Biochimia. Celula Ca Element Anatomic Fiziologic Si Biochimic

INTRODUCERE

Biochimia studiaza natura chimica a materiei vii, compusii chimici produsi in procesul de viata, functiile si transformarile substantelor in sistemele biologice, schimburile chimice si energetice asociate cu aceste transformari.

Analiza chimica elementara arata ca organismele animale, inclusiv cel uman, se formeaza din elemente care se gasesc rasp=ndite in scoarta pam=ntului si respectiv in apa si aer.

Preluarea acestora din circuitul biologic este selectiva, unele dintre ele C, H, N, S, P concentr=ndu-se in corpul omului. Acestea, impreuna cu oxigenul reprezinta peste 97% din organism si sunt denumite bioelemente. Adaugarea a inca 5 elemente: Ca, K, Na, Cl, Mg, arata ca 11 elemente constituie peste 99,9% din organismul uman.

Prin analiza spectrala au fost identificate in corpul uman un numar de peste 60 elemente, majoritatea lor gasindu-se in cantitati foarte mici de unde si denumirea de oligoelemente.

Compararea rasp=ndirii elementelor din organisme cu situarea lor in tabelul lui Mendeleev releva ca, in ansamblu, elementele cu numar atomic 1-20 reprezinta 99%, iar cele cu numar atomic 21-42 restul de 1% din corpul uman, de unde concluzia ca pentru existenta materiei vii sunt de interes proprietatile legate de marimea atomului, importante fiind elementele mai simple, cu greutate atomica mica.

Diferenta intre materia nonvie si vie, si in cadrul acesteia intre plante si animale, consta in cantitatea si calitatea moleculelor compusilor anorganici (apa, saruri minerale), dar mai ales organici.

Dintre compusii organici, importanta maxima structurala si/sau energetica o au glucidele, lipidele, proteinele si acizii nucleici, numite si biomolecule (“moleculele vietii”) si compusii cu rol in reglarea proceselor biochimice, denumiti biocatalizatori (vitamine, enzime, hormoni).

Plantele verzi, autotrofe, sunt furnizori primari de glucide (prin fotosinteza, asimilare clorofiliana) si folosesc glucidele polimere (amidon, celuloza) in construirea peretilor celulari sau ca materiale de rezerva.

Animalele, heterotrofe, necesita consumarea unei alimentatii echilibrata in proteine, glucide, lipide, vitamine, apa, saruri anorganice si oligoelemente.

In general, glucidele si lipidele simple servesc ca sursa de energie; lipidele complexe in structurarea membranelor celulare si particulelor subcelulare.

Dintre biomacromolecule (biopolimeri), proteinele sunt suportul structurii, functiilor si specificitatii, iar acizii nucleici sunt purtatori ai informatiei biologice.

Apa si sarurile minerale reprezinta mediul reactiilor biologice, iar oligoelementele sunt efectori ai acestor reactii.

Cea mai insemnata caracteristica a materiei vii este structura organizata si gradul de complexitate care creste odata cu dezvoltarea in scara animala, de la o specie la alta, de la un tesut la altul, de la o celula la alta.

CAPITOLUL I

CELULA – ELEMENT ANATOMIC, FIZIOLOGIC SI BIOCHIMIC

Celula este elementul anatomic, fiziologic, biochimic si genetic al tuturor organelor. Marimea si forma celulelor difera mult dupa regn, specie, organ (tesut), functie, mediu ambiant, compozitia si continutul citoplasmatic, regim alimentar, v=rsta, factori ecologici, modul de prelucrare.

Componentele structurale ale celulei sunt: citoplasma, nucleu, mitocondrie, reticul endoplasmatic, ribozomi, aparat Golgi, lizozomi, peroxizomi, microtubi, microfilamente, membrane.

Nucleul reprezinta, in general, o treime din masa celulei, de forma diferita, contin=nd unul sau mai multi nucleoli cu ARN si filamente cu cromatina alcatuite din ADN si proteine bazice – histone si nehistonice. In cursul diviziunii celulare, cromatina se organizeaza in structuri denumite cromozomi, responsabile de transferul caracterelor ereditare celulelor fiice.

Nucleul este sediul sintezei de acizi nucleici si este inconjurat de o dubla membrana.

Citoplasma (citozolul) are o anumita plasticitate, cu structura de gel si unde sunt amplasate organitele celulare. Fiecare organit celular indeplineste un rol bine definit c=nd se integreaza in viata celulei.

Mitocondria este o formatiune intracelulara bine individualizata microscopic, de forme si marimi diferite (in general elipsoidala). Are o dubla membrana: externa si interna, separate intre ele printr-un spatiu electronomicroscopic clar, denumit spatiu intermembranar. Membrana interna formeaza catre interiorul organitului pliuri (criste) care-i maresc suprafata interna.

Partea interna a mitocondriei se numeste matrice.

Membrana externa contine diferite enzime: MAO (monoaminoxida), acil-gras tiokinaza.

Membrana interna cu cristele, contine enzimele lantului respirator cuplat cu sinteza de ATP.

Matricea contine enzimele ciclului Krebs, oxidarii acizilor grasi, ribozomi, ADN, ARN.

Mitocondria este sediul a patru procese metabolice importante:

respiratia celulara (lantul respirator) principala producatoare de energie celulara;

sinteza de ATP din ADP si Pa in prezenta unor enzime localizate in particule legate de membrana interna;

ciclul Krebs ale carui enzime sunt localizate in matricea mitocondriala;

oxidarea acizilor grasi in prezenta unor enzime localizate de asemenea tot in matricea mitocondriala.

Membrana interna cuprinde sisteme enzimatice de concentrare a ionilor de Ca2.

In mitocondriile unor organe au loc procese metabolice specifice ca: ureogeneza, sinteza de porfirine.

Reticulul endoplasmatic este un sistem canalicular care apare ca prelungire a membranei nucleare in citozol, cuprinde intreaga celula si se prezinta sub forma de saci turtiti, vezicule, cisterne.

Prin cest sistem circulator vehiculeaza substante nutritive si O2, iar in cazul fibrelor musculare striate ar folosi la transmiterea excitatiei.

Se disting doua tipuri de reticul endoplasmatic: neted si rugos. Aspectul particular al celui rugos se datoreaza prezentei a numeroase particule mari numite ribozomi.

Reticulul endoplasmatic este format din proteine.

Microzomii contin fragmente de reticul endoplasmatic si ribozomi, fiind dotati cu un echipamant enzimatic in care sunt incluse si enzimele de metabolizare ale medicamentelor.

Ribozomii sunt alcatuiti din proteine si ARN si sunt locul de sinteza a proteinelor. Sunt mai abundenti in celulele hepatice, pancreatice, bacteriene.

Aparatul Golgi este prezent in toate celulele si are rol in prelucrarea finala a proteinelor sintetizate pe reticulul endoplasmatic.

Lizozomii sunt organite de forme si marimi variate, situati pericapilar sau la periferia citoplasmei. Sunt abundenti in ficat, rinichi si globule albe. Ei reprezinta sediul digestiei celulare datorita continutului lor in hidrolaze acide (enzime proteolitice, nucleaze, enzime care hidrolizeaza mucopolizaharidele, sfingolipidele).

Lizozomii sunt considerati “saci de sinucidere ai celulei”.

Peroxizomii sunt particule mai mici dec=t mitocondria si contin enzime oxidative (urat-oxidaza, izocitrat-dehidrogenaza, D-amino-oxidaza, enzime de peroxidare a acizilor grasi) prin actiunea carora se produce H2O2. Matricea lor contine catalaza cu rol in degradarea peroxidului de hidrogen, nociv pentru celula.

Microtubii de forma cilindrica se formeaza prin autoasamblarea unui mare numar de molecule proteice de doua tipuri: tubuline si.

Tubulinele se grupeaza sub forma de microtubi in prezenta de Ca2. Microtubii contribuie la deplasarea cromozomilor in celula in timpul mitozei si meiozei, la motilitatea cililor, flagelilor, la transportul intracelular a secretiei de hormoni.

Microtubii contribuie la formarea citoscheletului. Autoasamblarea tubulinelor este impiedicata de colchicina si vinblastina.

Microfilamentele sunt structuri filamentoase care alcatuiesc citoscheletul. Sunt formate din proteine contractile, in mod deosebit actina. Au rol in cresterea, miscarea celulelor, morfogeneza.

Microfilamentele pot fi dezorganizate de citochalasina B, un compus vegetal.

Membranele celulare reprezinta primul organit celular diferentiat. At=t membranele plasmatice ale diferitelor tipuri celulare, c=t si membranele intracelulare de la nivelul celulelor eucariote, sunt alcatuite din aceleasi tipuri fundamentale de molecule:

Lipide, const=nd in esenta din fosfolipide, sfingolipide si colesterol. Acestea sunt alcatuite dintr-o parte hidrofoba (-CH2-) si alta hidrofila (-OH, fosfat). Membrana cuprinde un dublu strat lipidic cu partea hidrofoba orientata in interior.

Proteine (foarte heterogene): unele integrale travers=nd membrana dintr-o parte in alta, orientate cu partea hidrofoba la exterior si asociate cu partea hidrofoba a lipidelor; altele periferice localizate pe partea externa sau interna a membranei.

Glucidele, care reprezinta aproximativ 10% din ansamblul constituentilor membranari, cu structuri foarte variate, complexe si ramificate. Sunt localizate pe partea externa a membranei, combinate de cele mai multe ori cu proteine sau cu lipide alcatuind glicocalixul. Glucidele au un rol important in relatiile intracelulare, in procesul de recunoastere a unor molecule (lectine, toxine), particule virale, bacteriene.

Membranele biologice sunt asimetrice.

Asimetria lipidelor este partiala, iar a proteinelor si glucidelor este totala.

Membranele celulare prezinta o mare fluiditate laterala astfel inc=t localizarea unor constituenti poate varia in timp.

Se disting mai multe categorii de membrane celulare:

1. Membrana citoplasmatica (plasmalema, membrana plasmatica) de circa 60-100 A grosime separa continutul celulei de mediul inconjurator, impiedic=nd amestecarea citoplasmei cu acest mediu. In acelasi timp, membrana citoplasmatica permite trecerea selectiva a metabolitilor de la exterior spre interior, precum si invers, din celula spre exterior.

La plante si uneori la bacterii, plasmalena este dublata de o a doua bariera, care este peretele celular.

2. Membranele organitelor celulare, care sunt mai subtiri de circa 60 A si care includ:

membrana dubla a mitocondriilor;

membrana lizozomilor – a carei integritate asigura mentinerea enzimelor lizozomale in stare inactiva, “latenta”;

reticulul endoplasmatic – reprezent=nd o retea de canale ce traverseaza intreaga celula si se compune din reticul neted si rugos (cu ribozomii atasati);

aparatul Golgi compus din vezicule si cisterne ce se afla in relatie de continuitate cu reticulul endoplasmic. Membranele reticulului endoplasmic formeaza vezicule numite microzomi;

membrana nucleului este dubla si prevazuta cu pori.

3. Membranele speciale: teaca de mielina, discurile segmentului extern al celulelor cu bastonase din retina.

Functiile membranelor celulare sunt indispensabile pentru viata:

– membranele mentin individualitatea celulei, fiind bariere cu permeabilitate selectiva prin care se fac schimburile intre celule si mediul inconjurator si

– intervin efectiv in desfasurarea proceselor metabolice.

Interactiunile lipido-proteice in membrane sunt esentiale pentru functia enzimelor de membrana.

Doua din procesele majore de conversie a energiei in natura se petrec in membrane:

– fotosinteza care are loc in membrana interna a cloroplastelor, prin care energia solara este convertita in energie chimica si

– fosforilarea oxidativa, proces prin care energia rezultata din oxidarea alimentelor este convertita in ATP si care are loc in membrana interna mitocondriala.

Membranele controleaza fluxul de informatii intre celule si mediul inconjurator (contin receptori specifici pentru stimulii externi, miscarea bacteriilor spre hrana, perceptia luminii, raspunsul celulelor la legarea hormonilor de membrana).

Membranele au proprietatea de a se modifica functional adaptativ si au rol in procesele imunitare si de aparare ale celulelor si organismului.

Compozitia membranelor biologice consta in proteine, lipide, glucide, ioni si apa, in proportii variabile.

Se pot considera trei tipuri de membrane dupa compozitia lor:

Cea mai simpla membrana este mielina – constituita din lipide in calitate de component major si foarte putine proteine.

A doua categorie sunt membranocondriilor;

membrana lizozomilor – a carei integritate asigura mentinerea enzimelor lizozomale in stare inactiva, “latenta”;

reticulul endoplasmatic – reprezent=nd o retea de canale ce traverseaza intreaga celula si se compune din reticul neted si rugos (cu ribozomii atasati);

aparatul Golgi compus din vezicule si cisterne ce se afla in relatie de continuitate cu reticulul endoplasmic. Membranele reticulului endoplasmic formeaza vezicule numite microzomi;

membrana nucleului este dubla si prevazuta cu pori.

3. Membranele speciale: teaca de mielina, discurile segmentului extern al celulelor cu bastonase din retina.

Functiile membranelor celulare sunt indispensabile pentru viata:

– membranele mentin individualitatea celulei, fiind bariere cu permeabilitate selectiva prin care se fac schimburile intre celule si mediul inconjurator si

– intervin efectiv in desfasurarea proceselor metabolice.

Interactiunile lipido-proteice in membrane sunt esentiale pentru functia enzimelor de membrana.

Doua din procesele majore de conversie a energiei in natura se petrec in membrane:

– fotosinteza care are loc in membrana interna a cloroplastelor, prin care energia solara este convertita in energie chimica si

– fosforilarea oxidativa, proces prin care energia rezultata din oxidarea alimentelor este convertita in ATP si care are loc in membrana interna mitocondriala.

Membranele controleaza fluxul de informatii intre celule si mediul inconjurator (contin receptori specifici pentru stimulii externi, miscarea bacteriilor spre hrana, perceptia luminii, raspunsul celulelor la legarea hormonilor de membrana).

Membranele au proprietatea de a se modifica functional adaptativ si au rol in procesele imunitare si de aparare ale celulelor si organismului.

Compozitia membranelor biologice consta in proteine, lipide, glucide, ioni si apa, in proportii variabile.

Se pot considera trei tipuri de membrane dupa compozitia lor:

Cea mai simpla membrana este mielina – constituita din lipide in calitate de component major si foarte putine proteine.

A doua categorie sunt membranele citoplasmatice cu un continut de 50% proteine din masa membranei.

Al treilea grup il constituie membranele citoplasmatice ale bacteriilor si membrana interna a mitocondriilor ( cu functia de fosforilare oxidativa si sinteza de acizi nucleici) care contin o cantitate mai mare de proteine (75% din masa membranei).

CAPITOLUL II

LIPIDELE

Lipidele din membranele celulare constau din: fosfolipide, glicolipide si colesterol. Toate lipidele au ca singur element comun acizii grasi.

Acizii grasi sunt componenti fundamentali ai multor categorii de lipide.

Cei mai rasp=nditi si mai abundenti sunt acizii grasi monocarboxilici alifatici, cu catena normala saturata sau nesaturata si numar pereche de atomi de carbon (de la 4 la 26 atomi de carbon).

Acizii grasi saturati pot fi redati prin formula generala CH3-(CH2)n-COOH, unde n este cuprins intre 2 si 28.

Acizii grasi saturati cei mai rasp=nditi in grasimile animale sunt:

Acidul butiric : CH3-(CH2)2-COOH

Acidul capronic : CH3-(CH2)4-COOH

Acidul caprilic : CH3-(CH2)6-COOH

Acidul caprinic : CH3-(CH2)8-COOH

Acidul lauric : CH3-(CH2)10-COOH

Acidul miristic : CH3-(CH2)12-COOH

Acidul palmitic : CH3-(CH2)14-COOH

Acidul stearic : CH3-(CH2)16-COOH

Acidul arahidic : CH3-(CH2)18-COOH

Acidul behenic : CH3-(CH2)20-COOH

Acidul lignoceric: CH3-(CH2)22-COOH

In lipidele de origine vegetala predomina acidul palmitic. La animalele cu s=nge rece predomina acidul palmitic urmat de acidul miristic, iar in lipidele animalelor cu s=nge cald (inclusiv la om) predomina acidul palmitic urmat de acidul stearic si in cantitati mici de acidul miristic.

Acizii grasi saturati cu catena ramificata mai rasp=nditi sunt:

acidul izobutiric: ,acidul izovalerianic:

Acizii grasi nesaturati cuprind una sau mai multe legaturi etilenice. Acesti acizi sunt caracterizati prin lungimea catenei hidrocarbonate (Cn) si prin pozitia dublei (sau a dublelor) legaturi, care este specificata prin numarul atomului de carbon de la care se porneste (Cn : m). Numaratoarea se face incep=nd cu gruparea carboxil: carbonul vecin sau C, C, …….. p=na la ultimul –CH3 care se noteaza cu C sau Cn.

Conventional, numarul si pozitia dublelor legaturi se indica astfel: acidul oleic, de exemplu (care contine 18 atomi de C si o singura dubla legatura intre C9 si C10) se reprezinta prin C18:9.

acidul palmitoleic: C16:9.

acidul linoleic: C18:9,12.

acidul linolenic: C18:9,12,15.

acidul arahidonic: C20:5,8,11,14.

Dupa gradul de nesaturare acizii grasi se subimpart in:

acizi grasi mononesaturati (monoetenoici sau monoenoici):exemplu este acidul palmit-oleic;

acizi grasi polinesaturati (polietenoici sau polienoici);

acizi eicosanoici (cu 20 atomi de carbon) care deriva din acizii grasi eicosapolienoici si care cuprind prostanoide si leucotriene. Prostanoidele includ prostaglandine (PG), prostacicline si tromboxani (Tx). Termenul de prostaglandine se utilizeaza de obicei pentru toate aceste substante;

acizi grasi cu functii secundare care apar ca intermediari -hidroxilati si -cetonici. Acestia fiind legati in complexele multienzimatice nu se gasesc in general in stare libera si nici in compozitia lipidelor naturale;

acizii alil-ciclici contin in molecula lor o parte ciclica si o catena laterala:

n10 in acidul hidnocarpic;

n12 in acidul chaulmogric.

Acestia au fost izolati din plantele tropicale si folositi in tratamentul leprei.

acizii grasi esentiali.

Organismul uman are nevoie de unii acizi grasi pe care nu ii poate sintetiza sau pe care ii produce in cantitati insuficiente. Din aceasta categorie fac parte acizii linoleic, linolenic, arahidonic.

