Alelopatia

Medicina

Alelopatia

Byadmin ianuarie 1, 2024

CUPRINS

INTRODUCERE

PARTEA I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

1.Alelopatia

2.Descrierea plantelor studiate

2.1.Mazărea

2.2.Porumbul

2.3.Tomatele

3. Sisteme de apӑrare ale plantelor în condiții de stres

PARTEA II – CONTRIBUȚII PROPRII

4. Scopul lucrӑrii

5. Materiale și metode de analizӑ

5.2. Materiale analizate

5.3. Metode de analizӑ

5.3.1.Determinarea germinației materialului semincer

5.3.2.Biometrizarea creșterii în lungime a plantulelor

5.3.3. Determinarea conținutului în pigmenți asimilatori

5.3.4.Dozarea activității peroxidazelor

5.3.5.Determinarea conținutului de prolină

6. Rezultate și discuții

6.1.Rezultate germinație materialului semincer

6.2. Rezultate privind biometrizarea creșterii în lungime a plantulelor

6.3. Rezultate privind determinarea conținutul în pigmenți asimilatori

6.4. Rezultate privind determinarea activitӑții peroxidazice din rӑdӑcinițe

6.5. Rezultate privind determinarea conținutului de prolinӑ din frunze.

7. Concluzii

Bibliografie

INTRODUCERE

În organismele vii se desfășoară în permanență o serie de transformări biochimice în prezența enzimelor, având ca rezultat sinteza și descompunerea substanțelor care intră în compoziția acestora. Totalitatea acestor procese formează metabolismul primar iar compușii formați (glucide, lipide, proteine) se numesc, metaboliți primari. Pe lângă acești metaboliți primari, cu rol important în menținerea viabilității organismelor, se formează și o serie de compuși care includ: glicozide, lignine, taninuri, uleiuri eterice, rășini, steroizi, antociani, antrachinone, fenoli și polifenoli, pigmenți, antibiotice, și care sunt cunoscuți sub denumirea de metaboliți secundari. Produșii secundari de metabolism pot avea rol important în industria alimentară, farmaceutică, agricultură, cosmetică, etc.

Termenul de “produși secundari” a fost introdus de Kossel în 1891, care se referea la faptul că în timp ce metaboliții primari sunt prezenți în fiecare celulă vie, capabilă de diviziune, metaboliții secundari sunt prezenți numai întâmplӑtor, și nu sunt de importanță vitală pentru viața plantelor.

Plantele conțin o varietate mare de metaboliți secundari, numărul acestora se ridică la mai mult de 100.000, cuprinzând reprezentanți ai principalelor clase de compuși organici: hidrocarburi alifatice, aromatice, și heterociclice; schelete unice de atomi de carbon împreună cu o multitudinea de grupuri funcționale.

Metaboliții secundari, prezintă specificitate de organ sau de țesut, pot fi identificați într-un anumit stadiu al creșterii și dezvoltării în cadrul unei specii, sau pot fi activați pe parcursul perioadelor de stres,

Plantele sunt supuse mai multor tipuri de stres biotic și abiotic. Fiind organisme imobile, autotrofe sunt foarte dependente de condițiile de mediu. Ele trebuie adeseori să se adapteze foarte repede la schimbările externe ale factorilor de mediu. Această reactivitate nu poate fi obținută numai prin răspunsuri pe termen lung, ce implică sinteza de proteine, ci necesită și reglarea imediată și rapidă. Faptul că ele pot face această reglare se datorează, cel puțin în parte, faptului că au un sistem enzimatic eficient de detoxificare. O gamă largă de funcții de protecție este realizată de metaboliți secundari.

PARTEA I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

1.Alelopatia

Alelopatia este un domeniu al biochimiei ecologice care studiază interrelațiile dintre plante, prin intermediul mesajelor (semnalelor) chimice (Neamtu, 1983). Efectele alelopatice se produc între specii diferite de plante, dar și între indivizii din cadrul aceleasi specii.

Compușii chimici care iau parte la interacțiunile biochimice dintre plante poartă denumirea generală de substanțe alelopatice. Ei sunt produșii secundari de metabolism ai plantelor, cu masă moleculară mică, prezenți în diferite organe ale multor specii vegetale cum sunt frunzele, florile, fructele si semințele, dar și în tulpini și în rădăcini, mai ales a celor perene (Miró si colab., 1998; Delachiave, 1999).

Aleopatia, o formӑ de competiție chimicӑ, care se referă la beneficiile sau efectele dăunătoare transmise de la o plantă la alta, indiferent dacӑ ele sunt legume, fructe sau cereale, de la resturile biochimice numite alelochimicale, provenite din diferite părți ale plantelor prin scurgere, volatilizare, descompunerea rezidurilor sau orice alt procedeu natural sau artificial obținut în urma activității agricole. Alelochimicale sunt compuși secundari ai plantelor, cu masă moleculară mică, prezenți în diferite organe ale multor specii vegetale cum sunt frunzele, florile, fructele și semințele, dar și în tulpini și în rădăcini, mai ales a celor perene.

Termenul „allelopatie” derivă de la cuvintele grecești „allelon” = reciproc si „pathos”= suferință. Fenomenul alelopatiei a existat și acum sute de ani, dar cercetare stiințificӑ în acest domeniu, se face doar de câteva decenii.

De Condolle (citat de Harborne, 1977) a emis în anul 1832, ideea cӑ unele substanțe chimice eliberate în mediu de către anumite organisme, au acțiune asupra altor organisme aflate în vecinӑtate. El a ajuns la concluzia că, toate plantele secretă prin rădăcini anumite substanțe care pot să stimuleze sau să inhibe creșterea altor plante. Termenul alelopatie a fost folosit pentru prima dată în 1937 de către cercetătorul austriac Hans Molisch în cartea Der Einfluss einer Pflanze auf die andere – Allelopathie. El s-a înrădăcinat în literatura de specialitate, devenind una din ramurile moderne ale biologiei ecofiziologice.

Un real progres în alelopatie s-a produs în anul 1974 cu publicarea cărții „Allelopathy” de către Rice (1974), care a definit alelopatia drept „efectul dăunător exercitat de o plantă asupra altei plante, prin producerea unor compusi chimici care sunt eliberați si difuzați în mediul înconjurător”.

Progresele făcute în chimie, în anatomia si fiziologia plantelor, în biotehnologie și în tehnologie digitală, ca și o mai bună înțelegere a proceselor ecologice, a contribuit la dezvoltarea cercetării alelopatice, în ultima perioadă (Corbu, 2007).

Alelochimicalele pot fi prezente în orice parte a plantei. Ei pot fi gӑsți în frunze, flori, rӑdӑcini, fructe, dar pot fi gӑsiți și în sol. Speciile țintӑ pot fi afectate în multe mai multe feluri. Chimicalele toxice pot inhiba creșterea rӑdӑcinilor și tulpinilor, absorbția de nutrienți, sau pot ataca o relație simbioticӑ natural, distrugând astfel sursa utilizabilӑ a unui nutrient. http://csip.cornell.edu/Projects/CEIRP/AR/Allelopathy.htm

Studiată pentru prima datӑ în sistemul forestier, aleopatia poate afecta multe aspecte din viața plantelor incluzând apariția, creșterea, succesiunea, structura plantei, diversitatea, productivitatea. Inițial multe dintre speciile forestiere evaluate aveau efecte aleopatice negative asupra fructelor și cerealelor comestibile, dar în 1980 au început să fie identificate specii care au efecte aleopatice benefice, neutre sau selective în compania culturilor comestibile.

Cele mai întâlnite efecte ale aleopatiei sunt: reducerea germinației semințelor, creșterea și dezvoltare redusӑ a răsadurilor. Nu se poate vorbi de un mod comun de acțiune sau ținte fiziologice de atins pentru toate substanțele aleochimicale. Totuși unele substanțe alelochimicale pot avea același tip de acțiune ca de exemplu: diviziunea celulară, germinarea polenului, fotosinteza, absorbția de nutrienți și enzime specifice funcției.

Inhibarea alelopatică este complexă și poate implica interacțiunea dintre diferite clase de substanțe chimice, compuși fenolici, flavonoide, terpenoli, alcaloizi, steroizi, carbohidrați, și aminoacizi, cu amestecuri de compuși diferiți, uneori, având un efect alelopatic mai mare decât compușii singuri. Mai mult decât atât, dăunătorii și bolile, radiația solară, ierbicidele, sau o ierbicidare improprie, umezeala dar și nivelele de temperaturӑ pot afecta de asemenea suprimarea aleopatica a plantelor.

Diferite părți din plante, cum a fi: florile, frunzele, tulpinile, coaja, rădăcinile pot avea efecte aleopatice diferite pe parcursul sezonului de creștere. Alelochimicalele pot, de asemenea, persista în sol, care afectează atât plantele vecine, precum și cele plantate în succesiune. Deși derivate din plante, alelochimicalele pot fi mai biodegradabile decât ierbicidele tradiționale, pot însă avea și efecte nedorite asupra speciilor țintă, fapt pentru care este recomandat un studiu ecologic înaintea utilizării pe o scară largă.

