Metode Biofizice Aplicate In Diagnosticul Modern al Unor Leziuni de Natura Infectioasa

Abrevieri:

ABC – avidină biotină complex

APC-celula prezentatoare de antigen

BAAR -bacil acid alcoolo rezistent

BK -bacil Koch

DNA- acid deoxiribonucleic

IDR- intradermoreactie

IHC- imunohistochimic

ish – hibridizare in situ

LAM- lipoarabinozid

MB- Mycobacterium bovis

MOTT- Mycobaceterium other than tuberculosis

MT- Mycobacterium tuberculosis

PAS- acid p aminosalicilic

PCR- reactia de polimerizare în lant

PPD- derivat proteic purificat

RHS- reactie de hipersensibilitate

RIC- raspuns imun celular

RNA-acid ribonucleic

SIDA -sindromul de imunodeficienta dobandita

TBC- tuberculoza

TCH- acidul 2 tiofenol –carboxilic

TGF – tumor growth factor

TNF – tumor necrosis factor

ZN- Ziehl -Neelson

Motto:”Viitorul si trecutul/Sunt a filei doua fete

Vede-n capat inceputul/Cine stie sa le-nvete.”

<<M. Eminescu-Glossa>>

INTRODUCERE

Medicina moderna este o imbinare mestesugita a unor metode clasice de diagnostic si tratament cu o multitudine de tehnici moderne, competitive care tintesc diagnosticul intim al leziunilor celulei. Metode ca PCR, hibridizare in situ, culturi celulare, terapie genica au intrat in ultimul de deceniu in “trusa de lucru” a medicului practician, imbunatatind considerabil atat acuratetea diagnosticului, cat si al terapiei. Problema care se impune este cea a cunoasterii si intelegerii principiilor biofizice si biochimice care stau la baza acestor tehnici in vederea unei interpretari corecte a rezultatelor, stiut fiind ca o cunoastere superficiala este mai periculoasa decat ignorarea respectivei metode. Una dintre povestile cele mai cunoscute pe care o intalnim de fiecare data cand ne avantam pe taramul cunoasterii este de origine indiana, pe care o voi reproduce dupa J.Cl. Carriere “Cercul mincinosilor”:

Intamplarea se petrece intr-un sat unde toti locuitorii erau orbi. Pe langa sat a trecut intr-o zi un rege calare pe un elefant, animal complet necunoscut in acel colt de lume. Cand au auzit vorbindu-se de un animal nou, care parea complet neobisnuit, cativa orbi s-au dus sa stea de vorba cu regele si cu curtenii. Li s-a ingaduit sa puna mana pe elefant. Intorcandu-se in sat, au fost incojurati de o multime de orbi care le-a cerut sa vorbeasca despre elefant. Primul orb care nu pipaise decat urechea elefantului a spus : « Este un animal mare si turtit cu pielea destul de aspra, cam ca un covor vechi. ».Al doilea care apucase trompa elefantului, le-a spus : “ Este ceva lung, gol pe dinauntru si se misca tot timpul. Este foarte voinic.” Cel de-al treilea orb, care il apucase pe elefant de un picior , a spus: “Este zdravan si bine proptit in pamant, ca un stalp.” Care dintre orbi avea dreptate?

Daca imi este permisa paralela cred ca asta era si situatia in medicina inainte de descifrarea structurilor genice si caracterizarea moleculara a tuturor organismelor vii. Stiintele de granita, precum biofizica, biochimia, biologia celulara si moleculara creeaza fundamentul pentru intelegerea si practicarea medicinii competitive a secolului XXI.

PARTEA GENERALA

Profilul molecular al infectiei cu Mycobacterium tuberculosis si MOTT (Mycobacterium Other Than tuberculosis)

Caracterizarea complexitatii proteice si lipidice a peretelui bacterian

Mecanismele moleculare ale raspunsului imun in infectia cu mycobacterii

Implicatii ale infectiei cu M tuberculosis in patologia umana

Genul Mycobacterium, unicul gen al familiei Mycobacteriaceae, ordinul Actinomicetaes, este constituit preponderent din specii conditionat patogene, multiplicandu-se liber in mediul exterior, unele capabile sa determine ocazional imbolnaviri la om, mai ales la persoane cu deficienta imuna. Genul mai contine specii strict patogene: M. tuberculosis, M. leprae. [35]. Numele genului vine de la Myces = ciuperca, mucegai si bacterion = bastonas (gr.)

Elementele minimale necesare stabilirii apartenentei la genul Mycobacterium sunt:

– rezistenta la decolorarea cu acid-alcool

– prezenta unor acizi micolici care contin 60-90 atomi de carbon si care pot fi clivati prin piroliza in acizi grasi cu 22 si respectiv 26 atomi de carbon

– un continut procentual de G+C de 61- 71 %

In afara de M. tuberculosis si M. leprae, au fost descoperite o serie de alte micobacterii considerate anterior saprofite dar care fiind conditionat patogene, sunt relativ frecvent implicate in patologia gazdelor imunodeprimate. Aceste micobacterii au fost denumite M. altele decat M. tuberculosis (MOTT) sau atipice sau nontuberculoase.

Exista diferite sisteme de clasificare care ar putea fi utilizate pentru gruparea speciilor micobacteriene. In mod clasic toate speciile de MOTT sunt incluse in 4 grupe, pe baza ratei de multiplicare si a pigmentogenazei. In acest sistem, elaborat de Ernst Runyon, pigmentogeneza este evaluata atat dupa expunere, cat si fara expunere la lumina.

Micobacteriile cu ritm lent de multiplicare fotocromogene, ale caror colonii se pigmenteaza numai dupa expunerea la lumina (ex. M. kansasii, M. marinum ) fac parte din grupul I.

Micobacteriile cu ritm lent de multiplicare scotocromogene, ale caror colonii se pigmenteaza la intuneric (ex. M. scrofulaceum, M. gordonae, M. szulagi) fac parte din grupul al II-lea.

Micobacteriile cu ritm lent de multiplicare nefotocromogene (ex. M. avium) fac parte din grupul al III-lea .

Din grupul al IV – lea fac parte micobacteriile cu ritm de multiplicare rapid (ex. M. fortuitum, M. Chelonae). [43]

In momentul de fata in genul Mycobacterium sunt clasificate peste 71 de specii diferite, multe dintre acestea fiind larg raspandite in natura. Speciile genului Mycobacterium, denumite curent micobacterii, au in comun urmatoarele caractere:

a. sunt bacili subtiri, drepti sau usor incurbati

b. imobili, nu au flageli, fimbrii sau pili

c. nu formeaza endospori sau capsula

d. sunt slab grampozitivi

e. sunt acid-alcoolo rezistenti

f. se multiplica lent, adica au un timp de generatie neobisnuit de lung

Principalele infectii produse de diferitele bacterii ale genului Mycobacterium sunt redate in tabelul 1. [4]

Tabelul 1. Principalele infectii produse de diferitele bacterii ale genului Mycobacterium

MOTT se intalnesc ubicvitar. M. tuberculosis (hominis, bovis, africanum) se gaseste in organismele infectate, de regula la nivel pulmonar si in cazul bolii poate fi eliminat in mediul exterior prin tuse ( in sputa in nucleii de picatura) sau prin lapte (animal infectat cu M. bovis). Habitatul si modul de transmitere al germenilor sunt infatisate in tabelul 2. [43]

Tabelul 2. Habitatul si modul de transmitere al MOTT

Morfologie si structura

Micobacteriile sunt bacili subtiri, usor incurbati sau liniari cu dimensiuni de 3- 10µ/ 0,3-0,6µ, cu margini paralele si extremitati rotunjite, frecvent dispusi in mici aglomerari, imobili, necapsulati, nesporulati. Variatiile morfologice sunt mari atat de la o specie la alta cat si in cadrul speciei, fiind legate de conditiile de multiplicare, dimensiunea fiind net influentata de timpul de generatie.

Interiorul celulei, protoplastul, este diferentiat in citoplasma si corp nuclear bine definit desi fara membrana nucleara . Nu exista reticul endoplasmic sau mitocondrii, dar se identifica organite membranoase mezozomi, granule dense- polifosfati si vacuole electron- translucide – ce stocheaza lipide.

Genomul este intens studiat, s-au produs prin inginerie genetica sonde DNA pentru principalele specii, ce permit identificarea germenelui in diverse produse patologice: sputa, LCR, ser, tesuturi fie ca atare fie dupa o reactie de amplificare- PCR. Citoplasma este limitata spre exterior de o membrana citoplasmatica care o separa de peretele celular.

Peretele celular are cea mai complexa structura cunoscuta si un continut bogat in lipide (60%). Este un perete foarte putin permeabil ceea ce explica si ineficienta majoritatii medicamentelor pe acest microb. M. tuberculosis nu se coloreaza usor si in coloratia Gram ramane neutru. Odata colorat, bacilul nu mai poate fi decolorat de acidalcool, caracteristica ce justifica incadrarea lui intre bacilii acid- alcoolo rezistenti. Aceasta rezistenta se explica prin concentratia mare de acid micolic, acizi grasi cu lant lung si alte lipide in componenta peretelui. Alte microorganisme ce sunt acid-alcoolo rezistente sunt Nocardia si Rhodococcus, Legionella micdadei , Isospora sI Cryptosporidium.

Peretele are 3 straturi care de la interior spre exterior sunt alcatuite din[35]:

– mureina, un peptidoglican format din lanturi lungi de polizaharide, unite intre ele prin tetra peptide – confera celulei forma si rigiditate

– arabinoglican, acizi micolici, sulfolipide, cord factor

– micozide ca peptidolipide si fenolglicolipide

Unele lipide-cord factor- sunt chiar implicate in virulenta bacilului, declansand fenomene citokin induse. Factorul cord este un glicolipid constituit din trehaloza si doua molecule de acizi micolici, cu structura extrem de complexa care a putut fi descifrata de curand [2]. Lipoarabinoza, componenta a peretelui este implicata in interactiunea germene- gazda si faciliteaza supravietuirea M.tuberculosis in interiorul macrofagelor.

Au fost identificate doua subfamilii de glicopeptidolipide polare (GPL) , denumite PIM2 si PIM6 ( PhosphatidylInositol Mannoside), localizate pe suprafata M smegmatis implicate in fagocitarea micobacteriilor de catre macrofagele umane [1]. Micozidele sunt identificabile la ME si au rol important: sunt specifice speciilor si tulpinilor de micobacterii, determina morfologia coloniilor, uneori virulenta si servesc ca receptor pentru bacteriofagi, sunt determinanti antigenici imporanti. [29]

Micobacteriile se coloreaza prin metoda Ziehl-Neelson in roz- rosu. Se mai foloseste o coloratie cu auramina fenilata care le confera proprietati fluorescente .

Caractere biochimice

Se poate identifica specia de Mycobacterium pe baza catorva teste: testul producerii de niacina, testul reducerii nitratilor, testul catalazei la 220C si la 680C, hidroliza tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2- tiofen- carboxilic(TCH) sI la acidul p-aminosalicilic (PAS).

Primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis. M. bovis are al 3- lea test pozitiv. Testul catalazei la 680C si respectiv hidroliza Tween sunt negative la ambele specii. M. tuberculosis se dezvolta pe mediu cu TCH, in timp ce M. bovis sau bovis-BCG nu. [43]

Rezistenta la factori fizici si chimici

Micobacteriile datorita peretelui au o rezistenta mai mare in mediu extern sI fata de agentii chimici. Diferiti coloranti ca de ex verdele de malachit au effect bacteriostatic fata de alte bacterii si se introduce in mediul de cultura Loewenstein- Jensen. Acizii si bazele pot fi utilizate in procesul de decontaminare al produselor patologice dar permit supravietuirea M.tuberculosis. Bacilii tuberculosi sunt rezistenti la uscaciune si rezista mult timp in sputa uscata, la intuneric. Sunt sensibili la actiunea radiatiilor UV. [43]

Structura antigenica

Constituentii peretelui induc un raspuns imun de tip celular si respectiv o hipersensibilitate de tipIV – inducand astfel un grad de rezistenta fata de o noua infectie.

Micobacteriile prezinta la nivelul peretelui o cantitate mare de lipide, acizi micolici, ceruri si fosfatide. CearaD pare a fi implicata in inducerea starii de hipersensibilitate. Lipidele sunt cuplate cu proteine si polizaharide si ele cu potential antigenic. Pentru evaluarea starii de reactivitate fata de infectie se poate utiliza IDR la tuberculina (PPD- derivat proteic purificat), filtrat proteic al M. tuberculosis fata de care apar anticorpi.

Mecanismele moleculare ale raspunsului imun in infectia cu Mycobacterii

Patogenia tuberculozei este legata de abilitatea micobacteriei de a se sustrage fagocitarii macrofagelor si de a induce un raspuns imun de tip intarziat. Aceste atribute se datoresc u ca de ex verdele de malachit au effect bacteriostatic fata de alte bacterii si se introduce in mediul de cultura Loewenstein- Jensen. Acizii si bazele pot fi utilizate in procesul de decontaminare al produselor patologice dar permit supravietuirea M.tuberculosis. Bacilii tuberculosi sunt rezistenti la uscaciune si rezista mult timp in sputa uscata, la intuneric. Sunt sensibili la actiunea radiatiilor UV. [43]

Structura antigenica

Constituentii peretelui induc un raspuns imun de tip celular si respectiv o hipersensibilitate de tipIV – inducand astfel un grad de rezistenta fata de o noua infectie.

Micobacteriile prezinta la nivelul peretelui o cantitate mare de lipide, acizi micolici, ceruri si fosfatide. CearaD pare a fi implicata in inducerea starii de hipersensibilitate. Lipidele sunt cuplate cu proteine si polizaharide si ele cu potential antigenic. Pentru evaluarea starii de reactivitate fata de infectie se poate utiliza IDR la tuberculina (PPD- derivat proteic purificat), filtrat proteic al M. tuberculosis fata de care apar anticorpi.

Mecanismele moleculare ale raspunsului imun in infectia cu Mycobacterii

Patogenia tuberculozei este legata de abilitatea micobacteriei de a se sustrage fagocitarii macrofagelor si de a induce un raspuns imun de tip intarziat. Aceste atribute se datoresc unor componente din peretele bacteriei:

1) cord factor un glicolipid de suprafata datorita caruia M.tuberculosis creste in vitro sub forma unor fire sinuoase. M. tuberculosis virulente au cord factor pe suprafata, la cele avirulente lipsind, iar injectarea de cord factor pur la soareci induce granuloame caracteristice.

2) LAM (lipoarabinozid), un polizaharid inhiba activarea macrofagelor de catre IFNα. LAM induce totodata secretia macrofagica de IFN α, ceea ce cauzeaza febra, scadere in greutate si leziuni tisulare, si de Il-10, ceea ce suprima proliferarea celulelor T indusa de micobacterii.

3) Complementul activat pe suprafata micobacteriei o poate opsoniza facilitand astfel fixarea de receptorul macrofagic pentru complement CR 3 (Mac-1 integrin).

4) Proteina de soc termic a M. tuberculosis, asemanatoare cu cea umana, are posibil un rol in reactia autoimuna indusa de M. tuberculosis.

RIC se foloseste pentru a indica faptul ca gazda, a fost capabila sa reziste infectiei initiale si diseminarii de bacili tuberculosi, aparent datorita capacitatii macrofagelor de a inhiba replicarea si supravietuirea. Aceste fapte au fost asociate cu involutia leziunii si diminuarea numarului de bacili atat la locul primar cat si la distanta.

Dimpotriva, hipersensibilitatea de tip IV exprima raspunsul la proteine tuberculoase la subiectii infectati cu MT. Este un raspuns imun tisular de intensitate mare, ce determina leziuni tisulare severe. Acesta apare cand sistemul imun este confruntat cu Ag complexe ce nu pot fi prelucrate de APC, cand exista o stimulare bacteriana intensa si repetata si cand APC sunt colonizate de microorganisme cu habitat intracelular.

Reactia parcurge 2 etape :

1) Faza de inductie – are loc captarea Ag de catre APC, migrarea lor in ganglionii regionali, maturarea intraganglionara a limfocitelor T naive (care se transforma in limfocite T cu memorie) si eliberarea unor interleukine de catre APC, care modifica expresia fenotipica a endoteliului vascular si initierea unei inflamatii acute

2) Faza de desfasurare – se face prin migrarea limfocitelor T cu memorie in tesuturi, ce vin in contact cu APC pe care le activeaza cu indepartarea Ag. Tipurile de RHS IV sunt reprezentate de : hipersensibilitatea Jones-Mode, hipersensibilitatea de contact, hipersensibilitatea clasic intarziata si reactia granulomatoasa.

