 1

Corodare oxid Electrozi de lucru (WE)

Masca 2

Depunere metal

Electrod de numărare (CE)

Masca 3 Masca 4 Masca 5

Depunere metal-Argint Pasivare chimică Canal chimic

Electrodul de referință- Ag/AgCl (RE) Camera de reacție

Figură 2.2- Realizarea măștilor

Setul măștilor fotolitografice:

Figură 2.3- Masca M1- Definirea ariei utile senzorului

Figură 2.4 – Masca M2- Depunere metal (Aur)- definrea geometriilor electrozilor (RE, WE1, WE2, CE)

Figură 2.5- Masca M3- Depunere metal (Argint), electrodul de referință (RE)

Figură 2.6- Masca M4- Pasivare chimică

Figură 2.7- Masca M5- Canal microfluidic

Detecția electrochimică este utilizată pentru determinarea compușilor organici și anorganici oxidabili și reductibili. Matricea de electrozi interdigitați obținută necesită curenți mici de încărcare. Reacția electrochimică este cu atât mai bună cu cât lățimea electrozilor și dimensiunea dintre ei este mai mică. Măsurarea curentului se realizează rapid, în timpul măsurării cu spectrometrul electrochimic, datorită capacității dublului strat scăzută.

Figură 2.8 – Camera de reacție

Camera de reacție are lungimea de 2 mm, lățimea de 1 mm și conține 64 de perechi de microelectrozi interdigitați (cu o spațiere de 5 μm și 5 μm lățime. Microcanalele de intrare și ieșire sunt utilizate pentru circularea soluției de testat, astfel încât selectivitatea de analiză și detecție să fie maximă.

Semnele de aliniere ale măștilor

Semnele de aliniere reprezintă suportul principal în alinierea exactă a celor cinci măști fotolitografice ale dispozitivului. Acestea sunt utilizate pentru menținerea în poziție corectă a măștilor. În figura de mai sus sunt reprezentate semnele de aliniere utilizate pentru poziționarea corectă a celor 5 măști. Fiecare culoare corespunde fiecărui layout al măștilor, iar cifrele corespund efectiv măștilor la care face referire semnul. Aliniearea se face succesiv, în ordinea cronologică a etapelor fluxului tehnologic.

Figură 2.9- Semnele de aliniere utilizate pentru cele 5 măști

Semnul structural “1 plus(+)” este obținut ca rezultat al corodării în geometria de layout procesată cu masca 1. Corodarea se face cu oxid termic intercip și este de fapt un “plus(+)” apărut la suprafața geometriei.

Primul semn de aliniere “2 plus(+)” este proiectat pentru masca 2. Această mască se va procesa cu fotorezesit pozitiv. Alinierea semnelor “2 plus(+)” la “1 plus(+)” reprezintă centrarea plusului opac corespondent din masca 1 în conturul “1 plus(+)”. Conturul “1 plus(+)” trebuie să fie mai mare decât conturul “2 plus(+)” opac din masca fizică pentru a se obține alinierea cu ușurință. Brațele plusului de aliniere au 30 de microni lățime, iar debordul în conturul plusului corodat este de 10 microni, nefiind necesară astfel o precizie de aliniere drastică. Următoarele semne de aliniere “2 plus(+)” sunt identice, rezultând pe suportul de oxid termic încă 4 plusuri din metal (aur), pline, pentru alinieri ulterioare.

Semnul de aliniere “3 plus(+)” negat format din patru patrate identice este inclus în masca M3 – argint clorinat cu layout de tip corodare în camp. În masca fizică M3 de crom pe cuartz, cele 4 pătrate sunt opace la iluminare externă. Alinierea se va face prin centrarea celor patru pătrate opace din masca M3 de aliniat a semnului “2 plus(+)” rămas format structural pe oxidul termic, după procesarea cu masca M2 corespondentă.

Semnul de aliniere “4 plus(+)” este inclus în masca M4- oxid de pasivare cu layout de tip corodare în geometrie. Acest semn este procesat folosind fotorezist pozitiv. Alinierea se face prin observarea semnului structural “2 plus(+)” prin acest ultim semn discutat. După procesarea măștii M4, oxidul de pasivare este eliminat din jurul semnului “2 plus(+)” corespondent pentru a facilita alinierea măștii M5 ulterioare, deci semnul “2 plus(+)” este perfect evidențiat pe suportul de oxid termic din preajma câmpului de oxid de pasivare, situație ce se repeată și pentru urmatoarele două semne de aliniere de tipul “2 plus(+)”.

Cele două semne de aliniere “5 plus(+)” și “5 plus negat”(patru patrate opace) incluse în masca M5- canal SU8 sunt proiectate știind că SU8 se comportă ca un fotorezist negativ. Layoutul pentru M5 este de tip corodare în geometrie. Alinierea se va face centrând între cele patru pătrate opace din Masca M5 semnul de aliniere de tipul “2 plus(+)”.

