Structura Proteinelor

Cuprins

1 Introducere……………………………………………………………….1

2 Clasificarea generală a protidelor

2.1 Clasificarea holoproteidelor…………………………………………..2

2.2 Clasificarea heteroproteidelor…………………………………………4

3 Structura proteinelor

3.1 Aminoacizi proteici…………………………………………….…20

3.2 Structura tridimensională a proteinelor……………………………24

3.3.1 Structura primară……………………………………………………….24

3.3.2 Structura secundară…………………………………………………….25

3.3.3 Structura terțiară………………………………………………………..29

3.3.4 Structura cuaternară…………………………………………………..30

4 Proteide cu funcții enzimatice

4.1 Enzime de natură holoproteidică……………………………………………31

4.2 Enzime de natură heteroproteidică………………………………………..33

4.3 Implicații ale enzimelor în procesele metabolice…………….….36

4.3.1 Degradarea aerobă a glucidelor (Respirația)…………….36

4.3.2 Biodegradarea glucidelor………………………………….48

4.3.3 Metabolismul aminoacizilor……………………………….52

5 Metode de separare și determinări cantitative ale unor proteine naturale

5.1 Metode de separare…………………………………………….…58

5.1.1 Separarea proteinelor prin electroforeză pe gel de agar.58

5.1.2 Precipitarea proteinelor……………………………………….……60

5.1.3 Fracționarea proteinelor dintr-un extract prin precipitări cu sulfat de amoniu………………………………………………………………61

5.1.4 Purificarea substanțelor proteice prin dializă……………….62

5.2 Metode de dozare a proteinelor………………………………….63

5.2.1 Dozarea azotului total și a proteinei brute (Metoda Kjeldahl)………………………………………………………………………………………….63

5.2.2 Dozarea proteinelor prin metoda biuretului……….……66

5.2.3 Dozarea proteinelor prin metoda Lowry……………………67

5.2.4 Dozarea activității peroxidazei……………………………………..70

5.2.5 Dozarea colorimetrică a catalazei…………………….…..71

6 Partea experimentală…………………………………………………………………….74

Bibliografie……………………………………………………………………78

1 Introducere

Proteinele alcătuiesc una din cele mai importante clase de substanțe organice care intră în structura organismelor vii și care prezintă importante funcții biochimice.

Structura lor complexă, rolul plastic și funcțional acordă substanțelor proteice (gr. proteios-primul, primordial) o poziție aparte față de celelalte componente ale materiei vii.

Datorită gradului înalt de organizare structurală, proteinele au variate și importante funcții în organismele vii. Viața nu poate fi concepută în structura membranelor celulare. Unele prezintă rol catalitic; toate enzimele sunt substanțe de natură proteică.

Unele îndeplinesc rol de transport și depozitare. Multe molecule mici și ioni sunt transportați de proteine specifice. De exemplu hemoglobina transportă oxigenul la eritrocite, în timp ce mioglobina, o proteină înrudită, transportă oxigenul în mușchi. Fierul este transportat în plasmă de transferină și depozitat în ficat sub forma unui complex cu feritina, o altă proteină. [1]

Proteinele sunt componente majore ale mușchilor. Contracția musculară este însoțită de mișcarea de alunecare a două tipuri de filamente proteice: actina și miozina. La nivel microscopic, astfel de coordonate, ca deplasarea cromozomilor în timpul diviziunii celulare, sunt produse de ansamblări contractile constând din proteine.

Elasticitatea pielii și a oaselor se datorează prezenței unei proteine fibrilare: colagenul (suport mecanic).

Anticorpii sunt proteine înalt specific, care recunosc substanțe străine (virusuri, bacterii, celule din alte organisme) și se combină cu ele (rol imunologic).

Proteinele joacă un rol important în generarea și transmiterea impulsului nervos. Răspunsul celulelor nervoase la stimuli specifici este mediată de proteine receptoare. De exemplu rodopsina este proteină fotosensibilă din celulule cu bastonașe ale retinei. Proteinele receptoare, a căror acțiune este declanșată de molecule specifice mici, ca acetilcolina sunt responsabile de transmiterea impulsului nervos către sinapse, joncțiunile dintre neuroni.

Ele sunt implicate și în stocarea și transmiterea caracterelor ereditare din generație în generație. Explicarea secvențială, controlată a informației genetice este esențială pentru creșterea și diferențierea celulară. Doar o mică fracțiune a genomului unei celule se explică la un moment dat. La bacterii, proteinele represoare sunt elemente de control importante în represia unor segmente specifice din ADN-ul celular. La organismele superioare, creșterea și diferențierea sunt controlate de factori de creștere proteici. Activitatea diferitelor celule din organismele pluricelulare este controlată de hormoni. Mulți dintre aceștia, ca insulina și hormonul tireostimulator sunt proteine.

Proteinele joacă în celule și rolul de senzori care controlează fluxul de energie și materie, altele intervin în procesul respirator sau în procesul de coagulare al sângelui.

Datorită multiplelor funcțiuni ale proteinelor și importanței lor pentru organismele vii, în lucrarea de față este studiată corelația între structura protidelor și principalele lor funcții biochimice.

2 Clasificarea generală a protidelor

Proteinele sunt produși de policondensare ai aminoacizilor, macromolecula lor fiind formată dintr-un lanț polipeptidic. [2]

În funcție de natura produșilor pe care îi formează prin hidroliză, proteinele se clasifică în:

– proteine simple (holoproteide), care prin hidroliză formează numai aminoacizi;

– proteine conjugate (heteroproteide), care prin hidroliză eliberează, pe lângă aminoacizi, una sau mai multe componente de natură neproteică (grupare prostetică).

2.1 Clasificarea holoproteidelor

Holoproteidele sunt molecule naturale cu roluri structurale și funcționale foarte importante în toate organismele animale și vegetale. Ele sunt caracterizate printr-un înalt grad de organizare structurală, fiind constituite numai din resturi de aminoacizi și prezentând mase moleculare ce variază aproximativ între și (sau chiar mai mari).

Datorită complexității structurii lor, clasificarea proteinelor nu se poate face după un criteriu unic. Astfel, în funcție de conformația lor tridimensională se clasifică în proteine globulare și fibrilare.

După caracterul lor chimic și după rolul lor, holoproteidele se clasifică în: albumine, globuline, prolamine, gluteline, histone, protamine și scleroproteine (protenoide). [3]

Albumine

Albuminele sunt proteine răspândite îndeosebi în regnul animal. Sunt solubile în apă și au un caracter acid.

În regnul animal, albuminele se găsesc în semințe, legumilina din leguminoase, leucozina din cereale, ricina din semințele de ricin.

În organismul animal albuminele se găsesc în ser. În plasmă, ele asigură presiunea coloid-osmotică a acesteia. Albuminele îndeplinesc rol și de vehiculanți ai unor substanțe importante: hormoni, săruri biliare, bilirubină, substanțe medicamentoase, a diferiților anioni și cationi.

Globuline

Globulinele sunt proteine cu caracter acid datorită prezenței acidului aspartic și glutamic în structura lor. Sunt răspandite în regnul animal (ser) și vegetal (semințe). În regnul animal se găsesc în lapte (lactoglobumina), în ou (ovoglobumina), în mușchi miozina precum și globuminele serice. În plasma sangvină globulinele alcătuiesc 35-40%. Ele au fost separate prin electroforeză în funcțiuniși globine, fiecare având proprietăți fizice, chimice și biologice diferite. Globinele serice au rol activ în transportul unor compuși chimici din organism cum sunt lipidele serice, glucidele, hormonii și alți produși de metabolism.

Prolamine

Prolaminele sunt proteine cu caracter acid conținând în proporții mari de acid glutamic, aspartic și prolină. Se găsesc răspândite exclusiv în regnul vegetal mai ales în semințele gramineelor. De exemplu în grâu se găsește gliadină, în porumb zeină, în orez hordeină, în ovăz oveina.

Gluteline

Glutelinele sunt proteine cu caracter acid. Au un conținut ridicat de acid glutamic, conțin lisină și în proporție mică triptofan. Valoarea alimentară a glutelinelor este mai mare decât a prolaminelor pe care de altfel le însoțesc în semințele gramineelor. De exemplu în semințele se grâu se găsește glutenina, în orez orizenina.

Histone

Histonele sunt proteine cu caracter bazic datorită conținutului ridicat în arginină și lisină, histidină și tripofan. Se găsesc răspândite în organismul animal, mai ales conjugate cu cromoproteide și nucleoproteide în nucleele celulelor, în spermă, în sânge. Au funcție importantă în reglarea activității genelor.

Protamine

Sunt proteine cu caracter bazic pronunțat, datorită conținutului mare (60%) în aminoacizi bazici (lizină,histidină, arginină). Protaminele se găsesc răspândite numai în regnul animal. S-au izolat din nucleele celulelor spermatice, din pește (clupeina, sturina) unde se găsesc combinate cu acizii nucleici sub formă de nucleoprotide.

Scleroproteine

Sunt proteine cu structură fibrilară de consistență solidă. Din această clasă fac parte: keratine, colagene, elastine, fibroine.

Keratinele sunt proteine cu rol de protecție, constituiente ale epidermei, părului, unghiilor, copitelor, coarnelor, lânei. Conțin în molecula lor o cantitate ridicată de sulf (2-2,7%) datorită cantității mari de cisteină. Keratinele prezintă o mare rezistență mecanică și chimică, neputând fi hidrolizate de agenți chimici obișnuiți și de enzime.

Colagenele sunt proteine ce constituie țesuturile conjunctive participând la structura tendoanelor, ligamentelor, oaselor, cartilagiilor, pielii. Au un conținut ridicat de glicocol, prolină și hidroxiprolină. Prin fierbere cu apa suferă o hidroliză parțială formând gelatina. Cu taninul, colagenele formează produse rezistente, neputrescibile, proprietate care stă la baza tăbăcirii pieilor. Colagenele reprezintă 50% din proteinele ce alcătuiesc corpul uman.

Elastinele sunt proteine care intră în structura fibrelor elastice din artere și tendoane fiind asemănătoere colagenelor. Spre deosebire de colagen, elastinele nu pot fi gelificate.

Fibroina este o proteină fibrilară din mătasea produsă de viermele de mătase. Are o structură asemănătoare cu -keratina.

2.2 Clasificarea heteroproteidelor

Heteroproteidele, numite și proteide conjugate sunt proteine formate dintr-o holoproteină și o grupare de natură neproteică numită grupare prostetică care se leagă de componenta proteică prin legături covalente, ionice sau alte tipuri de legături, cum sunt legăturile de hidrogen și legăturile prin forțe Van der Waals. [4]

În general legătura dintre partea proteică și gruparea prostetică este mai slabă decât legătura peptidică între resturile de aminoacizi ale componentei proteice. Prin hidroliză totală heteroproteidele pun în libertate aminoacizi și diferite grupări prostetice.

După natura grupării prostetice, heteroproteidele se clasifică în: fosfoproteide, glicoproteide, lipoproteide, cromoproteide, metaloproteide, nucleoproteide.

Posfoproteide

Fosfoproteidele au ca grupare prostetică acidul ortofosfor Protamine

Sunt proteine cu caracter bazic pronunțat, datorită conținutului mare (60%) în aminoacizi bazici (lizină,histidină, arginină). Protaminele se găsesc răspândite numai în regnul animal. S-au izolat din nucleele celulelor spermatice, din pește (clupeina, sturina) unde se găsesc combinate cu acizii nucleici sub formă de nucleoprotide.

Scleroproteine

Sunt proteine cu structură fibrilară de consistență solidă. Din această clasă fac parte: keratine, colagene, elastine, fibroine.

Keratinele sunt proteine cu rol de protecție, constituiente ale epidermei, părului, unghiilor, copitelor, coarnelor, lânei. Conțin în molecula lor o cantitate ridicată de sulf (2-2,7%) datorită cantității mari de cisteină. Keratinele prezintă o mare rezistență mecanică și chimică, neputând fi hidrolizate de agenți chimici obișnuiți și de enzime.

Colagenele sunt proteine ce constituie țesuturile conjunctive participând la structura tendoanelor, ligamentelor, oaselor, cartilagiilor, pielii. Au un conținut ridicat de glicocol, prolină și hidroxiprolină. Prin fierbere cu apa suferă o hidroliză parțială formând gelatina. Cu taninul, colagenele formează produse rezistente, neputrescibile, proprietate care stă la baza tăbăcirii pieilor. Colagenele reprezintă 50% din proteinele ce alcătuiesc corpul uman.

Elastinele sunt proteine care intră în structura fibrelor elastice din artere și tendoane fiind asemănătoere colagenelor. Spre deosebire de colagen, elastinele nu pot fi gelificate.

Fibroina este o proteină fibrilară din mătasea produsă de viermele de mătase. Are o structură asemănătoare cu -keratina.

2.2 Clasificarea heteroproteidelor

Heteroproteidele, numite și proteide conjugate sunt proteine formate dintr-o holoproteină și o grupare de natură neproteică numită grupare prostetică care se leagă de componenta proteică prin legături covalente, ionice sau alte tipuri de legături, cum sunt legăturile de hidrogen și legăturile prin forțe Van der Waals. [4]

În general legătura dintre partea proteică și gruparea prostetică este mai slabă decât legătura peptidică între resturile de aminoacizi ale componentei proteice. Prin hidroliză totală heteroproteidele pun în libertate aminoacizi și diferite grupări prostetice.

După natura grupării prostetice, heteroproteidele se clasifică în: fosfoproteide, glicoproteide, lipoproteide, cromoproteide, metaloproteide, nucleoproteide.

Posfoproteide

Fosfoproteidele au ca grupare prostetică acidul ortofosforic legat esteric de proteine prin intermediul gruparii –OH din serină.

Datorită restului fosforic din moleculă, fosfoproteidele au un caracter acid. În organismul animal se găsesc sub formă de săruri de calciu sau potasiu. Predomină în lapte și ouă. Principalele fosfoproteide din organismul animal sunt cazeinele, ovovitelinele și fosfovotelinele.

Cazeinele alcătuiesc principalele componente proteice ale laptelui. Se găsesc sub forma sărurilor de calciu sau potasiu, necuagulabile prin fierberea laptelui. Cazeinele sunt cuagulabile și hidrolizate parțial sub influența enzimelor chimiozina (renina) și pepsina din stomacul animalelor. Aceste fosfoprotide conțin în structura lor toți aminoacizii esențiali, laptele fiind un aliment cu valoare nutritivă completă. Fosfovitina din gălbenușul de ou se găsește de obicei legată de o fosfolipoproteidă bogată în fosfor și fier.

Glicoproteide

Sunt heteroproteide care au ca grupare prosterică un glucid.

Componenta glucidică a lor poate fi:

– un monozaharid (manoză, galactoză, xiloză, glucoză, fructoză);

– acizi urinici (D-glucinic);

– ozamine (glucozamină, galactozamină) sau derivați ai ozaminelor: acid neuramic, acid sialic.

Legătura dintre componenta glucidică și cea proteică poate fi: O-glicozidică sau N-glicozidică.

Glicoproteinele sunt răspândite mult în organism, fiind distribuite în diferite țesuturi, în glucoză, în sucul gastric. Ele intră în constituția unor hormoni (tiroidostimulant, foliculostimulant, luteinizant) și a unor enzime, mai ales din clasa transferazelor.

Glicoproteidele îndeplinesc roluri importante ca: constituienți plasmatici ai celulelor, substanțe protectoare față de agenții mecanici sau termici, inhibitori ai aglutinării hematiilor, componente specifice de grup sanguin și altele. Cantitatea de glucide care intră în alcătuirea lor variază între 1% și 60% din masa moleculei.

