Populatii de Microorganisme In Contextul Sistemelor Ecologice ale Cavitatii Bucale

CUPRINS

PARTEA I

Date actuale despre unele bacterii

din microflora cavității bucale

1. Introducere

2. Caracterul de sistem ecologic al cavității bucale

2.1. Ecosistemul cavității bucale

2.2. Integralitatea

2.3. Echilibrul dinamic

2.4. Autoreglarea

2.5. Caracterul informațional

2.6. Caracterul istoric

3. Microflora cavitații bucale

3.1. Modul de poluare a cavitații bucale cu microorganisme

3.1.1. Aderarea prin producera de polimeri extracelulri

3.1.2. Aderarea prin polimeri salivari

3.1.3. Aderarea prin înveliș fibrilar

3.1.4. Atașarea prin intermediul altor bacerii

3.1.5. Retenții mecanice

3.2. Dezvoltarea microorganismelor din cavitatea bucală

3.3. Repertizarea și numărul bacteriilor din cavitatea bucală

3.4. Mecanisme de autoprotecție antibacteriană a cavității bucale

PARTEA A II-A

Materiale și metode

4. Identificarea agentului etiologic

4.1. Considerații generale

4.1.1. Metode moderne de control microbiologic și de diagnostic

4.2. Bacterii gram pozitive aerobe

4.2.1. Cocii gram pozitivi

5. Testarea sensibilității germenilor la agenții antimicrobieni

5.1. Indicațiile antibiogramei

5.2. Antibiograma prin metoda difizimetrică

5.3. Standardizarea candițiilor tehnice și a reactivilor de lucru

6. Rezultate și concluzii

Concluzii

Bibliografie

Pagini 93

=== liceenta ===

CUPRINS

PARTEA I

Date actuale despre unele bacterii

din microflora cavității bucale

1. Introducere

2. Caracterul de sistem ecologic al cavității bucale

2.1. Ecosistemul cavității bucale

2.2. Integralitatea

2.3. Echilibrul dinamic

2.4. Autoreglarea

2.5. Caracterul informațional

2.6. Caracterul istoric

3. Microflora cavitații bucale

3.1. Modul de poluare a cavitații bucale cu microorganisme

3.1.1. Aderarea prin producera de polimeri extracelulri

3.1.2. Aderarea prin polimeri salivari

3.1.3. Aderarea prin înveliș fibrilar

3.1.4. Atașarea prin intermediul altor bacerii

3.1.5. Retenții mecanice

3.2. Dezvoltarea microorganismelor din cavitatea bucală

3.3. Repertizarea și numărul bacteriilor din cavitatea bucală

3.4. Mecanisme de autoprotecție antibacteriană a cavității bucale

PARTEA A II-A

Materiale și metode

4. Identificarea agentului etiologic

4.1. Considerații generale

4.1.1. Metode moderne de control microbiologic și de diagnostic

4.2. Bacterii gram pozitive aerobe

4.2.1. Cocii gram pozitivi

5. Testarea sensibilității germenilor la agenții antimicrobieni

5.1. Indicațiile antibiogramei

5.2. Antibiograma prin metoda difizimetrică

5.3. Standardizarea candițiilor tehnice și a reactivilor de lucru

6. Rezultate și concluzii

Concluzii

Bibliografie

CAPITOLUL 1

INTRODUCERE

Abordez în prezenta lucrare de diplomă, date actuale despre unele bacterii din microflora cavității bucale, datorită marilor implicații pe care le are în sănătatea omului modern, în societate și nu în ultimul rând în dezvoltatrea durabilă a acesteia.

Pe lângă modul de tratare strict stomatologic care se limitează strict la prevenție, stabilizare și combaterea cariei, îmbinând cunoștințele din domeniul ecologiei, am considerat necesară o analiză mai globală a suportului și a factorilor ce influentează dezvoltatrea plăcii bacteriene generatoare de carie.

În acest sens, pornind de la similitudinea care există între organizarea unui sistem ecologic, pe de o parte și condițiile care au ca rezultat apariția cariei, pe de altă parte, am căutat să integrez datele și să studiez modelul de dezvoltare al fenomenului.

În acest fel am considerat că se realizează o abordare nouă, interdisciplinară și poate o mai bună înțelegere a complexității fenomenului cariogen și a corelațiilor pe care acesta le are cu mediul său specific, cavitatea bucală.

Punctul de vedere prezentat în această lucrare, am căutat să aibă o orientare obiectivă, comună celor două mari discipline, care au în centrul atenției lor omul și păstrarea unor condiții sănătoase, durabile, de viață.

CAPITOLUL 2

CARACTERUL DE SISTEM ECOLOGIC

AL CAVITĂȚII BUCALE

2.1 ECOSISTEMUL CAVITĂȚII BUCALE

Microorganismele care trăiesc în cavitatea bucală sunt extrem de numeroase, de ordinul bilioanelor, și chiar în condițiile unei riguroase asanări a ei și a meținerii igienei bucale. De asemenea, ele sunt foarte variate ca specii. Unele specii sunt tranzitorii, ocazionale, altele cvasipermanente. Ele nu trăiesc izolate nici ca specii , nici ca indivizi celulari, ci într-un amestec mereu schimbător datorită fluxului continuu salivar, mișcărilor mestecatorii și de deglutiție, chiar și în perioada dintre mese. Aportul alimentar și cel lichid introduc de fiecare dată cantități noi de specii. Ele constau din bacterii, protozoare, fungii, viruși, levuri, etc., de aceea, cu un termen general le numim "microbi" sau "microorganisme" și la un loc constituie flora microbiană a cavității bucale, sau prescurtat "microflora". Din ea, bacteriile reprezintă doar o parte, cea majoritară.

Între diferitele specii de microorganisme se stabilesc în timp și spațiu numeroase feluri de relații, tocmai datorită amestecului lor permanent. Aceste relații constituie sistemul ecologic al cavității bucale. Orice noțiune de ecologie, de la nivelul cavităților naturale ale omului și deci și de la nivelul cavității bucale, trebuie înțeleasă în dublu sens: pe de o parte, relațiile interspeciale, adică cele dintre numeroasele specii de microorganisme prezentate, pe de altă parte relațiile fiecăreia și în ansamblul cu mediul lor de viață, în acest caz cavitatea bucală. Nici unele, nici altele, nu rămân limitate la acest nivel, ele au răsunet asupra întregului oganism. În același timp trebuie înțelese și influențele locale asupra microflorei bucale. Cavitatea bucală ca spațiu și condițiile ce le oferă microorganismelor constituie un "habitat". Aici ele au condiții de dezvoltare pe baza resturilor alimentare, caldură, umiditate, condiții de aerobioză, un anumit pH, în general favorabil lor. Dar tot aici există și unii factori nefavorabili lor, ca lizozimul, bacteriocine, numeroși bacteriofagi, sulfocinați din saliva, anticorpi de tipul IgA și altele.

Prin factorii de mediu pozitivi și negativi, în raport cu viața și persistența lor, acest habitat exercită o acțiune selectivă asupra speciilor de microorganisme, rămânând cele cu capacități mai bune de adaptare la aceste condiții. Căci la rândul lor, fiecare dintre acești factori sunt variabili, în jurul unei medii și sunt ritmați de alimentație și obiceiurile personale.

Între microorganismele din cavitatea bucală se stabilesc tot felul de relații, potrivit metabolismuiui fiecăruia în parte, și al tuturor, ca ansamblu. În linii mari, aceste relații pot fi de stimulare a dezvoltării unei specii sau de indiferență și de inhibare. Cele de stimulare pot fi unilaterale, privind beneficiul unei specii pe seama alteia, când o denumim "toleranță" și "dependență", cum este cazul bacteriilor-doică.

Acestea furnizează diferite vitamine sau factori de creștere și altora, prin sinteza pe care o fac pentru sine. De exemplu, stafilococul favorizează in prezența sa dezvoltarea lui Hemophilus influenzae, tot stafilococul poate fi sursă de vitamina K pentru Bacteroides melaninogenicus, de care acesta din urmă are neaparată nevoie. Există relații între organisme de beneficiu bilateral, când vorbim de simbioză. Astfel de relații se instalează pe parcursul descompunerii alimentelor complexe, când în scindările făcute de unele specii de bacterii anaerobe prin fermentații rezultă compuși utili altor specii, celor aerobe, de care profită.

Relațiile de "inhibiție", de asemenea pot fi de mai multe feluri: de inhibiție unilaterală, de inhibiție reciprocă, de antibioză. Lactobacilli, prin producția lor mare de acid lactic și de alte feluri de acizi, sunt nefavorabili, prin pH pe care îl scad, pentru multe alte specii. În schimb, acidul lactic și alti acizi produși de lactobacilii heterofermentivi, precum și acizii produși de streptococi sunt utilizați de veillonelle ca surse de energie (Rogosa, 1964). Bacteriile secretoare de bacteriocine duc la scăderea numerică a speciilor și tulpinilor sensibile la acțiunea bactericidă a acestora. Streptococii viridans prin peroxidul de hidrogen ce-1 eliberează în cantitate mare inhibă dezvoltarea bacteriilor ce nu au catalaze și peroxidaze ca să îl descompună, cum este cazul anaerobilor. Unii fungi (actinomicetele) din cavtitatea bucală produc cantități mici de substanțe cu caracter de antibiotice pentru alte specii. Tot prin scăderea pH ca urmare a producerii de acizi organici din fermentații la care contribuie alături de streptococi și lactobacili, antinomicetele, stafilococii epidermilis, difteromorfii și alte specii zaharolitice, sunt inhibate în dezvoltarea lor bacteriile proteolitice (pseudomonas aeruginosa, bacilul proteu, bacteroides fragilis și alții) care au nevoie de un mediu alcalin pentru activitațile lor. Cercetările facute pe animale germ-free au arătat că bacteriile anaerobe nu pot coloniza cavitatea bucală decât dupa prealabila ei colonizare cu bacterii aerobe, ceea ce subliniază dependența unora de celelalte ca să le consume oxigenul molecular nociv anaerobilor.

Deosebim deci relații favorabile de dezvoltare, de întrajutorări interspeciale, dar și numeroase relații de antagonism la nivelul cavității bucale. Ele sunt într-o dinamică permanentă, când în favoarea unora sau unei specii, când în defavoarea unei sau mai multor specii. În același timp distingem în cavitatea bucală în diferite regiuni, pe suprafața unor mucoase sau în interiorul unor cavități cu pH-uri diferite, condiții de aerobioză și anaerobioză, concomitente sau alternative, care duc la relații diferite și creează microflorei un tablou foarte variat.

Dar bacteriile nu se înmulțesc la infinit în cavitatea bucală. Din acest punct de vedere, alături de relațiile de proliferare și de cele de antagonism, mai distingem relații de limitare per ansamblul microflorei al numărului de bacterii. Acestea din urmă nu sunt și cele mai lipsite de importanță întrucât putem presupune unde ar duce un exces bacterian. La limitarea bacteriilor contribuie diferiți factori. Unul dintre ei este lizozimul, cu acțiune deosebită asupra florei grampozitive, depolimerizându-i peretele celular și transformând-o în protoplaști ce nu pot persista ca atare în condițiile cavității bucale.Un al doilea factor limitativ este sistemul lacto-peroxidaza-SCN-H2O2.

Alți factori sunt peroxidul de hidrogen produs de numeroase specii, și în primul rând de streptococii salivarius, precum și de acizii grași volatili (Rosebury, 1962). De asemenea, în gură există, mai ales în cele cu carii, sau cu igiena deficitară, numeroase protozoare avide mâncătoare de bacterii, precum și numeroși bacteriofaci ce lizează bacteriile. Dar un rol deosebit îl are saliva, care prin cantitatea ei de 1 – 1,5 l/24 ore le spală de pe dinti și mucoase și le transportă spre aciditatea bactericidă a stomacului și alcalinicitatea de la nivelul intestinului. Rolul salivei de îndepărtare a bacteriilor reiese din faptul că dimineața la sculare gura conține o cantitate excesiv de mare de bacterii, ce se corelează cu reducerea la maximum peste noapte a salivei. Descuamarea continuă a celulelor epitetului bucal are și ea un rol în îndepărtarea microorganismelor.

Din cele expuse rezultă că există într-un anumit sens un echilibru numeric al microorganismelor bucale, cum se poate vorbi de un anumit echilibru între specii. Acest echilibru nu este întâmplător, ci este dictat de necesități, iar baza lui materială sunt caracteristicile de specie și condițiile de dezvoltare. Relațiile ce se creează între microorganisme nu sunt relații simple de prezentă, ci sunt organizate în sistem. Ansamblul lor cu cavitatea în care au loc constituie un "ecosistem". El este specific acestei cavități întrucat este diferit prin numeroase particularități de ecosistemul intestinal sau vaginal. În acelasi timp, el nu este un ecosistem standard, deoarece prin foarte multe variante ce le poate avea, ecosistemul cavității bucale diferă de la un organism la altul. El are urmatoarele caractere:

a) Este stabil, în sensul unui relativ echilibru între specii la același individ în timp și condiții obișnuite, cu variațiile mici pe care le-am semnalat.

b) Controlează rezidența și stabilirea tulpinilor bacteriene nou intrate. Ca o tulpina să se poată menține, ea trebuie să aibă capacitatea de integrare în ecosistem, ținînd cont de numeroasele condiții nefavorabile ei ce le întâmpină din partea celorlalte tulpini și specii. În acest sens, ecosistemul realizează în mod automat o împărțire a speciilor bacteriene, în permanente și trecătoare prin cavitatea bucală. Nu orice bacterii se pot adapta și integra la condițiile găsite și create de sistemele numeroase ce determină variații de pH, aerobioză – anaerobioză, diferite feluri de metabolisme concomitente cu complexitatea de enzime ce le pun în joc, fenomenele de dependență, antagonisme, factori limitativi. Spre exemplu, Escherichia coli este o specie ușor adaptabilă la condițiile de mediu, nepretențioasă, ca dovadă marea ei posibilitate de răspândire. Și totuși, ea nu este capabilă să fie adaptată ca o specie permanentă în cavitatea bucală, în condițiile de aici. Face parte din cele trecătoare, incidentale. Deci ecosistemul are pentru unele bacterii o acțiune eliminatorie.

c) Altă caracteristică a lui este temperarea virulenței diferitelor specii sau tulpini în condițiile prezenței in ecosistem. Cu alte cuvinte, unele specii sau tulpini, cu cât sunt mai încadrate în ecosistem sunt obligate de numeroși factori constituenți ai acestuia să-și modereze patogenitatea, să trecă din patogene în condiționat-patogene. Ele numai când părăsesc ecosistemul își pot căpăta eventual agresivitatea. Așa este cazul stafilococului auriu sau a lui Pseudomonas aeruginosa. Sau devin agresive în condiții speciale de receptivitate a organismului, cum este cazul marilor traumatisme, sau după extracții anevoioase, când ei pot cauza osteomielite. La fel este cazul streptococilor sanguis, care în condițiile integrării în ecosistem sunt comensali, inofensivi, dar când pătrund de aici în torentul circular cauzează acea boală numită endocardita bacteriană subacută. Plecând din ecosistemul bucal, întâlnesc alte condiții.

Pentru ca o tulpina nou intrată, de la început să-și manifeste patogenitatea, învingând condițiile ecosistemului, ea trebuie să fie dotată sau cu o virulența deosebit de mare, sau ca organismul să aibă forțele de apărare foarte scăzute generale sau locale în acel moment biologic.

Ce înseamnă întreruperea echilibrului dintre specii, o dereglare a ecosistemului la un moment dat, o subliniază cazurile administrării masive sau îndelungate de tetracicline sau alte antibiotice cu spectru larg. Omorând speciile sensibile, cu rolul lor bine definit antagonist și limitant, speciile rezistente, cum sunt candidele, cresc și se înmulțesc nestânjenite, până la exces. Din situația dinaintea dereglării ecosistemului, când ele erau în număr redus și comensale, deodată se dezvoltă extrem de mult, colinizând întrega suprafață a cavitații bucale, cu puncte albe de diferite mărimi, coloniile lor caracteristice. În același timp devin patogene, formează filamente, apoi micelii ce pătrund prin mucoase în profunzimea țesuturilor și au tendiința de invadare a torentului sanguin.

Alte două exemple sunt la fel de grăitoare: Gibbons a încercat implantarea streptococului mutans in mod experimental într-o cavitate bucală indemnă de carii, de mai multe ori, fără succes. Ulterior însă a reușit prin zdruncinarea influenței oponente a ecosistemului în urma administrării de eritromicina, antibioticul cu care a omorat o parte din speciile prezente. La fel, administrarea de penicilina în doze mari zilnic, pe o perioadă anumită, unui organism, produce treptat o înmulțire abundentă a florei gramnegative și în special a bacililor. Ei vor predomina asupra celorlalți în ecosistem. Dacă însă penicilina este administrată apoi numai intermitent, relațiile anterioare dintre specii se refac, și o dată cu refacerea lor, scade numărul speciilor gramnegative și a coliformilor la nivelul anterior.

d) Ecosistemul cavității bucale are o caracteristică ce îl diferențiază de alte ecosisteme, cum este cel intestinal sau vaginal, etc., în el predomină numeric streptococii dintre bacteriile viabile, in cel intestinal predomină speciile de Bacteroides și Escherichia coli.