Cea mai bunӑ cale de a studia alelopatia este de a gӑsi semnele apariției în natura. Este practic imposibil sӑ fie observatӑ toxina la lucru, dar este posibil sӑ se observe semnele și simptomele cauzate de chimicale asupra plantelor din vecinӑtate

Interacțiunile biochimice dintre plante pot avea numeroase aplicații practice în agricultură. Anumiți compusi alelochimici pot fi folosiți ca ierbicide, insecticide naturale. Astfel, piretrinele extrase din specii de Chrysanthemum, precum si cineolul, derivat din cinmetilin, extras din plantele de deșert, sunt utilizate pentru elaborarea de noi pesticide (Corbu, 2007). Prin modificarea acestor substanțe alelochimice, produsul final poate fi mult mai activ, mai selectiv, sau mai persistent decât în plantele care le conțin. Aceste clase privesc alcaloizi, derivați ai acidului cinamic, compusi cianogenici, flavonoizi si etilenă.

Alelocompușii pot fi utilizați pentru obținerea ierbicidelor sintetice. Există mii de fitotoxine naturale, dar puține sunt comercializate ca ierbicide pentru că pe de o parte sinteza lor la nivel industrial este costisitoare (Duke și colab 2002), iar pe de altӑ parte multe fitotoxine naturale au structuri chimice complexe care sunt dificil sau imposibil de sintetizat.

Numeroși cercetӑtori au încercat sӑ foloseacӑ alelopatia direct ca o strategie în managementul buruienilor.

Efectele negative ale alelochimicalelor asupra plantelor beneficiare sunt considerate ca stres biotic numit stres alelochemic (Ortega și colab., 2002). Efectele unor soluții vegetale, a extractelor din diferite plante dar și a reziduurilor în descompunere, au fost în atenția numeroaselor cercetӑri, tocmai datoritӑ rolului important al alelopatiei în agriculturӑ (Mangal și colab., 2013).

HREANUL

Denumirea sa științifică este Armoracia rusticana, face parte din familia Brassicaceae, este o plantă legumicolă perenă. Hreanul este o rudă foarte apropiată a conopidei, a muștarului dar și a verzei. Este o plantă folosită la gӑtit, datoritӑ gustului său condimentat și aromat, dar și în medicina naturistă pentru beneficiile curative. Descoperirile arheologice făcute în Europa, ne arată că hreanul este folosit ca remediu natural încă din preistorie. În medicina populară românească, hreanul este recomandat în numeroase afecțiuni, specifice sezonului rece, cele mai multe dintre ele fiind de natură infecțioasă.

Hreanul este o plantă foarte bogată în nutrienți, la fel ca legumele cultivate și are o rezistență mare, asemӑnӑtoare cu a buruienilor. Rezistӑ la temperaturi scăzute dar și la secetӑ. Se cultivă în soluri argiloase și ferme.

Rădăcinile sunt cele care se folosesc atât în bucătărie cât și în medicină. Rădăcina hreanului conțin foarte multă vitamina C, utilă sistemului circulator și imunitar. Conține minerale foarte importante, precum fierul, potasiul, calciul și magnenziul. Mirosul înțepător și gustul de foc al rădăcinii se datorează mai multor compuși chimici, între care și așa-numiții glucozinolați, care ajutӑ la îndepӑrtarea bacteriilor dăunătoare, de multe ori fiind mai eficienți decât cele mai avansate antibiotice de sinteză. Cercetări de dată foarte recentă au arătat că glucozinolații au efecte citostatice foarte puternice, fiind eficienți în foarte multe forme de cancer (de piele, de plămâni, de colon, de stomac etc.).

2.Descrierea plantelor studiate

2.1.Mazărea

(http://miniaturalgarden.blogspot.ro/2012/04/mazarea-pisum-sativum.html; 14.10. 2013)

Mazărea (Pisum Sativum) se cultivă pentru boabele verzi și păstăile tinere. Este o plantă de zi,ecetӑ. Se cultivă în soluri argiloase și ferme.

Rădăcinile sunt cele care se folosesc atât în bucătărie cât și în medicină. Rădăcina hreanului conțin foarte multă vitamina C, utilă sistemului circulator și imunitar. Conține minerale foarte importante, precum fierul, potasiul, calciul și magnenziul. Mirosul înțepător și gustul de foc al rădăcinii se datorează mai multor compuși chimici, între care și așa-numiții glucozinolați, care ajutӑ la îndepӑrtarea bacteriilor dăunătoare, de multe ori fiind mai eficienți decât cele mai avansate antibiotice de sinteză. Cercetări de dată foarte recentă au arătat că glucozinolații au efecte citostatice foarte puternice, fiind eficienți în foarte multe forme de cancer (de piele, de plămâni, de colon, de stomac etc.).

2.Descrierea plantelor studiate

2.1.Mazărea

(http://miniaturalgarden.blogspot.ro/2012/04/mazarea-pisum-sativum.html; 14.10. 2013)

Mazărea (Pisum Sativum) se cultivă pentru boabele verzi și păstăile tinere. Este o plantă de zi, originară din Asia Mică și India, iar în țara noastră este cunoscută începând din secolul XVII.

Particularități botanice

Rădăcina pivotantă, bine dezvoltată. Tulpina cilindrică de culoare verde-albăstruie, erectă, agățătoare sau târâtoare. Frunzele paripenat compuse, se termină cu un cârcel. Florile sunt dispuse în raceme axiale. Fructul este o păstaie cu lungimea de 5-12 cm, cuprinde 6-12 semințe în funcție de soi.

Sămânța este sferică, ovoidală, unghiulară, turtită sau cubică, cu suprafața netedă sau zbârcită. Culoarea, la maturitatea tehnică, este verde de diferite nuanțe, care, după fierbere, devine galben-verzuie.

Factori de mediu

Germinază la temperatură scăzută 1-2. Temperatura optimă este de 15-17. Plantele tinere suportă temperaturi scăzute de până la minus 5–10, în funcție de soi.

Mazărea are cerințe moderate față de apă, dar cu pretenții mai ridicate în timpul înfloritului și legării păstăilor.

Umiditatea din sol este optimă pentru valoarea de 70-80% din capacitatea de câmp.

Mazărea este o plantă de zi lungă. În condiții de lumină de scurtă durată este stimulată creșterea vegetativă.

Intensitatea luminii este deosebit de importantă pentru cultura de mazăre. O intensitate redusă a luminii afectează primele etaje de noduri și ramificarea.

Mazărea are cerințe moderate față de sol, prefer solurile cu textură mijlocie, bine afânate, calde.

Tehnologia de cultură

Mazărea este o plantă care nu se suportă, revine pe același teren după 3-4 ani. Pentru mazăre sunt foarte bune premergătoare cerealele păioase.

Lucrările solului

Arătura adânca de toamnă care se face între 15 august și 30 septembrie, la adâncime de 25-30 cm. Pregătirea patului germinativ: prima discuire se face la 6-8 cm adâncime, a doua discuire se face la 4-6 cm adâncime.

Densitatea plantei și momentul semănatului

Se seamană primăvara timpuriu folosindu-se 250-300 kg/ha cu distanța între boabe pe rând de 8 cm, între rânduri 12,5 cm.

Lucrările de îngrijire

Încep de la răsărit și în special se face combaterea buruienilor prin grăpare cu grapa cu colți reglabili, prin prășit cu sapa rotativă, prin plivire și prin erbicidare.

Dintre boli, cele mai cunoscute sunt arsura bacteriană (Pseudomonas pisi), mana mazării (Peronospora pisi) și antracnoza (Ascochyta pisi).

Cei mai cunoscuți dăunători sunt afidele, în mod special păduchele verde al mazărei (Acyrthosiphon pisum), tripsul mazărei (Kakothrips robustus) și gărgărița mazării (Bruchus pisorum).

Recoltarea se face mecanizat sau manual, eșalonat sau simultan.

Producția medie la hectare este în funcție de clima anului, variază între 6-10 t/ha.

2.2.Porumbul

Porumbul (Zea Mays) este o cereală originară din America Centrală, a fost adus în Europa de către Cristofor Columb la sfârșitul secolului XV. În România porumbul se cultivă de la sfârșitul secolului al XVII-lea.

Porumbul ocupă locul al III-lea ca importanță, această importanță este motivată printr-o serie de particularități ale acestuia: prezintă o mare capacitate de producție, este o bună plantă premergătoare pentru majoritatea culturilor, suportă monocultura mai mulți ani, este o cultură mecanizată 100%, are o însămânțare mai târzie și permite eșalonarea mai târzie.

Particularități botanice

Sistemul radicular fasciculat și se răspândește în stratul arăt până la 20 cm adâncime, având rol important în dezoltarea și creșterea plantelor. Primele rădăcini sunt cele embrionare.

Tulpina principală este cilindrică și plină. Partea aeriană a tulpinii este împărțită de noduli care sunt plini.