2.1.4 Sistemul de inscripționare măști

DWL 66fs este sistemul de fotolitografie utilizat pentru inscripționarea măștilor utilizate la fabricarea matricei de microelectrozi. Acest echipament utilizează diode LASER cu o lungime de undă de 405 nm, permițând expunerea atât a măștilor cât și a plachetelor cu dimensiuni cuprinse între 2,5 și 6 inch. Echipamentul este dotat cu două capete de scriere, unul de 2mm cu rezoluția maximă de 0,6 microni, respectiv 10 mm cu rezoluția maximă de 2,5 microni. Capul de scriere se alege în funcție de rezoluția dorită, astfel timpul de scriere poate varia între câteva ore pentru capul de 10mm și câteva zile pentru cel de 2mm.

Mișcarea precisă de-a lungul axelor x,y a suprafeței pe care este poziționată masca în timpul expunerii este controlată cu ajutorul unui interferometru cu laser. În interiorul incintei există o cameră video cu care se poate realiza inspecția calitativă a măștii după ce au fost realizate procesele de developare și corodare. Cu ajutorul camerei video se poat face și măsurători asupra măștii obținute.

Procesarea chimică este un proces compus din 3 etape: developare, corodare și îndepărtarea fotorezistului.

Măștile expuse au substrat de soda lime, pe care a fost depus un strat de crom (cu grosimea de 900A), peste care a fost depus fotorezistul pozitiv AZ 1518 (cu o grosime de 0,6 microni).

Primul proces, cel de developare constă în solubilizarea în developant a fotorezistului pozitiv, depus în timpul executării măștii. Al doilea proces, corodarea stratului de crom se execută în fereastra deschisă în stratul de fotorezist.

Procesul de corodare se face pe cale umedă cu ajutorul unei soluții de acid percloric (HClO4) și a nitratului de amoniu (NH4)2[Ce(NO3)2] conform reacției:

3 Ce(NH4)2(NO3)6 + Cr → 3 Cr(NO3)3 + 3 Ce(NH4)2(NO3)5

După corodarea stratului de crom, se trece la cel de-al treilea proces denumit îndepartarea stratului de fotorezist rămas pe mască.

Ultima etapă, realizată doar în cazul în care avem un set de măști, este aceea a efectuării superpoziției măștilor. Acest proces reprezintă aducerea în aceeași poziție a semnelor de aliniere existente pe mască, pentru a verifica dacă acestea se suprapun perfect (simularea procesului de fotogravură din tehnologie).

Proiectarea tehnologiei de fabricație

Biosenzorul IDMEA integrat a fost proiectat pentru aplicabilitatea în diagnoză medicală. Fabricarea a fost realizată pe plachete de siliciu tip p- cu rezistivitatea de 50cm. Senzorul are o structură coplanară ce conține în același plan atât electrozi de generare cât și de colectare. Deasupra matricei de microelectrozi este fabricat un microcanal fluidic în SU-8. IDMEA este compus din două perechi de electrozi de lucru (WE) cu microelectrozi paraleli interdigitați, un electrod numărător (CE) din aur sau platină și un electrod de referință (RE) Ag/AgCl.

Proprietăți caracteristice acestui dispozitiv:

Dimensiunea este de 2,5cm x 1cm

Lățimea microelectrozilor și distanța dintre ei este de 5 m

Lățimea electrodului de referință este de 100m

Lățimea electrodului numărător (counter) este de 300m

Fabricarea pornește de la alegerea substratului pe care se construiește dispozitivul strat cu strat, având rolul principal de a oferi un suport mecanic pentru definirea structurii dorite. Procesul de bază al microfabricației este fotolitografia: transferul optic al unei geometrii de pe o mască pe un substrat acoperit cu un strat de fotorezist (prepolimer în stare lichidă care se întinde uniform pe substrat).

Pentru fabricarea electrozilor sunt folosite platina sau aurul. Stratul de aderență (Titan) trebuie să fie inert atât din punct de vedere chimic față de reactanții folosiți în mostrele biologice cât și din punct de vedere electrochimic în condițiile experimentale date și totodată trebuie să fie compatibil cu procedurile de fabricație.

A fost ales Titanul deoarece îndeplinește aceste proprietăți. Cromul nu putea fi folosit deoarece are reactivitate sporită cu lichidele, în special la aplicarea unei tensiuni electrice.

Pașii urmați în etapa de fabricație a dispozitivului sunt:

Pasul 1: Alegerea substratului pe care se construiește dispozitivul, având rolul de suport mecanic, pe care vor fi definite măștile conform Figură 2.2. Fabricarea senzorului impedimetric a fost realizată pe o plachetă de siliciu monocristalin <100>. A fost realizat procesul de oxidare termică cu obținerea unui strat de oxid de 500 nm.

Pasul 2: Procesul de fotogravură pentru M1 (Figură 2.3) : HPR 504 la 3000rpm cu obținerea unui strat de aproximativ 1.5 μm, urmat de corodarea oxidului în soluție BOE, timp de 5 minute. Rezultatul obținut este trecut în etapa de curățare cu acetonă, alcool izopropilic (IPA), apă deionizată și apoi în soluție Piranha.

