Cercetari Asupra Unor Infectii Virale sau Bacteriene la Persoane cu Diferite Afectiuni Oculare

Capitolul I

Structura și funcțiile aparatului vizual

Aparatul vizual, cel mai important organ de simț, informează sistemul nervos central asupra tuturor modificărilor care au loc în mediul înconjurător.

Funcționează pe principiul sistemul cibernetic, adică are în exterior globul ocular numit și "aparat de luat vederi", apoi căi de transmisie a mesajului și centri corticali de interpretare a imaginii.

Globul ocular este în general de formă sferică și are o structură formată din trei membrane:

– Membrana externa, numita sclerotică, de culoare albă sidefie, fibroasă și rezistentă, inextensibilă la adult, dar ușor extensibilă în prima copilărie, este numită și scoica sclerală, deoarece menține forma globului ocular și a fost asemuită cu sistemul osos din alte părți ale organismului. Este formată din fibre conjunctive-elastice, împletite în patru straturi, în sistem de rețea de balon, care îi dă rezistența și starea opacă, netransparentă. Aceste fibre iau naștere prin secretarea de substanțe colagene și mucopolizaharizi a unor celule numite fibrocite. Dacă genetic aceste celule nu au mesaj normal de sintetizare a acestor substanțe, apar fibre cu rezistență redusă, care prin presiunea continutului globului ocular se alungesc sau își modifică forma, putând sa ducă la tulburari de refracție cum este miopia, astigmatismul, cheratoconul.

Rolul fiziologic al scleroticei este de a proteja celelalte componente oculare.

Membrana externă, sclerotica, în 1/6 anterioară, la polul anterior își modifică structura prin plasarea fibrelor în sistem paralel, ceea ce face ca această porțiune să devină transparentă. Această zonă este numită corneea transparentă, prin care pătrunde lumina, excitantul specific al ochiului. Corneea poate fi asemuită cu geamul unei încaperi.

Corneea are principalul rol optic de a permite pătrunderea radiațiilor luminoase și, prin puterea ei de refractie de 40 de dioptrii, de a devia traiectoria luminii, pentru a ajunge la retină.

– Membrana mijlocie este numită uveea și se împarte în: uveea anterioară și uveea posterioară. Uveea anterioară cuprinde la rândul ei doua elemente: corpul ciliar și irisul.

Corpul ciliar este format de mușchii ciliari și procesele ciliare.

Mușchii ciliari sunt netezi, nesupuși vointei și functioneaza reflex, având legaturi foarte fine cu lentila cristaliniană transparentă. Îndeplinesc cea mai importantă funcție optica oculară și anume punerea la punct a imaginii pe care o fixăm de la orice distanță. Aceasta este funcția de acomodație vizuală, necesară unei vederi clare în privirea de la orice distanță dorim. Mușchii acționeaz prin contracție sau relaxare asupra cristalinului.

Procesele ciliare, bogat vascularizate, secretă umoarea apoasă necesară menținerii presiunii normale intraoculare, precum și nutriției formațiunilor care nu au vase, cum sunt corneea și cristalinul.

Irisul, membrana diafragmatică situată vertical în fața cristalinului este colorată diferit de la subiect la subiect, de la rasă la rasă. Central, irisul are un orificiu numit pupila.

Pupila își poate micșora sau mari diametrul în raport cu lumina din mediul exterior, având în mod reflex rolul de a doza cantitatea de lumină ce patrunde în interiorul ochiului până la retină.

Uvcea posterioară, cunoscută și sub numele de coroidă, este asemuită cu un burete vascular, deoarece contine aproape în totalitate numai vase de diferite mărimi, care au rolul de a hrăni retina și celelalte componente oculare.

Coroida conține și un pigment, care realizează așa numita cameră obscură a ochiului.

– A treia membrană a ochiului este retina, de tip nervos, formată din 10 straturi în care există 3 tipuri de neuroni: primul neuron: conul și bastonașul; al doilea neuron celula bipolară și al treilea neuron celula ganglionară.

La acest nivel se face transformarea radiației luminoase în energie electrică, care transmite mesajul vizual la scoarța cerebrală. Conurile și bastonașele sunt neuronii cei mai importanți, care conțin substanțele fotosensibile și anume iodopsina și rodopsina, substanțe care au în compoziția lor ca element esențial vitamina A. Conurile sunt așezate în centrul fundului de ochi în zona numită macula optică (pată optică).

Există în general până la aproximativ 8000000 de celule, care se ocupă cu perceperea formei elementelor fixate (simțul formelor) și cu distingerea luminii monocromatice, deci a culorilor (simțul cromatic).

Bastonașele sunt cu aproximație în numar de peste 60000000 elemente și au proprietatea de a sesiza intensități de lumină din ce în ce mai reduse, adică permit orientarea în lumina redusă, în întuneric (simțul luminos).

Excitantul specific al acestor celule neuroni este radiația electromagnetică, adică lumina compusă albă, formată din particule foarte fine numite fotoni sau cuante de lumină.

Cuantele de lumina pătrund în ochi prin mediile transparente și refringente, cum sunt corneea, umoarea apoasă, cristalinul și corpul vitros. Ajunse la conuri și bastonașe, determină un microbombardament, deoarece au masă și viteză, rupând molecula de substanță fotosensibilă (iodopsina și rodopsina). Are loc o transformare fotofizicochimică, ce se face prin rezonanță paramagnetică și electronii sunt aruncați pe orbite externe, determinând o diferență de potențial. Această diferență de potențial se transmite prin ceilalți neuroni (celule bipolare și ganglionare), prin nervii optici și căile optice până la scoarța cerebrală, unde se formează imaginea prin mecanism psihic.

Această proprietate piezoelectronică a neuronilor retinieni da posibilitatea transformării luminii în energie electrică, care duce mesajul vizual la scoarța cerebrală.

Deci imaginea vizuală, așa cum înfățișeaza tot ce fixam din mediul extern, este completă și se formează intr-o etapă optică (mediile transparente și refringente), una fiziologică (mecanismele petrecute în neuronii retinieni) și o etapă psihică (interpretarea mesajului în scoarța cerebrală).

Componenta optică oculară, formată din corneea transparentă, situată în polul anterior al globului ocular și refringentă cu o putere de 40 de dioptrii, poate sa dirijeze razele luminoase sosite la ea. Umoarea apoasa care este numai transparentă, se afla în spatele corneei, în aăa numita cameră anterioară a ochiului, care din punct de vedere optic nu are decât sa conduca razele luminoase.

Al treilea element și foarte important este lentila cristaliană convexă, transparentă, și refringenta de 20 de dioptrii.

Această lentilă este legată prin fibre foarte fine (zonula Zinn) de mușchii ciliari. Cristalinul este situat în spatele irisului și are posibilitatea prin contracția reflexă a mușchiului ciliar fie să-și crească refrigenta (se bombeaza) permitând vederea de aproape, fie sa-și scadă refringentă (se turtește), permitând vederea la distanță.

Această proprietate este acomodația vizuală, care ne permite să vedem clar de la orice distanță privim.

În spatele cristalinului și deci în restul conținutului ocular se află corpul vitros (sau umoarea sticloasa) element transparent, grație unui edificiu chimic colagenic cu o structură foarte fină, lipsită de orice alt element structural și mai ales de vase. Rolul corpului vitros este de a permite razelor sa ajunga la neuronii retinieni.

Anexele globului ocular. Ca să functioneze în conditii bune, globul ocular sau aparatul de luat vederi are aparate ajutatoare sau anexele.

Orbita este o cavitate de formă piramidală, patruunghiulară, cu vârful îndreptat posterior și ușor oblic din afară înauntru. La vârf se afla gaură optică, pe unde patrunde nervul optic în craniu și trece în creier prin caile optice.

Baza acestei piramide se află anterior la nivelul feței, de o parte și de alta a liniei mediane a craniului.

Orbita protejează globul ocular împotriva diferitelor agresiuni externe. Pe baza orbitei este asezat globul ocular, iar în rest orbita conține cei 6 muschi extrinseci care determină mișcările ochiului, vase, nervi și țesut adipos (grasos).

A doua anexa importantă sunt cele doua pleoape formațiuni cutaneo-musculo-membranoase, care protejeaza globul ocular împotriva agresiunilor (praf, fum, corpi straini etc.).

Aparatul lacrimal este anexa necesară lubrefierii corneei și conjunctivei prin secreția lacrimilor, care participă și la unele schimburi nutritive și la oxigenarea polului anterior al ochiului. Lacrimile contin și o substanța numită lizozim, care este un bacteriostatic ce menține echilibrul bacteriologic la polul anterior al ochiului.

Conjunctiva este o foiță foarte fină, roz-transparentă, care tapeteaza fața posterioară a pleoapelor apoi la baza lor se reflectă, formeaza un fund de sac și trece pe 1/3 anterioara a globului pâna la cornee.

Este o membrană bogat vascularizată și inervată, care protejează globul ocular contra oricărui corp strain, praf, fum etc. Mușchii extrinseci ai ochiului sunt 4 drepți (superior, inferior și externi) și 2 mușchi oblici, care toți participă la mișcările ochilor.

Ochiul astfel organizat, transmite prin nervul optic mesajul de la retină prin căile optice, care se încrucișează parțial în chiasma optică și trec în bandeletele optice, corpii geniculati extern, apoi în radiatiile optice, care se termină în scoarța cerebrală în scizura calcarină în zonele 17, 18, 19 Brodmann.

Infecțiile oculare pot afecta variatele structuri ale ochiului, orbitei și organelor accesorii de protecție.

Calea de pătrundere în ochi a agenților patogeni de natură bacteriană sau virală este diferită:

exogenă – prin plăgi perforante, traumatice sau chirurgicale, ulcere, corneene perforate;

prin transmitere de la țesuturile învecinate;

endogenă – cu punct de plecare de la un focar septic din organism sau în cursul unei boli infecțioase generale.

Traumatismele oculare de orice fel dau perturbări uneori grave ale funcției oculare. Astfel pot să apară hemoragii, creșterea tensiunii intraoculare, rupturi ale membranelor oculare (dezlipirea de retină) și chiar plăgi. Aceste șocuri traumatice de orice natură (lovitura cu mingea, pumn,obiecte dure etc.) determină sinteza unor substanțe în ochi, numite prostaglandine. Prostaglandinele tulbură funcțiile oculare, creând extravazări, exudate, edem cu întreruperea funcțiilor celulare, insuficiența oxigenării, care duc la scăderea vederii.

Precizăm ca numărul mare de îmbolnăviri oculare, mai ales la copii, nu afectează doar organul vederii, boala – produsă de un grup de agenți virali numit adenovirusuri – fiind cu mult mai extinsă.

Numeroase infecții determină distrugerea purulentă a unui țesut.

Traumatismele, ulcerațiile sporesc receptivitatea țesutului la infecție prin sumarea a cel puțin patru factori:

perturbarea irigării sangvine, care împiedică aportul de factori antimicrobieni și scade vitalitatea țesutului.

prezența țesutului necrotic;

hematomul, excelent mediu de dezvoltare pentru microorganisme;

corpii străini, care deprimă semnificativ fagocitoza și contaminează plaga cu microorganisme exogene.

