Dozarea Tiaminei din Produse Farmaceutice Printr O Metoda Gaz Cromatografica

cuprins

Introducere……………………………………………………………………… 5

Capitolul I.Tiamina………………………………..…………………………… 6

1.1.Vitamine….…………………………………………………………….… 6

1.1.1.Aspecte generale………………………………………………………………. 6

1.1.2.Nomenclatura și clasificarea vitaminelor………………………………. 7

1.1.3.Mecanismul de acțiune al vitaminelor………………………………….. 7

1.1.4.Implicații terapeutice…………………………………………………………. 8

1.2.Vitamine hidrosolubile…………………………………………………………. 8

1.3.Vitamina B1………………………………………………………………………….. 9

1.3.1.Structură………………………………………………………………………….. 9

1.3.2.Proprietǎți fizice și chimice…………………………………………………. 10

1.3.3.Distribuție în natură și alimente……………………………… 11

1.3.4.Unitatea de vitamină B1……………………………………………………… 14

1.3.5.Fiziologie…………………………………………………………………………. 14

1.3.5.1.Biogeneza………………………………………………………………… 14

1.3.5.2.Necesitatea organismului în vitamina B1……………………….. 15

1.3.5.3.Teste de carență……………………………………………………….. 16

1.3.5.4.Resorbție………………………………………………………………….. 17

1.3.5.5.Distribuția în organism……………………………………….. 17

1.3.5.6.Forme sub care se găsește în organism……………………….. 19

1.3.5.7.Eliminarea…………………..…………………………………. 19

1.3.6.Rolul vitaminei B1 în organism…………………………………………….. 21

1.3.6.1.Metabolismul glucidelor………………………………………………. 21

1.3.6.2.Metabolismul proteinelor……………………………………… 27

1.3.6.3.Metabolismul mineral…………………………………………. 28

1.3.6.4.Metabolismul apei…………………………………………….. 28

1.3.6.5.Rolul tiaminei în funcțiile diferitelor țesuturi, organe și

sisteme…………………………………………………………………….. 29

1.3.7.Farmacologie……………………………….……………………….. 34

1.3.8.Toxicitatea hipervitaminozǎ……………….……………………….. 34

1.3.8. 1.Acțiunea asupra metabolismului general………………….…. 35

1.3.8.2.Acțiunea asupra sistemului nervos…………………………….. 37

1.3.8.3.Acțiunea asupra sistemului circulator………………………… 38

1.3.8.4.Acțiunea asupra sistemului rinichiului…………………………… 38

1.3.8.5.Acțiunea asupra musculaturii………………………………………. 38

1.3.8.6.Acțiunea asupra tubului digestive……………………………….. 39

1.3.8.7.Acțiunea asupra ficatului…………………………………..……… 39

1.3.8.8.Acțiunea asupra glandelor cu secreție internǎ…………….. 40

1.3.8.9.Specificitatea acțiunii vitaminice……………………………….…. 40

1.3.9.Substanțe cu acțiune antivitaminicǎ……………………………. 41

1.3.10.Corelații cu alte vitamine……………………………………………… 42

1.3.11.Prezentare și administrare……………………………………………. 42

Capitolul II.Metode de dozare a tiaminei……………………….………… 44

2.1.Metode fizice……………………………………………………………………….. 44

2.1.1.Metoda fluorimetrică …………………………………………………………. 44

2.2.Metode chimice……………………………………………………………………. 47

2.2.1.Metoda cu paraaminoacetofenonă………. …………………………….. 47

2.2.2.Metoda gravimetrică …………………………………………………………. 48

2.2.3.Metoda Spruyt …………………………………………………………………. 49

2.2.4.Determinarea spectrofotometrică a vitaminei B1……………………. 49

2.3.Metode biologice………………………………………………………………….. 49

2.3.1.Metoda bazată pe curba de creștere în greutate a șobolanului.. 50

2.3.2.Metoda curativă………………………………………………………………… 51

2.4.Metode microbiologice…………………………………………………………. 53

Capitolul III. Metode cromatografice…………………………………………… 56

3.1.Generalități………………………………………………………………… 56

3.2.Tipuri de faze mobile și staționare………………………………………… 57

3.3.Procese de separare cromatografică…………………………………….. 58

3.4.Etapele unei separări cromatografice……………………………………. 59

3.5.Dinamica procesului cromatografic………………………………………. 60

3.6.Analiza cantitativă prin cromatografie…………………………………… 60

3.7.Concepte fundamentale ale cromatografiei…………………………… 61

3.8.Metode cromatografice pe coloană……………………………………….. 62

3.9.Adsorbție și repartiție…………………………………………………………… 64

3.10.Cromatografia de repartiție gaz-lichid………………………………….. 65

Capitolul IV. Parte experimentală………………………………………….. 70

4.1.Prepararea probelor ………………..………………..……….…………. 70

4.2.Calcularea rezultatelor………..……………………………………..… 71

4.3.Tehnica cromatografică………………………………………………………… 74

4.4.Rezultate și discuții ………………………………………….………………. 74

Concluzii………………………………………………………………………… 79

Bibliografie…………………………………………………………………..…. 80

+ referat sustinere , prezentare powerpoiny si autoslide

=== 7.Bibliografie ===

BIBLIOGRAFIE

Baloescu C., Sterescu R., Metode spectrofotometrice de absorbție aplicată la controlul medicamentelor, Ed. Medicală, București, 1975, 70.

Bognar J., Jellinak O., Mikrochim. Acta., 1964, 1129.

Bognar J., Jellinak O., Mikrochim. Acta., 1966, 453.

Bognar J., Jellinak O., Mikrochim. Acta., 1969, 312-318.

Bognar J., Jellinek O., Mikrochim. Acta., 1970, 1017.

Bungău S., Dozarea prin metode cinetice a concentrațiilor mici, Referat doctorat, Universitatea Babeș-Bolyai, Cluj-Napoca, 1999, 40-6.

Bungǎu S., Tezǎ de doctorat, Cluj Napoca, 2002, 84-6.

Bungău S., Determinarea vitaminelor și aminoacizilor prin metode cinetice, Editura Universității din Oradea, 2003.

Bungău S., Bâldea I., Copolovici L., ,,Determinarea vitaminelor B1 și B6 prin oxidare cu permanganat, Al XXVII-lea Simpozion Național de Chimie, 23 -26 octombrie, Călimănești-Căciulata, 2002.

Bungău S., Copolovici L., Niac G., Bâldea I, Kinetic determination of B1, B2 and B6 vitamins, Studia, Univ. “Babeș-Bolyai”, 2002.

Chioșa L., Meuman M., Vitamine și Antivitamine, Ed. Medicală, București, 1955

Dushman S., J. Phys. Chem., 1904, 8, 453.

Espenson J. H., Chemical Kinetics and Reaction Mechanisms, McGraw-Hill, New -York, 1981, 5.

Georgescu D., Produse Farmaceutice, Editura Național, București, 1997.

Gregory J. F. Ink S. L., Identification and quantification of pyridoxine β-glucoside as a major form of vitamin B6 in plant-derived foods, J. Agric. Food Chem., 1987, 35(1), 76-82.

Hein H., Kunze W., Umweltanalytik mit Spektrometrie und Chromatographie, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinhaim, Bundesrepublik Deutschland, 1994, 109-98.

Hill G., Holman J., Chemistry in context, Fourth edition, Nelson, 1995, 578.

Hollman P. C., Slangen J. H., Wagstaffe P. J., Faure U., Southgate D. A., Finglas P. M., Intercomparison of methods for determination of vitamins in foods. Part 2., Water soluble vitamins. Analyst, 118(5), 1993, 481-8.

Laitinen H. A., Chemical Analysis, McGraw-Hill, New-York, 1960, 431.

Longo a., Mancini M. A. D., Chromatographic identification of active ingredients in pharmaceutical forms Vitamin B – complex tablets and antihemorrhagic coated tablets, Part II, Brazil, Rev. Cienc. Farm., 1980, 231-45.

Mark H. B. Jr., Rechnitz G. A., Kinetics in Analytical Chemistry, vol. 24,, John Wiley & Sons, New York, !968.

Mottola H. A., Perez-Bendito D., Analytical Chemistry, 1994, 66, 131-62

Mottola H.A., Kinetic Aspects of Analytical Chemistry, vol. 96, John Wiley & Sons, New York, !988, 24-52.

Nenițescu C. D., Chimie organică, vol. II, Ed. Didactică și Pedagogică., București, 1980, 354.

Perez-Bendito D., Silva M., Kinetic Methods in Analytical Chemistry, Ellis Horwoord, Chichester, 1988, 146.

Perez-Ruiz T., Martinez–Lozano C., Tomas V., Ibarra I., Talanta, 1999, 39, 907.

Perez-Ruiz T., Martinez–Lozano C., Tomas V., Sidrach C., Analyst, 1997, 122, 115.

Pietrzyk D. J., Frank C. W., Chimie analitică, Ed. Tehnică, București, 1989.

Rappe A., Qualitative microbiological determination of B vitamins. Application to the analysis of drugs, dietetic preparations and foods. Assoc. Pharm. Belge, Brussels, Belg., J. Pharm. Belg, 1969, 24(3-4), 186-94.

Reynolds J. E. F., The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition, The Royal Pharmaceutical Society, Council of the Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, London, 1996, 1724, 1384.

Roman L., Săndulescu R., Chimie analitică, vol. II, Analiza Chimică Cantitativă, Ed. Didactică și Pedagogică R.A., București, 1999, 190.

Roman L., Săndulescu R., Chimie analitică, vol. III, Metode de separare și analiză instrumentală, Ed. Didactică și Pedagogică R.A., București, 1999, 190.

Schultz O. E., Schnekenburger J., Einführung in die Pharmazeutische Chemie, Verlag Chemie, Weinheim; Deerfield Beach, Florida; Basel, 1984, 464.

Skoog D. A., West D. M., Fundamentals of Analytical Chemistry, Third edition, Holt, Rinehart and Winston, United States of America, 1976.

Thielmann H., Thin layer chromatographic separation and identification of the ingredients of the multivitamin preparation Summavit 10 on UV 254 instant sheets, Halle/Saale, Ger. Dem. Rep., Pharmazie, 1981, 36(8), 574.

Yatsimirskii K. B., Kinetic Methods of Analysis, Pergamon Press, Oxford, 1966.

Wegscheider W., Standardization quality control and education in analytical chemistry, Fressenius J Anal Chem, 1994, 349, (12), 784-93.

***, Agenda medicală 2000, Editura Medicală, București, 2000, P. 1070, 1249, 1269.

***, Analytical Method Committee, Analyst, 1987, 112, 199.

***, Basic Biochemical Calculations: Related Procedures and Principles, Finlayson J. S. Foundation for Advenced Education in the Sciences, Addison-Wesley Publishing Company, Inc., USA, 1969.

***, British Pharmacopoeia, 5th Edition, Vol. II., HM Stationary Office, London, 1988, 47-48.

***, Farmacopeea Română, Ed. A X-a, Ed. Medicală, București, 1993.

***, Nomenclatorul de medicamente și produse biologice de uz uman pentru anul 1988, Ed. Medicală, București, 1988, 58.

***, Norma internă, MICh-NII 1409-78, Vitamina B1, fiole inj. A 0,010g.

***, Norma internă, MICh-NII 1257-79, Vitamina B1 , comprimatea 0,010g.

***, Rote Liste, 1996, ECV-Editio Cantor-Aulendorf/Württ, Bonn, 1996.

***, Tables scientifiques, Rédaction: K. Diem, Ed. J. R. Geigy S.A., Département Pharmaceutique, Sixième édition, 1963, 479.

***, The International Pharmacopoeia, Third Edition, Vol. I, General methods of analysis, World Health Organization, Geneva, 1979.

***, The Merk Index, 11th Edition, Published by Merk&Co., Inc., Rahway, N. J. 1989, U.S.A.,

***, United States Pharmacopoeial Convention, Inc., 23, 12601, Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, 1995, 130-1.

***, USP Dictionary of USAN and International Drug names, U.S. Pharmacopeia, 12601, Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, 1997.

=== 3.Tiamina ===

Capitolul I

Tiamina

1.1.Vitamine

Aspecte generale

Vitaminele sunt efectori biochimici indispensabili viețuitoarelor pentru creșterea, întreținerea troficității și funcției țesuturilor, respectiv organelor la speciile evoluate. Organismul uman nu le poate sintetiza, ori le produce în insuficientă măsură pe unele, deși sunt necesare obișnuit în cantități catalitice, de ordinul miligramelor sau mai puțin, cu excepția vitaminei C, cerută aproximativ 75 mg/zi (la adult). Ca atare, omul este tributar aportului exogen alimentar sau ca medicație. Aceste biomolecule pot fi deci considerate ca factori esențiali, în accepțiunea apropiată termenului de aminoacizi esențiali [11,47].

Carența unei vitamine generează stări patologice, cu manifestări specifice. Asemenea maladii au fost semnalate de foarte multă vreme, etiologic putând fi însă descifrate numai după descoperirea vitaminelor, în secolul XX. De exemplu, hemeralopia este amintită în Papirusul lui Ebber, manifestările de scorbut sunt descrise de Hipocrat, aproximativ din aceeași perioadă se cunoaște boala beri-beri, și mult mai târziu în secolul XVI-XVIII sunt semnalate rahitismul și pelagra [1.

Deficiențele vitaminice, reflectând dezechilibrul între aport și necesități sunt cauzate primar prin lipsa de aport, în legătură directă cu alimentația, fie în afecțiunile digestive ce se repercută asupra absorbției, fie datorită disbiozei, pentru vitaminele ce sunt produse de flora intestinală, afectată în acest caz prin administrare orală de antibiotice ori sulfamide. Secundar, deficiențele se produc condiționate de cerințele crescute, ce apar în anumite stări. Necesarul pentru o vitamină sau alta variază cu vârsta, în sarcina, dependent de starea sănătății și de alți factori, ca efortul fizic, temperatura ambiantă, administrarea unor medicamente etc.

Stările carențiale sunt denumite avitaminoze (astăzi apar rar, la populația malnutrită din țările subdezvoltate) și hipovitaminoze, cu precizarea cǎ în patologia umană survin mai curând manifestări policarențiale, decât hipovitaminoze pure, exprimate în cadrul unor entități clinice caracteristice.

La unele vitamine se cunosc precursorii lor numiți provitamine, compuși înrudiți structural, inactivi sau slab activi, pe care organismul îl transformǎ în forma activă de vitamină. Perturbarea acestui proces poate genera, de asemeni, carența.

S-au identificat și alți compuși, cu sau fără analogie structurală cu o anumită vitamină capabili să-i diminue sau să-i suprime activitatea, care au fost numiți antivitamine. Unele dintre acestea au utilizări terapeutice, cu dezavantajul de a induce simptomele carențiale [11,47].

1.1.2. Nomenclatura și clasificarea vitaminelor [11]

Termenul de vitamină, cu semnificația de aminǎ cu funcție vitală, introdus de Funk în 1911 pentru prima vitamină descoperită, adică vitamina B1, s-a păstrat, deși majoritatea nu posedă grupare aminica, iar unele nici nu conțin azot. Există mai multe modalități pentru a le denumi:

cu litere mari și indici (A, B1, B2, B12,C, K etc.);

ținând cont de acțiune sau de starea carențială (vitamina D se mai numește calciferol sau vitamina antirahitică, vitamina K este numită și vitamina antihemoragică etc.);

în funcție de structură, în acord cu recomandările Uniunii Internaționale de Biochimie (vitamina PP este nicotinamida și acidul nicotinic, vitamina C este acidul ascorbic).

Există o clasificare veche (Osborn și Mendel, 1915) bazatǎ pe criteriul solubilității în apă sau solvenți nepolari, care se menține în uz, criticabilă deoarece diferitele forme ale unei vitamine nu se încadrează uneori în aceeași categorie, (vitaminele K). În fine, unii autori admit și o categorie de pseudovitamine, cuprinzând compuși care au numai parțial trăsături de vitamine (se mai numesc și vitaminoide) de exemplu, flavonoizii numiți vitamina P , acizii grași esențiali considerați ca vitamina F , mezoinozitolul, colina.

1.1.3. Mecanismul de acțiune al vitaminelor

Cercetările în vitaminologie au lămurit structura și într-o anumită măsură modul în care își execută acțiunea. Sunt cunoscute o serie de aspecte asupra mecanismelor moleculare, cu ecou la nivelele superioare de organizare a sistemelor biologice. Multe vitamine funcționează, unele după o prealabilă biotransformare sau altele nemodificate, ca și coenzime, participând astfel la o multitudine de procese biochimice. Alte vitamine, ca de exemplu vitaminele D sau A, folosesc cǎi de acțiune ce amintesc de mecanismele hormonale. În fine, unele, ca vitamina E sau carotenii, funcționează ca sisteme defensive antioxidante față de agresiunea peroxidică nocivă. Există de asemenea și modalități particulare de acțiune (retinal, acid retinoic). Oricum, considerăm justificată plasarea vitaminelor în categoria biomoleculelor cu rol catalitic.

1.1.4. Implicații terapeutice

În terapie, vitaminele sunt utile în primul rând ca medicație specifică pentru combaterea sau profilaxia stărilor carențiale. Se indică în doze mari într-un număr variat de boli, fără legătură cu stările lor carențile, eficiența în aceste cazuri fiind, însă, după unele opinii, discutabilă. Preparatele pot conține o singură vitamină, sau asocieri de vitamine și/sau alte principii active, pentru potențarea acțiunii. Se folosesc derivați vitaminici ca săruri, esteri, reprezentând forme optimizate sub raportul eficacității sau al posibilității de administrare, dependent de scopul urmărit.

În doze terapeutice sunt în general bine tolerate. Supradozarea poate provoca tulburări grave (hipervitaminoze) mai ales pentru vitaminele liposolubile, mai greu eliminabile, putându-se acumula. Literatura semnalează că vitamina A ar prezenta un risc teratogen fiind deci contraindicată în primele luni de sarcină.

După cum am mai spus, unele antivitamine și-au consacrat, de asemeni, un loc între agenții terapeutici [11,47].

1.2. Vitamine hidrosolubile [11]

Multă vreme totalitatea vitaminelor hidrosolubile au fost considerate ca un singur factor, denumit vitamina B.

În 1926 s-a observat că factorul B pierdea prin încălzire proprietatea antinicotinică, dar păstra proprietatea de stimulare a creșterii. S-a admis atunci că existau în aceste produse doi factori, care au fost numiți de unii vitamina B și F, iar de alții vitamina B1 și B2.

Din fracțiunea termolabilă se izolează în 1932 vitamina B1 și i se determină formula brută. În 1935 a fost denumită de unii aneurină (antineuritis-vitamin), în special în Europa, iar de alții tiramină, având un nucleu tiazol. În 1936 s-a realizat și sinteza ei. Tot din fracțiunea termolabilă s-a izolat mai târziu acidul pantotenic (1939).

Cercetările făcute asupra componenței fracțiunii termostabile au arătat rând pe rând prezența unor factori care constituie azi împreună cu vitamina B1 și acidul pantotenic întregul grup al vitaminelor hidrosolubile din complexul B.

