Embriogeneza Somatica la Conifere. Molidul

Capitolul I. Date teoretice despre molid

1.1 Scopul lucrării

Lucrarea de față își propune să analizele calitatea structurală a liniilor embriogene de molid, calitate care este o condiție pentru o bună maturare embrionară și pentru o bună regenerare pentru a menține în colecție numai liniile embriogene viabile.

1.2 Incadrarea sistematică

Încrengătura Spermatophyta

Subîncrengătura Gymnospermae

Clasa Pinatae

Ordinul Pinales

Familia Pinaceae

Genul Picea

Specia Picea abies

1.3 Caractere morfologice

Picea abies se caracterizează prin frunze spiralate, canale rezinifere în tulpină, rădăcină și frunză. Este o plantă monoică cu flori unisexuate. Florile sunt nude, lipsite de înveliș floral și grupate în strobili. Picea abies are acele în 4 muchii ascuțite la vârf, dispuse în jurul ramurii pe câte o perniță proeminentă de pe care se desprind ușor în timpul uscării și cad. Conurile masculine sunt galbene, formate din numeroase stamine; seamănă cu amenții. Conurile femele, în tinerețe sunt roșii și erecte; mai târziu devin verzui, apoi brune și pendente. La maturitate cad întregi de pe ramuri. Semințele poartă câte o aripioară. Ea are o testă sclerificată provenită din țesutul carpelei, care dă acesteia aspectul de samară.

1.4 Ciclul de dezvoltare

Ciclul genetic este digenetic diplo – haplofazic.

Generația sporofitică este net predominantă ca durată și volum, se identifică cu planta însăși și este generația în care sunt produse celulele reproducătoare asexuate: microsporii și macrosporii.

Generația gametofitică (n) se reduce foarte mult. Gametofitul este legat de sporofit care îi conferă protecție și are rol trofic.

1.5 Importanța economică

Picea abies formează molidișuri pure sau de amestec, împreună cu bradul și fagul. Este utilizat pentru cherestea, celuloză și lemn de rezonanță (pentru instrumente muzicale cu coarde).

Capitolul II. Comparație între embriogeneza zigotică și embriogeneza somatică – generalități

2.1 Embriogeneza zigotică

Embriogeneza zigotică desemnează un ansamblu de evenimente ce conduc la dezvoltatea unui embrion diploid, în urma fecundației unui gamet femel de unul mascul.

Dezvoltarea embrionului zigotic are loc în două faze:

proembriogenă;

embriogenă.

Faza proembriogenă

Embriogeneza de la conifere în general se desfășoară asemănător cu cea de la Pinus, unde după fecundație nucleul zigotului se divide succesiv de două ori formând patru nuclei liberi în mijlocul acestuia. În acest stadiu tetranucleat nucleii coboară la polul inferior al zigotului. Aici are loc a treia diviziune nucleară rezultând 8 nuclei liberi între care se diferențiază simultan pereți despărțitori. Rezultă astfel 8 celule dispuse în două etaje, fiecare etaj fiind alcătuit din 4 celule. Celulele etajului superior sunt deschise spre fața superioară, adică spre interiorul zigotului. Ca rezultat al celei de-a 4-a diviziuni se diferențiază 3 etaje suprapuse din câte 4 celule fiecare și deasupra acestora un etaj din 4 nuclei între care se află pereți longitudinali. Din acest masiv de 16 celule care reprezintă proembrionul, cele care formează ultimul etaj nu se mai dezvoltă și degenerează treptat. Celulele etajului următor alcătuiesc rozeta și pot fi embriogene; peretele lor superior se îngroașă și formează placa bazală. Celulel din etajul imediat următor pe care se sprijină celulele rozetei nu generează embrioni dar se alungesc foarte mult și genereză suspensorul primar care afundă stratul terminal în endosperm. Celulele acestui strat , bogate în plasmă sunt inițialele embrionului; ele se alungesc sub formă de tuburi ce contribuie la mărirea suspensorului primar. Celulele inferioare rezultate odată cu celulele suspensorilor secundari generează embrionul propriu-zis formând un masiv globulos (Rădulescu Mitroiu, 1979).

Faza embriogenă

Celulele apicale ale embrionului se divid dând naștere hipocotilului, mugurelui terminal și cotiledoanelor. Axa situată între polul apexului radicular și caulinar se alungește și polul radicular dezvoltă caliptra (Figura 1, 2)

2.2 Embriogeneza somatică

Embriogeneza somatică desemnează ansamblul de evenimente provocate artificial in vitro și care conduce la formarea unui embrion pornind de la o celulă somatică, dar fără fecundație. Embrionii somatici sunt în principiu identici genetic cu celulele din care provin și conțin același număr de cromozomi.

