. Acidul Folic Si Derivatii Lui. Folatii In Natura Si Organism

INTRODUCERE

Acidul folic și derivații săi prezintă un larg interes în biologie și medicină datorită funcțiilor coenzimatice îndeplinite în organism într-o serie de reacții de importanță vitală.

Acidul folic participă la formarea timinei și a bazelor purinice din ADN, deci deține un rol fundamental în creșterea și reproducerea celulară.

Folat-coenzimele sunt derivați ai acidului tetrahidrofolic, acestea reprezentând forme biologic active ale acidului folic. De aici derivă importanța specială a reducerii acidului folic și mai ales aceea a transformării acidului dihidrofolic în acid tetrahidrofolic, proces ce se desfășoară în organism sub acțiunea enzimei dihidrofolatreductază.

Această enzimă “cheie” a metabolismului folaților a constituit obiectul unor numeroase studii biochimice și histoenzimologice.

Ea reprezintă cu cea mai mare probabilitate, receptorul molecular al analogilor acidului folic, explicând marea eficacitate a unora dintre aceste substanțe ca agenți citotoxici și în consecință, aplicabilitatea lor în terapia cancerului.

Dat fiind rolul derivaților acidului folic în biosinteza acizilor nucleici și a proteinelor, de un interes deosebit a beneficiat în această lucrare studiul implicațiior acidului folic în diferite situații fiziologice (sarcină, copil în creștere) sau patologice (neoplasme, în particular leucemii, anemie megaloblastică, boli cronice exfoliative ale pielii). De asemenea, în lucrarea de față s-a urmărit o reactualizare privind noile date apărute în literatura de specialitate în legătură cu această temă: noutăți referitoare la mecanismul absorbției, transportului și utilizării folaților, la carența de folați și malformațiile congenitale, la mecanismul de acțiune al medicamentelor antiinflamatoare nesteroidiene (AINS).

De-a lungul ultimilor ani s-au făcut multe studii în ceea ce privește incidența malnutriției la bătrâni (în special la pacienții vârstnici spitalizați pe perioade mai mari, cât și la persoane care se hrănesc cu conserve).

Câteva studii au indicat o incidență crescută a malnutriției la persoanele trecute de 65 de ani. Malnutriția a fost evaluată atât prin parametrii antropometrici cât și biochimici (incluzând nivelul seric de acid folic). De asemenea a fost observată o incidență crescută a anemiei la acești pacienți, anemie datorată unui deficit de folați.

Mai mult, în ultimii ani hiperhomocisteinemia a fost propusă ca factor independent de risc pentru boala arterială coronariană. De vreme ce deficitul de acid folic este o cauză importantă de hiperhomocisteinemie în populația generală, scăderea hiperhomocisteinemiei printr-un tratament simplu și eficace cu acid folic poate scădea incidența bolii arteriale coronariene.

Ținând cont de informațiile menționate anterior am ales să studiez în partea experimentală variația concentrației de acid folic din omogenate tisulare, în funcție de vârstă și organ (ca factori independenți).

Determinările le-am făcut pe șobolani împărțiți în trei grupe de vârstă: tineri, adulți și vârstnici și concentrațiile de acid folic au fost măsurate din omogenatele tisulare din ficat, creier, rinichi, splină.

Problema variației acidului folic cu vârsta este de importanță nu atât individuală, cât socială, indicând oportunitatea unei suplimentări sistematice puțin costisitoare și lipsită de riscuri (cel puțin la cei ce prezintă manifestări clinice).

Abordarea acestei teme se impunea cu atât mai mult cu cât la noi în țară există puține studii referitoare la acest subiect, iar în articolele de specialitate din întreaga lume este menționată tot mai frecvent.

ACIDUL FOLIC ȘI DERIVAȚII SĂI

1.1. Scurt istoric

Primele observații cu privire la existența unui nou factor alimentar, cu acțiune vitaminică, s-au semnalat în perioada anilor 1931-1932, când s-a constatat că leucopenia și granulocitopenia maimuțelor poate fi vindecată cu ajutorul unui extract obținut din drojdia de bere.

În 1931, L.Wills și B.S.Lond extrag din drojdia de bere un factor antianemic activ pe maimuță, numit vitamina M (M=monky). Tot în 1931, L.Wills, aflat în India, remarcă efectul favorabil al unui extract din ficat și drojdii asupra anemiei macrocitare tropicale, concluzionând că această afecțiune trebuie să fie cauzată de lipsa unui factor nutritiv, a unei deficiențe alimentare.

În 1938, P.Day, W.C.Langeston, W.Y.Darby constată că extractul din drojdia de bere este activ și asupra puilor de găină, stimulând creșterea acestora. A fost numit factor de creștere pentru pui sau “Factor U”. A.G.Hogan și E.M.Parrott reușesc să descopere în extractele din ficat un factor antianemic pentru puii de găină, căruia îi dau numele de “Vitamina Bc”(c=chick, pui de găină).

În perioada 1939-1940, E.E.Snell și W.H.Peterson obțin din ficat un factor de creștere pentru Lactobacillus casei, izolat prin adsorbție pe cărbune activ (norit) și eluare cu alcool amoniacal și îl denumesc “factor L.Casei”sau “norit-eluat-factor”.

În 1941, H.K.Mitchell, E.E.Snell, R.J.Williams reușesc să izoleze din frunzele de spanac acidul folic (folium=frunză), care stimulează creșterea la Streptococcus lactis și manifestă proprietăți vitaminice la animale.

Ulterior s-a constatat că factorii nutritivi obtinuți de diferiți cercetători din drojdie, ficat, spanac, microorganisme, fac parte din aceeași grupă și s-a propus denumirea lor generică de acizi folici.

Termenul de folați este utilizat să desemneze toți membrii familiei acizilor folici și a derivaților acestora, inclusiv compușii în care acidul folic este legat de unul sau mai multe resturi de molecule de acid L-glutamic.

Stabilirea structurii chimice a acidului folic a fost efectuată de E.L.Wittle, B.L.O’Dell, J.E.Vandenbelt, J.J.Pfiffner, în 1945, confirmată în același an prin sinteza de R.B.Angir și colab., care menționează că în componența acidului folic intră și unii pigmenți pteridinici izolați anterior din aripile fluturilor precum și acidul p-amino-benzoic.

În 1962, C.Herbert consumă mai multe luni o dietă deficitară în folați și stabilește simptomele care apar în starea carențială. Totodată stabilește necesitățile de folați pentru oamenii adulți.

Ulterior au fost identificați, în 1973, de către W.S.Osborne-White și R.M.Smith numeroși factori nutritivi înrudiți (aproximativ 28) din ficatul de oaie și șobolan, dintre care o importanță deosebită o prezintă acizii folinici în reacțiile de transformilare.

În 1991, G.Wald stabilește efectul favorabil al acidului folic în tratarea unor afecțiuni neuropsihice. În 1992, Butterworth raportează că dozele mari de acid folic ajunse în sânge reduc riscul apariției cancerului cervical la femeile infectate cu “papilloma virusul” uman.

În 1993 Serviciul de Sănătate Publică din S.U.A. hotărăște ca toate femeile să consume zilnic 0,4 miligrame de folați pentru a reduce riscul apariției unor malformații și afecțiuni cancerigene.

1.2. Grupul acizilor folici

Grupul generic al “acizilor folici” este constituit dintr-un complex de vitamine B, care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic, au acțiune hematopoetică și leucopoetică, dar se deosebesc între ele prin acțiunea specifică pe care o au asupra diferitelor microorganisme și specii de animale.

Aparțin acestui grup: acidul folic, acidul folinic, acidul tetrahidrofolic, acidul dihidrofolic, vitamina Bc-conjugată, vitaminele M, U, R etc.

Acidul folinic se mai numește și “citrovorum factor” deoarece este indispensabil culturilor de Leuconostoc citrovorum. Vitamina M este un factor nutritiv care vindecă anemia nutrițională la maimuță, de unde îi derivă și numele. Vitamina Bc-conjugată vindecă anemia macrocitară a puilor de găină și este esențială pentru creșterea microorganismelor Lactobacillus casei L. și Streptococcus faecalis R.

Dintre alți factori nutriționali corelați cu grupa acidului folic menționați de diferiți cercetători fac parte factorul U, factorul R, factorul S, vitaminele B10 si B11 etc., factori necesari creșterii unor microorganisme sau vindecării unor forme diferite de anemie la animale. Toți acești factori se pot obține prin extracte apoase din drojdii, frunze de spanac, ficat etc., prin adsorbție pe cărbune activ (norit) și apoi eluate de pe adsorbant cu diferiți compuși. Prin metode fizice și chimice compușii din complex pot fi separați, identificați și dozați. Acizii folici au un rol însemnat în formarea globulelor roșii și albe din sânge, în prevenirea și tratarea anemiilor, sunt factori de creștere pentru numeroase organisme; deasemenea au un rol fundamental și în activarea și transportul unităților C1 active (-CH3, -CH2OH, -C=O, HCOO-, -CH=NH etc.), în biosinteza bazelor azotate, a acizilor nucleici și a proteinelor, în metabolismul unor aminoacizi etc.

1.3. Structura acidului folic

Acidul folic se numește astfel deoarece a fost izolat prima dată din frunzele plantelor (folium-frunza). Se mai numește și acid pteroilglutamic, denumire ce provine din structura sa chimică. Este identic cu vitaminele Bc, B4, M, U, R, Lactobacillus factor, precum și cu cea de Norit eluat factor, pentru că la izolarea sa din produsele naturale se folosește adsorbția pe cărbune Norit (cărbune activ) și eluare cu soluții amoniacale.

Acidul folic are o structură complexă, având molecula compusă din trei fragmente:

-un inel pteridinic pe care se găsește grefată o grupare amino în pozitia 2 și o grupare hidroxil în pozitia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina);

-un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA);

-un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (până la 7) molecule de acid glutamic.

Primele două componente constituie acidul pteroic. Prin adăugarea la acesta a celui de-al treilea component (un rest de acid glutamic), se obține acidul pteroil-mono-glutamic (Pte-Glu), derivat la care ne referim atunci când folosim denumirea de acid folic.

Structura moleculara a acidului folic

Structura chimică a acidului folic s-a stabilit inițial prin identificarea compușilor ce rezultă din degradarea sa hidrolitică, în mediul alcalin aerob. În aceste condiții din acidul folic s-a obținut o fracțiune cu funcție aminică aromatică primară, din care prin hidroliza ulterioară se eliberează acidul paraaminobenzoic și acidul glutamic.

A doua fracțiune avea structură pteridinică, era fluorescentă și prezenta caracter acid.

Utilizarea difracției cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei de acid folic dihidratat; acesta are o conformație extinsă cu nucleu pteridinic în poziția ceto. Oxigenul de la carbonul 4 și atomul de azot 10 sunt de aceeași parte a moleculei, legându-se de restul moleculei prin legături de hidrogen.

aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic

1.4. Caracterizarea compușilor din categoria folaților

Folații reprezintă o mare familie de molecule naturale formate prin modificări a moleculei de acid folic, structura de bază a grupului.

Derivații naturali ai acidului folic diferă între ei prin:

-starea de oxidare a ciclului pteridinic;

-natura substituienților de la carbonul din pozitiile N5 si N10;

-numărul resturilor de acid glutamic din moleculă.

Pteridinele au fost identificate în pigmenții aripilor fluturilor, pe baza fluorescenței intense în U.V. (Hopkins, 1889-1893) și ulterior au fost izolate o serie de pteridine (xantopterina, leucopterina, izoxantopterina). Ele sunt prezente și la microorganisme și la animale și au fost supuse unor ample cercetări care au dus la stabilirea structurii (H.Wieland, 1925), la sinteza și la elucidarea rolului lor biologic, de exemplu: cofactori și hidrolaze ca precursori ai vitaminei B12; în biosinteza și/sau ca elemente structurale a acizilor folici și folinici.

Pteridina are o structură biciclică fiind formată dintr-un nucleu pirimidinic (A) și unul piramizinic (B).

Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina).

Pterina împreună cu acidul para-amino-benzoic formează acidul pteroic (Pte).

Prin atașarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obțacțiune avea structură pteridinică, era fluorescentă și prezenta caracter acid.

Utilizarea difracției cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei de acid folic dihidratat; acesta are o conformație extinsă cu nucleu pteridinic în poziția ceto. Oxigenul de la carbonul 4 și atomul de azot 10 sunt de aceeași parte a moleculei, legându-se de restul moleculei prin legături de hidrogen.

aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic

1.4. Caracterizarea compușilor din categoria folaților

Folații reprezintă o mare familie de molecule naturale formate prin modificări a moleculei de acid folic, structura de bază a grupului.

Derivații naturali ai acidului folic diferă între ei prin:

-starea de oxidare a ciclului pteridinic;

-natura substituienților de la carbonul din pozitiile N5 si N10;

-numărul resturilor de acid glutamic din moleculă.

