Efectul Exercitat In Vitro de Deoxinivalenol Asupra Proliferarii Celulelor Umane de Adenocarcinom de Colon

LUCRARE DE DIZERTAȚIE

Efectul exercitat in vitro de deoxinivalenol asupra proliferării celulelor umane de adenocarcinom de colon, linia Caco-2

CUPRINS

Lista de abrevieri

CFDA – SE diacetat de carboxi-fluoresceină, succinimidil ester

CI indice celular

DON deoxinivalenol

E.coli Escheria coli

EDTA etilendiaminotetraacetic

FITC izotiocianat de fluoresceină

IEC celule epiteliale intestinale

LDH lactat dehidrogenaza

LB sup supernatant de Lactobacili

MRS mediu DeMan Rogosa și Sharpe

PI iodură de propidiu

ROS specii reactive de oxigen

SFB ser fetal bovin

TFS tampon fosfat salin

Introducere

Contaminarea cu micotoxine din specia Fusarium a cerealelor utilizate în alimente sau ca hrană pentru animale, cum ar fi deoxinivalenolul (DON), ridică probleme importante de sănătate și economice pe tot parcursul lanțului alimentar. Expunerea acută la concentrații mari de DON poate altera integritatea barierei intestinale, în timp ce expunerea cronică la concentrații mici de DON poate avea efecte mai subtile, cum ar fi perturbarea căilor de transmitere intracelulară a semnalului care are consecințe asupra homeostaziei celulare.

Am investigat efectele exercitate in vitro de DON la concentrații joase (0,37–1,50 μM), relevante pentru alimentele contaminate cu micotoxină, asupra viabilității și proliferării celulelor umane de adenocarcinom de colon din linia Caco-2.

Lucrarea a avut ca scop investigarea efectelor exercitate in vitro de concentrații mici de DON, relevante pentru expunerea prin ingerare de alimente contaminate, asupra celulelor umane de adenocarcinom de colon din linia Caco-2.

Obiectivele lucrării au fost (1) Elaborarea unui model metodologic pentru investigarea acțiunii DON asupra viabilității, proliferării și adeziunii la suport solid a celulelor Caco-2; (2) Elaborarea unui model experimental pentru investigarea statusului oxidativ al celulelor Caco-2; (3) Demonstrarea modelului metodologic prin investigarea efectului exercitat in vitro de DON asupra celulelor Caco-2 în diverse stări proliferative.

Capitolul I

Considerații teoretice

1.1. Deoxinivalenol structură și proprietăți biologice

Deoxinivalenolul (DON, vomitoxină) este o micotoxină tricotecenică de tip B produsă de membri ai speciei Fusarium, cu preponderență Fusarium graminearum și Fusarium culmorum.

Structura de sesquiterpenoid a DON este prezentată în Figura 1.

Figura 1. Structura chimică a deoxinivalenolui (C15H20O6; ChemSpider ID36584)

(ChemSpider; http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.36584.html)

DON este un contaminant al cerealelor, cafelei, condimentelor, arahidelor etc. Contaminarea cu DON se produce în cultură și pe parcursul stocării acestor produse în silozuri și depozite.

Un studiu European pe 40.000 probe de alimente a evidențiat contaminarea acestora cu cantități considerabile de DON în intervalul 91–5000 μg/kg. Au fost evidențiate diferențe importante de contaminare a alimentelor în țări diferite. De exemplu 15 % dintre probele alimentare din Belgia, și în 100 % dintre cele din Franța au fost găsite contaminate cu DON [1]. Expunerea cronică a populației la DON a fost estimată ca fiind în medie cuprinsă între 0,22 și 0,58 μg/kg corp pe zi. Expunerea cronică a animalelor de fermă a fost estimată între 3,9 și 43,3 μg/kg corp pe zi [2].

S-a realizat un studiu pe 923 probe de către INCD- Bioresurse Alimentare-IBA București și Administrația Națională de Meteorologie RA în cadrul Contractului ADER 8.1.-2011 „Evaluarea riscului privind contaminarea cu micotoxine a producțiilor anuale de grâu din România”, etapa III „Evaluarea riscului privind contaminarea cu micotoxine a producției de grâu din România” a evidențiat următoarele constatări pentru România (Figura 2):

contaminarea probelor cu DON a variat în intervalul 18,5 – 3602,5 μg/kg, valorile medii fiind nereprezentative

incidența probelor pozitive pentru DON (concentrație mai mare de 18,5 μg/kg) a fost de 54%, cu variații importante în diversele regiuni ale țării

2,49 % din probe au prezentat contaminare cu DON mai mare de 1000 μg/kg, fiind reprezentate de 2,38 % grâu comun și 5,13 % triticale. Probele au provenit din localități în care s-au înregistrat precipitații abundente în perioadele critice de vegetație, sau au fost situate pe malurile sau în apropierea unor râuri.

Figura 2. Contaminarea cu DON pe categorii de cereale cultivate în regiunile agricole ale României în anul agricol 2012 -2013 (conform raportului furnizat de INCD pentru Bioresurse Alimentare-IBA București și Administrația Națională de Meteorologie RA în cadrul Contractului ADER 8.1.-2011 „Evaluarea riscului privind contaminarea cu micotoxine a producțiilor anuale de grâu din România”, etapa III „Evaluarea riscului privind contaminarea cu micotoxine a producției de grâu din România”)

Regulamentul CE nr. 881/ 2006 și 1126-2007 UE a stabilit limitele pentru reglementarea contaminării cu micotoxine a grâului materie primă care poate fi utilizat pentru consumul uman:

– 1.250 μg/kg DON – cereale neprocesate, altele decît grâu durum, ovăz și porumb;

– 1.750 μg/kg DON – cereale neprocesate, grâu durum și ovăz;

– 750 μg/kg pentru făina de grâu și producerea de paste făinoase destinate consumului uman;

– 200 μg/kg pentru cerealele destinate consumului sugarilor și copiilor mici;

– 4 μg/kg Aflatoxine totale (2 μg/kg Aflatoxină B1);

– 5 μg/kg Ochratoxina A – cereale neprocesate;

– 100 μg/kg Zearalenonă – cereale neprocesate, altele decât porumb

Prin introducerea cerealelor în lanțul alimentar, ca hrană pentru animale sau ca produse alimentare procesate, contaminarea cu DON devine o problemă de sănătate publică și veterinară [2-4]. DON fiind termo-stabil pe parcursul procesării hranei contaminate (până la 350oC), micotoxina persistă și este activă în tot lanțul alimentar [5]. Este rațiunea pentru care la nivel internațional au fost elaborate reglementări pentru controlul și reducerea contaminării cerealelor și a produselor alimentare cu DON (Codul de practică pentru prevenția și reducerea contaminării cerealelor cu micotoxină, referitor la zearalelonă, fumonisină și tricotecene). Este absolut necesar ca recolta de cereale să fie monitorizată anual pentru a preveni intrarea în circuitul comercial a loturilor de cereale contaminate peste limita admisibilă, prevenind astfel efectele negative asupra sănătății oamenilor și animalelor.

Pe baza datelor toxicologice și de expunere a populației la DON, comitetul de experți FAO/WHO pentru aditivii alimentari (JECFA, Joint Expert Committee on Food Additives) a propus 1 μg/kg corp ca doză de DON maxim tolerată pentru ingestia zilnică (PMTDI, provisional maximum tolerable daily intake) [6]. Recent s-a evidențiat faptul că expunerea la micotoxină ar putea fi în mod real mai mare decât s-a considerat până în prezent, datorită metaboliților de DON care nu s-au luat în considerație în studiile de expunere.

1.2. Toxicitatea DON

DON la concentrații mari are o puternică acțiune emetică centrală (de aceea DON este denumit vomitoxină). Expunerea acută la doze mari de DON se asociază cu diaree acută, dezinterie, ataxie, hemoragie la nivelul mucoaselor și moarte subită. Voma și pierderea apetitului se manifestă la doze mai joase de DON.

Aceste efecte se datorează efectului direct pe care DON îl exercită asupra barierei intestinale. DON afectează permeabilitatea epiteliului intestinal prin modularea joncțiunilor intercelulare strânse ca urmare a modificărilor induse la nivelul expresiei și localizării celulare a claudinelor. Mai mult, se pare că DON afectează producția de mucus intestinal, ceea ce ar putea explica modificările observate la nivelul microbiotei. DON inhibă de asemenea absorbția nutrienților la nivel intestinal, în special a glucozei și aminoacizilor, prin inhibarea activității transportorului dependent de sodiu-glucoză (SGLT1).

S-a demonstrat faptul că DON la concentrații mai mari de 30 μM perturbă puternic in vitro viabilitatea și funcționalitatea celulelor epiteliale intestinale (IEC). Concentrațiile mari de DON (10-50 μM) exercită efect citotoxic și induc apoptoza IEC, iar concentrațiile mai mici de DON (1-5 μM) inhibă proliferarea celulară. Starea de diferențiere a IEC dictează sensibilitatea celulelor la DON, celulele mai puțin diferențiate fiind mai responsive, în special atunci când sunt expuse pe fața bazolaterală la DON din circulație [7]. Acțiunea DON la nivel intestinal susține efectul emetic al micotoxinei și determină reducerea consumului de hrană, mergând până la anorexie [8-10]. DON afectează de asemenea integritatea barierei hemato-encefalice, ceea ce faciliteză pătrunderea rapidă a DON în creier și declanșarea neuroinflamației și a neurotoxicității. Aceasta ar putea explica efectul emetic și anorexia induse de DON [11].

Absorbția și metabolizarea DON la nivel gastro-intestinal este dictată de microbiota locală. Pătrunderea DON în circulație are consecințe importante asupra parametrilor hematologici și imunologici. În cazul expunerii la DON, chiar la doze relativ mici, au fost semnalate perturbări hematologice, cum ar fi anemia aplastică. S-a evidențiat de asemenea efectul DON de modulare a răspunsului imun, respectiv supresia sau activarea acestuia în funcție de doza de DON și de susceptibilitatea individuală a sistemului imun local și sistemic la acțiunea micotoxinei [12]. Remarcăm faptul că DON exercită efect bifazic asupra răspunsului imun, concentrațiile mici fiind pro-inflamatoare, iar cele mari imunosupresoare. DON la concentrații între 1 și 20 μM afectează expresia unor proteine cu rol în imunitatea înnăscută de la nivel epithelial, cum ar fi COX-2 și β-defensinele. Concentrațiile mici de DON (1-25 μM) stimulează secreția de IL-8, determinând astfel recrutarea granulocitelor și declanșarea inflamației intestinale. La concentrații mici, nanomolare, DON activează macrofagele să secrete citokine pro-inflamatoare, cum ar fi IL-1β, IL-6 și TNFα. Inflamația intestinală în urma expunerii la DON se datoreză și polarizării răspunsului imun local către fenotipul pro-inflamator Th17, prin creșterea selectivă a expresiei genelor care codifică pentru IL-21, IL-22 și IL-23. Activarea de către DON a sistemului imun de la nivelul intestinului susține acțiunea pro-inflamatoare exercitată direct de DON asupra IEC [13]. Pierderea integrității barierei intestinale facilitează de asemenea pătrunderea în circulație a unor microorganisme patogene din zona luminală a intestinului, determinând infecții sistemice și activarea cronică a răspunsului imun anti-microbian [4, 14-16]. DON afectează de asemenea interacția dintre gazdă și patogen prin modularea răspunsului imun înnăscut și adaptiv de la nivel local și sistemic.