Pasul 3: Pentru masca M2 (Figură 2.4) urmează procesul de depunere Ti/Au de grosime 30/300nm, cu ajutorul echipamentului AUTO 500, produs de Eduards, prin metoda E-beam. Fotogravura în HPR 504, Corodare Au, corodare Cu, apoi procesul de spălare cu apă deionizată.

Pasul 4: Realizarea măștii M3 prin tehnica de Lift-Off (Figură 2.5). Procesul de fotogravură cu HPR 504 la 1000rpm, rezultând un strat de aproximativ 1.8 μm. Depunerea propriu-zisă a Argintului cu AUTO 504, prin metoda E-beam. Urmează procesul de Lift-Off, curățarea cu acetonă și ultrasunete.

Pasul 5: Statul SiOx depus PECVD, SiH4 + N2O la temperatura de 200˚C. Masca M4 este realizată prin procesul de fotogravură, HPR 504 la 3000rpm, urmat de corodarea SiOx cu BHF într-un timp de 8 minute. Urmează curățarea rezultatului obținut, fără a utilza soluția Pirahna.

Pasul 6: Prin fotogravură, depunerea fotorezistului SU-8 la 3000 rpm pentru un strat de 5 μm.

Camera de reacție și padurile sunt singurele zone lăsate libere, peste tot avem oxid de pasivare, pentru a nu intra soluție peste contacte și astfel, evitarea unui scurtcircuit.

În urma realizării procesului de microfabricație, a rezultat senzorul ilustrat în Figură 2.10, utilizat în etapa următoare, caracterizarea unei soluții de celule. Se observă, în partea de jos: suprafața de contact pentru încadrarea în portul USB de tip SATA II male. Zona activă, reprezentată de camera de reacție este vizibilă, între cei doi electrozi de lucru.

Figură 2.10- Senzorul impedimetric obținut

. DESCRIEREA METODEI

Montajul experimental

Montajul experimental al măsurătorilor efectuate în cadrul lucrării de licență au fost realizate cu scopul de caracterizare a celulelor tumorale, prin analiza de spectrometrie de impedanță electrochimcă cu ajutorul senzorului impedimetric menționat anterior, având în vedere evidențierea proprietăților dielectrice ale soluției investigate.

Figură 3.1 ilustrează ansamblul experimental cu ajutorul căruia au fost preluate măsurătorile dorite.

A B C

E D

Figură 3.1- Montaj experimental: A- soluția de celule, B- ieșirile electrozilor (WE, CE, RE), C- electrozii de conectare specifici spectrometrului de impedanță, D- Spectrometru electric de impedanță, E- preluarea datelor pe un monitor

Montajul experimental, pentru caracterizarea soluției de celule presupune imersarea senzorului obținut în soluția suspensie cu celule (A). Senzorul este conectat în carcasă USB de tip SATA II male, contactul electrozilor fiind realizat corespunzător. În blocul B se observă ieșirile electrozilor (WE, CE, RE), conectate ulterior la cablurile specifice spectrometrului.

Montajul standard constă în utilizarea unei celule electrochimice alcătuite din 3 electrozi: de lucru, auxiliar și de referință și un potențiostat/galvanostat PARSTAT 2273.

În cazul măsurătorilor realizate, senzorul obținut este utilizat ca celulă electrochimică și este conectat la aparat prin electrozii echipamentului (C). Conectarea cu blocul C se realizeză cu ajutorul culorilor corespunzătoare: la verde se conectează electrodul de lucru (WE), roșu corespunde legării cu electrodul auxiliar (CE), alb la electrodul de referință (RE). Cablurile sunt conectate la spectrometru, acesta este conectat prin cablu USB la un monitor. Calculatorul utilizat dispunde de modulul Electrochemistry PowerSuite. Senzorul este imersat în soluția de analizat. Măsurătorile s-au efectuat în intervalul de frecvențe 100 mHz – 1 MHz.

Aparatura utilizată

Caracteristici tehnice: PARSTAT 2273 este cel mai bun spectrometru de impedanță electrochimică existent pe piață. Superioritatea lui constă în capacitanță și rezoluție foarte bune, viteză de răspuns și intensitatea curentului mare, tensiune înaltă, caracteristici care conferă acestui spectrometru calitatea de standard față de toate celelalte sisteme de măsurare a impedanței.

Figură 3.2- Spectrometru de Impedanță Electrochimică-

PARSTAT 2273-Princeton Applied Research [48]

Specificații generale: PARSTAT 2273 este format din:

partea hardware- intervalul de scanare 10V, intensitatea curentului – 2A, complianța 100V, impedanța de intrare 1013, capacitanța 5 pF și analizatorul pentru măsurarea impedanței poate varia plaja de frecvențe de la 100 mHz la 1MHz

partea software- PowerSuite, pachetul de modelare și analiza datelor.