Pteridinele au fost identificate în pigmenții aripilor fluturilor, pe baza fluorescenței intense în U.V. (Hopkins, 1889-1893) și ulterior au fost izolate o serie de pteridine (xantopterina, leucopterina, izoxantopterina). Ele sunt prezente și la microorganisme și la animale și au fost supuse unor ample cercetări care au dus la stabilirea structurii (H.Wieland, 1925), la sinteza și la elucidarea rolului lor biologic, de exemplu: cofactori și hidrolaze ca precursori ai vitaminei B12; în biosinteza și/sau ca elemente structurale a acizilor folici și folinici.

Pteridina are o structură biciclică fiind formată dintr-un nucleu pirimidinic (A) și unul piramizinic (B).

Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina).

Pterina împreună cu acidul para-amino-benzoic formează acidul pteroic (Pte).

Prin atașarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obține acidul pteroilmonoglutamic (Pte-Glu), respectiv acidul folic.

Prin adăugarea unor noi resturi de acid glutamic la acidul folic prin legături γ, se pot obține diopterina (Pte-Glu2), teropterina (Pte-Glu3), vitamina Bc conjugată (Pte-Glu7).

Structura pteridinei si a pterinei

Structura unor compusi pteroidici si folici

Structura unor compusi pteroidici si folici

Structura xantopterinei si a biopterinei

Acidul pteroic nu prezintă activitate de creștere asupra L.casei și nici antianemică.

Acidul N10-formil-pteroic (Rhizopterina-izolat din Risopus nigrigans) are activitate limitată de creștere asupra microorganismelor, dar, prezintă proprietăți antianemice. A fost obținut din diferite produse biologice. Are substituit un radical formil la N10 al acidului folic. Este de zece ori mai activ decât acidul folic asupra creșterii microorganismelor L.casei și Str.faecalis R.

Diopterina se găsește sub formă de acid pteroil-L-glutamil-α-glutamic și sub formă de acid pteroil-γ-glutamil-glutamic. Primul acid este eficace în tratarea anemiei macrocitare la om și atenuează la canceroși simptomele dureroase.

Teropterina sau acidul pteroilglutamic se mai numește și factor de creștere. Este utilizat în tratamentul tumorilor maligne.

Rizopterina este un factor de creștere pentru Streptococcus faecalis R (SLR), dar nu are acțiune asupra Lactobacillus casei și nici asupra anemiei puilor de găină. Este un derivat al acidului pteroic. S-a obținut prin sinteză din acid pteroic și acid folic. S-a izolat din lichidul de fermentare de la Rhizopus nigricans.

Vitamina Bc conjugată sau acidul pteroilhexaglutamic are 7 resturi de acid glutamic substituite la acidul pteroic. Reprezintă forma predominantă sub care se găsește acidul folic în țesuturi. Vitamina Bc conjugată nu are o acțiune directă asupra anemiei macrocitare la om și nici nu stimulează creșterea la L.casei și Streptococcus lactis R. Prezintă acțiune curativă în anemia puilor de găină. Sub acțiunea unei enzime hepatice numită vitamina-Bc – conjugaza, vitamina Bc conjugată eliberează acidul pteroil glutamic activ.

Vitamina Bc conjugată este forma cea mai răspândită sub care se găsește acidul folic în alimentele naturale. Ea este eficientă în tratarea anemiei macrocitare și la maimuță. Enzima vitamin – Bc conjugaza are acțiune carboxipeptidazică a fost inițial izolată din ficat, iar ulterior și din rinichi de porc, pancreas (pui de găină), de la gâște și din materiale vegetale (cartofi, migdale). Microorganismele nu conțin această enzimă și de aceea nu pot utiliza vitamina Bc conjugată.

1.5. Derivații metabolic activi

Acidul folic este inactiv ca atare în cadrul metabolismului celular, formele metabolic active fiind constituite din compușii rezultați din:

Reducerea acidului folic în pozițiile 5, 6, 7, 8 rezultând acid dihidrofolic și acid tetrahidrofolic.

Carbonul asimetric din poziția 6 conferă moleculei FH4 stereospecificitate pentru diferite funcții metabolice și mai ales permite trecerea în formele dihidro, în schimb, se pare că gruparea NH2 din poziția 2 a nucleului pteridinic deține rolul fundamental în coordonarea moleculei de folat cu funcție de coenzimă.

Reducerea acidului folic în acid tetrahidrofolic se realizează în două etape succesive; întâi se obține acidul dihidrofolic (FH2) și apoi acidul tetrahidrofolic (FH4), sub acțiunea enzimei dihidrofolatreductaza.

Reducerea acidului folic sub actiunea dihidrofolatreductazei

Acidul dihidrofolic se poate prepara prin reducerea catalitică cu oxid de platină sau paladiu în mediu alcalin sau prin reducerea cu hidrosulfit de sodiu la pH=6, în prezența acidului ascorbic. Sunt posibili trei izomeri ai acidului dihidrofolic:

5, 6 H2 Pt. Glu. ;

7, 8 H2 Pt. Glu. ;

5, 8 H2 Pt. Glu. ;

dintre care numai acidul 7, 8 dihidrofolic (acid dihidrofolic “standard”) s-a izolat și este stabil.

Acidul dihidrofolic este ușor degradat prin expunerea la aer sau sub acțiunea bazelor. Degradarea sa este favorizată de EDTA în timp ce acidul ascorbic și tiolic îl protejează.

Spectrul de absorbție al acidului dihidrofolic la pH neutru prezintă două maxime la lungimea de undă de 282 nm, precum și la 310 nm. Spre deosebire de acidul folic care nu este fluorescent, derivații săi în forma redusă posedă spectre de absorbție carecteristice în UV.

Acidul tetrahidrofolic (FH4) este acidul folic redus în pozițiile 5, 6, 7, 8. Poate fi stabilizat în mediul acid (de exemplu în acid ascorbic 0,2-0,5% sau cu compuși ce conțin grupări tiolice cum ar fi mercaptoetanolul în soluție 0,2-1 M).

Oxidarea cu aer produce o amină diazotabilă (acid para aminobenzoilglutamic). Spectrul de absorbție al acidului tetrahidrofolic prezintă două maxime, la lungimea de undă de 298 nm, iar în absența agenților reducători maximul de absorbție variază între limitele 270-298 nm.

Spectrul de absorbție al derivaților acidului folic la diferite pH-uri

Valoarea nu este cunoscută;

x compusul se transformă în N10 – formil FH4 în soluție neutră sau bazică;

xx compusul se transformă în N5, N10 – metenil FH4 în soluție acidă.

B. Substituirea de grupări monocarbonate în pozițiile N5 sau N5, N10 sau N10. Mai jos sunt reprezentate structurile celor mai importanți derivați ai acidului folic, metabolic activi: N5 – metil FH4: N5 formil – FH4; N5, N10 – metilen – FH4; N5, N10 – metilenil – FH4.

Structura generală a derivaților N5–substituiți în care R poate fi:

-CH3 în N5 – metil – FH4;

-CHO în N5 – formil – FH4;

-CH = NH în N5 formimino – FH4 este prezentată mai jos

Structura generala a derivatilor acidului folic N5 – substituiti

Acidul N5N10 metilen tetrahidrofolic

Modificarea numărului reziduurilor de acid glutamic din moleculă.

Resturile de acid glutamic sunt condensate între ele într–un mod special (gruparea – COOH din poziția γ a unui rest se leagă de gruparea – NH2 a altui rest de acid glutamic. Mai des întâlnite sunt formele în care n = 3 (acid pteroiltriglutamic) și n = 5 (acid pteroilpentaglutamic) în celule animale și

n = 7 (acid pteroilheptaglutamic) la plante.

Structura pteroilpoliglutamatilor

1. 6. Proprietăți fizice și chimice ale acidului folic

1. 6. 1. Proprietăți fizice

Acidul folic este o substanță solidă, cristalină de culoare galbenă, greu solubil în apă (0.16mg/100ml), piridină, în fenol, în metanol, în acid acetic glacial și insolubil în cloroform, benzen, eter și acetonă. Ca sare de sodiu este solubil în apă. Este optic activ dextrogir (+) 16˚, iar în mediul acid la pH 4 – 12 este stabil, cu ionii metalelor grele formează compuși complecși (cu Fe 3+ roșu, Cu2+ verde, Co2+ galben), iar în mediul bazic formează săruri cu metalele alcalinopământoase. Acidul folic se descompune sub influența luminii și a razelor UV, rezultând acid pteridoxamin – 6 – carboxilic și alți compuși proveniți din catena laterală. Spectrul său de absorbție în ultraviolet este asemănător cu cel al xantopterinei. Acidul folic se prezintă sub formă de plăcuțe galbene, lenticulare, subțiri, birefringente, cu punct de topire la 250˚C. Prin autoclavare 30min, pierde 70% din activitate la pH = 1. La 100˚C, sub acțiunea acizilor se descompune în acid p – aminobenzoil – glutamic și partea pteridinică modificată. Solubilitatea acidului folic în apă poate fi măsurată prin încălzire la 75˚C sau prin adăugare de glicocol. Soluțiile neutre sunt mai stabile, iar cele alcaline se oxidează cu ușurință. Este incompatibil cu substanțe oxidante sau reducătoare deoarece se degradează. Cu Ca2+ formează o sare insolubilă, iar în soluție alcoolică este incompatibilă cu clorhidrați, FeSO4, preparate acide, siropuri acide, gume și mucilagii vegetale. Este inactivat de acidul ascorbic, acidul nicotinic, vitaminele B1, B2, sulfamide, etc.

1. 6. 2. Proprietăți chimice

Dintre proprietățiile chimice ale acidului folic menționăm posibilitatea reducerii ciclului pteridinic în derivați di – și tetrahidrofolici; atașarea la o serie de enzime prin intermediul grupării – NH2 din poziția 2 (legături peptidice); transportul de unități monocarbonate în pozițiile N5, N10; atomul de carbon din poziția 6 conferă stereospecificitate moleculei.

2.FOLAȚII ÎN NATURĂ ȘI ÎN ORGANISM

2.1. Răspândire în natură

Acidul folic și derivații săi au o largă răspândire în alimente. Se găsesc în cantitate mare în ficatul animalelor, în frunzele plantelor superioare, în special în spanac, în mazăre, germeni de grâu, drojdii, sfeclă, lămâi și în unele microorganisme.

Conținutul substanțelor pteroilglutamice din plantule de porumb este de 11,5μg/g, iar în frunzele mature de 6-7 μg/g. În ierburi, conținutul acidului folic variază între 3-7,5 μg/g. Cele mai mari cantități de acid folic și de folați se găsesc în regnul animal. În ficatul de bou se găsesc 290 μg%, în ficatul de pui se găsesc 370 μg%, iar în cel de porc 220 μg%. Cerealele conțin în medie 35 μg%, iar dintre fructe lămâile 80 μg%, bananele 30 μg%, portocalele 33 μg%. Legumele au un conținut mai redus, fiind cuprins între 8 și 25 μg%.

O bună parte din acidul folic este sintetizat de flora intestinală fapt ce îngreunează stabilirea necesităților pentru om și animale.

Acidul folic se găsește în cantități variabile în toate alimentele uzuale. Ficatul și mușchii mamiferelor sunt sursele cele mai bogate, dar și sursele vegetale constituie un aport însemnat. Laptele de vacă conține cantități mici de acid folic.

În timpul preparării alimentelor o parte din folați se distrug, dar în același timp se eliberează cele aflate în complexe inactive sau sub formă conjugată. Cele mai multe forme de folați nu au stabilitate mare în alimente. Frunzele proaspete pot pierde prin uscare la temperatura camerii până la 70% din activitatea folaților în decurs de 3 zile. Cantități mari de folați se pierd în timpul extragerii, la prepararea hranei în soluții apoase și prin fierbere. Uneori pierderile totale se ridică până la 85 – 90%.

2. 2. Necesarul de folați al organismului uman

Cantitatea de acid folic total dintr-o dietă normală variază între 50 – 2000 mg zilnic.

Necesarul minim de acid folic este de 50 μg /zi, dar această valoare poate crește în anumite stări fiziologice (sarcină, pubertate) sau patologice (neoplazii, dermatoze cronice, etc.)

Comisia F. A. O.- O. M. S. recomandă următoarele valori pentru aportul zilnic de acid folic: 60 μg/zi pentru sugari, 100 μg/zi de la 1 –12 ani, 200 μg/zi între 13 – 19 ani și peste 200 μg/zi pentru adult.

Folații existenți în natură sunt conjugați cu mai multe molecule de acid glutamic, acidul pteroilmonoglutamic negăsindu-se ca atare în vreo sursă naturală; lanțul acid poliglutamic fiind încărcat cu o sarcină electrică negativă, împiedică absorbția vitaminei ca atare. Pentru a fi absorbiți, poliglutamații alimentari trebuie să fie hidrolizați la monoglutamați. Această hidroliză are loc la nivelul jejunului proximal, sub acțiunea unei conjugaze (cel mai probabil intraenterocitară) pH-dependentă și zinc-dependentă. După aceea monoglutamații rezultați vor fi absorbiți printr-un mecanism activ facilitat de glucoză.

Această absorbție poate fi însă pasivă pentru doze crescute de folați. În cursul transportului lor intraenterocitar monoglutamații sunt metilați și apoi reduși la dihidro- și tetrahidrofolați sub acțiunea dihidrofolatreductazei.

