Chimioterapia In Boala Canceroasa

I. INTRODUCERE

Era modernă a chimioterapiei antitumorale cu antimetaboliți a debutat la sfârșitul anilor 1940 (acid 2,4-diamino-4-deoxifolic) induce remisia în leucemia acută la copii.

Astăzi, cel mai utilizat antagonist al acidului folic în medicația oncologică este metotrexatul. Acest medicament are eficacitate demonstrată în leucemia acută, limfoame nonHodgkiniene, osteosarcoame, coriocarcinoame.

Pentru prevenirea reacților adverse și a accidentelor toxice provocate de dozele mari de metotrexat administrate în tratamentul oncologic, se administrează folinat de calciu (sare de sodiu a acidului folinic) și se monitorizează terapia.

În acest sens determinarea concentrației plasmatice a metotrexatului, respectiv a folinatului de calciu este foarte importantă mai ales în cazul pacienților cu anomalii ale clearence-lui care au un risc crescut de toxicitate și pentru care se impune instituirea unor măsuri terapeutice specifice.

Având în vedere faptul că timpul necesar determinării separate a metotrexatului, respectiv a folinatului de calciu este mai mare decât cel necesar determinării simultane a acestora ne-am propus să elaborăm o metodă eficientă și rapidă de dozare simultană a acestor compuși din plasmă umană metodă pe care ulterior să o aplicăm pentru analiza probelor biologice în cadrul terapiei cu doze mari de metotrexat, însoțită de “terapia de salvare” cu folinat de calciu.

II. PARTEA GENERALĂ

II.1 Chimioterapia în boala canceroasă

II.1.1 Fiziopatologie

Cancerul reunește o serie de boli umane și animale, caracterizate anatomo-clinic prin dezvoltarea de tumori maligne în organe și țesuturi.

Din punct de vedere histologic cancerul este denumit neoplazie, iar unitatea morfo-funcțională a acesteia este celula canceroasă.

Sub influența factorilor etiologici cancerigeni și cocancerigeni, orice tip de celulă din oricare țesut sau organ se poate transforma în celulă canceroasă.

Proliferând nelimitat și anarhic, celulele canceroase infiltrează și distrug țesuturile și organele în care migrează, apoi diseminează în tot organismul.

Proliferarea clonală a celulelor canceroase de la țesutul lor de origine formează tumoarea primară. Diseminarea celulelor canceroase de la țesutul lor de origine în întregul organism se face prin migrarea lor pe cale interstițială locoregională, pe cale limfatică la ganglionii limfatici și pe calea circulatorie prin vasele sanguine.

Astfel diseminate, celulele canceroase continuă să prolifereze și produc metastaze și tumori secundare în orice regiune a corpului.

În biopatologia celulară, cancerul este o alterare specifică a proliferării și diferențierii celulelor somatice. Totodată, cancerizarea este o alterare genetică moleculară, deoarece în celulele somatice agenții cancerigeni și cocancerigeni reacționează biochimic cu componenții macromoleculari ai aparatului genetic celular.

În urma alterării biochimice se modifică structura genomului sau se modifică expresia fenotipică a genotipului.

Cancerizarea celulară presupune contactul direct-permanent sau intermitent al celulelor cu cancerigenul, ceea ce la nivel macromolecular determină modificări biochimice în structurile replicabile ale ADN și ARN celular și în biosinteza proteică.

La nivel subcelular genetic, aceste modificări biochimice produc mutații somatice, alterarea expresiei fenotipice a unor funcții celulare cum ar fi: mitoza, diferențierea, biosinteza proteică.

Membrana celulei canceroase capătă noi calități structurale, apar noi antigene celulare specifice cancerizării – antigenele specific tumorale (AGST); se pierde adezivitatea intercelulară și de aceea, celulele canceroase devin libere, autonome, migratoare și se pot disemina în întreg organismul uman.

Cancerizarea celulară nu este decelabilă clinic, neexistând teste care să surprindă această fază înainte de dezvoltarea tumorii și diseminării neoplaziei.

După apariția celulelor canceroase începe a doua etapă de cancerizare a organismului, caracterizată prin dezvoltarea elementelor neoplaziei: clona de celule canceroase, celulele canceroase libere migratoare, care diseminează în tot organismul și formează metastazele, țesutul neoplazic vascularizat, care cuprinde tumoarea primară, metastazele și tumorile secundare.

II.1.2 Etiologie

Studiile epidemiologice arată că boala canceroasă este în primul rând o boală a societății și a vârstei înaintate.

Circa 80% din cazuri pot proveni în urma acțiunii prelungite a unor factori, cum ar fi: mediul înconjurător, factori habituali, dieta și fumatul.

Principalii factori de risc sunt:

fumatul

dieta

radiațiile

alcoolul

hormonii (anticoncepționale)

virusurile determină cancere particulare: virusul Epstein Barr determină limfomul Burkitt; virusul hepatitei B produce cancerul de ficat; virusul papilomului uman determină cancer cervical, etc.

imunodeficiența

paraziții – prezența parazitului Fasciola hepatica este asociată cu cancerul de duct biliar

genetici

prostaglandinele

acțiune directă mutagenă prin metaboliții oxidați ai acizilor grași polinesaturați care se leagă covalent de ADN

acțiune indirectă prin transformarea unor compuși necancerigeni în substanțe cancerigene

agenții industriali și chimici

Cancerigenii sunt agenți exogeni care determină transformarea celulelor normale în celule canceroase și inițiază cancerizarea celulară.

Cocancerigenii sunt factori extracelulari care în asociere cu agenții cancerigeni influențează, dar nu inițiază cancerizarea celulară.

Carcinogeni fizici: razele U.V., razele cosmice, X, alfa, beta, gamma, radiațiile emise de izotopii radioactivi.

Carcinogeni chimici: hidrocarburi policiclice aromatice, amine aromatice, coloranți aminoazoici, stilbeni, nitrozamine, alchilanții, etionina, etc.

Virusuri oncogene: virusuri cu ADN și virusuri cu ARN.

II.1.3 Terapia cancerului

Modalitățile de tratament ale cancerului sunt multiple.

Tratament chirurgical

Metoda chirurgicală se alege ca tratament numai dacă boala canceroasă este limitată și dacă extirparea celulelor canceroase se poate realiza fără a compromite structurile vitale.

Radioterapia

Este folosită pentru un tratament local sau regional al bolii.

Chimioterapia

Este foarte utilă în tratamentul cancerelor diseminate sau a celor care reapar, deși anterior s-a folosit un tratament chirurgical sau radioterapia.

Modificările răspunsului biologic

Specialiștii au observat că boala canceroasă nu apare la întâmplare, ci selectează preferențial anumite populații: tinerii, persoanele în vârstă, imunodeprimații și cei cu antecedente canceroase în familie.

Un prim candidat pentru mecanismul de control al bolii canceroase a fost imunitatea. Ea joacă un rol important în controlul dezvoltării bolii canceroase și a fost demonstrat clar pe animale și neoplasme umane.

În fiecare dintre noi există o mare varietate de agenți biologici care răspund de modificările organismului la acțiunea cancerului.

Există două clase de modificatori ai răspunsului biologic folosiți în terapie: interferonul și limfokinele (interleukina 2).

Combinarea modalităților de terapie

Chirurgia, radioterapia sau chimioterapia singure nu sunt suficient de eficiente pentru tratamentul tuturor cancerelor.

Oncologii fac o abordare multidisciplinară în tratamentul cancerului, selectând două sau mai multe modalități de terapie, folosindu-le secvențial sau simultan.

Medicația antineoplazică

Pentru înțelegerea modului de acțiune al medicamentelor oncostatice voi prezenta pe scurt etapele multiplicării celulare.

Prin ciclu celular sau ciclu evolutiv celular se înțelege succesiunea de transformări biochimice, fiziologice și morfologice ale unei celule care, prin procesul de diviziune celulară formează două celule fiice.

La om și mamifere ritmul de succesiune al ciclurilor celulare este în general circadian. Durata lor este influențată de condițiile de mediu, cum ar fi temperatura, pH-ul, conținutul în factori nutritivi.

În concepția clasică, ciclul celular este format din două faze:

interfaza

diviziunea mitotică

Interfaza

Se caracterizează prin sinteza macromoleculelor informaționale (ADN, ARN, proteine) și alte manifestări metabolice.

În celulele fiecărei specii se găsește o anumită cantitate de ADN în care se află informația genetică sub formă codificată.

unitățile de codificare sunt reprezentate de codoni

codonul este alcătuit dintr-o secvența de 3 nucelotide, având capacitatea de a determina includerea unui aminoacid în molecula proteică

lanțurile ADN sunt alcătuite din 4 tipuri de nucleotide prin a căror modificare secvențială se poate înregistra o cantitate imensă de informație genetică

o nucleotidă este constituită dintr-o bază azotată, o pentoza și un radical fosforic.

bazele azotate sunt de 2 feluri: baze purinice și baze pirimidinice

bazele purinice adenina și guanina sunt prezente atât în molecula de ADN, cât și în cea de ARN

bazele pirimidinice citozina și timina intră în componența ADN, iar în molecula de ARN în locul timinei se află uracilul.

Pentozele ce intră în structura acizilor nucleici sunt riboza în ARN și dezoxiriboza în ADN.

Din combinarea unei baze azotate cu o pentoză rezultă o nucleozidă, iar prin atașarea unei grupări fosfat la C3’ sau C5’ la pentoza nucleozidei rezultă o nucleotidă.

Prin înlănțuirea nucleotidelor se formează polinucleotidele. Macromolecula de ADN este bicatenară, fiind formată din 2 lanțuri polinucleotidice dispuse elicoidal în jurul unui ax comun care alcătuiesc un dublu helix.

Datorită faptului că legătura dintre două nucleotide succesive sunt de tip 5’-3’, cele două catene ale helixului ADN sunt antiparalele. Cele două lanțuri polinucleotidice sunt complementare, în sensul că întotdeauna o nucleotidă ce conține o bază purinică se leagă de una una care conține o bază pirimidinică și invers.

Prin urmare, în macromolecula de ADN nu există decât 4 tipuri de legături: A-T; T-A; G-C; C-G. Structura bicatenară se realizează cu ajutorul punților de hidrogen, care sunt duble între A-T și triple între G-C.

Sinteza de AND se numește replicație și se realizează după modelul semi- conservativ, ce asigură o sinteză de mare fidelitate.

Mitoza

Fiecare ciclu al unei celule în multiplicare se sfârșește prin diviziune mitotică.

Este formată din 4 faze: profaza, metafaza, anafaza și telofaza.

Fiecare fază se caracterizează prin modificări ale cromatinei nucleare, care se reorganizează în cromozomi structural individualizați și modificări citoplasmatice care conduc la formarea aparatului mitotic și la separarea citoplasmatică finală.

Principiile chimioterapiei

Chimioterapicele anticanceroase sunt capabile să amelioreze starea clinică, să micșoreze volumul tumorii, să prelungească durata de supraviețuire și uneori, să producă vindecarea bolnavilor cu afecțiuni canceroase.

Tratamentul trebuie stabilit și efectuat de către specialistul oncolog, care are la dispoziție toate mijloacele de laborator necesare.

Alegerea medicamentelor se face în funcție de datele științifice privind eficacitatea și raportul risc/beneficiu terapeutic.

OMS a stabilit 5 categorii de cancere, în funcție de răspunsul la chimioterapie:

Tumori pentru care tratamentul poate realiza vindecarea sau o prelungire semnificativă a supraviețuirii (leucemia acută limfoblastică, leucemia acută mieloidă, boala Hodgkin, limfoame nehodgkiniene, limfom Burkitt, cancerele gestaționale trofoblastice, cancerul testicular cu celule germinative, sarcom Ewing, sarcoame de țesuturi moi la copii, cancer pulmonar microcelular, sarcomul Kaposi).

Tumori cărora chimioterapia le poate micșora volumul, ameliorând și calitatea vieții bolnavului, dar fără a crește semnificativ durata supraviețuirii (leucemia limfatică cronică, leucemia mieloidă cronică, mielom multiplu, cancerul ovarian, cancerul endometrial, cancerul de prostată, neuroblastom).

Tumori cărora chemoterapia le poate micșora volumul, dar raportul reacții adverse/beneficiu terapeutic nu este evident favorabil, iar prelungirea vieții este contropicele anticanceroase sunt capabile să amelioreze starea clinică, să micșoreze volumul tumorii, să prelungească durata de supraviețuire și uneori, să producă vindecarea bolnavilor cu afecțiuni canceroase.