Capitolul II

2.1. Condiția microbiologică – bacterii

Microbiota indigenă a pleoapelor o reflectă pe cea a tegumentului, cu particularități legate de dispoziția unităților pilosebacee și glandulare ale marginii libere la zona de tranzit tegument-conjunctivă.

Cele mai mari densități microbiene sunt realizate în unitățile pilosebacee și în orificiile glandulare.

Dominanți dintre agenții bacterieni sunt:

stafilococii coagulazo-negativi, organisme facultativ anaerobe, care colonizează orificiile pilosebacee și ale glandelor sudoripare, celulele scvamoase superficiale și firele de păr.

condiții prielnice se găsesc și pentru S. aureus în cursul portajului nazal, ajungând la nivelele citate anterior.

Specii de Propionibacterium, în special P. acnes, organisme anaerobe, colonizează mai profund structurile pilosebacee.

Levurile lipofile favorizate de prezența sebumului.

Bacilii difterimorfi.

Conjunctiva și corneea, deși expuse continuu contaminării cu microorganisme tegumentare, nmicroorganisme tegumentare, nazale sau vehiculate prin pulberi și corpi străini, rămân grație spălării prin secreția lacrimară antrenată de mișcările palpebrale cu încărcătură microbiană mai redusă.

Se poate izola foarte frecvent până la 94% din persoanele investigate, stafilococi coagulazo-negativi.

ocazional: apar bacili difteriomorfi, specii de Candida, stafilococi coagulazo-pozitivi, neisseri, streptococi, specii de Haemophilus, prendomonade, bacili antracoizi, fungi saprofiți și oportuniști.

rar: – bacterii anaerobe (sporulate sau nesporulate)

microbacterii saprofite sau condiționat patogene

fungi saprofi sau oportuniști:

Absidia

Aureobasidium

Exophiala

Complexitatea structurilor care compun globul ocular sau îl protejează se reflectă în varietatea entităților nosologice cauzate de cei mai diferiți agenți infecțioși prin mecanisme patogenice multiple și anume:

conjunctivitele și keratitele – sunt afecțiuni care frecvent se intrisecă din cauza continuității epiteliale (kerata – conjunctivite)

endoftalmitele – cauzate de infecția tunicei și umorilor globului ocular.

panoftalmitele – inflamația sclerei și a capsulei lui TENON .

Infecții ale pleoapelor:

dermatite;

blefarite;

hardeolum;

infecții ale aparatului lacrimal:

canaliculite

infecții ale sacului lacrimal (dacriocistite)

ale glandei lacrimale (dacrioadenite):

acute

cronice

celulite orbitare

infecții supurative:

circumscrise (abces)

difuze (flegmon)

Particularități privind prelevarea probelor

Prelevarea probelor pentru investigarea microbiologică a infecțiilor oculare se face în cabinetul de oftalmologie sau în sala de operație cu responsabilitatea oftalmologului.

În afară de instrumentarul de investigație clinică și operator și de facilitățile (soluție anastezică, lampă cu fantă, microscop operator) oftalmologul mai trebuie să aibă la dispoziție o trusă care cuprinde:

tampoane mici de vată cu fibră lungă, preferabil din alginat de calciu;

spatulă de platină;

ansă bacteriologică;

micropipete pentru aspirarea conținutului din sacul conjunctival

lame și lamele de microscop curate și sterilizate;

membrane filtrante Millipore;

lampă cu spirt;

o baterie cu medii de cultură pentru izolarea bacteriilor, microbacteriilor și fungilor;

Conjunctivitele

Spectrul etiologic – este foarte variat.

În afara agenților infecțioși menționați în tabelul de mai jos, inflamațiile mai sunt produse de variate alergene (polen, cosmetice), substanțe toxice, iradierea cu ultraviolete:

Tabelul nr. __1____

Semnificația clinică a agenților infecțioși în cazul pacienților depistați cu conjunctivite.

* Nu sunt incluse filariile cu tropism ocular, agenți infecțioși absenți în România.

Oftalmiile neonatale prezintă, dată fiind condiția contagiului și reactivității nou-născutului, oftalmia gonococică, principala cauză de orbire de altădată, este azi controlată prin administrarea intraconjuctivală la naștere a soluției de 1% nitrat de argint, iar Chlamydia trachomatis serovarul D-K este în prezent cea mai frecventă cauză de conjunctivită la nou-născuți.

Investigația etiologică în conjunctivite

Înregistrează următoarele:

prezența / absența exudatului conjunctival

aspectul exudatului:

seros

sero-purulent

purulent

muco-purulent

fibrinos-pseudomembranos

aspectul mucoasei:

edemul

congestia

hemoragii

reacția foliculară

ulcerații.

2.1.1.PRELEVAREA PROBELOR

Pentru a asigura calitatea probelor se prelevează înainte de :

toaleta feței, care îndepărtează din secrețiile și exudatul conjuctival;

terapia antimicrobiană, topică sau sistematică, pentru că reduce șansa izolării agentului infecțios;

corticoterapia care modifică citologia;

aplicarea soluțiilor de fluoresceină, care denaturează colorațiile imunofluorescente;

machiajul, care face dificil examenul citobacterioscopic.

Se examinează după caz următoarele:

exudantul acumulat în sacul conjunctival și pe suprafața ambelor conjuctive palpebrale, prelevat pe tampoanele umectate cu bulion nutritiv;

exudatul seros sau sero-purulent aspirat, prin capilaritate, cu micropipeta din sacul conjuctival;

raclatul, realizat cu spatula de platină sterilă separat de pe conjuctivita tarsală superioară și inferioară. La aprecierea oftalmologului, această metodă (agresivă) poate fi înlocuită cu amprente citologice (HERSHENFELD și colab., 1981), respectiv prin amprente pe membrane Millepore pentru cultivare (LIOLET, 1994).

probe de ser, precoce și tardiv, pentru serodiagnosticul conjuctivitelor chlamidiale și virale.

Se efectuează extemporaneu frotiuri pentru colorații GRAM și GIEMSA sau colorații speciale (e.g., PAS, imunofluorescență) și totodată se însămânțează extemporaneu probele pentru izolarea bacteriilor, apoi se expediază la laboratorul de referință, în medii de transport adecvate pentru izolarea chlamidiilor și a virusurilor.

2.1.2.MICROSCOPIA

În secreția conjuctivală normală observăm:

celule descuamate integre sau pe cale de liză;

rare leucocite polimorfonucleare mai mult sau mai puțin alterate;

rare macrofage;

prezenți coci, bacili difteriomorfi, în cantități mici;

ocazional levuri rotunjite sau înmugurite.

Particolele brune cu diametre variabile provin de la rimel, iar particolele gălbui, cu diametrul de ordinul m provin de la pudră sau fond de ten.

FROTIU COLORAT GRAM

Urmărește reacția inflamatorie, numărul și caracterele morfo-tinctoriale ale microorganismelor.

Prezența în cadrul reacției inflamatorii a bacteriilor monomorfe indică o conjuctivită bacteriană.

Diplococii gram negativ, în „boabe de cafea” cu dispoziție intracelulară, sunt sugestivi pentru o conjuctivită gonococică, dar rezultatul comunicat în acest stadiu rămâne prezumtiv și investigația trebuie comunicată pentru că:

circulă tulpini de gonococ producătoare de -lactamază și multiplu rezistent la antibiotice și de unde necesitatea antibiogramei;

sunt semnalate confuzii microscopice între conjuctivita neonatală cu Moraxella catarrhalis și oftalmia gonococică (GARVEY și REED, 1981, SPARK și colab., 1979) sau între Acinetobacter calcoaceticus, specie rezistentă la penicilină.

Numeroase levuri intra și extracelulare pot prezenta filamente miceliene ce indică o conjuctivită fungică.

FROTIU COLORAT GIEMSA

Exudatul, dar mai ales raclatul sau amprentele conjuctivale oferă:

detalii citologice fine;

prezența incluziilor (chlamidiene, virale);

prezența unor fungi particulari.

Celule epiteliale – superficiale, majoritatea apar mari, înalte, prismatice, iar cele profunde, mici, neregulate, poliedrice sau fuziforme.

Celule caliciforme:

sunt globuloase;

citoplasmă palidă, plină cu picături de mucus;

nucleul mai mult sau mai puțin deformat.

Reacția inflamatorie este dominată de polimorfo-nucleare neutrofile, în conjuctivitele bacteriene acute, proporția limfocitelor și a macrofagelor crește în conjuctivitele bacteriene cronice sau în conjuctivitele cronice cu etiologie nedeterminată, devenind celule predominante în conjuctivitele virale.

În conjuctivitele alergice observăm numeroase polimorfonucleare neutrofile și eozinofile, câteva macrofage și mastocite. Densitatea eozinofilelor este proporțională cu intensitatea semnelor clinice (după expunerea acută la polenuri).

În conjuctivitele chlamidiale – reacția inflamatorie este mixtă, cu polimorfonucleare neutrofile, limfocite și plasmocite. Caracteristice sunt incluziunile chlamidiale bazofile, compacte, care destind celulele epiteliale și le deplasează nucleul. Sensibilitatea depistării incluziunilor chlamidiale prin colorația GIEMSA este satisfăcătoare în conjuctivitele neonatale, dar semnificativ mai redusă în cazul adultului.

În trachom densitatea incluziunilor este mai mare în raclatul de pe conjuctiva tarsală superioară, iar în cazul conjuctivitelor comune în raclatul conjuctivei tarsale inferioare.

La pacienții cu conjuctivite adenovirale putem observa, fără a fi patognomonice, incluziuni intranucleare bazofile.

În conjuctivitele herpetice – apar celule gigantice multinucleare, cu citoplasmă balonizată.

Prin colorație cu hematoxilin – eozină, pot fi observate intranuclear incluzii Cowdrey tip A (incluziuni precoce eozinofile); întregul nucleu până la cromatina marginală, este ocupată de incluziunea colorată în albastru, dar nu se poate diferenția infecția cu virusul herpes simplex sau cu vs. Varicella – zoster.

Conjuctivitele determinate de Rhinosporidium seeberi, o infecție mai rară este diagnosticată numai microscopic, deoarece fungul nu a fost cultivat încă. Proba trebuie prelevată sub microscopul operator pentru că fungul se dezvoltă profund în submucoasă, sub formă de chiști; pe frotiu chiștii apar cu diametrul = 10-200 m, amprentele gros, iar la maturitate sunt plini cu spori.

2.1.3. IMUNOFLUORESCENȚA

Este cea mai sensibilă și specifică metodă pentru diagnosticul rapid al conjuctivitelor chlamidiene, cu posibilitatea diferențierii serovarurilor trachomului de cele ale conjuctivitei cu incluziuni.

În cazul de suspiciune de conjuctivită tuberculoasă, trebuie făcută colorarea pentru depistarea bacililor acido-rezistenți: o colorație cu fucsină fenicată sau fluorescentă.