Frunza se formeza la fiecare nod al tulpinii, formată din două părți: teaca și limbul

Porumbul este o plantă unisexuat-monoică, având florile mascule așezate în vârful tulpinii, într-o inflorescență de tip panicul.

Florile femele sunt grupate în inflorescențe de tip spic, cu axul îngroșat (spadix). Pe rahisul știuletelui sunt așezate spiculețe, în rânduri perechi, cu câte două flori: una superioară fertilă și una inferioară sterilă.

Fructul este numit bob, este o cariopsă, de mărimi diferite

Factori de mediu

Temperatura optimă de germinare a semințelor este de 8-100C, iar temperatura de creștere și dezvoltare a plantelor este de 15-180C. Dacă temperatura coboară sub –40C, plantele mor iar la temperaturi mai mici de 100C creșterea încetează

Porumbul este o plantă de zi scurtă, adaptată la o lumină intensă.

În primele faze de creștere, după răsărire, porumbul are o rezistență deosebită la secetă, datorită sistemului radicular profund, consumului specific redus de apă. Lipsa sau insuficiența apei în perioada formării paniculului și a boabelor are efecte negative asupra producției.

Deși nu are cerințe deosebite față de sol, producțiile cele mai mari se realizează pe solurile cu fertilitate ridicată (cernoziomuri, soluri aluvionare, brun-roșcate), cu pH neutru (6,5-7) și capacitate mare de reținere a apei. Nu se recomandă solurile reci, cu exces de umiditate, compacte, tasate.

Tehnologia de cultură

Rotația – Porumbul fiind putin pretentios fata de plantele premergatoare, poate fi cultivat mai multi ani la rand pe acelasi teren.

Cele mai bune premergătoare sunt cerealele păioase, plante furajere, leguminoasele anuale pentru boabe, cartoful,sfecla de zahăr.

Nu este recomandat să fie cultivat după sorg, iarba de Sudan, mei, specii care consumă cantități mari de elemente fertilizante din sol.

După porumb urmează cerealele de primăvară, culturile furajere anuale, sau grâul cultivat după hibrizi timpurii.

Lucrările solului

Încep imediat după eliberarea terenului de plantă premergătoare și vizează: mobilizarea solului, incorporarea resturilor vegetale, mărunțirea, nivelarea.

Cea mai importantă lucrare a solului este arătura de bază, se execută la 20-25 cm adâncime pe terenurile după premergătoare timpurii și la 25-30 pe terenurile cu soluri mijlocii și grele.

Arătura se menține afânata și se curăța de buruieni. După plantele recoltate târziu se execută arătura de toamnă la 30 cm adâncime.

Primăvara terenul se mărunțește și se nivelează prin discuiri și pe urmă se face pregătirea patului germinativ.

Fertilizarea

Fertilizarea la porumb este foarte importantă fiind o mare consumatoare de azot, fosfor și potasiu. Fertilizarea organică are o mare importanță și se aplică pe toate tipurile de sol 20-40t/ha.

Sămânța și semănatul

Materialul semințier trebuie să aibă puritate de 98% și germinația 90%.

Împotriva dăunătorilor sămânța este tratată înainte de semănat cu diferite produse chimice.

Perioada de semănat este atunci când temperature solului este de 8̊ C, vremea în curs de încălzire.

Cantitatea de sămânță la hectar: 15-35 kg

Distant între rânduri 70 cm, adâncimea de semănat 5-6 cm. Semănatul se realizează cu semănători de precizie.

Dozele de ierbicide se calculează în funcție de conținutul de humus al solului, de plantele premergătoare; tratamentele se fac concomitant cu semănatul.

Recoltarea

Porumbul se recoltează mecanizat sub formă de știuleți sau boabe, când umiditatea boabelor este sub 20% apă.

Producții potențiale

În condițiile de tehnologie corespunzătoare, producția este de 20-30 t / ha la neirigat și 40-50 t / ha la irigat.

2.3.Tomatele

Tomatele fac parte din familia Solanaceae, genul Solanum, specia Solanum licopersicum.

Roșia este originarӑ din Peru si a fost considerată legumă în jurul anului 1870 în Franța. În România roșia s-a impus târziu, abia in 1907.

Tomatele conțin un pigment roșu denumit licopen. Licopenul este cel mai important reprezentant al familiei carotenoizilor, cea mai mare cantitate de licopen găsindu-se în tomate.

Tomatele galbene conțin în locul licopenului beta-caroten, un alt carotenoid valoros, a cărui forța antioxidanta este însa de 5 ori inferioară colorantului roșu

Particularități botanice

Tomatele sunt plante anuale. Rădăcina este pivotantă în cazul în care se cultivӑ prin semӑnat direct. Dacă se cultivă prin răsad, rădacina se ramifică puternic în stratul superficial al solului. Tulpina este erectă, de înălțimi diferite în funcție de varietate și de soi. Frunzele sunt împaripenat sectate, de diferite mărimi. Florile sunt mici, galbene, grupate în inflorescențe

Fructul este o bacă formată din epicarp, mezocarp, endocarp. Culoarea fructului imatur este verde, la maturitate roșie, oranj, zmeurie.

Fructele de tomate prezintă o importanță economică și alimentară prin conținutul ridicat în elemente energetice, vitamine și săruri minerale.

Fructele (roșiile) conțin vitamine (A, B1, B2, C, PP), glucide, protide, acizi organici, săruri minerale (Ca, Fe, P, K) și se consumă în stare proaspată sau pot fi consumate sub diverse forme.

Factori de mediu

Tomatele dunt considerate plante termofile. Temperatura minimă de germinare este de 10ºC în funcție de soi, temperaturile sub această valoare sunt dăunătoare plantelor. Temperatura optimă pentru dezvoltarea fructelor este de 18-24ºC.

Cerințele față de lumină sunt ridicate, în special în faza de răsărit și de fructificare. Insuficiența luminii duce la alungirea răsadului și la căderea florilor. Tomatele au cerințe moderate față de apă.

Pentru cultura de tomate, sunt recomandate solurile mijlocii.

Soiurile de tomate se clasifică în funcție de perioada de vegetație, tipul de cultură și destinația culturii. În funcție de modul de creștere, soiurile de tomate pot fi grupate în 2 mari categorii: soiuri cu creștere determinată și soiuri cu creștere nedeterminată. Soiurile cu creștere determinată cresc până la o anumită înălțime după care se opresc; vor înflori și vor face fructele într-o perioadă relativ scurtă de timp. Soiurile cu creștere nedeterminată cresc, înfloresc și fructifică pe toată perioada de dezvoltare, până când sunt distruse de ger.

3. Sisteme de apӑrare ale plantelor în condiții de stres

Creșterea și dezvoltarea plantelor este puternic afectată de factorii de mediu, cum ar fi: metalele grele, salinitatea, căldura, frigul, deficitul de apă, ozonul, radiațiile UV, substanțe alelochimice, etc. Semnalele comune ale răspunsului la factorii de stres abiotici includ: ofilirea, inhibarea unor procese metabolice, lipidperoxidarea, producerea de schimbări în permeabilitatea membranelor, în transportul ionilor și în diviziunea celulară. La plante toate aceste efecte dăunătoare se concretizează în alterări în fiziologia plantei, ceea ce cauzează o reducere a creșterii și o scădere a bioproductivității acestora (Hayat și colab, 2010).

Factorii nefavorabili, de mediu pot produce SRO, radicali activi toxici ai oxigenului, cum ar fi: ionul superoxid (O2-), radicalul hidroxil (HO) și peroxidul de hidrogen (H2O2), în cantități suficient de mari pentru a produce dereglări în funcțiile celulare și metabolice, în conținutul în pigmenți asimilatori, din cauza degradărilor oxidative. Pentru supraviețuirea plantelor, este foarte important să se mențină un echilibru, între producerea de SRO și neutralizarea lor (Scebba și colab., 1999).

Frunza reprezintă organul specializat al plantelor cormofite în care se realizează procesul de fotosinteză. Epiderma frunzelor este prevăzută cu stomate, aparat prin care se face schimbul de gaze între frunze și mediul ambient.

Frunza este străbătută de nervuri, respectiv de fascicole libero-lemnoase, care transportă și distribuie apa și sărurile minerale în limbul foliar și seva elaborată înspre toate organele plantelor. Frunza conține cloroplaste – organite specializate – în care se desfășoară procesul de fotosinteză.

Adaptările pe care le prezintă cloroplastele pentru desfășurarea procesului de fotosinteză sunt legate de suprafețele mari ale membranelor tilacoide și de prezența pigmenților clorofilieni. Membranele tilacoide au structura asemănătoare cu cea a membranelor plasmatice, adică sunt alcătuite dintr-un strat dublu de galactolipide în care sunt încorporați pigmenți asimilatori, respectiv clorofilele, carotenoizii și xantofilele (Burzo și colab., 1996).