Glicoproteidele sanguine conțin 10-15% glucide. Glicoproteidele specifice de grup sanguin conțin o componentă glucidică formată din 10-15 oze și derivați ai acestora; sunt asociate cu sfingolipide și determină specificitatea de grup sanguin.

Lipoproteide

Gruparea prostetică este formată din lipide (fosfolipide, trigliceride, colesterol sau steride). Legăturile stabilite între lipide și partea proteică sunt de obicei de natură ionică și se stabilesc între grupe libere din proteine și grupe din colină sau între restul fosforic al fosfolipidelor și grupei din proteină. De asemenea între cele două componente: lipidică și proteică se pot stabili legături prin forțe Van der Waals.

Lipoproteidele sunt componente structurale ale celulelor, ale mitocondriilor, membranelor celulare, etc. În organismul animal îndeplinesc diferite roluri: constituienți celulari, participă la transportul unor substanțe liposolubile, etc.

Cele mai importante lipoproteide sunt cele din plasmă sau din serul sanguin separate prin electroforeză: chilomicronii, α- și – lipoproteidele cât și albuminele legate de acizi grași neesterificați.

Metaloproteide

În acest caz grupul prostetic este constituit dintr-un metal. Metalul sub formă ionică este legat complex prin stabilirea unor legături coordinative între metal și anumite grupări chimice (liganzi) ale componentei proteice. Metalul astfel legat de componenta proteică mai poate stabili și cu alți liganzi (cu molecule mai mici), formând un complex intern numit chelat. Metalele care intră în structura metaloproteidelor sunt: Fe, Cu, Mn, Ca, Mg, etc. Dintre metaloproteide, cele mai importante sunt cele cu rol enzimatic (ascorbatoxidaza ce conține Cu, anhidraza carbonică cu Zn), feroproteidele (feritina ce constituie rezerva de fier pentru hemienzime), siderofilina din plasma sanguină, cât și o serie de enzime ce conțin fier. [5]

Hemocianinele sunt heteroproteide cu cupru și reprezintă pigmenți respiratori din sângele moluștelor și artropodelor.

Ceruloplastina, metaloproteidă de cupru, are rol de transportor al cuprului în sânge, participând totodată la oxidarea acidului ascorbic.

Cromoproteide

Cromoproteidele sunt formate dintr-o holoproteidă și au drept componentă o substanța colorată. După natura chimică a componentei prostetice se clasifică în:

-cromoproteine porfirinice;

-cromoproteine neporfirinice.

Cromoproteide porfirinice

Această clasă de cromoproteide au drept componentă prostetică un nucleu porfirinic. Din punct de vedere chimic sunt importante cromoproteidele cu funcție respiratorie – hemoglobina, citocromii, citocromoxidaza, hemenzimele, cruorinele – și cromoproteidele fără funcție respiratorie – cloroplastinele și ficobilinele. [6]

Hemoglobina

Hemoglobinele sunt componente porfirinice, componente de bază ale hematiilor din sângele vertebratelor, având funcție importnantă în transportul de gaze ( și ) între plămân și țesuturi.

Din punct de vedere structural hemoglobina este formată dintr-o componentă proteică: globina, cu caracter bazic și o componentă prostetică: hemul.

Structura globinei

Globina este o proteină oligomeră constituită prin asocierea a patru catene polipeptidice (protomeri) asamblate într-o structură cuaternară.

Globina conține două lanțuri polipeptidice numite constituite din 141 resturi de aminoacizi și două lanțuri polipeptidice numite , constituite din 146 resturi de aminoacizi. Astfel globina este alcătuită din două subunități, fiecare subunitate are compoziția -tât lanțurile cât și au aproximativstructură helix. Legăturile dintre două lanțuri identice (cu și cu sunt de natură polară și se stabilesc de regulă între grupări terminale și . Legăturile între subunități diferite se realizează prin legături de hidrogen și prin forțe Van de Waals, stabilindu-se de-a lungul unei zone mai întinse din lanțurile polipeptidice.

Conformația celor patru catene polipeptidice ale globulinei (cu structură helicidală rigidă ce alterează cu porțiuni nespiralate flexibile) permite crearea în interiorul fiecăreia dintre acestea a unei cavități în care se găsește amplasată molecula de hem.

În sângele organismului uman au fost identificate mai multe tipuri de hemoglobine care diferă între ele prin structura primară a fiecărei catene polipeptidice, catene notate cu Prin asocierea acestor patru catene rezultă hemoglobine diferite notate cu Hba (Hb adultă), Hb(în proporție mică de 3-4%) și HbF (Hb fetală). [7]

Figura 1: Structura globinei

Componenta proteică a hemoglobinei: globina, diferă de la o specie la alta, ea conferă specificitatea de specie a hemoglobinelor. Hemul are aceeași structură pentru toate speciile.

Structura hemului

Structura hemului a fost stabilită atât prin degradare treptată a moleculei și identificarea produșilor rezultați cât și prin sinteză.

Hemul este format din protoporfirină în centrul căreia se află un ion de .

Protoporfirina este formată din patru nuclee pirolice legate între ele prin grupări metinice () rezultând un nucleu porfirinic. În protoporfirină, nucleul porfirinic este substituit cu radicali în pozițiile 1, 3, 5 și 8, cu radicali vinil în pozițiile 2 și 4 cu radicali în pozițiile 6 și 7.

În hem atomul de este situat în centrul nucleului protoporfirinic, fiind hexacoordinat. Cele patru inele pirolice ale protoporfirinei sunt coplanare, fiind în același timp coplanare și cu atomul de fier.

Măsurătorile magnetice pun în evidență o legătură ionică între ionul de și dianionul aromatic porfirinic rezultat prin îndepărtarea a doi protoni de la atomii de azot aparținând inelelor B și D. Din cele 6 legături coordinative pe care le posedă fierul, patru apar legate în același plan de cei patru atomi de azot ai nucleelor pirolice. A cincea este îndrepată de o parte a planului și face legatura cu molecula de globină prin intermediul atomului de azot al unui rest de histeină, iar a șasea legătură coordinativă este îndrepată de cealaltă parte a planului și poate fixa molecula de apă, oxigen sau dioxid de carbon. Prin intermediul moleculei de apă se poate stabili o nouă legătură cu molecula globinei. Hemul se mai poate lega de globină prin legături ionice stabilite între ionii carboxil ai celor două resturi de acid propionic și grupări din resturile de aminoacizi ai catenei polipeptidice din globină.

Figura 2: Structura hemului

Figura 3: Reprezentarea celor 6 legături coordinative ale

din hemoglobină

Între radicalii metil și vinil ai hemului și radicalii unor aminoacizi (triptofan, fenilalanină) din globină se găsesc legături prin forțe Van der Waals.

Proprietățile hemoglobinei

Funcția principală a hemoglobinei ( Hb ) este aceea de a transporta oxigenul molecular de la plămâni la țesuturi. Hemul se poate combina reversibil cu oxigenul formând un compus disociabil: oxihemoglobina.

+

Sensul deplasării echilibrului acestei reacții depinde de presiunea parțială a oxigenului. De exemplu în plămâni, la presiunea parțială mare a oxigenului se fixează în fiecare 100 mL sânge 19,6mL oxigen (echilibru deplasat spre dreapta) iar în țesuturi, la nivelul vaselor capilare la presiunea mică a oxigenului, echilibrul este deplasat în sensul descompunerii oxihemoglobinei. Astfel la fiecare 100mL sânge eliberează 7-9mL oxigen la nivelul țesuturilor. Hemoglobina eliberată își reia rolul ei de transportor al oxigenului. Fixarea oxigenului are loc prin legarea sa coordinativ de fier, fără ca acesta să-și modifice valența. În lipsa globinei hemul nu poate lega oxigenul.

Hemoglobina are propriettea de a fixa reversibil formând carbhemoglonina. Aceasta este un compus important în transportul de la țesuturi (presiune parțială mare la ), la plămâni (presiunea parțială mică de ).

Hemoglobina reacționează ireversibil cu oxidul de carbon formând carboxihemoglobina:

+

Afinitatea hemoglobinei pentru este de 210 ori mai mare decât afinitatea pentru . Astfel în prezența în aerul inspirat hemoglobina nu mai leagă oxigenul ci oxidul de carbon, motiv al nocivității , care poate provoca moartea prin asfixiere dacă mai mult de 50% din hemoglobină este blocată sub formă de carboxihemoglobină.

Sub acțiunea oxidanților, din hemoglobină este oxidat la rezultând methemoglobina () cu componenta prostetică hematin și care nu mai posedă proprietatea de a fixa oxigenul. În organism se sintetizează permanent hemoglobină, dar ea este redusă sub influența enzimei methemoglobin-reductaza la hemoglobină, menținăndu-se echilibrul deplasat spre stănga cu o valoare de 0,4% a din totalul hemoglobinei. [8]

Hemul din hemoglobină, în prezența HCl sau NaCl se transformă în clorhemina în care este legat ionic de . Reacția este sensibilă, rezultând cristale caracteristice de clorhemină (cristale Teichman) ce servesc la identificarea urmelor de sânge.

Produșii similari ce conțin se numesc hemine.

Analiza cu raze X a deoxihemoglobinei arată că structura terțiară a celor patru lanțuri peptidice este aproape identică cu cea a lanțurilor oxihemoglobinei, dar structura cuaternară diferă semnificativ. Astfel legarea a patru molecule de la cele patru catene polipeptidice ale hemoglobinei produce o modificare a structurii cuaternare a acesteia.

Hemoglobina este o proteină oligomeră formată din patru catene polipeptidice și patru nuclee de hem fiecare dintre acestea putând lega câte o moleculă de oxigen.

Legarea primei molecule de de hemoglobină mărește capacitatea legării succesive a moleculelor de de hem. Aceasta se explică prin faptul că fiecare subunitate a moleculelor de hemoglobină poate exista în configurații diferite, una având o afinitate mai mare pentru oxigen, cealaltă mai mică. Legarea oxigenului de una din catenele α ale subunității , modifică conformația catenei de la forma sferică la una pătrată. Modificarea conformației catenei α este transmisă catenei care suferă o modificare conformațională identică cu a catenei , modificare ce conduce la creșterea afinității acesteia pentru și posibilității fixării celei de a doua molecule de la catena .

Forma cu afinitate scazuta Modelul secvential Forma cu afinitate

mare

Oxigenarea completă a primei subunități , determină modificarea conformațională a celei de-a doua subunități , căreia îi determină mărirea afinității pentru oxigen conducând la fixarea ușoară a următoarelor două molecule de oxigen.

Mioglobina

Este o cromoproteidă din mușchi asemănătoare ca structură și rol hemoglobinei. Se deosebește de hemoglobină deoarece molecula globinei din HbM este formată dintr-o singură catenă polipeptidică alcătuită din 153 resturi de aminoacizi. [9]

Mioglobina are o afinitate față de oxigen de aproximativ 6 ori mai mare comparativ cu hemoglobina. Ea constituie pentru mușchi rezerva importantă de oxigen în oxidările celulare.

Citocromii

Sunt cromoproteide ce au componenta prostetică asemănătoare hemului din hemoglobine. Se cunosc mai mulți citocromi a, b, c care intră în structura enzimelor oxidoreducătoare implicate în procesul de respirație tisulară. [10]

Cloroplastine

Sunt cromoproteide ce au componenta prostetică: clorofila, iar neproteică: plastina.Se găsesc în cloroplastele celulelor vegetale și animale și au rol important în procesul fitosintezei.

Clorofilele

Sunt pigmenți clorofilieni ai frunzelor verzi și se găsesc în cloroplaste. Se cunosc două clorofile numite clorofila a și clorofila b. Ele se găsesc în majoritatea plantelor în raport de 3:1.

Figura 4: Clorofila a

Clorofila a și b au structură asemănătoare: conțin un nucleu porfirinic în mijlocul căruia se află un atom de magneziu neionizat, legat prin două legături coordinative de atomi de azot ai nucleelor C și D.

Gruparea carboxil a restului de acid propionic legat la nucleul D la este esterificată cu un alcool nesaturat fitol ().

Prin saturarea dublei legături din nucleul pirolic D, cât și prin formarea unui ciclu legat de inelul C, în molecula clorofilelor apar trei atomi de carbon asimetrici ce conferă moleculei o activitate optică puternic levogiră.

Clorofila b diferă de molecula a prin înlocuirea grupării din poziția 3 cu gruparea formil . Clorofila a și b au culoare verde. Magneziul din molecula lor este scindat de către acizi.

Clorofilele au rol important în procesul de fotosinteză, intervenind mai ales în faza de lumină a acestui proces.

Componente neporfirinice

Sunt cromoproteide ce conțin o grupare prostetică colorată de natură neporfirinică. Din această clasă fac parte flavinenzimele și carotenoproteidele.

Flavinenzimele sunt cromoproteide formate dintr-o proteină și o grupare prostetică din clasa flavinelor. Au proprietăți enzimatice.

Carotenoidele sunt cromoproteide ce au drept componentă prostetică un pigment carotenoid. Importanță au pigmenții vizuali implicați în procesul vederii.

Nucleoproteide

Sunt heteroproteide formate dintr-o proteină cu caracter bazic (histonă sau protamină) și o grupare prostetică construită din acizi nucleici. [11]

Nucleoproteinele intră în structura tuturor celulelor (mai ales ale nucleelor celulelor animale și vegetale). Ele au un rol important în stocarea, transmiterea și exprimarea informației ereditare, în sinteza proteinelor, în diviziunea celulară.

Nucleoproteinele intră și în constituția bacteriilor și a virusurilor.

Structura acizilor nucleici

Acizii nucleici sunt produși macromoleculari rezultați prin policondensarea nucleotidelor. Nucleotidele sunt formate din trei componente: o bază azotată, o pentoză și un acid fosforic.

În structura primară a ADN-ului și ARN-ului, între nucleotide succesive se realizează legături covalente, fosfodiesterice.

La realizarea acestor legături se elimină apa între gruparea -OH din poziția din pentoza unei nucleotide și gruparea –OH din poziția a pentozei nucleotidei următoare. Rezultă lanțuri lungi polinucleotidice.

În structura ADN-ului participă dezoxiribonucleotide ce conțin ca baze: citozina, timina, adenina și guanina, iar în structura ARN-ului participă ribonucleotide ce conțin următoarele baze azotate: citozina, uracil, adenina și guanina.

Deși numărul bazelor azotate respectiv al nucleotidelor, componente ale acizilor nucleici este numai patru (două nucleotide pirimidinice și două nucleotide purinice) există un număr mare de acizi nucleici specifici fiecărei specii biologice, determinat de secvențe foarte variate ale acestor patru nucleotide componente.

Figura 5: Structura unor segmente din macromolecula de ADN și ARN

Acizii dezoxiribonucleici

Acizii dezoxiribonucleici (ARN) sunt localizați în cea mai mare parte în nucleul celular. Totuși localizarea intracelulară a ADN-ului diferă în funcție de gradul de evoluție al sistemului biologic. În celulele eucariote (organismele superioare și unele microorganisme) aproape întreaga cantitate de AND se găsește în nucleu combinată cu proteine bazice numite histone. La organismele superioare AND-ul este localizat în formațiuni numite cromozomi. [12]

Pe lângă ADN-ul din nucleu, la eucariote se găsesc cantități mici de ADN în mitocondrii. Clorolastele conțin de asemenea un tip special de molecule de ADN. Structura primară a ADN-ului este reprezentată de un lanț polidezoxiribonucleic, caracterizat prin natura, proporția și secvența nucleotidelor constituente. Lanțul polipeptidic al ADN-ului conține cele patru dezoxiribonucleotide: d AMP, d GMP, d CMP și d TMP dispuse într-o secvență specifică prin stabilitatea legăturii , fosfodiesterice între ele.