Embriogeneza experimentală poate fi de 2 feluri în funcție de originea embrionilor :

embriogeneza somatică – celula inițială din care va rezulta embrionul este o celulă somatică dediferențiată, sau un grup de celule supuse dediferențierii.

embriogeneza haploidă – celulele supuse inducției aparțin fazei haploide a ciclului de viață.

Expresia embriogenă are loc la nivelul calusului sau direct în explant, astfel încât s-au definit 2 categorii ale embriogenezei somatice:

Embriogeneză somatică indirectă – se realizează plecând de la celule diferențiate ce suferă un proces de dediferențiere, apoi o proliferare celulară ce are ca rezultat obținera unui grup de celule care se numește calus.

Embriogeneză somatică directă – embrionii sunt direct inițiați plecând de la explant.

Explantul reprezintă grupul de celule supus inducției pentru formarea de embrioni somatici. Inducția are loc datorită substanțelor reglatoare care determină dediferențiera celulară. În cadrul acestui proces complex cea mai importantă modificare este totipotența. La nivelul unui țesut sau explant nu toate celulele devin totipotente. Predispoziția spre totipotență o au țesuturile tinere.

Deși toate celulele au aceleași condiții și aproape toate au același grad de diferențiere și aceeași structură, nu toate au competență embriogenă.

Competența embriogenă este starea celulei vegetale ce permite recepționarea unui semnal și datorită recepționării, celula devine totipotentă.

Dediferențierea celulară este un proces de modificare fundamentală a expresiei genice a celulei vegetale cultivată in vitro; celula izolată structural și funcțională de țesutul din care făcea parte se comportă ca o celulă nespecifică, nespecializată și activă mitotic. Consecința dediferențierii celulare este formarea calusului.

Figura 1. Embriogeneza zigotică, maturarea și germinarea embrionului la gimnosperme.

1.-zigot; 2.,3.-proembrion 2 nuclear; 4.-proembrion 4 nuclear; 5.- proembrion 16 celular; 6.-conturarea embrionului globular (S=suspensor); 7.-embrion globular (S= suspensor, em=embrioderma, mp=meristem primordial); 8.-stadiu precotiledonar (d.a=dom apical); 9.-stadiu cotiledonar (m=muguraș); 10.-embrion matur în sămânță (a=coaja dură provenită din integument, b=nucela, c=endosperm primar haploid, d=cotiledoane, e=axa hipocotilă, f=primordiu radicular, g=embrion diploid); 11., 12.-stadii în germinarea seminței; 13.-plantula (14 zile); 14.-plantula la care apar frunze aciculare în urma activării meristemului apical.

Figura 2. Embriogeneza zigotică la Pinus și Picea de la stadiul 2-nuclear până la sămânța matură (după Nagmani & colab., 1994)

1, 2, 3, 4, 5 – dezvoltarea embrionului de la stadiul 2 nuclear până la stadiul 16 nuclear; 6, 7, 8, 9, 10 – faza precotiledonară de dezvoltare a embrionului cu clivaj la Pinus sau fără clivaj la Picea; 11 – embrion precotiledonar cu diferențierea unui dom apical; 12, 13 – embrioni cotiledonari.

Capitolul III. Embriogeneza somatică la conifere

3.1 Scurt istoric

In 1985, Hakman semnalează pentru prima dată obținerea de calus embriogen la conifere, plecând de la un embrion zigotic imatur. Tot în 1985, Nagmani și Bonga au realizat inducție embriogenă la nivelul megagametofitului de Larix sp.

Embriogeneza somatică la conifere decurge astfel:

depunerea explantului pe pe mediu pentru inducție embriogenă,

inducția embriogenă,

cultura stabilă a țesutului embriogen: purificare, stabilizare, multiplicare, cultură permanentă, maturarea embrionară, germinarea și conversia embrionului.

3.2 Surse de explant cu potențial embriogen

La gimnosperme se folosesc explante juvenile care sunt singurele ce răspund pozitiv la inducția embriogenă. Din explantele mature nu s-au obținut embrioni somatici (Hakman, 1987).