Descriere: spectroscopia de impedanță (IS) este o tehnică experimentală ce compară răspunsul electric a unui sistem analizat la un timp ce variază în funcție de excitația electrică, determinând proprietățile materialului. Tehnica poate fi utilizată pentru:

Caracterizarea materialelor și a proceselor de fabricație

Caracterizarea interfețelor corespunzătoare sistemelor electrochimice și a fenomenelor fizico-chimice

Caracterizarea sistemelor bio-electrochimice

Aplicații:

Microelectronică: dezvoltarea unor procese și materiale cu proprietăți electrice îmbunătățite;

Energie: dezvoltarea unor celule de combustie ca surse de energie nepoluante;

Senzori: dezvoltarea dispozitivelor de tip imunosnezori electrochimici: industria farmaceutică, alimentație, diagnosticare clinică;

Aplicații biomedicale: studii de biocompatibilitate a implanturilor;

Studii fundamentale ale fenomenelor fizico-chimice la interfețele bio-hibrid [49].

Folosind dispozitivul impedimetric obținut și cu ajutorul aparaturii specializate: Spectrometru de Impedanță Electrochimică- PARSTAT 2273- Princeton Applied Research, am realizat măsurători de impedanță.

Primul pas în realizarea măsurătorilor a constat în realizarea soluției de test:10 mM [Fe(CN)6 ]3+/4+ în 0.1 M KCl+ 5ml H2O.

Al doilea pas a constat în realizarea circuitului corespunzător celulei electrochimice:

Verde- electrodul de lucru

Roșu- Counter

Alb- electrodul de referință

Negru- masa

Am setat:

frecvența în intervalul: 100 mHz- 1 MHz.

Amplitudinea 10mV

OCP

0.5 V DC

Montajul experimental presupune utilizarea unei celule electrochimice ce are ca scop principal transformarea energiei chimice în energie electrică. În soluția ionică este introdus senzorul impedimetric, a cărei arie activă este dată de matricea de microelectrozi. Este aplicată o diferență de potențial între electrodul de lucru și electrodul de referință, curentul circulând între acești doi electrozi.

Valoarea curentului este determinată prin diferența de tensiune. Suprafața activă a senzorului trebuie să rămână nemodificată atunci când este aplicat un curent de intensități mari. Înainte de a fi utilizat în experiment, senzorul a fost curățat. Soluția de ferocianură este cel mai utilizat mediator pentru diferite reacții electrochimice, oferind un bun transfer de electroni.

. REZULTATE

Caracterizarea celulelor cu ajutorul senzorului dezvoltat a fost realizată prin metoda spectroscopiei de impedanță electrochimică. La aplicarea unei tensiuni electrice între electrozii de lucru ai senzorului, pe digiții unuia dintre electrozi, anodul, se produce reacția de oxidare iar electronii sunt eliberați, pe digiții celuilalt are loc reacția de reducere cu captare de electroni.

Partea I a experimentului a constat în analiza funcționării corecte a senzorului, testat pe o soluție redox K[Fe(CN)6]-3/-4, pentru determinarea rezistenței transferului de electroni în prezența acestei soluții. Datele prelute din această soluție, denumită experimental: probă, sunt marcate în Tabel 3 din Anexa II. Caracteristicile preluate cu ajutorul metodei EIS sunt frecvența, impedanța reală și impedanța imaginară. Aceste date au fost prelucrate, pentru a obține parametrii necesari caracterizării soluției din punct de vedere electric, evidențiați în Tabelul 5, din Anexa II.

Partea a II-a a experimentului presupune utilizarea montajului precizat în Figură 3.1, pentru a caracteriza un lot de celule melanom, cu diametru de 9-12 m. Celulele au fost imersate într-o soluție buffer ce conținea 10mM de KFe(CN)6. Caracteristile obținute: frecvență, impedanță reală și imaginară sunt trecute în Tabelul 4 din Anexa II. În urma analizei acestor date, au fost obținuți parametrii specifici, marcați în Tabelul 6 din Anexa II.

Cele două părți ale experimentului au fost realizate pentru a remarca funcționarea corectă a senzorului și totodată pentru a caracteriza din punct de vedere electric celulele melanom. Această aplicație, pe celule melanom a fost utilizată pentru a urmări dacă metoda EIS împreună cu matricea de electrozi prezentată pot fi întrebuințate în proiectarea unui dispozitiv pentru diagnosticarea melanomului.

În următoarele figuri sunt înregistrate caracteristicile specifice celor 2 seturi de experimente. Analiza proprietăților dielectrice ale celulelor este un pas foarte important pentru cercetarea viitoare. Acest studiu presupune practic comparația dintre soluția simplă de ferocianură (proba) și proba+celulele imersate în aceasta. Astfel, evidențiem diferențele și fenomenele apărute în urma aplicării unei diferențe de potențial în probă, comparativ cu ceea ce se are loc atunci când în soluția buffer se află și celulele tumorale.

Metoda presupune aplicarea unei tensiuni între -0,45 V și 0,55 V, cu o rată de 200 mV/secundă, între fiecare electrod de lucru (WE) și electrodul de referință Ag/AgCl (RE). Aplicarea unui stimul asupra celulei, duce la modificarea permeabilității membranei celulare. Rezultatul în impedanță modelează conductanța membranei în aria matricei de microelectrozi.

Spetrometru de Impedanță utilizat, folosește programul software PowerSuite, cu ajutorul căruia obținem direct rezultate în impedanță și frecvență.