Tratamentul trebuie stabilit și efectuat de către specialistul oncolog, care are la dispoziție toate mijloacele de laborator necesare.

Alegerea medicamentelor se face în funcție de datele științifice privind eficacitatea și raportul risc/beneficiu terapeutic.

OMS a stabilit 5 categorii de cancere, în funcție de răspunsul la chimioterapie:

Tumori pentru care tratamentul poate realiza vindecarea sau o prelungire semnificativă a supraviețuirii (leucemia acută limfoblastică, leucemia acută mieloidă, boala Hodgkin, limfoame nehodgkiniene, limfom Burkitt, cancerele gestaționale trofoblastice, cancerul testicular cu celule germinative, sarcom Ewing, sarcoame de țesuturi moi la copii, cancer pulmonar microcelular, sarcomul Kaposi).

Tumori cărora chimioterapia le poate micșora volumul, ameliorând și calitatea vieții bolnavului, dar fără a crește semnificativ durata supraviețuirii (leucemia limfatică cronică, leucemia mieloidă cronică, mielom multiplu, cancerul ovarian, cancerul endometrial, cancerul de prostată, neuroblastom).

Tumori cărora chemoterapia le poate micșora volumul, dar raportul reacții adverse/beneficiu terapeutic nu este evident favorabil, iar prelungirea vieții este controversată (cancerul gastric, cancerele capului și gâtului, cancerele primare ale SNC, cancerul vezicii urinare-intravezical, cancerul suprarenal, hepatoamele).

Tumori care nu beneficiază de tratament medicamentos, chimioterapia înrăutățind adesea calitatea vieții bolnavului, scurtând timpul de supraviețuire (unele cancere pulmonare, epidermoid, adenocarcinom, cancere cu celule mari, cancerul esofagian, colo-rectal, cancerul pancreatic neendocrin, cancer cervical, nefroblastom, melanoame).

Tratamentul tumorilor sensibile la chimioterapice trebuie să aibă în vedere următoarele reguli:

asociațiile chimioterapice în doze optimale realizează, de regulă, rezultate superioare celor obținute prin monoterapie;

tratamentul inițial este esențial pentru durata de supraviețuire a bolnavului;

dacă tumora este curabilă, tratamentul trebuie să fie precoce, folosind cure optimale;

polichimioterapia intensivă, folosită în cancere incurabile, poate crește morbiditatea, și mărește suferința bolnavului, fără a realiza beneficii simptomatice sau prelungirea vieții.

II.1.4 Clasificarea substanțelor antitumorale

In funcție de structura chimică:

AGENȚI ALCHILANȚI

Analogi de azot muștar (derivați de bis–clor etilamină)

Derivați de etilenimină

Alchilsulfonați

Nitrozouree

ANTIMETABOLIȚI

Analogi ai acidului folic

Analogi ai bazelor purinice

Analogi ai bazelor pirimidinice

ALCALOIZI DIN PLANTE ȘI ALTE PRODUSE NATURALE

Alcaloizi din Vinca și analogi

Derivați de podofilotoxină

Taxani

ANTIBIOTICE CITOTOXICE ȘI SUBSTANȚE INRUDITE

Actinomicine

Antracicline și substanțe înrudite

Alte antibiotice citotoxice

ALȚI AGENȚI ANTINEOPLAZICI

Compuși ai platinei

Metilhidrazide

Alți agenți antineoplazici

II.2 Antimetaboliți – Antagoniști ai acidului folic

II.2.1 Metotrexat

Sinonime: antifolan, amethopterin, ledertrexate

II.2.1.1 Încadrare farmacoterapeutică

Antineoplazice-antimetaboliți analogi ai acidului folic.

Cod ATC: L 01 BA

II.2.1.2 Farmacodinamie

Metotrexatul este un antimetabolit utilizat în tratamentul unor boli neoplazice și forme de psoriazis sever.

Metotrexatul este un antagonist al acidului folic ce inhiba reversibil dihidrofolat reductaza, enzima care reduce acidul folic la la acid tetrahidrofolic. Inhibarea acestei enzime limitează cantitatea de fragmente monocarbonice necesare sintezei purinelor și conversia deoxiuridilatului la timidilat în sinteza ADN și reproducerea și refacerea celulară.

Țesuturile proliferative active ca celulele maligne, maduva osoasă, celulele fetale, mucoasa bucală și intestinală, celulele vezicii urinare sunt, în general, mai sensibile la metotrexat. Când proliferarea celulară din țesuturile maligne este mai mare decât cea din țesuturile normale, metotrexatul produce tulburări ale proliferarii maligne, fara a distruge ireversibil țesuturile normale.

În psoriazis, rata proliferarii celulelor epiteliale este mai mare decât în cazul pielii normale. Folosirea metotrexatului în controlul procesului psoriazic se bazează tocmai pe aceasta diferențiere a ritmului de proliferare.

Dozele înalte de metotrexat, urmate de terapia de protecție cu leucovorin, sunt folosite în diferite scheme de tratament cu chimioterapeutice, precum și ca adjuvant, în cazul intervențiilor chirurgicale de rezecție sau amputație a tumorilor primare, la pacienții cu osteosarcom non-metastatic.

Raționamentul utilizării terapiei cu doze înalte de metotrexat s-a bazat pe conceptul protecției selective a țesuturilor normale cu ajutorul leucovorinului (care este un derivat al acidului tetrahidrofolic ce blochează efectele metotrexatului, atunci când este administrat la un interval scurt după agentul antineoplazic).

Se poate dezvolta rezistența la metotrexat, fiind asociată cu scăderea absorbției la nivel celular; oricum, nu a fost complet stabilit mecanismul precis de instalare a rezistenței.

Cercetarile recente sugerează apariția rezistenței la dozele înalte de metotrexat și în cazul disfuncției sistemelor de transport activ, scăderii afinitații dihidrofolic acid reductazei pentru metotrexat, creșterii nivelului de dihidrofolic acid reductaza datorată multiplicarii genetice, sau scăderii poliglutamatului de metotrexat. Actualul mecanism de acțiune este necunoscut. Metotrexatul are, de asemenea, acțiune imunosupresivă, ce se datorează parțial, inhibării multiplicării limfocitelor.

II.2.1.3 Farmacocinetică

Metotrexatul este, în general, absorbit complet după administrarea parenterală, indiferent de calea de injectare.

Metotrexatul traversează membranele celulare prin transport activ.

Medicamentul este distribuit larg în toate țesuturile corpului, cele mai mari concentrații fiind realizate în rinichi, vezica biliară, splina, ficat și piele.

Metotrexatul intră în competiție cu formele reduse ale folaților pentru sistemele de transport activ prin membranele celulare. La concentrații serice mai mari de 100 micromoli, difuzia pasivă este principala cale de realizare a concentrației eficiente intracelulare.

Aproximativ 50% din medicament se leagă de proteinele serice din sânge. Metotrexatul (MTX) este reținut în rinichi câteva saptamâni, și în ficat, câteva luni. Concentrația serică constantă și acumularea tisulară a metotrexatului rezultă în urma administrării zilnice repetate. Medicamentul nu atinge doze terapeutice la nivelul LCR după administrarea orală sau parenterală.

Concentrațiile mari în LCR se obțin numai după administrarea intratecală.

După administrarea intratecală, MTX trece și în circulația sistemică.

Concentrațiile serice maxime se realizează în interval de 2 ore de la administrarea intratecală. MTX traversează bariera placentară și se distribuie în laptele matern. Cea mai înaltă rată atinsă a fost de 0,08:1.

Metabolizare

Dupa absorbție, metotrexatul se transformă în poliglutamați sub influența metabolizarii hepatice și intracelulare. Aceste forme pot fi reconverite la metotrexat sub influența hidrolazelor (enzime hidrolitice).

Poliglutamații acționează ca inhibitori ai dihidrofolatreductazei și timidilatsintetazei. Cantitați mici de poliglutamați pot rămâne în țesuturi pentru perioade mari. Retenția și durata prelungită de acțiune a acestor metaboliți activi variază la nivelul celulelor, țesuturilor și tumorilor. O cantitate mică de metabolit 7-hidroximetotrexat poate apare chiar și la dozele uzuale prescrise. Acumularea acestui metabolit poate deveni semnificativă în cazul dozelor înalte folosite în osteosarcom. Hidrosolubilitatea 7-hidroximetotrexatului este de 3-5 ori mai mica decât a MTX. MTX este parțial metabolizat de flora intestinală, după administrarea orală.

Timp de înjumatațire (t1/2)

Timpul de înjumatațire final este de 3-10 ore pentru pacienții care sunt tratați pentru psoriazis sau în cazul terapiei antineoplazice cu doze mici (mai mici de 30 mg/m2). La pacienții ce primesc doze înalte de MTX, t1/2 este de 8-15 ore.

Excreție

Calea principală de eliminare este cea urinară, prin filtrare glomerulară și transport activ. Cantități reduse se elimină în fecale, probabil prin bilă. MTX are un mod de eliminare bifazic. Mai mult de 92% dintr-o doză unică se elimină în 24 ore după administrare i.v., urmată de excreția zilnică a 1-2% din doza ramasă.

La doze cuprinse între 7,5 și 30 mg folosite la pacienții cu psoriazis, nu a fost observată eliminarea neliniară ce s-ar putea datora saturării reabsorbției tubulare renale. Disfuncția renală, precum și administrarea concomitentă a altor medicamente (acizi organici slabi) ce se reabsorb tubular, pot determina creșterea concentrațiilor serice ale MTX. S-a putut stabili o excelentă corelație între clearance-ul MTX și clearance-ul creatininei endogene.

Rata de clearance variază în limite largi și este, în general, scazută în cazul dozelor mai mari. Clearance-ul întârziat al medicamentului este unul dintre factorii responsabili de toxicitatea sa, deoarece toxicitatea asupra țesuturilor normale este dependentă mai mult de timpul de expunere decât de concentrația plasmatică maximă. Când un pacient are funcția renală compromisă sau prezintă alte dereglări ce pot întârzia eliminarea medicamentului, concentrațiile serice ale MTX pot rămâne crescute pentru perioade de timp mai lungi. Potențialul toxic datorat terapiei cu doze înalte sau excreției întârziate, poate fi redus de leucovorin (folinat de calciu) administrat în timpul etapei finale de eliminare plasmatică a metotrexatului.

II.2.1.4 Farmacotoxicologie

Metotrexatul are un potențial toxic crescut. Frecvența și severitatea efectelor toxice sunt influențate de doza sau frecvența administrării, dar au fost raportate la toate dozele. Deoarece acestea pot apare oricând în cursul terapiei, se impune monitorizarea pacienților care primesc metotrexat.

Pacienții sub tratament vor fi supravegheați pentru a putea detecta și evalua rapid eventualele semne sau simptome ale posibilelor efecte toxice sau reacții adverse. Metotrexatul va fi administrat de, și sub supravegherea medicilor care au pregătirea și experiența necesară privind utilizarea terapiei cu antimetaboliți. Folosirea dozelor înalte de metotrexat, necesare în tratarea osteosarcoamelor, presupune o îngrijire meticuloasă. Utilizarea dozelor înalte pentru alte boli neoplazice se face în scop investigațional, nefiind stabilit un avantaj terapeutic.

Datorită posibilității de apariție a unor reacții adverse toxice, pacientul va fi informat de către medic asupra posibilelor riscuri și va fi sub permanentă supraveghere a acestuia.

Au fost raportate decese în cazul utilizării metotrexatului pentru tratarea bolilor maligne, psoriazis, artrita reumatoidă.

Pentru tratarea psoriazisului, metotrexatul va fi utilizat numai la pacienții cu forme severe, refractare, care nu răspund la alte forme de terapie, iar diagnosticul a fost stabilit în urma unei consultații amănunțite.

În cadrul terapiei cu metotrexat este obligatorie monitorizarea periodică a toxicității, ce include testarea funcției renale și hepatice, hemograma. În anumite situații este indicat efectuarea periodică a biopsiei hepatice. Pacienții cu risc crescut de eliminare deficitară a metotrexatului (ex. disfuncție renală, edem pleural sau ascită) trebuie monitorizați frecvent.

Metotrexatul provoacă hepatotoxicitate, fibroză și ciroză, dar în general, numai după utilizarea prelungită. Se observă des creșterea acută a nivelului enzimelor hepatice, de obicei, temporară și asimptomatică.

