Monitorizarea Virusologica A Tratamentului Antiretroviral LA Pacientii Hiv Pozitivi

CUPRINS

PARTEA GENERALA

Capitolul 1 Particularitati morfologice si replicative ale virusului HIV

Agentul etiologic

Morfologia HIV

Ciclul de replicare al HIV

Epidemiologie

Capitolul 2 Caracteristicile clinice ale infectiei HIV

2.1 Dinamica celulara a infectiei HIV

2.2 Rolul organelor limfoide

2.3 Clasificarea infectiei HIV

2.4 Raspunsul imun in infectia HIV

Capitolul 3 Principiile tratamentului in infectia HIV

3.1 Obiectivele tratamentului antiretroviral

3.2 Medicamente antiretrovirale

3.2.1 Analogi nucleotidici inhibitori de RT

Inhibitori non-nucleotidici ai RT

Inhibitori ai proteazei virale

Inhibitori ai fuziunii virale

3.3 Politerapia antiretrovirala divergenta de inalta eficienta

Capitolul 4 Monitorizarea virusologica a eficientei tratamentului in infectia HIV

PARTEA SPECIALA

1.Premise si obiectivele studiului

2. Pacienti si metode

2.1. Selectia pacientilor inclusi in studiu

2.2.Determinarea imunitatii celulare CD4 prin metoda microscopica Coulter

2.3.Evaluarea cantitativa a ARN-ului HIV 1 plasmatic

3. Rezultate

3.1.Scheme de tratament utilizate

3.2.Eficienta clinica a schemelor de tratament

3.3.Eficienta imunologica a schemelor de tratament

3.4.Eficienta virusologica a schemelor de tratament

3.5.Analiza pacientilor cu esec terapeutic

4. Discutii

5. Concluzii

6. Bibliografie

PARTEA GENERALA

CAPITOLUL1.

PARTICULARITATI MORFOLOGICE SI REPLICATIVE ALE VIRUSULUI HIV

Virusul HIV apartine familiei de retrovirusuri umane,subfamilia lentivirusuri. Microscopia electronica arata ca virionul HIV are o structura icosaedrica continand numerosi spiculi externi formati din doua proteine anvelopa majori gp120 externa si gp41 transmembranara.Virionul inmugureste la suprafata celulei infectate, incorporand o mare varietate de proteine preluate de la aceasta, inclusiv complexul major de histocompatibilitate( MHC) de clasa I si clasa II, intr-un bistrat lipidic.

Figura 1 Structura si imaginea de microscopie electronica a virusului HIV (dupa www.niaid.nih.gov, www.piperreport.com, )

HIV este un virus cu genom ARNss, diploid, a carui particularitate marcanta este reverstranscriptia propriului ARN genomic intr-un ADN proviral, prin intermediul unei enzime virale,reverstranscriptaza. Genomul conþine douã copii pe care sunt dispuse urmãtoarele trei categorii de gene virale:

gene structurale

gag (de la “antigen de grup”) care codificã:

p 17 – proteina matrice (MA)

p 24 – proteina capsidara (CA)

p 7 – nucleocapsida (NC)

pol (de la “polimeraza”) care codificã:

p 11 – proteaza (PR)

p 66 – reverstranscriptaza (RT)

p 32 – integraza (IN)

env (de la ”anvelopa”) care codificã:

gp 160 – glicoproteina precursor

gp 120 – glicoproteina de suprafaþã

gp 41 – glicoproteina transmembranarã

gene reglatorii

rev – activatoare a producþiei de virus

nef – reglatoare negativã a producþiei de virus

tat – transactivatoare, implicatã în relaþia cu factori de transcriere celulari

gene de maturare (neesenþiale pentru maturarea in vitro, în culturi de celule, dar importante pentru patogenitate in vivo):

vif – promoveazã infectivitatea virionilor

vpu – creºte proporþia particulelor virale extracelulare

vpr/vpx – genã accesorie cu activitate neprecizatã.

