Colagenul

Medicina

Colagenul

Byadmin ianuarie 1, 2024

REZUMAT

În contextul actual al crizei economice și financiare o bună gestionare a deșeurilor prin recuperare, valorificare superioară și reintroducerea în circuitul productiv, ar conduce la nivel european la o economie de peste 74 miliarde de euro.

Lucrarea de fată prezintă tocmai rezultatele unor cercetări în direcția valorificării deșeurilor de piele, rezultate în procesul tehnologic de prelucrare.

Obiectivele prezentei lucrări sunt: obținerea de noi bioproduse pe baza de colagen extras din deșeuri de piei netăbăcite de bovine și pești cu aplicabilitate in industria alimentară (geluri, gelatine, membrane, soluții colagenice, agenți de reglare a vâscozității etc.).

În primul capitol s-a elaborat și s-a prezentat un scurt studiu de literatura referitor la colagen și posibilitățile de utilizare in industria alimentara si alte industrii (cosmetica, medicina,farmacie, agricultura, textile, pielărie).

În capitolul al doilea sunt prezentate succint posibilitățile de valorificare a deșeurilor de piele precum si date teoretice cu privire la histologia pielii animale, a compoziției colagenului, a aminoacizilor cu elemente constitutive ale proteinei.

În capitolul al treilea (partea experimentala) sunt prezentate posibilitățile de extragere, caracterizare si utilizare a colagenului din deșeuri de piei netăbăcite de peste si bovina. S-au elaborat, experimentat si realizat 4 (patru) noi tehnologii de extragere a colagenului din pieile netăbăcite bovine și pești respectiv hidroliza enzimatică(HEB), acido-enzimatică (HAEB)pentru deșeurile de piele bovina, și două variante de hidroliză acidă (HAP1) și (HAP2) cu adaus de emulsie ulei vegeta in apa, pentru deșeurile de piei de peste. Materialele colagenice rezultate au fost analizate prin determinări analitice și instrumentale.

În capitolul al patrulea s-a concluzionat asupra relevanței proiectului și oportunitatea continuării cercetării. Extractul proteic HAP2 a fost testat cu succes în industria alimentară ca adjuvant tehnologic în tehnologiile de preparare a produselor din pește: pastă de pește, pește afumat. Rezultatele preliminare obținute arată că extractul HAP poate înlocui preparatele similare din import în proporție de cca. 30%.

O alta realizare concretă a proiectului a fost și eliminarea solvenților utilizați ca vehicul de extracție a uleiului de peste si guaninei folosite pana in prezent la prelucrarea deșeurilor de piei de peste.

CUPRINS

INTRODUCERE

Colagenul este proteina fibrilară cea mai abundenta din constituția organismelor nevertebrate și vertebrate la nivelul oaselor, pielii, tendoanelor, cartilagiilor, vaselor sangvine, corneei, membranei bazale, etc.

Colagenul reprezintă de fapt o familie formata din mai multe tipuri (izotipuri) genetic diferite, fiind o clasă de glico-proteine sintetizate de celule ce alcătuiesc diversitatea țesuturilor conjuctive.

Termenul de tipuri de colagen se considera în prezent a fi mai adecvat decât cel generic de colagen și exprima faptul că există mai multe tipuri de substanțe macromoleculare care, din punct de vedere structural, au atât elemente comune cat și unele diferite, pentru a putea fi individualizate. Pană în prezent s-au identificat peste 27 tipuri din care s-au caracterizat 12 tipuri. Varietatea mare a tipurilor colagenice este determinata de compoziția în aminoacizi și secvențele lor în catenele polipetidice. Acestea influențează proprietățile conformaționale și fizico-chimice ale moleculei de colagen.

Modificările chimice și structurale ale colagenului din piele dau posibilitatea obținerii de noi produse colagenice (biomateriale) cu aplicații din cele mai diverse cum ar fi : industriile de pielărie, textile, alimentara precum și in zootehnie, agricultura, medicina veterinara și umana, etc.

Procedeele de extracție a colagenului fibrilar din țesutul conjunctiv, în special din pielea animala s-au dezvoltat treptat de la simpla fierbere în apa a deșeurilor de piele (gelatină) la tehnologii care nu denaturează sau denaturează foarte puțin structura conformațională nativa a colagenului.

În contextul actual al crizei economice și financiare o buna gestionare a deșeurilor prin recuperare, valorificare superioară și reintroducerea în circuitul productiv, ar conduce la nivel european la o economie de peste 74 miliarde de euro.

Lucrarea de fată prezintă tocmai rezultatele unor cercetări în direcția valorificării deșeurilor de piele, rezultate în procesul tehnologic de prelucrare.

Obiectivele prezentei lucrări sunt: obținerea de noi bioproduse pe baza de colagen extras din deșeuri de piei netăbăcite de bovine si pești cu aplicabilitate in industria alimentară (geluri, gelatine, membrane, soluții colagenice, agenți de reglare a vâscozității etc.) .

În primul capitol s-a elaborat și s-a prezentat un scurt studiu de literatura referitor la colagen și posibilitățile de utilizare î n industria alimentară și în alte industrii (cosmetică, medicină, farmacie, agricultură, textile, pielărie).

În capitolul al doilea sunt prezentate succint posibilitățile de valorificare a deșeurilor de piele precum și date teoretice cu privire la histologia pielii animale, a compoziției colagenului, a aminoacizilor cu elemente constitutive ale proteinei.

În capitolul al treilea (partea experimentala) sunt prezentate posibilitățile de extragere, caracterizare si utilizare a colagenului din deșeuri de piei netăbăcite de pește și bovina.

În capitolul al patrulea s-a concluzionat asupra relevantei proiectului și oportunitatea continuării cercetării.

PARTEA DOCUMENTARĂ

STUDIU DE LITERATURĂ

Colagenul este una dintre cele mai abundente proteine de origine animală, reprezentând aproximativ 30% din totalul proteinelor.

Colagenul este prezent în toate țesuturile conjunctive incluzând oase, pielea animală, cartilaje, tendoane, vase sanguine (Muyanga și alții, 2004; Pataridis și alții, 2008; Cheng și alții, 2009; Huo and Zhao, 2009; Aberoumand, 2012; Liu, 2012).

Proteinele fibrilare sunt principalele constituente, componente ale cartilajelor, tendoanelor, oaselor, pielii si altor forme ale țesuturilor conjunctive (Gelse, 2003; Huo si Zhao, 2009; Mocan, 2011; Liu, 2012).

După Gomez-Guillen si alții (2011) proprietățile colagenului pot fi clasificate în două grupe, prima legată de capacitatea de gelifiere, texturare, îngroșare, formarea gelurilor, capacitatea de legare a apei iar a doua de proprietățile lor active de suprafață, care includ emulsionarea, formarea spumei, stabilitatea, adeziunea și coeziunea, funcția de coloid protector și capacitatea de a forma pelicule.

Datorita excelenței compatibilități biologice precum și a biodegradabilității , proprietăților antigenice, colagenul este potrivit pentru obținerea de bioproduse cu aplicabilitate în industria alimentară, cosmetică, farmaceutică, biomedicală, ingineria tisulară, agricultură, textile etc. (Bae, 2008; Nalinanan, 2008; Matmarah, 2011; Liu, 2012).

Polipeptidele colagenice înlănțuite și reticulate pot fi destructurate prin hidroliza termic ă parțială formând gelatina (Djagny,2001; Gómez-Guillén, 2011).

Gelatina are proprietăți reologice și vâscoelastice unice (Gómez- Guillén si altii, 2011).

În ultimul timp extracția acidă cu pepsină este metoda cea mai uzitată pentru extragerea colagenului (Cheng, 2009).

Aceasta metodă valorifică activitatea pepsinei la pH redus și temperatură redusă (35-38oC) extragerea colagenului obținându-se în scurt timp păstrând astfel integritatea structurii proteice (Liu si Liu, 2006).

Sursa principală de colagen comercial este dată de colagenul extras din oasele și pieile speciilor vertebrate cu precădere din bovine și porcine dar și animale marine (Liu, 2007; Parenteau-Bareil, 2010) acesta din urmă reprezentând un real interes pentru industria alimentară (cod Pacific, Wang, 2013; cod Baltic, Skienka si Sadowska, 2013; titapia roșie, Jamilah, 2012, etc.).

Studiu cu privire la structura și compoziția colagenului au efectuat numeroși autori (Gelse,2013; Cheng,2009; Parenteau-Bareil,2010; Friess,1998; Huo and Zhao,2009; Gómez-Guillén, 2011; Karim si Bhat, 2009; Lin si Liu,2006; Nam,2008; Pati,2010; Canty si Kadler,2005; Crowley,2009; Cao, 2013).

Utilizarea colagenului în industria alimentară și băuturilor este în continuă dezvoltare datorită faptului că este o importantă sursă de fibre și proteine nutritive mai ales în cazul dietelor umane (Neklyudov,2013; Wang,2010; King’ori,2011).

