Prevenirea Difteriei. Supravegherea Nivelului de Imunitate Si a Evolutiei Agentului Patogen al Bolii

1. INTRODUCERE

Boala difterica, considerata in curs de eliminare, continua sa ramana in actualitate datorita cunostintelor acumulate in domeniu la nivel genetic si molecular, evolutiei si trasaturilor caracteristice bolii in contextul epidemilologic recent aparut, masurilor de supraveghere si control care se impun.

Cunoscuta din cele mai vechi timpuri, primele cazuri fiind descrise la inceputul erei noastre, difteria a fost cauza comuna de morbiditate si mortalitate in multe tari din lume, raspandirea ei fiind universala. In perioada prevaccinala unul din douazeci de locuitori inregistra o imbolnavire de difterie in cursul vietii, iar 5-10% din cazuri erau insotite de deces. Descoperirea in 1891 a tratamentului specific cu ser antidifteric si introducerea anatoxinei difterice native in imunizarea activa a populatiei in perioada 1921 –1930, au constituit principalele mijloce de lupta impotriva bolii.

Initierea si implementarea unor programe nationale de imunizare, alaturi de supravegherea nivelului de imunitate antidifterica si a agentului patogen C. diphtheriae toxigen), au avut ca rezultat reducerea continua a morbiditatii prin difterie.

Astfel, in Europa, incidenta bolii s-a redus de la 160/0000 la 0,20/0000 cazuri pe an, in ultimii 25 de ani, unele tari raportand numai cazuri sporadice, altele mici epidemii.

La inceputul anului 1980, cand morbiditatea prin boala a atins cele mai reduse valori, s-a considerat ca difteria nu mai constituie o problema de sanatate publica. Mai mult, a existat optimismul general ca boala poate sa fie eliminata din tarile Europei.

Cu toate progresele inregistrate privind supravegherea verigilor implicate in procesul epidemiologic, dupa 1990 s-a constatat reemergenta difteriei in unele tari din Asia si estul Europei.

In acest context, conform recomandarilor OMS, fiecare tara trebuie sa realizeze propria conduita de prevenire si control a difteriei, in functie de situatia epidemiologica existenta.

Pentru Romania, tara limitrofa cu focarul epidemic din NIS, in care nu s-au inregistrat cazuri de difterie din 1989, planul de masuri pentru controlul si posibila eliminare a difteriei in viitor, vizeaza trei obiective majore:

– acoperirea vaccinala a populatiei receptive in proportie de 95% in primii doi ani de viata;

– evaluarea nivelului de imunitate antidifterica prin studii serologice;

– mentinerea unei supravegheri active clinic si bacteriologic a tuturor formelor de infectie difterica, inclusiv a circulatiei C. diphtheriae toxigen.

2. CONSIDERATII EPIDEMIOLOGICE PRIVIND DIFTERIA

A. DATE GENERALE DE EPIDEMIOLOGIE

Difteria este o boala infectioasa acuta, transmisibila determinata de exotoxina eliberata de C.diphtheriae. Desi sunt citate cazuri de boala produse de C. diphtheriae netoxigen (Barksdale L.,Brooks R.), difteria clinica clasica ramane o toxemie, iar evolutia si gravitatea ei depind de cantitatea si rapiditatea cu care toxina difterica difuzeaza in organism.

Evolutia bolii poate sa fie epidemica, sporadica sau endemo-epidemica. Cele mai grave epidemii au fost determinate de C. diphtheriae toxigen gravis, care prezinta si o capacitate mai mare de raspandire in populatie. Tipurile de bacil difteric toxigen mitis si intermedius sunt mai frecvente in situatii endemo – epidemice sau cazuri sporadice. In recenta epidemie de difterie din Rusia, Moldova, Ucraina si alte tari din NIS s-a remarcat prezenta tuturor biotipurilor de bacil difteric. De remarcat ca pana la actualele izbucniri de difterie din Europa de Est si Asia, potentialul epidemic al tulpinilor de C. diphtheriae intermedius si mitis toxigen a fost putin conoscut, iar diferentele intre virulenta celor trei biotipuri nu au fost inca elucidate.

Difteria clinica se manifesta prin fenomene locale (falsa membrana) si fenomene toxice generale, determiate de activitatea toxinei difterice la nivelul tesuturilor specializate.

Forma de raspandire a bolii este faringiana , dar poate sa existe si difteria laringiana , nazala, conjunctivala sau auriculara; in zonele calde predomina insa difteria cutanata.

Exista si forme atipice de difterie, cu manifestari clinice nezgomotoase al caror diagnostic este dificil de efectuat.

Cunoscuta de secole, difteria a evoluat in valuri epidemice. Datele istorice demonstreaza acest femomen si evidentiaza faptul ca evolutia ciclica a epidemiilor survine cu o periodicitate de 100 de ani sau mai mult (Galazka M.A.).

Informatiile sigure asupra bolii difterice dateaza din sec. XVI si XVII din Spania, unde boala a fost cunoscuta ca "morbus suffocans" sau "garrotilla", indicand forma de difterie laringiana, cu decese prin sufocare (tabel 1).

Boala a aparut in valuri distincte: 1583-1618, 1630-1646 si 1666, ultimul episod determinand aparitia catorva cazuri in lumea noua. Pana in sec XVIII, nu a mai fost descrisa nici o epidemie majora de difterie.

Insa, in perioada 1735 –1740 este descrisa epidemia din New England care se intinde rapid in unele regiuni din America. Denumita in acea perioada "boala a gatului", difteria a aparut cu predilectie in mediul rural, fiind insotita de complictii severe si rata inalta de morbiditate. Statisticile din Hampton Falls arata ca mortalitatea a fost indeosebi la copii: din cele 210 persoane decedate in 1735, 200 erau mai tineri de 20 de ani, iar in Kingston au decedat 1/3 din totalul copiilor (tabel 2). In aceeasi perioada boala este descrisa in Germania, Elvetia si America de Nord (1752), iar in 1755 in Suedia, dupa care informatiile devin mai rare. Medicii din perioada respectiva incep sa nu mai cunoasca boala, iar

Tabel 1

EVOLUTIA CICLIC~ A DIFTERIEI IN LUME

Tabel 2

Mortalitatea prin difterie In Hampton Falls, New Hampshire 1735

englezul Sir John Simon scria: "Difteria este o boala aproape necunoscuta generatiei actuale de medici".

In sec. XIX, incepand cu 1857, difteria se raspandeste rapid, aproape concomitent in cele mai multe tari din Europa si America de Nord evoluand in cadrul unei mari pandemii. .In Germania, in perioada 1862-1863 toate regiunile estice de la Rostock pana la Danzing au fost afectate; in Rusia (Petesburg, Moscova) si indeosebi in regiunile din sud, difteria a evoluat cu incidenta crescuta a mortalitatii in peroiada 1872-1879, victimele inregistrate fiind de ordinul sutelor in fiecare sat, al miilor in provincii, iar copiii aporape disparusera. Din 1880-1886, in orasul New York au fost inregistrate intre 2000 si 5196 cazuri de difterie cu o rate de fatalitate care nu a scazut niciodata sub 42%, indicele cel mai mare fiind atribuit copiilor sub 15 ani; difteria devenise endemica in orase si epidemica in mediul rural. In marile orase europene (Londra, Hamburg) datele statistice demonstreaza ca rata de mortalitate a atins valori de 50 – 100 0/0000 decese, iar in tarile Europei de 400/0000 .

Nu este o intamplare faptul ca in acest secol au aparut cele mai multe descoperiri legate de boala si tratamentul sau. Evolutia virulenta a bolii, raspandirea ei, a determinat descrierea manifestarilor clinice de catre Brettonneau care o denumeste "diphtheritis", termenul de difterie fiind introdus ulterior de Trousseau (1821 -1836), in 1886 Klebs descopera bacilul difteric, rolul lui etiologic fiind demonstrat de Loffler in 1884, iar in 1889 Roux si Yersin au descoperit toxina difterica.

O epidemie si mai mare de difterie a fost in Europa in sec XX in timpul si dupa Al Doilea Razboi Mondial.

Din 1937 si pana in 1940, rata de incidenta a difteriei a fost de 24 0/0000 in Danemarca si aproape 200/0000 in Olanda, Norvegia, Suedia, Elvetia, fiind de 10-50 ori mai mare in Germania. In 1941 datorita conditiilor igienico –sanitare precare caracteristice perioadei de razboi, morbiditatea prin difterie in Germania a crescut mai mult, continuand sa se mareasca in urmatorii ani. Daca in 1940 au fost inregistrate numai 173 de cazuri, in 1941 numarul de imbolnaviri se situa la 250 000. Aceeasi tendinta se observa in Norvegia si Olanda unde incidenta bolii creste de la 7-7600/0000 si respectiv 15-6220/0000 in perioada 1941-1943. Stowman K. (1945) a estimat ca numai in 1943 au existat peste un milion de cazuri de difterie, iar decesele inregistrate (50000) au provenit din Europa, exceptand numarul de decese din Rusia. In toata perioada razboiului, ca si in etapele imediat urmatoare, difteria a fost cauza majora de morbiditate si de mortalitate in continentul european. Cu tot declinul inregistrat in unele tari (Anglia si Wales), ea a continuat sa apara in altele (Polonia), raspandirea ei fiind exacerbata de conditiile socio–economice deficitare, miscarile masive de populatie din mediul rural spre cel urban, conditiile de locuit necorespunzatoare si rata inalta de fertilitate.

Aspectele mentionate privind evolutia ciclica epidemica a difteriei pana in 1940 sunt consecinta absentei unui mijloc eficace de limitare a procesului epidemic.