Diferenta dintre cei doi termeni se mentine si datorita observatiei ca, folosind un anume material antigenic, o persoana poate dezvolta imunitate partiala impotriva unui atac cu MT (RIC), fara sa dezvolte reactivitate tuberculinica, RHS IV poate fi produsa fara o crestere corespunzatoare a imunitatii, in timp ce animalele pot fi desensibilizate fara a modifica rezistenta imuna.

Dannenberg si Lurie au elaborat un model, structurat in 4 faze pentru a intelege mai usor imunitatea tuberculozei (fig. 1).

Fig.1

M. tuberculosis locuiesc in fagozomii neacidifiati ca lizozomi. Inhibarea acidiferii a fost asociata cu ureaza secretata de micobacterie si cu legare de receptorii pentru complement sau manoza.

Desfasurarea reactiei de hipersensibiliteate de tip IV explica oarecum capacitatea distructiva asupra tesuturilor dar si aparitia rezistentei fata de acest bacil.

Dupa prima expunerea la M. tuberculosis raspunsul inflamator initial este nespecific, asemanator reactiei ce apare in urma oricarei alte invazii bacteriene (figura 2).

Figura 2. Raspuns inflamator nespecific

In 2-3 saptamani, concomitent cu pozitivarea IDR la PPD, reactia devine granulomatoasa si centrul devine cazeos, formand tuberculi specifici. Succesiune de evenimente ulterioare sunt reprezentate in figura 3. Raspunsul gazdei este diferit daca este primoinfectie sau nu. Schematic, istoria naturala a tuberculozei se poate prezenta astfel (fig. 2):

Figura 3

Figura 4 Istoria naturala a tuberculozei (“Robbins Pathologic Basis of Disease”, Ed. a 6-

a, Ramzi Cotran, Vinay Kumar, Tucker Collins, Saunders Company)

Inflamatia granulomatoasa apare cand fagocitele neutrofile sunt inadecvate si nu pot neutraliza agentul cauzal. Stimuli ce pot produce aceasta reactie sunt:

– microorganisme cu patogenie redusa dar care induc un raspuns imun, germeni cu actiune intracelulara sau cu un invelis lipoproteic rezistent. Ex M. tuberculosis, M. leprae

– material inert, strain, depozitat in tesuturi

Cand un stimul lezional persista, nu poate apare vindecarea completa, aparand inflamatia cronica. Schematic succesiunea evenimentelor se poate enumera: leziune tisulara. inflamatie acuta exudativa. organizarea exudatului. tesut de granulatie. cicatrice fibroasa. Daca stimulul persista apare necroza tisulara, organizarea sI reparatia, aparand ulterior. [49]. Raspunsul imun joaca un rol important ce va fi descris mai jos. Inflamatia cronica este un echilibru intre repararea si continua lezare a tesutului.

Primoinfectia TBC incepe cu inhalarea micobacteriei. Se accepta azi ca unitatea infectanta este acea particula cu dimensiuni mici (droplet nucleus), sub 10mm, care rezulta din uscarea rapida in atmosfera a celor mai mici picaturi Pflugge. Acestea isi reduc volumul, prin evaporarea apei, inainte de a se depune gravitational si plutesc mult timp in aer, ajungand prin inhalare la nivelul unitatilor morfofunctionale terminale. Numai la acest nivel, bacilii pe care eventual ii contin se pot multiplica. Particulele mai mari sedimenteaza pe covorul de mucus endobronsic si sunt eliminate prin mecanismul de epurare- transport ciliar. Particulele Pflûgge sunt produse sI eliminate cu ocazia expirului energic (tuse, stranut, ras, tipat, cantat).

Efect bactericid asupra bacilului Koch au radiatiile ultraviolete. Iar o buna ventilatie scade contagiozitatea considerabil. Surse de infectie sunt bolnavii pozitivi in microscopie, mai ales bolnavii cavitari, tusitori in special. Contagiozitatea se reduce dramatic cu inceperea tratamentului.

Initial, leziunea tuberculoasa pulmonara ramane mica, dar infectia se raspandeste la limfoganglionii peribronsici. Microorganismul inhalat va prolifera initial in alveole la periferia plamanului, cel mai des chiar subpleural (focar Gohn).

Dupa aproximativ 3 saptamani se dezvolta un raspuns imun, limfocitele T activate atragand macrofage catre plaman si limfoganglioni, rezultand o inflamatie granulomatoasa si cazeificare. Aceste prime modificari pot sa nu dea o simptomatologie semnificativa, viitorul bolii depinzand de echilibrul intre raspunsul gazdei si virulenta si numarul de bacili. In aceasta perioada se va pozitiva si reactia cutanata IDR la PPD. Limfocitele T activate de micobacterii actioneaza cu macrofagul in 3 modalitati.

1) LT CD4+ secreta IFNα care activeaza macrofagele, stimuland distrugerea micobacteriilor intracelulare cu ajutorul intermediarilor reactivi de azot NO, NO2 sI HNO3. Astfel se explica formarea celulelor epitelioide din granulom.

2) LT supresoare CD8+ lizeaza macrofagele infectate cu micobacterii printr-un mecanism Fas independent, omorand micobacteriile.

3) LT CD4-CD8- (dublu negativ) lizeaza macrofagele printr-un mecanism Fas dependent, fara sa omoare micobacteriile.

Prin directa toxicitate a micobacteriilor asupra macrofagelor, se poate forma centrul necrotico-cazeos. Micobacteria nu poate supravietui in acest mediu acid si cu continut scazut in oxigen, astfel, infectia cu micobacterii fiind controlata.

Complexul primar (afectul pulmonar initial, limfangita si adenopatia satelita hilara) se va vindeca in majoritatea cazurilor si va dezvolta imunitate la tuberculoza.

In marea majoritate a cazurilor, focarul Ghon si granuloamele cazeoase din ganglionul limfatic se vor vindeca prin depunere de colagen in jurul lor. Leziunile vindecate cuprind central o zona de cazeificare, inconjurata de un perete dens de colagen la periferie. Saruri de calciu se depoziteaza frecvent in colagen si se intalnesc uneori si in cazeum. Foarte important, bacterii viabile pot ramane dormande in peretii focarelor aparent vindecate.

Rar, complexul primar va progresa la pacientii cu imunitate scazuta rezultand o tuberculoza primara progresiva. Imprastierea infectiei apare prin marirea nodulilor ce erodeaza fie peretele unei bronhii fie peretele subtire al unui vas de sange. Diseminarea bronhiala a micoorganismelor produce bronhopneumonie TBC.

In tuberculoza secundara micobacteriile pot fi achizitionate exogen sau din complexe primare vindecate aparent. O leziune apicala (denumita focar Assmann = infiltrat rotund precoce) poate fi punctul de plecare.

Ca organe mai frecvent implicate se pot cita: suprarenalele, rinichii, epididimul, creierul si meningele, articulatiile si osul. Leziunile tuberculoase se pot reactiva la mult timp dupa o vindecare aparenta. Acest lucru demonstreaza ca mentinerea unui raspuns imun si unuia reparative adecvat sunt necesare pentru a supresa stimulul lezional persistent, in cazul acesta, micobacteria latenta. [16]

Structura histopatogenica complexa a leziunilor si conditiile de multiplicare diferite explica de ce in leziunile tuberculoase active se afla simultan germeni in plina multiplicare exponentiala, germeni cu multiplicare lenta, germeni cu multiplicare ocazionala (intermitenta) si germeni dormanti. Proportia acestor subpopulatii are variabilitate in timp si depinde de mozaicul de modificari histopatologice.

La soareci susceptibilitatea la tuberculoza este data de o gena transmisa autozomal dominant, bcg, care codifica o proteina transportor de membrana. La om o astfel de gena inca nu a fost descoperita. [29]

Elementele componente ale leziunii tuberculoase

Figura 5. TBC pulmonar cu necroza cazeoasa extinsa, celule gigante multinucleate Langhans, HE, 4x

Granulomul TBC, numit si folicul Koester, are o arie de necroza cazeoasa tisulara central, caracteristica prin omogenitatea sa. Aici evidentierea tesutului anterior nu mai e posibila dar se pot gasi micobacterii. La periferie se gaseste tesutul granulomatos format din macrofage tinere, celule epitelioide si celule Langhans, monocite recent migrate, plasmocite, inconjurate de celule limfoide si fibroblasti, rare PMN, capilare limfatice si fibre reticulare.

Macrofagul, stimulat de IFNα secreta [49]:

– mediatori ai inflamatiei acute, factori activatori ai diverselor celule implicate in raspunsul imun, metaboliti ai acidului arahidonic

– metaboliti inalt reactivi de oxigen

– citokine, TNF

– factori de crestere

Celulele epitelioide sunt macrofage activate, uneori organizate intr-o structura asemanatoare celor epiteliale.

Celule gigante Langhans sunt celule gigante multinucleate care provin probabil din celule epitelioide ce au fuzionat una cu alta (cel mai frecvent in jurul unui mic fragment de tesut cazeos

Limfocitele sunt celule sferice cu nucleu rotund, usor reniform si cromatina densa, cu citoplasma redusa la o mica coroana perinucleara, continand ribozomi sI mitocondrii dar nu si reticul endoplasmic. S-au identificat printre limfocite subpopulatii diferind prin:

– durata de viata: limfocite cu viata scurta, care dispar dupa 4-5 zile, limfocite cu viata lunga de luni, reprezentand suportul memoriei imune

– participarea la raspunsul imun: limfocite B, T, K, NK

Implicatii ale infectiei cu M tuberculosis in patologia umana

Dupa o perioada de latenta, tuberculoza a redevenit o problema de sanatate publica, inregistrandu-se o crestere semnificativa a morbiditatii si mortalitatii prin aceasta boala in intreaga lume.

Boala insoteste omenirea de la inceputurile evolutiei ei, prezenta tuberculozei fiind documentata prin identificarea de leziuni tuberculoase atat in vertebre de om neolitic in Europa cat si la mumiile unor fiinte care au trait in variate regiuni ale planetei noastre, cu multe mii de ani in urma. Grecii au denumit boala ‘phthisis’ (‘consumare’), impresionati fiind de aspectul dramatic consumptiv al cazurilor cronice netratate.[6]

In secolele XVII si XVIII, in timpul industrializarii si urbanizarii, tuberculoza a luat proportii de epidemie in Europa, fiind cauza a cel putin 20 % din decesele din Anglia in 1650. In prima parte a secolului XX, imbunatatirea conditiilor socio-economice si izolarea pacientilor in sanatorii au avut un impact favorabil asupra epidemiologiei tuberculozei.

Factori ce contribuie la recrudescenta alarmanta a tuberculozei (TBC) sunt: selectarea tulpinilor rezistente la agenti terapeutici, aparitia sindromului de imunodeficienta castigata (AIDS) si imigrarea populatiei din tari cu incidenta crescuta a TBC.

In tara noastra, s-a inregistrat o crestere chiar mai accentuata a morbiditatii si mortalitatii prin TBC, ceea ce a determinat o incadrare in grupul tarilor cu profil infectios ‘primar’, alaturi de Africa si America de Sud.

TBC la om poate fi cauzata de Mycobacterium tuberculosis (MT) si Mycobacterium bovis (MB), dar in AIDS devin agresive o serie de alte micobacterii atipice ca Mycobacterium avium intracellulare etc., denumite generic Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT).

Pentru a identifica diferiti membri ai complexului MT, laboratoarele de microbiologie trebuie sa recurga la metode conventionale ce includ: microscopie directa, cultura pe mediu Loewenstein- Jensen (LJ) si teste biochimice. Chiar cu probe concentrate, sensibilitatea microscopiei nu este deosebita. Pe mediul de cultura bacilii cresc foarte incet (necesita 3-8 saptamani). Odata demonstrata prezenta micobacteriei sunt necesare teste biochimice aditionale pentru a identifica specia. Acestea necesita si ele timp si personal calificat. (Witebsky and Kruczak-Filipov, 1996). [7]

Datorita noilor conditii privind modul de infectare si agresivitatea micobacteriilor, leziunile din TBC au tendinta, tot mai frecventa, sa-si piarda caracterul specific, fiind din ce in ce mai greu de diagnosticat cu mijloace clasice, atat pe frotiuri, cat si prin cultura, sau pe sectiuni histopatologice. Aceste cazuri atipice survin la persoane debilitate sau cu sindrom de imunodeficienta castigata, confirmat serologic. Leziunile tuberculoase a caror etiologie nu poate fi demonstrata prin mijloace de rutina pot prezenta aspecte morfologice necaracteristice: necroza centrala supurativa asemanatoare bolii ghearelor de pisica, prezenta plasmocitelor, sugerand o inflamatie cronica nespecifica sau specifica luetica, prezenta macrofagelor spumoase, sau o necroza extinsa, fara reactie proliferativa in jur. Alteori procesul inflamator este format doar din epitelioide si celule gigante facand posibila confuzia cu sarcoidoza.

In asemenea cazuri este neaparat necesara stabilirea etiologiei TBC prin mijloace mai sensibile, unul dintre cele mai eficiente fiind PCR. Acesta din urma permite stabilirea prezentei bacilului Koch si pe material arhivat, important pentru diagnostic si eventual studiu retrospectiv. Se reduce totodata proportia de cazuri cu coloratie Ziehl-Neelsen pozitiva pentru MT. O parte dintre acestea pot fi incluse in categoria infectiilor cu micobacterii atipice (MOTT), datorita pozitivarii pentru reactia PAS, dar aceasta pozitivitate este putin specifica.

Toate acestea determina aparitia de noi probleme in diagnosticul si tratamentul infectiei TBC: intarzierea diagnosticului corect si a terapiei adecvate, evolutia clinica atipica si nefavorabila. Astfel a crescut semnificativ numarul de cazuri cu infectie generalizata si evolutie rapid letala, evolutie grava dupa vaccin BCG, cazuri trenante de infectii cu MOTT.

Nevoia detectarii rapide si identificarii TBC, mai ales la pacientii cu AIDS, a impus dezvoltarea unei metode de diagnostic rapide, ieftine, cu specificitate si sensibilitate crescuta. Introducerea amplificarii directe a ADN sau ARN din probe, o tehnica revolutionara in diagnosticul microbiologic, va facilita diagnosticul TBC intr-un timp util din punct de vedere clinic, dovedind totodata sensibilitate si specificitate inalta. (Hawkey 1994).[47]

Evolutia acestei metode este remarcabila. Determinarea secventelor ADN prin reactia de polimerizare in lant (PCR), realizata initial pe modele experimentale la soareci, a fost aplicata apoi pe produse patologice umane, initial sputa apoi tesuturi proaspete. Aplicarea pe material inclus la parafina este de data relativ recenta, rezultetele obtinute necesitand insa verificarea pe cazuistica. Metoda va putea fi aplicata, mai ales in cazurile cu reactie ZN negativa sau paucibacilare, pe materiale tisulare incluse la parafina. [7]

Detectarea prin PCR pe piese incluse in parafina a MT si MOTT isi gaseste utilitatea in clinica in toate localizarile acestor infectii. Astfel, in primul rand localizarea pulmonara sau mediastinala permite diagnosticul de precizie, evitand tratamente incorecte sau dimpotriva tratamente lungi, inutile, anti-TBC. In plus serveste diagnosticului diferential cu sarcoidoza, frecvent cu aceeasi localizare. In localizarile pericardice sau pleurale ale TBC, permite un diagnostic diferential cu etiologia reumatismala nespecifica.

Una din problemele de diagnostic diferential de mare dificultate este cea a limfadenitelor TBC, care se preteaza la confuzii cu alte leziuni granulomatoase inflamatorii si tumorale maligne. O localizare frecventa care poate beneficia de PCR pentru detectarea MT si MOTT este cea cutanata.

Nu trebuie neglijat faptul ca diagnosticul molecular nu este un diagnostic de sine statator, ci trebuie corelat cu toate celelalte tipuri de investigatii, inclusiv cea a statusului imun, de care depinde in mare parte evolutia bolii.