Rolul acizilor grasi esentiali este in special structural, fac=nd parte din alcatuirea fosfolipidelor celulare, mai ales mitocondriale.

Proprietatile acizilor grasi

Acizii grasi inferiori p=na la C8 sunt lichizi, ceilalti sunt solizi.

Acizii grasi nesaturati sunt lichizi si prezinta izomerie cis-trans. Formele naturale ale acestor acizi sunt totdeauna izomerii cis.

Acizii grasi sunt pusin solubili in apa, solubilitatea scaz=nd odata cu lungimea catenei hidrocarbonate.

Din punct de vedere chimic acizii grasi prezinta reactiile gruparii carboxil: formeaza saruri cu metalele si cu hidroxizii alcalini numite sapunuri, cu proprietati tensioactive; formeaza esteri cu alcoolii, amide (sfingolipide).

Acizii grasi nesaturati aditioneaza hidrogen, halogeni si sufera procesul de peroxidare.

Peroxidarea este un proces radicalic care necesita un initiator X ce extrage un atom de hidrogen de la gruparea metilenica din pozitia alilica cu formarea unui radical liber care se izomerizeaza:

In prezenta O2 se formeaza un peroxid:

Acesta ataca alte catene nesaturate intretin=nd reactia de peroxidare in lant.

Alcoolii din structura lipidelor pot fi:

a. monohidroxilici: alcool cetilic: CH3-(CH2)14-CH2OH corespunzator acidului palmitic; alcool stearilic: CH3-(CH2)16-CH2OH corespunzator acidului stearic.

b. polihidroxilici, dintre care cel mai important este propantriolul sau glicerina:

Importanta din punct de vedere biochimic o au produsii de oxidare ai glicerolului:

Gruparile hidroxil, -OH din glicerol pot fi esterificate:

cu acidul fosforic se formeaza acidul glicerofosforic:

si cu acizi grasi saturati ori nesaturati form=nd trigliceride:

Aminoalcoolii sunt componente ale glicerofosfolipidelor dintre care cei mai importanti sunt:

Un amino-alcool superior nesaturat este sfingozina, care intra in structura lipidelor complexe, av=nd structura:

Alcoolii ciclici sunt reprezentati de inozitol (un hexahidroxialcool) av=nd structura:

Sterolii se gasesc in asociere cu lipidele. Sunt derivati de la fenantren (ciclurile A, B, C), la care este atasat un nucleu de ciclopentan (D) fiind un inel de ciclopentano-perhidro-fenantren.

Cel mai important dintre steroli este colesterolul ce contine o grupare –OH de alcool secundar la C3 din ciclul A, o dubla legatura intre C5-C6 din ciclul B si o catena laterala legata la C17.

Colesterolul se gaseste in grasimile animale si este precursorul hormonilor steroizi, acizilor biliari, vitaminei D.

Grasimile neutre (triacilglicerolii sau trigliceridele) sunt componentele principale ale grasimilor de rezerva din tesuturi si ale grasimilor din lapte. In cantitati foarte mici si in proportii bine determinate se afla alaturi de alte categorii de lipide in structurile celulare.

Grasimile neutre sunt esteri ai glicerinei cu acizii grasi.

Dupa numarul gruparilor esterificate, pot fi: monogliceride (monoacilgliceroli), digliceride (diacilgliceroli), trigliceride (triacilgliceroli).

Triacilglicerolii pot fi simpli sau micsti. In cazul c=nd un singur fel de acid esterifica cele trei grupari hidroxil ai glicerolului se numesc simple (de exemplu: tristearil-glicerol, tripalmitil-glicerol, trioleil-glicerol).

Triacilglicerolii micsti contin doi sau mai multi acizi grasi diferiti.

Grasimile naturale sunt compuse aproape exclusiv din trigliceride. Mono- si digliceridele sunt intermediari in degradarea si sinteza trigliceridelor si se gasesc doar in cantitati mici in tesuturi. Se formeaza in cursul digestiei grasimilor.

Starea de agregare a trigliceridelor depinde de compozitia lor in acizi grasi: cele bogate in acizi grasi saturati inferiori sau nesaturati sunt lichide. Cu c=t continutul de acizi grasi saturati superiori este mai mare cu at=t punctul de topire al unei trigliceride este mai ridicat. Grasimile naturale sunt amestecuri de diverse trigliceride si nu pot fi caracterizate prin constante fizice nete. La incalzire ele se inmoaie treptat p=na la topire. Trigliceridele au densitati mai mici dec=t apa, sunt insolubile in apa av=nd un caracter aproape perfect nepolar. Puse pe suprafata apei se intind dar nu pot interactiona cu apa.

Trigliceridele care cuprind trei resturi acil diferite, au un atom de C asimetric (C2 din glicerol) si vor putea exista sub forma a doi enantiomeri.

Substantele naturale au toate aceeasi configuratie, care este redata cu ajutorul formulei:

Trigliceridele pot fi degradate prin hidroliza enzimatica la acizi grasi si la glicerol:

In organismele vii, hidroliza trigliceridelor este catalizata de esteraze, denumite lipaze sau triglicerid-lipaze.

Grasimile naturale aditioneaza la dublele legaturi hidrogen, halogeni, sau prin expunere la lumina si aer sufera un proces de autooxidare in urma carora se formeaza peroxizi.

Fosfolipidele (glicerofosfolipidele)

Sunt lipide complexe, componenti ai tuturor formatiunilor membranare celulare. Substanta de baza a acestor lipide este acidul fosfatidic rezultat prin esterificarea glicerolului cu doua molecule de acid gras si o molecula de acid fosforic:

Acizii fosfatidici sunt intermediari ai sintezei si degradarii fosfatidelor.

Fosfatidele cuprind un rest fosfatidil legat la diversi compusi cu functie alcoolica: colina, etanolamina, serina, inozitol.

Fosfatidil inozitolii (inozitol-fosfatidele) contin alcoolul ciclic mesoinozitol (mioinozitol) care este unul din cei noua stereoizomeri pe care ii prezinta hexahidroxiciclohexanul:

Fosfatidil mioinozitol

Substanta nervoasa alba si fibrele de mielina cuprind cantitati mult mai mari de fosfatidil-inozitol dec=t substanta cenusie.

Aceste lipide participa la transportul cationilor prin membrane, proces fundamental pentru functia nervoasa. Sub actiunea fosfolipazei C elibereaza diacilglicerol si inozitol fosfati, acestia constituind efectori ai unor mesageri extracelulari.

Fosfatidil-glicerolii sunt fosfolipide fara azot si cuprind unul sau doua resturi de acid fosfatidic legate la glicerol. Difosfatidilglicerolul sau cardiolipina este fosfolipidul cel mai abundent din mitocondrii si a fost izolat din muschiul cardiac:

Plasmalogenele (acetil-fosfatidele) se afla in toate tesuturile dar sunt mai abundente in muschi si in membranele celulelor nervoase. Se deosebesc de celelalte fosfatide prin aceea ca la C1 in locul unui acid gras (R-CH2-COOH) legat esteric, cuprind un enol superior:

Fosfatidil colinele (lecitinele) cuprind un rest fosfatidil legat de colina.

In molecula unei lecitine exista o functie acida (restul fosforil) si o functie bazica (baza cuaternara de amoniu) care se neutralizeaza reciproc, fapt ce confera lecitinelor caracterul de ion bipolar si proprietati tensioactive puternice.

Lecitinele reprezinta categoria de lipide complexe cu rasp=ndirea cea mai larga, ele sunt reprezentate in toate membranele biologice si in cantitatile cele mai mari. In proportie de 80-90% intra in compozitia surfactantului pulmonar, material ce acopera alveolele pulmonare si impiedica colapsul la expirare.

Fosfatidiletanolaminele (cefalinele) sunt fosfatide ce cuprind restul fosfatidil legat de etanolamina:

Cefalinele se gasesc in tesuturi alaturi de lecitine dar in cantitati mult mai mici. Sunt mai abundente in lipidele din tesutul nervos.

Fosfatidil serinele (serincefalinele) contin un rest de serina legat de radicalul fosfatidil. Fosfatidil serinele insotesc celelalte fosfatide:

Fosfolipidele sunt hidrolizate de fosfolipaze, enzime specifice, cu importanta in determinarea structurii fosfogliceridelor. Aceste fosfolipaze sunt: A1, A2, C, D.

Fosfolipaza A1 indeparteaza acizii grasi din pozitia 1 si fosfolipaza A2 din pozitia 2.

Prin indepartarea acizilor din structura fosfogliceridelor se formeaza lizofosfogliceride care sunt toxice si produc leziuni ale membranelor.

Fosfolipaza C a fost gasita in bacteria gangrenei gazoase si hidrolizeaza legatura dintre acidul fosforic si glicerol, iar fosfolipaza D (din plante) indeparteaza colina sau colamina pentru a forma acidul fosfatidic.

Sfingolipidele sunt lipide care nu contin glicerol. In locul glicerolului se afla sfingozina sau derivatul sau hidrogenat, dihidrosfingozina:

In sfingolipide acidul gras este legat amidic la gruparea –NH2 a sfingozinei pentru a forma un ceramid:

Sfingolipidele se impart in sfingofosfolipide (sfingomieline) si sfingolipide fara fosfor dar care cuprind o componenta glucidica, numite sfingoglicolipide.

Sfingomielinele se gasesc in toate tesuturile animale dar sunt deosebit de abundente in substanta nervoasa alba si nervii periferici.

Au in structura sfingozina legata la un acid gras cu 24 atomi de carbon, in care gruparea alcoolica primara este legata la fosforilcolina:

Proprietatile sfingomielinelor sunt asemanatoare cu ale fosfolipidelor, sunt amfioni, au caracter amfipatic.

Glicosfingolipidele au in structura un ceramid legat glicozidic de monozaharide (hexoze) sau oligozaharide. Se impart in cerebrozide, glicolipide neutre si gangliozide, glicolipide acide.

Cerebrozidele se gasesc in majoritatea tesuturilor dar sunt mai abundente in creier (substanta alba), in nervi. Sunt alcatuite dintr-un ceramid (un acid gras cu 24 atomi de C, legat la beta-galactoza (galactocerebrozid) sau mai rar la beta-glucoza (glucocerebrozid).

Cerebrozidele nu au sarcini electrice; au caracter amfipatic. In creier, galactocerebrozidele mai cuprin si resturi sulfat legate esteric de galactoza form=nd lipide polare numite sulfatide.

Structura unei sulfatide:

Gangliozidele sunt glicolipide prezente in cantitati mici in toate tesuturile, dar sunt mai abundente in creier si nervi. Cuprind un ceramid (in care acidul gras este acidul stearic) legat de un oligozaharid alcatuit din glucoza, galactoza, N-acetil-galactozamina.

Oligozaharidul este legat la r=ndul lui de unul, doua sau trei resturi de acid sialic (acid acetil-neuraminic).

Gangliozidele se clasifica si se citesc dupa numarul resturilor de acid sialic, in monosialo-gangliozide (GM), disialo-gangliozide (GD) si trisialo-gangliozide (GT).

Natura oligozaharidului este desemnata printr-un indice numeric, 5-n, in care n arata numarul de unitati hexozil.

De exemplu, gangliozidul GM1 are structura simplificata:

Componenta glucidica a gangliozidelor se gaseste totdeauna pe fata externa a membranelor, aceste lipide fiind implicate in procesele de pe suprafata a membranelor.

Desi structurile lipidelor sunt asa de diferite, acestea au o proprietate comuna: sunt molecule amfifile (amfipatice) av=nd o parte hidrofila si una hidrofoba.

Partea hidrofila este gruparea polara in fosfolipide, resturile glucidice in glicolipide si gruparea –OH la C3 in colesterol.

Partea hidrofoba o constituie lanturile de acizi grasi in fosfolipide, lantul de acid gras si lantul hidrocarbonat al sfingozinei in sfingomielina si glicolipide si toata molecula, cu exceptia gruparii –OH, in colesterol.

O consecinta a tructurii amfipatice este aranjamentul in mediu apos sub forma de micelii sau de foita compusa dintr-un strat dublu lipidic.

Formarea stratului dublu lipidic este un proces rapid si spontan de autoasamblare. Autoasamblarea fosfolipidelor in stratul dublu este dependenta de conformatia moleculei. Din motive sterice, fosfolipidele saturate au o asamblare mai compacta dec=t cele nesaturate care, din cauza conformatiei cis a legaturilor duble din lanturile acizilor grasi nesaturati, realizeaza straturi duble mai laxe dec=t fosfolipidele saturate.

Caracterul amfifil al fosfolipidelor sta la baza obtinerii de lipozomi. Realizarea lipozomilor a adus un aport important pentru biologie si medicina permit=nd studiul permeabilitatii membranelor, utilizarea lor ca transportori de substante biologic-active si terapia de substitutie a mucopolizaharidozelor tip tezaurismoze lizozomale, precum si in studiile metabolice.

Fosfolipidele s-au dovedit a fi necesare si pentru activitatea unor enzime precum -hidroxibutirat dehidrogenaza, glucozo-6-fosfataza, NADH-citocrom c- reductaza etc.

CAPITOLUL III

PROTEINELE DE MEMBRAN|

Proteinele de membrana sunt la fel de diverse ca si proteinele plasmatice sau citoplasmatice. Acestea se clasifica in:

a. proteine extrinseci sau periferice care sunt slab atasate de suprafata membranei si pot fi usor indepartate in stare solubila prin extractii bl=nde;

b. proteine intrinseci sau integrale care reprezinta mai mult de 70% din totalul proteinelor de membrana, – sunt foarte str=ns legate de partea lipidica si sunt indepartate doar prin procese drastice.

Proteinele intriseci pot fi extrase cu detergenti precum dodecilsulfat de sodiu sau cu guanidin clorhidrat 6M.

Prin extractie cu guanidin clorhidrat 6M s-a extras din membrana eritrocitara glicoforina – o glicoproteina care traverseaza complet membrana.

Membrana mitocondriala interna, cea mai complexa, contine peste 100 de feluri diferite de lanturi polipeptidice.

Proteinele sunt formate din unitati de aminoacizi, legati prin legaturi peptidice.

Aminoacizii sunt unitati structurale de baza care prin legatura peptidica realizata intre gruparea aminica a unei molecule si gruparea carboxil a altei molecule formeaza macromolecule proteice. Se cunosc aproximativ 300 aminoacizi dintre care doar 20 sunt proteinogeni, specificati prin codul genetic, prezenti in toate organismele vii, de la cele mai simple p=na la om.

Aminoacizii naturali se reprezinta prin formula generala:

sunt alfa aminoacizi.

Face exceptie prolina care are o functie aminica secundara, fiind un iminoacid:

Aminoacizii se clasifica dupa natura lui R care poate fi o catena hidrocarbonata: alifatica, aromatica, un heterociclu sau poate sa contina si alte functii aditionale.

Simbolic aminoacizii sunt denumiti si reprezentati de un grup de 3 litere sau de o singura litera:

Pe l=nga cei 20 de alfa aminoacizi care intra curent in constitutia proteinelor se mai gasesc si altii care se afla in cantitate mica numai in anumite tipuri de proteine specializate prin functiile pe care le indeplinesc. Astfel 4-hidroxi prolina si 5-hidroxi prolina intra in structura proteinei fibrilare – colagen, iar N-metil-lizina se gaseste in miozina, proteina importanta din muschi.

Unii aminoacizi neproteinogeni sunt importanti precursori sau intermediari in metabolism.

Astfel:

Aminoacizii se mai clasifica in: aminoacizi esentiali sau nutritionali, indispensabili, adusi prin aport exogen si care nu pot fi sintetizati de organism si aminoacizi neesentiali sintetizati de organism.

Din cei 20 de aminoacizi naturali, 8 sunt esentiali: treonina, metionina, izoleucina, leucina, valina, lizina, fenilalanina, triptofanul. Histidina si arginina sunt partial esentiali.

Aminoacizii neesentiali sintetizati in organism sunt: glicina, alanina, serina, acidul aspartic, acidul glutamic, cistina, prolina, citrulina.

Peptidele sunt substante formate din mai multe molecule de aminoacizi. In functie de numarul acestora, peptidele se impart in: dipeptide, oligopeptide – cu numar mic de aminoacizi (3-8 aminoacizi) si polipeptide, cu un numar mare de aminoacizi.

Peptidele se formeaza din mai multe molecule de aminoacizi prin legaturi peptidice –CO-NH-.

Polipeptidele sunt lanturi mari contin=nd un numar insemnat de legaturi peptidice si resturi de aminoacizi p=na la 100.

Exemple de peptide:

Carnozina este un dipeptid prezent in muschi. Este format din histidina si beta-alanina:

Are actiune hipertensiva si sub forma de carnozin fosfat intervine in procesul de contractie musculara.

Un alt dipeptid este anserina (beta alanil N3-metil histidina).

Este prezenta in muschii pasarilor.

Aceste dipeptide sunt considerate atipice pentru ca nu sunt formate numai din alfa aminoacizi, fiecare cuprinde un alfa aminoacid si un beta aminoacid.

Dintre tripeptidele atipice, glutationul este un constituent universal al sistemelor biologice absolut necesar dezvoltarii si supravietuirii celulei. Participa la sistemul celular redox si este donor de grupari gama-glutamil. Rolul fiziologic de baza este functia sa de sistem redox (prin trecerea din forma sulfhidril –SH in forma disulfurica (-S-S-) cu participarea glutation reductazei).

glutation redus (gama glutamil cisteinil glicina)

glutation oxidat (G-S-S-G)

Peptidele de origine animala si bacteriana prezinta grade diferite de condensare, iar dupa rolul biologic pot fi grupate in: hormoni propriu-zisi – secretati de glandele cu secretie interna (hipotalamus, hipofiza, pancreas etc.), hormoni tisulari (angiotensina), hormoni digestivi (secretina, gastrina).

Peptidele de origine bacteriana manifesta actiuni de antibiotice si sunt folosite in chimioterapie (colamina, triptofan, leucina, valina).

Polipeptidele existente la microorganisme (sau obtinute prin sinteza chimica) numite si ionofori, au proprietatea de a creste selectiv permeabilitatea pentru ioni.

Ionoforii, din punct de vedere structural, sunt peptide ciclice (valinomicina) sau liniare (gramicidina).

In functie de mecanismul prin care creste permeabilitatea stratului bilipidic al membranei, se disting doua categorii de ionofori: transportori ionici mobili sau carausi care preiau ionul de pe o parte a membranei difuz=nd in stratul bilipidic si elibereaza apoi ionul la nivelul fetei opuse a membranei (K, Ca2, Mg2) si ionofori care formeaza canale si care se dispun in stratul lipidic pentru a forma pori transmembranari ce permit trecerea selectiva a cationilor monovalenti in sensul gradientilor electrochimici (exemplu tipic gramicidina, filipina, nistatina, amfotericina B).