Cosmeticele nutritive sunt o altă aplicație a colagenului (Wong,2010).

În unele sortimente de biscuiți se pot regăsi până la 1200 mg. de colagen origine marina (Anonymeous,2011).

Suplimentele alimentare pe baza de hidrolizate de colagen si arginină ajută la dezvoltarea masei musculare (Kinóri,2011).

O alta aplicație a colagenului este utilizarea lui în compoziția aditivilor alimentari pentru îmbunătățirea calității, texturii, culorii, gustului (Neklyudov,2003).

Santana(2011) susține utilizarea colagenului ca emulgator în industria alimentelor si băuturilor acide.

O altă direcție în plină dezvoltare este utilizarea colagenului în infuzarea băuturilor (Tree,2012).

În combinație cu vitamina C și fructo-oligozaharide, colagenul (de origine marină, în special, este utilizat pe scara largă la obținerea unei diversități de sortimente de băuturi (Yacaubou, 2011).

În ceea ce privește utilizarea proteinelor aminoacizilor colagenici în agricultură, este obținerea de biocompost și amelioratori pentru solurile puternic erodate și/sau sărace în nutrienți organici (Voicu,2009; Florea,2003; Lixandru,2003; Zăinescu,2012; Zăinescu și Crudu,2012; Zăinescu, 2009; Zăinescu,2010; Trandafir și Cioroianu,2003).

O altă valorificare superioară a deșeurilor din industria de prelucrare a pieilor este obținerea de bioproduse pe bază de colagen pentru industria care le-a produs, respectiv industria de pielărie (Crudu,2013)

CAPITOLUL 1 DEȘEURI DE PIELE ȘI POSIBILITĂȚI DE

VALORIFICARE SUPERIOARĂ A LOR

Dacă până la un nivel de dezvoltare economico-socială ponderea cea mai mare o avea satisfacerea necesităților ce decurgeau din natura biologică a oamenilor, treptat au captat o pondere tot mai mare dezvoltarea pe bază de cunoaștere.

Cercetarea și dezvoltarea de produse impune o abordare globală în vederea protejării indivizilor, ecosistemelor și a mediului în general. În acest sens fiecare produs trebuie analizat în cadrul ecosistemului în care acesta se manifestă.

Criza ambientală legată de nesocotirea impactului ecologic al activității umane este expresia agresiunii iraționale asupra ecosistemelor naturale care ne susțin.

În contextul actual al dezvoltării științei, tehnologiei și culturii, cercetarea și dezvoltarea produselor reprezintă un domeniu al cunoașterii, în care se căuta sintetizarea metodologiilor, acțiunilor umane, la conservarea structurii sistemului integrator precum și a căilor de evoluție în timp. În acest context, traiectoria produsului urmărește menținerea echilibrului dinamic dintre natură-om-societate (ambient natural-om-ambient artificial).

Produsul trebuie să satisfacă un ansamblu de cerințe eco-sanogenetice, culturale, tehnologice, economice, calitative dar și din punct de vedere al impactului ecologic și al integrării în ambient.

Privită prin prisma celor afirmate anterior, și dezvoltarea industriei de prelucrare a pieilor a urmat un drum comun tuturor industriilor, acela spre o productivitate mărită, generată de dezvoltarea accelerată a științelor teoretice și aplicative.

Înlocuirea materialelor naturale utilizate tradițional la prelucrarea pieilor și blănurilor, (tananți, coloranți, substanțe grase, etc.) cu materiale de sinteză a modificat în sens negativ impactul asupra ambientului natural.

Din acest motiv industria de pielărie este catalogată ca fiind în categoria activităților controlat eco-agresive datorită efluenților gazoși, lichizi, nămolurilor și deșeurilor solide generate. Astfel principalul deziderat al producal producătorilor de piele, materiale auxiliare și utilaje este acela de a crește eco-eficiența sectorului de pielărie. Acest concept încearcă să reunească principii tehnologice noi care sa armonizeze criteriile de performanță economică a unităților productive cu criteriile de protecție a mediului și indivizilor.

Pentru ca o industrie să tindă către o eco-eficiență sporită aceasta trebuie să:

– utilizeze cantități minime de materii prime, materiale;

– satisfacă exigențele utilizatorilor;

-minimizeze emisiile de subproduse, rebuturi, deșeuri.

Referindu-ne la ultimul criteriu enumerat, în speță la generarea de deșeuri, industria de prelucrare a pieilor pierde prin prelucrare între 35-50% din substanța dermică (proteică) conținută de materia primă (piei crude/brute) sub formă de deșeuri netăbăcite, tăbăcite sau nămolurile rezultate la epurarea efluenților lichizi.

În aceste condiții funcționarea eficientă a managementului deșeurilor este obligatorie.

O componentă esențială în cadrul acestui management este reciclarea și recuperarea deșeurilor solide de piele, care însa nu urmează cursul obișnuit al celor care pot fi utilizate din nou ca materie prima precum cele de metal, sticla, textile, etc.

Pielea animală este un țesut conjunctiv moale și dens. Ca înveliș exterior al corpului, pielea constituie organul de apărare contra microorganismelor, substanțelor vătămătoare și diverselor acțiuni mecanice. Pielea este regulatorul temperaturii corpului animal, organ de secreție și excreție, având rol senzitiv și funcție tactilă. Funcțiunile pielii animale determină structura sa histologică, structură ce este variabilă în diferite regiuni topografice ale pielii, și dependentă de specia și condițiile de viață și mediu.

Pielea este constituită din trei straturi principale: epiderma, derma și hipoderma (figura 1.1) Stratul dermic este format din colagen fibrilar tip I și reprezintă materia primă pentru extracția colagenului.

Figura 1.1. Structura histologică a pielii (Trandafir V., et al. 2007)

Derma este stratul principal al pielii, reprezentând 85% din grosimea totală a acestuia și este limitat de epidermă la partea superioară, fiind despărțit de aceasta printr-o membrană bazală (membrană hialină), iar la partea inferioară de hipodermă.

Derma pielii este alcătuită din țesut conjunctiv fibrilar format din două straturi: papilar (de la membrana hialină până la zona terminală a papilelor părului) și reticular (de la papile până la stratul hipodermic).

În stratul papilar fibrele conjunctive (colagenice și elastice) sunt orientate în toate direcțiile, formând o rețea puternică împletită. Grosimea lor variază, crescând dinspre straturile superioare în profunzime. Fibrele de la suprafața stratului papilar sunt fine, astfel încât ele se înserează aproape invizibil în membrana bazală, care reprezintă suportul stratului bazal epidermic. În membrana bazală, fibrele conjunctive formează o împletitură deasă și fină care conferă întregii formațiuni un aspect de membrană; ea urmărește și traseul părului în dermă, separând derma de epidermă.

Structura membranei bazale este de o deosebită importanță pentru consolidarea epidermei pe suportul său (derma). Fibrilele epidermei străbat stratul bazal și pătrund în porii rețelei fibrilare a membranei bazale, realizându-se legătura dintre epidermă și dermă. Fibrele elastice sunt mai subțiri decât cele colagenice, formând o rețea mai densă în jurul foliculilor piloși și în jurul papilelor.

Stratul reticular este format din fascicule groase de fibre conjunctive, orientate în unghiuri diferite față de suprafața dermei și fibre elastice. Este stratul fibros cu rol de susținere a stratului papilar, fiind în raporturi funcționale cu acesta. Caracteristic stratului reticular este rețeaua fibrilară similară unei împletituri, fără capăt liber. Din fasciculele de fibre orientate paralel între ele, se desprind fascicule parțiale care participă la constituirea altor fascicule fibrilare din care se separă alte fascicule parțiale și așa mai departe.

În consecință, o fibră oarecare poate să aparțină mai multor fascicule de fibre consolidând astfel întreaga rețea fibroasă. Datorită acestei structuri, derma pielii prezintă o suprafață specifică foarte mare de cca. 120 m2/g.

Fibrele elastice acționează ca un schelet (rețea simplă) pentru masa fibroasă colagenică; ele susțin ancorarea părului și asigură elasticitatea țesutului față de orice acțiune mecanică. Fibrele elastice sunt răspândite mai mult în stratul papilar și în partea inferioară a stratului reticular, spre limita acestuia cu hipoderma.

Histogeneza fibrei elastice este încă o problemă cu multe necunoscute. Existența fibrelor elastice alături de fibrele de colagen sugerează histogeneza lor către fibroblaști sau formarea elastinei prin degradarea colagenului.