Parametrii de intrare se păstrează aceeași atât pentru soluția electrolit cât și pentru soluția de celule.

În diagrama Nyquist avem reprezentată impedanța imaginară (Zim) în funcție de impedanța reală (Zre). Caracteristica impedanței este vizualizată în Figură 4.1, comparativ pentru probă și celule. Din curba semicirculară corespunzătoare frecvențelor mari putem determina rezistența transferului de sarcină. Observăm variația liniară a impedanței imaginare în funcție de impedanța reală, fapt datorat procesului de difuzie și această variație este numită impedanță Warburg.

Figură 4.2- Circuitul Randles

Circuitul Randles este cel mai simplu circuit utilizat pentru modelarea reacțiilor electrochimice interfaciale în prezența difuziei. Impedanța unei reacții constă într-un transfer de sarcină Rct și un element electrochimic specific: impedanța Warburg W.

În prezența celulelor se observă o scădere a impedanței iar procesul de difuzie este mult mai activ. Impedanța Warburg în probă este prezentă într-o formă nesemnificativă, pe când în soluția de celule melanom este evident faptul că, odată cu scăderea frecvenței impedanța datorată procesului de difuzie crește.

În diagrama Bode avem reprezentată variația modului impedanței în funcție de frecvență (albastru) și variația modului fazei în funcție de frecvență (verde), astfel că, Bode ne oferă rezultate în plus, dependente de frecvență.

Din caracteristica Bode putem identifica frecvența de rezonanță a celor 2 soluții, prin urmare este remarcabilă diferența dintre cele două experimente. Frecvența de rezonanță pentru probă este vizibilă la 100 Hz, în moment ce, la adăugarea celuleor melanom, frecvența de rezonanță este definită la 100.000 Hz.

Din diagramele Bode și Nyquist putem diferenția un mediu sănătos de un mediu nesănătos prin caracterizarea mediilor din punct de vedere electric: impedanță (este observabil faptul că într-un mediu cu celule melanom impedanța scade), impedanța Warburg este datorată procesului de difuzie și este mult mai mare în soluția de celule melanom.

Atunci când este aplicat un câmp electric, interacția soluției redox cu acest câmp duce la separarea sarcinilor, și astfel formarea unor dipoli. Fenomenul care apare la introducerea dielectricului în câmp electric poartă denumirea în literatura de specialitate de polarizare electrică.

Proprietățile dielectrice ale membranelor celulare au fost caracterizate la frecvențe cuprinse între 0.1 Hz și 1 MHz. În sistemele biologice apar două tipuri de polarizări: migrarea ionilor pe suprafața membranelor celulare indusă de câmpul electric și polarizarea interfacială Maxwell specifică suprafețelor cu conductivitate mică.

Biomaterialele sunt compuse din molecule care prezintă diferențe mari de permitivitate și conductivitate. Membrana celulară are rolul de interfață între interiorul celulei și mediul exterior, are proprietatea de a menține potențialul electric al celulei și stabilește ce intră în interior și ce nu (permeabilitate selectivă). Când se aplică un câmp electric unui astfel de material, mobilitatea purtătorilor de sarcină, cum ar fi ionii, este considerabil mai mare în unele regiuni (de exemplu fazele apoase) în comparație cu alte regiuni (cum ar fi fazele lipide- membrana biologică este alcătuită în principal din lipide). Aceasta duce la apariția unei distribuții de sarcină neuniformă pe suprafețele membranei celulare. Astfel de sisteme în care avem medii de natură diferite, acestea prezintă proprietăți puternic dependente de frecvență, care sunt diferite de proprietățile constituenților fazei. Cu ajutorul permitivității imaginare, în domeniul frecvențelor scăzute, am observat apariția fenomenului de relaxare interfacială Maxwell- Wagner, datorat faptului că sarcinile electrice s-au depus la suprafața membranei celulare.

Scopul lucrării este de a caracteriza celulele din punct de vedere al proprietăților dielectrice. Acest lucru a fost realizat prin spectroscopie de impedanță electrochimică, în domeniul frecvențelor 0,1 Hz și 1 MHz. Pierderile dielectrice au avut loc la interfața dintre faza ionică apoasă a soluției buffer și membrana celulară, prin evidențierea apariției fenomenului de polarizare interfacială Maxwell- Wagner.

În cazul măsurătorilor experimentale asupra permitivității dielectrice a celulelor tumorale la frecvențe în domeniul 0,1 Hz – 1 MHz, există două tipuri de dispersii: dispersia α pentru frecvențe mai mici de 100Hz și dispersia β pentru frecvențe mai mari de 100 Hz. Dispersia α la frecvențe joase se manifestă printr-o creștere importantă a permitivității dielectrice și printr-o mișcare a ionilor tangențial cu suprafața membranară. Mărimea dispersiei α se traduce de obicei printr-o densitate mare de sarcini fixe la nivelul membranei celulare, care se datorează procesului de relaxare a ionilor interfaciali. Dispersia β apare la frecvențe mai mari și se datorează proceselor de polarizare interfacială de tipul Maxwell – Wagner dintre membrană și faza ionică apoasă.