Deoarece cercetările în domeniul vitaminelor s-au făcut în laboratoarele cele mai diverse, nomenclatura lor a variat și până acum câțiva ani a domnit o mare confuzie în acest domeniu. Astăzi încă, pentru un număr de vitamine, nomenclatura este diferită și greu de precizat dacă un factor este identic sau nu cu un factor asemănător cunoscut în literatura de specialitate.

Prezența unui număr atât de mare de factori esențiali pentru creșterea sau pentru alte funcții particulare organismului arată importanța pe care o au biocatalizatorii din hrană pentru funcțiile organismului și varietatea acestor funcții.

Pe de altă parte, acest fapt arată importanta dependență a organismului animal de mediul înconjurător, precum și diversitatea factorilor care pot deveni prin anumite modificări însemnate cauze patologice.

1.3. Vitamina B1

1.3.1.Structură

Vitamina B1 [48,51] este un compus format din doi nuclei: unul de pirimidină și unul de tiazol. Se mai numește 2-metil-5(4-metil,5-ß-hidroxietiltiazoliumclorat). clorhidrat de metil-6-aminopirimidină, cu formula moleculară C12H17N4SO.HCl și greutatea moleculară 300,5. Conține cel puțin 98,0% și cel mult 101,0% C12H17N4SO.HCl raportat la substanța uscată.

Tiamina

1.3.2. Proprietăți fizice și chimice

Se prezintă ca o pulbere cristalină albă. Cristalele au formă aciculară, sunt incolore și cristalizează cu o moleculă de apă. Are miros caracteristic și gust slab amar. Punctul de topire este cuprins între 249-2500C pentru clorhidrat. Clorhidratul este solubil în apă (1g într-un cm3) sau în 18 cm3 glicerină, în 100 cm3 alcool de 95% sau în 315 cm3 alcool absolut. Este insolubil în eter, acetonă, benzen și cloroform [46].

Vitamina B1 pură are punctul de topire la 2210C. Cristalizează în sistem monoclinic. Vitamina pură are două funcții bazice: atomul de azot cvaternar și gruparea NH2. În soluție apoasă, sărurile cu acizii minerali reacționează slab acid. Solubilă în apă, prezintă un punct izoelectric la pH = 9,2. Este sensibilă la lumină ultravioletă care o inactivează rapid (pH = 7) [47].

Rezistența la căldură variază după condiții. Pulberea cristalină uscată suportă 1000C timp de 24 de ore. În prezența apei, în special la un pH ridicat, vitamina se distruge chiar la temperatura obișnuită [11].

Prezența boraților la pH 5,4 antrenează, la 1000C, într-o oră, distrugerea în proporție de 100%. În apă netamponată, distrugerea într-o oră la 1000C este de 57%. În aceleași condiții, în mediu cu acetați=10%, cu fosfat=3%. Prezența cuprului catalizează distrugerea vitaminei. Fierul, zincul, staniul și aluminiul sunt indiferenți, ca și soluțiile de glucoză, clorură de sodiu, zahăr. Sulfiții catalizează și ei distugerea vitaminei (instantanee, la pH=6). Distrugerea de către sulfiți e slabă la un pH sub 5. În soluții apoase, la un pH scăzut (3,5-5), distrugerea e foarte redusă sau inexistentă la perioade scurte de încălzire ( jumătate de oră), chiar la temperatura de sterilizare a fiolelor de 1200C (autoclav).

Forma sub care se găsește în organism este de tiaminpirofosfat sau cocarboxilază, substanță albă, cristalină, cu punct de topire la 242-2440C și cu proprietăți chimice asemănătoare cu tiamina.

acetil S OH OH

N C-NH-COCH3 HC C-CH2- CH2-O-P-O-P-OH

H3C – C C-CH2 N C-CH3 O O

N CH Cl

Tiamin pirofosfat

Vitamina B1, ca și cocarboxilaza, nu este oxidată de aer atmosferic, dar ele sunt ușor oxidate de fericianura de potasiu, care le transformă în tiocrom, substanțe ce prezintă o puternică fluorescență albastră în ultraviolet și care servește de altfel la dozarea vitaminei.

Tiocromul tratat cu paraaminoacetofenonă diazotată produce colorația roșie. Colorațiile sunt diferite pentru derivatul din pirofosfat și cel din vitamina B1 și ei se pot separa prin extracție cu solvenți organici.

S S

N C-NH2 HC C-CH2CH2OH N C N C C-CH2CH2OH

H3C – C C CH2 N C-CH3 CH3 – C C CH2 N C-CH3

N CH Cl N CH

Tiamina și pirofosfatul de tiamină sunt distruse prin tratare cu sulfiți sau nitriți. Această distrugere se face prin clivarea celor doi nuclei, fapt important, folosit la prepararea mediilor complexe fără vitamina B1 , pentru dozările biologice.

1.3.3. Distribuție în natură și alimente [11,47]

Vitamina B1 este distribuită foarte variabil în lumea vegetală și animală. Există pe de o parte surse foarte bogate, ca grăunțele cerealelor, drojdia de bere, carnea. Celelalte surse sunt mult mai sărace. Vegetalele și legumele, deși mai sărace, aduc însâ un important aport în vitamina B1 prin masa mare care intră în consumul alimentar.

În bobul de cereale vitamina este acumulată în special în germen, coajă și endosperm. Extracția unei făini foarte albe antrenează pierderea celor mai importante cantități de vitamină B1. Pâinea diabeticilor, dimpotrivă, are o cantitate importantă de vitamină.

Faptul că pâinea constituie o bună parte din sursele de vitamină B1 pentru populație, și cum extracția unei făini albe diminuă enorm aportul de vitamină B1, s-a ajuns în anumit țări la reglementarea extracției la făină la o anumită proporție, sau au fost impuse corectări ale acestei deficiențe prin adaus de vitamina B1 sub formă de drojdie de bere 1% sau procedee speciale de decorticare numai a epidermului, printr-un sistem de flotație, ceea ce lasă făinii cea mai mare parte a vitaminei B1 ca și a vitaminei B2, a acidului nicotic etc.

Carnea e o sursă importantă, în special cea de porc. Cea de vacă și pasăre, ca și cea de pește, are o cantitate mult mai mică și deci trebuie consumată în cantități mari. Ouăle conțin o cantitate mare în general, dar care variază cu hrana păsărilor. Laptele conține cantitǎți reduse de vitamina B1.

Prin prepararea alimentelor au loc modificări. Din studiul proprietăților fizice și chimice ale vitaminei B1 s-a văzut influența căldurii și a pH-ului. Pentru calcularea cantităților de vitamină B1 pe care le ingeră un individ, datele din tabelele generale trebuie modificate după modul de preparare a alimentelor, fapt important mai ales pentru studiile de igienă alimentară ale diferitelor regiuni, întrucât obiceiurile culinare deosebite determină regimuri caracteristice.Acest fapt mai are o însemnătate deosebită pentru hrana artificială a sugarilor.

În cursul manipulării culinare trebuie să se țină seama de solubilitatea vitaminei B1 în apă. Prin fierberea alimentelor cu apă, o bună parte a vitaminei trece în soluție (20%-30%). Consumarea lichidului de fierbere condiționează aportul acestor cantități de vitamina B1 (borșuri, supe, diferite mâncăruri). Fierberea legumelor la baie de apă și prepararea mâncărilor și sosurilor în acest fel înpiedică în mare măsură distrugerea vitaminei.

Trebuie luată în considerare aici și posibilitatea de absorbție la amidon a vitaminei B1. În prezența legumelor conținând amidon (cartofi), cantitatea pierdută în lichid e neînsemantă, deoarece e în cea mai mare măsură absorbită la amidon.

Adăugarea de bicarbonat, deplasând pH-ul mediului spre alcalinitate, mărește foarte mult distrugerea vitaminei B1 cu ocazia preparării alimentelor.

În funcție de timpul întrebuințat pentru frigere în cuptor sau în grăsime, pierderea în vitamină este mai mică sau mai mare, putând ajunge până la 50%. Fierberea distruge până la 30% din vitamină. Prepararea suferită de diferite alimente pentru conservarea în cutii, cauzează o pierdere de 30-70%. Aici intervine în cea mai mare măsură autoclavarea la 1200. Păstrarea cutiilor este încă un factor care mărește distrugerea vitaminei B1. În cursul unui an se pierde aproximativ 40% din ceea ce rămăsese după autoclavare. Conservarea vegetalelor prin uscare antrenează pierderi relativ mici, până la15%.

Conservarea la frig (înghețarea) nu produce modificări sensibile ale conținutului în vitamina B1.

Este imprtant faptul că în unele cereale, legume și uleiuri se găsește un factor neenzimatic capabil să scindeze vitamina B1, ca și sulfitul de sodiu, în cei doi compuși tiazol și pirimidină. Acest factor este rezistent la autoclavare (18 ore la 1050), se extrage cu un amestec de cloroform și apă, și e solubil în alcool de 920. el cauzează distrugerea în timp a vitaminei, de exemplu în cursul conservării.

Alimentele consumate de sugar sunt cantități relativ mici. Laptele de femeie conține în jurul a 20γ) la 100 cm3. Colostrul este lipsit de vitamina B1. Variațiile vitaminei B1 în laptele mamei sunt mici, deoarece eliminarea vitaminei prin lapte este puțin importantă. În tabelul 1.1 figurează cantități de vitamină B1 conținute de principalele alimente ale copilului:

Tabel 1.1.Vitamina B1 în principalele alimente ale copilului

O enzimă care distruge vitamina B1 se găsește în carnea de pește crud, în special în peștele dulcicol, de asemenea în heringii din Atlantic.

La om, 50% din vitamina ingerată este distrusă în tractul intestinal dacă se ingeră concomitent pește crud.

Animalele ținute la un regim cu pește crud manifestă simptome de carență acută în vitamina B1, care dispar prin administrarea aneurinei.

S-a constatat că 100g carne de pește crud pot distruge 75 γ vitamina B1.

Trebuie să se țină seama de faptul că alcalinitatea crescută a mediului intestinal este un factor care favorizează distrugerea vitaminei B1, ceea ce se observă în special la pacienții tratați cu alcalinizante pentru ulcere gastrice. La aceștia, cantitatea de vitamină B1 este scăzută în urină.

De asemenea, anumite substanțe cu proprietăți absorbante, ca trisilicatul de magneziu, sau anumiți schimbători de ioni, prin acțiunea de fixare a vitaminei, micșorează cantitatea absorbită de peretele intestinal.

Vitamina B1 din drojdia de bere este greu utilizată de către om, și în cantitate mică. Aceasta se datorește faptului că celulele drojdiei nu sunt distruse în lumenul intestinal decât în mică proporție. Pentru ca vitamina să fie resorbită e necesar ca membranele calulare să fie rupte prin fierbere în apă.

Drojdia de bere proaspătă are proprietatea de a scoate din mediul intestinal o cantitate de vitamină ingerată concomitent, fapt care a putut fi demonstrat și în vitro.

1.3.4. Unitatea de vitamină B1 [11]

O unitate internațională (γ) corespunde la 3 micrograme de clorhidrat de tiamină. 1 miligram de vitamină (clorhidrat) este egală cu 333 unități internaționale.

1.3.5. Fiziologie [11]

1.3.5.1.Biogeneza

Dacă vitamina B1 este un factor esențial de creștere pentru unele microorganisme, altele sunt capabile să sintetizeze singure vitamina necesară.

În ce privește sinteza vitaminei, aceasta presupune formarea celor doi nuclei, tiazolic și pirimidinic. S-a emis ipoteza că porțiunea tiazolică a tiaminei ar putea să ia naștere dintr-un alfa-aminoacid print-o reacție care seamănă cu cea determinată de drojdie la aminoacizii fenilalanină, tirozină și triptofan, care dau respectiv alcoolii tirosol și triptofol.

Având drept precursor alanina (acid α-aminopropionic), se poate obține gruparea –CH2–CH2–OH la tiazol, care are o activitatea vitaminică de 100% pentru creștrea rădăcinilor de roșii în prezența pirimidinei.

Cercetările întreprinse pe rădăcinile de plante au dus la constatarea că sinteza tiaminei este posibilă. S-a văzut că reacția chimică folosită în vitro pentru sinteza nucleului tiazolic

HCS – NH2 + CH3COCH Cl CH2CH2OH

tioformamidă cloroacetopropilalcool

este realizată și de anumite rădăcini în vivo. În ce privește legătura dintre nucleul tiazolic și pirimidinic, acesta pare să fie făcută de o enzimă existentă în celulele rădăcinilor, o tiaminază.

1.3.5.2. Necesitatea organismului în vitamina B1

Organismul uman precum și organismele majorității animalelor și păsărilor nu fabrică vitamina B1, care e luată din alimente. Rumegătoarele par totuși să nu aibă nevoie de vitamina B1 dinafară, întrucât o cantitate importantă e sintetizată în intestinul acestor animale de Actinomyces albus și B. Coli precum și alte bacterii.

Pentru a preciza nevoia zilnică de vitamina B1 s-au făcut numeroase investigații cu diferite metode. Astfel s-a dozat vitamina în regimurile de bază ale omului, sau s-a studiat dispariția simptomelor de vitaminoză după ingestia unor cantități crescânde de vitamină B1 sau excreția vitaminei în urină, cu sau fără test de saturație. În fine, cercetările experimentale pe animal au avut un rol important în determinarea nevoii de vitamină B1 a organismului. În aceste lucrări s-a avut în vedere raportul dintre numărul de calorii ingerate și cantitatea de vitamină B1. Alte cercetări au ținut seama de faptul că proteinele și grăsimile sunt alimentele care economisesc vitamina B1, în timp ce un regim bogat în glucide spoliază organismul în tiamină.

După aceste cercetări experimentale, nevoia de vitamină B1 pentru om a fost apreciată la 0,5-0,75 mg pe zi.

Alte cercetări în același sens au arătat că nevoia minimă ar fi de 0,9 mg zilnic.

Faptul că prepararea alimentelor variază după regiune explică diferențele obținute de diverși autori. La aceste diferențe mai contribuie și varietatea metodelor utilizate pentru dozare.

Doza minimă de vitamină B1 necesară zilnic e apreciată e unii autori la 0,3-0,6 mg. După unii autori, 0,4 mg de vitamină B1 ingerate zilnic pot determina simptome de beri-beri.

Din studiul făcut asupra ameliorării fenomenelor de avitaminoză B1 prin doze crescânde de vitamină, au reieșit date similare. Aceste cercetări au fost făcute pe voluntari care s-au supus unui regim carențial între 3 și 6 luni și chiar 12 luni.

Cantitățile mici găsite de anumiți autori se pot atribui faptului că voluntarii au fost carențați relativ puțin timp (3 luni de exemplu); ori, trebuie să treacă un timp suficient de lung pentru ca rezervele de vitamină B1 ale organismului să se epuizeze.

În tabelul 1.2. este menționată nevoia pe vârstă și calorii. Din acest tabel rezultă nevoia crescută de vitamina B1 în cursul efortului și exercițiului muscular și nevoia crescută a copilului. Cantitatea necesară pentru acesta din urmă a fost calculată după excreția în laptele matern, după excreția urinară a vitaminei și prin dozarea cocarboxilazei sanguine.

Tabel 1.2. Nevoia de vitamină B1 pe vârstă și calorii

Necesarul în cursul sarcinii și lactației este crescut. Datele din literatură sunt destul de variate. Se admit în general în timpul sarcinii 1,8 mg zilnic și în cursul alăptării 2,3 mg.

În cursul diferitelor stări patologice, nevoia de vitamină B1 este variată.

Tulburările de sensibilitate la nivelul extremităților mâinii, în special, sunt semne de carență în vitamina B1. În cursul febrei și a stărilor toxice, nevoia e crescută, ca și în hipertiroidism. În cursul diareelor, absorbția din alimente fiind tulburată, necesarul crește de asemenea și este bine să se administreze vitamina B1 parenteral.

În tulburări de filtrare la nivelul rinichiului se pot constata pierderi importante de vitamină B1 (diabet, ingestia unor mari cantități de apă). În carența gravidelor trebuie să se țină seama de vărsături și în special de vărsăturile incoercibile.

1.3.5.3. Teste de carență

Pe baza relațiilor biochimice dintre metabolismul glucidic și vitamina B1 s-a putut alcătui un test de carență. Glucoza dată per os acționează asupra travaliului acut numai când organismul e saturat cu vitamina B1. Proba funcțională derivând din aceste constatări constă în măsurarea travaliului la ergometru bicicletă, după administrarea unei cantități de glucoză de 50g singură și în paralel 50g de glucoză +vitamina B1. Dacă după administrarea de glucoză+vitamină B1 travaliul la ergometru crește, dar nu după administrarea de glucoză singură, înseamnă că există o carență de vitamină B1.

Un alt test clinic de carență este realizat în felul următor: se injectează intramuscular, la 12 ore după ultimul prânz, 0,35 mg tiamină pe metrul pătrat de suprafață corporală. Individul carențat excretă prin urină mai puțin de 50 μg de vitamină în perioada celei de a patra ore.

Dozările se fac cu metoda colorimetrică.

În fine, a fost preconizată măsurarea piruvicemiei ca test de carență pentru vitamina B1. Aceasta se măsoară după prealabila ingestie de glucoză (1,75 g/kilocorp). Limita superioară normală este de 1,3 mg%; variația piruvicemiei pe 87 subiecți normali a fost de 0,77-1,16 mg la 100 cm3 sânge.

1.3.5.4. Resorbție

Resorbția maximă a vitaminei B1 are loc la nivelul intestinului subțire. Pentru ca să se facă resorbția e necesar să nu existe alterări ale mucoasei sau tulburări prea importante ale motilității tubului digestiv.

Resorbția este defectuoasă în colita ulcerativă, atrofiile mucoasei, inflamațiile mucoasei, scurtările de intestin prin intervenții chirurgicale, în fistule etc.

În tulburările gastrice și în special anaclorhidrie, resorbția este defectuoasă. Aceasta se datorește rapidității cu care alimentele sunt duse în intestinul subțire, în mediul alcalin unde vitamina e distrusă mai ușor. Totodată, tranzitul general intestinal fiind grăbit, posibilitatea de resorbție este micșotară.

Bila, sucul pancreatic distrug vitamina B1, spre deosebire de sucul gastric.

Resorbția la nivelul intestinului gros e slabă sau inexistentă după unii autori.

1.3.5.5. Distribuția în organism

Resorbția intestinală e urmată de distribuția în organism. După cum arată studiul vitaminei B1 după resorbție, în mod normal, crește atât vitamina B1 liberă, cât și cocarboxilaza.

Procesul de fosforilare începe încă în submucoasă sau chiar în lumenul intestinal, dacă ne referim la faptul că globulele albe trec în cantitate masivă în cursul digestiei în mucoasa intestinală și se reîntorc apoi în circulație. Cantitatea de cocarboxilază din globulele albe este mai mare decât în eritrocite și în același timp, după cum au arătat cercetările făcute în vitro, fosforilarea vitaminei B1 se face de către globulele albe.

Nu s-a putut confirma dependența totală a fosforilării vitaminei B1 de către corticosuprarenală și nici obligativitatea fosforilării pentru resorbția vitaminei. Există tot o competiție pentru sistemul fosforilant, competiție în care intră mai multe vitamine din grupul B, glucidele și acest lucru e legat de resorbția intestinală.