Clorofila reprezintă pigmenul verde al cloroplastelor, iar denumirea pe care o are provine de la cuvintele „chloros”, care înseamnă verde și „phillon”, care semnifică frunza. Clorofila este alcătuită din 4 nuclee pirolice, care formează nucleul porfirinic, iar în centrul moleculei se află un atom de magneziu, legat prin 2 valențe principale și 2 valențe secundare de inelele pirolice. De nucleul porfirinic se leagă fitolul, alcoolul unei hidrocarburi nesaturate, superioare, cu 20 de atomi de carbon.

Cele mai răspândite clorofile sunt clorofila a și clorofila b. Clorofila a are o grupare metilică, în timp ce clorofila b are o grupare aldehidică. Raportul dintre clorofila a și b este de 3 /1, și acesta poate să crească, în cazul plantelor heliofile (Burzo și colab., 1996).

Clorofilele a și b, în stare pură, sunt substanțe solide, cristaline, insolubile în apă, dar solubile în solvenți organici (acetonă, alcool, eter, etc). În soluție alcoolică, clorofila a are o culoare albastră-verzuie și o fluorescență roșiatică, iar clorofila b, are o culoare galbenă-verzuie și o fluorescență roșie brună.

Carotenoizii, sunt pigmenți reprezentați, în principal, de carotină și de xantofilă. Ei sunt pigmenți neazotați, care datorită dublelor legături conjugate pe care le conțin toamna dau frunzelor culoarea galbenă, portocalie, roșie sau chiar albǎstruie. În frunze, culoarea lor este mascată de culoarea clorofilelor, care se află în cantitate mai mare.

Sub aspectul proprietăților fizice, carotenoidele sunt substanțe insolubile în apă și solubile în solvenți organici, fapt pentru care unii autori le atribuie și denumirea de lipocromi. Carotenoidele prezintă spectre de absorbție caracteristice, diferite de cele ale pigmenților clorofilieni, proprietate care servește la identificarea lor spectrofotometricǎ.

Din punct de vedere chimic, carotenoidele sunt substanțe active datorită legăturilor duble, conjugate, din molecula lor. Ele dau reacții de adiție și de substituție. Pigmenții carotenoidici se oxidează foarte ușor, iar în contact cu aerul se autooxidează repede și se degradează, din această cauză cantitatea de carotenoizi se micșorează prin păstrare.

Biosinteza pigmenților se realizează în cicluri biochimice diferite, funcție de compoziția lor chimică.

Pigmenții clorofilieni se biosintetizează în cloroplaste, în ciclul acidului γ- aminolevulinic. Prin condensarea aminoacidului glicină, cu succinil CoA (produs intermediar al ciclului Krebs), se formează acidul γ-aminolevulinic. Două molecule de acid γ-aminolevulinic formează nucleul pirolic, iar 4 nuclee pirolice dau naștere nucleului porfirinic. Prin legarea magneziului de nucleul porfirinic se formează Mg-porfirina, care se esterifică cu fitolul formând clorofila a.

Pigmenții carotenoidici se biosintetizează în cloroplaste și în cromoplaste, prin ciclu, din acetil CoA, rezultată din biodegradarea glucidelor și lipidelor.

Factorii care influențează biosinteza pigmenților sunt: lumina, temperatura, oxigenul, substanțele minerale, etc.

Dintre sistemele de apӑrare ale plantelor amintim enzimele antioxidante și aminoacidul prolina.

a.Enzimele antioxidante – peroxidazele

Dintre numeroasele enzime care acționează în celula vegetală, peroxidazele și catalaza joacă un rol important în viața plantelor, ele făcând parte dintre enzimele cele mai studiate.

Plantele, în mediul lor natural sunt supuse la multiple stresuri. Fiind organisme imobile, autotrofe – dependente de condițiile de mediu, ele trebuie să se adapteze foarte repede la schimbările externe ale factorilor ambientali. Această reactivitate necesită reglare imediată și rapidă. Faptul că ele pot face această reglare, se datorează – cel puțin în parte – unui sistem enzimatic eficient de detoxificare. La plante, schimbările în activitatea enzimelor sunt utile în special pentru a ne ajuta în detectarea rapidă a modificărilor primare care au loc în acestea. Specificitatea largă și multiplicitatea izoformelor peroxidazei, explică utilizarea acestora ca markeri biochimici ai poluării, activitatea modificându-se înainte să apară în plante leziuni primare. Printre factorii poluanți, cei mai frecvent întâlniți sunt cei aerieni, temperaturile extreme, cele scăzute sau cele foarte ridicate, metalele grele, sărurile, germenii patogeni, radiațiile UV, dar și alelochimicalele. Mulți dintre acești factori poluanți produc stresul oxidativ.

Dintre numeroasele enzime care acționează în celula vegetală, peroxidazele joacă un rol important în viața plantelor, ele făcând parte dintre enzimele cele mai studiate.

Peroxidazele sunt enzime metaloproteice, care conțin în molecula lor fier legat porfirinic. Ele sunt enzime din clasa oxidoreductazelor (E.C.1.11.1.7). După Dumitru și Iordăchescu (1981), reacția are loc conform următoarei scheme:

AH2 + H2O2 → A + 2H2O

unde AH2 = donor de hidrogen

A = donor oxidat

Pentru celulele vii, acumularea apei oxigenate este dăunătoare, deoarece apa oxigenată este un oxidant puternic. Această acumulare este împiedicată de enzime specifice, cum ar fi peroxidazele și catalazele. Peroxidazele, descompun apa oxigenată utilizând-o în scopuri precise, de oxidare, necesare unor procese metabolice, iar catalaza o descompune până la apă și oxigen molecular (Vasilescu, 1981). Schimbarea spectaculoasă a culorii diferitelor hârtii de filtru, după oxidare, reprezintă baza utilizării peroxidazelor ca markeri, în multe aplicații biochimice.

Peroxidaza este o glicoproteidă alcătuită din protohemina IX, care conține fier trivalent și o componentă de natură glicoproteică (Dumitru, 1980).

Localizarea peroxidazelor vegetale variază cu anotimpul, cu specia, cu gradul de diferențiere și de distribuție endocelulară, care este diferită în funcție de tipologia țesutului analizat (Poux, 1969 citat de Gaspar și colab., 1982). Astfel, peroxidazele vegetale apar foarte pregnant în rădăcină, în epidermă, în țesutul cortical (la Pisum), în floem, xilem, epidermă, hipodermă, în celulele parenchimatice și în hipocotil la Phaseolus.

Adeseori, rădăcina este cel mai bogat organ în peroxidază, iar în fructe și în sucuri de plante, mai ales când pH-ul lor este acid, activitatea peroxidazică este scăzută. Chiar și la aceeași plantă, peroxidazele prezente în diverse țesuturi pot avea diferite proprietăți. Printre cele mai importante plante care conțin peroxidaze se pot cita: hreanul, soia (Ambreen și colab., 2000), tomatele (Zia și colab,. 2001), smochinul, merele, caisul, bumbacul, asparagusul, țelina, castraveții, lupinul, muștarul, ricinul, spanacul, sfecla, floarea-soarelui, tutunul, grâul, căpșuni (Reed, 1975), etc. In cazul plantelor comestibile, care suferă prelucrări ulterioare, peroxidaza poate persista în produsul alimentar final.

Numărul substraturilor pentru peroxidaze este foarte mare și se presupune că fiecare reacție peroxidazică are un rol specific în menținerea sau adaptarea structurii și funcțiilor celulelor plantelor, la cerințele mediului lor.

Rolul peroxidazelor și izoperoxidazelor în creșterea plantelor, în procesele de diferențiere și de dezvoltare a fost subiectul a numeroase lucrări. La plante peroxidazele, sunt adeseori, utilizate ca markeri ai proceselor de creștere și de dezvoltare; ele au un rol important în respirație, existând o corelație puternică între activitatea peroxidazei și rata respirației în decursul germinării semințelor. Activitatea lor este implicată în procesul de înflorire, în formarea, creșterea și maturarea fructelor, în inițierea și dezvoltarea rădăcinilor, în senescență, în răspunsul celulelor la stres și la patogene etc. S-a constata o schimbare în activitatea peroxidazelor, respectiv în profilul izoenzimelor, în corelație cu multe procese fiziologice.

Peroxidazele participă la construcția, rigidizarea și lignificarea sau suberificarea peretelui celular prin :

realizarea legăturii reziduurilor acidului hidroxicinamic și a acidului hidroxibenzoic, din pectine și xilani,

biosinteza ligninei,

legarea extensinei de polizaharide,

lipirea ligninei la glicoproteinele peretelui celular,

suberizare,

cuplarea reziduurilor de tirozina în extensina și alte glicoproteine

Extensina, este o proteină bogată în hidroxiprolină, cu rol în formarea peretelui celular, primar. Legătura dintre extensină și peroxidază se realizează printr-un polimer de pectină. Pectina este ca o ancoră pentru peroxidază, care va lega încrucișat extensina, formând astfel o rețea solidă în peretele celular (Passardi și colab., 2004). Interacțiunea dintre peroxidază și extensină are două funcții, și anume:

apărǎ celula de atacul germenilor patogeni, fiind greu de străbătut (Jackson și colab., 2001),

constituie o adaptare a plantei la factorii mecanici de stres (Price și colab., 2003).