Pielea are impedanța electrică cea mai mare în comparație cu alte organe ale corpului uman, datorită cantității reduse de apă. Atunci când țesutul conține o cantitate scăzută de apă, acesta are capacitatea de a conduce mai bine curentul electric, ca urmare rezistența țesutului crește.

În literatura de specialitate a fost demonstrat faptul că, cu cât țesutul este mai bogat în apă cu atât devine mai capacitiv. Impedanța electrică este o măsură a modului în care țesutul se opune curgerii curentului electric. În comparație cu țesutul sănătos, țesutul anormal diferă prin morfologie, dimensiune și formă a celulelor, dar și prin densitatea și structura membranei celulare. Aceste modificări afectează abilitatea celulelor de a conduce și stoca electricitatea, modificânu-se astfel impedanța electrochimică. Impedanțele la frecvențe joase dau informații despre proprietățile rezistive ale mediului extracelular și anume despre fenomenele de transport molecular din mediul extracelular (impedanța Warburg). Impedanțele la frecvențe înalte dau informații atât despre proprietățile rezistive intracelulare, cât și extracelulare, privind transportul de sarcină transmembranar, capacitatea dublului strat electric (stocarea energiei electrice la nivel celular). Morfologia celulară a țesuturilor își lasă amprenta în spectrul de impedanță electrochimică prin modificarea constantei dielectrice, a indicelui de refracție și a constantei de difuzie. La frecvențe joase curentul electric trece prin mediul extracelular ocolind celulele. Celulele tumorale fiind mult mai mari decât cele normale și de forme neregulate, calea curentului prin țesutul anormal este mult mai lungă, deci impedanța Warburg a țesuturilor anormale este mult mai mare decât a țesuturilor normale. La frecvențe înalte liniile de curent prin țesut sunt drepte influențând numai reactanțele. Membrana celulară este compusă din diferite faze care includ regiuni lipidice și apoase cu proprietăți electrice caracteristice, foarte diferite de la o fază la alta. În cazul celulelor normale (sănătoase) predomină fazele apoase, deoarece în urma metabolismului aerob se elimină dioxid de carbon și apă. În cazul celulelor tumorale, metabolismul lor fiind anaerob se elimină cantități mari de lipide, piruvat și acid lactic.

După cum am menționat la începutul capitolului, datele obținute inițial au fost frecvența și impedanța, utilizate în caracteristicile Nyquist și Bode amintite. Acești parametrii au fost utilizați pentru a se distinge proprietățile dielectrice ale soluțiilor analizate.

Inițial, am calculat

(4.1)

pentru a observa variația acesteia în funcție de frecvență, și faza, calculată pe baza fazei din Zre sau Zim. Faza din Zre se calculează ca fiind

(4.2)

iar faza din Zim este

(4.3)

Rezultatul fazei, astfel determinat, este transformat din radiani în grade. Datele obținute sunt plotate și rezultă Diagrama Bode, reprezentată în Figură 4.3.

Parametrii utilizați sunt evidențiați în tabelele din Anexa II. Rezutatele au fost calculate în Excel cu ajutorul ecuațiilor specifice fiecărui parametru și amintite în partea teoretică.

În cazul măsurătorilor obținute în curent alternativ am obținut două valori ale impedanțelor, de unde reiese obținerea a două permitivități dielectrice ale soluției: permitivitatea reală εre (în fază) și permitivitatea imaginară εim (în opoziție de fază).

Pentru determinarea permitivităților am utilizat formula impedanței :

(4.4)

Înlocuind formula (2.3.2.4) în (5.4), va rezulta faptul că permitivitatea este:

(4.5)

d = distanța dintre electrozi d=10 μm

Zim = impedanța imaginara, cunoscută

S = suprafața interfeței = 980.000 μm2

Membrana celulei este compusă din diferite faze care includ regiuni lipidice și apoase cu proprietăți electrice caracteristice, foarte diferite de la o fază la alta. În cazul celulelor normale (sănătoase) predomină fazele apoase, deoarece metabolismul lor este aerob și în urma glicolizei elimină bioxid de carbon și apă.

În cazul celulelor tumorale, metabolismul lor fiind anaerob, se elimină cantități mari de lipide, piruvat și acid lactic. Acumularea diferitelor specii de sarcini electrice la interfața membranară cu conductivitate redusă duce la formarea procesului de relaxare interfacială de tipul Maxwell-Wagner. Procesul amintit mai sus se observă în Figură 4.4 ca o dispersie a permitivității dielectrice în zonele cu frecvență mai mare.

Se observă faptul că senzorul funcționează corect, distribuția permitivității imaginare în funcție de permitivitatea reală (Figură 4.4) este aceeași cu distribuția impedanței imaginare în funcție de impedanța reală (Figură 4.1).

Dispersia dielectrică este dependența permitivității de frecvență la aplicarea câmpului electric. Diagrama Cole-Cole exprimă relaxarea dielectricului în prezența unor componente biologice.