Primii embrioni somatici descriși în literatură au fost obținuți din material juvenil: embrioni imaturi. Ca urmare, embrionii au fost obținuți plecând de la un material din ce în ce mai diferențiat: cotiledoane de 7 zile, cotiledoane prelevate din semințe de 4-5 luni, hipocotile, epicotile, ace de plantile de 36 de zile (Mo & von Arnold 1989). Cercetări recente indică posibilitatea de obținere de embrioni somatici imaturi plecând de la arbori de 26 de ani.

Explantele embriogene sunt reprezentate de:

megagametofit imatur , utilizat ca explant haploid;

embrioni zigotici în stadiul cotiledonar precoce;

embrioni maturi din semințe de Picea sp.;

cotiledoane ale embrionilor sau plantulelor provenite în urma germinării;

frunze aciculare de la plante foarte tinere .

3.3 Tipuri de inducție embriogenă

Inducția prin poliembrionie de clivaj sau înmugurire reprezintă singura posibilitate de a obține embrioni la genul Pinus. Acest fenomen este accidental la Picea sp. datorită faptului că clivarea nu este completă și se obțin structuri teratomice.

Inducția embriogenă directă a fost observată prima dată de HAKMAN (1985), și are loc prin proliferarea unor celule din stratul epidermal și subepidermal al explantului , proliferarea ducând la apariția de noduli embriogeni care duc la apariția embrionilor globulari.

Inducția embriogenă indirectă. Explantul parcurge inițial procese de dediferențiere parțială sau totală, rezultatul fiind formarea calusului ce este o structură nespeficică, nedefinită, ce include zone neembriogene. În masa calusului inițial se observă celule izodiametrice neembrionare și celule alungite care sunt potențial embriogene. Embriogeneza indirectă are loc și în cultura permanentă prin multiplicarea țesutului.

Inducția embriogenă include mai multe etape:

sensibilizare a explantului care nu se observă cu ochiul liber, ea fiind sesizabilă numai la nivel biochimic.

hiperhidrie care în cazul unei culturi de cotiledoane se observă prin faptul că explantul își mărește volumul și se deformează.

dediferențiere celulară – atunci când celulele se detașează din țesutul respectiv și devin independente, intră în mitoză și proliferează neorganizat, formând calus. La acest nivel pot apărea variații când procesul este total și explantul întreg se dediferențiază, sau este parțial când anumite părți din explant se dediferențiază.

Expresia embriogenică reprezintă momentul în care embrionii devin vizibili și conține următoarele etape:

formarea structurilor embriogene prin embriogeneză directă sau indirectă;

evoluția embrionilor până la stadiul globular;

multiplicarea embrionilor somatici prin embriogeneză ciclică și repetitivă pe mediul pentru inducție embriogenă.

La Picea abies randamentul inducției embriogene este în legătură cu tipul de explant. Din datele experimentale se poate observa că randamentul cel mai mare, de 60-70% se realizează folosind embrioni imaturi, 20-30% dacă se folosesc embrioni maturi sau cotiledoane, iar în cazul mugurilor este de maximum 5%.

3.4 Maturarea embrionilor somatici

Maturarea desemnează ansamblul de evenimente morfologice și biochimice ce conduc la evoluția embrionilor din stadiul precotiledonar spre cel cotiledonar. În evoluție se observă că suspensorul își diminuează treptat proporția față de zona apicală, nu se mai divide, iar zona apicală crește proporțional mai mult decât suspensorul, se alungește și opacizează datorită acumulării granulelor de amidon și substanțe de natură lipidică.

Maturarea embrionilor somatici de Picea abies și Pinus sp. este favorizată de prezența în mediul de cultură a acidului abscisic (ABA). Presiunea osmotică a mediului de cultură combinată cu prezența ABA par a fi determinante penru maturarea embrionilor (Jalonen, 1991).

După Hakman (1987) există patru stadii de dezvoltadrie care în cazul unei culturi de cotiledoane se observă prin faptul că explantul își mărește volumul și se deformează.

dediferențiere celulară – atunci când celulele se detașează din țesutul respectiv și devin independente, intră în mitoză și proliferează neorganizat, formând calus. La acest nivel pot apărea variații când procesul este total și explantul întreg se dediferențiază, sau este parțial când anumite părți din explant se dediferențiază.

Expresia embriogenică reprezintă momentul în care embrionii devin vizibili și conține următoarele etape:

formarea structurilor embriogene prin embriogeneză directă sau indirectă;

evoluția embrionilor până la stadiul globular;

multiplicarea embrionilor somatici prin embriogeneză ciclică și repetitivă pe mediul pentru inducție embriogenă.