Plantele, în mediul lor natural sunt supuse la multiple stresuri. Fiind organisme imobile, autotrofe – dependente de condițiile de mediu, ele trebuie să se adapteze foarte repede la schimbările externe ale factorilor ambientali. Această reactivitate necesită reglare imediată și rapidă. Faptul că ele pot face această reglare, se datorează – cel puțin în parte – unui sistem enzimatic eficient de detoxificare. La plante, schimbările în activitatea enzimelor sunt utile în special pentru a ne ajuta în detectarea rapidă a modificărilor primare în plante. Specificitatea largă și multiplicitatea izoformelor peroxidazei, explică utilizarea acestora ca markeri biochimici ai poluării, activitatea modificându-se înainte să apară în plante leziuni primare. Printre factorii poluanți, cei mai frecvent întâlniți sunt cei aerieni, temperaturile extreme, cele scăzute sau cele foarte ridicate, metalele grele, sărurile, germenii patogeni, radiațiile UV, etc. Mulți dintre acești factori poluanți produc stresul oxidativ (Ferreira și colab., 2002).

Stresul oxidativ este unul dintre pericolele majore pentru plantele expuse factorilor poluați din mediu. Mecanismul de acțiune al radicalilor liberi este încă neclar. Ei pot provoca direct distrugeri în celule, țesuturi, organe și în organisme. Cloroplastele, în special sunt sensibile la SRO fiind afectată rata fotosintezei, ceea ce duce la o diminuare a creșterii plantelor (Kwon și colab., 2002). Reacțiile care generează SRO, sunt contrabalansate de creșterea internă a proceselor oxidative. Celulele plantelor posedă mecanisme protectoare pentru a înlătura acești agenți poluanți, înainte de atingerea pragului critic de distrugere al celulelor. Printre ele există multe enzime – peroxidaze, aminoxidaze, catalaze, superoxiddismutaze (SOD), sau antioxidanți – acid ascorbic, vitamina E, β- carotenul, glutation, compuși fenolici, agenții de chelare ai metalelor etc., care joacă un rol important în menținerea unui potențial redox adecvat în celule și pot proteja membranele celulelor de oxidanții activi din surse exogene (Castillo și colab.,1987).

Prolină

Când sunt expuse condțiilor de stres în plante se acumuleazӑ o serie de metaboliți și în special aminoacizi. Aminoacizii sunt unitӑți structurale de bazӑ ale proteinelor și joaca un rol important în metabolismul plantelor dar și în dezvoltarea acestora.

Prolina este un aminoacid care a fost obținut in 1900 de Willstatter și care în 1901 a fost izolat de Hermann Fischer din cazeina.

Este o componentӑ esențialӑ a colagenului și poate fi sintetizatӑ din acidul glutamic.

Sursa: http://en.wikipedia.org/wiki/Proline

Prolina se acumuleazӑ în plante ca rӑspuns la stresul indus de factorii de mediu. Are rol în homeostazia celularӑ, incluzând balanța redox și starea de energie. Acționeazӑ ca o moleculӑ semnal care moduleazӑ funcțiile mitocondriale, influențeazӑ proliferarea sau moartea celularӑ, declanșeazӑ expresia genelor specifice, care pot fi esențiale pentru recuperarea plantelor fațӑ de condițiile de stres (Szabados și Savoure, 2010)

Numeroase studii au arӑtat cӑ în plantele superioare supuse factorilor de stres, conținutul de prolinӑ crește. Acumulӑri de prolinӑ s-au observant în cazul stresului indus de secetӑ (Couldhary și colab., 2005), salinitate (Yoshiba și colab.,1995), radiații UV (Saradhi și colab.,1995), metale grele (Schat și colab.,1997), stres oxidativ (Yang și colab., 2009) dar și ca rӑspuns la factorii de stres biotici (Fabro, și colab. 2004).

Figure . Reglarea redox intracelularӑ mediatӑ de prolinӑ (Hayat și colab., 2012)

Prolina, în afarӑ de faptul cӑ acționeazӑ ca un excelent osmolit, joacӑ 3 roluri principale în timpul stresului, cum ar fi: chelarea metalelor, antioxidant și moleculӑ semnal. Din numerase date de literaturӑ rezultӑ cӑ într-un mediu stresant se produce o supraproducție de prolinӑ în plante, care la rândul sӑu va preveni o scurgere de electrolit și va pӑstra concentrația de SRO în limite normale, ceea ce va determina prevenirea arderilor oxidative.

În cazul suplimentӑrii exogene în concentrații mari, însӑ prolina poate avea efecte negative.

PARTEA II – CONTRIBUȚII PROPRII

4. Scopul lucrӑrii

Scopul prezentei disertații a constat în analizarea efectului alelopatic al extractului apos preparat hrean (Armoracia rusticana L.) asupra următoarelor plante: mazăre (Pisum sativum L.), porumb (Zea mays ) și tomate (Licopersicum esculentum…..)

Obiectivele urmărite au fost:

studiul efectului extractului de hrean asupra parametrilor de creștere și dezvoltare;

determinarea efectului dat de extractele de hrean asupra unor parametrii biochimici.

5. Materiale și metode de analizӑ

5.2. Materiale analizate

Materialele analizate au fost reprezentate de material semincer certificat, respectiv de porumb (Zea mays L, soiul DK 004), cu facultatea germinativă de 95%, semințe de mazӑre (Pisum sativum L., soiul Zsuzsi), și de tomate timpurii din comerț.

Obținerea extractului de hrean

Extractul apos al cӑrui efect alelopatic s-a studiat a fost obținut din rӑdӑcinӑ de hrean, dupӑ urmӑtoarea metodӑ:

Extractele apoase din rădăcini au fost preparate din speciile de hrean si de astfel:

– 250g de rădăcini și de fructe au fost rase printr-o răzătoare din material plastic, iar materialul vegetal astfel obținut a fost acoperit cu 500 ml de apă distilată; amestecul s-a lăsat la macerat timp de 12 ore, după care supernatantul a fost decantat, iar extractul a fost filtrat prin hârtie de filtru si păstrat astfel până la întrebuințare, la întuneric, la temperatura de 4ºC.

În cazul acestor extracte apoase, soluția obținută a fost considerată ca un extract apos de referință, concentrația obținută evaluând-o ca 100%. S-au făcut diluții cu apă distilată, obținând-se următoarele concentrațiile finale: 5%, 25%, 50% si 75%.

Astfel, în afara lotului martor (P0) au fost constituite variante experimentale, după cum urmează:

• P0 – lot martor, material semincer pus la germinat pe substrat umectat cu apă;

• P1 – material semincer pus la germinat pe substrat umectat cu extract 5%;

• P2 – material semincer pus la germinat pe substrat umectat cu extract 25%;

• P3 – material semincer pus la germinat pe substrat umectat cu extract 50%;

• P4 – material semincer pus la germinat pe substrat umectat cu extract 75%;

• P5 – material semincer pus la germinat pe substrat umectat cu extract 100%;

5.3. Metode de analizӑ

Pentru evaluarea efectului alelopatic al extractelor apoase preparate din rӑdӑcini de hrean s-au efectuat următoarele analize, în raport cu loturile martor, reprezentate de material semincer pus la germinat pe substrat umectat cu apă distilată:

– determinarea germinației materialului semincer;

– biometrizarea plantulelor și organelor acestora;

– determinarea conținutului în pigmenți clorofilieni;

– determinarea activitӑții peroxidazice din rӑdӑcinițe;

– determinarea conținutului de prolinӑ din frunze.

5.3.1.Determinarea germinației materialului semincer

Determinarea germinației materialului semincer s-a efectuat după 4 zile dupӑ montarea experimentului. Materialul semincer a fost pus la germinat pe hârtie de filtru umidificată cu extract de diferite concentrații, în ceea ce priveste componentele hidrosolubile din materialul biologic utilizat; la lotul martor germinația s-a desfăsurat pe hârtie de filtru umidificată cu apă de robinet, așezatӑ în casolete incolore din material plastic transparent, cu lungimea de 18,5cm, lățimea de 12cm și înălțimea de 8cm, suficientă pentru a permite creșterea plantulelor în primele șapte zile de germinație. S-a urmărit ca boabele să fie amplasate cu zona embrionară în contact direct cu substratul de germinație.

Casoletele au fost păstrate în laborator, la temperatura de 23-25ºC, la lumină indirectă, cu variatii diurne specifice. Umiditatea hârtiei de filtru a fost menținutӑ prin adăugarea zilnică – în fiecare germinator – a câte 3ml de lichid.

5.3.2.Biometrizarea creșterii în lungime a plantulelor

Biometrizarea s-a efectuat dupӑ șapte zile. Creșterea plantulelor a fost urmӑritӑ în casolete, pe loturi de câte 100 de plantule/variantӑ. S-a determinat lungimea rӑdӑcinițelor embrionare și a tulpinițelor, respective a hipocotilelor la mazӑre.