Este remarcabil faptul că, la frecvențe mici, impedanța reală atinge valoarea maximă, determinând proprietățile rezistive ale mediului extracelular. Odată cu creșterea frecvenței, este străpuns atât mediul extracelular cât și cel intracelular, punând în evidență existența proprietăților capacitive ale mediului intracelular. Se observă faptul că, în probă, la frecvențe de peste 1000 Hz, impedanțele tind spre 0, iar în ceea ce privește soluția de celule variația impedanțelor dependente de frecvență tind sa scadă la frecvențe cu un ordin de mărime mai mare (10.000 Hz).

În Figură 4.6 avem rezultatul experimental al comportamentului dielectric al celulelor, observând faptul că datorită procesului de relaxare interfacială de tip Maxwell-Wagner, apare fenomenul de disperie al permitivității imaginare la frecvențe mai mici de 1 MHz.

Cu albastru avem reprezentată variația permitivității imaginare vs impedanța imaginară, în funcție de frecvență, iar cu portocaliu este realizată curba variației permitivității reale vs impedanța reală, în funcție de frecvență.

Este remarcabilă diferența dintre cele două experimente, permitivitatea membranei celulare infulențând răspunsul în frecvență.

im vs Zim exprimă relația dintre conductivitate (1/Zim), permitivitate (4.5) și impedanță și a fost determinată prin următoarea ecuație:

(4.6)

Conform ecuației (4.6) a fost determinată și variația permitivității reale în funcție de impedanța reală.

Factorul K a fost determinat prin aplicarea relației din teorie (1.3.3.0), fiind calculat în funcție de diferența dintre permitivitatea reală versus impedanța reală (permitivitatea complexă a mediului) și permitivitatea imaginară versus impedanța imaginară (permitivitatea complexă a membranei celulare).

Variația factorului Clausius- Mossotti cu frecvența indică faptul că, la frecvențe foarte mici, sub 2Hz, membranele celulare prezintă polarizabilitate maximă, iar după 2 Hz, odată cu creșterea frecvențelor, celulele prezintă o polarizabilitate negativă, de unde putem deduce faptul că soluția de celule prezintă o permitivitate dielectrică mult mai mică decât permitivitatea dielectrică a soluției de suspensie. Este observabil faptul că, la frecvența de 1MHz, factorul Clausius Mossotti are valoarea 0 pentru probă și -0,49 pentru soluția de celule, valoare la care constanta dielectrică a celulelor este comparabilă cu constanta dielectrică a mediului de suspensie, ceea ce înseamnă că la frecvențe foarte mari membrana celulară devine permeabilă pentru ioni și cu cât crește frecvența cu atât membrana celulară prezintă proprietăți conductive mai bune. În concluzie la frecvențe mari membrana se comportă pur dielectric, iar la frecvențe mici se comportă ca un condutor.

Figură 4.8 exprimă grafic variația indicelui de refracție dintre mediul lichid oferit de soluția de ferocianură de potasiu și suprafața matricei de microelectrozi, cu frecvența. Indicele de refracție este maxim atunci când senzorul este imersat în soluția de testat și îi este aplicată frecvența cea mai joasă de 0.1 Hz. După creșterea frecvenței peste 1 Hz, indicele de refracție dintre cele două medii scade sub 1. În experimentul realizat pe soluția de celule melanom, la frecvența de 1MHz se observă o creștere a indicelui de refracție spre 1, comparativ cu indicele de refracție din probă, unde acesta are o plajă de valori mult mai mici.

Indicele de refracție este insesizabil sau neimportant odată cu creșterea frecvenței, însă este clar faptul că indicele de refracție al melanomului este mai mare decât al soluției probă.

. CONCLUZII ȘI DISCUȚII

Tema abordată se bazează pe cercetări anterioare, cu privire la utilizarea unor senzori impedimetrici având ca aplicație principală diagnosticarea timpurie a cancerului.

În primul rând, scopul proiectului a fost îndeplinit cu succes, prin realizarea senzorului impedimetric cu ajutorul căruia am obținut rezultate promițătoare în ceea ce privește determinarea proprietăților dielectrice ale celulelor.

Pentru realizarea măștilor, având în vedere fabricarea senzorului impedimetric, am utilizat ca suport SiO2 deoarece are permitivitatea cea mai mică și astfel capacitățile parazite sunt reduse.

Electrozii folosiți au reacționat corespunzător așteptărilor, fără a produce reacții nedorite. Matricea de microelectrozi a detectat rapid activitatea celulară, răspunsul electrochimic fiind tranformat în răspuns electric. Prin determinarea proprietăților dielectrice, se realizeză identificarea stării celulelor: sănătoase sau tumorale.

Proprietățile dielectrice ale celulelor și ale țesuturilor biologice reprezintă un domeniu de interes pentru tot mai mulți cercetători. Permitivitatea și conductivitatea celulelor biologice sunt semnificativ dependente de frecvență.

Proprietățile dielectrice ale suspensiei de celule melanom au fost analizate cu ajutorul montajului experimental realizat în principal din senzorul obținut și spectrometrul de impedanță PARSTAT 2273, în domeniul frecvențelor cuprinse între 0,1 Hz și 1 MHz.