Principiul metodei:

În principiu, o reacție de precipitare se poate efectua și în celule. Aplicând

pe un preparat microscopic o soluție de anticorpi, aceștia vor reacționa cu

antigenele corespunzătoare din celule, dând naștere unui microprecipitat. După

localizarea microprecipitatului se pot trage concluzii în legătură cu distribuția

intracelulară sau intercelulară a antigenului. Din păcate, cu o soluție obișnuită de

anticorpi nu se poate pune în evidență microprecipitatul, deoarece el nu are

proprietăți optice detectabile microscopic. Dacă însă de moleculele anticorpilor se

atașează o substanță fluorescentă, atunci microprecipitatul va manifesta o

fluorescență caracteristică în lumină ultravioletă. După distribuția fluorescenței în

celule, experimentatorul poate trage concluzii valabile în legătură cu localizarea antigenului studiat.

Imunoprecipitarea cu anticorpi fluorescenți se efectuează după următoarea

schemă generală: se obțin secțiuni microscopice din țesutul în care se urmărește distribuția unui antigen oarecare. Peste secțiunile montate pe o lamă microscopică se picură o soluție de anticorpi fluorescenți. După un anumit timp de contact, în care a avut loc reacția dintre anticorpi și antigenul corespunzător, se îndepărtează excesul din soluția de anticorp. Preparatul se examinează la microscopul cu fluorescență.

Metoda anticorpilor fluorescenți a fost concepută de către A.Coons între

anii 1942 și 1950. Destinată inițial localizării antigenelor în țesuturi și celule,

acestă metodă a cunoscut o atât de largă dezvoltare încât, în prezent, se aplică și la

detectarea anticorpilor specifici.

Detectarea antigenelor specifice se poate realiza printr-un procedeu direct

și unul indirect.

Procedeul direct constă în aplicarea anticorpilor fluorescenți peste preparatul microscopic care conține antigenul studiat (Figura 1a).

Procedeul indirect denumit și tehnica straturilor multiple este constituit din două etape. În prima etapă se tratează preparatul microscopic cu anticorpul specific

nemarcat (Figura 1a). Imunoprecipitatul format este făcut vizibil în etapa a două,

adăugând un anticorp fluorescent, preparat față de anticorpul specific nemarcat

(Figura 1c).

Cum anticorpul nefluorescent specific are caracterul imunochimic al

γ-globulinei, în etapa a doua se folosește de fapt un anticorp fluorescent anti

γ-globulinic.

2.1.4. CULTIVAREA

Însămânțările pentru izolarea bacteriilor și fungilor pot fi făcute extemporaneu pe un set de medii:

agar-sânge

agar-sânge anaerob (preredus)

agar-sânge șocolat

agar – Mac Conkey

agar Thayer Martin modificat

agar Sabouroud

Folosirea agarului-sânge șocolat îmbunătățit cu supliment nutritiv și selectiv pentru Neisseria suplinește mediul Thayer Martin modificat, iar cu sulpimente care conțin cisteină este utilizat în suspiciunea tularemiei oculare.

Dacă prelevarea a fost făcută prin amprente pe membrană Millipore, se decupează fragmentele pentru a fi însămânțate cu amprenta în sus, pe suprafața diferitelor medii de cultură.

Posibilitatea rară a conjunctivitei difterice, impune însămânțarea în paralel pe un mediu selectiv cu telurit de potasiu și în mediul de îmbogățire OST.

Probele în care urmărim Mycrobacterium tuberculosis, trebuie să ajungă la laborator ca atare pentru decontaminare înainte de însămânțare pe mai multe tuburi cu mediul Löwenstein-Jensen.

Expedierea către laborator a probelor pentru izolare cu virus sau chlamydia poate fi făcută inițial pe baza circumstanțelor clinco-epidemiologice sau a rezultatelor microscopiei directe.

Se vor incuba și se urmăresc zilnic culturile în raport cu exigențele de creștere ale agenților infecțioși posibil implicați; se vor înregistra caracterele de cultură, microscopice și biochimice de identificate preliminară.

Se comunică etapizat, depistarea microscopică, rezultatele izolării și identificarea preliminară a patogenilor primari ai conjunctivitei.

Semnificația etiologică a microorganismelor condiționat patogene din prelevatele conjunctivale este dificil de probat, mai ales când habitează și suprafețele învecinate (Leibovitz și colaboratori, 1976).

Se replică coloniile bine individualizate pentru a obține cultură pură necesară testelor definitive de identificare și antibiogramei izolatelor clinic semnificative deoarece tratamentul conjunctivitelor se face prin aplicații topice de coliruri sau de pomezi oftalmice cu penicilină, gentamicină, neomicină, tetracicline, cloranfenicol, rifampicină, bacitracină, nistatin, în funcție de izolate se testează sensibilitatea față de antibioticele incluse în aceste preparate comerciale și se comunică și sensibilitatea intermediară.

B. KERATITELE

2.2. Aspecte etio-patogenice

Inflamația corneei, keratita, poate fi rezultatul agresiunii infecțioase sau al celei antigenice.

Condițiile locale (e.g. lentile de contact, avitaminoză, anomalii ale marginii pleoapelor, hiposecreție lacrimară) favorizează microtraumatisme și traumatisme care deschid calea infecției, iar condiții sistemice (diabet, imunodeficiență, alcoolism, avitaminoză) favorizează invazia corneei de către agenți infecțioși chiar cu potențial invaziv redus cum sunt: Staphilococcus epidermitis, streptococi viridans.

Continuitatea epitelială permite extinderea infecției de la conjunctivă la cornee: kerato-conjunctivite, puține bacterii penetrează epiteliul corneean intact (Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum) dar virusurile cu tropism conjunctivo-corneean (herpesvirusurile, adenovirusurile, vs. Vaccinia) o fac.

Corneea poate fi invadată pe cale nervoasă în herpesul recidivant, herpes zoster, rabic.

Majoritatea keratitelor apar prin inocularea traumatică a agenților infecțioși care între 65-90% sunt bacterii, până la 80% din ulcerele corneene sunt determinate de S. aureus, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa; plăcile corneene, prin materialele vegetale, mai ales urmate de aplicații topice ale antibioticelor cu spectrul larg și steroizi favorizează infecția fungică.

Un grad de inflamație intraoculară se adaugă celei corneene și se ajunge la formarea de hipopion dar umorile oculare rămân uzual sterile până în stadiile mai tardive ale ulcerului corneean, când infecția se întinde la tunicile interne și umorile oculare.

Dacă semnele locale pot diferenția cheratitele virale de cele prin alți agenți infecțioși, diagnosticul diferențial în cadrul acestor grupuri impune examene microbiologice.

Varietatea agenților infecțioși, evoluția rapidă spre perforația corneei cu endoftalmită a unor infecții, ca acela cu N. gonorrhoeae, S. aureus, particularitățile de prelevare și volumul redus al probelor fac din investigația etiologică a cheratitelor și ulcerelor corneene un act de responsabilitate cu anumite particularități.

Taber nr. 2

Agenți infecțioși cauzatori de keratite (adaptare după Hirst și colaboratori, 1988, Jones și colaboratori 1981).

* Nu sunt incluse finariile cu tropism ocular absente în România

** Cauzează majoritatea ulcerelor bacteriene ale corneei.

2.2.1. INVESTIGAȚIA ETIOLOGICĂ A KERATITELOR

A. PRELEVAREA PROBELOR

Imediat după stabilirea diagnosticului clinic și al indicației pentru investigația microbiologică trebuie prelevate următoarele probe:

raclat, din mai multe arii ale ulcerului corneean prelevat cu spatule de platină sterilă, oportunitatea aplicării topice a unei soluții anestezice este hotărâtă de oftalmolog;

tampoane din fundul de sac conjunctival și de pe conjunctiva tarsală sau chiar raclat de pe conjunctiva tarsală dacă pacientul are kerato-conjunctivită;

probe biopsice (keratectomie supreficială sau biopsie corneeană) prelevate sub microscop în sala de operație, dacă examinarea prelevatelor mai puțin agresive a rămas neconcludentă.

MICROSCOPIA

Se efectuează extemporaneu preparate microscopice cu prelevatul depus direct cu spatula de platină pe lame de microscop sterile pentru:

Colorația GRAM, care permite bacterioscopia

Colorația GIEMSA, prin care se urmăresc incluziunile bazofile intracitoplasmatice chlamidiale sau efecte citopatice virale.

Preparat între lamă și lamelă montat în soluția 10% KOH, pe care urmărim prezența fungilor prin examinare cu obiectivul 10X și 40X la microscopul optic uzual cu lumină corespunzător diafragmată sau mai bine, prin microscopie în contrast de fază.

Alte frotiuri pot fi colorate imunofluorescent pentru a identifica C. Trachomatis sau virusuri, prin impregnație argenetică Groccot – Gomori pentru depistarea mai sensibilă și cu detalii morfologice a fungilor, cu fluorocrom sau fucsină fenicată pentru depistarea micobacteriilor.

Suspiciunea infecției cu Acanthamoeba impune microscopia imediată, în contrast de fază sau la microscopul uzual cu lumină suficient diafragmată, a preparatului între lamă și lamelă obținut prin suspensionarea raclatului corneean în soluție salină Page pentru amibe.

Micile piese biologice trebuie mai întâi triturate cu câteva picături de soluție salină Page, în omogenizator Griffith. Se poate efectua și un frotiu colorat trichrom sau cu sulfat feriamoniacal – hematoxilină.

Testul de gelificare al lizatului amibocitelor de Limulus polyphemus, este utilizat pentru depistarea rapidă a bacililor gram – negativi în raclatul corneean.

C. CULTIVAREA

Este indicată următoarea baterie de medii de cultură:

câte o placă cu:

sânge – agar

agar șocolat pe bază de infuzie de creier – cord (preîncălzite)

agar – sânge anaerob (preredus)

agar Sabouroud

o placă cu Löwenstein – Jensen.

Facultativ în funcție de prelevatul disponibil, poate fi însămânțat și un mediu diferențial lactozat.

Raclatul corneean trebuie însămânțat și etalat în spot, direct cu spatula de recoltare.

Acanthamoeba poate fi izolată prin cultivare cu E. coli, pe gel de agar transparent.

Spatula cu raclatul corneean trebuie descărcată într-o picătură de soluție salină pentru amibe depusă în centrul ariei preînsămânțate cu E. coli.

Probele de epiteliu corneean debridat din leziuni virale trebuie suspensionate în mediul de transport pentru expedierea la laboratorul de referință.

D. INCUBAREA

Se vor urmări culturile în raport cu exigențele lor de creștere ale agenților infecțioși posibili implicați. Se vor compara izolatele din prelevatul corneean și conjunctival pe baza caracterelor de identificare (cultură, microscopie).

Se comunică identitatea probabilă a agentului infecțios cu semnificație clinică (bacil – gram negativ, fung) și se procedează la repicare pentru a obține cultură pură necesară identificării definitive.

2.3. ENDOFTALMITE

2.3.1. Aspecte etio-patogenice

Sunt afecțiuni inflamatorii ale uvei și mediilor interne ale globului ucular. Cel mai frecvent au etiologie infecțioasă, dar pot fi și neinfecțioase, determinate de procese autoimune (oftalmia simpatică), de hematoame intraoculare, corpi străini aseptici și substanțe chimice rămase în ochi după intervenții chirurgicale.

Agenți infecțioși cauzatori de endoftalmită

Uveitele în care elementul infecțios este dominant sunt infecții exogene sau infecții prin contiguitate ori continuitate.