Imunizarea naturala a populatiei, ca si imunitatea antidifterica dobandite prin boala sau transmisa transplacentar de la mama la nou-nascut sunt de scurta durata; aceste forme de imunizare au rol redus, in creerea unui fond imunitar solid in populatia receptiva si, in consecinta, in stoparea evolutiei naturale a bolii.

Aspecte epidemiologice ale difteriei arata ca boala poate sa fie controlata prin imunizarea activa a populatiei receptive. Administrarea vaccinoprofilaxiei intr-un cadru planificat, cum s-a practicat in general in majoritatea tarilor din Europa si unele tari din Asia, sau in mod arbitrar dupa recomandarea medicului pediatru, a avut ca rezultat imediat o reducere continua a morbiditatii si mortalitatii prin difterie.

Daca initial imunizarile active s-au efectuat pe grupe limitate de copii si numai in cateva tari, Germania (1934), Romania (1934), SUA, Italia (1939), Franta(1938), din 1940 si pana in 1950 vaccinarea antidifterica s-a generalizat in toate tarile cu standard socio-economic ridicat. Pe masura ce cuprinderea in imunizare a atins proportii tot mai mari, de la 28-34,4% in perioada 1951 –1953 pana la aproximativ 70-80% in 1977, indicele de morbiditate prin difterie s-a redus treptat, mentinandu-se la nivel ridicat numai in unele tari ca Turcia, Irak, Africa de Sud (Fig. 1).

Impactul dintre imunizarea antidifterica si evolutia morbiditatii prin difterie este si mai bine evidentiat in figura 2. In Anglia si Wales cazurile de difterie au scazut de la 58359/ an in perioada 1929 – 1939, la 37 in 1957, un caz in 1979.

Rata de mortalitate a urmat acelasi curs, diminuandu -se de la 288 cazuri/milion in 1931- 1940, la 2 decese in 1972. In Germania, incidenta bolii scade de la peste 150 000 cazuri de difterie in 1944 la 17 cazuri si doua decese in 1974, cauzele acestei evolutii favorabile fiind vaccinarea intensiva a copiilor, conditii igienico-sanitare imbunatatite, normalizarea conditiilor economice. Se credea chiar ca difteria a fost eradicata, intrucat dupa 1972 nu au mai fost inregistrate cazuri de boala pana in 1975 cand in Dusseldorf si orasele invecinate intr-o perioada de numai doi ani au aparut 70 cazuri de difterie cu un procent de letalitate de 12-66%. O situatie asemanatoare s-a remarcat si in alte tati. In

Figura 1

Figura 2

Incidența difteriei la 0/0000 locuitori în unele țări în perioada 1920-1980

SUA, de la peste 200 000 cazuri si un indice de mortalitate de 5-10% in 1921, se ajunge la 59 cazuri in 1979. Indicele crescut de morbiditate din perioada 1069-1970 si 1975 se datoreaza epidemiei din Texas si San Antonio, cand intr-o perioada relativ scurta de timp (un an ), au fost inregistrate 201 cazuri, sau numarului crescut de difterie oculara (23 cazuri) sau cutanata (171 cazuri) inregistrate dupa 1975. O imagine mai reala a evolutiei difteriei in SUA este si faptul ca din totalul de 43 de state care au raportat cazuri de boala in 1960, numai in 9 state s-au inregistrat cazuri de difterie in 1978. Curba de evolutie a morb44 la 17 cazuri si doua decese in 1974, cauzele acestei evolutii favorabile fiind vaccinarea intensiva a copiilor, conditii igienico-sanitare imbunatatite, normalizarea conditiilor economice. Se credea chiar ca difteria a fost eradicata, intrucat dupa 1972 nu au mai fost inregistrate cazuri de boala pana in 1975 cand in Dusseldorf si orasele invecinate intr-o perioada de numai doi ani au aparut 70 cazuri de difterie cu un procent de letalitate de 12-66%. O situatie asemanatoare s-a remarcat si in alte tati. In

Figura 1

Figura 2

Incidența difteriei la 0/0000 locuitori în unele țări în perioada 1920-1980

SUA, de la peste 200 000 cazuri si un indice de mortalitate de 5-10% in 1921, se ajunge la 59 cazuri in 1979. Indicele crescut de morbiditate din perioada 1069-1970 si 1975 se datoreaza epidemiei din Texas si San Antonio, cand intr-o perioada relativ scurta de timp (un an ), au fost inregistrate 201 cazuri, sau numarului crescut de difterie oculara (23 cazuri) sau cutanata (171 cazuri) inregistrate dupa 1975. O imagine mai reala a evolutiei difteriei in SUA este si faptul ca din totalul de 43 de state care au raportat cazuri de boala in 1960, numai in 9 state s-au inregistrat cazuri de difterie in 1978. Curba de evolutie a morbiditatii are acelasi aspect de declin continuu in Suedia, Danemarca, Franta, Polonia unde s-au inregistrat intre 0-3 cazuri dupa 1975, iar aceasta evolutie este explicata nu numai de eficacitatea vaccinarii, dar si de legislatia existenta in tarile respective.

Cu toata evolutia satisfacatoare din tarile cu standard socio- economic ridicat, in 1970 erau raportate la OMS un numar de 70 000- 90 000 cazuri de difterie anual. Aceasta incideta se datora morbiditatii crescute prin difterie inregistrata in unele tari din Asia si Africa in care imunizarea activa cu anatoxina difterica a fost lansata dupa 1970, cu ocazia Programului Largit de Imunizare recomandat de OMS.

Acoperirea vaccinala a copiilor cu trei doze de DTP creste de la 5% in 1974 la 45% in 1985 si 79% in 1992; in consecinta, se observa o reducere treptata a nivelului de morbiditate prin difterie si in aceste regiuni. In China numarul de cazuri in 1974 a fost de 25859, iar in 1992 au fost inregistrate numai 143. In Filipine indicele de morbiditate se reduce de la 106,43% in 1974 la 22,47% in 1986. Un declin rapid al morbiditatii prin difterie se observa si in Egipt, Sudan, Malaezia, Tailanda, Argentina, Brazilia (Fig. 3).

Figura 3

Incidența difteriei în unele țări cu PLV după 1970

Ca urmare a aplicarii intensive a imunizarilor active, intr-un numar de 13 tari din Europa si Asia (Finlanda, Norvegia, Elvetia, Grecia, Israel) nu s-au inregistrat cazuri de difterie in 3-12 ani consecutiv.

Extinderea ariei de aplicare a vaccinurilor a determinat ca procentul acestor tari sa atinga cifra de peste 55% in 1982.

Cazurile sporadice de difterie semnalate totusi dupa 1982 in Franta, Italia, Germania sau focarele mici de boala din Suedia, Iordania s-au datorat prezentei unor persoane receptive, neprotejate antidifteric.

Aplicarea incorecta a schemelor de imunizare, prezenta in teritoriu a tulpinilor de C. diphtheriae toxigen nu poate sa asigure protectia in masa impotriva bolii. A fost necesara alaturi de imunizarea antidifterica integrarea altor instrumente de supraveghere epidemiologica a difteriei: evaluarea continua a protectiei antidifterice conferita de imunizare (initial prin testul Schick, ulterior prin teste serologice standardizate), supravegherea activa a bolii, controlul circulatiei agentului patogen.

Izvorul de infectie pentru om in difterie este exclusiv uman, fiind repezentat de bolnavii si purtatorii de bacil difteric.

Bolnavii de difterie cu forme tipice de boala au rol epidemiologic mai limitat, spre deosebire de formele fruste sau atipice, greu de diagnosticat. Izvorul cel mai important de infectie il constituie insa purtatorii de bacil difteric (convalescenti sau sanatosi) intalniti cu frecventa mai mare in sezonul rece, in colectivitati de copii si adolescenti.

Rolul purtatorilor de bacil difteric este mai evident in perioada actuala de reducere a difteriei pana la cazuri sporadice aparute prin neglijente de vaccinare. Astfel ca este de inteles interesul pentru controlul circulatiei agentului patogen, alaturi de interesul acordat imunitatii antidifterice.

Transmiterea infectiei difterice se realizeaza prin contact apropiat cu izvorul de infectie ( picaturi Flugge, praf contaminat) sau prin obiectele contaminate recent. S-a demonstrat si transmiterea indirecta prin intermediul produselor alimentare contaminate ,indeosebi prin lapte.

Receptivitatea fata de difterie difera de la individ la individ, nedepasind in general 20% din populatie. Nou nascutii si sugarii in primele luni de viata sunt mai putin receptivi la difterie ca urmare a imunitatii antidifterice transmisa transplacentar. Dupa 6 luni imunitatea pasiva se pierde, receptivitatea crescand cu varsta si atingand maximum la 2-5 ani. In ultimii ani se consta o tendinta de deplasare a receptivitatii prin boala peste varsta de 14 ani, la adolescenti sau chiar la adulti.

Modificarea varstei de aparitie a cazurilor de difterie este determinata de o serie de factori:

– diminuarea nivelului de imunitate antidifterica in paralel cu cresterea intervalului de timp de la ultima revaccinare, fapt care determina aparitia unor procente crescute de populatie adulta neprotejata antidifteric;

– reducerea morbiditatii prin difterei a avut drept urmare diminuarea incidentei C. diphtheriae, iar izolarea tulpinilor toxigene a devenit neobisnuita in unele tari din Europa. In consecinta, lipsa de imunizare naturala a contribuit la accentuarea procentului de adolescenti si adulti neprotejati, fiind considrati dupa unii autori "grupe de risc pentru difterie";

– desi C. diphtheriae toxigen s-a redus substantial, in unele tari exista totusi o larga circulatie a b. difteric printre homosexuali, alcoolici, consumatori de droguri, iar adolescentii si adultii sunt in contact mai strans cu aceste medii sociale.