Efectuarea biopsiei hepatice după un tratament prelungit, evidențiază modificări histologice. Aceste leziuni nu sunt precedate de simptome caracteristice disfuncției hepatice.

Boala pulmonară indusă de metotrexat este o leziune periculoasă, care poate să apară brusc, oricând în cursul terapiei și a fost raportată chiar la doze mai mici de 7,5 mg/saptămână. Simptomele pulmonare (în special tuse uscată, neproductivă) sau pneumoniile nespecifice care apar pe parcursul tratamentului pot indica o leziune potențial periculoasă și necesită întreruperea tratamentului, urmată de investigarea atentă.

Metotrexatul poate produce depresia severă a măduvei osoase, manifestată prin anemie, leucopenie și/sau trombocitopenie.

Diareea și stomatitele ulcerative impun întreruperea tratamentului; pot apare enterite hemoragice sau decesul prin perforare intestinală.

Pacienții cu disfuncție renală vor face administrarea cu multă precauție, deoarece tulburările funcției renale pot întârzia eliminarea metotrexatului.

Au fost raportate depresii severe, neobișnuite, ale măduvei osoase (uneori fatale) și toxicitate gastrointestinală la pacienții ce primeau concomitent metotrexat (de obicei, doze înalte) și unele AINS.

Mutagenitate și afectarea fertilității

Metotrexatul produce dereglări cromozomiale pe celulele somatice animale și celulele măduvei osoase, deși semnificația clinică rămâne incertă. Va fi bine evaluat beneficiul față de riscul potențial înainte de utilizarea metotrexatului în combinație cu alte medicamente, în special la copiii și adulții tineri. Metotrexatul produce la om: embriotoxicitate, avort și defecte fetale. De asemenea, poate produce afectarea fertilității, oligospermie și disfuncție menstruală în timpul, și o perioadă scurtă după terminarea tratamentului.

Carcinogenitate

S-a observat la animale că antimetaboliții sunt carcinogenici și prezintă un risc crescut de dezvoltare a unor carcinoame secundare la oameni. Studiile de carcinogenitate la animale nu au fost concludente.

Teratogenitate

A fost raportat faptul că metotrexatul poate cauza moartea fătului și/sau anomalii congenitale. De aceea, nu este recomandată administrarea la femei fertile decât atunci când beneficiul este mai mare decât riscurile considerate.

Utilizarea în pediatrie

Este necesară o precauție sporită la nou-născuți și copii datorită funcției renale și hepatice reduse.

Utilizarea la vârstnici

Datorită funcției renale și hepatice diminuate și depozitelor mari de folați, la vârstnici, vor fi prescrise doze mai mici. Pacienții vor fi atent monitorizați pentru depistarea rapidă a eventualelor semne ale toxicitații.

Hematologie

Metotrexatul determină efecte supresive asupra hematopoezei, de aceea, studiile anterioare tratamentului și testele hematologice periodice sunt esențiale. Supresia poate apare brusc, chiar daca aparent s-a făcut o dozare atentă. Orice reducere severă a numarului de elemente figurate ale sângelui indică necesitatea întreruperii și înlocuirii tratamentului. Apariția unei leucopenii grave în timpul tratamentului poate favoriza declanșarea unei infecții bacteriene. În acest caz este indicată încetarea tratamentului și inițierea unei terapii adecvate cu antibiotice. În cazul afectării grave a măduvei osoase poate fi necesară transfuzia de sânge sau de masă eritrocitară.

Monitorizarea pacientului va include: hemograma completă, hematocrit, analiza urinară, testarea funcției renale și a celei hepatice, radiografii. Testele vor fi efectuate înainte, în timpul și după încetarea tratamentului. În cazul terapiei cu doze înalte sau de lungă durată vor fi necesare efectuarea unei biopsii hepatice sau studii de resorbție osoasă.

În cursul tratamentului pentru psoriazis, se recomandă monitorizarea parametrilor hematologici – lunar și funcția renală și hepatică la 1-3 luni.

Este indicată monitorizarea în perioadele de modificare a dozelor sau în perioadele cu risc în care poate crește concentrația sanguină a metotrexatului (ex.deshidratare).

II.2.1.5 Farmacografie

Boli neoplazice

Metotrexatul este indicat în tratamentul coriocarcinomului gestațional, corioadenom, chist hidatiform.

În leucemia acută limfoidă, metotrexatul este indicat pentru profilaxia leucemiei meningeale și este folosit în terapia de întreținere în combinație cu alte chimioterapeutice. De asemenea, este indicat și în tratamentul leucemiei meningeale. Cel mai puternic efect a fost observat în leucemia acută limfoblastică.

Metotrexatul este eficient și în tratamentul limfosarcoamelor de stadiu III și IV, în special la copii și în stadiile avansate de micoze fungice.

Este utilizat singur sau în combinație cu alți agenți antitumorali în tratamentul cancerului mamar, cancere epidermice ale capului și gâtului, cancer pulmonar cu celule mici și pavimentoase, cancer ale vezicii și osteogenic.

De asemenea, este utilizat în combinație cu alte chimioterapice în tratamentul stadiilor avansate de limfoame non-Hodgkin-iene.

Psoriazis

Metotrexatul este indicat în controlul simptomatic al psoriazisului sever, recalcitrant care nu răspunde la alte forme de terapie, dar numai când diagnosticul a fost bine stabilit, prin biopsie și/sau după control dermatologic.

Este important să fim siguri , aceasta nu se datorează unor boli concomitente ce afectează răspunsul imun.

Boli autoimune

Metotrexatul poate fi folosit în boli autoimune, cum ar fi artrita reumatoidă, dermatomiozita, granulom Wegener, etc.

Doze și mod de administrare

Boli neoplazice

Coriocarcinom și alte boli trofoblastice similare

Se recomandă 15-30 mg zilnic, administrat i.m. timp de 5 zile. Această cură se poate repeta de 3-5 ori, dacă este necesar, cu pauze de una sau mai multe saptamâni, până la dispariția tuturor efectelor toxice. Eficacitatea terapiei este evaluată prin analiza cantitativă pe 24 ore a gonadotrofinei corionice urinare (GCU), care trebuie să revină la normal sau la mai puțin de 50 UI/24 ore, după a 3-a sau a 4-a cură de tratament. Este urmată, de obicei, de o refacere completă a leziunilor după 4-6 săptămâni. Se recomadă încă 1-2 cure de metotrexat după normalizarea GCU.

Este esențială evaluarea clinică înainte de începerea fiecarei cure de tratament.

Dozele mai mari de 60 mg la 48 ore, 4 doze, trebuie urmate de terapia de recuperare cu leucovorin ca antidot. Această cură se poate repeta la intervale de 7 zile până la normalizarea GCU urinară. De obicei, sunt necesare 4 cure.

Pacienții cu complicații, cum ar fi metastaze în evoluție, pot fi tratați alternativ cu metotrexat și alte medicamente citotoxice.

Corioadenom și chist hidatiform

Se recomandă terapia profilactică cu metotrexat pentru evitarea evoluției chistului hidatiform spre corioadenom. Acesta este considerat o formă invazivă a chistului hidatiform. Metotrexatul se administrează în doze similare cu cele pentru coriocarcinom.

Leucemie

Copiii și adolescenții ce suferă de leucemie limfoblastică acută sunt cei mai sensibili la chemoterapia actuală. La adulții tineri și bătrâni se obține cu dificultate remisiunea clinică, iar recăderile sunt mai frecvente.

Inițial, metotrexatul în monoterapie sau asociat cu steroizi a fost utilizat pentru inducerea remisiunii în leucemia limfoblastică acută. Utilizarea recentă a terapiei cu corticosteroizi în combinație cu alte medicamente contra leucemiei sau în combinații ciclice ce includ metotrexat, produce remisiunea rapidă și eficientă. Când este folosit ca inductor, metotrexatul în doze zilnice de 3,3 mg/m2 în combinație cu prednison 60 mg/m2, produce remisia la 50% din pacienții tratați, de obicei într-un interval de 4-6 saptamâni.

Se pare că în combinație cu alte medicamente, metotrexatul este de elecție pentru a asigura menținerea remisiunii indusă de acele medicamente.

Când se realizează remisiunea și îngrijirea atentă poate produce ameliorarea clinică, menținerea terapiei se inițiază astfel: metotrexat administrat i.m de două ori pe saptămână, în doza totală saptămânală de 30 mg/m2. Se poate da, de asemenea, și în doze de 2,5 mg/kg i.v. la 14 zile. Când apare recăderea, reinducerea remisiunii poate fi realizată prin repetarea curei inductoare inițiale.

Leucemie meningeala

Pentru tratarea sau profilaxia leucemiei meningeale, metotrexatul se va administra pe cale intratecală. Soluția de metotrexat fără conservanți se diluează până la concentrația de 1 mg/ml într-un mediu corespunzător, steril, lipsit de conservanți cum ar fi clorura de sodiu 0,9% – soluție injectabilă.

Volumul de LCR (lichid cefalorahidian) este dependent de vârstă, nu de suprafața corporală. La naștere, volumul de LCR este 40% din cel al unui adult și ajunge la volumul de adult în câțiva ani. Administrarea intratecală de metotrexat în doze de 12 mg/m2 (maxim 15 mg) determină concentrații scăzute de metotrexat în LCR și eficacitate scăzută la copii, iar la adulți, concentrații ridicate în LCR și neurotoxicitate.

Următorul interval de doze se bazează pe vârstă în loc de suprafață corporală:

Mai puțin de 1 an 6 mg

1 an 8 mg

2 ani 10 mg

Peste 3 ani 12 mg

Deoarece volumul și turnover-ul scad cu vârsta este indicată reducerea dozelor la pacienții în vârstă.

Administrarea intratecală a metotrexatului se va face la intervale de 2-5 zile, pentru tratarea leucemiei meningeale. Oricum, administrarea la intervale mai mici de 1 săptămână poate accentua toxicitatea subacută. Tratamentul cu metotrexat se face până când numărul de leucocite din LCR revine la normal.

Pentru profilaxie se administrează aceleași doze ca și în tratarea leucemiei menigeale, diferă numai intervalele de administrare.

Efectele adverse care apar sunt comune tuturor soluțiilor administrate intratecal și sunt, de regulă, de natură neurologică. Dozele mari pot cauza convulsii. Metotrexatul administrat intratecal ajunge în circulația sistemică și poate cauza o toxicitate sistemică. De aceea, terapia sistemică cu medicamente contra leucemiei trebuie adaptată, redusă sau întreruptă.

Focarele de leucemie de la nivelul SNC pot fi tratate mai eficient prin radioterapie, deoarece uneori nu răspund la tratamentul intratecal cu chemoterapice.

Limfoame

La anumiți pacienți cu tumoare Burkitt, stadiul I sau II, metotrexatul a produs o remisiune prelungită. Administrarea metotrexatului se face pe cale orală. În stadiul III, metotrexatul se asociază cu alți agenți antitumorali. În toate stadiile, tratamentul constă în mai multe cure cu pauze de 7-10 zile între ele.

Limfosarcoamele de stadiu III pot răspunde la un tratament combinat cu metotrexat în doze de 0,625-2,5 mg/kg/zi.

Micoze fungice

Tratamentul obișnuit constă în administrarea orală a metotrexatului. Totuși, se poate administra și i.m în doze de 50 mg o dată pe săptamână sau 25 mg de două ori pe săptamână.

Cancer de sân

Pentru tratarea cancerului de sân în stadiu avansat se administrează metotrexat 10-60 mg/m2, i.v, asociat cu alte medicamente citotoxice, în cure ciclice.

Cure similare se adminstrează ca terapie adjuvantă în cazurile incipiente, urmate de mastectomie și/sau radioterapie.

Cancer al capului și gâtului

Pentru tratamentul tumorilor avansate sau ca terapie adjuvantă preoperatorie se folosește metotrexat 240 – 1080 mg/m2 în perfuzie i.v., urmat de terapia de protecție cu leucovorin – antidot.

Administrarea în perfuzie, intraarterial, se folosește mai rar, numai în cazuri sigure de cancer al capului și gâtului.

Carcinom bronșic

Pentru tratarea tumorilor în stadiu avansat se administrează metotrexat 20-100 mg/m2, în perfuzie i.v, asociat cu alte medicamente citotoxice, în cure ciclice.

Ca monoterapie se pot administra doze înalte de metotrexat, urmate de terapia de protecție cu leucovorin – antidot.