Măsurătorile biometrice referitoare la creșterea medie în lungime a plantulelor martor și a organelor vegetative ale acestora, au fost considerate ca valori de referință, de 100%, date la care au fost raportate procentual determinările biometrice efectuate la loturile tratate cu extracte apoase preparate din rӑdӑcini de hrean.

5.3.3. Determinarea conținutului în pigmenți asimilatori

Efectul tratamentelor cu soluții de AS asupra conținutului în pigmenți asimilatori, respectiv a totalului de pigmenți clorofilieni și a totalului de pigmenți carotenoidici din frunzele plantelor. Pentru a pune în evidență efectul alelopatic al extractului apos de hrean asupra conținutului în pigmenți asimilatori, respectiv a totalului de pigmenți clorofilieni și a totalului de pigmenți carotenoidici din frunzele plantelor, s-a determinat, cantitativ, conținutul în pigmenți clorofilieni și carotenoidici în frunzulițele plantelor tratate cu soluții de NaCl, AS, NaCl și AS dupǎ metoda descrisǎ. Pentru extracția acestora din frunzulițe s-a utilizat N,N–dimetilformamidă (DMF) (Moran și Porath, 1980). Utilizarea DMF grăbește procesul de extracție al pigmenților și face posibilă determinarea acestora din cantități mici de material vegetal.

În a 7-a zi de la punerea la germinat, s-a recoltat o probă de 2 cm din vârful primei frunzulițe a fiecărei plantule, și din aceastǎ probǎ s-au cântǎrit 50 mg. Fiecare probă a fost trituratǎ în mojar din sticlǎ, și omogenizată cu 5 ml de DMF. Probele triturate au fost ținute în frigider la temperatura de 4˚C timp de 72 ore. Supernatantul a fost separat, dupǎ care în extractul total s-a determinat conținutul în pigmenți prin spectrofotometrie, utilizând un spectrofotometru Shimadzu UV-mini 1240. Citirile extincțiilor s-au efectuat la lungimi de undă diferite, pentru fiecare tip de pigment determinat, astfel : la o lungime de undă de 664 nm pentru clorofila a, la 647 nm pentru clorofila b, respectiv 480 nm pentru pigmenții carotenoidici totali. Pentru fiecare probă și fiecare pigment s-au efectuat câte 3 citiri, la care s-a efectuat media aritmetică. Datele obținute au fost prelucrate matematic, cu ajutorul formulei propuse de Moran (1982). Pentru un spectrofotometru cu rezoluție între 1–4 nm, pentru exprimarea mg/g frunză, formula de calcul este urmǎtoarea :

Clorofila a (mg/g frunză) = (11,65 A664 – 2,69 A647) • v/G

Clorofila b (mg/g frunză) = (20,81 A647 – 4,53 A664) • v/G

Carotenoizi (mg/g frunză) = (1000 A480 – 0,89 clorofila a – 52,02 clorofila b)/ 245 • v/G

Unde: A480 – valoarea absorbanței citită pentru o lungime de undă de 480 nm

A647–valoarea absorbanței citită pentru o lungime de undă de 647 nm

A664 – valoarea absorbanței citită pentru o lungime de undă de 664 nm

v – volumul de solvent utilizat (ml)

G – cantitatea de probă luată în lucru (mg)

Clorofila a și Clorofila b reprezintă valorile determinate în primele 2 formule.

Rezultatele obținute în urma determinării conținutului în pigmenți asimilatori, clorofilieni și carotenoidici, a primei frunzulițe a plantulelor martor, au fost considerate ca valori de referință, de 100%. Comparativ cu acestea au fost calculate în valori procentuale, datele obținute la loturile similare, provenite în urma tratamentelor cu soluțiile de tratament.

Datele individuale, privind conținutul în pigmenți asimilatori, au fost prelucrate statistic cu ajutorul testului t, determinându-se media aritmetică și abaterea standard și, apoi, în funcție de acestea s-a determinat semnificația statistică a datelor obținute.

5.3.4.Dozarea activității peroxidazelor

Activitatea peroxidazei s-a determinat în rădăcinițele plantulelor de porumb, mazӑre și tomate, atât de la lotul martor, cât și în cele tratate cu extractul apos din rӑdӑcini de hrean. Extractul enzimatic a fost realizat din material vegetal proaspăt (1g) recoltat, după 21 de zile de la montarea experimentului. Mojararea s-a realizat cu nisip de cuarț bine spălat și sterilizat în etuvă la 120ºC adăugând 4 ml tampon fosfat în concentrație de 6,7x 10ˉ³ M, pH=7, diluat 1:9 cu apă distilată răcită la 4ºC și 40 mg polivinil-pirolidonǎ (pentru înlǎturarea eventualilor inhibitori ai activitǎții peroxidazice). Extractul s-a centrifugat la 15000xg, timp de 20 de minute la 4˚C. Supernatantul separat a fost păstrat 2 ore la frigder pentru exprimarea și stabilizarea activității enzimatice. Au fost efectuate câte 3 repetiții, atât pentru martor, cât și pentru variantele experimentale luate în studiu.

Activitatea peroxidazică s-a determinat folosind un spectrofotometru Shimadzu UV-mini–1240, la o temperatură de 30ºC, urmărind formarea tetraguaiacolului, la o lungime de undă de 470 nm, ε=26.6mM-1cm-1, în 3 ml amestec de reacție conținând 1 ml tampon fosfat 0,1M pH=6,0; 1 ml guaiacol 15mM, 1 ml H2O2 3mM, și 50μl extract enzimatic. O unitate peroxidazică (U) reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează oxidarea a 1μmol de guaiacol într-un minut, conform metodei citate de Kim și Yoo, 1996.

Se citeste absorbanța imediat la momentul t=0 (A0) și dupa 1 minut (A1)

(ΔA/min x Vt) / (ε x Vs)

Unde :

ΔA/min = A1 – A0

Vt = vol final de reactie = 3,05 ml

Vs = vol probei = 0,05

5.3.5.Determinarea conținutului de prolină

Prolina, aminoacid cu rol protector, sintetizat în cazul în care plantele sunt supuse unui factor de stres se va determina cu ajutorul metodei Bates și colab (1973).

0,5g de material vegetal s-a omogenizat cu 10 ml soluție apoasă 3% de acid sulfosalicilic s-a filtrat, iar filtratul a fost tratat cu 2 ml ninhidrină acidă și 2 ml acid acetic glacial într-o eprubetă la 100ºC, timp de o oră, după care s-a tăcit în baie de gheață. Amestecul de reacție a fost extras cu 4 ml de toluen prin agitare energică timp de 15-20 de secunde. A fost separat supernatantul cromoforic conținând toluen și s-a citit absorbanța la o lungime de undă de 520 nm, folosind toulen ca martor.

Concentrația prolinei a fost stabilită folosind o curbă etalon iar rezultatul s-a raportat la substanța proaspătă, conform următoarei relații.

[μg prolina/ml x ml toluen / 115.5 μg/ μmol]/ [g proba/5] = μmoli prolina/g mat.vegetal proaspăt.

μg prolina/ml –din concentrația calculatӑ din curba de etalonare.

6. Rezultate și discuții

6.1.Rezultate germinație materialului semincer

Pentru a observa efectele produse de extractul de hrean asupra embrionilor cariopselor de porumb, a semințelor de mazӑre și tomate în primele 4 zile de germinație, s-a urmărit, facultatea germinativă a acestora. Reacțiile semințelor, respectiv a cariopselor (în cazul monocotiledonatelor), la prezența în substratul de germinație a extractului apos au fost comparate cu rezultatele obținute la lotul martor, semințe sau cariopse germinate pe apă distilată.

Facultatea germinativӑ a cariopselor de porumb, semințele de mazӑre respective de tomate la lotul martor a înregistrat urmӑtoarele valori: 100% la porumb și mazӑre și 56% la tomate.

Comparativ cu aceste valori, la variantele germinate pe hârtie de filtru umectatӑ cu extracte de hrean de diferite concentrații, facultatea germinativӑ a fost inhibatӑ. Valorile au fost trecute în tabelul nr. 6.1. si reprezentate grefic in fig. 6.1.

Tabelul 6.1. Facultatea germinativă a cariopselor de grâu, mazӑre și tomate (exprimatǎ în valori procentuale/100 de boabe puse la încolțit) la lotul martor;

Fig. 6.1. Facultatea germinativă a cariopselor de grâu, mazӑre și tomate

6.2. Rezultate privind biometrizarea creșterii în lungime a plantulelor

Măsurătorile biometrice au fost efectuate începând din cea de a 7-a zi de germinație.

Rezultatele experimentale obținute în cazul celor 3 plante analizate, în urma determinării creșterii medii în lungime a rădăcinițelor embrionare, a rădăcinițelor adventive, a coleoptilului, a primelor frunzulițe și a întregii plantule, au fost inserate în tabele și au fost reprezentate grafic; datele privind creșterile medii în lungime ale organelor plantulelor provenite în urma aplicǎrii de tratamente cu extract apos de hrean, au fost raportate la cele obținute la lotul martor, valori de referințǎ, considerate 100%, date care au fost reprezentate grafic sub formǎ de histograme.