La individul normal, aproximativ 80% din acidul folic administrat oral este absorbit, indiferent de doza administrată. La o doză mai mică de 200μg

/zi, excreția urinară este minoră sau absentă. În schimb, la doze mai mari, aceasta poate deveni considerabilă, și anume: 6% pentru 1mg/zi; 10% pentru 2mg/zi; 50% pentru 50mg/zi, până la 80% pentru 15mg/zi.

Sângele conține aproximativ 1mg% folați, cea mai mare parte (90%) aflându-se în eritrocite, la nivelul cărora predomină pteroilglutamotetrahidrofolații.

Există proteine ce leagă folații în plasmă, dar rolul lor este încă neclar.

Folații plasmatici se află sub formă de monoglutamat (N5-metil-tetrahidrofolat) și sunt transportați în celule printr-un “carrier” care este specific pentru formele reduse (FH4). Odată ajuns în celulă, folatul trece în forma poliglutamată după pierderea grupării N5-CH3 într-o reacție de transfer a grupării metil. Forma poliglutamată pare a fi forma în care celulele rețin și depozitează folații.

În organism folații sunt depozitați în toate țesuturile, dar cu precădere la nivelul rinichilor, pancreasului și mai ales ficatului. Rezervele normale de folați sunt estimate între 5-20mg, din care jumătate în ficat; ținând seama de necesarul zilnic minim de folați (50μg), reiese faptul că rezervele organismului permit menținerea unei hematopoeze normale timp de 2-4 luni. Totuși, în caz de creștere importantă a necesităților (stări septice, traumatisme grave), timpul scurs până la apariția manifestărilor hematologice și mai ales a trombopeniei, poate fi mai scurt (15 zile sau mai puțin).

Pierderea folaților se produce prin descuamarea zilnică a celulelor epiteliale din piele și tractul intestinal, ca și prin bilă, urină, transpirație și salivă. Rata pierderii este de doar 1-2% din totalul rezervelor hepatice, dar valoarea ei este de 10 ori mai mare decât a vitaminei B12 deoarece cantitatea minimă de folați necesară a fi absorbită zilnic este de 100 de ori mai mare decât cea a vitaminei B12, iar turn-over-ul folaților este mult mai mare, simptomele deficienței de folați se dezvoltă mult mai rapid decât cele ale vitaminei B12. Deficitul va fi totuși aparent doar după câteva luni de la apariția tulburării primare de aport, absorbție sau utilizare.

2.3.Manifestările clinice ale deficitului de folați în organism

Manifestările clinice ale deficitului de folați implică celulele din țesuturile cu rată de multiplicare rapidă, și mai ales sângele și mucoasa intestinală. Manifestările neurologice ce apar în cadrul deficitului de vitamina B12 (deosebit de grave prin potențialul lor de ireversibilitate) sunt mai puțin frecvente.

Manifestările hematologice constau în primul rând în anemie megaloblastică, datorată unei eritropoeze ineficiente.

Sinteza de ADN anormal (prin încorporarea de d-UTP în locul d-TTP) duce la hematopoeză de tip megaloblastic, asincronism de maturație nucleo-citoplasmatic (nucleii sunt mai puțin maturi decât era de așteptat, cromatina nucleară este dispersată). În măduva osoasă apar mitoze anormale, hipercelularitate, metamielocite gigante și scăderea raportului mieloido/eritrocitar. Precursorii anormali sunt distruși prematur în măduva osoasă, rezultând anemie prin eritropoeză ineficientă, bilirubină indirectă crescută și hemosiderină normală sau crescută.

În sângele periferic se identifică hematii macrocitare (VEM > de 100μ3), hemoglobină scăzută sau chiar normală față de numărul de eritrocite scăzut (datorită VEM crescut, acesta fiind și motivul pentru care valori mici ale hemoglobinei sunt bine suportate de către acești pacienți); frotiul sanguin arată o marcată anizocitoză, poikilocitoză și macrocitoză.

În ceea ce privește celelalte serii celulare sanguine, modificările sunt mai rare, dar și mai precoce: numărul leucocitelor și al plachetelor poate fi scăzut, iar apariția PMN hipersegmentate (mai mult de 6 lobuli) în periferie este cvasipatognomonică pentru anemie megaloblastică.

Pe frotiul de măduvă osoasă se observă, deasemenea, precursori anormali ca mărime și morfologie și pentru seria granulocitară, iar clinic se poate constata un sindrom hemoragipar sau o scădere a imunității celulare.

Valorile plasmatice ale folaților sunt scăzute (normal 6-20ng/ml), dar aceste valori pot reflecta variații recente în aportul dietetic. Măsurarea folaților eritrocitari este în acest sens o măsurătoare cu grad crescut de precizie, nefiind supusă acestor fluctuații. Frecvent deficitul de folați este asociat cu deficitul de B12 (evidențiat prin testul Schilling).

Clinic, anemia se manifestă prin slăbiciune, amețeli, palpitații, angor, insuficiență cardiacă, tahicardie. Culoarea tegumentelor este palidă, cu nuanță subicterică, rareori apare purpura (datorită trombocitopeniei), iar uneori splina și ficatul pot fi ușor mărite.

A doua mare categorie de simptome sunt cele digestive, reflectând afectarea proliferării epiteliului intestinal (ce are un turn-over rapid) în cadrul deficitului de folați. Pacienții prezintă o limbă zmeurie (roșie, lucioasă, depapilată, dureroasă), anorexie (cu ușoară scădere în greutate), diaree, steatoree, etc.

Manifestările neurologice și psihice includ cel mai frecvent un tablou de polinevrită senzitivo-motorie (mai rar sindrom piramidal), se mai poate observa un sindrom depresiv, anxietate, demență sau psihoză.

Diagnosticul impune cercetarea frotiului periferic (PMN hipersegmentate, anemie macrocitară normocromă aregenerativă), a frotiului de măduvă osoasă (hematopoeză megaloblastică), a nivelului de folați plasmatic (mai puțin concludent) sau eritrocitar (se mai pot folosi testul de supresie prin deoxiuridină, excreția urinară de formiminoglutamat în exces) și excluderea unui deficit de B12 (test Schilling normal).

Diagnosticul etiologic presupune o anamneză amănunțită cu privire la dietă și explorarea funcției intestinului subțire.

2.4. Tratamentul deficitului de folați

Tratamentul deficitului de folați este un tratament de substituție, pe toată durata vieții (sau până la excluderea cauzei primare).

Folații sunt utilizați în scop terapeutic sub formă de:

acid pteroilglutamic (acid folic) administrat oral (1cp = 5mg)

acid N5-formil-tetrahidrofolic (acid folinic) sub formă de soluție pentru injectare parenterală, dar la fel de eficace și pe cale orală.

O doză de 50-100μg/zi permite obținerea unui răspuns hematologic, dar doze mai importante, de ordinul a 1mg/zi timp de 2-3 săptămâni sunt necesare pentru a corecta rezervele organismului. Această doză, administrată pe cale orală, este suficientă chiar și în caz de malabsorbție.

3. METABOLISMUL FOLAȚILOR

3.1. Extragere, sinteza și biosinteza folaților

Acidul folic se poate obține în stare cristalină din diferite surse naturale (ficat, spanac, drojdii, cojile cerealelor,etc) prin extracție cu apă la pH 3, adsorbție pe cărbune activ (norit), eluție cu soluție amoniacală 2,8%, purificat prin readsorbție pe cărbune, eluare cu anilină și precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritină, etc. În prezent se realizează inițial inactivarea enzimelor, care distrug cofactorii naturali prin încălzirea rapidă a materialului la 95˚C, în prezență de tampon ascorbat sau amestec cu uree 6M si cloroform. Cromatografierea extractului se face pe coloane cu schimbători de ioni și separare prin eluare în gradient de concentrație cu soluții amoniacale sau de anilină.

Prin sinteză acidul folic se obține prin condensarea acidului p-aminobenzoil-L (-)-glutamic, cu aldehida 2,3-dibrompropionică și cu compusul 2,4,5-triamino-6-hidroxipiridinclorhidrat în prezență de NaOH, O2 și acetal.

Schema sintezei acidului folic

În produsele naturale acidul folic se găsește în stare liberă în cantitate relativ redusă, deoarece se găsește în cantitate mai mare sub formă de compuși chimici diferiți, unii cu mai multe resturi de acid glutamic, care au însă aceeași importanță nutritivă pentru organismele vii.

Prin experiențe “in vitro” s-a observat că prin adăugarea de acid folic pe secțiunile hepatice din mediul de reacție, în prezența acidului ascorbic, se obține acidul folinic, care este un derivat formilat al acidului formic. Acidul folinic obținut prin sinteză este de două ori mai puțin activ decât cel natural, deoarece prin sinteză se obțin 2 stereoizomeri din care numai unul este activ.

Acidul folinic (N-5-COH-FH4) se obține “in vitro” prin formilarea și hidrogenarea sa la temperatură ridicată, în prezența acidului ascorbic, iar “in vivo” sub acțiunea piridinnucleotidreductazei și a vitaminei C, se formează inițial acidul dihidrofolic (FH2), care prin hidrogenare trece în acidul folinic.

Mecanismul biosintezei acidului folic la om nu este destul de bine cunoscut. Până în prezent s-au efectuat cercetări în acest domeniu pe microorganisme și pe animale, cu ajutorul unor inhibitori. Acidul folinic este sintetizat de majoritatea bacteriilor intestinale. Biosinteza acidului folic este stimulată de acidul ascorbic.

Experimental s-a dovedit că unele microorganisme sunt capabile să biosintetizeze acidul folic din precursori mai simpli, prin reacții de condensare, sub acțiunea unor enzime. Astfel, extractele celulare de E. coli, realizează biosinteza acidului folic din acid glutamic, acid p-aminobenzoic și 2-amino-4-hidroxipteridin-6-carboxialdehida, iar extractele de Lactobacillus arabinosus sunt capabile să utilizeze ca și compuși pteridinici 2-amino-4-hidroxi-6 hidroximetilpteridina și 2-amino-4-hidroxi-6-carboxildehidropteridina în prezența ATP și a ionilor de Mg2+. Biosinteza acidului folic se realizează mai repede dacă compusii pteridinici conțin acidul pirofosforic la C-9.

În experiențele efectuate cu Mycobacterium avium s-a observat că în prezența ATP, HS-CoA și acidului p-aminobenzoic se formează un derivat adenilic monofosforic al acidului p-aminobenzoic, care reacționează cu acidul glutamic și formează compusul p-aminobenzoilglutamic. Prin unirea acestui produs cu pterina se formează acidul folic.

Schema biosintezei acidului folic la Mycobacterium avium

Extractele de Clostridium striklandii au transformat acidul folic în acid dihidrofolic, iar din ficatul puilor de găină s-a izolat un sistem enzimatic capabil să transforme acidul dihidrofolic în acid tetrahidrofolic.

Transformarea acidului folic in acizii dihidrofolic si tetrahidrofolic

Transformarea acidului folic în acid folinic s-a pus in evidență atât la animale, cât și la microorganisme în prezența ATP, FAD, Mg2+, acid ascorbic și a unor enzime specifice. În ficatul puilor de găină s-a identificat o enzimă care în prezența ATP si Mg2+ realizează transformarea acidului N-5-tetrahidrofolic în acid N-10-tetrahidrofolic.

3.2. Absorbție, excreție și necesități

Acidul folic în stare liberă, ca acid pteroilmonoglutamic este ușor și rapid absorbit de organism în cantități de până la 15-20mg/zi. Absorbția are loc mai ales incepând din partea proximală a intestinului subțire și continuă, pe toată lungimea sa, cu un consum de energie, cu implicarea unor procese active (energodependente) pentru cantități fiziologice mici. Dozele mari sunt absorbite mai ales prin difuzie pasivă. În multe produse alimentare acidul folic se prezintă predominant sub forme poliglutamate. Din acești derivați acidul folic este absorbit numai după o deconjugare prealabilă a acestor compuși. În tubul digestiv și în rinichi, s-a pus în evidență existența unor sisteme enzimatice hidrolizante (conjugaze) care scindează complexele acidului folic. Absorbția acidului folic poate fi perturbată și micșorată de diferiți compuși cum sunt: difenilhidrantoina, pirimidine, cicloserine, etanol, glicocol, serina, homocisteina și metionina.

Se consideră că acidul folic, precum și derivații acestora, sunt convertiți în mucoasa intestinală sub acțiunea unor acidfolicreductaze în derivați metilici (CH3-FH4), forme sub care trec în sângele venei porte și apoi la ficat.

Din totalul de aproximativ 70mg acizi folici și folinici existenți la oamenii adulți, aproximativ 30-40% se găsesc în ficat (5-15μg/g), de unde prin circulația sanguină se aprovizionează toate organele și țesuturile. Imediat după absorbție și parțial chiar în timpul absorbției, acidul folic este convertit în diferiți compuși metabolici activi cum sunt:

acid N-5-formil-tetrahidrofolic (f5FH4);

acid N-10-formil-tetrahidrofolic (f10FH4);

acid N-5-formimino-tetrahidrofolic (fiFH4);

acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (f5-10FH4);

acid N-5-metil-tetrahidrofolic (m5FH4).