Influența genetică stocată în macromolecula de ADN este codificată în secvența bazelor azotate-respectiv a dezoxiribonucleotidelor-existente de-a lungul catenei polipeptidice. Astfel trei baze succesive din structura AND-ului codifică includerea unui aminoacid în macromolecula proteică în timpul sintezei acesteia. Structura secundară a AND-ului reprezintă structura tridimensională a acestuia care îi conferă proprietăți moleculare și biologice unice. [13]

J. D. Waston și F. H. Crick, în anul 1953, pe baza unor date experimentale au elaborat pentru ADN structura de dublu helix.

Figura 6: Modelul structural de dublu helix al moleculei de ADN după Waston și Crick (S-dezoxiriboza, P-fosfat)

Stabilirea dublului helix este asigurată atât de interacțiuni hidrofobe dintre bazele azotate cât și de legături de hidrogen ce se stabilesc între bazele azotate de pe catenă și baze azotate de pe cealaltă catenă.

Experimental s-a dovedit că o bază purinică de pe o catenă stabilește legături de hidrogen intercatenare numai cu o bază pirimidinică de pe cealaltă catenă. Complementaritatea bazelor azotate de pe cele două catene polinucleotidice este dată de complementaritatea structurilor. Astfel adenina se poate lega de timină prin legături de hidrogen, iar guanina de citozină prin trei legături de hidrogen. Deci bazele perechi sunt adenina-timina și guanina-citozina deoarece numai acestea pot stabili numărul maxim de legături de hidrogen, determinând configurația ADN-ului cu energia cea mai mică, deci cu stabilitatea cea mai mare.

În organism, ADN-ul îndeplinește importante funcții biologice cum sunt: în ADN este stocată informația genetică, are rol important în biosinteza proteinelor, are rol în transmiterea informației genetice de-a lungul generațiilor, asigură diferențierea și reglarea celulară, reprezintă baza materială a mutațiilor naturale și induse, are rol important în ameliorare la plante și animale.

Acizii ribonucleici

Acizii ribonucleici sunt produși macromoleculari rezultați prin policondensarea ribonucleotidelor.

În acizii ribonucleici intră patru nucleotide: AMP, GMP, CMP și UMP. Pentoza componentă a acestor nucleotide este riboza. Între ribonucleotidele constituiente ale ARN-ului se stabilesc legături fosfodiesterice , rezultând un lanț polinucleotidic. [14]

ARN-ul din diferite celule și virusuri este monocatenar și prezintă o structură primară determinată de aportul dintre cele patru tipuri de nucleotide constituiente, secvența lor și masa lor moleculară. Pe lângă cele patru baze majore (A, G, C, U) în molecula acizilor nucleici se găsesc și bazele minore. Acestea sunt produși metilați sau conțin grupe tiolate ale bazelor majore.

Moleculele de ADN monocatenare prezintă și o structură secundară, dublu helicoidală, pe anumite porțiuni ale catenei, acolo unde datorită complementarității bazelor azotate este posibilă crearea structurii dublu helicoidală. Porțiunile cu baze necomplementare sunt expulzate ca baze în afara zonelor de dublu helix.

Din cauza structurii lor, în molecula de ADN, coținutul de adenină este diferit de cel în uracil iar conținutul de guanină de cel de citozină.

Având o structură monocatenară, acizii ribonucleici au mase moleculare mai mici decât AND-ul .

ARN-ul se prezintă în mai multe specii moleculare distincte.

În funcție de rolul îndeplinit în celule se cunosc trei tipuri principale de ARN:

-ARN mesager ()

-ARN de transfer ()

-ARN ribozomal ()

Cele trei tipuri de ARN se deosebesc prin structură, proprietățile fizico-chimice și prin localizarea intracelulară.

ARN mesager ()

ARN mesager are o structură monocatenară, este situat în nucleu pe matriță de ADN. Printr-un proces de transcripție, secvanța bazelor dintr-un lanț de este copiată enzimatic în lanțul . Biosinteza poartă numele de transcripție, proces prin care informația genetică codificată în secvența nucleotidelor din ADN este transmisă în secvanța nucleotidelor din .

are masa moleculară cuprinsă între , coeficientul de sedimentare 6-25, numărul de nucleotide componente 75-300. Reprezintă doar 2% din ARN-ul total al celulelor, dar este extrem de heterogen, existând sub forma a sute sau chiar mii de specii moleculare diferite.

Secvența aminoacizilor din miile de proteine sintetizate în celule este codificată de un specific. Tipul de supraviețuire al în celulă este variabil. La eucariote are o viață de câteva ore în timp ce bacterian are o viață scurtă de 2-3 minute.

Funcția biochimică a este de a transmite informația preluată de la ADN la ribozomi unde are loc biosinteza proteinelor.

ARN de transfer ()

ARN de transfer are rol de a transporta aminoacizii la ribozomi unde are loc procesul de biosinteză al proteinelor. Sunt solubili în citoplasmă și nu sunt asociați cu proteinele. Au masa moleculară mică, cuprinsă între , sunt formați dintr-un număr mic de nucleotide (75-90) și constituie 10-20% din totalul de ARN.

Fiecare dintre cei 20 aminoacizi proteici au cel puțin un corespunzător iar unii aminoacizi au chiar mai mulți .

Funcția biochimică a constă în legarea specifică a aminoacizilor sub formă de complex aminoacil-, transportul acestora la ribozomi, adaptarea aminoacidului transportat în dreptul codonului de pe prin recunoașterea codon-anticodon, urmată de biosinteza lanțului polipeptidic al proteinei.

ARN ribozomal ()

ARN ribozomal este o componentă esențială a ribozomilor, funcțiuni la nivelul cărora are loc biosinteza proteinelor. are molecula monocatenară conținând 100-300 nucleotide, are masa moleculară cuprinsă între și constituie 75-80% din totalul de ARN celular.

Acizii ribonucleici ribozomali se deosebesc între ei prin masele lor moleculare și prin coeficienți de sedimentare. Se cunosc trei tipuri de ce au constantele de sedimentare 5S, 16S, 23S (unități Svedberg ce măsoară viteza cu care aceste particule sedimentează în câmpul ultracentrifugal) iar masele lor moleculare sunt de și respectiv .

ARN-ul ribozomal nu se găsește în stare liberă ci combinați cu proteine în complexe ribonucleoproteice numite ribozomi. Ei sunt alcătuiți din 65% ARN și 35% proteine. Valoarea coeficientului de sedimentare al ribozomilor la bacterii este de 70S iar la eucariote de 80S.

La ribozomi are loc biosinteza proteinelor. Pe suprafața fiecărui ribozom există două situsuri: situsul aminoacid de care se leagă ce poartă aminoacidul și situsul peptid de care se leagă ce poartă un peptid deja format. [15]

Subunitatea mică a ribozomului (40s) leagă . și ribozomii se pot deplasa unul în raport cu celălalt. Ribozomii permit conlucrarea , , în vederea sintezei proteinelor.

3 Structura proteinelor

Proteinele sunt produși naturali de policondensare ai aminoacizilor. Structura aminoacizilor proteici are un rol esențial în formarea lanțului macromolecular proteic, cât și în stabilirea configurației naturale a acesteia. Din aceste motive sunt prezentate mai întâi clasificarea și structura aminoacizilor proteici și apoi noțiuni detailate referitoare la structura proteinelor.

3.1 Aminoacizi proteici

Aminoacizii naturali se găsesc în organismele vii. O parte din aceștia intră în constituția proteidelor și poartă numele de aminoacizi proteici. În structura proteinelor intră 20 aminoacizi, iar pe lângă aceștia, în anumite proteine specializate prin funcțiile lor, se mai găsesc încă 3-4 aminoacizi. Cu excepția prolinei, toți aminoacizii proteici sunt α-L aminoacizi: [16]

Dintre aminoacizii proteici, 8 aminoacizi sunt absolut necesari organismului animal și uman, deci ei nu pot fi sintetizați de aceste organisme. Ei se numesc aminoacizi esențiali și sunt procurați pentru hrană fiind sintetizați numai de organismele vegetale.

Aminoacizii esențiali sunt: valina, leucina, izoleucina, lizina, metionina, treonina, fenilalanina, triptofan.

Aminoacizii neesențiali sunt aminoacizii proteici care pot fi sintetizați atât în plante cât și în animale.

După structura lor chimică, aminoacizii proteici se clasifică în:

– aminoacizi monoaminomonocarboxilici

Acid aminoacetic Acid α-aminopropionic

Glicocol (Glicina) (Gly) Alania (Ala)

Acid α-aminoizovalerianic Acid α-aminoizocapronic

Valina (Val) Leucina (Leu)

Acid α-amino-β metil-valerianic

Izoleucina (Ile)

– aminoacizi monoaminodicarboxilici

Acidul aminosuccinic Acid α-aminoglutaric

Acid aspartic (Asp) Acid glutamic (Glu)

Asparagina (Asn) Glutamina (Glu)

– aminoacizi diaminomonocarboxilici

Acid α, δ-diaminovalerianic

Oritina

Acid α, ε-diaminocapronic

Lisina (Lis)

Acid α-amino-γ-guanidivalerianic

Argnina (Arg)

– aminoacizi cu alte grupe funcționare

Acid α-amino-β hidroxipropionic Acid α-amino-β hidroxibutiric

Serina (Ser) Treonina (Thr)

Acid α-amino-γ tiometilbutiric Cistina

Metionina (Met)

Acid α-amino-β –tiopropionic

Cisteina (Cis)

Acid α-amino- β-fenil propionic Acid α-amino-β

Fenilanina (Phe) (p-hidroxi-fenil) propionic

Tirozina (Tyr)

Acid α-amino-β imidazolil Acid α-pirolidin carboxilic

Histidina (Hys) Prolina (Pro)

Hidroxiprolina Acid α-amino-β indolil propionic

(Pro – OH) Triptofan (Trp)

3.2 Structura tridimensională a proteinelor

Lanțul polipeptidic al diverselor proteine diferă prin lungimea sa și segvența amioacizilor constituienți. Rezultă astfel lanțuri polipeptidice foarte variate care determină existența unui număr foarte mare și variat de proteine naturale. Aceste lanțuri polipeptidice prezintă o structură tridimensională, determinată de orientare spațială, de conformația acestor catene, de interacțiile intra și intercatenare. Deși structura globală a macromoleculelor proteice este dată de existența și interacțiunea mai multor tipuri de structuri sau nivele de organizare și anume : de o structură primară, secundară terțiară și cuaternară. Între aceste nivele de organizare structurală există o interdependență și împreună determină particularitățile structurale și proprietățile funcționale specifice fiecărei proteine. [17]

3.2.1 Structura primară

Structura primară a proteinelor reprezintă organizarea intercatenară a oricărei proteine și este determinată de numărul, felul și segvența aminoacizilor constituienți. Orice proteină este alcătuită din catene polipeptidice a căror specificitate structurală este determinată de segvența aminoacizilo

Figura 7: Structura primară a unui fragment dintr-o
catenă polipeptidică

Prin metoda difracției razelor X s-a contatat că lungimea legăturii C-N (1,32Ǻ) este mai scurtă decât cea nornală (1,47Ǻ) iar legătura C=O (1,24Ǻ) este mai lungă decât cea normală. Aceasta se explică prin existența efectului de rezonanță al legăturii peptidice ce conduce la un caracter parțial de dublă legătură pentru legătura peptidică dintre azot și carbon.

Caracterul parțial de dublă legătură al legăturii peptidice conduce la blocarea rotației libere a celor doi atomi (C și N) în jurul legăturii peptidice, acești doi atomi ai legăturii peptidice fiind coplanari. Consecința acestei structuri este apariția izomeriei cis-trans. În peptidele naturale apare numai izomerul trans.

3.2.2 Structura secundară

Structura secundară redă conformația lanțurilor polipeptidice ale proteinelor naturale. Ținând cont de structura lanțului polipeptidic Pauling și Corey au constatat că lanțurile polipeptidice pot fi răsucite în spirală (helix)

sau pot fi dispuse în foaie pliată generând două structuri de lanțuri polipeptidice notate cu α-helix și respectiv structură β. Mai există și un tip de conformație al lanțului polipeptidic numit model tip colagen.

Modelul α-helix

Acest model prevede răsucirea unei catene polipeptidice în spirală luând naștere o conformație numită α-helix. Acest model este stabilizat prin legături de hidrogen intracatenare între legăturile peptidice. Elicea are un pas de 4,5Å și fiecare pas al său este alcătuit din 4,6 aminoacizi. Legăturile de hidrogen au loc între o grupare carbonil (C=O) a unui amoinoacid și una aminică (NH) a altui aminoacid aparținând altei legături peptidice situată peste trei aminoacizi mai jos în catena polipeptidică (la o distanță de trei secvențe în raport cu prima legătură peptidică). Legăturile de hidrogen sunt dispuse aproape paralel cu axa helixului. Aceste legături de hidrogen intracatenare se pot reprezenta astfel:

Figura 8: Reprezentarea conformației α-helix

Modelul în straturi pliate (foaie pliată)

Acest model reprezintă o conformație ordonată și stabilizată prin legături de hidrogen între grupe C=O și NH ale legăturilor peptidice de pe catene diferite (legături de hidrogen intercatenare). [18]

Tip β-keratină (paralel)

Tip fibroină (antiparalel)

Figura 9: Modelul structural în straturi pliate

Catenele polipeptidice în zig-zag sunt dispuse paralel între ele stabilindu-se legături de hirogen conferind o mare stabilitate acestor structuri.

Prototipul modelului în planuri pliate îl reprezintă β-keratina, proteină fibrilară din lână, păr, unghii. O structură secundară asemănătoare β-keratinei o are fibroina din mătase. În fibroină, spre deosebire de β-keratină, catenele polipeptidice sunt orientate antiparalel.

Modelul tip colagen

Colagenul este o proteină fibrilară, răspândită larg în țesuturile animale, fiind prezentă în oase, cartilagii, tendoane, piele, etc. Structura modelului de colagen se prezintă ca un superhelix format din trei catene polipetidice spiralate ce constituie un tripluhelix.

Fiecare catenă spiralată este răsucită spre stânga și înfășurată în jurul axei proprii precum și în jurul axei comune a celor trei catene. Structura este consolidată prin legături de hidrogen intercatenare și seamănă cu un cablu împletit. Acest model este caracterizat de o rigiditate extremă. Conținutul ridicat de prolină, hidroxiprolină și glicocol nu permite organizarea catenei polipeptidice de tip α-helix sau de tip straturi pliate.

Figura 10: Structura colagenului

3.2.3 Structura terțiară a proteinelor globulare

Proteinele globulare au o structură mult mai complexă față de proteinele fibrilare care au structuri relativ simple.

Structura terțiară reprezintă un studiu avansat de organizare spațială a structurii proteinelor. Ea constă în replierea catenelor polipeptidice elicoidale asupra lor înșile.

Catena polipeptidică suferă o înfășurare spontană, având loc o repliere ordonată îmbinată cu plieri neordonate.