Astfel ca in ultimele epidemii difteria a fost semalata la toate varstele: in Yemen si Sudan sub 5 ani, in Iordania intre 5-15 ani, iar in Suedia si SUA varsta de aparitie a bolii a fost de 40 ani.

In epidemia de difterie din Rusia, Ucraina, Moldova difteria a aparut in proportie relativ echilibrata intre cele doua grupe: adolescenti 15-19 ani, adulti 20-60 ani si in procent mai redus la copii.

Difteria este o boala tipica a colectivitatilor. Focarele se produc de obicei in conditii de contact strans (familie, internate, case de copii, scoli). Daca in Europa Centrala si de Nord sau in SUA, rolul acestuia este nesemnificativ, in recentele situatii epidemice din Europa de Est si Asia difteria a fost inregistrata in institutii prescolare, unitati militare, de constructii, spitale de psihiatrie. In conditiile in care vaccinarea se practica sistematic, acestea nu mai reprezinta locuri de risc pentru boala.

In general, difteria evolueaza la populatia neprotejata antidifteric cu un nivel de imunitate antitoxica < 0,03 UI/ml, factorii predispozanti fiind foctorii economico-sociali.

Au fost insa semnalate cazuri de difterie la persoane cu nivele de imunitate >0,1 UI/ml (SUA, Franta). Fenomenul poate sa fie explicat fie prin posibila virulenta crescuta a tulpinilor de C. diphtheriae sau posibila interventie concomitenta a altori factori de patogenicitate, alaturi de toxina difterica. S-ar putea de asemenea ca nivelul de imunitate antitoxica antidifterica de 0,03-0,1 UI/ml sa nu furnizeze o protectie antidifterica absoluta sau, poate, este vorba de un nivel individul diminuat de imunitate a populatiei, de alta natura.

Recent, OMS recomanda o alta interpretare a nivelului de imunitate antitoxica antidifterica:

– < 0,01 UI/ml – susceptibilitate individuala;

– 0,01 UI/ml – cel mai scazut nivel de antitoxina care confera un anumit grad de protectie antidifterica;

– 0,01- 0,09 UI/ml – nivele de antitoxina care ofera un anumit grad de protectie antidifterica;

– 0,1 UI/ml – nivelul sigur de protectie;

– > 0,1 UI/ml – nivelul de protectie de lunga durata.

B. ASPECTE PRIVIND RECENTELE EPIDEMII DE DIFTERIE DIN RUSIA SI NIS

Asa cum am mentionat, dupa 1989, dar in special dupa 1990, se observa o crestere a morbiditatii prin difterie. Aceasta situatie se datoreste reemergentei bolii in Rusia, Statele Noi Independente (NIS) raspandirii cazurilor de difterie in unele tari din Europa.

1. Difteria in Federatia Rusa (F.R.)

Introducerea imunizarii active dupa 1950 in tarile care au apartinut fostei URSS a permis reducerea treptata a morbiditatii prin difterie pana la 0.080/0000 . Dupa 1976, se remarca insa o crestere a incidentei bolii, un prim val fiind inregistrat in perioada 1981-1983. Cele mai multe cazuri de boala au fost raportate de tari care in prezent fac parte din Federatia Rusa.

Un al doilea val al procesului epidemic a inceput in 1990 si continua sa evolueze si in prezent ( Fig. 4 ).

Figura 4

Nr. de cazuri de difterie raportat. în Noile State Independente ale fostei URSS

Intr-o perioada de numai patru ani morbiditatea prin difterie s-a dublat anual. Cazurile de difterie au aparut in aproape toate regiunile administrative ale Federatiei Ruse (89 regiuni). Daca initial in 1992 difteria a fost inregistrata numai in partea europeana a tarii, dupa 1993 apare in zone din centrul si nordul Federatiei Ruse. Cea mai mare incidenta a fost inregistrata in zone cu densitate mare a populatiei: Moldova (2830/0000), regiunea Petersburg (35,9), orasul St. Petrsburg (51,7).

Indicele de mortalitate este de asemeni crescut atingand 10,150/0000. Cazurile de boala au aparut la toate varstele. Daca inainte de 1980 incidenta difteriei era redusa la copiii sub 6 ani, boala fiind mai frecventa la copiii peste 10 ani, in perioada primului val epidemic a existat o modificare a varstei de aparitie a cazurilor, cu cresterea morbiditatii prin difterie la copiii prescolari. Din 1990 procesul epidemic a fost insa caracterizat prin procent mai mare (75%) de cazuri la adolescenti si adulti, incidenta cea mai ridicata fiind inregistrata la 15-17 ani si 40-49 ani.

Initial difteria a urmat o evolutie sezoniera, aparand mai frecvent in anotimpul rece, din 1992 evolutia bolii nu mai respecta caractrul sezonier cunoscut; ea apare in tot cursul anului, numarul de cazuri raportate continuand sa creasca dramatic.

Formele clinice de manifestare ale bolii au fost clasice, de difterie faringiana si laringiana insotite de complicatii toxice in special la copiii si adultii neimunizati. Au fost semnalate in proportie de 9 –12,8 % din totalul cazurilor analizate si forme atipice de difterie asemanatoare cu angina sau faringita acuta, depistate numai in cadrul unor examene bacteriologice.

Difteria face parte din bolile cu transmitere respiratorie prin intermediul picaturilor Flugge. Un rol important in raspandirea bolii in acest context epidemiologic a avut personalul militar: in 1985 din totalul de 58 cazuri inregistrate in Kazahstan, 67% au fost in cadrul personalului din armata. De asemeni, cresterea morbiditatii prin difterie in Moldova in perioada 1990–1991 s-a datorat adolescentilor si persoanelor de 20-25 ani, membrii ai grupelor paramilitare, iar in 1992 –1993 incidenta crescuta a difteriei s-a inregistrat in randul trupelor militare care stationau in regiunea Kalinigrad. A fost incriminat de asemeni si personalul din transporturi si sectoarele alimentare. Un rol important in evolutia bolii l-a constituit factorul socio–economic. Cu toate masurile de limitare a infectiei difterice, de imunizare in masa a grupelor de populatie receptive, morbiditatea prin difterie in perioada 1996-1998 s-a situat intre 9,3 –0,98 0/0000 locuitori, indicele cel mai mare fiind la persoane de peste 15 ani.

2. Difteria In noile state independente.

Inca din 1990 a existat tendinta ca starea epidemica prin difterie sa evolueze si in alte state. Datele statistice au evidntiat faptul ca dupa 1991 , dar in special 1993, difteria se remarca in toate tarile independente, sunt de asemeni raportate cazuri de boala in unele tari din Europa, existand dovada unor conexiuni epidemiologice cu Federatia Rusa, Belarus si Kazakstan (Fig. 5).

Figura 5

Indicele de morbiditate prin difterie

În Federația Rusă și Noile State Independente în 1994

Difteria in Ucraina

In perioada 1970- 1989 numarul de cazuri de difterie raportate anual in Ucraina a fost de aproximativ 90-100. Dupa 1990 se consata o crestere rapida a incidentei bolii de la 109 cazuri in 1990 la 2990 (5,70/0000 ) in 1993. Difteria a fost raportata in toate regiunile, iar rata de incidenta a fost de doua ori mai mare in mediul urban decat in cel rural. In 1993, 34% din cazuri au fost raportate in trei zone: Kiev (570 cazuri), Harcov(311 cazuri) si Lwov (149 cazuri).

Numarul de decese a crescut anual de la 50 in 1991 la 68 in 1992 si 78 in 1993. Indicele de fatalitate a fost crescut in special in mediul rural. In timp ce adultii au reprezentat cea mai mare proportie, difteria a fost mult mai severa la copii (indicele de fatalitate 9,6%). Boala a aparut in special in sezonul rece (septembrie, octombrie, noiembrie), dar cazurile de difterie au fost inregistrate ca si in Federatia Rusa, pe parcursul intregului an.

Difteria in Moldova

Dupa o perioada de aproximativ 20 de ani in care morbiditatea prin difterie s-a situat la 0,10/0000, din 1990 s-au inregistrat cazuri sporadice in aproape toate teritoriile adminstrative ale Moldovei.

Boala a aparut atat la copii cat si la adulti cu un procent usor mai crescut la copiii sub 5 ani (58,8%). Cazurile de boala au fost semnalate in special in mediul rural, dar numarul de adulti bolnavi de difterie a fost mai mare in mediul urban.

Difteria in unele tari din Asia Centrala

Din 1993 difteria a evoluat in aproape toate celelalte state independente cu exceptia Armeniei si Turkmeni-stanului, iar in 1994 toate tarile din vecinatatea Federatiei Ruse au raportat cazuri de difterie intre 1 –31,8 0/0000, locuitori. Numarul cel mai mare de imbolnaviri a fost inregistrat in special in tarile din centrul Asiei si republicile transcaucaziene, in corelatie cu prezenta unui numar de populatie refugiata, cu conditiile de locuit improprii datorita conflictelor interne existente.

Pe primul loc s-a situat Tajikistanul in care numarul cazurilor raportate a crescut de la 680 in 1993 la 1970 (31,80/0000) in 1994; cele mai multe imbolnaviri au fost raportate in regiunile sudice vecine cu Afganistanul. Morbiditatea crescuta prin difterie s-a inregistrat si in Azerbaijan, Kirkistan. Georgia a raportat in 1994 un numar de 293 cazuri de difterie (5,4 0/0000), ceea ce reprezinta o crestere de 10 ori a morbiditatii fata de 1993, iar in Armenia care nu a avut difterie in perioada 1991 –1993 s-au inregistrat 36 imbolnaviri in 1994. De remarcat faptul ca aproximativ 50% din cazurile raportate in aceaste tari au aparut la persoane in varsta de peste 14 ani.