Tuberculoza pulmonara

Initial, pacientul este relativ asimptomatic, prezentand simptomatologie discreta si necaracteristica pentru ca mai apoi sa apara simptome si semne mai pregnante, ce arata progresul si extensia bolii.

Sunt prezente fatigabilitate, anorexie, iritabilitate si pierdere in greutate, subfebrilitate/febra persistenta.

O tuse usoara va progresa in saptamani pentru a deveni mai frecventa, mucoasa sau mucopurulenta. Hemoptizia apare intr-o proportie de 8% la adultii cu boala active si poate fi semnificativa la cei cu leziuni cavitare. Tuberculoza primara este deci foarte frecvent asimptomatica, procentul ajungand pana la 70% , restul prezentand o simptomatologie nespecifica si usor de trecut cu vederea. Tusea si toracalgia sunt simptomele cele mai comune, boala mimand o pneumonie acuta.

Tuberculoza miliara

Tuberculoza miliara este si ea o manifestare aparte anatomo- clinica a infectiei cu BK, diseminata pe cale hematogena; se intalneste cel mai des in plaman dar poate apare si in alte organe. Termenul de miliara provine de la asemanarea nodulilor pulmonari cu boabele de mei, de dimensiuni 1-2mm.[51].

Organele bine perfuzate si cu celule reticulo- endoteliale sunt cele mai frecvent implicate in TBC miliara: plamani, maduva, ficat, rinichi, suprerenale, splina.

Tuberculoza pleurala

Tuberculoza pleurala este considerata o tuberculoza primara dar ea poate apare si ca o complicatie a tuberculozei secundare.

Tuberculoza laringiana

In era preterapeutica implicatia laringiana in tuberculoza atingea 34- 83%. Laringele era infectat direct, prin contact cu sputa contaminata. Momentan procentul de interes al CRS (cailor respiratorii superioare) este de 1.8% dintre pacientii cu TBC. Desi in mod obisnuit coexista cu o afectare pulmonara, se poate prezenta si izolat, ca o laringita exudativa, eritematoasa, ea progreseaza de la o infamatie discreta la ulcerare. Orice arie laringiana poate fi afectata dar cel mai frecvent sunt implicate corzile vocale si epiglota. Progresiv poate afecta si faringele, amigdalele sau palatul moale. [52]

Limfadenita tuberculoasa

Este forma cea mai frecventa de TBC extrapulmonara. Cel mai des sunt afectati ganglionii din grupul cervical (60- 90%) dar orice ganglion poate fi afectat. Afectarea multiganglionara apare in 10-20% din cazuri, iar limfadenopatie generalizata in mai putin de 5% din cazuri.

Tuberculoza sistemului nervos

Meningita TBC se dezvolta in general prin efractia unui nodul Rich localizat subependimal. Acest focar a fost gasit constant la autopsie. El comunica cu LCR, deversand material cazeos. El se poate destabiliza dupa multi ani de tacere, datorita unei imunosupresii, TCC (traumatism cranio cerebral), debilizare. Meningita debuteaza subacut, cu simptomatologie vaga, slabiciune, stare subfebrila, cefalee, schimbari de personalitate. In cateva saptamani se contureaza un tablou mult mai evident de meningoencefalita: cefalee intensa, semne de iritatie meningeala, febra, varsaturi, confuzie. Tuberculoza gastrointestinala

a) ileocecala

Este cea mai frecventa tuberculoza gastrointestinala. Dupa implicarea mucoasei si submucoasei, inflamatie intensa si necroza pot apare in peretele intestinal sau in ganglionii limfatici invecinati. Infectia se datoreaza inghitirii sputei contaminate sau diseminarii de la nivelul ganglionilor limfatici periintestinali.

b) peritoneala

Apare ca reactivare locala sau diseminata de la nivel gastrointestinal sau genital. Consta in insamantarea bacililor la nivel peritoneal. Ca localzari rare, sunt citate: esofagul, stomacul, duodenul, pancreasul.

Tuberculoza genitourinara

a) urinara

Reactivarea unui focar renal poate fi uni sau bilaterala si incepe din cortex, raspandindu-se spre papila si medulara. Cu progresia infectiei, leziunile devin cazeoase, caviteaza, descarcand material necrotic cu BK in pelvis si ureter. Infectia produce edem si fibroza caliceala, ureteropelvica si la jonctiunea uretero vezicala. Procesul coboara spre vezica urinara. [53]

b) genitala

• La barbat

Are implicari multiple: prostata (37%), epididim(31%), testicule(23%), vezicule seminale (9%). Tuberculoza peniana este rara, aceasta forma de TBC cutanat se transmite sexual.

Frecvent este asociata cu TBC urinara. In general este considerata o forma descendenta de la nivel urinar. Un alt mod de transmitere este cel de diseminare hematogena de la un focar reactivat sau limfatica.

• La femeie

Patologic, cel mai des implicata este trompa uterina (80-100%) cel mai frecvent bilateral. Infectia este o diseminare de la un focar primar reactivat si se prezinta ca TBC miliara. Endometrul este des afectat, probabil prin o diseminare tubara, miometrul si miosalpinxul de asemenea. Mai rar sunt implicate cervixul si vaginul.

Tuberculoza oaselor si articulatiilor

Apare rar, 1% dintre pacientii cu tuberculoza si reprezinta 5 % dintre manifestarile extrapulmonare. Este de obicei o manifestare tardiva a diseminarii hematogene de la un focar de tuberculoza primara . Cea mai frecvent afectata este coloana vertebrala, boala cunoscuta sub numele de morbul lui Pott, apare cel mai frecvent in regiunea toracica inferioara sau lombara superioara. Se formeaza leziuni tuberculoase, abcese reci intervertebrale, coloana va prezenta o gibozitate angulara caracteristica.

Tuberculoza la pacientii HIV +

La indivizii imunocompetenti, tuberculoza este stapanita si nu apare boala manifesta clinic.

Reactivarea bolii apare la 10 % dintre pacienti avand o serie de particularitati:

– tuberculoza precede de obicei alte boli ce definesc SIDA

– incidenta tuberculozei extrapulmonare este crescuta

– tabloul depinde de nivelul functiei imune

– simptomele sunt in general nespecifice

– radiologia este de multe ori atipica

– un mare procentaj de cazuri este ZN negativ

– tratamentul este dificil

B.Infectia cu HPV (Human papilloma Virus)

Caracterizarea genomica a subtipurilor virale HPV

Caracterizarea moleculara a proteinelor capsidei virale

HPV in patologia umana

Caracterizarea genomica a subtipurilor virale HPV

Frecventa tot mai mare a infectiilor virale genitale, au determinat o intensificare a studiilor asupra virusurilor implicate. Intre aceste virusuri, primul plan al patologiei genitale, il ocupa fara discutie familia de virusuri Papova, atat prin frecventa, cat si prin gravitatea consecintelor pe care le induce.

Virusul HPV este un virus DNA, format din DNA circular, dublu catenar, cu 7900 de perechi de baze. Prezinta o capsida formata din 72 de capsomere dispuse intr-un icosahedron, are 55-60 nm in diametru si un miez nucleohistonic. Capsida este constituita ditr-un strat omogen cu grosimea de 2nm, pe suprafata caruia e dispun capsomerele pana la o grosime maxima de 5,8nm [9]. Toate capsomerele (pentoni si hexoni) par sa formeze un “cap “ cu forma regulata de stea cu cinci colturi.

Fig.6. Capsida HPV:reconstructie pe calculator (Baker TS si colab: “Biophysical J 60: 1445-1456, 1991)

Genomul viral cuprinde urmatoarele regiuni:

1.regiuna de control URR, contine elementele promotor si secventele de amplificare si represie care regleaza replicarea DNA prin controlul transcriptiei regiunii precoce. Aceasta regiune prezinta cel mai mare grad de variatie a genomului viral.

2. regiunea precoce E1-E7 implicata in replicarea virala si oncogeneza.

3. regiunea tardiva L1-L2 care codifica proteinele structurale ale capsidei virale.

Fig.7. Prezentare schematica a genomului viral al subtipului oncogen HPV-16 (Wikippidia Enciclopedia

Gena L1 codifica pentru proteina majora de capsida (care formeaza 95% din masa virionului).

Gena L2 codifica pentru proteina minora de capsida.

Genele E1 si E2 sunt responsabile de replicarea virala si represia genica. E2 codifica si doua proteine: una care inhiba transcriptia si alta care amplifica transcriptia regiunii genice precoce [12]. Tipic pentru carcinoamele cervicale HPV asociate este pierderea expresiei proteinei E2 [13]. Pierderea functiei E2 dupa integrare va determina derepresia promotorului viral si consecutiv amplificarea expresiei E6 si E7 [14].

E4 este exprimata in stadii mai tardive ale infectiei, cand au fost asamblati virioni completi; are un rol important in maturarea si replicarea virala. E4 produce si colapsul retelei citoplasmatice de citokeratina nin keratinocitele umane , ceea ce poate facilita eliberarea virionilor din celulele infectate.

E5 dispare frecvent in celulele neoplazice ceea ce indica faptul ca nu este neaparat necesara mentinerii transformarii maligne.

Cele mai importante roluri le au genele E6 si E7. Acestea codifica oncoproteine care ajuta la replicarea virusului , imortalizarea si transformarea celulelor gazda [15, 23]. Astfel, genele E6 si E7 sunt responsabile de imortalizarea keratinocitelor umane.

Produsul E6 mediaza degenerarea proteinei supresor tumorale P53, in timp ce produsul E7 se leaga la produsele genei retinoblastomului. Afinitatea acestor proteine virale pentru produsii genelor supresor tumorale difera in relatie cu potentialul oncogenic al HPV. La virusurile cu risc inalt afinitatea este ridicata, in timp ce la virusurile cu risc redus, ea este scazuta[16].

Caracterizarea moleculara a proteinelor capsidei virale

Ciclul replicarii HPV porneste prin patrunderea virusului in celulele stratului bazal al epiteliului; probabil ca acest eveniment necesita microtraumatisme anterioare ale epidermului. α-Integrina reprezinta un receptor pentru HPV6, nefiind insa obligatorie pentru alte tipuri. HPV16, 33 se ataseaza la celule prin intermediul heparan-sulfatului de suprafata. In interiorul celulei gazda, virusul se replica pe masura diferentierii celulelor bazale si progresiei spre suprafata epiteliului. In keratinocitele diferentiate virusul isi amplifica numarul de copii DNA, sintetizeaza proteinele capsida si se produce asamblarea virala[ 24].

Pentru initierea replicarii DNA-ului viral sunt necesare doar doua proteine: E1 si E2. Proteina E1 are rol de proteina initiatoare virala care, in timpul denaturarii si replicarii DNA-ului viral, functioneaza ca helicaza[18].

Portiunea centrala a proteinei E1 contine situsul de legare DNA-specific.Capatul N-terminal cuprinde aproximativ 200 aminoacizi si prezinta variatii largi intre diverse subtipuri de HPV. Domeniul helicazic este continut in portiunea C-terminala a proteinei.

Fig.8 Structura complexului E1-E2 (A) AA din domeniile cheie ale HPV E1 si E2 (AD) Domeniul de activare; (DBD) DNA-binding domain; (NLS) secvente localizate nuclear. (B) reprezentarea structurii complexului E1 · E2. proteina E1 reprezentata in albastru; domeniul de legatura galben, domeniul N-terminal al E2 colorat in verde si domeniul β-plisat in rosu(Eric A Abbate. GENES & DEVELOPMENT 18:1981-1996, 2004)

Secventa evenimentelor care altereaza procesul apoptotic normal, ducand la aparitia de celule displazice nemuritoare, este urmatoarea: in cursul integrarii, genomul viral se rupe in regiunea E1/E2; inactivarea E2 va determina amplificarea expresiei E6 si E7, deci a oncoproteinelor care vor determina inactivarea produsilor genelor supresor tumorale P53 si pRb. Consecinta va fi progresia ciclului celular si imortalizarea celulelor cervicale [15]. Dell G si colab[41] au studiat structura proteinei E2, comparativ la virusurile inalt oncogene HPV16 si HPV18 si cele cu patogenitate joasa, HPV6. In ambele subtipuri virale, proteina E2 se leaga la patru situsuri de legare specifice situate de-a lungul regiunii LCR(viral long control region), prezentand afinitate de legare crescuta pentru regiunile bogate in A T [41]

Inactivarea P53 de catre oncoproteiona E6 determina decuplarea ciclului celular, facilitand astfel aparitia mutatiilor celulare. Majoritatea celulelor maligne cervicale prezinta un tip “salbatic” de gena P53 [25]. S-a ra[portat ca o alela particulara a P53 cu arginina in loc de prolina intr-o anume pozitie, este mai susceptibila la degradare prin E6. in mod corespunzator, indivizii cu forma “ argininica” a p53 au un risc de 7 ori mai mare de a dezvolta cancer. Produsul genei E6 se leaga la p53 si determina degradarea rapida prin intermediul mubiquitinligasei. Aceasta degradare are acelasi efect ca si o mutatie inactivatoare. Drept consecinta, actiunile normale ale p53 care guverneaza arestul in faza G1, apoptoza si repararea DNA vor fi anulate. Legarea oncoproteinei E7 la pRb reprezinta o functie complementara. Ea va fi urmata de eliberarea factorului de transcriptie E2F care va activa transcriptia genelor care stimuleaza sinteza celulara de DNA si intrarea celulei in faza S a ciclului celular. Rezultatul va fi stimularea sintezei de DNA si proliferarea celulara. Daca actiunea E6 anterioara a eliberat celula de sub controlul p53, celula va supravietui in faza S cu un DNA lezat, iar actiunea E7 va determina replicarea DNA-HPV.

Cercetarile privind proprietatile oncogenice ale E6 si E7 si efectele lor asupra P53 si pRb au demonstrat in continuare cum ele submineaza ciclul celular si procesele reglatorii prin cicline, Kinaza ciclin-dependente (CDKs), inhibitori ai kinazelor ciclin-dependente (CDIs) si astfel transforma si imortalizeaza celula gazda [26].

Fig.9. Efectul proteinelor virale E6 si E7 asupra ciclului celular (Modificat dupa Robbins and Cotran, pathologic basis of disease, 7th edition, 2005)

Integrarea DNA-ului viral in genomul celulei gazda este asociata cu progresia de la policlonalitate, la monoclonalitate in leziunile scuamoase intraepiteliale, aspect important in progresia leziunii de la grad redus, la grad inalt[27].

In leziunile preinvazive de grad inal (CIN I- CIN III), virusurile sunt frecvent localizate extracromozomial. In carcinoame ele sunt integrate in cromozomi. Integrarea conduce la un avantaj selectiv care va rezulta in proliferare celulara necontrolatsa si aneuploidie.

O teorie interesanta este cea propusa de Tewari si colab. [28]. Aceasta evidentiaza afectarea de catre E7 a legaturii functionale intre pRb si histon-deacytelaza 1 (HDAC1) cu expresia subsecventa aberanta a proteinelor Notch-1, care la randul lor duc la carcinom scuamo-celular cervical.

HDAC-1 strange legatura intre DNA si nucleozomi, prevenind accesul factorilor de transcriptie la elementele de recunoastere ale DNA. Conform teoriei, aceasta bariera este ridicata cand degradarea E7 a pRb previne legarea HDAC-1. ca rezultat, se va produce o expresie aberanta a genelor care participa la proliferarea celulara ca si a genelor Notch si a altora implicate in statusul celulei.

Notch-1 codifica o proteina transmembranara si participa la determinarea progresiei celulelor imature catre un status mai diferentiat.

Prezenta Notch-1 in zona e tranzitie a fost dovedita, in special in celulele de rezerva de sub epiteliul cilindric diferentiat, in ariile de metaplazie.

Deci teoria sugereaza ca rezultatul distrugerii legarii HDAC1 de catre E7-pRb va fi o functionare aberanta a Notch-1, ceea ce va favoriza difentierea asimetrica a celulelor precursor in celulele scuamoase, in loc de epiteliu cilindric. Actiunea genelor HPV in celule scuamoase previne apoptoza, ducand la hiperplazie. Teoria propune mai departe ca persistenta E6 si E7, plus actiunea co-factorilor oncogeni vor rezulta in carcinom scuamo-celular.