Structura terțiară se caracterizează prin alternanța de-a lungul catenei polipeptidice respective a unor porțiuni elicoidale regulate și rigide cu porțiuni neelicoidale și flexibile. Structura terțiară reprezintă o conformație specifică a catenelor polipeptidice, o conformație organizată și menținută prin legături specifice între țesuturile de aminoacii, legături ce stabilizează structura spațială a proteinelor și sunt de următoarele tipuri:

– legături covalente disulfurice S-S stabilite între radicali de cisteină;

– legături ionice realizate între grupări polare și din aminoacizii diamonomonocarboxilici și monoaminodicarboxilici;

– legături de hidrogen stabilite între grupările peptidice;

– legături de hidrogen stabilite între grupe -OH și -COOH din resturi de aminoacizi;

– legături prin forțe Van der Waals și interacțiuni hidrofobe stabilite între radicali hidrocarbonați nepolari, hidrofobi ai aminoacizlor;

– interacțiuni dipol-dipol.

Figura 11: Reprezentarea schematică a structurii tridimensionale a unei catene polipeptidice de hemoglobină

Structura terțiară este influențată de diferiți factori fizici și chimici. Sub acțiunea acestor factori se pot desface legături chimice ce stabilizează această structură, lucru ce determină denaturarea proteinei.

3.2.4 Structura cuaternară

Structura cuaternară constă în fragmentarea unor molecule din mai multe catene polipeptidice cu structură terțiară bine stabilită. Mai multe subunități numite protomeri se unesc într-un ansamblu sau agregat numit oligomer. Structura cuaternară, în funcție de numărul de protomeri este frecvent formată din dimeri, trimeri, tetrameri. Aceste unități sunt asamblate cu ajutorul legăturilor electrostatice și de hidrogen între suprafețele diferiților polimeri.

De exemplu globina din hemoglobină este formată dintr-un tetramer constituit din patru catene polipeptidice: 2 catene identice (fiecare conține 141 aminoacizi) și 2 catene identice (fiecare conține 146 aminoacizi). Nivel cuaternar de organizare au mai ales proteinlele cu proprietăți enzimatice.

Înaltul nivel de organizare a structurii proteinelor le conferă o înaltă specificitate de acțiune cât și propietăți fizico-chimice specifice.

4 Enzime cu funcții enzimatice

Reacțiile chimice din organismul viu au loc în condiții mult mai blânde decât în vitro. Organismul viu realizează aceste procese cu ajutorul unor biocatalizatori secretați în cantități foarte mici de celulele vii.

Acești catalizatori poartă numele de enzime. Sintetizate de către celula vie, enzimele catalizează toate reacțiile termodinamic posibile din organismele vii, condiționând desfășurarea , coordonarea și autoreglarea acestor reacții. Ca orice catalizator, enzimele sunt substanțe care modifică cinetica reacțiilor în condiții extrem de mici. La sfârșitul procesului chimic ele se regenerează. [19]

Până în prezent se cunosc peste 1000 de enzime care au fost identificate și caracterizare. Unele dintre ele au fost izolate în stare pură, iar peste 150 au fost obținute în stare cristalină.

Toate enzimele sunt substanțe de natură proteică, structura lor chimică de ansamblu fiind dată de nivelele de organizare structurală ale proteinelor: de o structură primară secundară și terțiară și uneori chiar de o structură cuaternară.

Din punct de vedere structural,enzimele se împart în două categorii:

– enzime de natură exclusiv proteică formate dintr-o holoproteidă;

– enzime de natură heteroproteidică, formate din două componente,

una de natură proteică numită apoenzimă și alta de natură neproteică numită coenzimă. Împreună, cele două părți alcătuiesc holoenzima.

4.1Enzime de natură holoproteidică

Enzimele de natură holoproteidică prezintă unele particularități structurale ce le conferă activitate catalitică. Moleculele de enzime prezintă în structura lor zone denumite situsuri, caracterizate printr-o anumită secvență de aminoacizi și o conformație caracteristică. Aceste situsuri sunt esențiale pentru manifestarea activității catalitice (situs catalitic) sau pentru funcția de reglare a unor reacții chimice (situs alosteric).

În afara acestor situsuri întraga configurație a macromoleculei enzimei, în asamblul ei, este responsabilă de activitatea catalitică.

Situsul catalitic

Este format dintr-un număr restrâns de resturi de aminoacizi (situați pe o anumită zonă a macromoleculei proteinei enzimatice) care au o structură specifică și la nivelul căreia se manifestă activitatea catalitică. Situsul catalitic mai poartă numele de centru activ al enzimei, de care se fixează substanța a cărei transformare o catalizează, substanță numită substat.[20]

Una din cele mai remarcabile proprietăți ale unei enzime este capacitatea lor de a acționa numai asupra anumitor substraturi, proprietate denumită generic specificitate enzimatică.

Conformația unei proteine enzimatice tip globulare implică existanța unei regiuni interne hidrofobe a moleculei și a unei regiuni hodrofile constituită din resturi de aminoacizi polari.

Situsul catalitic este situat în regiunea hidrifobă a molculei de protein-enzimă și include grupări chimice active din resturile de aminoacizi. Aceste grupe active pot fi: -OH, , -COOH, -SH, heterociclul imidazolic și altele. În mod individual sau împreună, ele participă la stabilirea legăturii dintre enzimă și substrat determinând reacția catalitică specifică.

De exemplu centrul activ al chimiotripsinei conține un rest de histidină și un rest de serină. Astfel enzima are acțiune proteolitică.

Figura 12: Reprezentarea formării complexului enzimă-substrat după ipoteza lui Fisher

Radicalii aminoacizilor din situsul catalitic, prin grupările lor reactive intervin: ca agenți de complexare a substratului cu care stabilesc interacțiuni ionice sau covalente; ca donori de electroni și de protoni în mecanismul catalitic de reacție; intervin în stabilirea unei topografii adecvate în molecula de enzimă, necesară pentru interacțiunea substatului și coenzimei ambele fixate la un moment dat pe molecula de enzimă.

Situsul alosteric

Unele enzime cu rol de reglare enzimatică, denumite enzime alosterice, conțin în molecula lor pe lângă situsul catalitic și un al doilea situs numit situs alosteric. În procesul de reglare prin interacțiuni alosterice intervine un cofactor alosteric cu rol de activator sau inhibitor. Acesta se leagă de situsul alosteric determinând tranzițiile moleculei de enzimă între diferite conformații posibile pe care le poate lua. Astfel efectul alosteric realizează efecte reglatoare ale enzimelor alosterice.

Figura 13: Structura schematică a unei enzime alosterice

Enzimele alosterice sunt enzime oligomere constituite din două sau mai multe subunități.

4.2 Enzime de natură heteroproteidică

Aceste enzime își manifestă activitatea prin intermediul situsului catalitic și a unor cofactori enzimatici (coenzime, grupări prostetice, metale) indispensabile pentru manifestarea activității enzimatice.

Centrul catalitic reprezintă totalitatea regiunilor funcționale ale enzimei, ansamblul grupărilor chimice active ce participă efectiv la reacția catalizată.

În cazul enzimelor holoproteice, care nu necesită pentru activitatea lor catalitică prezența unui cofactor, centrul catalitic este sinonim cu situsul catalitic.

Centru catalitic= situs catalitic.

În cazul enzimelor heteroproteidice care necesită pentru activitatea lor catalitică prezența unor cofactori, centrul catalitic include și regiunea din moleculă la care se atașează cofactorul ( coeanzime și/sau metal ).

Centrul activ = situs catalitic + coenzimă + metal

Figura 14: Reprezentarea schematică a absenței coenzimei și a două substrate de către enzimă. Formarea complexului enzimă-substat-coenzimă

Apoenzima și cofactorii enzimatici

Pentru funcția catalitică a enzimelor, un rol determinant îl constituie configurația moleculei proteice ce poartă situsul catalitic. [21]

La enzimele de natură holoproteică proprietățile catalitice sunt exercitate numai de componenta proteică pe care e localizat situsul catalitic.

La enzimele de natură heteroproteică proprietățile catalitice sunt date de interacția și cooperarea dintre componenta proteică (apoenzima) și anumite micromolecule sau ioni denumiți cofactori.

Aceste enzime sunt heterogene și formate dintr-o componentă neproteică numită cofactor care se localizează la nivelul centrului catalitic.

Apoenzima sau cofactorul separat sunt inactive catalitic. Ele formează un complex enzimatic enzimă-cofactor denumit holoenzimă dotat cu activitate catalitică. Cofactorul este indispensabil activității catalitice a enzimei sau în unele cazuri potențează activitatea enzimei.

Apoenzimă + cofactor = holoenzimă

Apoenzima este de natură proteică, termolabilă și nedializabilă, are localizat în structura sa situsul catalitic și situsul alosteric ( la enzimele alosterice ). Apoenzima determină legarea substatului la situsul catalitic sau a cofactorului alosteric la situsul alosteric, formează complexe enzime-substrat și enzimă-cofactor, determină specificitatea de substrat în reacția pe care o catalizează. Apoenzima manifestă grade diferite de afinitate pentru cofactor acesta putând fi legat labil sau foarte strâns la apoenzimă prin legături covalente. Aponzima poate suferi modificări conformaționale în anumite limite permise.

Cofactori enzimatici

Cofactorii enzimatici sunt micromolecule cu structuri chimice foarte diferite și anume: derivați de la vitamine, de la hem, trifozforibonucleotide sau simplii ioni metalici.

Cofactorii sunt indispensabili pentru manifestarea activității catalitice sau pentru potențarea acestei activități.

Cofactorii sunt termolabili și dializabili, unii sunt ușor disociabili de apoenzimă alții sunt legați intim de apoenzimă. Cofactorii determină specificitatea de reacție, respectiv tipul de mecanism de reacție pentru reacția catalizată la care participă sub forma complexului enzimă-cofacor.

Mecanismul general de acțiune al cofactorilor constă în :

– introducerea unei conformații optime necesară interacțiunii enzimei cu substratul prin atașarea cofactorului la suprafața apoenzimei;

– asigurarea dispunerii enzimei și substratului într-un aranjament spațial adecvat prin situarea cofactorului în vecinătatea sitului catalitic și a substatului;

– participarea cofactorului la reacția enzimatică prin acceptare și transformare de electroni, atomi sau grupuri chimice de la un substrat la alt substrat.

După natura chimică și modul lor de legare la apoenzimă, cofactorii se clasifică în: coenzime, grupări prostetice, ioni metalici.

Coenzimele sunt micromolecule organice (majoritatea derivați de la vitamine) care se atașează temporar la apoenzimă și care sunt ușor disociabili de aceasta. Coenzimele sunt legate labil de apoenzimă iar la sfârșitul reacției coenzima este eliberată și se găsește în stare inițială, ea se poate reasocia la apoenzimă putând participa din nou la transformarea altor molecule de substrat.

Exemple de coenzime sunt: derivați de la viatmine (, , FMN, FAD, etc) derivați de la nucleul heminic și coenzime de tip nucleozidtrifosfați.

Coenzimele acționează ca transportori de electroni, atomi sau grupe de atomi.

Grupările prostetice sunt cofactori strâns legați de molecula apoenzimei prin legături covalente. De exemplu nucleul heminic conținând ioni de () este o componentă a citocromilor (enzime transportoare de electroni) nucleul heminic fiind puternic legat de apoenzimă prin legături de tip covalent. Un alt exemplu de cofator este tiaminpirofosfatul care se leagă covalent de apoenzimă în enzimele numite carboxilaze. De asemenea riboflavina din FAD și FMN se leagă covalent de apoenzimă. [22]

Ionii metalici sunt inispensabili pentru excitarea funcției catalitice a unor enzime participând în calitate de cofactori sau componente structurale ale acestora. Legarea dintre ei și apoenzimă se face sub formă de chelat la anumiți aminoacizi din molecula apoenzimei.

Ionii acționează fie ca o grupare catalitică, fie ca mijloc de legare al substatului de enzimă, ilustrând astfel formarea unui complex ion metalic-enzimă-substrat, fie ca activatori ai reacțiilor enzimatice. Exemplul de enzime metal dependente sunt: citocromoxidaza dependentă de ionii (), ascorbicoxidaza, dependentă de ionii (), fosfatazele dependente de , piruvatfosfokinaza- dependentă de ionii și altele.

4.3 Implicații ale enzimelor în procesele metabilice

Enzimele participă în toate procesele de anabolism și catabolism din organismele vii. Fiecare etapă a proceselor metabolice este catalizată de enzime specifice. În organism unele enzime se găsesc sub două forme: relaxată (inactivă) și tensă (activă).

În funcție de necesitățile metabolice ale organismului, aceste enzime sunt activate sau inactivate trecând în forme relaxate și relativ tensă. Unele din cele mai importante procese de catabilosm și anabolism au fost : respirația, biodegradarea trigliceridelor și metabolismul aminoacizilor.

4.3.1 Respirația

Degradarea aerobă -catabolismul aerob- este un proces de degradare care decurge în prezența oxigenului atmosferic. Produșii finali ai unei degradări aerobe sunt , și o mare cantitate de energie. De exemplu în cazul hexozelor, degradarea oxidativă se poate prezenta prin ecuația globală:

Reacția nu constituie o ardere obișnuită, ci are loc printr-un proces complex la care participă multe sisteme enzimatice. Trebuie făcută mențiunea că degradarea aerobă este o cale comună de degradare a substanțelor de natură proteică, glucidică, lipidică.

Intermediarul comun, care rezultă din metabolismul protidic, glucidic, lipidic este acidul piruvic sau acetilCoA care parcurge ulterior aceleași etape în degradare, până la formarea , și elaborarea energiei. [23]

Cele trei mari etape pe care o substanță le parcurge în sensul de degradare aerobă sunt:

– formarea acetilCoA prin intermediari diferiți, care apar în metabolismul glucidic, din aminoacizi sau din acizi grași;

– parcurgerea de către acetilCoA a ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul lui Krebs), unde se descompune în 2 moli de și 8 atomi de hidrogen preluați de cofactori, , FAD;

– participarea atomilor de hidrogen în lanțul respirator, oxidarea celulară, unde sunt oxidați de către oxigenul atmosferic, cu formare de apă. Totodată are loc și eliminarea unei catități mari de energie, care parțial este înmagazinată în ATP în procesul de fosforilare oxidativă.

Figura 15: Schema procesului de degradare oxidativă

Formarea acetilCoA

AcetilCoA care constituie punctul cheie al proceselor metabolice poate rezulta din intermediari ai glicolizei, ai metabolismului protidic sau lipidic. [24]

Unul din cei mai importanți precursori ai acetilCoA este acidul piruvic (rezultat din degradarea aerobă a glucidelor). Aceasta suferă un proces de decarboxilare oxidativă, sub acțiunea unui complex multienzimatic numit piruvatdehidrogenază, transformânu-se în acetilCoA. În procesul de decarboxilare oxidativă participă tiaminpirofosfatul (TPP), acidul lipoic, coenzima A, o dehidrogenază dependentă și alta FAD dependentă.

Procesul are loc prin o decarboxilare sub acțiunea TPP care se transformă în hidroxietil TPP. Aceasta cedează restul hidroxietil acidului lipoic oxidat, care trece în acetillipoat. Acetillipoatul, în reație cu coenzima A formează acetilCoA și acid lipoic redus. Atomii de hidrogen sunt transferați pe FAD, cofactor al dihidrolipoat dehidrogenazei și de aici pe , iar acidul lipoic trece din nou în formă oxidată.