2.2 INTEGRALITATEA

Integralitatea este o trăsătură a sistemelor deschise, cu mari semnificații pentru sistemele ecologice.

Părțile ecologice ale unui sistem ecologic se diferențiază morfo-funcțional, se stabilesc între ele conexiuni și interacțiuni care determină funcționarea sistemului ca un întreg. Fiecare sistem ecologic este delimitat față de celelalte sisteme și se comportă ca un tot datorită conexiunilor care leagă componentele lui.

Însușirile întregului nu pot fi reduse la suma însușirilor lui. Din însușirea componentelor întregului apar trăsături noi, ale părților, și trăsături noi, ale întregului, fapt de o mare generalitate la toate nivelele de organizare a materiei.

În fapt, bacteriile din cavitatea bucală, se hrănesc cu resturi de alimente care tranzitează acest segment al tubului digestiv, dar acest lucru, coraborat cu activitatea lor metabolică, producătoare a cariei dentare, face ca acestea să se constituie împreună cu substratul dento-parodontal într-un sistem ecologic de sine stătător.

Aceste bacterii se găsesc oriunde în tubul digestiv și chiar în alimente, însă coexistență lor în cavitatea bucală creează un sistem ecologic cariogen, sistem ecologic specific și bine delimitat în cadrul organismului uman.

Fiind o multitudine de specii (aproape 400) cu conexiuni strânse, ele constituie un sistem cu o integritate bine conturată. Dezvoltarea integralității coincide cu însași dezvoltarea organizării sistemului, și are ca efect sporirea eficacității autocontrolului și a echilibrului dinamic.

2.3. ECHILIBRUL DINAMIC

Starea caracteristică tuturor sistemelor ecologice este echilibrul dinamic sau starea staționară. Este consecința însușirii fundamentale a sistemelor deschise, de a întreține permanent schimb de substantă și energie cu mediul și sistemele înconjurătoare.

Toate sistemele ecologice care efectuează permanent schimburi de materie și energie cu mediul ambiant se autoreînnoiesc continuu, ele însă iși pastreză individualitatea determinată genetic, reușind să realizeze astfel un echilibru dinamic, între stabilitate și schimbare. Acest echilibru se realizează prin compensarea metabolică a pierderilor metaboilice și materiale.

Biocenoza sistemului ecologic cariogen apare odată cu nașterea individului uman și se dezvoltă atâta timp cât individul uman trăiește. Până în prezent nu s-a obținut și nici nu s-au întrevăzut metode prin care să se obțină o cavitate bucală sterilă.

Biotopul acestui sistem constituie poarta de intrare a organismului uman, a resurselor energetice, a alimentelor dar și a microorganismelor. Aici în cavitatea bucală este granița dintre mediul steril, propriu organismului, și cel nesteril reprezentat de mediul înconjurător.

Cavitatea bucală este bariera cea mai permisivă și totodată cea mai selectivă care permite trecerea lentă de la mediul homeostatic al organismului, la mediul înconjurător al cărui parametrii sunt într-o continuă schimbare. În rest organismul uman este delimitat de epidermă care este o barieră destul de fermă împotriva tendințelor de variație a parametrilor din mediul înconjurător.

În aceste condiții, flora din cavitatea bucală, respectiv cea care produce placa bacteriană nu poate fi eradicată, indiferent ce fel de mijloace am folosi. Eliminarea completă a florei cavitații bucale prin antibiotice și chimioterapie s-a dovedit a fi nefastă pentru sanătatea cavitații bucale și a organismului.

Sistemul ecologic cariogen are deci o stabilitate deosebită, și încercarea de a-1 exclude din organismul uman produce dezechilibre altor aparate și sisteme.

În condițiile în care se încearcă reducerea numărului de microorganisme prin mijloace fizice (periaj dentar) și chimice (administrarea de antibiotice) potențialul de refacere a acestuia este considerabil.

Astfel în urma cercetarilor lui Loe (1965) și Mandel (1970) de eradicare completă a plăcii bacteriene se remarcă: dupa o zi, prezețta de coci gram negativi incluși într-o matrice celulară, dupa trei zile, se adaugă fuzobacteriile și bacteriile filamentoase, iar după nouă zile, se adaugă spirilii, vibronii și spirochetele.

Se remarcă deci o capacitate de regenerare destul de mare ceea ce face ca sistemul ecologic să aibă un echilibru dinamic destul de stabil.

În condițiile în care nu se intervine în nici un fel (mecanic sau chimic) asupra sistemuiui ecologic cariogen acesta nu involuează. Limba si obrajii, prin mișcarile lor, spală permanent dinții, decolând volumul de masă bacteriană care nu mai poate fi susținut de matricea celulară a plăcii bacteriene. La aceste acțiuni participă și alimentele de consistență dură precum și cele care au în compoziția lor fibre vegetale care eliberează, în timpul masticației, dinții de placa matură.

2.4 AUTOREGLAREA

Autoreglarea este una din cele mai importante caracteristici ale sistemelor ecologice care sunt organizate de așa natură încât să permită recepționarea informațiilor, circulația lor în interiorul sistemuiui și selecția celui mai bun răspuns.

În ultima perioadă de timp se acordă o importanță tot mai crescută și formelor inferioare de autoreglare de la nivelul celulei, studiate de biologia moleculară și de microcibernetică.

Acest tip de autoreglare întâlnit la nivel individual este întâlnit și la nivelul sistemului ecologic cariogen, sistem alcătuit din organisme inferioare: virusuri, bacterii și ciuperci.

Autoreglarea la nivel individual este un mecanism extrem de complicat de explicat la o așa mare diversitate de specii și, după cum am mai afirmat este obiectul de studiu al unor cercetări sofosticate. Însă autoreglarea la nivelul plăcii bacteriene ca sistem, este un mecanism simplu prin care este controlat aportul de substanțe nutritive, dispoziția diferitelor specii în straturile plăcii dentare in raport cu evoluția ei, prioritatea sau limitarea accesului informațiilor în procesele cheie ale plăcii.

Toate aceste procese vor fi tratate pe larg în capitolul III (Microflora cavitații bucale) ocazie cu care se vor reliefa conexiunile care se stabilesc între variatele specii de microorganisme din cavitatea bucală.

2.5 CARACTERUL INFORMAȚIONAL

Toate ecosistemele din punct de vedere fizic functionează ca niște sisteme cibernetice. Sistemele cibernetice sunt sisteme informaționale care folosesc transformările energetice ca mijloc pentru recepționarea, prelucrarea, acumularea și tansmiterea informațiilor.

Oricare din organismele vii, în activitățile sale metabolice, transformă energia diverselor legături chimice în energie termică, mecanică, nervoasă, electrică, etc.

Această transformare de energie reprezintă forma cea mai adcvată, prin care organismele, ca sisteme deschise, întrețin relații cu mediul înconjurător.

Astfel, o bacterie cu o structură simplă, procariotă, deține mai puține informații decât o plantă sau organismul uman. Această informație este stocată la nivelul AND-ului sau ARN-ului și este transmisă foarte rapid, datorită succesiunii mari de generații și, foarte exact datorită faptului că este într-o cantitate mult mai redusă decât în cazul macroorganismelor.

Eventualele erori apar datorită ritmului alert de înmulțire, știindu-se faptul ca erorile apar în corelație directă cu numărul de diviziuni celulare.

Dar semnalele se mai pot transmite și: biochimic prin intermediul produșilor de secreție sau excreție celulară, sau electric ca urmare a metabolismului celular și a funcționării pompelor ionice.

Tendința generlă este de creștere a informației pe masura dezvoltării; sistemele ecoiogice nu tind spre o creștere maximă ci spre un optim al gradului de informație.

2.6 CARACTERUL ISTORIC

Evoluția, privită larg, ca un proces de dezvoltare, mișcare, este o proprietate generală a tuturor corpurilor materiaie. La sistemele ecologice, acest proces este foarte complex și calitativ diferit in comparație cu sistemele lipsite de viața.

Oricât de profund am cunoaște alcătuirea unui sistem ecologic, utilizând metodele cele mai adecvate, analitice și toxonomice, nu vom putea reuși să explicăm structura și funcțiile lui dacă nu îi cunoaștem etapele apariției lui, mai bine zis istoria lui.

Fiecare organism, de la cel mai simplu, până la cel mai evaluat, conservă și rezumă în patrimoniul său ereditar, istoria populației din care face parte, istorie a nenumărate generații.

Prin coevoluție, organismul uman și microorganismele formează exo-și endosimbioze. După Sturgen "…atunci când microbii populează permanent organismele animale, se formează simbioze mult mai strânse între ele, denumite endosimbioze animale-microorganisme" (în cazul nostru endosimbioze om-microorganisme) pe fondul cărora sunt edificate ecosisteme, în cazul nostru -sistemul ecologic cariogen.

Microorganismele din cavitatea bucală, reprezentate de virusuri, bacterii și fungii au o dezvoltare filogenetică bine stabilită pentru fiecare specie în parte (există circa 380 de specii diferite), iar coevoluția lor în cavitatea bucală datează de la apariția omului.

CAPITOLUL 3

MICROFLORA CAVITAȚII BUCALE

3.1 MODUL DE POPULARE A CAVITAȚII BUCALE CU MICROORGANISME

Pentru ca o bacterie să devină parte integrantă din microflora bucală, ea trebuie să fie reținută, să poată persista la nivelul acestei cavități. Altfel există riscul de a fi repede spălată de salivă și îndepărtată prin deglutiție. De aceea ea trebuie să aibă o serie de calități morfologice, sau enzimatice, sau de altă natura, care să-i confere un anumit fel de a rezista la influența celorlalte microorganisme și la condițiile din ecosistem. Implantarea unui agent microbian nou venit este un fapt simplu și ușor, fiindcă el nu vine pe un loc "gol".

Ca urmare, retenția unei bacterii poate fi adezivă sau neadezivă (mecanică). Retențiile adezive se pot datora:

1.) sintezei de polimeri extracelulari de catre unele bacterii;

2.) întâlnirii cu diferiți polimeri de către o bacterie nesintetizantă de polimeri proprii și atașarea la ei;

3.) atașării prin înveliș fibrilar;

4.) atașării prin intermediul altei bacterii.

Înainte de a vedea pe rând fiecare din aceste moduri cu particularitățile lui, trebuie subliniată proprietatea generală a bacteriilor de a se atașa și de a adera la unele suprafețe. Deosebirea între atașare și aderare constă în fermitatea fixării. Microorganismele au o tendiință continuă, deși foarte lentă, să se depună, să sedimenteze în apă, sau din aer pe obiecte, pe sol. Acest fenomen se datorează greutății lor specifice mai mare pe unitatea de volum, decât a acestor factori de mediu. La rândul lor sunt ridicate de curenții de apă, aer și mobilizate în dezordine, după intensitate și direcție.

Simpla depunere, sedimentare este temporară, pe când atașarea, și mai ales aderarea tind spre stabilizare.

Capacitatea de aderare este diferită pentru fiecare specie și este corelată cu dimensiunea celulei, forma ei, sistemul enzimatic al peretelui celular și structura peretelui celular. Speciile cu celule mari sedimentează mai ușor decât cele cu celule mici și foarte mici. Cele cu celule rotunde sedimentează mai greu decât bacilii și încă mai greu decât formele filamentare. Suprafață rugoasă a peretelui celular furnizează mai degrabă o aderare, dacât o suprafață netedă, iar secrețiile ce se depun pe perete sau trec prin peretele celular au o importanță deosebită în ajutarea aderării, în fixare, chiar în conglomerare, cum este cazul mycobacteriilor prin cond – factorul lor (lipide și ceride), ce le determină să se lipească sub formă de șuvițe lungi, întortocheate.

Pentru bacteriile cu habitat în cavitatea bucală aderența are o valoare de determinant ecologic pentru că majoritatea din ele se stabilesc aici prin unul din modurile de aderare.

Nu orice aderare este o garanție că bacteria va coloniza, pentru că numeroase aderări pot fi reversibile. De aceea, facem distincția între atașare-aderare pe de o parte, și colonizare pe de alta. Colonizarea trebuie socotită ca o interacțiune între bacterie, suprafața pe care a aderat și ecosistem. Felul suprafeței din cavitatea bucală poate favoriza mai mult sau mai puțin o aderare.

Cele rugoase sunt mai favorabile adeziunii decât cele netede, asigură o menținere. Detașarea este mai dificilă de către salivă, din cauza acestor suprafețe, și a contactului mai ferm dintre bacterie și suprafață.

Streptococii mutans și Streptococii sanguis au preferințe pentru astfel de suprafețe rugoase de pe dinți și proteze, pe când streptococii salivarius când nu colonizează în mod primar limba, aderă numai la suprafețe netede, dar cu toate acestea, atașarea lui este tot atât de fermă, întrucât nu se detașează nici cu enzime, nici cu detergenți (Hoffman, 1967).

Din partea bacteriei, în fenomenul de colonizare are o mare importanță preferințele de specie. Ele determină în cele din urmă, că întotdeauna Streptococul salivarius să se fixeze ca loc pe dosul limbii, Streptococul mitis pe mucoasa obrajilor, Streptococul mutans pe dinți și streptococul sanguis pe dinți și între dinți.

Prin urmare, în aceleași condiții ale ecosistemului, preferințele fiecăreia dintre specii sunt altele și constante, cel puțin în cazul streptococilor, din motive prea puțin cunoscute încă.

Dupa ce a aderat, ca o bacterie să se colonizeze, adică să aibă o dezvoltare numerică abundentă până la formarea de colonii, trebuie în condițiile ecosistemului să aibă o rată de înmulțire care să exceadă pe cea oponentă a altor bacterii și pe cea de spălare continuă prin secreție, în cazul gurii, saliva. De aceea se apreciază că și cantitatea inițială de pătrundere în gură a unei bacterii nou venite trebuie să fie destul de mare, peste 108. Sub această cantitate șansele ei de implantare scad.

Totuși, unele specii, ca streptococul sanguis, se pot coloniza și când se găsesc numai într-o cantitate de 103-104 per ml salivă. Dar streptococul mutans necesită cantități inițiale de cel puțin 10 ori mai mari ca să poată coloniza. Prin urmare, colonizarea este în raport și cu atributul de specie.

3.1.1 Aderarea prin producere de polimeri extracelulari

Exemplul cel mai elocvent despre modul acesta de adeziune prin polimeri îl constituie streptococul mutans. El produce din sucroză polimer de aderare extracelular, cu care aderă și se menține pe orice suprafață atât în vivo cât și în vitro. Dovada rolului jucat de acest polimer a făcut-o Fitzgerald (1969) tratând suprafețele cu dextronază, enzimă ce degradează dextronul și constatând astfel prevenirea formării plăcii dentare la hamsterii cărora li s-a încercat implantarea de streptococi mutans. Spre deosebire de animalele tratate cu dextronază, martorilor li s-au putut implanta streptococi mutans tuturor. Specificitatea acestui polimer se vede și din faptul că streptococul mutans se lasă ușor și repede aglutinat la contactul cu dextronul, pe când alte bacterii nu aglutinează cu el. În schimb, acestea din urmă, aglutinează în prezența altor polimeri salivari, dar cu care nu aglutinează streptococul mutans. Așa e cazul streptococului sanguis, sau al speciei Actinomus viscosis.

Se poate vorbi deci în cazul unor bacterii de aglutinare specifică (s. mutans), iar în al altora de aglutinare nespecifică (s. sanguis). Evident că în cazul aglutinării specifice aderența la suprafețe este mai mare, detașarea experimentală mai dificilă, ceea ce s-a constatat în cazul streptococului mutans și al plăcilor dentare produse de el.

Proprietatea adezivă a unor polimeri, cum este aceea a dextronului nu favorizează numai aderența propriei specii, a streptococului mutans, ci și a altor specii bacteriene în mod nespecific, prin simplul fenomen fizic al vâscozității. Se deosebesc și din acest punct de vedere bacterii ce se lasă ușor alipite la un contact cu dextronul și altele ce reușesc să se detașeze. Aceasta este în funcție și de gradul lui de polimerizare, vâscozitatea și aderența fiind proporționate cu acest grad, pentru că o dată cu polimerizarea crește și greutatea moleculară și proporția înălțimii axiale. În absența unui regim bogat în sucroză, streptococul mutans are slabe capacități adezive, el este repede spălat și îndepărtat de salivă, ceea ce explică absența lui, sau procentul redus, in cavitatea bucala. Dar avand multa sucroza la dispozitie, el este capabil să colonizeze dinții până la exces. Sucroza este mai importantă pentru el ca mijloc de aderență decât ca substrat nutritiv.