Capsida virala este constituita in proportie de 95% din proteina L1 care reprezinta proteina majora a capsidei si 5% din proteina L2. Rolul proteinei minore de capsida este de a facilita asamblarea capsomerelor si formarea capsidei virale prin intermediul puntilor disulfidice dintre capsomere.[39]

HPV in patologia umana

HPV poate infecta celulele bazale epiteliale la nivelul pielii sau mucoaselor( mucoasa orala, faringe, esofag, laringe, trahee, conjunctiva, zonele genitale si anale). Perioada de incubare a virusului este de 3-4 luni. Dupa infectarea celulelor bazale, virionul se asambleaza in nucleu si ulterior, pe masura ce keratinocitele sunt descuamate, este eliminat.

HPV se manifesta diferit in functie de fazele ciclului viral. Faza de latenta se caracterizeaza prin modificari morfologice minime, sau absente, in timp ce faza de replicare se asociaza cu modificari variate, de la anomalii celulare de tip diskeratozic si koilocitic , pana la defecte majore de maturare epiteliala si aparitia leziunilor net tumorale.

Semnele clinice ale infectiei HPV pot aparea la luni sau chiar ani de la infectia initiala. Simpla infectare cu HPV nu este suficienta pentru instalarea infectiei cu HPV si transformarea potentialului sau spre

neoplazie; infectia cu HPV, in special cu tipurile 16, 18, 31 si 35 identificate in peste 93% din cazuri, reprezinta factorul de risc esential pentru cancerul de col. Totusi, nu orice infectie virala cu HPV este urmata de dezvoltarea unui cancer de col. Grupurile de virusuri oncogene HPV sunt necesare dar nu suficiente pentru histogeneza unei leziuni CIN; evolutia acestora catre malignitate este favorizata de factorii de risc si dependenta de raspunsul immunologic al gazdei.

Infectia cu HPV este o maladie virala, transmisibila sexual. Este o afectiune multicentrica, multifocala, cu evolutie cronica , prezenta atat la femei cat si la barbati, 2-3 din partenerii femeilor infectate cu HPV fiind contaminati. Mai mult, infectia cu unele dintre aceste virusuri este incriminata ca un factor important in unele cancere genitale atat la femeie cat si la barbat. Cancerul de col reprezinta una dintre localizarile maligne cu cea mai mare frecventa la femei, in lume fiind descoperite aproximativ 456.000 de cazuri noi anual (15% din cancerele nou depistate la femei), producand 200.000 de decese in fiecare an.

In procesul carcinogenezei un argument important pentru implicarea HPV in cancerele umane aparute natural este evidentierea unor secvente genomice virale in genomul celulelor maligne. Progresia leziunilor determinate de HPV spre malignizare este foarte lenta implicand cofactori celulari si virali. HPV prezinta un inalt grad de specificitate de specie, omul fiind unica gazda pentru HPV. Manifestand un tropism celular marcat, HPV infecteaza numai suprafata epiteliului pavimentos al pielii si al mucoaselor, putand determina tumori epiteliale. Intre infectia cu HPV si diversele leziuni neoplazice epiteliale ano-genitale, laringiene si cutanate exista o legatura cauzala, fiind demonstrata participarea in procesul carcinogenezei atat a produsilor virali cat si a factorilor genici celulari. Stabilirea tipurilor virale cu potential oncogen este deosebit de importanta pentru depistarea posibilitatilor evolutive spre carcinomul de col uterin, care este al doilea cancer ca frecventa la femeie in majoritatea tarilor europene.

In localizarile cervicale ale leziunilor produse de HPV, diagnosticul este intotdeauna complex: colposcopic, citologic si histologic acesta din urma completat cu metode moderne de imunohistochimie si biologie moleculara. Studii de biologie moleculara si de histopatologie au demonstrat prezenta acestor virusuri in peste 80% din cazurile de leziuni neoplazice scuamoase ano-genitale si cutanate. Anual, 2-3% dintre femeile tinere dezvolta leziuni cervicale morfologice clinic semnificative, sau inaparente, datorate infectiei cu HPV, infectie transmisa pe cale sexuala. Dintre cele peste 118 de tipuri de HPV, aproximativ 20 de tipuri din tractul genital feminin ar avea un potential oncogen; interactiunea dintre produsii virali si cei ai genelor celulare ar juca un rol in carcinogeneza leziunilor de tip epidermoid ale exocolului, dar intr-o proportie mare in adenocarcinoamele endocolului. Relatia dintre infectia cu HPV si neoplazia cervicala a fost imaginata de Ambros si Kurman (1995), astfel:

-infectia cu HPV incepe la nivelul celulelor bazale de la nivelul epiteliului metaplazic; expresia morfologica consta in leziuni intraepiteliale scuamoase cu grad scazut;

-in cazul cand infectia regreseaza, nu apar anomalii morfologice, iar DNA-ul viral nu poate fi detectat;

-daca regresia este partiala, DNA-ul viral este detectabil in epiteliul normal si infectia persista; acest tip de infectie poate fi produs de oricare tip de HPV;

-in prezenta unor cofactori, inca neidentificati, infectia virala progreseaza spre leziune intraepiteliala scuamoasa de grad inalt sau spre neoplazie ; aceasta infectie este de obicei cu tipul 16, sau mai rar, cu HPV 31,33,35;

-progresia rapida spre carcinom invaziv se produce de obicei in prezenta tipului HPV 18; leziunea progresiva poate trece prin stadiile de CIN I si CIN II, sau poate progresa direct spre carcinomul invaziv.

Un numar de tipuri virale sunt implicate in producerea anumitor tumori epidermoide, benigne si maligne avand si alte localizari: anala, cutanata, orala sau laringiana.

In tabelul 3 sunt prezentate cele mai frecvente leziuni produse de HPV si subtipurile virale implicate.

Tabel 3

Prezenta secventelor nucleotidice virale tipice atat in leziunile epiteliale considerate precursoare cat si in cele maligne, in situ sau invazive, a putut fi determinata cu metodele biologiei moleculare, in speta hibridizarea in situ (ISH), si amplificarea genica enzimatica (PCR) clasica. Prin aceste metode au fost identificate peste 20 de tipuri virale asociate acestor leziuni . Dintre acestea, unele au potential oncogenic cu risc mic (tipurile 6,11,42-44), iar altele cu risc mare (tipurile 16, 18, 31, 33, 35); modificarile morfologice produse de diferitele tipuri, variaza, la fel ca si cele produse de virusuri in diferitele faze ale ciclului replicarii.

Actiunea HPV se manifesta diferit in fazele ciclului viral. Faza de latenta se caracterizeaza prin modificari morfologice minime, in timp ce faza de replicare se asociaza cu modificari ce variaza, de la anomalii celulare de tip diskeratozic si koilocitic pana la defecte majore de maturare epiteliala si aparitia leziunilor net tumorale.

In celulele infectate se produce asa-numitul efect citopatic viral, caracterizat morfologic prin aparitia diskeratocitelor si a koilocitelor. Koilocitele au caractere morfologice care pot fi identificate atat pe frotiuri cat si pe sectiuni histologice. Prezenta lor pe frotiuri poate fi folosita in aprecierea infectiei virale in cadrul programelor de screening pentru carcinomul de col uterin. Aparitia lor pe sectiunile histologice se asociaza cu usoara proliferare a celulelor bazale in condiloamele acuminate sau in displazii. Integrarea virala este prezenta mai ales in carcinomul invaziv. Numarul de koilocite este variabil, ele putandu-se prezenta solitare sau in agregate celulare.

Clasic, koilocitul este o celula superficiala sau intermediara cu un nucleu atipic, fie marit ca dimensiuni, fie cu aspect retractat, stafidit. Cromatina poate fi macrogranulara, dar alteori nucleii pot avesa aspect opac, sters sau picnotic. Caracteristic este haloul clar perinuclear cu o demarcatie neta. La periferie citoplasma este condensata , omogena, uneori sticloasa. Frecvent celulele sunt binucleate, mai rar multinucleate.

In ceea ce priveste leziunile cervicale, tabelul urmator prezinta comparativ, criteriile de diagnostic ale sistemelor internationale in vigoare, pe care le-am utilizat si noi in diagnostic.

Prezenta HPV a fost constatata in ultimul timp si in adenocarcinoamele endocervicale si in leziunile lor precursoare, asociate frecvent cu leziuni epidermoide intraepiteliale severe.

Modificarile morfologice produse de HPV sunt mult mai usor de urmarit in practica histopatologica curenta decat detectarea secventei nucleotidice virale sau amplificarea lor enzimatica. Aprecierea modificarilor morfologice are insa un caracter subiectiv datorita numeroaselor anomalii celulare nonvirale cu care ele se pot confunda (metaplazia imatura, atrofia, pseudo-koilocitoza). De aceea s-a incercat cresterea preciziei diagnosticului prin utilizarea analizei interactiunilor genice virale si celulare cu metodele biologiei moleculare si corelarea aspectelor diferitelor etape ale progresiei tumorale cu modificari morfologice cat mai precise. Metodele de amplificare enzimatica a ADN (PCR) sau de hibridizare in situ (ISH), au o mare sensibilitate si specificitate, dar sunt foarte laborioase si costisitoare. Detectarea directa a HPV prin electronomicroscopie (EM) are o sensibilitate redusa. Cultivarea in vitro a celulelor epiteliale cervicale infectate este de asemenea dificila, intrucat HPV se dezvolta doar pe keratinocite.

O buna sensibilitate cu posibilitatea detectarii capsidei proteice a virusului concomitent cu vizualizarea structurilor histologice in care este el cantonat si la un pret de cost incomparabil mai scazut, o prezinta metoda imunohistochimica (IHC). Aceasta are o reproductibilitate mare; posibilitatea utilizarii materialului inclus la parafina permite efectuarea de studii retrospective; tehnica de lucru este rapida, relativ simplu de executat. Este de luat in considerare si posibilitatea aplicarii sale pe frotiuri de citologie vaginala, usor de obtinut in cadrul programelor de screening, dar insuficient verificata pana in prezent.

PARTEA SPECIALA

A. Obiectivele studiului

B. Material si metoda

C. Rezultate si discutii

D. Concluzii

Obiectivele studiului

Diagnosticul infectiei cu Mtuberculosis cu diverse localizari pe material arhivat la parafina prin metode clasice

Evidentierea infectiei cu M tuberculosis prin PCR

Diagnosticul complex citologic, histopatologic, imunohistochimic si prin hibridizare in situ al infectiei cu HPV

MATERIAL SI METODA

In ceea ce priveste infectia cu M tuberculosis am efectuat un studiu pe 44 de cazuri, 42 de cazuri de leziuni tuberculoase sau presupus tuberculoase si 2 cazuri martor, unul pozitiv si altul negativ, inregistrate la Institutul V.Babes din Bucuresti. Cazurile provin din arhiva Institutului V.Babes.

Materialul a constat din fragmente tisulare prelevate prin biopsie incizionala sau excizionala, fixate in formol tamponat 10% si incluse la parafina. Examenul preliminar a fost efectuat pe coloratia Hematoxilina-Eozina (HE). Pentru efectuarea coloratiilor histochimice speciale s-au folosit sectiuni la parafina de 3 microni.

Pentru studiul infectiei HPV am analizat un numar de 30 cazuri din cazuistica de rutina a Institutului “Dr.Victor.Babes” reprezentat de biopsii cervicale fixate in formol tamponat 10% si incluse la parafina, precum si frotiuri citovaginale selectate in urma examenului colposcopic si de triere citologica. Pentru unele cazuri a fost posibila examinarea succesiva a frotiurilor si a biopsiei cervicale sau a piesei de conizatie. La cazurile studiate am efectuat coloratia de rutina HE, urmata de coloratii imunohistochimice si hibridizare in situ. Pentru examenul citologic s-au efectuat coloratiile Papanicolaou.

Metode clasice de diagnostic al infectiilor cu M. Tuberculosis si HPV

Coloratia hemalaun – eozina (HE)

Colorația hematoxilină – eozină utilizează drept coloranți hemalaunul Meyer (colorant bazic) și eozina (colorant acid – de fond); ca rezultate, nucleul se colorează albastru-violet, iar citoplasma – roz-roșu. Tehnica de colorare s-a efectuat după cum urmează :

– după pregătirile de rigoare (recoltare, fixare, spălare, includere la parafină și secționare), lamele sunt ținute în apă câteva minute

– se colorează 10 min. în hemalaun Meyer acidulat

– se spală cu apă de robinet (cufundând lamele de 2-3 ori într-un pahar cu apă)

– se lasă lamele în apa în care se pun 1-3 cm3 din soluție saturată de LiCo3, până ce culoarea nucleilor devine neagră la controlul microscopic, iar culoarea secțiunilor din violet devine neagră (LiCo3 alcalinizează apa; alcalinitatea determină virarea culorii hemalaunului)

– se spală din nou lamele cu apă distilată

– se colorează cu eozina 2-3 minute; dacă se colorează pe lamă se pun câteva picături de eozină întrucât soluția colorantă este foarte puternică

– se spală abundent cu apă pentru dizolvarea și eliminarea eozinei apoase în exces

– se spală abundent cu alcool etilic 900 (pe lamă), pentru eliminarea excesului de eozină alcoolică; secțiunile trebuie să fie de culoare roz, dacă sunt roșii înseamnă că sunt supracolorate și trebuie încă bine spălate

– se deshidratează cu alcool 950, alcool absolut, xilen fenicat, xilen, și se montează în balsam de Canada

Determinarea etiologiei infectiei cu MT sau cu MOTT s-a efectuat prin 2 coloratii histochimice clasice:

– coloratia Ziehl-Neelsen (ZN), care evidentiaza bacilii TBC alcoolo-acidorezistenti colorati in rosu cu fuxina, pe fond albastru cu albastru de metil.

– coloratia PAS care evidentiaza micobacteriile atipice (Rosu violaceu), utilizand fuxina bazica sau pararosanilina.

Coloratia Ziehl-Neelsen (ZN):

a) Coloranti:

– fuxina fenilata Ziehl.

– albastru de metil.

b) Rezultate:

– bacili tuberculosi rosii.

– restul albastru.

c) Tehnica:

– frotiul uscat si fixat se acopera un timp de 10 min. cu fuxina concentrata care se numeste fuxina fenilata Ziehl

In timpul celor 10 min se incalzeste lama pe dedesubt pana la emisia de vapori (sa nu fiarba). Se repeta de 3-4 ori pentru ca fuxina sa fie fierbinte. Daca fuxina se evapora, ea trebuie inlocuita. Lama trebuie sa fie mereu acoperita cu fuxina – se apala foarte bine.

– toata lama este rosie

– decolorarea cu alcool 97% si acid clorhidric 3%. Se lasa 1 min

– se pot repeta spalarea si declorarea

– micobacteriile raman rosii si restul se decoloreaza

– se pune albastru de metilen 1- 2 min

– se spala bine si se examineaza

Coloratia PAS

Coloratia PAS este o tehnica histochimica utilizata pentru studiul glicogenului, glicolipidelor si GAG (glicozaminoglicani) prezenti in substanta fundamentala din tesuturi.

Reactivi:

– reactiv Schiff.

– apa sulfuroasa.

– solutie apoasa de acid periodic.

Rezultate: substantele PAS (+) se coloreaza in rosu viu.

Tehnica reactiei:

– deparafinare, hidratare

– oxidare 5-10 min. cu acid periodic

– spalare 5 min. cu apa distilata

– tratare 15-30 min. cu reactiv Schiff

– spalare in 3 bai cu apa sulfuroasa cate 2 min. in fiecare

– spalare 10 min. cu apa curenta

– colorare de fond (facultativ) cu hemalaun, hemalaun-oranj G,

allocrom Lillie etc.

– deshidratare, clarificare, montare in balsam neutru

Rezultate

– MPZ (mucopolizaharidele ) se coloreaza in albastru (sau in verde daca

se face colorare de fond)

– substantele PAS (+) se coloreaza in rosu

-MOTT sunt PAS (+) si ZN (-)

Colorația Babeș Papanicolaou (pentru frotiuri cervico-vaginale)

Metoda Papanicolau reprezinta o reactie de colorare policroma destinata sa evidentieze variatiile legate de maturarea celulara si activitatea metabolica. Deoarece celulele indemne se suprapun si unele apar intr-o configuratie tridimensionala, cea mai importanta caracteristica a coloratiei Papanicolaou este transparenta celulara rezultata. Beneficiile utilizarii acestei metode sunt evidentierea detaliilor nucleare si a transparentei citoplasmatice.