Figura 16: Decarboxilarea oxidativă a acidului piruvic

Reacția globală de decarboxilare oxidativă a acidului piruvic este:

Acid piruvic + +HS-CoA

Ciclul acizilor tricarboxilici. Ciclul lui Krebs

Ciclul acizilor tricarboxilici este un ciclu universal întâlnit la toate organismele aerobe animale, vegetale, microorganisme, drojdii, mucegaiuri, bacterii. Acest ciclu reprezintă unul din procesele biochimice fundamentale ale organismelor vii. El este format dintr-o succesiune de reacții de oxido-reducere, de decarboxilare, de fosforilare, de hidratare care sunt catalizate de enzime specifice localizate în mitocondrii. [25]

Principala caracteristică a ATP este aceea că necesită un compus esențial care intră în ciclu și se regăsește la sfârșitul ciclului inițiind un nou ciclu. Acest compus este acidul oxalacetic. El fixează o moleculă de acetilCoA și formează compuși cu șase atomi de carbon, care pe parcursul ciclului pierd 2 atomi de carbon sub formă de și regenerează o nouă moleculă de acid oxalacetic.

Reacția globală de degradare a acetilCoA este:

Atomii de hidrogen sunt preluați de către hidrogenaze, , FAD dependente și trecuți în catena de respirație, unde reacționează cu oxigenul.

Etapele ciclului acizilor tricarboxilici

– formarea acidului citric prin condensarea acetilCoA cu acidul

oxalacetic. Reacția este catalizată de către citrat sintetază (enzima lui Ochao):

Acetil CoA Acid oxalacetic

Citril SCoA

– trecerea acidului citric în acid izocitric sub acțiunea aconitazei;

Reacția are loc prin intermediul acidului aconitic:

Acid citric Acid aconitic Acid izocitric

– oxidarea acidului izocitric la acid α cetoglutaric, proces care are loc sub acțiunea izocitratdehidrogenazei sau dependentă. Se formează acid oxalacetic, care ulterior suferă o decarboxilare conducând la acid α cetoglutaric:

Acid izocitric Acid oxalsuccinic Acid α-cetoglutaric

– oxidarea acidului α cetoglutaric la succinilCoA este analoagă acidului piruvic și se realizază sub acțiunea unui complex enzimaitc α cetoglutarat dehidrogenază cu participarea tiaminpirofosfatului, a acidului lipoic, a HSCoA, FAD și cu rol de enzime: [26]

Acid α-cetoglutaric Succinil~SCoA

– energia legăturii macroergice din succinilCoA este transferată pe GDP în prezența succinilCo-sintetazei sau pe IDP, care poate îndeplini funcția de acceptor primar al legăturii fosfat:

Succinil~SCoA Acid succinic

La plante, transferul energiei de pe succinilScoA se face pe ADP.

GTP care se formează transferă gruparea fosfat și energia unei legături macroergice ADP cu formare de ATP.

GTP +ADPATP + GDP

– dehidrogenarea acidului succinic cu formare de acid fumaric. Reacția este catalizată de succinat dehidrogenaza. Acceptorul de hidrogen este FAD.

Reacția de dehidrogenare a acidului succinic este stereospecifică ducând la formarea izomerului trans. Enzima este activată de acidul succinic, fumaric, acidul fosforic și inhibată de acidul oxalacetic, malonic.

– hidratarea acidului fumaric în prezența fumarazei la acid malic:

Acid fumaric Acid L malic

Fumaraza este enzimă stereospecifică deoarece conduce la formarea numai a acidului L malic.

– regenerarea acidului oxalacetic prin oxidarea acidului L malic în prezența malatdehidrogenazei și (enzima este stereospecifică pentru acidul L malic):

Acid L malic Acid oxalacetic

Acidul oxalacetic închide ciclul Krebs dar îl poate redeschide prin combinare cu o nouă moleculă de acetilCoA. [27]

Urmărind reațiile din ciclul lui Krebs se constată că acetilCoA se transformă în 2 moli de bioxid de carbon și 8 atomi de hidrogen preluați de cofactorii și FAD. Simplicat, reația de degrdare a acetil~CoA este:

Cofactorii hidrogenați întră mai departe în procesul de oxidare celulară unde sunt oxidați de către oxigen cu formare de apă. Acest proces este puternic exergonic, iar energia rezultată este parțial utilizată pentru desfășurarea proceselor de sinteză, parțial este transformată în energie mecanică, osmică, electrică iar o parte se pierde sub formă de energie calorică. Surplusul de energie este acumulată în compuși macroergici prin procesul de fosforilare oxidativă. Oxidarea unui mol de eliberează o cantitate de energie echivalentă cu energia acumulată în 3 moli de ATP, iar a unui mol de cu energia acumulată de 2 moli de ATP.

Bilanțul energetic al ciclului acizilor

Ciclul acizilor tricarboxilici reprezintă sursa majoră de energie pentru celulă. Din cele 688,5 Kcal eliberate prin arderea completă a unei molecule de glucoză la și , aproximativ 10% sunt produse prin degradarea anaerobă (glicoliză), restul fiind rezultate prin procesul de degradare aerobă.

Energia eliberată în urma procesului de degradare aerobă a glucidelor este acumulată sub formă de legături macroergice în molecule de ATP, iar din numărul de molecule ATP sintetizate în cursul acestui proces se poate calcula cantitatea de energie rezultată. Astfel, prin oxidarea a două molecule de aicd piruvic (corespunzătoare la o moleculă de glucoză) se formează 30 molecule de ATP, în următoarele etape ale ciclului lui Krebs:

– în reacția de decarboxilare oxidativă a acidului piruvic la acetilCoA, intervine care reoxidează acidul dihidrolipoic la acid lipoic, . Această formă redusă a cofactorului enzimatic se reoxidează la ducând la formarea a 3 molecule de ATP:

– reacția de oxidare a acidului izocitric acceptorul de hidrogen este , care se reduce la . Reoxidarea la generează 3 molecule de ATP;

– în reacția de transformare a acidului α cetoglutaric în succinilCoA, acceptorul de hidrogen este , care se reduce la , iar prin reoxidarea sa rezultă 3 molecule de ATP;

– în etapa de formare a acidului succinic din succinilCoA rezultă o moleculă de ATP printr-o reacție de fosforilare la nivelul substratului:

SuccinilCoA + GDP + Acid succinic + HSCoA + GTP

GTP + ADPATP + GTP

– în reacția de oxidare a acidului succinic la acid fumaric,

acceptorul de hidrogen este FAD, care se reduce la . Reoxidarea la FAD are loc în prezența oxigenului atmosferic, a ADP și ducând la formarea a două molecule de ATP:

– în reacția de oxidare a acidului malic la acid oxalacetic, acceptorul de hidrogen este care se reduce la , iar prin oxidarea sa rezultă 3 molecule de ATP.

Bilanțul energetic al procesului de degradare aerobă a glucidelor pe calea ciclului acizilor tricarboxilici, reprezentat prin numărul de molecule de ATP sintetizat este redat de tabelul: [28]

Bilanțul energetic al ciclului Krebs

Aceste 30 de molecule de ATP sintetizate în cursul procesului de degradare aerobă a glucidelor reprezintă o cantitate de 225Kcal/mol de glucoză (307,5=225). Dacă ținem cont și de cele 8 molecule de ATP sintetizate în cursul procesului de glicoliză rezultă un număr de 38 molecule ATP prin degradarea completă a glucozei la și . (Cele 8 molecule de ATP rezultă prin oxidare a 2 molecule de , care nu se mai consumă pentru reducerea acidului piruvic la acid lactic și care formează 32=6 molecule de ATP, rezultate în procesul de glicoliză.)

Energia rezultată celor 38 molecule de ATP exprimată în Kcal va fi deci de 387,5=285Kcal/mol de glucoză. Eficiența energetică a proceselor de degradare a glucidelor este de aproximativ 40%, deoarece din cele 688,5Kcal acumulate de 1 mol de glucoză în cursul procesului de fotosinteză, sunt redate prin degradare numai 285Kcal/mol glicoză.

Oxidarea componentelor din catena de respirație, precum și locul în care intră diferitele substrate provenite din metabolismul glucidic, lipidic, protidic sunt prezente în figura:

Fosforilarea oxidativă la nivelul catenei de respirație

Acest proces are loc numai atunci când donorii și acceptorii de hidrogen aparțin catenei de respirație.

Deoarece variația de energie liberă a proceselor redox este direct proporțională cu diferența de potențial a reactanților, se poate calcula cantitatea de ATP ce se sintetizează pe baza energiei eliberate prin reducerea oxigenului la apă. S-a stabilit că energia care se eliberează la formarea unui mol de apă poate să conducă la sinteza a 3 molecule de ATP, dacă catena de respirație începe cu ; la sinteza a 2 molecule de ATP, dacă catena pornește de la FAD sau la sinteza unei molecule de ATP, dacă catena cuprinde doar oxidarea citocromilor.

Procesul de sinteză a moleculelor de ATP poartă numele de fosforilare oxidativă. [29]

Se definește raportul P/O, dintre cantitatea de ATP format și cantitatea de oxigen consumat ca raport al fosforilării oxidative. Acest raport poate avea valorile 3, 2, 1, în funcție de locul în care se realizează cuplarea fosforilării oxidative cu catena de respirație. În condiții fiziologice normale, catena de respirație pentru un ciclu întreg de reacții furnizează energia din care 40% este utilizată pentru sinteza a 3 molecule de ATP, restul de 60% este transformată în căldură, în energie mecanică, osmotică, electrică. Dacă fosforilarea oxidativă este cuplată cu catena de respirație la nivelul () ecuația reacției este:

NADH + + 3ADP ++2ATP

Dacă cuplarea fosforilării oxidative cu catena de respirație se face la nivelul FAD, ecuația este:

Reglarea procesului de fosforilare oxidativă se face în funcție de concentrația ADP, a oxigenului din mitocondrii, precum și în funcție de viteza procesului de respirație celulară. Cantitatea mare de ADP induce o accelerare a proceselor oxidative care asigură eliberarea unei mari cantități de energie și deci de formare a unui număr mare de molecule de ATP.

Creșterea concentrației de ATP induce o accelerare a proceselor consumatoare de energie, în urma cărora crește concentrația de ADP care va induce intensificarea proceselor respiratorii. În acest fel ADP reglează procesul de fosforilare oxidativă printr-un mecanism feed-back pozitiv:

Reglarea procesului de fosforilare oxidativă se poate realiza și prin intermediul unor substanțe care inhibă formarea ATP, fără a modifica viteza reacțiilor din catena de respirație. Aceste substanțe determină decuplarea fosforilarii oxidative de reacțiile din catena de respirație și se numesc: agenți decuplați ai fosforilării oxidative (2,4-dinitrofenol, dicumarolul, gramicidina). Alte substanțe, ca de exemplu antibioticile, oligomicina, rutamicina, aurovertina inhibă în acelși timp și respirația celulară. Cuplarea, respectiv decuplarea procesului de fosforilare oxidativă de reacțiile catenei de respirație este controlată de organism și prin necesitățile energetice ale acestuia.

La temperaturi scăzute are loc o decuplare a celor două procese, iar energia rezultată din catena de respirație este transformată în căldura necesară termoreglării. Această reglare se face de obicei pe cale hormonală. Viteza respirației celulare scade când concentrația tiroxinei și a triiodtironinei este mică și crește odată cu creșterea acestor hormoni tiroidieni. Tiroxina stimulează respirația decuplând-o de procesul de fosforilare oxidativă. [30]

4.3.2Biodegradarea trigliceridelor

Hidroliza trigliceridelor are loc sub influența enzimelor triglicerid lipaze rezulând glicerina și acizi grași:

Cea mai importantă enzimă este triglicerid lipaza din țesutul adipos, răspunzătoare de mobilizarea rezervelor lipidice ale organismului. Activitatea enzimei crește sub influența catecolaminelor, a glucagonului (hormoni lipolitici). Activitatea este mediată de . Forma activă a enzimei este forma fosforilată. Glicerina se transformă în acid 3-fosfogliceric sub acțiunea glicerofosfokinazei și ATP.

Acidul 3-fosfogliceric este oxidat sub acțiunea α-glicerofosfat dehidrogenza cu o coenzimă NAD rezultând dihidroxiaceton fosfatul.

Dihidroxiaceton fosfatul se izomerizează la gliceraldehid-3-fosfat care intră în secvența glicolitică. [31]

Biodegradarea acizilor grași

În condiții normale, trigliceridele acoperă 40% din nevoile energetice ale organismului. Acizii grași rezultați prin hidroliza trigliceridelor exogene sau endogene se degradează oxidativ până la și rezultând energie.

β oxidarea acizilor grași (Ciclul lui Lynen)

În acest proces molecula de acid gras suferă un atac oxidativ în poziția β față de gruparea –COOH urmat de desprinderea unui fragment de 2 atomi de carbon sub formă de acetilCoA. Prin repetarea secvenței β oxidative rezultă alte molecule de acetilCoA. [32]

Etapa a doua de degradare oxidativă a acizilor grași constă în degradarea resturilor de acetilCoA în ciclul lui Krebs.

Procesul se încheie prin fosforilarea lanțului respirator de către coenzimele reduse, concomitent cu biosinteza de ATP.

Etapele β oxidării

Activarea acizilor grași

Activarea are loc în citoplasma extramitocondrială prin reacția acidului gras cu HSCoA, pe seama energiei furnizate de ATP sub acțiunea unei tiokinaze specifice:

R-COOH + HSCoA + ATPR-CoSCoA + AMP + PPi

Acid gras AcetilCoA

Intermediar se formează anhidrida mixtă a acidului gras cu restul fosforic din AMP, intermediar denumit aciladenilat:

acil adenilat acil~SCoA

Tiochinazele se găsesc localizate în membrana extramiticondrială.

Transferul derivaților acilCoA în mitocondrii

β oxidarea are loc în mitocondrii, iar acilCoA se formează în citosol. Membrana internă a mitocondriilor este impermeabilă pentru acilCoA.

Transportul acidului gras prin membrana mitocondrială o constituie preluarea restului acil de către cornitină (β-hidroxi-γ-trimetilamoniubutirat). Reacția este catalizată de o transferază specifică și are următorul mecanism:

Carnitina Acetil~CoA

Acil~carnitina

Acil-carnitina străbate membrana mitocondrială, apoi, sub acțiunea unui transferaze specifice are loc transferul grupei acil de la carnitină la HSCoA intramitocondrial.

AcetilCoA + HSCoAAcetilCoA + carnitina

AcetilCoA intră în ciclul β oxidării din comportamentul matricial intern al mitocondriei.

Dehidrogenara acetil~CoA

Dehidrogenara acetil~CoA are loc sub acțiunea acetilCoA dehidrogenazei cu o coenzimă FAD:

Bilanț energetic

Palmitil~CoA este degradat la acetil~CoA prin repetarea ciclului β-oxidativ de 7 ori.

Palmitil~CoA + 7HSCoA + 7FAD +

Cele 8 molecule de acetil~CoA formate în β-oxidare intră în ciclul lui Krebs iar coenzimele FADH și FADH+formate intră în catena de respirație generând ATP.

Prin degradarea în ciclul lui Krebs a unei molecule de acetil~CoA rezultă 3 molecule de , una de FAD și una de ATP.

Din β-oxidarea acidului palmitic rezultă 7 molecule și 7 .

În total, prin degradarea unei molecule de acid palmitic rezultă 31 molecule , 15 moleculeși 8 molecule de ATP.

Din 31 molecule rezultă prin fosforilare 93 molecule ATP.

Din 15 molecule rezultă prin fosforilare 30 molecule ATP.

Din β-oxidare rezultă prin fosforilare 8 molecule ATP.

131×7=917Kcal/mol

4.3.3Metabolismul aminoacizilor

Se realizează prin mecanisme generale de degradare și de biosinteză comună tuturor aminoacizilor, dar și pe căi particulare, proprii fiecărui aminoacid.

Principalele procese de biodegradare ale aminoacizilor sunt:

– desaminarea;

– decarboxilarea;

– transaminarea. [33]

Desaminarea aminoacizilor

Constă în îndepărtarea grupărilor aminice din poziția α a aminoacizilor sub formă de aminoacizi.