DON intră în celule foarte probabil prin difuzie pasivă, și se leagă la ARN-ul ribozomal prin intermediul grupării epoxidice din pozițiile 12-13 (Figura 1), ceea ce determină stres ribotoxic [17-19]. Ca răspuns la stresul ribotoxic indus de DON se fosforilează 188 proteine implicate în transcripție, modulare epigenetică, ciclu celular, procesarea ARN, biogeneza ribozomilor, diferențierea celulară și organizarea citoscheletului. DON activează căi majore de transmitere intracelulară a semnalului:

Proteine asociate ARN ribozomal – protein kinaza activată de ARN dublu catenar (PKR) și kinaza celulelor hematopoetice (Hck). Ambele kinaze acționează în aval de MAP kinaze;

MAP-kinazele ERK1/2, JNK și p38, care modulează imunitatea înnăscută (via NFκB) sau apoptoza (via p53). Tipul de MAP- kinaze care se activează este dependent de doza de DON. Astfel, în cazul macrofagelor concentrațiile nanomolare de DON activează preferențial ERK, determinând supraviețuirea celulelor, în timp ce dozele mai mari, la nivel micromolar, activează p38 și determină apoptoză, clivarea ARN ribozomal și inhibarea sintezei proteice.

În general studiile au fost concentrate pe investigarea in vitro a mecanismelor moleculare celulare și moleculare care stau la baza efectelor gastrointestinale ale DON la concentrații citotoxice (>30 μM). Există însă mult mai puține date privind impactul DON asupra IEC la concentrații necitotoxice (<2.5 μM) care sunt mult mai relevante pentru expunerea la alimente contaminate cu DON [2, 20].

Capitolul II

Materiale și metode

2.1. Modelul experimental

Scopul acestei lucrări a fost de a investiga efectele exercitate in vitro la concentrații scăzute de DON (0,37 – 1,50µM) asupra liniei celulare epiteliale umane de adenocarcinom colorectal Caco-2 în diverse stări de proliferare (celule confluente, neproliferative, comparativ cu celule proliferative). Menționăm faptul că celulele Caco-2 aflate în stare proliferativă au fenotip tumorigen, în timp ce atunci când sunt confluente se manifestă ca enterocite relativ normale.

Am investigat efectul exercitat in vitro de DON asupra unor parametri funcționali ai celulelor Caco-2. Am avut în principal ca obiectiv evaluarea impactului DON asupra viabilității și proliferării celulelor Caco-2, ca determinanți esențiali ai tumorigenezei și progresiei tumorale la nivelul colonului (cazul celulelor Caco-2 cu fenotip tumorigen). Având în vedere faptul că speciile reactive de oxigen (ROS) generate intracelular joacă un rol major în semnalizarea redox și contribuie astfel la menținerea homeostaziei celulare, inclusiv la reglarea proliferării celulare, am studiat activitatea oxidativă a celulelor Caco-2 în corelație cu starea lor proliferativă.

Studiul s-a bazat în principal pe măsurători de impendanță electrică în timp real folosind sistemul xCELLigence. Metoda evidențiază modificările la nivelul cantității de membrană celulară atașată la electrozi, reflectând implicit adeziunea și proliferarea celulară. Pentru verificarea și interpretarea rezultatelor obținute s-au folosit comparativ mai multe metode, cum ar fi reducerea unei sări de tetrazoliu sau evaluarea prin citometrie în flux cu CFDA-SE a numărului de generații celulare rezultate din proliferare. O parte dintre rezultatele experimentelor realizate în cadrul tezei de masterat, referitoare la efectul exercitat in vitro de DON asupra impedanței celulelor Caco-2 și o primă comparare a acestor date cu rezultatele obținute prin testul reducerii MTT/PMS au fost deja publicate [21].

Potențialele efecte citotoxice ale DON au fost determinate ca eliberare de lactat dehidrogenaza (LDH) sau ca apoptoză celulară evaluată prin citometrie în flux cu anexina V-iodură de propidiu.

Activitatea oxidativă intracelulară a celulelor Caco-2 a fost evaluată prin citometrie în flux, utilizând ca marcatori fluorescenți ai ROS fie reactivul CellROX care evidențiază activitatea oxidativă intracelulară globală, fie reactivul MitoSOX care detectează în mod specific anionul superoxid generat la nivelul mitocondriilor în cursul procesului de fosforilare oxidativă.

Figura 3. Modelul experimental de investigare a efectului exercitat in vitro de DON.

Deoxinivalenolul (DON) a fost furnizat de Dr. Ionelia Țăranu de la Institutul de Biologie și Nutriție Animală Balotești, ca soluție apoasă cu concentrația de 10 mM. Această soluție stoc a fost alicotată și păstrată până la utilizare la -18oC.

Înainte de experiment au fost realizate soluții de DON în mediu de cultură complet, cu concentrație de 10 ori mai mare decât concentrația finală în sistemul experimental (0,37 μg/mL, 0,75 μg/mL sau 1,50 μg/mL).

Tulpinile de Lactobacillus (Lactobacillus plantarum (ID1253), Lactobacillus paracasei (ID13239), Lactobacillus acidophilus (ID11692) și mediul DeMan Rogosa și Sharpe (MRS) au fost furnizate prin amabilitatea domnului Dr. O. Dracea de la Institutul Național de Cercetare pentru Microbiologie și Imunologie “Cantacuzino”, București, România. Lactobacilii au fost crescuți în condiții anaerobe în mediu MRS timp de 16 h la 37 °C, apoi diluați 1:15 în MRS proaspăt și cultivați încă 4 h până la jumătatea fazei logaritmice de multiplicare [22]. După măsurarea densității optice (DO) (600 nm = 1.0 ± 0.1, corespunzând cu 1.0 × 109 CFU/mL-L. plantarum; 2.9 × 108 CFU/mL-L. paracasei și 3.2 × 108 CFU/mL-L. acidofilus), bacteriile au fost recoltate prin centrifugare la 4000 rpm timp de 10 min la 4 °C. Supernatanții au fost colectați și au fost amestecate volume egale din fiecare preparat corespunzând unei anumite specii de lactobacili (supernatant de lactobacili, LB sup). LB sup a fost sterilizat prin filtrare (filtre cu porozitatea de 0.22 μm), alicotat și păstrat înghețat până la testare (stocare la −80 °C). Chiar înaintea experimentului, LB sup a fost dezghețat și centrifugat la 4000 rpm timp de 10 min la 4 °C pentru îndepărtarea eventualelor reziduuri solide.

Suspensia stabilizată de E.coli opsonizată cu anticorpi umani anti-E. coli, conținând aproximativ 1 × 109 bacterii/ml, a provenit din kitul BURSTTEST (Glycotope Biotechnology).

Linia celulară de adenocarcinom de colon uman Caco-2 de la ATCC (ATCC® HTB-37) a fost furnizată de Dr. Ionelia Țăranu de la Institutul de Biologie și Nutriție Animală Balotești.

Celulele aderente Caco-2 au fost menținute în cultură prin pasaj de trei ori pe săptămână (luni, miercuri, vineri). Celulele au fost cultivate în mediu de cultură DMEM/F12 (Gibco, Life Technologies) suplimentat cu 1% antibiotic-antimicotic (Sigma-Aldrich), 20% ser fetal bovin (SFB, Biochrom) și 1% aminoacizi neesențiali (Sigma-Aldrich), denumit în continuare mediu de cultură complet. Celulele au fost însămânțate la densitatea de 40.000 celule/cm2 în vase de cultură sterile de 25 cm2 (Biochrom) și au fost cultivate în atmosferă de 5% CO2 și umiditate 95%.

La un grad de confluență de aproximativ 80% atins în aproximativ 48 h celulele au fost detașate de pe suprafața vasului de cultură prin tripsinizare. Pe scurt, mediul de cultură a fost îndepărtat, după care celulele aderate au fost spălate cu tampon fosfat salin fără calciu și magneziu (TFS, Biochrom) pentru îndepărtarea urmelor de ser și de ioni de calciu / magneziu care inactivează tripsina. Peste stratul de celule s-a adăugat 1 mL din soluția de 0,25%/0,02% tripsină/EDTA (Gibco, Life Technologies), după care vasul de cultură a fost incubat la 370C timp de 5-10 min pentru tripsinizarea celulelor. La microscopul ranversat s-a verificat periodic desprinderea celulelor de pe suprafața vasului de cultură pentru a minimiza timpul de expunere al acestora la tripsină. După desprinderea celulelor, tripsina a fost inactivată prin adăugarea a 2 mL mediu de cultură complet care conține 20% SFB (este necesar minim 5% SFB pentru inactivarea tripsinei). Celulele au fost apoi spălate prin centrifugare 5 min la 1200 rpm, la 4oC. Sedimentul celular s-a reluat în 3 mL mediu de cultură complet. Viabilitatea celulelor a fost evaluată la microscopul optic prin testul excluderii albastrului de tripan (0.4% soluție albastru de tripan, Sigma-Aldrich). Pentru aceasta, peste 20 μL suspensie celulară s-au adăugat 20 μL albastru de tripan. Număratoarea celulelor s-a realizat la microscopul optic pe un hemocitometru Burker-Turk. Au fost numărate diferențiat celulele vii (care nu au încorporat albastru de tripan) și celulele moarte (colorate în albastru datorită albastrului de tripan încorporat). Numărarea celulelor s-a realizat pe cel puțin două camere ale hemocitometrului. Evidențiem faptul că o numărătoare corectă se realizează dacă pe cameră sunt între 10 și 50 celule. Dacă suspensia celulară este prea concentrată, se realizează diluarea acesteia înainte de etapa amestecului cu albastru tripan. Dacă suspensia celulară este prea diluată, se centrifughează și se reia într-un volum adecvat de mediu de cultură complet. Pe baza numărului de celule numărate, concentrația suspensiei celulare s-a determinat pe baza urmatoarei formule:

Concentrație suspensie celulară (celule – mL) = x 2 x 104

Viabilitatea celulară s-a determinat pe baza următoarei formule:

% viabilitatea celulară = (nr. celule vii) / (nr. celule vii + nr. celule moarte)

În experimente s-au utilizat doar suspensii celulare cu viabilitate mai mare de 95%.