Fibrele de reticulină sunt structuri fine, foarte elastice de diametre foarte diferite care se constituie în rețea. Aceste fibre sunt mai abundente în organele în care schimburile între sânge și celule sunt mai intense, prin permeabilitate și difuziune mare (ficat, plămâni, glande endocrine etc.). Conform ultimelor rezultate obținute prin tehnici microscopice, s-a avansat ipoteza că fibrele de reticulină se deosebesc de fibrele de colagen doar prin modul de agregare al fibrilelor elementare. În cazul reticulinei intervine un complex muco-polizaharidic din substanța fundamentală, care reunește fibrilele prin legături sulfidice. În cazul fibrelor de colagen, agregarea fibrilelor se face mai mult prin forțe fizico-chimice. O altă ipoteză susține originea diferită a reticulinei și respectiv a colagenului, provenită dintr-un nivel de sinteză celular diferit: histocitoblaste în cazul reticulinei și fibroblaste în cazul colagenului.

1.1.Aminoacizii constituenți ai proteinelor

Aminoacizii regăsiți în proteinele de biosinteză (numiți și aminoacizi proteinogeni) sunt specii chimice care conțin două grupări funcționale, una aminică și una carboxilică, grefate la un același atom de carbon, denumit carbon . Dată fiind această structură, aminoacizii proteinogeni sunt -aminoacizi.

În natură au fost identificați circa 300 aminoacizi, dar dintre aceștia doar 20 au fost regăsiți în compoziția proteinelor, prin hidroliza completă a acestora din urmă. O serie de proteine încorporează și derivați ai unor aminoacizi proteinogeni, formați după ce aminoacidul de proveniență a fost încatenat prin biosinteză (exemple: hidroxiprolina și hidroxilizina). Structura chimică a -aminoacizilor este prezentată în figura 2.2.

Figura 2.2.: Reprezentări ale structurii -aminoacizilor.

1.1.1. Aminoacizii naturali proteinogeni. Caracteristici și proprietăți.

Aminoacizii, în general, conțin în moleculă cel puțin două grupări chimice ionizabile, care pot juca rolul unor funcțiuni slab acide, respectiv gruparea carboxil nedisociat și gruparea amoniu:

În soluții apoase, aceste două grupări se pot regăsi fie în stare ionizată, fie în stare neîncărcată electric, funcție de pH-ul soluției. Cele două forme se află în echilibre de deprotonare / protonare:

Gruparea carboxil nedisociată este un acid cu circa trei ordine de mărime (altfel spus, de câteva mii de ori) mai puternic comparativ cu gruparea amoniu organic, astfel încât la pH neutru practic toate grupările carboxil se găsesc sub formă disociată, de ion carboxilat, iar majoritatea grupărilor aminice se găsesc sub formă protonată, de amoniu cuaternar:

Pe măsură ce valoarea pH-ului mediului apos scade, grupările caboxilat se protonează progresiv, iar grupările aminice rămân în continuare protonate, fiind acizi mai slabi decât ionul carboxilat. Valorile aproximative ale constantelor de aciditate ale funcțiilor chimice ionizabile specifice aminoacizilor sunt prezentate în tabelul 1.1. Ele pot fi utilizate pentru a aprecia valoarea pH-ului la care au loc protonările, respectiv deprotonările grupărilor chimice ale aminoacizilor.

Tabelul 1.1.: Grupările slab acide regăsite în structura aminoacizilor proteinogeni

1.1.2. Structura aminoacizilor și proprietățile specifice care derivă din aceasta

Din punct de vedere chimic, aminoacizii proteinogeni pot fi clasificați în două mari categorii, funcție de caracteristicile grupării laterale, generic notată cu R. Astfel, există aminoacizi nepolari și polari, această modalitate de grupare fiind prezentată în tabelul 1.2. Tabelul 1.3. prezintă caracterul catenelor aminoacidice laterale, iar tabelul 1.4. rezumă denumirile aminoacizilor, formula lor structurală și modul de codificare a acestora în variantele cu trei și respectiv cu un caracter (literă). În acest din urmă tabel, cu excepția aminoacizilor prolină și hidroxiprolină, sunt prezentate doar structurile catenelor laterale.

Tabelul 1.2.: Calsificarea l-(-)- -aminoacizilor proteinogeni funcție de polaritatea

catenei lor laterale (enumerați în ordine alfabetică).

Tabelul 1.3.: Caracterul chimic și fizico-chimic al catenelor aminoacidice laterale

pentru aminoacizii proteinogeni (enumerare în ordine alfabetică).

Tabelul 1.4.: Denumirea, structura chimică și modul de codificare a aminoacizilor

proteinogeni

Tabelul 1.5. prezintă valorile constantelor de ionizare ale grupărilor polare ale aminoacizilor proteinogeni, precum și poziția punctului lor izoelectric pe scala de pH. Pentru aceste constante, în literatura de specialitate se regăsesc valori ce diferă în mică măsură, funcție de metoda utilizată la determinare.

Tabelul 1.5.: Constantele de ionizare ale grupărilor polare ale aminoacizilor

proteinogeni și pH-ul izoelectric al respectivilor aminoacizi.

Din examinarea datelor cuprinse în tabelul 2.5. se remarcă faptul că gruparea -carboxil a aminoacizilor este un acid mai puternic (= 2,1 0,5) decât gruparea similară a majorității acizilor carboxilici (spre exemplu, pentru acidul acetic = 4,76). Aciditatea grupării aminice protonate este redusă (= 9,8 1,0), întrecând mult bazicitatea grupării carboxil disociate ( 2). Din acest motiv, în apă pură, gruparea aminică protonată va dona protonul mai ușor decât îl va accepta gruparea carboxil disociată, ceea ce are drept consecință o reacție slab acidă a soluției (prezența unui exces de protoni liberi, accesibili altor baze eventual prezente în soluție). În cazul acizilor aspartic și glutamic, aciditatea grupării carboxil de ce catena laterală este mai mică decât aciditatea grupării -carboxilice, fiind comparabilă cu aceea a acizilor organici. Pentru acești doi aminoacizi influența prezenței grupării -aminice imediat învecinate (grefate pe același atom de carbon) nu mai este la fel de puternică, ei având cel mai scăzut punct izoelectric.

1.2. Valorificarea colagenului din deșeuri de piele animală

În procesele tehnologice de solubilizare (extracție) a colagenului din dermă, fibrele elastice, cele de reticulină, precum și alte componente necolagenice, sunt eliminate prin tratamente chimice și enzimatice.

Pentru obținerea de diverse extracte colagenice tip I fibrilar se poate utiliza pielea crudă sau deșeurile de piele tehnologice, rezultate din industria de pielărie.

Pentru valorificarea acestor deșeuri, atât în industria de pielărie cât și în alte domenii, au fost elaborate diverse procedee de prelucrare mecanică, chimică, enzimatică sau mecano-chimică Trebuie subliniat faptul că procedeele de reciclare și recuperare a deșeurilor de piele nu urmează cursul obișnuit al celor folosite pentru alte tipuri de deșeuri, care pot fi reutilizate, ca materie primă (cum este în cazul metalului, sticlei, textilelor etc.). Din această cauză, tehnologiile stabilite se referă în primul rând la extragerea proteinei colagenice – componenta de bază din piele – sub formă de fibre scurte sau solubilizate, urmărindu-se realizarea unui randament și grad de valorificare (transformare) cât mai ridicat.

Procedeele de valorificare ale colagenului din deșeurile de piele animală depind de proveniența acestora (bovine, porcine, caprine, ovine, pești, pasări, reptile, etc.), de faza tehnologică din care rezultă și de suprafața acestora.

Principiul de procesare a acestui component util (colagenul) este redat schematic în figura nr.1.3.

Figura nr.1.3. Principiul de procesare a colagenului

Termenul de material colagenic se referă la totalitatea tipurilor de structuri macromoleculare de natura colagenică (glicoproteine caracterizate printr-un conținut ridicat de prolină și hidroxiprolină) care sunt diferențiate prin compoziție chimicp, caracteristici obținute prin prelucrarea (I) a pieilor și deșeurilor de piele.

Produsele colagenice (bioproduse) pot fi sub formă de fluide, geluri, solide, cu forme și morfologii diferite, care se obțin prelucrând (II) materiale colagenice prin compoundare cu diverse materiale auxiliare în urma unor operații specifice (amestecare, profilare, formare, etc.).

Deșeurile de piele pot fi clasificate în două mari grupe, respectiv de la:

– prelucrarea pieilor crude și cenușărire (șeruitură și ștuțuitură);

– prelucrarea pieilor tăbăcite și finisate precum și din industria confecțiilor de piele.

Pentru valorificarea acestor deșeuri din industria de pielărie au fost elaborate diverse procedee de prelucrare mecanica, chimica, enzimatica .

1.2.1.Deșeuri de piele netăbăcită

Deșeurile de piele gelatină sunt utilizate de multă vreme pentru fabricarea cleiului, gelatinei și a făinii de furaje. Apariția pe piață a adezivilor (acrilici, poliuretanici, cauciuc natural, etc.) a făcut ca desfacerea cleiurilor să fie aproape sistată.
Făina furajeră utilizată în alimentația animalelor, este în prezent mult discutată datorită conținutului redus în aminoacizi esențiali, care îi scad valoarea nutritivă și nu în ultimul rând al raportului calitate/preț.