Proteinele sunt compusi macromoleculari de natura polipeptidica, ce detin functii fundamentale specifice organismelor vii.

Au rol structural, impreuna cu alte substante (lipide, glucide, acizi nucleici) formeaza materialul din care se construiesc membranele celulare, organitele celulare ( nucleul celular, mitocondrie, ribozomi).

Rol in activitatea contractila si locomotorie (actina si miozina din muschi).

Rol catalitic – proteinele intra in structura unor factori biologic activi (enzime, hormoni proteici).

Rol de transport si de depozitare a unor compusi chimici precum: ioni metalici, vitamine, oxigen, dioxid de carbon, (transferina, hemoglobina, serumalbumina, citocromi.

Rol de aparare a organismului impotriva infectiilor – intra in structura anticorpilor, imunoglobulinelor, complementului, interferonului.

Rol in coagularea s=ngelui (fibrinogenul etc.).

Prin proprietatile fizico-chimice intervin in reglarea schimburilor hidrice dintre capilare – interstitiu-celule, precum si in mentinerea echilibrului acido-bazic.

Rol in procesul de crestere si reparatie celulara.

Proteinele intervin astfel in majoritatea proceselor fiziologice fundamentale.

Structura proteinelor

Macromolecula proteica este formata dintr-un numar mare de aminoacizi uniti prin legaturi covalente. Legatura peptidica se poate realiza intre gruparea –COOH a unui aminoacid si –NH2 a altui aminoacid; mai multe asemenea legaturi, intre mai multi aminoacizi, formeaza lanturile polipeptidice:

Ca urmare a combinarii in mai multe moduri a aminoacizilor apare o mare varietate de proteine, care se diferentiaza intre ele prin modul de organizare, de asezare a lanturilor polipeptidice. Organizarea spatiala este dependenta si de radicalul R care contine grupari –NH2, -COOH, -OH sau –SH.

Proteinele au in molecula lor catene de dimensiuni mari, cu structuri interne diferite care pot adopta in spatiu diverse orientari, sau pot interactiona intre ele. Au mai multe nivele de organizare numite structuri: primara, secundara, tertiara si cuaternara.

Structura primara se refera la legatura covalenta a lantului peptidic si la secventa si natura resturilor aminoacizilor in lant.

Structura primara se mai numeste si secventa aminoacizilor. Legatura peptidica a fost studiata prin metoda difractiei cu raze X in cristalele de peptide sintetice, constat=ndu-se valoarea distantelor interatomice intr-o catena si unghiurile dintre atomii componenti ai secventei respective. Perioada de identitate intre resturile de aminoacizi a fost gasita de 7,27 A iar distanta interatomica C-N (din legatura peptidica) este mai mica dec=t in mod normal. Aceasta legatura nu este flexibila ca legatura simpla, ci este rigida, av=nd caracter partial de dubla legatura. In jurul legaturii simple, ce incadreaza legatura peptidica, se produc rotatii care vor imprima anumite conformatii lanturilor polipeptidice.

In catena polipeptidica scheletul este alcatuit din atomi de C carbonilici, atomi de N iminici si atomi de C din pozitia alfa a aminoacidului, form=nd catenele in zig-zag.

Atomii legaturii peptidice sunt coplanari, iar resturile aminoacizilor R1, R2, R3 alterneaza de o parte si de alta a planului legaturii peptidice:

Determinarea structurii primare poate fi facuta sub doua aspecte: identificarea calitativa si estimarea cantitativa a resturilor de aminoacid prezente precum si determinarea secventei.

Numarul lanturilor polipeptidice se stabileste prin determinarea numarului aminoacizilor N-terminali sau C-terminali, oentru ca fiecare catena are la una din extremitati o grupare alfa-amino libera, iar la cealalta o grupare alfa-carboxilica libera. S-a convenit ca aminoacidul N-terminal sa fie la st=nga, iar cel C-terminal la dreapta lantului polipeptidic.

Aminoacizii N-terminali se determina cu ajutorul reactivilor specifici: 2,4-dinitrofluorbenzen, fenil izotiocianat etc.

Aminoacizii C-terminali se pot determina cu reactivii: hidrazina, mercaptoetanol, acid performic, enzime.

Determinarea secventei aminoacizilor in produsii de degradare se face prin identificarea naturii aminoacizilor.

Structura secundara defineste orientarea spatiala a lantului polipeptidic, datorita legaturilor de hidrogen dintre gruparile –CO si –NH ce apartin diferitelor legaturi peptidice din aceeasi catena sau din catene separate:

Pauling si Corey au stabilit criteriile care stau la baza formarii structurii secundare:

a) atomii legaturii peptidice sunt coplanari si apartin aminoacizilor seriei;

b) formarea unui numar maxim de legaturi de H care asigura o stabilitate maxima;

c) atomul de H din legatura de H sa fie c=t mai aproape de o linie imaginara ce uneste cei doi atomi ai legaturii peptidice si anume de O din gruparea CO si N din NH.

S-au elaborat doua modele teoretice limita: cel spiralat sau helicoidal (ce se realizeaza prin rasucirea in spirala a catenei polipeptidice, si care, are la baza legaturile de H intracatenare si modelul in foaie pliata (realizat prin plierea catenei, av=nd la baza legaturile de H intercatenare).

Modelul helicoidal sau alfa-helix rezulta prin rasucirea catenei polipeptidice in jurul unui cilindru imaginar c=nd elicea poate sa apara sub doua forme: cu sensul de insurubare spre dreapta si spre st=nga. Fiecare spira este formata din 3, 6 unitati de aminoacid. Spiralele au un ax de simetrie longitudinal, distanta dintre doua spire fiind de 5,4 A. Radicalii R ai aminoacizilor sunt dispusi in afara helixului si intre ei pot aparea interactiuni, astfel ca structura helicoidala (secundara) depinde de secventa aminoacizilor (de structura primara). Elicea alfa dreapta este mai stabila si la ea se refera structura secundara. Aceasta aranjare spatiala este mentinuta datorita legaturilor de hidrogen. In acest model repetarea resturilor de aminoacizi se face dupa 5 spire ceea ce repezinta aproximativ 18 aminoacizi.

Modelul in foaie pliata este caracteristic proteinelor fibrilare, beta-keratinelor si se bazeaza pe legaturile de H intermoleculare, care sunt orientate perpendicular pe directia catenei principale. Aceasta structura este de doua tipuri: paralela si antiparalela.

Metodele de investigare a structurii secundare utilizeaza metode fizico-chimice ca: spectroscopia in infrarosu, dispersia rotatiei optice si metoda schimbului izotopic.

Structura tertiara este un grad de organizare superior si reprezinta interactiunea dintre resturile aminoacizilor din catenele polipeptidice (R).

In aceasta arhitectura, mai multe alfa-helixuri se infasoara sub forma unor suprahelixuri. In mentinerea structurii tertiare sunt implicate forte de atractie intre catenele laterale, care pot ajunge in pozitii favorabile formarii legaturilor de tipul:

– legaturi ionice intre resturile –COO– a acizilor dicarboxilici si a –NH2 a acizilor diaminici; deci proteinele in solutii au un numar maxim de grupari polare, care sunt expuse la suprafata arhitecturii moleculei, interaction=nd usor cu solventul:

– legatura disulfurica, -S-S- intre doua resturi de cisteina:

– legatura esterica intre un grup –COO– (din acid glutamic sau aspartic) si un grup –OH alcoolic (din serina, spre exemplu:)

– legaturi de hidrogen intre CO dintr-un lant si –NH din alt lant:

– legaturi prin forte Van der Waals intre grupe nepolare: spre exemplu, intre gruparea –CH3 a alaninei si gruparile metil din valina sau leucina:

Desi slabe, legaturile de H si Van der Waals sunt foarte numeroase, ele contribuind intr-o mare masura la consolidarea lanturilor si la imprimarea structurii tertiare a proteinelor.

Dezorganizarea unei astfel de structuri complexe aduce cu sine pierderea proprietatilor biologice a proteinelor.

Determinarea structurii tertiare se realizeaza prin metoda difractiei razelor X.

Structura cuaternara este cel mai inalt grad de organizare a proteinelor si consta in agregarea a doua sau mai multe molecule identice sau usor diferite structural. Aceste agregate sunt unite intre ele prin aceleasi tipuri de legaturi ca si in cazul structurii tertiare, action=nd intracatenar.

Exemplu tipic de structura cuaternara il ofera hemoglobina si unele protein-enzime. Hemoglobina are molecula formata din lanturi polipeptidice, fiecare cu structura primara, secundara, tertiara. Lanturile polipeptidice sunt legate intre ele prin legaturi de H, forte Van der Waals, legaturi polare.

Nivelele superioare de organizare a structurii proteinelor sunt conditionate de structura primara.

Stabilirea structurii complete a proteinelor presupune izolarea si purificarea lor, determinarea masei moleculare, identificarea aminoacizilor si modul lor de legare, deci a secventei exacte.

Proprietati fizico-chimice

Proteinele au greutate moleculara mare (de la zeci de mii p=na la 1 milion daltoni). Determinarea greutatii moleculare se poate face prin ultracentrifugare, masurarea presiunii osmotice a proteinelor, viteza de difuzie, viteza de filtrare prin gel sau a v=scozitatii.

Proteinele au activitate optica data de prezenta C asimetric din structura aminoacizilor si de asimetria generala a arhitecturii macromoleculare, c=nd proteina are structura helicoidala.

Caracterul amfoter este dat de aminoacizii constituenti. La valoarea pH egala punctul izoelectric molecula proteica are solubilitate, v=scozitate, presiune osmotica si reactivitate chimica minime.

Sarcinile electrice libere determina puncte izoelectrice diferite anumitor proteine – deci mobilitate electrica in functie de pH-ul mediului in care proteinele sunt dizolvate, de concentratia ionica a acesteia, de intensitatea c=mpului electric, temperatura. Metoda electroforetica este una din posibilitatile de fractionare a proteinelor serice.

Unele proteine sunt solubile in apa, altele insolubile, iar altele se solva in solutii saline diluate, in solutii acide sau bazice.

Precipitarea proteinelor ( reversibila, ireversibila) se realizeaza prin adaugarea de saruri ale metalelor alcaline sau solventi organici miscibili cu apa, la solutia proteinei.

O precipitare ireversibila se realizeaza prin adaugarea de saruri ale metalelor grele: CuSO4, HgCl2, acizi minerali (azotic, percloric, tungstic) sau unii acizi organici complecsi (fosfowolframic, tricloracetic, sulfosalicilic). Aceasta precipitare ireversibila are loc cu producerea unor transformari chimice mai profunde a proteinelor (denaturare).

Denaturarea este modificarea structurala datorata actiunii agentilor fizici (T, pH) si chimici asupra proteinelor, care este insotita de pierderea activitatii fiziologice. Mecanismul de actiune consta in formarea complexelor metalice insolubile.

Hidroliza consta in desfacerea legaturii peptidice cu eliberarea in final a aminoacizilor constituenti. Hidroliza se poate face sub influenta acizilor, bazelor sau a enzimelor proteolitice.

Reactiile de culoare ale aminoacizilor pot fi utilizate si la analiza proteinelor: reactia biuretului, reactia xantoproteica, reactia Millon, reactia Adamkiewicz.

Clasificarea proteinelor

Proteinele se clasifica in: proteine simple (formate numai din aminoacizi) si proteine conjugate.

Proteinele conjugate se impart la r=ndul lor in:

fosfoproteine, in care gruparea prostetica este acidul fosforic, care esterifica grupari alcoolice din hidroxiaminoacizi (serina, treonina), ce intra in constitutia componentei proteice. Fosfoproteinele sunt insolubile in apa si acizi, dar sunt solubile in alcalii (NaHCO3). Cele mai importante fosfoproteine de origine animala sunt caseina din lapte, vitelina si fosvitina din galbenusul de ou.

glicoproteinele au grept grupare prostetica glucidele, sub forma de monozaharide: manoza, galactoza, xiloza, glucoza, fructoza, acizi uronici (D-glucuronic), aminozaharuri (glucozamina, galactozamina) sau derivati ai aminozaharurilor: acid neuraminic si acid sialic proveniti din manozamina.

Glicoproteinele sunt foarte rasp=ndite in organism. Ele predomina in tesutul conjunctiv. Se gasesc in plasma (haptoglobina, orosomucoidul, factorii grupelor sanguine), in sucul gastric (factorul intrinsec indispensabil pentru absorbtia vit.B12), in structura unor hormoni (tiroidstimulant, foliculostimulant, luteinizant) si a unor enzime (in special transferaze).

Majoritatea glicoproteinelor joaca rol de substante lubrefiante si protectoare fata de diversi agenti mecanici sau termici.

Dintre glicoproteinele foarte bogate in glucide, interes deosebit prezinta mucinele – substante v=scoase care precipita la incalzire sau la tratare cu acizi (pH 2 – 4,5).

lipoproteinele cuprind drept grupare prostetica colesterol, fosfolipide, gliceride, acizi grasi.

Au molecule mari, greutatea moleculara depasind 1.000.000 daltoni. Ele joaca un rol important in permeabilitatea selectiva a membranelor.

Au densitate mica si de aceea floteaza – ridic=ndu-se la suprafata mediului supus ultracentrifugarii.

Lipoproteinele sunt mult rasp=ndite in organism intr=nd in structura membranelor celulare, in mitocondrii si reticulul endoplasmatic. In plasma, lipoproteinele indeplinesc rolul de transportori ai lipidelor.

Metaloproteinele sunt proteine conjugate in care gruparea prostetica este constituita dintr-un atom de metal – acesta este chelat (legat complex) de resturile de aminoacizi din partea proteica a moleculei.

Dintre metaloproteine prezinta interes deosebit cele care au rolul de a transporta metale (transferina pentru fier, ceruloplasmina pentru cupru), sau de a depozita metale (feritina pentru fier) precum si unele proteine enzimatice (ascorbat oxidaza contine cupru, anhidraza carbonica contine zinc).

Cromoproteinele sunt formate dintr-o parte proteica iar ca grupare prostetica au o substanta colorata care absoarbe anumite radiatii din spectrul vizibil, imprim=nd culoarea ei intregii molecule. Aceasta clasa se imparte la r=ndul ei in cromoproteine porfirinice (care au gruparea prostetica de tip tetrapirolic) si cromoproteine neporfirinice.

Cromoproteinele porfirinice: hemoglobina, mioglobina, citocromii, enzimele heminice, toate au rol respirator in organism.

Cromoproteine neporfirinice mai importante: flavinenzimele, carotenoproteinele, feritinele etc.

Nucleoproteinele sunt alcatuite dintr-o parte prostetica – acizii nucleici si o proteina bazica de tip histona sau protamina, cu un continut crescut de acid fosforic ce le confera un caracter acid.

Acizii nucleici sunt cele mai mari biomolecule si rolul lor consta in inmagazinarea informatiei genetice si a transcrierii sale in biosinteza tuturor proteinelor din organism.

Acizii nucleici sunt rasp=nditi sub forma a doua tipuri principale: ADN si ARN.

Hidroliza cu acizi, baze, enzime, arata ca acizii nucleici contin trei categorii de componente: acidul fosforic, pentoze (riboza in ARN si 2’-deoxiriboza in ADN) si o baza azotata de tip purinic si pirimidinic. Pentoza este D-riboza sub forma furanozica, cu structura:

sau D-2’deoxiriboza sub forma furanozica, cu structura:

Dintre bazele purinice:

Adenina (A) (6 aminopurina) cu structura:

si guanina (G) (2 amino-oxipurina) cu structura:

Hipoxantina si xantina apar ca metaboliti ai bazelor purinice:

Din adenina rezulta hipoxantina:

Iar din guanina rezulta xantina:

Dintre bazele pirimidinice mai importante sunt:

– Uracilul (2,4 dioxipirimidina) cu structura:

si timina (2,4 dioxi 5 metil-pirimidina):

Timina a fost izolata din timus si este considerata ca baza pirimidinica a ADN.

– Citozina (2 oxi-4 amino-pirimidina):

Se gaseste at=t in ADN c=t si in ARN, in unele nucleotide (citidinfosfati) si are rol important in biosinteza fosfolipidelor.

Ca precursor important in biosinteza pirimidinelor este acidul orotic (2,4 dioxi-6-carboxil pirimidina):

Nucleozidele au fost izolate din produsii de hidroliza ai acizilor nucleici si nucleotidelor.

Structural, nucleozidele sunt N-glucozide heterociclice ale bazelor pirimidinice si purinice cu o pentoza in configuratia beta. Unirea celor doi componenti se face prin intermediul N9 al purinelor, respectiv N1 al pirimidinei cu C1 (glicozidic) al ribozei sau 2’-deoxiribozei.

Ribonucleozidele apar in cantitati mici si libere, spre deosebire de dezoxiribonucleozide.

Nucleozidele formate din baze azotate si pentoze sunt: adenozina, guanozina, citidina, uridina, timidina.

Un nucleozid important in procesele de transmetilare este S-adenozil metionina:

Nucleotidele se formeaza prin legarea esterica a unui radical fosfat la un oxidril al pentozei din nucleozid (5/ sau 3/).

Purin nucleotidele mai importante sunt cele cu adenina: acidul adenilic sau adenozin monofosfat (AMP) si cu guanina (GMP) -–acidul guanilic.

Pirimidin nucleotidele cu riboza sunt: acidul uridilic (UMP), acidul timidilic (TMP), acidul citidilic (CMP).

Acidul uridilic are structura:

Prin esterificarea a doua grupari oxidril din acidul fosforic cu doua grupari oxidril ale ribozei din pozitia 3/ si 5/ se obtin nucleotide ciclice:

3/, 5/ AMP ciclic si

3/, 5/ GMP ciclic cu rol important ca “al doilea mesager” in activitatea hormonilor.

Acizii nucleici sunt polinucleotide realizate prin stabilirea de legaturi covalente intre nucleotidele ce se succed in lant.

Gruparea 5/ -hidroxi a unui nucleotid este legata de gruparea 3/ -hidroxi a ribonucleotidului urmator prin legatura fosfat diesterica.

Structura covalenta a ADN

Fiecare catena polinucleotidica are doua capete: capatul 5/, la care gruparea –OH de la C5 este libera si capatul 3/ la care gruparea –OH de la C3 nu este angajata intr-o legatura inter nucleotidica.