Pentru investigații pe celule proliferative, celulele Caco-2 au fost lăsate timp de 24 h să adere, după care a fost adăugat DON. Pentru investigații pe celule neproliferative, celulele Caco-2 au fost cultivate timp de 96 h pentru a obține o cultură de celule confluente, după care au fost tratate cu DON.

Pe tot parcursul cultivării celulelor s-au asigurat condiții de sterilitate, respectiv s-a lucrat în hota cu flux laminar, dezinfectată în prealabil prin spălare cu metanol 70% și expunere la UV minim 15 min.

Datele de literatură arată că pasarea îndelungată a liniilor celulare afectează fenotipul acestora. În cazul celulelor Caco-2, după mai mult de 30 pasaje ele iși pierd proprietatea de adeziune la plastic. Este rațiunea pentru care în experimente s-au utilizat celule Caco-2 la pasaje între 4 și 26. Figura 4 prezintă imagini microscopice ale celulelor Caco-2 neconfluente și confluente obținute în laboratorul nostru.

Celule Caco-2 neconfluente

Celule Caco-2 confluente

Figura 4. Imagini ale celulelor Caco-2 neconfluente și confluente.

De asemenea se pot observa imagini microscopice ale celulelor Caco-2 cultivate în diverse perioade de timp (Figura 5).

Figura 5. Celule Caco-2 cultivate în diverse perioade de timp.

2.2. Evaluarea proliferării celulare după tratamentul cu DON

2.2.1. Măsurători de impedanță

Modificarea imperdanței celulare s-a măsurat în timp real cu sistemul xCELLigence (ACEA Biosciences) și reflectă adeziunea sau multiplicarea celulelor, în funcție de starea lor proliferativă [23]. Astfel, metoda a fost utilizată pentru investigarea efectului DON asupra aderenței celulelor Caco-2 confluente non-proliferative, cât și pentru evaluarea dinamicii proliferării în cazul celulelor Caco-2 neconfluente (activ proliferative).

Prezența celulelor aderente pe suprafața electrozilor afectează micromediul ionic local la interfața electrod – soluție, conducând la creșterea impedanței electrodului. Impedanța depinde de calitatea interacței dintre celule și electrozi. Cu cât sunt mai multe celule aderate pe electrod, cu atât este mai mare creșterea impedanței. Mai mult, schimbarea formei celulei atașate la electrozi pe parcursul experimentului determină de asemenea modificări la nivelul impedanței. În figura 6 este prezentat sistemul xCELLigence utilizat în acest studiu.

Figura 6. Sistemul xCELLigence.

Pentru măsuratori de impedanță în timp real au fost utilizate plăci de cultură de tip E-Plate 16 sau E-Plate view (ACEA Biosciences), destinate măsurătorilor de impedanță celulară cu sistemul xCELLigence. După cum se observă și în Figura 7, plăcile conțin o rețea de microelectrozi din aur care captează modificările de semnal electric asociate aderării celulelor sau multiplicării acestora. Menționăm faptul că plăcile de tip E-plate View permit și vizualizarea celulelor aderate pentru corelarea morfologiei celulare cu rezultatele măsurătorilor de impedanță.

Figura 7. Placă de cultură de tip E-Plate 16 pentru măsurarea impedanței celulare. Imagini reproduse după ACEA Biosciences (http://www.aceabio.com/theory.aspx?cateid=277).

Pentru stabilirea uniformă a nivelului zero în toate godeurile plăcilor, s-au repartizat 50μL mediu de cultură complet. După aceea s-au însămânțat celulele la concentrația de 7000 celule/godeu/100μL. Volumul final de probă în acest moment a fost de 150μL. Probele au fost repartizate în duplicat. Pentru investigații pe celule în stare de proliferare activă, celulele Caco-2 au fost lăsate timp de 24 h să adere, după care s-a adăugat DON. Celulele Caco-2 confluente (neproliferative) au fost obținute în culturi de 96 h înainte de adăugarea DON.

Pentru măsurătoare, a fost setată frecvența achiziție a semnalului de impedanță care a fost programată diferențiat pentru diverse intervale de timp relevante pentru funcționalitatea celulară:

citire la 30 min în primele 24 h (adeziunea celulelor și intrarea lor în faza proliferativă);

citire la 5 min după adăugarea stimului și în următoarele 2 h (detalierea efectelor imediate ale stimulului);

citiri la 15 min în faza proliferativă și după atingerea confluenței.

Datele experimentale se obțin ca indice celular (cell index; CI) în funcție de timp. O curbă reprezentativă este descrisă în figura 8, în care au fost evidențiate diverse procese celulare pe parcursul cultivării celulelor Caco-2: faza de adeziune celulară, faza de proliferare celulară, atingerea confluenței și compromiterea graduală a adeziunii celulare datorită inhibiției de contact.

Figura 8. Dinamica impedanței celulare, reprezentată ca „indice celular” (cell index) pe parcursul cultivării celulelor Caco-2.

Indicele celular este un parametru adimensional care este folosit pentru a evalua modificarea relativă a impendanței electrice datorită modificării statusului celular. Valoarea indicelui celular reflectă creșterea numărului de celule aderate, capacitatea lor de aderare, ca și modificările de adeziune. Indirect, impedanța celulară poate fi utilizată pentru evidențierea morții celulare, având în vedere faptul că celulele aderente moarte își pierd proprietatea de adeziune la suport solid.

2.2.2. Testul reducerii MTT/PMS în prezența-absența de DON

Testul reducerii sării de tetrazoliu la formazan solubil MTT/PMS (metodă colorimetrică) a fost utilizat pentru evaluarea numărului de celule active din punct de vedere metabolic în cultură. S-a utilizat kit-ul CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corporation), al cărui reactiv de detecție este un compus de tetrazoliu [MTT; 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazoliu, sare internă] și un reactiv care se cuplează cu electronii (PMS; fenazin metosulfat). În celulele metabolic active, sistemul MTT/PMS este bioredus de către NADPH sau NADH produse de dehidrogenazele celulare. Rezultă un compus de formazan care este solubil în mediul de cultură. Absorbanța compusului de formazan la 490 nm este proporțională cu numărul de celule vii în cultură.

Celulele Caco-2 au fost însămânțate în placă de cultură sterilă cu 96 godeuri, la o densitate de 7000 celule/100µl mediu de cultură complet. Celulele au fost cultivate în absență de DON (control celular) și în prezență de diverse concentrații de DON. În paralel au fost realizate probe acelulare pentru determinarea fondului (probe care conțin numai mediu de cultură complet). Probele au fost realizate în triplicat. La încheierea timpului de incubare în fiecare probă s-au adaugat 20µl reactiv MTT/PMS, după care probele au fost incubate la 370C timp de 3 h.

Absorbanța s-a determinat la un cititor ELISA (Sunrise, Tecan) la 492 nm, față de lungimea de undă de referință de 620 nm. Rezultatele au fost exprimate ca diferența de densități optice DO= DO492-DO620. Din DO a probelor s-a scăzut apoi DO corespunzătoare fondului [24].

2.2.3. Analiza generațiilor celulare prin citometrie în flux prin marcare cu CFDA-SE

Numărul de generații celulare generate ca urmare a proliferării celulelor Caco-2 s-a determinat prin citometrie în flux cu celule marcate cu colorantul CFDA SE (diacetat de carboxi-fluoresceină, succinimidil ester).

CFDA-SE difuzează pasiv în celule. El este un compus incolor și nefluorescent până când grupările sale acetat sunt clivate de esterazele celulare, generându-se un compus fluorescent (succinimidil ester de carboxifluoresceină). Gruparea succinimidil ester reacționează cu aminele intracelulare, formând conjugate fluorescente care sunt bine reținute în celule. Excesul de reactiv neconjugat difuzează pasiv în mediul extracelular, putând fi astfel îndepărtat. Aductul de colorant-proteină care se formează în celulele marcate cu CFDA-SE este reținut în celule pe parcursul dezvoltării acestora și al meiozei. Compusul marcat este transmis celulelor fiică după diviziunea sau fuziunea celulară. Figura 9 prezintă diagrama FSC-SSC (împrăștiere înainte-împrăștiere în lateral) de citometrie în flux, după 72 h de cultivare a celulelor proliferative.

Figura 9. Diagrama FSC-SSC (împrăștiere înainte-împrăștiere în lateral) de citometrie în flux, după 72 h de cultivare a celulelor proliferative. Selecționarea celulelor vii pentru analiză.

În Figura 10 se prezintă un exemplu de reprezentare a generațiilor fiică pornind de la populația mamă marcată cu CFDA-SE, și evaluarea indicelui de proliferare.

Figura 10. Exemplu de reprezentare a generațiilor fiică pornind de la populația mamă marcată cu CFDA-SE, și evaluarea indicelui de proliferare. Informații furnizate de programul ModFit LT pe baza datelor de citometrie în flux achiziționate cu programul CellQuest.

Pentru realizarea testului s-a utilizat kitul Vybrant CFDA SE Cell Tracer kit de la Invitrogen (Molecular Probes). Pe scurt, celulele au fost însămânțate în placă cu 12 godeuri la o densitate de 83.000 celule/godeu în 1,5 mL mediu de cultură complet. Celulele au fost incubate 24 h pentru aderare. Mediul de cultură a fost îndepărtat și înlocuit cu o soluție de 10μM CFDA-SE în TFS. Probele au fost incubate 15 min la 370C pentru încorporarea marcatorului. Mediul a fost apoi schimbat cu mediu proaspăt pentru îndepărtarea marcatorului neîncorporat în celule. Culturile au fost incubate încă 30 min la 370C pentru echilibrarea marcatorului în celule. Mediul de cultură a fost schimbat încă o dată, după care s-a adăugat DON. La încheierea experimentului, peste stratul de celule sau adăugat 200µl din soluția de 0,25%/0,02% tripsina/EDTA, după care placa de cultură a fost lăsată timp de 5-10 minute pentru tripsinizarea celulelor. Celulele au fost apoi spălate prin centrifugare 5 min la 1200 rpm, la 40C. În final celulele s-au reluat în 500µl tampon de fixare (BD CellFix; BD Biosciences) și au fost incubate 15 min la temperatura camerei la întuneric. Probele fixate pot fi ținute 24 h la frigider, până la citirea lor la citometrul în flux. Citirea probelor s-a realizat la citometrul în flux FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizând programul CellQuest pentru achiziția datelor. Prelucrarea datelor a fost realizată cu programul ModFit LT.