În această conjunctură cercetările în direcția unei valorificări superioare a deșeurilor de piele cu conținut ridicat de polipeptide (colagen) s-au îndreptat spre dezvoltarea de noi produse cu aplicabilitate în:

– industria alimentară;

– industria de pielărie;

– medicina veterinară;

– medicina umană;

– agricultură;

– alte domenii.

O succintă prezentare a tehnologiilor existente de prelucrare a deșeurilor din piele netăbăcită este prezentată în figura nr.1.4.

Figura nr.1.4. Tehnologii de prelucrare a deșeurilor de piele netăbăcită și domeniile de valorificare

După depistarea encefalopatiei spongioforme la bovine (boala vacii nebune) s-au impus anumite restricții de utilizare a materialelor colagenice obținute din piei bovine la obținerea bioproduselor utilizabile in industria alimentara (Cliche et al, 2003; Liu et al, 2007; Liu et al, 2012).

O alta restricție de utilizare în industria alimentara se refer ă la materialele colagenice obținute din piei porcine datorită faptului că produsele alimentare cu acest conținut ar putea fi consumate de populația musulmana ( Riaz and Chaudry, 2004; Fadzlillah et al, 2011)

Astfel singura sursă de colagen acceptată este dată de animalele marine (Liu et al, 2007; Parenteau-Bareil et al, 2012).

Astfel având în vedere aceste considerații precum și resursa de deșeuri de piele în lucrarea de față s-au utilizat deșeuri de piei netăbăcite bovine și de pește.

PARTEA EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL 2 EXTRAGEREA COLAGENULUI DIN DEȘEURI DE PIELE NETĂBĂCITĂ DE BOVINĂ ȘI PEȘTE

2.1. Extragerea colagenului din deșeuri de piei bovine netăbăcite

Având în vedere că în acest moment în România 99% din deșeurile de piele netăbăcită (gelatină) sunt depozitate la groapa de gunoi, găsirea unor soluții de utilizare a acestora este impetuos necesară atât din punct de vedere ecologic dar mai ales economic.

Este cunoscut faptul că la prelucrarea a de piele bovină (crudă/brută) rezultă ~ deșeuri, cea mai mare parte din ele reprezentând-o deșeurile de piele netăbăcită (crudă/brută/gelatină) de circa .

În tabelul nr.2.1. este prezentată compoziția chimică a deșeurilor de piele netăbăcită respectiv, șeruitură (țesut hipodermic, bucăți de țesut dermic, apă, produse chimice etc.) ștuțuitură (fragmente de piele, șpalt/ștuțuirea pieilor crude/gelatină)

Tabelul nr.2.1. Compoziția chimică a deșeurilor de piele bovina netăbăcită

* cifrele marcate reprezintă valori recalculate la liber de apă

După cum se observa din tabelul nr.3.1. deșeurile din pielea și șpaltul gelatina, respectiv ștuțuitura au un conținut foarte ridicat în substanța proteica recomandându-le pentru o recuperare totala și utilizarea lor pentru extracția colagenului.

Tehnologiile de extracție a colagenului diferă funcție de starea finala a acestuia, respectiv stare conformaționala nedenaturata sau denaturata.

2.1.1. Extractia colagenului in stare conformationala nedenaturata

Tehnicile de extracție ale colagenului în stare nedenaturata din pielea bovina trebuie sa asigure fragmentelor structurale (fibrile, microfibrile) păstrarea informațiile biostructurale naturale.

Trecerea colagenului insolubil în soluție cu păstrarea conformației moleculare de triplu helix, se realizează în urma distrugerii legăturilor transversale, în special a celor covalente care susțin structura.

Obținerea extractelor colagenice depinde de materia prima și de domeniul de utilizare ca bioprodus final .

Câteva din variantele tehnologice de extracție a colagenului în stare conformaționala sunt prezentate în figura nr.2.1.

Figura nr.2.1. Tehnologii de extracție a colagenului din piei bovine netăbăcite în stare conformaționala nemodificata

2.1.2. Extracția colagenului in stare conformaționala denaturată

Pentru experimentările de obținere a bioproduselor cu aplicabilitate în agricultura și prelucrarea pieilor, care fac obiectul acestei lucrări, hidrolizatele de colagen au fost practic materialele colagenice de la care s-au pornit formulările noilor materiale obținute, caracterizate și experimentate în aceasta lucrare.

Hidrolizatele (alături de gelatina) se obțin prin metode de extracție în stare conformaționala denaturata și conțin cca 90% macromolecule de colagen denaturat sub forma de lanțuri polipeptidice.

În figura nr.2.2. sunt prezentate etapele tehnologice de prelucrare a țesutului dermic pentru obținerea colagenului denaturat și respectiv a colagenului hidrolizat.

Combinarea acțiunii agentului de solubilizare cu temperatura produce denaturarea conformației structurale caracteristice colagenului nativ.

Denaturarea poate ajunge la toate nivelele structurii colagenului prin distrugerea reticularilor inter și intra moleculare covalente, hidrofobe, legăturilor de hidrogen precum și a legăturii peptidice din lanțurile α-helix.

Figura nr.2.2. Tehnologie de extracție a colagenului în stare conformaționala denaturata

Colagenul sub acțiunea alcalilor, acizilor, temperaturii, se denaturează mai întâi în gelatina, apoi în polipeptide (hidrolizate) și în final în aminoacizi.

Termenul de hidroliza se refera în general la degradarea proteinelor pana la componentele de baza-aminoacizii, în acest ultim caz, hidroliza necesita condiții drastice: temperatură și presiune ridicata, concentrații mari de acizi sau baze. Hidroliza parțiala a proteinelor, cu concentrații relativ scăzute de acizi și baze, sau pe cale enzimatica, conduce la o degradare parțiala a structurii tridimensionale, numai pana la polipeptide (figura nr.2.3. și 2.4.).

Tehnologia de hidroliza a colagenului insolubil are două variante:

• hidroliza chimica în mediu acid sau alcalin;

• hidroliza enzimatică.

Figura nr.2.3. Tehnologia de hidroliza chimica a colagenului din deșeuri de piele bovină netăbăcită

Figura nr.2.4. Tehnologia de hidroliză enzimatica a colagenului din deșeuri de piele bovină netăbăcită (gelatina)

Prin combinarea agenților chimici cu temperatura și presiunea se obțin diferite stadii de hidroliza a colagenului, caracterizate prin greutatea moleculara medie a hidrolizatelor.

Gradul de polidispersie a polipeptidelor extrase este foarte mare, deoarece scindarea lanțului polipetidic se produce în punctele slabe de legătura.

Atât natura chimica diferita a legăturilor din structura colagenului, cat și numărul lor foarte mare, nu permit o distrugere selectiva a lor, ceea ce face ca procesul de hidroliză (în special cel chimic) să aibă un caracter static.

Hidroliza enzimatica este mai selectiva prin faptul ca eznimele acționează preferențial pe anumite secvențe de aminoacizi. Procesul nu poate fi controlat integral, deoarece enzimele acționează continuu și asupra fragmentelor extrase nu numai asupra substratului de piele gelatină.

Un control riguros asupra cineticii procesului de hidroliza enzimatica se poate realiza doar dacă substratul este format din gelatina sau colagen solubil. Astfel hidroliza enzimatica parcurge un proces de degradare progresiva, mai întâi prin scindarea reticularilor intermoleculare și a regiunilor terminale (telopeptide), apoi prin scindarea reticularilor intramoleculare se ajunge la nivelul lanțurilor α-helix. Scindarea lanțurilor în fracții este influențată foarte mult de parametrii procesului și condițiile de hidroliza enzimatică.

Tripsina scindează catena polipetidică la nivelul legăturilor peptidice formate intre grupările carboxil și resturile de arginina și lizina, cat și a legăturilor amidice și esterice ale acestor aminoacizi bazici. Secvența resturilor de aminoacizi cer se găsesc in vecinătatea situsului catalitic activ al tripsinei este:-glicina-asparagina-serina-glicina-prolina-valina-.

Chimotripsina hidrolizează legătura polipetidică in care este implicata gruparea carboxil a tirozinei, fenilalaninei si triptofanului si intr-o mai mica masura la nivelul metioninei si leucinei. In centrul catalitic activ al chimotripsinei se afla un rest de serina si secventa de aminoacizi din vecinatatea centrului catalitic activ este: -glicina-asparagina-serina-glicina-.

Pepsina scindeaza legaturile polipeptidice formate prin participarea grupării amino a resturilor de fenilanlina și tirozina, cu gruparea carboxil a altor resturi de aminoacizi (acid glutamic, metionina, glicina, cisteina, etc.). la nivelul centrului catalitic activ este prezenta următoarea secvența de aminoacizi: -izoleucina-valina-asparagina-treonina-.

