Obtinerea de Noi Compusi cu Activitate Antibiotica Si Antitumorala Pornind de la Culturi de Microorga

„Never underestimate the power of the microbe”

Jackson W. Foster

1. Introducere

Majoritatea sistemelor biotehnologice implica actiunea bacteriilor, drojdiilor, algelor ce au fost selectate pentru sinteza unor medicamente, produse alimentare, acizi organici, alcooli sau vitamine. O multime de produsi industriali si alimentari sunt obtinuti prin fermentatie, termen general folosit aici pentru a se referi la masa, cultura controlata de microorganisme pentru a produce compusii organici doriti. Trebuie amintit si folosirea microorganismelor in controlul deseurilor, controlul poluarii si industria extractiva a metalelor.

Ultima metoda de atacare a problemei poluarii este prin epurare microbiologica -folosind microorganisme pentru a distruge si inlatura deseuri toxice din apa si sol. Unii din acesti „mancatori de deseuri” sunt rezidenti naturali in apa si sol si au o capacitate surprinzatoare de a descompune reziduuri [42].

Deoarece, fara ajutor, natural procesul se produce prea lent, majoritatea proceselor de depoluare sunt asociate cu operatii de bioremediere care trateaza solurile contaminate cu oxigen, nutrienti si apa pentru a accelera viteza de actiune microbiana. Prin aceste actiuni, nivelele de pesticide pot fi reduse cu 96%. Printre cele mai importante microorganisme bioremediatoare sunt tulpini de Pseudomonass Bacillus precum si diversi fungi „mancatori de toxine”. Cautarea curenta in bioremediere este pentru „superbacterii” –ingineriile genetice de conversie a diverselor substante chimice in dioxid de carbon sau compusi netoxici [5].

Toate produsele alimentare utilizate de oameni – de la produse vegetale la caviar sau branza- provin din alte organisme.

Procesul industrial de fermentatie incepe de la o singura celula bacteriana. De la o singura celula se produc miliarde de copii ale sale si apoi volume mari de produs dorit. Pentru a produce nivele apropiate de crestere si fermentatie, microorganismele trebuie sa fie cultivati in conditii controlate de mediu. Acest proces este similar cultivarii bacteriilor in eprubete cu mediu de cultura. Necesita un mediu steril continand nutrientii necesari, protectia impotriva contaminarii, introducerea de aer steril sau excluderea totala a aerului, si o temperatura si un pH optime.

Produsii proveniti din biosintezele microbiene sunt antibioticele, hormonii, vitaminele si vaccinurile.

Prima biomasa antimicrobiana produsa a fost penicilina, care provine de la Penicillium chrysogenum [50]. Pentru producerea derivatilor penicilinei semisintetice au fost introdusi in vasul de fermentatie precursori asortati in timpul cel mai probabil al fazei de crestere. Aceste experiente cu penicilina s-au dovedit un model important si pentru celelalte antibiotice.

Diagrama schematica a unui fermentor industrial de cultivare a microorganismelor este prezentata in figura 1:

Figura 1. Schema unui fermentor industrial de cultivare a microorganismelor.

1.1 Notiuni generale

Bacteriile sunt microorganisme unicelulare. Din punct de vedere al organizarii interne, ele sunt celule procariote, protiste inferioare, care au un nucleu primitiv, fara membrana proprie, constituit dintr-o singura molecula de acid dezoxiribonucleic (ADN ), fiind lipsite de aparat mitotic. Pe langa acestea, celula bacteriana in comparatie cu celula eucariota, nu are mitocondrii, reticul endoplasmic si aparat Golgi.

Cele mai multe bacterii poseda un perete propriu, rigid, constituit din peptidoglican, un material specific celulei bacteriene.

Deoarece microorganismele sufera modificari apreciabile in functie de varsta si de conditiile de mediu, caracteristicile unei bacterii, inclusiv cele morfologice, sunt tipice numai atunci cand acestea sunt tinere, in general 16-18 ore, cultivate

pe medii adecvate in conditii optime de temperatura, pH, in prezenta sau absenta oxigenului etc.

Celula bacteriana este o entitate morfologica si fiziologica de sine statatoare.

Primele cunostinte asupra morfologiei bacteriilor au aparut odata cu construirea primelor microscoape. Detaliile de structura ale celulei bacteriene nu au putut fi totusi puse in evidenta decat dupa aplicarea microscopiei cu contrast de faza, a metodelor de citochimie, a microdisectiei si mai ales a microscopiei electronice.

Deoarece bacteriile sufera modificari apreciabile de forma, dimensiune si structura, in functie de varsta si conditiile de mediu, se considera morfologia tipica pentru o bacterie, aspectul sau in culturi tinere, in faza de crestere activa, pe medii de cultura adecvate si in conditii optime de temperatura si pH [4].

Bacteriile pot imbraca una din urmatoarele trei forme fundamentale:

-forma sferica (coc);

-forma cilindrica, de bastonas (bacil);

-forma incurbata (vibrion, spiril, spirocheta).

Bacteriile de forma sferica se numesc coci. Cocii se pot prezenta si sub forma ovoidala sau lanceolata. Gruparea cocilor fiind caracteristica anumitor grupe de bacterii bine individualizate, poate ajuta mult la identificarea unui agent patogen. In general, gruparea bacteriilor este legata de planul de diviziune al celulei.

Cocii se prezinta rar izolati; cel mai adesea ei se grupeaza perechi (diplococi), in lanturi (streptococi), cate patru (tetracoci), in pachete (sarcine) sau in gramezi, sub forma de ciorchine (stafilococi).

Bacteriile in forma de bastonas se numesc bacili. Ei nu au intotdeauna o forma cilindrica perfecta. Exista forme de suveica, de piscot.

Bacilii pot fi izolati sau se pot grupa cate doi (diplobacili) in lanturi (streptobacili) etc.

Bacilii foarte scurti care uneori sunt greu de deosebit de coci sunt cunoscuti sub numele de cocobacili.

Bacteriile incurbate se pot prezenta sub trei forme :

-vibrionii, in forma de virgula;

-spirilii, de forma spiralata cu spirele rigide;

-spirochetele, tot de forma spiralata, dar cu mai multe spire care sunt flexibile, se strang si se relaxeaza.

In functie de afinitatea pentru anumiti coloranti, bacteriile se pot grupa in bacterii gram pozitive (stafilococul, bacilul carbunos) sau gram negative (meningococul, colibacilul), bacili acidoalcoolrezistenti (bacilul Koch).

1.2 Compozitia chimica a bacteriilor

Cunoasterea compozitiei chimice a bacteriilor este necesara atat pentru a putea intelege procesele de metabolism si modificarile ce survin in cursul vietii bacteriilor cat si pentru prepararea mediilor de cultura in raport cu cerintele lor nutritive.

Compozitia chimica a bacteriilor este foarte complexa si se pot recunoaste toate categoriile de substante cunoscute de noi.

In compozitia celulei bacteriene vom gasi sub forma de compusi organici si anorganici, aceleasi elemente ca si in celulele plantelor si animalelor. Afirmatia lui Claude Bernard: “ca animalul sau planta cea mai inferioara nu se prezinta mai simplu si cu functii mai putin complicate ca animalele sau plantele superioare “ avea sa devina realitate odata cu progresele realizate in domeniul histochimiei microbiene [3].

Analiza elementara a pus in evidenta o serie de elemente totdeauna intalnite: C, O, H, N, P, Na, K, Mg, Ca, S Fe, Cl si incidental, dupa specia microbiana si conditiile de cultura si alte elemente chimice sub forma de microsubstituenti, ca: Mn, Zn etc.

Unele din ele intra in constitutia diverselor componente celulare, altele au rol de activatori ai diverselor procese enzimatice.

Trebuie atrasa atentia asupra faptului ca diversele constituente variaza in limite foarte largi, in functie de: specia bacteriana, natura mediului in care sunt cultivate, varsta celulei in momentul analizei etc., acesti factori influentand compozitia atat din punct de vedere cantitativ cat si calitativ.

Apa

Apa este mediul in care au loc toate fenomenele vitale, fapt pentru care apa, atat in stare libera cat si in combinatie cu alte componente celulare, ocupa primul loc.

Ea este solventul componentilor celulari, este transportorul care, prin membrane celulara, aduce substante nutritive si le evacueaza pe cele care numai sunt necesare.

Apa, prin disociatia ionilor OH- si H+ joaca rol hotarator in reactia mediului.

In formele vegetative ale bacteriilor, continutul in apa variaza dupa specie intre 75% si 85%. Formele de rezistenta, sporii, contin insa mult mai putina apa majoritatea fiind sub forma de combinatii chimice, fapt care confera rezistenta deosebita a acestora la caldura..

Cantitatea de substante organice cuprinse in apa va modifica pozitiv sau negativ balanta bacteriana.

1.2.2 Cenusa bacteriana

Totalul substantelor minerale din celula bacteriana, obtinute prin calcinarea corpilor microbieni, variaza intre 2% si 30% din greutatea lor uscata. Aceasta variatie mare, cantitativa si calitativa, in functie de factorii aratati mai sus se explica astfel: celulele tinere sunt de 6-7 ori mai bogate in substante minerale decat cele batrane. Insamantand vibrionul holeric in bulion cu 1% NaCl, rezulta 8-10% cenusa din greutatea corpilor uscati, in timp ce in bulion cu 3% NaCl, proportia se ridica la 22-28%.

In legatura cu rolul substantelor minerale, Bordet arata ca lipsa calciului duce, in cazul stafilococului, la modificari ale pigmentului, la modificari ale propietatilor antigenice si de virulenta. Fosforul intra in molecula nucleoproteinelor a unor zaharuri si lipide si este indispensabil multiplicarii germenilor din grupul tific, dizenteric si coli, ca si a bacilului tuberculozei. Sulful ia parte la formarea unor aminoacizi sau vitamine. Fierul ia parte la fenomenele de oxidare celulara si stimuleaza toxigeneza diftericului sau pigmentogeneza piocianicului.

1.2.3 Glucidele

Glucidele sunt compusi ternari in care proportia de H si O este la fel ca in apa. Reprezinta material de rezerva, de energie necesara desfasurarii proceseor metabolice. Se gasesc in proportii care variaza in functie de aceiasi factori, intre 12 si 28% din greutatea substantei uscate.

Acesti compusi sub forma de polizaharide se pot gasi la suprafata bacteriilor, in capsula germenilor capsulati. Avand propietatea de a precipita cu serurile preparate cu bacteriile din care s-au extras, aceste polizaharide vor avea un deosebit rol in clasificarea unor specii. Rezultate importante s-au obtinut in studiul acestor polizaharide din grupul Salmonella.

1.2.4 Proteinele

Proteinele constituie componentele structurale si functionale esentiale ale celulei vii. Ele reprezinta 40-70% din greutatea uscata . Studiul lor prezinta o importanta deosebita in microbiologie si imunologie. In constitutia proteinelor bacteriene intalnim aceiasi aminoacizi ca si la animale si la plante.

De natura proteica sunt si toxinle secretate de germeni in mediul extern. Prin unire cu acizii nucleici , proteinele dau nastere la nucleoproteine.

Nucleoproteinele variaza in jurul cifrei de 10% din greutatea uscata a bacteriei. In nucleoproteinele asa zisului „nucleu” s-a pus in evidenta acidul dezoxiribonucleic (ADN), iar in citoplasma bacteriei, acidul ribonucleic (ARN). Diferenta dintre acesti doi acizi este imprimata de zaharul ce intra in constitutie: dezoxiriboza in primul, riboza in al doilea.

1.2.5 Lipidele

Acestea sunt substante solubile in eter, cloroform, acetona, petrol. Cantitatea lor variaza, rar, depasind 10%, exceptand microbacteriile la care pot ajunge pana la 40,8%.

Boivin si Mesrobeanu au pus in evidenta la bacteriile gram negative, un compus glucidolipidic, care este antigenic, specific si toxic si care reprezinta antigenul somatic al bacteriei si in acelasi timp endotoxina ei.

Studiul facut in legatura cu acizii grasi, la microbacterii au aratat ca la acesti germeni, in afara de cei obisnuiti, se intalnesc si acizi grasi speciali, fiecare conferind bacteriei o caracteristica: acidul micolic – acidorezistenta, acidul tubercolostearic – actiune iritativa , iar acidul ftioic – formarea tuberculilor.

1.2.6 Enzimele

Enzimele sau fermentii sunt biocatalizatori, adica factori care pot sa mijloceasca intr-un timp foarte scurt numeroase, variate si complicate reactii chimice care se petrec in substanta vstituie componentele structurale si functionale esentiale ale celulei vii. Ele reprezinta 40-70% din greutatea uscata . Studiul lor prezinta o importanta deosebita in microbiologie si imunologie. In constitutia proteinelor bacteriene intalnim aceiasi aminoacizi ca si la animale si la plante.

De natura proteica sunt si toxinle secretate de germeni in mediul extern. Prin unire cu acizii nucleici , proteinele dau nastere la nucleoproteine.

Nucleoproteinele variaza in jurul cifrei de 10% din greutatea uscata a bacteriei. In nucleoproteinele asa zisului „nucleu” s-a pus in evidenta acidul dezoxiribonucleic (ADN), iar in citoplasma bacteriei, acidul ribonucleic (ARN). Diferenta dintre acesti doi acizi este imprimata de zaharul ce intra in constitutie: dezoxiriboza in primul, riboza in al doilea.

1.2.5 Lipidele

Acestea sunt substante solubile in eter, cloroform, acetona, petrol. Cantitatea lor variaza, rar, depasind 10%, exceptand microbacteriile la care pot ajunge pana la 40,8%.

Boivin si Mesrobeanu au pus in evidenta la bacteriile gram negative, un compus glucidolipidic, care este antigenic, specific si toxic si care reprezinta antigenul somatic al bacteriei si in acelasi timp endotoxina ei.

Studiul facut in legatura cu acizii grasi, la microbacterii au aratat ca la acesti germeni, in afara de cei obisnuiti, se intalnesc si acizi grasi speciali, fiecare conferind bacteriei o caracteristica: acidul micolic – acidorezistenta, acidul tubercolostearic – actiune iritativa , iar acidul ftioic – formarea tuberculilor.

1.2.6 Enzimele

Enzimele sau fermentii sunt biocatalizatori, adica factori care pot sa mijloceasca intr-un timp foarte scurt numeroase, variate si complicate reactii chimice care se petrec in substanta vie. Microorganismele au un bagaj enzimatic foarte activ, care se transmite ereditar. Fiecare enzima este responsabila de o anumita transformare chimica.

Activitatea enzimelor poate fi inhibata printr-o serie de substante, in celula bacteriana aparand o serie de tulburari. In aceasta categorie intra antibioticele si chimioteapeuticele, intrebuintate in terapia bolilor microbiene.