Vitamina B1 se distribuie în organism sub forma liberă, care e vehiculată de plasmă, precum și prin cocarboxilază, vehiculată de elemente sanguine.

Procesul masiv de fosforilare are loc la nivelul ficatului și rinichiului unde vitamina, dacă se poate spune astfel, e depozitată sub formă de cocarboxilază.

Aceste două organe sunt depozitul pentru vitamină, cedată prin defosforilarea plasmei și astfel pusă în circulație continuu și distribuită la alte organe, la care fosforilarea e mult mai lentă.

Formele cele mai obișnuite sub care se găsește vitamina în organism sunt cocarboxilaza și fermenții (carboxilazele). Ele sunt eliminate la cuantumul necesar funcției organului respectiv. Administrarea masivă de vitamină B1 cu câteva zile înainte de punerea animalului la un regim fără vitamină nu prelungește timpul de supraviețuire. Deci, lipsește posibilitatea de depozitare care există la vitaminele A, D, sau E. În cursul avitaminozei creierul și inima pierd foarte încet vitamina B1 ca și splina, plămânul, stomacul, intestinele. Ficatul pierde foarte repede conținutul de vitamină B1.

Sistemul muscular pierde de asemenea foarte repede vitamina B1, după cum foarte repede o câștigă în cursul administrării masive.

Vitamina administrată peste limita de saturație a organismului e eliminată sau distrusă în organism.

În sânge, vitamina B1 se găsește în cantitate de 3,5-16,5 γ la 100 cm3. Cifrele variate întâlnite în literatură se datoresc metodelor diferite întrebuințate. În aceste cantități, o zecime (cca 0,5 %) este sub formă pură nefosforilată.

Cel mai bogat țesut în vitamina B1 este miocardul, conținând 2-3 γ/g.

1.3.5.6. Forme sub care se găsește în organism

În natură vitamina B1 se găsește în general sub două forme: în regnul vegetal mai ales liberă, ca tiamină, iar în organismele animale în cea mai mare măsură sub formă de cocarboxilază.

Cocarboxilaza a fost izolată în 1937 sub formă pură și sintetizată chimic. Ea este un tiaminpirofosfat și constituie forma activă a vitaminei B1, fiind rezultatul unei sinteze enzimatice în organism. De altfel, sinteza ei pe cale enzimatică din vitamina B1 și fosfat a fost realizată tot atunci de Euler și R. Vestin.

Unii autori considerau fosforilarea vitaminei B1 dependentă de un factor hormonal corticosuprarenal. Probabil că fosforilarea se face grație unui purtător de fosfat și anume adenozintrifosfatului.

Cocarboxilaza este în mare măsură legată la substratele proteice din celulele organismului, generând astfel fermenți, sub care formă efectuează travaliul de catalizare metabolică.

Enzima care catalizează carboxilarea acidului piruvic și transformarea lui în acid oxalacetic este carboxilaza, care a putut fi izolată și obținută în stare pură. Ea este un complex proteovitamină B1 pirofosfat-magneziu.

Formele sub care se găsește vitamina în organism pot fi puse în evidență și dozate microbiologic, anumite microorganisme crescând numai în prezența vitaminei B1 libere, altele necesitând ca factor esențial de creștere vitamina B1 pirofosfat.

Sensibilitatea la acești factori esențiali este cu atât mai mare, încât a permis dozarea în anumite celule din regiunea cercetată sau în nervi. Transformarea în piramină, formă sub care se elimină în mică măsură vitamina B1 în urină, are loc probabil la nivelul rinichiului.

Vitamina B1 se mai găsește de asemenea în organism legată de diferite proteine.

1.3.5.7. Eliminarea

Excreția vitaminei B1 se face în cea mai mare măsură pe cale renală. Mici cantități sunt eliminate pe calea tubului digestiv. În anumite condiții, atunci când resorbția la nivelul intestinului subțire nu s-a făcut din motive de tranzit exagerat sau din cauza tulburărilor mucoasei, cantitatea găsită în scaun e mai mare. Mai trebuie luat în considerare și faptul că vitamina B1 poate fi sintetizată de flora intestinală și că o parte din ceea ce dozăm în scaun are această origine. Așa se explică faptul că, atunci când nu se ingeră vitamina de loc, în scaun se găsește încă o cantitate de vitamină B1. O bună parte a vitaminei este distrusă probabil în organism în cursul proceselor metabolice.

Cercetări făcute cu vitamina B1 sintetizată, în care sulful este radioactiv, au arătat că 61% din vitamina injectată sunt eliminate pe cale renală, 11% pe cale tubului digestiv, fără a putea explica ce cale urmează restul.

Excreția urinară a vitaminei B1 depinde de numeroși factori.

Factorul aport alimentar este unul dintre cei mai importanți și cercetările asupra excreției vitaminei B1 sunt făcute îndeobște cu un regim constant și al cărui conținut în vitamină e cunoscut.

Studiile recente de eliminare la indivizi cu regim constant dau cifre medii de 230 γ la bărbat și 120 γ la femei în 24 de ore. Diferența dintre sexe e datorată în cea mai mare măsură cantității de alimente ingerate.

În condiții obișnuite, la regimurile normale variate, cifrele excreției urinare a vitaminei B1 variază între 30-500 γ în 24 de ore.

Raportul dintre proteine, grăsimi și glucide este de asemenea o cauză a variației în eliminarea vitaminei B1 dată fiind acțiunea de economie de consum a vitaminei B1 pe care o au proteinele și lipidele. Dimpotrivă, glucidele măresc cantitatea de vitamină consumată și eliminarea urinară e scăzută.

La cei puși la un regim carențial, eliminarea vitaminei scade. Astfel, la o ingestie de 0,1 mg pe 1000 calorii, eliminarea atinge 3-19 γ) zilnic.

În cursul carențelor prelungite (120 zile), eliminarea urinară e în jurul a 3 γ). Semne de carență vitaminică subiectivă apar în general când excreția culinară scade sub 100 γ) zilnic.

Semne obiective, cum ar fi modificarea electrocardiogramei, apar numai când eliminarea e sub 30 γ) zilnic.

O scădere importantă a eliminării vitaminei B1 prin urină nu apare imediat ce subiectul e pus în condiții de carență, ci mult mai târziu, după cum și la administrarea masivă eliminarea urinară se prelungește 1-2 săptămâni după încetarea bruscă a tratamentului.

Excreția urinară a vitaminei în cursul sarcinii este scăzută în ultimele luni până aproape la jumătatea cantității din primele 4-5 luni. O scădere a eliminării vitaminei sub 40 γ) e considerată, ca o stare de hipovitamină și, plecând de al acest considerent, 35% din femeile însărcinate au o hipovitaminoză B1.

Administrarea de vitamină în cursul sarcinii este urmată de retenția ei în măsură mult mai mare decât la femeia neânsărcinată. În cursul toxemiilor gravidice, această retenție este și mai mare. Există variații ale excreției în funcție de vârstă. La bătrâni, eliminara e diminuată.

Exercițiul muscular produce, o dată cu consumul mărit în vitamină , scăderea eliminării urinare. În același timp se observă o eliminare prin piele, în transpirație. În cursul efortului la sportivi (jucători de fotbal), cantitatea de vitamină B1 eliminată prin transpirație întrece pe cea din urină, atingând 15 γ) la 100 g lichid de transpirație. Un consum important de vitamină B1 se constată la cei care stau într-o atmosferă caldă de lucru, la cuptoare, în uzine, fără ca eliminarea prin transpirație să fie prea mare.

În cursul diferitelor stări patologice, excreția de vitamină B1 variază. În starile de tireotoxicoză este crescută datorită probabil tulburărilor hepatice și musculare coexistente. În fine, există modificări ale eliminării produse de administrarea concomitentă a altor medicamente. Diureticele mercuriale cresc eliminarea urinară pentru o scurtă perioadă, după care urmează scăderea eliminării urinare (salicilații la fel).

1.3.6. Rolul vitaminei B1 în organism

1.3.6.1. Metabolismul glucidelor

Vitamina B1 sub formă activă, cocarboxilază, acidul tiamindifosforic, are rol important în metabolismul glucidic, atât în procesele aerobe, cât și în cele anaerobe. Această vitamină catalizează carboxilarea și decarboxilarea acidului piruvic, termen intermediar în cursul degradării glucozei. Astfel, în fermentația anaerobă a drojdiei de bere, acidul piruvic este transformat în acetaldehidă și bioxid de carbon.

CH3 CH3

C O C O + CO2

COOH H

acid piruvic acetaldehidă + bioxid de carbon

Denumirea de cocarboxilază vine de la însuși punctul de atac al acidului tiamindifosforic, care e grupul carboxil al acidului piruvic. Diferitele stadii de oxidare a glucozei în cursul glicolizei se află sub dependența mai multor enzime care catalizează procese biochimice variate și caracteristice.

În schema alăturată a acestor degradări ale glucozei la acid lactic se văd etapele de transformare respective.

Proces de fosforilare

a glucidelor glucoză monofosfat

(hexoză)

hexoză difosfat

trioză fosfat

trioză difosfat

acid difosfogliceric

acid fosfogliceric

acid fosfoenolpiruvic

acid fosforic + acid piruvic

acid lactic

Etapa de transformare a acidului piruvic în acid lactic este mai complexă decât pare la prima vedere. Acidul piruvic nu e direct oxidat în acid lactic. Un număr de date experimentale biochimice au permis să se lămurească în mare măsură procesul de transformare acid piruvic – acid lactic.

CH3 COOH

C O + CO2 CH2

COOH C O

COOH

acid piruvic acid oxalacetic

Acidul piruvic este carboxilat și trece în acid oxalacetic. Această carboxilare este sub dependența unei enzime care a fost izolată de altfel în stare foarte pură, o carboxilază formată din asocierea unei apoenzime (proteina) cu vitamina B1 difosfat și magneziu.

Se admit două cicluri pornind de la acidul oxalacetic: un ciclu așa-numit al acidului citric, în care acidul oxalacetic, prin condensare cu acid piruvic în prezența oxigenului, dă naștere la acid citric. În cursul acestui ciclu asistăm la transformarea acidului piruvic prin intermediul acid oxalacetic. Această transformare, după cum am văzut, e catalizată de vitamina B1 prin forma ei activă, carboxilaza: ciclul a fost pus în evidență în țesutul renal în vitro, unde acidul citric apare în cantitate mărită, în prezența vitaminei B1. In vivo s-a observat scăderea eliminării urinare a acidului citric la animalele carențate.

Un al doilea ciclu este cel al acidului succinic, în care acidul oxalacetic este redus la acid malic pe seama oxidării acidului piruvic:

(1) acid piruvic+acid oxalacetic+apă – acid malic+acid acetic+ CO2

(2) acid malic+acid piruvic acid oxalacetic+acid lactic

-H2O H2

acid malic acid fumaric acid succinic

Aceste diferite etape sunt găsite în metabolismele din țesuturile animale, rinichi, creier, ficat, precum și la bacterii.

Cercetările făcute cu ajutorul cărbunelui marcat C13 au arătat că tot carbonul radioactiv al acidului piruvic care intră în acidul α-cetoglutaric se găsește apoi în carboxilul terminal.

Acest fapt experimental a permis alcătuirea unei scheme a metabolismului acidului piruvic:

acid oxalacetic

CO2 + acid piruvic acid oxalcitraconic acid cisaconitic acid

citric

acid malic acid izocitric

acid fumaric

acid succinic acid α-cetoglutaric

Aceste procese de oxidare a glucozei sunt catalizate de un număr de fermenți, care utilizeazǎ drept apofermenți proteine ale organismului respectiv, iar drept cofermenți o serie de coenzime esențiale: adenozintrifosfatul (ATP), adenozindifosfatul, ionul de magneziu, codehidrazele I și II, citocromul, flavoproteinele etc.

Se știe că fosforilarea vitaminei B1 este efectuată numai în prezența unui purtător de acid pirofosforic și anume a acidului adenozintrifosforic. Cocarboxilaza, vitamina B1, pirofosfat, catalizează procesele biochimice grație tocmai acidului pirofosforic. Reiese deci clar rolul acidului fosforic în sistemele enzimatice ale catabolismului gucidic.

O moleculă de acid adenilic + două molecule de acid fosforic dau o moleculă de acid adenilpirofosforic.

În prezența acidului adenilpirofosforic, vitamina B1 se fosforilează, dând acidul tiaminpirofosforic, acidul adenilic rămânând liber să catalizeze din nou procesele de fosforilare prin aportul de fosfor din fosforul liber din organism.

carboxilază (tiaminpirofosfat) N C – NH2

vitamina B1 H – C C – N CH

S N C – N

N C – NH2 HC C – CH2CH2O

H – C

H3C – C C – CH2 N C – CH3

HO – CH

N CH Cl O

HO – CH

OH OH OH HC

HO–P–O–P–O–P–O – C–H acizi fosforici

O O O H

acid adenilic

(acid adenozinmonofosforic)

acid adenozindifosforic

ADP

acid adenozintrifosforic

ATP

Prin legătura strânsă pe care o are vitamina B1 cu fosforul și cu adenozintrifosfatul și difosfatul ea ține sub dependența ei un număr de procese de fosforilare în care intră acidul adenilic. O privire asupra constituției codehidrazelor. I și II arată prezența aceleași grupări, acid adenilic, riboză, acid fosforic. De aici reies corelațiile posibile biochimice, care de altfel au și un răsunet clinic, dintre vitamina B1 și vitamina nicotică.

Interrelațiile importante se găsesc și în riboflavinǎ, unde acidul fosforic este legat tot de riboză. După unele cercetări, prezența riboflavinei și vitamina B1 împreună e necesară pentru menținerea unei glicemii constante. La câinii depancreatizați, carența dublă de vitamină B1 și B2 împiedică glicozuria și hipoglicemia insulinică. Dacă se administrează ambele vitamine se produce șocul insulinic hipoglicemic. Vitamina B1 singură nu are această acțiune.

Legătura strânsă dintre vitamina B1 și fosfor are și aspecte clinice foarte importante.

Acidul fosforic (fosfații) este crescut în avitaminoza B1, atât în sânge, cât și în mușchi, iar administrarea de vitamină readuce la normal cantitatea de fosfați liberi sanguini și tisulari.

Administrarea de fosfați concomitent cu vitamina B1 potențează efectul vitaminei asupra activității musculare. Efectul clinic al tratamentului cu vitamina B1 este mărit dacă se administrează în același timp și fosfați și în special săruri ale acidului pirofosforic.

Efectul vitaminei B1 este adesea minim sau nul din cauza carenței de acid fosforic. Adăugarea acestuia din urmă sub una din formele de administrare schimbă răspunsul la vitaminoterapia B1.

Rolul pe care-l au fosfații în metabolismul vitaminei B1 și necesitatea prezenței grupării adenildifosfat pentru sinteza cocarboxilazei au dus la întrebuințarea compușilor fosforați ai acidului adenilic, precum și la folosirea cocarboxilazei.

Relația strânsă dintre vitamina B1 și acidul adenilic pune și problema dependenței metabolice a acestuia din urmă de vitamina B1. În carența de vitamină B1 apare o acumulare de acid adenilic, din lipsă de utilizare pentru sinteza cocarboxilazelor.

Pentru eliminarea normală a produselor de ardere a acidului adenilic este nevoie de procesul de fosforilare, tulburat în avitaminoza B1. Din procesul de distrugere oxidativă a acestui acid apare o mare cantitate de acid uric. Aici se vede relația cu metabolismul purinelor și nucleoproteinelor.

Fosforilarea este un proces legat de numeroase faze ale metabolismului glucidelor, probabil în condiții diferite.

Fosforilarea vitaminei B1, transformarea în cocarboxilază, se face îndeosebi la nivelul ficatului și rinichiului. În cursul diferitelor afecțiuni grave hepatice sau renale, această fosforilare e lentă și de mică amploare. Dacă se injectează 15 mg de vitamină B1 la un subiect normal crește rapid vitamina B1, ca și cocarboxilazemia. Aceeași doză de vitamină B1 la un cirotic face să crească rapid vitamina B1 și să coboare imediat, în timp ce cocarboxilaza crește foarte încet. La renali, acest fapt e de mai mică amploare decât la hepatici. Datele din literatură asupra relațiilor dintre vitamina B1 și metabolismul glucidic sunt destul de contradictorii.

Experimental, pe iepure s-a văzut că vitamina B1 în doză de 0,1-4 mg nu modifică nici glicemia animalului, nici curba hiperglicemică produsă de injecția de glucoză. Există alte cercetări cu rezultate contrarii, arătând creșteri sau descreșteri ale glucozei sanguine.

De asemenea, în ce privește hipogicemia insulinică, unele cercetări pledează în favoarea unei sinergii și potențări a acțiunii, după cum există rezultatele contrarii sau arătând o lipsă de legătură între vitamina B1 și hipoglicemia insulinică.

Desigur că în cercetările în acest domeniu intervin factori diferiți, cum ar fi specia pe care s-a lucrat. La porumbelul cu avitaminoză B1 s-a găsit o creștere a glicogenului hepatic și o hiperglicemie, în timp ce la câini se întâmplă tocmai contrariul.

La șobolanii cu avitaminoză B1, glicogenul hepatic e scăzut sau dispărut.

La diabetici, în special la cei tineri, există o importantă hipovitaminoză B1. Numeroasele cercetări făcute pentru găsirea unor relații clinice, în scop terapeutic, nu au putut preciza încă dacǎ toleranța la glucoză este modificată de prezența vitaminei B1 sau nu, dacă asocierea tratamentului cu vitamină B1 la insulinoterapie este necesară etc., deoarece există lucrări care pledează în favoarea acestor date, după cum din alte rezultate nu reies interrelații sensibile.

Creșterea acidului piruvic în țesuturi și în sângele animalelor în cursul avitaminozei B1 este considerată de majoritatea autorilor drept un factor constant. Dozarea acestui acid în sânge este un test sanguin de carență de vitamină B1 în special în regiunile unde apare beri-beri în patologia umană (Extremul Orient). În regiunile noaste, unde hipovitaminozele B1 sunt rare și mică importanță, acest test nu poate fi utilizat.

După cum s-a văzut, creșterea acidului piruvic este consecința insuficienței de decarboxilare prin lipsa cocarboxilazei. În general crește nu numai acidul piruvic, ci și alți compuși conținând gruparea cetonică sau aldehidică, cum ar fi metilglioxalul, precum și acidul lactic.

Efortul muscular mărește cantitatea de piruvat sanguin în cursul avitaminozei B1, precum și la persoanele normale neantrenate. În cursul avitaminozei B1 efortul fizic duce atât la creșterea acidului piruvic, cât și a acidului lactic. Procesul de transformare a acidului piruvic are loc prin intermediul unui complex enzimatic: acid fosfopiruvic, vitamina B1, pirofosfat, magneziu, proteină (carboxilaza). Fosforilarea are și aici un rol important, acest complex enzimatic făcând parte probabil și din sistemul de sinteză al glucidelor, pornind de la acid piruvic și acid lactic.

În tabloul transformărilor metabolice suferite de glucide se constată așa numitul ciclu al acidului citric, în care acest acid e sintetizat din acidul piruvic [24].

În cursul degradării glucozei mai apare acidul acetic, care joacă ulterior un rol important în metabolismul lipidelor de constituție și funcționale ale sistemului nervos.