Compoziția în aminoacizi a colagenului variază cantitativ de la o specie la alta. În tabelul 2.2. este redat conținutul în aminoacizi din diferite specii .

Tabelul 2.2. Compoziția în aminoacizi a colagenului fibrilar tip I din diferite specii animale

2.2. Extragerea colagenului din piei de peste netabacite

Dezechilibrarea balanței de piei animale în sensul scăderii cantității de piei de bovine, porcine, ovine, resursă tradițională pentru industria de pielărie, resimițită încă din condus la reconsiderarea și a altor resurse de piei printre care si a pieilor de peste.

În general, pielea tuturor speciilor de pește, de apă dulce sau sărată poate fi tăbăcită, dar numai pielea de la câteva specii de apă dulce și sărată poate constitui o resursă de materie primă pentru industria de pielărie.

Spre deosebire de pieile de pește cartilaginos (gelly-fish): rechin, calcan, care pot fi tăbăcite ca atare, solzii acoperind parțial pielea, pieile de pește osos (Bony-fish) care au solzi mari sau mici de tip cycloid sau ctenoid, se pot tăbăci numai după îndepărtarea solzilor, care cresc din epidermă și care acoperă aproape întreaga suprafață a acestuia. Îndepărtarea solzilor conduce la o structură specifică a suprafeței pieilor, lăcașul (buzunarul) solzilor rămâne deschis. Acest aspect diferențiază pielea de pește de cea de șarpe, unde solzii sunt crescuți direct din corium-ul pielii și rămân în timpul procesului de tăbăcire.

Pieile peștilor, constituie în mediu (de exemplu la cod) cca. 3% din greutatea corpului, iar partea de piele care se pretează cel mai bine la tăbăcit, din cauză că se jupoaie mai ușor, adică aceea de pe prima jumătate a corpului, se ridică la 1,7 – 2%.

Pescuitul de coastă și cel de larg este cel care asigură în majoritatea țărilor, cantități de pește necesare atât consumului alimentar, dar și materia primă pentru industria de pielărie, zootehnie, cosmetică, etc.

În prezent, în întreaga lume se pescuiesc cca. 600.000 t/an de crap, anghilă, somn, cod, etc. Jupuirea (îndepărtarea pielii) se poate face și manual sau mecanic, direct pe vasele de pescuit sau la societățile care prelucrează peștele congelat sau sărat. Pielea separată poate fi conservată prin congelare sau sărare, în cazul în care peștele a fost congelat, sau prin congelare dacă peștele a fost proaspăt.

Pe plan mondial se prelucrează pieile de anghilă, somn și crap, mai mult decât cele provenite de la cod, hering, stavrid, etc., aceasta datorită modului de utilizare în alimentație: file sau tranșat ca atare cu piele.

Pană în prezent, deși există resursă nu se poate vorbi încă de o industrie dezvoltată, de marochinărie și confecții bazată pe pielea de pește tăbăcită. Acest fapt se datorește specificului structurii pielii, ce cuprinde zone diferențiate, dimensiunilor mici și variabile în funcție de specie, precum și dificultăților încă existente în asigurarea condițiilor optime pentru conservarea pieilor.

În domeniul tehnologiilor de tăbăcire și finisare sunt realizate progrese importante, în special în operațiile de desolzare și de stabilizare (fixare) a buzunarelor solzilor care conferă modelul specific de piele de pește.

Tradiție în prelucrarea pieilor de pește precum și a celor de calcan și de rechin au mici producători din Asia, Coreea, Taiwan, Japonia, Australia, Danemarca și țările Scandinave (Norvegia, Suedia).

În ceea ce privește pescuitul rechinului și deci și prelucrarea pieilor, în acord cu organismele internaționale (TRAFIC International), mai mult de 125 de țări participă la comerțul cu rechini și produsele acestuia.

La nivel internațional, se impune însă două etape esențiale și anume: o monitorizare consistentă și eficientă a pescuitului, depozitării și comerțului cu rechini, precum și efortul global și susținut de asigurare a supraviețuirii speciei.

În ceea ce privește prelucrarea pieilor de reptile aceasta întrece în prezent prelucrarea pieilor de pește.

În Europa, s-au efectuat studii de piață și de fezabilitate: CTC-Franța, BLC-Anglia, Spania, pentru conservarea pieilor de somn și prelucrarea peștelui pe nave speciale de pescuit. S-a optat pentru conservarea sau piclarea pieilor combinate cu o ușoară congelare, pentru o mai bună protejare a structurii fibroase colagenice, care este foarte sensibilă la temperaturi de peste 27oC.

Specialiștii pielari din Europa, au stabilit tehnologii pentru prelucrarea pieilor de pește, utilizând produse auxiliare realizate special de firme mari cu tradiție în sinteza de produse chimice: BASF, Clariant, Zechimmer și Schwarz, TFL, dar aplicarea lor se realizează la nivelul micilor producători; iar destinația este pentru fabricarea de articole de marochinărie.

Pe plan mondial, resursa de piele de pește este considerată atractivă tehnico-economic și cu stabilitate cantitativă pe termen lung, bineînțeles în acceptarea unui echilibru armonios al ecosistemului planetar.

În prezent în țara noastră pielea de pește nu se prelucrează nici la nivel de mic producător și nu sunt stabilite condițiile de conservare și depozitare a pieilor de pește în sistem organizat (pescuit/prelucrat) și nici resursa formată din subproduse piscicole (pește mărunt și gelly-fish) nu este valorificată. După anul 1990, datorită proceselor normale de descentralizare, restructurare, privatizare, industria piscicolă din țara noastră este într-o situație critică datorită faptului că flota de pescuit s-a redus drastic, întreprinderile de industrializare a peștelui s-au redus sau și-au redus capacitatea, iar poluarea aerului, apelor fluviale și a Mării Negre a dus la micșorarea cantității de pește.

Pielea de pește are două părți fundamentale: epitelium și pielea propriu zisă. În epitelium se află celulele care secretă un lichid vâscos (la rechini pielea este presărată cu dinți și este aspră) (fig. 2.5. și 2.6.).

Figura nr.2.5. – Aspectul denticulelor dermice Figura nr.2.6. – Solzi plancoizi la diferite specii de rechin

Pielea propriu-zisă se compune din solzi, vase sanguine, limfatice, nervi, grăsimi, pigmenți, proteine și mucopolizaharide).

Solzii de pește se află implantați în epidermă (la bony-fish)sau în corium (la rechini, calcan)și sunt clasați pe patru grupe de bază:

1) placoidali, în formă de spini ca la rechini;

2) gonoidali care s-au format prin conjuncția catorva straturi în formă de roculi – la sturioni;

3) cicloidali, de formă rotundă;

4) heternoidali

Este important de cunoscut structura histologică a pielii peștelui pentru a elabora cea mai adecvată tehnologie de desolzare și de prelucrare ulterioară a pieilor de pește.

Pieile de pește sunt formate dintr-o rețea de fibre subțiri slab împletite, așezate mai mult în direcție paralelă cu suprafața și legate între ele numai la intervale mari.

Stratul feței este mai puțin diferențiat de restul dermei. Ca urmare a lipsei de pori și glande, în special a lipsei glandelor sebacee, lipsește un strat papilar propriu-zis. Stratul superior al dermei este caracterizat prin solzi sau plăci care ies din piele și sunt implantate, în parte, în anumite pungi ca și perii. Solzii pieilor de pește sunt formațiuni ale dermei și nu ale epidermei cum este părul mamiferelor. Solzii sunt formații din țesut conjunctiv neosificat.

Studiile asupra compoziției chimice a pieilor de pește au arătat că ele conțin colagen alături de proteinele colagenice, glicoproteine și mucopolizaharide. În literatură se găsesc denumirile de “ ichtyocol “ pentru colagenul din vezica înotătoare, din pielea și din tendoanele peștilor osoși «(teleosteni ), “ ichtylepidin “ pentru o componență a oaselor și solzilor pe care unii autori o consideră identică cu colagenul, iar alții o consideră prin solubilitatea mai redusă în acizi și alcalii și prin temperatura de contracție mai ridicată. Un amestec de proteine extras din aripioarele dorsale ale rechinilor este denumit «elastoidină ».

Compoziția în aminoacizi a colagenului din diferite specii de pești, comparativ cu colagenul din pielea de vițel este prezentată în tabelul nr. 3.3. Datele sunt calculate în număr de resturi din aminoacidul respectiv la 1000 resturi.

Limitele de variație ale compoziției colagenului din pielea de pește, sunt relativ restrânse deși variațiile cantitative sunt mai mari la mamifere, reflectând vârsta vertebratelor acvatice ; datele asupra principalilor aminoacizi sunt apropiate de cele obținute la mamifere. Conținutul în azot total este mai ridicat decât al pielii de vițel ; în orice caz, după cum se știe azotul total în colagen și în gelatină depășește valoare de 16% admisă în general pentru proteine, ajungând la 17,7% ; de aceea la calcularea proteinelor din azotul total nu se folosește factorul 6,25 și 5,62.