Totusi, HIV-1 este mai complex decat alte retrovirusuri, in particular decat cele din grupul non primatelor, prin faptul ca prezinta de asemenea si alte gene tat ,rev, nef, vif ,vpr, vpu care codifica proteine implicate in reglarea expresiei genice. Diferenta intre HIV-1 si HIV-2 consta in faptul ca , spre deosebire de HIV-1, HIV-2 prezinta gena vpx,si nu prezinta gena vpu

Figura 2 Genomul HIV(dupa, www.stanford.edu)

. Analiza moleculara a HIV-1 releva o variatie de secventelor la nivelul a mai multor parti ale genomului viral.Aceste modificari au tendinta sa se izoleze in regiunile hipervariabile.O astfel de regiune, V3 este tinta pentru anticorpii neutralizanti si contine situsuri de recunoastere pentru raspunsul celulelor.

Exista doua grupe de HIV-1 : grupul M (major), responsabil pentru majoritatea infectiilor in lume si grupul O (marginal), virus relativ rar, gasit in acest moment in Camerun, Franta si Gabon.Grupul M contine cel putin opt secvente, subtipuri sau ramuri , notate de la A la H , ce se deosebesc prin aceea ca in acest moment ele difera una de cealalta printr-un procentaj de 30% la nivelul secventelor env si 14% la nivelul gag. Pattern-ul global rezulta mai probabil prin accidente de transfer viral.Subtipul B de virus, care difera acum cu 17% in secventa env, este uniform gasit in SUA.Subtipul A de virus pare a fi cel mai comun din intreaga lume, multe tari reprezintand circulatie concomitenta a acestor subtipuri , ce dau nastere la noi forme recombinate.

Figura 3 Distributia globala a subtipurilor HIV-1(dupa www3.niaid.nih.gov)

Subtipul B este raspandit predominant in Europa, si cele doua Americi.In Africa cele mai raspandite subtipuri in proportie de 75 % au fost cele A,C,D. In Asia izolatele HIV-1 au fost gasite continand subtipurile E, C, B, tipul C raspandit in India, subtipul F gasit in Romania si in procente mici in Brazilia..

Ciclul de viata al virusului incepe prin legarea, cu mare afinitate, a proteinei gp120 prin intermediul unei portiuni din regiunea V1 apropiata de capatul N-ter minal pe receptorul de pe suprafata celulei gazda –molecula CD4.CD4 este un receptor ce se afla predominant la nivelul unui subset de limfocite T ce sunt responsabile pentru actiunile T helper sau inductor in cadrul sistemului imun. Ea este exprimata si pe suprafata macrofagelor, monocitelor, precum si celulele Langerhans. Tropismul celular al izolatelor HIV variazã dupã cum ne raportãm la izolate din infecþia primarã sau la izolatele din fazele tardive ale bolii.

In infecþia primarã predominã izolate macrofagotrope (M-trop) ºi nonsinciþizante (NSI). Aceste izolate utilizeazã coreceptorul pentru beta-chemokine notat CCR5.

In infecþia tardivã izolatele sunt cu tropism pentru limfocite (T-trope) ºi sinciþizante (SI). Aceste tulpini nu sunt influenþate de beta-chemokine, ele utilizeazã drept coreceptor fusina – CXCR 4 (un receptor care semnaleazã prin proteinele G). Moleculele de fuzinã leagã glicoproteina transmembranalã a anvelopei HIV: gp 41.

Particularitatea bolii HIV este reprezentata de imunodeficienta profunda rezultata primar dintr-o deficinta progresiva , calitativa si cantitativa a subsetului de limfocite T denumite T helper, definite fenotipic prin prezenta moleculelor CD4 pe suprafata lor.Moleculele CD4 servesc ca receptori primari pentru HIV, dar acesta utilizeaza si o serie de coreceptori pentru a patrunde eficient in celulele sale gazda. Molecula de fuzina sau CXCR4 este coreceptorul pentru tulpinile de HIV-1 cu tropism T celular , iar receptorul pentru β-chemokine (CCR5) este coreceptorul pentru tulpinile cu tropism macrofagic.Mecanismele responsabile pentru efectul citopatic si disfunctia imuna a celulelor T CD4 nu sunt inca elucidate. Cand scade numarul de limfocitelor T CD4 sub un anumit nivel, pacientul prezinta un risc mare de a dezvolta multiple boli oportuniste, in special infectii si neoplasme, ce sunt definitorii pentru SIDA.