Prin legătura cu sistemul de fosforilare, vitamina B1 are o acțiune importantă în resorbția intestinală a grăsimilor, deci o acțiune indirectă. Tot o acțiune indirectă are vitamina B1 prin activarea acțiunii insulinei. S-a putut demonstra că atât proteinele, cât și grăsimile au o acțiune de protecție față de consumul de vitamină B1.

Nevoia de vitamină B1 a animalelor cărora li se dă un regim bogat în grăsimi e mai mică.

1.3.6.2. Metabolismul proteinelor

Se știe că acidul piruvic este produsul comun obținut prin dezaminarea oxidativă a l-alaninei, după cum este și produsul de matabolism al glucidelor. Acidul piruvic este matabolizat prin intervenția vitaminei B1. O tulburare în metabolismul acidului piruvic ar putea influența indirect calea normală a transformărilor l-alaninei, a degradării acestui aminoacid, și în acest fel s-ar stabili încă un aspect al relațiilor dintre vitamina B1 și metabolismul proteic.

Acidul piruvic mai poate rezulta, după cum arată cercetările făcute în vivo pe secțiuni de ficat, deci, o altă posibilitate de interferare prin același produs metabolic, acid piruvic, cu metabolismul aminoacizilor și proteinelor.

O altă legătură apare din studiul rolului tiaminei în creșterea oxidării și utilizării α-cetoglutaratului la șobolanii cu vitaminoză. Se știe că acidul cetoglutaric e un intermediar și pentru catabolismul glucidelor, după cum este și un produs rezultând din dezaminarea oxidativă a acidului glutamic.

acidului glutamic acid cetoglutaric.

O interrelație importantă este între vitamina B1 și metabolismul nucleoproteidelor. Se știe că în gută și în beri-beri este crescut acidul adenilic în sânge. Simptomatologia asemănătoare din punct de vedere nervos și cardiac a arătat rolul pe care-l poate juca o hipovitaminoză B1 în gută.

Acidul adenilic este crescut în sânge prin imposibilitatea eliminării lui care necesită fosforilarea, proces tulburat la rândul său tocmai din lipsa vitaminei B1. Acidul adenilic suferă deci numai distrugerea oxidativă, care duce la formarea de acid uric în cantitate mare. Astfel apare relația dintre vitamina B1 și metabolismul nucleoproteidelor și purinelor.

1.3.6.3. Metabolismul mineral

Metabolismul mineral este parțial în legătură cu vitamina B1, deoarece, dată fiind legătura cu funcțiile de fosforilare, desigur că e în legătură indirect cu metabolismul fosforului și în mod deosebit cu fosforul organic, de care depinde și eliminarea de fosfați etc.

Relații experimentale interesante s-au găsit între ionul de mangan și vitamina B1. În sistemul enzimatic al carboxilazei ionul de magneziu poate fi înlocuit cu mangan fără ca activitatea enzimei să sufere în mod deosebit. Dimpotrivă, cantități mici de mangan stimulează activitatea carboxilazei.

De asemenea, zincul produce modificări importante în ce privește resorbția vitaminei B1. Acest element poate înlocui manganul și magneziul în sistemul enzimatic al carboxilazei. S-a putut arăta că zincul e scăzut cu 50% în beri-beri.

1.3.6.4. Metabolismul apei [11]

Este și el tulburat în cursul avitaminozei B1, când apar: edeme, hipoproteinemie, imbibiție apoasă a mușchiului cardiac, revărsări seroase etc.

Dată fiind nevoia importantă de vitamina B1 a nucleilor bazali, aceste tulburări sunt probabil în mare măsură rezultatul tulburării funcționale a centrului nervos al reglării diurezei.

În imbibiția apoasă din avitaminoza B1 există o inversare a raportului albumino-globulinic al serului.

Acțiunea diuretică a vitaminei B1 se manifestă prin: restabilirea funcției centrilor nervoși, a țesuturilor în general și a funcției renale de fosforilare și, implicit, de filtrare.

1.3.6.5. Rolul tiaminei în funcțiile diferitelor țesuturi, organe și sisteme

Sistemul nervos

Vitamina B1 este necesară pentru funcția normală a sistemului nervos central și periferic.

Prin vitamina liberă se înțelege cantitatea care se poate extrage în soluție apoasă fără o metodă specială.

Vitamina legată este calculată din cantitatea totală prin scăderea celei libere. Cantitatea totală a fost dozată fie în urma hidrolizei acide a țesutului, fie prin metoda cu Phycomyces, care e capabil să pună în evidență toată cantitatea de vitamină.

Este important de semnalat că, în cursul carenței, cantitatea de vitamină de constituție a țesutului cerebral nu se modifică sensibil. Este caracteristică avitaminozei B1 prezența de acid piruvic în sistemul nervos și în sânge. La porumbelul normal au putut fi declanșate simptome de beri-beri acut prin injectarea unei cantități importante de acid piruvic. Simptomatologia avitaminozei apare ca rezultat al unei acțiuni toxice a acidului cetonic.

Tulburările nervoase la om, și în general simptomatologia principală în beri-beri, care din numeroase motive nu trebuie considerat ca o vitaminoză B1, ci ca o polivitaminoză, au fost atribuite metilglioxalului. Acesta apare în cursul contracției cardiace și musculare. Datorită lipsei glutationului care pare constantă în beri-beri, și care servește drept coenzimă pentru glioxalază, metilglioxalul nu se poate metaboliza. Dacă cu injecții de metilglioxal nu s-au putut provoca fenomene de beri-beri, în schimb prin injecția de piruvat de sodiu la porumbel sau la iepuri, se pot produce pareze ale membrelor și aspecte similare avitaminozei B1.

În cursul avitaminozei B1 la om și în beri-beri apar o serie de modificări structurale ale nervilor, procese de degenerescență la nivelul diferiților nervi: nervii periferici, nervii cranieni, vag.

Nervii periferici sunt primii atinși; învelișul de mielină, locul unde este depozitată vitamina B1 și unde se desfășoară activitatea metabolică legată de prezența ei degenerează. Există și leziuni ale celulelor Schwann. Cilindracșii prezintă fragmentări și chiar aspecte de degenerescență walleriană. Aceste leziuni ale axonilor sunt proporționale cu severitatea carenței.

Aspecte de degenerescență sunt vizibile și în frenic, celulele ganglionare simpatice, plexurile cardiace, solare, renale, nervii splanhnici etc.

În sistemul nervos central, leziunile aparente sunt mai reduse decât în sistemul nervos periferic și apar mai târziu. Leziuni degenerative se găsesc în diferite cordoane: anterior și posterior în special rădăcinile nervilor anteriori și posteriori.

Aceste leziuni multiplex explică simptomatologia clinică atât de variată în beri-beri.

La șoarece, în cursul carenței acute se observă hemoragii în creier și în substanța reticulară din măduvă.

În sfârșit, tulburările funcționale ale sistemului nervos se traduc și prin manifestări psihice: aspecte de neurastenie, lipsită de atenție și mai ales scăderea calității atenției, defecte de memorie, nervozitate, instabilitate, stare de depresie și insomnii.

Inapetența este de asemenea un simptom frecvent.

Organele simțului

Tulburările organelor de simț sunt rezultatul degenerării fibrelor nervoase.

De pildă, nevritele nervului optic produc scotoame, micșorarea câmpului vizual, iar degenerarea fibrelor chiasmei optice este caracteristică pentru beri-beri la păsări.

Tulburări grave ca ambliopia pot fi rezultatul unei carențe de vitamină B1. Un autor japonez atribuie acestei avitaminoze 19% din ambliopiile din Japonia.

Nervul acustic poate fi de asemenea influențat de carența de vitamină B1. Nevritele respective sunt ameliorate de doze mari de tiamină.

Mușchii

În cursul carenței, probabil consecutiv tulburărilor nervoase, apar și leziuni musculare. Acestea se manifestă la majoritatea șoarecilor prin apariția unor atrofii în mușchii scheletici, datorate unor leziuni necrotice care apar în fibrele musculare.

La om aceste leziuni nu apar, probabil grație faptului că nu se ajunge niciodată la gradul de carență din cercetările experimentale.

Aparatul circulator

Carența vitaminei B1 dă o bradicardie importantă, care a servit pentru dozarea vitaminei. Această tulburare în funcția cardiacă rezultă din rolul particular pe care îl joacă vitamina în metabolismul miocardului. În cursul avitaminozei B1 scade cantitatea de cocarboxilază din inimă. Spre deosebire de sistemul nervos, unde în cursul lipsei de vitamină B1 se acumulează acid piruvic, acesta fiind treapta la care se oprește oxidarea glucidelor, în miocard, în cursul avitaminozei B1 se găsește o mare cantitate de acid lactic, termenul ultim de degradare a glucidelor.

Bradicaria sinuzală din cursul carenței este atribuită de aceea acidului lactic, iar după alți autori metilglioxalului, regăsit în sângele, laptele și urina animalelor beri-berice.

În cursul carenței de vitamina B1, inima și creierul o păstrează în aproape totalitata ei, spre deosebire de alte organe, unde ea dispare complet sau aproape complet. Unii autori au arătat că vitamina B1 cristalizată este un factor de stimulare a atriului la contracție.

Acidul lactic, care ia naștere din glicoliză, în miocard, poate fi oxidat de fermenții oxidanți numai atunci când în țesut sunt prezenți doi fermenți: vitamina B1 și coenzima lui Banga și Szentgyörgyi.

La porumbel, glicogenul cardiac și hepatic cresc în cursul carenței.

Tulburările inimii își pot avea cel puțin cauza și în puternica imbibiție cu apă a miocardului.

Modificările clinice importante care apar în cursul avitaminozelor B1 și beri-beri merg până la cedarea inimii drepte.

Simptomatologia obișnuită constă în dispnee de efort, reducerea capacității vitale, tahicardie, palpitații, ritm de galop, pulsații ale arterelor mari în epigastru, puls periferic săltăreț, vene destinse și edeme.

Modificările miocardice sunt reversibile în avitaminozele de scurtă durată. În cursul avitaminozelor cronice, însă, precum și în puseuri repetate de avitaminoză B1 leziunile pot rămâne definitive.

Experimental, la șobolanul cu avitaminoză B1, tabloul histologic al inimii arată infiltrații celulare și proliferare musculară, necroză a fibrelor musculare, precum și fibroză în pereții atriali.

La porc se găsesc pe primul plan modificările cardiace: dilatație cardiacă, necroză miocardică, în timp ce sistemul nervos nu prezintă nici un fel de leziune.

La om, modificările observate au constat în edemațierea și vacuolizarea fibrelor.

Modificările electrocardiografice

Sunt prezente în cursul avitaminozelor B1. Ele nu sunt caracteristice. Se observă în general: scăderea voltajului, scurtarea intervalului PR și creșterea intervalului QT, micșorarea și lărgirea undei T în cele trei conduceri.

Un criteriu al cauzei acestei modificări o dă terapia intensă și de lungă durată cu vitamina B1, care normalizează intervalul QT și celelalte modificări ale electrocardiogramei. Electrocardiograma este utilizată experimental pentru decelarea bradicardiei și modificărilor bradicardiei la șobolan sub acțiunea vitaminei B1.

La acest animal, numărul bătăilor inimii e în jurul a 500-550 pe minut, scăzând după un regim carențial, la 350 pe minut. Revenirea este proporțională cu doza de vitamină B1 administrată. Bineînțeles că acest test nu e specific. La om, modificările vasculare în avitaminoza B1 se traduc prin dereglare a sistemului vasodilatator periferic, de unde rezultă o piele caldă. Viteza circulatorie periferică e crescută. Timpul de circulație e crescut. Diferența de oxigen arterio-venoasă este scăzută. Hipotensiunea și aparența venelor sunt aproape regulă.

Rinichiul

Din datele experimentale biochimice apare o corelație interesantă între vitamina B1 și respirația tisulară, legată de consumul de glucide. Acestea sunt consumate în prezenața vitaminei B1.

În vitro, secțiuni de rinichi sintetizează glucide pornind de la acid piruvic. Această sinteză este încetinită în cursul avitaminozelor B1. Adaosul de vitamină B1 stimulează sinteza de glucide.

Se pare că procesul de fosforilare a vitaminei B1 în rinichi este esențial pentru resorbția la nivelul tubilor.

Cum variațiile de filtrare renală a apei depind de factori tisulari, nervoși și endocrini, e normal să constatăm în cursul avitaminozei B1 o relație funcțională renală cu vitamina B1, în sensul că diureza este mărită prin administrarea ei.

Tubul digestiv

Un număr de tulburări ale tractului digestiv au fost puse în legătură cu avitaminoza B1. De fapt, ele pot fi influențate și de alți factori (acid nicotinic, riboflavină etc).

Unele constipații și dispepsii au fost atribuite hipovitaminozei B1, pentru că administrarea acestei vitamine a dus la ameliorări. Pe de altă parte, lipsa de vitamină B1 cauzează atât tulburǎri ale funcției nervoase autonome, cât și ale musculaturii netede.

În ce privește activitatea mucoaselor digestive, această e tulburată în avitaminoza B1. Secreția gastrică scade, aciditatea dispărând complet. Pofta de mâncare dispare și ea. Din cauza lipsei de aciditate tractul intestinal e foarte ușor accesibil infecțiilor.

Ficatul

În cursul avitaminozei experimentale B1 la porumbel, în perioada de convulsii s-a constatat uneori o creștere a cantității de glicogen hepatic, ceea ce rezultă din tulburarea metabolică pe care o produce această avitaminoză în domeniul glucidic.

Capacitatea de protecție a ficatului față de diferite toxice este legată de prezența vitaminei B1. Toxemia arșilor scade dacă se administrează animalului vitamină B1. Ea protejează șobolanii față de intoxicația guanidinică, împiedică scăderea glicogenului hepatic după administrarea de cloroform etc.

Aparatul genital

Se știe că în cursul avitaminozei B1 experimentale șobolanii au o fertilitate redusă. Femelele sunt în anestru datorită probabil în cea mai mare măsură funcție scăzute a hipofizei anterioare.

La șoarece se observă totdeauna o degenerare a testicului în cursul carenței de vitamină B1.

Funcțiile de apărare

În avitaminoza B1 experimentală, activitatea fagocitară scade. Acest lucru poate fi pus în sarcina importanței pe care o are sistemul de cocarboxilază în leucocite (de 10 ori mai multă decât în eritrocite).

Rezistența la infecție e scăzută în cursul carențelor experimentale; aici intervine probabil și micșorarea capacității funcționale a sistemului nervos central, în urma carenței de vitamină B1.

Procesele de creștere

Încă din 1934 s-a constatat că vitamina B1 este un factor esențial de creștere pentru Phycomices blakesleanus. Ulterior acest fapt a fost demonstrat pentru microorganisme: ciuperci, bacterii, protozoare. S-a observat de asemenea că unele bacterii sau ciuperci sintetizează singure vitamina B1 necesară, de pildă B. subtilis, Eb. typhosa, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium diphteriae, diferiți bacili dizenterici, Staphilococcus flavus, o serie de bacterii lactice și propionice etc. De aici reiese necesitatea vitaminei B1 pentru metabolismul acestor microorganisme.

În cercetările făcute pe culturi în vitro de plante superioare, ca rădăcini de pătlăgele roșii, s-a văzut că, în afară de mediul format din săruri anorganice, zaharoză și nitrat, este absolut necesar extractul de drojdie, din acesta vitamina B1 având importanța cea mai mare. La anumite plante care cresc greu, adăugarea de tiamină stimulează creșterea.

Sinteza vitaminei B1 de către bacterii este importantă pentru lumea animală. S-a văzut că în fecalele șobolanilor supuși unui regim fără vitamină B1 există importante cantități de vitamină. Sinteza are loc în colonul larg și în special cecul, însă resorbția la nivelul intestinului gros este neânsemnată, aproape nulă. Faptul că șobolanii sunt coprofagi impune anumite măsuri în cursul cercetărilor experimentale după cum s-a văzut la capitolul dozărilor biologice.

1.3.7. Farmacologie [7,14,15]

Utilizarea largă terapeutică a vitamnei B1 nu este legată de acțiunea ei specifică antiberi-berică, ci în mare măsură de aceea nespecifică, rezultat al acțiunii dinamice a administrării vitaminei B1.

Desigur că terapia cu această vitamină se adresează unei simptomatologii care ține de foarte multe ori de frecvente stări de hipovitaminoză ușoară, provenind nu numai dintr-o carență alimentară, ci și dintr-un dezechilibru vitaminic alimentar.

1.3.8.Toxicitatea hipervitaminozǎ

Vitamina B1 în cantitate mare are acțiune toxică. Simptome de intoxicație se constată rar la om, unde dozele administrate nu sunt prea mari; chiar administrând 500 mg timp de o lună nu s-a observat vreo acțiune toxică. Există totuși cazuri descrise ca rezultând dintr-o acțiune toxică după administrarea a numai 50 mg intramuscular [47,49]. Ele trebuie considerate ca intoleranțe sau hipersensibilități, de altfel rare.

La animalele de experiență, administrarea unor doze masive de vitamină B1 determină spasme, tetanie musculară, tulburări respiratorii și apnee.

În majoritatea cazurilor, doza toxică variază la animale între 125-350 mg/kilocorp pe cale venoasă. Pe cale subcutanată este necesară în general de șase ori doza intravenoasă, iar pe cale bucală de 40 de ori aceasta din urmă.

La șoarece, doza de 50 mg/kilocorp pe cale venoasă dă o ușoară stare trecătoare de agitație; 75 mg/kilocorp determină decubit lateral, dispnee. Aceste fenomene durează 2 minute. Cu doze de 100mg/kilocorp moare un animal din trei. Administrarea a 150 mg/kilocorp determină moartea tuturor animalelor. Pe cale subcutanată e nevoie de 1g/kilocorp pentru a provoca moartea a două animale din trei în 20 de minute. Pe cale bucală e nevoie de 3g/kilocorp pentru a provoca moartea a două animele din trei [11].

Doza toxică la Macacus rhesus este de 600 mg/kilocorp.

Indicele terapeutic al vitaminei B1, raportul dintre doza terapeutică minimă și doza toxică minimă este foarte bun, variind între 1:7200 la 1:36000.

În cursul administrării de vitamină, chiar în doze mici, au fost observate fenomene de intoleranță, fenomene de alergie, edem angioneurotic și separat, simptome variate, nervozitate, eritem, tahicardie, dureri gastrice, greață vărsături, amețeală, pierdere a cunoștinței, tot de natură anafilactică. Frecvența acestor reeacții este foarte mică și poate fi pusă în legătură cu eventualitatea unei sterilizări defectuoase, care dă eventual naștere la culturi de anumiți germeni în fiolă, ceea ce produce fenomene de sensibilizare la acești germeni. De astfel, în literatură se observă de obicei sensibilizări după injecții repetate. Desigur că trebuie să admitem sensibilizarea cu înșăși vitamina, indiferent de posibilitatea de modificare a conținutului fiolei în cursul fabricării sau după fabricarea ei din cauza ueni fisuri în peretele fiolei. Testul intradermic pentru proba sensibilității nu dă indicații valabile [11].