În toți acești derivați apare ca structură de bază acidul tetrahidrofolic (FH4), care joacă rolul unei coenzime de acceptor si transportor al unei unități C1.

Acidul folic este transportat în organism sub formă de CH3-FH3 legat de proteine transportoare, având în sânge o concentrație de 300ng/ml. Folații se găsesc în cantitate mai mare în eritrocite, cu variații normale între 160-640ng/ml de eritrocite. Conținutul folaților din eritrocite, se menține relativ constant și reflectă gradul de aprovizionare a întregului organism cu acești compuși. Cantitatea de folați din sânge scade în bolile de cancer (leucemii), carența folinică și anemie pernicioasă, în ciroza alcoolică, anemii gravidice, etc. Plasma sanguină conține 5-20ng/l, iar eritrocitele conțin cantități de 30 de ori mai mari de folați.

În sânge și țesuturi, acizii folici suferă procese de interconversiune și de catabolizare. Acidul folic se transformă mai ales în derivați tetrahidrofolici. În eritrocite acidul folic prin metabolizare dă naștere la acid p-aminobenzoilglutamic și la un derivat aldehidic al pterinei. În ficat, acidul folinic se degradează în compuși similari, reacția fiind activată de acidul glutamic și inhibată de acidul ascorbic. Tot la nivelul ficatului se transformă acidul folic în acid N-10-formil-folinic.

Eliminarea folaților și a metaboliților acestora se face în cantitate mai mare prin fecale, aproximativ 200-500μg/zi la omul adult, cuprinzând aproximativ 20% din cantitatea ingerată și partea neabsorbită produsă de flora intestinală.

Excreția prin urină este mică, aproximativ 2-5 μg/zi, dar crește prin administrarea de doze orale, după saturarea organismului cu folați. Eliminarea folaților prin urină reprezintă sub 1% din cantitatea acestora în organism.

Dacă se administrează intravenos doze mici de acid folic (1μg/kg corp), aproximativ 90% din cantitatea administrată este distribuită din fluxul sanguin în tot corpul în decurs de 3 minute, iar aproximativ 2% se elimină prin urină. Dacă însă se măresc dozele până la 150μg/kg corp, până la 90% din cantitatea administrată se elimină prin urină, în decurs de 6-12 ore, sub formă de acid folic sau derivați apropiați sub aspect structural.

La o dietă normală, corespunzătoare la o ingestie de 600 μg de acid folic pe zi, cantitatea acestui acid din organism se apreciază a fi între 6-10mg, cantitate suficientă pentru trei sau patru luni, dacă este blocată absorbția. O altă cale de eliminare a acidului folic este cea cutanată. Prin transpirație se elimină cantități destul de însemnate de folați, precum și prin bilă.

3.3. Rol și activitate biochimică

Acizii folici, sub formă de acizi tetrahidrofolici, reprezintă coenzimele unor sisteme enzimatice, implicate în activarea și transportul unor fragmente monocarbonice (C1) sub formă de hidroximetil (-CH2OH), formil (-COH), formiat (HOOC-), metil (-CH3), formimino (CH=NH), care iau parte la reacții deosebit de importante pentru organism.

Formele coenzimatice active, care poartă fragmente sau radicali cu un atom de carbon, sunt derivați ai acidului tetrahidrofolic (FH4) din care fac parte:

acid N-5-formil-tetrahidrofolic (N-5-COH-FH4);

acid N-10-formil-tetrahidrofolic (N-10-FH4);

acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4);

acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10-CH2-FH4);

acid N-5-metil-tetrahidrofolic (N-5-CH3-FH4).

Derivati coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic

Derivații coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic se pot obține pe două căi principale:

-tratarea directă a aldehidei formice sau a acidului formic cu acid tetrahidrofolic (FH4);

-transferul direct al acestor unități pe FH4. Ca substanțe donatoare de unități C1, cele mai active sunt serina, histidina, xantina, metionina, colina, betaine, nicotina, timina, acidul glutamic etc. Ca acceptori de grupări C1 funcționează glicocolul, colamina, nornicotina, uracilul, homocisteina, gliconamidoribozida, acidul folic etc.

Existența acidului N-5-formil-tetrahidrofolic, care este inert, sub aspect coenzimatic nu constituie un balast pentru organism deoarece poate fi ușor transformat pe cale enzimatică în acid N-10-metenil-tetrahidrofolic, iar acesta cu apa dă acidul N-10-formil-terahidrofolic care este cel mai activ metabolit.

Acidul N-10-formil-tetrahidrofolic se poate forma și prin reacția directă dintre aldehida formică și FH4:

Reacția este catalizată de formiltetrafolatsintetaza, care a fost izolată din ficatul de porumbel și din diferite microorganisme. Fragmentele monocarbonice sunt, sub aspect metabolic, interconvertibile, deoarece pot trece reciproc una în alta, sub acțiunea unor sisteme enzimatice de tipul hidroximetildehidrogenazei în prezență de NADP+și NAD+.

Transportul fragmentelor C1 de la o substanță la alta se realizează de acidul tetrahidrofolic și derivații săi menționați anterior.

Dintre reacțiile chimice la care iau parte coenzimele tetrahidrofolice, face parte și transformarea serinei în glicocol în prezența piridoxalfosfatului (PALP):

Din histidină, se obține ca produs intermediar acidul formiminoglutamic care transferă radicalul formimino pe FH4 cu formare de acid N-5-formimino-tetrahidrofolic.

Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4), sub acțiunea unei ciclodezaminaze, formează acidul N-5,N-10-metilenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4). Același mecanism de reacție se produce și la transformarea xantinei în formiminoglicocol.

Glicocolul, printr-o reacție de transaminare, formează acid glicoxalic, care cedează gruparea formil acidului glutamic, în prezență de NAD+ cu formare de acid N-formil-glutamic.

Acidul formilglutamic cedează radicalul formil acidului FH4 și se formează acidul folinic, care este mai puțin activ. Acesta în prezența ATP se transformă în acidul N-10-formil-tetrahidrofolic.

Coenzimele folinice, care au fixate unități C1, se comportă ca donori în reacțiile care necesită acceptarea fragmentelor –CH2OH, -CHO, -CH=NH, HCOO-, -CH3. În funcție de felul compușilor care se sintetizează în urma transferului de unități C1, participă la reacție una sau alta din formele active.

În reacțiile cu cedare de radicali formil vor funcționa ca donori acizii N-10-formil-FH4 și N-5, N-10=CH-FH4. Ca donori de grupări –CH2-OH este mai activ acidul N-5, N-10-CH2-FH4, iar ca donori de radicali CH3 funcționează acidul N-5-CH2-FH4 și uneori acidul N-5,N-10-CH2-FH4.

Acceptorii de grupări C1 active sunt mai numeroși în procesul de biosinteză a bazelor și a nucleotidelor purinice, în biosinteza colinei, betainei, nicotinei, etc. În procesul de biosinteză a bazelor purinice sunt cedate două grupări formil, localizate la C-2 si C-8 al nucleului purinic. Dintre compușii intermediari care se formează în procesul de biosinteză a bazelor purinice, în urma primirii unor unitați C1 active fac parte :

-formilglicinamidoribozida(FGAR)

-formilaminoimidazolcarboxiamidribozida(FAICAR)

Datorită participării coenzimelor folinice în biosinteza nucleotidelor purinice, ce iau parte la formarea acizilor nucleici, rezultă rolul important pe care îl au acizii folici în procesele de creștere și reproducere celulară.

Acidul N-5,N-10-metilen-FH4 are un rol însemnat în biosinteza ADN, deoarece se comportă ca o coenzimă în reacția de transformare a uracilului în nucleozide și nucleotide în timină. Ea donează un radical metil la 2’-deoxiuridin-nucleotide (sau nucleozide) și acestea se transformă în 2’-deoxitimidin-nucleotide, respectiv nucleozide. Transformarea uracilului în timină se face în molecula nucleotidelor (nucleozidelor), care reprezintă cărămizile de bază în biosinteza acidului deoxiribonucleic.

În cazul biosintezei metioninei se realizează transferul grupării metil de la N-5-CH3-FH4 la homocisteină.

În procesul de biosinteză a metioninei se produce neogeneza grupei metil și nu transferul acesteia de la alți donori. Metionina are rol însemnat în formarea colinfosfolipidelor deoarece grupele metil din colină provin din metionina activată (S-adenozilmetionina).

Dintre reacțiile la care participă N-10-formil-FH4 si N-10-CH2OH-FH4,e importantă trasformarea betainei în serină.

Ultima reacție este reversibilă fapt important deoarece serina se poate transforma în glicocol, constituind o importantă sursă de fragmente –CH2OH.

Există date experimentale care dovedesc că timina poate substitui acidul folic în stimularea creșterii unor microorganisme (Str. faecalis), iar efectul optim al acidului folic asupra acestor microorganisme se obține când se administrează împreună cu vitamina B12. Datorită acestor corelații se consideră că acidul folic funcționează direct sau indirect ca o coenzimă în biosinteza timinei. Unele microorganisme transformă ușor uracilul în timină sau citozină, dar pentru biosinteza timinei au nevoie de acid folic. În prezența formiatului marcat cu 14C, acesta se regăsește în atomul de carbon al grupării metil din timină.

Acidul N-5-formil-tetrahidrofolic, pe lângă transformarea glicocolului în serină, și a homocisteinei în timină, contribuie activ la transformarea uracilului în timină și a metioninei în creatină precum și la biosinteza inelelor porfirinice. Prin administrarea de formiat marcat cu 14C se regăsește în hem, numai la animalele tratate cu acid folic, nu și la cele aflate în carență de folați.

Acidul folic stimulează activitatea colinesterazei, a cărei diminuare ar duce la o creștere a acetilcolinei, cu influență negativă asupra hematopoezei, dar inhibă activitatea tirozinazei și a xantinoxidazei. Acidul tetrahidrofolic stimulează biosinteza nucleelor porfirinice și a nucleoproteidelor. La maimuțe cu deficiențe de acid folic, conținutul nucleoproteidelor scade în mod accentuat, iar situația se redresează prin administrare de acid folic.

Acidul folic este un factor important pentru creșterea animalelor tinere și pentru microorganisme. Este utilizat tot mai mult în lupta împotriva cancerului. Asigură funcționarea optimă a sistemului nervos. A manifestat efecte antiteratogene la animalele tratate cu pirimetamină.

4. PERTURBAREA METABOLISMULUI FOLAȚILOR LA OM

4.1. Cauze ce duc la scăderea acidului folic în organism

Cauzele ce duc la scăderea acidului folic în organism sunt multiple, implicând aportul de acid folic, necesitățile metabolice crescute (sarcină, anemie cronică hemolitică, neoplasm), malabsorbția (sprue, medicamente-fenitoina, barbiturice, etanol) sau interferarea căilor metabolice (inhibitori DHFR-Metotrexat, etanolul) și altele.

Deficitul de aport dietetic de acid folic este mai frecvent întâlnit decât deficitul de vitamină B12. Dintre categoriile mai frecvent afectate fac parte bătrânii cu aport alimentar nediversificat (conserve, regimul “tea and toast”) și ocazional adolescenții- alcoolicii și toxicomanii. În cazul alcoolicilor sursa lor principală o constituie băuturile alcoolice, acestea având conținut de acid folic scăzut (berea, vinul) sau practic nul (băuturile distilate). În alcoolismul cronic se cumulează aportul scăzut cu scăderea utilizării acidului folic.

Necesitățile metabolice crescute de folați apar atât în condiții fiziologice (sarcină, perioadele de creștere în copilărie și adolescență) precum și în condițiile patologice de creștere a ratei de multiplicare a țesuturilor cu turn-over crescut (mucoasa intestinală, măduva osoasă).

Astfel, în timpul sarcinii necesarul zilnic de acid folic este crescut de câteva ori față de normal, iar deficitul de acid folic este de 3 ori mai frecvent la multipare față de primipare. Pentru un organism sănătos și o dietă rațională, echilibrată, necesitățile suplimentare nu constituie un impediment. Anemia ce apare in timpul sarcinii este rezultatul unui consum crescut de acid folic pe fondul unor factori favorizanți ca: alimentație deficitară, ignoranța, etc. Important de reținut este că anemia poate fi anterioară sarcinii și o agravează prin necesitățile crescute; existând cazuri în care anemia din perioada inițială a sarcinii se datorează unor deficiențe alimentare sau menometroragiilor.

Cauza principală a deficienței de folați în sarcină este reprezentată de creșterea sintezei de ARN, ADN asociată cu dezvoltarea fătului, placentei și uterului, precum și cu expansiunea masei eritrocitare a mamei. Pot interveni și alți factori precum: anorexia, reducerea absorbției de folați și creșterea necesarului favorizată de infecțiile urinare frecvente. Gemelaritatea accentuează nevoile de acid folic, determinând creșterea de aproximativ 5 ori a posibilității de apariție a deficienței de acid folic în ultimul trimestru al sarcinii.