Figura 4 Ciclul de replicare HIV (dupa hiv.buffalo.edu)

Dupa legare, are loc fuziunea cu membrana celulei gazda prin intermediul proteinei gp41, astfel ARN genomic al HIV este dezvelit si internalizat in celula gazda.Revers- transcriptaza ,ce este continuta in virionul infectant, catalizeaza ulterior revers transcriptia ARN-ului genomic in ADN dublu spiralat.ADN-ul este translocat la nivelul nucleului fiind integrat aleator in cromozomii celulei gazda sub actiunea unei enzime codificate virale, integraza.Acest virus poate ramane inactiv transcriptional sau isi poate manifesta nivele variate de exprimare genica , mergand pana la productie activa de virioni. Activarea celulara joaca un rol important in ciclul de replicare HIV si este esentiala in patogenia bolii.Activarea celulei gazda este necesara pentru initierea transcriptiei ADN-ul proviral integrat in ARN –ul genomic sau ARNm.Dupa transcriptie, ARNm HIV este translat in proteine care sufera modificari prin glicozilare, fosforilare, clivare. Miezul viral este format prin asamblarea proteinelor HIV, enzime, si ARN genomic la membrana plasmatica celulelor.Inmugurirea noului virion apare prin membrana celulei gazda , la nivelul careia miezul isi dobandeste anvelopa externa. Fiecare ciclu de viata al HIV este o tinta reala sau potentiala pentru interventia terapeutica.

Figura 5. Tinte potentiale in cursul replicarii virale pentru terapia antiretrovirala(dupa www.roche.com)

CAPITOLUL 2.

CARACTERISTICILE CLINICE ALE INFECTIEI HIV

Dupa explozia viremica initiala, in timpul infectiei primare, indivizii infectati HIV prezinta in general, un raspuns imun robust ce, in mod obisnuit, reduce substantial nivelele de viremie plasmatice si aproape sigur contribuie la intarzierea progresiei infectiei si a dezvoltarii bolii clinice manifeste pe o perioada medie de 10 ani. Acest raspuns imun contine elemente atat ale imunitatii mediate umoral cat si celular, fiind directionat impotriva determinantilor antigenici multipli ai virionului HIV, ca si impotriva proteinelor virale produse de celulele infectate.

Combinatia de evenimente patogenice si imunopatogenice virale ce apar in cursul bolii produsa de HIV, incepand din momentul initial al infectiei pana la dezvoltarea SIDA este complexa si variata. Este important de apreciat faptul ca mecanismele de patogenice ale bolii produsa de HIV sunt multifactoriale si multifazice si difera in functie de stadiul bolii.

Figura 7 Evolutia naturala a infectiei HIV(dupa.www.bbc.co.uk/2035_aids_biology.)

Consecutiv infecþiei primare virusul disemineazã în ganglionii limfatici. In ciuda rãspunsului imun celular ºi humoral care, de regulã, inhibã viremia primarã, virusul scapã supravegherii imune producând o infecþie persistentã, progresivã, cu mortalitate ridicatã dupã o perioadã asimptomaticã foarte lungã (în medie 10 ani). Marea capacitate de variabilitate a genomului retroviral explicã eludarea rãspunsului imun. Eficienta raspusului imun in infecþia primara influenteaza nivelul incarcarii virale fixand un asa numit “set-point” sau o anumita concentraþie plasmatica a virusului. Cu cat aceasta concentraþie este mai mica sansele de evoluþie ale bolnavului sunt mai bune.

In ganglionii limfatici (ºi în alte organe limfoide centrale) replicarea viralã este foarte productivã: în fiecare zi circa 10 miliarde de virioni sunt produºi. 99% din aceºti virioni sunt produºi de limfocitele CD4 în urma unei infecþii litice (semiviaþa lor este de numai 1,6 zile). Efortul sistemului imun de-a balansa citopatogenitatea virusului se traduce prin diviziunea rapidã a precursorilor limfocitari. Mult timp numãrul limfocitelor CD4 în periferie rãmâne constant (1000 cel/mmc) însã declinul acestui numãr precede intrarea bolnavului în stadiul simptomatic. Un numãr de 500 limfocite CD4/mmc ºi o încãrcare viralã de circa 10.000 copii ARN/ml sunt criterii de iniþiere a terapiei antivirale. Balanþa dintre factorii inductori ºi supresori ai replicãrii virale influenþeazã cursul bolii. S-au descries doua forme de latenþã:

Preintegrativã – în care HIV intra în limfocitele CD4 neactivate si unde se produce o discreta activitate reverstranscriptazica. Activarea limfocitelor dormante declanseaza pusee replicative.