Coloratia Papanicolau presupune cinci etape:

 fixare -pentru mentinerea cat mai adecvata a detaliilor celulare de pe frotiu

   colorare nucleara – nucleul reflecta potentialul de reproducere celular; dimensiunea si intensitatea cromatica a nucleului sunt factori critici in evaluarea celulei

colorare citoplasmatica – permite citologilor sa diferentieze intre diferite tipuri de celule;

    clarificare – mentine citoplasma transparenta; permite citologilor sa poata vedea printre straturile de celule;

  montare si acoperirea frotiului cu lamela – asigura conservarea pe termen lung a frotiurilor citologice .

Reactivi :

etanol 950

apă distilată

hematoxilină Harris

apă de robinet

etanol absolut

OG 6, EA 50

Tehnica de colorare :

se pune etanol 950, timp de 2 minute, apoi

apă distilată 2 minute

hematoxilină Harris 1-2 minute

apă de robinet 5 minute

etanol 950, 15 secunde

OG 6, 2 minute

etanol 950, 15 secunde 2 băi succesive

EA 50 5 minute

etanol 950, 15 secunde

etanol absolut 30 secunde, 2 băi succesive

toluen 2 minute, 2 băi

Rezultate :

nuclei : albastru violet

citoplasmă cianofilă albastru-verde

citoplasmă eozinofilă roz

citoplasma keratinizată de la roz la portocaliu

Celule ce apar in frotiurile citologice

Celule scuamoase

                                                           i.      Celule superficiale

                                                           ii.      Celule intermediare

                                                           iii.      Celule parabazale

                                                           iv.      Celule bazale

celule glandulare

                                                           i.      celule endocervicale normale

                                                           ii.      celule endocervicale metaplaziate

                                                           iii.      celule endocervicale metaplazice atipice

                                                           iv.      celule endometriale

celule inflamatorii

                                                           i.      granulocite

                                                           ii.      limfocite

                                                           iii.      histiocite

                                                           iv.      macrofage

Organisme ce determina, la nivelul frotiului, modificari celulare benigne

Haemophilus vaginalis (Gardnerella vaginalis)

Candida albicans

Trichomonas vaginalis

Leptotrix

Actinomyces

Herpes simplex virus tip 2

Metode moderne de diagnostic al infectiilor cu M tuberculosis: reactia de amplificare ADN prin PCR

Principiul metodei

PCR permite amplificarea selectiva in vitro a unei regiuni particulare deDNA mimand fenomenul de replicareDNA in vivo.

Sunt necesari urmatorii compusi de reactie: matrita DNA unicatenara, primeri (secvente de oligonucleotide de la capetele unei secvente de DNA definite), dezoxinucleotide trifosfat (dNTP) si o enzima, DNA polimeraza.

In conditii corespunzatoare, poate sa fie astfel sintetizata enzimatic o noua catena DNA complementara matritei dorite. (fig. 10)

Figura 10. Sinteza enzimatica a catenei de ADN de la capatul

3'OH al primerului. Catena nou sintetizata va fi complementara

matritei (Rolfs A., Schuller I., Finckh U., Weber- Rolfs I., “PCR

Clinical Diagnostics and Research”, Springer Verlag NYBerlin-

Heidelberg, 1992)

Introducerea polimerazei termostabile a dus la imbunatatirea si automatizarea metodei PCR. [48]

Reactia in sine este alcatuita din 3 timpi: 1) denaturarea DNA-ului dublu catenar la 92-96oC; 2) fixarea primerilor la situsurile complementare ale matricii la 45- 72oC si 3)extensia de primeri de la capatul 3’OH prin adaugare succesiva de oligonucleotide, la 72oC

Schema de denaturare, fixare si extindere, definite pe o perioada anumita de timp se numeste ciclu. Repetarea ciclului duce la amplificarea DNA. Daca doi primeri diferiti- fiecare legandu-se selectiv de una dintre catenele complementare deDNA- se extind intr-un ciclu de amplificare, atunci fiecare DNA nou creat va contine un loc de legare pentru celalalt primer. In acest fel fiecare DNA devine matrita pentru orice ciclu de amplificare care va urma, largind cantitatea de matrite de la ciclu la ciclu. Cicluri repetate de amplificare, duc teoretic la sinteza exponentiala a fragmentului de DNA cu lungimea determinata de primerul de la capatul 5. Cresterea exponentiala se exprima prin formula: (2n-2n)x unde n=numarul de cicluri, 2n=produsi de extindere primara si secundara de lungime nedeterminata, x=numar de copii de matrita initial.

Figura 11. Primul ciclu de amplificare DNA. Sinteza DNAincepe din

doua locuri de legare a primerilor, fiecare pe cate o catena initiala.

Catenele nou sintetizate nu au o lungime predefinita (Rolfs A., Schuller

I., Finckh U., Weber- Rolfs I., “PCR Clinical Diagnostics and

Research”, Springer Verlag NY- Berlin-Heidelberg, 1992)

Figura 12. Al doilea ciclu de amplificare DNA. Dupa denaturarea

produsilor primari din primul ciclu, primerii se ataseaza de catenele

originale si de cele sintetizate in primul ciclu. Catenele nou sintetizate

din produsii secundari vor avea o lungime bine determinata

corespunzator distantei dintre capetele 5’ a celor doi polimeri (Rolfs

A., Schuller I., Finckh U., Weber- Rolfs I., “PCR Clinical Diagnostics

and Research”, Springer Verlag NY- Berlin-Heidelberg, 1992)

Figura 13. Dupa ciclul 3 sunt sintetizate primele fragmente

scurte dublucatenare, acestea se amplifica exponeltial in

ciclurile urmatoare, produsii secundari se amplifica liniar

(Rolfs A., Schuller I., Finckh U., Weber- Rolfs I., “PCR

Clinical Diagnostics and Research”, Springer Verlag NYBerlin-

Heidelberg, 1992)

Ca in figura 11,produsii primari de extindere rezulta din sinteza de DNA de pe matrita originala in primul ciclu. Produsii secundari rezulta din sinteza dupa denaturare a produsilor primari si se amplifica liniar in urmatoarele cicluri. (fig. 12). Ei au lungime nedeterminata. In ciclul 3 fig. 13 sunt sintetizati primii produsi tinta de lungime definita din denaturarea produsilor secundari. Dupa primele 4 ciclui se declanseaza cresterea exponentiala a fragmentelor tinta. In principiu, fiecare component fizic sau chimic al reactiei poate fi considerat un factor variabil si poate fi modificat pentru a realiza o crestere potentiala a calitatii reactiei.

Mixul de reactie, componenti si cantitate

1. Concentratia enzimei 1-2,5 unitati

2. Dezoxinucleotide 20-200 microM fiecare

3. Mg2+ 1,2-2,5 mM

4. ioni 40mM NaCl 50mM KCl

5. Primeri 0,026- 0,2 .M

6. pH 8,8

7. ADN liniar, mici fragmente 1-3 .l

Se adauga apa pana la volum de reactie 10-100.l.

Primerii

Reguli [34]:

– lungime 18-24 ncl

– Continutul G/C aprox 50%

– Elemente de structura secundara fara polindroame (in limita posibilitatilor)

– Sa nu fie complementari intre ei

– Sa nu aiba secvente purinice sau pirimidinice

– Sa aiba temperaturi de topire asemanatoare

Obiectivarea rezultatelor

In general se face detectia produsului de reactie prin electroforeza cu migrare pe gel de agaroza (0,4- 1,2 %) si apoi citirea cu lampa cu UV.(metoda folosita si de noi). Este metoda cea mai simpla, ieftina si fidela. Produsul trebuie sa apara ca banda clara la nivelul corespunzator. Benzi difuze la frontul de gel arata fragmente mici de ADN ca de ex primeri sau dimeri.

Benzi neclare in plus arata produsii secundari aparuti prin priming sau DNA monocatenar si o posibila cauza ar putea fi ca primerii nu sunt in cantitati echimolare.

PCR pentru Mycobacterium Tuberculosis

Estimarea sensibilitatii metodei, variaza de la 10 (Bass et. Al 1990)la 100% (Bates 1997) de MT pe ml de sputa. [54] Aceasta mare variatie se explica prin marele numar de metode pentru detectarea ADN MT prin PCR, metode care au la baza strategii diferite si au ca secventa de nucleotide tinta zone diferite ale catenei. Strategiile folosite se bazeaza pe amplificari de secvente specifice speciei sau mai multor specii dar urmata de identificarea speciei, amplificare ‘nested’, sau amplificare de ARN.[24]

Se poate lucra cu sputa si alte umori ale organismului precum si cu tesuturi proaspete sau fixate la parafina, cu RNA sau DNA. Amplificarea poate fi urmata de hibridizare pentru a creste specificitate si sensibilitatea reactiei.

Primerii folositi pentru amplificarea si hibridizarea MT in PCR sunt prezentati in tabelul 7-5 [54].

Tabelul 7-5. Primeri utilizati in reactia PCR

Metoda de amplificare a DNA-ului prin reactia de polimerizare in lant efectuata pe material fixat in formol si inclus la parafina se remarca printr-o senzitivitate extreme de crescuta si printr-un proces relativ simplu. Printre alte calitati ale metodei se mai numara posibilitatea de a folosi material de peste 40 de ani vechime si necesarul redus de specimen. In felul acesta metoda se dovedeste de o utilitate deosebita, avantajele constand in materialul arhivat (practic in orice sectie de histopatologie blocurile de parafina se pastreaza minim 30 de ani) ce ofera posibilitati de cercetare teoretic nelimitate. Exista insa si probleme in ce priveste calitatea materialului genetic extras care odata cu cresterea vechimii se degradeaza facand tot mai dificila realizarea reactiei PCR.

Extractia ADN din probe

Dintre factorii procesarii tesutului care altereaza DNA- ul se cunosc (atat din literatura cat si din experienta noastra):

– fixarea indelungata a tesutului in formol

– concentratia (si poate calitatea) formolului

– indepartarea corespunzatoare a acestuia inainte de includere (problema pe care ne-am pus-o ulterior )

Formolul, in cazul unei actiuni crescute asupra DNA- ului creeaza legaturi incrucisate intre molecule, iar intreaga procesare de includere la parafina duce la fragmentarea DNA-ului (de unde dificultatea reactiei de amplificare si a obtinerii unor produsi de lungime ce depaseste 600- 800 perechi de baze).

Astfel, unul din cazurile lucrate care a fost fixat in formol timp de 4 zile nu a dat nici un rezultat la amplificare (desi s-a incercat repetat).

Extractia din alte blocuri fixate corespunzator a dat o alta imagine pe gel, sub forma unui “smear” intre ~1200-1000 si 600-800 perechi de baze (imagini identice cu cele din literatura) dat de fragmentarea DNA, cazuri in care s-a reusit efectuarea unei reactii de amplificare. De altfel, pentru a avea o comparatie si pentru a analiza parametrii care pot influenta calitatea fixarii (din punct de vedere al DNA) am luat in studiu piese proaspete pe care le-am fixat si inclus la parafina in laboratorul nostru.

In afara duratei fixarii, si calitatea formolului poate influenta extractia. E vorba de concentratie si pH. Formolul tamponat (pH=7,4) este recomandat in timp ce majoritatea laboratoarelor folosesc formolul asa cum este livrat de producator ( pH= 4-6).

Exista mai multe protocoale pentru extractie (numerosi autori facand studii comparative ) ce incearca astfel sa obtina pe de o parte simplitatea metodei si pe de alta o calitate cat mai buna a ADN-ului. Se pot folosi si kituri de extactie, cum este Qiamp (produs de QiAgen).

Metodele de extractie pot diferi prin etapele de deparafinare, prin durata digestiei, si prin metoda de separare purificare a materialului genetic .

Deparafinarea

Xilen – etanol

– se aplica un tratament succesiv de 3 bai de xilen: initial se mixeaza viguros, se centrifugheaza, si se indeparteaza supernatantul la fiecare trecere.

– indepartarea xilenului se face similar, folosind etanol 100%.

– urmeaza apoi eliminarea alcoolului care se poate face prin evaporare in vacuum sau prin adaugare de acetona.

– variante ale metodei pot fi: incubarea sectiunilor la 80 grd pentru topirea parafinei sau baia de xilen incalzita la 600C, astfel imbunatatindu-se eficacitatea deparafinarii.

Digestia s-a realizat folosind Proteinaza K (SIGMA) adaugata in fiecare tub pana la o concentratie finala de 200 µg/ml. Digestia a durat 3h la 550C cu agitatie slaba la fiecare ora.

Metode de purificare

a) fara purificare

b) fierberea simpla

– peste proba se adauga 100 µl Tris- EDTA.

– incalzire la 99 grade C timp de 10 min.

– se centrifugheaza la 10 500g timp de 15 min.

– se pune pe gheata.

– se indeparteaza surplusul de parafina.

– se recentrifugheaza la 10 500g 15 min.

– prelevarea stratul superficial si se va stoca la -20 grade pentru analiza ulterioara.

c) fenol/ cloroform

– probele se agita in 100 µl fenol.

– se centrifugheaza la 10 500g 15 min.

– stratul superficial se pune intr-un nou tubulet si se adauga 100µl cloroform.

– se centrifugheaza la 10 500g 15 min.

– la stratul superficial se adauga 200µl etanol 100%: 0.03M acetat de sodiu.

– se centrifugheaza si se pune la -80 grade C timp de 30 min.

– se spala cu etanol 70% si se centrifugheaza la 10 500g 30 min.

– recoltarea acidul nucleic precipitat si se lasa la uscat.

– se va stoca la -20 0C pentru analiza ulterioara.

Metoda de extractie cu jutorul kiturilor

Am utilizat extractia cu ajutorul kitului QIA amp.Tissue Kit (QIAGEN, BIOTRADE, Austria)

peste proba deparafinizata si uscata se adauga 180 µl tampon ATL si 20µl proteinaza K (20mg /ml).

se vortexeaza bine timp de 20 sec si se incubeaza peste noapte la 56 0C.

se adauga peste proba 200µl AL.

probele se incubeaza 15 min la 70 0C.

se adauga 200µl etanol 100% si se centrifugheaza.

supernatantul este transferat pe coloane.

ADN se lasa sa se adsoarba pe o membrana siliconata QIAamp cu o scurta centrifugare (1 min, 12 000 rpm).

spalare de 2 ori cu 500 µl tampon AW1 si AW2.

se adauga 200µl buffer de elutie AE preincalzit la 70 0C intr-o coloana.

se incubeaza 5 min la temperatura camerei.

dupa centrifugare 1 min la 12 000 rpm elutia se transfera intr-un nou tubulet.

Proba astfel obtinuta se poate stoca la –20 0C.

In aceasta etapa este important de stabilit daca s-a obtinut DNA in concentratie corespunzatoare si daca nu este impurificat de proteine ramase printr-o digestie necorespunzatoare a proteinazei, care ar duce la amplificari nedorite. Pentru aceasta se foloseste o mica cantitate din proba care se dilueaza si se analizeaza la spectrofotometru, la lungimile de unda de 260nm si 280nm ,unde DNA-ul, respectiv proteinele, au absorbtia maxima. Prin cuantificarea absorbtiei se poate calcula concentratia DNA-ului iar un raport 260/280 > 1,7 arata ca nu avem proteine sau RNA in cantitate prea mare. Evidentierea DNA-ului extras se poate face si prin migrare pe gel de agaroza 1% si compararea intensitatii benzilor cu a unui marker.

Fig 14. Extractrie AND utilizand Kit-ul de extractie QIA amp.Tissue Kit

Gelul l-am preparat in laboratorul nostru din pulbere de agaroza (BIORAD- Certified Molecular Biology Agarose). Am incercat si agaroza speciala pentru PCR (BIORAD- Certified PCR Agarose) si am obtinut rezultate mai bune: benzi mai drepte, claritate mai mare.

Metoda este urmatoarea:

TBE: tris-borat EDTA: 0,089M trisborat, 0,089M acid boric, 0,02M EDTA

– tampon TBE 0,5x 130 ml.

– agaroza 1,5- 2%.

– amestecul se topeste in cuptorul cu microunde sau in baie de apa ce fierbe pana se dizolva agaroza

– se raceste la 500C

– se adauga bromura de etidiu (din solutia stoc 10 mg/ml) pana la o concentratie 0,5 µg/ml, se mixeaza bine.

– se pregateste cuva de gel, se spala bine.