Cu ajutorul enzimelor, bacteriile descompun cele mai complexe substante organice, rezultand elemente simple, care apoi sunt asimilate de plante si animale.

Trebuie retinut faptul ca si pentru desfasurarea in bune conditii a acestor enzime sunt necesare anumite conditii fizico-chimice.

Din punctul de vedere al activitatii chimice pe care o desfasoara, enzimele se impart in doua mari grupe:

– Hidrolazele, respectiv acele enzime care au o activitate hidrolitica, desfac sau reconstituie substantele organice scotand sau fixand o molecula de apa. Din aceasta categorie amintim:

-lipazele, care hidolizeaza grasimile;

-carbohidrazele, care hidrolizeaza hidratii de carbon;

-proteinazele, care hidrolizeaza proteinele;

-nucleazele,care hidrolizeaza acizii nucleici.

-Desmolazele sunt enzime care desfac legaturile dintre atomii de carbon (-C-C-).

Din aceasta categorie amintim:

-peroxidazele, care asigura oxidarea substanelor prin intermediul apei oxigente;

-catalazele, care asigura eliminarea peroxidului de hidrogen, format de sistemele enzimatice celulare.

1.3 Metabolismul bacterian

Bacteriile desfasoara o activitate metabolica neintrerupta in cursul careia cresc, se multiplica, isi schimba structura si compozitia chimica.

Metabolismul bacterian, a carui intensitate este cu mult mai mare in comparatie cu cel al organismelor superioare, cuprinde totalitatea reactiilor biochimice care au loc in celula. Prin intermediul acestor reactii substantele nutritive sunt incorporate si transformate in energie (reactii catalitice sau procese de dezasimilatie) sau in constituenti celulari (reactii anabolice sau procese de asimilare).

1.4 Nutritia bacteriana

Prin nutritia bacteriana se intelege totalitatea proceselor metabolice care participa la producerea de substante energetice sau de materiale cu rol plastic, necesare sintezei constituentilor celulari. Bacteriile isi realizeaza activitatea metabolica prin numeroase mecanisme, folosind surse nutritive extrem de diverse, de la azot molecular, dioxid de carbon, sulf, pana la substantele organice cele mai complexe. In acest fel se explica posibilitatea unor bacterii de a produce unele vitamine pe care metabolismul uman nu este capabil sa le sintetizeze.

Bacteriile, ca de altfel orice fiinta vie, nu pot trai si nu se pot inmulti in absenta substantelor nutritive, substante din care prin procese de oxidare, reducere si fermentatie isi asigura sursa de energie si potentialul plastic.

In urma unei neincetate selectii, adaptandu-se la foarte variate conditii de viata, microorganismele pot fi:

-saprofite, cele care folosesc ca material nutritiv substantele organice, rezultate din cadavrele altor fiinte:

-parazite, cele care se dezvolta pe socoteala organismelor vii.

Dupa posibilitatea de a-si sintetiza substantele necesare, bacteriile se impart in:

-bacteriile autotrofe (utilizeaza azotul si carbonul din compusi norganici) sunt acele bacterii care isi formeaza constituentii necesari utilizand bioxid de carbon, amoniac si o sursa de energie:

-fotosintetice cele care utilizeaza energia solara – si chimio- sintetice – cele care nu au nevoie de energie solara, putandu-se dezvolta si la intuneric, asigurandu-si energia necesara asimilarii cu ajutorul unor reactii chimice simple;

-bacteriile heterotrofe (utilizeaza azot si carbon din compusi anorganici) si reprezinta o categorie de bacterii unde intra marea majoritate a germenilor patogeni; se dezvolta numai in prezenta unor substante nutritive complexe, organice sau anorganice, pe care le transforma si le asimileaza cu ajutorul unui bagaj enzimatic bine reprezentat.

Bacteriile patogene sunt heterotrofe; datorita parazitismului ele si-au pierdut capacitatea de a-si sintetiza singure toate elementele de care au nevoie.

In functie de puterea de adaptare si sintetizare a heterotrofelor se deosebesc:

microorganisme care utilizeaza azotul atmosferic;

microrganisme care utilizeaza azotul, carbonul si energia prin degradarea

substantelor organice in mediu;

microrganisme dependente de unii aminoacizi, pe care, neputandu-i sintetiza,

trebuie sa ii gaseasca in mediul de cultura;

microrganisme dependente de factorii de crestere-au vitamine bacteriene

fara de care nu se pot dezvolta. Aceste substante speciale, aduse in mediile de cultura de diverse produse organice complexe (sange, ser, ascita, carne, drojdie), sunt necesare in cantitati foarte mici si indeplinesc functia de biocatalizatori. Cunoasterea lor este necesara pentru a fi luate in considerare la prepararea mediilor de cultura. Unele produse, numite esentiale, intrand in structura protoplasmei, a aparatului nuclear bacterian sau in compozitia unor enzime, sunt indispenabile. Lipsa lor duce la moartea populatiei microbiene. Altele, numite stimulente, favorizeaza prin prezenta lor dezvoltarea populatiei bacteriene.

Dintre factorii de crestere studiati la bacterii mai importanti sunt:

-vitamina B1 (aneurina sau tiamina), care intervine in metabolismul glucidic, fiind indispensabila cocilor gram-pozitiv, brucelelor si unor salmonele.

-Vitamina B2 (riboflavina), necesara dezvoltarii streptococilor.

-Vitamina B6 (piridoxina), necesara pentru cocii patogeni si bacteriile anaerobe.

-vitamina PP (nicotinamida), factor esential pentru bacilii dizenterici si paratifici.

Alaturi de aceste vitamine si altele neamintite, unii aminoacizi, unele baze purinice, acidul oxalic, purinic etc., joaca rolul de factori de crestere.

In acelasi timp, bacteriile reprezinta sursa principalade vitamine, in special din grupul B, cu care organismele animale, organisme- care nu si le pot sintetiza – isi acopera nevoile de vitamine alaturi de cele aduse de alimente. Asa se explica de ce prin reducerea florei bacteriene intestinale, in urma tratamentului cu antibiotice si sulfamide se ajunge la carente vitaminice care trebuie combatute si, in special, prevenite prin administrarea concomitenta a complexului B.

Substantele nutritive sunt introduse prin permeabilitatea peretelui celular in corpul bacteriei, din care printr-un sens invers sunt eliminate la exterior produsele metabolismului bacterian.

Odata intrate in celula, principiile alimentare urmeaza drumul transformarilor metabolice, astfel:

1. glucidele – cu ajutorul enzimelor bacteriene, polizaharidele sunt transformate pana la monozaharide. Cu ajutorul enzimei „celulaza”, bacteriile transforma celuloza in dizaharidul celobioza, apoi in monozaharidul glucoza. Glucoza este apoi fosforilata, trecand prin ciclul Krebs pana la dioxid de carbon si apa.

2. lipidele- in mediul nutritiv, sub actiunea enzimelor numite lipaze, sunt transformate in acizi grasi si glicerina, forma sub care trec prin membrana bacteriei. Sub actiunea acetilcoenzimei A, acizii grasi se transforma in compusi necesari celulei bacteriene.

3. proteinele- cei mai importanti componenti ai bacteriei, datorita faptului ca au o molecula mare, vor patrunde in corpul microbian, numai dupa ce au fost fragmentate in elemente cu molecula mica. Proteinazele transforma proteinele in peptide, iar acestea sunt transformate, la randul lor, de peptidaze in aminoacizi. Aminoacizii sunt degradati prin dezaminare, cu eliberare de amoniac, care se transforma in uree, sau prin decarboxilare –cu producere de amine.

1.5 Rolul concentratiei ionilor de hidrogen (pH-ul)

Concentratia ionilor de hidrogen sau „reactia mediului” joaca un rol esential in desfasurarea proceselor vitale. Limitele de toleranta ale acestei concentratii sunt foarte diverse, in functie de germeni, unii din ei putand supravietui in medii acide sau alcaline, in care fiintele superioare nu pot supravietui. In timp ce pneumococul are o banda scurta de pH pentru dezvoltare, intre 7 si 8,3, la bacilul tific aceasta banda se lungeste intre ph 4.0 si 9,6. In general, pentru majoritatea germenilor, pH-ul optim este in jurul neutralitatii (ph – 7,0) .

Bacteriile sunt, in general destul de tolerante la variatii ale concentratiilor ionice. Unele specii patogene au chiar o afinitate pentru salinitate crescuta, care impiedica dezvoltarea majoritatii bacteriilor, fapt ce a permis crearea si utilizarea de medii de cultura selective. Aciditatea: este incompatibila cu supravietuirea microorganismelor.

1.6 Rolul temperaturii in dezvoltarea bacteriilor

Actiunea caldurii in functie de grad si timpul de actiune produce asupra bacteriilor efecte variate, de la stimulare la alteratii, care pot duce chiar la moarte.

Dupa temperatura optima de dezvoltare, bacteriile au fost impartite in trei categorii:

a.Microrganisme mezofile- in aceasta categorie sunt cuprinse cele mai multe bacterii saprofite si parazite, avand temperatura optima intre 20 si 370C.

b.Microrganisme termofile – in aceasta categorie sunt cuprinse bacterii saprofite la care optimum de temperatura este de peste 400C, ajungand la unele la peste 700C.

c.Microrganisme psihrofile- in aceasta categorie sunt cuprinse bacterii cu temperatura optima intre 200 si 400C, dar care se pot dezvolta, binenteles lent, si la 00C, la care au inca o intensa activitate biochimica.

Prin temperatura maxima de dezvoltare se intelege cea mai ridicata temperatura la care inca viata bacteriei este posibila. Ea reprezinta o constanta de care trebuie sa se tina cont atunci cand se urmareste bacteria si cand aceasta temperatura trebuie depasita.

Temperatura: efectul ei este in functie de cantitatea de substante organice. O temperatura crescuta coexistand cu o cantitate mare de substante organice va duce la o multiplicare a germenilor. Temperatura scazuta permite supravietuirea lor.

1.7 Respiratia bacteriana

Respiratia bacteriana reprezinta totalitatea proceselor biochimice aerobe si anaerobe prin care celula elibereaza energia necesara activitatii vitale. Aceste reactii au la baza mecanismul oxidoreducerii.

Prin oxidare biologica se intelege pierderea atomilor de hidrogen- a electronilor- de catre o substanta chimica, numita donator, si transferul acestora pe molecula unei alte substante chimice, numita acceptor. Substanta donatoare se oxideaza si, concomitent, substanta acceptoare se reduce. Aceste reactii sunt reversibile, iar efectuarea lor necesita prezenta unor enzime.

Pentru a se putea dezvolta, bacteriile au nevoie de energie. Principala sursa de energie este reprezentata de oxigen. Aceasta energie se elibereaza prin procesul numit respiratie, proces care cuprinde un complex de reactii biochimice. Dupa cum bacteriile intrebuinteaza oxigenul liber sau oxigenul combinat, Pasteur a divizat germenii in doua clase: a germenilor aerobi si a germenilor anaerobi.

-respiratia aerobiotica numita si oxibiotica este respiratia, in care oxigenul este luat din aerul atmosferic. In acest mod de respiratie, oxigenl este fixat de hidrogenul din substantele energetice, care apoi se descompun, eliberand apa si o cantitate de energie. respiratie aeroba (oxibiotica), in care acceptorul de hidrogen este oxigenul molecular, iar produsul rezultat este apa;

In timpul cresterii, cantitatea de oxigen absorbita este superioara celei de bioxid de carbon degajata. Urmeaza apoi o faza de echilibru, dupa care cantitatea de bioxid de carbon devine superioara cantitatii de oxigen absorbita.

-respiratia anaerobiotica, sau anoxibiotica, este respiratia in care dehidrogenarea se face in lipsa oxigenului. Acceptorul de hidrogen poate fi orice substanta anorganica, cu exceptia oxigenului.

-fermentatia, in care acceptorul de electroni este un compus organic.

Glucidele reprezinta, in general, pentru anaerobi sursa importanta de O2 si de energie necesara. Reactiile intracelulare si descompunerea substantelor au loc sub actiunea unor enzime numite dehidraze.

Daca oxigenul liber impiedica formele vegetative ale microbilor anaerobi sa se dezvolte, comportandu-se ca o toxina, nu aceeasi situatie este pentru spori. Acestia suporta oxigenul liber, insa nu germineaza in conditii de anaerobioza.

Ciclul carbonului si respectiv al azotului sunt conditionate de distructia materiilor organice de catre microorganisme, printre care microorganismele anaerobe joaca un rol deosebit.

1.8 Cresterea , multiplicarea si moartea bacteriilor

Figura 2. Variatiile curbei de crestere

Ca toate celulele si substantele vii, bacteriile cresc, se inmultesc si mor. Inmultirea se face prin diviziune: fie printr-o diviziune directa, numita si amitotica, in care materilaul viu se imparte fara o transformare prealabila evidenta, fie printr-o diviziune mitotica, mai complicata, in care elementele celulei si in special nucleul sufera modificari importante.

Daca alcatuirea celulara este simpla si mai mult sau mai putin omogena, cum se intampla in cazul celulelor bacteriene, diviziunea directa permite o impartire oarecum egala a componentelor celulare.

Nu se cunosc cu precizie cauzele care, la un moment dat, fac celula sa se divida. Se pare ca diviziunea este declansata de modificarea raportului dintre volumul celular, care creste mult prin adaugare de protoplasma si suprafata celulara ce creste mai putin. O alta ipoteza presupune ca marirea distantei dintre periferia celulei si formatiunile centrale, printre acestea in primul rand nucleul, ar duce la tulburari in metabolismul unor substante socotite cheie in diviziunea celulara, cum ar fi acidul dezoxiribonucleic.

Diviziunea poate fi excitata sau impiedicata cu ajutorul diferitelor substante chimice sau prin diferiti agenti fizici, printre care retinem, in special, caldura. Sub influenta penicilinei, diviziunea bacteriana poate fi impiedicata, fara ca metabolismul anabolic sa fie oprit. Germenii cresc, dar fiind in imposibilitatea de a se divide, rezulta forme gigante sau filamentoase.

In cazul accentuarii metabolismului energetico- constructiv, bacteriile isi maresc considerabil volumul, iar acidul dezoxiribonucleic se divide in mai multe mase noi, ceea ce face ca bacteria sa ia aspectul unei celule cu mai multi nuclei.

In stadiul urmator, membrana nucleara emite prelungiri in interiorul bacteriei si se produce diviziunea bacteriana. In functie de directia planurilor de diviziune si de aderenta elementelor rezultate printr-o separare incompleta a stratului periferic, bacteriile pot fi grupate variat.

Cand germenii sunt insamantati, intr-un mediu de cultura, care prin compozitie si constante fizico-chimice ofera conditii favorabile, indivizii microbieni isi vor dezvolta protoplasma si apoi vor creste numeric. Cresterea numerica intr-un mediu de cultura se numeste inmultire sau multiplicare.