Tabel nr. 2.3. Aminoacizii din colagenul de diferite proveniențe – după Eastoe

CAPITOLUL 3 : MATERIALE, APARATURA SI MATERIALE UTILIZATE

3.1. Materiale, aparatura și metode utilizate

3.1.1. Materiale utilizate

deșeuri de piele de bovina netăbăcita(gelatina)

deșeuri de piele de peste netăbăcita (cruda)

Pentru tehnologia de prelucrare a pieilor de peste s-au folosit următorii reactivi:

apa demineralizata;

Var hidratat praf (Ca(OH)2)

Tripsina 1%:

Pepsina 1%;

Sulfat de sodiu cristalizat p.a.;

Hidroxid de sodiu p.a.;

Fosfat trisodic p.a.;

Acid clorhidric 1N, p.a.;

Bicarbonat de sodiu p.a;

Acid lactic 2%;

Hidroxid de calciu 2%.

produs comercial enzimatic ce conține 30.000 MWU lipaza; 900 unit./g celuloza; 1.200 unit./g amilaza si 10.000 unit./g proteaza

Pentru caracterizarea fizico-chimica a pieilor de peste s-au utilizat următorii reactivi:

Acid clorhidric conc. p.a.;

Eter etilic

Clorura de sodiu, sol. 15%

Metilorange sol. Apoasa 0,2@

Sulfat de sodiu anhidru;

Hidroxid de sodiu, sol. 0,1N;

Fenolftaleina, sol. alcoolica 1%;

Acid sulfuric 0,1N;

Acid boric, sol. 4%;

Eter de petrol

3.1.2.Aparatura utilizata:

Pentru prelucrarea deșeurilor din piele de peste: alimentator deșeuri, mașina de tocat / măcinat, cantar, fierbător pentru hidroliza acida ; mixer planetar (separare ulei / proteine / reziduu) vase de neutralizare, condiționare, ambalare.

Pentru prelucrarea deșeurilor de piele bovina netăbăcita (gelatina): mașină de tocat tip C/E 660 (cuțite duble) de la firma PETRUZALEK, autoclava de 50l cu dubla manta 90-

In figura nr.3.1 sunt prezentate deșeurile de piele bovina netăbăcite (gelatina), mașina de tocat , vasul de reacție pentru hidroliza (autoclava) si aspectul unui hidrolizat de colagen obținut.

Figura nr.3.1. Deșeurile de piele bovina netăbăcite (gelatina), mașina de tocat , vasul de reacție pentru hidroliza (autoclava) si aspectul unui hidrolizat de colagen obținut

Aparatura utilizata pentru investigarea aminoacizilor si grupelor peptidice conținute de materialele proteice obținute :

JASCO HPLC LC Net II/AC(Japonia) pentru cromatografia de lichide de înalta performanta (HPLC)

Vertical Dual-Gel Units VWR (Austria) sistem de electroforeza

3.1.3. Metode utilizate :

● analitice

– Determinarea materii volatile conform SR EN ISO4684:2006

– Determinarea cenușii sulfatate conform SR EN ISO 4047:2002

– Determinarea azotului total conform SR ISO 5397:1996

– Determinarea substanțelor grase conform STAS 145/20-88

● instrumentale

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) este o formă a cromatografiei pe coloană utilizată frecvent la separarea, identificarea și cuantificarea diferiților compuși. Este considerată o foarte bună metodă de separare și cuantificare a aminoacizilor dintr-o proteină, pe baza compoziției relative de aminoacizi putându-se determina tipul și autenticitatea unei proteine. Există mai multe metode de analiză cantitativă a aminoacizilor care diferă între ele prin mecanismul de separare al aminoacizilor, prin modul de derivatizare și prin sistemul de detecție, cea mai utilizată metodă fiind cromatografia de lichide cu mecanism de schimb ionic, cu derivatizare postcoloana cu o-ftalaldehidă și detector de fluorescență.

Cromatograful de tip JASCO HPLC LC Net II/AC (figura nr.3.2.) are in componenta doua pompe binare, degazor, autosampler (cu un suport ce permite introducerea a unui număr de 50 de probe), termostat (ce conține suporți pentru un număr de doua coloane) si poate asigura o încălzire a incintei coloanelor pana la o temperatura de , detector UV-VIS cu punte de diode.

Achiziția de date se poate face pe trei canale simultan.

Echipamentul poate utilizează coloane cromatografice Kromasil, LichroSphere, Nucleosil.

Programul specific al echipamentului se numește ChromPass, program ce este utilizat atât la analiza cat si la prelucrarea ulterioara a rezultatelor.

Așa cum se poate observa in figura nr.33, se poate vedea o reprezentare 3D a semnalului probei (timp, lungime de unda, intensitate) putându-se identifica spectrul UV-Vis in fiecare punct al spectrului probei.

Figura nr.3.2. Dispozitivul de tip JASCO HPLC LC Net II/AC (Japonia)

Figura nr.3.3. Reprezentare 3D a semnalului probei (timp, lungime de unda, intensitate)

Electroforeza reprezintă migrarea moleculelor încarcate electric aflate intr-un mediu lichid, sub influenta unui câmp electric, putându-se astfel realiza separarea componenților unui amestec, și este utilă ca metodă analitică, avantajul major este acela că proteinele pot fi vizualizate și separate în același timp, permițând estimarea rapida a numărului de proteine dintr-un amestec sau gradul de puritate al unui preparat proteic specific. Electroforeza permite, de asemenea, determinarea proprietăților fundamentale ale proteinelor, cum ar fi punctul izoelectric sau greutatea moleculara[ Keren,D.F. (2003); Bollag, D.M. si Edelstein, S.J.,(1991)].

Experimentarile pentru aceasta lucrare au fost realizate in cadrul Institutului National de Cercetare Dezvoltare Textile-Pielarie Sucursala Institutul de Cercetari Pielarie Incaltaminte (INCDTP Sucursala ICPI) Bucuresti in cadrul Laboratorului Incercari Control Calitate s-au executa analizele fizico-chimice si instrumentale, iar experiementarile prectice (hidrolizele) au fost realizate in Statia Pilot a Departamentului Pielarie.

CAPITOLUL 4 : REZULTATE

4.1.. Extragerea colagenului din deseuri de piei netabacite bovine/la nivel laborator micropilot

4.1.1.1.. Hidroliza enzimatică (HEB)

Pentru o hidroliza mai profunda s-au cântărit 5000g de deșeuri de piele netăbăcita (gelatina), se supun unui pretratament in 30- de apa, la temperatura camerei, timp de 4 – 6 ore. Aceasta etapa de pretratare este necesara pentru a obține pH-ul optim pentru digestie enzimatica. Apoi se adaugă 0,5 – 1% produs comercial enzimatic ce conține 30.000 MWU lipaza; 900 unit./g celuloza; 1.200 unit./g amilaza si 10.000 unit./g proteaza. Amestecul se menține timp de 1,5- 2,5 ore la temperatura de 35-.

4.1.1.2. Hidroliza acido-enzimatică (HAEB)

Modelul experimental privind obținerea materialului colagenic (HAB) din deșeuri de piei bovine netăbăcite propus cuprinde următoarele operații:

1. O cantitate de de deșeuri de piele netăbăcită (piele gelatină) este spălată cu apă curentă la temperatura de 20- într-un butoi.

2. Deșeurile de piele se mărunțesc cu o mașină de tocat tip C/E 660 (cuțite duble) de la firma PETRUZALEK, obținându-se o masa păstoasă, omogenă .

3. Apoi urmează hidroliza propriu zisa cu 0,2% acid boric si 0,1% HCl in autoclava de 50l cu dubla manta 90- timp de 2,5 – 5 ore,

4. Se adauga produsul enzimatic 0,2-0,3% si se continua hidroliza încă 5-8 ore.

4.1.2.. Extragerea colagenului din deșeuri de piei netabacite bovine la nivel laborator micropilot

4.1.2.1. Hidroliza acida

S-au prelucrat cca.20 kg de deșeuri de piele peste (crap) cruda prin hidrolizare acidă în două variante: HAP1 cu un amestec de 3% acid (1,5% HCl, 1,5% ac. lactic) , HAP2 cu un amestec de 3% acid (1,5% HCl, 1,5% ac. lactic) la care s-a adăugat 1,5% emulsie de ulei vegetal/apă;

Algoritmul tehnologic de extragerea colagenului din deșeuri de piele de peste prin hidroliza acida este prezentata in figura

Hidroliza acidă s-a efectuat în 2 variante HAP1 și HAP2. Ca agent de hidroliză s-a folosit un amestec de acizi în varianta HAP2.S-a utilizat și o emulsie ulei/apă.