In prezent, datorita masurilor de supraveghere si control existente pe tot teritoriul fostei URSS, situatia epidemiologica este tinuta sub control, sunt raportate numai cazuri sporadice in Rusia, Ucraina si Moldova.

Concomitent cu episodul epidemic mentionat au mai existat cazuri de difterie in Finlanda si Tarile Baltice, Polonia, Turcia. De mentionat ca unele cazuri de difterie au aparut la persoane de 20-26 ani, vaccinate antidifteric corect in copilarie; de asemeni, majoritatea au vizitat sau au avut contacte cu persoane sosite din Ucraina sau Belarus.

Incepand cu 1993 au mai fost raportate cazuri de difterie de import in Germania (10),Bulgaria (4), Austria (1), SUA (3), toate in relatie epidemiologica directa cu actualul episod epidemic; majoritatea cazurilor au fost persoane adulte peste 20 ani, iar unele din ele subiecti cu nivel de protectie antidifterica > 0,1 UI/ml.

Cauzele situației epidemiologice din arealul epidemic

Potentialul epidemiologic mentionat a avut la baza un complex de factori care au determinat extinderea lui in numeroase tari din Europa si Asia. Cauzele majore care s-au evidentiat sunt: rata redusa de acoperire vaccinala a copiilor, reducerea imunitatii antidifterice in populatia adulta, miscarile masive de populatie observate in teritoriu in ultimii ani.

1.Rata redusa de acoperire vaccinala a copiilor

In Federatia Rusa rata de acoperire vaccinala a copiilor s-a redus de la 84% la 68% in peroada 1980-1990. Acelasi nivel redus se constata si in 1991 in special in orasele mari (Moscova ,St. Petesburg), unde indicele de acoperire atinge valorile cele mai reduse de 18-40%. Cu toate masurile sanitaro – epidemice luate, in 1994 acoperirea vaccinala a ramas redusa (<60%) in unele regiuni administrative. O situatie asemanatoare s-a inregistrat si in Ucraina, unde acoperirea vaccinala primarâ a copiilor cu DTP a scazut de la 85% in 1981 la 46-50% in perioada 1982-1987.

Lipsa de acoperire vaccinala a condus la o proportie crescuta de copii neprotejati antidifteric, care au constituit nucleul de populatie susceptibila, pe fondul caruia s-a dezvoltat actualul proces epidemiologic.

La aceasta situatie a contribuit o serie de factori:

– existenta unei liste excesive de C.I. pentru DTP (aproximativ 50), determinand pe multi pediatri sa nu recomande imunizarea sau sa utilizeze pentru vaccinarea primara a copiilor doze antigenice reduse de anatoxina difterica (Ucraina, Federatia Rusa, Moldova);

– insuficienta informare a publicului general asupra consecintelor bolii si beneficiilor imunizarii, lipsa de incredere din partea acestuia in personalul sanitar si eficacitatea vaccinarii, exagerate si de mass- media;

– cadre de specialitate insuficiente sau insuficient pregatite.

2. Al doilea factor important l-a consituit cresterea susceptibilitatii populatiei adulte pentru difterie. Scaderea imunitatii antidifterice, la persoanele peste 20 de ani in Ucraina si Federatia Rusa, lipsa unor masuri adecvate pentru corectarea situatiei imunitare, a contribuit la accentuarea nucleului de persoane susceptibile la raspandirea bolii la toate grupele de varsta. De fapt, actualii adulti neprotejati sunt fostii copii si adolescenti nevaccinati sau incorect vaccinati in anii anteriori.

3. Al treilea factor implicat este reprezentat de deplasarile mari de populatie in cadrul NIS care au facilitat raspandirea infectiei pe un teritoriu atat de vast. Migrarea populatiei spre Moscova si St. Petersburg si alte orase mari a avut o contributie importanta in cresterea morbiditatii prin difterie in zonele mentionate.

In aspectul evolutiv al difteriei in perioada 1990-1994 pot fi incriminati si alti factori:

4. Modificari probabile ale agentului cauzal sau ale toxinogenezei sugerate de analiza genetica a tulpinilor de C. diphtheriae toxinogene implicate in cazurile de boala.

5. Implicarea altor factori de virulenta ai bacilului difteric (cord factor, antigenele K).

6. Absenta sau insuficienta supraveghere a bolii si a agentului patogen, determinata de existenta unor focare multiple de boala greu de urmarit sau de dotarea insuficienta a laboratoarelor de microbiologie.

7. Cunoasterea insuficienta a simptomatologiei difteriei in special de catre cadrele sanitare tinere, determinand intarzieri in aplicarea primului ajutor medical; in St. Petersburg 88% din cazurile de boala au fost spitalizate dupa 4-10 zile de la aparitia simptomelor.

8. Eventuala reducere a potentei vaccinurilor, infirmata de studiile efectuate la Kiev si Moscova.

C.ELIMINAREA DIFTERIEI SI

M~SURI CARE SE IMPUN

In planul de masuri pentru difterie recomandat de OMS in 1994 se prevede eliminarea formelor indigene de difterie respiratorie pana in anul 2000. Exista anumiti factori favorizanti care sustin aceasta idee:

– omul este gazda majoritara a agentului patogen al bolii C. diphtheriae tox+;

– exista mijlocul cel mai eficace de stopare a evolutiei morbiditâtii, vaccinarea cu anatoxina difterica;

– difteria este o boala cu evolutie sezoniera, transmiterea ei putand fi intrerupta;

Aspectele epidemiologice actuale mentionate au demonstrat insa existenta altor factori care impiedica pentru moment, dar posibil si in viitor eliminarea difteriei:

1. difteria, departe de a fi rezolvata, ramane o problema de actualitate atat prin prezenta starilor endemice si epidemice care determina prezenta circulatiei C. diphtheriae tox+, cat si prin existenta unei mase de populatie susceptibile la infectia difterica: copii, adolescenti si adulti;

2. actuala situatie de deschidere a granitelor permite contacte frecvente cu diverse zone din lume; ca urmare, exista posibilitatea unei circulatii internationale a tulpinilor de C.diphtheriae tox+ , cu aparitia difteriei de import sau reluarea ciclului evolutiv al difteriei prin grupele de populatie susceptibila;

3. prezenta starii de purtator sanatos asimptomatic sau a infectiilor blande paucisimptomatice, ca si prezenta tot mai crescuta a infectiilor cutanate cu C. diphtheriae (Asia de Sud-Est, Kenya, India, Bangladesh) constituie un mijloc efectiv de diseminare a microrganismului in colectivitate.

4. existenta unor factori socio – economici favorizanti (alcoolici, toxicomani, homosexuali) sau a unor maladii cu consecinte asupra sistemului imunitar (HIV) in continua dezvoltare in perioada actuala, care influenteaza evolutia bolii, dar si implicarea agentului patogen in unele infectii invazive.

5. nu se cunoaste realul potential patogen al tulpinilor C. diphtheriae netoxigen, dar semnalarea acestora in forme moderate " diphtheria like " sau chiar in unele forme clasice de difterie, asa cum s-a mentionat, pun in discutie probleme importante de solutionat: rolul componentelor peretelui bacterian in evolutia acestor manifestari clinice, necesitatea altor preparate profilactice cu rol in potentarea imunitatii antitoxice.

6. vaccinarea antidifterica; exclusiv antitoxica, este capabila sa elimine difteria clasica, sa combata sau sa atenueze complicatiile post infectie; ea nu poate suprima circulatia agentului patogen al difteriei si este limitata in timp.

Datorita acestor considerente, pentru mentinerea sub control a difteriei si pentru posibila eliminare in viitor sunt necesare urmatoarele masuri:(OMS 1994)

– acoperirea vaccinala a populatei receptive (95% in primii 2 ani de viata);

– mentinerea unui nivel de imunitate antidifterica de minimum 90% la copii si 75% la adulti;

– supravegherea bolii, a circulatiei tulpinilor de C. diphtheriae toxigen .

3. SUPRAVEGHEREA DIFTERIEI

IN ROMANIA

-contributii personale-

Situatia creata de evolutia difteriei in tari din Europa si Asia a constituit un semnal pentru reevaluarea si reactualizarea planului national pentru controlul difteriei in Romania.

In conditiile in care in tara noastra nu au mai fost inregistrate cazuri de difterie din 1989, masurile de sanatate publica trebuie sa mentina principalele parghii care au condus la aceasta situatie epidemiologica:

– controlul nivelului de imunitate antidifterica;

– supravegherea circulatiei agentului patogen al bolii.

A. Controlul nivelului de imunitate antidifterica

Metode de investigare

Controlul nivelului de imunitate – nivelul antitoxinei difterice in sange – s-a realizat prin o metoda de neutralizare "in vivo" (Jensen) pe iepure, care are valoare de referinta, dar este scumpa si accesibila numai Centrului National de Referinta si deasemeni prin metode "in vitro": Elisa, RIA, culturi celulare, Latex aglutinare sau R.H.A.P. (reactia de hemaglutinare pasiva). Singura metoda "in vitro" standardizata in prezent in Romania este metoda R.H.A.P., avand valoare de screening in investigatiile de masa.