Pentru a intelege mai bine acest proces al multiplicarii, el este studiat sub forma unor faze, caracterizate prin variatiile curbei de crestere.

-faza de lag (latenta), in care nu se inregistreaza o crestere a numarului de bacterii. Aceasta este o etapa de adaptare a populatiei bacteriene la noile conditii de mediu;

Daca bacteriile sunt puse in conditii bune, este necesara o perioada de timp pentru unii germeni de ordinul orelor, perioada care pare a fi o perioada de pregatire si se numeste perioada de „lag” sau faza de latenta.. Pe durata acestei perioade, populatia microbiana nu numai ca nu creste numeric, ba uneori scade important. Face impresia unei perioade de liniste. Linistea e numai aparenta, deoarece contrasteaza cu activitatea metabolica foarte intensa, care are loc in interiorul celulei, activitate care face sa se acumuleze material energic, celula marindu-si dimensiunile. Creste in special cantitatea de acid ribo- si dezoxiribonucleic.

Procesele metabolice pot fi favorizate de unii factori de initiere sau factori de crestere si atunci aceasta perioada va fi mai scurta. Printre acesti factori citam produsele rezultate din autoliza microbiana si de aceea insamantarile bogate pot duce mai repede la initiera multiplicarii la unii germeni.

Lungimea perioadei de lag este invers proportionala cu temperatura, cu bogatia culturii inoculate si direct proportionala cu cantitatea mediului de cultura.

Propietatea de a prelungi aproape indefinit aceasta perioada, blocand diviziunea prin substante chimioterapice sau antibiotice se numeste bacteriostaza.

-faza de crestere logaritmica;

Dupa trecerea perioadei de lag, bacteriile incep sa se inmulteasca, la inceput mai incet, apoi din ce in ce mai repede. Numarul bacteriilor care mor in aceasta perioada este foarte mic. Viteza de multiplicare este foarte mare. Numarul bacteriilor creste in progresie geometrica cu ratia doi. Se numeste perioada de inmultire logaritmica. Este faza tineretii fiziologice. Timpul de multiplicare variaza dupa specie, dupa valoarea nutritiva a mediului, pH, temperatura etc.

Trebuie retinut ca in aceasta perioada bacteriile prezinta cele mai caracteristice proprietati ale speciei.

-faza stationara-dupa atingerea unui nivel maxim de multiplicare, numarul celulelor vii ramane neschimbat cateva ore;

Dupa aproximativ 10 ore de la incubare, pe o durata de 5-6 ore, numarul bacteriilor ramane aproape constant, ajungandu-se la un echilibru, multiplicarea fiind contrabalansata de moarte prin autoliza. Este faza stationara. Oprirea nu se datoreste atat unei epuizari a mediului de cultura, cat mai degraba acumularii in mediu a produselor nefavorabile de metabolism si enzimelor microbiene.

-faza de declin, in care celulele imbatranesc si viabilitatea lor scade progresiv.Urmeaza faza de declin, a carei durata variaza dupa germene de la cateva ore pana la saptamani, perioada in care mortalitatea este mai mare decat natalitatea. Este perioada in care fenomenul de autoliza atinge un maixm. La unele specii se ajunge la autosterilizare. In aceasta perioada apar formele de sporulatie.

Necesitatea cunoasterii celor expuse mai sus este legata practic de intretinerea colectiilor microbiene si in special a tulpinilor de referinta, precum si de cercetarile variatelor caractere si caracteristici ale germenilor care trebuie facute in perioada de inmultire logaritmica.

Populatia microbiana produce modificari fizice si chimice mediilor in care se dezvolta, modificari care caracterizeaza pana la un punct specia microbiana.

In cazul unui mediu lichid, multiplicarea poate produce tulburarea uniforma sau neuniforma a mediului, pelicula sau inel aderent la suprafata si sediment mai mult sau mai putin intens.

In culturile pe medii solide, prin cresterea la un loc a descendentilor, rezulta o colonie microbiana, cuprinzand, cuprinzand miliarde de germeni. Studiul cu ochiul liber sau cu lupa pune in evidenta dimensiunea, forma, opacitatea, culoarea, aspectul suprafetei.

Printre factorii care influenteaza morfologia coloniilor se mentioneaza: mediul de cultura, umiditatea, temperatura si in special varsta culturii:

Deosebim urmatoarele tipuri morfologice:

-colonii „S” (smooth =netede);

-colonii „R” (rough =rugos);

-colonii „M” (mucoide);

-colonii „G” (colonii pitice).

Uneori, atunci cand germenii sunt pusi in conditii nefavorabile de dezvoltare in vivo sau in vitro; antibiotice, antiseptice, anticorpi, coloniile se transforma in forma „L” .

Pentru studiul cresterii, multiplicarii si mortii bacteriilor sunt folosite o serie de metode, astfel:

-germenii pot fi masurati, pe frotiuri fixate cu acid osmic sau cu formalina si colorate May-Grünwald-Giemsa, cu ajutorul unui micrometru ocular, care a fost in prealabil etalonat.

-numaratoarea germenilor vii se face numarand coloniile care au rezultat pe o placa cu geloza, in care s-a insamantat 1 ml dintr-o suspensie microbiana de dilutie cunoscuta.

Activitatea de bacteriologie consta cultivarea microbilor pe medii de cultura potrivite.

Mediile de cultura trebuie sa satisfaca unele conditii si anume:

-sa contina toate substantele necesare vietii microbilor: substante plastice, energetice adica sa asigure surse de azot, de hidrati de carbon, de apa, vitamine, saruri minerale;

-sa fie sterile, pentru a permite izolarea in cultura pura a germenului respectiv ;

-sa aibe o anumita reactie chimica, respectiv sa corespunda unui pH optim;

-sa satisfaca exigentele de viata ale bacteriilor in ceea ce priveste oxigenul;

-sa aiba o concentratie de ioni de hidrogen optima

Mediile de cultura pot fi impartite dupa origine in:

-medii de origine animala;

-medii de origine vegetala;

-medii de origine sintetica.

Dupa intrebuintare mediile se impart in:

-medii uzuale sau simple, folosite in cultivarea celor mai multe specii microbiene;

-medii speciale sau complexe utilizate pentru anumite specii microbiene.

Dupa consistenta se folosesc:

-medii solide;

-medii lichide.

In raport cu scopul utilizarii se intalnesc:

-medii diferentiale, care contin substante ce pun in evidenta unele proprietati biochimice ale bacteriilor studiate;

-medii de imbogatire, destinate cutivarii unor bacterii cu necesitati nutritive particulare si care sunt stimulate sa creasca in mod special;

-medii selective, care contin elemente ce permit cresterea numai anumitor bacterii.

Pentru ca mediul sa fie considerat utilizabil, el trebuie sa corespunda cu efect maxim scopul urmarit pentru fiecare germene, si anume:

-sa dea in minimum de timp o cultura abundenta;

-sa dezvolte la maximum activitatea biologica si produsele ei, grad de virulenta, proprietati imunogene, toxigeneza.

Mediile trebuie sa fie sterile, pentru a asigura cultura singulara a germenului. In general sterilizarea se face prin caldura umeda, in autoclav intre 115 si 1200C sau pe baie de apa. Exista indicatii speciale pentru fiecare mediu, dupa compozitia chimica a acestuia. Astfel, mediile care contin zaharuri nu se sterilizeaza peste 1100, deoarece ridicarea temperaturii peste aceasta limita duce la hidroliza sau caramelizarea zaharurirlor.

Mediile de cultura sterilizate peste 1100 pierd proprietatea de a se gelifica dupa racire.

O atentie deosebita trebuie sa se acorde sterilizarii mediilor care contin indicatori sau substante organice, ce se reduc la temperaturi inalte.

In tehnica prepararii unui mediu nutritiv bun, mai trebuie sa se aiba in vedere si alti timpi:

-pregatirea atenta a recipientelor in care se vor prelucra si repartiza mediile determina puritatea si claritatea acestora;

-este necesar ca mediile sa fie clare, pentru a se putea urmari aspectul culturii in mediile lichide sau morfologia coloniilor pe mediile solide, clarificarea se obtine printr-o filtrare corecta, in mod curent dupa adaugarea de albus de ou, sulfat de aluminiu, mediile care contin albumine coagulate nu se clarifica.

-incalzirea mediului dupa ajustarea pH-ului provoaca in mediile cu peptona sau bulion de carne precipitarea substantelor alcalino-teroase si a metalelor grele, care tulbura mediul. In aceste situatii, pentru a avea medii limpezi, autoclavarea urmatoare trebuie sa se faca la o temperatura mai scazuta decat cea anterioara.

-pentru obtinerea unui mediu nutritiv valoros este nevoie ca substantele organice de la care se pleaca sa aiba calitati nutritive optime.

-peptona, care nu este altceva decat un produs intermediar de hidroliza a albuminelor, are o compozitie foarte variata, in functie de material din care se obtine si de felul hidrolizei realizate. Ea nu trebuie sa aiba o cantitate prea mare de substante anorganice. Astfel peptonele comerciale au o valoare nutritiva variabila, legata de procedeele si de substantele utilizate in realizarea acestui preaparat de diversele case de fabricatie.

Pentru unele medii, peptone se va prepara din digestia peptica a stomacurilor de porc. Dupa cum am vazut mai sus, una din conditiile principale ale unui mediu de cultura este aceea de a avea o anumita reactie chimica absolut necesara, germenii putand trai numai in anumite limite, uneori destul de stranse, limite care variaza cu specia, un pH impropriu impiedicand dezvoltarea lor.

Reactia mediului se determina practic prin determinarea pH-ului, care reprezinta logaritmul cu semn schimbat al concentratiei ionilor de hidrogen intr-o solutie. El indica alcalinitatea sau aciditatea.

Practic s-a stabilit o scara conventionlala de pH de la 0, care reprezinta aciditatea absoluta, la 14, care reprezinta alcalinitatea absoluta, pH-ul 7 fiind zona de neutralitate.

pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

tare slaba slaba tare

aciditate alcalinitate

pH- ul poate fi determinat cu foarte mare precizie prin metoda electrometrica, colorimetrica, etc.

Este cunoscut faptul ca prin autoclavare pH-ul mediului scade.

Prin insamantare se intelege operatia de trecere a germenilor dintr-un produs patologic, pe medii de cultura solide sau lichide, in vederea inmultirii sau cultivarii lor. Insamantarea se va face cat mai repede, pentru a nu pemite moartea germenilor. Toate operatiile unei insamantari se va face avand in continuu grija pentru a nu se introduce nici un germene din afara. Insamantarile se pot face atat pe medii solide cat si in medii lichide, cu ansa de platina, cu pipeta Pasteur sau gradate.

Se folosesc diverse tehnici de insamantare:

a. insamantarea in medii lichide se face:

-1) cu ansa de platina

-2) cu pipeta Pasteur

-3) cu tamponul

b. insamantarea pe suprafata mediilor solide se face:

-1) cu ansa, pe mediul inclinat in eprubeta

-2) cu ansa, in capsula Petri

c. insamantari in profunzimea mediilor solide:

-1) prin inteparea in geloza sau gelatina dreapta

-2) medii in prealabil lichefiate

Se recomanda ca la insamantare sa se aibe in vedere urmatoarele:

-intreaga activitate sa se desfasoare cat mai aproape de flacara

-sa nu se insamanteze cu pipeta sau cu ansa fierbinte, omorand germenii;

-sa se flambeze ansa dupa intrebuintare, pentru a distruge germenii .

Izolarea se face de cele mai multe ori concomitent cu insamantarea.

Prin izolare se intelege operatia care se face pentru a separa germenii dintr-o asociatie microbiana , pentru ca apoi sa poata fi studiati fiecare in parte.

Pentru izolarea germenilor se folosesc doua categorii de metode:

-metode generale, care se pot aplica tuturor germenilor si care intrebuinteaza medii solide obisnuite, considerand ca fiecare colonie izolata este generata de un singur germene.

epuizarea pe suprafata mediului

metoda dilutiilor successive

-metode speciale, sunt in unele situatii si metode de identificare

izolare pe medii speciale

izolarea pe baza comportarii variate fata de agentii fizii si chimici

Sterilizarea este procedeul prin care se obtine distrugerea tuturor microorganismelor saprofite sau patogene, fie ca sunt in stare vegetativa fie ca sunt sporulate. Principalii agenti fizici utilizati pentru realizarea sterilizarii sunt: caldura, filtrarea, centrifugarea, radiatiile ultraviolete si, mai rar, ultrasunete.

Viabilitatea si dezvoltarea microorganismelor sunt in permanenta influentate de complexul de factori fizico-chimici si biologici care alcatuiesc mediul ambient. Orice modificare aparuta in acest mediu ambient se poate rasfrange negativ asupra bacteriilor si ca urmare pot aparea trei situatii:

Moartea (efectul bactericid,virulicid, fungicide)

Incetinirea si oprirea in mod reversibil a multiplicarii (efectul bacteriostatic)

Aparitia unor modificari ale microorganismelor ce permit fie selectarea unor forme mai rezistente, fie trecerea bacteriilor din forma vegetativa in aceea de spor.

1.9 Biotehnologiile ca sursa de poluare a mediului

Lucrarile aparute in ultima vreme arata ca bolile care se transmit pe cale aeriana sunt din ce in ce mai frecvent intalnite, datele statistice indicand 20% din totalul bolilor infectioase. Procentajul, in realitate este mult mai mare daca alaturi de bacteriozele de care se ocupa statisticile( tuse convulsiva, scarlatina, difterie, t.b.c) ar fi incluse si virozele transmise pe aceeasi cale..

Problema bolilor infectioase aerogene prezinta un interes din ce in ce mai crescand, datorita pe de o parte morbiditatii si mortalitatii ridicate, iar pe de alta parte faptului ca ele debilitand organismul, sunt responsabile de infectii secundare[5].

Aceste considerente au facut pe cercetatori sa acorde atentie microflorei aeriene si sa puna la punct metodele de studiere [58]. Activitatea fiind inceputa insa nu de mult timp, nu exista un indicator acceptat de toti in privinta gradului de poluare al aerului. Marea majoritate a microorganismelor detectate in aerul incaperilor este reprezentata de specii nepatogene. Se intalnesc frecvent stafilococul alb, sarcini, micrococi banali, bacilul subtilis, mezentericus etc.

Totusi, autorii considera ca, numarul acestor germeni nepatogeni crescand, cresc si posibiltatile aparitiei intre ei a celor patogeni. Acest rationament a condus pe unii la concluzia ca nu este absolut necesara izolarea germenilor patogeni in aerul cercetat pentru a-l considera impoluat. Este suficient numai numarul mare de nepatogeni pentru aceasta, intrucat acestia pot impiedica prin actiunea lor antagonista pe cei patogeni sau il pot masca numeric.