Lipsa acidului folic, necesar pentru sinteza ADN, determină tulburări de maturație și multiplicare celulară, cu repercursiuni asupra produsului de concepție, mergând de la malformații ale tubului neural, pâna la avort. Rolul acidului folic în etiologia defectului de tub neural precum și metodele de profilaxie ale acestor malformații prin suplimentarea dietei femeii gravide sunt foarte importante.

În condiții patologice, necesitățile de acid folic cresc cel mai frecvent datorită unei eritropoeze foarte active (de ex. anemia hemolitică cronică). Malabsorbția poate duce la un deficit de acid folic în condițiile unui aport de folați normal; ea are drept cauză afecțiuni ale intestinului (sprue tropical, enteropatia glutenică etc.), alcoolismul cronic sau medicamente ce acționează probabil pe această cale (fenitoina, barbiturice).

Interferarea căilor metabolice ale acidului folic se datorează alcoolului, unor rare deficite enzimatice (DHFR) sau cel mai frecvent inhibitorilor DHFR (Metrotrexat). În celulele în care acești inhibitori de DHFR se acumulează este împiedicată transformarea deoxiuridinmonofosfat (dUMP) în deoxitimidinmonofosfat (dTMP) și drept consecință are loc fosforilarea dUMP ce va fi inserat în lanțurile de ADN într-o proporție ce va depăsi cantitativ capacitatea sistemelor ce recunosc, excizează și repară eroarea, rezultând astfel false lanțuri de ADN ce explică eritropoeza megaloblastică.

Cauzele deficitului de folati

4.2. Folații și sarcina; profilaxia malformațiilor fetale prin administrarea acidului folic

Datorită rolului fundamental al folaților în replicarea celulară, s-a stabilit pentru prima oară în 1964, de către Hibbard că deficitul de folați, cunoscut deja ca fiind răspunzător de hematopoeza anormală, ar putea induce modificări și asupra produsului de concepție și a placentei, putând (mai ales dacă apare la începutul gestației) da avorturi spontane sau malformații. În ultimul timp, interesul cercetătorilor a fost focalizat mai ales spre relația deficit de acid folic –malformații ale tubului neural (prima asociere în acest sens a fost facută de Hibbard, 1965, când 66% dintre mamele cu produs de concepție afectat au avut concentrații crescute de acid forminoglutamic în urină). Un studiu prospectiv privind nivelul folaților eritrocitari la gravide în primul trimestru de sarcină a arătat o incidență semnificativ crescută a malformațiilor la gravidele cu nivel al folaților eritrocitari redus (<130μg/ml).

Problema efectului protector al administrării preventive a acidului folic a fost obiectul unui amplu program de cercetare administrat în Marea Britanie în 1983 și finalizat în 1991 (MRC Vitamin Study Group 1991); astfel, una din patru femei având în antecedente o sarcină afectată din această cauză a primit 4 mg acid folic timp de minimum 12 săptămâni înaintea concepției și în timpul primelor 3 luni de sarcină. Riscul apariției malformațiilor de tub neural la produsul de concepție a fost semnificativ mai mic la gravidele ce au primit acid folic față de lotul martor.

Confirmarea efectului protector al suplimentării folaților în profilaxia recurenței malformațiilor de tub neural susține utilitatea administrării de folați la femeile ce aparțin unei grupe de risc (din punct de vedere al apariției malformațiilor neurale fetale) și pune problema extinderii administării profilactice a folaților la toate femeile gravide.

Un mare număr de femei gravide au un aport dietetic de folați sub valorile recomandate (300μg de folați/zi), dar numai o mică parte din acestea vor avea un produs de concepție normal; oricum până în prezent este imposibilă determinarea certă a apartenenței gravidei la o grupă de risc crescut din acest punct de vedere, făcând foarte greu o profilaxie țintită.

Cele trei mari direcții ale strategiei privind profilaxia deficitului de folați și a consecințelor acestuia, sunt: educația generală privind dieta (cu o atenție specială privind grupurile cu cerințe crescute: utilizatorii de medicamente citotoxice, sindroame de malabsorbție, tulburări metabolice), suplimentare a alimentelor cu acid folic și administrarea suplimentară de acid folic la toate femeile ce vor deveni gravide în scurt timp.

Din punct de vedere al avizului privind dieta, se recomandă consumul crescut de legume proaspete, spanac, fulgi de porumb, lapte (de exemplu o supă de spanac conține aproximativ 125 μg, o porție de fulgi de porumb cu un pahar de lapte 80 μg). Astfel, se combate ipoteza că deficitul de acid folic s-ar datora exclusiv unui statut socio-economic scăzut, accentul fiind pus pe alimentele populare și nici foarte scumpe. Orientarea populației pe baza unui aviz dietetic a specialistului este extrem de deficitară, atât în perioada antenatală, cât și în școli și în rândurile adolescenților.

Suplimentarea artificială cu folați a alimentelor comerciale disponibile pune problema libertății de opțiune și a posibilelor reacții adverse, precum neuropatia datorată unui exces de acid folic la vârstnici. Alimentele alese trebuie să fie consumate cu precădere de către populația țintă, iar nivelul suplimentării trebuie să fie cel minim protector (pentru a evita aportul excesiv de acid folic); cele mai frecvente alimente îmbogățite în folați sunt pâinea (există deja pâine suplimentată cu conținut în folați 120μg/100 grame), iar fulgii de porumb sunt fortificați la 250 μg/100g (75μg/porție medie); aceste evaluări aparțin Expert Advisory Group și sunt valabile pentru produse alimentare in Marea Britanie.

Problema suplimentării acidului folic la femeile gravide se pune mai ales pentru marea masă a populației, întrucât numărul restrâns al celor cu risc crescut va beneficia probabil de consult și tratament adecvat. Din nefericire, în general concepția nu este planificată și numai un număr restrâns de cupluri se vor prezenta la un consult prenatal.

Multe studii au recomandat folosirea dozelor farmacologice de acid folic (4mg/zi) în scop profilactic, dar grija unei supradozări a ridicat problema folosirii unor doze “fiziologice” (0,5mg/zi) pentru profilaxia generală antenatală. Astfel, deși nu se cunosc posibilele reacții adverse ale acidului folic asupra femeilor în perioada de fertilitate, se recomandă doze mici pentru mamele cu risc mic și doze mari (4mg/zi) pentru femeile cu risc crescut. În orice caz, suplimentarea trebuie începută cu trei luni înaintea concepției și continuată primele 8-12 săptămâni de sarcină. Un efect protector, dar de intensitate mai mică, poate fi obținut și dacă suplimentarea este începută mai tarziu, chiar la începutul gestației.

În concluzie, dozele sugerate au fost stabilite empiric și nu se știe dacă efectul protector al folaților împotriva apariției malformațiilor este la fel de cert ca și cel împotriva recurenței lor. Deși nu s-au evidențiat încă reacțiile adverse pentru doze mari, ele pot apărea abia după mulți ani, așa cum a fost cazul unor posibile efecte teratogene ale vitaminei A (1990). Strategia cea mai corectă ar consta în evitarea administrării dozelor farmacologice dacă nu există o justificare clară.

Punerea la punct a unui protocol de “screening” prenatal privind femeile cu risc crescut ar putea reorienta întreaga strategie profilactică și poate fi obiectul unor cercetări ulterioare la noi în țară.

4.3. Acidul folic, ținta terapiei anticanceroase

Terapia antineoplazică depășește în vechime vârsta de 50 de ani. Dacă înainte de 1940 cuvântul cancer apărea în indexul tratatelor de farmacologie doar accidental, astăzi chimioterapia reprezintă o piatră de temelie în terapia cancerului. Principalul progres al ultimilor ani nu constă în lărgirea numărului de agenți antineoplazici descoperiți, ci în dezvoltarea conceptuală a terapeuticii. Aceasta constă în: stabilirea unor regimuri terapeutice mai eficace prin administrarea simultană a diverse medicamente, incluzând agenți antineoplazici și stimulatori ai răspunsului biologic; înțelegerea mecanismelor de acțiune ale medicamentelor, lucru care duce la prevenirea sau micșorarea efectelor toxice; aprofundarea mecanismelor de rezistență la terapie; creșterea întrebuințării terapiei adjuvante (prevenirea recidivelor și distrugerea micrometastazelor, după radioterapie și/sau chirurgie) și neoadjuvante (administrarea înainte de radioterapie sau chimioterapie sau chirurgie pentru scăderea masei tumorale); lărgirea cunoștințelor despre inițierea tumorală, diseminarea, implantarea și creșterea metastazelor.

Antimetaboliții sunt substanțe proiectate ca inhibitori competitivi ai reacțiilor enzimatice ale metabolismului intermediar, sau cu analogi inactivi ai substraturilor reacțiilor specifice. Majoritatea sunt specifici doar în timpul anumitor faze ale ciclului celular. Antimetaboliții nu sunt administrați obișnuit ca medicatie unică, datorită specificității de fază și a faptului că afectează sinteza macromoleculară în puncte multiple.

Acidul folic reprezintă o țintă atractivă pentru chimioterapia antitumorală, datorită rolului său esențial în sinteza precursorilor ADN. Formele reduse de acid folic (tetrahidrofolați) sunt necesare pentru sinteza purinelor și a timidilatului. N10-formil-FH4 și N5, N10-metenil-FH4 contribuie cu o grupare monocarbonată la sinteza acidului inozinic, precursorul adenilatului (AMP) și guanilatului (GMP). Într-o altă cale metabolică importantă, N5, N10-metilen-FH4 asigură o grupare metil și doi atomi de hidrogen pentru sinteza timidilatului (dTMP) din deoxiuridilat. Farber și colab. au propus că analogii acidului folic pot inhiba proliferarea celulelor maligne, o ipoteză care a fost confirmată de testele inițiale, cu aminopterină (acid 2,4 diamino 4 dezoxifolic), în 1948. Acest compus a fost înlocuit mai târziu cu derivatul său N10 metilat, metotrexatul (MTX).

Antifolații ocupă un loc important în terapia antineoplazică; aceștia au produs prima remisie temporară a leucemiei (Farber et al. 1948) și prima vindecare a unei tumori solide, coriocarcinomul (Hertz, 1963). Procentajul crescut de remisiuni complete ale coriocarcinomului a impulsionat cercetarea în domeniul chimioterapiei. Interesul pentru antifolați a crescut semnificativ după introducerea terapiei cu doze mari combinate cu leucovorină (acid folinic, factor C), care scade efectul toxic al metotrexatului. Folosirea dozelor crescute de MTX a extins utilitatea acestuia la tumori ca sarcomul osteogenic, tumori ce nu răspund la doze mici. MTX este folosit și în terapia psoriazisului, o boală non-neoplazică caracterizată prin proliferare rapidă, anormală a celulelor epidermoide (McDonald 1981). În plus, antifolații sunt inhibitori puternici ai reactivității imune mediate celular, având și rol de agenți imunosupresori ce se folosesc în transplantele de organe, în tratamentul artritei reumatoide și în granulomatoza Wegener (Jackson 1984, Chabner et al. 1985).

Metotrexatul (ametopterina) a fost primul antimetabolit care a primit recunoaștere clinică, ca medicament eficace, cu toxicitate acceptabilă. În ultimii 20 de ani au fost testați clinic noi compuși antifolați, cum ar fi diaminopirimidinele și chinazolinele. Cel mai recent dintre acestea este trimetrexatul, un antifolat chinazolinic lipofil, care ocolește obligativitatea din cazul folaților și a metotrexatului de a folosi transportul activ. Trimetrexatul are activitate puternic antiparazitară și efecte antineoplazice, testate încă în ambele specialități. Un alt folat din ce în ce mai interesant este 10-EDAM (10-etil-5-diazo-aminopterina), un inhibitor potent al dihidrofolat reductazei, care posedă transport și poliglutamare îmbunătățite față de metotrexat. Trimetrexatul și 10-EDAM au demonstrat o activitate antitumorală în tratamentul carcinoamelor de intestin, plămân.

MTX face parte din clasa drogurilor specifice pentru ciclul celular faza S (CCS), alături de toți ceilalți antimetaboliți. În general, drogurile CCS s-au dovedit eficace împotriva malignităților hematologice și a altor tumori în care proliferează o proporție relativ crescută de celule.

O problemă majoră a chimioterapiei anticanceroase este rezistența la drog. Unele tipuri tumorale, cum ar fi cancerul colonic sau cancerul pulmonar prezintă o rezistență primară, adica o lipsă de răspuns la prima expunere la drog. Rezistența dobândită se dezvoltă în diferite tipuri de tumori inițial sensibile la tratament. Experimental, se poate observa apariția unei rezistențe specifice pentru un anumit drog, care apare datorită fenomenului de amplificare genică. Alteori se observă un fenotip cu rezistență multiplă, după expunerea la un singur agent. Acesta este frecvent asociat cu creșterea expresiei genei MDR 1 pentru o glicoproteină membranară (glicoproteina-P), implicând efluxul medicamentului. Această proteină transportoare, care apare atât în celule normale cât și în celule tumorale, folosește energia ATP pentru evacuarea multor molecule străine, nefiind limitată doar la agenții antineoplazici. Un alt mecanism de rezistență multiplă implică modificări calitative și cantitative în topoizomeraza II, enzima care repară leziunile produse în ADN de medicamentele antineoplazice.