1.3.8.1. Acțiunea asupra metabolismului general [11]

Cercetările experimentale, în cursul cărora s-a injectat vitamina B1 subcutanată în doze de 50-500 mg/kilocorp, au arătat că metabolismul general este stimulat. La cobai s-a obținut o creștere a consumului de oxigen timp de 30–60 de minute.

Este de așteptat ca o vitamină cu rol important în lanțul catabolismului glucidic să intervină în metabolismul general; totuși, pentru dozele uzuale, în cazul metabolismului normal, acțiunea vitaminei este greu de observat.

În tulburări ale metabolismului, în hipertiroidism, se observă efecte clinice favorabile. Vitamina nu manifestă o acțiune antitireotoxică directă, deci specifică, ci o acțiune indirectă, tisulară și prin intermediul sistemului nervos. În cursul hipertiroidismului la câine se constată o scădere a glicogenului muscular și hepatic, care e sub dependența vitaminei B1. Administrarea de vitamină B1 la câinele hipertiroidizat influențează ameliorarea greutății.

În general, experimental, pierderea de greutate determinată de tiroxină sau de ingestia de tiroidă poate fi anulată de vitamina B1. Pentru fiecare 0,2 mg tiroxină e necesar 0,1 mg vitamină B1.

În alte tulburări ale metabolismului, cum ar fi diabetul, acțiunea vitaminei B1 tinde la normalizarea metabolismului viciat, scăderea acidozei, a hiperglicemiei etc.

În tulburările metabolismului purinelor, în gută, vitamina B1 provoacă o scădere a nucleotidelor sanguine care sunt crescute în cursul acestei afecțiuni. Vitamina B1 nu are nici un efect asupra metabolismului uric la indivizii normali.

Metabolismul apei este influențat de vitamina B1. Această influență e manifestă numai în cursul hipo- și avitaminozelor.

În beri-beri, o singură administrare de vitamină B1 face să scadă în decurs de 3-5 ore presiunea osmotică a plasmei sanguine, urmată de o creștere, după 20 de ore, peste valoarea inițială. În general se observă o acțiune de reglare. Se utilizează proba de diureză Volhard pentru diferențierea tulburărilor în metabolismul apei.

În aceste din urmă tulburări, acțiunea vitaminei B1 se manifestă la nivelul centrilor diurezei, al rinichiului (reglarea sistemului de fosforilare) și al țesuturilor.

Acțiunea asupra centrilor a fost demonstrată prin scăderea acțiunii diuretice a vitaminei B1 după administrarea de barbiturice, care se știe că au o acțiune depresivă asupra centrului diuretic diencefalic.

Această acțiune explică rezultatele favorabile obținute în edemele din beri-beri, în cele provocate de subalimentația în general, în edemele tulburărilor de nutriție ale copilului etc.

Coborârea rapidă a afinității sângelui pentru apă după administrarea de vitamină B1 are drept efect modificarea distribuției apei dintre țesuturi și sânge, ceea ce explică acțiunea diuretică a vitaminei B1.

În sfârșit, nu trebuie să uităm că tabloul metabolic general poate fi influențat în cursul tratamentului cu doze masive de vitamină B1 prin faptul că acest tratament determină eliminarea masivă de vitamină B2.

1.3.8.2. Acțiunea asupra sistemului nervos

Administrarea unor cantități mari de vitamină provoacă la animale oprirea respirației printr-o acțiune depresivă asupra centrilor respiratori.

Dozele moderate de vitamină B1 măresc consumul de O2 al țesutului cerebral (în vitro) și normalizează câtul respirator.

Acțiunea specifică a vitaminei B1 în beri-beri rezultă din ameliorarea consumului de acizi cetonici, acid piruvic, din ameliorarea funcției nervoase prin aportul de constituent esențial al nervilor (chiar vitamina B1), precum și stimularea sintezei de acetilcolină. Aceasta se efectuează în vitro de către sistemul nervos al porumbelului, în prezența piruvatului de potasiu.

Ameliorarea funcției nervoase prin vitamina B1 a dus la întrebuințarea ei terapeutică în numeroase afecțiuni ale sistemului nervos central și periferic, și în general în simptomul durere.

Creșterea nucleotidelor sanguine și a acidului uric determină simptomatologia de sensibilizare nervoasă, care se atenuează prin aportul de vitamină B1. Acțiunea asupra sistemului esterazic al colinei, colinesteraza specifică și nespecifică, nu pare să existe, cel puțin direct. Indirect există această acțiune, mai importantă asupra colinacetilazei, prin corelațiile dintre grupul care se leagă de cocarboxilază, și prin apariția grupului acetil în cursul metabolismului glucidic.

1.3.8.3. Acțiunea asupra sistemului circulator

Experimental, pe inima izolată de broască, dozele mici de vitamină B1 micșorează amplitudinea bătăilor. Această acțiune trece printr-un maximum, după care se anulează și, în fine, se inversează. O doză foarte mare provoacă oprirea inimii. Acțiunea acetilcolinei este inhibată sau chiar inversată de doze de vitamină B1 superioare mai concentrate de 10-5.

Vitamina B1 are o mare importanță mai ales la nivelul miocardului, prin rolul său în sistemul enzimatic care dirijează funcția biochimică a consumului de glucide. Competiția pentru substratul de fosforilare a glucidelor și a vitaminei B1 pune problema modului de întrebuințare a glucidelor, a glucozei (soluție glucozată). O întrebuințare masivă de glucide ar putea provoca o deplasare spre hipovitaminoza B1, tocmai prin mecanismul descris mai sus.

Experimental s-a descris o acțiune hipotensivă a vitaminei B1, mai ales pentru vitamina de extracție, a cărei puritate nu era perfectă. Nu a fost observată o acțiune vasculară pe animalul normal sau la om, cu vitamină B1 pură. Acțiunea asupra vaselor periferice a fost observată în cursul arteritelor obliterante, unde vitamina B1 a permis ameliorări importante într-un număr de cazuri, și unde acțiunea nu pare să fie direct periferică, ci prin intermediul sistemului nervos central.

O acțiune de sensibilizare a vitaminei B1 pentru acetilcolina în ce privește aparatul cardio-vascular este admisă pentru anumite concentrații (tren posterior de broască irigat pe preparatul Laewen Trendelenburg).

Acest fapt a fost demonstrat experimental și pentru presiunea arterială la câine și inima de broască.

1.3.8.4. Acțiunea asupra sistemului rinichiului [11,47]

Acțiunea vitaminei B1 asupra rinichiului e minimă la animale sau subiectul normal. Acțiunea asupra diurezei e netă în cursul carenței experimentale sau în beri-beri. În afară de acțiunea asupra centrului diurezei și asupra țesuturilor și sîngelui, există și o acțiune renală directă, în special la nivelul tubilor, unde se efectuează procesul de fosforilare, în cursul resorbției a numeroase substanțe.

1.3.8.5. Acțiunea asupra musculaturii [11]

Mușchiul normal este aproape insensibil la acțiunea vitaminei B1. Activitatea musculară este influențată de vitamina B1, în sensul că prezența ei mărește efectul dinamic al glucidelor. Aceasta poate fi interpretată însă ca o acțiune prin intermediul sistemului nervos, deși în cursul efortului muscular există un mare consum de vitamină B1, care trebuie atribuit metabolismului muscular.

În degenerescența walleriană a nervului, mușchiul corespondent devine net sensibil la acțiunea vitaminei B1. Injecția de vitamină B1 normalizează repede cronaxia și pentru o durată mai lungă decât acetilcolina.

Vitamina B1 are influență și asupra musculaturii netede. Intestinul izolat al porumbelului în carență de vitamină B1 pierde rapid activitatea ritmică, pe care nu și-o câștigă prin administrarea de acetilcolină singură, dar și-o recapătă dacă la acetilcolină adăugăm și vitamină B1. Desigur că e greu de separat rolul vitaminei B1 asupra fibrei netede de acțiunea asupra sistemului nervos intrinsec. S-ar părea că vitamina B1 e necesară funcției mecanice a intestinului.

Acțiunea de sensibilizare a vitaminei B1 pentru acetilcolină se constată și în cazul mușchiului izolat de lipitoare.

1.3.8.6. Acțiunea asupra tubului digestiv [11]

Vitamina B1 injectată în doze de 5 mg al om provoacă creșterea acidității și secreției gastrice, atât la normal, cât și la cei cu avitaminoză B1, atenuând și anorexia.

Motilitatea tubului digestiv la om este infuențată numai în cursul carențelor de vitamină B1, când există o hipotonie a musculaturii netede. În aceste cazuri, constipația este vindecată prin vitaminoterapie B1 datorită acțiunii ei asupra terminațiilor nervoase intramurale, precum și asupra plexurilor autonome care prezintă tulburări morfologice în cursul carenței.

Asupra intestinului subțire izolat are un efect depresor, în timp ce asupra tonusului intestinului gros, ureterelor și rectului are un efect stimulant.

Acțiunea dinamică a vitaminei presupune o bună resorbție. În cazul administrării orale, în cazuri de avitaminoză severă, resorbția intestinală este nulă sau minimă din cauza integrității fiziologice a mucoasei și a secrețiilor glandulare. Anaciditatea este motiv important pentru ca resorbția să nu se facă. Aceste date trebuie luate în considerație în cursul terapiei specifice sau nespecifice cu vitamina B1.

1.3.8.7. Acțiunea asupra ficatului

Acțiunea coleretică și colekinetică a vitaminei B1 nu a făcut obiectul unor cercetări deosebite. În schimb a fost constatată o acțiune antitoxică. Vitamina B1 protejează funcțiile hepatice de intoxicație cu cloroform, eter, produse provenite din arsuri, tiroxină.

Scăderea glicogenului nu se mai observă la animalele tratate cu vitamină B1 câteva zile înainte de administrarea prelungită a eterului sau cloroformului [47].

La fel, după tratamentul cu tiroxină la câine se observă o scădere a glicogenului hepatic, care este împiedicată de vitamina B1.

1.3.8.8. Acțiunea asupra glandelor cu secreție internǎ [11]

Administrarea unor doze foarte mari, continue, are o acțiune depresivă asupra activității hipofizei anterioare și scade indirect progesterona. Totodată, la șobolani se observă o sterilitate parțială în prima generație și micșorarea lactației la a treia generație, cu pierderea instinctului matern. Este de remarcat că acest din urmă fenomen se mai obține la animale carențate în mangan. Manganul poate înlocui ionul magneziu în procesele enzimatice în care intră vitamina B1. Este de asemenea interesant faptul că pierderea instinctului matern, canibalismul și pierderea forțelor pot fi împiedicate prin administrarea unor doze mici de clorură de mangan.

1.3.8.9. Specificitatea acțiunii vitaminice [11]

Acțiunea antinevritică nu o posedă numai vitamina B1, adică 2-metil-5 (4-metil-5-ß-hidroxietiltiazolclorat)-metil-6-aminopirimidinclorhidratul. Au putut fi sintetizați peste 40 de derivați carea au o activitate antinevritică, în aproape totalitatea lor bineânțeles inferioară vitaminei B1.

C Cl

N C R3 N C – R4

R1 C C–NH–R2 HC C – R5

N R6

S-au sintetizat în general produse în care au fost înlocuite grupele de substituție din nucleul tiazolului sau al pirimidinei. S-a ajuns chiar la înlocuirea nucleului tiazol cu nucleul pirimidină, obținându-se așa numita hetero-vitamină B1, care e activată în avitaminoza porumbelului și inactivă la șobolan.

În tabelul 1.3. se văd grupele de substituție înlocuite, cu ce au fost înlocuite și titrul activității acestor produse, titrul vitaminei B1 fiind egal cu 100.

În schița de formulă au fost numerotate locurile unde sunt substituite grupele din tabel.

Tabel 1.3. Grupele de subsituție înlocuite, substituentul și titrul activitǎții acestor produse

1.3.9. Substanțe cu acțiune antivitaminicǎ [7,11,47]

Cercetările făcute pentru a constata dacă substanțe cu structură chimică asemănătoare au vreo acțiune antivitaminică au arătat că piritiamina e capabilă să inhibe creșterea microorganismelor care au nevoie de tiamină exogenă pentru creșterea lor. Acțiunea inhibitoare poate fi neutralizată prin vitamina B1. Cu alte cuvinte, piritiamina este un antimetabolit esențial.

Piritiamina este obținută prin înlocuirea S din nucleul metiltiazolic printr-o grupare vinilică = CH = CH.

CH3

N CNH2

C C – CH2 – CH2OH

H3C – C C – CH2 – N CH

C C

N CH H H

Această acțiune antagonistă, piritiamină tiamină, a fost regăsită și la șoarece, unde injecția de piritiamină provoacă simptomele clasice de avitaminoză B1. E necesar în acest scop un anumit raport cantitativ, și anume o moleculă de tiamină cere 40 molecule de piritiamină.

Alt component cu acțiune antagonistă este oxitiamina, în care NH2 este înlocuit prin OH. O acțiune similară asupra vitaminei B1 o are pirofosfatul de tiazol, deci pirofosfatul jumătății tiazolice a vitaminei. S-a constatat că o serie de derivați ai unor 6-aminopirimidine au și o acțiune antivitaminică B1.

Trebuie să mai adăugăm apoi că, în afară de aceste substanțe cu acțiune de competiție, mai există factori care, administrați animalelor, dau aspecte de avitaminoză B1. De pildă, se pot produce aspecte de beri-beri experimental prin administrare de acid uric, piruvic, metilglicoxal.

De asemenea, se știe că un regim foarte bogat în glucide, aproape exclusiv, poate antrena fenomene de beri-beri, cu polinevrită, aceasta datorându-se consumului ridicat de cocarboxilază și vitamină B1 necesare metabolizării masive a glucidelor.

1.3.10. Corelații cu alte vitamine [11]

Deși nu se cunosc perfect interrelațiile vitaminice, există totuși câteva date care au importanță în special pentru asocierea vitaminelor atunci când e vorba de terapeutică.

În ce privește legăturile vitaminei B1 cu celelalte din acest grup, putem cita necesitatea prezenței acidului pantotenic și a biotinei pentru metabolizarea acidului piruvic. Lipsa biotinei micșorează viteza de oxidare a piruvatului. Același lucru se întâmplă și în lipsa acidului pantotenic. O relație importantă o are vitamina B1 cu riboflavina. În cursul carenței de vitamină B1 se observă o resorbție săracă de B2 și o eliminare marcată. De asemenea, depozitarea masivă a vitaminei B2 în ficat este condiționată de prezența vitaminei B1 în cantitate suficientă.

Vitamina A acționează antagonist față de vitamina B1, simptomele carenței de vitamină B1 fiind precipitate de administrarea vitaminei A.

Relații de sinergie au fost găsite pentru vitaminele B1 și C1, tiamina întârziind apariția scorbutului experimental, și acțiunea antiscorbutică a vitamiei C fiind potențată de vitamina B1.

1.3.11. Prezentare și administrare

Vitamina B1 se prezintă sub formă de tablete sau fiole.

Tabletele sunt dozate variabil, între 5 și 25 mg.

Fiole sunt de 5 mg, 25 mg (forte) și 100 mg (fortissime).

Calea de administrare variază după necesitate: orală sau parenterală. Parenteral se administrează subcutanat sau, mai bine, intramuscular, dat fiind pH-ul acid al soluției injectabile.

De asemenea se administrează intravenos.

Dozele de vitamină sunt impuse de necesitatea clinică și fac obiectul capitolelor speciale.

Tiamina apare într-o multitudine de alte preparate farmaceutice, în asociere cu alte vitamine, minerale, aminoacizi etc (Vitamax, Ginsavit, Supradyn, Centrum de la A la Zn, Pikovit ș.a) [14,38].

=== 4.Met. dozare tiamina ===

Capitolul II

Metode de dozare a Tiaminei

Importanța fiziologică a vitaminei B1 a determinat numeroase cercetări în vederea precizării unor metode exacte de dozare în diferite medii biologice.

2.1. Metode fizice

2.1.1. Metoda fluorimetrică [13,18]

Este o metodă care se bazează pe măsurarea fluorescenței particulare a tiocromului în lumină ultravioletă. Aceastǎ substanță rezultă din oxidarea moderată a vitaminei B1 cu ajutorul diferiților agenți.

Cel mai utilizat agent este actualmente fericianura de potasiu în soluție alcalină (pH=10).

La început se proceda la oxidarea vitaminei și apoi la extragerea tiocromului cu izobutanol în care este solubil și în fine la dozarea fluorimetrică. S-au propus diferite modificări ale tehnicii, constatându-se că un număr de substanțe din țesuturi și lichide biologice tulbură reacția fluorimetrică.

O metodă de o rigurozitate deosebită a fost obținută în momentul în care s-a utilizat pentru purificare procesul de absorbție la un schimbător de ioni. Prin acest procedeu, toate substanțele care interferează în examenul fluorimetric sunt eliminate, prin faptul că pe schimbătorul de ioni rămâne numai tiocromul, iar în filtrat trec celelalte substanțe.

Această metodă de dozare, bazată e fluorimetrie, necesită în stadiul actual mai multe operații succesive.

Astfel se procedează la extragerea vitaminei din țesuturi prin fierbere cu acid sulfuric sau acetic diluat. Dacă materialul este bogat în proteine se procedează la hidroliza cu pepsină și apoi cu tacadiastază pentru eliberarea vitaminei din compușii în care se găsește în țesuturi.

Pentru scindarea cocarboxilazei (vitamina B1 pirofosfat) se utilizeză deasemenea enzime cu importantă putere fosfatazică (clarază), enzime preparate fie din rinichi, fie din prostată.

Se procedează apoi la absorbția pe coloană de zeolit (Decalso). În lichidul filtrat trec toate substanțele care tulbură reacția fluorimetrică, iar tiocromul rămâne absorbit la coloana de zeolit de unde este eluat cu clorură de potasiu acidificată.

Eluatul este tratat apoi cu fericianură de potasiu; se adaugă izobutanolul și hidroxid de sodiu. Se agită, apoi se centrifughează în vase care servesc în același timp ca pâlnie de separare și ca vase de centrifugă. Se separă izobutanolul, care se usucă pe sulfat de sodiu anhidru și se fluorimetrează cu ajutorul unui fluorimetru electric, echipat cu filtru de 360 mμ. În acest aparat se măsoară intensitatea fluorescenței unei soluții, flluorescență excitată de un fascicul de raze ultraviolete care cade perpendicular pe suprafața soluției, într-o chiuvetă de sticlă, cu ajutorul unei celule fotoelectrice așezate lateral.

Curentul electric ce ia naștere în celulă determină deplasarea acului unui galvanometru, deplasare care este liniară pentru cantitatea de tiocrom corespunzând la cantități de vitamină B1 până la 20 γ) .

Pentru a obține o intensitate de fluorescență standard se utilizează de obicei o soluție apoasă de chinină sulfurică (0,2 μg pe cm3 H2SO4 0,1N).

Redăm mai jos una din metodele existente în literatură și utilizată pe scară largă: 2 g de substanță solidă se fierb într-un balon cu refrigerent ascendent cu 75 cm3 H2SO4 0,1N timp de 30 de minute. Se răcește la 400C, se adaugă 0,5g de pepsină (pentru produse bogate în albumină) și se incubează 12 ore la 370C. După aceea se fierbe și se răcește. Se adaugă 10 cm3 acetat de sodiu 1,8 M și se aduce la pH 4,5. Se adaugă 0,5g tacadiastază și se ține la etuvă circa 12 ore la 370C sau 3 ore la 45-500C.