La Picea abies randamentul inducției embriogene este în legătură cu tipul de explant. Din datele experimentale se poate observa că randamentul cel mai mare, de 60-70% se realizează folosind embrioni imaturi, 20-30% dacă se folosesc embrioni maturi sau cotiledoane, iar în cazul mugurilor este de maximum 5%.

3.4 Maturarea embrionilor somatici

Maturarea desemnează ansamblul de evenimente morfologice și biochimice ce conduc la evoluția embrionilor din stadiul precotiledonar spre cel cotiledonar. În evoluție se observă că suspensorul își diminuează treptat proporția față de zona apicală, nu se mai divide, iar zona apicală crește proporțional mai mult decât suspensorul, se alungește și opacizează datorită acumulării granulelor de amidon și substanțe de natură lipidică.

Maturarea embrionilor somatici de Picea abies și Pinus sp. este favorizată de prezența în mediul de cultură a acidului abscisic (ABA). Presiunea osmotică a mediului de cultură combinată cu prezența ABA par a fi determinante penru maturarea embrionilor (Jalonen, 1991).

După Hakman (1987) există patru stadii de dezvoltare a embrionilor somatici:

stadiul 1 – stadiul embrionilor precotiledonari ce cuprinde embrioni în faza globulară fără acumulări de amidon;

stadiul 2 – stadiul embrionilor cotiledonari cu aspect opacizat ce cuprinde faza globulară avansată și faza polară (Figura 3);

stadiul 3 – în care zona apicală începe să se structureze la fel ca cea a embrionului zigotic. Zona meristematică se fragmentează, în centru se află meristemul apical care este originea axei epicotile , iar în jurul său ca o coroană sunt cotiledoanele (Figura 4);

stadiul 4 – plantula prezintă primele frunze aciculare. În acest stadiul intră în activitate meristemul central.

3.5 Germinarea embrionilor

După germinare embrionii se selectează și se pun pe mediu pentru germinare, care este mai sărac și lipsit de regulatori de creștere. În aceste condiții au loc numeroase modificări: creștera și alungirea meristemelor apicale și radiculare, mobilizarea rezervelor din cotiledoane, creșterea și alungirea țesuturilor meristematice, rezultând radicula și primordiile foliare. Germinarea embrionilor cotiledonari la Picea abies se realizează mai bine la întuneric decât la lumină. Rata de germinare a embrionilor variază între 35 – 90% (Paques, 1997).

3.6 Conversia embrionilor

Conversia este foarte importantă pentru dezvoltarea viitoare a plantei “ex vitro”. Succesul depinde de anumiți factori:

vigoarea inițială a plantelor somatice;

durata fotoperioadei;

umiditatea relativă;

compoziția solului.

Succesul conversiei este dependent de lungimea cotiledoanelor și hipocotilelor. Relația liniară dintre lungimea cotiledoanelor și hipocotilelor lor, și succesul conversiei arată că lungimea cotiledoanelor și hipocotilelor poate fi privită ca un indicator al succesului conversiei. Prezența unui epicotil bine dezvoltat este considerată ca predictivă pentru succesul aclimatizării. O fotoperioadă lungă (>16h) determină creștera epicotilului pe când o fotoperioadă mică (<16h) în mod aparent induce menținera stării de adormire a mugurilor.

3.7 Aclimatizarea

Aclimatizarea reprezintă transplantarea plantulelor în sol, în atmosferă naturală. Pentru ca trecerea să aibă succes trebuie ca planta să aibă o nutriție exclusiv autotrofă.

Se consideră reușită când plantele obținute “in vitro” sunt normale și fertile, dezvoltându-se ca plante obținute din semințe.