– se toarna amestecul si se lasa 30-45 minute la temperatura camerei pentru realizarea polimerizarii.

– se scoate gelul.

– se pastreaza la frigider (40 C) in recipient etans.

Reactia de amplificare

Pentru controlul prezentei si calitatii DNA- ului extras s-a folosit beta globina, proteina prezenta ubiquitar in celulele umane.

Rezultatele amplificarii au fost variabile, probabil din cauza unei extractii deficitare, dar posibil si din cauze intrinseci reactiei de amplificare, incercand astfel imbunatatirea acesteia. Factorii presupusi a fi cei mai sensibili au fost Taq polimeraza si temperaturile reactiei. Astfel primele reactii s-au efectuat cu taq SuperPak (producator Sigma), dupa incercari repetate obtinandu-se reactii bune de amplificare(fig. 15).

Fig.15. Verificarea electroforetica a reactiei PCR pentru Beta-globina utilizand taq SuperPak

Din pacate nu toate cazurile cercetate au dat rezultate si mai ales reactia nu a dovedit o reproductibilitate corespunzatoare (problema cunoscuta in PCR). Procedura Hot Start este citata in literatura ca fiind net superioara.

Metoda manuala de hot start (adaugarea polimerazei in mix dupa ce acesta a fost pus in termocicler) nu a dat rezultate deosebite (risc crescut de contaminare si de erori de pipetare si reproductibilitate).

Am incercat astfel polimeraza JumpStart de la acelasi producator care asigura aceasta procedura prin fabricatia ei si nu necesita manipulari deosebite, doar modificarea timpului initial de denaturare pentru activarea sa, obtinand rezultate superioare. (Fig 16.)

Fig.16. Verificarea electroforetica a reactiei PCR pentru Beta-globina utilizand taq JumpStart

Polimerazele produse de firma Fermentas au dat de asemenea rezultate promitatoare

Din punct de vedere al temperaturilor de reactie s-au incercat si alti parametrii, scurtarea timpului de reactie (cum presupune aparatul Perkin Elmer 9700), incercarea unei metode de Touch down PCR ( cresterea gradata a temperaturii de annealing a primerilor la fiecare ciclu care ar garanta obtinerea unor produsi mai specifici) modificari promitatoare initial au dat rezultate nu cu mult superioare, concluzionand insa ca un interval de timp de denaturare initial de 5 minute este absolut necesar. Este esential sa se adapteze timpul de denaturare la felul de tuburi si la termocycler.

Obtinerea unei reactii cat mai performante se impune deoarece cazurile pozitive pentru PCR au prezentat un numar mic de bacili identificati sau nu prin metoda histochimica in tesutul analizat, ceea ce furnizeaza o cantitate redusa de DNA micobacterian problema intalnita si de alti autori .

Prepararea mixului pentru amplificare:

Acesta este alcatuit din: proba de analizat (o mica cantitate din ce am obtinut anterior), cei doi primeri, Taq polimeraza (SIGMA JumpStart; Fermentas BSA), clorura de magneziu, mix de nucleotide, si un tampon.

Primerii utilizati au fost sintetizati la Universitatea din Torino Italia (Prof. Bussolati) – IS 6110 pentru MT (EAB 577 si EAB 578) si IS 900 pentru MOTT (IT 3337 si IT 3338), si ulterior pe baza secventei cunoscute au fost sintetizati primeri Invitrogen. Pentru Beta globina s-au utilizat primerii EAB 524 si EAB 525. O atentie deosebita trebuie acordata manipularilor care trebuiesc efectuate in mediu steril sub hota. Amestecul obtinut este gata de amplificare.

Voi da 2-3 exemple pentru a ilustra mai bine tehnica de lucru:

Mix PCR pentru detectarea beta globinei in probe, demonstrand astfel prezenta DNA celular:

1) PCR BETA

Pentru reactie a fost folosit termocyclerul Perkin Elmer. Acesta trebuie sa supuna proba unei succesiuni de temperaturi pentru intervale bine stabilite de timp intr-un numar de cicli. Evidentierea materialului amplificat a fost facuta prin electroforeza in gel de agaroza, in plan orizontal. Colorantul utilizat a fost albastrul de bromfenol (LKB, Bromma, Suedia).

Identificarea fragmentului obtinut se face comparand migrarea cu a unui marker care se alege in functie de marimea fragmentului amplificat, care se calculeaza la randul sau stiind structura primerilor si a DNA-ului gazdei.

Metode moderne de diagnostic al infectiilor cu HPV: tehnica de imunohistochimie si tehnica de hibridizare in situ (ISH) pe material arhivat la parafina

Tehnica de imunohistochimie :

O buna sensibilitate cu posibilitatea detectarii capsidei proteice a virusului concomitent cu vizualizarea structurilor histologice in care este el cantonat si la un pret de cost incomparabil mai scazut, o prezinta metoda imunohistochimica (IHC). Aceasta are o reproductibilitate mare; posibilitatea utilizarii materialului inclus la parafina permite efectuarea de studii retrospective; tehnica de lucru este rapida, relativ simplu de executat. Este de luat in considerare si posibilitatea aplicarii sale pe frotiuri de citologie vaginala, usor de obtinut in cadrul programelor de screening, dar insuficient verificata pana in prezent.

Metoda folosită de rutină pentru evidențierea antigenelor tisulare a fost tehnica indirectă tristadială ABC (avidină – biotină complex), după Hsu S.M, et al. [56], modificată de Bussolati și Gugliotta [57], utilizând anticorpi monoclonali sau policlonali anti capsida virala, în Institutul Național “Victor Babeș”.

Tehnica se bazează pe metoda indirectă a complexelor imune circulante PAP (peroxidază – antiperoxidază) introdusă prima oară de Ludwig Sternberger în 1970 [58].

Controlul negativ a fost făcut utilizând un anticorp primar nerelevant sau înlocuind anticorpul secundar cu tampon fosfat salin. De asemenea, pentru asigurarea acurateței IHC, a fost efectuat controlul intern de calitate conform unui sistem certificat de asigurare al calității (ISO 9001/2001).

Principiul metodei este înfățișat în fig.17 :

In prima etapă, Ac (anticorpul) primar se cuplează cu Ag (antigenul) dorit; în a doua etapă, de Ac primar se leagă un Ac secundar, marcat cu biotină;

In a treia etapă, se introduce un reactiv cu mai multe molecule de avidină combinate cu biotina marcată cu peroxidază de hrean (HRP);

La locusul antigenic se leagă un complex cu multe molecule de peroxidază, intensitatea reactiei cromogene va fi accentuată și sensibilitatea metodei va fi mare.

Fig.17 Principiul metodei IHC indirecte tristadiale ABC

Tehnica propriu-zisă s-a aplicat pe fragmentele de tesut inclus în parafină și secționat la 3 m grosime. Secțiunile au fost etalate pe lame tratate cu Poly-l-lysină. A urmat deparafinarea, hidratarea și inhibarea peroxidazei endogene, prin trecerea printr-o soluție de apă oxigenată 0,3% timp de 30 de minute. După spălarea în tampon fosfat salin (PBS) pH = 7, acolo unde a fost necesar s-a făcut un pretratament cu pronază (digestie enzimatică), sau prin fierbere la cuptorul cu microunde (pretratament termic).

Blocarea biotinei endogene s-a realizat utilizând soluție de albuș de ou în 100 ml apă distilată și biotină 0,2% în PBS. Lamele au fost trecute prin 2 băi succesive: albumina (15 min.), respectiv biotina (15 min.).

A urmat legarea situsurilor nespecifice de tip Fc prin adăugarea serului normal timp de 20 de minute. Etapa de incubare cu anticorpii primari în diluțiile specifice de lucru a avut loc peste noapte în camera umedă la temperatura camerei.

In ziua a 2-a, după spălarea timp de 20 de minute în PBS, s-a adaugat anticorpul secundar (cu rol de punte) cu care s-au incubat secțiunile 30 de minute la temperatura camerei. A urmat apoi o incubare de 45 de minute cu complexul ABC (kit Vector, Burlingame, USA). După spălarea în apă curentă s-a efectuat developarea într-o soluție de diaminobenzidină (10 mg DAB în 88 ml PBS) cu 0,0025 ml apă oxigenată.

Diaminobenzidina scindată de peroxidaza liberă din complexul ABC, a produs un precipitat de culoare brună, localizând cu precizie antigenul căutat, fie în citoplasmă, fie în nucleu. S-a realizat o contracolorare a nucleilor cu hemalaun Meyer, urmată de deshidratare, clarificare și montare într-un mediu organic sintetic.

Principalii anticorpi utilizati si parametrii de lucru au fost:

A fost aplicata pentru unele cazuri metoda de amplificare a semnalului cu tiramina la cald, preconizata de Bussolati si col. (1999).

Metoda de amplificare cu tiramina a fost cea a lui Kerstens (1995), modificata de Bussolati. Biotinilarea tiraminei s-a efectuat dupa metoda lui Adams [30]. Blocarea biotinei endogene s-a realizat cu metoda realizata de Bussolati [32].

Tehnica de lucru a fost urmatoarea:

Dupa deparafinare si rehidratare, lamele au fost imersate in apa oxigenata 3% , pentru inhibarea perozidazei endogene, apoi tratate cu solutie de albus de ou pentru 15 minute la temperatura camerei (TC). Fara incubare cu serul normal, s-a aplicat anticorpul primar, iar a doua zi s-a efectuat dupa aplicarea anticorpului secundar biotinilat si incubarea cu avidina peroxidata, o incubare cu tiramina biotinilata in apa oxigenta 15 min., apoi s-a efectuat o spalare in tampon fosfat salin (PBS) la cald si una la rece. S-a incubat apoi cu Streptavidina peroxidata (Kit DAKO, LSAB +), iar developarea s-a efectuat cu DAB. Contracolorarea nucleara s-a efectuat cu Hemalaun Meyer.

Dilutiile serului si anticorpului primar au fost facute din solutiile deja diluate pentru metoda clasica ce apar in tabelul cu anticorpi. Dilutiile noi sunt urmatoarele:

Ser policlonal: 1:10, 1: 30, 1: 50, 1:100

Anticorp monoclonal 1:1, 1:5, 1:10, 1:30

Metoda de hibridizare in situ(ISH)

Hibridizarea in situ permite localizarea unor secvente specifice de DNA sau RNA in celule si tesuturi, prin hibridizxarea acestora cu ajutorul unei probe complementare de acid nucleic.

Spre deosebire de alte tehnici bazate pe hibridizare( Northern Blot, Southern Blot, Dot Blot, PCR, etc), ISH nu necesita extragerea secventei de DNA, ci aceasta este identificata direct in celula intacta, in sectiuni histologice. Mai mult, in cadrul ISH, relatiile dintre celule se pastreaza si este posibil sa se identifice cu precizie tipurile celulare care exprima gene de interes, precum si interactiuni potential importante intre celulele care exprima diferite proteine.

Principiul ISH este urmatorul:cele doua catene ale unei molecule de DNA sunt complementare si antisens; perechile de nucleotide care constituie molecula sunt unite prin legaturi de hidrogen. Ruperea acestor legaturi determina separarea celor doua catene si denaturarea DNA. Denaturarea DNA se obtine prin cresterea temperaturii (5 minute la 95o C ), diminuarea concentratiei de ioni de Na+ a tamponului de hibridizare sau utilizand molecule care pot intra in competitie cu bazele pentru formarea legaturilor de hidrogen(ex. formamida).

Hibridizarea cu sonda (renaturarea) a acidului nucleic tinta (pentru formarea de hibrizi) se realizeaza la o temperatura inferioara cu 15oC celei de topire, cu o forta ionica crescuta, pentru a scadea respingerile electrostatice dintre molecule. Adaugarea de formamida in tamponul de hibridizare permite scaderea temperaturii de hibridizare. In scopul cresterii accesibilitatii sondei la acizii nucleici tinta sunt necesare uneori pretratamente (proteoliza cu proteinaza K). Exista doua categorii de probe pentru ISH: probe genomice si oligonucleotide.

Probele genomice sunt formate din segmente de DNA cu o lungime de peste 1000 pb. Probele mai lungi pot conduce la obtinerea de semnale mai slabe, probabil datorita faptului ca penetreaza mai putin eficient legaturile incrucisate din tesut; rezultate foarte bune au fost obtinute cu probe cu lungimea de 50-200 pb. Oligoprobele sunt mult mai scurte, fiind compuse in general din 20-40pb. Ele sunt sintetizate in laborator; prezinta dezavantajul unei relative insensibilitati in comparatie cu probele mai lungi.

Dupa hibridizare urmeaza incubarea, cu o durata de cateva ore; hibrizii incompleti sau eronati si moleculele de sonda nehibridizate sunt inlaturate prin digestie enzimatica si spalare in solutii saline de concentratii descrescatoare la temperaturi ce depind de temperatura de topire. Dupa spalarea posthibridizare ramane doar complexul tinta-proba.

Metoda de ISH utilizata este cea standardizata in Laboratorul de Anatomie Patologica a Departamentului de Anatomie Patologica a Universitatii de Studii din Torino, pentru material inclus la parafina (Patrizia Gugliotta). Aceasta foloseste sectiuni de 4 microni din blocuri de parafina obtinute pe apa distilata sau deionizata, etalate pe lame electrostatice sau tratate cu adezivi speciali (silan). Timpii metodei sunt urmatorii:

Se incepe cu deparafinarea (HemoDe, xilen) apoi indepartarea completa a solventului in alcool;

pasaje in PBS (tampon fosfat salin);

tratare cu proteinaza K 10-15 min la 37oC pentru demascarea materialului genetic;

spalare in solutie SSC 2x preferandu-se uscarea lamei inaintea fiecarei etape in curent de aer la 45-50 grd 2-5 minute;

blocarea peroxidazei endogene cu apa oxigenata;

blocarea biotinei endogene cu tratament secvential de avidina si biotina;

prehibridizare;

Hibridizarea propriu zisa se realizeaza prin adaugarea sondei (10 microlitri mix hibridizare) sub lamela; se cimenteaza si se incubeaza in camera umeda la 37grd pentru 14-18 ore;

denaturarea acidului nucleic pe placa de hibridizare la 95-100 oC timp de 5 min.;

blocarea denaturarii pe gheata 1 min.30 sec.;

incubare peste noapte la 37 oC;

spalare in tampon SSC (citrat de sodiu tribazic salin) pentru indepartarea lamelei, cu schimbarea concentratiei tamponului;

incubare cu streptavidina peroxidata;

amplificare cu tiramina la cald;

developare in DAB;

contracolorare nucleara si montare in balsam sintetic.

Sonda oligonucleotidica utilizata provine dintr-un cocktail de DNA, tipurile 6,11,16,18,31,33,35,45,51,52, DAKO, Danemarca (Y 1404).

2. REZULTATE SI DISCUTII

Au fost investigate 44 de cazuri, 27 barbati si 17 femei, cu varste cuprinse intre 13 si 81 de ani. Leziunile tuberculoase predomina la tinerii activi cu varste intre 25 si 40 ani. S-au mai folosit 2 cazuri martor pentru reactia de polimerizare in lant, unul pozitiv, cu ZN pozitiv, caz cu TBC diagnosticata si tratata, si un martor negativ, ganglion, pentru a verifica daca s-a efectuat corect extractia de ADN si daca amplificarea nu a fost contaminata.

S-au examinat fragmente tisulare, de o variabilitate remarcabila: ganglioni, plaman, perete toracic, faringe, ficat, splina, tegument, biopsie medulara osoasa, ovar , testicul, rinichi, tiroida, prostata.

Tabel 4. Distributia leziunilor TBC functie de localizare

Grafic 1. Distributia leziunilor TBC functie de localizare

Histopatologic, leziunile au fost tipice in 26 cazuri (aprox 59,09%) (grafic 2) fig 2.1., 2.2, 2.3., 2.4. care prezentau granuloame giganto-epitelioide, cu foliculi confluenti si necroza cazeoasa uneori extinsa pana la 95%;

Fig.18. TBC pulmonara miliara; granuloame tipice cu necroza cazeoasa incipienta, HE, 4x

Fig.19 Detaliu la fig.18; granulom TBC cu necroza cazeoasa centrala, celule gigante multinucleate Langhans, limfocite, HE, 10x

Fig.20. TBC pulmonar cu necroza cazeoasa extinsa, celule gigante multinucleate Langhans, HE, 4x

Fig.21. TBC ganglionar, necroza cazeoasa extinsa, celule gigante multinucleate, HE, 4x

Leziuni atipice,(fig 22), (grafic 2) s-au inregistrat la 17 cazuri (aprox 38,6%) sub forma de granuloame incomplete, cu foliculi dispersati, uneori cu fibroza, cu putine celule gigante, cu multe PMN, plasmocite si cu necroza supurativa sau palisadare nucleara perinecrotica. Doua cazuri au fost suspecte de sarcoidoza.