Infecțiile exogene – urmează inoculării unor microorganisme (bacterie sau fung) prin plagă perforată, plagă chirurgicală, ulcer corneean sau sclerol. Sunt o cauză importantă a endoftalmitelor.

Infecțiile endogene – agenții infecțioși (virusuri, bacterii, fungi, protozoare) provin dintr.un focar infecțios situat în altă regiune a corpului. Frecvent sunt metastatice, dar pot fi și expresia unei sensibilizări la agentul infecțios.

Infecții prin contiguitate sau continuitate

Propagarea infecției de la structuri vecine ochiului este rară. Sunt de reținut abcese orbitare, tromboflebita venelor orbitare, meningite cu propagarea infecției prin teaca nervului optic.

Conjunctivitele purulente, mai frecvent Keratitele sau scleritele determină iridociclite toxice, aseptice, deși apare hipopion.

Dintre endoftalmitele aseptice 65% sunt determinate de coci gram pozitivi, 24% de bacili și cocobacili gram negativi, 11% fungi.

Lentilele și umorile intraoculare sunt un mediu bun de cultură, de aceea la acest nivel se pot implanta agenți infecțioși și care determină infecții ale suprafeței conjunctivale, aceasta explicând incidența în circa 28% din endoftalmite a Staphylococcus epidermitis (Salvanet – Bouccara, 1989) sau varietatea fungilor implicați în infecții exogene.

2.3.2. INVESTIGAȚIA ETIOLOGICĂ A ENDOFTALMITELOR

A. PRELEVAREA PROBELOR

Examinăm:

prelevate endoculare

prelevate superficiale, conjunctivale

prelevate din focare septice extraoculare

Probele de sânge sunt utile pentru diagnosticul serologic în infecțiile virale, rickețiene, cu Toxoplasma sau cu nemathelminți.

Prelevări endoculare – se fac în sala de operație sub anestezie generală sau locală și includ:

Prelevarea camerulară: aspiratul prin puncția camerei anterioare;

Prelevări vitreene;

aspiratul prin puncția vitreană;

vitrectomia, este un gest terapeutic și diagnostic indicat în faza inițială a endoftalmitelor septice cu puroi endocular gros, vâscos. Siguranța și sensibilitatea examinării irigatului vitreean cresc dacă prelevarea se face pe membrană Millipore interpusă între sistemul de aspirație.

Prelevări superficiale

exudat din plaga oculară, cu sau fără fenomene de abcedare;

raclat sau probe biopsice din ulcerul corneean;

exudat conjunctival.

Prelevarea și examinarea exudatului conjunctival este necesară la pacienții cu risc pentru endoftalmită: ochi congestiv, obstrucția căilor lacrimale, purtători de lentile de contact, proteză la celălalt ochi.

Prelevări din focare septice extraoculare

Sunt indicate preoperator: probe din focare infecțioase dentare, ale sinusurilor paranazale sau alte focare septice la distanță.

Hemoculturi pentru bacterii și fungi

Probe de ser pentru investigarea unor posibile infecții virale, fungice sau a toxoplasmozei.

B. PRELUCRAREA PROBELOR

Se centrifughează 10 minute la 1000 – 2000 xg aspiratul camerular și aspiratul sau irigatul vitrean. Se decantează și utilizează sedimentul pentru examenul cito – bacteriologic / micologic.

Se reține supernatantul aspiratelor pentru dozări biochimice, depistare de antigene sau anticorpi.

MICROSCOPIA

Se efectuează din sedimentul probelor sau din puroiul vitrean frotiuri colorate GIEMSA, GRAM, PAS.

Colorația GIEMSA – împreună și cu alte teste poate orienta satisfăcător diagnosticul:

o reacție inflamatorie dominată de polimorfonucleare neutrofile intacte sau alterate pledează pentru etiologia bacteriană.

dacă bacterioscopia este negativă apare utilă dozarea glucozei și a acidului lactic în aspiratul vitreean, în endoftalmitele bacteriene glucoza din vitros scade mult sub c% de 70 mg/dl. Testul de gelificare a lizatului amibocitelor de Limulus este rapid și foarte sensibil pentru depistarea infecției cu bacterii gram negative ( ELLISON, 1978) în aspiratul camerular.

o proporție crescută a eozinofilelor este un semn al endoftalmitelor determinate de nematode, astfel depistarea prin tehnici ELISA a anticorpilor anti -Toxocara confirmă diagnosticul, iar la un nivel normal al lactic-dehidrogenazei poate exclude diagnosticul de retinoblastom.

Colorația GRAM – permite bacterioscopia cu diferențieri morfotinctoriale atât de necesare terapiei antimicrobiene de primă intenție.

Colorația PAS – sau impregnația argentică Grocott – Gomori, depistează cu o mai mare sensibilitate fungii.

Absența unui microorganism pe frotiul direct nu exclude însă etiologia microbiană.

CULTIVAREA

Prelevatele oculare se însămânțează pe o bacterie de medii care include:

o placă agar-sânge

agar șocolat pe bază de infuzie de creier – cord (preîncălzite)

agar – sânge anaerob (preredus)

agar Sabouroud

mai multe plăci cu mediul Löwenstein – Jensen.

De asemeni se utilizează pentru izolatele endoculare și un tub cu bulion tioglicolat îmbogățit.

E. INCUBAREA ȘI CITIREA PLĂCILOR

Se incubează și se urmăresc culturile în condițiile care satisfac varietatea agenților etiologici posibili.

Se compară izolatele din variatele prelevate însămânțate și se examinează în paralel cu cele de pe frotiuri, pentru a stabili cu mai multă siguranță semnificația clinică și se trece la identificarea acestora.

Se comunică etapizat rezultatele începând din momentul argumentării specifice a semnificației lor clinice (antibiogramă, gen, specie).

2.4 INFECȚIILE PLEOAPELOR

2.4.1 Aspecte clinice și etio-patogenice

Inflamațiile pleoapelor sunt afecțiuni frecvente. Clinic distingem:

impetigo;

dermatite;

blefarite;

hordeolum.

Blefarita – este inflamația marginii libere a pleoapei. Uzual este bilaterală și cu evoluție cronică. Poate fi expresia unei infecții, cauzată mai frecvent de stafilococi (S.aureus, S. epidermitis), posibil însă și de Pseudomonas aeruginoasa, Proteus mirabilis, Moxarella spp., virusul herpetic simplex sau molluscum contagiosum sau infestării cu Phthirius pubis, eventual Demodex spp., dar pot fi și alergii cauzate de cosmetice sau coliruri.

Hordeolum – este o infecție supurativă a glandei pleoapei – Zeiss, Moll (hordeolum extern) sau Meibomius (hordeolum intern) cauzată de stafilococi.

Alte forme de inflamație supurativă a pleoapei post traumatice sau prin propagare de la orbită, sinusurile paranazale.

Investigarea etiologică a infecțiilor pleoapei

PRELEVAREA PROBELOR

Se examinează:

tampoane de pe marginea liberă a pleoapelor afectate de blefarită, puroi din inflamațiile supurative.

Se epuizează tamponul cu exudatul din leziunile de blefarită pe o placă cu agar-sânge și se incubează cultura anaerob peste noapte la 37C. Se vor urmări izolatele predominante.

2.4.2 Infecțiile aparatului lacrimal

Aspecte clinice și etio-patogenice

Infecțiile interesează mai frecvent căile lacrimale decât glandele lacrimale.

Canaliculitele – se manifestă ca inflamații cronice mai mult sau mai puțin discrete cauzate mai frecvent de actinomicete (Actinomyces spp., Arachnia propionica), Malassezia pachidermatis, Fusobacterium spp.

Infecția cronică determină frecvent formarea de concrețiuni care se calcifică și obturează canaliculele lacrimale. Obstrucția canalului lacrimonazal este frecvent urmarea unor infecții din vecinătate (rinite, sinuzită maxilară, inflamații apicale dentare) și mai rar a traumatismelor accidentale sau operatorii la nivelul sinusurilor sau rădăcinilor dentare.

Favorizează infecții ale sacului lacrimal care pot fi cronice sau acute.

Dacriocistitele cronice – sunt cauzate mai frecvent de pneumonococi, asociații de stafilococi, streptococi și bacil piocianic. Ocazional pot fi implicate Actinomyces sp, Aspergillus spp sau Candida albicans, Chlamydia trachomatis.

Dacriocistitele acute – apar pe fondul obstrucției proximale și distale a căilor lacrimale: uzual prin tumefierea mocoasei sau dacrioliți în cursul dacriocistitelor cronice, ocazional în cazuri de sarcoidoză a sacului lacrimal sau traumatisme. Cel mai frecvent este Streptococcus pyogenes. Complicațiile pot să apară prin extinderea infecției:

ulcer cornean marginal;

dacriocistită cu fistulizarea sacului lacrimal.

Dacrioadinite acute – pot fi expresia unor metastaze septice în cursul septicemiilor sau bacterimiilor stafilococice, streptococice, tifoide, pneumococice, gonococice, mai rar traumatisme locale deschid calea infecției stafilococice sau streptococice.

La copii, dacrioadenitele acute bilaterale pot să apară în cursul parotiditei epidermitice sau mononucleazei infecțioase.

Dacrioadinite cronice pot să apară în :

tuberculoză;

silis;

lepră.

2.4.3 INVESTIGAREA ETIOLOGICĂ A INFECȚIILOR CĂILOR LACRIMALE

A. PRELEVAREA PROBELOR

La pacienții cu dacrioadinite acute unilaterale apărute pe fondul unei infecții sistemice se pot tenta hemoculturi. În formulele supurative se examinează puroiul obținut prin incizia de drenaj. De la copii cu dacrioadenite acute bilaterale apărute pe fondul unei febre cu simptomatologie sugestivă de parotidită sau mononucleoză infecțioasă și se prelevează probe pentru examenul virusologic sau serologic.

În caz de canaliculită se examinează exudatul restant pe sonda lacrimală și eventualele concrețiuni canaliculare.

De la pacienții cu dacriocistită, în funcție de forma clinică și decizia oftalmologului se examinează:

puroiul exprimat prin punctele lacrimale la palparea sacului lacrimal tumefiat (prelevarea pe tampon), puroiul prelevat prin incizia de drenaj a colecției saculare.

B. MICROSCOPIA – a puroiului, concrețiunilor sau pentru izolarea germenilor se vizează izolare bacteriilor piogene aerobe și anaerobe a actinomicetelor și fungilor.

Pentru a izola Malassezia pachidermatis se însămânțează prelevatele canaliculare pe pante de agar – Saboroud glucozat cu strat superficial de ulei de măsline, mediul poate fi selectiv și prin adaos de cicloheximidă. Se incubează tuburile la 30C sau 37C în poziție înclinată pentru a menține suprafața mediului sub stratul de ulei. Se urmăresc tuburile patru zile pentru apariția culturii.

2.5. VIRUSURILE

Noțiunea de virus

Virusurile sunt agenți infecțioși ai animalelor, omului, plantelor și bacteriilor care prezintă o serie de caractere specifice care se deosebesc de bacterii.

Tipul de organizare

Virusurile au o organizare acelulară, spre deosebire de bacterii, care prezintă o organizare celulară de tip procariot.