Principalele mecanisme de rezistență cunoscute sunt:

transportul deficitar al MTX în celule (Assaraf & Shimke 1987);

producția de forme de DHFR alterată, care are afinitate scăzută pentru inhibitor (Thill et colab. 1988);

creșterea concentrației intracelulare a DHFR;

scăderea abilității de a sintetiza poliglutamați de MTX;

scăderea activității timidilat-sintetazei (Curt 1985).

Structura chimica a unor analogi structurali ai folatilor

4.4. Mecanisme de acțiune și rezistență

Activitatea antitumorală a analogilor de folați este rezultatul substituției unei grupări amino cu una hidroxil în poziția 4 a inelului pteridinic, schimbare care transformă molecula de folat din substrat, într-un inhibitor ce se leagă strâns de enzima cheie a metabolismului folic intracelular, dihidrofolatreductaza (DHFR).

Pentru a întelege acțiunea metotrexatului și a altor antifolați, este necesar să se determine rolul determinant al DHFR în metabolismul folaților. Derivații acidului folic sunt coenzime active doar în forma complet redusă de tetrahidrofolați. În reacția timidilat sintetazei (TS), acidul N5, N10 metilen FH4 este convertit la DHF. Acest cofactor inactiv devine apoi substrat pentru DHFR, care transferă doi atomi de hidrogen de la cofactorul NADPH la DHF pentru a forma FH4. În celulele cu ritm crescut a sintezei de timidilat, inhibiția DHFR cu MTX sau analogi similari duce la acumularea de cofactori folat în formă inactivă, de DHF, ceea ce are ca rezultat inhibiția sintezei purinelor și timidilatului.

Astfel, citotoxicitatea MTX-ului este determinată de perturbarea sintezei de novo a purinelor și a sintezei timidilatului, iar importanța relativă a fiecărui efect variază la diferitele tipuri de celule cultivate in vitro și, probabil, la celulele normale și maligne in vivo.

Borsa și Whitmore au demonstrat că citotoxicitatea MTX-ului față de limfocite de șoarece poate fi crescută prin administrarea de purine, probabil datorită creșterii efectului antitimidilat al MTX. Totuși, în modelele de limfom L5178, MTX a avut un efect antipurinic letal. În general, întreruperea sintezei de novo a purinelor apare în prezența unor nivele crescute de timidilat sintază și se produce prin consumarea rezervelor de folați reduși necesare sintezei acestora. Deoarece legarea strânsă de DHFR și depleția consecutivă a folaților reduși sunt esențiale pentru mecanismul de acțiune a MTX, activitatea timidilat sintazei modulează citotoxicitatea MTX. Inhibiția timidilat sintazei (prin administrarea F-pirimidinelor și reducerea rezervelor de dUMP) scade turnover-ul folaților reduși și reduce citotoxicitatea MTX. Importanța activității timidilat sintazei în determinarea citotoxicității MTX a fost confirmată recent de Tattetersall și colaboratorii, care au investigat capacitatea timidinei de a proteja culturi de celule mamare împotriva unei doze letale de MTX. Când a fost administrată cu două ore înaintea MTX, timidina a protejat ambele linii celulare, normale și maligne. Măsurarea rezervelor intracelulare de nucleotide a demonstrat că timidina realizează o depleție a rezervei de dUMP (prin inhibiția cu TTP a dCMP deaminazei) și încetinește reacția timidilat sintazei, conservând astfel folații reduși și păstrând sinteza de novo a purinelor. MTX-ul poliglutamat are un efect inhibitor puternic și direct asupra timidilat sintazei și a enzimelor sintezei purinelor; prin aceste efecte inhibitorii pot contribui direct la citotoxicitatea drogului.

Evenimentele care conduc la acțiunea citotoxică a MTX, începând cu transformarea membranelor celulare, transformarea în derivați poliglutamați, legarea de DHFR, deleția folaților reduși intracelulari și inhibiția sintezei ADN constituie pași importanți în determinarea răspunsului la tratament și a toxicității acestui medicament.

4.5.Transportul transmembranar

Traversarea de către antifolați a membranelor celulare a fost studiată cu multă atenție datorită legăturii dintre anomaliile de transport și rezistență. Studiile clasice ale lui Goldman și colab. au stabilit că MTX intră în celule pe baza unui proces activ sensibil la temperatură, dependent probabil de o proteină transmembranară. Influxul poate fi observat și în vezicule membranare izolate.

Aportul celular de folați se produce prin cel puțin două mecanisme independente: folații reduși sunt internalizați printr-un sistem “carrier” (RFC-reduced folate carrier) cu afinitate redusă (Km=1-5μM) prin transport anionic, întâlnit în majoritatea celulelor, iar acidul folic și 5-metil-FH4 intră în celulă în complex cu o proteină membranară care leagă folatul (FBP folate binding protein). FBP leagă folații cu afinitate crescută (Kd de ordinul nM) și apoi îi eliberează în citoplasmă printr-un proces de endocitoză mediată de receptori. Se pare că FBP acționează la concentrații scăzute de folați (<50 nM) iar carrierul la concentrații normale sau crescute.

Macromoleculele care leagă folații au fost izolate din membranele unor celule de mamifere, dar nu li s-a dovedit vreun rol în transport. Mecanismul transportor al MTX în celulele leucemice murinice și umane este deasemenea utilizat de folații reduși naturali, incluzând agentul de salvare 5-formil-FH4 (leucovorina). MTX și folații reduși concurează, deci, pentru a intra în celulă. În plus, printr-un proces cunoscut sub numele de heteroschimb, MTX intracelular liber este forțat să iasă din celule atunci când intră în celule cantități crescute FH4 extracelular.

Gena RFC e localizată distal, pe brațul lung al cromozomului 21. Afinitatea “carrier”-ului pentru MTX se situează între 1μM-6μM pentru diverse linii de celule tumorale (murine și umane), în timp ce afinitatea celulelor epiteliale intestinale este oarecum mai scăzută Km=87 μM. Acestă afinitate mai mare a carrier-ului celulelor tumorale este considerată ca fiind explicația persistenței mai îndelungate a MTX liber intracelular și poate contribui la selectivitatea acțiunii antifolaților împotriva tumorilor, față de celulele normale. Acumularea MTX în celulele tumorale poate fi influențată de alți agenți antitumorali, incluzând medicamente frecvent utilizate ca antifolați în terapiile combinate. Vincristina crește MTX intracelular, inhibând efectul medicamentului. Concentrația vincristinei necesară pentru a produce acest efect (10μM) nu este ușor obținută în timpul chimioterapiei clinice, care produce frecvent niveluri sanguine maxime ale vincristinei mai mici de 0,1μM. Influxul MTX este inhibat de ouabaină, glucocorticoizi și cefalotin, în timp ce acumularea este crescută de probenecid, prin inhibarea efluxului. Nici una dintre aceste interacții nu a dovedit că afectează chimio terapia clinică.

Faza proliferativă sau cinetică a celulelor influențează puternic procesul de transport. Celulele leucemice murinice rapid proliferative au o viteză de preluare a MTX de 3 ori mai mare și o viteză de eflux a drogului cu 50% mai mică decât o au celulele în faza staționară de creștere. Aceste modificări cresc nivelele MTX intracelular de 5-6 ori. Dependența transportului de ritmul de creștere poate contribui la creșterea citotoxicității MTX pentru celulele care se divid rapid, dar și mărirea necesarului de folați reduși în fazele de creștere rapidă pentru a contribui la aceasta. În continuare la procesul de transport activ cu afinitate crescută, descris mai sus, un al doilea mecanism de intrare apare la concentrații crescute ale drogului (peste 20μM). Acest al doilea proces poate fi difuzie pasivă, sau un proces realizat pentru un “carrier” specific. Alte aspecte ale acestui proces de transport sunt lipsa competiției dintre MTX și FH4 pentru intrare, precum și absența heteroschimbului dintre MTX si FH4. Mecanismul de intrare explică abilitatea celulelor rezistente la transport de a prelua drogul la concentrații extracelulare crescute și reprezintă o motivație rațională a utilizării dozelor crescute de MTX în chimioterapie. Un studiu recent a lui Henderson și Zeveny a evidențiat doar o singură cale de influx cu afinitate crescută pentru concentrații de până la 50μM, dar trei sisteme de eflux pentru MTX. Cel mai important dintre acestea pare să fie același care mediază și influxul de MTX. A doua cale a fost caracterizată prin sensibilitatea la bromosulfonftaleină, în timp ce a treia a fost insensibilă la această substanță și la inhibitori competitivi ai MTX. Contribuția acestor componente la eflux poate fi modificată în funcție de prezența extracelulară a anionilor glucozei, sau a inhibitorilor metabolici. Acumularea și persistența drogului în tumori față de țesutul normal determină în mod clar durata sa de acțiune în teritorii specifice. Au fost observate nivele maxime intracelulare mai mari și o persistență mai îndelungată a drogului în celulele leucemice ale murinelor, sensibile la MTX, față de epiteliul intestinal, în timp ce linia celulară sarcomatoasă 180 rezistentă, a acumulat concentrații mai scăzute de drog, a avut perioade mai scurte ale inhibiției sintezei ADN și a fost neafectată în experimentele chimioterapice. Analiza specifică in vitro a ratelor de preluare a medicamentului de către celulele leucemice a evidențiat o relație pozitivă similară între răspunsul la medicament și transport.

Există diferențe semnificative ale caracteristicelor de transport între diverși antifolați. Antifolații chinazolinici au o rată de eflux mai crescută. Aceste diferențe se corelează cu acumularea intracelulară mai mare a chinazolinelor și aminopterinei față de MTX, după doze echimolare în vivo. Importanța transportului MTX în determinarea răspunsului clinic este nesigură. Alte mecanisme de rezistență, în special creșterea concentrației de DHFR ca urmare a amplificației genice, au fost observate în tumori umane și murinice expuse la creșteri treptate ale concentrației drogului in vitro care poate fi un mecanism la fel de important și în practica clinică. Înțelegerea rezistenței la antifolați la nivel clinic rămâne incompletă. Au fost propuse noi investigații, cu scopul de a ocoli rezistența cauzată de deficiența de transport. Antifolații liposolubili, cum sunt esterii de MTX, diaminopirimidinele, triazinații și trimetrexatul au o excelentă activitate antitumorală în culturile de celule în tratamentul experimental al tumorilor la rozătoare și ar trebui să penetreze celulele deficiente în transport. Dibutilester-MTX are deasemenea proprietatea neobișnuită de a inhiba încorporarea timidinei în ADN, aparent datorită inhibiției transportului nucleozidelor. Diesterii MTX sunt rapid hidrolizați la compusul de bază în plasma de șoarece, dar sunt mai stabili în plasma maimuței, câinelui și omului; când sunt inhibate în aceste plasme dibutilesterii sunt convertiți la derivați α și γ monobutilici, fiind inhibitori stabili și eficace ai DHFR. Proprietățile de transport ale monobutilesterilor nu au fost încă definite. Conjugații de MTX și polilizină, care sunt toxici pentru culturile de celule ovariene de hamsteri cu transport eficient, oferă și posibilitatea de a ocoli rezistența la transport. Deoarece conjugatul polilizin-MTX nu inhibă direct DHFR și toxicitatea sa poate fi anulată prin administrarea simultană de leucovorină, este probabil că și compusul suportă liza intracelulară, cu eliberarea antifolatului.

Shen și colab. au postulat că conjugatul intră în celulă prin pinocitoză și prin liza enzimatică ce apare în lizozomi. Astfel, conjugatul polilizină-MTX este transportat printr-un sistem “carrier” independent. Tiamin pirofosfatul, care inhibă transportul MTX, protejează fibroblaștii de șoarece de toxicitatea MTX, dar nu de aceea a polilizin-MTX. Deși acidul folic este capabil să salveze celulele hepatom Reuber H35 de citotoxicitatea MTX, este incapabil să salveze o murină rezistentă la transport de efectele polilizin-MTX, probabil deoarece, ca și MTX, acidul folic este incapabil să intre în celulele rezistente la transport.

O altă încercare de a depăși rezistența la transport este încapsularea MTX în vezicule fosfolipidice bistrat, numite lizozomi. Aceste plachete microscopice ce conțin medicament pot, teoretic, transporta MTX la suprafața celulară, unde intrarea poate fi făcută prin pinocitoză, sau prin contopirea membranelor celulare și lipozomice. Lasserman și colab. au reușit să îndrepte lipozomi cu purtători de haptene, conținând MTX, spre celulele mielomatoase murinice care exprimau pe suprafața lor imunoglobuline cu afinitate pentru haptene. Deși lipozomii localizau celule țintă mielomatoase cu acuratețe nu a fost observată nici o inhibiție a încorporării deoxiuridinei, deoarece conținutul veziculelor nu a putut intra în celulă. Deși rezultate încurajatoare cu lipozomi încărcați cu MTX au fost raportate pe modele animale, majoritatea dovezilor sugerează că îmbunătățirea supraviețuirii provine de la întârzierea nespecifică a clearence- lui plasmatic și nu din transportul selectiv al medicamentului la tumora. O excepție posibilă a acestei concluzii este tehnica de încapsulare a MTX in lipozomi termolabili. Dacă tumora este apoi incălzită, eliberarea preferențială a MTX apare la sediul tumorii, ducând la o activitate terapeutică îmbunătățită.