Altii insa socotesc ca acest mod de a privi lucrurile este insuficient, intrucat privita numai cantitativ, microflora aeriana furnizezeaza date incomplete [2, 11]. Ei socotesc ca este absolut necesar cercetarea calitativa, intrucat unele specii pot orienta asupra sursei de unde acesti germeni provin. Prezenta streptococului viridans sau a celui hemolitic orienteaza catre o impurificare cu flora apartinand cailor aeriene superioare, prezenta bacilului coli catre o impurificare a aerului cu praf ce contine materii fecale etc.

Bacteriologia solului este in stransa legatura cu prezenta substantelor organice. Cercetarile facute in deserturi si ghetari au aratat ca in locurile unde nu se gasesc substante organice nu se gasesc germeni.

Microorganismele solului sunt microorganisme provenite in marea lor majoritate de la om si animale. Acestia, impreuna cu altii existenti in sol, transforma moleculele organice in produsi foarte simpli. Cu ajutorul diastazelor pe care le secreta, microbii descompun substantele ternare. Ei peptoneaza materiile albuminoide si permit putrefactia. Fenomenul de putrefactie al materiilor albuminoide consta in transformarea lor in peptone, apoi in aminoacizi si mai departe in leucina, tirosina si indol, scatol etc. putrefactia este initiata de germeni aerobi si apoi desavarsita de cei anaerobi si se desfasoara in mai multe stadii. In primul stadiu, azotul organic este transformat in azot amoniacal sub influenta unor germeni ca: bacilul proteus, coli, piocianic, perfringens etc. azotul amoniacal este insa o otrava puternica pentru plante. Tot cu ajutorul microorganismelor el este transformat in azot nitros, apoi in azot nitric pentru a se ajunge in final la nitrati asimilabili.

Deci, diferitii germeni ai solului concura la realizarea unui adevarat ciclu al azotului in natura, a carei importanta vitala este incontestabila.

Bacteriile solului prezinta de asemenea un imens interes din punct de vedere al biologiei generale, intrucat fara ele viata pe pamant ar fi imposibila [42].

Trebuie subliniat insa ca privind prin prisma medicala ceea ce intereseaza in primul rand este rolul patogen al germenilor.

Primii microbi patogeni au fost izolati din sol de catre Pasteur. Este vorba de vibrionul septic si bacilul anthracis.

Pana in prezent nu exista o metoda unanim acceptata in ceea ce priveste analiza bacteriologica a solului.

Scopul analizei este de a pune in evidenta germenii care sunt socotiti a fi indicatori generali sau specifici ai impurificarii solului. Medicina este interesata de starea bacteriologica a solurilor centrelor locuite, a solurilor tributare surselor de apa, sau a celor irigate pentru cultivarea legumelor si zarzavaturilor.

Experientele facute de Biot au aratat ca multiplicarea microbilor in sol este in functie de distributia materiilor organice, de umiditate, de temperatura si de gradul de impurificare.

Cei mai multi microbiologi considera ca solul ca mediu, nu favorizeaza dezvoltarea germenilor patogeni.

Cand se cerceteaza bacteriologia apei [5], germenii care pot fi intalniti se incadreaza in una din urmatoarele categorii:

1)germeni naturali ai apei

2)germeni ce ajung in apa prin apa de canal

3)germeni din aer si sol

O multitudine de factori fac ca acesti factori sa varieze . Printre acesti factori se citeaza:

Felul apei – de suprafata (de profunzime-aceasta fiind relativ pura);

– apa de ploaie contine germenii particulelor de praf

-grindina este mai bogata in germeni datorita curentilor repezi care o preced si care ridica in atmosfera o cantitate mare de praf pe care apoi o inglobeaza;

-gheata cuprinde germeni in functie de apa din care a provenit;

-puturile putin profunde contin germeni in functie de constructie si de dispozitivul de scos;

– apa de suprafata de munte este de obicei pura;

-apa raurilor contine un numar mare de germeni;

-apa lacurilor este mai pura datorita actiunii de autopurificare;

-apa de mare este saraca in germeni datorita dilutiei realizate;

-apele minerale contin un numar redus de germeni.

Biotehnologiile sunt o sursa de poluarea mediului, in mod special cele care includ bioconversia unui mare numar de substante organice prin fermentatie si prin procesele metabolice ale organismelor. In industria farmaceutica, antibioticele sunt produse pe scara larga prin procese fermentative, cu exeptia cloramfenicolului; 400000 l de materiale brute pot fi prelucrate in acest fel, produsele reziduale incluzand celule microbiene, anumite produse de metabolism ca si ingrediente nefolosite din mediile de cultura.

Produsele secundare si reziduurile care contin hidrati de carbon pot fi convertite prin fermentatii microbiene conventionale sau prin tehnologii biotehnologice care reprezinta o parte a microbiologiei industriale. Bacteria anaeroba Thermobacteroides saccharolyticum descompune hemicelulozele din furaje si deseuri lemnoase la o temperatura care depaseste 400C. produsele finale au inclus printre altele etanol si acid lactic. Cercetatorii de la S.E.R.I.au reusit sa izoleze enzimele implicate in descompunerea si fermentarea produselor secundare obtinute.

Scheineder de la Consiliul National pentru cercetare Stiintifica din Canada si Tsao de la Universitatea Purdue au raportat, independent, ca dupa ce xiloza este convertita in xiluloza, ea poate fi transformata in etanol prin procesul de fermentare produs de Saccharomyces cerevisiae. Xiloza poate fi convertita in xilitol, substanta cu o mare capacitate de indulcire, fara a produce carii dentare.

Purificarea apelor de canalizare si eliminarea unei mari proportii de materii organice din efluntii reziduali sunt realizate prin folosirea microorganismelor aerobe si a celor anaerobe.

Microbiologii utilizeaza 5 tehnici pentru manipularea, examinarea, si caracterizarea microorganismelor: inocularea, incubarea, izolarea , inspectia si identificarea.

1.10 Microorganisme marine pentru producerea de metaboliti bioactivi

Au fost facute o serie de incercari de a explora potentialul microorganismelor marine pentru producerea de metaboliti activi, in ultimii zece ani organismele marine s-au aratat inzestrate cu un numar foarte mare de compusi naturali noi [8]. Compusii de un mare interes sunt in principal cei derivati din microorganisme cum ar fi spongii, coralii[3]. Numarul metabolitilor secundari proveniti din microorganismele marine este mic, dar in rapida crestere. Datorita enormelor dificultati pe care le implica produsii izolati din animalele marine, precum si faptul ca unii compusi bioactivi sunt produsi de bacterii asociate, avantajele producerii de metaboliti activi de bacterii sau de fungi, sub protectia resurselor animale, pare a fi foarte atractiva pentru viitor [9].

Bacteriile marine pot fi definite ca fiind acele bacterii care au nevoie absoluta de clorura de sodiu- insa aceasta nu este o definire buna intrucat au fost izolate multe baterii marine care pot tolera limite largi de salinitate. Aceasta a dus la concluzia ca acestea sunt de fapt organisme terestre care au fost duse de rauri in oceane. Microorganismele marine au fost de aceea definite ca bacterii ce au fost izolate din surse marine pe medii marine [14].

Prezent, sunt cunoscute trei spoturi filogenetice microbiene pentru producerea de metaboliti secundari [59]:

-Streptomicete, un grup de bacterii Gram positive (Actinomycete) din care se izoleaza produsi naturali [15].

-Myxobacteria, bacterii mobile cu un ciclu de viata complex care formeaza un gen distinct cu δ-subclase ale Proteobacterii si care s-au dovedit o sursa bogata de activitati structurale si biologice noi [16, 17].

-Cyanobacteria, alge albastreverzi, bacterii fotosintetice care sunt distribuite peste tot si produc toxine [18, 19, 20].

In plus, antibioticele si alte bactericine sunt detectate in bacteriile lactice, dar au fost gasite mai tarziu si in microorganismele Gram positive [44]. Bacteriile lactice sunt un grup de bacterii nesporulate, anaerobe, fermentative [21].

Se fac cercetari pentru explorarea sistematica a posibiliattilor metabolice a bacteriilor din Marea Nordului cu producerea de compusi bioactivi [1]. Cultivarea bacteriilor marine sunt cunoscute pentru cresterea lor lenta si preferintele lor pentru medii cu continut nutritiv scazut. Productiile extrase sunt de aceea de cele mai multe ori mici, rezultand probleme legate de limitele de detectie pentru produsii naturali. De altfel este cunoscut ca mediul si conditiile de crestere au un efect profund in producerea metabolitilor secundari [22].

Cultivarea si izolarea bacteriilor sunt influentate de o serie de parametri, incluzand sursa precisa de prelevare (este aproape imposibil de a extrage probe identice din natura), pretratamentul probei (depozitarea, racirea, transportul, amestecarea, filtrarea, etc.), imbogatirea procedurilor si nu in ultimul rand conditiile de mediu si de incubatie folosite la cultivarea bacteriilor [57].

Intr-una din strategiile de izolare a bacteriilor marine care se gasesc in abundenta in marea Nordului, folosind “conditii naturale” care nu sunt selective pentru speciile care cresc cel mai rapid, s- au folosit probe nefiltrate de apa din Marea Nordului. Probele au fost procesate la o ora dupa ce au fost prelevate. Nu s-a efectuat nici o imbogatire, dar s-au obtinut colonii individuale prin dilutii seriate si apoi insamantarea dilutiilor pe placi

Placile au fost incubate la temperatura camerei timp de 4 saptamani. Cresterea eucariotelor si protozoarelor a fost prevenita prin adaosul de antibiotice cicloheximide [23].

Produsii extractului au fost separati prin cromatografie in strat subtire folosind pentru developare diferiti agenti, iar migrarea spoturilor este pusa in evidenta cu unul din agentii: anisaldehida sau Ehrlich’s. Cu ajutorul cromatografiei de lichide de inalta performanta, UV si RMN se pot obtine informatii despre structura produsilor separati [43, 45, 54].

Sensibilitatea metodelor biologice de analiza este mai mare decat a metodelor chimice si pot fi detectate cantitati in urme din compusul de interes.

In timpul ultimelor cinci decade de cercetare a medicamentelor anticancerigene s-au descoperit aproape 100 de produsi care se pot folosi in tratamentul clinic al cancerului.

Organismele marine reprezinta o sursa larga, neexplorata de substante chimice, toxice [52].

Aceste toxine sunt produse de microorganisme , ca arme de aparare impotriva pradatorilor. Cativa compusi au demonstrat activitate antitumorala in vitro si in vivo, compusi izolati din organisme marine: briostatin (de la Bugula neritina), dolastin 10( de la Dolabelle auricularia) si halichondrine B ( de la Halichondria okadai) [10].

Pasii urmariti in cercetarile medicamentelor antitumorale din organismele marine sunt prezentati in figura de mai jos:

Achizitie

↓

cultivarea+ prepararea extractului crud

↓

ecranarea liniei de baza a celulei tumorale

↓

izolarea metabolitului activ si determinarea structurii

↓

producerea

↓

analize antitumorale in vivo

↓

toxicologie si farmacodinamica

↓

experimente clinice

Izolarea si determinarea structurii sunt procese “mancatoare” de timp si scumpe, chiar daca se folosesc cele mai moderne metode. Este de aceea important de a recunoaste si exclude compusii cunoscuti in stadiul cel mai timpuriu, proces denumit dereplicare. Pentru aceasta proprietatile amestecului sau a metabolitilor puri sunt comparate cu datele din literatura [51].

Mai des folosite sunt comparatiile cu datele spectrometriei de masa si timpilor de retentie din cromatografia de lichide de inalta performanta cu colectii de date cu referinte apropiate, metode care necesita numai cantitati minime si ofera rezultate credibile.

Cea mai importanta colectie de date a compusilor naturali este “Dictionarul compusilor naturali” care cuprinde metabolitii tuturor surselor naturale din plante. Mai potrivita pentru dereplicarea produsilor microbieni este o colectie proprie de date care permite identificarea rapida trasaturilor structurale combinate si date spectroscopice, instrumente care nu sunt valabile in DNP [38, 39].

Singura metoda care este aplicata amestecurilor, pentru elucidarea structurii produsilor este spectrometria de masa. Nu toate tipurile de compusi, sunt accesibili prin aceasta metoda. Unii compusi au nevoie mai departe de teste biologice, amestecurile fiind separate inainte de analiza. Purificarea constituentilor bacterieni incepe de obicei intr-un mod foarte conventional cu un pas de extractie a culturii crude la un pH neutru sau usor acid. Organismele micelului format sunt separate prin filtrare, iar masa celulara si filtratul sunt extrase separat.. Pentru faza lichida, rasina adsorbanta permite o rata inalta de recuperare a metabolitilor si costuri ale procesului scazute datorita posibilitati de refolosire a rasinei. Daca se aplica extractia lichid- lichid sunt favorizati solventii de polaritate medie sau inalta. Solventul ales este etil acetatul si numai in unele cazuri butanolul. Pentru a extrage materialul celular umed poate fi folosit: etil acetat, acetona sau diclormetan/methanol [53].

In extractul crud se gasesc si trigliceride, acizi cu lant lung, hidrocarburi, si cativa compusi nepolari care necesita tehnici de separare diferita. Majoritatea acestor compusi sunt inlaturati din solutie metanolica prin extractia cu ciclohexan. Activitatea antibiotica este rareori intalnita in in faza lipofila.; oricum prin folosirea gaz cromatografiei-spectrometria de masa si teste celulare pentru citotoxicitate s-au gasit in unele cazuri compusi cu o puternica citotoxicitate .

Pentru operatia de purificare finala sunt folosite cromatografia in faza normala, in faza inversa precum si alte tehnici. Nu este o regula generala cum sa procedezi, dar datorita capacitatii inalte a absorbtiei ireversibile a Sephadexului, excluziunea sterica ar trebui folosite la inceput, in timp ce HPLC este mai bine de utilizat in pasii finali de purificare.

In concluzie cercetarea de noi metaboliti chimici in microorganismele marine este o procedura cu pasi multipli care incepe cu selectia celei mai potrivite surse si cultivarea [37].

Haliangicin, un nou antibiotic β-methoxyacrilat a fost izolat dintr-o cultura a speciei myxobacterium marine [24]. Aceasta specie este privita ca o sursa de metaboliti secundari si au fost izolate mai mult de 800 de structuri noi si mai mult de 400 de variante a acestor compusi.

Strain-ul AJ-13395 myxobacterial a fost izolat dintr-o proba de alge marine colectate din peninsula Miura, Japonia. Prin studii filogenetice si fiziologice , acest strain a fost numit Haliangium luteum.