Metoda Schick, larg utilizata in anii anteriori, in prezent nu mai este recomandata. S-a inlaturat astfel necesitatea deplasarii unor medici specialisti pentru interpretarea precisa a reactiei si s-a redus riscul aparitiei unor afectiuni periculoase datoritâ contaminârii prin sange.. Mai mult, in testul RHAP nu se mai modifica statusul imun preexistent al subiectilor investigati, permitand astfel eventual, repetarea investigatiilor serologice pentru nivelul de imunitate.

Testul RHAP (anexa 1) se bazeaza pe aglutinarea hematiilor sensibilizate (cuplate) cu anatoxina difterica, de catre anticorpii (antitoxinele) existente in serul persoanelor investigate .

Inainte de efectuarea reactiei toate serurile sunt diluate 1/10 cu o solutie de tampon-fosfat salin si inactivate , (cu exceptia serului pozitiv de referinta), 30'/560 la bain marie, pentru indepartarea activitatii complementului.

Anexa 1

SCHEMA EXECUT~RII REACTIEI DE H.A.P.

Agitare. Citire dupa 2 ore , la temperatura laboratorului.

Testul se realizeaza in placi de polistiren cu godeuri, bine spalate anterior, dar fara detergent. Este destinat cate un sir de godeuri (longitudinal) pentru fiecare ser de controlat, inclusiv pentru serul martor pozitiv (de referinta) sau negativ, marcandu-se corespunzator sirurile pe placa.

Se realizeaza apoi o dilutie 1/20 – 1/10 240 a serurilor de investigat in volum final de 0,2 ml.

Astfel, in toate godeurile se repartizeaza cate 0,2 ml diluent si apoi in primul godeu al sirului se adauga 0,2 ml din ser diluat anterior 1/10. Se trec cate 0,2 ml din primul godeu in al doilea godeu si asa mai departe prin cele 8 godeuri ramase. In ultimul godeu o cantitate de 0,2 ml se arunca.

Se adauga apoi in fiecare godeu cu dilutii cate 0,02 ml hematii sensibilizate utilizand o pipeta calibrata.

Se omogenizeaza continutul godeurilor prin percutii usoare aplicate placii si apoi se lasa in repaus pe masa, la temperatura camerei, timp de 2 ore, dupa care se citesc rezultatele reactiei.

Pentru interpretare, in reactie se utilizeaza 3 martori:

1 dilutie x martor pozitiv: 0,2 ml ser de referinta plus 0,2 ml diluent, plus hematii sensibilizate 0.02 ml, dupa ce s-au aruncat 0,2 ml din godeu;

b) 4 dilutii x martor negativ 0,2 ml ser normal de iepure dilutie 1/10 plus 0,2 diluent, in primul tub realizandu-se apoi dilutiile 1/20,1/40 si 1/160, plus cate 0,02 ml hematii sensibilizate in fiecare godeu, dupa ce din ultimul godeu s-au aruncat 0,2 ml;

c) 1 x martor hematii : 0,2 ml diluent plus 0,02 ml hematii sensibilizate.

Acesti martori permit sa se aprecieze daca reactia executata a fost corecta. Martorul pozitiv trebuie sa ofere o aglutinare completa, la martorul negativ reactia de aglutinare trebuie sa lipseasca, iar la martorul hematii nu trebuie sa apara o liza a hematiilor sau o aglutinare a lor daca hematiile sensibilizate au fost pregatite corect.

In cazul unei reactii specifice pozitive hematiile se depun pe fundul godeului sub forma unui val subtire (fin) cu margini netede sau dintate. In cazul unei reactii negative hematiile se depun pe fundul godeului sub forma unui inel sau buton.

– cu +++ se noteaza aglutinarea completa;

– cu ++ se noteaza o aglutinare partiala (val fin plus inceput de inel);

– cu + se noteaza un inel vizibil cu contur mai mare si mai putin net fata de martorul negativ.

Titrul RHAP este dat de ultima dilutie de ser la care se noteaza o aglutinare cu +.

Asa cum s-a mai precizat, in Romania un titru protector de antitoxina difterica, exprimat prin metoda Jensen in unitati internationale (UI/ml) este de 0,03 UI/ml.

Un titru RHAP <1/20 este < 0,03 UI/ml, deci este neprotector .

Un titru de 1/640 este considerat egal cu 0,03 UI/ml, deci este un titru protector la limita.

Un titru RHAP peste 1/640 este considerat un titru sigur protector.

Serurile cu un titru 1/20 – 1/320 sau in situatii discutabile se trimit la Institutul Cantacuzino pentru testul de referinta Jensen.

Asigurarea nivelului de protectie antidiftericâ în România

Pentru a putea evalua nivelul de protectie antidifterica in tara noastra am abordat studiul a 489 seruri provenite de la subiecti intre 1 si 70 ani, din diferite judete pe care le- am investigat prin metoda "in vitro" RHAP. Pentru 96 de seruri din acest lot, de la subiecti de toate varstele si din toate judetele, investigarea s-a facut in paralel atat prin RHAP cat si prin metoda "in vivo" pe iepure Jensen.

Material si metode

– toxina difterica test Institutul Cantacuzino;

– truse "Imuno – Diftero – Test Institutul Cantacuzino";

– iepuri albi Newzeeland (2500- 2800 gr.);

– seruri recoltate de la subiecti 1–70 ani din toate judetele tarii;

– semnificatia diferentelor dintre repartitiile de frecventa ale subiectilor "protejati" si "neprotejati" obtinute prin testul RHAP comparativ cu testul Jensen a fost evaluata pe baza testului statistico – matematic "".

Rezultate:

Rezultatele obtinute in estimarea nivelului de imunitate antidifterica la subiecti în varsta de (1-70 ani) indiferent de antecedentele vaccinale (care nu reprezinta un ghid sigur pentru imunizarea fata de difterie) au permis obtinerea unui procent mediu de protectie antidifterica de 87,12% ( Tabelul 3, figurile 6 si 7).

Nivelul de imunitate antidifterica a variat in functie de grupa de varsta studiata. De asemeni se observa o diminuare partiala si progresiva a nivelului de imunitate odata cu inaintarea in varsta.

Trebuie reamintit totusi ca in Romania ultimul rapel al vaccinarii antidifterice se efectueaza la 14 ani si ca in tara noastra nu se practica rapeluri la adulti decat in anumite situatii particulare sau in colectivitati de risc.

Pentru adulti, valorile cele mai ridicate de susceptibilitate fata de difterie s-au inregistrat in a 6a decada de viata – 25,59% si a7a -27,50%, iar la copii grupele 1-4 ani (12,5%) si 5-7 ani (11,91%).

Aceste procente de neprotejati la copii indica nerespectarea programului de vaccinari la nivelul unitatilor sanitare, deci existenta unor copii scapati de la vacinare sau vaccinati incomplet.

Prin comparatie, un nivel inalt de imunitate se inregistraza la copii si tineri, in special dupa rapelurile 3 si 4, rezultatele fiind comparabile si in alte tari.

Rezultatele investigarii unor seruri prin metodele RHAP si Jensen (tabelul 4) sunt in general comparabile.

Statistico-matematic valoarea calculata de 3,34, demonstreaza ca nu exista diferente semnificative intre rezultatele obtinute (protejati si neprotejati) in determinarile paralele prin Jensen si RHAP.

Tabel 3

Rezultatele obtinute la determinarea antitoxinei

difterice prin RHAP* si TN**

* RHAP = reactia de hemaglutinare pasiva

** TN= testul de neutralizare "in vivo" (Jensen)

Fig. 6

SUSCEPTIBILITATEA FAT~ DE DIFTERIE

– PE GRUPE DE VARST~ –

Figura 7

Tabelul 4

Rezultatele obtinute din determinari paralele

prin testul de neutralizare "in vivo" (Jensen) si RHAP

Tabelul 5

Semnificatia statistica dintre repartitia de frecventa intre "Protejati" si "Neprotejati" fata de difterie obtinuta in determinarile paralele prin Jensen si RHAP

-Testul statistic 2-

B. SUPRAVEGHEREA CIRCULATIEI AGENTULUI PATOGEN AL BOLII

Alaturi de asigurarea si controlul programului national de vaccinare in stransa relatie cu contextul epidemiologic existent in tara sau in zonele invecinate, un element major in supravegherea difteriei il constituie controlul C. diphtheriae in unitati sanitare din Romania. In aceste scop am investigat in anii 1997 si 1998 un numar de 19 colectivitati din 13 judete ale tarii.In total au fost recoltate si analizate 6200 exudate nazo faringiene.

Metode de diagnostic

Etapele diagnosticlui bacteriologic constau in :

1. prelevarea produsului patologic si izolarea agentului patogen;

2. identificarea tulpinilor izolate;

3. testarea toxinogenezei;

4. tipizarea tulpinilor de C. diphtheriae identificate.

1.Prelevarea produsului patogen si izolarea agentului patogen. S-a efectuat sub control vizual al leziunii, respectand conditiile generale pentur prelevarea produsului patologic. Pentru determinarea circulatiei C. diphteriae la purtator, s-a recoltat cate un tampon din nas si gat. Tampoanele au fost insamantate pe medii specifice in doua ore de la prelevare.

Pentru izolarea agentului patogen au fost utilizate urmatoarele medii:

– mediul de imbogatire OST;

– geloza sange;

– mediile selective: Tinsdale modificat si Gundel Tietz

– mediul nutritiv si de stocare Loeffler;

Mediile au fost insamantate conform conduitei de izolare redata in Fig.8 coloniile caractristice, aparute pe medii de cultura incubate 24-28 ore la 370 sunt repicate pe mediul Loeffler in vederea identificarii.