Grafic 2. Distributia cazurilor pe leziuni histopatologice

Fig.22. Granulom defectiv tuberculoid cu necroza supurativa, HE, 10x

Fig.23. Granulom defectiv tuberculoid cu plasmocite, HE, 10x

Din 44 de cazuri 9 au fost Ziehl-Neelsen pozitive(fig.24, fig.25), graficul 3, si 2 cazuri PAS pozitiv;

Fig.24. Bacili Koch pozitivi la col. Ziehl-Neelsen, 100x, imersie

Fig.25. Bacili Koch pozitivi, col. Ziehl-Neelsen, 40x

Fig.26. Bacili Koch pozitivi la col. Ziehl-Neelsen, 100x, imersie

Grafic 3. Reactia Ziehl Nielsen pentru cazurile studiate

Numarul cazurilor pozitive la coloratia Z-N este redus (9/44) atat in cazurile cu leziuni tipice (7) sau complete cat si in cazurile atipice (2), cu specificitate limitata sau cu leziuni incomplete. Coloratia Z-N poate aparea pozitiva insa in unele cazuri cu leziuni total atipice, care prezinta necroze supurative intinse. Coloratia poate fi pozitiva si in leziuni incomplete, cu celule limfo-monocitare, celule spumoase sau absenta necrozei de cazeificare. Cazurile cu necroza minima sau fara necroza ar fi in primul rand o indicatie pentru amplificarea prin PCR, datorita confuziei posibile cu sarcoidoza, care necesita un tratament complet diferit de al TBC.

Reactia de polimerizare in lant pentru detectarea Mycobacterium tuberculosis s-a efectuat pe cele 44 cazuri.

Un semn de alarma este procentul relativ mare de cazuri cu PCR pentru betaglobina negative(27,3%)(Grafic 4) (fig 27)

Grafic 4. Reactia PCR pentru beta-globina

Fig.27. Verificarea electroforetica a reactiei PCR pentru Beta-globina

Acest rezultat inseamna ca nu avem DNA celular corespunzator, fapt ce reduce sansele de a efectua un PCR pentru MT. De aceea aceste cazuri nu au dat un rezultat foarte fiabil in determinarea TBC prin PCR. ` Cauzele ar putea fi: piesa este prea veche, a fost tinuta prea mult in formol, formolul nu a fost de buna calitate. Metoda de extractie care cu cele mai bune rezultatea fost utilizarea kitului Qiagen QiaAmp DNA Mini Kit, care ofera un DNA de cea mai buna calitate, ideala prelucrarilor ulterioare.

Toate cazurile fixate in laboratorul nostru, fara exceptie, au dus la o amplificare a beta globinei cu rezultate intens pozitive, extractia fiind de o inalta calitate, lucru imbucurator si care da speranta unei metode de succes.

Fig.1.4.bis. Verificarea electroforetica a reactiei PCR pentru Beta-globina utilizand taq JumpStart

Cele 44 cazuri pentru PCR au fost alese dupa cum urmeaza:

– cele 9 ZN pozitive ne-au servit pentru a verifica fiabilitatea si sensibilitatea reactiei. Se observa ca majoritatea sunt ganglioni(5).

– cele 2 cazuri suspecte de sarcoidoza au fost incluse in studiu pentru precizari diagnostice, stiindu-se dificultatea diagnosticului diferential histopatologic intre tuberculoza si sarcoidoza.

– martorul pozitiv si negativ sunt necesari pentru a verifica extractia si respectiv eventuala contaminare PCR.

– cele 31 cazuri ramase sunt fragmente tisulare diverse, obtinute prin biopsie. Sunt cazuri deosebit de grave ce au pus probleme mari de diagnostic si tratament (rezistenta), ajungandu-se in final la tratament chirurgical.

Din cele 42 cazuri lucrate (excluzand martorii) PCR, 26 au fost diagnosticate clinic, epidemiolgic si/ sau radiologic cu tuberculoza si au urmat tratament antiTBC care a dat rezultate favorabile.

Dintre cele 26 de cazuri cu leziuni tipice au fost confirmate prin PCR 21 de cazuri, celelalte 5 fiind nedeterminate datorita calitatii deficitare a materialului bioptic ce nu a permis reusita extractiei.

Grafic 5. Corelatia intre leziunile tipice si reactia PCR

Din cele 18 cazuri cu leziuni atipice au fost diagnosticate cu TBC prin reactia PCR 5 cazuri (28%), altele 6 (33%)au fost negative la reactia PCR; restul de 7 cazuri (39%) sunt nedeterminate datorita calitatii deficitare a materialului bioptic ce nu a permis reusita extractiei.

Grafic 6. Corelatia intre leziunile atipice si reactia PCR

Din 9 cazuri ZN pozitive (inclusiv martorul poz) pe care s-a lucrat PCR au fost confirmate 6 cazuri (PCR +). Din cele 3 cazuri neconfirmate PCR, unul a fost negativ pentru TBC deoarece extractia DNA a fost nereusita (PCR pentru beta globina negativ) in conditiile in care fragmentele de tesut prelucrat au avut necroza extinsa si celularitate redusa, celelalte 2 fiind pozitive la PCR pentru beta globina, dar negative la PCR pentru MT.

Dintre cazurile ZN pozitive, au fost deci confirmate PCR 6/8, 75%, o sensibilitate destul de mare (Fig 28). Lotul nefiind insa reprezentativ, valoare procentuala nu este statistic semnificativa. Parametrii vor fi imbunatatiti odata cu standardizarea reactiei si cu dobandirea experientei.

Fig.28. Verificarea electroforetica a reactiei PCR pentru MT pentru cazurile ZN+

Pentru MOTT au fost studiate doar 5 cazuri care prezentau un interes deosebit. Intre acestea au fost incluse si cele 2 cazuri PAS positive. Reactia PCR pentru MOTT a fost pozitiva doar pentru unul din cazuri. Lipsa unui control pozitiv nu a permis evaluarea exacta a acestui rezultat, cazul de interes urmand a fi studiat in context clinic.

Fig.29. Verificarea electroforetica a reactiei PCR pentru MOTT

Un procent semnificativ de esec, mai ales in lotul atipic este dat de PCR nedeterminat, deci de materiale si de riscurile pe care la implica reactia dar care poate fi stapanit prin experienta si incercari repetate.

Evaluarea comparativa citologica, histopatologica, imunohistochimica si de biologie moleculara a infectiei cu HPV

Criteriile histopatologice de selectare a cazurilor au fost :

– prezenta de leziuni displazice izolate sau in cadrul unor cervicite, sau in vecinatatea leziunilor neoplazice in situ sau invazive;

– leziuni de tip papilomatos, exofitic, plan sau endofitic;

– leziuni carcinomatoase de tip epidermoid , in situ sau invazive.

Cazurile care prezentau modificari celulare nonvirale ca metaplazie imatura, atrofia pseudokoilocitara, au fost eliminate. Pentru toate tipurile de leziuni selectate se va aplica un sistem de gradare histopatologica folosind criteriile lui Reid: prezenta anselor capilare in corion, hiperplazia bazala, acantoza, koilocitoza, modificari nucleare, binucleeri, diskeratoze. Primul si ultimul dintre aceste aspecte explica si tabloul colposcopic caracteristic: mucoasa alba, punctata sau mozaicata. Absenta, prezenta discutabila sau categorica a fiecarui caracter se noteaza cu 0, I si respectiv, III . Scorurile > sau = 9 obtinute prin sumarea acestor caractere, se vor determina procentual pentru fiecare tip de leziune.

Pentru evaluarea expresiei HPV s-au selectat , in urma analizei citologice, realizata pe frotiuri cervico-vaginale, in coloratie Papanicolaou, 30 paciente cu varsta cuprinsa intre 19 si 57 de ani. Frotiurile au fost fixate in alcool metilic absolut. Materialul biopsic a fost fixat in formol neutru 10 % si inclus la parafina.

Frotiurile au fost recoltate de la nivelul exocolului , urmarind si surprinderea elementelor celulare ale zonei de transformare, a fundului de sac vaginal posterior si a endocolului, iar tabloul citologic a fost incadrat dupa sistemul Bethesda.

Criteriile citologice pentru aprecierea modificarilor pe frotiurile cito-vaginale au fost: halou perinuclear, cu sau fara anomalii nucleare, celule diskeratozice, celule supreficiale gigante, celule cu nuclei dubli sau multipli, cu hipercromazie.

Anomaliile nucleare au reprezenta un alt criteriu morfologic luat in considerare. Ele constau din prezenta nucleilor dubli sau multipli, asociati cu modificari de forma, contururi neregulate, forme colturoase, creneluri, picnoze. Nucleii se pot deosebi de cei atipici din carcinom datorita pastrarii raportului nucleo-citoplasmatic chiar in conditii de citomegalie, prin lipsa nucleolului sau volumul mic al acestuia, prin aspect omogen, mitoze rare, tipice; citoplasma prezinta aspect caracteristic cu un halou clar perinuclear.

Leziunile scuamoase intraepiteliale au fost diagnosticate citologic si confirmate histologic, prin observarea urmatoarelor caracteristici:

L-SIL (23 cazuri) au fost diagnosticate citologic datorita nucleilor usor mariti, un grad de anizokarioza, cromatina fin granulara, hipercromazie usoara si membrane citoplasmatice evidente; histologic , s-a constatat prezenta figurilor mitotice in treimea bazala e epiteliului , cu maturarea in 2/3 superioare si prezenta variabila a atipiei usoare, incluzand koilocitoza. H-SIL( 7 cazuri) s-a diagnosticat citologic in prezenta plajelor sau agregatelor sincitiale de celule de talie in general mai redusa decat cele din L-SIL, cu pleomorfism, cresterea raportuluii nucleo- citoplasmatic, hipercromazie nucleara, cromatina fiind distribuita inegal; histologic s-au observat anomalii nucleare extinse, mitoze in doua treimi superioare pana in toata grosimea epiteliului, cu maturarre absenta.

Carcinoamele testate pentru HPV, au fost localizate toate la nivelul exocolului si au fost 3 cazuri nekeratinizante moderat si slab diferentiate si 4 cazuri keratinizante.

Grafic6. Analiza citologica a cazurilor selectate

Anomaliile morfologice notate au fost de obicei cele nucleare si doar rareori aspecte koilocitare tipice. Alaturi de koilocitoza , in cazurile de condiloame s-au asociat variabil si aspecte de hiperplazie epiteliala, papilomatoza, acantoza, diskeratoza, parakeratoza si infiltrat inflamator caracteristic stromal.

Fig.30 Frotiu cervico-vaginal, koilocit, numerosi bacili Doderlein, Pap, 40x

Leziunile histopatologice au fost grupate in functie de tipul histologic, astfel:

CIN I Condiloame Carcinoame

11 12 7

Grafic 7. Distributia histopatologica a cazurilor studiate

Fig.31.Condilom cervical exofitic cu frecvente modificari morfologice de tip efect citopatic viral. Col.HE, ob.10x

Fig. 32. Condilom cervical exofitic.Detaliu celular cu koilocite si anomalii nucleare. Col.HE, ob.20x

Leziunile de aspect condilomatos s-au incadrat mai ales in grupul celor plane; diagnosticul histopatologic al acestora este deseori dificil pentru ca grosimea epiteliului de obicei nu o depaseste pe cea normala. Leziunile de tip papilomatos, mai ales cele de condilom acuminat (leziune indusa de HPV -6 si HPV-11 in 70-90% din cazuri si ocazional de HPV –16), se caracterizeaza din punct de vedere microscopic prin: papilomatoza, acantoza, koilocitoza si un grad variabil de infiltrat inflamator in stroma. Aspectul ondulat al epiteliului este caracteristic la examinarea cu obiectivul mic. Koilocitele se gasesc de obicei in zona intermediara superficiala sau in spre suprafata. Cele mai interesante si dificile probleme pe care le pun leziunile cervicale induse de HPV sunt in legatura cu diagnosticul diferential, coexistenta si posibila relatie de cauzalitate cu CIN si carcinomul invaziv. In cele 7 carcinoame scuamoase studiate (4 keratinizante si 3 nekeratinizante), modificarile de tip citopatic viral au fost mult mai reduse decat cele semnalate in literatura.

Fig.33.Carcinom scuamocelular nekeratinizant de col uterin, HE, 4x

Analiza imunohistochimica a fost efectuata utilizand ser policlonal anti-HPV, cu specificitate pentru capsida proteica (DAKO), in dilutie 1:1000.Aspectele IHC observate au fost variate: pozitivitatea citoplasmatica s-a asociat variabil cu modificari de tip citopatic viral; in cazul celulelor cu halou clar perinuclear, acesta s-a mentinut optic vid.

Rezultatele obtinute prin aplicarea serului policlonal anti HPV ofera un numar mai mic de cazuri pozitive proportional cu numarul de cazuri considerate pozitive pe baze strict morfologice (Fig. 37,38). Cele 7 cazurile de condiloame cu reactie IHC pozitiva pentru HPV au prezentat modificari morfologice inalt sugestive pentru efect citopatic viral. Dar un numar semnificativ de cazuri cu leziuni de aspect condilomatos(5 condiloame) intricate cu leziuni displazice(6 leziuni CINI) au prezentat reactia HPV negativa, ceea ce evidentiaza valoarea relativa a aprecierii morfologice, ridicand in acelasi timp insa problema sensibilitatii determinarii imunohistochimice.

In cazul carcinoamelor epidermoide de col, aspectele morfologice sugestive pentru efect citopatic viral sunt mai putin concordante cu rezultatele IHC, ele fiind observate doar in 2 cazuri din 7; intr-un caz in vecinatatea carcinomului erau modificari morfologice de tip condilomatos. Probabil determinarea prezentei virusului devine dficila prin IHC, datorita integrarii in genomul celulelor malignizate.

Fig.34.Reactie IHC pozitiva pentru ser HPV policlonal intr-un condilom fara modificari citopatice pe HE

Fig.35.Reactie IHC pozitiva pentru ser HPV monoclonal intr-un condilom cu modificari citopatice pe HE

Fig.36. Condilom cervical exofitic. Celule HPV pozitive in straturile superficiale. Col.IHC pentru HPV, ob.10x

Fig.37. Condilom cervical; detaliu – nuclei pozitivi pentru HPV. Col.IHC pentru HPV, ob.40x

Aplicarea amplificarii cu tiramina a dat rezultatele scontate, dar concentratiile solutiilor de anticorpi nu au fost la fel de mici ca si cele citate in literatura. Astfel, in condilomul exofitic (Fig. 31,32), prezentand aspectele cele mai sugestive pentru efectele citopatice virale, dilutia optima pentru serul policlonal a fost de 1:30, in timp ce pentru anticorpul monoclonal dilutia a fost doar de 1:1.In aceste cazuri, reactia de culoare, la dilutia obisnuita este foarte buna (Fig. 36), dar se mentine un zgomot de fond destul de accentuat. Acesta insa nu a fost observat in cazurile cu reactie nucleara negativa. Amplificarea cu tiramina arata pe langa reducerea zgomotului de fond (Fig.37), o reactie de culoare nucleara la fel de intensa pentru dilutia de 1:30 (din dilutia initiala), ca pentru metoda clasica.

Pentru anticorpul monoclonal, numarul de nuclei pozitivi este ceva mai mic decat pentru serul policlonal, dar reactia nucleara apare in aceleasi cazuri pentru ambele .

Numarul nucleilor pozitivi pentru HPV variaza in raport cu diferitele tipuri de condiloame, fiind net mai mare in condiloamele exofitice in raport cu cele plane sau inversate. Acest lucru arata dificultatea si caracterul subiectiv al aprecierii morfologice a modificarilor de tip citopatic viral in cazul leziunilor plane.