Carcinom al vezicii urinare

În tratamentul cancerului de vezică urinară se administrează metotrexat în doze mai mari de 100 mg la 1-2 săptămâni, în perfuzie i.v sau soluție injectabilă i.v. Este necesară hidratarea corespunzatoare a pacienților cu insuficiență renală pentru a reduce toxicitatea excesivă a medicamentului.

Osteosarcom

Pentru un tratament eficient sunt necesare mai multe chemoterapeutice citotoxice. Alături de doze înalte de metotrexat, urmate de terapia de protecție cu leucovorin – antidot, se pot folosi doxorubicina, cisplatin și combinația bleomicina + ciclofosfamida + dactinomicina (BCD) în dozele și la intervalele menționate în tabelul urmator. Doza inițială de metotrexat este de 12 g/m2.

Dacă această doză nu este suficientă pentru a realiza o concentrație serică de 1mmol/L (10-3mol/L) la epuizarea perfuziei, doza trebuie crescută la 15g/m2 în tratamentele ulterioare. Dacă pacientul vomită sau nu tolerează medicația orală, se va administra leucovorin i.m sau i.v în aceleași doze și la aceleași intervale.

Scheme de tratament chimioterapic pentru osteosarcom

Psoriazis

Pacientul va fi informat asupra riscului potențial la care este expus și va fi supravegheat permanent de medic. Se vor analiza antecedentele hematologice, funcția hepatică, renală și pulmonară ale pacientului; se vor efectua teste de laborator și examinarea fizică înainte de începerea tratamentului, periodic în timpul acestuia și înainte de reinstituirea unei noi cure.

Se vor lua măsurile corespunzătoare pentru a evita apariția unei sarcini.

Doza inițială recomandată este de 10-25 mg/săptămânal, i.m. sau i.v., până la obținerea unui răspuns adecvat, apoi se continuă cu tratamentul oral.

O atenție deosebită se va acorda apariției hepatotoxicitații și va fi urmarită prin testarea funcției hepatice înainte de începerea tratamentului și repetarea testelor la 2-4 luni, în timpul tratamentului.

În cazul funcționării necorespunzatoare a ficatului sau a biopsiei hepatice ce evidențiază anumite modificări anormale nu se va începe tratamentul sau se va întrerupe, dacă acesta a fost deja inițiat. Utilizarea metotrexatului permite aplicarea terapiei topice convenționale, care trebuie încurajată.

Dacă este necesară administrarea unor doze înalte de metotrexat, se vor respecta următoarele reguli de siguranță.

Reguli pentru tratamentul cu metotrexat și leucovorin ca antidot

1. Administrarea metotrexatului va fi amânată până la refacere dacă:

– Numărul leucocitelor este mai mic de 1500/mm3;

– Numărul neutrofilelor este mai mic de 200/mm3;

– Numărul trombocitelor este mai mic de 75.000/mm3

– Nivelul bilirubinei serice < 0,2 mg/dl;

– Nivelul SGPT este mai mare de 450 U

– Mucoasele sunt inflamate, până la primele semne de vindecare

2. Verificarea funcției renale

– Creatinina serică trebuie să fie în limite normale și clearance–ul creatininei va fi de minim 60ml/minut înainte de începerea tratamentului.

– Nivelul creatininei serice va fi determinat înainte de fiecare cură ulterioară. Dacă acesta a crescut cu 50% sau mai mult față de valoarea anterioară, trebuie verificat și clearance-ul creatininei, ce trebuie să fie mai mare de 60ml/minut (chiar dacă nivelul creatininei serice se încadrează în limitele normale).

Pacienții vor fi bine hidratați și vor primi carbonat acid de sodiu.

– Se vor administra 1000 ml/m2 de lichid, i.v, cu 6 ore înainte de perfuzia cu metotrexat. Hidratarea se va continua cu 125ml/m2/ora (3 litri/m2/zi), în timpul administrării perfuziei cu metotrexat și 2 zile după încetarea perfuzării.

– Se va alcaliniza urina, menținându-se la pH >7 în timpul administrării perfuziei cu metotrexat și terapiei cu folinat de calciu (leucovorin calciu) prin admnistrarea orală de carbonat acid de sodiu sau prin încorporarea într-o soluție i.v separată.

4. Se vor repeta determinarile de creatinină serică și metotrexat seric la 24 ore după începerea administrării de metotrexat și cel puțin 1 dată/zi până când nivelul metotrexatului va scădea sub 5×10-8 mol/L (0,05 micromolar).

5. Următorul tabel furnizează indicații referitoare la dozele de folinat de calciu (leucovorin calciu) ce trebuie administrate în funcție de nivelul concentrațiilor de metotrexat seric.

Pacienții la care se manifestă devreme eliminarea dificilă, aceasta poate evolua către oligurie ireversibilă. Pe lângă terapia adecvată cu leucovorin, se va continua hidratarea și alcalinizarea urinară, precum și monitorizarea atentă a concentrației hidrice și a electroliților până la scăderea nivelului metotrexatului sub 0,05 micromoli și remedierea insuficienței renale.

6. Unii pacienți vor prezenta anormalități în eliminarea metotrexatului sau în funcția renală după administrarea de metotrexat, care sunt semnificative, dar mult mai puțin severe decât cele descrise în tabel. Aceste anormalități pot fi sau nu asociate cu toxicitatea clinică semnificativă. Dacă se observă semne clinice ale toxicității, se va continua terapia cu leucovorin pentru încă 24 ore (în total 14 doze în 84 ore) în curele ulterioare de tratament. Se va ține cont de posibilitatea că pacientul ia și alte medicamente, ce pot interacționa cu metotrexatul, atunci când se observă semne ale toxicității clinice sau teste de laborator anormale (ex.medicamente care interferă cu metotrexatul în legarea de albuminele serice sau la eliminare).

7. Dereglări ale funcției hepatice: Dozele de metotrexat vor fi reduse cu 25% dacă bilirubina este între 3 și 5, sau AST este mai mare de 180 U. dacă bilirubina este mai mare de 5, dozele vor fi întrerupte.

II.3 Antitoxici în tratamentul neoplazic

II.3.1 Folinat de calciu

Sinonime : leucovorin, factori citrovorum

II.3.1.1 Încadrare faramcoterapeutică

Antitoxice în tratamentul antineoplazic, alexifarmice

Cod ATC: V03 AF03

II.3.1.2 Farmacodinamie

Folinatul de calciu este un alexifarmic specific pentru metotrexat, utilizat în scopul protejării celulelor sănătoase față de efectul toxic al antifolaților, pentru contracararea efectelor toxice generate de doze mari de metotrexat și ca antidot în cazul intoxicațiilor cu antifolați (toxidromul determinat de antifolați cuprinde: leucopenie, trombopenie, hemoragii, ulcerații ale mucoasei digestive).

Aportul exogen de leucovorin compensează deficitul de tetrahidrofolat apărut ca urmare a inhibiției dehidofolat- reductazei, DHFR, enzimă implicată în reducerea acidului folic la forme biologic active mediază transformarea dihidrofolatului la tetrahidrofolat). DHFR este inhibată de antifolați precum metotrexatul (analog structural și antagonist al acidului folic capabil să inhibe și alte enzime folat-dependente) cu următoarele consecințe: depleția parțială de tetrahidrofolat , inhibiția fiind reversibilă numai în condițiile administrării de leucovorin sau în cazul creșterii foarte mari a concentrației de dihidrofolat (FH2). Alte medicamente care inhibă DHFR sunt pentamidina, trimetoprimul, triamteren, proguanilul. Tetrahidrofolatul, FH4, este un cofactor esențial în sinteza acizilor nucleici și în metabolismul proteic (intervine în conversia homocisteinei la metionină, a serinei la glicină, în metabolismul histidinei). Scăderea concentrației de FH4 conduce la scăderea biosintezei de acid timidilic și purine (precursori ai acizilor nucleici), metionină și serină.

Acidul folinic, 5-formil-derivatul acidului tetrahidrofolic, este rapid convertit la forme reduse ale acidului folic, fără a necesita implicarea DHFR și fără a fi afectat de inhibiția enzimatică indusă de metotrexat. Leucovorinul se utilizează pentru potențarea efectului citotoxic al 5-fluorouracilului. (5-FU), prin stabilizarea legării metabolitului activ 5-FdUMP la timidilat-sintetază, fapt care generează inactivarea enzimei și obținerea efectului terapeutic.

II.3.1.3 Farmacocinetică

Biodisponibilitate p.o. doză-dependentă: 97% (25mg), 75% (50mg), 37% (100mg)

Absorbție

Metabolizare: hepatică, mucoasă intestinală.

Timp de înjumătățire (p.o.): 6,2 ore.

Excreție: renală 80-90%, fecală 5-8%

II.3.1.4 Farmacotoxicologie

-Tulburări ale sistemului imunitar. Foarte rare (< 0,01%): reacții alergice, urticarie, șoc anafilactic.

-Tulburări psihiatrice. Rare (0,01-0,1%): insomnie, agitație și depresie la doze mari.

-Tulbrări gastrointestinale. Rare (0,01-0,1%), după doze mari.

-Tulburări neurologice. Rare (0,01-0,1%): creșterea frecvenței crizelor la epileptici.

-Altele. Neobișnuite (0,1-1%): febră după administrare parenterală.

Folinatul de calciu + 5-fluorouracil. Folinatul de calciu poate crește toxicitatea 5-fluorouracilului, mai ales în cazul pacienților vârstnici sau debili. Manifestările cele mai frecvente, doză-dependente, sunt leucopenia, stomatitele și/sau diareea. În aceste situații, se impune scăderea dozelor de citotoxic mai mult decât în cazul în care 5-fluorouracilul se folosește neasociat cu folinatul de calciu. În funcție de severitatea reacțiilor adverse, tratamentul combinat nu se inițiază sau menține la pacienții cu simptome ale unei toxicități gastrointestinale. Tulburările gastrointestinale frecvente (> 10% din cazuri) sunt voma și greața, .

Folinatul de calciu + metotrexat. Folinatul de calciu nu influențează toxicitățile non-hematologice ale metotrexatului (ex. nefrotoxicitatea cauzată de precipitarea acestuia și/sau metaboliților lui). Prezența unei preexistente- sau metotrexat-induse insuficiențe renale se asociază cu o excreție renală potențial întârziată a metotrexatului, fapt care conduce la necesitatea măririi dozelor de antifolic sau la prelungirea tratamentului cu folinat de calciu. Se are în vedere faptul că după cure repetate, folinatul de calciu se poate acumula la nivelul tumorilor SNC.

II.3.1.5 Farmacografie

Dozele administrate diferă în funcție de indicațiile terapeutice.

-Folinatul de calciu comprimate se administrează în doze ≤ 25 mg/zi.

-În terapia cu doze mari de metotrexat din osteosarcoame (12-15 mg/m²) folinatul de calciu se administrează la 24 de ore de la începutul perfuziei cu metotrexat, în doze de 15 mg/m². Dacă la 24 ore dupa administrarea metotrexatului valoarea creatininei este mai mare de 50% din valoarea precedenta administrarii, doza de folinat de calciu va trebui crescută la 100 mg/m² la 3 ore sub controlul metotrexatului seric, până la obținerea unei concentratii inferioare valorii de 5×10-8 M. In aceasta perioadă se recomandă asigurarea hiperdiurezei alcaline.

-În anemia megaloblastică se recomandă ințial p.o.15 mg/zi sau i.m. 9-12 mg/zi, timp de 10-15 zile. Dacă răspunsul la tratament este corespunzător, se va continua tratamentul cu doze mai mici, până la normalizarea tabloului sanguin. În intoxicația cu metotrexat: doză cel puțin egală cu metotrexatul sau 75 mg i.v., apoi 4 doze a câte 12 mg la fiecare 6 ore. La pacienții care suferă de sindrom de malabsorbție sau de tulburări gastrointestinale care afectează absorbția enterală, se administrează parenteral 25-50 mg folinat de calciu, până la obținerea unei absorbții enterale saturabile. Când se aplică terapia cu doze mari de metotrexat, folinatul de calciu se administrează la interval de 24-36 ore de la începerea perfuziei cu metotrexat

-În intoxicația cu alți antagoniști de acid folic: 5-15 mg/zi i.m., i.v., p.o. 5-7 zile.

-În intoxicația cu metanol: 1mg/kg i.v. (doza totală 50-70 mg.), la fiecare 4 ore (2-3 doze).