Postintegrativã – în care genomul proviral este inserat în genomul celular si ramane astfel pana cand semnale activatoare precipita infecþia productivã.

Mecanismul prin care un lentã supravegherii imune producând o infecþie persistentã, progresivã, cu mortalitate ridicatã dupã o perioadã asimptomaticã foarte lungã (în medie 10 ani). Marea capacitate de variabilitate a genomului retroviral explicã eludarea rãspunsului imun. Eficienta raspusului imun in infecþia primara influenteaza nivelul incarcarii virale fixand un asa numit “set-point” sau o anumita concentraþie plasmatica a virusului. Cu cat aceasta concentraþie este mai mica sansele de evoluþie ale bolnavului sunt mai bune.

In ganglionii limfatici (ºi în alte organe limfoide centrale) replicarea viralã este foarte productivã: în fiecare zi circa 10 miliarde de virioni sunt produºi. 99% din aceºti virioni sunt produºi de limfocitele CD4 în urma unei infecþii litice (semiviaþa lor este de numai 1,6 zile). Efortul sistemului imun de-a balansa citopatogenitatea virusului se traduce prin diviziunea rapidã a precursorilor limfocitari. Mult timp numãrul limfocitelor CD4 în periferie rãmâne constant (1000 cel/mmc) însã declinul acestui numãr precede intrarea bolnavului în stadiul simptomatic. Un numãr de 500 limfocite CD4/mmc ºi o încãrcare viralã de circa 10.000 copii ARN/ml sunt criterii de iniþiere a terapiei antivirale. Balanþa dintre factorii inductori ºi supresori ai replicãrii virale influenþeazã cursul bolii. S-au descries doua forme de latenþã:

Preintegrativã – în care HIV intra în limfocitele CD4 neactivate si unde se produce o discreta activitate reverstranscriptazica. Activarea limfocitelor dormante declanseaza pusee replicative.

Postintegrativã – în care genomul proviral este inserat în genomul celular si ramane astfel pana cand semnale activatoare precipita infecþia productivã.

Mecanismul prin care un lentivirus precum HIV determinã o infecþie persistentã progresivã cu sfârºit letal la om este diferit de infecþia determinatã de lentivirusurile simiene la gazdele naturale – maimuþele inferioare nonhominoide. La acesea din urmã infecþia SIV (simian immunodeficiency virus) nu determinã simptome deºi replicarea viralã este intensã iar limfocitele T CD4+ infectate sunt lizate. Principalele caracteristici ale infecþiei HIV la om sunt:

Replicare viralã masivã în þesutul limfoid,

Depleþia limfocitelor T CD4+ infectate,

Hiperreactivitate imunã generalizatã.

Si la om ºi la maimuþe þesutul limfoid intestinal este situl principal al replicãrii virale ºi al pierderii limfocitelor T CD4+ infectate. Celulele þintã sunt însã diferite: limfocite la om, macrofage la maimuþe. In plus, cele mai vulnerabile celule þintã sunt cele care exprimã ambii coreceptori CD4 ºi CCR5. Replicarea în macrofage poate determina ºi la om infecþii cu evoluþie prelungitã iar de la subiecþii nonprogresori sau supravieþuitori de lungã duratã se izoleazã tulpini HIV macrofagotrope. Intestinul rãmâne rezervorul de virus ºi la subiecþii sub antiretrovirale pentrucã medicamentele penetreazã cu dificultate acest compartiment.

Stadializarea infectiei HIV este importanta pentru aprecierea prognosticului si pentru evaluarea raspunsului la tratament.Durata scurta a urmarii pacientilor tratati dupa noile protocoale nu permite evaluarea acestora decat prin comparatie cu datele cunoscute privind evolutia naturala a infectiei la bolnavii netratati.Infectia HIV prezinta urmatoarele stadii clinice

Sindromul retroviral acut care se manifesta ca si gripa, acest sindrom apare intr-un interval de timp care poate varia intre cateva zile si cateva saptamani de la infectare.