2.3. Evaluarea citotoxicității DON

2.3.1. Eliberarea LDH

Lactat dehidrogenaza (LDH) este o enzimă cu localizare intracelulară, care este eliberată din celulă atunci când membrana plasmatică este lezată. Măsurarea LDH în mediul extracelular oferă informații privind integritatea membranei celulare. În corelație cu reducerea MTT/PMS care evidențiază numărul de celule metabolic active, eliberarea LDH oferă informații privind acțiunea citotoxică a unei substanțe. Citotoxicitatea se asociază cu scăderea intensității reacției MTT/PMS, însoțită de creșterea eliberării LDH.

Eliberarea LDH a fost măsurată spectrofotometric cu kitul Cytotox 96 Non- Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega). Celulele Caco-2 au fost însămânțate în placă de cultură sterilă cu 96 godeuri, la o densitate de 7000 celule/100µl mediu de cultură complet. Celulele au fost cultivate în absență de DON (control celular) și în prezență de diverse concentrații de DON. În paralel au fost realizate probe acelulare pentru determinarea fondului (probe care conțin numai mediu de cultură complet). Probele au fost realizate în triplicat.

La încheierea experimentului, placa de cultură a fost centrifugată 5 min la 250G, după care s-au recoltat 50µl supernatant care au fost transferați în altă placă de cultură cu 96 godeuri. Peste acești supernatanți s-au adăugat câte 50µl din amestecul de reacție al kitului și probele au fost incubate la întuneric timp de 30 min pentru dezvoltarea reacției. Reacția a fost stopată cu reactivul special al kitului.

Absorbanța probelor s-a măsurat la un cititor ELISA (Sunrise, Tecan) la 492 nm. Rezultatele au fost exprimate ca diferența de densități optice DO= DOprobă-DOfond.

2.3.2. Evaluarea proceselor de apoptoză și necroză celulară

Apoptoza (moarte celulară programată) este un proces fiziologic normal care are loc în timpul dezvoltării embrionare și în homeostazia celulelor pentru eliminarea celulelor compromise. Unul dintre procesele celulare asociate apoptozei este inducerea unei asimetrii membranare prin expunerea pe suprafața celulelor apoptotice a fosfatidil serinei care este prezentă în mod normal pe fața citoplasmatică membranei plasmatice. Anexina V este o proteină care leagă fosfolipidele cu masa moleculară de 35-36 kDa, și are afinitate mare pentru fosfatidil serină. Legarea este dependentă de concentrația ionilor de Ca 2+ din mediu și de concentrația totală de săruri. Iodura de propidiu este încorporată de celulele necrotice și se inserează în nucleu.

Apoptoza celulară a fost determinată prin citometrie în flux cu anexină V (marcată cu FITC) și iodură de propidiu (kit BD Pharmingen).

Celulele au fost însămânțate pe o placă cu 12 godeuri la o densitate de 83.000 celule/ godeu. La 24 h de cultivare, când se consideră că celulele au aderat, mediul de cultură a fost înlocuit cu mediu de cultură conținând DON.

După 48 h de la adăugarea DON în cultură, mediul din fiecare godeu a fost recoltat pentru prelevarea celulelor moarte, care își pierd proprietatea de aderență. La încheierea experimentului, peste stratul de celule sau adăugat 200µl din soluția de 0.25%/0.02% tripsina/EDTA, după care placa de cultură a fost lăsată timp de 5-10 minute pentru tripsinizarea celulelor.

Suspensia de celule rezultată s-a centrifugat 5 min la 1200 rpm, la 4oC. Sedimentul celular s-a spălat de două ori cu TFS rece (ținut pe ghiață) prin centrifugare de 5 min la 1200 rpm, la 4oC. Sedimentul celular a fost reluat în tamponul pentru anexină al kitului la o concentrație de 1 x 106/ml. Pentru testare am utilizat tuburi speciale pentru citometrie in flux s-au repartizat 5µl anexină V și 5µl iodură de propidiu, peste care s-au adăugat 100 µl din concentrația 1 x 106/ml. Probele se vortexează ușor și se incubează 15 min la temperatura camerei și la întuneric. În fiecare tub se adaugă în final 300 µl tampon pentru anexină pentru diluarea marcatorilor. Probele astfel pregătite se analizează prin citometrie în flux în decurs de o oră. Măsurarea probelor s-a realizat prin citometrie în flux la un citometru FACSCalibur cu ajutorul programului CelQuest (achiziția și prelucrarea datelor). În Figura 11 este prezentată diagrama FSC-SSC (împrăștiere înainte-împrăștiere în lateral) de citometrie în flux.

Figura 11. Diagrama FSC-SSC (împrăștiere înainte-împrăștiere în lateral) de citometrie în flux – selecționarea populației celulare de interes pentru analiză.

Un exemplu de reprezentare a populațiilor de celule apoptotice și necrotice într-o cultură evaluate prin citometrie în flux este prezentat în Figura 12.

Figura 12. Exemplu de reprezentare a populațiilor de celule apoptotice și necrotice într-o cultură, evaluate prin citometrie în flux. Apoptoza a fost determinată ca asimetrie membranară evidențiată cu anexina V marcată cu FITC. Necroza a fost evidențiată cu iodură de propidiu.

2.4. Evaluarea activității oxidative intracelulare

Activitatea oxidativă intracelulară a celulelor Caco-2 în diverse sisteme experimentale a fost investigată prin citometrie în flux cu marcatori specifici pentru acest tip de activitate:

CellROX, care este un indicator al prezenței speciilor reactive de oxigen (ROS) în celulele vii. Compusul nu este fluorescent în stare redusă, dar emite fluorescent atunci când este oxidat și se leagă în această stare la ADN (mitocondrial sau genomic)

MitoSOX, care este indicator de superoxid anion mitocondrial, este generat ca produs secundar al procesului de fosforilare oxidativă pentru generarea de ATP. Intensificarea producției de anion superoxid la nivel mitocondrial este asociată cu diverse patologii, cum ar fi cancer [25], boli cardiovasculare [26], boli neurodegenerative [27] etc. MitoSOX pătrunde în celulele vii și se leagă în mod specific la mitocondrii. Aici este oxidat de anionul superoxid (dar nu și de alte ROS) și devine în consecință fluorescent. În stare oxidată, MitoSOX se leagă la acizi nucleici. S-a demonstrat faptul că MitoSOX interacționează specific numai cu anionul superoxid la nivel mitocondrial.

2.4.1. Evaluarea activității oxidative intracelulare globale cu indicatorul CellROX

Activitatea oxidativă intracelulară globală a fost evaluată prin citometrie în flux cu indicatorul CellROX, utilizând kitul CellROX oxidative stress reagent (Molecular Probes).

Celulele Caco-2 au fost cultivate în placă de 12 godeuri la o densitate de 83.000 celule/godeu în 1,5 ml mediu de cultură complet .

Soluția stoc de 2,5mM CellROX a fost diluată la concentrația de 5 µM în mediu de cultură complet. Mediul din cultură a fost înlocuit cu mediul care conține CellROX 5µM, iar celulele au fost incubate 30 min la 37oC pentru marcare. Mediul cu CellROX a fost îndepărtat, iar celulele aderente marcate au fost desprinse prin tripsinizare.

Suspensia celulară a fost spălată în TFS prin centrifugare 5 min la 1200 rpm, la 4oC. Sedimentul celular a fost reluat în final în 500µl tampon de fixare (BD CellFix; BD Biosciences) și a fost incubat 15 min la temperatura camerei la întuneric pentru fixare. Probele fixate pot fi ținute 24 h la frigider, până la citirea lor la citometrul în flux.

Citirea probelor s-a realizat la citometrul în flux FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizând programul CellQuest pentru achiziția și prelucrarea datelor.

2.4.2. Evaluarea producerii de anion superoxid cu indicatorul MitoSOX

Generarea de anion superoxid mitocondrial a fost evaluată prin citometrie în flux cu indicatorul MitoSOX, utilizând kitul MitoSOX Red mitochondrial superoxide indicator for live cell imaging (Molecular Probes).

Celulele Caco-2 au fost cultivate în placă de 12 godeuri la o densitate de 83.000 celule/godeu în 1,5 ml mediu de cultură complet .

MitoSOX a fost dizolvat la concentrația stoc de 5 mM în DMSO. Concentrația finală pentru marcarea celulelor a fost de 5 µM în TFS. Marcarea celulelor Caco-2 cu MitoSOX s-a realizat 10 min la 37oC, după care a fost îndepărtat marcatorul, iar stratul de celule aderate a fost spălat cu TFS la temperatura camerei și desprinse prin tripsinizare. Suspensia celulară a fost centrifugată 5 min la 1200 rpm, la 4oC, iar sedimentul celular a fost reluat în final în 0,5mL TFS. Citirea probelor la citometru în flux s-a realizat în maxim 30 min, întrucât celulele marcate cu MitoSOX nu se fixează.

Citirea probelor s-a realizat la citometrul în flux FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizând programul CellQuest pentru achiziția și prelucrarea datelor.

În Figura 13 este prezentată diagrama FSC-SSC (împrăștiere înainte-împrăștiere în lateral) de citometrie în flux.

Figura 13. Diagrama FSC-SSC (împrăștiere înainte-împrăștiere în lateral) de citometrie în flux – selecționarea populației celulare de interes pentru analiză.

Model de diagramă privind distribuția fluorescenței indicatorilor de ROS CellROX (a) și MitoSOX (b) într-o populație de celule este reprezentat în Figura 14.

Figura 14. Model de diagramă privind distribuția fluorescenței indicatorilor de ROS CellROX (a) și MitoSOX (b) într-o populație de celule; definirea subpopulației celulare pozitive (M1) care dezvoltă activitate oxidativă intracelulară crescută.

2.4.3. Prelucrarea statistică a datelor experimentale

Datele experimentale individuale obținute în triplicat în cadrul aceluiași experiment, și datele obținute în experimente distincte au fost prelucrate statistic ca medie ± eroare standard a mediei (SEM) cu ajutorul programului Excel. Comparația între grupuri de rezultate s-a realizat cu testul Anova, utilizand programul SPSS versiunea 19, în accepțiunea că datele nu sunt distribuite normal.