Se completează cu apă distilată l a100 cm3 și se filtrează.

Se trece printr-o coloană cu zeolit activat (Decalso) o porțiune de lichid care conține vitamina B1 (între 3 și 5), după care se spală coloana în două rânduri cu câte 20 cm3 apă distilată.

Zeolitul se activează prin agitare consecutivă în 3-4 rânduri cu o soluție de acid acetic 3% câte 10 minute cu de 10 ori volumul zeolitului. Între a doua și a treia agitare se tratează zeolitul cu KCl 25%, 5 volume, timp de 15 minute. Se spală zeolitul cu apă distilată până ce clorurile dispar și apoi cu alcool și eter. Se usucă la aer și se păstrează într-un flacon bine închis.

Coloana poate primi cam 2 g de zeolit. Ea are la partea superioară un rezervor de aproximativ 30 cm3, urmat de un tub lung de 14 cm, cu diametrul interior de 5-6 mm. La partea inferioară se continuă cu un capilar astfel calibrat încât viteza lichidului să fie în jurul a 1 cm3 pe minut.

Se eluează de pe coloana de zeolit cu ajutorul clorurii de potasiu 25 cm3 din soluția de 25% în acid clorhidric 0,1N. Se culege eluatul. Se trece o soluție standard conținând 5) de vitamină în apă acidulată la pH 4,5 printr-o coloană similară și se eluează ca mai sus, culegându-se și acest eluat.

Determinarea fluorimetrică se realizează în felul următor: se pipetează 5 cm3 din fiecare eluat în două pâlnii de separare de 30 cm3 capacitate, pâlnii speciale care pot servi și la centrifugare. La una (testul) se adaugă 3 cm3 din soluția de fericianură de potasiu (obținută prin dizolvarea a 30 mg de fericianură de potasiu cu 100 cm3 de hidroxid de sodiu 15%). Se adaugă apoi la ambele 16,5 cm3 hitobutanol. La a doua (proba blanc) se adaugă 3 cm3 din soluția de hidroxid de sodiu 15%. Se agită pâlniile 90 de secunde, centrifugând și îndepărtând faza apoasă. Se clarifică izobutanolul prin deshidratare cu aproximativ 1 g de sulfat de sodiu anhidru cu care se agită.

Se transferă soluția de izobutanol în chiuveta fluorimetrului prevăzut cu filtre care lasă să treacă de la sursă ultravioletul cu lungime de undă în jurul a 360-370 mµ.

Între chiuvetă și celulă se pune un filtru care lasă să treacă radiații luminoase în jurul a 460 mµ.

Pentru aranjarea instrumentului se utilizează o soluție standard de chinină sulfurică într-un cm3 acid sulfuric 0,1 N.

Pentru calculul vitaminei din probă se întrebuințează formula:

vitamină

unde: Tn – cifra pe galvanometru obținută cu izobutanolul extras din proba

necunoscută tratată cu fericianură;

Ts – cifra obținută cu standardul;

Bn și Bs – cifre obținute cu probele albe ale probei necunoscute și cu

standardul;

A – volumul soluției necunoscute trecută prin coloană;

G – masa probei luată pentru analiză.

În afară de metoda fluorimetrică s-a mai încercat o metodă fizică, bazată pe faptul că vitamina B1 are un spectru de absorbție caracteristic. În soluția de hidroxid de sodiu 4%, vitamina dă un maximum de absorbție trecător la lungimea de undă de 340 mµ.

Această proprietate nu este utilizată pentru dozare.

2.2. Metode chimice

Se bazează pe reacțiile colorate pe care le dau compuși de vitamină B1 și sărurile de diazoniu a numeroși compuși ca: acid sulfanilic, paraaminoacetofenonă, 2,4-dicloroanilină, paraaminobenzoat de etil. Coloranții obținuți se extrag cu ajutorul solvenților organici și se colorimetrază în paralel cu un standard tratat similar.

Aceste metode sunt mai puțin sensibile decât cele fluorimetrice și se folosesc mai puțin la materiale bogate în proteine și sărace în vitamine, deoarece marile cantități de aminoacizi rezultate tulbură absorbția de coloană de zeolit a vitaminei B1.

2.2.1. Metoda cu paraaminoacetofenonă [11,16]

Este curent utilizată pentru dozările în urină, unde extracția și hidroliza enzimatică nu se mai fac și probele de urină sunt trecute direct pe coloană după prealabila ajustare a pH-ului la 4,5. Metoda colorimetrică, bazată pe colorația roșie produsă de reacția dintre vitamină și paraaminoacetofenona diazotată este realizată în mai multe operații succesive.

Se procedează la prepararea extractului prin fierberea la reflux a unei cantități de produs biologic care să conțină minimum 20γ) de vitamină. Se face hidroliza enzimatică cu tacadiastază în condiții apropiate cu cele utilizate în metoda fluorimetrică.

Purificarea și concentrarea soluțiilor se realizează într-o aparatură specială formată dintr-o pâlnie lungă, a cărei tubulară este chiar tubul interior al unui refrigerent (condensator) ce se continuă cu coloane de zeolit activat ca în metoda fluorimetrică. Coloana de zeolit este fixată la capătul inferior la un dop de cauciuc care intră în gâtul unui vas Kitasato. O eprubetă cotată la 10 cm3 poate fi atârnată cu agățători la capătul tubului inferior al coloanei pentru a primi eluatul în cursul aspirării aerului din vasul de trompă prin tubulara laterală.

Rolul refrigerentului este de a încălzi lichidul din tubulatura interioară cu ajutorul vaporilor introduși în camera refrigerentului (schimbător de căldură).

Se realizează astfel o încălzire a apei care trece prin coloană și respectiv se încălzește zeolitul din coloană. Tratarea cu apă fierbinte are ca scop regenerarea zeolitului. Acesta este un principiu general de regenerare a schimbătorilor de ioni.

Se procedează în felul următor: se trece o cantitate de extract filtrat prin coloana de zeolit la temperatura ambiantă cu ajutorul unui vacuum moderat pentru a avea un debit de 3-4 picături pe secundă. Se trec apoi prin camera refrigerentului vapori și peste coloană o cantitate de apă (30 cm3), grație unui puternic vacuum. Apa este încălzită de vaporii fluenți timp de ½ minute. Eprubeta cotată este adăugată apoi și se procedează la eluarea cu clorură de potasiu a vitaminei B1 în trei reprize, fiecare cantitate fiind culeasă până la ultima picătură. O soluție standard de vitamină e trecută prin coloană în condiții similare.

Reacția colorată se realizează astfel: o cantitate de reactiv alcool-fenol preparat din 3,9 g fenol în 500 cm3 alcool de 950 și 2 picături dintr-o soluție de albastru de timol 1% în alcool este adăugată peste eluat. Se adaugă apoi NaOH 5N până când apare o culoare albastru distinctă.

Se adaugă atunci o cantitate determinată de reactiv pentru vitamina B1 proaspăt preparat (reactivul pentru vitamina B1 se prepară prin amestecarea a 10 cm3 soluție de sare de diazoniu cu 137 cm3 soluție de hidroxid de bicarbonat de sodiu, agitând puternic). Se lasă să stea până când colorația roz inițială se schimbă în galben-pal (5-20 minute, când se utilizează); se dizolvă 0,635 g paraaminoacetofenonă în 9 cm3 de acid clorhidric concentrat și se completează cu apă distilată la 100 cm3; se dizolvă 22,5 g nitrit de sodiu în apă distilată și se diluează la 500 cm3. Apoi se dizolvă 20 g hidroxid de sodiu și 28,8 g bicarbonat de sodiu și se diluează la 1000 cm3); se lasă să stea la temperatura camerei peste noapte sau minimum 2 ore. Se agită cu 5-15 cm3 de xilen timp de 3 minute și se transferă xilenul colorat într-o celulă a unui colorimetru sau fotocolorimetru. Același procedeu este urmat pentru soluția standard de vitamină B1.

2.2.2. Metoda gravimetrică

Se bazează pe formarea unui precipitat roșu-portocaliu al vitaminei cu iodură dublă de bismut și potasiu.

2.2.3. Metoda Spruyt

Se bazează pe separarea vitaminei ca fosfotungstat și reducerea lui cu hidrogen născând. Culoarea brună care este proporțională cu cantitatea de vitamină B1. În metoda Raybin, vitamina B1 dă naștere cu 2,6- dibromochinonclorimidă unei culori portocalii în soluția de borax la pH 9,6 [11].

Această culoare se poate extrage în cloroform și fotometra. Intensitatea culorii scade cu timpul.

2.2.4. Determinarea spectrofotometrică a vitaminei B1 [7,44,45]

Reactivi. Mod de lucru

Se cântăresc 0,1200 g pulbere de comprimate cu o precizie de 0,0002 g și se aduce cantitativ într-un balon cotat de 1000 ml cu 80ml acid clorhidric 0,01N, se agită timp de 5 minute, se completează la semn cu acid clorhidric 0,01N și se filtrează. 10 ml filtrat se diluează cu HCl 0,01N într-un balon cotat de 50 ml. Se citește extincția soluției la spectrofotometru la lungimea de undă de 270 nm, în cuva de cuarț de 1cm, față de HCl 0,01N ca martor.

Calcularea rezultatelor

Conținutul în vitamina B1 se calculează cu formula:

Vitamina B1g/comprimat

în care: Ee-extincția solutiei etalon; Es-extincția solutiei de cercetat; Ce-concentrația soluției etalon; M-greutatea medie a comprimatelor în grame; G-greutatea substanței luate în lucru.

2.3. Metode biologice

Se bazează pe tratamentul sau prevenirea anumitor simptome specifice avitaminozei B1.

În acest scop se utilizează porumbeii, puii de găină și șobolanii, lipsa vitaminei din hrana lor determinând fenomene caracteristice de polinevrită.

Metoda curativă este greu de folosit la porumbel, ca și la șobolan, din cauza limitei neprecise a acțiunii curative în ceea ce privește retracția cefei la porumbel sau convulsiile paralitice la șobolan.

De asemenea, simptomatologia de mai sus este foarte greu de realizat la șobolan. Ea se obține prin pregătirea îndelungată a animalului, ținut timp îndelungat la un regim de carență parțială. Animalele trebuie să trăiască multă vreme cu un asemenea regim pentru ca să apară tulburările neuro-musculare.

Deși metodele biologice au fost înlocuite în cea mai largă măsură cu cele microbiologice, socotim important să descriem pe larg două metode utilizate încă.

2.3.1. Metoda bazată pe curba de creștere în greutate a șobolanului

Animalul este supus unui regim carențial, sub acțiunea produsului de cercetat. Această metodă se efectuează pe șobolani de 28 de zile, cântărind 40-50 g, ținuți în cuști individuale cu podeaua din plasă de sârmă, cu ochiuri de cel puțin 8×8 mm, pentru a preveni coprofagia.

Animalele au la dispoziție apă la discreție și dietă de bază, compusă din alimentele prezentate în tabelul 2.1.

Tabel 2.1. Componentele dietei de bază la șobolan

Soluția de sare de diazoniu: se pipează 5 cm3 dintr-o soluție de paraaminoacetofenonă într-un cilindru scufundat în apă cu gheață și prevăzut cu un agitator. Se adaugă 5 cm3 din soluția de nitrit de sodiu, încet, și se agită 10 minute; se mai adaugă încet 20 cm3 soluție de nitrat și se agită în baia de gheață 30 minute. Se lasă apoi la 50C și se utilizează în aceeași zi.

Cazeina fără vitamina B1 se prepară în modul următor: se agită 400g cazeină cu 2 L alcool 60% (prin cântărire) ½ oră. Se lasă să stea 5½ ore. Se filtrează la trompă și se spală cu 1 litru alcool 60%. Se repetă spălarea, se lasă 18 ore și se face spălarea finală cu 1 litru de alcool 90%,se cântărește. Se usucă la aer.

Șobolanii sunt cântăriți la fiecare 3 zile. După 10 sau înainte de 30 zile se produce descărcarea de vitamină, care se manifestă prin scăderea vizibililă a greutății pe o perioadă de 5 zile. Animalele sunt atunci grupate câte opt. Un grup este menținut la dieta de bază drept control negativ. La celelalte grupuri se administrează per os, cu ajutorul unei seringi și al unui ac gros, rotunjit, fie cantități cunoscute de vitamină, în doză cescândă, fie cantități cunoscute din materialul de dozat.

Greutatea netă câștigată de grupele de referință este notată pe hârtia milimetrică. Pe aceleași curbe se interpolează greutățile grupului pe care se cercetează cantitatea de produs necunoscut.

Se exprimă în general rezultatul în mg de vitamină B1 la 100g de material.

2.3.2. Metoda curativă [11]

Se realizeaza sub acțiunea produsului cercetat, după ce în prealabil a fost cercetată acțiunea unui standard de referință în aceleași condiții pe același animal.

Această metodă se realizează cu anumite precauții privind întreținerea și observarea animalelor.

De asemenea, perioadele experimentale sunt bine definite, la fel și simptomatologia de căutat, pentru a preântâmpina pe cât posibil erorile care pot surveni în cursul dozării.

Metoda se realizează în cursul a trei perioade:

perioada preliminară;

perioada de descărcare (depleție);

perioada de dozare.

În perioada preliminară, animalele sunt supuse unei supravegheri deosebite și unui regim constant.

În perioada de „descărcare” intră șobolani de vârstă maximă 30 de zile și greutate maximă 50 g. Animalele au la dispoziție tot timpul apă și regimul test pentru vitamină B1 prezentat în tabelul 2.2.

Tabel 2.2. Componentele regimului test pentru tiamină

Se dizolvă 100g extract de ficat în 1000 cm3 soluție de bisulfit de sodiu 0,6%. După păstrare într-un vas bine închis 24 de ore se acidifică cu HCl la pH 1,5. Se concentrează prin distilare în vacuum la temperatura de 500 la ½ volum. Se usucă pe cazeină purificată de vitamina B1, la o temperatură care nu depășește 650C. Extractul utilizat în această dietă trebuie să conțină pe fiecare gram cel puțin cantitatea de extract care, administrează zilnic unui bolnav de anemie megaloblastică biermeriană, dă un răspuns suficient în ce privește acțiunea hematopoetică.

Administrarea produsului și a standardului de referință se face pe aceeași cale pentru ambele, fie oral, fie parenteral. Doza trebuie astfel potrivită ca să producă o perioadă curativă de minimum 5 zile și maximum 15 zile. Prin perioada curativă se înțelege timpul scurs (număr de zile) între administrarea vitaminei și reapariția polinevritei acute după o totală amendare a simptomelor.

După repartiția fenomenelor de polinerită se administrează la aceleași animale produsul de cercetat pe aceeași cale ca și standardul de referință.

Pentru aprecierea rezultatelor se iau în considerare: datele când s-a administrat standardul, când au dispărut simptomele de polinevrită, când au reapărut, ziua în care a fost administrat produsul necunoscut, când au dispărut simptomele și când au reapărut. O dozare se face prin administrarea standardului de referință și a produsului de cercetat, consecutiv (la același animal) pe un lot de minimum opt animale.

Standardul de referință este dat de clorhidratul de tiamină pur, în prealabil uscat în exicator pe pentoxid de fosfor până la greutatea constantă. Însăși cântărirea trebuie făcută rapid, din cauză că este avid de apă. De asemenea, vitamina B1 se distruge atât în soluțiile alcaline, cât și în cele neutre. Este stabilă în soluții acide, motiv pentru care se utilizează soluția stoc în alcool 25% cu acid clorhidric, care să dea o concentrație 0,005N aproximativ.

2.4. Metode microbiologice [11]

Aceste metode se bazează pe faptul că vitamina B1 este necesară pentru creșterea și înmulțirea diferitelor bacterii sau ciuperci. Există numeroase metode și ele diferă după microorganismul întrebuințat: Lactobacillus fermenti 36, Saccharomyces carevisiae, Streptococcus salivarius, Propionibacterium pentosaceum, Glaucom piriformis, Leuconostoc mesenteroides.

Pentru extragerea completă a vitaminei din țesuturile respective se procedează la hidroliza cu acid sau enzime care scindează cocarboxilaza, sau ambele, după nevoie. Purificarea pe coloană de zeolit nu e absolut necesară în procedeul microbiologic și poate fi omisă.

Se utilizează în general medii sintetice care sunt inoculate cu microorganismele de mai sus. Mediile sunt caracteristice fiecărui germen întrebuințat. Dozara se face fie prin măsurarea turbidității mediului, fie prin titrarea acidității, în cazul bacteriilor generatoare de acid lactic, fie prin măsurarea volumului de CO2 degajat în cursul fermentației în aparate speciale. În cazul P. blakesleanus se cântăresc miceliile după uscare pe filtru tarat.

Nu toate microorganismele de mai sus utilizează cocarboxilaze. De aceea este necesară hidroliza prealabilă. Pentru Streptomyces salivarius și Lactobacillus fermenti, cocarboxilaza este mai activă decât vitamina B1 cu respectiv 40 și 30%. În dozări microbiologice acest fapt trebuie luat în considerare. Unele bacterii pot crește în prezența vitaminei sau a amestecului celor doi nuclei care o compun: tiazolic și pirimidinic. Altele necesită unul sau altul din acești nuclei.

Una din metodele întrebuințate este aceea care folosește Lactobacillus fermentum. Creșterea acestui microorganism nu este stimulată nici de nucleul pirimidină, nici de nucleul tiazolic, nici de ambele împreună. Creșterea P, blakesteanus nu e stimulată de nici unul din cei doi nuclei separat, este însă stimulată de amestecul lor. Același lucru se întâmplă cu S. aureus și diferite protozoare. Există microorganisme (ciuperci și protozoare) care necesită pentru creștere numai fracțiunea tiazolică, iar altele numai fracțiunea pirimidinică (ciuperci, levure și protozoare).

Dăm mai jos un tip de mediu pentru L. fermentum, metodă care dă cifre asemănătoare cu metoda ce utilizează dozarea fizico-chimică a tiocromului.

Peptonă tratată cu alcali plus acetat de sodiu 2 g

Peptona tratată cu alcalii se prepară din 40g peptonă pentru bacteriologie dizolvată în 250 cm3 apă la care se adaugă 20g NaOH dizolvat în 250 cm3 apă. Soluția este păstrată 24 ore (la întuneric pentru dozarea vitaminei B1). Se adaugă acid acetic glacial până se obține un pH cuprins între 6,6-6,8 (27-29 cm3 în general); se mai adaugă 7g acetat de sodiu anhidru și se completează cu apă la 800 cm3. Se păstrează indefinit sub toluen răcit. Soluția conține 5% peptonă și 6% acetat de sodiu.

Hidroliză de cazeină 0,5 g

Hidrolizatul de cazeină se prepară în felul următor: 100g cazeină purificată este amestecată cu 500 cm3 dintr-o soluție de acid sulfuric 25% (în volum). Se autoclavează amestecul 10 ore la o presiune de 2 atmosfere. Soluția e diluată la 2 litri și se neutralizează cu o soluție de hidrioxid de bariu saturată la cald. După sedimentare se sifonează și se filtrează supernatantul, apoi se elimină urmele de bariu pintr-o nouă tratare cu acid sulfuric diluat, se refiltrează și se concentrează la 1000 cm3 în vacuum. Soluția, pentru a fi purificată de urmele de acid nicotic, este trecută pe cărbune activat.