Carcinoamele testate pentru HPV, au fost localizate toate la nivelul exocolului si au fost 3 cazuri nekeratinizante moderat si slab diferentiate si 4 cazuri keratinizante. In carcinoamele epidermoide pozitivitatea nucleara a fost prezenta in 2 din 7 cazuri, proportie mai redusa decat in literatura. In ambele noastre cazuri, in mucoasa peritumorala existau modificari de tip citopatic viral. intr-un caz in vecinatatea carcinomului erau modificari morfologice de tip condilomatos. Reactia de culoare este mult mai difuza, depasind limitele nucleare, ceea ce face dificila interpretarea sa, mai ales ca intensitatea culorii este de obicei mai slaba decat in cazul condiloamelor. Se poate pune problema disparitiei virusului in momentul malignizarii.

Fig.38. Carcinom scumocelular nekeratinizat. Rari nuclei pozitivi pentru HPV. Col.IHC pentru HPV, ob.20x

Fig. 39.Carcinom scuamocelular de col uterin. Coloratie IHC pozitiva difuz pentru HPV, 10x

Pozitivitatea nucleara apare in majoritatea cazurilor in straturile superficiale in celule cu aspect de koilocite, dar uneori si in alte celule; foarte rar apare in celule de tip parabazal (Fig. 35,36). Numarul de nuclei pozitivi a fost in general redus, chiar in cazul unei reactii de culoare intense (Fig.36). Proportia de nuclei pozitivi pentru HPV variaza in raport cu diferitele tipuri de condiloame, fiind net mai mare in condiloamele exofitice in raport cu cele plane sau inversate. Acest lucru arata dificultatea aprecierii morfologice a leziunilor de tip citopatic viral in cazul leziunilor plane. Rezultatele obtinute prin aplicarea serului policlonal anti HPV ofera un numar mai mic de cazuri pozitive proportional cu numarul de cazuri considerate pozitive pe baze strict morfologice.

Rezultatele obtinute au indicat pozitivitatea expresiei imunohistochimice in …..din cazurile examinate, aceasta fiind constatata la nivelul celulelor scuamoase superficiale. Reactia imunohistochimica a inregistrat o variabilitate a expresiei datorita pozitivitatii nucleare in …..cazuri si repectiv citoplasmatice in cazuri.

Aplicarea testelor de amplificare a DNA prin ISH s-a efectuat atat pe cazuri cu reactie IHC intens pozitiva cat si pe cazuri neconcludente sau negative. Reactia de ISH s-a pozitivat atat pe cazurile pozitive pentru IHC cat si pe cazurile neconcludente pentru IHC; de asemenea unele cazuri negative pentru IHC au fost pozitive prin ISH. De remarcat este faptul ca in toate cazurile cu reactie IHC pozitiva, reactia de ISH a fost mult mai intensa si a cuprins un numar mult mai mare de nuclei (Fig. 40). De asemenea s-a constatat ca numarul de copii ale DNA-ului viral este mult mai mare in leziunile de grad redus decat in cele de grad inalt si in cancerele invazive. Extinderea mai mare a reactiei pentru ISH sugereaza superioritatea acesteia fata de IHC.

Fig.40.Reactie ISH pozitiva pentru HPV in condilom

Este nevoie ca datele obtinute prin cercetari cu metode de biologie moleculara, pe loturi semnificative sa fie folosite doar ca o completare a metodelor conventionale, asa incat sa poata fi corelate cat mai exact cu modificari morfologice cat mai specifice, prezente pe material citologic sau histologic.

4. CONCLUZII

1. Se constata o crestere semnificativa a numarului de cazuri de TBC rezistente la tratament; aceste cazuri prezinta histopatologic in special leziuni atipice cu necroza cazeoasa extinsa si cu BK absenti la coloratia Ziehl-Neelsen.

2. Metodele de histochimie clasica prezinta o sensibilitate si o specificitate redusa in ce priveste evidentierea MT si MOTT pe material histologic inclus

la parafina, chiar in conditiile unor leziuni tuberculoase tipice.

3. Leziunile tuberculoase atipice, indiferent de localizare, ar necesita diagnostic molecular prin PCR.

4. Realizarea unei reactii PCR pe material inclus la parafina necesita o precizie si performanta crescuta datorita degradarii ADN in timpul procesarii.

5. Succesul rezultatelor reactiilor de amplificare PCR depinde de parametrii

fixarii si de metoda de extractie.

6. In aceasta situatie, PCR este o metoda complementara precisa de diagnostic, dar nu este infailibila datorita problemelor tehnice si materiale pe care le pune.

7. Reactia de polimerizare in lant se confirma ca metoda complementara valoroasa si rapida de diagnostic alaturi de cele clasice, datorita specificitatii crescute si sensibilitatii multumitoare, 60%.

8. Prezenta koilocitelor pe frotiu sau pe sectiunea histopatologica este un criteriu morfologic valoros, dar nu unic, pentru diagnosticul leziunilor produse de HPV.

9. Depistarea indirecta a prezentei infectiei cu HPV prin aprecierea efectului citopatic viral pe frotiurile citovaginale prezinta erori semnificative (pana la 25%)

10. Analiza pur morfologica a biopsiei cervicale tintite nu permite depistarea infectiilor inaparente.

11. HPV poate fi evidentiat imunohistochimic in preparatele citologice ale leziunilor cervicale intr-un procent important, exprimand o dubla localizare la nivelul celulelor scuamoase superficiale.

12. Negativitatea expresiei IHC a HPV in leziunile investigate poate fi atribuita (co)existentei altui agent infectios, epuizarii fazei proliferative virale sau sensibilitatii limitate a metodei imunohistochimice.

13. Este utila depistarea atat a prezentei secventelor comune tuturor tipurilor de HPV, cat mai ales a celor specifice tipurilor cu potential oncogen ridicat

14. Se impune introducerea metodelor de amplificare a DNA-ului viral pentru depistarea infectiilor minime sau inaparente si pentru confirmarea supiciunii de infectie cu un anumit tip viral.

15. Cantitatea de DNA viral din celulele portiunii superficiale a epiteliului este mult mai mare, fata de cea sugerata de haloul perinucleart si de atipia nucleara.

16. Numarul de copii ale DNA-ului viral este mult mai mare in leziunile de grad redus decat in cele de grad inalt si in cancerele invazive.

BIBLIOGRAFIE

1. Villeneuve C, Gilleron M, Maridonneau-parini I, et al. Mycobacteria use their surface-exposed glycolipids to infect human macrophages through a receptor-dependent process. J Lipid Res. 2005; 46(3): 475-83

2. Fujita Y, Naka T, McNeil MR, Yano I. Intact molecular characterization of cord factor (trehalose 6,6, – dimycolate) from nine species of mycobacteria by MALDI-TOF mass spectrometry. Microbiology. 2005; 151(Pt10):3403-16

3. Brodin P, de Jonge MI, Majlessi L, et al. Functional analysis of early secreted antigenic target-6, the dominant T-cell antigen of Mycobacterium tuberculosis, reveals key residues involved in secretion , complex formation, virulence, and immunogenicity. J Biol Chem. 2005; 280(40): 33953-9

4. . Hart Tony, Shears Paul, Atlas de Poche de Microbiologie, Medecine-Sciences, Flammario, Paris, 1997

5. Bartlett John M.S., PCR Protocols, Humana Press, Totowa NY, 2000

6. Iftimovici Radu, Istoria medicinii, Ed All, 1991, București

7. Berk BH, Yazici M, Atabey N, Ozdamar OS, Pabuccuogler U, Alici E,

Detection of MT in Formaldehyde solution- fixed, paraffin- embedded tissue by PCR in Pott’s disease, Spine 1996 Sept 1; 21(17): 1991-5

8. Brisson- Noel A., Gicquel B., Lecossier D., Levy FV., Nassif X., Hance AJ.,Rapid Diagnosis of Tuberculosis by Amplification of Mycobacterial DNA inClinical Samples , Lancet 2, 1989, 1069- 1071

9.Baker TS, Newcomb WW, Olson NH, Cowsert LM, Olson C, Brown JC.
Structures of bovine and human papillomaviruses. Analysis by cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction.
Biophys J. 1991 Dec;60(6):1445-56.

10.Boehringer Mannheim, PCR Application Manual, Boehringer Mannheim,

Mannheim, 1995

11. Burd EM. Human Papillomavirus and cervical cancer. Clinical Microbiology Rewiews, Jan. 2003; 16(1): 1-17

12. Ward P, Coleman DV, Malcolm DB. Regulatory mechanisms of the papillomaviruses. Trends Genet 1989; 5: 97-98

13. Thierry F, Benotmane MA, Demeret C, Mori M, Teissier S, Desaintes O. A genomic approach reveals a novel mitotic pathway in papillomavirus carcinogenesis. Cancer Res 2004; 64:895-903

14. Arends MJ, Buckley CH, Weels M. Aetiology, pathogenesis, and pathology of cervical neoplasia. J Clin Pathol. 1998; 51: 96-103

15. Phelps WC, Yee CL, Munger K, Howley PM. The human papillomavirus type 16E7 gene encodes transactivation and transforming functions similar to adenovirus EIA. Cell 1988; 58: 539-547

16.Contran Ramzi, Kumar Vinaz, Collins Tucker, Robbins Pathologic Basis of Disease,7th Edition, W.B. Saunders Company,2005

17.Cook SM, Bartos RE, Pierson CL, Frank TS, Detection and Characterization of 115 Athypical Mycobacteria by the PCR, Diagn. Mol. Pathol, 1994, 3: 53- 8

18. Eric A. Abbate, James M. Berger1 and Michael R. Botcha. The X-ray structure of the papillomavirus helicase in complex with its molecular matchmaker E2 GENES & DEV 18:1981-1996, 2004
19.Dabbs David J., Diagnostic Immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 2002

20. Wilcox J. N. Fundamental principles of in situ hibridization. J. Histochem. Cytochem.,1993; 41:1725-1733

21. Olinici C, Gheban D., Vasiu R., Crisan D. Biologia celulara si anatomia patologica, Ed. Floarea albastra, 1999, Zalau

22.Dennis Lo, Clinical Applications of PCR, Humana Press Inc., New Jersez, 1998

23.Spitkovsky D, Aengeneydt F, Braspenning J, knebel Doeberitz M. p-53 independent growth regulation of cervical cancer cells by the papillomavirus E6 oncogene. Oncogene 1996; 13: 1027-1035

24. Motoyama S, Ladines-Llave CA, Villanueva SL, Maruo T Kobe. The role of Human Papilloma Virus in the Molecular Biology of Cervical Carcinogenesis. J Med Sci. 2004; 50(1): 9-19

25. Tommasino M, Accardi R, Caldeira S, Dong W, et al. The role of TP53 in cervical carcinogenesis. Hum Mutat 2003; 21:307-312

26. Southern SA, Herrington CS. Disruption of cell cycle control by human papillomavirus with special reference to cervical carcinoma. Int J Gynecol Cancer 2000; 10:263-274

27.Ueda Y, Enomoto T, Miyatake T, Ozaki K, et al. Monoclonal expansion with integration of high-risk type human papillomavirus is an essential step for cervical carcinogenesis: association of clonal status and human papilloma virus infection with clinical outcome in cervical intraepithelial neoplasia. Lab Invest 2003; 83: 1517-1527

28. Tewari KS, Taylor JA, Liao SY, et al. Development and assessment of a general theory of cervical carcinogenesis utilizing a severe combined immunodeficiency murine-human xenograft model. Gyn Onco 2000; 77: 137-148

29.Fauci A. et Al., Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14th Ed , The

McGraw-HillCompanies Inc, 1998

30. Adams JC, Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains, J. Histochem. Cytochem. 1992,40, 1457-1463

31.Frank TS, Cook SM, Del Buono EA, Wilson MD, A Simlpified Method for

Detecting CMV by PCR from Histologic Sections of Small Biopsies, Mod Pathol, 1992, 5 : 449- 54

32. BussolatiG, Gugliotta P, Volante M, Pace M, Papotti M, Retrieved endogenous biotin : a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry, Histopathology1997, 31: 400-407

33.Frevel T., Shafer K.L., Totsch M., Bocker W., Dockhorn- Dworniczak B., PCR Based Detection of Mycobacterium Tuberculosis in Paraffin Wax Embedded Material, Routinely Processed for Morphological Examination, Mol. Pathol. 1999 Oct; 52(3): 283- 8

34.Gassen H., Sachse G., Schulte A., PCR- Grundlagen und Anwendungen der Polymerase-Kettenreaktion, Gustav Fischer Verlag- Schtuttgart, 1994

35.Gherasim L., Medicină Internă, volI, ed II, Ed Medicală, București, 2001

36.Goelz SE, Hamilton SR, Vogelstein B. Purification of DNA from Formaldehyde Fixed and Paraffin Embedded Human Tissue, Biochim Biophys Res Comm, 1985, 130: 118-26

37. Jonker A., de Boer P., Van den Hoff, et al. Towards quantitative in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem., 1997; 45: 413-423

38. Hove MG, Hightower BJ, Graves K. Use of combining in situ hybridization and immunohistochemistry in detecting human papillomavirus on routine sections in cases of diagnostic uncertainty. Cent Afr J Med. 2000 Aug;46:217-21
39. Ishii Y, Ozaki S, Tanaka K, Kanda T. Human papillomavirus 16 minor capsid protein l2 helps capsomeres assemble independently of intercapsomeric disulfide bonding. Virus Genes. 2005 Dec;31:321-8.
40. Dallenbach-Hellweg G, Trunk MJ, von Knebel Doeberitz M. Traditional and new molecular methods for early detection of cervical cancer. Arkh Patol. 2004 Sep-Oct;66:35-9.

41. Dell G, Wilkinson KW, Tranter R, Parish J, Leo Brady R, Gaston K. Comparison of the structure and DNA-binding properties of the E2 proteins from an oncogenic and a non-oncogenic human papillomavirus.
JMolBiol.2003Dec12;334:979-91
42. Anitra S. Auster and Leemor Joshua-Tor. The DNA-binding Domain of Human Papillomavirus Type 18 E1 CRYSTAL STRUCTURE, DIMERIZATION, AND DNA BINDING. J. Biol. Chem., Vol. 279, Issue 5, 3733-3742, January 30, 2004

43. Popa Mircea Ioan, Microbiologie generală și microbiologie specială- note de curs, Ed. Concept publishing house, București, 1999

44.Heller MJ., Robinson RA., Burgart LJ., Teneyck CJ., Wilke WW., DNA

Extraction by Sonication: Comparison of Fresh Frozen and Paraffin Embedded Tissue Extracted for use in the PCR Assays, Mod Pathol, 1992, 5: 203- 6

45. Yang DH, Wildeman AG, Sharom FJ. Overexpression, purification, and structural analysis of the hydrophobic E5 protein from human papillomavirus type 16. Protein Expr Purif. 2003 Jul;30:1-10
46. Alonso A, Reed J. Modelling of the human papillomavirus type 16 E5 protein. Biochim Biophys Acta. 2002 Nov 19;1601:9-18
47. Richter E, Schulter C et Al, Am Improved Method for the Species-Specific assessement of mycobacterie in routinely formalin fixed and paraffin embedded 118 tissues, J. Pathol 1995 Jan; 175(1): 85-92

48. Rolfs A., Schuller I., Finckh U., Weber- Rolfs I., PCR Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag NY- Berlin-Heidelberg, 1992

49. Stevens Alan, Lowe James, Pathology, 2nd Ed, Mosby, Harcourt Rublisher Limited, 2000

50. Ulrika V., Mikel, Advanced Laboratory Methods in Hisology and Pathology,Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology,Washington DC, 1994

51. Konietzko Nikolaus, Loddenkemper Robert, Tuberkulose , Georg Thiem Verlag, Stuttgart, 1999

52.Lutwick Larry J,Tuberculosis, a Clinical Handbook , Chapmann& Hall Medical,London, 1995

53. Lutwick, Larry J., Tuberculosis- A Clinical Handbook, Chapmann & Hall,

London, 1995

54..Latchman David.S., PCR Applications in Pathology Principals and Practice, Oxford University Press, 1995

55. Bancroft John, Gamble Marilyn. Theory and Practice of Histological Techniques, Churcchill Livingstone, 2002

56. Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem. 1981; 29: 577-80.

57. Bussolati G, Gugliotta P. Nonspecific staining of mast cells by avidin-biotin-peroxidase complexes (ABC). J HistochemCytochem. 1983; 31: 1419-21.

58. Ludwig A. Sternberger: “Journal of Histochemistry and Cytochemistry”, 1970