-Datorită conținutului de calciu, la administrarea i.v. nu se injectează mai mult de 160 mg folinat de calciu/minut.

-În terapia asociată cu 5-fluorouracil, folinatul de calciu se administrează înainte de acesta, exceptând formele farmaceutice ce coțin ambele substanțe medicamentoase.

II. PARTEA EXPERIMENTALĂ

III.1 Monografia Metotrexat ( Farmacopeea Europeana 5.0)

DEFINIȚIE

Sarea anhidră a metotrexatului, conține cel puțin 98,0%, dar nu mai mult decât 102,0%, (2S)-2-[[4-[[(2,4-diaminopteridin-6-il) metil] metilamino] benzoil] amino] pentandioic acid.

CARACTERISTICI

Se prezintă sub forma unei pulberi de culoare galbenă, cristalină, higroscopică, practic insolubilă în apă, în alcool și în clorură de metilen. Se dizolvă în soluții de acizi minerali și în soluții diluate de hidroxizi alcalini și carbonate.

IDENTIFICARE

Se dizolvă 0.250 g în soluție de carbonat de sodiu R 14 g/l și se diluează la 25.0 ml cu aceeași soluție. Rotația optică specifică (2.2.7) este cuprinsă între +19 și +24, calculată raportat la substanța anhidră.

Se dizolvă 10 mg în soluție de hidroxid de sodiu R 4 g/l și se diluează la 100 ml cu același solvent. Se diluează 10 ml din această soluție la 100 ml cu soluție de hidroxid de sodiu R 4 g/l. Examinată spectrofotometric între 230 – 380 nm (2.2.25), soluția prezintă trei maxime de absorbție la 258 nm, 302 nm și respectiv 371 nm. Raportul absorbanțelor măsurate la max. 302 nm și max. 371 nm este cuprins între 2,8 -3,3.

Se determină prin spectrofotometrie de absorbție în infraroșu (2.2.24) comparând spectrul probei analizate cu spectrul stadardului de referință metotrexat CRS.

TESTE

Substanțe înrudite. Se examinează prin cromatografie de lichide (2.2.29), cum este prescris la dozare dar lungimea de undă este 265 nm.

Se injectează 20 µl soluție de referință (c). Testul nu este valid decât dacă în cromatograma obținută, rezoluția între picul corespunzator impurității D și metotrexat este cel putin 2.0.

Se injectează 20 µl soluție test și 20 µl soluție de referință (b). Se continuă cromatografia de trei ori timpul de retenție al metotrexatului.

Când cromatograma este inregistrată în condițiile prescrise, timpul de retenție relativ aproximativ este: impuritatea A = 0.2; impuritatea B = 0.3; impuritatea C = 0.4; impuritatea D = 0.8; impuritatea E =2.3.

În cromatograma obținută la soluția test, aria a cel mult cinci picuri, aparținând principalului pic, este mai mare decât 0.2 ori aria piclui principal din cromatograma obținută cu soluția de referință (b) (0.1 %) și nici un alt pic nu are aria mai mare decât aria picului principal din cromatograma obținută cu soluția de referință (b) (0.5 %). Suma ariilor tuturor picurlor, aparținând principalului pic, nu este mai mare decat 2.6 ori aria picului principal din cromatograma obtinuță cu soluția de referință (b) (1.3 %). Nu se ia în considerare nici un pic cu aria mai mică decât 0.05 ori picul principal obținut în cromatograma soluției de referință (b).

(R)- Metotrexat. Max 3.0 %. Se examinează prin cromatografie de lichide (2.2.29).

Soluția test. Se dizolvă 20.0 mg substanță de examinat în fază mobilă și se diluează la 100.0 ml cu fază mobilă.

Soluția de referință (a). Se diluează 1.0 ml din soluția test la 100.0 ml cu faza mobilă.

Soluția de referință (b). Se dizolvă 4.0 mg de (RS)- metotrexat R în faza mobilă și se diluează la 100.0 ml cu fază mobilă.

Procedura cromatografică poate fi realizată folosind:

o coloană de inox cu lungime de 0.15 m, diametru intern 4 mm umplută cu albumină bovină R legată de silica gel pentru cromatografie R (7 µm; dimensiunea porilor 30 nm),

faza mobilă (cu un debit de 1.5 ml / min) este un amestec preparat astfel: la 500 ml soluție 7.1 g/l de fosfat disodic anhidru R se adaugă 600 ml soluție 6.9 g/l de fosfat monosodic monohidrat R și se agită. Se ajustează pH-ul la 6.9 cu soluție de hidroxid de sodiu diluat R. La 920 ml din acest amestec se adaugă 80 ml propanol R,

ca detector un spectrofotometru (la λ=302 nm)

Se injectează 20 µl din fiecare soluție. Testul nu este valid decât dacă în cromatograma obținută cu soluția de referință (b), rezoluția între picurile corespunzatoare la (S)- metotrexat și respectiv (R)- metotrexat este cel puțin 3.0.

În cromatograma obținută cu soluția test aria oricărui pic corespunzător la (R)-metotrexat nu este mai mare decât de trei ori aria picului principal în cromatograma obținută cu soluția referință (a) (3.0 %).

Metale grele (2.4.8). 1.0 g se ia în lucru pentru testul F al limitei de metale grele (50 ppm). Se prepară un standard folosind 5 ml soluție standard de plumb (10 ppm Pb) R.

Apă (2.2.12). Substanța contine un procent de maxim 13.0 %, determinată pe 0.100 g.

Cenușă sulfatată (2.4.14). Max 0.1 % determinată pe 1.0 g

Dozare. Se examinează prin cromatografie de lichide (2.2.29).

Soluția test. Se dizolvă 25.0 mg substanța de examinat în fază mobilă și se diluează la 250.0 ml cu fază mobilă.

Soluția de referință (a). Se dizolvă 25.0 mg de metotrexat CRS în fază mobilă și se diluează la 250.0 ml cu fază mobilă.

Soluția de referință (b). Se diluează 0.5 ml soluție de referință (a) la 100.0 ml cu fază mobilă.

Soluția de referință (c). Se dizolvă 25.0 mg substanță de examinat și 25.0 mg de metotrexat CRS în fază mobilă și se diluează la 250.0 ml cu fază mobilă.

Procedeul cromatografic poate fi realizat folosind:

o coloană de inox cu lungime de 0.25 m, diametru intern 4.6 mm umplută cu octadecilsilil silica gel pentru cromatografie R (5µm),

faza mobilă (cu un debit de 1.2 ml / min) este un amestec de 7 volume acetonitril R și 93 volume soluție preparată astfel: se dizolvă 7.8 g acid citric R și 17.9 g fosfat disodic anhidru R în apă și se diluează la 1000 ml cu același solvent,

ca detector un spectrofotometru (la λ=302 nm)

Se injectează soluția de referință (a) de șase ori. Dozarea nu este validă decât dacă deviația standard relativă a picului de metotrexat este mai mică de 2 %. Se injectează 20 µl din soluția test și 20 µl din soluția de referință (a). Se calculează conținutul procentual al metotrexatului folosind cromatogramele obținute cu soluția test și soluția de referintă (a).

CONSERVARE

Se pastreză în recipiente închise etanș, ferit de lumină.

III.2 Monografie folinat de calciu ( Farmacopeea Europeană 5.0)

Mr 511,5 (substanță anhidră)

DEFINIȚIE

Sarea anhidră a folinatului de calciu și lipsită de solvenți, conține cel puțin 97,0%, dar nu mai mult decât 102,0%, (2S) 2-[4-[(6RS)-2-amino-5-formil-5,6,7,8-tetrahidro-4-hidroxi-pteridin-6-il)]metilamino]benzoamido]-glutarat de calciu și echivalentul a cel puțin 7,54%, dar nu mai mult de 8,14% Ca.

1 mg folinat de calciu conține 0,002 mmol acid folinic și 0,002 mmol Ca (0,004 mEq Ca).

CARACTERISTICI

Se prezintă sub forma unei pulberi de culoare albă sau ușor gălbuie, amorfă sau cristalină, puțin solubilă în apă, practic insolubilă în acetonă și în alcool. Forma amorfă poate produce soluții supersaturate în apă.

IDENTIFICARE

Identificare primară : A, B, D

Identificare secundară : A, C, D

A. Testul de rotație optică specifică este valid.

B. Se determină prin spectrofotometrie de absorbție în infraroșu (2.2.24) comparând spectrul probei analizate cu spectrul stadardului de referință folinat de calciu CRS.

C. Se determină prin cromatografie în strat subțire (2.2.27), folosind ca fază staționară celuloza pentru cromatografie F254 R.

Soluția test. Se dizolvă 15 mg din substanța de analizat într-o soluție 3% V/V de amoniac R și se diluează la 5ml cu același solvent.

Soluția de referință. Se dizolvă 15 mg de folinat de calciu CRS într-o soluție 3% V/V de amoniac R și se diluează la 5ml cu același solvent.

Se aplică pe placa cromatografică 5µl din fiecare soluție. Migrarea probei se realizează cu ajutorul unei faze mobile alcatuită dintr-un amestec 1:10 alcool izoamilic : soluție acid citric 50g/l ajustat în prealabil la pH 8 cu amoniac R. Se usucă placa la aer și apoi se examinează în lumina ultravioletă la 254 nm. Principalul spot de pe cromatogramă obținut la soluția test este similar ca poziție și mărime cu spotul obținut la soluția de referință.

D. Substanța dă reacția (b) pentru calciu conform monografiei generale 2.3.1.

Testele și dozarea se determină cât mai repede posibil protejând proba de

lumina puternică.

TESTE

Soluția S. Se dizolvă 1.25g în apă fără dioxid de carbon R încazită la 40 0C dacă este necesar, și se diluează la 50.0ml cu același solvent.

Aspectul soluției. Soluția S este clară conform monografiei generale 2.2.1. Absorbanța (2.2.25) soluției S, masurată la 420 nm folosind apa ca lichid de compensare, nu este mai mare de 0.6.

pH (2.2.3). pH-ul soluției S este cuprins între 6.8 – 8.0.

Putere rotatorie specifică (2.2.7). Rotația optică specifică este cuprinsă între +14.4 – +18.0, determinată pe soluția S și calculată raportat la substanța anhidră și fara solvenți reziduali.

Acetona, etanol și metanol. Limitele maxime admise sunt 0.5% pentru acetonă, 3.0% pentru etanol și 0.5% pentru metanol. Analiza se determină prin gaz cromatografie (sistem GC-HS) (2.2.28).

Soluția test. Se dizolvă 0.25 g de substanță de examinat în apă R și se diluează la 10.0 ml cu același solvent.

Soluția de referința. Se diluează 0.125 g acetonă R, 0.750 g etanol R, și 0.125 g metanol R în apă R și se diluează la 1000.0 ml cu apă R.

Procedura cromatografică poarte fi realizată folosind:

– o coloană capilară cu lungime de 10 m, diametru intern de 0.32 mm și căptușită cu stiren – divinilbenzen copolimer R,

– azot pentru cromatografie R ca gaz purtător la un debit de 4 ml/ min,

– detector cu ionizare în flacără,

crescând temperatura pe coloană de la 1250C la 1850C cu o rată de 100C/ min și menținând la 1850C până la 15 min. Se menține temperatutra la injector la 2500C și la detector la 2500C. Se introduc probele în camera termostatată la 800C timp de 20 min și presurizare 30 s. Se repetă injecțiile de cel puțin trei ori.

Substanțe înrudire. Se examinează cromatogramele obținute la Dozare. În cromatograma obținută la soluția test: aria oricărui pic corespunzător acidului formilfolic nu este mai mare decât aria picului principal în cromatograma obținută la soluția de referință (c)(1%); aria oricărui pic, aparținând principalului pic și orice pic corespunzător acidului formilfolic nu este mai mare decât aria picului principal în cromatograma obținută la soluția de referință (b)(1%); suma ariilor tuturor picurilor, apartinând principalului pic, nu este mai mare decât 2.5 ori aria principalului pic în cromatograma obținută la soluția de referință (b)(2.5%). Limita de detecție a oricărui pic cu aria mai mică decât a picului principal se obține cu ajutorul soluției de referință (d).

Cloruri(2.4.4). Se dizolvă 67 mg în 10 ml apă R și se adaugă 3 ml de acid acetic R. Se filtrează și se spală precipitatul de cinci ori cu câte 5 ml apă R. Se colectează filtratele și apa de spălare și se diluează la 100 ml cu apă R. 15 ml din această soluție se iau în lucru pentru testul limitei de cloruri (0.5 %).