2. Identificarea C. diphtheriae s-a efectuat pe baza urmatoarelor teste:

2.1. Teste preliminare de identificare:

Aspectul morfologic microscopic (frotiu colorat Gram): C. diphtheriae este bacil Gram pozitiv la limita, cu tendinta de decolorare la unele tulpini, avand dimensiuni de 3-8 microni lungime si 0,5 microni grosime; sunt usor incurbati, polimorfi, cu dispozitie caracteristica ( V, L, Y sau "litere chinezesti"); prezinta inegalitate tinctoriala datorita prezentei corpusculilor metacromatici.

Aspectul morfologic cultural pe medii conventionale

Pe mediul Gundel Tietz (geloza – sange – cistina telurit): C. diphtheriae gravis apare sub forma de colonii plate, de 1-2 mm, cu marginile crenelate, cu striatii radiale si suprafata granulara; coloniile sunt negre cenusii, sau negre cu marginea transparenta; cand colonia este bine izolata si dezvoltata aspectul ei este de margareta.

Figura 8

C. diphtheriae intermedius, se prezinta sub forma de colonii de marime variabila, aspect plat si centrul mamelonat; marginile sunt circulare cu suprafata granulara sau lucioasa; coloniile sunt negre, iar marginea lor este transparenta.

C. diphtheriae mitis sunt de marime variabila, convexe, cu margine circulara, suprafata lucioasa si consistenta cremoasa; prin invechire coloniile devin mai plate cu suprafta mai granulara.

Pe mediul Tinsdale modificat (geloza- ser- cistina- telurit – thiosulfat)

C. diphtheriae, indiferent de biotip, se dezvolta sub forma de colonii mici, negre cenusii, cu halou cafeniu bine delimitat.

Pe geloza -sange aspectul coloniilor este asemanator cu caracteristicile culturale descrise pe mediul Gundel Tietz; coloratia coloniilor este insa alba – gri perle, din cauza absentei sarurilor de telur.

Variantele de C. diphtheriae gravis si mitis pot sa prezinte o zona redusa de hemoliza, insa producerea de hemolizina este caracter variabil in cadrul speciei C. diphtheriae si nu are valoare taxonomica.

2.2.Teste pentru confirmarea C. diphtheriae

– testul catalazei;

– testul ureazei ( pe mediu Black Christensen);

– testul cistinazei ( pe mediu Pisu);

– teste pentru evidentierea hidrolazelor pentru glucoza, zaharoza, dextrina si glicogen (pe mediul Hiss cu indicator Andrade).

Testele mentionate au permis identificarea C. diphtheriae in 24-48 ore dupa incubare la 370 . Schema de identificare utilizata este evidentiata in tabelul 6.

3. Testarea toxinogenezei

Este etapa importanta in cadrul diagnosticului C. diphtheriae prin care sunt evidentiate tulpinile toxigene de bacil difteric. Exista numeroase teste pentru decelarea capacitatii tulpinilor de C. diphtheriae de a produce toxina difterica: teste "in vivo" pe cobai sau iepure, teste "in vitro" (Elisa, CIA, western-blot, teste pe culturi celulare) sau teste moleculare de decelare a genei tox+ (reactia de amplificare enzimatica PCR).Testul utilizat pentru decelarea toxinogenezei la tulpinile analizate este testul clasic "in vitro" Elek.

Materiale necesare :

– placa cu mediu Elek;

– cultura pe Loeffler de 24-48 ore la 370;

Tabel 6

Schema minima de diagnostic

pentru identificarea C. diphtheriae si C. ulcerans

– ser antidifteric nefenolat;

Tehnica de lucru:

Pe placa cu mediu Elek se decupeaza un sant cu dimensiunile de 7/0,5 cm pe diametrul placii. Dupa indepartarea gelozei din sant, se introduc 0,5 ml ser antidifteric nefenolat (antitoxina difterica): placa se lasa la termostat cu capacul intredeschis aproximativ doua ore pentru difuzia serului, dupa care santul se plombeaza cu geloza simpla.

Insamantarea se face cu cultura de 24-48 ore de pe Loeffler in striuri perpendiculare pe santul care contine antitoxina. Obligatoriu testul se practica in prezenta unui martor, o tulpina de C. diphtheriae tox+.

Placile sunt incubate 24-48 ore la 370.

Apartia unei linii de precipitare in unghiul format de linia de cultura si santul care contine antitoxina induce o reactie pozitva: C. diphtheriae toxigen.

4. Tipizarea tulpinilor de C. diphtheriae

A fost efectuata in scop epidemiologic prin doua metode de investigare.

4.1.Lizotipia este o metoda conventionala de tipizare; logica; utilizand suspensii fagice din setul original si aditional, au fost stabilite lizotipurile circulante din judetele analizate. Identificarea s-a efectuat conform schemelor de tipizare originale si aditionale.

4.2. Ribotipia este o metoda moleculara de tipizare care evidentiaza profilul de restrictie al genelor care codifica ARN ribozonal 16 si 23 S. Aceasta metoda poate sa discrimineze tulpinile de C. diphtheriae in cadrul aceluiasi lizotip.

AND-ul tulpinii de C. diphtheriae extras si purificat dupa metoda fenol- cloroform- alcool izoamilic (25:24:1) a fost digerat cu PSU II (GIBCO, BRL), iar fragmentele generate, separate prin electroforeza si transferate pe membrana N+ ( Amersham) au fost hibridizate cu ARNr marcat cu acetyl – amino-fluorena.

Profilul de restrictie si distanta genetica au fost analizate pe computere utilizand programul Taxotron (I. Pasteur, Paris).

ASPECTE ALE CIRCULATIEI C. DIPHTHERIAE IN PERIOADA 1997,1998

Din totalul de 6200 exudate naso-faringiene au fost izolate in anii studiati, 307 tulpini de bacil difteric, toate netoxinogene. Indicele de izolare a fost de 3,34 %.

Analizand circulatia C. diphtheriae in cele 19 colectivitati inchise investigate, se remarca predominanta biotipului intermedius (83,41 % in 1997 si 90,35 % in 1998) din totalul tulpinilor identificate – tabelele 7,8- .

In cadrul biotipurilor intermedius incidenta mai mare a avut llizotipul V cu variantele sale; raportat la totalul tulpinilor de C. diphtheriae intermedius netoxigen diagnosticate, procentul de izolare a lizotipului V cu variantele sale este de 96,27% in 1997 si 96,12% in 1998.

Privind biotipul gravis, in cei doi ani studiati, observam o incidenta mult mai redusa fata de biotipul intermedius, respectiv 14.5 % in 1997 si 9,65 in 1998. Majoritatea tulpinilor C. diphtheriae gravis netoxigene sunt lizorezistente.

In judetele Cluj, dar in special Tulcea au fost izolate din acelasi produs patologic asocieri de C. diphtheriae intermedius netoxigen si C. diphtheriae ulcerans .De asemeni, unele tulpini de C. diphtheriae gravis netoxigene L si intermedius netoxigene lizotip ls 34 au fost identificate la purtatori cu faringo amigdalita pseudomembranoasa. Portajul cu C. diphtheriae mentionat a fost in general la copii din colectivitati inchise; in unele situatii au existat purtatori sanatosi de bacil difteric in cadrul personalului de ingrijire din colectivitate.

Coreland frecventele de izolare cu judetele investigate, remarcam un procent mai ridicat al bacilului

Tabel 7

Circulatia c. diphtheriae in 1997

* ls lizosensibil

** LR lizorezistent

Tabel 8

Circulatia C. diphtheriae in 1998

* ls lizosensibil; ** LR lizorezistent

difteric netoxigen in judetele Braila (atat in 1997 cat si in 1998) si Constanta (numai in 1997).

Repartizarea geografica a lizotipurilor identificate (figura 9 ) permite urmatoarele observatii:

– lizotipul V cu variantele sale este reprezentat in 12 din cele 13 judeta investigate;

– lizotipul VI a fost izolat numai in judetul Tulcea;

– lizotipul L este prezent in patru judete:Neamt, Bacau, Mehedinti, Prahova;

– tulpini lizorezistente se remarca in opt din judetele cercetate; aceasta semnifica o distributie aproape unifoma a tulpinilor rezistente in teritoriu si este in relatie cu suspensiile fagice din schemele de lizotipie utilizate pentru tipizare;

– remarcam in ultimii ani tendinta de constituire a unor noi tipuri fagice. In acest sens, mentionam C. diphtheriae intermedius netoxigen lizotip V ls 34 ad si C.diphtheriae intermedius netoxigen lizotip V ls 5,34 ad. Daca aceste tipuri fagice au existat initial intr-un singur judet (Braila), in prezent sunt izolate in zece judete din tara.

Datele mentionate au fost confirmate de rezultatele obtinute prin ribotipie (Tabel 9). Studiul genetic efectuat la 22 tulpini C. diphtheriae netoxigene provenite de la

Tabel 9

Aspecte comparative ale tipizarii C. diphtheriae prin lizotipie si ribotopie

*ls= lizosensibi

lpurtatori a demonstrat ca tulpinile intermedius lizotip V ls 34 ad apatin la doua ribotipuri: majoritatea C14 si o tulpina C4. Aceste ribotipuri sunt total diferite fata de ribotipurile identificate in cadrul tulpinilor intermedius lizotip V. La acest lizotip au fost evidetiate ribotipurile C6,8,9,13.

Tulpinile C. diphtheriae gravis netoxigen L sunt subdivizate in ribotipurile C3, C5,C11,C12, C13 iar la C. diphtheriae gravis netoxigen lizotip VI in ribotipul C7 si C15. Frecventa mai mare a ribotiporilor in cadrul aceluiasi lizotip este justificata de discriminarea mai larga la nivel genetic, in cadrul metodelor moleculare de tipizare.