MTX – γ – aspartat

Legarea reziduurilor de aspartat la MTX prin legături γ – peptidice

Un alt experiment a fost folosit de Heath și colab., folosind MTX-γ aspartat, conținut în lipozomi înveliți în anticorpii specifici antitumorali. Acest analog de MTX are capacitate limitată de a traversa membrana celulară și este de 200 de ori mai puțin toxic decât MTX, datorită transportului deficitar. Citotoxicitatea a apărut doar prrin eliberarea intracelulară a drogului via lipozomi îmbrăcați cu anticorpi specifici pentru fibroblaști murinici L 929. În mod ideal, va fi nevoie de identificarea unor antigene tumorale umane comune în scopul de a face acest experiment util din punct de vedere clinic.

4.6. Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductază

Caracteristicile fizice ale legării NADPH și a MTX de DHFR au fost stabilite prin studii cristalografice cu raze X și prin determinarea secvențelor de aminoacizi ale enzimelor naturale și ale celor modificate chimic. Au fost studiate enzime bacteriene și de la mamifere; secvențele de aminoacizi posedând similitudini puternice în pozițiile implicate în legarea cofactorilor sau a inhibitorilor. În general, MTX este legat printr-o porțiune lungă, hidrofobă, formată din izoleucina-7 (sau leucina-7), alanina-9, leucina-31, fenilalanina-34 și alte reziduuri. Două interacții mai importante participă la potențarea legării 4-amino-antifolaților:

oxigenul carbonilic al izoleucinei-7 realizează o legătură de hidrogen cu gruparea 4-aminei ;

gruparea carboxil a aspartatului-30 (sau glutamatului-30) protonează atomul N al MTX, dar nu și pe cel al substratului fiziologic (FH4). În plus, substratul fiziologic pare să se lege de enzimă într-o configurație răsturnată, în comparație cu inhibitorul.

În prezența NADPH-ului în exces, afinitatea de legare a MTX de reductază a fost estimată între 1nM și 1pM. Această afinitate este crescută de pH-ul acid, potențată de ionii de K+ și oxidarea grupărilor sulfhidril ale enzimei. În condițiile unui pH scăzut, a excesului de NADPH și a unei afinități scăzute a inhibitorului față de enzimă, legarea este stoechiometrică, ceea ce inseamnă că fiecare moleculă de MTX va lega o moleculă de enzimă. Complexul enzimă-NADPH-inhibitor este extrem de stabil, supraviețuind electroforezei în gel și filtrării în gel.

NADH are deasemenea capacitatea de a acționa ca și cosubstrat pentru DHFR în locul NADPH, pentru reducerea folatului și a dihidrofolatului. Spre deosebire de NADPH, NADH nu asigură legarea MTX de DHFR. Importanța raportului dintre NADH și NADPH în determinarea răspunsului la MTX rămâne să fie stabilită.

Legarea MTX la reductaza izolată de la Streptococcus faecium generează lent un complex cu un Ki al inhibitorului de 58 pM. Procesul a fost denumit inhibiție strâns legată și lentă. Alți analogi de folați, incluzând diaminopirimidinele, trimetroprimul și aminopterina urmează același proces cinetic, de “legare strânsă și lentă”, în timp ce pteridinele ce nu au gruparea acid amino benzoic se comportă ca inhibitorii competitivi clasici ai enzimei. Cinetica a fost evaluată folosind și modele de simulare .

În terapeutică, MTX acționează ca un inhibitor cu legare strânsă, dar reversibil. În condițiile unor concentrații crescute de substrat competitiv și la un pH normal, este necesar un exces considerabil de MTX liber pentru realizarea unei inhibiții complete a enzimei. În culturile de celule și în sisteme acelulare, 3H-MTX (MTX marcat cu 3H) legat de enzimă poate fi deplasat de pe aceasta prin expunere la noi doze de drog, fenomen ce indică o disociere lentă, dar stabilă a MTX de pe enzimă. Acestă disociere lentă este considerabil mai rapidă decât cea calculată în experimente cu enzimă pură în prezența unui exces de NADPH. Motivul acestei diferențe este încă neclar, dar poate fi rezultatul diferențelor din mediul ionic, de legare prin complexe cu afinitate scăzută a drogului cu DHFR și NADP+, sau doar cu enzima. Deci este necesar un exces de drog liber, nelegat, pentru a menține inhibiția totală a DHFR și a sista sinteza timidilatului. De exemplu, dacă se incubează celule tumorale cu cantități crescute de MTX pentru a permite titrarea totală a enzimei și apoi se scoate drogul nelegat din soluție, sinteza timidilatului va reîncepe imediat în ciuda persistenței MTX intracelular legat de enzimă.

5. REZULTATE EXPERIMENTALE

În studiul prezent am folosit o metodă spectrofotometrică pentru a determina concentrația de acid folic din omogenate tisulare din diferite organe (ficat, rinichi, creier, splină) la șobolanii albi; acest studiu a fost

realizat în scopul aflării variației concentrației de acid folic în funcție de:

vârstă;

organ.

Pentru curba de etalonare am folosit:

metoda biuretului pentru determinarea proteinelor celulare;

reactivul naftiletilendiamină pentru determinarea acidului folic.

Concentrațiile acidului folic în funcție de vârstă și de organ le-am estimat prin metoda descrisă de Lowry (Lowry, 1951), cu ajutorul acidului fosfomolibdenowolframic.

Determinarea concentrației de acid folic la șobolani

5.1. Material și metodă

Animale și dietă

Pentru studiu s-au folosit trei grupuri de șobolani albi, de sex masculin, fiecare grup constând în cinci șobolani de vârstă și greutăți apropiate, astfel:

1)-primul grup: șobolani tineri, cu vârsta mai mică de șase luni și greutate mai mică de 50 de grame;

2)-al doilea grup: șobolani adulți, cu vârste cuprinse între șase luni și un an și greutate cuprinsă între 100 grame și 125 grame;

3)-al treilea grup: șobolani bătrâni, cu vârste în jur de un an sau chiar mai mult și greutate mai mare de 125 grame.

Toți șobolanii au fost supuși la aceeași dietă.

Prepararea omogenatelor tisulare

Toate operațiunile de preparare a omogenatelor tisulare pentru investigații biochimice se fac la 0-4˚ C. Sticlăria de lucru, eprubetele și cupele de centrifugă, soluțiile de spălare și mediile de omogenizare au fost păstrate la gheață și au fost reci în momentul întrebuințării.

Animalele de laborator au fost decapitate și apoi supuse exsanguinării.

S-au izolat organele necesare experimentului: ficat, rinichi, creier și splină, iar apoi s-au presat ușor pe hârtie de filtru, pentru a îndepărta sângele. S-au cântărit foarte repede.

Fiecare organ a fost spălat de câteva ori (într-un pahar Berzelius menținut în gheață) cu soluție rece de NaCl 0,15M până ce lichidul de spălare a rămas limpede.

Apoi, cu o foarfecă s-a mărunțit bine organul și s-a spălat cu NaCl 0,15M, pâna ce soluția de spălare a rămas limpede.

Pentru omogenizare 5 ml de soluție de NaCl 0,15M au fost adăugați pe gramul de țesut (cu scopul de a obține un omogenat de concentrație 10%).

Țesuturile ușor poterabile (ficat și creier) au fost omogenizate la 1500rpm, timp de 2 minute, într-un omogenizator de sticlă tip Potter-Elvehjem. Țesuturile mai dure (rinichi și splină) au necesitat o omogenizare cu o durată mai crescută.

Omogenatele obținute s-au centrifugat la 700 g timp de 10 minute (după o prealabilă echilibrare). Sunt sedimentați:

-nucleii;

-celulele întregi;

-debriurile celulare;

-hematiile.

Supernatantul se decantează și se păstreaza în gheață pentru alte determinări biochimice.

Pentru a putea compara și interpreta rezultatele determinărilor biochimice pe omogenate, materialul biologic s-a standardizat în două moduri:

-prin raportare la greutatea produsului la începutul determinării (standard de preparare);

-prin raportare la conținutul proteic al omogenatului.

Standard de preparare

Inițial organul sau fragmentul de organ se cântărește. În funcție de greutatea sa se realizează omogenate de 10-20%, diverse soluții de omogenizare.

Standardizarea se obține preparând totdeauna omogenate de aceeași concentrație.

Raportarea la conținutul proteic

Este metoda de standardizare cea mai utilizată.

Metoda de determinare a proteinelor celulare folosită pentru standardizare

(metoda biuretului)

-sensibilitate de 0,25-10mg/ml omogenat

Principiu:

Proteinele celulare dau cu reactivul biuret un derivat de culoare albastră caracteristică, a cărei intesitate este direct proportională cu concentrația proteinelor din probă.

Reactivi:

1.reactivul biuret;

2.NaOH 10%.

Reactivul biuret se prepară astfel:

-tartrat de sodiu și potasiu –9g;

-CuSO4·5H2O –3g;

-KI-5g;

Se dizolvă și se aduce la 1000ml cu NaOH 0,2N.

Reactivul preparat corect este de culoare albastră. Se păstrează timp nelimitat. Dacă reactivul este contaminat cu alte substanțe apare un precipitat roșcat și nu se mai folosește.

Tehnica

Deoarece omogenatele tisulare nu sunt soluții limpezi, ele prezintă o anumită turbiditate, dând cu reactivul biuret un efect secundar ce interferă cu reacția de culoare. Se face pentru fiecare determinare și un martor de turbiditate.

Se agită bine. Se lasă în repaus 30 de minute la temperatura camerei, după care se citește extincția la lungimea de undă de 540 nm, cu grosimea stratului de 10 nm.

Se citește extincția probei față de cea a martorului de culoare , iar extincția martorului de turbiditate față de cea a apei distilate.

Calculul cantității de proteine se face prin raportarea valorii corespunzătoare diferenței dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

Curba etalon

-se prepară o soluție standard de albumină serică de bou;

-se pregătește o scară de diluții de concentrații cunoscute cuprinse între 0,25-60 mg/ml ;

-se respectă pentru fiecare diluție protocolul prezentat în tabelul anterior ;

-se reprezintă grafic modul de variație a extincției în funcție de concentrația soluției de proteine

*)-extincția probei față de cea a martorului de culoare minus extincția martorului de turbiditate față de cea a apei distilate

5.2.Determinarea conținutului în acid folic

Reactivi

-fosfat dibazic de potasiu soluție 3%;

-permanganat de sodiu 0,4%;

-azotit de sodiu soluție 2%;

-acid clorhidric soluție 5N;

-acid sulfamic soluție 5%;

-diclorhidrat de N (1-naftil) etilendiamina NED soluție 0,1%.

Tehnica

Se citește extincția probei față de cea a martorului de culoare și a martorului de turbiditate față de cea a apei distilate după 10 minute la lungimea de undă 530 nm în cuvă de 10 mm.

Calculul cantității de acid folic se face prin raportarea valorii corespunzătoare diferenței dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

Curba etalon:

-se prepară o soluție standard de acid folic;

-se pregătește o scară de diluții cu concentrații cunoscute cuprinse între 1,2023-130 μg/ml;

-se respectă pentru fiecare diluție protocolul prezentat în tabelul anterior;

-se reprezintă grafic modul de variație al extincției în funcție de concentrația soluției de acid folic.

*)extincția probei față de cea a martorului de turbiditate

**)-extincția probei față de cea a martorului de culoare minus extincția martorului de turbiditate față de a apei distilate.

Măsurarea cantităților de acid folic din omogenatele tisulare

Concentrațiile de acid folic au fost estimate prin metoda NED (N-1-naftiletilen diamina), o metodă de bază, spectrofotometrică. Această metodă se folosește ca tehnică de dozare în industria farmaceutică (Atanasiu și colab., 1989)

.

Reactivi

-_monofosfat de potasiu –3%;

permanganat de potasiu –0,4% ;

NaNO2 -2%

acid hidrocloric – 5%;

acid sulfamic –5%

NED-0,1%

Tehnica

Se citește extincția față de martorul de culoare la lungimea de undă de 530 de nm; concentrația de acid folic corespunzătoare acestei extincții s-a calculat prin raportarea la curba standard (prin metoda expusă anterior).

Rezultatele obținute s-au exprimat atât în funcție de greutatea inițială a organului (μg de acid folic/g de țesut), cât și în funcție de concentrația de proteine din omogenat (μg de acid folic/mg de proteine).

Măsurarea concentrației de proteine din omogenat

Concentrația de proteine a fost calculată prin metoda descrisă de Lowry (Lowry, 1951), metodă bazată pe acidul fosfomolibdenowolframic (reactivul “Folin-Ciocalteu”).