Prin conventie, structura unei catene polinucleotidice este scrisa totdeauna cu capatul 5/ in st=nga si cel 3/ in dreapa.

De exemplu, succesiunea ACGAC semnifica faptul ca adenina are gruparea 5/ -OH neangajata in legatura cu alt nucleotid, in timp ce citozina are libera gruparea 3/ -OH.

Doua lanturi polinucleotidice sunt antiparalele c=nd unul se deruleaza in directia 5/ 3/, iar celalalt in directia 3/ 5/.

At=t ADN c=t si ARN pot fi hidrolizati de enzime numite nucleaze. Sunt doua tipuri de nucleaze:

endonucleaze – care hidrolizeaza legaturile fosfat diesterice din interiorul catenei polinucleotidice si

exonucleaze – care hidrolizeaza legatura nucleotidica terminala de la capatul 5/ sau 3/.

Acizii dezoxiribonucleici sunt polidezoxiribonucleotide cu masa moleculara mare in structura carora intra obligatoriu patru baze azotate: adenina, guanina, timina si citozina. ADN contin informatia genetica completa pentru a specifica structura proteinelor din organism.

Prin analiza cromatografica efectuata pe molecule de ADN izolate din diverse specii s-a stabilit ca in toate tipurile de ADN numarul de resturi de adenina este egal cu cel al resturilor de timina, iar cel a resturilor de guanina cu cel de citozina; numarul de baze purinice este egal cu cel al bazelor pirimidinice (AG TC).

Prin difractia cu raze X, efectuata pe cristale de ADN, s-a demonstrat existenta a doua perioade de identitate de-a lungul axei lungi a moleculei: una mare de 3,4 nm si una mica de 0,34 nm.

Pornind de la aceste date, Watson si Crick au elaborat un model tridimensional al moleculei de ADN cu urmatoarele caracteristici:

doua lanturi polidezoxiribonucleotidice se rasucesc helicoidal si in acelasi sens in jurul unui ax comun, form=nd o dubla helice cu orientare dreapta;

– inelele glucidice, legate prin resturi fosfat, constituie scheletul extern al dublului helix, iar bazele azotate, hidrofobe sunt orientate spre interior si perpendicular pe axa helixului;

– toate gruparile fosfat la pH 7 sunt ionizate si incarcate negativ;

cilindrul ce incadreaza dublul helix are un diametru de 2 nm;

distanta dintre planurile a doua baze adiacente este de 0,34 nm;

perioada de identitate este de 3,4 nm, deci structura se repeta dupa 10 baze azotate;

Stabilitatea dublului helix este asigurata de interactiunile hidrofobe dintre bazele azotate si de legaturile de hidrogen ce se stabilesc intre bazele azotate de pe o catena si cele complementare de pe cealalta catena.

Legaturile de hidrogen se stabilisc intre o baza azotata purinica de pe o catena si una pirimidinica de pe cealalta catena. Bazele pereche sunt A – T si G – C, deoarece numai acestea pot stabili numarul maxim de legaturi de hidrogen, asigur=nd configuratia cu energia libera cea mai mica, deci cea mai stabila pentru molecula de ADN.

Adenina se leaga de timina prin doua legaturi de hidrogen, iar guanina de citozina prin trei legaturi de hidrogen.

Cele doua catene polinucleotidice ale dublului helix nu sunt identice ci complementare, in sensul ca adeninei dintr-o catena ii va corespunde totdeauna timina de pe cealalta catena, iar guaninei, citozina.

Succesiunea bazelor azotate dintr-o catena dicteaza succesiunea bazelor azotate din cea de a doua catena; o catena este replica celeilalte.

Din secventa bazelor azotate din catenele ADN rezulta si informatia genetica cu privire la biosinteza de proteine.

ADN stocheaza si transmite informatia genetica de-a lungul generatiilor.

Acizii ribonucleici sunt produsi macromoleculari formati prin policondensarea ribonucleotidelor – prin legaturi fosfat diesterice intre gruparea –OH din pozitia 3/ a unui nucleotid si gruparea –OH din 5/ a nucleotidului succesiv.

Bazele azotate care intra in structura ARN sunt: A, G, U, C.

Moleculele de ARN sunt monocatenare.

Structura covalenta a ARN

Dupa rolul ce le revine in procesul de biosinteza a proteinelor, ARN pot fi: ARN mesager (ARNm), ARN de transfer sau solubil (ARNt), ARN ribozomal (ARNr).

ARN mesager este sintetizat in nucleu pe matrita de ADN. El iese in citoplasma unde va servi ca matrita (template) pentru sinteza unui polipeptid cu o secventa specifica de aminoacizi. Fiecare aminoacid este codificat de catre o secventa de trei nucleotide, numite codon.

Timpul de supravietuire a ARNm in celula este de ordinul orelor.

ARN de transfer sunt molecule mici (70-90 nucleotide) monocatenare, in care procentul de baze complementare este deosebit de mare fata de alte specii de ARN. Raportul AG/UC este aproximativ 1.

ARNt prezinta o conformatie in “foaie de trifoi” av=nd 4 zone de perechi complementare si 3 necomplementare expulzate ca bucle.

La capatul 5/ terminal ARNt are un rest guanilic, iar la capatul 3/ toti au secventa nucleotidica CCA. La capatul buclei se gaseste anticodonul.

Toate tipurile de ARNt contin un mare numar de baze minore: tiouridina, inozina, pseudo-uridina, ribotimidina.

In biosinteza de proteine ARNt are doua functii:

1. transportul aminoacizilor, activati in faza solubila, la ribozomi, sub forma de complexe aminoacil-ARNt.

Fiecarui dintre cei 20 de aminoacizi care intra in structura proteinelor ii corespunde cel putin un ARNt specific.

2. adaptarea aminoacidului transportat in dreptul codonului de pe ARNm care-l specifica. Aceasta racordare este posibila prin recunoasterea codon-anticodon.

ARN ribozomal (ARNr) sunt molecule mari, flexibile si deformabile.

In functie de constanta de sedimentare (S) care depinde de forma si marimea particulei, se impart in:

ARNr 23S, 16S, 5S la procariote

ARNr 28S, 18S, 5,8S si 5S la eucariote.

ARN ribozomal este tipul de ARN cel mai abundent (aproximativ 75% din totalul ARN celular) si cel mai stabil metabolic.

ARN ribozomal se agrega cu proteine si lipide form=nd ribozomii (descoperiti de George Palade).

Dupa valoarea constantei de sedimentare ribozomii pot fi 70S la bacterii si 80S la eucariote, acesta din urma poate disocia in 60S si 40S.

Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor.

Pe suprafata fiecarui ribozom sunt doua situsuri: situsul aminoacid care leaga ARNt, purtator al unui aminoacid si situsul peptid, care leaga ARNt purtator al unui lant polipeptidic.

Modalitatea specifica de sinteza a ARN este transcrierea, respectiv sinteza moleculelor de ARN pe matrita de ADN.

Pe una din catenele duplexului de ADN nuclear se edifica o catena de ARN complementara cu portiunea de ADN transcrisa – in acest mod structura ARN reflecta compozitia in baze a fragmentului de ADN transcris.

ARN poate fi degradat de o nucleaza specifica numita ribonucleaza care este o endonucleaza.

Produsii finali ai actiunii ribonucleazei sunt pirimidin nucleozid 3/ fosfati si oligonucleotide cu pirimidin 3/ fosfati ca nucleotide terminale.

Unii acizi nucleici se afla asociati necovalent cu proteine specifice form=nd complexe supramoleculare. Dintre aceste sisteme acid nucleic – proteina, cu structuri si functii biologice foarte complexe, ribozomii si virusurile sunt cei mai bine cunoscuti.

Cele mai complexe sisteme acid nucleic – proteina sunt cromozomii din celulele eucariote.

CAPITOLUL IV

ENZIME

Enzimele sunt catalizatori proteici pentru reactiile chimice care se petrec in sistemele biologice. In absenta enzimelor, majoritatea reactiilor din celula vie s-ar petrece cu viteze foarte mici.

Spre deosebire de catalizatorii neproteici (ioni metalici, H, OH–) fiecare enzima catalizeaza un numar mic de reactii, de cele mai multe ori una singura.

Exista un numar foarte mare de enzime; pentru fiecare compus organic c=t si pentru multi compusi anorganici exista macar o enzima capabila sa reactioneze cu acesta si sa catalizeze o anumita modificare chimica.

Mult timp s-a crezut ca activitatea enzimatica exista numai in celulele intacte; ulterior multe enzime au fost extrase fara pierderea activitatii lor biologice, ceea ce a permis studiul lor extracelular.

Extractele enzimatice sunt utilizate in studiul reactiilor metabolice, a structurii si mecanismului lor de actiune si chiar in calitate de catalizatori in sinteza industriala de compusi biologic activi: hormoni, medicamente.

Activitatea diferitelor enzime este str=ns legata de localizarea lor celulara; exista un aranjament spatial si o compartimentare a enzimelor, coenzimelor si substratelor.

In citoplasma sunt localizate enzimele glicolitice. Mitocondriile, “centrale de energie” ale celulei capteaza energia furnizata de procesele oxidative sintetiz=nd ATP din ADP si Pa. In mitocondrii sunt localizate enzimele ciclului Krebs, cele ale oxidarii acizilor grasi. Lizozomii, organite subcelulare, contin enzimele digestiei celulare care degradeaza grasimile, proteinele, acizii nucleici si alte molecule mari in molecule mai mici care sunt apoi metabolizate de sistemele enzimatice ale mitocondriei.

Multe celule au un sistem de membrane interne in citoplasma (reticulul endoplasmatic format din lipoproteine). Pe suprafata interna a reticulului endoplasmatic se gasesc numeroase granule bogate in ARN, numite ribozomi si care sunt sediul sintezei proteinelor. Nucleul contine o cantitate mare de cromatina cu un continut mare din ADN-ul celular.

Clasificarea si nomenclatura enzimelor.

Comisia pentru enzime a Uniunii Internationale de Biochimie a stabilit un sistem de clasificare zecimala care tine seama de reactia catalizata si de natura substratului si serveste at=t pentru clasificare c=t si pentru nomenclatura. In acest sistem fiecare enzima este notata cu un numar de cod format din patru cifre, numar care permite identificarea enzimei, a substratului asupra caruia actioneaza si a reactiei catalizate. Prima cifra a numarului de cod indica clasa si se refera la tipul reactiei catalizate. Din acest punct de vedere enzimele sunt grupate in sase clase:

1. Oxidoreductaze – catalizeaza reactii de oxidoreducere;

2. Transferaze – catalizeaza transferul de grupari de pe un substrat (donor) pe alt substrat (acceptor);

3. Hidrolaze – catalizeaza reactiile de scindare in prezenta apei;

4. Liaze – catalizeaza scindarea nehidrolitica a unei grupari de pe un substrat cu formarea unei duble legaturi sau fixeaza o grupare la o dubla legatura;

5. Izomeraze – catalizeaza reactiile de izomerizare;

6. Ligaze (sintetaze) – unirea a doua molecule (formarea de noi legaturi) cu energia cedata prin hidroliza ATP.

A doua cifra a numarului de cod defineste subclasa si se refera la tipul gruparii din molecula substratului asupra careia actioneaza enzima.

A treia cifra defineste subclasa si indica gruparea transferata sau natura acceptorului.

A patra cifra din numarul de cod reprezinta numarul de ordine a enzimei in subclasa respectiva.

De exemplu enzima cu numarul de cod 1.1.1.1. este Alcool:NAD-oxireductaza.

Pe l=nga aceasta denumire stiintifica a enzimei, se utilizeaza o denumire uzuala, care este in acord cu numele stiintific. Denumirea uzuala este formata din doua parti: prima parte indica substratul sau substratele asupra carora actioneaza enzima, iar partea a doua indica reactia catalizata. De exemplu alcool:NAD-oxidoreductaza se numeste curent alcool dehidrogenaza (ADH).

1. Oxidoreductaze

Enzimele grupate in aceasta clasa catalizeaza reactiile de oxidoreducere dintre doi compusi prin transferul electronilor de la un donor (agent reducator) la un acceptor (agent oxidant) dupa reactia generala:

Sredus S’oxidat Soxidat S’redus

In multe reactii transferul electronilor se face concomitent cu transferul protonilor (deci are loc transferul de H). In acest caz reactia poarta numele de dehidrogenare si este echivalenta cu reactia de oxidare, iar dehidrogenarea este echivalenta cu reducerea.

Transportul de H in aceste reactii este partea coenzimatica a enzimei.

Principalele coenzime cu rol in oxidoreducere sunt coenzimele pirimidinice (NAD, NADP), coenzimele flavinice (FMN si FAD), acidul lipoic, citocromii, coenzima Q.

Oxidoreductazele catalizeaza oxidoreducerea gruparilor:

-CH-OH; -CH2-CH2-; -CH-NH2; -CHNH.

1.1. Oxidoreductaze care actioneaza asupra grupelor CH-OH ale donorilor.

Alcool:NAD-oxidoreductaza (alcool-dehidrogenaza)

1.1.1.27. L-Lactat:NAD-oxidoreductaza (lactat dehidrogenaza)

1.4. Enzime ce actioneaza asupra gruparii –CH-NH2 ca donor de electroni.

1.4.13. L-glutamat: NAD(P) -oxidoreductaza (glutamat dehidrogenaza).

1.9. Enzime ce actioneaza asupra gruparii hem ca donor de electroni

1.9.3.1. Citocrom c:O2-oxidoreductaza (citocrom oxidaza)

4 citocrom O2 4 H 4 citocrom c oxidat 2 H2O

1.11. Enzime ce actioneaza asupra H2O2 ca acceptor de electroni.

1.11.1.6. H2O2: H2O2- oxido reductaza (catalaza)

H2O2 H2O2 O2 2 H2O

2. Transferaze

Transferazele catalizeaza reactiile de transfer a unor grupari “G” (alta dec=t H) de la un substrat S1 la alt substrat S2, conform reactiei:

S1-G S2 S1 S2-G

Gruparile transferate pot fi grupari cu un singur atom de carbon, resturi de aldehide, cetone, acil, alchil, glicozil, amino, fosfat, sulfat.

Acil-transferaze

2.3.1.6. Acetil-CoA: Colin-O-acetil-transferaza (colin acil transferaza)

Acetil-CoA colina CoA O-acetilcolina

2.4. Glicozil-transferaze (transglicozidaze) – transfera glicozil.

–1,4-Glucon:ortofosfat-glicoziltransferaza (fosforilaza)

2.7. Enzime ce catalizeaza transferul gruparilor fosfat

2.7.1.1. ATP-D-hexoz-6-fosfotransferaza (hexokinaza)

3. Hidrolaze

Sunt enzime ce catalizeaza ruperea unor legaturi organice cu participarea apei, dupa reactia:

A-B H2O AH BOH

Legaturile care pot fi desfacute prin hidroliza sunt legaturile esterice, eterice, peptidice, anhidride, C-N (altele dec=t C-N din legatura peptidica), C-X, P-N.

Caracteristic pentru aceasta clasa de enzime este lipsa coenzimelor. Ele necesita prezenta unor ioni metalici pentru activare. Din aceasta clasa fac parte in general enzimele digestive.

3.1. Esterazele scindeaza legaturile esterice: carboxi esteraze, tio esteraze, fosfo esteraze, sulfo esteraze.

3.1.1.8. Acetilcolin-acil hidrolaza (pseudocolin-esteraza)

3.4. Enzime ce actioneaza asupra legaturilor peptidice.

Peptidazele scindeaza legaturile peptidice din proteine:

exopeptidaze – actioneaza asupra legaturii peptidice terminale; unele sunt specifice pentru legaturile din capatul N-terminal (amino peptidaze) iar altele pentru capatul C-terminal (carboxi peptidaze).

endo peptidazele scindeaza legaturile peptidice situate in mijlocul lanturilor peptidice – acestea sunt peptidazele propriu-zise: – pepsina, tripsina, chimotripsina, catepsina.

4. Liaze

Sunt enzimele care catalizeaza indepartarea unor grupari din molecula substratului fara participarea apei duc=nd la formarea unei duble legaturi:

Aceasta clasa include enzimele care actioneaza asupra legaturilor C-C, CO, -CN, CS, -C-X.

4.1.2. Aldehid-liaze:

4.1.2.7. Cetoz-1-fosfat-aldehid-liaza (aldolaza) – scindeaza legatura C-C din fructoza fosforilata:

4.2. Carbon-oxigen-liaze

4.2.1.2. L-Malat-hidro liaza (fumaraza)

L-Malat Fumarat H2O

5. Izomeraze

Cuprinde enzimele care catalizeaza interconversiunea izomerilor optici, geometrici si de catena.

5.1. Racemaze si epimeraze

5.1.1.1. Alanin-racemaza:

5.2. Cis-trans-izomeraze

5.2.1.3. All-trans-retinol:11-cis-trans-izomeraza (retinen-izomeraza)

All-trans-retinol 11-cis-retinol

5.3. Enzime ce catalizeaza interconversiunea aldozelor si cetozelor:

6. Ligaze

Clasa ligazelor cuprinde enzimele care catalizeaza legarea a doi compusi, cuplata cu ruperea unei molecule de ATP (utilizeaza aceasta energie pentru realizarea noii legaturi). In acest mod se realizeaza legaturi C-O, C-S, CN, C-C.

6.3. Enzime care catalizeaza formarea legaturii C-N

6.3.1.2. L-Glutamat amoniac-ligaza (ADP) (glutamin sintetaza):

6.4. Enzime care catalizeaza formarea legaturii C-C

6.4.1.2. Acetil-CoA: CO2-ligaza (ADP) (acetil-CoA-carboxilaza)

Structura enzimelor

Specificitatea mare a unei enzime este str=ns legata de structura ei fizica si chimica. Din punct de vedere chimic, o enzima este formata dintr-o parte proteica – apoenzima si o parte neproteica – coenzima sau cofactor.

Partea proteica este termolabila iar coenzima este termostabila si dializabila.

Tipurile de reactii care necesita pentru cataliza participarea coenzimelor sunt reactii de transfer de grupari, de izomerizare, de oxido reducere (transfer de H) si cele care au drept rezultat formarea de legaturi covalente (clasele 1, 2, 5, 6).

Spre deosebire de acestea, reactiile litice, incluz=nd si pe cele hidrolitice (reactiile catalizate de enzimele digestive) nu au nevoie, pentru actiune de coenzime (clasele 3 si 4).

Apoenzima. Enzimele simple si apoproteinele enzimelor complexe sunt formate din catene lungi polipeptidice, av=nd aceleasi nivele de organizare structurala ca si alte proteine: primara, secundara, tertiara si cuaternara.