Metale grele(2.4.8). 1.0 g se ia în lucru pentru testul F al limitei de metale grele (50 ppm). Se prepară un standard folosind 5 ml soluție standard de plumb (10 ppm Pb) R.

Platina. Limita maximă admisă este de 20 ppm Pt, determinată prin spectrofotometrie de absorbție atomică (2.2.23, Metoda II )

Apa (2.2.12). Substanța conține un procent de maxim 17%, determinată pe 0.200 g (pulbere foarte fină). Se agită substanța de examinat în solventul de titrare timp de 6 min înainte de titrare și se folosește un titrant adecvat care să nu conțina piridină.

Endotoxine bacteriene (2.6.14): mai puțin de 0.5 UI / ml dacă se intenționează a se folosi la prepararea formelor parenterale fără o procedură suplimentară pentru indepărtarea endotoxinelor bacteriene.

DOZARE

Calciu. Se dizolvă 0.400 g în 150 ml apă R și se diluează la 300 ml cu același solvent. Se realizează titrarea compexonometrică a calciului (2.5.11).

Folinat de calciu. Se determină prin lichid cromatografie (2.2.29).

Soluția test. Se dizolvă 10.0 mg substanță de examinat în apă R și se diluează la 10.0 ml cu același solvent.

Soluția de referință (a). Se dizolvă 10.0 mg folinat de calciu CRS în apă R și se diluează la 10.0 ml cu același solvent.

Soluția de referință (b). Se diluează 1.0 ml din soluția de referința (a) la 100.0 ml cu apă R.

Soluția de referință (c). Se dizolvă 10.0 mg de acid formilfolic CRS în fază mobilă și se diluează la 100.0 ml cu fază mobilă. Se diluează 1.0 ml din acestă soluție la 10.0 ml cu apă R.

Soluția de referință (d). Se diluează 1.0 ml soluție de referință (b) la 10.0 ml cu apă R.

Soluția de referință (e). Se diluează 5.0 ml soluție de referință (c) la 10.0 ml cu soluție de referință (b).

Procedura cromatografică poate fi relizată folsind:

– o coloană de inox cu lungime de 0.25 m, diametru intern 4 mm umplută cu octadecilsilil silica gel pentru cromatografie R (5µm),

faza mobilă (cu un debit de 1 ml / min) este un amestec preparat astfel: 220 ml metanol R și 780 ml soluție conținând 2.0 ml soluție de hidroxid de tetrabutilamoniu (400 g / l) R și 2.2 g fosfat disodic R ajustată în prealabil la pH 7.8 cu acid fosforic R,

– ca detector un spectrofotometru (la λ=280 nm) menținând temperatura pe coloană la 40 0C.

Se injectează 10 µl din fiecare soluție. Se continuă cromatografia pentru 2.5 ori timpul de retenție al principalului pic în cromatograma obținută la soluția test. Dozare nu este validă decât dacă, în cromatograma obținută cu soluția de referință (e), rezoluția între picurile corespunzătore folinatului de calciu respectiv acidului formilfolic este cel puțin 2.2 și deviația standard relativă a ariei picului principal pentru șase injecții din soluția de referință (a) este cel mult 2.0.

Se calculeză conținutul procentual de C20H21CaN7O7 din ariile picurilor și conținutul declarat al folinatului de calciu CRS .

CONSERVARE

Se pastreză în recipiente închise etanș ferite de lumină. Dacă substanța este sterilă, se păstreză în recipiente sterile, etanșe, sigilate.

IMPURITĂȚI

Acid 4-aminobenzoil-glutamic

Acid 5,10-diformiltetrahidrofolic

Acid folic

Acid 10-formilfolic

Acid 5-formiltetrahidropteroic

STABILITATE.

Folinatul de calciu este fotosensibil și higroscopic (în 4 ore incorporează aproximativ 10% apă). Soluțiile neutre sau slab bazice sunt mai stabile decât cele acide. 1mM soluție expusă la temperatura camerei, se degradează în primele 4 ore cca. 0,3%, iar în 15 zile aproximativ 4%.

În soluțiile acide se formează în timp acid 5,10-metiltetrahidrofolic .

III.3 Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) – metodă analitică utilizată în controlul medicamentelor

Cromatografia reprezintă ansamblul de metode de separare a componentelor unui amestec pe baza migrării defențiate într-un sistem de două faze aflate în contact : faza staționară/faza mobilă. Migrarea diferențiată este determinată de vitezele diferite cu care componentele traversează faza staționară (FS) antrenate de faza mobilă (FM), de-a lungul coloanei cromatografice sau al unui echivalent al ei.

Tehnicele cromatografice de analiză se numără printre metodele instrumentale cele mai performante, cu largă aplicabilitate în controlul medicamentelor.

O clasificare a tehnicilor cromatografice se poate realiza fie în funcție de natura fizică a fazelor, fie prin procedura utilizată, fie pe baza fenomenelor fizico-chimice care stau la baza separării.

Clasificarea care urmează dă prioritate naturii fazelor aflate în prezență:

Cromatografie gaz-solid

Cromatografie gaz-lichid

Cromatografie lichid-solid

Cromatografie lichid-lichid

În continuare ne vom referi la cromatografia lichid-lichid, una din tehnicile cele mai utilizate.

Cromatografia lichid-lichid

În cromatografia lichid-lichid (CLL) sau de repartiție, faza staționară este un lichid impregnat pe un suport solid (în general gel de silice).

Separarea se bazează pe repartiția soluților între faza impregnată sau legată chimic și faza mobilă, care depinde de diferențele de solubilitate ale soluților în cele două faze lichide .

Această tehnică se poate practica sub forma cromatografiei HPLC lichid-lichid și HPLC-fază legată (grefată), între aceste două variante existând numai o diferență privind modul de fixare a fazei staționare pe suportul solid.

În prima variantă faza staționară se fixează prin adsorbția fizică, în timp ce în varianta cu fază legată este vorba de legături covalente.

Varianta clasică lichid-lichid are puține aplicații practice, mult mai utilizată fiind cromatografia HPLC pe fază legată chimic. Se disting astfel două moduri de cromatografie cu faze legate:

-cromatografie în fază normală- unde faza staționară este de natură hidrofilă (având grefate pe silice grupări de tipul: amino sau aminopropil, nitro sau nitril; dialcool) iar faza mobilă este lipofilă

-cromatografia în fază inversă- unde faza staționară este lipofilă (lanțuri alchil C4-C30; propil, fenil) și faza mobilă este hidrofilă; fazele staționare octil și octadecil fiind foarte des utilizate.

Pentru sinteza fazelor staționare legate, gelul de silice s-a dovedit a fi un suport convenabil datorită calităților sale: suprafață specifică mare, rezistență la presiune, reactivitatea grupelor ≡ Si-OH.

Dezavantajul acestui suport constă în instabilitatea lui în mediu alcalin (pH>8), în astfel de medii fiind prefereat gelul de polimer de tip stiren-divinilbenzen.

Fazele mobile trebuie să fie caracterizate prin putere eluotropică și inerție chimică față de probele de analizat.

Cei mai utilizați solvenți în cromatografia în fază inversă, în ordinea creșterii puterii de eluție, sunt: metanol > acetonitril > etanol > izopropanol > dimetilformamida > n-propanol > dioxan > tetrohidrofuran.

Majoritatea separărilor cromatografice în cromatografia de lichide se realizează prin cromatografie de repartiție în fază inversă într-un sistem HPLC.

Un sistem HPLC conține un rezervor de eluent, o pompă de înaltă presiune cu ajutorul căreia se realizează fluxul de fază mobilă prin coloană, un injector pentru introducerea probei în fluxul fazei mobile, o coloană din oțel inoxidabil care are la interior faza staționară imobilizată, un detector și un sistem de înregistrare.

Adițional, pentru creșterea preciziei analizei, se poate atașa un termostat de coloană. Sistemul poate fi controlat prin intermediul unui calculator. În figura 1 este prezentată schema de principiu a unui cromatograf de lichide.

Sistemele actuale pot folosi o singură pompă, care asigură un debit stabil pentru o fază mobilă dată (situație în care sistemul se numește izocratic) sau mai multe (de obicei, până la 4), cu ajutorul cărora se poate genera un amestec de solvenți variabil în timp din punctul de vedere al compoziției chimice (sistem gradient).

Injectorul automat este cel mai adesea folosit (injectarea probelor se face programat; fiecare probă este introdusă dintr-o fiolă specială așezată într-un suport special.

Coloanele sunt confecționate din oțel cu crom-nichel-molibden, rezistent la presiunile de lucru (aproximativ 400-500 bari) din sistemele HPLC și inert chimic. La coloanele HPLC uzuale lungimea este cuprinsă între 5-25 cm, diametrul intern este 4-4.6 mm, iar diametrul granulelor fazei staționare este cuprins între 5-10 μm.

Detectorul – indică în eluantul de pe coloană modificarea unei mărimi fizice sub forma unui semnal a cărui înălțime este proporțională cu concentrația substanței răspunzătoare de această modificare. Un detector ideal trebuie să aibă aceeași sensibilitate pentru toate componenetele, să detecteze cantități foarte mici de probă, să aibă un răspuns rapid, să nu fie influențat de schimbările în compoziția fazei mobile, să asigure reproductibilitatea semnalului, să nu altereze calitatea separării produselor pe coloană, etc. Detectorii folosiți în sistemele cromatografice HPLC sunt: detectorii UV-VIS, de fluorescență, detectorul electrochimic, spectrometre de masă, detectorul de indice de refracție.

Cel mai des întâlnit detector este spectrometrul de absorbție UV-VIS, situație în care fracțiile eluate trec pe rând printr-o celulă flux parcursă de radiația de lungime de undă fixă (UV sau vizibil). Detectorul înregistrează absorbanța fracției eluate, iar cuantificarea se face pe baza legii Lambert-Beer. Unele sisteme de detectori sunt echipate cu bucle de întârziere a fracției eluate, astfel încât să se poată realiza și spectrul acesteia. Pe măsură ce fracțiile eluate se scurg din coloană, detectorul le înregistrează ca pe o serie de picuri care se succed în timp, obținându-se astfel cromatograma.

O variantă mai nouă a detectorului UV-VIS o constituie detectorul cu șir de diode (diode-array detector – DAD). Sistemul este deosebit de eficient atunci când ar fi nevoie de măsurători simultane la mai multe lungimi de undă (de pildă, pentru efectuarea unor corecții spectrale).

Un alt tip de detector este cel de fluorescență. În acest caz, fracția eluată care trece prin celula-flux este excitată cu radiație de lungime de undă potrivită compusului urmărit și este detectată ca emisie fluorescentă provenită de la acel compus. Avantajul acestui sistem de detecție constă în selectivitatea și sensibilitatea crescută datorate metodei fluorescente.

Un detector de ultimă generație cuplat cu cromatograful de lichide este spectometrul de masă, care permite atât analiza calitativă foarte precisă, cât și analiza cantitativă.

Detectorul sesizează prezența componenților în fluxul de eluent și transformă această informație într-un semnal ce poate fi înregistrat.

Prin înregistrarea grafică a semnalului detectorului în funcție de timp se obține o cromatogramă (sau o curbă de eluție ~ Curba Gauss). Un astfel de semnal produs de un detector în momentul eluției unui anumit compus este cunoscut sub numele de pic cromatografic.

Picul cromatografic corespunde unei distribuții gaussiene de valori reprezentată în sistemul de coordonate p=f(t).

Picul cromatografic este caracterizat prin parametrii calitativi și cantitativi .

III.3.2 Parametrii calitativi

Parametrii calitativi ce definesc picul cromatografic sunt corelabili cu anumite proprietăți ale analițiilor și cu anumite particularități ale proceselor de distribuție ale acestora între cele două faze.

Timpul de retenție absolut (tR) reprezintă timpul scurs ( măsurat) din momentul injecției amestecului în sistemul cromatografic și până în momentul detecției unui răspuns maxim, la eluția fiecăreia dintre speciile separate (figura 2), și este dat de relația :

tR = + tM

unde este timpul de retenție relativ iar tM este timpul mort

Un timp de retenție absolut foarte lung corespunde unui echilibru de repartiție al solutului deplasat preferențial către faza staționară.

Un timp de retenție scurt corespunde unui echilibru de repartiție al solutului deplasat preferențial către faza mobilă.