Tabelul 6.2. Valori medii estimative pentru parametrii fiziologici de creștere analizați la plantulele de porumb în condiții normale și de germinare în soluții de extract de hrean de diferite concentrații.

p>0,05= nesemnificativ; p<0,05 * semnificativ; p<0,01=** distinct semnificativ; p<0,001=*** foarte semnificativ în comparație cu lotul martor.

Fig. 6.2. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul extractului de hrean asupra creșterii în lungime a rӑdӑcinitelor, tulpinițelor+frunzelor și a plantulelor întregi de porumb comparativ cu cele ale lotului martor

În cazul plantulelor de porumb, se poate observa cӑ atât lungimea rӑdӑciniței cât și a frunzulițelor și tulpinilor și implicit lungimea întregii plantule a înregistrat scӑderi nesemnificative în cazul utilizӑrii extractului apos de hrean în concentrație de 5%, iar pentru celelalte concentrații s-au înregistrat scӑderi foarte semnificative, comparativ cu lotul martor.

Tabelul 6.3. Valori medii estimative pentru parametrii fiziologici de creștere analizați la plantulele de mazӑre în condiții normale și de germinare în soluții de extract de hrean de diferite concentrații.

p>0,05= nesemnificativ; p<0,05 * semnificativ; p<0,01=** distinct semnificativ; p<0,001=*** foarte semnificativ în comparație cu lotul martor.

Fig. 6.3. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul extractului de hrean asupra creșterii în lungime a rӑdӑcinitelor, tulpinițelor+frunzelor și a plantulelor întregi de mazӑre comparativ cu cele ale lotului martor

Analizând rezultatele obținute în urma biometrizӑrii organelor vegetative ale plantulelor de mazӑre am putut observa scӑderi foarte semnificative și semnificative începând cu concentrația de 5% a extractului de hrean. La concentrațiile de 50; 75 și 100% formarea organelor vegetative a fost inhibatӑ, deci nu s-au mai efectuat biometrizӑri.

Tabelul 6.4. Valori medii estimative pentru parametrii fiziologici de creștere analizați la plantulele de tomate în condiții normale și de germinare în soluții de extract de hrean de diferite concentrații.

p>0,05= nesemnificativ; p<0,05 * semnificativ; p<0,01=** distinct semnificativ; p<0,001=*** foarte semnificativ în comparație cu lotul martor.

Fig. 6.4. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul extractului de hrean asupra creșterii în lungime a rӑdӑcinitelor, tulpinițelor+frunzelor și a plantulelor întregi de tomate comparativ cu cele ale lotului martor

La plantulele de tomate, reducerea creșterii organelor vegetative au fost foarte semnificative la concentrația de 5% a extractului apos urmând ca de la concentrația de 25 % sӑ nu se mai dezvolte tulpinițe și frunze, iar de la 50% nici rӑdӑcinițe.

6.3. Rezultate privind determinarea conținutul în pigmenți asimilatori

Studiind conținutul în pigmenți clorofilieni și carotenoidici în frunzulițele primare ale plantulelor de porumb, se poate observa că la prima variantӑ (extract de hrean conc.5%) stresul indus de substanțele alelochimice din extractul de hrean a redus nesemnificativ, conținutul de clorofila a, și pigmenți carotenoidici, și foarte semnificativ pe cel de clorofilӑ b. Pentru extracte cu concentrații mai mari de 50 % ale extractului de hrean, scӑderea conținutului pentru toate cele trei tipuri de pigmenți, este foarte semnificativӑ și reprezintӑ între 50 și 85% din valorile pentru lotul martor, germinat în apӑ.

La extractul de hrean de concentrație 100%, nu s-au dezvoltat frunze și de aceea nu s-au fӑcut determinӑrile de pigmenți clorofilieni.

Analizând rezultatele obținute pentru conținutul în pigmenți asimilatori în frunzele plantulelor de mazӑre, scӑderea a fost de aproximativ 65% penru extractul de hrean de 5% concentrație și în jurul valorii de 82% pentru concentrația de 25%. Pentru concentrațiile mai mari nu s-au dezvoltat frunze.

Valorile obținute pentru conținutul în pigmenți asimilatori, în urma determinării spectrofotometrice au fost trecute în tabelul 6.5; 6.6 și 6.7.și reprezentate grafic în fig. 6.5; 6.6., 6.7.

Tabel 6.5. Valori medii estimative pentru conținutul de pigmenți asimilatori din frunzele plantulelor de porumb în condiții normale și de germinare în soluții de extract de hrean de diferite concentrații.

p>0,05= nesemnificativ; p<0,05 * semnificativ; p<0,01=** distinct semnificativ; p<0,001=*** foarte

semnificativ în comparație cu lotul martor.

Fig.6.5. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul extractului de hrean asupra conținutului în pigmenți asimilatori al frunzelor plantulelor de porumb, comparativ cu cele ale lotului martor.

Tabel 6.6. Valori medii estimative pentru conținutul de pigmenți asimilatori din frunzele plantulelor de mazӑre în condiții normale și de germinare în soluții de extract de hrean de diferite concentrații.

p>0,05= nesemnificativ; p<0,05 * semnificativ; p<0,01=** distinct semnificativ; p<0,001=*** foarte

semnificativ în comparație cu lotul martor.

La tomate doar 2 variante au fost analizate: lotul martor și varianta 1, semințe germinate în extract de hrean 5%. În acest al doilea caz descreșterea a fost cuprinsӑ între 34 și 75%, fațӑ de lotul martor.

Fig.6.6. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul extractului de hrean asupra conținutului în pigmenți asimilatori al frunzelor plantulelor de mazӑre, comparativ cu cele ale lotului martor.

Tabel 6.7. Valori medii estimative pentru conținutul de pigmenți asimilatori din frunzele plantulelor de tomate în condiții normale și de germinare în soluții de extract de hrean de diferite concentrații.

p>0,05= nesemnificativ; p<0,05 * semnificativ; p<0,01=** distinct semnificativ; p<0,001=*** foarte

semnificativ în comparație cu lotul martor.

Fig.6.7. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul extractului de hrean asupra conținutului în pigmenți asimilatori al frunzelor plantulelor de tomate, comparativ cu cele ale lotului martor.

6.4. Rezultate privind determinarea activitӑții peroxidazice din rӑdӑcinițe

Producerea radicalilor liberi are loc în special în cloroplaste, în condiții de stres. Pentru a neutraliza acești radicali, plantele posedă mecanisme specifice, printre care activarea enzimelor antioxidante dar și a antioxidantilor neenzimatici, respectiv pigmenții carotenoidici și acidul ascorbic (Jaleel și colab., 2006).

Peroxidaza este una dintre cele mai importante enzime antioxidante.

Valorile pentru activitățile enzimatice ale peroxidazei au fost inserate in tabelul 6.8. și reprezentate grafic în fig. 6.8.

Activitatea peroxidazică în rădăcinițele de porumb, mazӑre și roșii a fost intensificatӑ la concentrații mici (5%) ale extractului de hrean. Concentrațiile superioare ale extractelor, de 75% si de 100%, au condus la diminuarea activității peroxidazice, la toate speciile luate în studiu.

Tab 6.8. Valori medii estimative pentru valorile activităților enzimatice ale extractelor din rădăcinițele plantulelor de porumb și mazӑre în condiții normale (P0)și de alelopatie.

Fig.6.8. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul alelopatic al extractului de hrean asupra activitǎții peroxidazei, din rӑdӑcinile de porumb, mazӑre și tomate.

Crescând activitatea enzimelor antioxidante, acestea vor neutraliza o cantitate mai mare de radicali liberi cu efecte negative asupra creșterii și dezvoltării plantelor.

6.5. Rezultate privind determinarea conținutului de prolinӑ din frunze.

În condiții de stres, conținutul de prolină liberă din frunzulițele plantulelor crește foarte semnificativ față de valorile obținute pentru plantulele lotului martor.

Curba de etalonare este reprezentatӑ în fig. 6.9

Fig.6.9. Reprezentarea graficӑ a curbei de etalonare pentru determinarea prolinei

Tab 6.9. Valori medii estimative pentru valorile conținutului de prolinӑ din extractele obținute din frunzulițele plantulelor de porumb și mazӑre în condiții normale (P0) și de alelopatie.

Extractul apos de hrean determină o creștere a conținutului de prolină aminoacid cu rol în atenuarea efectelor negative induse de diferiți factori de stres.

Fig.6.10. Diferențe procentuale care reflectǎ efectul alelopatic al extractului de hrean asupra conținutului de prolinӑ din frunzulițele de porumb, mazӑre si tomate.

Prolina este un compus important în reacțiile de apărare ale plantelor la acțiunea diferiților factori de stres. Existӑ numeroase cercetări care au scos în evidență creșterea conținutului de prolină în diferite condiții de stres, astfel, concetrația de prolină crește în plantele de grâu, orz, fasole și roșii în condiții de stres oxidativ (Tasgin și colab., 2006, Deef, 2007).