Desi toate enzimele au structuri primare, secundare si tertiare, structura cuaternara nu este obligatorie.

Fiecare nivel de organizare structurala are o anumita semnificatie biologica. De exemplu, o enzima care are o structura primara corecta, dar celelalte structuri incorecte, nu este catalitic activa. La fel, subunitatile cu structura primara, secundara si tertiara corecte, dar fara structura cuaternara corecta, sunt inactive.

Structurile secundara, tertiara si cuaternara pot fi dictate de structura primara. desi o proteina poate avea mai multe conformatii, forma biologica activa este aceea cu nivelul energetic cel mai scazut, aceea cu cea mai mare stabilitate – structura tridimensionala. Un argument in favoarea acestui fapt il constituie capacitatea multor enzime, a caror conformatie activa a fost distrusa prin denaturare bl=nda, de a-si reface activitatea prin pastrarea in conditii care favorizeaza ruperea si refacerea legaturilor secundare.

Coenzime. Frecvent, coenzimele contin in structura lor vitamine din grupul B. Astfel, vitamina B6 , vitamina PP, vitamina B1, B2, acidul pantotenic si acidul lipoic participa la reactiile de oxido reducere, iar acidul folic si vitamina B12 intervin in metabolismul fragmentelor de un atom de C.

Coenzimele sunt considerate ca al doilea substrat pentru enzima sau cosubstrat.

Dupa taria legaturilor dintre apoenzima si cofactor, deosebim:

grupari prostetice – care sunt molecule organice fixate pe apoenzima si care disociaza greu. Gruparea prostetica determina mecanismul dupa care se desfasoara unele procese enzimatice, cum ar fi transportul de hidrogen, de electroni, de grupari –NH2, -CH3, acetil.

coenzimele (se separa de apoenzima prin dializa si trec usor de la o apoenzima la alta) sunt reprezentate de: NAD, NADP, NADHH, NADPHH, ATP, CTP, FMN, FAD, acidul lipoic etc.

cofactorii anorganici sunt reprezentati de ioni ai diferitelor metale (Mg2, Mn2, Cu2, Zn2) care sunt indispensabili activitatii metal-enzimei. Acesti ioni metalici sunt furnizati in cantitati mici prin alimentatie.

Nu se poate face, uneori, o delimitare neta intre coenzima si gruparea prostetica. Acestea pot aduce enzima intr-o stare activa sau se pot comporta ca un al doilea substrat care fixeaza temporar grupari, radicali sau electroni ce vor fi transferati de pe un substrat pe altul.

Coenzimele pot fi clasificate dupa tipul reactiei la care participa in doua categorii:

A. Coenzime ce participa la transferul hidrogenului:

1. Coenzimele piridinice (NAD, NADP)

2. Coenzimele flavinice (FMN, FAD)

3. Acidul lipoic

4. Coenzima Q

B. Coenzime care participa la transportul de grupari (altele dec=t H):

1. Glucide fosforilate

2. CoA-SH

3. Tiamin pirofosfat (TPP)

4. Piridoxal-5-P

5. Acizii folinici

6. Biotina

7. Coenzimele vitaminei B12

8. Acidul lipoic

Se constata ca in structura multor coenzime intra AMP, de aceea aceste coenzime pot fi considerate derivati ai AMP care difera in privinta substituentilor R1; R2; R3 si ai numarului de grupari fosfat legate la carbonul 5/ din riboza.

Izoenzimele sunt forme moleculare multiple ale aceleiasi enzime. Ele catalizeaza aceeasi reactie enzimatica, dar difera intre ele in privinta proprietatilor fizice, chimice si imunologice.

Interesul medical pentru izoenzime a fost stimulat prin descoperirea in 1957, in serul uman, a mai multor izoenzime LDH, a caror proprietati relative se modifica semnificativ in anumite stari patologice.

Existenta izoenzimelor a fost relatata si in alte tesuturi ale mamiferelor, ca si la pasari, pesti, insecte.

Cele 5 izoenzime LDH difera intre ele in ceea ce priveste structura cuaternara. Molecula activa de LDH este un tetramer format din doua tipuri de subunitati H si M luate c=te patru (fiecare subunitate av=nd 34.000 daltoni).

Subunitatea H (heart) este caracteristica muschiului inimii si in general tesuturilor cu metabolism aerob, iar subunitatea M (muscle) este caracteristica muschiului scheletic si in general organelor si tesuturilor cu metabolism anaerob. Exceptie fac ficatul si eritrocitul.

Clement Markert a utilizat fenomenul de distrugere si refacere a structurii cuaternare, pentru a clarifica structura izoenzimelor LDH. Efectu=nd experiente cu LDH1 si LDH5, a ajuns la concluzia ca acestea sunt formate din subunitati de acelasi tip. Amestec=nd LDH1 si LDH5 purificate prin recombinare, a obtinut inca trei izoenzime hibride : LDH2, LDH3 si LDH4. Structura celor 5 izoenzime LDH este:

LDH1 – H4

LDH2 – H3M1

LDH3 – H2M2

LDH4 – H M3

LDH5 – M4

Sinteza celor doua tipuri este coordonata de doua gene diferite.

Ulterior au fost evidentiate izoenzime si pentru alte enzime: creatinkinaza – CK1(BB); CK2(MB) si CK3 (MM), hexokinaza, fosfataza alcalina etc.

Specificitatea enzimelor

Majoritatea enzimelor fac parte din clasa proteinelor complexe, fiind compuse dintr-o parte proteica – apoenzima si o parte prostetica – coenzima. Prin unirea celor doua parti se formeaza holoenzima sau enzima propriu-zisa, forma sub care ea este activa.

In partea proteica este situata specificitatea enzimei, de actiune, dar mai ales de substrat.

Dupa specificitatea de actiune enzimele pot fi grupate astfel:

a) enzime cu specificitate absoluta;

b) enzime cu specificitatea absoluta de grup;

c) enzime cu specificitate relativa de grup;

d) enzime cu specificitate optica sau stereochimica

a) Specificitatea absoluta. Unele enzime actioneaza numai asupra unui singur substrat, cataliz=nd o singura reactie, de exemplu ureaza:

Aceasta enzima este total inactiva fata de compusi foarte asemanatori structural cum este tioureea: H2N-CS-NH2. De asemenea, arginaza, enzima care hidrolizeaza L-arginina la uree si ornitina nu poate hidroliza esterul metilic al argininei sau scindarea agmatinei (rezultata prin decarboxilarea argininei.

b) Specificitatea absoluta de grup – prezinta enzimele ce actioneaza numai asupra unei serii de substrate apropiate ca structura chimica (cu legaturi chimice de acelasi fel).

Din aceasta categorie fac parte glicozidazele si succin-dehidrogenaza, care catalizeaza reactia de trecere a acidului succinic in fumaric, dar cu aproximativ aceeasi viteza si dehidrogenarea acizilor L-metil-succinic, L-etil-succinic si L-clor-succinic.

c) Specificitatea relativa de grup. Multe enzime sunt specifice numai pentru anumite tipuri de legaturi chimice indiferent de structura moleculelor respective.

Din acest grup fac parte ligazele sau esterazele care fac posibila scindarea mono-, di- si trigliceridelor si chiar alti esteri cu structura chimica mult mai complicata. De exemplu, acetilcolinesteraza, specifica pentru acetil-colina, poate scinda si alti esteri ai colinei cu acizii propionic, butiric etc. Butiril-colina pare a fi substratul de electie, fiind hidrolizata mai rapid dec=t alti esteri ai colinei.

Enzimele proteolitice care hidrolizeaza legaturile peptidice din proteine si din alti compusi neproteici, fac parte tot din acest grup.

d) Specificitatea optica. Enzimele catalizeaza transformarea numai a unui stereoizimer; aceasta specificitate optica este de obicei absoluta, celalalt antipod ram=n=nd neschimbat. De exemplu, L-serin-hidroliaza si D-serin-hidroliaza – enzime care catalizeaza dezaminarea serinei la piruvat:

Exceptie fac racemazele care catalizeaza interconversiunea antipozilor optici.

Enzimele care recunosc substrate cu izomeri geometrici au o specificitate geometrica.

Fumaraza, de exemplu, permite hidratarea acidului fumaric (izomer trans) si nu a acidului maleic (izomer cis) cu formarea acidului malic ca produs final.

Stereospecificitatea isi gaseste o aplicatie directa in studiul centrului activ al enzimelor sub numele de marcaj de afinitate.

Metoda consta in formarea unui complex intre enzima si un analog steric al substratului pe care se grefeaza o functie chimica reactiva. Analogul se comporta ca un inhibitor competitiv. Initial, se formeaza un complex reversibil intre enzima si analogul A (E-A), dupa care, printr-o reactie chimica ireversibila intre functia X a analogului A si aminoacidul R din centrul activ al enzimei, se formeaza un complex E-A legat covalent.

Dupa proteoliza enzimei modificate, se poate identifica aminoacidul care a reactionat cu analogul.

Metoda permite identificarea aminoacizilor din centrul activ care intervin fie in recunoasterea substratului, fie in mecanismul catalitic. Cromatografia de afinitate este o aplicatie directa a specifictatii enzimatice.

Cinetica reactiilor enzimatice.

Studiul cineticii enzimatice permite cunoasterea mecanismelor, intelegerea si clasificarea proceselor metabolice si importanta lor fiziologica pentru organism. Masurarea activitatii enzimatice se reduce la studiul cineticii sau vitezei reactiei catalizate care reprezinta, in general, cantitatea de substrat transformata in unitate de timp sau de produs (produsi) format in reactie.

Centrul catalitic al enzimei

Structura binara a enzimelor este indispensabila actiunii catalitice. Luate separat, at=t cofactorul c=t si apoenzima nu au activitate catalitica.

Din numarul foarte mare de resturi de aminoacizi numai un numar limitat (un segment limitat de enzima) participa la interactiunea cu substratul. Pe aceasta portiune exista grupari functionale capabile sa atraga si sa fixeze molecula substratului intr-o pozitie privilegiata si intr-un loc (situs) strict determinat. Ansamblul acestor grupari chimice functionale alcatuiesc centrul catalitic al enzimei. In segmentul polipeptidic al centrului catalitic se deosebesc trei grupe de aminoacizi:

– aminoacizi implicati in prima etapa a catalizei enzimatice deci cei care constitue locul sau situsul de specificitate si asigura recunoasterea substratului pentru reactia ES E-S sa poata avea loc;

– aminoacizi care participa la transformarea chimica a substratului in produs de reactie conform ecuatiei E-S EP. acesti aminoacizi alcatuiesc partea catalitica a centrului activ;

– aminoacizi necesari mentinerii conformatiei adecvate a centrului catalitic, a situsului alosteric (care regleaza functionarea centrului activ) si pozitionarea adecvata a enzimei in interiorul celulei (de exemplu, asocierea enzimei cu alta enzima pentru formarea unui complex multienzimatic sau legarea de membrana).

Centrul catalitic cuprinde aminoacizi din primele doua grupe.

Uneori centrul catalitic este reprezentat de unele catene laterale ale lanturilor peptidice din structura enzimei.

De exemplu, in cazul pseudocolinesterazei, centrul catalitic contine acid glutamic, serina, alanina. S-a sugerat ca la nivelul acidului glutamic (la gruparea carboxil) se fixeaza gruparea bazica a colinei (-N(CH3)3 iar la nivelul gruparii –OH din serina s-ar fixa radicalul acetil. Prin aceasta, molecula de acetilcolina se leaga labil de enzima, iar legatura esterica se desface. Produsii care rezulta (colina si acetatul) parasesc centrul catalitic al enzimei care va fixa o noua molecula de acetilcolina.

Deci reactia enzimatica poate fi conceputa ca av=nd loc in doua etape: formarea complexului enzima – substrat, urmata de modificarea substratului si desprinderea produsului de reactie de pe enzima.

Centrul catalitic a fost conceput multa vreme ca un tipar rigid, preformat, substratul potrivindu-se in enzima ca si “cheia in broasca” (lock and key) sau “template” (modelul Fischer). Desi in acest model centrul activ este rigid, el se mai foloseste inca pentru explicarea unor proprietati enzimatice, cum ar fi legarea intr-o anumita ordine a substratelor sau curba de saturare cu substrat.

Un model mai perfectionat este cel imaginat de Koshland, numit “induced fit” (fixare indusa), modelul cu cel mai puternic suport experimental. Principala caracteristica a acestui model este flexibilitatea centrului activ. In absenta substratului, gruparile catalitice si de legare a substratului sunt situate la departare unele de altele, separate de mai multe resturi de aminoacizi. Apropierea substratului induce o modificare conformationala a enzimei inc=t gruparile care participa la legarea substratului sau la reactia catalitica se apropie spatial.

Situsul (centrul) activ dintr-o enzima poate fi pus in evidenta prin tratarea cu anumite substante ce au capacitatea de a se combina specific cu aminoacizii centrului catalitic, inactiv=nd enzima.

Astfel, di-izo-propil-fluorfosfatul se combina specific cu serina din centrul activ al majoritatii hidrolazelor (ex. colinesteraza).

Para-clor-mercuribenzoatul se combina specific cu resturile de cisteina, aflata in centrul activ al majoritatii dehidrogenazelor, bloc=nd astfel reactiile metabolice catalizate de acestea.

Derivatii cu arsenic se combina cu resturile de cisteina explic=nd in mare parte toxicitatea arsenicului:

Gruparile tiol pot fi deblocate cu ditioglicerol utilizat in terapeutica in intoxicatiile cu metale grele,

in special in intoxicatiile cu cupru.

Viteza reactiei enzimatice

Enzimele modifica reactiile asupra carora actioneaza. Pentru o reactie de tipul A P viteza de reactie se defineste ca fiind raportul dintre cantitatea de substanta A care se transforma intr-un interval t, in produsul P.

Viteza de reactie poate fi exprimata si in functie de concentratia produsului de reactie format intr-un timp t si care este data de relatia dP/dt.

Daca se reprezinta grafic cantitatea de substrat transformat in produs, in unitatea de timp, se obtine o curba care comporta o parte rectilinie in care viteza este constanta si una curba in care viteza scade pentru ca in final sa devina nula.

Prima parte a curbei indica viteza initiala a reactiei vo, definita prin panta maxima a curbei (unghiul dintre abscisa si tangenta la curba vo tg o

Viteza reactiei (v) la un timp dat (t) este egala cu dP/dt. Pentru a cunoaste viteza, este suficient sa se masoare unghiul pe care il face tangenta la curba, la timpul t.

Tangenta la origine da viteza initiala a reactiei, vo. Viteza de reactie este influentata de o serie de factori: concentratia enzimei, concentratia substratului, temperatura, pH, agenti redox, presiune, radiatii etc.

Influenta concentratiei enzimei

Daca se utilizeaza concentratii cresc=nde de enzima (E1, E2, E3) cantitatea de substrat transformat in unitatea de timp creste proportional cu concentratia enzimei (1X, 2X, 3X) numai pentru un interval de timp si numai pentru portiunea rectilinie a curbei.

Proportionalitatea dispare c=nd este depasit un anumit timp t2 pentru concentratiile E2 si E3.

Daca intr-un preparat biologic, de exemplu, se formeaza X mg P intr-un timp dat si in alt preparat, in acelasi timp se formeaza 2X mg P, inseamna ca acesta contine de doua ori mai multa enzima care catalizeaza formarea de produs P.

In practica fenomenul de inflexiune a curbei nu se observa deoarece cantitatea de substrat in raport cu cea a enzimei este mai mare. Fenomenul este limitat si de solubilitatea macromoleculei proteice. Proportionalitatea dintre viteza de reactie initiala si concentratia enzimei are importanta practica, pentru ca se pot calcula concentratiile relative ale unei enzime din preparatele biologice si eventualele variatii in afara limitelor normale permit=nd diagnosticarea unor stari patologice.

Influenta concentratiei substratului asupra vitezei de reactie.

Daca se mentine constanta concentratia de enzima si se mareste concentratia de substrat S, se constata o crestere rapida a vitezei de reactie, p=na la o valoare limita (vmax.). Daca S continua sa creasca, curba capata o inflexiune si pentru valori mari de S viteza nu mai creste, curba tinde asimptomatic catre o valoare maxima (vmax.).

Cresc=nd in continuare concentratia substratului viteza reactiei ram=ne constanta deoarece nu mai exista enzima libera. Transformarea substratului in produs (produsi) de reactie are loc cu formarea, pentru scurt timp, a unui complex enzima-substrat.

Ipoteza formarii complexului ES a fost emisa prima data de Michaelis. Existenta acestui complex a fost demonstrata practic prin analiza spectrelor de absorbtie in ultraviolet, vizibil, rezonanta magnetica nucleara, fluorescenta sau prin dializa.

Reactia de baza care descrie cataliza enzimatica este:

Cantitatea de produs P formata depinde direct de concentratia complexului ES.

Daca S continua sa creasca, este evident ca ES nu va continua sa creasca dec=t p=na la o valoare maxima care depinde de cantitatea de enzima disponibila. E devine factor limitant al formarii complexului ES si o crestere a S nu va avea efect asupra vitezei de reactie (platoul din graficul de mai sus).

Un studiu cantitativ a variatiilor vitezei unei reactii enzimatice in functie de concentratia de substrat a fost efectuat de Michaelis si Menten si care se bazeaza pe relatia:

Obtinerea unui echilibru intre E, S si ES este un proces rapid in comparatie cu reactia ES EP (3).

Viteza reactiei enzimatice este proportionala cu concentratia complexului ES, deci v K3 ES (4).

La vmax., concentratia de substrat este cea la care toata enzima este legata de substratul sau.

Valoarea maxima a ES este egala cu concentratia totala in enzima:

si in acest caz se poate scrie:

Constanta de echilibru sau constanta Michaelis pentru disocierea complexului ES este:

in care E este concentratia enzimei libere, egala cu ET-ES. Inlocuind, se poate deci scrie:

care trece in forma:

sau inca:

dar si se poate astfel scrie:

Atunci c=nd viteza de descompunere a complexului atinge jumatate din valoarea vitezei maxime, adica

obtinem

din care se poate calcula Km:

Constanta Michaelis sau constanta de echilibru a disocierii complexului ES este deci egala cu concentratia substratului pentru care viteza este egala cu jumatate din valoarea vitezei maxime. In general, valorile Km sunt cuprinse intre 10-2M si 10-8M.

Km este o masura a afinitatii enzimei pentru substratul sau. O valoare mica a Km indica o afinitate mare a enzimei pentru substrat, iar o valoare mare a Km indica o afinitate mica a enzimei pentru substratul sau.