Infectia HIV asimptomatica : exista cazuri in care pot trece mai multi ani fara simptome de infectie HIV, totusi virusul se multiplica in organism pe toata aceasta perioada , chiar daca lipsesc semnele clinice.Multiplicarea se produce cu atat de rapid , incat sistemul imunitar al gazdei nu poate sa distruga virusul.

Infectia HIV simptomatica :odata cu primele semne de slabire a sistemului imunitar, apar susceptibilitate la anumite boli sau infectii cum ar fi pneumonia , cancer , boli care apar frecvent la persoanele cu sistem imun slabit.

SIDA :boala apare in ultimul stadiu al infectiei HIV; majoritatea persoanelor netratate dezvolta SIDA dupa 12-13 ani de la infectie, cu tratamentul pentru infectia HIV spre SIDA este intarziata sau chiar prevenita.

Clasificarea CDC ( Control Disease Centre) dupa categoriile clinice si imunologice:

Categoria A

Infectia HIV asimptomatica;

Limfadenopatie persistenta generalizata

Sindromul retroviral acut(infectia primara)

Categoria B

Simptome majore (pierdere corporala ,febra prelungita, diaree cronica);

Candidoze orale si /sau genitale ,recurente ;

Displazie de col uterin ;

Leucoplakie paroasa;

Herpes recurent;

Purpura trombocitara;

Neuropatie periferica;

Categoria C

Candidiaze pulmonare,esofagiene;

Cancer de col uterin;

Coccidiomicoza;

Criptococcoza extrapulmonara;

Criptosporidioza;

Boala citomegalica,

Encefalopatia HIV;

Herpex Simplex cronic;

Histoplasmoza;

Isosporioza;

Sarcom Kaposi;

Limfoame;

Tuberculoza; infectii cu MAC

Pneumocistoza(P carinii);

Pneumonii interstitiale recurente;

Leucoencefalopatie progresiva multifocala;

Exista o clasificare a infectiei HIV pediatrice in categorii imunologice bazate pe numarul si procentajul limfocitelor CD4 in acord cu varsta copiilor ,prezentata in tabelul 1.3:

Tabelul 1.3 Stadializarea infectiei HIV la copii dupa criterii imunologice

Raspunsul imun umoral. Anticorpii impotriva HIV apar dupa doua saptamani si aproape invariabil prezenti opt saptamani de la debutul bolii primare, initiale.Detectarea anticorpilor reprezinta baza majoritatii testelor de screening diagnostic pentru infectia HIV.Trebuie remarcat ca aparitia anticorpilor ce cupleaza HIV detectati prin tehnica ELISA si WESTERN-BLOT se desfasoara inaintea aparitiei anticorpilor neutralizanti.Ultimii apar, in general ,dupa diminuarea viremiei plasmatice,ce e mai mult puternic asociata cu aparitia de celule CTL, CD8+ HIV specifice. Diagnosticul infectiei HIV depinde de demonstrarea anticorpilor anti-HIVsi sau detectarea directa a HIV sau a unei din componentele sale.Anticorpii HIV sunt in general prezenti in circulatie la 4-8 saptamani dupa infectie.Testul standard de screening pentru HIV este testul de imunoabsorbtie cuplata enzimatic ( ELISA) cu o sensibilitate de peste 99.5%. Majoritatea centrelor de diagnostic folosesc un kit ELISA comercial ce contine antigene de la HIV-1si de la HIV-2 si care le va detecta pe oricare dintre acestea.Aceste kituri folosesc antigene naturale si recombinate