Glucoză 4 g

Acetat de sodiu 1,2 g

Cistină 20 mg

Sulfat de adenină 2 mg

Clorhidrat de guanină 2 mg

Uracil 2 mg

Săruri A 1 cm3

B2 1 cm3

Soluția salină A conține pe cm3: K2PO4H 100mg și KPO4H2 100mg

Soluția salină B conține pe cm3: MgSO4.7H2O 40mg; NaCl 2mg;

FeSO4.7H2O 2mg; MnSO4.4H2O 2mg

Riboflavină, pantotenat de calciu, acid paraaminobenzoic 20 γ

Clorhidrat de piridoxină 20 γ

Biotină 0,08 γ

Acid folic 0,015 γ

Pentru dozarea vitaminei cu acest mediu se procedează la prepararea inoculului pe mediul de bază, la care se adaugă în plus 10 γ) vitamină pentru 5 cm3 de mediu și 10 cm3 apă distilată, precum și extract de drojdie de bere 5 mg. Inocularea se face după sterilizare. Creșterea inoculului se realizează în 16-24 de ore la 370C. Celulele sunt centrifugate și suspendate în 10 cm3 soluție clorurată izotonică. O picătură din acestă suspensie se diluează în 25 cm3 soluție clorurată izotonică și o picătură, la rândul ei, este cantitatea utilizată pentru însămânțarea eprubetelor cu mediu.

Concentrația succesivă de standard de vitamină B1 este următoarea: 0; 5; 10; 15; 20; 30; 40; și 50 mγ (0-0,05 γ).

Probele de cercetat se potrivesc în jurul acelorași cifre pentru a putea fi interpolate. Sterilizarea mediilor se face 15 minute în vapori fluenți (1000C) pentru a nu distruge vitamina la acest pH (6,5).

Timpul de incubație este de 16-18 ore la 370C.

=== 5.Met cr ===

Capitolul III

Metode cromatografice

3.1. Generalități

Cromatografia este o parte distinctă, un domeniu vast al metodelor de analiză, ea bazându-se pe distribuția diferită a componenților unui amestec între o fază mobilă și una staționară, ca urmare a deplasării cu viteze diferite a componenților purtați de faza mobilă, de-a lungul fazei staționare. Acest domeniu cuprinde diverse metode de separare, de importanță majoră pentru chimia analitică, deoarece permit separarea, izolarea și identificarea componenților unui amestec, care altfel ar fi mult mai greu de realizat.

Metodele cromatografice se numără printre cele mai eficiente, mai selective și mai sensibile metode de separare și de detecție. Tehnica separării cromatografice a fost descoperită de botanistul rus Țvet în 1903, care a studiat adsorbția pigmenților vegetali, menționând clorofila, pe suporturi de oxid de aluminiu.

Termenul de cromatografie provine de la „cromatograph” ce înseamnă scriere în culori. În 1930 s-a descoperit cromatografia de repartiție, iar în 1960 a început utilizarea fazelor peliculare, legată de numele lui Stal și Kirhel. Ulterior, s-a dezvoltat cromatografia cu microparticule.

Tipurile de procese ce stau la baza procedeelor cromatografice sunt următoarele:

adsorbția pe suporturi solide sau faze staționare;

repartiția între două faze lichide, una staționară depusă pe solid și

cealaltă mobilă;

excluderea – difuzia;

schimbul ionic.

Termenul de ,,cromatografie” este deci relativ dificil de definit riguros, datorită varietății sistemelor și tehnicilor care se utilizează. În principal, se admite cǎ analiza cromatograficǎ se referă la procese ce se bazează pe vitezele diferite cu care, diferitele componente ale unui amestec migrează printr-un mediu staționar poros, având drept suport o fază mobilă, ce poate fi gaz sau lichid.

3.2. Tipuri de faze mobile și staționare

Există mai multe posibilități de prezentare, atât pentru starea staționară, cât și pentru faza mobilă, și anume:

Faza staționară este în stare solidă, fin divizată, dispusă într-un tub de sticlă sau metal; faza mobilă percolează prin solid, fie datorită influenței gravității, fie datorită unei pompe.

Alte metode folosesc drept stare staționară o hârtie poroasă sau un solid fin granulat, dispuse pe o placă de sticlă; aici, faza mobilă migrează prin solid datorită acțiunii capilare sau influenței gravitaționale.

Faza staționară poate fi de asemenea un lichid imobilizat, nemiscibil cu faza mobilă. Reținerea acestui lichid în interiorul unui tub se realizează prin intermediul unui solid fin divizat (faza mobilă percolează printre particulele de solid impregnate cu lichidul staționar) ori cu ajutorul pereților interiori a tubului capilar (faza mobilă este un gaz care trece prin tub); lichidul mai poate fi păstrat și cu ajutorul fibrelor de hârtie sau a particulelor fin granulate, repartizate pe o placă de sticlă.

Tabelul 3.1. prezintă procedeele cromatografice obișnuite, ce sunt clasificate ținând cont de natura fazei mobile și a celei staționare.

În general, metodele de separare cromatografice se împart în două categorii:

în prima intră cele ce se bazează pe afinitatea diferită a componenților (repartiție, adsorbție, schimb ionic și aciditate);

din a doua categorie fac parte cele ce se bazează pe mărimea diferită a componenților (excluziunea sterică), așa cum este arătat și în schema prezentată în figura 3.1.

Tabel 3.1. Clasificarea separărilor cromatografice

Cromatografia

Cromatografia gazoasǎ Cromatografia lichidǎ

Cromatografia Cromatografia Cromatografia Cromatografia

gaz-lichid gaz-solid planǎ pe coloanǎ

Cromatografia Cromatografia

pe hârtie pe strat subțire

Cromatografia Cromatografia Cromatografia Cromatografia Cromatografia Cromatografia

lichid-solid lichid-lichid prin schimb ionic de afinitate prin excluziune stericǎ într-o fazǎ

Fig 3.1. Clasificarea metodelor cromatografice

3.3. Procese de separare cromatografică

Există trei procese de separare cromatografică utilizate în cromatografia de lichide pe coloană, și anume: adsorbție – repartiție, schimbul ionic și excludere – difuzie. Pe unele faze staționare pot avea loc toate aceste procese, dar pe altele au loc numai una sau douǎ dintre ele.

A. Cromatografia de adsorbție și repartiție

Adsorbția este rezultatul forțelor intermoleculare dintre atomii de la suprafața solidului și moleculele solutului exterior. Aceste forțe sunt:

forțe London, ce se stabilesc între toate moleculele adsorbite și suprafața fazei staționare – forțe electrostatice;

forțe de transfer ionic, ce se realizează între donorii electronici puternici și acceptori;

legături de hidrogen.

Toate aceste legături sunt mult mai slabe decât legătura covalentă – ionică.

În cazul repartiției, moleculele solutului se află în echilibru, la interfața ce separă faza staționară de faza mobilă. Dacă sistemul ar fi static și nu dinamic, procesul ar fi în general identic cu cel al extracției. Procesele cromatografice nu sunt reprezentate de adsorbții sau repartiții pure.

B. Cromatografia de excludere

Separarea componenților probei are loc conform mărimii moleculare. Se poate face în gel sau pe site. În cazul penetrației în gel, separarea are loc în funcție de mărimea moleculei solutului. Metoda permite separarea zaharurilor, proteinelor, lipidelor etc.

Suporții solizi utilizați sunt formațiuni tridimensionale de lanțuri de polimeri legate în cruce. Aceste geluri au capacitatea de a se umfla, crescând astfel spațiile dintre lanțurile de polimeri. Mărimea acestor cavități are importanță în separarea anumitor componenți. Cele mai utilizate materiale în acest caz sunt zeoliții (aluminosilicați metalici) sintetici sau naturali.

C. Cromatografia prin schimb ionic

Schimbul de ioni este un proces reversibil între ionii dintr-o fază lichidă și o substanță solidă. Schimbul presupune substituția unui ion cu alt ion, prin desfacerea unei legături ionice și formarea alteia, fără modificări semnificative în structură. Schimbul ionic a contribuit la înțelegerea mecanismelor din lumea vie, deoarece membranele celulare sunt văzute ca și un schimbător de ioni; de asemenea, transmiterea influxului nervos a fost considerat un proces de schimb ionic. Zeoliții pot funcționa ca schimbători de ioni.

3.4. Etapele unei separări cromatografice

Principalele faze ale unei determinări cromatografice sunt:

prepararea fazei staționare;

introducerea probei;

trecerea probei peste faza staționară;

colectarea componenților individuali.

Cromatografia se poate face în două moduri:

– pe coloană: lichidă sau gazoasă;

– planară: pe strat subțire sau pe hârtie cromatografică.

Developarea presupune trecerea fazei mobile peste adsorbant (cromatografie de adsorbție) sau suport (cromatografie de repartiție). Eluția reprezintă procesul de developare. Agentul de eluție este faza mobilă folosită la developare. În urma procesului de eluție, se obține o cromatogramă. Cromatograma este rezultatul unei separări cromatografice și este generată de procesul de detecție a analiților, în ordinea eluției acestora. Această cromatogramă este o reprezentare a concentrației componenților unei probe, în funcție de timpul de eluție sau de volumul de eluție, respectiv timpul de retenție sau volumul de retenție.

3.5. Dinamica procesului cromatografic

Pentru cromatografia pe coloană, faza staționară este plasată sub formă de pastă, într-un tub cilindric care este astupat la partea inferioară cu un tampon de vată de sticlă sau cu un disc poros inert. În funcție de condițiile alese (fază staționară, eluent, temperatură etc.) fiecare solut din amestec va apare la partea de jos a coloanei, în funcție de volumul de eluție sau timpul de eluție.

Developarea cromatografică se realizează prin patru metode :

Eluția

Proba dizolvată într-un volum mic de solvent se introduce în coloană, peste care se adaugă eluentul – viteze de migrare diferite a componenților. Aceasta este cea mai folosită metodă.

Eluția variabilă

Se folosește atunci când eluția simplă nu este eficientă. Se mai numește eluție varibilă cu gradient.

Analiza frontală

Se caracterizează printr-o trecere continuă a soluției de probă prin coloană. Se folosește în general la purificarea solutului reținut cel mai puțin.

Procesul deplasării

Proba este introdusă în coloană; peste aceasta, se adaugă agentul de deplasare. Avantajul este că se pot utiliza cantități mari din proba supusă analizei. Dezavantajul este constituit de faptul că sistemul cromatografic este complet încărcat cu agent de deplasare, în urma terminării procesului cromatografic. Se utilizează în general pentru purificări și determinări cantitative.

3.6. Analiza cantitativă prin cromatografie

Analiza cantitativă se bazează pe corelarea datelor obținute din cromatogramă cu concentrația componenților din proba de analizat. Pentru aceasta, este necesară estimarea cantitativă a ariei sau înălțimii picului. În cromatografia de gaze și de lichide se utilizează două tipuri de detectoare. Funcție de acestea, aria picului se calculează diferit:

Detector sensibil la concentrație

(3.1)

unde: – factor de răspuns;

– constantă dependentă de viteza de deplasare a benzii;

w – masa componentului;

F – debit gaz purtător.

Detector sensibil la debit masic:

(3.2)

unde factor de răspuns corespunzător detectorului.

Aria picului cromatografic se calculează manual, prin mai multe metode:

– Metoda produsului înălțimii presupune:

(3.3)

– Metoda triunghiului se bazează pe relația:

(3.4)

– Decuparea și cântărirea picului – este preferată atunci când picurile sunt de formă negaussiană.

– Metoda planimetrării

Se bazeazǎ pe determinarea ariei cu ajutorul planimetrului (aparat ce determină aria prin urmărirea conturului).

– Metoda înălțimii picurilor

Dacă picurile sunt destul de ascuțite, este posibilă corelarea înălțimii acestora cu concentrația analitului.

– Integrarea automată

Există sisteme în care integrarea și determinarea ariei se face automat, pe calculator.

3.7. Concepte fundamentale ale cromatografiei

Valoarea distribuției este analog cu extracția, iar constanta de repartiție se calculează ca fiind raportul dintre concentrația solutului pe faza staționară Cs și concentrația pe faza mobilă CM.

(3.5)

Pentru cromatografia plană:

(3.6)

Rezoluția

Eficacitatea separării este determinată de doi factori:

distanța dintre zonele centrale pe măsură ce ele migrează;

compactitatea zonelor.

(3.7)

Forma picurilor – picurile pot adopta diferite forme.

4. Selectivitatea – este o măsura a preferinței fazei staționare pentru un anumit solut, în comparație cu alți soluți.

(3.8)

K1 , K2 – coeficienți de distribuție.

Cu cât diferența dintre acești coeficienți este mai mare, cu atât selectivitatea este mai bună.

5. Eficiența – se exprimă prin numărul de talere teoretice sau prin înălțimea echivalentă a unui taler teoretic.

(3.9)

unde: H – înălțimea unui taler teoretic; L – lungimea coloanei; N – numărul de talere.

Talerul teoretic reprezintă lungimea coloanei în care solutul suferă o echilibrare completă între cele două faze. Cu cât numărul de talere teoretice este mai mare, cu atât eficiența acestora este mai mare.

(3.10)

unde: VR – volumul de retenție;

B – baza picului;

N – numărul de talere teoretice.

3.8. Metode cromatografice pe coloană

În cromatografia pe coloană, ca fază mobilă se pot folosi atât lichidele, cât și gazele. În coloană pot fi realizate și cromatografii prin schimb ionic sau de excludere. Toate aplicațiile cromatografiei de lichide pe coloană introduc amestecul care va fi separat la partea de sus a coloanei, sub forma unei probe mici și concentrate, adăugând apoi faza lichidă mobilă (agentul de eluție).

Dacă separarea are loc pe baza adsorbției, ea depinde de interacțiunea dintre solut și cele două faze cu care vine în contact (suprafața adsorbantă și solvent).

Dacă separarea se datorează repartiției, ea depinde de distribuția solutului între cele două faze lichide: faza mobilă și faza staționară.

În ambele cazuri, pentru o separare optimă, este necesară o alegere corespunzătoare a dimensiunilor coloanei, a fazei mobile lichide și a fazei staționare.

Tuburile cromatografice pot avea diferite mărimi, forme și concepții, fiind realizate din sticlă sau alt material inert din punct de vedere chimic. Funcția lor este de a constitui un suport pentru faza staționară (adsorbant lichid sau solid staționar pe un suport inert) aflată în coloană și de a permite controlul asupra introducerii solventului și colectarea efluentului.

Raportul dintre lungime și diametru trebuie să fie cel puțin egal cu 10 sau mai mare. Dacă amestecul conține componenți cu caracteristici apropiate, în general sunt necesare coloane lungi. De asemenea, cu cât cantitatea de probă este mai mare, sunt necesare coloane cu diametru mai mare.

Coloanele sunt realizate astfel încât să permită o eluție completă a zonelor. Debitul fazei mobile este controlat cu un ventil de închidere sau clemă de strângere. Curgerea fazei mobile poate fi determinată gravitațional sau prin pompare.

Țevile prin care se asigură transportul fazei mobile spre coloană și a efluentului ieșit din coloană trebuie să fie inerte față de faza mobilă utilizată: oțel inoxidabil, sticlă, teflon, polietenă etc.

Înclinările se pot realiza cu piese de legătură sau cu manșoane. Supradimensionarea unei coloane poate duce la pierderi și rezultate eronate deoarece:

este necesar un volum excesiv de fază mobilă;

difuzia în toate direcțiile determină dispersarea zonelor din coloană.

Se preferă o viteză de curgere mică, în caz contrar se obține un sistem neechilibrat și are loc o creștere a trenării. Pentru a introduce umplutura în coloană, se folosește o suspensie realizată din umplutura propriu-zisă, dispersată în agenți de eluție, sau un alt solvent al probei.

O trecere continuă a solventului ajută la sedimentarea particulelor umpluturii.

Deoarece proba și faza mobilă încearcă să parcurgă drumul de rezistență lungă, coloanele în care umplutura este neomogenă și cu o densitate insuficient de mare, conduc la o separare necorespunzătoare.

Rezoluția aparentă poate fi influențată de diametrul și modul de umplere al coloanei.

3.9. Adsorbție și repartiție

Metodele cromatografice, atât cele de adsorbție, cât și cele de repartiție, au atât avantaje, cât și dezavantaje. Cele de adsorbție pe coloană sunt mai ușor de realizat, decât cele de repartiție. Totuși, atunci când se pune problema alegerii între cele două metode, se iau în considerare și alte criterii, cum ar fi tipul compușilor și scopul separării.

Mecanismul de adsorbție sau repartiție implică procedee complicate; în toate cazurile însă iese în evidență un singur factor: polaritatea. Pe baza acestor considerente se pot face aprecieri asupra suporților fazelor mobile și staționare corespunzătoare.

Avantajele și dezavantajele adsorbției

procedeele experimentale prin adsorbție se efectuează mai ușor decât cele prin repartiție;

prezintă o comportare mai uniformă și mai reproductibilă, deoarece utilizează o singură fază mobilă de eluție și o fază solidă;

sensibilitate foarte mare la diferențe sterice pentru molecule similare, deci poate fi aplicată la separarea amestecurilor care conțin acest tip de substanță;

polaritatea fazei mobile poate fi variată pe un domeniu larg, deoarece apare fenomenul de miscibilitate cu o fază staționară lichidă;

se utilizează în cazul unor cantități mari de probă;

se preferă în cazul separării amestecurilor cu componenți mult diferiți în polaritate și structură.

Avantajele si dezavantajele repartiției:

putere de rezoluție mult mai mare decât la adsorbție;

dificultate în reproducerea condițiilor experimentale;

se folosește în cazul unor concentrații scăzute de amestec;

este influențată de diferențe mici ale masei moleculare, prin urmare se preferă pentru separarea unor serii omoloage;

coeficientul de repartiție tinde să fie independent de concentrație, pe un interval mult mai mare față de coeficientul de adsorbție;

există o relație mai rațională între structura și influența substituentului.

3.10. Cromatografia de repartiție gaz-lichid

Este o metodă modernă prin care pot fi separate substanțele care sunt volatilizate ușor la temperaturi nu prea ridicate.

Avantajele gaz cromatografiei constau în:

analiză calitativă și cantitativă a componenților;

precizie mare;

aparatură simplă;

sensibilitate ridicată, permițând detectarea cantităților de compuși de ordinul nanogramelor;

timpul de analiză scurt. Există doi timpi de analiză:

– pentru cromatografia gaz-lichid, fenomenul este de repartiție;

– pentru cromatografia gaz-solid, fenomenul este de adsorbție.

Componentele unui gaz cromatograf sunt următoarele:

un rezervor cu eluent;

cuptor de preîncălzire unde se injectează proba;

coloană cromatografică;

detector;

recorder sau înregistrator.

În gaz cromatografie, analiții se distribuie între faza staționară solidă sau lichidă și în faza mobilă care este constituită dintr-un gaz inert (această fază mobilă se mai numește gaz director sau gaz vector și poate fi azot, argon, hidrogen, metan).