4. DISCUTII SI CONCLUZII

Semnalata pentru prima data in Romania in 1868, difteria a evoluat in relatie directa cu situatia epidemiologica din Europa si cu etapele de dezvoltare si aplicare a profilacticelor difterice.

Daca in timpul Primului Razboi Mondial morbiditatea prin difterie se situa la 117 0/0000, introducerea in profilaxie a ADN (1929) precum si legiferarea in 1934 a obligativitatii vaccinarii copiilor intre 1-10 ani, au condus la scaderea rapida a curbei de morbiditate pana la valori de 10,90/0000 in 1945 si 6,40/0000 in 1955.

Cand programul de imunizare nu a avut amploarea si continuitatea necesara, iar calitatile antigenice ale profilacticelor difterice au fost insuficiente, scaderea morbiditatii a pastrat un caracter inconstant, cu alternante anuale situate intre 10,9– 16,5 0/0000. Introducerea in profilaxie a vaccinurilor purificate si adsorbite (ADPA – 1955, BIVACCIN – 1960, TRIVACCIN – 1961), si elaborarea planului de eliminare a difteriei in perioada 1961- 1962, au avut drept consecinta o scadere continua, progresiva a morbiditatii pana la valori de 0,10/0000 in 1964 si 1965.

Din aceasta perioada in Romania au fost inregistrate numai cazuri sporadice de boala, incidenta anuala fiind de 0,10/0000, exceptand anii 1967,1968. Din 1989 nu au mai fost inregistrate cazuri de difterie pe teritoriul tarii.

In paralel cu scadereea morbiditatii, curba de mortalitate prin difterie a avut o evolutie descendenta pana la 0,040/0000 in 1969, cu mici cresteri in anii urmatori, corespunzator aparitiei cazurilor sporadice de boala.

Actuala situatie epidemiologica a fost determinata de :

– asiguratea unui nivel de imunitate antidifterica cuprins intre 81,59% – 94,64% prin urmarirea stricta a realizarii planului national de vaccinari, conform schemelor de imunizare recomandate de Ministerul Sanatatii.

– prezenta in circulatie a tulpinelor C. diphtheriae toxigene si a focarelor de purtatori C. diphtheriae intermedius toxigen 5, 17 (in colectivitati) care nu au produs niciodata cazuri de boala in tara noastra, permitand numai imunizarea oculta a populatiei receptive;

– existeta unui sistem riguros de supaveghere a difteriei si a bacilului difteric.

Datele obtinute in estimarea nivelului de imunitate antidifterica (pe esantionul studiat ) evidentiaza in prezent un nivel mediu de 87,12%, procent aflat insa sub limita admisa de OMS (90%). Se constata deasemeni existenta unor procente de susceptibilitate fata de boala de 12,5% intre 1 si 4 ani si 11,91% la grupa de varsta 5-7 ani. Aceste rezultate confirma persistenta unor deficiente anuale in realizarea programelor de imunizare, cu existenta unor goluri de vaccinare ("buzunare de nevaccinati") la nivelul institutiilor sanitare din tara.

Reamintim ca in Romania ultimul rapel cu bivaccin (VCDT) se efectueaza la varsta de 14 ani. Ca urmare a diminuarii progresive a imunitatii antidifterice in paralel cu cresterea intervalului de timp de la ultima revaccinare, in randul populatiei adulte se constata persoane susceptibile la infectia difterica. Din investigarea efectuata a rezultat ca la grupele de varsta peste 50 de ani, nivelul de protectie antidifterica este sub limita admisa de OMS de 75% (25,59% si 27,5% persoane neprotejate la 51-60 ani, respectiv 61-70 ani).

Este cunoscut faptul ca raspunsul imun antitoxic este intarit si mentinut de stimularea imuna naturala. Reducerea substantiala a C. diphtheriae si dispatitia focarelor de purtatori toxigeni ( C. diphtheriae intermedius tox+ 5, 17), frecvent intalnite anterior pe teritoriul tarii a contribuit in egala masura la aparitia grupelor mentionate de persoane susceptibile la infectia difterica.

Fenomenul mentionat va constitui si in viitor factor de diminuare a imunitatii antidifterice, in absenta unor masuri de corectare a situatiei imune. Aceasta datorita disparitiei cazurilor de boala din Romania, reducerii circulatiei C. diphtheriae (194 tulpini izolate in 1997 si 114 in 1998) si absenta bacilului difteric toxigen.

Asa cum a fost mentionat, in prezent in Romania persista in circulatie numai C. diphtheriae netoxigen. Acest fenomen de crestere a numarului de tulpini netoxigene este explicat de A.M. Pappenheimer prin tendinta de diminuare a proprietatilor toxigene ale bacilului difteric, de " saprofitizare " in conditiile circulatiei intr-o colectivitate vaccinata.

S-a inregistrat disparitia lizotipurilor toxigene, unele din ele incriminate in cazuri de boala:XIV, XIV def, XVI si IX (considerat epidemiogen pentru Romania).

Se inregistreaza insa prezenta a doua lizotipuri netoxigene, V si L, predominant fiind lizotipul V, precum si particularitati de sensibilitate complementara la tipurile fagice cunoscute. Acestea pot fi considerate noi lizotipuri, iar implicarea lor in patogenie nu este suficient cunoscuta.

Au fost inregistrate insa cazuri de amigdalita acuta membranoasa la care s-a izolat C. diphtheriae netoxigen lizotip V ls 34 sau C. diphtheriae gravis L.

In investigatiile efectuate, in procent de 11,7% au fost izolate tulpini de C. diphtheriae lizorezistente, fapt observat de mai multi ani in Romania, care poate sa fie explicat prin modificarile fagilor endogeni lizogenizati.

Datele acumulate ne-ar putea permite sa afirmam ca in Romania este posibila eliminarea difteriei in viitorii ani. Prezenta insa a “buzunarelor de nevaccinati” si extinderea lor reprezinta un rezervor permanent pentru reemergenta bolii.

Rezultatele prezentate in relatie cu Romania si aspectele evolutiei epidemiologice ale difteriei in lume permit urmatoarele concluzii:

1. Desi Romania este tara limitrofa cu recenta zona epidemica din Estul Europei, difteria ca boala este mentinuta sub control, ramanand ca o problema permanenta de sanatate publica prin masurile de prevenire si control care se impun.

2. Neanregistrarea unor cazuri de difterie dupa 1989 a fost determinata esential de asigurarea unui nivel de imunitate antitoxica antidifterica in populatia receptiva cu valori ce depasesc 80% persoane imunizate.

3. Existenta unor abateri in aplicarea si controlul programului national de imunizare evidentiat in lucrare, dar si in datele Ministerului Sanatatii, sustin ideea prezentei in teritoriu a "buzunarelor de neprotejati" , varstele cele mai periclitate fiind 1-6 ani. In acelasi timp identificarea unor grupe de adulti peste 50 ani susceptibili la boala justifica necesitatea respectarii actualei scheme de imunizare antidifterica recomandata de Ministerul Sanatatii in 1994.

4. In Romania nivelul minim de protectie antidifterica admis este de 0,03 UI/ml. Tinand cont de raportarea unor cazuri de difterie la persoane vaccinate cu nivel de protectie mai mare de 0,1 U.I/ml, se impune necesitatea respectarii recomandarilor OMS privind noile valori de nivel de imunitate care asigura protectia de lunga durata.

5. Desi in prezent difteria in Romania este mentinuta sub control, lipsa unei acoperiri vaccinale corespunzatoare, existenta unui nivel de imunitate antidifterica sub limitele admise de OMS in special la copii, diminuarea procesului de imunizare naturala, consecinta a diminuarii circulatiei bacilului difteric si raportarea unor cazuri suspecte de boala neconfirmate bacteriologic conduc la posibilitatea reaparitiei difteriei in viitor.

6. Eliminarea bolii poate sa fie obtinuta numai in cazul indeplinirii urmatoarelor obiective:

– respectarea programului national de imunizare;

– intensificarea masurilor de control in aplicarea programului de vaccinare, astfel incat nivelul de imunitate antidifterica in populatia infantila sa depaseasca 90%, iar pentru adulti 75%;

– supravegherea in continuare a circulatiei agentului patogen cu izolarea si sterilizarea purtatorilor de bacil difteric toxigen; este necesar controlul pentru C. diphtheriae atat in afectiuni cutanate, cat si ORL in vederea obtinerii informatiilor necesare actiunilor de prevenire a difteriei.