Daca se examineaza ecuatia Michaelis si Menten scisa sub forma:

se vede ca S este foarte crescuta in raport cu Km si se poate neglija Km iar v tinde spre vmax.. Daca, din contra, S este foarte mica in raport cu Km, v devine egal cu , deci v este proportionala cu S.

In cataliza enzimatica se disting doua etape: formarea complexului ES care implica recunoasterea substratului de catre centrul activ al enzimei, etapa caracterizata prin Km egal cu si o a doua etapa este descompunerea complexului ES in EP si care este caracterizata de vmax. Deoarece este dificil de reprezentat viteza reactiei pentru concentratii mici de substrat, unde precizia este destul de mica, s-a incercat o linearizare a ecuatiei Michaelis care a fost realizata de Lineweaver si Burk.

Ecuatia Michaelis si Menten se poate scris sub forma:

sau inca

Scrisa sub aceasta ultima forma este o ecuatie de tipul yax b in care si sunt variabilele y si x iar si sunt constantele a si b.

Reprezent=nd grafic vitezele invers in functie de se obtine o dreapta care taie ordonatele in punctul , iar axa abciselor in punctul , asa cum reiese din graficul urmator:

Daca se poate scrie:

Aceasta reprezentare grafica este mai comoda pentru determinarea constantei Michaelis (Km) si a vitezei maxime (vmax) a reactiei pentru o concentratie data de enzima.

Aceasta permite deosebirea intre un inhibitor competitiv si unul necompetitiv.

Influenta temperaturii asupra activitatii enzimatice

Viteza de reactie creste cu cresterea temperaturii, dar in anumite limite. Studiul vitezei initiale a unei reactii enzimatice in functie de temperatura determina aparitia a doua faze distincte care corespund la doua fenomene diferite:

in zona de temperaturi mai mici (0 si 40oC) viteza reactiei creste c=nd temperatura creste. Aceasta crestere a vitezei cu temperatura se explica printr-o crestere a concentratiei complexului activat (intermediar) atunci c=nd se furnizeaza mai multa energie sub forma termica sistemului de reactie.

La o temperatura ce depaseste 45oC se asista la o denaturare a proteinei.

Curba care corespunde temperaturii optime este rezultanta a doua curbe punctate: curba de activare si curba de denaturare. Temperatura optima este cea la care cele doua fenomene se gasesc in echilibru. Ele depind de pH, de forta ionica a mediului si de timpul de reactie, de puritatea enzimei, prezenta activatorilor si inhibitorilor.

Se observa deci ca p=na la o anumita temperatura viteza reactiei creste ating=nd o valoare maxima dupa care scade cu cresterea temperaturii. Temperatura corespunzatoare vitezei maxime de actiune a enzimei reprezinta temperatura optima de actiune. Efectul temperaturii asupra reactiilor enzimatice este exprimat prin coeficientul de temperatura Q10, care reprezinta factorul de crestere a vitezei de reactie enzimatica prin ridicarea temperaturii cu 10oC.

Temperatura optima pentru cele mai multe enzime este de 30oC – 40oC. Temperaturile scazute conserva activitatea enzimatica. Unele enzime cu greutate moleculara mica si a caror stabilitate structurala este realizata prin punti disulfidice, cum sunt ribonucleaza, miokinaza, sunt rezistente la incalzire.

Exista microorganisme termofile care traiesc in apa la 70oC – 80oC si a caror enzime sunt active la aceasta temperatura. La 0oC unele enzime isi inceteaza reversibil activitatea, aceasta temperatura constituind temperatura de conservare pentru unele enzime.

Unele enzime imobilizate pe gel de poliacrilamida, rasini schimbatoare de ioni etc., sunt mai rezistente la caldura. Aceste enzime imobilizate pot fi utilizate in medicina in tratamentul unor boli (galactozemie, ateroscleroza).

Influenta pH-ului

Variatiile de pH pot avea efecte at=t la nivelul enzimei, c=t si la nivelul substratului. Astfel, se poate modifica gradul de ionizare a unor grupari functionale de pe enzima a caror sarcina pozitiva sau negativa este necesara fie formarii complexului enzima-substrat, fie mentinerii conformatiei tridimensionale native a protein-enzimei. De asemenea, la nivelul substratului poate fi modificat gradul de ionizare impiedic=nd sau favoriz=nd formarea complexului enzima-substrat. Valoarea pH-ului la care reactia enzimatica se desfasoara cu viteza maxima se numeste pH optim.

Se observa, din grafic, ca de o parte si de alta a valorii optime a pH-ului viteza de reactie descreste rapid ating=nd valori neglijabile. In cazul ribonucleazei, de exemplu, viteza este foarte mica, cu 0,5 unitati de pH de o parte si de alta a pH optim, ceea ce arata importanta unui mediu de reactie bine tamponat pentru studiul reactiei enzimatice in vitro.

In vivo, variatiile de pH pot influenta actiunea enzimelor. La animalele superioare, de exemplu, pH-ul sanguin este mentinut in limite foarte inguste datorita sistemelor tampon si eliminarii acizilor sau bazelor in exces.

pH-ul optim pentru cele mai multe enzime are valori cuprinse intre 6 – 8. Exceptie fac enzimele digestive, pepsina (pH1,5 – 2), arginaza (pH9,5 – 10).

Variatiile de pH modifica geometria centrului activ si deci activitatea catalitica a enzimei, modific=nd incarcarea electrica a unor grupari departate de acest centru, dar care intervin in mentinerea conformatiei adecvate a lantului polipeptidic.

Potentialul redox al mediului influenteaza starea gruparilor care intra in constitutia enzimelor, ele put=nd fi oxidate sau reduse. Astfel gruparile –SH din dehidrogenaze pot fi modificate prin reactii de tipul:

determin=nd schimbari conformationale ale enzimei si antren=nd modificari ale activitatii enzimatice.

Influenta presiunii si a radiatiilor

Enzimele supuse la presiuni foarte mari (18.000 atm.) isi pierd ireversibil actiunea catalitica.

Acelasi efect il au radiatiile energice : U.V., radiatiile , razele X. Efectul radiatiilor se datoreste in parte oxidarii unor grupari functionale (-SH) din structura enzimelor de catre peroxizii si radicalii liberi de tipul HO—formati din apa sub actiunea radiatiilor cu energie mare.

Influenta efectorilor asupra activitatii enzimelor

Efectorii sunt substante care maresc sau scad actiunea catalitica a enzimelor. Acestia pot fi activatori sau inhibitori.

Activatorii sunt compusi de natura organica sau anorganica care in concentratii mici maresc viteza unei reactii enzimatice atunci c=nd se gasesc in mediul de reactie.

O serie de ioni metalici cum ar fi: K, Cu, Fe, Mg, Mn, Co, Mo au efecte pozitive asupra unor reactii enzimatice.

Fe, Mo, Cu participa in reactiile de oxidoreducere, Mg este necesar in reactiile de transfer ale gruparii fosfat, Ca este necesar in reactiile enzimatice ce intervin in coagularea s=ngelui.

Metalele influenteaza reactiile catalizate enzimatic prin unele mecanisme cum ar fi:

participarea directa a ionului metal in cataliza prin schimbari ale valentei si transportul de electroni in procesele de oxidoreducere (de exemplu Fe in citocromi);

formarea de complexe intre substrat si metal (de exemplu ATP si Mg2 in reactiile de transfer de fosfat);

formarea unor metaloenzime care leaga apoi substratul intr-un complex enzima-metal-substrat;

inducerea unor modificari conformationale a enzimei sub influenta ionului metalic.

Un numar mare de enzime contin un ion metalic, in calitate de cofactor, absolut necesar activitatii catalitice. Alcool dehidrogenaza, anhidraza carbonica, fosfataza alcalina, carboxipeptidaza, contin Zn 2. Arginaza, aminopeptidaza, contin Mn2, fosfokinaza – Mg2, tirozinaza – Cu2, succindehidrogenaza – Fe, xantin oxidaza – Mo2 etc.

In calitate de activatori functioneaza si unele kinaze care permit transformarea unor proenzime in enzime. De exemplu, enterokinaza activeaza transformarea tripsinogenului in enzima activa numita tripsina,; plasmokinaza transforma plasminogenul in plasmina, trombokinaza transforma protrombina in trombina.

In calitate de activatori lucreaza si unele substante reducatoare care au grupari –SH (cisteina, glutationul, marcaptoetanolul) si care blocheaza ionii metalelor grele evit=nd inhibarea gruparilor –SH din aminoacizii protein-enzimei.

Inhibitorii enzimatici sunt compusi care diminueaza sau anihileaza activitatea enzimelor. Ei au compozitie chimica si mod de actiune diferit. Utilizarea unor inhibitori a permis determinarea naturii aminoacizilor din centrul activ si cei care participa la formarea complexului ES. Printre substantele capabile sa se fixeze pe diferite grupari din proteine (hidroxil, sulfhidril, carboxil) si sa determine proprietatile catalitice, fie prin modificarea conformatiei, fie prin blocarea centrului activ al enzimei, se gasesc ionii metalelor grele, sau compusi cum sunt acidul monoiod-acetic sau acidul paraclor mercuri-benzoic care reactioneaza cu gruparile tiol:

(reactie reversibila), sau:

Enz-SH Cl-Hg-C6H4-COOH HCl Enz.-S-Hg-C6H4-COOH

(reactie reversibila prin adaugarea in exces a unei substante reducatoare cum este cisteina).

Astfel, di-izopropilfluorfosfatul care permite fosforilarea restului de serina din centrul activ al diverselor enzime (esteraze si unele enzime proteolitice cum este tripsina) provoaca inactivarea ireversibila a enzimei:

Inhibitorii competitivi sunt compusi care prezinta o analogie structurala cu substratul enzimei si pot intra in competitie cu acesta pentru a se fixa pe situsul activ al enzimei. Enzima se poate combina fie cu substratul, fie cu inhibitorul stabilindu-se echilibrele urmatoare:

Este clar ca enzima angajata in complexul EI nu poate functiona ca un catalizator, numai complexul ES va permite formarea produsilor de reactie.

Inhibitia depinde de concentratia substratului, inhibitorului, de afinitatea enzimei pentru substrat si pentru inhibitor.

Adaugarea unui inhibitor competitiv favorizeaza disocierea complexului ES si cresterea constantei Michaelis. La adaugarea de cantitati mari de substrat inhibitorul este deplasat din centrul catalitic al enzimei, care va fi ocupat de substrat, iar viteza de reactie va avea aceeasi valoare maxima ca si in absenta inhibitorului.

Se observa, din graficul alaturat, ca dreapta corespunzatoare inhibitiei competitive taie axa absciselor intr-un punct 1/K’m care permite calculare valorii K/m.

Inhibitia competitiva exista la toate enzimele. Un analog structural al substratului, nemetabolizabil, este in general un inhibitor competitiv.

De exemplu, succindehidrogenaza, inhibata de diferiti analogi structurali ai acidului succinic:

Actiunea enzimatica este inhibata de acizii:

datorita asemanarii lor structurale cu acidul succinic.

Inhibitia competitiva are numeroase aplicatii practice, in special in terapeutica. Exemplu clasic este cel al sulfamidelor, analogi structurali ai acidului para-aminobenzoic:

Sulfamidele intra in competitie cu acidul p-aminobenzoic si inhiba producerea de acid folic necesar cresterii bacteriilor.

Chimioterapia anticanceroasa face apel la numerosi antimetaboliti, in general analogi structurali ai bazelor purinice sau pirimidinice, permit=nd inhibitia biosintezei acizilor nucleici si blocarea diviziunii celulare.

Alt exemplu de inhibitor competitiv utilizat ca medicament este alopurinolul ce inhiba actiunea xantin-oxidazei care oxideaza xantina la acid uric. Acesta este utilizat in tratamentul gutei, prevenind incarcarea organismului cu acid uric.

Inhibitorii necompetitivi se fixeaza fie pe enzima (dar intr-un situs diferit de situsul activ), fie pe complexul ES pentru a forma un complex ESI, fie pe am=ndoua.

Situsurile active ale enzimei isi pierd capacitatea de a reactiona cu substratul datorita unui fenomen de impiedicare sterica. Gradul de inhibitie depinde de concentratia inhibitorului si de afinitatea enzimei pentru inhibitor. Exemple de inhibitori necompetitivi sunt cianurile, care se combina cu unele metale necesare activitatii enzimei (Fe2, Fe3) cu care formeaza complexe inactive asemanatoare cu fero- sau fericianurile.

Unele metale grele (Hg, Pb, Cu, Ag) sunt inhibitori deoarece se combina cu gruparile –SH ale enzimei form=nd mercaptide:

Enzima-SH Ag Enzima-S-Ag H

Agentii chelatanti de tipul acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA) leaga Mg2 sau Ca2.

Un tip rar de inhibitie este cea data de inhibitori care nu se leaga la enzima libera ci numai la complexul enzima-substrat. Aceasta este o inhibitie necompetitiva. Un astfel de inhibitor micsoreaza in egala masura viteza maxima c=t si valoarea Km, dar raportul dintre Km si v ram=ne acelasi. Un exemplu de inhibitie necompetitiva este cel al inhibitiei citocromoxidazei de catre azida de sodiu.

C=nd in mediul de reactie exista un exces de substrat are loc formarea unui complex ESS care este mai putin activ sau chiar inactiv. Are loc in acest caz o inhibitie prin exces de substrat.

Un exemplu de inhibitie prin exces de substrat este hexokinaza care este inhibata de glucoza-6-fosfat, produsul propriei reactii.

Efectorii alosterici

Activitatea catalitica a enzimelor poate fi alterata si de compusi care se fixeaza pe enzima in locuri indepartate de centrul activ (loc alosteric). Acesti compusi pot creste activitatea catalitica si se numesc efectori pozitivi, sau pot reduce activitatea catalitica si se numesc efectori negativi. Acestia sunt deci modulatori metabolici sau efectori enzimatici.

Enzimele alosterice se deosebesc de alte enzime prin faptul ca au un raspuns atipic al vitezei de reactie in functie de S iar curba obtinuta are o forma sigmoida (in forma de S) ceea ce demonstreaza ca aceste enzime au un efect cooperativ, adica legarea primei molecule de substrat la centrul catalitic al enzimei favorizeaza legarea celei de a doua molecule, marind capacitatea catalitica a enzimei.

O curba asemanatoare se int=lneste la fixarea O2 pe hemoglobina pentru a forma oxihemoglobina.

In figura de mai sus este reprezentata cinetica unei reactii catalizate de o enzima alosterica:

curba 1 – in absenta efectorului

curba 2 – in prezenta activatorului

curba 3 – in prezenta unui inhibitor alosteric.

Enzimele alosterice au o structura cuaternara, oligomera, formate dintr-un numar variabil de monomeri legati prin legaturi necovalente.

In afara situsului catalitic unde se fixeaza substratul, aceste enzime poseda unul sau mai multe situsuri alosterice, care pot fi situate pe acelasi lant polipeptidic unde se afla si centrul activ dar in portiuni (zone) diferite (nu au anologie structurala cu substratul).

Activatorii alosterici se fixeaza la situsul alosteric determin=nd o modificare a conformatiei enzimei, numita tranzitie alosterica, care antreneaza o modificare a conformatiei la nivelul situsului catalitic. Acest situs determina o conformatie mai propice pentru fixarea substratului, cresc=nd afinitatea enzimei pentru substrat (K/m Km). In acest caz se modifica forma curbei care din hiperbolica devine sigmoida.

Schematic, se poate reprezenta tranzitia alosterica cauzata de fixarea activatorului si repercursiunile la nivelul situsului activ conform figurii alaturate.

Daca se studiaza v in functie de S se constata ca curba are totdeauna o forma sigmoida dar cu o diminuare a afinitatii enzimei pentru substrat (K/m Km).

Tranzitia alosterica cauzata de un inhibitor alosteric este redata in figura de mai jos.

Reactiile catalizate de enzime au loc cu viteze anumite determinate de concentratia enzimei, a substratului, pH-ului, temperaturii etc. Aceste reactii nu sunt independente unele de altele, acestea sunt grupate si se succed form=nd cai metabolice care functioneaza simultan si in mod coordonat calitativ si cantitativ.

Zimogenii (proenzime) – sunt secretate in forme inactive, iar prin ruperea unor legaturi peptidice specifice sunt transformati in catalizatori activi, printr-un proces ireversibil. Activarea zimogenilor este un proces catalitic, alteori autocatalitic gener=nd o activare in cascada. Astfel de cascade activatoare sunt int=lnite la digestia proteinelor, coagularea s=ngelui, functionarea sistemului complementului.

Antienzime (antiproteaze)

Unele enzime proteolitice provin din zimogeni prin procese activatoare declansate de anumite semnale. Pentru a bloca, a intrerupe actiunea acestor proteaze este utilizat un mecanism inhibitor la care participa unele proteine reglatoare denumite antiproteaze (antienzime). Proteina antienzima se leaga prin forte necovalente la enzima, bloc=ndu-i centrul activ. Mai cunoscuta este o familie de antienzime care blocheaza actiunea unor proteaze care cuprind resturi de serina in centrul activ si sunt denumite serpine. Din aceasta familie fac parte inhibitorul pancreatic al tripsinei, antitrombina, 1-antitripsina, 2-macroglobulina.

Inhibitorul pancreatic al tripsinei este o proteina mica care se leaga foarte str=ns la tripsina prevenind astfel activarea prematura a cascadei de enzime proteolitice.

Antitrombina este prezenta in plasma, inactiveaza trombina si alti factori ai coagularii (XIIa, XIa, IXa si Xa) intrerup=nd cascada de coagulare.

1-antitripsina (1-antiproteaza) este componentul principal al fractiunii 1-globulinice, functioneaza ca inhibitor al unor proteaze prin legarea ireversibila la centrul activ al enzimei tinta.

1-antiproteaza difuzeaza din plasma in spatiul interstitial unde isi exercita functia antiproteazica.

Rolul fiziologic este de blocare a actiunii elastazei eliberata de neutrofilele activate intr-un focar infectios, inflamator. In centrul focarului, elastaza isi exercita actiunea proteolitica deoarece 1-antiproteaza a fost inactivata. Neutrofilele activate produc si secreta oxidanti puternici care ataca restul metionina-358 din 1-antiproteaza, grupare esentiala pentru actiunea sa. Restul metionina-358 este oxidat la sulfoxid:

Complexe multienzimatice

Cresterea eficientei globale a unui proces care implica parcurgerea unui sir mai lung de reactii se realizeaza prin asamblarea diverselor proteine catalitice intr-un complex multienzimatic sau prin localizarea fiecarei activitati catalitice pe un domeniu structural al unei proteine mari, rezult=nd o enzima multifunctionala.