Reactivi

Reactivul A: – 4g NaOH;

-10g sare Seignette;

-apă distilată până la 1000ml;

Reactivul B: -5g CuSO4·5 H2O;

-apă distilată până la 1000 ml;

Reactivul C: -25 ml reactiv A + 0,5 ml reactiv B;

Reactivul D: -acid fosfomolibdenowolframic.

Tehnica

Peste 20 μl de omogenat se adaugă 180 μl de apă distilată, iar apoi se adaugă 5ml reactiv C și 0,5ml reactiv Folin-Ciocâlteu; întregul amestec a fost agitat și după aceea lăsat timp de 30 de minute. Extincția s-a citit la o lungime de undă de 660 nm, față de un martor ce conținea 20μl de apă distilată în loc de 20μl de omogenat. Rezultatele au fost deasemenea raportate la o curbă etalon, curbă construită pe baza unor concentrații proteice cunoscute (prin metoda descrisă anterior).

5.3.Rezultate și discuții

Variația concentrației de acid folic: în funcție de vârstă și organ

Variația concentației de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/g de țesut

Variația concentației de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/mg prot.

Variatia concentratiei de acid folic pe grupe de varsta exprimata in μg AF/g de tesut

Variația concentrației de acid folic pe grupe de vârstă

Din studiul grafic al variației concentrației de acid folic pe grupe de vârstă (exprimată în μg de AF/g de țesut) s-a observat o scădere gradată de la tineri spre adulți și spre bătrâni, cu excepția concentrațiilor de acid folic din omogenatul din rinichi. În acest caz particular concentrația de acid folic scade de la tineri la adulți, ca apoi să crească paradoxal la șobolanii bătrâni.

Sunt două posibile explicații prentru aceste variații neașteptate.

prezența unei concentrații crescute de folați în omogenatul de rinichi la tineri;

prezența unei concentrații scăzute de proteine în acest omogenat.

Dintre aceste două ipoteze ultima este mai plauzibila. Această ipoteză

s-a justificat prin corelarea cu valorile calculate a concentrațiilor proteinelor din omogenatul de rinichi de la tineri și de la adulți.

În ceea ce privește concentrațiile de acid folic din creier nu are valoare faptul că s-a obținut o scădere a concentrațiilor de acid folic (de aproximativ trei ordine de mărime) de la tineri spre adulți.

Variațiile concentrațiilor de acid folic în funcție de organ:

Din toate tipurile de reprezentări grafice, pe grupe de vârstă, rezultă faptul că indiferent de modalitatea de exprimare a acidului folic (μg acid folic/g de țesut sau μg acid folic/ mg de proteine) nivelul cel mai crescut de folați s-a obținut în omogenatul de ficat; aceste rezultate sunt în concordanță cu studiile histologice făcute anterior (Onicescu și colab., 1979) și cu nivelul activității metabolice din ficat (implicând metabolismul hepatic a unei singure unități carbonice).

S – au obținut cantități mult mai mari de acid folic în ficat și rinichi, față de valorile corespunzătoare din splină și creier.

Variațiile concetrațiilor de acid folic în funcție de organ (exprimate în μg AF/mg de proteine)

Concluzii

În acest studiu s-a dovedit o incidență crescută a deficitului de acid folic la bătrâni, deficit cauzat în principal de malnutriție. Este necesară o evaluare ulterioară pentru a demonstra rolul patogenic a deficitului de acid folic în diferite sindroame clinice la bătrâni (ca de exemplu deficite imunologice și neuropsihiatrice). Tabloul clinic nespecific al malnutriției la bătrâni (care este adesea greșit diagnosticată) însoțit de deficiență de folați induc homocisteinemia și se asociază cu un risc crescut cardiovascular. Aceste observații sunt argumente în favoarea următoarelor concluzii:

stării nutriționale a bătrânilor trebuie să i se acorde o mai mare importanță decât unui diagnostic de rutină

soluția este suplimentarea de acid folic la bătrâni (măcar la pacienții cu risc de a dezvolta o deficiență de acid folic, la pacienți instituționalizați la geriatrie, la pacienții ce consumă mâncare conservată etc.); această soluție este atât sigură cât și ieftină (singura reacție adversă a fost observată la epileptici).

BIBLIOGRAFIE

1) Acuna J., Yoon P., Erickson J.D., Centers for Diseases Control and Prevention, 1999

2) Adams M.J Jr., Khoury M.J., Scanlon K.S., Stevenson R.E., Knight G.J., Haddow J.E., Sylvester G.C., Cheek J.E., Henry J.P., Stabler S.P., Allen R.H.-Teratology, 51, 311-317, 1995

3) Atanasiu V.-Acidul folic și derivații săi în lumea vie, 34-70, 1997

4) Atanasiu V., Iacoban S., Stanciu B., Nitescu I.-Journal Medical Biochemistry, 2, 20-25, 1997

5) Atanasiu V., Niculescu I., Niculescu O., Iacoban S., Truția E.-Romanian Journal of Physiology, 34, 18-20, 1997

6) Atanasiu V., Stanciu B.- Spitalul, 3, 15-18, 1997

7) Atanasiu V.- Conference Book, International Biology, 1995

8) Berry R.J., Li Z., Erickson J.D., Li S., Moore C.A., Wang H., Mulinare J., Zhao P., Wong L.Y., Gindler J., Hong S. X., Correa A., Hao L., Gunter E.-New England Journal of Medicine, 341,30-32, 1999

9) Botto L.D., Khoury M.J., Mastroiacovo P., Castilla E.E., Moore C.A., Skjaerven R., Mutchinick O.M., Borman B., Cocchi G., Czeizel A.E., Goujard J., Irgens L.M., Lancaster P.A.L., Martiinez-Friias M.L., Merlob P., Ruusinen A., Stoll C., Sumiyoshi Y.-American Journal of Medical Genetics, 71, 8-15, 1997

10) Botto L.D., Mastroiacovo P.- Clinical genetics, 53, 456-459, 1998

Botto L.D., Moore C.A., Khoury M.J., Erickson J.D.-New of Medicine, 341, 1509-1519, 1999

11) Botto L.D., Mulinare J.- American Journal of Epidemiology, 150, 323-324, 1999

12) Botto L.D., Yang Q.- American Journal of Epidemiology, 151, 862-867, 2000

13) Buehler J.W., Mulinare J.- Pediatric Annals, 26, 535-539, 1997

14) Castilla F., Cardenas J.- Bioquimica, 478-483, 1995

15) Carr F., Medina W.D., Dube S., Bertino J.R.-Blood, 62, 180-185, 1983

16) Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report, 47, 773-778, 1998

17) Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report, 49, 1-4, 2000

18) Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report, 48, 914-917, 1999

19) Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report, 47, 131-134, 1998

20)Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report, 46, 721-723, 1997

21) Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report, 45, 793-795, 1996

22) Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report, 44, 694-699, 1995

23) Chu E., Takimoto C.H.,Voller D., Grem J.L., Allegra C.J.-Biochemistry, 32, 4756-4760, 1993

24) Cline M.J., Stang H., Mercola K., Morse L., Ruprecht R., Browne J., Salser W.-Nature, 284, 422-425, 1980

25) Cragan J. D., Roberts H.E., Edmonds L.D., Khoury M.J., Kirby R.S., Shaw G.M., Velie E.M., Merz R.D., Forrester M.B., Williamson R.A., Krishnamurti D.S., Stevenson R.E., Dean J.H.-Teratology, 56, 37-49, 1997 26) Curtin N.J., Morris A.L.-Biochemistry Pharmacology, 37, 2113-2120, 1986

27) Daniel W.W.-Biostatistics, 207-216, 1987

28) Djerassi I., CieselkaW., Kim J.S.-Cancer Treatment Report, 61, 751-752, 1977

29) Drews C.D., Yeargin-Allsopp M., Decoufle P., Murphy C.C.-American Journal of Public Health , 85, 329-324, 1995

30) Edincott J.A., Ling V.-Biochemistry Journal, 291, 855-860, 1993

31) Fanin R., Banerjee D., Volkenandt M., Waltham M., Li W.W., Dicker A.P., Schweitzer B.I., Bertino J.R.-Molecular Pharmacology, 44, 13-21, 1993

32) Forrester M.B., Merz R.D., Yoon P.W.-American Journal of Epidemiology , 148, 1206-1211, 1998

33) Fridland A.-Cancer Research, 34, 1883-1888, 1974

34) Freisheim J.H., Kumar A.A., Blankenship D.T.-Chemistry and Biology of Pteridines, 419-424, 1979

35) Glode L.M., Pitman S.W., EnsmingerW.D.-Cancer Research, 39, 3707, 1979

36) Jackson R.C., Hart L.I., Harrap K.R.-Cancer Research, 36, 1991-1997, 1980

37) Jackson R.C.-Molecular Pharmacology, 18, 281-286, 1985

38) Jaharko D.S., Fung W.P., Yang K.H.-Cancer Research, 41, 1549-1558, 1977

39) Khoury J.M., James L.M., Erickson J.D.-Teratology, 49, 273-281, 1994

40) Khoury M.J., Shaw G.M., Moore C.A., Lammer E.J., Mulinare J.-American Journal of Medical Genetics, 61, 30-36, 1996

41) Kuenneth C.A., BoyleC., Murphy C.C., Yeargin –Allsopp M-Pediatric and Perinatal Epidemiology, 10, 186-196, 1996

42) Lary J. M., Edmonds L.D.- Morbidity and Mortality Weekly Report CDC Surveillance Summaries, 45, 15-26, 1996

43) Lary J.M., Edmonds L.D.-Teratology, 56, 19-30, 1997

44) Lawrence J.M., Petitti D.B., Watkins M., Umekubo M.A.-Lancet, 354, 915-916, 1999

45) Lipski P.S.- Age Ageing, 22, 15-18, 1993

46) Lynberg M.C., Khoury M.J., Lu X, Cocian T-American Journal of Epidemiology, 140, 244-255, 1994

47) Lyon Daniel K., Veto L.L.- Centers for Diseases Control and Prevention, 1999

48) Mersereau P.-Small Talk, 12, 1-2, 4-5, 2000

49) Miller J.W.-Biochemistry Journal, 298, 1994

50) Moore C.A., Li S., Li Z., Hong S.X., Gu H.Q., Berry R.J., Mulinare J., Erickson J.D.-American Journal of Medical Genetics, 73, 113-118, 1997

51) Mulinare J., Erickson J.D.-Teratology, 56, 17-18, 1997

52) Mulinare J.-Cereal Foods Word, 40, 58-61, 1995

53) Oakley G. P. Jr.-JAMA, 274, 1717-1718, 1995

54) Oakley G. P. Jr., Adams M.J., Dickinson C.M.-Journal of Nutrition, 126, 7510-7515, 1996

55) Oakley G.P. Jr.-Reproductive Toxicology, 11, 579-581, 1997

56) Oakley G.P. Jr-American Journal of Clinical Nutrition, 65, 1889-1890, 1997

57) Olney R., Mulinare J.-Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews, 4, 241-246, 1998

58) Onicescu D., Atanasiu V.-Histochemistry, 61, 109-110, 1979

59) Onicescu D., Atanasiu V.-Review Romanian Biochemistry, 26, 1989

60) Ou C.Y., Stevenson R.E., Brown V.K., Schwartz C.E., Allen W.P., Khoury M.J., Rosen R., Oakley G.P., Adams M.J.- American Journal of Medical Genetics, 63, 610-614, 1996

61) Posey D.L., Khoury M.J., Mulinare J, Adams M.J.Jr, Ou C.Y.-Lancet 347, 686-687, 1996

62) Roberts H.E., Moore C.A., Cragan J.D., Fernhoff P.M., Khoury M.J.-Pediatrics, 96, 880-883, 1995

63) Rotherb K.G.-Analitical Biochemistry, 103, 152, 1980

64) Sostman H.D., Matthay R.A., Putman C., Smith G.W.J.-Medicine, 55, 371-388, 1976

65) Stoller R.G., Hande K.R., Jacobs S.A., Rosenberg S.A., Chabner B.A.-New England Journal Medicine, 297, 630-634, 1977

66) Taylor I.W., Tattersall M.H.-Cancer Research, 37, 1602-1607, 1977

67) Voet J., Voet D.-Tetrahydrofolate Cofactors: Metabolism of C1 Units, 761-764, 1995

68) Watkins M.-Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews, 4, 282-290, 1998

69) Watkins M.L., Erickson J.D., Thun M.J., Mulinare J., Heath C.W. Jr.- American Journal of Epidemiology, 152, 149-162, 2000

70) Watkins M.L., Erickson J.D., Mulinare J.-New England Journal of Medicine, 341, 923-924, 1999

71) Watkins M.L., Scanlon K.S., Mulinare J., Khoury M.J.-Epidemiology, 7, 507-512, 1996

72) Zaharho D.S., Fung W.P., Yang K.H.-Cancer Research, 37, 1602-1607, 1977

73) Zachariae H., Kragballe K., Sogaard H.-British Journal Dermatology, 102, 407-412, 1980

74) Zi Houn, Grant S.C., Kris M.G., Young C.W., Sirotnak F.M.-Cancer Investigation, 11, 36-45, 1993