BIBLIOGRAFIE

Andronescu C, Diaconescu A, Aspecte ale circulației bacilului difteric în prezentul context epidemiologic, A II-A Consfătuire Națională de Epidemiologie, 5-6 mai 1993; Bacteriologia. Virusologia. Parazitologia. Epidemiologia. 1993; 38:1-2; 63

Calab G., Petreanu R., Sănică E., Stoina C., Niveau d’immunite antidiphterique de la population de differents groups d’age dans la periode d’eradication de la diphterie en Roumanie, Arch. Roum. Path., Exp, Microbial 29, 1970

Cellesi C., Zanchi A., Michelangeli C. , Giovannoni F, Immunity to diphtheria sample of adult population from central Italy, Vaccine, 1989

Clements C., Diphtheria immunity in New Zealand children , The New Zealand Med. J. 710, 1982

Communique OMS, La diphterie dans l’ex URSS; L’epidemie continue: 10 septembre 1993/70

Diaconescu Angela, Andronescu C., Studiul nivelului de imunitate antidifterică în populația adultă în relație cu circulația C. diphtheriae, Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 1991; 50; 4; 291

Diaconescu Angela, Imunitatea antidifterică, premiza pentru optimizarea schemei de imunizare actuală, Sesiunea științifică anuală, I.C. 29-30 XI 1993

Dixon S.M.J., Diphtheria in North America, J. Hyg. , Comb., 1984; 93 :419-432

Duffy J. , A History of Public Health in New York City 1866-1966, New York, Russell Sage Foundation, 1974; 154-155

Durbacă Steliana, Suban R., Ulmeanu V., Antidiphtheria and antitetanus immunity in various age group (0-70 years) in Romania, Rom Arch, Microb. Immunol., T. 57, n.1, 1998

Durbacă Steliana, Stoean Cecilia, Investigation concerning the possibility to replace the Schick test by the passive haemagglutination reaction for evaluating the diphtheria immunity level in population, Rom. Arch. Microbial Immunol., T. 51, n.3, 1992

Durbacă Steliana, Roșianu Aneta, Utilizarea de sânge capilar absorbit pe hârtie de filtru pentru evaluarea imunității antidifterice și antitetanice în supravegherea sero-epidemiologică, Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, 1-2, 1992

English C.P., Diphtheria and Theories of Infection Disease: Centennial Appreciation of the Critical Role of Diphtheria in the History of Medicin, Pediatrics, 1985; 76:1-8.

EXPANDED PROGRAMME ON IMMUNIZATION, Feasibility of elimination of vaccine-preventive diseases, Weekly Epidem, Rec. 1984; 59: 143-145.

EXPANDED PROGRAMME ON IMMUNIZATION, Tendance des maladies cibles du PEV en Europe, Weekly Epidemiol. Rec. 1988; 63:12:81-88

EXPANDED PROGRAMME ON IMMUNIZATION, Surveillance locale Philippines, Weekly Epidemiol. Rec. 1988; 63: 21: 153+160.

EXPANDED PROGRAMME ON IMMUNIZATION, Lutte contre la diphterie et la rougeole, China, Weekly, Epidemiol. Rec., 1988; 63, 30: 225-232.

EXPANDED PROGRAMME ON IMMUNIZATION, Diphtheria epidemic, Ucraine, Weekly Epidemiol. Rec. !994; 69: 253+258.

THE E.P.I. IN THE EUROPEAN REGION OF WHO, Plan of action for the prevention and control od Diphtheria in the European Region (1994-1995); Copenhaga, 1994.

GALAZKA A., ROBERTSON E.S., Diphtheria: Changing patterns in the developing world and the industrialized world, European J. of Epidemiol. 1995; 11:107-117.

GALAZKA N.A., Changes in the epidemiology of diphtheria in developing and Industrialized countries, Proceedings of the first international meeting of the European Laboratory, Working group on Diphtheria, 21-21 Aprilie 1994.

GALAZKA N.A., ROBERSTON S., Resurgence of diphtheria European Journal of Epidemiology, 1995, 11: 95-105.

GASPARINI R., FRAGAPANE E., SERESINI R., CELESI C., Immunity to diphtheria in Siena, epidemiol. And Infect, 119, 1997.

Griffith A.H. , The role of immunization în the control of diphtheria, Dev. Biol. Stand. 1979, 43: 3-13

Hallender O.H., Haeggman S., Epidemiological typing of Corynebacterium diphteriae isolated in Sweden 1984-1986, Scand. I. Infect Des. 1988 ; 20 173-176

Jdanov P.V., Measnikov S.A., Unele particularități ale clinicii și epidemiologiei difteriei în colective organizate de adulți, Voeuno medituiskii jurnal, 1987; 9:38-42

Jensen C., Die intracutane kaninchenmethode zur auswertung von dipheteria toxin und antitoxin, Acha Path Microbiol. Scand. Suppl. 14,1, 1993

Jones E.E., Kim – Farley R. J. , Diphteria: a possible Joodborne outbreak in Hodeida, Yemen Arab Republic, Bulletin of the World Health Organization 1985; 65:287-293

Kasimova la D., Supravegherea epicemiologică ainfecției difterice pe teritoriul RSS Azberbaidjan, J Mei, 1988;1 :34-37

Karzon T.D., Edwards M.K., Diphtheria outbreaks in immunized population, The New England Journal of Medicine, 1989; 318:41-43

Khuri – Bulos, Hamzah Y, The changing epidemiology of Dipheteria in Jordan, Bulletin of the World Health Organization, 1988, 66; 65-68

Kjeldsen K., Simonsen O., Immunity against diphtheria 25-30 years after primary vaccination in childhood, The Lancet, 1985;1: 900-902

Kjeldsen K, Simonsen O. , Heron J., Immunity against diphteria and tetanus in age group 30-70 years, Scand., I. Infect. Dis., 20, 1988

Kostrzewski J. Blonica, Diphteria: Infections diseases in Poland in their control in 1918-1962, Warszawa: Panstwowy Zakland Wydamnic Lekarskick, 1964; 96-117

Kwantes W., Diphtherian Europe, I. Hyg . Caneb., 1984; 97: 433-437

MAPLE A.P., ANDROULLA EFSTRATOIU, Diphtheria immunity in U.K. blood donners , The Lancet, 1995; 345:963-965.

MATTI JAHKOLA, Diphtheria in Finland and The Baltic Countries 1990-1993, Proceeding of the first international meeting of The European Laboratory; Working group of Diphtheria 21-22 aprilie 1994; 8-9.

MASTERSON R.G., TETTMAR R.E., PILE R.L.C., Immunity in diphtheria in young British adults, J. Infect. 15, 1987.

MIHĂILESCU R., STOEAN C., BĂLUȚĂ M., DURBACĂ S., MATEESCU M., Passive haemagglutination reaction as screening test in diphtheria immunity evaluation, Communication XIII-th Meeting of Immunology, 1984.

MCCLOSEKEZ R., ELTER I. J., The 1970 epidemic of Diphtheria in San Antonio, Annals of Internal Medicine, 1971; 75:495-503.

Mofredj A., Guerin M.J., Diphterie cutanee. Apropos d’un cas avec hemocultures positives, Med. Mal. Infect. 1993, 23:929-930

Naumann P. , Krech T., Phagenlysotypie und Epidemiologie der Diphterie Erkrankungen 1975 bis 1984, Dautsche Medizwische Wochenschrift 1986; 111:288 – 292

Pappenheiner am Jr., Diphtheria, Bacterial Vaccines by Academic Press, 1984;1-35

Rappinoli R., Podda D., Giovannonif., Menciori L., Absence of protective immunity against diphtheria in a large proportion of young adults, Vaccine, 11, 1993

Recommendations of the national advisory committee on immunization practice, Guidelines for vaccine prophylaxis and other preventive measures; Diphtheria, Tetanus and Pertusis, New York State Journal of Medicin 1982; 1563-1569

Recommendations of the immunization practices advisory committee diphteheria, tetanus and pertusis, Morbidity and Mortality Weekly Report, 1985; 34: 406-424

Roure Colette, Diphtheria in Europe, Proceedings of the first international meeting of the European Laboratory; Working group on Diphtheria, 21 –22 aprilie 1994, 3-4

Saragea A., Maximescu P., Corynebacterium dipheteriae: microbiological methods used in clinical and epidemiological investigations, In: Bergan and Noris (editors). Methods in microbiology New York: Academic Press, 1979; 13: 61-176

Semiletko N. T., Zdanovskaia I.N., Infecția difterică în regiunea Habarovsk, J. Mei, 1988:103-104

Simonsen O., Kristiansen M., Aggerbeck H., Hanc., Heron J., Fall-of in immunity following diphtheria revaccination in 8 year follow study, APMIS, 104, 1996

Simonsen O., Vaccination against tetanus and diphtheria, Danish Med., Bull., 36, 24, 1989

Soulion E., Eyriazopoulou V., Dizae , Serological survey on the immunity to diphtheria of Northern Greek population, Europ J. Epid. 13, 1997

Stowman K., Diphthria rebounds, Epidemiol., Inform. Bull., Microbiol, 1945; 1:157-168

Svart A. S. , Bukova E. V. , Dinamica morbidității și imunității prin difterie, J. Mei, 1987,2,26-32

Weiss B. P. , Strassburg M.A., Feeley J.C., Tetanus and diphtheria immunity in an elderly population in Los Angeles country, Am. J. Publ. Health 73, 1983

White M. J. , Efstratiou A., Incidence of diphtheria and other infections caused by C. diphtheriae and C. ulcerans in England and Wales 1986-1993, Proceedings of the first international meeting of the European Laboratory, Working group on Diphthria, 21-22 Aprilie 1994, 7-8

Winporfer A., Die Diphtherie in Wandel: Zur Geschichte und Epidemiologie der Diphtherie, Klin, Padiat. 1977, 189, 346-349

World Health Organization, Diphtheria Epidemic – New Independent States of the Former Soviet Union 1990-1994, Morbidity and Mortality Weekly Report, 1995; 44:10:178-181

World Health Organization , Diphtheria Acquired by U.S.Citizens in the Russian Federation and Ucraine – 1994, Morbidity and Mortality Weekly Report, 1995, 44: 12: 237-244

World Health Organization, La lutte contre la diphterie en Europe, Rapport sur une reunion de L’OMS. 17-19 aprilie 1990 Geneve, 315913 : 1-17

World Health Organization, Troisieme reunion des administrateur de programmes nationaux du Programme elarge de vaccination, Rapport sur une reunion de l’OMS, 22-25 mai 1990

Zuber P.L.F., Gruner E., Invazive infection with non toxique Corynebacterium diphtheriae among drog users, Lancet 1993; 339; 359