Aceasta a fost cultivata la 280 C pe un mediuVy2-ASW . Acesta contine (pe litru de apa de mare artificiala) drojdie Baker’s, 5 g; cianocobalamina, 0.5 mg; agar, 15 g [25]. Dupa ce diametrul coloniei radiale a atins in jur de 5 cm, piesele de agar bacterian au fost smulse cu fire de plastic sterilizate de la periferia coloniei. Zece piese de agar au fost omogenizate si inoculate in pahare Erlenmayer continand 100 ml dintr-un mediu ce contine: extract de drojdii, 1 g, Na Cl 20 g, citrat de fier, 0.1 g, MgSO4ּ7H2o 8 g, CaCl2ּ2 H2o 1 g, KCl 0.5 g, NaHCO3 0.16 g, H3BO3 0.02 g, KBr 0.08 g, SrCl2 0.03 g, glicerofosfat disodic 0.01 g, pH 7.0 cu KOH. Fermentatia a fost realizata intr-un agitator rotativ la 280C pentru 17 zile.

Productivitatea haliangicinei a fost masurata prin HPLC a extractului in acetona al celulelor bacteriene. Detectia s-a facut prin absorbtie UV la 254 nm iar timpul de retentie a fost 16.5 minute

Productia incepe in a 7 a zi si atinge un maxim in ziua a 12-a.

Prezinta activitate puternica impotriva fungilor filamentosi comparativ cu amfotericin B si nistatin [46, 48, 49]. Haliangicina arata de asemenea efecte antimicrobiene impotriva fungilor oomycete, in schimb nu arata activitate inhibitorie impotriva bacteriilor.

Haliangicina este primul antibiotic izolat dintr-un strain myxobacterial de origine marina. Myxobacteriile sunt cunoscute a fi bogate surse de antibiotice , in special acele care inhiba respiratia. O serie de inhibitori respiratorii (aproape 20 ) au fost gasiti in myxobacterii[29].

Un alt articol trateaza o alta clasa de antibiotice-cea a tetrocarcinelor, mai precis doi membrii noi ai acestei clase si anume: arisostatin A si B din Micromonospora sp. TP-A0316 [26].

Acest strain a fost obtinut din fluidul de cultura prin extractie cu solventi si purificare cromatografica. S-a demonstrat activiatea antibiotica impotriva bacteriilor Gram-pozitive si activitatea antitumorala.

Acest strain, TP-A0316, producator de arisostatin, a fost izolat din probe de apa de mare colectate din Toyama Bay, Japonia. Sporii acestui strain s-au obtinut prin metoda filtrarii prin membrane si cultivarea pe placi cu agar. O cultura pura din acest strain s-a pastrat in 20% glicerol la -800C.

Producerea de tetrocarcin A in pahare Erlenmayer , cultura atinge un maxim de 41 mg/l dupa 7 zile. Compozitia peretelui celular a fost analizata printr-o metoda descrisa de Lechevalier si colab., folosind cromatografia pe strat subtire [27].

Activitatea antitumorala a tetrocarcin A a fost descrisa intr-un articol fara a se discuta mecanismul [28].

Bacteriile speciei Microbacterium, izolate din spongi Halichondria panicea, produc patru glicerolipide si un difosfatidilglicerol atunci cand sunt cultivate in supa marina sau pe mediu de apa de mare artificiala.

Lipidele au fost izolate prin cromatografie pe coloana si structurile au fost elucidate folosind tehnici de RMN si tehnici ale spectrometriei de masa.

Daca la mediul ASW se adauga 20g/l glucoza productia de glicolipide este la 200 mg/l. Compusul principal descreste tensiunea superficiala a apei sub 33mN/m si tensiunea interfaciala a sistemului apa/n-hexadecan sub 5mN/m. In plus, glicerolipidul principal a aratat activitati antitumorale.

Este bine cunoscut faptul ca spongii marini sunt surse importante de noi compusi bioactivi [30,31,32]. In acest articol sunt prezentate conditiile de cultivare ale bacteriei, izolarea, identificarea, elucidarea structurii acestor compusi, dar si proprietatile lor fundamentale de surfactanti si activitatea biologica.

Pentru a izola cultura pura din specia Microbacterium, piese de material proaspat au fost au fost recoltate in conditii sterile si insamantate pe agar de supa marina. Dupa incubare la 270C pentru 3 zile, o singura colonie galbena a fost obtinuta si transferata pe placi noi pentru a imbogati cultura pura de Microbacterium sp.

Cand cresterea are loc pe supa de marina continand peptone si extract de drojdie ca sursa de carbon si azot, specia de Microbacterium produce acid antranilic si acid fenilacetic. Ambii compusi aromatici sunt eliberati in supernatant si ating pana la 14 mg/l [33].

In plus, aceasta specie produce in final patru glicerolipide si un difosfatidilglicerol. Centrifugarea supei bacteriene dupa cultivare si extractia separata a supernatantului si a celulelor a aratat ca toate aceste lipide sunt asociate cu celulele. Initial studiul a fost facut prin cultivarea in pahare Erlenmayer de 100 ml. O incubare la temperature de 300 C a aratat cea mai buna crestere si producerea glicolipidelor, in timp ce la temperaturi mai scazute (27, 20, 10 si 40C) cresterea se produce mai incet iar la temperaturi mai mari (34 si 370C) cresterea inceteaza. Aditia unei cantitati de 20 g/l glucoza mediului, cauzeaza imbunatatirea cresterii si o productie inalta de glicerolipide.

Schimbarea mediului marin al ASW cu cantitati de extract de drojdie(3.5g/l) si peptona (3.5 g/l) ofera cele mai bune rezultate pentru cresterea culturii si producerea lipidelor.

O comparatie a diferitelor surse de azot a indicat ca cea mai mare productie de glicerolipid a fost atinsa cu clorura de amoniu, mai buna decat in cazul folosirii sulfatului de amoniu, nitrat de amoniu sau nitrat de sodium [34].

Cu o concentratie initiala de glucoza de 20 g/l cresterea inceteaza cu 11-12 g/l de biomasa uscata dupa 30 de ore cand sursa de carbon a fost evacuata. Formarea glicerolipiului a atins valoarea maxima dupa 27 h. Activitatea fiziologica a fost indicata prin masurarea presiunii partiale a oxigenului, viteza de consumare a oxigenului, viteza de producere a dioxidului de carbon, si a fost in acord cu cresterea celulara aratand cele mai mari valori in timpul fazei exponentiale de crestere. Analiza calitativa a extractului celular crud prin TLC a aratat un difosfatidilglicerol la Rf 0.16 si patru fractii de glicerolipide la Rf 0.31, 0.45, 0.56, 0.6. Aceste glicerolipide sunt frecvent intalnite drept componente ale peretelui celular [12,13, 35].

Dupa separarea si purificarea pe coloane de silicagel, au fost elucidate structurile chimice ale compusilor izolati prin RMN si spectrometrie de masa.

In timpul ultimilor 20 de ani, grupuri de chimisiti de produsi naturali marini , in colaborare cu farmacologi si impreuna cu industria farmaceutica, au raportat un numar mare de metaboliti noi cu proprietati folositoare si uneori chiar senzationale. Oceanele sunt sursele unui mare grup de produsi naturali, cu structuri unice [36, 37, 38, 39]. De la descoperirea penicilinelor, microorganismele terestre s-au dovedit a fi cele mai bogate surse de medicamente naturale care sunt indispensabile in special pentru tratamentul bolilor fatale cum ar fi cancerul. Este interesat de notat ca majoritatea produsilor naturali marini utilizati in incercarile clinice sunt produse de nevertebrate cum ar fi spongi, moluste, sau briozoare si nu de alge [40]. Acesta este un mare contrast fata de mediul terestru unde plantele depasesc animalele din punct de vedere al producerii produsilor naturali bioactivi.

1.11 Cromatografia in strat subtire

Cromatografia in strat subtire este o metoda simpla, microanalitica, selectiva si rapida. Comparata cu cromatografia pe hartie, cromatografia in strat subtire prezinta urmatoarele avantaje: eficienta, sensibilitate si viteza mai mare, spoturi mai compacte, posibilitatea folosirii agentilor corosivi si a temperaturilor mai ridicate [6].

Cromatografia in strat subtire se bazeaza pe separarea unui amestec de substante , care migreaza cu ajutorul unui solvent adecvat, printr-un strat subtire de material absorbant.

Separarea compusilor din amestec se realizeaza prin mecanisme de adsorbtie, partitie, schimb ionic, filtrare in gel sau prin combinarea acestora. Procesul de adsorbtie este cel mai frecvent utilizat. In acest caz, proba de cercetat este continuu fractionata pe masura ce migreaza prin stratul de adsorbant. Competitia ce are loc intre proba de analizat si solvent pentru locurile active ale adsorbantului, permite fractionarea succesiva a probei respective. O parte din proba se va gasi in faza lichida, mobila, iar alta parte va fi adsorbita pe particule solide ale adsorbantului [41].

In felul acesta, diversele componente ale probei de cercetat se deplaseaza la distante diferite in functie de afinitatea lor pentru materialul adsorbant.

Distanta de migrare reprezinta valoarea Rf, care este raportul dintre distanta parcursa de substanta A (masurata de la O la A) si distanta frontului de solvent (masurata de la O la F).

Pentru calcularea valorii Rf se masoara distanta de la start pana la centrul petei (OA) si distanta de la start pana la linia de migrare a frontului de solvent(OF). Se aplica formula Rf =OA/OF.

Valorile Rf definesc pozitia petelor de cromatograma. Conform definitiei, valorile Rf sunt mai mari decat 0 si mai mici decat 1.

Valorile Rf mai mari decat 1 se intalnesc in cazuri exceptionale, in care amestecul de dizolvanti formeaza doua fronturi; calculul se face in raport cu frontul mai apropiat de linia de start.

Valorile Rf sunt influentate de numerosi factori, care trebuie riguros controlati pentru a obtine rezultate reproductibile. Acesti factori sunt:

-calitatea adsorbantului

-grosimea stratului de adsorbant

-gradul de activitate al adsorbantului

-marimea porilor adsorbantului

-calitatea si natura solventilor folositi

-temperatura la care se executa cromatografia

-distanta de migrare (distanta intre frontul dizolvantului si linia de strat trebuie sa fie de minimum 10 cm)

-tehnica aplicata (ascendenta, descendenta, orizontala)

-cantitatea de proba aplicata

-conditii standard in timpul operatiunilor (aplicarea probei, uscare, developare, evaluare).

Produsii extractului sunt separati prin cromatografie in strat subtire folosind pentru developare diferiti agenti iar migrarea spoturilor este pusa in evidenta cu unul din agentii: anisaldehida sau Ehrlich’s.

2.Partea practica

2.1 Introducere

Microbiologia industriala este un domeniu al Microbilogiei aplicate care studiaza utilizarea microorganismelor pentru obtinerea de substante utile in alimentatie, medicina sau diverse industrii [56]. De obicei, aceste substante sunt compusi secretati in mediu in timpul cresterii microorganismelor, dar pot fi si substante care intra in constitutia celulei microbiene.

Microorganismele utilizate in microbiologia industriala apartin principalelor tipuri cunoscute: bacterii, fungi microscopici (drojdii si mucegaiuri) si microalge.

Microorganismele folosite in industrie trebuie sa posede urmatoarele caracteristici:

Sa fie culturi pure, nu numai lipsite de alte microorganisme vizibile la

microscop, ci si lipsite de fagi;

Sa creasca rapid si viguros dupa inoculare, pentru a obtine cantitati mari

de inocul, inainte de procesul industrial;

Sa creasca pe un substrat ieftin, pe care sa il transforme in cea mai mare

parte si intr-un timp cat mai scurt, producand cantitati maxime de produs util si cantitati minime de produse secundare;

Sa tolereze cantitati mari de produs final, fara sa il metabolizeze,

permitand acumularea lui in mediu separarea usoara de alti produsi;

Sa nu produca substante toxice;

Sa manifeste rezistenta la contaminare, fie prin capacitatea de crestere la

pH scazut sau la temperaturi ridicate, fie prin elaborarea rapida de inhibitori microbieni;

Sa fie stabile genetic, adica, sa-si conserve in timp caracterele biochimice,

fara riscul variatiilor genetice.

Aproape toate procesele microbiologice industriale necesita izolarea initiala a culturii din natura, urmata de cultivari si optimizarea la scara mica, inainte ca producerea la scara mare sa devina realitate.

Aceasta variaza pentru fiecare organism deoarece, fiecare poseda exigente nutritive speciale. Totusi, orice mediu de cultura, trebuie sa contina in general: o sursa de carbon si energie, o sursa de azot, elemente minerale si adesea, factori de crestere, care sunt vitaminele din grupul B.

Sursa de carbon este reprezentata de glucide. In mediile de cultura industriale, mai rar se folosesc glucide pure deoarece sunt scumpe.

Sursa de azot este reprezentata de azot mineral, sun forma de saruri de amoniu sau nitrati sau/si azot organic sub forma de hidrolizate proteice de natura animala sau vegetala ca: peptone, extract de carne, faina de soia, faina de alune etc,

Factorii de crestere sunt adusi de extractul de drojdie, extractul de ficat sau reziduurile de la distilarea alcoolului. Acestea din urma sunt bogate in proteine si vitamine din grupul B.

Elementele minerale sunt adaugate in mediu sub forma de solutii de saruri minerale sau organice, mai mult sau mai putin complexe, desi apa de la robinet le aduce in cantitate suficienta pentru cresterea majoritatii microorganismelor utilizate in industrie.

Inafara substantelor enumerate mai sus, in mediile de cultura industriale se adauga uleiuri vegetale sau minerale, cele vegetale au un rol dublu: atat ca antispumanti, fiin agenti tensioactivi, cat si ca sursa nutritiva de carbon. Uleiurile minerale, de obicei hidrocarburi cu greutatea moleculara mare, se folosesc numai ca antispumanti, ele nefiind metabolizate de microorganisme [47, 55].

2.2 Materiale si metode

2.2.1 Microorganismul

Microorganismul cultivat face parte din specia Gelidibacter, si a fost izolat din Marea Nordului.

2.2.2 Reactivi

Substantele chimice care au fost utilizate in acest experiment au fost achizitionate de la Fluka (Neu-Ulm, Deutschland) si Merck KgaA (Darmstadt, Deutschland).

Extract de drojdie: (Ohly, Hamburg, Germany)

2.2.3 Etapa de laborator

Cultivarea in pahare Erlenmayer “shake flask”

2.2.3.1. Mediul pentru precultura

Marine Broth 2216 (Difco mediu dinainte preparat) 37.4 g/l

2.2.3.2 Mediul pentru cultura principala

Mediul pentru cultivarea bacteriilor din Marea Nordului este Mediul 6.

Acest mediu este un mediu Luria-Bertani modificat (KSW-LB). El consta intr-un amestec in raport de 1:1 de solutie complexa si apa de mare artificiala. Valoarea pH-ului mediului astfel preparat trebuie sa fie in jurul cifrei de 7.2.