Funcție de aderență este mai mare când polimerul este secretat de novo, adică după ce bacteria vine în contact cu suprafața dintelui, ca urmare a acestui contact ea fixându-se ferm în acest caz; dacă însă polimerul era secretat dinainte,aderența este mai slabă și bacteria chiar poate fi îndepărtată.

Și alte microorganisme posedă un mecanism aproximativ de aderență prin sinteza de polimeri extracelulari. Actinomices naeseundii aderă prin acidul hialuronic pe care-1 secretă sub o formă alterată a acestuia, deoarece aderarea lui este înlăturată de hialuronidază (Socrovski, 1970). Ca și streptococul mutans, actinomicerul trebuie să se atașeze mai întâi de dinte, apoi să secrete polimerul, și numai prin acesta el aderă propriu-zis. Alte specii de actinomices sintetizează levoni, iar mai nou s-a arătat că unele actinomicete elaborează în jurul lor un văl de heteropolizaharid ce conține o cantitate mare de acetilglucizonina cu rol evident în aglutinarea specifică a actinomicetelor, rolul aproximativ al dextronului pentru streptococul mutans (Hammond, 1974).

3.1.2. Aderarea prin polimeri salivari

În salivă se gasesc în mod permanent polimeri ai glicoproteinelor, cu greutăți moleculare diferite. Prin faptul că ei dau un caracter vâscos salivei, au o importanță deosebită în aderarea numeroaselor specii bacteriene cu care vin în contact, pe de o parte, pe de altă parte ei umectează în continuu dinții și aderă de hidroxiapatit, favorizând aderarea la acesta a microorganismelor. Cu cât greutatea moleculară a polimerului mucoid este mai mare, cu atât vâscozitatea lui crește și este mai ușoară atașarea și aderența la contactul bacteriei cu polimerul. Rolul polimerilor salivari reiese și din faptul ca ei constituie matricea de baza a placii dentare pe care se face aglomerarea celulară. Mai mult chiar, se știe că unele specii se lasă aglomerate numai de unele tipuri de polimeri salivari, spre exemplu, streptococul mitis, pe când streptococul sanguis numai de altele.

Cercetările lui Hillman (1970) au demonstrat că streptococul salivarius și sanguis aderă în mod egal pe pulberea de smalț netratată cu salivă. Dar tratat cu salivă, streptococul sanguis devine dintr-o dată mult mai aderent și pe suprafețe mai mari decât streptococul salivarius, în proporție de peste 100 de ori. Alături de acesta, autorul citat a constatat încă masive aglomerari in vivo pe dinți de alți streptococi bucali decât streptococul sanguis. Și diferite mucine din secreția bronșică au rol în aderarea bacteriilor și pe tractul arborelui respirator, servind ca un fel de filtre al aerului.

3.1.3. Aderarea prin înveliș fibrilar.

O serie de specii din cavitatea bucală au la periferia celulei lor un înveliș, supraadăugat peretelui. El are un aspect franjurat sau fibrilar. A fost descris întâi de Zobell la sterptococul piogen. S-a văzut că el dispare morfologic la microscopul electronic după tratarea celulelor cu pepsină, deci este de natură proteică. Ulterior s-a constatat că el există și la alți streptococi, de exemplu la streptococul salivarius și la streptococul mitis, sau la alte specii bacteriene, ca Leptotrichia buccalis, fiind însă diferit de la o specie la alta. Tururor le servește evident la aderarea în cavitatea bucală pe diferite suprafețe. Se deosebește net de pilii bacteriilor gram-negative prin faptul că este mai scurt în lungime decât aceștia și altfel distribuit pe periferia celulei. Spre exemplu, actinomicetele îl au sub aspectul unor fibrile lungi, rare. Bacteriilor care-1 posedă le permite o atașare directă de fețele dure sau moi, fară ajutorul polimerilor. Nu toate speciile îl au însă, spre exemplu, lactobacilii cozec, de aceea ei nu pot adera direct de dinte.

Unele bacterii gram-negative mai pot adera probabil prin pilii lor, mai ales bacilii.

3.1.4. Atașarea prin intermediul altor bacterii.

Ea a fost postulată de Gibbson și Nygaard pe baza aglutinărilor ce se constată frecvent între bacterii de specii diferite. Cauza este fie înrudirile antigenice, cazuri mai rare, fie structura lor de suprafață, mai des, ce le face să intre în reacții de afinitate unele cu altele.

Parson și colaboratorii (1973) au izolat 8 specii de bacterii din gură ce nu produceau nici una din ele aglomerari pe tijă de metal implantată în mediu cu sucroză (model pentru producerea de plăci dentare în vitro), din care 6 coci gram-pozitivi și 2 bacili gram-negativi. Cu aceste bacterii a realizat 35 de combinații diferite și a constatat că 21 combinații în condiții de amestec au produs placă dentară în vitro prin aderență cu diferite grade defermitate pe tija de metal, asemănătoare plăcii bacteriene în vivo. Prin urmare, specii cu o slabă capacitate adezivă pe parți dure, când sunt singulare, în amestec se potentează.

Un rol deosebit în aderarea speciilor cu slabă capacitate proprie adezivă îl are ajutorul dat de speciile care în mod primar sunt formatoare de plăci dentare, cu mare putere de aderare, cum este sterptococul Actinomices mutans și Actinomices viscosis. Genul Veillonella, spre exemplu, dotată cu o slabă aderență în vivo și în vitro, devine aderentă și se fixează pe placa dentară formată de actinomices viscosus (Bladon, 1970).

3.1.5. Retenții mecanice.

Alături de retențiile adezive văzute mai sus, datorita proprietăților de specie, există în cavitatea bucală o serie de posibilități de retenții mecanice ale bacteriilor. Ele se fac în două feluri. Unele prin absorbirea grosolană a microbilor pe substratul format de resturile alimenatre ce stagnează temporar ăn gurile cu igiena dinților neglijată. Răspândirea lor poate fi foarte inegală, cu deosebire sunt prezente în diferite faze, în pliuri ale mucoaselor, în spațiile interdentare. Al doilea fel constă în pătrunderea incidentală cu saliva a bacteriilor în fisurile dinților, în leziunile cariare, între suprafețe neregulate, crenelate ale gingiilor, în spațiul gingiilor, în pungile parodontale. În ambele cazuri bacteriile se aglomerează și depozitează, se înmulțesc, fiindcă sunt protejate într-un anumit mod de acțiunea de spălare a salivei. Acestea sunt modalitatile de menținere în gură a unor specii cu o aderență proprie scazută, care altfel s-ar implanta greu numai prin proprietățile lor, ca lactobacilii, Bacteroides melaninogenicus, levurile, fuzobacteriile. Dovada acestui mod de reținere reiese din faptul că aceste specii se găsesc într-o cantitate extrem de mică la edentați, dar îndată după montarea de proteze, numarul lor crește semnificativ. Spre exemplu, lactobacilii se găsesc într-o cantitate foarte mică, sau chiar lipsesc din gurile fară carii dentare. Dar ei abundă în carii și în jurul lor, numărul lactobacililor fiind proporțional cu al cariilor. După asanare, numărul acestora se reduce puternic. Astfel de constatări 1-au determinat pe Krane să creadă că lactobacilii își au habitatul numai în carii, fiind adăpostiți în ele, unde au pătruns o dată cu saliva. La fel este cazul lui Bacteroides melaninogenicus, care la copii și edentați lipsește, dar reapare după punerea de proteze și dispare iar o dată cu ele. Cu cât o dantură este mai neregulată, mai rugoasă, mai fisurată, sau o proteză, cu atât favorizează mai usor o reținere mecanică de bacterii, și un numar mai mare, căci le oferă un adapost din care periajul de întreținere a igienei le îndepărtează mai anevoie.

Tot la acest capitol mai trebuie amintit un alt fel de reținere mecanică a bacteriilor. Este cea datorată formelor filamentoase din cavitatea bucală: diferite genuri de actinimices, leptotrichii, forme bacilare lungi, ramificate, de antracoizi (bacilul mycoides, mezentericus, megatherium, etc.), micelii ale diverselor levuri. Acestea, pe langă proprietățile lor adezive, au tendiința să formeze ghemuri mai mici sau mai mari, cu deosebire leptotrichiile, în ochiurile cărora își găsesc adăpost, ca într-o plasă, o mulțime de alte bacterii și protozoare, favorizându-le stagnarea. La randul lor, însăși aceste forme filamentare, sunt reținute mecanic, cum am văzut, și se găsesc mai mult într-o gură cu dinții implantați defectuos sau cu suprafețe neregulate, cu adâncituri sau leziuni in ele.

3.2. DEZVOLTAREA MICROORGANISMELOR ÎN CAVITATEA BUCALĂ

Comparativ cu alte cavităti naturale ale organismului, cavitatea bucală reprezintă oarecum un loc ideal de dezvoltare pentru microorganisme. Aici ele găsesc temperatura favorabilă, la punctul lor optimal, găsesc condițiile de umiditate necesare, un mediu alcalin care scaldă limba și mucoasele. De asemenea, găsesc condiții de aerobioză, sau prezență de bioxid de carbon, cele care au nevoie. Microaerofilele găsesc în gură numeroase locuri cu potențial oxido-reductor scăzut, unde pot cantona bacteriile obligatoriu anaerobe, de asemenea își găsesc în șanțul gingiilor și în pliurile mucoaselor condiții unde Eh-ul este scăzut și se pot multiplica, iar aportul de substanțe plastice și energetice le este permanent.

Substratul material al dezvoltării bacteriilor din cavitatea bucală poate fi furnizat de gazdă însăși prin diferitele lui componente constituționale sau de secrețiile utile acestora; poate fi furnizat de regimul alimentar al gazdei; poate fi furnizat de alte bacterii, din alte specii.

Ca să se dezvolte, bacteriile au nevoie de o sursă de carbon, de una de azot, de vitamine și de ioni. Aceste alimente se găsesc din abundența chiar și în cavitățile bucale cu igiena cea mai riguroasă, cu atat mai mult în gurile cu igiena neglijată. Cutele mucoasei, spațiile interdentare, sanțul gingiilor sunt locuri în care întotdeauna rămân suficiente resturi alimentare, cu mult mai mult decât au nevoie microorganismele bucale.

S-a constatat că și pe dinți lipsiți de carii se pot pune în evidență resturi alimentare infime.

Chiar dacă am face abstracție de aceste resturi alimentare, bacteriilor le rămân importante surse nutritive din cei 18 AMINOACIZI liberi prezenți în saliva spontană, alături de condroitin sulfat, acid hialuronic și alte elemente provenite din celulele epiteliale de descuamare a căror eliminare este permanentă.

Saliva are o compoziție de proteine între 0.3 si 0.13% în schimb aerul eliminat prin sanțul gingival este mult mai concentrat având un conținut de aproximativ 20-30 de ori mai mare în proteine pe care le devarsă în salivă, cu deosebire albuminele. Celulele de descuamare sunt supuse acțiunii multiple de degradare enzimatică a bacteriilor prin proteozele lor, lipozele și hidrolazele glicozidice, cum este neurominidază, pregătind acest substrat pentru a-1 utiliza, degradând polimerii. Rolul substratului nutritiv oferit de gazdă bacteriilor a fost adeverit experimental prin cercetări independente, făcute de Bowen(1970), de Egelberg (1967), de Littleton (1967), hrănind voluntari mai multe zile cu sonda, dupa o riguroasă curațire bucală și constatând că totuși numărul bacteriilor nu scade din gură.

La acestea mai trebuie adăugat că în condițiile obișnuite oricărei cavități bucale diversele specii bacteriene se ajută adesea reciproc, în sensul că iși sustrag una alteia în cadrul sistemului ecologic factorii de care au nevoie. Unele din ele nu și-i pot sintetiza. Importanța gurii ca habitat bacterian o subliniază foarte expresiv cazul Treponemei microdentium, care nu poate supraviețui decât în cavitatea bucală pentru că numai aici are asigurat izobutiratul necesar și poliaminele ce i se suplimentează difteroizii și fuzobacteriile și un potențial oxido-reducator controlat ce i-1 asigură de asemenea, alte bacterii, fiind dependentă de ele (Socrovski, 1964).

La fel pentru Vibrio sputorum și Veillonella alcalescens acidul formic și acidul lactic de care ele au nevoie și-1 procură de la numeroase specii anaerobe și aerobe, care prin metabolismul lor eliberează acești acizi (Loesche Rogosa). Bacteriile aerobe consumând oxigen pe ariile lor de dezvoltare, creează condiții favorabile ulterior bacteriilor anaerobe.

Spre exemplu, spirochetele, ca să-și înceapă creșterea au nevoie în prima fază de un Eh scăzut la aproximativ -18 mV pe care li-1 creează alte specii, dovadă abundenta lor dezvoltare.

Testele de potențiale oxido-reducatoare făcute în diferitele locuri din cavitatea bucală de Eisenbrandt, Luro, Onisi și Manganiellooy.

Se poate spune că flora bacteriană endogenă cel puțin al unor indivizi, se opune într-o mare măsură implantării experimentale și dezvoltării bacteriilor cariogene. Există persoane cu o gură lipsită de carii sau cu foarte puține carii, dar care după un tratament mai îndelungat cu antibiotice, spre exemplu tetracicline sau alte antibiotice cu specific lar, fac brusc un număr mare de carii ca urmare a distrugerii echilibrului dintre specii, respectiv dispariția unora dintre ele ce se opuneau implantării și menținerii în gură a speciilor cariogene. Konig si Guggenheim au reprodus mecanismul pe animale de experientă. Ei au luat o tulpină de streptococ mutans rezistent la eritromicină și au încercat fără success să-1 implanteze în cavitatea bucală a unui șobolan. Dar administrându-1 animalului concomitent cu eritromicina, s-a reușit implantarea și colonizarea lui aparând ulterior carii prin dereglarea și reducerea masivă a unui total de bacterii și dispariția speciilor oponente streptococilor cariogeni. Tratând cariile șobolanului și suprimând administrarea eritromicinei, din nou nu s-a mai putut implanta streptococul în gură, pentru că redând eritromicina fenomenul să se reproducă. Se poate trage din acest experiment concluzia practică a exploziilor leziunilor carioase la care se poate aștepta un bolnav uneori după un tratament îndelungat cu antibiotice.

Dezvoltarea predominantă unor specii este favorizată uneori de dieta alimentara a gazdei. Aceasta s-a demonstrat vel puțin în cazul streptococului mutans a cărui înmulțire este condiționată de prezența sucrozei, atât experimental pe animal, cât și în încercările de implantare la voluntari. Cercetările speciale au arătat că numărul plăcilor dentare este direct proportional cu utilizarea mai frecventă a sucrozei în regimul alimentar și invers proporțional cu utilizarea glucozei.

Tot experimental s-a demonstrat că introducerea masivă în consum de sucroză la un subiect care are deja plăci dentare schimbă atat densitatea populației bacteriene căt și participarea diferitelor specii din plăci prin producerea excesivă de dextron extracelular, după cum se schimbă și proporția din placă dintre azot și hidrocarbonați (Carlson).

Această influență a regimului alimentar asupra înmulțirii deosebite a streptococilor mutans se poate constata și prin experimentul inversat.

Van Houtte a arătat că atunci când se reduce sau se stopează cantitatea de sucroză din dieta, scade proporțional și polizaharidul stocat în interiorul celulelor bacteriene. Mai mult decat atât, Stoppelar și colaboratorii (1970) au demonstrat o relație interspecifică legată de regimul alimentar: introducerea unui regim lipsit de sucroză la o serie de subiecți duce la scăderea semnificativă a procentului streptococilor mutans ăn plăcile dentare, crescând în schimb procentul streptococilor sanguis.

Dar nu numai cantitatea de sucroză în dieta unei persoane influentează dezvoltarea și felul speciilor bacteriene, ci și proteinele. Hrănind șobolani cu un regim foarte bogat în proteine, animalele devin purtătoarele unui număr mai mult decat dublu, fața de martori, de bacterii gram-pozitive și bacili pleomorfi, acestora din urmă atribuindu-li-se un rol determinant în formarea de tartru, ca dovadă că s-a putut induce cu ajutorul lor formarea abundentă de tartru la specii de șobolan care fac greu această complicație.

Se știe că și la copilul sugar, o dată cu introducerea unui regim mixt, i se schimbă flora microbiană nu numai la nivelul cavității bucale, dar și flora intestinală, bacilul coli înlocuind treptat preponderența avută în timpul alimentației naturale de lactobacilul bifidus.