Figura 2. Caracterizarea picului cromatografic

Timpul de retenție relativ (sau corectat ) corespunde timpului pe care o specie de analiți îl petrece în faza staționară. Diferența între timpul de retenție absolut (tR) și timpul de retenție relativ (sau corectat) corespunde perioadei de timp pe care solutul a petrecut-o în fază mobilă. Timpul necesar frontului de fază mobilă pentru a parcurge coloana cromatografică se definește ca fiind timpul mort (tM) ce caracterizează coloana respectivă.

= tR – tM

Pentru că timpul de retenție depinde de viteza de curgere a eluentului prin coloană se folosește noțiunea de volum de retenție, (volum de retenție brut), care este volumul de fază mobilă măsurat din momentul injecției până la maximul vîrfului cromatografic al fiecărui solut

= ∙ D

unde D este debitul fazei mobile (constant )

Volumul de retenție corectat () este dat de diferența dintre volumul de retenție brut () și volumul mort al coloanei ().

= –

Factorul de retenție , K′ (numit și factor de capacitate) poate fi definit ca raportul dintre timpul petrecut de compus în faza staționară și cel petrecut în faza mobilă

K′ = ,

sau dacă se ține seama că = se obține:

K′ = , preferabil 1 ≤ K′ < 10

Factorul de retenție caracterizează mai ales termodinamic interacțiunea dintre solut și faza staționară. În condiții experimentale date K′ este constant.

Dacă se observă modificări ale factorului de retenție (K′) când parametrii sunt identici înseamnă că faza staționară s-a alterat și trebuie înlocuită coloana.

Lărgimea picului cromatografic – furnizează informații asupra cineticii de distribuție a analitului între faze.

În cazul distribuției gaussiene în sistemul de coordonate P=f(t), forma analitică a funcției este:

,

unde:

P reprezintă mărimea proprietății detectate la un moment de timp t cuprins între momentul de început și cel final, în eluția picului cromatografic;

reprezintă mărimea proprietății detectate la momentul de timp ;

[începutul eluției picului, sfârșitul eluției picului];

σ reprezintă deviația standard.

Lărgimea picului cromatografic poate fi descrisă prin intermediul deviației standard ce caracterizează distribuția gaussiană a valorilor proprietății măsurate de către sistemul de detecție în raport cu timpul necesar eluției frontului de analizat separat pe coloana cromatografică.

Figura 3. Pic cromatografic ideal

Lărgimea picului cromatografic poate fi măsurată la baza sa – Wb (intersecția tangentelor duse în punctele de inflexiune ale curbei Gauss cu axa Ox sau 0,044 din înălțimea sa), la jumătate din înălțimea sa – Wh, sau la 0,607 din înălțimea sa Wi. Relațiile care se stabilesc între Wb, Wh și Wi în raport cu σ sunt prezentate în figura 3.

III.3.3 Parametrii cantitativi

Parametrii cantitativi sunt:

-înălțimea (h)

-aria (A)

fiind corelabile prin intermediul unor relații simple, cu masa sau concentrația de analit separată.

Pentru o determinare cantitativă mai precisă este utilizată aria picului cromatografic:

A = c′ ∙

c`- reprezintă o constantă de proporționalitate

– reprezintă cantitatea medie de analit i existentă în faza mobilă pe toată durata eluției picului cromatografic corespunzător

III.3.4 Mărimi ce caracterizează separarea cromatografică

Exprimarea teoretică a eficienței coloanei este dată de valoarea înâlțimii echivalente a talerului teoretic (H). Aceasta este un concept teoretic ce indică lungimea segmentului de coloană în care se realizează un echilibru de distribuție al componentului între faza mobilă și faza staționară. Prin împărțirea lungimii coloanei L, la numărul total de talere, se obține înălțimea unui taler, adică valoarea H :

Din punct de vedere cromatografic, valoarea H este o măsură a lățirii picului care are loc în timpul procesului de eluție. Cu cât este mai mică valoarea H, cu atât este mai mică lățirea picului și este mai mare eficiența coloanei.

Numărul de talere teoretice (N) este proporțional cu pătratul timpului de retenție absolut și invers proporțional cu pătratul abaterii standard

Selectivitatea separării

Doi componenți dintr-un amestec pot fi separați dacă au valori K′ diferite. Această diferență se exprimă prin factorul de selectivitate (separare) notat α. Acesta caracterizează echilibrul de distribuție (mărime termodinamică) pentru doi analiți eluați consecutiv din coloană.

> >

dacă α = 1 nu are loc separarea (coeluția celor două specii; ies împreună de pe coloană)

dacă α > 4 apar diferențe mari între tR1 și tR2 ceea ce înseamnă o eluare prea lentă

ideal: 1 < α < 4

Rezoluția (Rs) – reprezintă măsura capacității efective de separare a doi compuși pe o coloană specifică (având o anumită lungime, rază, natură a fazei staționare, grosime a filmului), în condiții bine determinate (natura și viteza fazei mobile, temperatura).

Rezoluția depinde de natura componenților. Pentru a evalua posibilitatea de aplicare în analiză a unui sistem cromatografic, rezoluția Rs a unei perechi critice este exprimată, pe baza reprezentării grafice, prin formula:

unde > , iar reprezintă lățimea bazei picului (figura 4).

Pentru două picuri vecine , iar poate fi considerat valoare medie

= = ,

aceasta fiind ecuația de bază pentru optimizarea separării.

este 1 pentru = = 4α. În acest caz separarea este 95,4 %

este 1,5 pentru = = 6α. În acest caz separarea este 99,73 %

Figura 4. Rezoluția a două picuri învecinate

În termeni cromatografici, acest lucru s-ar putea exprima astfel: ∆tR depinde de interacția celor doi componenți cu faza staționară (eficiența selectivității), în timp ce wb este dependent de mecanismele ce determină lărgirea picului (eficiența coloanei), care sunt în schimb funcții de timpul de înârziere (factorul de retenție) al componenților în coloană.

Făcând înlocuirile necesare în ecuația de bază pentru optimizarea separării, rezoluția este dată de relația:

,

aceasta fiind ecuația de bază a cromatografiei.

Potrivit acestei formule pentru optimizarea proceselor de separare cromatografică se poate interveni asupra parametrilor :

-asupra numărului de platouri teoretice N (primul termen din formulă)

-asupra factorului de selectivitate α (al doilea termen din formulă) -asupra factorului de capacitate al coloanei față de compusul 2 (ultimul termen al formulei)

Rezoluția și implicit calitatea separării cromatografice poate fi mult îmbunătățită prin conceperea și proiectarea aparaturii cromatografice, care trebuie să permită optimizarea separării, adică să permită aplicarea practică a conceptelor teoretice prezentate anterior privind modul de acțiune asupra vitezei fazei mobile, granulației, umplerii coloanei, fixării fazei staționare, asupra naturii acesteia, asupra asigurării unor factori de selectivitate și de retenție optimi.

III.4 Validarea metodelor analitice

III.4.1 Generalități

Validarea este o metodologie care are drept scop să demonstreze că o metodă de analiză corespunde utilizării pentru care a fost elaborată și că performanțele metodei, stabilite prin studii de laborator, satisfac cerințele de aplicabilitate în practica de laborator curentă.

Validarea se face pe baza unei strategii generale stabilită prin norme ISO (International Standardisation Organisation) cuprinse în nota explicativă a Comisiei de specialitate a CEE, în “Ghidul privind metodologia de validare a procedeelor analitice – 3AQ14a” elaborat de “Conferința Internațională pentru armonizarea cerințelor tehnice (International Committee for Harmonisation – ICH) pentru înregistrarea medicamentelor de uz uman”, ce cuprinde opt parametri de validare și în USP 28-NF23 , în care este inclus un ghid de linii directoare specifice pentru validarea metodelor utilizate pentru determinarea unor componenți.

Datele cuprinse în nota explicativă a Comisiei CEE se aplică tuturor metodelor de analiză care sunt utilizate în domeniile documentării chimice, farmaceutice și biologice; aceste date sunt aplicabile în domeniile cercetării științifice chimice, farmaceutice, medicale, agronomice, etc. Nota explicativă se referă la următoarele domenii de aplicare:

dezvoltare analitică, respectiv dezvoltarea metodelor și metodologiei analitice

controlul materiilor prime, active sau nu;

controlul în cursul fabricației, respectiv al produșilor intermediari;

controlul produsului finit

studii de stabilitate

Principalii parametri ce fac obiectul validării sunt:

specificitatea/selectivitatea

linearitatea și domeniul

acuratețea (exactitatea)

precizia (fidelitatea)

limita de detecție

limita de cuantificare

robustețea

Performanțele caracteristice metodei trebuie să fie corelate cu scopul acesteia.

În toate țările vest-europene sunt acceptate aceste principii, precum și definițiile date parametrilor enumerați, pentru a asigura o evaluare științifică sigură, precum și unanimitatea necesară de tratare a relațiilor privind producerea medicamentelor și calitatea acestora.

III.4.2 Definirea parametrilor de validare

Specificitatea unei metode analitice este capacitatea ei de a detecta sau determina un analit dintr-un amestec multicomponent, prin măsurarea cantitativă a unui parametru fizico-chimic caracteristic numai componentului analizat.

Deoarece relativ rar se poate vorbi de specificitatea unui procedeu analitic, cel puțin pentru identificare (detecție) se utilizează cu precădere termenul selectivitate. Un procedeu analitic este selectiv dacă permite detecția unui analit (component) în prezența altora, dacă în probă se realizează anumite condiții experimentale de eliminare sau de diminuare a interferențelor.

Linearitatea unei metode reprezintă capacitatea metodei de a conduce, într-un interval determinat, la rezultate ale parametrului măsurat direct proporționale cu concentrația substanței analizate; altfel spus, intensitatea semnalului analitic variază proporțional cu concentrația, într-un domeniu limitat. Linearitatea se exprimă în general prin variația pantei dreptei de regresie calculată conform unei relații matematice din rezultalele obținute prin analiza probelor de analit cu diferite concentrații. Ecuația de regresie liniară aplicată rezultatelor trebuie să aibă o ordonată (intercept) nesemnificativ diferită de zero. Se determină printr-o serie de 3-6 probe paralele a 5 sau mai multe standarde (etaloane) ale căror concentrații acoperă 50-150% din domeniul de concentrații la care ne așteptăm.

Domeniul unei metode analitice este intervalul dintre limita superioară și cea inferioară ale analitului care au fost determinat cu acuratețe, precizie și într-un anumit domeniu de linearitate, folosind metoda enunțată.

Acuratețea unei metode analitice exprimă concordanța între rezultatele obținute prin metoda de analiză considerată și valoarea acceptată ca fiind adevărată. Poate fi exprimată ca fiind procentul de regăsire dintr-o cantitate cunoscută de probă. Acuratețea este o măsură a exactității metodei analitice respective.

Precizia (fidelitatea) unei metode analitice se referă la gradul de concordanță între rezultatele testelor atunci când procedura se aplică repetat. Se exprimă în mod normal ca deviația standard sau deviația standard relativă (coeficientul de variație). Precizia poate fi o măsură a gradului de repetabilitate sau de reproductibilitate al metodei analitice în condiții normale de lucru. Precizia poate varia între 2% și 20%, în funcție de tehnica analitică utilizată.

Repetabilitatea se referă la concordanța rezultatelor obținute în urma repetării determinărilor sau aplicării metodei în cadrul unui laborator, de către un singur analist, cu același tip de echipament, în decursul unei perioade scurtă de timp.

Reproductibilitatea exprimă fidelitatea în condiții experimentale diferite și anume: în laboratoare diferite, efectuate de către analiști diferiți, în zile diferite, utilizând aparatură de același tip, dar de proveniență diferită. Demonstrarea reproductibilității este importantă dacă o metodă trebuie să fie utilizată în laboratoare diferite.

Precizia intermediară, concept definit de ICH în 1997, reprezintă variabilitatea pe termen lung a măsurătorilor (Bojiță M. și colab., 2002). Acest parametru poate reflecta și diferențele dintre rezultatele obținute de analiști diferiți cu instrumente diferite, cu standarde și reactivi proveniți de la furnizori diferiți, sau diferențele determinate de doi sau mai mulți factori din cei menționați. Ea se evaluează prin compararea rezultatelor metodei utilizate într-un singur laborator timp de mai multe săptămâni.