Solutia complexa si apa de mare artificiala nu au fost autoclavate impreuna pentru a se evita reactiile nedorite.

Solutia complexa LB-mediu (1000 ml)

Triptona: 20 g

Extract de drojdie 10 g

NaCl 20 g

Completat cu apa pana la 1000 ml

pH-ul adjustat in jur 7.5 cu KOH 1 N

Apa de mare artificiala (KSW) (1000 ml):

Citrat feric 0,1 g (maruntit seaparat)

NaCl 19.45 g

MgCl2 ּ 6H2O 8.8 g

Na2SO4 3.24 g (dizolvat separat)

CaCl2 1.8 g

Na2HPO4 0.008 g

SiO2 0.015 g

Solution I 1 ml

Solution II 10 ml

Apa distilata pana la 1000 ml

Solutia I ( Trace element solution):

H3BO4 0.611 g

MnCl2 0.389 g

CuSO4 0.056 g

ZnSO4ּ7H2O 0.056 g

Al2(SO4)3ּ18H2O 0,056 g

NiSO4 ּ 6H2O 0.056 g

Co(NO3)3 ּ H2O 0.056 g

TiO2 0.056 g

(NH4)6Mo7O24 ּ 4H2O 0.056 g

LiCl 0.028 g

SnCl2 0.028 g

KI 0.028 g

Apa distilata pana la 1000 ml

Solutia II

KCl 55 g

NaHCO3 16 g

KBr 8 g

SrCl2 ּ6H2O 3.4 g

H3BO3 2.2 g

NaF 0.24g

NH4NO3 0.16g

Apa distilata pana la 1000 ml

Glucoza 50 g/l (Solutia de glucoza trebuie sterilizata separat la 1210C pentru 25 minute).

2.2.4 Fermentatia

Conditiile in care a avut loc fermentatia au fost urmatoarele:

Volumul: 40 l

Temperatura: 270C

Viteza de rotatie: 300 rpm

Viteza de aeratie: 0.25 V/VM

pH-ul de start: 7.5

Mediul pentru cultivarea bacteriei intr-un bioreactor de 40 l

40 l de mediu LB= Mediul complex+Apa artificiala de mare + Precultura.

Mediul complex

Triptona: 400 g

Extract de drojdie: 200 g

NaCl: 400 g

Apa artificiala de mare

Citrat Feric ּH2O 2.146 g (maruntit seaparat)

NaCl 389 g

MgCl2 ּ 6H2O 176 g

Na2SO4 64.8 g (dizolvat separat)

CaCl2 ּ 2 H2O 47.68 g

Na2HPO4 ּ 2 H2O 0.2 g

SiO2 0.3 g

Solutia I 20 ml

Solutia II 200 ml

Apa distilata pana la 40 l –solutia de precultura (4 l)

pH-ul adjustat 7.5 cu NaOH 10%

precultura 10% -4 l

In timpul fermentatiei au fost prelevate 15 probe, dintre care 8 in primele 24 de ore si 7 in urmatoarele 24 (timpul de fermentatie a fost de 48 de ore).

Sistemul este prevazut cu sistem de prelevare automat, pentru recoltarea probelor “overnight”.

2.2.5 Metode de analiza

Biomasa uscata (BTM)

-Din fiecare proba prelevata s-au luat 10 ml din suspensia de cultura in niste tuburi de metal pentru centrifuga ( inainte s-a notat greutatea acestor tuburi).

-s-au pus la centrifugat la 13000 rpm. Dupa centrifugare, supernatantul a fost colectat , sterilizat si aruncat

-tuburile mai sus mentionate au fost uscate intr-un cuptor pentru 48 de ore la 1000C

-s-a determinat dupa aceasta greutatea probei uscate ( biomasa uscata).

Absorbanta

Solutia probei a fost astfel diluata incat sa se obtina valori ale densitatii optice intre 0-0.5. Densitatea optica a fost citita la un spectrometru UV-Vis la o lungime de unda de 546 nm.

Testul de glucoza

Continutul de glucoza al suspensiei bacteriene a fost masurat cu ajutorul unor benzi-test ale unui aparat de masura –Accutrend Alpha

Valorile pH-ului

Valorile de pH s-au masurat folosind un electrod de pH

Extractia ( izolarea produsului crud din supa fermentata)

-s-au luat cate 150 ml din fiecare proba si s-a adjustat pH-ul la 3-4 cu HCl 5N

-se amesteca proba cu 150 ml MTBE (tert metil butil eter) si se agita amestecul 20 de minute

– amestecul se transfera intr-o palnie de separare si, dupa separarea fazelor se colecteaza faza inferioara. Se repeta operatia de extractie cu faza inferioara colectata

– se colecteaza fazele organice de la prima si de la a doua extractie, se adauga Na2SO4 pentru uscare si apoi se filtreaza,

-extractul colectat este supus apoi operatiei de uscare la rece.

Dupa extractia si prelucrarea produsului crud s-a facut cromatografie pe strat subtire cu 15 μL solutie . Ca agenti de elutie s-au folosit urmatoarele amestecuri de solventi:

Cloroform/metanol=95/5

Diclormetan/metanol=95/5

Cloroform/metanol/apa=65/15/2

Cromatografie pe strat subtire

Pentru aceasta se folosesc 15ּ10-3 ml din extractul colectat

Ca agent de developare s-a utilizat CHCl3/CH3OH/H2O=65/15/2

Dupa uscarea placutelor cromatografice, acestea au fost puse la lumina UV-la 2 lungimi de unda -254 nm si 366 nm.

Ca agent de detectie s-a folosit Anisaldehyda pentru evidentierea hidratilor de carbon, si reactivul Ehrlich’s ca indicator al compusilor cu azot.

Reactivul Ehrlich’s

p-Dimetilaminobenzaldehida 1 g

metanol 75 ml

HCl (36%) 25ml

Anisaldehida

Anisaldehida 0,5 ml

acid acetic (conc.) 50 ml

acid sulfuric (conc.) 1 ml

Extractul crud se depoziteaza la camera de racire dupa utilizarea in cromtatografie in strat subtire..

Au fost folosite culturi de microorganism Gelidibacter izolate de o echipa din Braunschweig si de una din Göttingen.

2.3. Rezultate

Scopul primului experiment a fost de a determina temperatura optima pentru cultivarea microorganismului. Astfel, au fost pregatite 24 de pahare, fiecare cu cate 100 ml, in diferite conditii.

-12 cu proba ;

-12 fara proba, pentru extractie.

Acestea au fost inoculate cu 1ml (1%) solutie de precultura. Paharele astfel pregatite au fost incubate la diferite temperaturi, la un agitator mecanic -100 rpm.

Tabelul 3.1 Conditiile de cultivare.

-Braunschweig-12 pahare- 6 cu proba -3 cu glucoza-1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

-3 fara glucoza -1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

– 6 fara proba -3 cu glucoza -1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

-3 fara glucoza -1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

-Göttingen -12 pahare – 6 cu proba-3 cu glucoza -1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

-3 fara glucoza -1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

– 6 fara proba -3 cu glucoza -1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

-3 fara glucoza -1*22 0C

-1*27 0C

-1*30 0C

Pentru paharele “fara proba” , cultivarea a fost stopata dupa 7 zile. Pentru celelalte 12 pahare “ cu proba” cultivarea a fost oprita dupa 4 zile, si zilnic au fost luate probe si masurate pH, OD, continutul de glucoza.

Goettingen cu glucoza Braunschweig cu glucoza

Figura 3. Variatia pH-ului cu temperatura pentru Gelidibacter. Sp. in mediul LB cu glucoza.

Se observa o valoare maxima a valorilor de pH dupa 2 zile de la cultivare, atat in cazul in care in mediu a fost adaugata glucoza, cat si in absenta acesteia. Dupa aceasta perioada de aproximativ de 48 de ore, atat pH-ul cultura de la 220C cat si al celei de la 300C continua sa creasca putin. In schimb pH-ul culturii de Goettingen de la 270C, si cu glucoza incepe sa scada dupa valoarea maxima atinsa dupa 2 zile.

Pentru cultura de Braunschweig cu glucoza la toate cele trei temperaturi de lucru se observa aceeasi situatie si anume, o crestere pana la pH=8,5, dupa 44 de ore, dupa care se inregistreaza o usoara scadere si apoi iar o crestere a valorilor de pH.

O situatie aproape asemanatoare intalnim si in cazul in care in mediu nu s-a adaugat glucoza:

Goettingen fara glucoza Braunschweig fara glucoza

Figura 4. Variatia pH-ului cu temperatura pentru Gelidibacter. Sp. in mediul LB fara glucoza

Se observa ca, in conditii diferite de lucru variatia valorilor de pH este aproape aceeasi.. De asemenea, aceste valori incep sa creasca la inceputul fazei exponentiale Aceasta arata ca in timpul cresterii bacteriene se produc substante cu caracter alcalin.

Pentru monitorizarea cresterii culturii bacteriene, s-a masurat zilnic adsorbanta suspensiei.

Dupa cum reiese din figura 5 faza de crestere exponentiala se termina dupa 24 de ore.

Goettingen cu glucoza Braunschweig cu glucoza

Figura 5 . Variatia absorbantei (OD) unctie de timp, pentru cele doua culturi, in prezenta glucozei .

Aceleasi conditii dar fara glucoza:

Goettingen fara glucoza Braunschweig fara glucoza

Figura 6. Variatia absorbantei functie de timp, pentru cele doua culturi, in absenta glucozei .

La 220C concentratia maxima este atinsa dupa 24 ore pentru ambele culturi in cazul in care in mediu s-a pus sau nu glucoza, la toate temperaturile si pentru cultura de Goettingen la 22 0C. Asa cum reiese din figurile 5 si 6, faza de crestere se opreste dupa aproximativ 24 de ore. Numarul bacteriilor care mor in aceasta perioada este foarte mic. Viteza de multiplicare este foarte mare. Se numeste perioada de inmultire logaritmica. Este faza tineretii fiziologice. Trebuie retinut ca in aceasta perioada bacteriile prezinta proprietatile caracteristice speciei. Dupa care urmeaza faza stationara-dupa atingerea unui nivel maxim de multiplicare, numarul celulelor vii ramane neschimbat cateva ore;

Dupa aproximativ 24 ore de la incubare, pana la 68 de ore, numarul bacteriilor ramane aproape constant, ajungandu-se la un echilibru, multiplicarea fiind contrabalansata de moarte-aceasta este faza stationara.

Urmeaza apoi faza de declin, in care celulele imbatranesc si viabilitatea lor scade progresiv.

Continutul de glucoza in timpul cultivarii a variat astfel:

Goettingen –glucoza Braunschweig-glucoza

Figura 7. Variatia concentratiei de glucoza functie de timp, pentru cele doua culturi.

O scadere maxima a concentratiei de glucoza s-a observat in cazul culturii de Goettingen de la 300C, dupa care evolutia este identica pentru cele trei temperaturi.

Pentru cultura de Braunschweig, la toate temperaturile de lucru avem aceeasi variatie a continutului de glucoza.

S-a utilizat cromatografia pe strat subtire pentru a putea vedea care sunt conditiile de lucru si care este cel mai potrivit moment de producere a compusului de interes si pentru a vedea ce imbunatatiri pot fi aduse mediului de cultura pentru obtinerea de metaboliti secundari. Compusul urmarit se presupune ca ar apare atunci cand este folosit ca agent de elutie amestecul de solventi: Diclormetan/metanol=95/5 si poate fi vizualizat in lumina UV la 366 nm. Se presupune de asemenea ca acesta apare pe placuta cromatografica la o valoare Rf =0.233.

Dupa developare, substantele colorate sunt observate direct pe suportul plan.

Cele incolore sunt vizualizate prin tratare cu un reactiv cromogenic, pe baza fluorescentei lor sub influenta radiatiilor ultraviolete la doua lungimi de unda 254 nm si 366 nm.

Cloroform/metanol=95/5

Anisaldehida Ehrlich’s

Figura 8. Placutele cromatografice cu extractul fiecarei probe

1-cultura de Braunschweig la 220C cu glucoza

2- cultura de Braunschweig la 220C fara glucoza

3- cultura de Braunschweig la 270C cu glucoza

4- cultura de Braunschweig la 270C fara glucoza

5- cultura de Braunschweig la 300C cu glucoza

6- cultura de Braunschweig la 300C fara glucoza

7- mediu de cultura cu glucoza

8-mediu de cultura fara glucoza

UV 254 nm UV 366 nm

Figura 9. Vizualizarea placutelor cromatografice cu extractul probei la UV

Proba ramane concentrata in partea inferioara a placutei, ceea ce inseamna ca solventul folosit nu este potrivit. Pentru a se putea realiza separarea, este necesara cresterea polaritatii solventului folosit la elutie.

Pe de alta parte compusul urmarit se presupune ca ar apare atunci cand este folosit amestecul de solventi: Diclormetan/metanol=95/5 si poate fi vizualizat in lumina UV la 366 nm. Se presupune de asemenea ca acesta apare pe placuta cromatografica la o valoare Rf =0.233.

Dupa cum se vede in figura 9 nu apare nici un spot la aceasta valoare a Rf.

Aceleasi conditii dar folosind: Diclormetan/metanol=95/5

Ehrlich’s Anisaldehida

Figura 10. Placutele cromatografice cu extractul fiecarei probe

1-cultura de Braunschweig la 220C cu glucoza

2- cultura de Braunschweig la 220C fara glucoza

3- cultura de Braunschweig la 270C cu glucoza

4- cultura de Braunschweig la 270C fara glucoza

5- cultura de Braunschweig la 300C cu glucoza

6- cultura de Braunschweig la 300C fara glucoza

7- mediu de cultura cu glucoza

8-mediu de cultura fara glucoza

In acest caz s-a produs o separare mai buna a compusilor extractului. De asemenea apare pe placuta cromatografica un compus la Rf=0.233 care poate corespunde compusului urmarit. Acesta apare in cazul cultivarii la temperatura de 270C fara glucoza. Deci aceste conditii ar putea fi folosite la cultivarea in bioreactor.

UV 366 nm UV 254 nm

Figura 11. Vizualizarea placutelor cromatografice cu extractul probei la UV

Cloroform/metanol/apa=65/15/2

Ehrlich’s Anisaldehida

Figura 12. Placutele cromatografice cu extractul fiecarei probe

1-cultura de Braunschweig la 220C cu glucoza

2- cultura de Braunschweig la 220C fara glucoza

3- cultura de Braunschweig la 270C cu glucoza

4- cultura de Braunschweig la 270C fara glucoza

5- cultura de Braunschweig la 300C cu glucoza

6- cultura de Braunschweig la 300C fara glucoza

7- mediu de cultura cu glucoza

8-mediu de cultura fara glucoza

UV 254 nm UV 366 nm

Figura 13. Vizualizarea placutelor cromatografice cu extractul probei la UV

La folosirea acestui amestec de solventi nu se observa pe placuta cromatografica spotul de interes, in schimb se separa o seri de compusi noi, care apar pe cromatograma la diferite valori ale Rf, spoturi care nu sunt atribuite componentelor mediului.