În schema de mai jos este prezentată o diagramă a studiului de față

Capitolul III

Rezultate și discuții

Inițial, în lucrarea de față s-a realizat un studiu preliminar privind efectul exercitat in vitro de DON asupra viabilității/multiplicării celulelor din linia umană Caco-2 (celule de adenocarcinom de colon). Determinările s-au realizat prin testul reducerii MTT/PMS care reflectă metabolismul celular și implicit multiplicarea celulară.

Rezultatele preliminare (Figura 15) au arătat că DON reduce drastic numărul de celule Caco-2 metabolic active aflate în stare proliferativă, la concentrații mai mari de 2μM. Efectul DON se intensifică în timp, fiind mai pregnant la 48 h comparativ cu 24 h de cultură. Efectul inhibitor al 1,50 μM DON se manifestă la timpi mai îndelungați de cultivare (48 h), efectul fiind mai modest la 24 h de expunere. La concentrații mai mici de 1,50 μM, DON nu mai exercită efecte statistic semnificative, nici chiar la 48 h de expunere a celulelor.

Datele experimentale preliminare au arătat că expunerea prelungită la concentrații relativ mici de DON, în jurul valorii de 1,50 μM, poate limita metabolismul sau proliferarea celulelor de colon din linia Caco-2. Pe baza rezultatelor obtinuțe prin testul reducerii MTT/PMS nu se poate preciza însă dacă DON limitează metabolismul celular, sau inhibă proliferarea celulară, sau exercită efect citotoxic. Aceasta este rațiunea pentru care am inițiat un studiu prin care să investigăm mai țintit efectele antiproliferative sau citotoxice ale concentrațiilor mici de DON (0,37-1,50) µM asupra celulelor de colon Caco-2 cu diverse grade de proliferare (celule activ proliferative și celule neproliferative, confluente). Figura 15 prezintă efectul exercitat in vitro de DON asupra intensității reducerii MTT/PMS de către celulele Caco-2 proliferative.

Figura 15. Efectul exercitat in vitro de DON asupra intensității reducerii MTT/PMS de către celulele Caco-2 proliferative. Rezultate experimentale prezentate ca medie ± SEM pentru n=4 experimente independente.

3.1. Studiul celulelor Caco-2 evaluate prin măsurători de impedanță în timp real

În continuare s-a investigat în timp real efectul exercitat in vitro de DON asupra proliferării celulelor Caco-2, utilizând măsurători de impedanță electrică celulară realizate cu sistemul xCELLigence. Modificările de impedanță reflectă cumulativ efecte la nivelul multiplicării și aderenței celulare. Pe scurt, celulele au fost lăsate 24 h să adere la electrozii plăcii, după care s-a adăugat DON în diverse concentrații (0,37-1,50 μM) și s-a continuat cultivarea. Au fost urmărite în dinamică faza de aderență celulară la suport solid, faza de proliferare și faza de confluență celulară.

Datele experimentale descrise în Figura 16 arată că 1,50 μM DON inhibă multiplicarea celulelor Caco-2 proliferative, menținându-le aproximativ la numărul de celule aderate în momentul adiției toxinei. Acest efect de blocare a proliferării celulare persistă pentru cel puțin 150 ore de la inițierea culturii (aproximativ 126 ore de expunere a celulelor la DON).

Figura 16. Efectul exercitat in vitro de 1,50 μM DON asupra semnalului de impedanță dat de celulele Caco-2 proliferative. Măsurători realizate cu sistemul xCELLigence. Date prezentate ca medie ± SEM pentru duplicate de probă realizate în cadrul aceluiași experiment. Experiment reprezentativ din 5 exeprimente independente realizate.

Forma curbei de impedanță a celulelor Caco-2 în prezență de DON indică stabilirea unui posibil echilibru dinamic între moarte și proliferare celulară, sau arestarea ciclului celular, astfel încât numărul celulelor aderate la suport solid nu mai crește comparativ cu cultura netratată. Acest tip de efect, de inhibiție a multiplicării celulare, este susținut de imaginile de microscopie optică prezentate în Figura 17 care arată un număr mai mic de celule aderate la suport solid în culturile tratate cu 1,5μM DON, comparativ cu celulele netratate. Potențialele efecte citotoxice ale DON nu sunt evidente în aceste imagini, respectiv nu este semnificativ crescut numărul de celulele moarte, care se caracterizează prin aspect rotunjit și pierderea proprietăților de adeziune.

celule netratate cu DON

b) celule tratate cu 1,5μM DON

Figura 17. Imagini ale celulelor Caco-2 după 48 h de cultivare în absența (a) și în prezență de 1,50 μM DON (b).

Efectul anti-proliferativ exercitat de 1,50 μM DON, evidențiat prin măsurători de impedanță, pare să fie același indiferent de gradul de proliferare a celulelor Caco-2. În Figura 18 este reprezentat un experiment în care celulele Caco-2 au avut o rată de proliferare mai scăzută decât celulele din experimentul prezentat în figura 16, respectiv au prezentat valori mai mici ale indicelui celular în funcție de timp, ca și interval de timp mai lung până la atingerea confluenței. Și în cazul celulelor Caco-2 mai slab proliferative se observă faptul că 1,50 μM DON inhibă rapid multiplicarea celulelor, iar acest efect este persistent.

Figura 18. Dependența efectului exercitat in vitro de 1,50 μM DON de gradul de proliferare a celulelor Caco-2. Măsurători de impedanță în timp real realizate cu sistemul xCELLigence.

Gradul de inhibiție a proliferării celulelor Caco-2 de către 1,50 μM DON este doar în aparență dependent de rata de proliferare a celulelor. Astfel, gradul de inhibiție al celulelor mai slab proliferative este de 21% în experimentul descris în Figura 18, iar gradul de inhibiție al celulelor mai proliferative este de 45% în experimentul din Figura 16. În fapt, rezultatele experimentale ne arată că DON limitează numărul de celule aderate la valoarea atinsă înainte de adiția toxinei și nu depinde de rata de proliferare a celulelor.

Prin măsurători de impedanță am investigat comparativ efectul asupra proliferării celulelor Caco-2, exercitat de diverse concentrații de DON în intervalul (0,37-1,50) μM. Datele descrise în Figura 19 arată că 1,50 μM DON limitează drastic multiplicarea celulelor Caco-2, așa cum am aratăt și în experimentele descrise mai sus. Efectul nu se mai manifestă la doze mai joase de DON, respectiv 0,75 μM și 0,37 μM. Mai mult, 0,37 μM pare să susțină cel puțin într-o primă etapă proliferarea celulelor Caco-2, determinând atingerea mai rapidă a confluenței (60 ore în cazul celulelor netratate cu DON și 48 h în cazul celulelor tratate cu 0,37 μM DON). Aceste date experimentale obținute prin măsurători de impedanță în timp real sunt în acord cu cele descrise în Figura 15, obținute prin testul reducerii MTT/PMS.

Studiul evidențiază faptul că DON iși modifică acțiunea într-un interval de concentrații îngust (0,37-1,50 μM), de la un efect moderat pro-proliferativ la concentrația de 0,37 μM, la un efect marcant anti-proliferativ la concentrația de 1,5μM.

Figura 19. Efectul exercitat in vitro de DON în intervalul de concentrații (0,37-1,50) μM asupra semnalului de impedanță dat de celulele Caco-2 proliferative. Măsurători realizate cu sistemul xCELLigence. Date prezentate ca valori medii pentru duplicate de probă realizate în cadrul aceluiași experiment.

3.1.1. Proliferarea celulelor Caco-2 evaluată prin testul reducerii MTT/PMS

În paralel cu măsurătorile de impedanță celulară, am realizat experimente de evaluare a viabilității / multiplicării celulelor Caco-2 cu ajutorul testului reducerii MTT/PMS. Acest test reflectă metabolismul celular, respectiv activitatea dehidrogenazelor care bioreduc sarea de tetrazoliu prin intermediul NADPH și NADH produse de aceste enzime. Testul reducerii MTT/PMS poate fi asimilat în general cu un test de proliferare care evidențiază numărul de celule metabolic active [28].

Datele descrise în Figura 20 arată că 1,50 μM DON determină scăderea intensității reacției MTT/PMS dezvoltate de celulele Caco-2 proliferative tratate cu micotoxină timp de 72 h. Se observă reducerea semnificativă, la aproximativ 48%, a numărului de celule metabolic active sub acțiunea DON. Scăderea numărului de celule metabolic active s-ar putea datora citotoxicității DON sau blocării ciclului celular. Pentru lămurirea acestor aspecte au trebuit să fie realizate teste de evidențiere a morții celulare, care vor fi prezentate într-un subcapitol ulterior.

Figura 20. Efectul exercitat in vitro de 1,50 μM DON asupra intensitătți reacției MTT/PMS dezvoltate de celulele Caco-2 în stare proliferativă. Date prezentate ca medie ± SEM pentru 8 experimente independente.

S-a analizat de asemenea curba doză-efect pentru DON în intervalul de concentrații (0,37-1,50) μM. Datele prezentate în Figura 21 evidențiază faptul că 1,50 μM DON reduce drastic numărul de celule metabolic active, dar concentrațiile mai mici de DON, respectiv 0,37 μM și 1,50 μM, nu mai limitează multiplicarea celulelor Caco-2. Se observă de asemenea faptul că 0,37 μM DON are tendința de a intensifica reacția de reducere a MTT/PMS de către celulele Caco-2 proliferative. Acest efect stimulator se exercită mai târziu, el înregistrându-se la 48 h, dar nu la 24 h de cultură. Rezultatele experimentale obtinuțe prin testul reducerii MTT/PMS sunt în acord cu cele obtinuțe prin măsurători de impedanță (Figura 19).

Figura 21. Efectul exercitat in vitro de DON în intervalul de concentrații (0,37-1,50) μM asupra intensității reacției MTT/PMS dezvoltate de celulele Caco-2 în stare proliferativă. Date prezentate ca medie ± SEM pentru triplicate de probă.

În continuare s-a investigat dependența efectului anti-proliferativ exercitat de 1,50 μM DON de natura celulelor tumorale. Prin metoda reducerii MTT/PMS, am investigat în paralel efectul exercitat de (0,37-1,50) μM DON asupra celulelor de adenocarcinom de colon Caco-2 și asupra celulelor de carcinom de sân MCF-7. Datele experimentale prezentate în Figura 22 arată că DON are același tip de curbă doză-efect indiferent de natura celulelor tumorale luate în studiu. În ambele cazuri constatăm inhibarea reacției MTT/PMS de către 1,50 µM DON și tendința de stimulare a reacției de către 0,37 µM DON. Mai mult, rezultatele obținute cu celulele MCF-7, care prezintă defect de apoptoză la nivelul caspazei 3, arată că efectul inhibitor exercitat de 1,50 μM DON nu pare sa fie dependent de caspaza 3 și de moartea celulelor Caco-2 prin apoptoză. Nu excludem totuși posibilitatea că apoptoza celulară să intervină prin alte mecanisme [29].