Celulele au fost suspendate într-o soluție buffer ce conține 10mM K3Fe(CN)6. Datorită aplicării curentului electric, apare impedanța Warburg ca rezultat al difuziei. În diagrama Nyquist este evidențiată prin linia ce pornește de la a doua jumătate de semicerc, iar în diagrama Bode, este evidentă prin schimbarea fazei la 45˚.

La aplicarea unui curent electric la frecvențe joase, membrana celulară este rezistentă și la un curent electric mic, acesta traversează spațiul extracelular din jurul celulelor rezultând astfel o impedanță ridicată. Odată cu creșterea frecvenței se observă o scădere a impedanței, datorită faptului că membrana celulară se comportă ca un capacitor.

Cu ajutorul măsurătorilor de impedanță se poate realiza diferența dintre un țesut sănătos și un țesut bolnav. Senzorul obținut îndeplinește cerințele dorite și astfel urmeză îndeplinirea unui pas important: realizarea unui dispozitiv neinvaziv pentru diagnosticarea melanomului.

Perspectivele pun accentul pe îmbunătățirea calității senzorului, pentru a putea fi aplicat pe piele, prin adăugarea unor nanopiramiduțe ce vor purta rolul de interfață între senzor și țesut. Al doilea pas constă în realizarea dispozitivului propriu-zis, prin implementarea programului de preluare și înregistrare a datelor, urmând analiza caracteristicilor înregistrate.

Prima încercare a constat în preluarea unor date experimentale, senzorul fiind imersat în soluția de ferocianură și conectat la modulul LMP9100. LMP9100EVM reprezintă un modul de evaluare, oferit de Texas Instruments, utilizat pentru identificarea speciilor chimice, aplicații amperometrice și diferite măsurători electrochimice. Această plăcuță este conectată la un controller digital SPIO4, ce are ca scop înregistrarea datelor și transferul acestora către un calculator printr-o conexiune USB 2.0.

Datele înregistrate sunt imprecise și, până în acest moment nu au fost obținute rezultate utile pentru caracterizarea soluției.

Important este faptul că matricea de microelectrozi reacționează conform cerințelor și senzorul poate fi utilizat în fabricarea unui dispozitiv cu caracter neinvaziv pentru determinarea impedanței electrice a țesutului, medicul sau specialistul fiind capabil să pună un diagnostic asupra zonei investigate, în urma interpretării rezultatului obținut.

BIBLIOGRAFIE

ANEXA I

Fabricația tehnologică a senzorului impedimetric

Aparatura utilizată pentru procesul de microlitografie

DWL 66fs- Sistemul Laser de Litografie

Descriere

Procesul de inscripționare măști este realizat cu sistemului DWL 66fs, prin intermediul unei diode laser de 450nm. Are 2 capete de scriere de 2 și 10 mm, care asigură o rezoluție de 0,6 µm și respectiv 3 µm

Acest echipament este utilizat pentru transferul geometriilor de pe calculator, din fisier.cif pe masca de crom. Formatul măștilor este necesar a avea extensia: DXF, HPGL, Gerber, GDSII sau CIF.

Aplicații

Aparatul de fotolitografie este utilizat pentru executarea măștilor sau chiar pentru expunerea directă a fotorezistului pe material.

Timpul de executare pentru mască

Timpul necesar pentru realizarea măștii depinde de modul de proiectare al măștii și de numărul de măști solicitate. După ce fișierul este acceptat, timpul mediu de executare este de 2 zile., pentru dimensiuni mai mari de 3 microni și de 6 zile pentru dimnesiuni între 1-3 microni.

Aparatura utilizată în procesul de depunere fizică

Electron Beam Evaporation an DC Sputtering system- AUTO 500 (BOC Edwards, UK)

Descriere

Depunere de filme subțiri, cu o cameră de 500×500 mm. Dimensiunea substratului flexibil: 260 nm- diametrul plăcii de lucru.

Depunere multistrat: 6 tipuri diferite de materiale metalice (4 prin e-beam și 2 prin pulverizare).

Materiale de acoperire: Al, Ni, Cr, Au, Pt. Încălzirea substratului ajunge până la 250˚C.

Ultima depunere în vid: 7×10-7 mbar.

Aplicații

Depunerea în vid a filmelor de Al, Ni, Cr, Au, Pt, etc, utilizând pulverizarea în plasmă și/sau evaporarea cu fascicul de electroni

Aparatura utilizată în procesul de depunere chimică

PECVD- LPX-CVD, with LDS module (STS, UK)

Descriere

PECVD = Plasma-assisted chemical vapor deposition of dielectric thin films

Echipamentul PECVD este utilizat pentru depunerea straturilor dielectrice.

Aplicații

Utilizarea acestui echipament se realizează pentru obținerea oxidului de siliciu, poli silicon, nitrură de siliciu

ANEXA II

Rezultate experimentale

Tabel 3- Rezultate preluate- probă

Tabel 4- Rezultate preluate- celule melanom

Tabel 5- Parametrii calculați- probă

Tabel 6- Parametrii calculați- celule melanom