De asemenea, se știe că și la omul adult, o alimentație bogata în proteine favorizează cu deosebire favorizarea unei flore proteolitice, în care predomină bacteriile gram-negative, bacilare, pe când o alimentație bogată în hidrați de carbon favorizează dezvoltarea unei flore zaharolitice, cu predilecție a speciilor gram-pozitive.

Egelberg a arătat că și consistența dietei alimentare își are importanța ei asupra unei anumite flore, date confirmate de Carlson, Larson și alții. Atât la animale cât și la om, o dieta compusă din elemente moi favorizează un număr mai mare de plăci dentare și gingivite. Probabil că faptul se datorează adezivității mai mari a unor astfel de alimente și deci este marită posibilitatea retenției mecanice bacteriene și aderarea de suprafețe.

Laptele și produsele lactate stagnează mai mult pe suprafața dinților și între ei. La unele persoane, consumul laptelui, neurmat de curățirea cavitatății bucale, induce o adevarată peliculă adezivă, ce cuprinde toți dinții și se menține aproape 60 de minute, ce favorizează lipirea bacteriilor.

Dimpotrivă, un regim alimentar consistent are un rol de îndepărtare mecanică, de dislocare a florei bacteriene, de curățire a cavității bucale, cel puțin parțial. "Limba încărcată" a bolnavilor cu boli febrile, ca urmare a alimentației numai cu alimente lichide, exprimă tocmai rolul pe care-1 au unele alimente dure în curățirea ei mecanică. În orice caz, alimentele moi favorizează într-o mai mare masură pătrunderea lor în șanțurile gingivale, cu posibilități de retenție și înmulțire a florei, pe când o alimentație consistentă limitează această retenție, execută într-o anumită masură masaj asupra mucoasei gingivale, activându-i circulația și menținând-o vitală.

Inflamațiile gingivale însă au un efect asupra dezvoltării florei microbiene. În inflamație crește cantitatea exudatului la acest nivel și o dată cu el și unele elemente ce pot servi ca stimulatori ai nutriției bacteriilor (aminoacizi, electroliți, factori de creștere).

Ca dovadă că lucrurile se petrec așa este faptul semnalat de Theilade și colaboratori, care au arătat că în gingivitele cronice plăcile dentare cresc în volum. Prin urmare, nu numai plăcile dentare influențează apariția și întreținerea proceselor parodontale, ci fenomenul este și invers. Pungile parodontale întrețin condiții deosebit de favorabile în dezvoltarea bacteriilor anaerobe și alte bacterii proteolitice.

Puroiul, sfacelarea țesuturilor locale, este însăși urmarea acțiunii bacteriilor. În același timp, ele închid un cerc vicios deoarece produsele degradate de ele pe cale fermentativă, acizii aminați, etc. – servesc la nutriția și dezvoltarea altor specii, după cum a subliniat Loesche. Spre exemplu, Bacteroides melaninogenicus are neaparată nevoie în dezvoltarea lui de hem, iar Treponema denticola are nevoie de α-α globuline; multe substanțe aceste specii și le procurș din sucul șanțului gingival, în condițiile obișnuite de dezvoltare a lor, iar în cazurile patologice și le procură in plus din țesuturi lezate (Evans, Socrovski). Lactobacilli au nevoie de aminoacizi și de vitamine din complexul B, în schimb ei produc în exces, de care beneficiază alte specii, vitamina K. Levurile au nevoie de inozitol pe care îl sustrag de la actinomicete, iar hemophilus influenzae de factori x și v pe care-i iau de la stafilococi și micrococi. Brown a arătat că prin țesuturile integre sau lezate, sunt frecvent factori de creștere pentru bacterii cu rol în stimularea înmulțirii lor. Lactobacillus arabinosus își procură acidul nicotinic de care are nevoie din dentina dintelui ce îl parazitează, iar atunci când vitamina nu-i ajunge la suprafată în cantități suficiente, bacteria invadează canaliculele dentinale.

3.3. REPARTIZAREA Ș1 NUMĂRUL BACTERIILOR DIN CAVITATEA BUCALĂ

Microorganismele ce populează cavitatea bucală nu sunt în mod egal distribuite nici ca spațiu, nici ca timp. Unele specii au preferința de dezvoltare pe anumite arii. Spunem că au "nișe" ecologice primare. De aici sunt apoi răspândite de salivă, de mișcările limbii și mușchilor obrajilor, în alte regiuni. Nișele ecologice în realitate exprimă condițiile optime de dezvoltare pentru specie, pe care le găsesc pe diferite suprafețe. Dar chiar și acolo există o variție de număr la mai multe determinari succesive.

Saliva în momentul secretării ei nu conține bacterii, sau foarte puține, dar se încarcă repede cu ele, ajungând să conțină 10 microorganisme per ml prin dislocarea lor de pe limbă, cât și din detașarea de pe mucoase. Concentrația bacteriilor din salivă fluctuează în decursul diferitelor ore ale zilei. Numărul cel mai mare se găsește în decursul masticației, din cauza fluxului crescut al salivei care le mobilizează și a mușchilor obrajilor care le detașează; de asemenea, un număr enorm de bacterii conține salivă dimineața la sculare, din cauza acumulării lor în decursul nopții, când cantitatea salivei este redusă (Lear 1965, Schneyer 1966).

Din punctul de vedere al raportării lor bacteriile din cavitatea bucală se împart în bacterii viabile și neviabile. Cele viabile sunt cele care pot fi ușor sau greu cultivabile pe medii nutritive și deci se poate face prin metoda diluțiilor o apreciere numerică a lor per mililitru de salivă. Există o serie de specii bacteriene în gură ce se cultivă extrem de greu pe medii, nu cresc sau nu se lasă întreținute în subculturi. Acesta este cazul fuzobacteriilor, al germenilor din grupul bacteroides, nocardia, actinomicetele și al altora. De aceea, ele apar rar în statistici, ceea ce nu înseamnă că au un număr sau o importanță mai scazută, dimpotrivă, unele din ele sunt predominante.

În salivă se găsesc în mod obișnuit peste 35 de specii bacteriene permanente cunoscute și recunoscute. Dintre bacteriile viabile din cavitatea bucală 80% sunt diferite specii de streptococi, veillonelle și difteromorhi anaerobi și facultativ-anaerobi. Streptococii și veillonellele constituie majoritatea bacteriilor din salivă. Dar alături de ele se mai găsesc stafilococi (cu deosebire specia epidermidis), leptotrichii, pneumococi, corynebacterii, bacili gram-negativi, nocardii, micrococi, bacili gram-pozitivi, specii de Rothia, Bacterionema, vibroni, spirili, spirochete, diferite specii de levuri. În plus, recent, s-a demonstrat prezența in număr mare de hemofili, în special Hemophilus influenzae și H. parainfluenzae. Dintre speciile tranzitoare posibile amintim: stafilococul aureu, streptococul betahemolitic, Escherichia coli, coliformi, mycobacterii, etc.

După modul de a respecta igiena bucală totalul bacteriilor ce pot fi pe dinți este de la câteva miligrame la un gram, sau mai multe grame. Numărul lor este de natura cifrelor astronomice.

Ca grup, streptococii sunt cei mai numeroși și reprezintă 50% din bacteriile viabile,1/4 din cele din placa dentară și tot 1/4 din cele din șanțul gingival. Neisseriile se găsesc în proporție de 3-5%. Lactobacilli, stafilococii epidermidis, formele bacteriene filamentoase (leptotrichii, actinomicete) într-o gură fără carii sau fără afecțiuni parodontale se găsesc în cantități reduse, fiecare reprezentând cel mult 1% din totalul bacteriilor viabile din salivă. Spirochetele (Treponemele și boreliile), de asemenea 1%. Dar toate aceste specii cresc într-un număr considerabil la indivizii cu carii mai multe și la cei cu parodontoze. Mycoplasmele au fost găsite însă aproape la fiecare individ, deși mereu prezente, dar nu permanente. Dintre speciile de levuri, candidele albicans sunt cele mai frecvente, găsindu-se la 50% din persoanele adulte. Dupa sezon, vara și mai ales toamna, din cauza consumului de fructe, numărul și varietatea speciilor de levuri cresc. Protozoarele, de asemenea, se găsesc la majoritatea indivizilor, în număr foarte mic la cei cu igiena bucală severă și în număr foarte mare la cei cu igiena bucală neglijată. Numărul lor crește cu deosebire și afecțiunile parodontale cronice. Hemofilul influenzei și cel al parainfluenzei, dar și alte specii se găsesc circa 107 într-un ml salivă (Sims, 1970). Escherichia coli este doar trecător prin cavitatea bucală, sub 1%, dar la copii poate atinge și cifra de 5% ocazional. Streptococii beta hemolitici se găsesc la fel numai ocazional, dar există un număr mare de 12% purtători, cifra care ar varia după unii cercetatori pană la 16% și chiar 30%. Bacteroides melaninogenicus constituie o medie de 4,5% din totalul de 10 probe luate din șanțul gingival, având limite între 0,23 – 19,8%. și el crește mult ca număr în infecțiile parodontale.

Localizare. Streptococul salivarius și veillonellele își au habitatul pe dosul limbii, în criptele și pe papilele ei. Colonizează limba la câteva zile dupa naștere. Celulele epiteliale raclate de pe suprafața limbii conțin fiecare peste 100 de bacterii aderente pe ele. Un loc atât de bogat în microorganisme este numai placa dentară și abia în al treilea rând vine suprafața dinților, în cazul lipsei de carii. Pe celulele raclate de pe obraji și palatul moale se gasesc doar 5 – 25 de bacterii aderente. Lactobacilii se găsesc cu deosebire in carii și în jurul lor pe mucoasa de contact, în fisurile ocluzale și între pliurile mucoaselor. Streptococul mutans are preferințe de localizare pe suprafețe dure (dinți). De aceea apare numai dupa erupția primului dinte la câteva luni. Streptococul sanguis, la fel, lipsește din gură înaintea erupției dentare, apare totuși înaintea streptococului mutans și dispare o dată cu ultimul dinte sau cu dantura. Dar ambii au o participare mare în placa dentară. Streptococul mitis aderă numai de părțile moi, pe suprafața epitelială a obrajilor.

Șanțul gingival constituie un loc deosebit de propice pentru înmulțirea bacteriilor, în special a acelora care au nevoie de condiții de anaerobioză strictă, deoarece este singura arie din cavitatea bucală unde Eh este sub 300 de milivolti. De aceea el găzduiește bacteriile anaerobe gramnegative (Bacteroides fragilis, melaninogenicus, fiisobacteriile, vibrioni), pe cele grampozitive (difteromorfi, spirochete cu genurile treponema și borelia, actinomicete, enterococi, mycoplasma). Dovada dependenței acestor specii de condițiile din șanțul gingival este faptul că majoritatea din ele apar în cavitatea bucală numai și îndată după erupția dentară. Ultimele, în timp, apar spirochetele si Bacteroides melaninogenicus, aproape spre pubertate.

La edentați ele lipsesc, cu deosebire Bacteroides melaninogenicus, spirochetele, mycoplasmele, vibrionii, din cauza absenței șanțului gingival.

3.4. MECANISME DE AUTOPROTECȚIE

ANTIBACTERIANĂ A CAVITĂȚII BUCALE

Din punctul de vedere al integrității ei morfologice și funcționale, cavitatea bucală nu ramâne pasivă la ecosistemul bacterian instalat în interiorul ei. Este vorba de o serie de mecanisme prin care se apară cel puțin parțial de unele microorganisme. Se face abstracție aici de relațiile nefavorabile dezvoltării dintre diferite specii, care constau în modificări de pH-uri antagonisme, antibioze.

Mecanismele de autoprotecție sunt endogene și ele includ constituenți intrinseci, care sunt secretați de salivă și depind de gazdă. Niște cercetștori au denumit acesti factori inhibine, mutine, lizine, bacteriotoxine, zidine, -după criterii diferite, atribuindu-le cel puțin unora o acțiune specifică, mai mult sau mai puțin confirmată ulterior. Intervenția fiecăruia dintre ei este mai mult sau mai puțin clarificată, dar acțiunea lor în ansamblu a atras atenția sub forma observației ca unele persoane sunt complet lipsite de carii (indemne de carii), și în cavitatea bucală încercarea experimentală de implantare a unor tulpini bacteriene incriminate direct și indirect în etiologia cariei a ramas fără succes, ele fiind repede eliminate. Deci există persoane cu o mare rezistență la acțiunea agenților carioși, după cum există alții cu o rezistență moderată sau slabă, ceea ce ar explica incidența diferită a afecțiunilor carioase. Alți factori constituționali și mai ales hormonii își au contribuția lor la această rezistență. Este știut că persoanele ce nu au avut carii niciodată pot face la un moment al vieții lor brusc carii multiple, sau că femeile la vârsta pubertății, sau la graviditate, sunt predispuse cu deosebire la carii numeroase.

Un prim factor de autoprotecție este lizozimul. Aceasta este o enzimă mucopolizaharidică, cu caracter de proteină bazică, introdus în organism o dată cu anumite alimente: legume, ouă. Dar poate fi secretat și de unele bacterii, în cantitate mică. Se găsește în diferite țesuturi, leucocite, dar lipsește din lichidul cefalorahidian, din transpirație și urina. Se elimină prin salivă, mucoasa bucală, fluidul șanțului gingival, prin mucusul nazal și lacrimi. Cantitatea lui crește în inflamațiile gingivale și în afecțiunile parodontale. Are acțiune asupra micrococilor, bacililor antracoizi, sarcinelor, klebisellelor, a unor tulpini de stafilococi. Acestora le produce scindarea zaharurilor din mucopeptidul constitutiv al peretelui bacterian dezorganizându-1 astfel și transformând celula în protoplast neviabil. Nu se epuizează în timpul activității sale, deci are valoare de catalizator. În combinație cu anticorpii și complementul accelerează liza bacteriilor gramnegative. Ar mai avea și o acțiune numai de inhibare a dezvoltării unor specii, fără să le lizeze propriu-zis.

Un al doilea sistem de autoprotecție a fost descris de Kerr, Wadeburn și colaboratori, sub numele de "sistem antibacterial lactoperoxidazo-thiocianat-H2O2". El este un component normal de secreție a glandei parotide și submaxilare și nu se găsește în serul sanguin. Acesta din urmă are chiar o acțiune depresivă a activității lui. Apare la nou-nascut după primele zile de viața, și își crește nivelul în primii 10 ani, după care stagnează. Ca să-și desfășoare acțiunea, are nevoie de doi factori complimentari: de ionul de thiocianat §i de unul nedializabil cu caracter de peroxidază salivară. Se găsește în cantitate mare în gura persoanelor indemne de carii și chiar la acestea el variază ca nivel în funcție de starea lor sanitară; la persoanele susceptibile la carii se găsește foarte puțin, sau deloc. Efectul lui este numai bacteriostatic, iar spectrul de acțiune este limitat la unii lactobacili și streptococi din grupa N.

Green descrie un alt component, care-i poartă numele, prezent în saliva persoanelor indemne, care are efect antibacterian atât asupra lactobacililor homofermentativi, cât și asupra lactobacililor heterofermentativi, precum și asupra streptococului salivarius și a streptococului mitis și încă asupra unor specii cu structuri antigenice comune acestora. Acțiunea începe la 4-6 ore de la contact și el are valoare de catalizator ca lizozimul, deoarece poate fi luat de pe bacteriile atacate și își pastrează activitatea.

Este foarte activ, suportând diluții de până la 0,25 mgt per ml proteină totală salivară. El este prezent în gammaglobuline și precipită o dată cu ele, din acestea ajungând în salivă. După proprietățile lui flzice, chimice și modul de acțiune trebuie interpretat ca un anticorp natural, o izohemaglutinină. Cercetările făcute de autor l-au dus la concluzia că la persoanele susceptibile la carii, comparativ cu cele indemne, există o deficiență fie de secreție a glandei salivare a anticorpilor serici, fie una de transmisie din glandă în salivă a lui, sub formă cantitativă sau calitativă, concluzie sugerată și de alți cercetători.

Un al patrulea sistem de autoapărare este constituit de betazinele din serul sanguin. Are un efect nespecific asupra bacilului subtilis și a altor bacterii grampozitive pe care le lizează încă după câteva minute de la contactul cu ele. Are drept cofactori ionii de calciu și bicarbonat, prin care se deosebește de sistemul lui Kerr §i Wedderburn amintit, iar de anticorpul natural descris de Green se deosebește prin efectul lui foarte rapid. Sursa lui ar fi plăcuțele sangiune.