Acele componente care au o solubilitate limitată în starea lichidă staționară se autodistribuie între acestă fază și faza gazoasă, conform legii de echilibru. Viteza cu care diferitele componente migrează depinde de propria tendință de a se dizolva în faza lichida. Un coeficient de repartiție bun se obține pentru o viteză mică. Implicit, speciile cu solubilitate mică în faza lichidă, vor migra rapid. Identificarea calitativă a unui component se bazează pe timpul necesar pentru apariția picului caracteristic, la sfârșitul coloanei. Datele cantitative se obțin din evaluarea ariei picului.

Proba se injectează lent prin injecție directă, cu ajutorul unei microseringi (se introduc în general între 1-10 microlitri), sub formă de vapori.

Cromatografia gaz-lichid utilizează două tipuri de coloane. Cel mai adesea, coloana este confecționată din oțel inox sau sticlă de calitate superioară având lungimi cuprinse între 1-6 m, iar diametrul coloanei este de 1-5 mm. Această coloană este umplută cu particule omogene de site moleculare de tip alumino-silicat sintetic sau diverși polimeri poroși. Faza staționară lichidă este dispusă pe un suport inert de tip silicagel sau derivați ai acestuia, cu mare stabilitate termică și inert la spălare cu acizi. Coloana este plasată într-un cuptor ce are rolul de a menține temperatura între 24-4000 C.

Suportul staționar ideal este constituit din particule sferice mici (20-40 microni), cu o bună rezistență mecanică. Acest material este necesar să fie inert la temperaturi ridicate și să poată fi umezit uniform de către faza lichidă. Deoarece un asemenea material nu este încă disponibil, alegerea fazei staționare și a suportului acesteia presupune ca:

suprafața adsorbantă să prezinte un înalt grad de porozitate și să aibă suprafața specifică foarte mare;

faza lichidă să fie un bun solvent pentru componenții probei;

faza lichidă să fie inertă din punct de vedere termic și chimic;

la alegerea fazei gazoase trebuie ținut cont de faza staționară (în funcție de polaritatea acesteia).

Separarea este eficientă atunci când faza lichidă este similară din punct de vedere structural cu componenții ce trebuie separați. De exemplu, separarea hidrocarburilor folosește o fază lichidă nepolară. Cea mai utilizată fază solidă este diatomita (kieselgurul).

De asemenea, faza lichidă folosită trebuie să prezinte o volatilitate scăzută, cu punct de fierbere de minim 2000C care să se situeze peste temperatura maximă de operare a coloanei, stabilitate termică, inerție chimică; nu în ultimul rând, caracteristicile solventului să se situeze într-un domeniu potrivit determinărilor. Deoarece un singur lichid nu întrunește toate aceste cerințe, se obișnuiește în practica de laborator să avem la dispoziție câteva coloane interschimbabile, fiecare dintre ele cu câte o faza staționară diferită.

Timpul de retenție pentru un solut este în directă dependență cu coeficientul său de repartiție, care la rândul său este legat de proprietățile lichidului ce servește drept stare staționară. Prin urmare, pentru a fi folositor unei cromatografii gaz-lichid, lichidul trebuie să prezinte afinități diferite pentru speciile care urmează a fi separate. Coeficienții de repartiție ai acestor soluți în lichid vor trebui să fie nici prea mari, dar nici prea mici. Dacă valoarea lui K este prea mică, solutul trece prin coloană rapid, fără ca să se separe în mod semnificativ. Pe de altă parte, dacă valoarea lui K este prea mare, este necesar un timp neconvenabil pentru a trece solutul prin coloană.

Astfel, în ideea de a avea un timp de retenție rezonabil în coloană, solutul trebuie să manifeste un grad de compatibilitate cu solventul, și ceea ce am amintit mai înainte, polaritățile celor două să fie asemănătoare.

Între soluții cu polaritate similara, ordinea eluției este aceea stabilită de punctele de fierbere. Când aceste puncte de fierbere sunt suficient de diferite, au loc separări foarte clare. Soluții care au puncte de fierbere apropiate, dar cu polarități diferite, necesită adesea o fază lichidă care reține selectiv unul sau mai multe dintre componente, prin interacțiuni de tip dipol sau prin formarea unui aduct. O interacțiune importantă care necesită selectivitate este formarea legăturii de hidrogen. Pentru ca acest efect să se manifeste, trebuie ca solutul să aibă un atom polar de hidrogen, iar solventul să dețină o grupare electronegativă -oxigen, fluor sau azot).

Prepararea coloanei cromatografice pornește de la aducerea materialului care servește drept suport în limitele domeniului de mărime adecvat particulelor. Apoi particulele sunt uscate și pregătite pentru cromatografie, utilizând un solvent volatil care umezește întâi particulele, pentru a fi ulterior volatilizat. Coloane sunt realizate din sticlă, oțel inoxidabil, cupru sau aluminiu. O coloană realizată potrivit, poate fi folosită pentru câteva sute de determinări.

Urmează termostatarea coloanei la o temperatură ce depinde de punctul de fierbere al probei și de gradul de separare cerut. În general, o rezoluție optimă este asociată cu temperaturi minimale.

Detectorul se folosește pentru punerea în evidență a componenților unui amestec ce au fost separați anterior într-o coloană cromatografică. Sistemele de detecție trebuie sa răspundă rapid și reproductibil la concentrații scăzute ale solutului eluat din coloană Alte proprietăți pe care trebuie să le prezinte un detector sunt: răspuns liniar, o bună stabilitate pe parcursul determinării, răspuns uniform pentru o mare varietate de compuși. Câteva tipuri de detectoare sunt prezentate mai jos:

detectorul cu conductibilitate termică – se folosește la detecția unei molecule străine bazându-se pe scăderea conductibilității termice a gazului vector în prezența acestuia; un instrument utilizat în acest scop poartă uneori numele de catarometru.

detectorul flamfotometric – specific pentru compușii organici; la temperatura unei flăcări hidrogen-aer, acești compuși suferă o piroliză, se formează intermediari ionici care facilitează un mecanism prin care curentul poate fi trecut prin flacără.

detectorul de radioactivitate (detector de raze β) – specific pentru compușii radioactivi, are o mare sensibilitate și prezintă avantajul de a nu altera proba semnificativ (față de detectorul flamfotometric).

Pe măsură ce componenții probei sunt detectați, aceștia sunt înregistrați în funcție de volum sau de timp, obținându-se cromatograma prin :

analiză calitativă – se realizează prin determinarea timpului de retenție;

analiză cantitativă – se pot determina ariile picurilor de eluție care sunt proporționale cu concentrația.

Dintre factorii care influențează gazcromatografia amintim: mărimea particulei și suprafața specifică, viteza de curgere a gazului purtător; tipul și cantitatea fazei staționare, lungimea coloanei, diametrul coloanei, temperatura coloanei.

Gaz-cromatografia are aplicații în domenii ca: analiza purității aerului; controlul medicamentului; analiza alimentelor; analiza solului.

=== 6.Parte Experimental ===

capitolul IV

Partea experimentală. Determinarea tiaminei din medicamente printr-o metodă gaz cromatografică

Lucrarea de față își propune punerea la punct a unei metode cromatografice simple și rapide care să faciliteze determinarea tiaminei din produse farmaceutice complexe, ce conțin pe lângă vitamina B1 și alte substanțe active. Probele sunt injectate direct în sistemul cromatografic, fǎrǎ a fi necesară supunerea acestora unui tratament prealabil și fǎrǎ a fi diluate.

Dreapta de etalonare a fost obținutǎ în condițiile unei sensibilitǎți cât mai ridicate. Limita de detecție a metodei este bunǎ, ca de altfel și precizia determinǎrilor și exactitatea acestora. Au fost investigate influențele diferitor substanțe organice și a ionilor metalici.

Metoda a fost aplicatǎ pentru determinarea concentrației de tiaminǎ din soluții și comprimate de uz farmaceutic.

Rezultatele experimentale obținute prin utilizarea metodei propuse, ce utilizează cromatografia de gaze, sunt în bunǎ concordanțǎ cu cele declarate de producǎtor.

4.1. Prepararea probelor

Toți reactivii utilizați sunt de puritate analiticǎ și pentru toate soluțiile s-a utilizat apǎ demineralizatǎ provenitǎ de la un sistem Milli-Q.

Soluțiile standard (10−3 mol/L) de vitaminǎ B1 au fost preparate prin dizolvarea clorhidratului tiaminei, uscat în prealabil, în apǎ ultrapurǎ; pH-ul a fost ajustat cu acid clorhidric la valoarea 4. Soluția este stabilǎ la rece pe durata a trei luni, dacă este păstrată la rece. Soluțiile de lucru au fost preparate zilnic din soluția stoc prin diluții convenabile cu apǎ demineralizatǎ.

În cazul în care produsele farmaceutice au fost sub formǎ solidă (tablete, comprimate etc) s-au cântǎrit și pulverizat 10 tablete. Din aceastǎ pudrǎ s-a cântǎrit cantitatea necesarǎ și s-a dizolvat în apǎ bidistilată, într-un balon cotat de 100 mL.

Când produsele farmaceutice au fost sub formǎ injectabilǎ (fiole) sau sub formă de sirop, s-au dizolvat 10 fiole în apǎ demineralizatǎ (respectiv o cantitate de 20 ml sirop) și apoi s-au diluat convenabil.

4.2. Calcularea rezultatelor

Aprecierea preciziei determinărilor [ ] s-a făcut utilizănd deviația standard, numită și eroare pătratică medie a determinărilor, utilizând expresia:

(4.1)

unde: , fiind eroarea absolută a determinării față de media determinărilor,

xi- valoarea rezultatului analitic a cărui precizie se calculează,

– media aritmetică a celor n determinări.

Rezultatele analitice au fost evaluate cu ajutorul deviației standard relative, RSD, care este deviația stanard exprimată în procente ale mediei; RSD se mai numește și coeficient de variație și se calculează utilizând următoarea relație matematică:

(4.2)

Derviația relativă standard oferă o informație, în mod cert mai netă, asupra calității rezultatelor analitice, decât deviația standard absolută, indicând ce fracțiune din media aritmetică exprimă abaterea standard.

Pentru exprimarea rezultatului final al unei analize, în cazul când se execută un număr mic de determinări (n<30), se poate folosi relația:

(4.3)

în care: A este rezultatul final;

este eroarea medie pătratică a mediei (de selecție);

t este factorul Student, ce caracterizează limita de siguranță a metodei.

Mărimea t nu poate avea orice valori; valorile lui t depind de numărul gradelor de libertate k, ce depind la rândul său de numărul de determinări () și de probabilitatea aleasă P% (raportul dintre numărul determinărilor care dau același rezultat și numărul determinărilor totale, înmulțit cu 100), de obicei avznd valoarea de 95%.

Pentru estimarea limitei de detecție se poate folosi ecuația diferenței dintre două medii experimentale (și care permite compararea lor):

(4.4)

în care n1 și n2 sunt numerele de măsurători din care s-au calculat cele două medii; t este testul student; sgrup abaterea tip a seriei de date care alcătuiesc un grup de date și se calculează plecând de la mai multe dozaje blanc.

Cantitatea minimă de substanță detectabilă Δxmin se calculează conform relației:

(4.5)

Pentru a găsi ,,cea mai bună dreaptă” compatibilă cu punctele ce corespund datelor experimentale, s-a utilizat analiza de regresie, o metodă obiectivă. Această metodă permite atât stabilirea acestei drepte, cât și calcularea incertitudinii ce o însoțește la folosirea ei.

Cea mai simplă metodă de regresie este metoda celor mai mici pătrate.

Relația care stă la baza trasării curbei de etalonare este:

(4.6)

unde y este variabila dependentă (potențial, absorbanță, etc.); x este variabila independentă; a este ordonata la origine (interceptul pe ordonata y); b este panta curbei.

Se poate demonstra statistic că cea mai probabilă linie dreaptă printre punctele ce reprezintă valorile unei serii de măsurători experimentale este aceea care dă cele mai mici pătrate ale pantei și interceptului.

De notat că abaterea verticală a fiecărui punct de la dreaptă se numește ,,reziduu” (rest) și că dreapta calculată prin metoda celor mai mici pătrate minimizează suma pătrată a ,,reziduurilor” tuturor punctelor; de altfel, metoda dă abaterile tip pentru a și b.

Abaterea patratică medie a punctelor de la dreapta cea mai probabilă, s0, este o măsură a erorii, așa cum s este o măsură a abaterii valorilor individuale de la medie (dreapta ține aici loc de valoarea medie), doar că de data acesta s0 se calculează cu n-2 grade de libertate:

(4.7)

în care: s0 este abaterea pătratică medie a punctelor de la dreaptă;

xi și yi sunt coordonatele unui punct (perechi individuale de valori x și y);

N este numărul de perechi de date (coordonate) utilizate pentru trasarea

curbei de etalonare.

Numărul gradelor de libertate din ecuația de mai sus este egal cu N-2, deoarece un grad de libertate se pierde la calculul pantei b și altul la calculul ordonatei la origine a.

Locul abaterii pătratice medii a mediei:

(4.8)

este luat aici de cele două abateri (deviații) ale pantei și ordonatei la origine.

Coeficientul de corelație este un parametru utilizat pentru evaluarea măsurii corelației care există între variabilele x și y. Acest concept sau parametru a fost introdus de Pearson și se poate calcula conform:

(4.9)

în care : n este numărul de măsurători;

Sx, Sy sunt deviațiile standard a lui x, respectiv y;

și sunt mediile aritmetice corespunzătoare pentru valorile individuale xi și yi ale măsurătorilor lui x și y.

Toate calculele referitoare la parametrii de regresie ai dreptelor de etalonare au luat în considerare valoarea tuturor punctelor experimentale. Abaterile sunt înmulțite cu factorul Student, pentru o probabilitate de 95%.

În concluzie, măsurătorile analitice sunt însoțite de un anumit grad de incertitudine, determinat de diferite surse de erori aleatoare mici, care afectează semnalul analitic și care constituie așa numitul „zgomot de fond”. Acesta ,„limitează” cantitatea de analit care se poate detecta.

De aceea, definiției limitei de detcție trebuie să i se aducă precizarea că, aceasta este concentrația cea mai mică de analit care poate fi determinată și care dă un semnal caracteristic diferit de acela al blancului”, sau chiar mai mult, făcând precizarea că „limita de detecție este concentrația care dă un semnal de trei ori mai mare decât deviația standard a fondului”.

Conform normelor IUPAC, limita de detecție s-a calculat cu ajutorul relației:

(4.10)

4.3. Tehnica cromatograficǎ

S-a folosit un cromatograf de gaze Hewlett-Packard model 5890, seria II echipat cu un detector cu flacǎrǎ de ionizare, un port de injecție split–splitless și o camerǎ liniarǎ de amestecare.

Coloana cromatograficǎ utilizată a fost de tip HP-2 Methyl Siloxane (lungime – 20 m, diametru – 0.2 mm și dimensiunea particulelor – 0.33 m). Gazul utilizat ca și eluent a fost heliu, la o presiune constantǎ de 75 kPa.

Temperatura injectorului și detectorului a fost 2500 C și respectiv 300 0C. La temperatura de 1000 C, raportul de separare a fost 1:28 (septum purge 2 mL/min, debitul coloanei 1.5 mL/min și split flow 40 mL/min). Domeniul de temperaturǎ aplicat este 70–2000 C, cu un interval de 100 C. Acest interval permite obținerea de timpi de retenție de sub 1 orǎ.

Diferitele volume de probe au fost injectate manual.

4.4. Rezultate și discuții

Figura 4.1 prezintǎ cromatograma obținută pentru tiaminǎ, în condițiile experimentale descrise anterior.

Fig. 4.1. Cromatograma pentru 510-5 g/L tiaminǎ

Curba de etalonare pentru tiaminǎ

În condițiile prezentate mai sus, a fost realizatǎ curba de etalonare pentru tiaminǎ (aria de sub pic funcție de concentrația de tiaminǎ), prezentată în figura 4.2.

Ecuația curbei prelucratǎ statistic este:

(4.11)

cu r=0.9998; s0=4; N=11.

Limita de detecție a fost definitǎ ca CL = 3SB/m [22], unde SB și m sunt deviația standard a probei fǎrǎ tiamină, respectiv panta dreptei de etalonare. Valoarea limitei de detecție a fost stabilitǎ la 0,06 g/L, iar limita de determinare la 0.2 g/L.

Fig.4.2. Curba de etalonare pentru tiaminǎ în condițiile prezentate

Exactitatea și precizia

Pentru a evalua exactitatea și precizia determinǎrilor, au fost utilizate o serie de probe independente. Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 4.1.

Tabel 4.1. Exactitatea și precizia metodei propuse

Selectivitatea

Pentru a observa selectivitatea, a fost studiat efectul compușilor organici și a ionilor metalici asociați de obicei în diverse forme și produse farmaceutice. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.2.

Tabel 4.2. Toleranța limitǎ pentru diverse substanțe organice și ioni metalici la determinarea a 510-5 g/L tiaminǎ

* limitǎ maximǎ testatǎ

Limita de toleranțǎ a fost definitǎ ca fiind cantitatea de interferent adǎugatǎ, ce cauzeazǎ o eroare relativǎ sub 3 %. Din datele prezentate mai sus, se poate constata că majoritatea cationilor și a substanțelor organice investigate nu interferǎ determinǎrile, chiar atunci când sunt prezente în cantități foarte mari (în exces de 200 de ori fațǎ de concentrația de vitaminǎ B1).

De asemenea, nici celelalte vitamine de tip B (riboflavina, piridoxina, cianocobalamina etc) nu influențeazǎ determinǎrile, chiar atunci când sunt prezente într-un exces de 100 de ori fațǎ de concentrația de tiaminǎ.

Determinarea tiaminei din produse farmaceutice

Metoda propusǎ a fost aplicatǎ pentru determinarea tiaminei din produse farmaceutice. Au fost investigate șaptesprezece produse farmaceutice, de proveniență diferită, cărora li s-a determinat conținutul în vitamina B1, prin metoda gaz cromatografică propusă. Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 4.3.

Dupǎ cum se poate observa din datele experimentale, a fost gǎsitǎ o corelație mai mult decât acceptabilǎ între conținutul dat de producǎtor, în normele interne ale fiecărui produs, și rezultatele obținute experimental.

Concluzii

Lucrarea propune o metodǎ cromatograficǎ simplǎ și rapidǎ pentru determinarea tiaminei.

Probele nu necesită diluare sau tratament prealabil înainte de injectarea în sistemul cromatografic.

Dreapta de etalonare a fost obținutǎ în condițiile unei sensibilitǎți cât mai ridicate.

Limita de detecție a metodei este bunǎ, ca de altfel și precizia determinǎrilor și exactitatea acestora.

Au fost investigate influențele diferitor substanțe organice și a ionilor metalici.

Metoda a fost aplicatǎ pentru determinarea concentrației de tiaminǎ din șaptesprezece produse farmaceutice, aflate atât în formă lichidă (soluții, siropuri), cât și solidă (tablete).

Rezultatele obținute sunt în foarte bunǎ concordanțǎ cu cele declarate de producǎtor.

=== 6.Tabel 4.3. ===

Tabel 4.3. Rezultatele determinǎrilor de tiaminǎ din produse farmaceutice prin metoda propusă