Desaminarea poate fi oxidativă, hidrolitică și intramoleculară.

Desaminarea oxidativă conduce la formarea α-cetoacidului corespunzător conform reacției:

Aminoacid Cetoacid

Reacția are loc în mai multe etape și este catalizată de L-aminoacid oxidaza cu coenzima FMN sau FAD:

Desaminarea reductivă are loc mai rar la animale și om, dar este frecventă la bacterii. Din reacție rezultă acidul corespunzător:

aminoacid acid carboxilic

Desaminarea hidrolitică conduce la hidroxiacidul corespunzător:

Desaminarea intramoleculară:

Decarboxilarea aminoacizilor

Are loc sub acțiunea enzimelor aminoacid decarboxilaze cu o coenzimă piridoxalfosfat:

Amină biogenă

Reacția are loc în mai multe etape:

Transaminarea

Este procesul chimic de transfer al unei grupări aminice dintr-un aminoacid pe un cetoacid:

Acidul glutamic joacă un rol important în metabolismul aminoacizilor deoarece el poate prelua grupe amino de la majoritatea aminoacizilor:

acid α-cetoglutaric acid glutamic

Reacția este catalizată de enzime numite transaminaze și au drept coenzimă piridoxal fosfatul:

Figura 17: Schema transferului grupării amino de pe aminoacid pe un cetoacid cu participarea piridoxal fosfatului

Din punctul de vedere al capacității aminoacizilor de a participa la procese de biosinteză, aminoacizii se împart în :

– aminoacizi glucoformatori a căror componentă se poate transforma în glucide;

– aminoacizi cetoformatori generatori de acilCoA care prin condensare conduce la formarea corpilor cetonici;

– aminoacizi care pot concomitent glucoformatori și cetoformatori.

Anabolismul aminoacizilor

Principalele procese de biosinteză ale aminoacizilor sunt:

– aminarea reductivă;

– transaminarea. [34]

Aminarea reductivă are ca precursori cetoacizi: acid piruvic, acid oxalacetic, acid α-cetoglutaric. Reacția generală este:

Exemplu:

Acid α-cetoglutamic Acid glutamic

Alte mecanisme implicate în biosinteza aminoacizilor neesențiali sunt:

– hidroxilarea;

– transferul grupării;

– transferul grupării SH;

– transferal de grupări cu un singur atom de carbon.

Transaminarea reprezintă o cale atât de biodegradare cât și de biosinteză a aminoacizilor.

5 Metode de separare și determinări cantitative ale unor proteine naturale

Separarea și purificarea unei proteine dintr-un extract proteic total este una din cele mai importante părți din cercetarea biochimiei proteinelor, utilizând metode specifice care conservă activitatea biologică a acestor macromolecule.

Metodele de separare a amestecurilor de proteine se bazează pe proprietățile acestora ca: masa moleculară, solubilitatea, încărcarea electrică, diferențe în caracteristicile de absorbție, afinitate biologică pentru alte molecule.

5.1Metode de separare

5.1.1Separarea proteinelor prin electroforeză pe gel de agar

Agarul este un amestec de polizaharide lineare compuse în principal din D-galactoză și 3,6 anhidro L-galactoză, obținut din diferite specii de alge marine. Macromoleculele gelului de agar sunt ținute asamblat prin legături de hidrogen, spațiale libere din structura gelului formând microcristale.[35]

Agarul prezintă dezavantajul de a conține un număr mare de grupări încadrate electric, ceea ce conduce la apariția unor efecte secundare migrării electroforetice. Araki a demonstrat că agarul constă din două componente: agaropectină – fracția care conține grupările încărcate electric și agaroză – componentă neîncărcată electric. Pentru acest motiv, în ultimul timp se preferă separarea proteinelor prin electroforeză pe gel de agaroză.

Prin încălzirea unei anumite cantități de agar sau agaroză, suspendate într-o soluție tampon adecvată, pe o sită de azbest, sub agitare continuă, are loc inhibarea particulelor polizaharidului și formarea unei soluții care prin răcire gelifică.

Principiul metodei

În câmp electric, printr-un gel de agar preparat într-o soluție tampon, componentele unui amestec de proteine migrează în direcția și la viteza corespunzătoare încărcării lor electrice. Fracțiile separate pot fi detectate prin tehnici speciale de colorare și determinate cantitativ.

Aparatură

1 Aparat de electroforeză;

2 Redresor de curent 0-600V și 0-60Ma;

3 Plăci de sticlă de dimensiunea cm.

Soluții

1Soluție tampon (29,43g veronal sodic și 19,43g sunt dizolvate în aproximativ 1000mL apă distilată. La această soluție se adaugă 180 mL HCl 0,1N și volumul este adus la 3000 mL cu apă distilată; pH-ul soluției este 8,6).

Soluția de agar (1,5g agar solid se amestecă cu 1000mL soluție tampon 1, distilată 1:1 cu apă distilată). Suspensia este încălzită sub agitare continuă pe o sită de azbest până se obține o soluție limpede.

Prepararea plăcilor de agar

Pe fiecare placă, bine spălată, degresată și uscată, se pipetează 12 mL gel fierbinte. Operația se realizează pe o suprafață perfect orizontală, suficient de repede pentru ca gelul să nu se solidifice. După ce gelul s-a solidificat, se practică în mijlocul plăcii, în masa gelului o fantă care marchează linia de start și în care se aplică amestecul de proteine ce urmează a fi separat. Fanta se poate realiza punând pe placa de sticlă, înainte de turnarea gelului, o bucățică de sticlă cu lungimea de 1 cm, care se îndepărtează după ce gelul s-a solidificat.

Umplerea tancului electroforetic cu tampon

În fiecare compartiment al tancului electroforetic se introduc circa 500Ml tampon1 și se stabilește contactul între ele.

Aplicarea probei

Proba de analizat se încălzește pe baie de apă la și se amestecă 1:1 cu o cantitate din gelul fluid 2. Amestecul se introduce repede, cu ajutorul unei micropipete, în fanta practicată în gel, la jumătatea plăcii. În câteva minute, gelul se solidifică, înglobând proba și refăcând uniformizarea suportului electroforetic. În cazul particular în care se face separarea electroforetică a proteinelor serice, pe placa de agar se aplică amestecul: 0,2 mL ser + 0,3 mL apă distilată + 0,5 soluție agar 1,5%.

Electroforeza

Plăcile cu agar se introduc în tancul electroforetic, iar legătura cu soluția de tampon este asigurată prin intermediul unor benzi de hârtie de filtru umectată în tampon. Proteinele din ser sunt supuse elecroforezei la 6V/cm, timp de 4-5 ore; temperatura de lucru nu trebuie sa depășească .

Fixarea proteinelor

Fracțiile proteice separate electroforetic sunt fixate pe placa cu gel de agar prin plasarea acesteia într-o soluție de acid acetic 2% timp de o oră.

Uscarea plăcii de agar

După fixarea plăcilor de agar, placa este acoperită cu o hârtie de filtru îmbibată cu apă distilată și uscată peste noapte. După uscare, hârtia de filtru este îndepărtată și placa este colorată printr-o metodă potrivită.

Deoarece procesul de electroforeză este puternic, migrarea proteinelor către catod este accelerată. Pentru a evita acest proces, se recomandă aplicarea probei de separate în mijlocul plăcii de agar.

5.1.2 Precipitarea

Proteinele globulare prezintă o structură tridimensională, în care grupările polare, hidrofile sunt orientate, stabilind interacții ion-dipol sau dipol-dipol cu moleculele apei din mediu, în timp ce grupările hidrofobe sunt orientate spre interiorul globulului proteic, alcătuind un miez hidrofob. În cazul albuminelor, interacțiile dintre grupările hidrofile și moleculele de apă sunt mai proteice decât între moleculele proteice învecinate, proprietate care conduce la solubilizarea acestor proteine în apă. În cazul globulinelor, solubilizarea nu se poate realiza decât în prezența unor cantități mai mici de sare, când apar interacții între grupările hidrofile al proteinei și ionii sării dizolvate.

Pentru o proteină dată, solubilitatea crește cu creșterea concentrației unei sări neutre (salting-out). Fiecare proteină, în funcție de structura sa, precipită la o anumită concentrație dintr-o sare, deci, teoretic, este posibilă precipitarea fracționată, treptată, a proteinelor dintr-un amestec și separarea lor.

În solubilitatea S și tăria ionică a unei soluții saline, există relația:

LogS =

unde este constanta de precipitare caracteristică pentru o anumită proteină și pentru o sare neură cu care a fost realizată precipitarea.

Precipitarea proteinelor la concentrații saline mari se datorează faptului că ionii sării îndepărtează mare parte din moleculele de apă care în mod obișnuit hidratează suprafața proteinelor, fenomen care conduce în final la precipitarea acestora din soluție. Fenomenul de precipitare este reversibil. Prin reluarea precipitatului într-un volum limitat de apă, acesta se redizolvă, semn că nu a fost alterată structura terțiară a macromolecului proteice. [36]

Pentru a fi utilizată ca agent de precipitare fracționată a unui amestec de proteine, o sare neutră trebuie să îndeplinească următoarele condiții:

– să aibă o mare solubilitate în apă, pentru a permite obținerea unei game variate de concentrații la care să precipite diferențiat proteinele din amestec;

– dizolvarea sării în mediul apos să nu fie însoțită de procese exoterme, care pot denatura termic proteinele sau provoca variații de pH;

– sarea nu trebuie să interacționeze chimic cu proteina, ceea ce înlesnește separarea ei ulterioară din precipitatele proteice.

Dintre sărurile utilizate curent în precipitarea fracținată a proteinelor amintim: ; ; ; NaCl. Sulfatul de amoniu este cel mai des utilizat agent de precipitare fracționată a proteinelor, fiind o sare deosebit de solubilă (70,6g la 100 mL, la ) și manifestând un efect protector asupra multor proteine cu funcții biologice ca de exemplu enzimele. Utilizarea sulfatului de amoniu prezintă și unele dezavantaje: interferă în dozarea proteinelor prin metoda Lawrzy, iar prin solubilizare au loc mici variații de pH

5.1.3Fracționarea proteinelor dintr-un extract prin precipitări cu sulfat de amoniu

Principiul metodei

Într-un extract proteic total se introduce sulfat de amoniu până la o concentrație finală de 30% din saturație, care precipită o parte din proteine (fracția proteică de 30% saturație ) care pot fi saturate prin centrifugare. În supernatat este crescută concentrația în sulfat de amoniu până la 60% saturație, când precipită o altă fracție de proteine (30-60% saturație). După centrifugare se reține fracția , iar în supernatant este crescută saturația. Prin centrifugarea suspensiei se obține o a treia fracție proteică (proteine precipitate în domeniul 60-90% saturație). Cele trei fracții proteice , , sunt reluate în volume minime de apă distilată sau soluții saline și analizate din punct de vedere al concentrației proteice. În cazul în care fracționarea cu sulfat de amoniu a fost relizată în scopul purificării unei proteine cu funcție biologică, de exemplu a unei enzime prezente în extractul inițial, cele trei fracții sunt și din punct de vedere al capacității catalitice respective.

Metoda este utilizată pentru purificarea unor enzime, anticorpi, hormoni proteici. Pentru aceasta, atât în extractul total cât și în fiecare fracție proteică este testată activitatea biologică a proteinei care urmează a fi purificată. Dacă, de exemplu, activitarea biologică testată este găsită numai în extractul proteic total și în fracția , fracțiile , sunt aruncate.

5.1.4Purificarea substanțelor proteice prin dializă

Principiul metodei

Dializa este o metodă de separare a biomoleculelor mari de molecule mici cu ajutorul unei membrane semipermeabile, care permite trecerea numai a compușilor cu mase moleculare mici. Amestecul de separat este introdus într-un sac de dializă imersat într-un exces de solvent apos. Moleculele mici sau ionii trec prin membrana semipermeabilă în lichidul exterior până când este atins echilibrul. [37]

Purificarea proteinelor prin dializă se bazează pe caracterul lor macromolecular datorită căruia formează cu apa soluții coloidale.

Rectivi și soluții: soluție NaCl 5%, soluție 1%, soluție NaOH 1%, soluție 2%, făină de grâu, sac de dializă (din celofan).

Mod de lucru

Într-un pahar Berzelius de 250 mL se introduc 250 mL soluție de NaCl 5% și se adaugă sub agitare mecanică, în proporții mici 10g făină de grâu. Suspensia se agită la temperatura abiantă timp de 30 minute, după care se filtrază pe filtru cutat. Pe 3mL filtrat se încarcă reacția biuretului. Din filtrat se introduc 10-15 mL într-un cristalizor cu apă distilată. Dializa este favorizată prin amestecarea continuă a dializatului cu ajutorul unui agitator magnetic. [38]

La diferite intervale de timp se iau proporții din dializat și se testează prezența proteinei prin reacția biuretului și prezența ionilor de prin reacția cu .

5.2Metode de dozare a proteinelor

Pentru dozarea proteinelor au fost folosite de-a lungul timpului, diverse metode directe și indirecte.

5.2.1Dozarea azotului total și a proteinei brute (metoda Kjeldahl)

Principiul metodei

Dozarea proteinelor se realizează prin extracția lor cantitativă din materialul biologic, purificare de orice alt compus anorganic sau organic și cântărire. [39] Cum operațiile sunt foarte dificile, de obicei se recurge la metode indirecte, din care face parte și metoda bazată pe determinarea azotului. Ținând seama că procentul de azot dintr-o proteină dată este constant, se pote deduce ușor cantitatea acesteia. Exemple:

a)Cazeina conține 15,63% azot. Într-un preparat de cazeină s-au găsit 24,7mg azot. Cantitatea de cazeină din preparat se determină astfel:

15,63 gN 100 g cazeină

24,7 mgNx mg cazeină

x==15,8mg

b)Zeina conține 16,2% N. La analiza unui material conținând zeină s-au găsit 2,11% N. Conținutul procentual de proteină va fi =13,0%.

O deficiență a metodei constă însă în fapul că procentul de azot nu este cunoscut pentru toate proteinele, iar de cele mai multe ori, în materialele biologice asemănătoare, chiar dacă natura proteinelor este aceeași.

Raporturile cantitative dintre ele pot să varieze și o dată cu ele și conținutul mediu în azot. În diverse proteine, datorită diferențelor în conținutul de aminoacizi, procentul de azot variază între 14,0-19,5%. Această variație relativ mică, se obișnuiește să se adopte pentru conținutul de azot, o valoare medie convențională, aceeași pentru toate determinările.

Primele analize de proteine animale au arătat o variație a conținutului de azot între 15-17% cu o medie de 16% care a fost adoptată ca valoare convențională.În acest caz proteină % = .

Determinările ulterioare au arătat că pentru proteinele vegetale procentul real de azot este mai mare: 17,0-19,5%. De asemenea se recomandă folosirea unor coeficienți de calcul corespunzători. De exemplu pentru semințele de:

– porumb, fasole: 6,0;

– mazăre, orez, ovăz, grâu, secară: 5,7;

– în cânepă, ricin, alune, bumbac, floarea-soarelui: 5,5.

A doua deficiență a metodei o constituie faptul că de obicei, materialul din care se dozează azotul nu este supus unei purificări prealabile, astfel el mai conține și alți compuși cu azot neproteici: săruri de amoniu, alcaloizi, acizi nucleici, clorofilă, aminoglucide, cefaline, leucine.

Prin analiza materialului brut se obține o valoare a azotului total, din care se deduce proteina brută.