În afara sistemelor de autoprotecție amintite, saliva mai este îmbogățită incontinuu cu anticorpi sintetizați la nivelul local. Aceștia sunt de două feluri: IgA și IgG. Cei IgA predomină în salivă. Cei IgG predomină în lichidul șanțului gingival, unde sunt produși (Brandtzaeg). Dovada că formarea lor a fost indusă de bacteriile bucale și nu de altele, este că nu reacționează imunologic decât cu acestea și nu, spre exemplu, și cu cele intestinale (Sirisha). De aceea au și o mare eficiență ce se vede, pe de o parte, prin faptul, ca numeroase bacterii prezente in mod natural în salivă au fost găsite având fixate pe suprafața lor anticorpi IgA, pe de altă parte atât anticorpi IgA cât și IgG au fost găsiți în număr mare fixați pe bacteriile depozitate pe dinți (Brandtzaeg, Taubman). S-a demonstrat că anticorpii IgA salivari au capacitatea inhibării aderenței și colonizării pe suprafața mucoaselor a diferitelor specii de streptococi, deci cel puțin parțial ei asigură protecția împotriva acestora. Specificitatea lor mare se evidențiază prin mai multe aspecte. Unul constă în aceea că bacteriile puse în prealabil în contact cu ei (saliva parotidiană) au o capacitate scazută sau nula de aderare când sunt reintroduse în gură.

Al doilea aspect arată că fixarea lor pe bacteriile aderente deja le face să fie foarte ușor dislocate și eliminate.

Al treilea aspect reiese din faptul că în acțiunea lor antibacteriană nu au nevoie nici de fagocitoză nici de acțiunea complementului (Gibbons, Williams), ci simpla lor fixare pe suprafața bacteriilor le schimbă acestora în mod hotărâtor caracterele de aderență și menținere în gură. De asemenea pledează în același sens faptul că tirul lor scade cu timpul, că să reapară, ceea ce arată fie că tulpina inductoare a suferit o mutație, fie că ea a fost înlocuită cu alta, având o altă structură antigenică.

Intelegerea importanței anticorpilor locali și a marii lor specificități au condus pe unii cercetători la ideea unui posibil vaccin anticarie dentară, deoarece s-a văzut că anticorpii pot inhiba și formarea de depozite aderente de streptococi mutans pe suprafețele solide, cel puțin în vitro (Evans, Mukasa, Olson).

Un rol de autoprotecție o au și glicoproteinele salivare, prin caracterul lor adeziv, mucilaginos. Căci dacă în unele cazuri, cum am văzut, favorizează aderența și depozitarea bacteriilor pe suprafața dinților, este tot atât de adevărat că ele în unele cazuri servesc la curățirea cavității bucale de bacterii deoarece le fac aderente de ele, le aglomerează și sunt îndepartate prin deglutiție. Cu atât mai mult, cu cât unele glicoproteine au o specificitate de a lega, de a agiutina unele specii de bacterii, în primul rând streptococii sanguis, deci acestea ar servi direct la detașarea acestora de pe dinți. Au fost cercetări care au demonstrat o relație de înrudire a unor glicoproteine sau a unor glicolipide cu substratul structural al grupelor sanguine umane și în continuare au enunțat posibilitatea ca și aceste glicoproteine sau glicolipide salivare să aibă caractere de fixatoare prin receptori similari a unor virusuri care dau fenomenul de hemaglutinare, adică să le servească drept substrat adeziv, ca hematiile, și astfel, să ducă la eliminarea lor. Ar fi vorba de mixovirusuri și paramixovirusuri, precum și mycoplasmele (Ada, Springer, Sobelavsky). Se pare că receptori similari ar exista pe suprafața celulelor epiteliale din gură pentru streptococul sanguis deoarece după tratarea lor cu antiser preparat cu grupele sanguine, celulele devin inapte de a fixa pe ele streptococul sanguis. Glicoproteinele, scăldând acestea, le maschează receptorii pentru streptococ,acoperindu-i, având afinitate pentru ei (Williams).

Un rol important protector la nivelul cavității bucale îl are și procesul fagocitozei. Au fost gasite leucocite intacte și dezintegrate, de numeroși cercetători, atăt în șanțul gingival, cât și pe epiteliul acestuia, ca și în țesuturile subiacente conjunctival. Aceste fagocite în condiții de sănatate ar servi la limitarea unei infecții bucale în general și în special la extinderea unei gingivite.

De asemenea, în salivă se găsesc numeroase leucocite polimorfonucleare. Ele ajung în ea prin mucoase și în special prin mucoasa gingivală. Au un rol în fagocitoza de la acest nivel, dovadă faptul că în inflamațiile gingivale și ale paradonțiului numărul lor este crescut proporțional cu intensitatea proceselor patologice, iar după asanare, numărul lor scade. Tot în acest sens pledează faptul că în astfel de procese în salivă se găsesc din abundență enzime lizozomale deversate în timpul fagocitozei, ce se adaugă și potentează acțiunea lizozimului.

De asemenea în salivă difuzează atât prin glandele salivare, cât și prin șanțul gingival anticorpi din ser cu activitate specifică făță de diferite bacterii din infecția generală a organismului. Ei trebuie diferențiați ca origine, de cei produși local, la nivelul mucoasei bucale, mai ales în gingii și glanda submaxilară care sunt IgA. Cei serici sunt cu deosebire IgG și ajung în mod pasiv în gură după ce au atins un anumit titru in ser, de aceea în salivă ei intotdeauna ajută in procesul de fagocitare a bacteriilor bucale.

În plus, la nivelul cavității bucale se găsesc numeroși bacteriofagi ce exercită rol litic.

CAPITOLUL 4

MATERIALE ȘI METODE

IDENTIFICAREA AGENTULUI ETIOLOGIC

4.1. CONSIDERAȚII GENERALE

Identificarea agentului etiologic este scopul final al examinării oricărui produs patologic. În unele situații acest act poate fi realizat pe baza datelor de ordin morfologic și cultural prezentate în capitolele anterioare. În cele mai multe cazuri este nevoie de completarea cu informații privind caracterele metabolice, de structură antigenică și de patogenitate ale germenului în cauză.

În investigarea proprietăților metabolice, accentul trebuie pus pe cele generale – catalaza, oxidaza, modul de desfacere a glucozei (testul F/O) și producerea de gaz. Numai în situații în care identificarea nu poate fi realizată cu acest set de teste se va proceda la determinări suplimentare, limitându-se însă la strictul necesar. Definirea caracterelor antigenice; astfel, în unele situații, de exemplu în identificarea germenilor din grupurile: Salmonella, Shigella, Vibrio (Holerae) procedeul este indispensabil. în alte cazuri, determinarea structurii antigenice are o valoare mai redusă (meningococ, pneumococ, Brucella, Bordetella, streptococ), în comparație cu proprietățile morfologice, culturale și metabolice pe care le completează; uneori procedeul se folosește pentru precizarea caracterelor de subspecie (serotip) nu întotdeauna necesară pentru orientarea terapeutică. Cercetarea caracterelor antigenice se efectuează în mod predilect prin reacția de aglutinare pe lamă și în tuburi, cu seruri imune, în unele cazuri (definirea grupului de streptococ) se folosește reacția de precipitare, de competență, în special a laboratoarelor CSA și a laboratorului de profil din institut.

Foarte rar se face apel la determinarea caracterelor de patogenitate prin inoculări a animale (clostridii-toxigene, antrax) de fapt însăși izolarea dintr-un produs a unui agent etiologic conferă acestuia atributul de "patogen" indiferent de poziția pe care o ocupă în această ierarhie. Mai frecvent se utilizează cercetarea caracterelor de suspiciune de patogenitate prin procedee "in vitro", de exemplu; coagulaza, toxigeneza prin metoda difuziunii în gel, prezena hemolizei, etc.

Prezentăm în cele ce urmează criteriile minimale necesare identificării principalelor specii sau genuri bacteriene de interes medical, precizând că toate determinările trebuie executate pe culturi pure. Ordinea prezentării grupelor se bazează pe aspectul morfologic; coci și bacili gram-pozitivi; pentru fiecare grup se face o apreciere privind semnificația determinării la substanțe antimicrobiene.

4.1.1.Metode moderne de control microbiologic

1. Sistemul automat de însămânțare în spirală

Metoda de însămânțare în spirală este un sistem automat de obținere a numărului de celule viabile . Prin folosirea unui tub capilar cu vârf, se poate distribui proba lichidă în forma spiralată (spirala Arhimede) pe suprafața unei plăci cu agar preturnat (selectiv sau neselectiv) având concentrația gradientului descrescătoare dinspre centru înspre exteriorul plăcii aflate în rotație ( Fig. 1 ). Se cunoaște volumul lichidului depozitat în orice segment al plăcii cu agar . După ce lichidul care conține microorganisme este distribuit, placa cu agar se incubează peste noapte la o temperatură adecvată dezvoltării coloniilor. Coloniile apărute de-alungul traiectoriei spiralei pot fi numărate fie, manual, fie electronic. Timpul pentru insămînțarea probei este de ordinul a câtorva secunde , comparativ cu metoda convențională, în care este de ordinul minutelor.

De asemenea, utilizând un numărător cu laser, analistul poate obține o numărătoare corectă în câteva secunde, comparativ cu procedeul de numărare cu ochiul liber a coloniilor care este greoi și durează câteva minute .

Noile versiuni ale acestei metode automate de însămânțare în spirală sunt cunoscute sub numele de Autoplater și Whitly.

Cu aceste instrumente automate , analistul nu trebuie decît să introducă proba lichidă și instrumentul o va procesa complet și automat incluzînd stilizarea unității pentru o nouă probă.

Fig. 1 Moduri de distribuire a probei pentru maximă eficiență

1.1. Sistemul avansat de însămânțare în spirală Autoplate

Sistemul automat de însămânțare în spirală a fost special conceput pentru a crește productivitatea și pentru a îmbunătății rezultatele în cadrul laboratorului de microbiologie.

Fig. 2 .Sistemul avansat de însămânțare în spirală Autoplate

Stație inovativă de spălare pentru dezinfectare totală

Windows CE cu LCD și ecran digital care garantează ușurința în utilizare

Tub unic capilar conceput pentru a permite umplerea din tuburile de testare, cupele sau eprubetele pentru centrifugare.

Fascicul luminos de precizie care să asigure o operațiune adecvată.

Compartiment pentru spălarea și aruncarea recipientelor.

1.2. Avantajele sistemului

Acest aparat prezintă avantajele:

se elimină nevoia de diluții repetate,

se economisește timp,

se economisesc bani,

are loc automatizarea laboratorului

Aparatul Autoplate® – este un microprocesor reglabil de însămânțare în spirală, folosit pentru numărarea bacteriilor, testarea sensibilității antimicrobiene, precum și pentru testele de mutagenitate. Această tehnologie unică are drept rezultat reducerea a ¾ din materialele disponibile și economisirea semnificativă de timp și muncă. Autoplate posedă o mai mare sensibilitate de detectare și repetabilitate a probei decat în cazul tehnicilor convenționale de însămînțare.

Fig. 3 Prezentarea metodei de însămînțate în spirală în comparație cu

metoda de însămânțare standard

Autoplate – crește productivitatea laboratorului, cu o performanță intr-un domeniu de 2 cfu / ml pâna la 1.000.000 cfu / ml, făra a fi necesară nici o diluție, reducând utilizarea elementelor consumabile de 3 / 4.

1.3. Aplicații

Metoda de însămânțare în spirală este utilizată într-un domeniu foarte larg , incluzând testări pentru bacterii patogene și de alterare. În industria farmaceutică, aceasta metodă de însămânțare în spirală este utilizată pentru testele de conservare(PET), și testele de sensibilitate efectuate de SGE (Spiral Gradient Endpoint). Agricultura și industriile de mediu utilizează această metodă pentru testarea aplicării biopesticidelor, prevenirea înghețurilor și pentru studierea frunzelor.

2. Sistemul Petrifilm

Sistemul Petrifilm este un sistem ingenios cu nutrienți rehidratabili corespunzători, integrați într-o serie de filme în unitatea respectivă. Unitatea este puțin mai mare decât mărimea unei cărți de credit. Pentru obținerea unui număr de celule viabile, stratul superior protector este ridicat și se introduce 1 ml din proba lichidă în centrul unitații, după care capacul este așezat la loc. Pentru a se crea o formă rotundă se așează pe capac un șablon din plastic. După incubarea la temperatură și timp adecvat, mediul rehidratat va suporta dezvoltarea microorganismelor. Coloniile sunt numărate direct în unitate. Acest sistem rezistă peste 1 an la temperaturi scăzute. Ceea ce atrage la acest sistem este ușurința de utilizare, mărimea mică, durata mare de păstrare. Nu este necesară prepararea agarului, și rezultatele sunt ușor de citit.

Recent, companiile au introdus un numărator Petrifilm, la care analistul trebuie doar să așeze Petrifilmul cu coloniile în unitate, și acesta va număra automat și va înregistra numărul de celule viabile pe calculator. Formatul manual al sistemului Petrifilm a fost utilizat pentru multe sisteme , și câștigă acordul internațional, fiind o metodă alternativă pentru numărarea celulelor viabile.

Rondelele Petrifilm conțin nutrienți modificați bilă roșu violet, agenți gelifianți solubili în apă rece și indicatorul tetrazoliumn care facilitează deosebirea coloniilor. Filmul de la partea superioară captează gazul produs în urma fermentării lactozei de către coliformi. Timpul și temperatura de incubare, precum și interpretarea cutiilor Petri variază în funcție de metodă.

ISO definește coliformii în funcție de abilitatea de a crește în medii selective utilizând metode specifice. Metoda ISO 4832, enumerând coliformii proveniți din metoda numărării de colonii, îi definește în funcție de mărimea coloniei și producerea de acid pe mediu de VRB cu agar lactoză (VRBL). Pe rondelele CC Petrifilm , această producere de acid de către coliformi este indicată de colonii roșii cu sau fără gaze (vezi cercul 1). Metoda ISO 4831 enumerând coliformii după metoda celui mai probabil număr (MPN), definește coliformii după abilitatea lor de a crește și de a produce gaz din lactoză într-un mediu selectiv de bulion de carne. Pe aceste rondele Petrifilm CC coliformii sunt indicați sub forma unor colonii roșii asociate cu gaz .

FDA (Administratia medicamentelor) /BAM definesc coliformii ca fiind bastonașe gram negative care produc acid și gaz din lactoză în timpul fermentării metabolice. Coloniile de coliformi care cresc pe rondelele Petrifilm CC , produc acid determinând indicatorul de pH să închidă culoarea gelului. Gazul captat în jurul coloniilor indică coliformii .

Utilizarea rondelei Petrifilm este indicată pentru detectarea coliformilor totali și a celor termorezistenți ( fecali).

Plăcile Petrifilm pentru determinarea numărului de colonii aerobe

Plăcile Petrifilm pentru determinarea numărului de colonii aerobe sunt un sistem bazat pe un mediu cultural gata preparat, ce conține nutrienți, un agent gelifiant, solubil in apă rece, și un indicator colorat ce determină vizibilitatea coloniilor.

Plăcile Petrifilm AC sunt concepute cu o grilă de fond care să ușureze numărarea coloniilor.

Plăcile Petrifilm AC pot fi folosite în locul unui mediu cu nutrienți standard, precum plăcile de bulion-agar Luria, plăcile cu nutrient agar sau plăcile cu soia-agar in multe aplicații:

Plăcile Petrifilm pot fi hidratate cu o cultură bacteriană, sau cu diluția unei culturi, pentru numărarea organismelor viabile prezente.

Plăcile de Petrifilm pot fi hidratate pentru început cu apă sau soluție tampon, iar apoi inoculate prin înțepare, striație, sau atingerea de suprafețe.

Se pot adăuga antibiotice la fluidul de hidratare pentru selecționarea organismelor rezistente.

CAPITOLUL 5

TESTAREA SENSIBILITĂȚII GERMENILOR LA AGENȚI ANTIMICROBIENI

Sensibilitatea germenilor la un agent antimicrobian se exprimă prin concentrația cea mai mică de medicament care în condiții standardizate de lucru inhibă "in vitro" creșterea bacteriană (CMI). Din motive de ordin clinic, adeseori este mai utilă determinarea concentrației minime de medicament în stare – în aceleași condiții standard – să omoare germenul în cauză ( concentrația minimă bactericidă – CMB).

Consecutiv administrării agenților antimicrobieni se obține în organism, între două administrări, concentrații sau nivele variind de la maxim la minim ceea ce constituie zona nivelelor critice. Felul relației dintre concentrația minimă inhibantă sau concentrația minimă bactericidă, nivelul de antibiotic în sânge sau în focarul infecțios, precum și criteriul clinic, permit clasificarea germenilor în sensibili, intermediari și rezistenți.

Un germen este sensibil atunci când este inhibat de acea concentrație a agentului antimicrobian care se poate obține în organism consecutiv unei administrări uzuale. În consecință o infecție de formă clinică ușoară sau medie cu tulpină sensibilă va răspunde favorabil terapiei cu medicamentul respectiv aplicat în doză adecvată localizării infecției.