Figura 22. Comparație între efectul exercitat in vitro de DON în intervalul de concentrații (0,37 – 1,50) μM asupra intensității reacției MTT/PMS dezvoltate de celulele de adenocarcinom de colon Caco-2 și de celulele de carcinom de sân MCF-7. Date prezentate ca medie ± SEM pentru triplicate de probă.

Testul reducerii MTT/PMS confirmă rezultatele obținute prin măsurători de impedanță referitoare la: a) limitarea multiplicării celulelor Caco-2 sub acțiunea DON la concentrația de 1,50 μM; b) tendința de stimulare a metabolismului sau proliferării celulelor sub acțiunea DON la concentrația de 0,37 μM DON. Totuși, fiind un test la punct fix (end-point), testul reducerii MTT/PMS oferă mai puține informații decât măsurătorile de impedanță în timp real, cel puțin în ceea ce privește capacitatea de a evidenția rapiditatea cu care DON limitează multiplicarea celulară, ca și persistență și constanta acestui efect în timp.

Am constat de asemenea că intensificarea reacției de reducere a MTT/PMS nu reflectă în unele cazuri multiplicarea celulelor proliferative, ci intensificarea metabolismului celular. Această constatare s-a conturat într-un studiu colateral în care am investigat potențiala acțiune modulatoare a unui supernatant de lactobacili (LB sup) asupra celulelor Caco-2 tratate cu 1,50 μM DON. Studiul a fost inițiat cunoscându-se faptul că lactobacilii (LB) s-au dovedit probiotice eficiente pentru contracararea efectelor dăunătoare ale micotoxinelor din specia Fusarium [30]. După ce au fost aderate 24 h, celulele Caco-2 proliferative au fost tratate cu 1,5µM DON, în absența și în prezență de supernatant de lactobacili (LB sup) 3,5%. Am investigat proliferarea / metabolismul celular cu metoda reducerii MTT/PMS, iar proliferarea celulară a fost evaluată și prin măsurători de impedanță.

Datele experimentale descrise în Figura 23 arată faptul ca LB sup tinde să reducă efectul inhibitor exercitat de 1,50 μM DON asupra reacției de reducere a MTT/PMS de către celulele Caco-2 proliferative, fără a avea însă efect asupra celulelor neexpuse la DON. LB sup pare să susțină proliferarea celulelor Caco-2 inhibate de 1,50 µM DON.

Figura 23. Efectul exercitat in vitro de LB sup asupra reacției MTT/PMS dezvoltate de celulele Caco-2 în stare proliferativă, co-tratate cu 1,50 µM DON. Date prezentate ca medie ± SEM pentru n=4 experimente independente.

Totuși, studiul dinamicii impedanței celulare arată că LB sup nu afectează în fapt proliferarea sau adeziunea celulelor Caco-2 inhibate cu 1,50 μM DON, după cum se observă din Figura 24.

Figura 24. Efectul exercitat in vitro de LB sup asupra dinamicii impedanței celulelor Caco-2 în stare proliferativă, co-tratate cu 1,50 µM DON. Măsurători realizate cu sistemul xCELLigence. Experiment reprezentativ din 3 experimente independente.

Analizând datele prezentate în Figura 23 și Figura 24, se poate concluziona faptul că DON intensifică metabolismul celulelor Caco-2 inhibate de 1,50 µM DON, dar aceasta nu se traduce în intensificarea proliferării celulare.

Din acest experiment constatăm utilitatea aplicării în paralel a măsurătorilor de impedanță în timp real și a testului reducerii MTT/PMS, primul adresându-se direct adeziunii și proliferării celulare, iar celălalt reflectând direct metabolismul celular și indirect, în anumite cazuri, proliferarea celulară.

Datele experimentale descrise mai sus sugerează că 1,50 μM DON tinde să limiteze dezvoltarea tumorilor de colon în faza incipientă. Dacă în condiții normale LB ar putea contracara efectele nocive ale DON, în cazul celulelor tumorale acțiunea LB ar putea fi nedorită datorită intensificării metabolismului celulelor tumorale.

3.1.2. Analiza procesului de proliferare a celulelor Caco-2 în generații fiică succesive

În paralel cu măsurătorile de impedanță celulară, am realizat de asemenea experimente de evaluare a multiplicării celulare ca evoluție a celulelor Caco-2 proliferative în diverse generații fiică succesive. Pentru aceasta am utilizat marcarea cu CFDA-SE a celulelor Caco-2 aderate, aflate în stare proliferativă, și evaluarea prin citometrie în flux a distribuției celulelor în diverse generații fiică.

Rezultatele experimentale au arătat că, în comparație cu celulele netratate, 1,50 μM DON induce acumularea celulelor Caco-2 în generațiile fiică 2 și 3, și limitează evoluția lor în generațiile mai avansate 4 și 5 (Figura 25).

Figura 25. Efectul exercitat in vitro de 1,50 μM DON asupra proliferării celulelor Caco-2, evaluată ca distribuție a celulelor pe generații fiică. Măsurători realizate prin citometrie în flux cu CFDA-SE, după 72 h de tratament al celulelor cu DON. Rezultate exprimate ca medie ± SEM pentru n=3 experimente independente.

Analizând curba doză-efect a DON asupra celulelor Caco-2 în stare proliferativă, constatăm că 0,75 μM și 1,50 μM DON determină acumularea celulelor în generația 2 și scăderea procentului de celule în generațiile 5 și 6 (Figura 26a). Indicele de proliferare calculat pe baza acestei metode (Figura 26b) demonstrează că 1,50 μM și, în mai mică măsură 0,75 μM DON, limitează după o curbă doză-efect multiplicarea celulelor Caco-2 aflate în stare proliferativă la momentul adiției DON. Rezulatele obținute prin citometrie în flux se confirmă și prin metoda reducerii MTT/PMS (Figura 26c).

% de celule Caco-2 în generații fiică succesive (citometrie în flux cu CFDA-SE).

indicele de proliferare a celulelor Caco-2 evaluat prin citometrie în flux cu CFDA-SE.

reducerea MTT/PMS de către celulele Caco-2.

Figura 26. Studiul efectului exercitat in vitro de 0,75 μM și 1,50 μM DON asupra proliferării celulelor Caco-2, evaluat ca: a) distribuție a celulelor pe generații fiică succesive; b) indice de proliferare; măsurători realizate prin citometrie în flux cu CFDA-SE; c) reducerea MTT/PMS. Determinările au fost realizate după 72 h de tratament al celulelor cu DON. Rezultate prezentate ca medie ± SEM pentru triplicate de probă.

În continuare s-a realizat un experiment suplimentar pentru a compara prin două metode efectul exercitat de DON asupra proliferării celulelor Caco-2, respectiv prin citometrie în flux cu CFDA-SE și prin testul reducerii MTT/PMS (Figura 27). Datele experimentale arată că cele două metode reflectă efectul de limitare a multiplicării celulare de către DON.

citometrie în flux cu CFDA-SE

reducerea MTT/PMS

Figura 27. Studiu comparativ al efectului exercitat in vitro de (0,37-1,50) μM DON asupra proliferării celulelor Caco-2, evaluat ca: a) distribuție a celulelor pe generații fiică succesive- măsurători realizate prin citometrie în flux cu CFDA-SE; b) intensitate de reducere a MTT/PMS. Determinările au fost realizate după 72 h de tratament al celulelor cu DON.

3.2. Analiza procesului de moarte celulară la linia Caco-2 tratată cu DON

Rezultatele experimentale prezentate mai sus au arătat că 1,50 μM DON limitează multiplicarea celulelor Caco-2. Această acțiune s-ar putea datora unui efect de blocare a ciclului celular și/sau inducerii morții celulare. În consecință, am investigat potențialul efect citotoxic exercitat in vitro de DON asupra celulelor Caco-2 în stare proliferativă.

3.2.1. Investigarea în paralel a viabilității și mortalității celulelor Caco-2 cu DON

Am investigat în paralel efectul exercitat de (0,37–1,50) μM DON asupra următorilor parametri celulari:

metabolismul / proliferarea celulelor Caco-2, evidențiate prin testul reducerii MTT/PMS;

moartea celulelor Caco-2, evidențiată ca eliberare de LDH datorită perturbării integrității membranei plasmatice.

Rezultatele experimentale sunt descrise în Figura 28 pentru 2 experimente independente. Se observă faptul că reducerea numărului de celule metabolic active, evidențiată prin testul reducerii MTT/PMS, nu este însoțită de efecte citotoxice ale DON manifestate prin perturbarea integrității membranare și eliberarea LDH. Este posibil ca 1,50 μM DON să inhibe drastic multiplicarea celulelor Caco-2 prin blocarea ciclului celular, fără a exercita efecte citotoxice semnificative.

a) experiment 1

b) experiment 2

Figura 28. Studiu comparativ al efectului exercitat in vitro de (0,37 – 1,50) μM DON asupra proliferării celulelor Caco-2, evaluat la nivelul metabolismului / proliferării celulare (testul reducerii MTT/PMS) și al integrității membranei celulare (testul eliberării LDH). Determinările au fost făcute după 48 h de tratament al celulelor cu DON. Rezultate prezentate ca medie ± SEM pentru triplicate de probă în 2 experimente independente.

3.2.2. Investigarea apoptozei celulare

Pentru a verifica constatările precedente privind faptul că (0,37-1,50) μM DON nu exercită efecte citotoxice in vitro asupra celulelor Caco-2 proliferative, am realizat un experiment în care am evaluat apoptoza celulară totală (apoptoza timpurie + apoptoza târzie). Determinările au fost realizate prin citometrie în flux cu anexină V-iodură de propidiu. Rezultele de citometrie în flux au fost comparate cu cele obținute prin testul eliberării LDH pentru evaluarea morții celulare. În paralel am prezentat și datele privind reducerea MTT/PMS pentru a evidenția în cadrul aceluiași experiment efectele anti-proliferative exercitate de DON.