In figura nr.4.1. este prezentat schematic procedeul de obtinere a hidrolizatului proteic– HAP1 din deseuri de piele de peste prin hidroliză acidă

Figura nr.4.1. Obtinerea hidrolizatului proteic– HAP1 din deseuri de piele de peste prin hidroliză acidă

4.1.2.2. Hhidroliză acidă cu emulsie ulei/apă

In figura nr.4.2. este prezentat schematic procedeul de obtinere a hidrolizatului proteic– HAP2 din deseuri de piele de peste prin hidroliză acidă cu emulsie ulei/apă

Figura nr.4.2.Obtinere a hidrolizatului proteic– HAP2 din deseuri de piele de peste prin hidroliză acidă cu emulsie ulei/apă

4.2. Caracteristici fizico-chimice ale colagenului

In urma experimentarilor la nivel laborator/pilot s-au obtinut hidrolizate proteice , doua hidrolizate proteice HEB si HAEB din deseuri de piele bovine si doua hidrolizate proteice HAP1 si HAP2 din deseuri de piele de peste.

In tabelul nr.4.1..sunt prezentate caracteristicile fizico-chimice ale hidrolizatelor din deșeuri piei de peste (crap) HAP1 – HAP2

Tabelul 4.1. Caracteristici fizico-chimice ale hidrolizatelor din deșeuri piei de peste HAP1 – HAP2

După cum se observa in tabelul 4.1. hidrolizatul de colagen obtinut din deseuri piei de peste HAP2 nu are grasimi iar substanta dermica este mai mare dacat 1 datorita eficentei metodei propuse de extragere a grasimilor prin tehnologiile de prelucrare a deseurilor din piei de peste fără solventi ,valorile de la materiile volatile, azotul total , azotul aminic si pH sunt sensibil egale, diferenta fiind foarte mica.

In tabelul nr.4.2..sunt prezentate caracteristicile fizico-chimice ale hidrolizatelor din deșeuri piei bovine netăbăcite HEB si HAEB

Tabelul 4.2. Caracteristici fizico-chimice ale hidrolizatelor din deșeuri de piei bovine netăbăcite HEB si HAEB

După cum se observa in tabelele 4.1. si 4.2.. hidrolizatele de colagen obținute din deșeurile de piele bovina si peste prin hidrolize acide, enzimatice si combinate au un conținut de substanța dermica cuprins intre 48-70% , substanțe grase cuprinse intre 0-8%, valori de pH cuprinse intre 2,8-7,2. Aceste caracteristici ne indica faptul ca materialele colagenice obținute si caracterizate pot fi utilizate ca atare in industria alimentara sau pot fi baza de plecare pentru ingrediente alimentare prin prelucrări ulterioare (purificări, compoundări, aditivări, funcționalizări).

4.2.1. Determinarea conținutului de aminoacizi din hidrolizatele obținute din deșeuri de piei bovine netăbăcite

Pentru determinarea compozitie in aminacizi a hidrolizatelor colagenice obtinute, acestea au fost analizate prin cromatografie de inalta performanta HPLC cu detectie UV.

In tabelul nr.4.3. sunt prezentate cantitățile de aminoacizi regăsite in hidrolizatele enzimatice HEB si acido-enzimatice HAEB.

Tabelul nr. 4.3. Cantitățile de aminoacizi regăsite în hidrolizatele enzimatice HEB si acido-enzimatice HAEB

După cum se observa in tabelul nr.4.3.. cantitatea de aminoacizi decelata in proba HAEB este aproape dubla fata de proba HEB, lucru firesc pentru ca proba HAEB a rezultat în urma unei hidrolize mai intense si de durata mai lungă utilizând atât efectul chimic al acizilor cat și acțiunea hidrolitica a produsului enzimatic.

4.2.2, Determinarea maselor moleculare a hidrolizatelor de colagen obținute din deșeuri de piele de peste cu ajutorul electroforezei

S-a utilizat electroforeza pe gel de acrilamida si sistemul kuroGEL Verti 10×10 cm, Vertical Dual-Gel Units, VWR Austria , prezentat in figura nr.4.3.au fost analizate următoarele 4 probe

Figura nr.4.3. Sistem de electroforeza Vertical Dual-Gel Units, VWR Austria

Au fost analizate următoarele 7 probe:

GB1 sol.1% – soluție aprox. 1% gelatina extrasa din piele bovina cenușărită;

GP1S sol.1% – soluție aprox. 1% gelatina extrasa din piele cruda de peste păstrăv;

GP1C sol.1% – soluție aprox. 1% gelatina extrasa din piele cruda de peste crap ;

GS 1F28 – hidrolizat de colagen din piele bovina tăbăcită cu săruri de crom;

GS 7F- hidrolizat de colagen din piele bovina tăbăcita cu săruri de crom;

HAP1 – hidrolizat de colagen din deșeuri piele de peste (crap), pH=2,8;

HAEB – hidrolizat de colagen din deșeuri de piele bovina netăbăcita, pH=4,86

Rezultatele obținute experimental pentru gelatine și hidrolizate de colagen, sunt prezentate în figura 4.4..

Fig. 4.4. Imaginea fotografica a gelului rezultat in urma electroforezei

"M" reprezintă markerul, probele 1-3 sunt gelatinele, iar probele 4-7 sunt hidrolizatele de colagen. Se poate constata ca gelatinele, probele 1-3, prezintă liniile caracteristice maselor moleculare din intervalul 40-60 KDa, ceea ce este in acord cu datele teoretice înregistrate in literatura de specialitate. Probele 4-7, fiind obținute prin hidroliza avansata, au mase moleculare mult mai mici decât gelatinele, iar faptul că nu sunt vizibile se datorează faptului că au mase moleculare situate sub limita inferioara a markerului.

CONCLUZII

Cercetările efectuate în cadrul acestui proiect (lucrare de disertație) a avut ca obiectiv general experimentări în direcția valorificării superioare a deșeurilor de piele rezultate în timpul proceselor tehnologice de prelucrare.

În contextul actual al crizei economice și financiare, o bună gestionare a deșeurilor prin recuperare, valorificare superioară și reintroducerea în circuitul productiv, ar conduce la nivel european la o economie de peste 74 miliarde de euro.

Obiectivele specifice a prezentei lucrări sunt: obținerea de noi bioproduse pe baza de colagen extras din deșeuri de piele netăbăcite de bovine și pești cu aplicabilitate în industria alimentară, la ingrediente (agenți de gelatinizare, texturare, glazurare, emulgare, stabilizare, liere, reglare de vâscozitate, microîncapsulare, suporturi cu enzime imobilizate, agenți de limpezire, adjuvant tehnologic).

În vederea atingerii obiectivelor proiectului s-au efectuat următoarele activități:

s-a elaborat și s-a prezentat un scurt studiu de literatura referitoare la colagen și posibilitățile de utilizare în industria alimentară și alte industrii (cosmetică, medicină, farmacie, agricultură, textile, pielărie);

– s-au prezentat posibilitățile de valorificare a deșeurilor de piele precum și date teoretice cu privire la histologia pielii animale, a compoziției colagenului, a aminoacizilor cu elemente constitutive ale proteinei;

s-au efectuat experimentări practice de extragere a colagenului din piei netăbăcite din bovine și pești utilizând noile tehnologii propuse în cadrul proiectului după cum urmează:

● în urma determinarilor analitice realizate pentru caracterizarea hidrolizatelor obtinute s-a constatat că hidrolizatele de colagen obținute din deșeurile de piele bovină și pește prin hidrolize acide, enzimatice și combinate au un conținut de substanță dermică cuprins între 48-70% , substanțe grase cuprinse între 0-8%, valori de pH cuprinse între 2,8-7,2 ;

● determinarile de aminoacizi liberi realizate din hidrolizatele obtinute au condus la concluzia că materialele colagenice obținute prin hidrolize mai avansate și combinate respectiv chimico-enzimatice conțin o cantitate mai mare de aminoacizi liberi, respectiv

HAEB conținând 8,399 g/100ml față de numai 4,530g/100ml în cazul HEB determinate prin HPLC, iar probele de gelatină utilizate pentru comparație la analizare prin electroforeză cu hidrolizatele HAP1 si HAEB au mase moleculare în intervalul 40-60 KDa față de hidrolizate care au mase moleculare mult mai mici decât gelatinele, iar faptul că nu sunt vizibile se datorează faptului ca au mase moleculare situate sub limita inferioară a markerului.

● aceste caracteristici ne indică faptul ca materialele colagenice obținute și caracterizate pot fi utilizate ca atare în industria alimentară sau pot fi bază de plecare pentru ingrediente alimentare prin prelucrări ulterioare (purificări, compoundări, aditivări, funcționalizări).

BIBLIOGRAFIE

Aberoumand, A. 2010. Isolation and characteristics of collagen from fish waste material World Journal of Fish and Marine Sciences 2 (5): 471-474

Aberoumand, A. 2012. Comparative study between different methods of collagen extraction from fish and from its properties. World Applied Sciences Journal 16 (3): 316-319.