Stări posibile de existență

Virusurile sunt paraziți intracelulari care pot exista sub două forme distincte: intracelulară și extracelulară.

Forma extracelulară – în această fază virusul este numit virion, particulă virală sau corpuscul elementar și corespund particulei virale mature, complete, infecțioase, cu un genom ADN sau ARN.

Virionul – este forma în care virusul se găsește la sfârșitul perioadei de replicare în celula gazdă și sub care eliberat în mediu extern.

Proteinele și ceilalți constituienți chimici protejează genomul viral de acțiunea distructivă a mediului extracelular, asigurând pătrunderea acidului nucleic viral într-o nouă celulă și inițierea ciclului de replicare intracelulară.

Pătrunderea virionului sau a acidului nucleic viral într-o celulă este numită infecție, iar celula respectivă infectată de virus și în care acesta se poate replica se numește celulă gazdă.

Stadiul intracelular

În acest stadiu are loc replicarea virusului, structura virionului fiind profund afectată în sensul că genomul viral este liber în celula gazdă și pregătit să se replice și să fie transcris.

Acest stadiu reprezentat de genomul viral liber, lipsit de înveliș proteic se numește virus vegetativ.

În anumite condiții, genomul viral aflat în faza intracelulară se poate integra în genomul celulei gazdă și această stare de existență se numește provirus.

Structura internă

Există două tipuri de virusuri:

virusuri nude (în sensul că nu au un înveliș extern), formate doar din genom viral (ADN sau ARN) și un înveliș proteic numit capsidă virală, care protejează acidul nucleic viral.

Ansamblul viral format din genom și capsidă se numește nucleocapsidă virală.

virusuri acoperite – au o structură mai complexă, nucleocapsida virală fiind acoperită de un înveliș extern, derivat din membrana celulei gazdă, odată cu eliberarea virionilor în mediul extracelular. În această membrană pot fi inserate glicoproteine codificate de genomul viral cum sunt: hemaglutininele și neuramimidazele.

Simetria moleculară

Virusurile prezintă în arhitectura capsidei o așezare a unităților morfologică de natură proteică după o simetrie:

icosaedrică;

helicoidală;

mixtă.

Compoziție chimică

Tipuri de acizi nucleici

Virusurile conțin în genomul lor un singur tip de acid nucleic fie ADN, fie ARN.

Conținutul în proteine

Virusurile au capsida virală formată dintr-un număr fix de molecule proteice, fie prezentând toate același tip de structură (compoziție identică în aminoacizi), fie un număr redus de tipuri structurale diferite.

O consecință a numărului mic de tipuri de proteine de la virusuri este că aceste proteine trebuie să prezinte o dispunere simetrică.

Echipamentul enzimatic

Virusurile sunt lipsite de metabolism, de echipamentul enzimatic de biosinteză și de catabolism, ca urmare ele nu-și pot face sinteza constituenților virali și nici să utilizeze resursele nutritive ale mediului (virusurile nu pot crește pe medii de cultură acelulare).

Structura virusurilor

Cu toată diversitatea deosebită ca talie și formă a virusurilor, acestea prezintă un mod general de structură, fiind alcătuit din doi constituenți esențiali: genomul viral și capsida virală și un constituent neesențial care poate lipsi la unele familii de virusuri, reprezentat de acel înveliș extern.

În contrast cu celulele bacteriene, la care genomurile sunt formate întotdeauna din molecule de ADN dublu catenare, genomul viral este alcătuit dintr-un singur tip de acid nucleic (ADN sau ARN), niciodată ambele.

Virusurile cu genom ADN

ADN monocatenar linear – întâlnit la fagul filamentos M13, la familia Parvoviridae, genul Dependovirus / virusuri asociate adenovirusurilor, virusuri defective care depind pentru a se replica de prezența în celule a adenovirusurilor sau a herpesvirusurilor.

ADN monocatenar circular evidențiat la fagul фx174, fagul filamentos f.d.

ADN dublu catenar, linear, cu secvențe terminale repetate identic (redundanță terminală) la bacteriofagul T7.

ADN dublu catenar, linear, cu secvențe terminale repetate în ordine inversă la adenovirusuri.

Aceste molecule de ADN dublu catenar linear pot fi circularizate cu ajutorul a două molecule de proteine de circularizare, care se leagă covalent la extremitățile 5’ ale ADN și interacționează între ele.

ADN dublu catenar linear cu redundanță și permutare circulară, întâlnit la fagii din seria T – par (T2, T4, T6).

ADN dublu catenar linear cu extremitățile 5’ monocatenare complementare, întâlnit la fagul λ.

ADN dublu catenar circular, covalent închis, caracteristic virusurilor din grupul Papova (papilom, polioma, vacuolizant – SV40).

2.5.1. Culturi celulare

A. Preparare – proprietăți

Culturile celulare reprezintă substrate de celule eucariote (animale) cultivate „in vitro”. Din punct de vedere tehnic, țesutul proaspăt recoltat este fragmentat cu ajutorul enzimelor proteolitice (uzual se folosește tripsine) până la obținerea unei suspensii de celule izolate. Acestea sunt reluate într-un mediu de creștere. Mediile pentru culturi celulare conțin ioni minerali, vitamine, extracte de hidroliză proteică sau aminoacizi, indicatori de pH. În țara noastră institutul Cantacuzino livrează mediile Eagle și IC-65. la mediu se adaugă un procent de ser de vițel (2-10%) în funcție de cultura celulară.

După reluarea suspensiei celulare în mediu de creștere, această suspensie se ajustează la o concentrație optimă de celule (10 / 10 celule / ml) și se repartizează în vas pentru cultură (tuburi de 160-16 mm sau flacoane tip Kolle, paralelipipedice, de 200 mm). Vasele se incubează la 37 C. Cultura celulară constă în atașarea celulelor pe suportul solid (sticlă) multiplicarea acestora, astfel încât, în final apare o pânyă celulară compactă (monostrat). În acest stadiu se utilizează curent culturile celulare pentru invoulări de produse, în vederea izolării de virusuri.

B. Categorii de culturi celulare

După țesutul – sursă, ca și după anumite caracteristici în cursul multiplicării „in vitro”, culturile de celule se împart în trei categorii: culturi primare din țesuturi adulte normale, linii celulare, continue sau tumorale, tulpini diploide.

Culturile primare din țesuturi adulte normale provin din țesuturi de animal adult (de obicei rinichi). Cultura prezintă caracterele genetice și morfologice ale țesutului sursă. Exemplu: cultura primară de rinichi de maimuță, rinichi de iepure, rinichi bovin etc.

Liniile celulare continue sau tumorale reprezintă culturi capabile de a fi transferate (pasate) indefinit „in vitro” (monostratul desprins cu tripsină și reluat cu mediu de creștere generează o nouă cultură). Celulele liniilor continue au ca țesut sursă fie o tumoare malignă umană sau animală, fie un țesut embrionar normal, care în cursul pasajelor „in vitro” a suferit o transformare spre malignitate. Liniile continue prezintă modificări profunde, morfologoce și genetice, comparativ cu țesutul sursă. Dintre liniile continue de origine umană, utilizate în diagnosticul virusologic, menționăm liniile Hels, KB etc.

Tulpinile diploide au ca sursă un țesut embrionar (om, maimuță etc.). culturile prezintă caracterele morfologice și genetice ale speciei și țesutului sursă, dar numărul de pasaje „in vitro” care se poate obține cu aceste culturi este limitat (pentru tulpinile diploide umane –40-60).

În practica diagnosticului virusologic se folosesc toate cele trei categorii de culturi celulare. Astfel, pentru izolarea enterovirusurilor se utilizează culturi primare de rinichi de maimuță sau tulpini diploide umane sau simiene. Pentru virusurile gripale și paragripale se folosesc culturile primare de rinichi de maimuță. Pentru adenovirusuri, substratul optim de izolare este reprezentat de liniile continue umane. Pentru izolarea virusurilor din grupul Herpes, cultura primară de rinichi de iepure este substratul de selecție.

C. Inocularea culturii celulare în vederea izolării virusului

Alegerea culturii se va face în funcție de categoria de virus a cărui izolare se urmărește. Curent pentru diagnosticul virusologic se folosesc culturi celulare în monostrat, crescute în tuburi. Se scoate mediul de creștere, se spală cultura în soluție tamponată izotona (PBS) și se inoculează produsul patologic (recoltat și prelucrat) pe câte două tuburi produs în volum de 0.2 ml / tub. Tuburile se incubează cu cultura în jo timp de o oră – două ore la 37C, după care se adaugă mediu de întreținere (Eagle, IC.65) fără ser de vițel (1.8 ml / tub). Culturile se incubează la temperatura optimă multiplicării virusului a cărui izolare o urmărim (37C pentru enterovirusuri, 33C pentru virusurile gripale și paragripale timp variabil cu examinare periodică a efectelor virus – specifice în cultură.

D. Efectele virus – specifice în cultura celulară

Prezența și multiplicarea virusului într-o cultură celulară se poate trăda prin mai multe efecte. Dintre acestea notăm: efectul citopatic, incluziile virale, efectul de hemasorbție, efectul de hemaglutinare, efectul transformant.

Efectul citopatic (ECP) este manifestarea cea mai frecventă a unui virus în cultura celulară și traduce modificările morfologice celulare consecutive multiplicării unor virusuri, care în acest caz se numesc virusuri citopatogene. ECP poate fi urmărit fie direct (examinarea culturii celulare la microscop inversat – obiectiv 10X, ocular 10X – pe baza modificărilor de refringentă a monostratului celular) fie pe preparate colorate (hematoxilină – eozină, Giemsa etc.). Curent se folosește examenul direct.

Aspectul ECP este foarte important și orientează diagnosticul. Astfel, enterovirusurile citopatogene (polivirusuri, virusuri ECHO, unele virusuri Cozsackie) determină un ECP distructiv (celule mari, globuloase, refringente în final desprinderea monostratului celular de pe peretele de sticlă). Unele virusuri respiratorii (virusrespirator sincațial, virusaparagripal tip 2) provoacă ECP de tip sincițial (mase mari multinucleate), adenovirusurile produs ECP în focar („În ciorchine”).

Incluziile virale reprezintă un efect virus – specific care se realizează fie timpuriu, în cazul virusurilor citopatogene, fie ca efect unic în cazul unor virusuri necitopatogene. Incluziile se evidențiază prin colorații speciale (Mann, Giemsa, Sellera etc). Un aport esențial în diagnosticarea rapidă a incluziilor virale l-au adus metodele moderne (fluorescența, citochimia). Aspectul incluziilor poate fi caracteristic pentru anumite virusuri în culturile celulare, ca în cazul reovirusurilor sau al virusurilor din grupul Herpes.

Efectul de hemadsorbție (HAD) constă în faptul că, pentru unii agenți virali, îndeobște necitopatogeni, multiplicarea lor în cultura celulară se evidențiază prin adăugarea pe monostratul celular, la 5-12 zile de la inocularea produsului patologic, a unei suspensii de eritrocite proaspete (0.5%) de cobai (sau alte specii) și examinarea culturii după 30 de minute de incubare. Efectul HAD se traduce prin atașarea fermă a eritrocitelor pe monostrat, datorită prezenței virusului la suprafața monostratului. Dintre virusurile hemadsorbante menționăm în primul rând virusurile paragripale și virusul rujeolei.