Rezultatele experimentale descrise în Figura 29 arată că 1,50 μM DON reduce numărul de celule Caco-2 metabolic active (testul reducerii MTT/PMS), dar nu afectează integritatea membranară a acestora (testul eliberării LDH) și nu crește semnificativ numărul de celule apoptotice (citometrie în flux cu anexina V-iodură de propidiu). Efectul anti-proliferativ exercitat de 0,75 μM DON este mai slab decât cel exercitat de 1,50 μM DON, și nu este însoțit de manifestări citotoxice, după cum se evidențiază prin testul eliberării LDH și prin citometrie în flux cu anexina V-iodură de propidiu.

eliberarea LDH și apoptoza totală

b) reducerea MTT/PMS

Figura 29. Studiu comparativ al efectului exercitat in vitro de (0,37 – 1,50) μM DON asupra viabilității și proliferării celulelor Caco-2. Metabolismul celular a fost evaluat prin testul reducerii MTT/PMS, integritatea membranei plasmatice prin testul eliberării LDH, iar apoptoza celulară totală a fost determinată prin citometrie în flux cu anexina V-iodură de propidiu. Determinările au fost realizate la 48 h de tratare a celulelor Caco-2 cu DON. Rezultate prezentate ca medie ± SEM pentru triplicate de probă.

3.3. Măsurători de impedanță celulară cu sistemul xCELLigence

Pentru demonstrarea faptului că acțiunea exercitată de 1,50 μM DON asupra celulelor Caco-2 în stare proliferativă nu este de tip citotoxic, am investigat în paralel efectul exercitat de 1,50 μM DON și de un agent citotoxic pentru celulele Caco-2, respectiv de E.coli (atenuată termic) opsonizată cu anticorpi (1 × 107 bacterii / mL). Efectul citotoxic exercitat de E.coli asupra celulelor Caco-2 a fost verificat prin testul de viabilitate celulară cu albastru de tripan, care a evidențiat moartea celulelor Caco-2.

E.coli reduce progresiv impedanța celulară și implicit numărul de celule Caco-2 aderate la suportul solid, deoarece celulele moarte își pierd proprietățile de aderență (Figura 30). În același timp, 1,50 μM DON menține aproximativ constant numărul de celule Caco-2 aderate la suport solid, la valoarea înregistrată înainte de adiția micotoxinei. Constatăm astfel în mod indirect ca 1,50 μM DON exercită alt tip de acțiune decât acțiunea citotoxică a E.coli asupra celulelor Caco-2.

Figura 30. Efectul exercitat in vitro de E.coli (atenuată termic și opsonizată cu anticorpi), comparativ cu 1,5μM DON, asupra semnalului de impedanță dat de celulele Caco-2 proliferative. Măsurători în timp real realizate cu sistemul xCELLigence. Adiția DON sau a E.coli în cultură s-a considerat momentul 0. Experiment reprezentativ din 5 exprimente independente realizate.

Diferența de acțiune a DON și a E. coli a fost evidențiată de asemenea prin microscopie optică (Figura 31). E.coli reduce numărul de celule aderate și crește numărul de celule moarte, care prezintă aspect rotunjit și pierderea proprietății de aderență la suport solid. Spre deosebire de E. coli, în cazul expunerii celulelor Caco-2 la 1,50 μM DON nu observăm un număr mai mic de celule aderate, și nu se evidențiază un număr mare de celule moarte.

Celule Caco-2 netratate

Celule Caco-2 tratate 72 h cu 1,50 μM DON

Celule Caco-2 tratate 72 h cu E. coli (atenuată termic) opsonizată cu anticorpi

Figura 31. Imagini de microscopie optică a celulelor Caco-2 proliferative netratate sau tratate cu 1,50 μM DON sau cu E.coli (atenuată termic și opsonizată cu anticorpi).

Concluzionând, rezultatele măsurătorile de impedanță celulară au susținut indirect constatarea că 1,50 μM DON nu omoară celule Caco-2 aflate în stare proliferativă, dar reduce numărul de celule metabolic active, posibil prin blocarea ciclului celular.

3.3.1. Activitatea oxidativă intracelulară a celulelor Caco-2

Este cunoscut faptul că celulele canceroase manifestă activitate oxidativă intracelulară crescută, care conferă celulelor tumorale un avantaj de supraviețuire prin stimularea proliferării și inhibiția apoptozei celulare [24]. În aceste condiții, am investigat corelația dintre activitatea anti-proliferativă exercitată de DON asupra celulelor Caco-2 și potențialele modificări ale statusului oxidativ celular induse de micotoxină. Activitatea oxidativă intracelulară a celulelor Caco-2 a fost evaluată prin citometrie în flux, utilizând următorii indicatori de ROS:

CellROX – indicator de activitate oxidativă generală

MitoSOX – indicator specific pentru anionul superoxid generat la nivel mitocondrial.

Rezultatele experimentale din Figura 32 arată că reducerea numărului de celule Caco-2 metabolic active de către (0,75-1,50) μM DON este însoțită de creșterea procentului de celule cu activitate oxidativă generală mai intensă decât cea a celulelor netratate. Evidențiem corelația negativă dintre numărul de celule metabolic active și activitatea lor oxidativă intracelulară (coeficient de corelație Pearson r = – 0,987, P< 0,05). În același timp constatăm că DON nu afectează semnificativ generarea de anion superoxid la nivel mitocondrial, ceea ce sugerează că metabolismul energetic nu este afectat de expunerea celulelor la micotoxină.

a) activitatea oxidativă intracelulară

b) numărul de celule metabolic active

Figura 32. Efectul exercitat in vitro de (0,37-1,50) μM DON asupra activității oxidative intracelulare a celulelor Caco-2 proliferative (a). Activitatea oxidativă intracelulară a fost evaluată prin citometrie în flux cu CellROX (indicator general de ROS) sau cu MitoSOX (indicator de anion superoxid mitocondrial). În paralel, s-a determinat efectul exercitat de DON asupra numărului de celule metabolic active evaluat prin testul reducerii MTT/PMS (b). Celulele au fost investigate la 48 h de la adiția DON în cultură.

Este posibil ca DON să activeze mecanisme de reparare celulară care induc într-o primă etapă blocarea ciclului celular. Această constatare deschide noi perspective pentru continuarea studiului privind efectul exercitat de DON asupra expresiei supresorului tumoral p53 care controlează ciclul celular și determină blocarea ciclului celular în fazele G2M și G1 ca răspuns la diverse forme de stres [31]. Remarcăm faptul că transcripția și activitatea p53 sunt dependente de statusul redox celular [32]. În plus, concentrațiile fiziologice de ROS controlează supraviețuirea celulară mediată de MAP kinazele ERK½ care conferă celulelor canceroase un avantaj de supraviețuire față de celulele normale [33].

3.4. Efectul exercitat in vitro de DON asupra celulelor Caco-2 neproliferative

Am comparat efectul exercitat in vitro de (0,37-1,50) μM DON asupra celulelor Caco-2 proliferative, care manifestă fenotip tumorigen, cu acțiunea micotoxinei asupra celulelor Caco-2 în stare neproliferativă datorită confluenței și care mimează bariera intestinală.

3.4.1. Adeziunea celulelor Caco-2 la confluență evaluată prin măsurători de impedanță

Am investigat în timp real efectul exercitat de DON asupra adeziunii celulelor Caco-2 aflate la confluență (neproliferative), utilizând măsurători de impedanță electrică celulară cu sistemul xCELLigence. Remarcăm faptul că măsurătorile de impedanță realizate pe celule la confluență, care sunt în consecință neproliferative, reflectă numai adeziunea acestora la suport solid. Pe scurt, celulele au fost lăsate 96 h să ajungă la confluență, după care s-au adăugat 1,5μM DON și s-a continuat cultivarea celulelor. Au fost urmărite în dinamică fazele inițiale de aderență și proliferare celulară, ca și etapa de confluență a celulelor .

Datele experimentale descrise în Figura 33 arată că celulele Caco-2 ating confluența în aproximativ 40 ore, după care semnalul de impedanță scade ușor pe măsură ce factorii nutritivi din mediul de cultură se epuizează și/sau stratul confluent de celule începe să se detașeze. Înlocuirea mediului de cultură la 96 h a indus creșterea tranzientă a impedanței, posibil datorită adiției de factori nutritivi. Impedanța celulară continuă după aceea să scadă datorită detașării stratului de celule confluente.

Figura 33. Efectul exercitat in vitro de 1,50 μM DON asupra semnalului de impedanță dat de celulele Caco-2 neproliferative, aflate la confluență. În paralel s-au investigat modificările de impedanță induse de un agent citotoxic (E. coli atenuată termic și opsonizată cu anticorpi). Măsurătorile au fost realizate în timp real cu sistemul xCELLigence. Experiment reprezentativ din 3 experimente independente.

1,50 μM DON pare să susțină adeziunea la suport solid a stratului confluent de celule Caco-2, după cum arată în Figura 33 valorile mai mari ale impedanței celulare în prezență de DON comparativ cu celulele netratate. Aceste rezultate sunt susținute și de imaginile de microscopie optică prezentate în Figura 34.

celule netratate cu DON

b) celule tratate cu 1,5 μM DON

Figura 34. Imagini ale celulelor Caco-2 confluente după 48 h de cultivare în absența (a) și în prezență de 1,50 μM DON (b).

Este posibil ca DON să altereze joncțiunile dintre celulele Caco-2 [6, 34] și astfel aderența la suport solid a acestui strat confluent cu legături intercelulare mai slabe să tindă să se restaureze. Nu putem totuși exclude posibilitatea ca DON să transmită semnale proliferative celulelor Caco-2 în zonele în care stratul celular a fost alterat [35].

Aceste rezultate ne arată faptul că 1,50 μM DON nu afectează in vitro integritatea barierei intestinale și pare sa aibă efecte pozitive asupra procesului de vindecare a leziunilor de la acest nivel [36]. În același timp, dacă 1,50 μM DON limitează multiplicarea celulelor Caco-2 în stare de proliferare activă, care mimează tumorile incipiente, micotoxina nu pare să mai aibă o astfel de acțiune asupra celulelor Caco-2 confluente, care mimează tumora de colon constituită.

3.4.2. Metabolismul celulelor Caco-2 evaluat prin testul reducerii MTT/PMS

În paralel cu măsurătorile de impedanță celulară, am realizat experimente de evaluare a viabilității celulelor Caco-2 confluente. Am aplicat testul reducerii MTT/PMS care reflectă metabolismul celular, respectiv activitatea dehidrogenazelor care bioreduc sarea de tetrazoliu prin NADPH și NADH pe care le produc.

Am investigat în paralel efectul exercitat de (0,37-1,50) μM DON asupra celulelor Caco-2 aflate în stare proliferativă sau la confluență.