Bae, I., Osatomi, K., Yoshida, A., Osako, K., Yamaguchi, A. and Hara, K. 2008. Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilised fishes. Food Chemistry 108: 49-54.

Bollag, D.M., si Edelstein, S.J., (1991), Protein Methods, Wiley-Liss, New York

Cao, H., Shi, F. X., Xu, F. and Yu, J. S. 2013. Molecular structure and physicochemical properties of pepsin- solubilized type II collagen from the chick sterna cartilage. European Review for Medical and Pharmacological Sciences 17: 1427-1437.

Cheng, F. Y., Hsu, F. W., Chang, H. S., Lin, L. C., and Sakata, R. 2009. Effect of different acids on the extraction of pepsin-solubilised collagen melanin from silky fowl feet. Food Chemistry 113: 563-567.

Crowley, D. C., Lau, F. C., Sharma, P., Evans, M., Guthrie, N., Bagchi, M., Bagchi, D., Dey, D. K. and Raychauduri, P. 2009. Safety and efficacy of undenatured type II collagen in the treatment of osteoarthritis of the knee: a clinical trial. International Journal of Medical Sciences 6: 312-321.

Crudu M., Ionescu M, Crudu A.M., Gaidau C.C., Popescu M. A00781/28.10.2013 Compozitie pentru finisarea umeda a pieilor tabacite

Dahm, C. 2011. Final report. Alternative use of hides. Literature and patent review. Australia: Meat and Livestock Australia Limited.

Djagny, V. B., Wang, Z. and Xu, S. 2001. Gelatin: A valuable protein for food and pharmaceutical industries. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 41 (6): 481-492.

Friess, W. 1998. Review article. Collagen-biomaterial for drug delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 45 (2): 113-136.

Florea, N. (2003). „Degradarea, protecția și ameliorarea solurilor și a terenurilor”, București

Gelse, K., Poschl, E., and Aigner, T. 2003. Collagens- structure, function and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews 55 (12): 1531-1546.

Gomez-Guillen, M. C., Gimenez, B., Lopez-Caballero, M.E., and Montero, M. P. 2011. Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review. Food Hydrocolloids 25: 1813-1827. Gray, N. 2011. Collagen fibre shows potential as emulsifier. Downloaded from http://www.foodnavigator.com/ Science-Nutrition/Collagen-fibre-shows-potential-as-emulsifier on 30/07/2012.

Greene, D. M. 2003. Use of poultry collagen coating and antioxidants as flavor protection for cat foods made with rendered poultry fat.Virginia, United States: Virginia Polytechnic Institute and State University, MSc thesis.

Huo, J. and Zhao, Z. 2009. Study on enzymatic hydrolysis of Gadus morrhua skin collagen and molecular weight distribution of hydrolysates. Agricultural Sciences in China 8 (6): 723-729.

Jamilah, B., Umi Hartina, M. R., Hashim, D., Awis Qurni, S., Harvinder, K., Abdul Rahman, R., and Kaur, H.2012. Collagen extraction from aquatic animals. United States.

Karim, A. A. and Bhat, R. 2009. Fish gelatin: properties, challenges, and prospects as an alternative to mammalian gelatins. Food Hydrocolloids 23 (3):563–576.

Keren, D. F., (2003), Protein Electrophoresis in Clinical Diagnosis, Holder Arnold, London

King’ori, A.M. 2011. Review of the uses of poultry eggshells and shell membranes. International Journal of Poultry Science 10 (11): 908-912.

Lin, Y. K and Liu, D. C. 2006. Effects of pepsin digestion at different temperatures and times on properties of telopeptide-poor collagen from bird feet. Food Chemistry 94: 621-625.

Liu, D., Liang, L., Regenstein, J. M., and Zhou, P. 2012.Extraction and characterisation of

pepsin-solubilised collagen from fins, scales, skins, bones and swim bladders of bighead carp (Hypophthalmichthysnobilis). Food Chemistry 133: 1441-1448.

Liu, D. C., Lin, Y. K., and Chen, M. T. 2001. Optimum condition of extracting collagen from chicken feet and its characteristics. Asian-Austaralia Journal Animal Science 14 (11): 1638-1644.

Liu, H., Li, D. and Guo, S. 2007. Studies on collagen from the skin of channel catfish (Ictaluruspunctaus). Food Chemistry 101: 621-625.

Lixandru, Gh. (2003). „Sisteme integrate de fertilizare în agricultură”, Editura PIM, Iași

Maier S., ( 2010 ) „Metode experimentale in fizica chimia colagenului” Editura Politehnica, Iași

Matmaroh, K., Benjakul, S., Prodpan, T., Encarnacion, A.B., and Kishimura, H. 2011.

haracteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish (Parupeneusheptacanthus). Food Chemistry 129: 1179-1186.

Mocan, E., Tagadiuc, O., and Nacu, V. 2011. Aspects of collagen procedure. Clinical Research Studies.

Muyonga, J. H., Cole, C. G. B., and Duodu, K. G. 2004.Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopic study of acid soluble collagen and gelatin from skins and bones of young and adult Nile perch (Latesniloticus). Food Chemistry 86: 325-332.

Nalinanon, S., Benjakul, S., Visessanguan, W. and KIshimura, H. 2007. Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper (Priacanthustayenus). Food Chemistry 104: 593-608. Neklyudov, A. D. 2003. Nutritive fibers of animal origin: Collagen and its fractions as essential components of new and useful food products. Applied Biochemistry and Microbiology 39 (3): 229-238.

Nam, K. A, You, S. G., and Kim, S. M. 2008. Molecular and physical characteristics of squid (Todarodes pacificus) skin collagens and biological properties of their enzymatic hydrolysates. Journal of Food Science 73 (4): 249–255.

Neklyudov, A. D. 2003. Nutritive fibers of animal origin: Collagen and its fractions as essential components of new and useful food products. Applied Biochemistry and Microbiology 39 (3): 229-238.

Parenteau-Bareil, R., Gauvin, R. and Berthod, F. 2010. Review. Collagen-based biomaterials for tissue engineering applications. Materials 3: 1863-1887.

Pataridis, S., Eckhardt, A., Mikulikoca, K., Sedilakova, P., and Miksik, I. 2008. Identification of collagen types in tissues using HPLC-MS/MS. Journal of Separation Sciences 31: 3483-3488.

Pati, F., Adhikari, B. and Dhara, S. 2010. Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability. Bioresource Technology 101 (10):3737–3742.

Santana, R. C., Perrechil, F. A., Sato, A. C. K. and Cunha, R. L. 2011. Emulsifying properties of collagen fibers: Effect of pH, protein concentration and homogenization pressure. Food Hydrocolloids 25:604-612.

Tree, A. 2012. What is a collagen drink? Downloaded from http://www.wisegeek.com/what-is-a-collagen- drink.htm on 7/8/2012

Trandafir V., Cioroianu T.M., Bratulescu V., Sarbu C., – Utilizarea hidrolizatelor de colagen ca substanta activa in biofertilizatori- Cuoio Pelli Matterie Concianti 79(6), 2003, pg.289-293

Trandafir V., et al. (2007) „Bioproduse pe baza de colagen” Editura ARS DOCENTI 2007

Voicu Petre – Cercetari privind utilizarea polimerilor in agricultura Editura BREN 2009.

Zainescu G., Deselnicu D. C., Ioannidis I., Crudu M., Voicu P., „New versatile conversion technology for wet white waste transformation intp biofertilisers” The 4th International Conference on Advanced Materials and Systems,27th –29th of September, 2012, Bucharest, Romania

Zainescu G.,Ioannidis I., Deselnicu D.C., Crudu M A00617/23.08.2012 „Procedeu de obtinere de biopolimeri proteici din deseuri de piele wet-white”

Zainescu G., Voicu P., Gherghina C.A., Sandru L., – Cercetari exploratorii privind utilizarea biopolimerilor organici din tabacarii in agricultura- partea I, Revista de Pielarie-Incaltaminte, vol 9, 2009 pg.256

Zainescu G., Costache M., Nicolae F., Voicu P., Constantinescu R., Sandru L., Vizitiu O., Barma E. – Sistem de biopolimeri din deseuri de piele pentru agricultura – Bulletin Stiintific Informativ, 20, 2010, pg.19

Wang, L., Yang, B., Wang, R. and Du, X. 2008.Extraction of pepsin-soluble collagen from grass carp (Ctenopharyngodonidella) skin using an artificial neural network. Food Chemistry 111: 683-686.

Wang, S., Hou, H., Hou, J., Tao, Y., Lu, Y., Yang, X. and Li, B. 2013. Characterization of acid-soluble collagen from bone of pacific cod (Gadus macrocephalus). Journal of Aquatic Food Product Technology 22 (4):407–420.