Integrarea structurala a mai multor enzime intr-o unitate functionala face posibila cataliza coordonata a unei succesiuni de reactii.

Intermediarii de reactie trec pe r=nd de la un centru activ la altul, nu are loc difuzia si diluarea lor in mediu. Pentru o enzima multifunctionala, codificata de o singura gena, sinteza proteica asigura si raportul optim cantitativ intre diversele activitati catalitice.

Ca exemple de enzime multifunctonale amintim: piruvat-dehidrogenaza, – cetoglutarat dehidrogenaza, acid gras sintetaza.

Diversele activitati catalitice sunt localizate pe acelasi lant polipeptidic organizat in mai multe domenii structurale.

Distributia intracelulara a enzimelor.

Separarea organitelor celulare prin ultracentrifugare urmata de identificarea cu ajutorul tehnicilor histochimice si biochimice a permis elaborarea unui tablou al distributiei intracelulare a enzimelor.

Orice celula specializata dispune numai de enzime care catalizeaza reactii in celula data.

Unele enzime cum sunt cele implicate in biosinteza proteinelor si a acizilor nucleici, glicoliza, ciclul Krebs etc. se afla in toate tipurile de celule specializate. Fara functionarea acestor cai nici un tip de celule nu poate exista.

Pe de alta parte, fiecare tip de celula specializata dispune de seturi de enzime care catalizeaza reactii din caile metabolice particulare. Asa sunt enzimele din sinteza ureei care se afla numai in ficat, creatinkinaza care se afla aproape in totalitate in muschi, enzimele implicate in biosinteza hormonilor tiroidieni sunt localizate numai in tiroida etc.

Intr-o celula data, locul unde se afla unele enzime coincide cu locul de desfasurare a unei cai metabolice sau a unei secvente metabolice din care face parte reactia pe care o catalizeaza. Astfel, glicoliza se desfasoara numai in citoplasma, deci toate enzimele glicolizei sunt in citoplasma. Biosinteza ureei are loc in mitocondria hepatica si in citoplasma, astfel ca unele enzime a acestei cai metabolice sunt citoplasmatice, altele mitocondriale. Enzimele implicate in sinteza ARN-ului sunt localizate in nucleul celular care este sediul sintezei. Unele enzime au localizare dubla: izocitric dehidrogenaza, glutamic-oxal-acetic transaminaza, pot fi at=t mitocondriale c=t si citoplasmatice. Multe enzime sunt legate de membrana celulara sau sunt incluse in aceasta membrana, cu localizare spre citoplasma sau spre exterior. In cazul mitocondriilor, enzimele pot fi legate de membrana interna, de membrana externa sau se gasesc in matricea mitocondriala.

In plasma se afla un numar foarte mare de enzime functionale (cele implicate in coagulare si fibrinoliza, pseudocolinesteraza, lipoprotein lipaza) si nefunctionale a caror activitate se determina in relatie cu bolile de metabolism (glucidic, lipidic si protidic). Aceste enzime nefunctionale au o provenienta multipla (hepatica, cardiaca, musculara, renala, osoasa).

Unele enzime sunt considerate markeri pentru anumite organite.

Astfel:

glutamic dehidrogenaza este marker pentru mitocondrie,

glucoza-6-fosfataza pentru reticulul endoplasmic,

fosfataza acida pentru lizozomi,

Na/K-ATP-aza si 5’ nucleotidaza pentru membrana plasmatica,

catalaza, acid uric oxidaza pentru peroxizomi,

galactozil transferaza pentru aparatul Golgi, iar

lactat dehidrogenaza pentru citoplasma.

Enzime imobilizate

Enzimele imobilizate sunt importante din punct de vedre teoretic pentru modelarea membranelor biologice naturale c=t si din punct de vedre practic datorita duratei de viata prelungita. Au aplicatii in cromatografia de afinitate, in terapie si in tehnologia industriala ca agenti biologici. Ca aplicatii terapeutice, importante sunt protezele interne enzimatice (prin implantarea permanenta a unei enzime imobilizate) pentru tratamentul erorilor enzimatice innascute si membranele de oxigenare utilizate in dializa renala (purtatoare de catalaza si anhidraza carbonica).

Un sistem important pentru terapie este si cel reprezentat de lizozomi, in care se includ enzime lizozomale pentru tratamentul substitutiv in tezaurismozele sfingolipidozice. Enzimele se includ in membrane lipidice artificiale sau in membrane de eritrocit.

O trasatura caracteristica, importanta pentru aplicatiile practice si care decurge din imobilizare, este aceea ca cinetica acestor sisteme se indeparteaza de legile cineticii in sistem omogen si se apropie mai mult de cinetica enzimelor alosterice care prezinta interactii cooperative. Factorul important care determina cinetica reactiei in interiorul structurii enzima-suport este difuzia speciilor moleculare.

Imobilizarea mareste durata de viata a enzimelor si micsoreaza probabilitatea de distrugere ireversibila sau a denaturarii termice, scaz=nd capacitatea de autoliza.

Prepararea sistemelor de enzime imobilizate se realizeaza prin:

– absorbtia pe suport inert (sticla, colodiu, nylon) sau pe rasini schimbatoare (carboxi-metil-celuloza, DEAE celuloza, sefaroza activata cu bromura de cianogen), suporturi derivati de polistiren, peptide artificiale, polimeri micsti de polilizina si anhidrida maleica, siliconi;

– legarea incrucisata covalenta a protein-enzimei de un suport insolubil in apa prin grupari functionale neesentiale pentru activitatea sa biologica;

– incluzia in geluri reticulate de sefadex sau poliacrilamida;

– legarea incrucisata covalenta a protein-enzimei prin intermediul unui reactiv bifunctional de tipul aldehidei glutarice.

Aceasta conditie creata in mod artificial se apropie de cea naturala a sistemelor enzimatice incluse ca unitati structurale si functionale in membranele biologice.

CAPITOLUL V

HIDRATII DE CARBON

Hidratii de carbon, zaharidele sau glucidele sunt substante organice naturale rasp=ndite in regnul animal c=t si in cel vegetal, in stare libera sau sub forma de polimeri

Glucidele au functii biologice fundamentale:

functie nucleara (sub forma de pentoze intra in structura acizilor nucleici);

functie de sustinere (prin tesutul conjunctiv in a carui compozitie participa in cantitati mari mucopolizaharidele);

functie nervoasa (prin participarea cerebrozidelor in a caror compozitie intra glucoza, galactoza sau oligozide);

functia de detoxifiere (prin acidul glucuronic);

rol functional in calitate de componente a unor hormoni, anticorpi;

rol energetic.

Din punct de vedere al structurii chimice, glucidele sunt aldehide sau cetone ale polialcoolilor, sau produsii lor de condensare. Au formula empirica Cn(H2O)n.

In functie de structura si proprietati, glucidele se impart in oze si ozide.

Ozele sau monozaharidele nu pot fi hidrolizate in molecule mici. Acestea pot fi: aldoze si cetoze.

Ozidele, prin hidroliza pun in libertate una sau mai multe molecule de oze. Unele ozide pot pune in libertate, in plus, si un compus de natura neglucidica. Ozidele care prin hidroliza elibereaza numai produsi de natura glucidica se numesc holozide. In functie de numarul ozelor din molecula, holozidele se impart in: oligozide (cu 2……. 6 oze) si poliholozide (cu 6…….n oze). Ozidele care prin hidroliza elibereaza, in afara de oze, si alte substante de natura neglucidica se numesc heterozide (glucozide).

Ozele sau monozaharidele contin o functie carbonilica de tip semialdehidic sau semicetonic, alaturi de functii alcoolice primare si secundare. Dupa numarul atomilor de carbon pot fi trioze, tetroze, pentoze, hexoze, heptoze etc.

O serie de anomalii in comportarea functiei aldehidice ( ) a ozelor a determinat pe Colley (1870) si Tollens (1882) sa propuna o formula ciclica a monozaharidelor care sa scoata in evidenta adevaratele proprietati ale acestor glucide. Formularea a fost admisa de Fischer (1912) iar natura spatiala a structurii a fost stabilita de W.M.Haworth (1926). Cercetarile au dovedit ca structura ciclica prin aparitia unui nou atom de carbon asimetric poate sa apara sub forma a doi izomeri: unul cu puntea semiacetalica intre C1 si C5, de tip piranic, al doilea cu legatura semiacetalica intre C1 si C4, de tip furanic.

Un exemplu il constituie structura si-D-glucopiranozei si a -D-fructofuranozei.

Pentru -D-fructoza structura, mai des folosita, este cea furanizica:

Inelul piranozic poate exista in doua conformatii: forma scaun si forma baie.

Forma scaun a inelului piranozic este mult mai stabila predomin=nd in solutiile hexozelor.

Structura conformationala (forma scaun) a -D si-D-glucopiranozei este redata astfel:

Intre formele particulare ciclice si formele carbonilice adevarate exista un echilibru, singur in masura sa explice comportarea ozelor in unele din reactiile care au dus la confirmarea structurii lor.

Diferite tipuri de oze

Ozele se pot diviza in patru categorii: oze neutre, ozamine, acizi uronici si acizi sialici (neuraminici).

Ozele neutre sunt reprezentate de D-glucoza, D-galactoza, D-manoza, D-xiloza etc. Acestea au in molecula o singura grupare carboxilica (de tip aldehidic sau cetonic) si functii de alcool (primar, secundar).

Din aceasta grupa mai fac parte unele oze care au pierdut unul sau doi atomi de oxigen. Este exemplul 6-dezoxihexozei care poate fi considerata, fie ca o aldohexoza a carei grupare –CH2OH terminala a fost inlocuita cu o grupare –CH3, fie ca o aldopentoza a carei atom de hidrogen de la C5 a fost inlocuit printr-o grupare –CH3. Este exemplul -L-ramnozei (6-dezoxi-L-manoza), -L-fucozei (6-dezoxi–L-galactoza).

Acesti doi compusi sunt componente importante ale peretelui celular bacterian.

Importanta deosebita prezinta 2-dezoxi-D-riboza, o pentoza care deriva din D-riboza prin inlocuirea gruparii hidroxil de la C2 printr-un atom de hidrogen:

Aceasta pentoza intra in structura acizilor dezoxiribonucleici.

Ozaminele sunt derivati ai ozelor la care gruparea hidroxil de la C2 a fost substituita printr-o functie amino (-NH2), frecvent acetilata. Importante sunt patru hexozamine reprezentate de: galactozamina, manozamina, glucozamina, acid muramic:

D-galactozamina este componenta glicolipidelor si a polizaharidelor din cartilagii (condroitin-sulfatul).

D-glucozamina este prezenta in multe din polizaharidele tesuturilor de vertebrate si este componentul major al chitinei, un polizaharid structural al tegumentelor exterioare ale insectelor si crustaceelor.

Acidul N-acetil muramic este elementul major din structura peretelui celular bacterian si se afla legat cu N-acetil-glucozamina. Legatura intre acesti doi compusi poate fi usor desfacuta de lizozim, o enzima prezenta in gura si cavitatea nazala care constituie un mecanism de aparare nespecific.

Acizii uronici sunt derivati ai aldozelor in care functia de alcool primar este oxidata la functie carboxilica, cu conservarea functiei aldehidice.

Mai rasp=ndit este acidul D-glucuronic. Participa la procesele de detoxifiere prin care unii compusi sunt eliminati, sub forma conjugata, din organism. Se formeaza prin conversiunea D-glucozei.

Din acidul glucuronic deriva acidul L-iduronic, D-galacturonic.

Acizii sialici sunt constituienti ai glicoproteinelor si glicolipidelor din invelisul celular si membranele tesuturilor animale. Sunt derivati ai acidului neuraminic rezultati prin condensarea unei molecule de D-manozamina cu acidul piruvic.

Derivatii acidului neuraminic sunt numiti acizi sialici. Acizii sialici sunt distribuiti in toate tesuturile. Cei din tesuturile umane contin o grupare N-acetil, iar cei din celelalte specii contin o grupare N-glicozil.

Unii compusi, precum acidul L-ascorbic, L-sorbitolul, D-manitolul, glicerolul, mioinozitolul sunt derivati ai ozelor.

Proprietatile generale ale ozelor

Ozele sunt compusi optic activi datorita prezentei atomilor de carbon asimetrici. Sunt foarte solubile in apa, putin solubile in alcool si prezinta o solubilitate aproape nula in solventi organici apolari, hidrocarburi, cloroform. Sunt substante cristalizate, incolore, cu gust dulce.

Proprietatile chimice sunt determinate de prezenta gruparilor functionale caracteristice. Prezenta gruparii semialdehidice la unele oze confera acestora putere reducatoare. In solutie apoasa ozele reduc sarurile metalelor grele: Cu, Hg, Ag, in mediu alcalin, la cald, cu obtinerea unui precipitat de metal sau oxid inferior, in functie de substanta folosita.

R-CHO 2 Ag(NH3)2 2 OH– RCOO– 2 Ag 3 NH3 NH4 H2O

sau R-CHO 2 Cu2 5 OH– RCOO– Cu2O 3 H2O

Reactivii cei mai folositi sunt Fehling, Tollens.

Reactiile sunt folosite pentru recunoasterea puterii reducatoare a glucidelor si pentru dozarea lor.

Ozele pot fi esterificate la functia de alcool primar (se obtine de exemplu glucoza-6-fosfat, fructoza-1-fosfat, fructoza-6-fosfat, gliceraldehid-3-fosfat etc.) sau la functia semiacetalica (exemplu glucoza-1-fosfat), sau poate fi esterificata si functia semiacetalica si cea de alcool primar (exemplu: 5 fosforibozil-1-pirofosfat).

In prezenta unor agenti alcalini si sulfat sau iodura de metil, gruparile hidroxil libere pot fi inlocuite cu grupari metoxi (OCH3). Metilarea se foloseste pentru determinarea pozitiei puntii de oxigen din structura moleculei sau a locului in care se face legatura ozidica in structurile poliozidice.

Cu alcoolii, aldozele sau cetozele, in prezenta de acid clorhidric, formeaza si heterozide:

Heterozidele sunt hidrolizate de enzime specifice numite sau -glucozidaze.

Cu acizii concentrati si la cald, aldozele si cetozele dau nastere la furfural (in cazul pentozelor), la hidroximetilfurfural (in cazul hexozelor) sau la acid furoic (in cazul acizilor uronici).

Cei doi compusi, in prezenta unor derivati fenolici (rezorcina, orcina) dau derivati de condensare colorati, cu care se pot identifica diferite cetoze, pentoze, metilpentoze si se pot diferentia aldozele de cetoze.

Actiunea fenilhidrazinei in exces, la cald, se finalizeaza prin formarea unor osazone caracteristice pentru fiecare tip de glucid.

Global, se prezinta astfel:

Reactia de reducere a zaharidelor consta in formarea de alcooli polihidroxilici. Astfel din glucoza se obtine sorbitol iar din manoza se obtine manitol. Doi polioli sunt importanti din punct de vedre biologic, care exista in stare naturala si anume glicerolul (component a numeroase lipide) si inozitolul (intra in structura fosfatidil-inozidelor).

Oxidarea aldozelor se poate efectua cu oxidanti mai energici (HNO3 concentrat) sau oxidarea se poate efectua cu protejarea gruparii carbonil c=nd se obtin acizi uronici cu importanta biologica in detoxifierea organismului.

Epimerizarea ozelor

Se numesc epimeri doua substante care nu difera dec=t prin conformatia spatiala a unui singur centru de asimetrie moleculara, intr-o molecula care contine mai multi centri asimetrici. Sunt epimeri D-glucoza si D-galactoza, in raport cu atomul de carbon 4, iar D-glucoza si D-manoza in raport cu atomul de carbon 2;

Trecerea unui epimer in altul (epimerizare) se poate practic realiza pe cale chimica sau enzimatica.

Ozidele sunt glucide care, prin hidroliza acida sau bazica, genereaza una sau mai multe oze. Acestea cuprind: holozide, care contin numai molecule de oze si heterozide care se desfac, prin hidroliza, in oze si o componenta neglucidica (numita aglicon).

Holozidele mai studiate sunt diholozidele, triholozidele, poliholozidele.

Diholozidele naturale pot fi reducatoare (c=nd functia semi-acetalica a unei oze este angajata intr-o legatura ozidica cu hidroxilul alcoolic a celei de a doua oze) si nereducatoare (c=nd cele doua oze sunt legate prin cele doua functii semiacetalice).

Dintre diholozidele reducatoare fac parte maltoza formata din doua molecule de -D-glucoza unite -1,4 glicozidic), lactoza (rezultata prin unirea unei molecule de D-galactoza angajata prin functie semiacetalica si o molecula de D-glucoza angajata prin hidroxilul din pozitia 4) si trehaloza rasp=ndita in ciuperci si formata din doua molecule de -glucoza unite -1 glicozidic:

Trehaloza

Dintre holozidele nereducatoare, mai rasp=ndita este zaharoza formata prin unirea unei molecule de D-glucoza, cu o molecula de D-fructoza, ambele angajate prin functiile lor semiacetalice in legatura ozidica.

Dintre triholozide, mai rasp=ndita este rafinoza, obtinuta din sfecla de zahar si care contine glucoza, galactoza si fructoza. Este un triholozid nereducator.

Laptele de femeie este bogat in oligozide derivate din lactoza, unele av=nd un rol fiziologic important favoriz=nd activitatea florei intestinale a sugarului. Laptele contine oligozide cu acizi sialici.

Poliholozidele sau polizaharidele sunt formate dintr-un numar mare de oze, fie identice (homopoliozide), fie de tipuri diferite (heteropoliozide).

Homopoliozidele (glucozani, poliozide homogene) sunt formate numai din unitati de glucoza. Din aceasta categorie face parte amidonul cu cei doi constituienti (amiloza, amilopectina), glicogenul, celuloza, dextranii, chitina.

Amidonul este polizaharidul de rezerva din vegetale. Contine aproximativ 20% amiloza si 80% amilopectina. Sursa principala din care se obtine amidon este reprezentata de tuberculi, cartofi, boabe de gr=u, porumb. Este o macromolecula formata din unitati de -glucoza legate 14 si 16 glicozidice. Amidonul da solutii coloidale iar in lumina polarizata reprezinta caracterul de birefringenta. Cu iodul da o culoare albastra.

Glicogenul, polizaharidul de rezerva din organismele umane, are o structura asemanatoare amilopectinei dar mult mai ramificata. Cu iodul da o culoare brun-roscata.