7. Concluzii

Analizând rezultatele obținute în cadrul experimentelor efectuate în condiții de laborator în corelație cu datele de literatură studiate, se desprind următoarele concluzii :

Facultatea germinativǎ a scǎzut foarte semnificativ la loturile germinate în extract de hrean de diferite concentrații.

La mazӑre extractul apos de hrean 75% a stopat complect germinația, iar la tomate concentratia de 50% a avut același efect de inhibare totalӑ a germinației.

Extractele apoase de hrean au dus la o scӑdere a creșterii plantelor, fiind afectate în special frunzele. Dintre specii, porumbul a fost cel mai rezistent, la mazӑre nu s-au mai putut efectua biometrizӑri de la concentrația de 25% a extractului apos de hrean, iar la tomate începnd cu concentrația de 10%.

Extractele apoase de hrean au dus la scӑderea conținutului de pigmenți clorofilieni și carotenoidici în frunzele primare ale plantulelor de porumb, mazӑre și tomate, în comparație cu probele lotului martor.

Germinația și creșterea plantulelor în extracte apoase de hrean au determinat creșterea activității enzimei peroxidaza – enzimӑ antioxidantӑ, plantele luptând astfel împotriva stresului indus de alelochimicalele prezente în extractul apos de hrean. Creșterea a fost maximӑ la prima serie experimentalӑ (concentrație de 5% a extractului apos), la valori mai mari efectul extractului de hrean fiind mai puternic duce din nou la scӑderea a activitӑții peroxidazice.

Alelochimicalele din extractul apos de hrean au determinat creșterea semnificativă a conținutului de prolină, aminoacid liber implicat in ameliorarea efectelor negative ale factorilor de stres, la toate speciile luate în studiu.

Rezultatele studiilor noastre au dovedit cӑ extractul apos de hrean a avut efect alelopatic asupra speciilor luate în studiu, respectiv: porumb, mazӑre și tomate, dintre aceste plante porumbul a fost cel mai rezistent iar tomatele cele mai sensibile.

Plantele fiind organisme imobile, posedӑ sisteme de apӑrare împotriva factorilor de stres, cum ar fi: enzime antioxidante și prolina – produs secundar de metabolism cu efect protector, sintetizat în diferite condiții de stres.

Bibliografie

Ambreen S, Rehman K, Zia A., Habib F. 2000 – Kinetic studies and partial purification of peroxidase from soybean. Pak. J.Agril. Sci., 37, p.119-122.

Burzo I.,Voican V., Dobrescu A., Delian E., 1996 – Curs de fiziologia plantelor, Universitatea de Stiințe Agricole și Medicină Veterinară, București.

Castillo FJ., Miller PR., Greppin H., 1987 – Extracellular biochemical markers of photochemical oxidant air pollution damage to Norway spruce. Experimentia 43, p.276-287.

Choudhary, N.L. 2005 – Expression of delta1-pyrroline-5- carboxylate synthetase gene during drought in rice (Oryza sativa L.). Ind. J. Biochem. Biophys. 42, 366–370.

Corbu S, 2007 – Teza de doctorat, Universitatea din Oradea.

Bostan C, 2009 – Teza de doctorat, Universitatea de stiinte agricole si medicina veterinara a banatului Timisoara

Deef H., (2007) – Influence of Salicylic Acid on Stress Tolerance During Seed ermination of Triticum aestivum and Hordeum vulgare. Advances in Biological Research 1 (1-2): 40-48.

Delachiave, M. E. A. P.; Ono, E. O.; Rodrigues, J. D. 1999, Efeitos alelopáticos de grama-seda (Cynodon dactylon L.) Persna germinação de sementes de pepino, milho, feijão e tomate. Revista Brasileira de Sementes, 21 (1): 194-197.

Duke, S.O., Scheffler, B.E., Dayan, F.E., 2002, Allelochemicals as Herbicides, In: Allelopathy, From Molecules to Ecosystems. Ed. Regiosa, M., Pedrol, N., Departamento de Bioloxia Vexetal e Ciencia do Solo, Universida de Vigo, Spain, p. 183-195.

Dumitru IF, Iordăchescu D, 1981–Introducere în enzimologie, Ed. Medicală București.

Dumitru IF., 1980 – Biochimie, Editura Didactică și pedagogică, București.

Fabro, G. și colab., 2004 – Proline accumulation and AtP5CS2 gene activation are induced by plant-pathogen incompatible interactions in Arabidopsis. Mol. Plant–Microbe Interact. 17, 343–350.

Ferreira RR., Farnezier RF., Vitoria Ap., 2002 – Changes in antioxidant enzimes activities in soybean under cadmium stress. J.Plant Nutr. 25(2): p.327-342.

Gaspar, Th., Penel, Cl., Thorpe, T., Greppin, H., (1982) – Peroxidases 1970-1980, A survey of their biochimical and physiological roles in higher Plants, Edit. University of Geneva.

Harborne.J.B., 1977 – Introduction to ecological biochemistry.Academic Press New York.

Hayat Q., Hayat S., Irfan M., Ahmad A., 2010- Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: A review. Environmental and experimental botany. Volume 68, Issue 1, March 2010, Pages 14-25.

Hayat S, Hayat Q, Alyemeni MN, Wani AS, Pichtel J, Ahmad A., 2012 – Role of proline under changing environments: a review. Plant Signal Behav. 2012 Nov; 7(11):1456-66. doi: 10.4161/psb.21949. Epub 2012 Sep 5.

Jackson PA., Galinha CI., Pereira CS., Fortunato A., Soares NC., Amancio SB., 2001 – Rapid deposition of extensin during the elicitation of grapevine callus cultures is specifically catalyzed by a 40-kiloDalton peroxidase. Plant Physiol. 127: p.1065–1076.

Krishan Murari Mangal1, Jawahar Lal Bhat, Ajay Kumar, Pragati Saini -2013 –

Kwon SV., Jeong YJ., Lee HS., Kim JS., Cho KY., Allen RD., & Kwak SS., 2002 – Enhanced tolerances of transgenic tobacco plants expressing both superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in chloroplasts against methyl viologen mediated oxidative stress. Plant, Cell and Environment 25, p.873–882.

Miró, C. P.; Ferreira, A. G.; Aquila, M. E. A. 1998 – Alelopatia defrutos de erva-mate (Ilex paraguariensis) no desenvolvimento domilho. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 33 (8): 261-270.

Moran, R., Porath, D., 1980 – Clorophyll determination in intact tissue using N,N- dimethylformamide, Plant Physiol, 65, p 478-479.

Moran, R., 1982 – Formulae for determination of chlorophyllous pigments extracted with N,N- dimethylformamide, Plant Physiol. 69 (6), p. 1376-1381.

Neamțu G., 1983 – Biochimie ecologicӑ, Ed.

Passardi F., Penel C., Dunand C., 2004 – Performing the paradoxical: how plant peroxidase modify the plant cell wall. Plant Science vol.9 (11)., p.534-540.

Price NJ., 2003 – A biochemical and molecular characterization of LEP1, an extensin peroxidase from lupin. J. Biol. Chem. 278, p.41389–41399.

Reed G., 1975 – Oxidoreductase. In: Enzymes in food processing. Academic Press, USA.

Rice, E.L., 1984, „Allelopathy” 2nd. Edit. Academic Press, New York, p.421.

Saradhi, P.P. 1995- Proline accumulates in plants exposed to UV radiation and protects them against UV induced peroxidation.Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 1–5.

Scebba F., Sebastiani L., Vitagliano C., (1999) – Protective enzymes against activated oxygen species in wheat (Triticum aestivum) seedling:response to cold acclimation. J.Plant. Physiol. 155., p.762-768.

Schat, H. și colab., 1997- Heavy metal-induced accumulation of free proline in a metal-tolerant and a nontolerant ecotype of Silene vulgaris. Physiol. Plant. 101, 477–482

Szabados L., Savoure A., 2010 – Proline: a multifunctional aminoacid, Trends in Plant Science Vol.15 No.2, pp. 89-97.

Tasgin E., Atici O., Nalbantoglu B., (2003) – Effects of salicylic acid and cold on freezing tolerance in winter wheat leaves. Plant Growth Regul. 41, p. 231-236

Vasilescu I. , 1981 – Enzime, Ed.Acad.București.

Yang, S.L. 2009 – Hydrogen peroxide-induced proline and metabolic pathway of its accumulation in maize seedlings. J. Plant Physiol. 166, 1694–1699.

Yoshiba, Y. 1995 Correlation between the induction of a gene for delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and the accumulation of proline in Arabidopsis thaliana under osmotic stress. Plant J. 7, 751–760

Zia Ma., Rehman K., Saed K., Ahmed A., 2001 – Partial purification of peroxidase from tomato. The Sciences 1, p.404-406.

http://www.formula-as.ro/2012/1050/medicina-naturii-44/hreanul-15910

http://edis.ifas.ufl.edu/hs186

http://www.oxfordbibliographies.com/view/document/obo-9780199830060/obo-9780199830060-0038.xml)

(http://www.hgtv.com/landscaping/killer-plants/index.html)