Efectul hemaglutinant (HA). Uneori o multiplicare virală în cultura celulară, neevidențiabilă prin alte metode, se însoțește de eliberarea în mediul culturii a particulelor de virus, care în prezența eritrocitelor proaspete se adsorb la suprafața acestora, determinând aglutinarea lor. Efectul de hemaglutinare a mediului culturii celulare în prezența eritrocitelor de cocoș este caracteristică pentru virusurile gripate și paragripale. Tulpini hemaglutinante se pot evidenția în culturile celulare inoculate cu virusuri ECHO sau adenovirusuri.

Efectul „transformant”. Deși mai rar întâlnit la virusurile umane, fiind apanajul unor virusuri ale maimuței sau rozătoarelor, efectul transformant s-a notat în anumite condiții la culturi de celule inoculate cu virusuri din grupul Herpes sau adenovirusuri. Acest efect constă în modificări ale morfologiei și proprietăților genetice ale celulelor (culturii de celule având drept sursă un țesut normal). Celulele virustransformate sunt capabilke să introducă tumori la animale imunosupresate.

Ou embrionat

Pentru diagnosticul virusologic se folosesc ouă de găină fecundate, proaspete, provenite din crescătorii necontaminate cu virusuri sau bacterii. Ouăle sunt incubate la 38C, 39C, în atmosferă umedă de obicei în poziție crizomtală, cu întoarcerea zilnică a lor, în jurul axului lung, cu 45. Ouăle embrionate se inoculează între 7-15 zile obișnuit la 10-12 zile.

Înainte de inoculare, ouăle sunt examinate la evoscop (cameră de lemn, prevăzută cu bec și orificii, care să permită vizualizarea embrionului prin fascicolul luminos). Examinarea se face la întuneric, de preferință în termostat. Cu ocazia examinării, se elimină ouăle cu embrionul mort (lipsa mișcărilor acestuia, existența unui cerc vascular în jurul embrionului).

La ouăle alese pentru lucru se marchează cu creionul, pe coajă, limitele camerei cu aer și locul embrionului (întotdeauna acesta este așezat mai aproape de una din zonele suprafeței laterale).

E. Inocularea ouălor pentru izolarea virusurilor

Produsul prelucrat va fi inoculat în volum de 0.2 ml, cu ajutorul unei siringi de 0.5 – 1 cmc și la care s-a adaptat un ac subțire cu bizoul scurt. Înainte de inoculare, locul unde urmează să se introducă acul, la nivelul cojii este badijonat cu soluție antiseptică (alcool 75%) sau alcool iodat. În funcție de virusul a cărui izolare se urmărește inocularea poate fi: pe membrana cerioalantoidiană intraamniotică, intrasalantoidian. Indiferent de calea de inoculare, după introducerea produsului și retragerea acului, orificiul se închide cu o picătură de parafină sau ceară sterilă.

F. Inocularea pe membrana corioalantoidiană

Se face un mic orificiu în centrul camerei cu aer. Cu o pompă mică de cauciuc, se aspiră aerul și astfel membrana cerioalantoidiană se depărtează de membrana proprie a oului. Se închide cu parafină sau ceară sterilă orificiul și se efectuează un alt orificiu în zona laterală unde anterior sub evoscop se reperase embrionul (și se marcase un semn). Cu acul se pătrunde 1-2 mm sub membrana proprie a oului și se inoculează produsul. Orificiul se închide cu parafină sau ceară sterilă. Inocularea pe membrane cerioalantoidiană se folosește pentru izolarea unor virusuri din grupul pox (virus vaccin, virus variolic).

G. Inoculare intraamniotică

Procedeul A. Se efectuează un orificiu în centru camerei cu aer (sub controlul ovoscopic), uul fiind așezat vertical cu camera de aer în sus. Se pătrunde cu acul siringii 1-3 mm până la penetrarea membranei proprii și a membranei cerioalantoide (se simt învingerea unei mici rezintențe). Apoi direcția acului se schimbă oblic către locul unde se găsește embrionul și acul este introdus încă 1-2 cm până se simte o rezistență netă. Controlul introducerii în cavitatea amniotică este dat de faptul că embrionul prezintă o mișcare bruscă de retracție, iar la încercarea de mișcare ușoară a acului, mișcările acestuia antrenează și embionul. Se introduce produsul și se scoate brusc acul. Orificiul se închide cu parafină sau ceară sterilă.

Procedeul B. Este mai puțin folosit, dar prezintă avantajul că nu necesită obligatoriu controlul ovoscopic în timpul inoculării. Oul este așezat orizontal în suport, cu semnul care arată locul embnrionului (reperat ovoscopic în prealabil) în sus. Se efectuează un mic orificiu în coajă cu acul siringii vertical se pătrunde prin membrană și prin membrana corioalantoidiană până se simte o rezistență (embrionul). Se inoculează produsul și se trage acul brusc. Orificiul se închide cu parafină sau ceară sterilă.

Inocularea intraamniotică se utilizează frecvent pentru izolarea virusurilor gripale și paragripale.

H. Inocularea intraalantoidiană

Procedeul A. Se efectuează sub controlul ovoscopic. Oul este pus în poziție verticală, cu camera de aer sus. Se efectuează un orificiu în centrul camerei de aer. Se pătrunde cu acul siringii vertical 1-3 mm până la penetrarea membranei proprii și a membranei corioalantoidiene. Apoi se face o mișcare ușoară de schimbare oblică a direcției acului către partea opusă celei în care se găsește embrionul. Se introduce acul 2-3 cm până se pătrunde în cavitatea alantoidiană (cât mai departe de partea centrală a embrionului, pentru a evita perforarea sacului vitelin). Se introduce produsul și acul se retrage brusc. Orificiul se închide cu parafină sau ceară sterilă.

Procedeul B. Se poate și fără control ovoscopic. Oul este așezat orizontal cu semnul care marchează locul embrionului în sus. Se efectuează un orificiu la locul semnului. Se pătrunde cu acul siringii vertical până la penetrarea membranei proprii și a membranei corioalantoidiene (se simt învingerea unei mici rezintențe) și imediat (fără a ajunge la embrion) se inoculează produsul. Acul se retrage brusc și orificiul se închide cu parafină sau ceară sterilă.

Inocularea intraalantoidiană este utilizată paralel cu cea intraamniotică, pentru izolarea virusurilor gripale și paragripale.

I. Incubarea ouălor inoculate

Incubarea se face la temperaturi diferite, în funcție de virusul a cărui izolare se urmărește (37C pentru virusurile pox, 33C pentru virusurile gripale și paragripale). Timpul de incubare este variabil, între 4-7 zile, de la inoculare, tot în raport cu virusul a cărui izolare se caută.

J. Prelevarea produselor din oul inoculat

Oul este așezat vertical în suport, cu camera de aer în sus. Se aseptizează regiunea (alcool 75% sau alcool iodat) și cu o foarfece fină, sterilă, se decupează coaja exact la limitele camerei de aer. Se îndepărtează membrana proprie a oului și se examinează membrana corioalaptoidiană – (pentru aspectul macroscopic al leziunilor, în cazul de pildă al virusurilor din grupul pox). Pentru recoltarea lichidului amniotic, se perforează membrana corioalantoidiană, se apucă cu o pensă sterilă embrionul și cu siringa cu acul oblic spre partea dorsală a embrionului se puncționează sacul amniotic și se aspiră lichidul. Cu o altă seringă, păstrând embrionul în pensă, se pătrunde spre partea ventrală a acestuia, cu acul siringii sau cu o pipetă cu vârful efilat, cât mai aproape de sacul vitelin (atașat strâns de embrion) și se aspiră lichidul.

2.6.Diagnosticul de laborator al infecțiilor micotice

Micozele sunt afecțiuni foarte răspândite în patologia umană. Agenții etiologici ai micozelor pot fi clasificați după criteriul localizării și bolii pe care o provoacă în : agenți ai micozelor superficiale (dermatofiți) – genurile Microsporum, Tricophyton, Epidermophyton, Candida albicans, Aspergillus fumigatus; agenți ai micozelor profunde sau sistemice – actinomicete (aerobe și anaerobe), Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis.

Micozele constituie o grupa mare de boli de piele, extrem de frecvent întâlnită. Micoza este boala omului modern, îmbrăcat în fibre sintetice și încălțat în plastic. Căldura verii și transpirația exacerbează acest tip de îmbolnăvire. Dintre micoze, epidermofitia palmoplantară sau altfel spus ciuperca degetelor, este cea mai răspândita. Debutul se produce cel mai adesea în ultimul spațiu dintre degetele picioarelor, cu piele macerata albicioasa, sub care se găsește eritem fisurat. Seara când se descalță, bolnavul suferă de mâncărimi și miros neplăcut. Alteori apar vezicule în scobitura și pe marginile tălpii, dar și pe fetele laterale ale degetelor mâinilor. În unele cazuri, acestor doua forme le urmează descuamația plantară, hiperkeratoza, fisuri dureroase, uneori infecție și zemuire, ba chiar și imposibilitatea de a merge. Afecțiunea se întâlnește mai des la sportivi, la cei care lucrează în cizme de cauciuc, fiind favorizata de transpirație. Ciupercile trăiesc pe pereții bazinelor de înot, pe echipamentul sportiv, pe grătarele din băile publice și în solul de suprafața. Încălțămintea din înlocuitori de piele, cu talpa de cauciuc, plastic și mai ales cea tip "Adidas" favorizează înmulțirea acestor ciuperci. Ce puteți face dumneavoastră pentru a nu ajunge la doctor? După spălarea și uscarea piciorului, tamponați spatiile dintre degete cu o soluție de alcool iodat, purtați ciorapi din bumbac și încălțăminte comodă de piele.

O altă localizare frecventa a micozelor este cea inghinală, adică în treimea superioara a coapsei, intre picioare. Ciuperca se manifesta prin placarde roșii, cu extindere periferică, având suprafața de cele mai multe ori scuamoasă, marginea netă și dantelată, uneori ușor reliefată și cu mici vezicule. Erupția se poate extinde spre organele genitale, provoacă mâncărimi și este contagioasă direct sau prin intermediul obiectelor folosite în comun. Pentru a preveni îmbolnăvirea, purtați lenjerie din bumbac, evitați pantalonii foarte mulați și nu folosiți prosoapele în comun. Când apar primele semne de îmbolnăvire, medicul dermatolog este cel care vă va recomanda tratamentul cel mai potrivit.

Din punct de vedere morfologic și al modului de înmulțire, agenții micozelor (fungii) pot fi împărțiți în: mucegaiuri și levuri (drojdii). Ambele categorii prezintă o parte vegetativă, numită tal. Mucegaiurile conțin filamente sau micelii adevărate (hife), constând din tuburi alungite, uneori ramificate, cu sau fără septe intercalate. Levurile (Candida) se deosebesc prin faptul că filamentele lor sunt pseudomicelii, fiind formate în procesul de înmulțire a celulelor (înmulțire asexuată).