Datele descrise în Figura 35 arată că 1,50 μM DON determină scăderea intensității reacției MTT/PMS în cazul celulelor Caco-2 proliferative, dar nu mai afectează viabilitatea / metabolismul celular atunci când micotoxina este aplicată celulelor Caco-2 la confluență, deci neproliferative. Testul reducerii MTT/PMS confirmă rezultatele obținute prin măsurători de impedanță celulară în timp real.

Figura 35. Efectul exercitat in vitro de 1,50 μM DON asupra intensității reacției MTT/PMS dezvoltate de celulele Caco-2 în stare proliferativă sau la confluență. Efecte înregistrate după 48 h de tratament al celulelor Caco-2 cu DON. Date prezentate ca medie ± SEM pentru triplicate de probă.

3.4.3. Proliferarea celulelor Caco-2 evaluată ca evoluție a celulelor Caco-2 în generații fiică succesive

Am realizat de asemenea experimente de evaluare a multiplicării celulare ca evoluție a celulelor Caco-2 în generații fiică succesive. Pentru aceasta am utilizat marcarea cu CFDA-SE a celulelor Caco-2 aflate fie în stare proliferativă, fie la confluență. Distribuția celulelor în diverse generații fiică succesive a fost determinată prin citometrie în flux.

Rezultatele experimentale au arătat că (0,37–1,50) μM DON nu modifică semnificativ distribuția în diverse generații fiică a celulelor Caco-2 aflate la confluență în momentul adiției DON (Figura 36a). DON exercită un efect diferit în cazul în care celulele Caco-2 sunt proliferative (Figura 36b), respectiv determină acumularea celulelor în generațiile 2 și 3, și reduce avansarea celulelor în generațiile ulterioare. Efectul cel mai pregnant este exercitat de 1,50 μM DON.

a) celule Caco-2 neproliferative (la confluență)

b) celule Caco-2 proliferative

Figura 36. Efectul exercitat in vitro de 1,50 μM DON asupra proliferării celulelor Caco-2, evaluată ca distribuție a celulelor în generații fiică succesive. Măsurători realizate prin citometrie în flux cu CFDA-SE, după 72 h de tratament al celulelor cu DON. Rezultate exprimate ca medie ± SEM pentru n=3 experimente independente.

3.4.4. Moartea celulelor Caco-2

Am investigat potențialul efect citotoxic exercitat de DON asupra celulelor Caco-2 neproliferative (la confluență). Pentru aceasta am investigat în paralel efectul DON asupra metabolismului celulelor Caco-2 (testul reducerii MTT/PMS), și asupra integrității membranei plasmatice (testul eliberării LDH).

Rezultatele experimentale sunt descrise în Figura 37 pentru 2 experimente independente. Se observă faptul că DON nu afectează nici metabolismul celulelor Caco-2 confluente și nici integritatea membranei plasmatice.

a) experiment 1

b) experiment 2

Figura 37. Studiu comparativ al efectului exercitat in vitro de (0,37 – 1,50) μM DON asupra viabilității celulelor Caco-2 neproliferative (aflate la confluență), evaluat la nivelul metabolismului celular (testul reducerii MTT/PMS) și al integrității membranei plasmatice (testul eliberării LDH). Determinările au fost realizate după 48 h de tratament cu DON a celulelor Caco-2 confluente. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SEM pentru triplicate de probă în 2 experimente independente.

3.4.5. Activitatea oxidativă intracelulară a celulelor Caco-2

Am investigat efectul exercitat in vitro de DON activității oxidative intracelulare a celulelor Caco-2 neproliferative (aflate la conflență). Activitatea oxidativă intracelulară a celulelor Caco-2 a fost evaluată prin citometrie în flux, utilizând următorii indicatori de ROS: 1) CellROX – indicator general de activitate oxidativă; 2) MitoSOX – indicator specific pentru anionul superoxid generat la nivel mitocondrial.

Rezultatele experimentale din Figura 38 arată 0,75 μM și 1,50 μM DON induc scăderea activității oxidative intracelulare a celulelor Caco-2 neproliferative (aflate la confluență). Constatăm astfel diferența de acțiune a DON asupra celulelor Caco-2 neproliferative, comparativ cu cele proliferative. Așa cum am arătat anterior, DON induce intensificarea într-o manieră doză-efect a activității oxidative generale a celulelor Caco-2 aflate în stare proliferativă.

Figura 38. Efectul exercitat in vitro de (0,37 – 1,50) μM DON asupra activității oxidative intracelulare a celulelor Caco-2 neproliferative (aflate la confluență). Activitatea oxidativă intracelulară a fost evaluată prin citometrie în flux cu CellROX (indicator general de ROS) sau cu MitoSOX (indicator de anion superoxid mitocondrial).

DON la concentrațiile de 0,75 μM și 1,50 μM tinde să limiteze generarea de anion superoxid la nivelul mitocondriilor în cazul celulelor Caco-2 neproliferative. Și în acest caz, DON exercită efecte diferite asupra celulelor Caco-2 poliferative și neproliferative. În cazul celulelor proliferative, DON nu afectează producerea de anion superoxid la nivel mitocondrial. În cazul celulelor Caco-2 aflate în stare neproliferativă datorită confluenței, este posibil ca DON să limiteze activitatea oxidativă intracelulară pentru a menține homeostazia celulară și implicit integritatea barierei intestinale.

Până în prezent s-au realizat diverse studii, în principal in vitro, care au arătat că toxicitatea DON este asociată cu modificări ale statusului redox celular [37]. În general, studiile s-au adresat unor concentrații mai mari de DON decât cele investigate în această lucrare. Rezultatele experimentale obținute de noi arată că DON, chiar la concentratii micromolare, poate în fapt modula statusul redox celular, iar tipul de acțiune depinde de starea proliferativă a celulelor Caco-2.

Capitolul IV

4.1. Concluzii

Studiul experimental a relevat următoarele aspecte privind efectul exercitat in vitro de (0,37 – 1,50) μM DON asupra celulelor de adenocarcinom uman de colon din linia Caco-2:

În cazul celulelor Caco-2 proliferative care manifestă fenotip tumorigen și care mimează tumora de colon incipientă

1,50 μM DON limitează drastic multiplicarea celulelor Caco-2 aflate în stare proliferativă, posibil prin blocarea ciclului celular și acumularea celulelor în generatiile fiică 2 și 3

Acțiunea anti-proliferativă exercitată de 1,50 μM DON nu este însoțită de efecte citotoxice notabile

La concentrații mai mici de 1,50 μM, DON nu mai are efect semnificativ asupra multiplicării celulelor Caco-2. Remarcăm totuși tendința concentrațiilor foarte joase de DON (0,37 μM) de a susține multiplicarea/viabilitatea celulelor Caco-2 în stare proliferativă

În intervalul de concentrații investigat, DON intensifică într-o manieră doză-efect activitatea oxidativă a celulelor Caco-2 proliferative, ceea ce induce posibil modificări ale căilor de semnalizare redox și blocarea diviziunii celulare ca mecanism de protecție față de stres. DON nu afectează însă generarea de anion superoxid mitocondrial, ceea ce dovedește că micotoxina nu perturbă metabolismul energetic al celulelor Caco-2 proliferative în intervalul de concentrații (0,37 – 1,50) μM.

În cazul celulelor Caco-2 neproliferative (confluente) care mimează bariera intestinală și tumora de colon constituită

În intervalul de concentrații (0,37 – 1,50) μM DON nu perturbă semnificativ in vitro integritatea barierei intestinale și/sau nu are efecte asupra tumorii de colon constituite. Rezultatele experimentale sugerează chiar că micotoxina ar susține aderența celulelor Caco-2 confluente, ca posibil mecanism de reparare a unor leziuni la nivelul colonului

Prezervarea stratului confluent de celule Caco-2 expus la DON se realizează prin scăderea activității oxidative intracelulare, inclusiv a generării de anion superoxid intracelular.

Studiul experimental arată că dozele mici de DON, relevante in vitro pentru expunerea umană ca urmare a ingestiei de alimente pe baza de cereale contaminate cu micotoxină, ar putea limita dezvoltarea tumorilor de colon incipiente, dar nu exercită efecte anti-proliferative asupra tumorilor constituite. Efectul anti-proliferativ al DON pare să fie rapid și persistent. Remarcăm totuși faptul că acest efect al DON se exercită in vitro într-un interval restrâns de concentrații, în jurul valorii de 1,50 μM. Dozele mai mici de DON fie nu afectează celulele tumorale de colon, fie pot susține în mod nedorit proliferarea / metabolismul acestora.

Aceste constatări experimentale sugerează că, datorită variabilității inter-individuale, este posibil ca expunerea la aceeași doză joasă de DON să determine la unii subiecți progresia unei tumori incipiente de colon, iar la alții să limiteze dezvoltarea acesteia.

Lactobacilii s-au dovedit utili pentru contracararea efectelor exercitate de concentrațiile citotoxice de DON la nivelul colonului normal. Studiul nostru arată că factorii solubili secretați de lactobacili pot susține metabolismul celulelor tumorale de colon în faze incipiente de dezvoltare a tumorii, expuse la DON. Această constatare generează un semnal de alarmă privind utilizarea lactobacililor ca probiotice pentru limitarea efectelor toxice ale dozelor joase de DON în condițiile existenței unui proces tumoral la nivelul colonului.

Lucrarea dovedește utilitatea măsurătorilor în timp real cu sistemul xCELLigence pentru investigarea efectului exercitat in vitro de xenobiotice. Metoda oferă informații valoroase privind dinamica adeziunii / proliferării celulare, care pot fi utilizate pentru investigații la punct fix prin metode mai accesibile de evaluare a metabolismului / proliferării celulare, cum ar fi metoda reducerii MTT/PMS. Măsurătorile de impedanță celulară pot oferi informații similare, deși mai detaliate decât metoda reducerii MTT/PMS. În unele sisteme experimentale celulare, prin măsurători de impedanță coroborate cu alte teste se pot obține date complementare privind adeziunea, metabolismul și proliferarea celulară.

4.2. Perspective de continuare a lucrării

Lărgirea studiului privind impactul DON asupra activității oxidative intracelulare a celulelor de colon Caco-2 în diverse stări proliferative

Investigarea răspunsului antioxidant al celulelor Caco-2 expuse la doze mici de DON

Corelarea efectului anti-proliferativ al DON cu activarea MAP kinazelor

4.3. Publicație în domeniul lucrării de master

Manda, G.; Mocanu, M.A.; Marin, D.E.; Taranu, I.; Dual Effects Exerted in vitro by Micromolar Concentrations of Deoxynivalenol on Undifferentiated Caco-2 Cells. Toxins 2015, 7, 593-603

Bibliografie