Figura 3. Țesut embriogen după trei săptămâni de cultură cu embrioni globulari

Figura 4. Țesut embriogen după șase săptămâni de cultură. Embrionii somatici prezintă cotiledoane și un hipocotil

Concluzii

În urma analizelor structurale s-au desprins următoarele concluzii:

Reinducția este o metodă de menținere a calități structurale a liniilor embriogene;

Reinducția elimină deficiențele datorate senescenței;

Reinducția nu îmbunătățește vizibil calitatea structurală a liniilor embriogene dacă nu s-a manifestat fenomenul de senescență;

În cazul liniilor polimorfice, reinducția este o modalitate de selecție, liniile fiice fiind diferite între ele. În cazul unei noi inducții polimorfismul se menține.

bibliografie

Egertsdorffer, W., von Arnold, S., 1993, Classification of Embriogenic Cell – lines of Picea abies as Regards Protoplasts Isolation and Culture, I. Plant Physiol. Vol 141: 222 – 229;

Hakman, I., 1985, Tissue culture in conifers with emphasis of somatic embryogenesis in norway spruce (Picea abies (L). Karst), Acta Universitatis Upsaliensis;

Hakman, I., Fowke, L. C., von Arnold, S., 1985, The development of somatic embryos of Picea abies (Norway spruce), Plant Sience, 38: 53 – 59;

Hakman, I., Fowke, L. C., 1987, An embriogenic cell suspension culture of Picea glauca (White spruce), Plant Cell Reports 6: 20 – 22;

Jalonen, P., von Arnold, S., 1991, Characterization of embryogenic cell lines of Picea abies in relation to their competence for maturation, Plant Cell Reports 10: 384 – 387;

Mo, L. H., von Arnold, S., 1989, Morphogenic and genetic stability in long term embryogenic cultures and somatic embryos of Norway spruce (Picea abies (L). Karst), Plant Cell Reports, 8: 375 – 378;

Paques, M., Bercetche, J., Palada, M., 1997 Prospects and limits of Somatic Embryogenesis of Picea abies, Somatic Embryogenesis in Woody Plants, vol 1, 399 – 414;

Rădulescu – Mitroiu, N., Embriogeneza plantelor, 1979, Editura Didactică și Pedagogică, Buscurești, 34 –39;

Wann, S. R., Feirer, R. P., Jonnson, M. A., Noland, T. L., 1986, Norway spruce as a model system for somatic embryogenesis in conifers IPC Tehnical paper series: 189

*** Biotechnologies vegetales, UNISAT Universite audiovisuelle francophone, 1997.

14.Ellis RE, Jacobson DM, Horvitz HR, 1991a, Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans, Genetics, 129: 79 – 94;

15.Ellis RE, Yuan JY, Horvitz HR, 1991b, Mechanisms and functions of cell death, Annu Rev Cell Biol, 7: 663 – 698;

16.Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S, 1998, A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibator ICAD, Nature 319: 43 – 50;

17.Fadok VA, Henson PM, 1998, Apoptosis: getting rid of the bodies, Curr biol 8: R6930 – R695;

18.Fearnhead HO, Dinsdale D Cohen GM, 1995, An interleukin-1 beta-converting enzyme-like protease is a common mediator of apoptosis in thymocytes, FEBS Lett, 375: 283 – 288;

19.Fernandez-Segura E, Garcia JM, Campos A, 1990, Scanning electron microscopic study of natural killer cell-mediated cytoxicity, Histol Histopathol, 5: 305 – 310;

20.Gavrielli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA, 1992, Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation, J Cell Biol, 119: 493 – 501;

21.Granville DJ, Carthy CM, Jiang H, Shore GC, McManus BM, Hunt DW, 1998, Rapide cytochrome c release, activation of caspases 3, 6, 7 and 8 followed by Bap31 cleavage in HeLa cells treated with photodinamic therapy, FEBS Lett, 437: 5 – 10;

22. Haining WN, Carboy-Newcomb C, Wei CL, Steller H, 1999, The apoptotic function of Drosophila Hid is conserved in mammalian cells, Proc Natl Acad Sci USA, 96(9): 4936 – 41

23.Halaby R, Zakery Z, Lockshin RA, 1994, Metabolic events during programmed cell death in insect labial glands, Biochem Cell Biol, 72: 597 – 601;

24.Hammond EM, Brunet CL, Johnson GD, Parkhill J, Mlner AE, Brady G, Gregory CD, Grand RJ, 1998, Homology between human apoptosis specific protein and the product of APG5, a gene involved in autophagy in yeast, FEBS Lett, 425: 391 – 395;

25.Hennics Tulpini, Wheatly DN, 1999, Cytoplasmic vacuolation, adaptation and cell death: a view on new perspectives and features, Biol Cell, 91: 485 – 498;

26.Hirata H, Takahashi A, Kobayashi S, Yonehara S, Sawai H, Okazaki T, Yamamoto K, Sasada M, 1998, Caspases are activated in a branched protease cascade and control distinct downstream processes in Fas-induced apoptosis, J Exp Med, 187: 587 – 600;