Primii anticorpi detectati sunt cei directionati impotriva proteinelor structurale HIV, p24, si p17 si ale precursorului gag.. Majoritatea anticorpilor anti-envsunt directionati impotriva fie unui epitop al gp41 intr-o regiune cuprinzand aminoacizi 579-613, fie impotriva unei regiuni hipervariabile a moleculei gp120 cunoscuta ca regiunea buclei V3, cuprinzand aminoacizii 303-338.Regiunea V3 este un situs major pentru dezvoltarea mutatiilor prin care apar variante ale virusului HIV.Anticorpii indreptati asupra HIV au atat rol protector cat si sunt probabil implicati in patogeneza bolii produse de HIV.In randul anticorpii protectori sunt aceia a caror functie este sa neutralizeze diresct HIV si sa previna infectarea altor celule ,ca si cei care participa la ADCC.Anticorpii neutralizanti par a fi de doua tipuri: tip specifici si grup specifici.Cei tip specifici sunt in general indreptati impotriva buclei V3.Acesti anticorpi neutralizeaza numai virusurile unei tulpini date si sunt prezenti in concentratii scazute la majoritatea indivizilor infectati.Pe de alta parte cei grup specifici sunt capabili sa neutralizeze o gama variata de izolate HIV.Au fost identificati cel putin doua forme de anticorpi grup specifici : cei care leaga aminoacizii 728-745, ai gp41 si cei care leaga aminoacizii 423-437 ai gp120.

O alta categorie de anticorpi majori protectori este formata din cei care participa la ADCC, forma de imunitate de tip celular.Practic in ADCC, celulele NK, care poarta receptori Fc, sunt inarmati cu anticorpi specifici anti-HIV( ce se leaga prin portiunea lor Fc de receptorii Fc celulari) cupleaza si distrug celulele care exprima antigenele HIV.

Nivelele de anticorpi antianvelopa , capabili sa medieze ADCC, sunt mai inalte in stadiile initiale ale infectiei HIV.In plus fata de rolul jucat in apararea organismului, anticorpii anti-HIV au si un rol in patogeneza bolii.S-a demonstrat ca atunci cand sunt in concentratii scazut, anticorpii directionati impotriva gp41, existenti in vitro, au capacitatea de a facilita infectarea celulelor prin intermediul unui mecanism mediat de receptorul Fc, cunoscut ca amplificator anticorpic.Aceleasi regiuni ale proteinei de anvelopa care determina cresterea anticorpilor capabile sa medieze ADCC, sunt capabile sa stimuleze, producerea de anticorpi care sa faciliteze infectia in vitro a celulelor indemne.

Raspunsul imun celular. Dat fiind faptul ca imunitatea celulara T mediata este cunoscuta ca jucand rol un rol important in apararea impotriva celor mai multe infectii virale, ea fiind in general cotata ca fiind o importanta componenta a raspunsului celulei gazda impotriva HIV.Imunitatea celulara T poate fi impartita in doua categorii majore, respectiv mediata de celulele T-helper/inducer sau CD4+ si de celuleleT citotoxice/imunoreglatoare sau CD8+. Clasic in sangele periferic al pacientilor au fost identificate celule CTL, CD8+ HIV-specifice, restrictionate MHC I in cateva saptamani de infectie HIV.Aceste limfocite CD8+ prin intermediul receptorilor pentru antigene HIV-specifice se leaga si cauzeaza distructia litica a celulelor tinta ce exprima molecule MHC I identice cu asociate antigenelor HIV. Mononuclearele din sangele periferic si ganglionii limfatici ai indivizilor infectati HIV le pot fi demonstrate doua tipuri de activitati CTL CD8+.Primul tip lizeaza direct, in cultura, celulele tinta potrivite, fara stimulare in vitro.Celalalt tip CTL reflecta frecventa precursorilor celulelor CTL.Au fost identificate celule CTL, restrictionate MCH I , directionate impotriva produselor a cel putin sase gene HIV : gag, env, pol, tat, rev, nef.Celulele CTL CD4+ sunt restrictionate MHC II , au fost identificate de asemenea , la indivizii infectati HIV si la cei neinfectati dupa vaccinarea cu proteine HIV. Au fost descrise inca cel putin alte trei forme de imunitate mediata celular in legatura cu infectia HIV:

Supresia replicarii HIV mediata de celulele T CD8+

ADCC

Activitatea celulelor NK

Celulele T CD8+ la fel ca si monocitele, celulele T CD4+, celule B , secreta βchemokinele RANTES, MIP-1α, si MIP-1β. Aceste chemokine sunt supresoare potente ale replicarii HIV si actioneaza, cel putinin parte la blocarea coreceptorului CCR5pentru tulpinile cu tropism macrofagic aflat pe celulele mononucleare din sangele periferic.