2.6.1. Diagnosticul de laborator al candidomicozelor

Etapele diagnosticului de laborator sunt: recoltarea produselor patologice, examenul microscopic direct, izolarea, identificarea (pe baza caracterelor de cultură, morfologie și biochimie).

1. Recoltarea produselor patologice

Candida albicans poate fi incriminată în afecțiuni diverse, de la micoze cutanate – intertrigo – p’nă la stomatite, vulvo – vaginite, uretrite, enterite și chiar abcese purulente. Produsele patologice vor fi constituite, deci, în funcție de suspiciune clinică, din: fragmente de leziune cutanată (recoltare cu spatulă fină, prin recoltare), secreție vaginală, secreție uretrală (recoltare cu ansa bacteriologică), materii fecale (recoltate cu tamponul sau cu ansa bacteriologică), secreție nazofaringiană și fragmente de leziune de pe mucoasa bucală (recoltate cu tamponul), puroi (recoltat cu ansa sau tamponul) etc. Produsele sunt examinate direct și concomitent însămânțate pe medii de izolare.

A. Examenul microscopic direct

Acest examen, direct din produsul patologic, are numai valoare orientativă. Se efectuează fie pe preparate proaspete (examinare între lamă și lamelă a unui fragment de leziune sau a secreției), fie pe preparate colorate (frotiu, efectuat după modelul frotiului bacteriologic, fixat la flacără și colorat cu albastru de metilen). Examenul direct evidențiază prezența pseudomiceliilor înmugurite, rareori și a clamidosporilor (formațiuni sferice, cu pereții groși, situate în interiorul pseudomiceliilor).

B. Izolarea

În vederea izolării Candidei albicans, produsul patologic este însămânțat pe medii de izolare.

Dintre mediile de izolare, cea mai largă răspândire o are mediul Sabouraud (solid sau lichid), care conține glucoză sau maltoză în concentrație de 2%. Dăm mai jos formula mediului Sabouraud (gelozat):

Glucoză sau maltoză brută 20 g

Peptonă bacteriologică 1 g

Geloză fibre 2 g

Apă 1000 ml

Pentru alți agenți micotici, concentrația de glucoză sau maltoză poate fi dublată (4% în loc de 2%).

Mediul Sabouraud este suplimentat, pentru protecția împotriva dezvoltării florei bacteriene biogene, fie cu cloramfenicol 500 gama / ml., fie cu un amestec conținând penicilină 500 U.I. / ml și streptomicină 500 gama / ml. În vederea izolării Candidei albicans din leziunile cutanate, mediul de izolare este suplimentat și cu actidionă 0.5 mgr / ml, pentru inhibarea dezvoltării fungilor saprofiți. Adăugarea antibioticelor la mediul solid se face înainte de răcire (când amestecul gelozat este la temperatura de 45 – 50C), apoi mediul este turnat în tuburi și se lasă să se solidifice în poziție înclinată.

Însămânțarea produsului patologic pe mediile de izolare, solide sau lichide, se face după modelul însămânțării produselor în diagnosticul bacteriologic (cu ansa, tamponul sau pipeta). Mediul însămânțat se incubează la 37C.

C. Identificare

Identificarea se face pe baza caracterelor de cultură, morfologice și biochimice. În vederea unei identificări corecte, după izolarea Candidei pe mediul de izolare (Sabouraud) este bine să se facă o trecere (reînsămânțare) pe medii de identificare (mediu Sabouraud solid sau lichid), la care se adaugă extracte vegetale ca: extract de malț, extract de porumb, amidon de porumb, amidon de cartof, extract de orez (dar nu ca atare, ci în diferite combinații).

D. Identificarea pe baza caracterelor de cultură

După însămânțarea pe mediile de izolare și de identificare se vor urmări mai multe aspecte și anume: intervalul de timp de la însămânțare până la evidențierea Candidei în mediu și aspectul mediului (în cazul mediului solid, aspectul coloniilor: suprafață, relief, consistență, culoare).

După însămânțare, Candida albicans se evidențiază rapid (2 – 3 zile).

Pe mediul lichid, se observă: creștere cu tulburare uniformă a mediului, prezența depozitului și a vălului.

Pe mediul solid, coloniile de Candida prezintă o suprafață lucioasă, netedă, umedă, sunt de consistență cremoasă albe sidefii, ușor detașabile și degajă un miros caracteristic de drojdie de bere.

Dacă însămânțarea s-a făcut pe mediu Sabouraud solid suplimentat cu clorură trifeniltetrazolin (TTC), în concentrație de 0.1%, coloniile de Candida albicans apar incolore (spre deosebire de coloniile altor specii de Candida (C. Tropicalis, C. Guillermondi), care, reducând TTC, dau colonii de culoare roție sau roz. În cazul folosirii mediului Sabouraud lichi suplimentat cu TTC, mediul rămâne incolor după dezvoltarea Candidei albicans, dar capătă o culoare roz în cazul dezvoltării altor specii de Candida.

E. Identificarea pe baza proprietăților morfologice

Dintr-o colonie de pe mediu de identificare solid se prelevă un fragment și se efectuează frotiu pe lamă, care se fixează și se colorează cu albastru de metilen (după tehnica de colorare a frotiului bacteriologic). Se examinează microscopic și se remarcă: celule levurice înmugurite, cu pseudomicelii. Dacă a fost efectuată o însămânțare pe un mediu special pentru clamidospori, examenul morfologic al frotiului poate evidenția prezența clamidosporilor: spori voluminoși, rotunzi, cu citoplasma densă și peretele gros (dublu contur). Prezența clamidosporilor este un element foarte important de diagnostic diferențial, în sensul că din genul Candida, singurele specii care prezintă clamidospori sunt Candida albicans și Candida stelutoidea, speciile saprofite uzuale nedând clamidospori în cultură.

Un test de identificare morfologică rapidă este urmărirea filamentizării (germinării) rapide. Un fragment din colonia crescută pe un mediu solid de identificare este suspendat în 0.5 ml ser uman, ser de iepure sau albuș de ou și se incubează timp de 4 ore la 37C. După expirarea perioadei de incubare, se face un preparat proaspăt între lamă și lamelă și se examinează la microscop. Diagnosticul este pozitiv pentru Candida albicans dacă se observă, alături de celulele propriu-zise (rotunde), filamente (pseudomicelii) care dovedesc producerea fenomenului de înmugurire „in vitro”.

F. Identificarea pe baza proprietăților biochimice

Identificarea biochimică testează capacitatea candidei albicans de fermentare a unor zaharuri, de asimilare a carbonului și de asimilare a azotului.

Fermentarea unor zaharuri. Se folosește apă peptonată 1% la care se adaugă în proporție de 1% următoarele zaharuri (separat pentru câte un rub cu mediu câte un zahar): glucoză, galactoză, maltoză, zaharoză, rafinoză. Se suplimentează fiecare tub cu un indicator (de obicei albastru de bromtimol). Tuburile cu mediu pot fi tuburi cu dimensiuni obișnuite (12 / 120 mm), închise însă, după însămânțare, cu câte un strat de parafină caldă, sau se pot folosi alte sisteme: tuburi tip Yvan – Hall (cu bilă), tuburi tip Durhan (cu o strangulație pe traiectul tubului) etc. După însămânțarea fragmentului de colonie, se incubează seria de tuburi un timp 3-4 zile la 37C. Rezultatul este pozitiv (fermentație prezentă), dacă indicatorul virează spre acid (galben, în cazul albastrului de bromtimol) și dacă se produce gaz (în cazul metodei cu parafină, stratul de parafină este împins în sus). Metoda diferențiază Candida albicans, care fermentează glucoza și maltoza, de alte levuri, după cum urmează:

Asimilarea carbonului (auxanograma pentru carbon)

Se testează capacitatea levurii de a asimila unele zaharuri. Se folosește în acest scop mediu solid gelozat, care conține fosfat monopotasic și sulfat de amoniu. Procedeul este următorul: pe o plasă Petri se depune 1 ml suspensie Candida (obținută dintr-o colonie suspendată în soluție clorurosodică izotonă sau direct de pe mediu lichid). Mediul, încălzit în prealabil la 40 – 45C, este turnat deasupra și se lasă să se solidifice. După solidificare, pe suprafața mediului, se aplică 6 rondele de hârtie de filtru, care au fost mai înainte îmbibate cu câte o soluție 10% din următoarele zaharuriȘ glucoză, galactiză, lactoză, maltoză, zaharoză, rafinoză. Se incubează timp de 24-48 de ore la 37C. Prezența asimilării se traduce prin apariția unei zone de creștere a culturii în jurul rondelei cu zahărul asimilat.

2.6.2. Asimilarea azotului (auxanograma pentru azot)

Se testează capacitatea levurii de a asimila azotul din compuși anorganici și organici. Se folosește același mediu ca și la auxanograma pentru carbon dar cu grija de a spăla în prealabil foarte bine geloza (de trei ori pentru a îndepărta orice urmă de azot) și cu deosebirea că nu se adaugă în mediu sulfat de amoniu. După însămânțarea culturii după procedeul expus mai sus, se aplică pe suprafața mediului 6 rondele îmbibate în următoarele substanțe (concentrație 1%): peptonă, asparagină, triptofan, sulfat de amoniu, nitrat de potasiu (pentru uree este mai bine să se folosească o placă Petri separată, datorită difuzibilității mari a substanței în mediu). Plăcile se incubează 24 – 48 de ore la 37C. Asimilarea azotului este prezentă dacă în jurul rondelelor apare o zonă cu cultură densă.

Asimilarea nitratului de potasiu și a ureei diferențiază speciile de Candida între ele, deoarece celelalte substanțe sunt asimilate de toate speciile.

Auxanograma pentru carbon

Auxanograma pentru azot

Schema sintetică a diagnosticului de laborator în Candidomicoză

recoltarea produsului patologic

examen microscopic direct (orientativ)

izolare (medii de izolare solide sau lichide)

identificare (pe medii de identificare):

proprietăți de cultură

proprietăți morfologice

proprietăți biochimice (fermentare zaharuri, asimilare carbon, asimilare azot)

Diagnosticul de laborator al actinimicozelor

Etapele diagnosticului actinimicozelor coincid cu cele expuse pentru candidomicoze, cu unele deosebiri. Ele sunt:

recoltarea produselor patologice

examenul microscopic direct (izolarea pe medii de cultură aerobe și anaerobe)

identificarea (pe baza caracterelor de cultură și morfologice)

2.6.3. Recoltarea produselor patologice

Leziunile profunde date de actinimicete pot fi constituite fie de abcese fie de nodulii actinimicotici.

În cazul abceselor, se recoltează puroi prin puncție. Puroiul prezintă un aspect macroscopic caracteristic, fiind format din grunji mari.

În cazul nodulilor actinimicotici, recoltarea se face prin biopsie.

A. Examenul microscopic direct

Puroiul poate examinat prin prelevarea din masa de puroi cu ajutorul ansei a grunjilor, spălarea lor în ser fiziologic (într-un cristalizator mic sau lamă). Examenul microscopic se face fie punând grunji ca atare, între lamă și lamelă, fie după sfărâmarea grunjilor. Aceasta se efectuează astfel: se iau două lame de microscop, se flambează și după răcire, se depun pe una din lame câțiva grunji de puroi. Cu cealaltă lamă situată oblic, în poziția folosită pentru efectuarea frotiului de sânge, se execută o mișcare ușoară de glisare cu marginea, astfel încât grunjii să fie destrămați și masa lor etalată pe suprafața lamei de dedesubt.