Dupa stabilirea temperaturii optime de crestere a bacteriei si anume la 270C, urmatoarele experimente s-au desfasurat la aceasta temperatura si au urmarit obtinerea produsului activ in conditii de mediu diferite, dar si obtinerea diversilor metaboliti secundari, prin adaugarea in mediu a unor aminoacizi.. Pentru aceasta s-a lucrat in urmatoarele conditii:

1 . Mediul LB1 –mediul Luria Bertani redus+ Glicina

Glicina 0.8 g

Triptona 1 g

Extract de drojdie 0.5 g

NaCl 1 g

Apa distilata pana la 500 ml

Mediul LB2 – mediul Luria Bertani redus + L-Tirozina

L-Tirozina 0.8 g

Triptona 1 g

Extract de drojdie 0.5 g

NaCl 1 g

Apa distilata pana la 500 ml

3. Mediul LB3 –mediul Luria Bertani redus + Triptofan

Triptofan 0.8 g

Triptona 1 g

Extract de drojdie 0.5 g

NaCl 1 g

Apa distilata pana la 500 ml

4.Mediul LB4

NaCl 23.0 g

KCl 0.75 g

CaCl2ּ2H2O 1.47 g

MgCl2ּ6H2O 5.08 g

MgSO4ּ7H2O 6.16 g

NH4Cl 5 g

Extract de drojdie 3.5 g

Peptona 3.5 g

Na2HPO4ּ2H2O 0.89 g

Glucoza 20 g

Apa distilata pana la 1000 ml

Precultura Marine Broth 37.4 g/l

Rezultatele obtinute sunt prezentate mai jos:

1. Mediul LB1 –mediul Luria Bertani redus+ Glicina

Figura 14. Variatia pH-ului, cu temperatura pentru mediul LB+Glicina

Se observa o variatie a pH-ului astfel: Faza de lag dureaza aproape 18 ore, dupa care urmeaza faza de crestere exponentiala care se intinde pana in a treia zi. Faza stationara inceteaza dupa aproximativ 131 de ore cand incepe faza de declin, de moarte celulara.

Figura 15. Variatia OD cu timpul pentru mediul LB+Glicina

Variatia absorbantei cu timpul arata o crestere a concentratiei celulare care dureaza aproximativ 48 de ore (faza de crestere). Dupa aceasta se instaleaza faza stationara .

Cloroform/metanol=9/1

Anisaldehida Ehrlich’s UV-366 nm

Figura 16. Placutele cromatografice cu spoturile extractului celular in care:

cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 2 zile de la cultivare

cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 2 zile de la cultivare

cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 4 zile de la cultivare

cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 4 zile de la cultivare

cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 6 zile de la cultivare

cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 6 zile de la cultivare

mediul de cultura LB1 dupa 2 zile

mediul de cultura LB1 dupa 4 zile

In cazul utilizarii acestui amestec de solventi, spoturile nu au migrat ceea ce indica faptul ca solventul nu este potrivit. Se observa o intensificare a spoturilor dupa 4 -6 zile, dar majoritatea spoturilor care apar pe placuta cromatografica provin de la compusii din mediu. Amestecul fiind nepolar, compusii nu se separa deci avem nevoie de un amestec de solventi. mai polar.

Cloroform/metanol/apa=65/15/2

Anisaldehida Ehrlich’s UV 366 nm

Figura 17. Placutele cromatografice cu spoturile extractului celular in care:

1.cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 2 zile de la cultivare

2.cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 2 zile de la cultivare

3.cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 4 zile de la cultivare

4.cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 4 zile de la cultivare

5.cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 6 zile de la cultivare

6.cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 6 zile de la cultivare

7.mediul de cultura LB1 dupa 2 zile

8.mediul de cultura LB1 dupa 4 zile

Diclormetan/metanol=95/5

Anisaldehida Ehrlich’s UV 366 nm

Figura 18. Placutele cromatografice cu spoturile extractului celular in care:

1-cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 2 zile de la cultivare

2-cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 2 zile de la cultivare

3-cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 4 zile de la cultivare

4-cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 4 zile de la cultivare

5-cultura de Braunschweig , in mediul LB1 dupa 6 zile de la cultivare

6-cultura de Goettingen , in mediul LB1 dupa 6 zile de la cultivare

7-mediul de cultura LB1 dupa 2 zile

8-mediul de cultura LB1 dupa 4 zile

In aceste conditii, pe placutele cromatografice nu se intalneste produsul de interes la valoarea de Rf stiuta. Apar in schimb produsi noi, produsi rezultati ca urmare a introducerii gicinei in mediu. Acesti noi produsi reprezinta etapa urmatoare in cercetarea si elucidarea structurii produsilor ce deriva din aceasta specie de microrganism.

Mediul LB2 – mediul Luria Bertani redus + L-Tirozina

Figura 19. Variatia pH-ului cu temperatura pentru mediul LB+ L-Tirozina

In timpul fazei de lag pH-ul se mentine scazut sub valoarea de 7.4, dupa care odata cu inceperea fazei de crestere exponentiala, dupa 48 de ore de la insamantare pH-ul creste, odata cu acumularea in mediu a substantelor cu caracter alcalin, ca urmare a metabolismului celular, dupa care pH-ul ramane constant – faza stationara.

Figura 20. Variatia absorbantei cu temperatura pentru mediul LB+ L-Tirozina

Concentratia celulara atinge valoarea maxima dupa 44 de ore, dupa care urmeaza o faza in care aceasta se mentine constanta, pe durata fazei stationare, bacteriile inmultindu-se dar intr-un ritm mult mai lent fata de faza de crestere exponentiala.

Cloroform/metanol=9/1

Anisaldehida Ehrlich’s UV-366 nm

Figura 21. Placutele cromatografice cu extractul fiecarei probe

1-cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 6 zile

La utilizarea ca agent de developare a amestecului Cloroform/metanol=9/1

avem: o parte din spoturi migreaza la o distanta mai mare de linia de start fata de altele care nu se indeparteaza prea tare. Apar si in acest caz produsi noi, metaboliti rezultati ca urmare a prezentei tirozinei in mediu.

Cloroform/metanol/apa=65/15/2

Anisaldehida Ehrlich’s UV 366 nm

Figura 22. Placutele cromatografice cu extractul probei

1-cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 6 zile

Diclormetan/metanol=95/5

Ehrlich’s Anisaldehida UV 366 nm

Figura 23. Placutele cromatografice cu extractul probei

1-cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB+ L-Tirozina dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB+ L-Tirozina dupa 6 zile

In nici unul din cazurile prezentate in aceste conditii, nu apare produsul de interes. Avem in schimb o serie de produsi noi, mai ales in cazul folosirii ca solvent de developare a amestecului Cloroform/metanol/apa=65/15/2

3. Mediul LB3 –mediul Luria Bertani redus + Triptofan

Figura 24. Variatia pH-ului in functie de timp pentru mediul LB+Triptofan

pH-ul nu inregistreaza o crestere semnificativa, probabil nici metalismul nu este prea intens, deci nu se produce o cantitate prea mare de substante care sa influenteze semnificativ valoarea pH-ului

Figura 25. Variatia OD-ului in functie de timp pentru mediul LB+Triptofan

Spre deosebire de celelalte cazuri tratate pana acum se observa in acest caz o diferenta majora intre valorile absorbantelor celor doua culturi.

Diclormetan/metanol=95/5

Ehrlich’s Anisaldehida UV 366 nm UV 254

Figura 26. placutele cromatografice cu extractul probei

1-cultura de Braunschweig, mediu LB+ Triptofan dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB+ Triptofan dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB+ Triptofan dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB+ Triptofan dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB+ Triptofan dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB+ Triptofan dupa 6 zile

Cloroform/metanol/apa=65/15/2

Anisaldehida Ehrlich’s UV 366nm UV 254nm

Figura 27. Placutele cromatografice cu extractul probei

1-cultura de Braunschweig, mediu LB+ Triptofan dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB+ Triptofan dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB+ Triptofan dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB+ Triptofan dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB+ Triptofan dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB+ Triptofan dupa 6 zile

Rezultatele obtinute ca urmare a folosirii acestui mediu cu Triptofan nu pare sa aduca imbunatatiri in ceea ce priveste produsul activ cautat nici in cazul metabolitilor secundari.prin urmare acest mediu nu va fi luat in considerare in cazul cultivarii in bioreactor.

4.Mediul LB4

Figura 28.Variatia pH-ului in functie de timp pentru mediul LB4

Se observa variatia pH-ului la fel ca si in celelalte cazuri tratate mai sus distingandu-se aceleasi faze : faza de lag- aproximativ 32 de ore de la cultivare dupa care urmeaza faza de crestere logaritmica, iar dupa 56 de ore se instaleaza faza stationara.

Figura 29. Variatia absorbantei functie de timp pentru mediul LB4

Figura 30. Variatia concentratiei de glucoza in functie de timp pentru mediul LB4

Cloroform/metanol=9/1

Ehrlich’s Anisaldehida UV-366 nm

Figura 31. Placutele cromatografice cu extractul probei

1-cultura de Braunschweig, mediu LB4 dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB4 dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB4 dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB4dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB4dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB4dupa 6 zile

Ca si in celelalte cazuri in care am folosit acest agent de developare , solventul fiind puternic nepolar separarea nu este reusita.

Diclormetan/metanol=95/5

Ehrlich’s Anisaldehida UV 366 nm

Figura 32. Placutele cromatografice cu extractul probei

1-cultura de Braunschweig, mediu LB4 dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB4 dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB4 dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB4dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB4dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB4dupa 6 zile

Si in acest caz a fost pusa in evidenta prezenta la Rf= 0.233 a compusului de interes. Si aceste conditii ar fi putut fi folosite in bioreactor daca nu ar fi aparut probleme legate de mirosul culturii.

Cloroform/metanol/apa=65/15/2

UV 366nm Ehrlich’s Anisaldehida

Figura 33. Placutele cromatografice cu extractul probei

1-cultura de Braunschweig, mediu LB4 dupa 2 zile

2- cultura de Goettingen, mediu LB4 dupa 2 zile

3- cultura de Braunschweig, mediu LB4 dupa 4 zile

4- cultura de Goettingen, mediu LB4dupa 4 zile

5- cultura de Braunschweig, mediu LB4dupa 6 zile

6- cultura de Goettingen, mediu LB4dupa 6 zile

Acest amestec polar pare sa separe compusii rezultati din metabolismul bacteriei. Acesti produsi vor fi mai departe analizati prin alte tehnici pentru elucidarea structurii lor.

Pe baza datelor obtinute din acest experiment, tinand cont de acestea si de produsul de interes am ales sa lucram in continuare , la scara mare , in bioreactor la temperatura de 270C intrucat la aceasta temperatura, concenmtratia bacteriana este buna si compusul de interes apare pe placuta cromatografica, in conditiile in care am folosit amestecul de solventi : Diclormetan/metanol=95/5.

Fermentatia

Multe procese comerciale de fermentatie s-au dovedit a functiona foarte bine la scala mica, in laborator dar apoi cand urmeaza transpunerea procesului la scala mare, in bioreactor procesele devin mai complexe.

Componentul esential in cultivarea la scala mare este fermentorul, in care masa de cultura creste, au loc reactiile si se dezvolta produsii.

Majoritatea tipurilor de fermentori industriali sunt cilindrii metalici prevazuti cu mecanisme pentru agitare, racire, monitorizare, si de colecatre a produsilor.

Pentru a obtine productii optime, un fermentor trebuie sa reproduca actiunile

ce au loc la scara mica-experimentul test. Pentru un contact permanent intre cultura microbiana si nutrienti , in partea centrala a bioreactorului sunt palete care asigura agitarea viguroasa a amestecului de fermentatie si uniformizandu- Temperatura interioara a incintei reactorului este mentinuta printr-o manata de

racire.

Figura 34. Pasii generali in prodecerea masei de substante organice intr-un fermentor

Acesti pasi ar putea fi sumarizati ca:

introducerea cuturii microbiene si a mediului steril in camera de reactie

fermentatia

„downstream ”

procesul indepartarea reziduului.

Toate fazele procesului trebuie realizate in conditii aseptice si monitorizate permanent pentru urmarirea vitezei fluxului si pentru calitatea produsilor. Substraturile crude includ reziduuri de plante crude, melasa, zahar, faina de peste si carne si zer. In plus, pot fi adaugate diverse substante chimice pentru controlul pH-ului sau pentru cresterea productiei. In fermentatia „batch” substratul este adaugat in sistem tot odata pe cand in fermentatia „continua” nutrientii sunt introdusi continuu in bioreactor iar produsul este eliminat in timpul desfasurarii procesului de fermentatie.

Reactorul este asfel construit incat sa permita produsului crud si materialelor reziduale sa fie recuperate din camera reactorului cand fermentatia este completa.

Produsul crud este recuperat prin stabilizare, precipitare, centrifugare, filtrare sau liza celulara.

Unii produsi nu necesita alte operatii, pe cand altii necesita mai departe purificari, extractii, concentrari si uscari.

Produsul final este in mod uzual ca o pudra, sub forma de granule, sau sub forma lichida, si este plasat in containare sterile.

Tehnologia de fermentatie pentru cultivarea la scara mare a bacteriilor si producerea de produsi bacterieni este complexa.

Conditiile in care a avut loc fermentatia au fost urmatoarele:

Volumul: 40 l

Temperatura: 270C

Viteza de rotatie: 300 rpm

Viteza de aeratie: 0.25 V/VM

pH-ul de start: 7.5

Mediul pentru cultivarea bacteriei intr-un bioreactor de 40 l

40 l de mediu LB= Mediu complex+Apa artificiala de mare + Precultura.

Mediul complex

Triptona: 400 g

Extract de drojdie: 200 g

NaCl: 400 g

Apa artificiala de mare

Ferric CitrateּH2O 2.146 g (maruntit seaparat)

NaCl 389 g

MgCl2 ּ 6H2O 176 g

Na2SO4 64.8 g (dizolvat separat)

CaCl2 ּ 2 H2O 47.68 g

Na2HPO4 ּ 2 H2O 0.2 g

SiO2 0.3 g

Solution I 20 ml

Solution II 200 ml

Apa distilata pana la 40 l –solutia de precultura (4 l)

pH-ul adjustat 7.5 cu NaOH 10%

precultura 10% -4 l

In timpul fermentatiei au fost prelevate 12 probe, dintre care 8 in primele 24 de ore si 4 in urmatoarele 24 (timpul de fermentatie a fost de 48 de ore).