Categoria de tulpini intermediare se referă la germenii pentru care răspunsul favorabil la terapia infecției nu poate fi atins decât prin nivele obținute după administrarea de doze supramedii de medicament – date sub limita de toxicitate (în cazul unei infecții generalizate) sau în situația în care se obține o concentrare fiziologică a substanței active chiar la locul infecției (urinare, biliare, etc.). Atributul de tulpină rezistentă se referă la acel germen care necesită pentru inhibiție o concentrare de medicament superioară nivelului ce se poate obține în organism, chiar după doze masive; în consecință, infecția nu va răspunde favorabil unei terapii cu medicamentul respectiv indiferent de dozaj și de localizare.

5.1 INDICAȚIILE ANTIBIOGRAMEI

Antibiograma este una din cele mai frecvente examinări fiind soilicitată pe multiple considerente de ordin clinic, epidemiologie și de cercetare. În scop clinic antibiograma este necesară pentru alegerea sau realegerea agentului antimicrobian cel mai indicat pentru o infecție dată, provocată de germeni cu o creștere rapidă a căror sensibilitate nu poate fi prevăzută. În mod deosebit este necesară efectuarea antibiogramei în infecții cu stafiiococi, enterococi, enterobacterii, bacili Gram-negativi nefermentativi, cu condiția ca rolul etiologic să fie precis stabilit iar infecția respectivă să necesite un tratament antimicrobian.

Antibiograma poate fi inutilă pentru unii germeni a căror sensibilitate la unul sau mai multe medicamente este previzibilă cum ar fi streptococii pyogeni, Streptococcus pmeumoniae, Neisseria meningitidis, Vibrio cholerae, etc. De subliniat totuși că astfel de situații devin tot mai rare o dată cu semnalarea de tulpini bacteriene din speciile respective, rezistente la antibioticele de elecție.

În scop epidemiologie antibiograma se practică în cadrul unui plan global de supraveghere a evoluției spectrului de antibiotip, de urmărire a emergenței de tulpini rezistente la medicamentele de elecție și de rezervă și pentru controlul difuziunii tulpinilor multiplu rezistente.

În spitale îndeosebi, supravegherea antibiorezistenței prin antibiograme de rutină constituie o sursă de informare epidemiologică și clinică foarte prețioasă. Astfel se poate evidenția la un moment dat prevalența unui anume antibiotip la o anumită specie bacteriană, iar asocierea antibioticului cu alți markeri biologici – spre exemplu serotip, lizotip, etc. – face posibilă urmărirea eventualelor surse de infecții intraspitalicești, identificarea infecțiilor încrucișate, etc.

Informațiile pe care le oferă prelucrarea rezultatelor antibiogramei de rutină sunt utile și pentru stabilirea unei politici raționale în utilizarea antibioticelor în spitale indicând la un moment dat necesitatea restricției și/sau rotației unor grupe de medicamente implicate în emergența de tulpini rezistente. În scop științific antibiograma se practică pentru cercetarea fenomenului de rezistență respectiv mecanismul de rezistență, incidența rezistenței plasmidice, relația între plasmide și alți determinanți genetici ai celulei bacteriene, etc.

În unele situații testarea sensibilității germenilor trebuie completată cu examinări suplimentare cum ar fi determinarea concentrației minime bactericide, testarea activității antimicrobiene a unor antibiotice în asociație, probleme care vor face obiectul unor capitole separate. Testarea sensibilității germenilor la agenții antimicrobieni se efectuează după două metode de bază – fiecare cu variantele sale – respectiv metoda diluțiilor și metoda difuzimetrică.

5.2 ANTIBIOGRAMA PRIN METODA DIFUZIMETRICĂ

Cu toate avanatjele pe care le prezintă metoda diluțiilor, se recomandă pentru laboratoarele clinice de spital testarea sensibilității prin metoda difuzimetrică, întrucât este mai ușor de realizat, mai ieftină și dacă se respectă cu strictețe toate condițiile de lucru, poate asigura o reproductibilitate de aproximativ 90%.

Concordanța rezultatelor între metoda difuzimetrică și metoda diluțiilor este însă mult diferită, cu variații mari în funcție de germeni. În majoritatea țarilor metoda Kirby-Bauer standardizată și reevaluată periodic de experți OMS a fost acceptată ca procedeu standard. Redăm mai jos această metodă adaptată unor condiții de lucru din țara noastră, respectiv folosirea substanțelor antimicrobiene condiționate sub formă de microcomprimate în loc de rondele de hârtie de filtra. Pentru laboratoarele mici de spital, rămâne valabilă posibilitatea utilizării metodei comparative Stokes-Balș care poate furniza rezultate mulțumitoare chiar dacă ingredientele nu sunt de o calitate perfect constantă. Deși este mai laborioasă, metoda este mai ieftină și mai precisă.

Prinicipiul metodei

Consecutiv depunerii de microcomprimate (discuri) cu antibiotice pe suprafața unui mediu solid însămânțat cu cultură bacteriană au loc – în ordine sucesivă – următoarele procese fîzico-biologice.

În primul rând, microcomprimatul sau discul absoarbe apa din mediu necesară dizolvării substanțelor antimicrobiene active care ajunse în soluție vor difuza în mediu conform legilor fizice ce condiționează difuziunea moleculeor în gelul de agar prezentând o scădere constantă a gradientului de concentrație de la marginea discului către periferie. Pe măsură ce agentul antimicrobian difuzează, începe – după faza de lag -, faza de creștere bacteriană logaritmică. După un anumit timp de incubație – peruioadă critică – se vor contura două zone distincte: una în care creșterea bacterian ă este inhibată de concentrații suficiente de substanță antimicrobiană și o zonă de creștere în care concentrația de antibiotic este absentă sau prea mică pentru a inhiba creșterea.

Poziția zonei de inhibiție pentru cei mai mulți germeni și pentru cele mai multe antiobiotice este determinată după primele ore de incubare și include faza de lag și timpul necesar pentru 2-3 generații; din acest motiv cu tehnica difuzimetrică nu se pot testa decât germenii care, în condiții standard au o dezvoltare rapidă și constantă. Cu cât diametrul zonei de inhibiție este mai mare, cu atât germenul este mai sensibil adică cantitatea de antibiotic necesară inhibiției germenului – concentrația minimă inhibantă (CMI) – este mai mică și invers.

Mărimea zonei de inhibiție este evident condiționată și de rata de difuziune în gelul de agar, variabilă de la un antibiotic la altul, ceea ce face ca zonele de inhibiție obținute să fie proprii fiecărui agent antimicrobian. Există deci pentru un anumit agent antimicrobian o relație inversă între diametrul zonei de inhibiție — apreciată difuzimetric – și cantitatea cea mai mică de antibiotic ce produce inhibiția germenului – CMI – determinată prin metoda diluțiilor. Această corelație se stabilește cantitativ, experimental, efectuând 100-150 testări pentru fiecare antibiotic cu tulpini microbiene variate atât prin metoda diluțiilor cât și prin metoda difuzimetrică.

Rezultatele obținute se exprimă grafic notând pe ordonată concentrația de antibiotic în mcg/ml în scară logaritmică și abscisă diametrul zonelor de inhibiție în mm în scară aritmetică. Cunoscând, pentru un anume germen, diametrul zonei de inhibiție, față de un antibiotic se poate obține ușor CMI prin proiectarea pe ordonată a punctului de pe curba de concordanță situat la locul de întâlnire cu verticala ridicată de pe abscisa din dreptul valorii respective a diametrului zonei de inhibiție. Linia trasată reprezintă curba de regresie, reflectând media valorilor celor mai apropiate de deasupra și de desubtul liniei.

O dată aceste relații precizate trebuiesc comparate valorile concentrațiilor minime inhibante cu nivelele de antibiotic ce se pot obține în organism la nivelul focarului infecțios de multiplicare bacteriană; prin această determinare este posibil a se stabili valori critice ce definesc un germen sensibil și rezistent. Dacă CMI este inferioară nivelelor de antibiotice realizabile în organism printr-o terapie uzuală, germenul este sensibil și terapia are șanse de succes. Dacă CMI este sueperioară nivelelor ce se pot obține în organism – chiar prin supradozare – germenul este rezistent terapia constituind un insucces.

Atributul de tulpină intermediară se acordă situațiilor în care germenul poate fi inhibat în doze masive accesibile sau este sensibil prin concentrarea antibioticelor în produsul respectiv – bilă, urină, materii fecale, etc. În urma unui stadiu colaborativ între laborator și clinică s-a putut formula pentru tehinica Kirby-Bauer, care sunt diasmetrele (și implicit nivelele) critice care permit clasificarea germenilor studiați în "sensibili", "rezistenți" și "intermediari" în cazul unor infecții de gravitate medie și folosind antibioticele în doze admisibile.

Diametrele critice au o valoare orientativă statistic valabilă, dar nu reprezintă criterii absolute universal acceptabile în clinică; în plus, orice abatere de la respectarea cu extremă scrupulozitate a indicațiilor date pentru tehnica Kirby-Bauer, vor compromite rezultatele.

5.3 STANDARDIZAREA CONDIȚIILOR TEHNICE ȘI A REACTIVILOR DE LUCRU

Fiecare din componentele ce concură la efectuarea antibiogramei pot influența diametrul zonei de inhibiție și deci criteriile de interpretare. Astfel un mediu cu o concentrație mai mare de geloză va condiționa zonă de inhibiție mai reduse și invers, un inocul prea bogat va determina un siametru de inhibiție mai mic și invers. În consecință, condițiile tehnice referitoare la mediul de cultură ( compoziție, pH), inocul, felul discurilor, modul de incubare, de citire, trebuie precis standardizate.

Mediul de cultură

Mediul de cutlură recomandat este geloza Mueller-Hinton (M-H) pe motivul că dintre mediile gelozate existente răspunde cel mai bine următoarele condiții:

Asigură o dezvoltare bună a majorității germenilor patogeni cu creșterea rapidă;

Nu exercită anatgonism față de agenți animicrobieni inclusiv sulfamide și trimetoprim în condițiile unor concentrații adecvate de ioni bivalenți (Ca++ și Mg++);

Este izotonic pentru sângele care trebuie adăugat în vederea asigurării dezvoltării unor gemeni cu necesități de creștere deosebite;

Are o compoziție relativ definită și asigură performanțe reproductibile de la lot la lot;

Mediul Mueller-Hinton a furnizat cele mai multe observații până acum în acțiunea de standardizare a antibiogramei.

Folosirea unui alt mediu în locul gelozei M-H nu este recomandată. În lipsa oricărei alte alternative, utilizarea gelozei nutritive este condiționată de suplimentarea cu 5-8% sânge lacat de cal ; rezultatele vor fi valorificate numai în cazul în care controlul de calitate efectuat pe același mediu cu tulpinile de referință corespunde criteriilor din tabelul 12V și 12VI. Mediul de cultură trebuie să-ndeplinească unele caracteristici tehnice și anume:

Să aibă compoziția standard și o consistență corespunzătoare cu cea dată de agarul pulbere în concentrație de 1,5-1,7%;

PH-ul mediului M-H trebuie să fie cuprins între 7,2-7,4; este indicat ca pH-ul să fie testat înainte de turnare în plăci (50° C) sau mai bine după gelificare în plăci, în această situație determinarea pH-ului se face în funcție de posibilitățile laboratorului, fie macerând o mică cantitate de geloză, fie lăsând să se solidifice o mică cantitate de agar în jurul unui electrod de suprafață;

Grosimea stratului de geloză turnată în plăci cu fundul perfect plan trebuie să fie de 4mm; în acest scop se recomandă plăcile din material plastic. Pentru realizarea acestui strat sunt necesare aproximativ 25ml mediu pentru o placă de 10 cm diametru și50 ml mediu pentru o placă cu diametru de 15cm.

Geloza M-H se folosește ca atare pentru cultivarea majorității speciilor bacteriene, cu următoarele excepții:

Pentru testarea sensibilității Streptococilor grup A, B, C, D și viridans, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, se suplimentează cu sânge de oaie, de cal sau altă specie (sânge lipsit de activitate antimicrobiană);

Pentru testarea chmiosensibilității Haemopliylus influenzae este necesară prepararea unei geloze M-H șocolat cu adaos de autolizat proaspăt de drojdie sau de preferință factor X și V în stare pură. Pentru Neisseria gonorrheae testarea se va face pe geloză M-H sau geloză specială pentru acest scop suplimentată cu sânge și soluție de vitamine, spre exemplu, izovitalex;

În cazul notării unei rezistențe la cotrimoxazol este indicată retestarea pe mediul M-H cu sănge lacat de cal.

Cu toate avantajele oferite mediului M-H nu constituie formula optimă, în special din cauza concentrației variate de cationi bivalenți ce pot influența diametrul zonelor de inhibiție pentru amino-glicozide, antibiotice polipeptidice, și tetraciclină. Standardizarea unui mediu definit chimic este însă un deziderat greu realizabil. Ca mediu lichid pentru prepararea inoculului este indicat bulionul M-H sau în lipsa acestuia bulion cord-creer.

Germenul de testat

Este absolut necesar ca agentul etiologic să fie izolat în cultură pură; este total contraindicată efectuarea antibiogramei din floră bacteriană mixtă dezvoltată pe medii solide sau lichide. De asemenea antibiograma este inutilă sau constituie chiar o gravă sursă de eroare clinică dacă germenul de cercetat nu este confirmat ca agentul etiologic cert al infecției ce trebuie tratată.

În scop clinic efectuarea antibiogramei este indicată numai pentru acele specii bacteriene a căror CMI nu este o constantă dinainte previzibilă. Din această categorie de germeni se pot testa prin antibiograma difuzimetrică numai bacteriile cu dezvoltare rapidă și uniformă și îndeosebi acelea care au tendiința de a câștiga rapid rezistență fată de medicaementele de uz clinic.

Antibiograma de rutină pentru Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis și Neisseria gonorrheae este practic inutilă, exceptând unele situații când:

Se înregistrează un eșec terapeutic în cazul utilizării antibioticului de elecție cum ar fi arrele tzlpini de Streptococcus pnezumoniae, Neisseria gonorrheae devenite rezistente la Betalactamine;

Bolnavul este sensibilizat față de antibioticul de elecție;

Nu se pot testa prin metoda difuzimetrică germeni cu dezvoltare lentă, spre exemplu Nochardia, Actinomyces, etc.

Asigurarea unei dezvoltări rapide pentru germeni tip Haemophylus și Neisseria se face prin suplimentarea mediului cu diferiți factori așa cum s-a specificat anterior. Constituie o eroare efectuarea antibiogramei direct din produs; fac excepție de la această regulă numai cazurile urgente în care produsul respectiv conține un singur germen și în cantitate suficientă pentru un inocul adecvat.

În această situație se pot găsi unele lichide cefalo-rahidiene, bulionul de hemocultură, lichidul pleural și chiar urini, dacă au fost corect recoltate, transportate și examinate în timp util. Rezultatul obținut este considerat ca provizoriu urmând a se efectua antibiograma din cultura ca atare. Prezintă o contraindicație absolută efectuarea antibiogramei din produse pluricontaminate (exudat faringian, spută, materii fecale, secreție vaginală). Antibiograma trebuie efectuată imediat după izolare chiar dacă germenul este în curs de identificare; testarea germenilor sălbatici după stocarea îndelungată este total contraindicată dată fiind posibilitatea segregării determinanților de rezistență.

Inoculul

Este absolut necesar ca inoculul să fie reprezentativ, adică să cuprindă toate categoriile populației microbiene uneori heterogenă din punct de vedere al rezistenței. În acest scop pentru prepararea inoculului se va pleca în mod obligatoriu de la 4-6 colonii identice dezvoltate pe un mediu neselectiv (sau din cultura de bulion). Mărimea inoculului trebuie să fie riguros standardizată. Aceasta se realizează pe bază nefelometrică și trebuie să corespundă opacității din tubul cu sulfat de bariu obținut printr-un amestec de BaCl2 cu SO4H2 după tehnica menționată; aceasta corespunde la un conținut de aproximativ 5×107-108 germeni/ml (Enterobacteriaceae și Stafilococi) și aproximativ 108-5x 108germeni/ml pentru Pseudomonas aeruginosa.

Prepararea inoculului din cultura de testat se efectuează după una din modalitățile mai jos notate:

Se suspendă 4-6 colonii separate, identice, dezvoltate pe mediu neselectiv din culturi 16-20 h în mediu lichid sau în soluție salină pH 7,2 și se ajustează la turbiditate standard;

Se repică 4-6 colonii în 5ml bulion nr.1 (sau bulion M-H), se incubează 4-8h la 37° și se ajustează la nevoie la turbiditate standard.

Însămânțarea inoculului pe plăci se va efectua în cel mult 15 min. de la data preparării.