Limita de detecție reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă, care poate fi detectată în condiții experimentale, dar nu cuantificată ca o valoare exactă. Limita de detecție se exprimă ca și concentrația de analit dintr-o probă.

Limita de cuantificare este cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă care poate fi determinată cu precizie și acuratețe acceptabile în condițiile experimentale stabilite. Limita de cuantificare se exprimă ca și concentrația de analit din probă.

Robustețea unei metode analitice este o măsură a capacității sale de a rămâne neafectată de mici variații (deliberate) în parametrii metodei și furnizează informații asupra siguranței utilizării metodei în condiții normale. Se evaluează prin teste care examinează efectele parametrilor operaționali asupra rezultatelor analitice.

III.5 Metodă HPLC de dozare a metotrexatului și folinatului de

calciu din plasmă umană

Folinatul de calciu (sare de sodiu a acidului folinic) este folosit frecvent pentru prevenirea reacților adverse a accidentelor toxice provocate de dozele mari de metotrexat administrate în timpul tratamentului osteosarcoamelor.

Astfel în terapia cu doze mari de metotrexat din osteosarcoame (12-15g/m2) folinatul de calciu se administrează la 24 ore de la începutul perfuziei cu metotrexat în doze de 15-30 mg/m2

În acest sens determinarea concentrației plasmatice a metotrexatului, respectiv a folinatului de calciu este foarte importantă pentru identificarea pacienților cu anomalii ale clearence-lui care au un risc crescut de toxicitate și pentru instituirea unor măsuri terapeutice specifice.

Având în vedere faptul că timpul necesar determinării separate a metotrexatului, respectiv a folinatului de calciu este mai mare decât cel necesar determinării simultane acestora ne-am propus să elaborăm o metodă eficientă și rapidă de dozare simultană a acestor compuși pe plasmă umană metodă pe care ulterior să o aplicăm pentru analiza probelor biologice în cadrul terapiei cu doze mari de metotrexat, însoțită de “terapia de salvare” cu folinat de calciu.

Plecând de la datele de literatură (F. Eur. 5) am dezvoltat o metodă HPLC pentru determinarea simultană a metotrexatului și a folinatului de calciu în plasmă umană.

Pentru scurtarea timpurilor de retenție ai metotrexatului și folinatului de calciu am folosit o fază mobilă compusă din soluțiile tampon pH = 7,8 : metanol (720 ml : 280 ml , în loc de 780 ml : 220 ml cum era prevăzut în F. Eur. 5).

III.5.1 Principiul metodei

Dozarea folinatului de calciu și a metotrexatului prin metoda HPLC în fază inversă, cu detecție în UV (λ=280nm) utilizând ca fază staționară o coloană Zorbax SB 5µm (fază legată C18) și o fază mobilă polară compusă din soluțiile tampon pH=7,8 : metanol (720 ml:280 ml).

III.5.2 Materiale și metode

Reactivi și aparatură:

-folinat de calciu – substanță de referință (Sigma)

-folinat de calciu s.a (Sindan)

-plasmă umană – Centrul de Hematologie al M.Ap.N.

-metotrexat s.ref. (Merck)

-metanol de puritate HPLC (Merck)

-hidroxid de tetrabutilamoniu 400g/L (Merck)

-fosfat disodic de puritate analitică (Merck)

-acid fosforic de puritate analitică (Merck)

-hidroxid de sodiu (Merk)

-alcool n-butilic HPLC (Fluka)

-acetonitril HPLC (Merk)

-dietil eter extrapur (Merk)

-apă bidistilată pentru HPLC

-lichid cromatograf – Agilent 1100 detecție UV (detector DAD)

-balanță analitică Sartorius, model BP 121S

-baie de ultrasonare Branson, model 1510

-centrifugă Janetzki cu 10 cupe

-vortex Velp ZX 3-Italia

Condițiile experimentale:

coloană: Zorbax SB C18 (5µm), 25cm x 4,6 mm (diametru intern)

faza mobilă: soluție tampon pH=7,8: metanol (720:280)

debitul de eluție: 0.7 ml/minut

volumul de injecție: 10µl

detecție UV , λ=280nm

Mod de lucru

Prepararea soluțiilor :

Soluția tampon pH=7,8: 2 ml soluție hidroxid tetrabutil amoniu (400 g/L) și 2,2 g fosfat disodic se aduc în 780 ml apă de puritate HPLC. Se ajustează la pH=7,8 cu acid fosforic.

Faza mobilă: se amestecă 720 ml soluție tampon pH=7,8 cu 280ml metanol și se degazează

Soluția etalon de folinat de calciu: 15,00 mg de folinat de calciu (s.a) se aduc într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă o picătură de hidroxid de sodiu 0,1mol/L și se aduce la volum cu fază mobilă.

Soluția de referință de metotrexat: 15,00 mg de metotrexat (s.r.) se aduc într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă o picătură de hidroxid de sodiu 0,1 mol/L și se aduce la volum cu fază mobilă.

Soluția mixtă (Et) de folinat de calciu și de metotrexat: se amestecă 50ml soluție etalon de folinat de calciu și 50ml soluție de referință de metotrexat. Concentrația teoretică de folinat de calciu respectiv de metotrexat este de 0,075mg/ml. Din această soluție se fac diluții (1:1) succesive (în cascadă) în plasmă umană pentru stabilirea domeniului de linearitate. Soluțiile astfel obținute se supun prelucrării conform “Extracția din plasmă”.

Extracția din plasmă

La 2 ml plasmă se adaugă 2 ml acetonă și se centrifughează 10 min la 2500 rpm. Se prelucrează 1,0 ml supernatant, la care se adaugă 600 µl n-butanol și 800 µl dietileter.

Se supune extracției prin agitare, cu ajutorul vortexului, apoi se centrifughează 10 min la 2500 rpm. Se colectează faza apoasă care servește analizei HPLC.

III.5.3 Protocol experimental

Se injectează (de trei ori pentru fiecare nivel de concentrație) soluțiile preparate pentru verificarea linearității metodei.

Pentru verificarea selectivității se injectează o soluție compusă din metotrexat și folinat de calciu în faza mobilă și a soluției de metotrexat și folinat de calciu în plasmă umană.

Se injectează consecutiv 6 soluții mixte de metotrexat și folinat de calciu cu aceeași concentrație. Determinarea este corespunzătoare numai dacă deviația standard relativă (RSD) a ariilor picurilor de folinat de calciu respectiv de metotrexat, nu este mai mare de 2%.

Calcul

Se calculează procentul de regăsire (R%) folosind formula:

Procent de regăsire (R%) = cantitatea regăsită ∙100

cantitatea luată în lucru

III.5.4 Rezultate și discuții

Prin metoda elaborată se realizează o separare corespunzătoare a metotrexatului și folinatului de calciu (rezoluție ≈ 7) la timpi de retenție sub 5 minute (tR folinat de calciu = 3 minute, tR metotrexat ≈ 4,4 minute), ceea ce reprezintă un avantaj deoarece timpul de analiză este mai scurt (figura 5).

Am validat metoda elaborată prin parametrii: selectivitate, linearitate, precizie, acuratețe, limită de cuantificare.

Selectivitatea

În condițiile de lucru descrise s-a realizat o separare eficientă a analiților metotrexat și folinat de calciu din matricea plasmatică faără a se observa picuri suplimentare semnificative la timpii de retenție corespunzători celor doi analiți, așadar compușii endogeni nu interferă determinarea (figura 6).

Linearitatea și domeniul de linearitate

Am realizat curba de calibrare pentru metotrexat și folinat de calciu în plasmă, în domeniul de concentrații 1,17 – 37,5µg/ml.

Pe baza ariilor picurilor folinatului de calciu respectiv metotrexatului (tabelul nr. 1), au fost trasate curbele de calibrare (figurile 7 și 8)

Parametrii dreptei de dozare și coeficienții de corelație (R²) obținuți pe baza analizei de regresie au fost:

– pentru folinat de calciu y = 44.85286 · x + 4.7000

R² = 0,9999

– pentru metotrexat y = 36.88755 · x + 3.39902

R² = 0,9999

Rezultatele obținute demonstrează că metoda este lineară în domeniul de concentrații menționat.

Figura 5. Cromatograma ce ilustrează separarea corespunzătoare a metotrexatului și folinatului de calciu

Figura 6. Cromatograma ce ilustrează selectivitatea metodei HPLC de dozare a metotrexatului și folinatului de calciu

Tabelul nr. 1. Rezultatele obținute la verificarea linearității metodei HPLC de dozare a metotrexatului și folinatului de calciu din plasmă

Figurile 7 și 8. Curbele de calibrare pentru dozarea folinatului de caciu respectiv a metotrexatului din plasmă prin metoda HPLC

Precizia metodei

Precizia metodei a fost verificată prin parametrul repetabilitate.

Au fost înregisrate cromatogramele (figurile 9, 10, 11, 12, 13, 14) a șase soluții (de aceeași concentrație) de metotrexat și folinat de calciu în plasmă.

Pe bazarezultatelor obținute (tabelul nr. 2) s-a calculat deviația standard relativă (RSD%).

Tabelul nr. 2. Rezultatele experimentale privind precizia metodei HPLC

Pentru metotrexat RSD = 0,336% iar pentru folinatul de calciu RSD = 0,591%).

Metoda este precisă, valorile calculate ale deviației standard relative (RSD) fiind mai mici decât 2%.

Figura 9. Cromatograma obținută la verificarea preciziei metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 10. Cromatograma obținută la verificarea preciziei metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 11. Cromatograma obținută la verificarea preciziei metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 12. Cromatograma obținută la verificarea preciziei metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 13. Cromatograma obținută la verificarea preciziei metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 14. Cromatograma obținută la verificarea preciziei metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Acuratețea (exactitatea metodei)

Acuratețea metodei s-a determinat pe soluții de plasmă în care s-au adăugat cantități de folinat de calciu și metotrexat pentru a obține trei concetrații cuprinse în domeniul de linearitate (1,17µg/ml ; 2,34µg/ml ; 18,75µg/ml ). Spre exemplificare sunt prezentate cromatogramele înregistrate pentru soluțiile cu concentrațiile menționate.(figurile 15, 16, 17).

Acuratețea a fost evaluată prin calcularea procentului de regasire și suplimentar, prin prelucrarea statistică a procentelor de regăsire și calcularea abaterii standard relative.

Pe baza rezultatelor sintetizate în tabelele 3 și 4 s-a calculat procentul de regăsire (R%) și procentul de regăsire mediu (Rm %) precum și abaterea standard relativă (RSD).

Tabelul nr. 3. Rezultate privind acuratețea metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu

Tabelul nr. 4. Rezultate privind privind acuratețea metodei HPLC de dozare a metotrexatului

Se observă că atât pentru folinatul de calciu cât și pentru metotrexat valoarea procentului de regăsire (R %) este mai mare de 92%, iar valoarea RSD ≤ 2% demonstrează faptul că metoda de dozare este exactă.

Limita de cuantificare(LOQ)

Limita de cuantificare s-a determinat pe baza raportului semnal-zgomot ≥ 10 și corespunde unei concentrații de 0,585µg/ml (figura 18).

Figura 15. Cromatograma obținută la verificarea acurateței metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 16. Cromatograma obținută la verificarea acurateței metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 17. Cromatograma obținută la verificarea acurateței metodei HPLC de dozare a folinatului de calciu și a metotrexatului

Figura 18. Cromatograma obținută la determinarea limitei de cuantificare a folinatului de calciu și a metotrexatului prin metoda HPLC

IV. CONCLUZII

Scopul acestei lucrări a fost elaborarea unei metode analitice de dozare care să permită optimizarea monitorizării terapiei oncologice cu doze mari de metotrexat însoțită de “terapia de salvare” cu folinat de calciu.

Având în vedere faptul că timpul necesar determinării separate a metotrexatului, respectiv a folinatului de calciu este mai mare decât cel necesar determinării simultane a acestora ne-am propus să elaborăm dozare simultană a acestor compuși din plasmă umană.

Astfel am elaborat o metodă HPLC eficientă și rapidă pentru dozarea simultană a folinatului de calciu și a metotrexatului din plasma umană.

Metoda elaborată este selectivă, exactă, precisă (RSD ≤ 2%), și lineară (R² > 0,99) în domeniul de concentrații 1,17 – 37,5 µg/ml.

Metoda este sensibilă (0,585 µg/ml) permițând cuantificarea metotrexatului și folinatului de calciu din plasma umană.

V. BIBLIOGRAFIE