Sistemul este prevazut cu sistem de prelevare automat, pentru recoltarea probelor “overnight”.

Urmarind unde se afla produsul activ s-au pregatiti placute cromatografice cu 3 spoturi: -unul pentru masa celulara rezultata in urma centrifugarii, unul pentru supernatant si unul pentru extractul ultimei probe. Placutele astfel pregatite au fost introduse in cele trei tipuri de amestecuri solventi folosite si dupa vizualizare s-au obtinut uramtoarele:

-se separa un produs in supernatant la valoarea Rf =0.233, ceea ce inseamna ca produsul de interes se gaseste in supernatant. Dar intrucat nu se regaseste in extractul ultimei probe inseamna ca acestea se produce mai devreme. De aceea ceea ce ne intereseaza din supa bacteriana este supernatantul care a fost trimis spre prelucrare la un alt institut care permite manuirea unei cantitati mari de solvent si etapelor necesare pentru separarea acestui produs.

Cloroform/ methanol/apa 65/15/2

Anisaldehida Ehrlich’s UV 366 nm UV 254 nm

Figura 35. Placutele cromatografice cu extractul celular, extractul supernatantului si extractul ultimei probei

extractul de celule ( din masa bacteriana)

extractul de supernatant

extractul ultimei probe 15

Anisaldehida Ehrlich’s

UV 366 nm UV 254 nm

1.-15.: extractul probelor recoltate in impul fermentatiei

Figura 36. Extractul celular al probelor, in timpul fermentatiei in bioreactor

Valorile pH-ului, OD-ului, si biomasei uscate in urma cultivarii in bioreactor au fost trecute in urmatorul graphic:

Figura 37 . Valorile pH-ului, OD-ului, si biomasei uscate in urma cultivarii in bioreactor

Diclormetan/methanol=95/5

Anisaldehida Ehrlich’s UV 254 nm UV 366 nm

1.extractul de celule

2.extractul de supernatant

3.extractul ultimei probe 15

Figura 38. Extractul de celule, de supernatant si al ultimei probe in urma fermentiei in bioreactor

Anisaldehida Ehrlich’s

UV 366 nm UV 254 nm

1.-15.: extractul probelor recoltate in impul fermentatiei

Figura 39. Extractul celular al probelor, in timpul fermentatiei in bioreactor

Rezultatele obtinute la scara mica, in laborator, inainte ca producerea la scara mare sa devina realitate nu corespund intotdeauna cu cele obtinute in urma cultivarii microorganismelor in bioreactor.

Analizand rezultatele obtinute in urma experimentului se pot trage cateva concluzii.

Aceasta specie de microorganisme creste rapid dupa inoculare, putandu-se obtine cantitati mari de inocul, inainte de procesul industrial.

Sunt stabile genetic, conservandu-si in timp caracterele biochimice.

Valoarea pH-ului trebuie sa ramana sub 8 pentru s-a aratat intr-un experiment anterior ca aceasta specie nu tolereaza valori mai mari.

Au fost facute mai multe experimente in laborator, in diferite conditi, pentru a afla conditiile optime de cultivare a microorganismului, astfel incat sa produca produsul de interes si pentru a pune in evidenta si alti produsi de metabolism.

Temperature optima de cultivare s-a stabilit, in urma experimentului , a fi cea de 270C, temperatura la care faza exponentiala de crestere dureaza aproape 24 de ore.

Numarul bacteriilor care mor in aceasta perioada este foarte mic. Viteza de multiplicare este foarte mare.

De asemenea nu a fost necesara adaugarea in mediu a glucozei. Valoarea pH-ului creste in faza exponentiala ca urmare a acumularii in mediu a unor compusi cu caracter alcalin.

Dupa aproximativ 24 ore de la incubare, pana la 68 de ore, numarul bacteriilor ramane aproape constant, ajungandu-se la un echilibru, multiplicarea fiind contrabalansata de moarte-aceasta este faza stationara..

Urmeaza apoi faza de declin, in care celulele imbatranesc si viabilitatea lor scade progresiv.

S-a utilizat cromatografia pe strat subtire pentru a putea vedea care sunt conditiile de lucru si care este cel mai potrivit moment de producere a compusului de interes si pentru a vedea ce imbunatatiri pot fi aduse mediului de cultura pentru obtinerea de metaboliti secundari. Compusul urmarit se presupunea ca ar apare atunci cand este folosit ca agent de elutie amestecul de solventi: Diclormetan/metanol=95/5 si poate fi vizualizat in lumina UV la 366 nm. Se stia de asemenea ca acesta apare pe placuta cromatografica la o valoare Rf =0.233.

Dupa developare, substantele colorate au fost observate direct pe suportul plan. Cele incolore au fost vizualizate prin tratare cu un reactiv cromogenic, pe baza fluorescentei lor sub influenta radiatiilor ultraviolete la doua lungimi de unda 254 nm si 366 nm.

In cazul folosirii amestecului de elutie Diclormetan/metanol=95/5 s-a produs o separare mai buna a compusilor extractului comparativ cu situatia in care am folosit Cloroform/metanol=95/5 sau Cloroform/metanol/apa=65/15/2.

De asemenea apare pe placuta cromatografica un compus la Rf=0.233 care corespunde compusului urmarit. Acesta apare in cazul cultivarii la temperatura de 270C, fara glucoza. Deci aceste conditii ar putea fi folosite la cultivarea in bioreactor.

Dupa stabilirea temperaturii optime de crestere a bacteriei si anume la 270C, urmatoarele experimente s-au desfasurat la aceasta temperatura si au urmarit obtinerea produsului activ in conditii de mediu diferite, dar si obtinerea diversilor metaboliti secundari, prin adaugarea in mediu a unor aminoacizi sau in urma anumitor modificari ale mediului de cultura.

In cazurile in care am folosit mediul Luria Bertani redus+ Glicina sau cu L-Tirozina, pe placutele cromatografice nu se intalneste produsul de interes la valoarea de Rf stiuta. Apar in schimb produsi noi, produsi rezultati ca urmare a introducerii gicinei in mediu. Acesti noi produsi reprezinta etapa urmatoare in cercetarea si elucidarea structurii produsilor ce deriva din aceasta specie de microrganism.

Rezultatele obtinute ca urmare a folosirii acestui mediu cu Triptofan nu au adus imbunatatiri in ceea ce priveste produsul activ cautat nici in cazul metabolitilor secundari.prin urmare acest mediu nu a fost luat in considerare in cazul cultivarii in bioreactor.

Si in cazul folosirii mediului LB4 a fost pusa in evidenta prezenta la Rf= 0.233 a compusului de interes. Si aceste conditii ar fi putut fi folosite in bioreactor daca nu ar fi aparut probleme legate de mirosul culturii.

Pe baza datelor obtinute din aceste experimente, tinand cont de acestea si de produsul de interes am ales sa lucram in continuare , la scara mare, in bioreactor la temperatura de 270C intrucat la aceasta temperatura, concentratia bacteriana este buna si compusul de interes apare pe placuta cromatografica, in conditiile in care am folosit amestecul de solventi : Diclormetan/metanol=95/5.

Extractul obtinut in urma cultivarii in bioreactor a fost prelucrat la un alt institut. Experimentele legate de acest microorganism nu s-au oprit aici, urmand sa fie incercate multe alte conditii pana la elucidarea structurii produsului activ rezultat prin prelucrarea extractului crud.

Bibliografie

1. Proksch, P.; Edrada, R.A.; Ebel, R.; Drugs from the seas, – current status and microbiological implication, Appl. Microbiologie, Biotechnologie, 2002, 59:125:134.

Jensen, P.R. and Fenical, W. Microbiol. Ecol., 1995, 29, 249-257.

Faulkner, D.J. Nat. Prod. Rep. 1996, 13, 75-176.

Valentin, R. si Dinache, Ghe. Microbiologie si parazitologie Ed. Crisana 1978.

Dimache, Ghe. Si Panaitescu, Dan Microbiologie si parazitologie medicala, Ed. Uranus, 1994.

Anghel, A. Ghid de laborator clinic in industria chimica, Ed. Poligrafica Brasov.

Fudou, R.; T. Ilzuka & S. Yamanaka: Haliangicin, a novel antifungal metabolites, produced by marine myxobacteria. 1. Fermentation and biological Characteristics. J. Antibiotics 2000, 154: 149 -152.

Lang, Siegmund. ; Corrina Wicke, Hueners, M. Production and Structure Elucidation of Glycoglycerolipids from a Marine Sponge- Associated Microbacterium Species. J. Nat. Prod. 2000, 63, 621-626.

Siegmund Lang, Marinus Meiners, Hartmut Laatsch, Integrated Approach to explore the potential of Marine Microorganisms for the production of bioactive Metabolites, may, 2001.

Speitling, M. PhD thesis, University of Goettingen, Germany 1998.

Weidner, S.; Arnold, W.; Stackebrandt, E.; Puhler, A. Microbial. Ecol. 2000, 39:22.

Grabley, S.; Thiericke, R. (eds) Drug discovery from nature. Springer, Berlin Heidelberg, New York, 1999.

Upasani, V. N.; Desai, S; Moldoveanu, N. Microbiology 1994, 140, 1959-1966.

Haygood, M.G.; Davidson, S.K. Appl Environ MIcrobiol. 1997, 63:4612.

Hodgson, D.A. Adv Microb Physiol. 2000, 42:47.

Dawid, W. FEMS Microbiol Rev. 2000, 24:403.

Reichenbach, H. Microbiol Sci. 1986, 3:268.

Baslow, M.H. Ann Rev Pharmacol. 1971, 11:447.

Nassar, M.M. J Egypt Soc Parasitol. 2000, 30:631.

Pereira, P.; Onodera, H.; Andrinolo, D.; Franca, S.; Araujo, F.; Lagos, N.; Oshima, Y. Toxicon 2000, 38:1689.

Van Kraaij, C.; De Vos, W.M.; Siezen, R.J.; Kuipersm O.P.) Nat Prod Rep. 1999, 16:575.

Chen, G.; Wang, G.Y.; Li, X.; Waters, B.; Davies, J. J Antibiot. 2000, 53:1145.

Uphoff, H.; Felske, A.; Wagner-Dobler, I . FEMS Microbiol Ecol, in press 2001.

Fudou, R.; S. Yamanaka, T. Iizuka &T. Ando : Polyene Antibiotic SMP-2 and its Photoisomers and antifungal agents containing it. JP 200023926, September, 5, 2000.

Ilzuka, T.; Y. Jojima, R. Fudou & S. Yamanaka Isolation of myxobacteria from the marine environment. FEMS Mirobiol. Lett. 1998, 169: 317~322.

Tomita, F.; T. Tamaoki, K. Shirahata, M. Morimoto, S. Ohkubo Novel antitumor antibiotics, tetrocarcins. J. Antibiotics 1980, 33: 668 ~670.

Lechevalier, H. A. & M. P. Lechevalier The Actinomycetales, 1970, 393~ 405.

Morimoto, M.; M. Fukui, S.; Ohkubo, T. Tamaoki & F . Tomita Tetrocarcins, new antitumor antibiotics- J. Antibiotics 1982, 35: 1033~1037.

Sasse, F.; B. Boehlendorf, M. Hermann, B. Kunze, E. Forche, H. Steinmetz J. Antibiotics 1999, 52: 721~729.

Yosief, T.; Ruddi, A.; Stein, Z.; Goldberg, I.; Gravalos, G. M. D.; Tetrahedron. Lett. 1998, 39, 3323-3326.

Koenig, G. M.; Wright, A.D. J.Org. Chem. 1997, 62, 3837-3840

Supryiono, A.; Schwarz, B.; Wray, V.; Witte, L.; van Soest, R.; Proksch; Z. Naturforsch. 1995, 50c, 669-674.

Jollivet, N.; Bezenger, M.; Vayssier, Y.; Belin, J. Appl. Microbiol. Biotehnol. 1992, 36, 790-794..

Gamian, A.; Mordarska, H.; Ekiel, I.; Ulrich, J.; Defaye, J. Carbohydrate Res. 1996, 296, 55-67.

Murakami, N.; Morimoto, T.; Imamura, H.; Ueda, , T.; Nagai, S.; Sakakibara, J. Chem. Pharm. Bull. 1991, 39, 2277-2281.

Yurkov, V.V.; Beatty, J.T. Appl Environ Microbiol , 1998, 64:337

Omura, S. The search for bioactive compounds from microorganisms, 1st edn. Springer, Berlin Heidelberg New York, 1992.

Ruiz-Ponte, C.; Samain, J.F., Sanchez, J.L.; Nicolas, J.L. Mar Biotehnol 1999,1:52.

Grabley, S.; Thiericke, R. Drug discovery from nature, Springer, Berlin Heidelberg New York, 1999.

Fisher, D.E. Cell 1994, 78:539.

Kennedy, J.H..; Analytical Chemistry: principles, New York, Chicago Saunders, 1990.

Labrenz, M.; Collins, M.D.; Lawson, P.A.; Tindall, B.J.; Schumann, P. Int J Syst Bacteriol. 1999, 49:137.

Grigioni, S.; Boucher-Rodoni, R.; Demarta, A.; Tonolla, M.; Peduzzi, R. Mar Biol . 2000, 136:217.

Gerth, K.; Schummer, D.; Höfle, G.; Irschik, H.; Reichenbach, H. J Antibiot. 1995, 48: 973.

Fiedler, H.P. Nat Prod Lett. 1993, 2:119.

Wicke, C.; Hüners, M.; Wray, V.; Nimtz, M.; Lang, S. J Nat Prod . 2000, 63:621.

Schleper, C.; Swanson, R.V.; Mathur, E.J.; De Long, E.F. J Bacteriol .1997, 179:7803.

Cardellina, J.K. II;. Nigh, D.; Van Wagenen, B.C. J Nat Prod . 1986, 49:1065.

Barrow, C.J. J Nat Prod. 1994, 57:471.

Searls, D.B. Drug Discovery Today 2000, 5:135.

Bewley, C.A.; Faulkner, D.J. Angew. Chem. 1998, 110:2280.

Moore, B.S. Nat Prod Rep. 1999, 16:653.

Page, M.J.; Amess, B.; Rohlff, C.; Stubberfield, C.; Parekh, R. Drug Discovery Today 1999, 4:55.

Staneck, J.L. & G.D. Roberts: Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromatography. Appl.Microbiol. 1974, 28: 26~231.

Shaw, N.; Stead, D. J. Bacteriol. 1971, 107, 130-133.

Bax, A.; Summers, M. F. J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 2093-2094.

Desai, J. D.; Banat, I. M. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997, 61, 47-64.

Vergin, K.L;. Urbach, E.; Stein, J.L.; DeLong, E.F.; Lanoil, B.D.; Giovannoni, S.J. Appl Environ Microbiol. 1998, 64:3075.

Kayser, O. private communication, Berlin, Germany 2001.