Dacă se precipită proteinele cu un agent și se îndepărtează prin filtrare, în filtrat se poate doza azotul neproteic. Azotul proteic se determină prin diferență între azotul total și cel neproteic.

Dozarea azotului

Materialul genetic este mineralizat prin încălzire cu în prezență de catalizatori. Elementele componente se transformă în substanțe anorganice simple, ușor de dozat. Astfel, carbonul trece în acid fosforic, iar azotul în amoniac. Amoniacul rezultat este reținut de sub formă de sulfat de amoniu: [40]

+

O parte din acidul sulfuric este antrenat cu vapori de apă și absorbit într-o soluție de acid sulfuric N/10 cu titru cunoscut. Excesul de acid sulfuric este titrat cu o soluție de hidroxid de sodiu.

Amoniacul poate fi dozat și colorimetric, cu reactiv Nessler (iodură mercurică de potasiu, în mediu alcalin). Reactivul Nessler reacționează cu sarea de amoniu din mineralizat formând un sol coloidal colorat, colorimetrabil la 480nm.

Reactivi și soluții: soluție concentrat; catalizatori: ,; oxidanți: care se pot adăuga spre sfârșitul mineralizării pentru a accelera oxidarea; soluție 0,1N; soluție NaOH 0,1N; soluție NaOH 30-40%; indicator roșu de metil sau un amestec de roșu de metil și albastru de metil (violet în mediu acid, verde în mediu bazic).

Aparatura

Mineralizarea se execută în baloane Kjeldahl de volum corespunzător mărimii probei, prevăzut cu refrigerent. Se lucrează numai sub nișă deoarece se degajă vapori corozivi. Distilarea amoniacului rezultat prin mineralizarea probei se realizează într-un aparat Parnas-Wagner:

Figura 18: Aparat Parnas-Wagner

Mod de lucru

Mineralizatul se mărește și se omogenizează. Mărimea probei se alege în funcție de procentul de azot presupus. Proba se trece în balonul Kjeldahl. Se introduce acidul pentru mineralizare, de obicei acid sulfuric în cantitate de 20 mL/g substanță uscată. Se lasă să se usuce, mișcând circular și evitând împrăștierea materialului pe pereții balonului. Încălzirea se face treptat, cu prudență, până la încetarea spumei, apoi se încălzește mai puternic. Se adaugă catalizatorul, în cantitate de 0,05-0,1g pentru fiecare 10mL acid sulfuric folosit și se continuă încălzirea. Când începe o degajare de vapori albi, se reglează încălzirea astfel ca lichidul să fiarbă domol. [41]

După 1-8 de încălzire, în funcție de natura materialului de analizat, lichidul devine limpede și incolor. Din acest motiv, se mai continuă încălzirea cîteva ore. Se lasă să se răcească până la cica , se diluează (de trei ori volumul) și se tranzvazează cantitativ în vasul de antrenare, spălând de 2-3 ori balonul Kjeldahl și pâlnia. După transvazare, în paharul de colectare a distilatului se toarnă cantitatea de acid diluat, cu titru cunoscut, câteva picături de indicator și se așează astfel ca țeava refrigerentului să intre sub nivelul lichidului. Pentru captarea se folosește de obicei acidul sulfuric 0,1N. Se ia un exces de circa 50%. Acidul se măsoară exact, într-o biuretă. În vasul de antrenare se adaugă 2-3 picături de fenoftaleină apoi, cu precauție o soluție de 30-40% NaOH. Volumul de soluție de NaOH trebuie sa fie de 5 ori mai mare decât cel al acidului sulfuric folosit inițial la mineralizare. Astfel obținut prin mineralizarea probei trece în . Se închide robinetul pâlniei de umplere și se deschide robinetul de admisie a vaporilor, reglând debitul astfel încât în vasul de culegere a distilatului bulele de aer să barboteze în acid sulfuric în ritm de 2-3/secundă. Uneori , în timpul distilării se observă virarea culorii în vasul de culegere a distilatului. Aceasta se poate datora fie unei distilări prea energice, când are loc trecerea unor stropi de lichid alcalin în refrigerent, iar distilarea este ratată, fie distilării unei cantități de amoniac mult mai mare decât cea prevăzută, care neutralizează tot acidul sulfuric.

Distilarea se oprește atunci când o picătură de distilat, culeasă după spălarea cu apă a exteriorului țevii refrigerentului, nu mai albăstrește hârtia de turnesol sau nu mai dă reacția pozitivă cu reactivul Nessler. După terminarea distilării, țeava refrigerentului se spală, iar excesul de acid din paharul de colectare a distilatului se titrează cu o soluție de NaOH de aceeași normalitate ca a acidului folosit:

Calculul se efectuează după relația:

%proteină brută=

unde: V – volumul soluției de 0,1N folosit pentru prinderea amoniacului;

– volumul soluției de NaOH 0,1N necesar pentru neutralizarea excesului de 0,1N;

0,0014 – titrul soliției de în raport cu azotul (din amoniac);

6,25 – factor de transformare a cantității de azot în cantitate de proteină;

m – masa probei de analizat, în grame.

5.2.2 Dozarea proteinelor prin metoda biuretului

Principiu

Sulfatul de cupru, în mediu bazic reacționează cu substanțele care conțin două sau mai multe legături peptidice formând un complex violet. Intensitatea culorii este o măsură a numarului de legături peptidice prezent în proteină fiind deci, proporțională cu concentrația soluției proteice. [42]

Metoda este utilizată pentru dozarea unor cantități relativ mari de proteine (1-20mg).

Reactivi și soluții: soluție standard de albumină serică bovină (BSA) 5mg/mL; reactiv biuret (se adaugă 3g și 9g tartrat de

sodiu și potasiu în 500mL soluție NaOH0,2M); se adaugă 5g KI și se aduce volumul la 100 mL cu NaOH 0,2M; extract proteic total.

Mod de lucru

În 6 eprubete se pipetează:

și câte 3 mL reactiv biuret. Probele se agită energic, se incubează timp de 10 minute la iar după răcire se colorimetrează la 540nm față de apa distilată. Se construiește o curbă etalon trasând pe abscisă mg proteină/2mL, iar pe ordonată nm. Se determină concentrația proteică în extractul proteic total incubând 2mL extract cu 3 mL reactiv biuret timp de 10 minute la . După răcire proba se colorimetrează la 540 nm față de apa distilată, iar absorbția se transformă în concentrație proteică (2mg/2mL) cu ajutorul curbei etalon. Dacă intensitatea culorii complexului format este puternică, se recurge la diluarea preparatului proteic până când absorbția măsurată se încadrează în curba etalon. Valorile obținute trebuie multiplicate apoi cu factorul de diluție. [43]

5.2.3 Dozarea proteinelor prin metoda Lowry

Principiu

Metoda se bazează pe formarea unui complex cupric prin reacția proteinei cu un reactiv alcalin de cupru (reacția biuretului) și pe reducerea fosfomolibdaților și fosfowolframaților din reactivul Folin-Ciocâlteu de către compușii fenolici din proteină, în special tirozina.

Reactivi și soluții

Reactivul Felin-Ciocâlteu: într-un balon de refluxare se introduc pe rând 100g care se dizolvă în circa 700mL apă distilată, după care se adaugă 50 mL 85% și 100 mL HCl concentrat și se refluxează la flacără 10 ore. Apoi fierbe 15 minute fără refrigerent, se răcește la temperatura camerei, se distilă la 1L și se filtrează. Reactivul, de culoare galbenă, trebuie ținut într-o sticlă brună, etanșă, curată la . Reactivul este extrem de ușor, când devine verzui. Înainte de utilizare se diluează o parte reactiv cu 10 părți apă distilată. [44]

Reactiv alcalin de cupru:

– A: anhidru, soluție 10% în NaOH soluție 0,5N

– B: soluție 0,5% de în citrat de sodiu 1%.

Înainte de întrebuințare se amestecă 10 părți reactiv A cu o parte reactiv B.

– soluție standard de albumină serică bovină 10 mg % preparată în apă distilată;

– extract proteic total.

Mod de lucru

1mL preparat proteic, 1 mL reactiv alcalin de cupru, se amestecă bine și se lasă în repaus 10 minute la temperatura camerei pentru formarea proteinizatului de cupru. După aceea se adaugă 3mL reactiv Folin-Ciocâlteu (diluat 1:10).

Probele se agită energic și se incubează 10 minute la , se răcesc și se colorimetrează la 660 nm față de apa distilată.

Construirea curbei etalon

Din soluția standard de albumină serică bovină se realizează diluții astfel:

În fiecare eprubetă se adaugă câte un mL reactiv alcalin de cupru, se incubează 10 minute la temperatura camerei, apoi se adaugă câte 3 mL reactiv Folin-Ciocâlteu diluat 1:10 se agită energic și se incubează 10 minute la . După răcire probele se colorimetrează la 600 nm față de apa distilată. Se tratează curba etalon luând pe abscisă proteină/mL iar pe ordonată .

Calculul rezultatelor

Absorbanțele probelor cu soluții de proteină sunt transferate în termeni de concentrație cu ajutorul curbei etalon. Dacă sunt mai mari din curba etalon se recurge la diluarea preparatului probei, în cadrul concentrației ținându-se seama de factorul de diluție.

Observații

– reactivul alcalin de cupru se prepară extemporaneum pentru a evita carbonarea sau precipitarea hidroxidului cupric;

– adăugarea reactivului Folin-Ciocâlteu trebuie efectuată rapid, deoarece în mediu alcalin reactivul este distrus;

– pentru dezvoltarea culorii, amestecul de reacție trebuie să aibă pH 10; asigurarea alcalinității este condiția reproductibilității rezultatelor;

– încălzirea probelor la , timp de 10 minute poate fi înlocuită cu staționarea la temperatura camerei timp de 45 minute;

– în concentrații mari afectează determinările: sulfatul de amoniu, hidrazina, sărurile de potasiu, acid sulfosalicilic.

5.2.4 Dozarea colorimetrică a activității peroxidazei

Termenul de perozidaze include o grupă de enzime specifice, ca NAD perozidaza, NADP perozidaza, acid gras perozidaza, citocrom perozidaza, glutation perozidaza și o grupă de enzime nespecifice izolate din diferite surse, cu nomenclatura sistemică donor de hidrogen oxidoreductaza și codul EC 1.11.1.7. [45]

Peroxidaza catalizează dehidrogenarea unei mare număr de compuși organici ca de exemplu: fenol și amine aromatice, hidrochinone, în special derivați benzidinici. În particular pot fi menționați o-crezol, o-toluidina, guaiacolul, pirogalolul, acid homovanilinic, p-hidrochinona, o- sau p-fenilen diamina, leucomalachitul verde, 2,6-diclorfenol indofenolul redus; 4,-diaminodifenil amina, benzidina, o-tolidina, di-o-anisidina, etc.

Cu puține excepții, peroxidazele cu codul EC 1.11.1.7 sunt hemoproteine, catalizând reacția:

Există însă și peroxidaze care acționează asemenea oxidazelor:

sau monooxigenazelor:

Peroxidazele sunt găsite în hrean, ananas, smochine, cartofi, legume, grâu, tabac, in, drajdii, fungi și bacterii.

La mamifere au fost evidențiate peroxidaze în leucocite, lapte, ficat, splină, uter, glande salivare, perete intestinal, mucoasa intestinală, plămân, glanda tiroidă în fracțiile supernatant, microzomiale și miticondriale.

Principiul metodei

Metoda se bazează pe proprietatea peroxidazei de a oxida, în prezența apei oxigenate sau a altor peroxizi, compuși de natură aromatică; rezultă chinone care prin polimerizare dau compuși de culoare brună (melanine). Reacția este foarte sensibilă. În acest caz se folosește drept substrat o soluție alcoolică de guaiacol.

Reacția continuă cu polimerizarea chinonelor și formarea unor compuși colorați în brun.

Reactivi: -soluție alcoolică de guaicol 1%;

-apă oxigenată 0,5m;

-clorură de sodiu 2%.

Mod de lucru

Se cântăresc 5-10g produs și se mojarează fin cu 25mL soluție NaCl 2%. Se trece conținutul mojarului, cantitativ într-un cilindru gradat de 100mL cu apă distilată și se aduce la semn; se omogenizează bine și se lasă 15 minute pentru extracție, timp în care se mai agită de câteva ori; se filtrează prin filtru cutat într-un vas curat și uscat. Din filtru se iau 10 mL și se lasă la temperatura camerei timp de 30 minute. Se obține o culoare brună mai mult sau mai puțin intensă, în funcție de cât este de activă enzima.

Se determină extincția soluției la un fotocolorimetru, la lungimea de undă de 420 nm, prin cuvă de 1 cm, folosind ca blanc apa distilată. Dacă soluția este intens colorată se face o diluție corespunzătoare.

Mod de calcul

În funcție de extincția determinată și de diluțiile efectuate se exprimă activitatea peroxidazei în extincție pentru 1 g de produs:

unde E -extincție determinată;

G- cantitatea de preparat enzimatic sau sursă de enzimă în g sau mL;

d-diluția.

5.2.5 Dozarea activității catalazei

Catalaza (peroxid de hidrogen:peroxid de hidrogen oxidoreductaza, EC1.11.1.6) este o enzimă întâlnită în toate organismele vii. A fost pentru prima dată izolată și obținută în stare cristalizată în 1937, de Summer și Douce din țesutul hepatic ovin. Enzima prezintă o masă moleculară de 240 000 daltoni, patru grupări feriprotoporfirinice, ceea ce corespunde unui conținut de Fe (II) de 0,09%. Catalaza prezintă o absorbție specifică de 405nm (banda Soret), valoarea existenței fiind utilizată la determinarea concentrației catalazei. [46]

Activitatea catalazei variază în diferite țesuturi; cea mai mare activitatea enzimatică fiind depistată în ficat și rinichi, iar cea mai mică în țesutul conjunctiv. În țesuturi, catalaza este în principal legată de mitocondrii și peroxizomi în timp ce în eritrocite enzima este solubilă. Activitatea catalazică a sângelui este datorată eritrocitelor.

Catalaza prezintă o funcție dublă deoarece catalizează reacțiile:

(1)

(2)

-descompunerea peroxidatului de hidrogen, un proces redox în care o moleculă este agent oxidant, iar cealaltă este agent reducător;

-oxidarea unor donori de hidrogen (metanol, etanol, acid formic, fenoli)

Reacția predominantă depinde de concentrația donorului de hidrogen sau de viteza cu care sistemul enzimatic este alimentat cu . Inițial, se formează complexul I: catalizează după care prin reacția rapidă cu a doua moleculă de se formează complexul II. Constanta de viteză pentu reacția (1) este , în timp ce reacțiile peroxidazice (2) au loc mai lent: moli.

Funcția fiziologică a catalazei este însă obscură. Probabil catalaza, localizată în peroxizomi joacă un rol important în metabolizarea rapidă a peroxidului de hidrogen, metabolit deosebit de toxic pentru celula vie. De Duve și Baudhuin propun următorul mecanism, în care este integrată catalaza:

unde este acid uric, D-aminoacizi, L-aminoacizi, hidrixiacizi, acid glicolic, metanol, etanol, formiat, fenoli. [47]

În peroxizomi coexistă enzime producătoare de : D și L-aminoacid oxidaza, urat oxidaza și enzime consumatoare de : catalaza și peroxidaza.

În eritrocite, catalaza manifestă o funcție protectoare față de hemoglobină și diferite proteine SH. La concentrații scăzute de catalază sunt deosebit de nocivi agenții oxidanți (, acidul ascorbic, metal hidrazina) sau radiațiile X care conduc la formarea methemoglobinei.