Detranii sunt poliozide formate din unitati de glucoza legate 1-6 glicozidic. Se gasesc la diferite bacterii. Sunt utilizati pentru cromatografie pe gel sau unii sunt utilizati in terapeutica ca inlocuitori ai plasmei sanguine.

Chitina este polimer de N-acetilglucozamina a carei molecule sunt unite prin legaturi -1,4. Asociata cu saruri minerale si cu proteine constituie exoscheletul artropodelor.

Arabanii insotesc de foarte multe ori materiile pectice int=lnite in peretii celulelor, in pulpa si invelisul fructelor.

Xilanii se gasesc in lignina vegetalelor si sunt formati din unitati de xilopiranoza.

Fructozanii, cum este inulina formata din unitati de fructofuranoza, se gasesc in tuberculii unor plante. Inulina este utilizata in explorarile functionale ale rinichiului.

Heteropoliozidele elibereaza prin hidroliza monozaharide neutre, acizi uronici, ozamine, acizi sialici..

Acesti polimeri, liniari sau ramificati, se gasesc in peretele citoplasmatic al bacteriilor si in capsula. Sunt substante care deternina specificitatea diferitelor tipuri de bacterii. La bacterii, aceste poliozide asigura rigiditatea si soliditatea germenului.

La animale, poliozidele se int=lnesc ca mucopolizaharide de structura, iar in s=nge sub forma de mucopolizaharide de secretie.

Mucopolizaharidele de structura se gasesc in tesutul conjunctiv sub forma unor molecule simple de tipul acidului hialuronic si al condroitinei.

Acidul hialuronic a fost izolat si identificat din cordonul ombilical uman, s=nge, lichid sinovial, piele. In structura lui intra acidul glucuronic si o molecula de N-acetil glucozamina:

Acidul hialuronic are o functie importanta de a fixa usor moleculele de apa in spatiile intracelulare ale tesutului conjunctiv. Hialuronidaza depolimerizeaza lantul lung al acidului hialuronic si functioneaza ca un factor de difuziune permit=nd patrunderea mai usoara in organism a unor produsi straini.

Condroitina are structura asemanatoare cu a acidului hialuronic fiind formata din acid glucuronic si o molecula de N-acetil galactozamina:

O categorie de mucopolizaharide str=ns legate de colagen o constituie acizii condroitin sulfurici. Au rol de sustinere in perioada elaborarii structurii fibrilare a colagenului, iar prin capacitatea lor de a fixa ioni de Ca2 participa la procesul de osificare. Concentratia acestora in tesuturi scade cu v=rsta.

Mucopolizaharidele de secretie sunt reprezentate de heparina si acizii heparin sulfurici.

Heparina este secretata de mastocite, are proprietati anticoagulante si este un activator al lipoprotein lipazei. Este formata prin condensarea unei molecule de acid glucuronic cu o molecula de glucozamina dublu sulfatata:

In tesuturi, se gaseste combinata cu proteinele si lipoproteinele.

Acizii mucoitin sulfurici au fost izolati din mucusul secretat din glandele tubului digestiv si ale aparatului respirator. Au structura asemanatoare cu acizii condroitin sulfurici in care hexozamina o reprezinta N-acetil-glucozamina esterificata in pozitia 4 si 6 cu acid sulfuric. Mucinele imprima v=scozitatea solutiilor. Aceasta poate dispare prin actiunea unei sialidaze (neuraminidaze).

Glicoproteinele sunt complexe glucido-proteice in care glucidele au structura liniara, ramificata sau neramificata. Componenta oligozaharidica imprima glicoproteinelor functii extracelulare specifice, stabilitate, localizare.

Legatura intre componenta oligozaharidica si proteina corespunzatoare se realizeaza prin legaturi de tip N-glicozilaminica si O-glicozidica.

Legatura N-glicozilaminica se realizeaza intre functia reducatoare a N-acetil glucozaminei cu functia amidica a asparaginei:

In mureina din peretii bacteriilor, legatura se realizeaza prin condensarea gruparii carboxil a acidului N-acetil muramic cu functia amino a alaninei:

Legatura O-glicozidica, caracteristica O-glicozil proteinelor se realizeaza intre functia reducatoare terminala a unui glican (in general a N-acetil-galactozaminei) cu hidroxilul provenit de la serina sau treonina:

Glicoproteinele sunt rasp=ndite in tesuturile animale si vegetale, in microorganisme si virusuri.

Lichidele biologice (saliva, urina, bila, lapte, s=nge) sunt foarte bogate in glicoproteine.

Anticorpii, proteinele plasmatice (transferina, ceruloplasmina, haptoglobinele, protrombina si fibrinogenul) sunt glicoproteine.

Proteinele de grup sanguin contin lanturi oligozaharidice laterale formate din resturi de L-fucoza, D-galactoza, N-acetil galactozamina, N-acetil glucozamina. Aceste lanturi determina specificitatea de grup sanguin.

CAPITOLUL VI

LANTUL RESPIRATOR SI FOSFORILAREA OXIDATIV

Lantul respirator reprezinta ansamblul enzimelor si sistemelor redox care participa la transferul echivalentilor reducatori (atomi de hidrogen sau electroni) de la coenzimele reduse p=na la oxigen. Reprezinta etapa finala a oxidarilor biologice in care atomii de hidrogen ai substratelor energetice, care au fost labilizati prin reactii de dehidrogenare, se combina cu oxigenul molecular:

H ½ O2 H2O

Aceasta interactiune a hidrogenului cu oxigenul are loc in etape succesive prin care atomii de hidrogen, sau numai electronii acestora, sunt transportati pe sisteme redox cu afinitati cresc=nde pentru echivalentii reducatori ca in final acestia sa fie acceptati de molecula de oxigen.

Componentii lantului respirator, sistemele redox si alti factori auxiliari sunt localizati in membrana interna mitocondriala intr-o ordine corespunzatoare descresterii potentialului redox negativ. Numarul de mitocondrii per celula este functie de intensitatea metabolismului oxidativ aerob proprie fiecarui tesut. Tesuturi bogate in mitocondrii sunt ficatul, miocardul, cortexul renal. Membrana externa este neteda pe c=nd membrana interna prezinta numeroase pliuri care ii maresc foarte mult suprafata. Spatiul delimitat de membrana interna este denumit spatiu matricial (matrix). Cele doua membrane delimiteaza un spatiu intermembranar.

Membrana interna si externa au compozitii si functii diferite.

Membrana externa are o compozitie lipidica asemanatoare cu cea a altor membrane. Cuprinde aproximativ 50% proteine, este permeabila pentru ioni si molecule mici, cu pori, canale strabatute de diverse molecule.

Membrana interna are un continut foarte ridicat in proteine (80%). Compozitia lipidica este particulara contin=nd o proportie mare de cardiolipine. Nu cuprinde colesterol.

Lantul respirator si fosforilarea oxidativa sunt localizate in membrana interna mitocondriala. Aceasta constituie o bariera de permebilitate pentru multi compusi care participa la metabolismul oxidativ mitocondrial. In afara de CO2 si O2 care strabat liber, prin difuzie, aceasta membrana, alti compusi (ADP, ATP, Pi, H, HO–, metaboliti intermediari, aminoacizi, coenzime) nu pot traversa liber aceasta membrana. Translocarea acestor compusi intre matrix si compartimentul exterior implica participarea unor sisteme transportoare.

Transportul echivalentilor reducatori

Cea mai mare parte a reactiilor generatoare de coenzime reduse se desfasoara in mitocondrii, in vecinatatea imediata a lantului respirator. Piruvat dehidrogenaza, ciclul Krebs, -oxidarea acizilor grasi sunt localizate in matrixul mitocondrial si alimenteaza direct lantul respirator. Dar, glicoliza (degradarea glucozei la piruvat) genereaza NADH in citosol.

Membrana interna este impermeabila at=t pentru NADH c=t si pentru NAD . atomii de hidrogen din NADH sunt translocati din citosol in matrix cu ajutorul “navetei malat-aspartat”:

Bilantul net al functionarii navetei:

(NADH.H)citosolic (NADH.H)mitocondrial

Nucleotidele cu ADN si ATP sunt participanti directi la fosforilarea oxidativa. Patrunderea in matrix a ADP este corelata cu iesirea ATP, schimbul dintre acestea este asociat cu deplasarea unui proton din matrix in compartimentul exterior.

Lantul respirator este alcatuit din ansambluri multienzimatice a caror activitate este conditionata de succesiunea lor stricta in membrana mitocondriala

sau sub forma simplificata, cuplurile redox pot fi reprezentate astfel:

Substratul de baza este NADH care provine in urma oxidarii diferitelor substrate: -OH butirat, -OH acil-CoA, glutamat, malat, izocitrat, piruvat, -cetoglutarat. Oxidarea NADH de catre coenzima Q este catalizata de un complex de proteine NADH-dehidrogenaza (simbolizate Fp1). Unele substrate sunt legate de lantul respirator prin intermediul flavoprotein dehidrogenazelor (FAD, succinat, glicerol-3-fosfat) la coenzima Q.

De la nivelul coenzimei Q protonii trec in solutie, iar electronii sunt transferati sistemului citocromic. Coenzima Q (ubichinona) este un compus lipidic, cu o molecula mica, solubila in stratul lipidic al membranei mitocondriale, si se deplaseaza usor. CoQ formeaza chinone relativ stabile capabile sa accepte un electron transform=ndu-se in semichinona sau in chinol:

Coenzima Q constituie o adevarata placa turnanta a lantului respirator.

Citocromii sunt hemoproteine transportoare de electroni prin schimbarea starii de oxidare a Fe2 la Fe3 :

Mitocondriile cuprind citocromii a, a3, b, c si c1. Citocromii difera intre ei prin natura hemului, natura lantului polipeptidic si a modului de asociere dintre hem si proteina.

Citocromul c difera de hemul din hemoglobina sau mioglobina prin legarea covalenta la resturile vinil din pozitiile 2 si 4 cu doua resturi cys (cys 14 si cys 17) din lantul polipeptidic.

Citocromul c

Citocromii de tip a (a si a3) au in pozitia 8 gruparea –CHO iar la restul vinil este atasata o catena izoprenica cu 15 atomi de carbon.

Proteinele cu Fe-Sulf sunt componenti oxidoreducatori mitocondriali la care fierul nu face parte din structura hemului.

Componentii lantului respirator, cu exceptia citocromului c si a coenzimei Q, sunt oragnizati in “complexe respiratorii”, entitati de sine statatoare.

Un complex respirator primeste echivalenti reducatori de la un donator din afara si ii cedeaza unui acceptor extern. Legatura functionala intre complexe este asigurata de coenzima Q si de citocromul c care difuzeaza liber in membrana.

Lantul respirator cuprinde patru complexe:

Complexul I (NADH-CoQ reductaza) catalizeaza oxidarea NADH si reduce coenzima Q. Procesul global este:

NADH.H CoQ NAD CoQH2

Este cunoscut sub numele de complexul NADH dehidrogenazic.

Complexul II (succinat-CoQ reductaza) primeste doi atomi de hidrogen de la succinat care ajung pe coenzima Q:

succinat CoQ fumarat CoQH2

Este numit complexul succinat dehidrogenazic.

Complexul III (CoQH2-citocrom c reductaza) primeste atomi de hidrogen de la coenzima QH2 si elibereaza electroni care reduc citocromul c extern:

CoQH2 2 cit.c (Fe3) CoQ 2 cit.c (Fe2) 2 H

Complexul IV (citocrom c oxidaza) primeste electroni de la citocromul c redus si dupa trecerea lor prin citocromii a si a3 si ionii de cupru, reduc oxigenul cu formarea moleculei de apa:

4 cit.c (Fe2) O2 4 cit.c (Fe3) 2 O2—

2 O2— 4 H 2 H2O

NADH si succinatul alimenteaza lantul respirator cu echivalenti reducatori la nivelul complexelor I si II. Alte dehidrogenaze cu FMN sau FAD care nu fac parte din complexele respiratorii alimenteaza lantul cu echivalenti reducatori (glicerol fosfat dehidrogenaza, acil-CoA dehidrogenaza, succinat dehidrogenaza).

Formarea unei molecule de apa in lantul respirator asigura eliberarea unei energii echivalenta cu aproximativ 52 Kcal:

Global: NADH.H ½ O2 NAD H2O H -52 Kcal

Energia eliberata partial se pierde sub forma de caldura sau o parte se inmagazineaza temporar in legaturile macroergice ale ATP, care este utilizata in functie de necesitatile energetice ale celulei.

Fosforilarea oxidativa este procesul de sinteza a ATP din ADP si fosfat anorganic cuplat cu lantul respirator.

ADP Pa energie libera ATP H2O

Capacitatea de fosforilare se apreciaza prin c=tul de fosforilare , P/O, care corespunde numarului de moli de fosfat anorganic ce trec din stare minerala in ATP pentru un atom de oxigen consumat.

Pentru NADH raportul P/O 3 iar pentru coenzimele FMNH2 sau FADH2, sau pentru metaboliti care furnizeaza atomi de hidrogen acestor coenzime, raportul P/O 2.

Sinteza de ATP in mitocondrii este catalizata de o enzima oligomera numita ATP sintetaza. Aceasta are capacitatea de a utiliza energia libera mobilizata in lantul respirator pentru sinteza de ATP. Asupra mecanismului fosforilarii oxidative s-au emis mai multe ipoteze: ipoteza cuplarii chimice, conformationala si ipoteza cuplarii chemiosmotice. Cea mai larg acceptata este teoria cuplarii chemiosmotice a lui P.Mitchell (1961) potrivit careia energia proceselor oxidative este conservata sub forma unui potential electrochimic transversal membranei interne mitocondriale. Rezultatul procesului este realizarea unui gradient de concentratie protonica intre cele doua fete ale membranei interne, gradient dublat de un potential electric datorita distributiei inegale a sarcinilor pe cele doua fete ale membranei. Acest potential electrochimic este utilizat de ATP sintetaza pentru sinteza de ATP.

Regiunea transmembranara functioneaza ca un canal protonic prin care curg protonii in sensul gradientului electrochimic, din exterior in spatiul matriceal, energia mobilizata permit=nd legarea fosforului anorganic la ADP cu sinteza de ATP.

Au fost identificate in lantul respirator trei locuri furnizoare de energie pentru fosforilare: un loc situat intre NAD si coenzima Q, altul intre citocromul b si c si al treilea intre citocromul a si oxigen:

Sinteza de ATP in toate cele trei puncte de fosforilare este un proces enzimatic.

Multi compusi chimici, naturali sau sintetici, au calitatea de a decupla lantul respirator de fosforilarea oxidativa si anuleaza total sau partial gradientul protonic. Unul din primii compusi recunoscuti ca decuplant al respiratiei de fosforilare este 2,4 dinitro-fenolul.

Inhibitorii lantului respirator impiedica fluxul de electroni si translocarea de protoni care in consecinta inhiba consumul de oxigen.

Alti inhibitori, precum oligomicina, inhiba ATP-aza care transloca protoni sau consumul de ADP.

Unele substante cu caracter lipofil leaga specific cationii stimul=nd transportul lor prin membrane. Este exemplul valinomicinei care fosforileaza transportul K in afara mitocondriei. Asemenea substante se numesc ionofori.

Citocromii au si alte localizari in afara lantului respirator mitocondrial.

Astfel citocromul b5 si citocromul P450 sunt amplasati in reticulul endoplasmatic si sunt componente ale lantului transportor de electroni microzomial, nefosforilant. Acesti citocromi sunt implicati in metabolizarea unor compusi endogeni, xenobiotice, inclusiv medicamentele.

Citocromul P450 este o hemoproteina terminala a catenei respiratorii microzomiale nefosforilante cu rol de monooxigenaza cu functie mixta. Catalizeaza introducerea unui atom de oxigen in diferiti compusi, celalalt atom de oxigen fiind redus la H2O. Monooxigenazele functioneaza cuplat cu un sistem redox care furnizeaza doi electroni:

Functia oxigenata primara este cel mai adesea gruparea –OH, dar produsul oxigenat poate avea si alta structura: epoxid, aldehida, sulf-oxid, N-oxid etc.

Toate monooxidazele utilizeaza ioni metalici (fier, cupru), care participa la ciclul catalitic, ca transportori intermediari de electroni.

Prolil- si lizil- hidroxilaza actioneaza asupra procolagenului transform=nd resturi prolil- si lizil- in derivatii lor hidroxilati:

Alte monooxigenaze utilizeaza drept coenzima tetrahidrobiopterina, inrudita structural cu acidul folic.

Reactii de hidroxilare dependente de tetrahidrobiopterina sunt hidroxilarea fenilalaninei la tirozina, a tirozinei la DOPA, a triptofanului la 5-hidroxitriptofan.

Hidroxilazele citocrom P450 dependente utilizeaza ca sursa imediata de electroni NADPH:

Ciclul catalitic in care activeaza citocromul P450 si care transforma un compus SH in derivatul sau hidroxilat S-OH este urmatorul:

Cei doi electroni furnizati de NADPH sunt transferati spre citocrom astfel: primul electron permite legarea oxigenului si formarea radicalului superoxid, iar al doilea electron reduce mai departe oxigenul molecular permit=nd scindarea moleculei si inserarea unui atom in molecula produsului final (S-OH).

Sunt hidroxilaze cu citocromi P450 multe enzime implicate in sinteza hormonilor steroizi din colesterol: enzima de clivare a colesterolului, -17, -11, 21-, 18-hidroxilazele, 25- si 1 -calciferol hidroxilazele.

Monooxigenazele cu citocrom P450 sunt abundente in reticulul endoplasmatic din ficat.

Transferul electronilor din lantul respirator din reticulul endoplasmatic este folosit numai pentru modificarea substratelor. Nu este asociat nici cu captarea energiei eliberata in timpul reactiilor de oxidare si nici cu fosforilarea.

BIBLIOGRAFIE

(selectiva)

Campbell K.Mary – Biochemistry, International edition, 1992.

Devlin M.Thomas – Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 1992.

Dinu Veronica, Eugen Trutia si colab. – Biochimie medicala. Mic tratat, Editura Medicala, Bucuresti, 1996.

Gheorghiu-Zamfirescu Marcela – Tendinte si directii de dezvoltare in Biochimia medicala, Editura Academiei, Bucuresti, 1983.

Harper’s Biochemistry – A Lange medical book, 1997.

Kepes A. – Aspects moleculaires des fonctions membranaires, Masson, Paris, 1980.

Streyer Lubert – Biochemistry, International student edition, 1988.

Weil Y.H. – Biochimie generale, Masson, Paris, 1990.

Zubay Geoffrey – Biochemistry, 1993.