Depunerea inoculului se poate face după următoarele modalități:

Cu ajutorul unui tampon de vată netoxic și steril care se îmbibă cu suspensie bacteriană; se elimină cu grijă excesul prin presarea și rotarea completă de mai multe ori a tamponului pe peretele tubului. Se șterge tamponul pe suprafața mediului în trei direcții până la acoperirea uniformă a întregii suprafețe, efectuând în final un striu marginal circular. Presupunând că conținutul unui tampon reprezintă aproximativ 1/10 ml rezultă că pe suprafața plăcii s-au depus 5-106 -107 celule bacteriene.

Prin inundarea plăcii cu 3-5 ml inocul îndepărtând excesul cu o pipetă Pasteur;

Prin depunerea a 0,1 ml inocul în 3-4 picături și întindere cu tamponul uscat.

Plăcile îsămânțate – indiferent de procedeul folosit – se lasă maximum 5- 10 min. la temperatura camerei pentru uscare până la depunerea microcomprimatelor. Dacă inoculul și însămânțarea plăcilor s-au efectuat corect se obține o cultură bacteriană uniform confluentă sau semiconfluentă.

Substanțe antimicrobiene

Substanțele antimicrobiene pentru antibiogramă sunt condiționate în țara noastră sub forma de microcomprimate (substanța activă este incorporată în poliezilenă cu un adaos de Na2S04 și amestecul este supus comprimării directe). Fiecare microcomprimat are un diametru de 6 mm și are notat pe o față simbolul respectiv.

Pentru medicamentele de uz curent față de care nu există microcomprimate corespunzătoare se pot folosi – în condițiile menționate la capitolul Control de Calitate – discuri preparate de alte case farmaceutice sau discuri preparate de laborator. Conservarea microcomprimatelor se face prin menținerea la adăpost de căldură, lumină și umiditate. Experiența confirmă că microcomprimatele B lactaminice (peniciline și cefalosporine) își pierd eficacitatea înainte de limită dacă nu se păstrează la +4°C.

Flacoanele cu microromprimate o dată desfăcute ca și antibioticele condiționate sub formă de discuri impregnate vor fi păstrate numai la 4°C. Înainte de utilizare se mențin la temperatura camerei timp de 30-60min. pentru echilibrarea termică. Microcomprimatele și discurile cu valabilitate depășită sau acelea care dau zone de inhibiție pentru germeni de referință în afara valorilor standard, nu pot fi utilizate.

Este indicat a se folosi un singur preparat reprezentativ pentru un grzup de agenți antimicrobieni strâns înrudiți ca activitate "in vitro" și anume:

Benzil penicilina sau penicilina G este utilizată pentru testarea sensibilității față de toate penicilinele sensibile la penicilinază (fenoximetilpenicilin sau penicilina V și feneticilină );

Oxacilina, reprezintă de fapt toate penicilinele rezistente la penicilinază (meticilina, nafcilina, cloxacilina și flucloxacilina); de menționat că rezistența stafilococului la oxacilină și la medicamentele înrudite este de tip heterogen: astfel majoritatea celulelor pot fi perfect sensibile producând o zonă mare de inhibiție în timp ce altele pot apărea sub formă de colonii rezistente minuscule și discrete în interiorul zonei de inhibiție; acest tip de rezistență este potențat prin incubare prelungită la 35°C.

Ampicilina este utilizată pentru testarea față de penicilinele cu spectru larg active pe germeni Gram-negativi cum ar fi: amoxicilina, pivampicilina, talampicilina, etc.; spectrul de acțiune nu este însă superpozabil cu cel al carbenicilinei care trebuie să reprezinte a doua penicilină activă pe Gram-negativ; de menționat proliferarea deosebită în ultimul timp al acestor tipuri de B lactamine;

Cefalotinul reprezintă toate cefalosporinele comercializate de prima generație (cefalexin, cefrodin, cefaloridin, cefozolin și cefapirin); consecutiv proliferării cefalotinelor din generația a II-a și a III-a este indicat a se folosi câte un disc pentru unele din aceste medicamente cum ar fi cefoxidin, cefamandol, cefuroxin, moxalactan, cefotoxin și cefsulodin și ureid penicilinele;

Între aminoglicozide, kanamicina poate reprezenta și neomocina și paromomicina; restul aminoglicozidclor cum ar fi streptomicina, gentamicina, tobramicina, sisomicina și amikacina se include în funcție de indicațiile clinice.

Discurile de cloramfenicol pot fi aplicate și înlocui tiamfenicolului;

Tetraciclină este singurul agent pentru oxitetraciclină, clortetraciclină și alți membrii ai acestui grup (metaciclina, dimetil-clor-tetraciclina, etc.). Unii germeni Gram-pozitivi și Gram-negativi pot arăta o comportare deosebită față de doxiciclină (vibramicină) și minociclină care ar trebui să completeze grupa tetraciclinelor;

Eritromicina poate suplini unele din antibioticele din grupul macrolidelor ca oleandomicina, spiramicina și virginomicina; nu poate înlocui însă lincocina și clindamicina care au spectru mai larg;

Colistinul și polimixina B sunt medicamente polipeptidice strâns înrudite și este suficient a folosi unul din ele;

Sulfamidele pot fi reprezentate de un singur preparat – sulfizosazol sau sulfafurazol;

Dintre nitrofurani se va folosi nitrofurantoin pentru germenii izolați din urină și alte produse și furazolidonul pentru germenii din conținutul intestinal;

Acidul nalidixic reprezintă grupul quinolonelor de primă generație;

Cotrimoxazolul, combinație din trimetoprim și sulafametoxazol, este singurul disc conținând combinații de medicamente; având o acțiune net diferită de medicamentele componente, este considerat ca un preparat unic.

Concentrația în substanță activă a microcomprimatelor și discurilor trebuie să fie astfel aleasă încât atunci când sunt utilizate după tehnica standard să ducă la obținerea de zone de inhibiție nete față de germeni pentru care concentrațiile minime inhibante sunt cuprinse între limitele nivelelor maxim și minim ce se pot obține în sânge și țesuturi cu o terapie uzuală și invers, să nu arate nici o zonă de inhibiție față de germeni a căror concentrație minimă inhibantă este superioară nivelelor ce se pot obține în organism.

Selecționarea setului de microcomprimate pentru antibiogramă se face în funcție de obiectivul sau scopul urmărit care poate fi de ordin strict clinico-terapeutic, de ordin taxonomic, epidemiologie sau în scop de cercetare. Pentru a face față oricărui criteriu din cele menționate, se sugerează întocmirea a 2 (eventual a 3) seturi mari din combinarea truselor de microcomprimate distribuite ( și care nu corespund cerințelor reale), respectiv unul pentru Gram- pozitiv și altul pentru Gram-negativ precum și unul pentru infecții urinare; din acestea se vor selecționa microcomprimatele în funcție de obiectivul urmărit (clinic, epidemiologie, de cercetare).

Dintre microcomprimateîe existente în diferite truse unele pot fi excluse cum ar fi pristinamicina, novobiocina, foarte rar utilizate. Mai pot fi eliminate microcomprimatele cu concentrația inadecvată în substanță activă, cum ar fi microfurantoin- doza mică (10 mcg), sulfafurazol – doza mică (30mcg), colistin- doza mare ( 300 mcg) și care nu prezintă o utilitate practică. În schimb trebuie introduse microcomprimate sau rondele corespunzătoare medicamentelor utilizate în clinică ca: gentamicina, cotrimoxazol, cefalotin, carbenicilina, etc.

Pe baza acestor criterii, propunem următoarele două seturi pentru Gram-pozitiv și Gram-negativ. Tabel 13.1

Pentru laboratoarele de spital și în scop strict terapeutic se vor folosi din seturile menționate mimai microcomprimatele strict necesare, în funcție de felul germenilor și localizarea infecției.

Tabel 13.2

a = numai ca medicament de rezervă rar aplicat

x = numai în asociație cu B lactamine Tabel 13.3

Tabel 13.4

Tabel 13.5

Față de unii germeni, testarea va putea fi limitată la numai 2-3 preparate incluzând medicamentul de elecție și 1-2 medicamente de rezervă, spre exemplu penicilină, tetraciclină, și eritromicină pentru Streptococcus pneumoniae. Streptococi grup B, Streptococcus pyogenes sau penicilină și sulfafurazol pentru Neisseria maningitidis.

Depunerea microcomprimatelor se face după uscarea plăcilor și nu mai târziu de 15 min. de la însămânțare. Așezarea spațială a microcomprimatelor este la libera alegere a fiecărui laborator dar este recomandabilă o dispoziție în funcție de grupele de agenți antimicrobieni, spre exemplu:

B lactamine (peniciline și cefalosporine);

Aminoglicozide;

Antibiotice cu spectru larg (cloramfenicol, tetraciclină);

Macrolide și substanțe înrudite;

Polipeptide;

Substanțe chimioterapice.

În acest fel, spectrul de rezistență se poate aprecia și reține mai ușor. Înainte de depunerea inoculului se scriu pe fundul plăcii simbolul sau numărul de ordine al microcomprimatului respectiv. Depunerea microcomprimatelor se face cu pensa – de preferat pensă oftalmologică tip Iris – presând ușor fiecare comprimat pentru a ajunge pe toată suprafața sa în contact cu cultura. Se va respecta o distanță 15 mm de la marginea plăcii și aproximativ 24 mm între comprimate. Se poate deasemenea folosi un dispozitiv mecanic sau semiautomat de așezare simultană a mai multor discuri.

Pe o placă de 150 mm diametru, se pot depune aproximativ 12 microcomprimate iar pe una de 100 mm diametru 8 microcomprimate. După depunerea microcomprimatelor se realizează o periadă de predifuziune nu mai mare de 15 min.

Incubarea

Se face la 37°C (de preferință la 35°C) în poziție răsturnată în condiții de aerobioză. Incubarea în atmosferă de CO2: nu este recomandată din cauza modificărilor de pH pe care le cauzează. Durata incubării este de 16-18 h; numai în cazuri de extremă urgență se va putea face o citire cu caracter preliminar după 4-8h cu obligația de a reincuba plăcile și de a reefectua o citire definitivă la sfârșitul perioadei de incubare.

Citirea, exprimarea și interpretarea rezultatelor

Se supun citirii numai plăcile care prezintă o cultură corespunzătoare din punct de vedere al purității și densității. Citirea se efectuează cu ochiul liber, măsurând diametrul zonei de inhibiție în mm (inclusiv diametrul microcomprimatului) de 2-3 ori în diferite direcții cu ajutorul unei rigle sau unui abac. Pe mediile fară sânge măsurarea diametrului se poate efectua direct pe fundul plăcii în lumina reflectată sau transmisă, dacă s-a adăugat sânge, zona de inhibiție se determină prin măsurare la suprafață în lumina reflectată după îndepărtarea capacului plăcii Petri.

Se apreciază inhibiția completă a creșterii așa cum se observă cu ochiul liber cu următoarele precizări:

Nu se iau în considerare:

Cultura foarte fină ce poate apărea în zona microcomprimatului cu sulfamide și cotrimoxazol din cauza diferenței de timp între apariția culturii (sunt necesare câteva generații de creștere) și începutul procesului de inhibiție;

Colonii foarte mici, punctiforme, vizibile numai cu lupa la marginea zonei de inhibiție;

Zona de creștere foarte fină pe aria de inhibiție (mai ales la cloramfenicol) cauzată de roirea Proteusului, în prezența unei zone circulare de inhibiție foarte net vizibilă (situație provocată de obicei de un inocul prea bogat).

Se iau în considerare:

Colonii mari, bine dezvoltate, apărate în interiorul zonei de inhibiție: acestea reprezintă mutante rezistente în cadrul unei populații predominant sensibile; astfel de colonii se vor repica, reidentifica și retesta pentru sensibilitate, notându-se totodată și numărul lor;

Cultura net vizibilă, chiar dacă prezintă o opacitate mai redusă; în cazul în care aceasta este dispusă circular și există o zonă de inhibiție completă, se va nota numai diametral interior al inhibiției totale; dacă cultura rezistentă cu opacitate mai redusă este prezentă pe toată aria se va nota diametrul zonei de inhibiție parțiale cu specificarea prezenței culturii rezistente.

Situațiile de mai sus sunt generate de mutante rezistente precum și în cazul unor bacterii cu viteze de multiplicare diferite în cadrul unei populații bacteriene heterogene.

Exprimarea rezultatelor

În buletin se face fie direct prin transcrierea diametrului zonei de inhibiție în mm cu indicarea limitelor valorilor exprimând sensibilitate sau rezistență fie prin traducerea acestei valori în atribute calitative de tulpini rezistente, intermediare sau sensibile conform criteriilor menționate în tabelul 13.6

* – discuri impregnate în laborator în lipsa microcomprimatelor respective Tabel 13.6

Interpretarea rezultatelor

Semnificația clinică a atributului de tulpină sensibilă intermediară sau rezistentă a fost specificată la capitolul Introducere.

În interpretarea rezultatelor pe baza diametrelor critice trebuie avute în vedere următoarele limite sau precauții:

Rezistența la polimixină și colimicină este uneori inexactă, eroarea fiind cauzată de un inocul prea bogat asociat cu un coeficient redus de difuziune a acestor antibiotice; astfel de situații se controlează prin metoda diluțiilor;

Unele tulpini de stafilococ pot apărea ca fals sensibile la meticilină în condițiile incubării la 37°C; rezistența la meticilină poate fi mai ușor decelabilă prin incubare la 37°C sau prin adăugare la mediu a 5% NaCl, cu condiția folosirii unui inocul bogat;

Tulpinile de stafîlococ meticilină-rezistente se arată uneori sensibile la cefalosporin; aceasta poate fi datorată diferenței de concentrație a celor două discuri (microcomprimate) de 5 și respectiv 30 mcg. În general astfel de rezultate nu se confirmă în clinică, motiv pentru care sensibilitatea la cefalotin a tulpinilor meticilino-rezistente trebuie privite cu rezervă; practic se poate considera rezistent;

Tulpinile de Pseudomonas găsite rezistente la aminoglicozide și într-o oarecare măsură la polipeptide vor fi retestate întrucât falsa rezistență ar putea fi datorată unei concentrații mai mari de ioni de Mg și Ca decât concentrația fiziologică; se poate înregistra și o situație inversă și anume o falsă sensibilitate în condițiile unei concentrații subfiziologice de cationi bivalenți respectivi;

Unele tulpini de stafilococ și Pseudomonas cu un grad redus de rezistență la Gentamicină (CM! = 8-6 mcg/ml) vor fi greu de diferențiat de tulpinile sensibile din cauza lipsei unei zone intermediare; astfel de tulpini care dau o zonă de inhibiție cu 3-6 mm mai redusă decât a tulpinei de Pseudomonas aeruginosa de referință, vor trebui să fie retestați.

Procedeul de lucru

Rezultă din capitolele anterioare.

Se scot plăcile din frigider și se lasă să se usuce la temperatura laboratorului; se controlează pentru sterilitate și grad de consistență; se notează pe fundul plăcii numărul probei și locul de aplicare al microcomprimatelor;

Se prepară inoculul după tehnica menționată și se ajustează turbiditatca la etalonul standard prin compararea vizuală pe fondul unei hârtii albe cu dungi negre de contrast;

Se inoculează plăcile în cel mult 15 min. de la prepararea inoculului după unul din procedeele menționate. După însămânțare se lasă să se usuce cu capacul deschis 5-15 min;

Se depun microcomprimatele (discurile) pe suprafața gelozei însămânțate; întrucât eliberarea antibioticului se face aproape instantaneu, discurile odată depuse nu vor mai fi mișcate în altă poziție;

După cel mult 15 min. de la depunerea microcomprimatelor (perioada de predifuziune) plăcile se incubează în termostat în poziție răsturnată;

După 16-18 h de incubare se citesc zonele de inhibiție și se interpretează conform indicațiilor de la capitolul "mod de exprimare al rezultatelor".

Surse de erori

Acestea pot fi cauzate de o serie de situații ca cele mai jos menționate:

Folosirea unui alt mediu decât geloza M-H fără determinarea parametrilor dați de curbele de concordanță, sau folosirea, mediului M-H necontrolat din punct de vedere al pH-ului, consistenței, al concentrației de ioni de Ca și Mg;

Folosirea de microcomprimate (discuri) degradate având depășită limita reală de eficacitate;

Însămânțarea unui inocul nestandardizat;

Depășirea intervalelor de timp între prepararea inoculului și însămânțare, între însămânțare și aplicarea microcomprimatelor și între aplicarea microcomprimatelor și incubare (prelungirea periopadei de predifuziune);

Incubarea în CO2 sau incubare aerobă pe o perioadă prea scurtă fără recitire;

Testare de culturi niixre;

Produse pluricontaminate sau pe germeni cu dezvoltare lentă;

Citirea inexactă a diametrelor zonelor de inhibiție sau transcrierea eronată a diametrelor critice;

Lipsa controlului de calitate.