Determinarea activității catalazei prezintă o deosebită importanță în analiza laptelui. În mod normal, laptele nu trebuie să manifeste o activitate catalizică. Dacă în lapte este depistată această enzimă, există indicații asupra prezenței leucocitelor care provin de la unele maladii de secreție sau ale ugerului. Activitatea catalazică din laptele pasteurizat reprezintă și un indiciu că acest proces a fost efectuat defectuos deoarece există încă forme vegetative care conțin catalază.

Cantitatea de enzimă prezentă este definită prin așa numitul număr catalitic care se exprimă prin cantitatea de descompusă de 100g lapte, în decursul a două ore. Oxigenul eliberat enzimatic este delimitat volumetric cu un aparat numit catalazerul Lobeck. [48]

Dozarea activității catalazei poate fi urmărită spectrofotometric în UV. Prin titrare perganometrică sau iodometrică, prin metode monometrice sau colorimetrice.

Metoda colorimetrică descrisă de Sinha (1972)

Principiul lucrării

Metoda se bazează pe faptul că bicromatul de potasiu, în mediu acid, este redus de peroxidul de hidrogen la acetat cronic, care poate fi colorimetrat la 570nm. Deoarece bicromatul nu absoarbe în această regiune, prezența compusului în mediul de reacție nu interferă cu determinarea colorimetrică a acetatului cronic. Preparatul de catalază este lăsat să acționeze asupra o perioadă fixă de timp, după care reacția este stopată cu un amestec de bicromat-acid acetic glacial. Cantitatea de rămasă după stocarea reacției enzimatice este determinată colorimetric. [49]

Calculul rezulatelor

Valorile reacțiilor se transformă în μmoli consumat /1mL preparat enzimatic/temperatura camerei.

Constanta de viteză minimoleculară K pentru descompunerea sub acțiunea catalazei, poate fi determinată utilizând ecuația pentru o reacție de ordinul 1:

unde este concentrația inițială a , iar S concentrația de peroxid după t minute. Valorile K sunt schițate față de timpul de reacție, explicat în minute, iar constanta de vitază a catalazei K(0) la 0 minute este determinată prin extrapolare.

Conținutul de catalază a preparatului enzimatic este exprimat în termini de Katalasefaähigheit sau “” , conform formulei:

care necesită și determinarea proteinelor (prin metoda Lorzy sau metoda spectrofotometrică) în preparatul enzimatic.

6 Partea experimentală

Variația activității enzimatice în frunzele de tomate tratate cu biostimulatori

Rolul substanțelor stimulatoare în reglarea proceselor metabolice la plantele legumicole a fost scos în evidență prin numeroase cercetări realizate atât la plantele cultivate în sere, cât și la culturile de câmp. [50]

Utilizarea stimulatorilor sintetici și naturali la tratarea plantelor constituie o preocupare de bază în scopul măririi potențialului productiv al acestor culturi.

Produsele se sinteză cu rol stimulator sunt destul de costisitoare, iar influența lor asupra proceselor metabolice din plante fiind mai redusă decât cea a biostimulatorilor naturali.

Am folosit o serie de extracte naturale cu rol biostimulator pentru tratarea culturilor legumicole, urmărind în special efectul acestora asupra unor procese de fotosinteză și repirație.

În acest scop am tratat semințele de tomate (Hibrid Vemonte) cu biostimulatorul Penasoil, variind concentrația soluțiilor și durata de tratare (umectare). Efectul tratamentelor a fost urmărit prin studiul variației unor oxidoreductaze implicate în procesul respirator corelat cu biosinteza principalelor biomolecule în frunzele plantelor.

Materiale și metode

Cercetările s-au efectuat asupra a nouă variante de tomate din hibridul Vemone cultivate în câmpul experimental al stațiunii de cercetare Banu Mărăcine din cadrul Universității Craiova. Semințele utilizate au fost în prealabil tratate cu soluții apoase de concentrații diferite din biostimulatorul Penasoil prin umectare, durata de umectare fiind și ea variabilă. [51]

Oxidoreductazele a căror activitate s-a studiat sunt catalaza, peroxidaza și izoperoxidazele. Analizele au fost efectuate pe material vegetal (frunze) proaspăt la trei faze de vegetație diferite ale plantelor: faza de răsad, prima inflorescență și faza de coacere completă (maturare deplină) a fructelor, la încheierea coacerii. [52, 53]

Extractele peroxidazice au fost obținute prin omogenizarea materialului vegetal cu soluție tampon acid acetic-acetat cu 4,7; centrifugare la 15000x g timp de 30 minute, precipitare cu sulfat de amoniu (20-90%). Activitatea peroxidazei s-a determinat prin metoda cronometrică, folosind drept donor de hidrogen acidul ascorbic, exprimându-se în micromoli de acid ascorbic oxidat într-un minut de peroxidază dintr-un gram de substanță proaspătă.

Extractele catalazice s-au obținut prin omogenizare cu soluție tampon fosfat cu pH 7,1; centrifugare, precipitare și din nou centrifugare. Activitatea catalazei s-a determinat prin metoda gazvolumetrică, exprimându-se în mL de oxigen eliberat de catalaza dintr-un gram de substanță proaspătă din apa oxigenată timp de 3 minute, la .

Spectrul izoperoxidazic s-a determinat prin electroforeză în gel de agaroză, vizualizarea realizându-se cu soluție de benzidină și apă oxigenată. Fracțiunile izoperoxidazice s-au exprimat în unități densitometrice obținute cu un densiometru.

Activarea acestor enzime s-a determinat pentru trei faze de vegetație diferite ale plantelor:

luna mai- faza de răsad;

luna iunie- faza de inflorescență;

luna iulie-faza de maturitate deplină a fructelor.

Rezulate și discuții

S-a constatat că activitatea enzimelor studiate variază cu concentrația soluției bistimulatorului folosit, cu timpul de umectare a semințelor, cât și cu faza de vegetație analizată. [54-57]

Activarea peroxidazei este mai mare la factorii imersați în timp mai lung în soluțiile de biostimulator (V1 și V2), cât și la variantele corespunzătoare acestora care au fost tratate cu soluții de Penasoil de concentrație mai mare (V6 și V4).

Variantele tratate cu soluții mai concentrate de biostimulator (0,01%) prezintă de asemenea o activitate mărită indiferent de timpul de umectare V4, V6, V8 . În funcție de faza de vegetație analizată, activitatea peroxidazei variază astfel: la răsaduri frunzele prezintă cea mai mică activitate peroxidazică ca apoi să crească foarte mult faza de inflorescentă, când procesele respiratorii sunt intense și să scadă din nou la faza de maturitate deplină a fructelor pentru recoltare.

Activitatea catalazei este și ea mai mare în cazul variantelor tratate cu soluții mai concentrate și menținute timp mai îndelungat în soluție. Faza de vegetație prezintă următoarea influență asupra activității catalazei: activitatea intensă în cazul răsadurilor scade brusc în faza de inflorescență, corelată cu activitatea foarte intensă a peroxidazei în această fază, apoi crește atingând valorile maxime în faza de maturitate deplină pentru recoltare.

Spectrul izoperoxidazic a fost determinat pentru a doua și a treia fază de vegetație, în acest caz observându-se că variantele tratate cu soluții mai concentrate și un timp mai îndelungat prezintă, în general, o activitate mai crescută; cât privește numărul de fracțiuni izoperoxidazice, variația acestuia nu prezintă o corelație semnificativă cu tipul tratamentului. Pentru a treia fază de vegetație se constată că variantele tratate prezintă activități izoperoxidazice mult mărite față de martorii netratați, valorile fiind comparabile cu cele din faza precedentă, cât și un număr mult mai mare de fracțiuni.

Pentru edificarea rolului biostimulatorului Penasoil în procesele de creștere și dezvoltare din plantele legumicole aceste studii se vor repeta și în anii următori și se vor extinde și asupra altor factori implicați în procesele de dezvoltare și creștere a tomatelor.

Concluzii

Activitatea perozidazei, catalazei și cea a izoperoxidazelor din frunzele de tomate ale căror semițe au fost tratate cu Penasoil variază atât în funcție de concentrațiile de tratare a semințelor, fapt care indică variantele optime de tratament, timp mai mare de umectare și soluții mai concentrate de Penasoil cât și cu faza de vegetație studiată.

Se observă concordanța activității de sinteză a biomoleculelor din frunze.

Bibliografie

1 Cristea Popa Elena, Popescu Aurora, Truția E., Dinu Veronica, Tratatat de biochimie medicală, vol. I și II, Ediția Medicală 1991.

2 Diculescu I., Onicescu Doina, Benga Ch., Popescu L. M., Biochimie celulară, Ediția Didactică și Pedagogică, București 1983.

3 Dumitru I. F., Mayer S., Turcu A., Biochimie generală, Ediția Didactică și Pedagogică, București 1983.

4 Marinescu G., Glodeanu E., Biochimie generală, Ediția Universitaria, Craiova 2005.

5 Marinescu G., Biochimie generală, Tipografia Universității, Craiova 2005.

6 Murray K. R., Granner K. D., Mayer A. P., Rowell V. W., Harper’s Biochemistry, Large Medical book, California 1988.

7 Nuță GH., Bușneag C., Investigații Biochimice, Ediția Didactică și Pedagogică, București 1977.

8 Popescu A., Cristea E, Zamfirescu Gheorghiu M., Biochimie Medicală, Ediția Didactică și Pedagogică, București 1980.

9 Rosseti-Colțoiu Matilda, Mitrea Niculina, Biochimie, Ediția Didactică și Pedagogică, București 1985.

10 Stryer L., Biochemistry, Stanford University 1995.

11 Uckum F. M., Kurosaki T., Jim J., Jun X, Morgan A., Takata M., Bolen I., Luben R. I., Bio. Molec. 1995.

12 Varo Ionescu, Dumitru Gh., Deliu Cornelia, Biochimie celulară, Ediția Didactică și Pedagogică, București 1981.

13 Dinu V., Popescu A., Cârstea-Popa E., Truția E., Tratat de Biochimie medicală, vol. I, Ediția Medicală, București 1991.

14 Badea C., Fărcășeanu V., Nicoară Elena, Șlușanschi H., Tratat de biochimie vegetală, Ediția Academiei RSR, București, vol. I 1964, vol. II 1965, vol. III 1966.

15 Benson P. F., Fenson A. H., Genetic Biochemical Disordes Oxford University, Oxford New York-Toronto 1985.

16 Campbell P., Biochimie ilustrată, Ediția Academiei Române 2004.

17 Gârban Z., Biochimie. Tratat comprehensiv vol. I, Ediția Didactică și Pedagogică, București 1999.

18 Gârban Z., Biochimie moleculară, probleme fendamentale și aplicative, Ediția Eurobit, Timișoara 1997.

19 Glodeanu E., Marinescu G., Biochimie metabolică, Ediția Gorjanul 1997.

20 Gordona Zavisic, Svetlana Seatovic, Ljubinka Gligic, 4th International Conference of Chemical Societies of the South-East European Countries, Book of Abstract, Belgrad 2004.

21 Harper H., Rodwell V. W., Mayer P. A., Review Physiological Chemistry, Large Medical Publication, Los Altos 1977.

22 Harris E. L. V., Angel S., Protein Purification Methods, A. Practical Approach, IRL Press, Oxford 1989.

23 Holub B. J. Nutritional Biochemical and clinical aspects of inostitol and phosphatidylinostiol metabolism. Can J. Physiol Pharmacol, vol. 62 1984.

24 Haulica I., Fiziologie Umană, Editura Medicală 1996.

25 Lagrimini M. L., Plant peroxidase biochemistry and phsiology-IV International Symposium Procedings, Viena 1996.

26 Laninger A. L., Biochimie, vol. I, Ediția Tehnică, București 1987.

27 Manta I., Benga C, Cucuianu M., Hodârnău A., Metode biochimice în laboratorul clinic, Ediția Dacia Cluj-Napoca 1976.

28 Ginalska G., Labarzenwki J., Greppin H., Plant Peroxidase Newslatter 2000.

29 Gordon A. H., Electroforesis of Protein in Polyacrylamide and Starch, North-Holand 1969.

30 Iordănescu D., I. F. Dumitru, Biologie practică, Proteine și enzime, partea I, București 1980.

31 H Lis and Scharon, J. Biochem 1993.

32 Perutz M. F., Proteins and nucleic acides, Amsterdam 1971.

33 Popescu Al., Băniceru Mihaela, Metode de separare și analiză în urme, Lucrări practice, Reprografia Universității din Craiova 1979.

34 Máthé Y., Galbács Z., Székely P., Romain Journal of Biochemistry, vol. 38, Bucharest 2001.

35 Morita Y., Yamashitra H., Minami J., J. Biochem 1998.

36 Șerban M., Câmpeanu G., Ionescu E., Metode de laborator în biochimia animală, Ediția Didactică și Pedagogică R A., București 1993.

37 Welinder K. G. And Gajhede M., Plant peroxidases: biochemistry and physiology, University of Geneva, Switzerland 1993.

38 Amstrong F. B., Biochemistry, Oxford University Press, New York-Oxford 1989.

39 Badea E., Marinescu G., Băbeanu C., Glodeanu E., Caiet de lucrări practice de biochimie generală, Reprografia Universității din Craiova 2001.

40 Belyavskaya M. A. Adv. Space Res 2001.

41 Bemeyer H. U., Metodes of Enzymatic Analysis, vol 1, 2, 3, 4, Academic Press 1974.

42 Bernier L. V., Navaro E., Sevilla F., Lazaro J. J. VI International Plant Peconidase Symposium Proceding, Murcia 2003, Spain.

43 Blank M., Goodman R., Bioelectromagnetics 1997.

44 Cîmpeanu G., Șerban M., Ionescu E., Metode de laborator în biochimie animală, Ediția Didactică și Pedagogică R A, București 1993.

45 Cucuianu M., Rus H. G., Niculescu D., Vopica A., Biochimie.Aplicații chimice, Ediția Dacia, Cluj-Napoca 1991.

46 Dogaru C. J., Metode de laborator în biochimie, Ediția Mirton, Timișoara 1996.

47 Dumitru I. F., Iordăchescu Dana , Introducere în Enzimologie, Ediția Medicală, București 1981.

48 Dunford H. B., Peroxidases in chemistry and biology vol. 2, CRC Press, Boca Ration, Florida 1991.

49 Escober, J. A. Vasquez-Vivar Photochem, Photobiol 1992.

50 Gasper Th., Kevers C., Hausman J. F., Penel C. L., Greppin H., Peroxidase as en indissociable factor of auxin polyamine metabolisms and physiology-IV International Symposium Proceedings, Viena 1996.

51 Jakopitsck C., Obinger C., Jvancich A, VI International Plant Peroxidase Symposium, Murcia 2003.

52 Badea E., Marinescu G., Corneanu G., Journal of Biochemistry, vol. 38, Bucharest 2001.

53 Băbeanu C., Marin N., Badea E., Marineasu G., Journal of Environement Protection and Ecology 2, Nr. 2, 2001.

54 Gilfoyle D. J., A. T. Smith-Eur. J. Biochem. 1996.

55 Glodeanu E., Băbeanu C., Marinescu G., Ciobanu A., Am. Univ. Craiova, Ser. Chim. XXXXXII, 2003.

56 Marinescu G., Glodeanu E., Badea E., Băbeanu C., Biochimie Vegetală, Caiet de lucrări practice, Reprografia Universității din Craiova 2000.

57 Marinescu G., Badea E., Băbeanu C., Glodeanu E., Plant Peroxidase Newsletter Nr. 14, 2000.