Examenul microscopic se efectuează fie pe preparat proaspăt, fie pe preparat colorat cu Gram. Aspectul unui grăunte de puroi, mai ales pe preparatul colorat, este caracteristic. În centru se găsește o masă gelatinoasă, numită „tuf actinomicotic” (Gram – pozitiv) care conține filamente subțiri (până la 1 micron grosime), nesepetate, ramificate. Unele elemente sunt pseudobacilare, altele cocciforme, altele în unghi drept (rectangulare), iar altele se termină în formă de măciucă (conidie). Acest aspect se deosebește de cel al altor fungi care dau micoze profunde (fungii imperfecți sau ascomicetele), cu filamente groase, septate înglobate într-o substanță interstițială abundentă care se disociază foarte greu. În jurul „tufului”, se observă numeroase leucocite (cu predominență granulocitelor neutrofile și limfocitelor).

Nodulii actinomicotici, prelevați prin biopsie, sunt examinați imediat prin secțiunea la gheață sau sunt fixați (formol, Bouin) etc și prelucrați după metodele histopatologice uzuale (fixare, deshidratare, includere în parafină, secționare, deparafinare, colorare cu hematoxilină – eozină, clarificare, montare). Aspectul histopatologic este foarte caracteristic, leziunea purtând numele de „micetom profund” sau „folicul actinomicetic”. În centru se găsește „tuful actinomicotic” cu filamente subțiri, neseptate, ramificate, unele cu conidii terminale. În jur, se observă o coroană de limfocite, precum și granulecite neutrofice și celule gigante.

2.6.4. Izolarea pe medii de cultură

Produsele patologice (puroi, trituat de modul), se însămânțează obligatoriu pe medii aerobe și medii anaerobe.

Medii aerobe. Se însămânțează cu ansa, prin metoda în striuri, pe medii solide Loffler, geloză glicerinată (Garraud), mediu solid Sabouraus.

Mediul Lofflor conține bulion și ser coagulat de cal sau bou.

Mediul gelozat glicerinat (Garraud) conține peptonă, glucoză, glicerină și geloză. Mediul Sabouraud a fost a fost descris la dg.candidomicozelor.

Medii anaerobe. Cu ansa bacteriologică se însămânțează în profunzime profunzime următoarele medii:

mediul Tarozzi (macerat de carne, peptonă, albuș de ou coagulat)

mediul bulion thiglicolat (mediu acoperit cu un strat de ulei de parafină)

geloză Veillon (în tuburi înalte)

Însămânțarea pe mediile aerobe depistează speciile aerobe de actinomicete (Nocarsia, Streptomyces). Însămânțarea pe mediile anaerobe are în vedere declararea speciilor anaerobe. (A. Israeli, A. Megeri, A. Liquefaciens, A. Cellulitis).

Incubarea mediilor aerobe și anaerobe însămânțate se face la 37C, timp de 5-6 zile.

2.6.5. Identificarea

Caractere de cultură

Pe mediile aerobe solide, speciile Nocardia și Streptomyces sau colonii după 5-6 zile de incubare. Coloniile sunt mari, cu suprafața neregulată (cerebriforme), aderente, pigmentate în roșu – brun.

Pe mediile anaerobe, speciile anaerobe (A. Israeli, A. Megeri, A. Liquefaciens, A. Cellulitis), determină aspecte diferite, în raport cu mediul. Pe mediul Tarozzi, se dezvoltă colonii albicioase, pufoase, fragile, la suprafața oului coagulat; în profunzimea gelozei Veillon, coloniile dezvoltate sunt albicioase, de aspectul bobului de linte.

Caractere morfologice

Din coloniile dezvoltate pe mediile aerobe sau anaerobe se fac frotiuri pe lamă, care se examinează, fie pe preparat proaspăt, fie după colorare cu Gram. Pe baza caracterelor morfologice se pot diferenția unele specii de actinomicete între ele, precum și față de fungii imperfecți (ascomicete).

2.7. Diagnosticul de laborator al infecțiilor cu germeni din grupul chlamydia (prezentare schematică)

Germenii din ord. Ricketiales, familia Chlamydia, ceea ce sunt agenți care pot parazita păsările sau oamenii. Dintre agenții patogeni din grup, care pot da afecțiuni la om, menționăm:

agentul psittacozei – ornitozei (contaminare umană de la papagal)

agentul granulomatozei benigne inghinale (boală venerică)

agentul trahomului

Diagnosticul de laborator se bazează atât pe examen direct, izolare și identificare, cât mai ales pe examen serologic și biologic.

2.7.1.Etapele diagnosticului de laborator al Chlamydozelor

A. Recoltarea produselor patologice

Limfogranulomatoză inghinală: produs de exudat ganglionar

Ornitoză – psittacoză: sânge (pentru izolare și pentru examen serologic), spută, exudat faringian, fragment plămân, cazuri letale)

Trahom: secreție conjunctivală.

B. Diagnostic bacteriologic

1. Examen direct: frotiu, colorat cu met. Gimenez (morfologie similară cu a rickettsiilor)

2. Izolare: inoculare cu embrionat (sac vitelin)

3. Identificare morfologică (frotiu din sac vitelin de ou inoculat cu produs, colorat cu met. Gimenez)

C. Diagnostic serologic: în ornitoză – psittacoză RFC cu antigen ornitozic

D. Diagnostic biologic: reacții de hipersensibilitate întârziată (intradermoreacția pentru ornitoză – psittacoză, intradermoreacția pentru limfogranulomatoză inghinală).

2.8. Diagnosticul de laborator al infecțiilor cu micoplasme

Micoplasmele, cu diferite specii umane și animale )Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma homini, etc.) sunt germeni la granița dintre bacterii și virusuri, fără perete celular propriu de sinteză proteică. Sunt paraziți strict intracelulari, ca și rickettsiile și chlamydiile.

La om pot determina diferite afecțiuni (pneumopatii, afecțiuni respiratorii acute necaracteristice). De o mare importanță este contaminarea cu micoplasme a culturilor celulare folosite în diagnosticul de laborator al unor viroze și la prepararea unor vaccinuri virale. Această contaminare poate proveni de la țesutul sursă al culturii celulare., de la ingredientele mediului de creștere pentru culturi celulare, contaminate accidental în timpul manipulării de către purtători și mai ales din serul de vițel contaminat, introdus în formula mediului de creștere. De aceea, paralel cu diagnosticul afecțiunilor umane cu micoplasme, un rol deosebit îl are decelarea micoplasmelor în culturile celulare și în ingredientele folosite pentru prepararea acestor culturi. Diagnosticul de laborator constă în: examen direct și izolare pe medii sensibile, cu identificare morfologică ulterioară.

Etapele diagnosticului de laborator al infecțiilor cu micoplasme

A. Recoltarea produselor patologice: exudat faringian, spută, salivă, culturi celulare, medii pentru culturi celulare, ser de vițel pentru suplimentarea mediilor de creștere pentru culturi celulare, preparate de vaccinuri virale.

B. Diagnostic bacteriologic:

1. Examen direct – eventual examen electro (tehnica „colorării negative”)

2. Izolare – însămânțare pe medii speciale (PPLO) (pe bază de infuzie de inimă de bou, ser de cal și ext. drojdie) – incubare 30 de zile.

3. Identificare:

a. Propr. Cultură – colonii microscopice caracteristice emisferice, cu zonă centrală opacă, granulară, îngropată în grosimea mediului și o zonă periferică translucidă – aspect de ou prăjit.

b. Propr. Morfologice – frotiu, colorat cu met. speciale (pleomoerfism), examen electronooptic din colonie sau mediu însămânțat.

c. Propr. Serologice – testul de inhibiție a dezvoltării coloniilor, în prezența serului specific, imunofluorescență.

CAPITOLUL III

Materiale și metode

lotul de pacienți luat în studiu

Pentru a se studia incidența persoanelor cu afecțiuni oculare s-a lucrat pe un eșantion de 484 de persoane.

Datele necesare au fost culese din registrul de evidență al pacienților din cadrul spitalului județean Argeș – secția oftalmologie, ulterior fiind prelucrate.

Datele în studiu se referă la persoanele internate în perioada ianuarie 2002 – decembrie 2002.

Incidența infecțiilor oculare la populația județului Argeș în perioada anului 2002

Mai jos este prezentat graficul generat de tabelul de mai sus pentru a se putea observa mai bine statistica.

În perioada ianuarie 2002 – decembrie 2002, în cadrul populației din județul Argeș s-a înregistrat un număr de 484 cazuri de infecții oculare. Din acest total o pondere ridicată s-a înregistrat pentru germenele patogen Staphylococcus aureus (220 cazuri, prezentând în cele 4 trimestre variații diferite). La distanță mare se situează Staphylococcus haemolitic – 160 de cazuri virusuriale cu un total de 56 de cazuri, urmate de chlamidii cu 48 de apariții.

Incidența pe grupe de vârstă a infecțiilor oculare în populația județului Argeș în anul 2002.

Din volumul total de 484 de unități cercetate se observă că intervalul de vârstă 20-50 ani, prezintă o rată a incidenței ridicată – 401 cazuri, urmată la mare distanță de grupa de vârstă peste 50 ani respectiv 18-20 ani, cu incidență de doar 24 de cazuri.

Incidența pe sexe

Ponderea celor infectați este ridicată în rândul persoanelor de sex masculin – 347 cazuri, urmată doar de 137 de cazuri în rândul populației de sex feminin.

Incidența în funcție de mediu

În funcție de mediul persoanelor observate se constată din tabel o pondere ridicată a persoanelor cu afecțiuni oculare din mediul urban – 381de cazuri semnalate și numai 103 cazuri semnalate în rândul persoanelor din mediul rural.

Putem concluziona că aceste date cu privire la incidența infecțiilor oculare în funcție de mediu nu reflectă realitatea deoarece multe persoane din mediul rural nu se prezintă la control.

Bibliografie

1. Balbaie V., Pozsgi, Bacteriologie medicala, Editura Medicala, Bucuresti, 1985

2. Bals, M. G., Laboratorul clinic in infectii, Editura Medicala, Bucuresti, 1982

3. Buiuc Dumitru, Editura Didactica si Pedagogica, R. A. Bucuresti, 1998 – Vol. 1

4. Buiuc Dumitru, Microbiologie Medicala, Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1992

5. Ciufecu, E. S., Compediu de virusologie medicala, Editura Fundatiei Romania de Maine, Bucuresti, 1995

6. Coman I, Popescu O Micotoxine si micotoxicoze, Editura Ceres Bucuresti, 1985

7. Liolet S., Diagnostic Biologique des conjunctivites, Encycl. Med. Chir (France), Ophthalmologie, Eds. Techniques, 21-130-B-10, pp. 1-17

8. Manescu S, Microbiologie sanitara, Editura Medicala, Bucuresti 1989

9. Moisa Ioan, Microbiologie volumul 1, Editura Amco Press, 1998

10. Paul Cernea, Florica Constantin, Curs de Oftalmologie – Universitatea Craiova, 1979