Controlul de calitate

Rezultatele obținute cu tehnica difuzimetrică pot fi influențate – așa cum s-a arătat în capitolul precedent – de fiecare din componentele implicate în efectuarea antibiogramei (mediu, inocul, microcomprimate, condiții tehnice de lucru).

Tulpini de referință

Întrucât nu este posibil a se controla fiecare variabilă a metodei în parte se recurge la verificarea rezultatului final, exprimat de diametrul zonei de inhibiție observat la tulpinile de referință (testate în aceleași condiții ca și germenii de cercetat) raportat la valori standard de referință.

Pentru antibiograma difuzimetrică sunt recomandate următoarele tulpini de referință internaționale:

Echerichia coli, ATCC 25922 (NCTC 10418)

Stafilococ aureus ATCC 25923 (NCTC 6571)

Pseudomonas aeraginosa ATCC 27853 (NCTC 10662)

Tulpinile menționate pot fi obținute de la Institutul Cantacuzino, colecția de culturi microbiene sau laboratorul de microbiologie clinică.

Fiecare laborator va păstra aceste tulpini în triplu exemplar și în următoarele modalități:

Tulpină de rezervă sub formă liofilizată;

Tulpină stock – pe geloză dreaptă M-H la +4°C;

Tulpină de lucru, obținută din tulpina stoc prin subculturi la interval de două săptămâni.

Folosirea zilnică pe o perioadă îndelungată a tulpinei de lucru poate duce la rezultate eronate. Acestea pot fi cauzate fie de o contaminare, fie de schimbarea spectrului de sensibilitate a gemenului de referință consecutiv a prea multe pasaje. În consecință ori de câte ori se observă modificări ale diametrului zonelor de inhibiție peste limitele admise, modificări ce nu pot fi atribuite unor comprimate ale tehnicii, se va face apel la subculturi din tulpina stoc.

Pentru fiecare din tulpinile de referință au fost determinate valorile diametrelor zonelor de inhibiție față de fiecare microcomprimat. Pe baza a numeroase măsurători s-a ajuns la definirea provizorie a unor parametrii de valoare internă utili în efectuarea controlului de calitate al antibiogramei și anume:

Media diametrului zonei de inhibiție;

Rangul sau diferența între observația cea mai mare și cea mai mică; aceasta reprezintă limita de toleranță în interiorul căreia trebuie să fie incluse cel puțin 75% din determinările singulare la nivelul diferitelor laboratoare.

Diametrul zonelor de inhibiție (mm) al tulpinilor de referință E. coli și Stafilococ față de microcomprimatele R.S.R.

Tabel 13.7

Aceste date sunt prezentate în tabelul de mai jos, pentru stafilococ ATCC25923 și pentru Echerichia coli ATCC25922. Pentru Pseudomonas sunt trecute valorile interanaționale pentru gentamicină, carbenicilină și tobramicină – fără corespondențe în microcomprimate românești și valoarea internă pentru coilistin.

Tabel 13.8

a= valori internaționale pentru rondele standard;

b= valori pentru microcomprimate românești.

Modul de efectuare al controlului

Fiecare laborator va testa în aceleași condiții de tehnică o dată cu tulpinile de examinat și tulpinile de referință. Înainte de înregistrarea și interpretarea rezultatelor antibiogramelor se va trece la citirea și scrierea diametrelor zonelor de inhibiție pentru tulpinile de referință; se verifică dacă diametrul găsit pentru aceste tulpini se înregistrează în limitele variației admise de rang. Cu cât diametrul zonei de inhibiție pentru tulpinile de referință sunt în mod repetat mai aproape de valoarea medie și în orice caz în interiorul variației admise, cu atât rezultatele sunt mai exacte și reproductibile.

În această situație se poate trece la citirea antibiogramelor și la interpretarea rezultatelor în rezistent, sensibil, intermediar . Dacă mărimea diametrelor zonelor de inhibiție la tulpinile de referință pentru unul sau mai multe comprimate se situează în afara valorilor rangului, rezultatele pentru respectivele microcomprimate nu sunt valabile și nu se raportează pe buletin. Într-o astfel de situație se trece la cercetarea cauzei prin verificarea fiecărei componente a tehnicii în parte.

În cazul în care variația în afara limitelor admise este dată pentru mai multe microcomprimate, sunt implicate foarte probabil deficiențe ale mediului (compoziție, consistență, pH) sau ale inoculului (prea bogat sau prea sărac). Dacă variația nepermisă interesează în mod constant unul sau un număr redus de comprimate este foarte probabil ca eroarea să fie consecința unei deteriorări a microcomprimatelor printr-o incorectă conservare sau inexactă dozare. În astfel de situatii se va trece la verificarea concentrației în substanță activă a microcomprimatelor (rondelelor).

Controlul concentrației în substanța activă a microcomprimatelor

Pentru efectuarea acestui control se folosesc aceleași tehnici de lucru și una din tulpinile de referință menționate. Este necesară deasemenea prepararea unor soluții etalon proaspete din antibioticul respectiv, în cazul în care nu există un etalon național de referință. Se folosesc trei concentrații etalon din care una corespunde conținutului în substanță microbiană activă a microcomprimatului respectiv, o concentrație superioară și una inferioară distanțate pe scara logaritmică; spre exemplu, dacă microcomprimatui conține 30 mcg, în afară de soluția de 30 mcg se vor prepara concentrațiile de 15 și respectiv 60 mcg pentru o scară logaritmică 2 sau 20 și respectiv 45 mcg pentru scara logaritmică 1,5.

Pentru depunerea antibioticelor se folosesc fie cilindrii fixați în geloză în care se depun 0,05ml, fie discuri îmbibate cu 0,02 ml din soluții de concentrații corespunzătoare: discul trebuie să fie de același diametru cu cel al discului standard și de o porozitate care să permită absorbția unei cantități de apă disilată egală cu 2,5-3 ori din greutatea sa. Pentru efectuarea propriu-zisă a titrării se depun la întâmplare cel puțin 5 discuri sau cilindrii din fiecare concentrație și discurile sau microcomprimatele de titrat.

Se face media diametrelor pentru fiecare din cele trei concentrații etalon și cu ajutorul acestora se întocmește o curbă de concordanță notându-se pe abscisă zonele de inhibiție în mm și pe ordonată logaritmul concentrației în mcg. Concentrația în antibiotic a unei doze sau a unui comprimat de titrat se poate determina prin proiectarea pe ordonată a punctului de intersecție de pe curba de concordanță cu verticala ridicată de pe abscisă din dreptul valorii diametrului de inhibiție dat de microcomprimatul respectiv.

Un microcomprimat sau un disc este considerat corespunzător dacă coținutul în substanță antimicrobiană se situează între 75-125% în raport cu concentrația notată. Discurile sau microcomprimatele uniform impregnate nu trebuie să arate (în aceleași condiții de testare) o diferență mai mare de 2,5 mm. Menționăm că nu există în țară microcomprimate sau discuri etalon de referință națională sau internațională; în lipsa acestora se pot folosi etaloanele naționale pentru agenții antimicrobieni uzuali existenți la Institutul Pentru Controlul Medicamentelor.

Fig. 3. Cultură de Staphylococcus aureus pe geloză cu sânge de berbec

CAPITOLUL 6

REZULTATE ȘI CONCLUZII

2007 STAȚIONAR

2007 AMBULATOR

Recoltarea de probe pe anul 2007- AMBULATOR + STAȚIONAR

exudatul faringian (EF):8858-dintre care – 1350 – staționar

– 7508 – ambulator

Numărul total de probe recoltate 9171 din:

secreție nazală (SN):310 – dintre care – 50 – staționar

– 260 – ambulator

Numărul total de probe recoltate masculine și feminine pozitive: 1752 dintre care – 242 staționar

– 1510 ambulator

Numărul total de indivizi cu: SH M=580 SAH M=161 Pneumococi M=34 Candida M=111

F=566 F=149 F=22 F=108

Haemophilus M=4 Pseudomonas M=3 Klebsiella M=3 Moraxella M=1

F=4 F=3 F=1 F=1

SAH – Anul 2007

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de stafilococ isolate în anul 2007

2008 Staționar

2008 Ambulator

Recoltarea de probe pe anul 2008- AMBULATOR + STAȚIONAR

exudatul faringian (EF):12629-dintre care – 3094 – staționar

– 9535 – ambulator

Numărul total de probe recoltate 13906 din:

secreție nazală (SN):1277 – dintre care – 673 – staționar

– 604 – ambulator

Numărul total de probe recoltate masculine și feminine pozitive: 3225 dintre care – 910 staționar

– 2315 ambulator

Numărul total de indivizi cu: SH M=683 SAH M=558 Pneumococi M=150 Candida M=127

F=687 F=524 F=110 F=145

Haemophilus M=108 Pseudomonas M=7 Klebsiella M=4 Moraxella M=31

F=70 F=6 F=8 F=20

SAH – Anul 2008

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de stafilococ isolate în anul 2008

2009 Staționar

2009 Ambulator

Recoltarea de probe pe anul 2009- AMBULATOR + STAȚIONAR

exudatul faringian (EF):1736-dintre care – 437 – staționar

– 1299 – ambulator

Numărul total de probe recoltate 13906 din:

secreție nazală (SN):294 – dintre care – 183 – staționar

– 111 – ambulator

Numărul total de probe recoltate masculine și feminine pozitive: 324 dintre care – 151 staționar

– 173 ambulator

Numărul total de indivizi cu: SH M=55 SAH M=67 Pneumococi M=14 Candida M=12

F=45 F=48 F=6 F=12

Haemophilus M=34 Pseudomonas M=5 Klebsiella M=0 Moraxella M=0

F=33 F=2 F=0 F=0

SAH – Anul 2009

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de stafilococ izolate în anul 2009

Concluzii

Între diferitele specii de microorganisme se stabilesc în timp și spațiu numeroase feluri de relații, tocmai datorită amestecului lor permanent. Aceste relații constituie sistemul ecologic al cavității bucale. Orice noțiune de ecologie, de la nivelul cavităților naturale ale omului și deci și de la nivelul cavității bucale, trebuie înțeleasă în dublu sens: pe de o parte, relațiile interspeciale, adică cele dintre numeroasele specii de microorganisme prezentate, pe de altă parte relațiile fiecăreia și în ansamblul cu mediul lor de viață, în acest caz cavitatea bucală.

Între microorganismele din cavitatea bucală se stabilesc tot felul de relații, potrivit metabolismuiui fiecăruia în parte, și al tuturor, ca ansamblu. În linii mari, aceste relații pot fi de stimulare a dezvoltării unei specii sau de indiferență și de inhibare. Cele de stimulare pot fi unilaterale, privind beneficiul unei specii pe seama alteia, când o denumim "toleranță" și "dependență", cum este cazul bacteriilor-doică.

Pentru ca o bacterie să devină parte integrantă din microflora bucală, ea trebuie să fie reținută, să poată persista la nivelul acestei cavități. Altfel există riscul de a fi repede spălată de salivă și îndepărtată prin deglutiție. De aceea ea trebuie să aibă o serie de calități morfologice, sau enzimatice, sau de altă natura, care să-i confere un anumit fel de a rezista la influența celorlalte microorganisme și la condițiile din ecosistem. Implantarea unui agent microbian nou venit este un fapt simplu și ușor, fiindcă el nu vine pe un loc "gol".

Identificarea agentului etiologic este scopul final al examinării oricărui produs patologic. În unele situații acest act poate fi realizat pe baza datelor de ordin morfologic și cultural prezentate în capitolele anterioare. În cele mai multe cazuri este nevoie de completarea cu informații privind caracterele metabolice, de structură antigenică și de patogenitate ale germenului în cauză.

Sensibilitatea germenilor la un agent antimicrobian se exprimă prin concentrația cea mai mică de medicament care în condiții standardizate de lucru inhibă "in vitro" creșterea bacteriană. Din motive de ordin clinic, adeseori este mai utilă determinarea concentrației minime de medicament în stare – în aceleași condiții standard – să omoare germenul în cauză.

Consecutiv administrării agenților antimicrobieni se obține în organism, între două administrări, concentrații sau nivele variind de la maxim la minim ceea ce constituie zona nivelelor critice. Felul relației dintre concentrația minimă inhibantă sau concentrația minimă bactericidă, nivelul de antibiotic în sânge sau în focarul infecțios, precum și criteriul clinic, permit clasificarea germenilor în sensibili, intermediari și rezistenți.

Fiecare laborator va testa în aceleași condiții de tehnică o dată cu tulpinile de examinat și tulpinile de referință. Înainte de înregistrarea și interpretarea rezultatelor antibiogramelor se va trece la citirea și scrierea diametrelor zonelor de inhibiție pentru tulpinile de referință; se verifică dacă diametrul găsit pentru aceste tulpini se înregistrează în limitele variației admise de rang. Cu cât diametrul zonei de inhibiție pentru tulpinile de referință sunt în mod repetat mai aproape de valoarea medie și în orice caz în interiorul variației admise, cu atât rezultatele sunt mai exacte și reproductibile.

În această situație se poate trece la citirea antibiogramelor și la interpretarea rezultatelor în rezistent, sensibil, intermediar . Dacă mărimea diametrelor zonelor de inhibiție la tulpinile de referință pentru unul sau mai multe comprimate se situează în afara valorilor rangului, rezultatele pentru respectivele microcomprimate nu sunt valabile și nu se raportează pe buletin.

Bibliografie

Oprean L., Microbiologie generală, Ed. Univ. “Lucian Blaga”, Sibiu,2000.

Oprean L., Gaspar E., Curs de biologie celulară și moleculară, Ed. Univ. „Lucian Blaga”, Sibiu, 2009.

Oprean L., Gaspar E., Lengyel E.,Biologie celulară și moleculară, Îndrumător de laborator, Ed. Univ. „Lucian Blaga”, Sibiu, 2009.

Zara Margareta, Microbiologie generală, Editura EuroPlus, 2006.

SR ISO 6887-1 / 2002 Pregatirea probei pentru analiză a suspensiei inițiale și a diluțiilor decimale pentru examen Microbiologic.

SR ISO 4833-2003 Enumerarea microorganismelor .Tehnica de numărare a coloniilor la 300C.

STAS ISO 6888 –1 /2003 Metoda orizontală pentru enumararea Stafilococilor coagulază pozitivi.Tehnica pe mediu de agar Baird-Parker.

SR EN ISO 21871/ 2006 Metoda orizontală pentru determinarea celui mai mic număr de Bacillus cereus prezumtiv.

SR EN ISO 7937 /2005- Metoda orizontală pentru numărarea Clostridium perfringens.

Felicia TOMA, Bacteriologie generală, Editura Universității de Medicină și Farmacie Tg. Mureș, 2005.

Borucki, M.K.; Krug, M.J.; Muraoka, W.T.; D.R. Discrimination among Listeria monocytogenes isolates using a mixed genome DNA microarray. Veterinary Microbiology,2003.

Call, D.R.; Brockman F.J.; Chandler D.P. Detecting and genotypin Escherichia coli O157:H7 using multiplexed PCP and nucleic acid microarray. International Journal of Food Microbiology. 2001.

Liébana, S.; Lermo, A.; Campoy, S.; Cortés, M.P.; Alegret, S.; Pividori, M.I. Rapid detection of Salmonella in milk by electrochemical magneto-immunosensing. Biosensors and Bioelectronics. 2009.

Lisa, M.; Chouhan, R.S.; Vinayaka, A.C.; Manonmani, H.K.; Thakur. M.S. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane:An organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 2009.

Liu, T. The comparisons of zymotechnics and the fluorescence method in food coliforms .Chinese Journal of Health Laboratory Technology. 2004.

McGuinness, S.; McCabe, E.; O’Regan, E.; Dolan, A.; Duffy, G.; Burgess, C.; Fanning, S.; Barry, T.; O’Grady, J. Development and validation of a rapid real-time PCR based method for the specific detection of Salmonella on fresh meat. Meat Science. 2009.

Pranoto, Y.; Rakshit, S.K.; ; Salokhe, V.M. Enhancing antimicrobial activity of chitosan films by incorporating garlic oil, potassium sorbate and nisin. LWT-Food Science and Technology, 2005.

Qiu, Y. Examination of B gene of golden color staphylococcus enterotoxin in food by PCR. Chinese Journal of Microbiology. 2004.

Shan,C.Several examination methods of food safety in our country. China Condiment.2004.

Wilson, W.J.; Strout, C. L.; Desantis, T. Z.; Stilwell, J. L.; Carrano, A.V.; Aanersen, G.L. Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using microarray technology. Molecular and Cellular Probes. 2002.

Yu, J.; Liu, Z.; Liu, Q.; Yuen, K. T.; Mak, A.F.T.; Yang, M.; Leung. P. A polyethylene glycol (PEG) microfluidic chip with nanostructures for bacteria rapid patterning and detection. Sensors and Actuators A: Physical. 2009.