Celulele NK sunt singurele care pot distruge celulele tinta infectate HV in tesutul de cultura.Acest mecanism citotoxic primitiv de aparare a gazdei este folosit in supravegherea non-specifica pentru transformarea neoplazica si infectarea virala prin recunoasterea moleculelor MHC I alterate.

CAPITOLUL 3.

PRINCIPIILE TRATAMENTULUI IN INFECTIA HIV

In mod normal, in absenta tratamentului ,rata de progresie a infectiei HIV de la seroconversie la deces este in medie 10ani (7 ani pentru cei acre au fost infectati prin transfuzii cu sange ,infectat , 10 ani pentru hemofilici, 10 ani pentru toxicomani ce utilizeaza droguri injectabile intravenos , 8-12 ani pentru homosexuali

.Obiectivele tratamentului infectiei HIV sunt:

diminuarea replicarii virale virale (inclusiv in rezervoarele de virus :ganglioni limfatici si SNC);

favorizarea imunorestaurarii sau restabilirea numarului si recuperarea functionla a limfocitelor CD4.

Medicamentele antiretrovirale pot fi caracterizate de:

specificitatea lor in raport cu tinta

nivelul activitatii antivirale

citotoxicitate in vitro si efectele adverse diverse in vivo

capacitatea de a induce mutante rezistente.

La ora actuala se afla in diferite faze experimentale sau in utilizare in clinica mai multe medicamente antiretovirale, alaturi de tratamente imunomodulatoare si cele adresate terapiei infectiilor si neoplaziilor oportuniste. In functie de etapa din ciclul replicativ al HIV in care actioneaza, aceste medicamente pot fi sistematizate dupa cum urmeaza:

in etapa reverstranscrierii genomului viral –analogii nucleozidici si inhibitorii nonnucleozidici ai reverstranscriptazei HIV

la nivelul transcriptional si posttranscriptional –inhibitorii genelor reglatoare virale care altereaza activitatea genelor virale ce controleaza replicarea (este vizata in special gena tat)

la nivel posttraducere – antiproteazele care inhiba proteaza virala si formarea proteinelor si aglicoproteinelor mature;

infazele finale ale ciclului replicativ al HIV actioneaza interferonii, inhiband inmugurirea particulelor virale progene la suprafata celulei gazda.Interferonul –alfa este , de asemenea, un agent antitumoral valoros in sarcomul Kaposi si prezinta actiune antiretrovirala sinergica in asociere cu analogii nucleozidici.

In practica, există patru clase de medicamente folosite curent in terapia infecția HIV:

A) analogii nucleozidici inhibitori ai reverstranscriptazei virale RT- NRTI

B) inhibitorii nonnucleozidici ai RT – NNRTI

C) inhibitorii proteazei virale – PI

D) inhibitorii fuziuni virale- enfivurtide(Fuzeon)

Analogii nucleozidici inhibitori ai reverstranscriptazei virale – NRTI sunt prodroguri. Ei trebuiesc transformați în organism în compuși 5 ’ trifosfați pentru a-și manifesta activitatea antivirală.Analogii nucleozidici sunt compuși aparținând clasei dideoxinucleozidelor, substanțe chimice formate dintr-o bază azotată și un rest glucidic, a carui grupare hidroxil din poziția 3’ a fost înlocuită cu un alt substituent, care nu permite participarea acestei structuri la legaturi fosfodiesterice. Prototipul acestei clase este Zidovudina )descoperită în 1987) la care gruparea OH din poziția 3’ a timidinei este înlocuită de o grupare azido )N3-) ce nu permite încorporarea nucleotidului următor.Alți analogi nucleozidici conțin în locul grupării OH din poziția 3’ un atom de hidrogen 9 didanizina- descoperită în 1992, dideoxicitidina –descoperită în 1994).

Transformarea analogilor nucleozidici în medicamente active necesită 3 etape succesive de fosforilări intracelulare în poziția 5’, la nivelul dezoxiribozei.Prima fosforilare, realizată de o kinază celulară specifică este etapa limitantă, crucială și absolut specifică pentru fiecare analog nucleozidic în parte.Analogul monofosforilat este convertit în cel bifosforilat de o kinază și ulterior în compusul activ trifosforilat.

Analogii nucleozidici trifosforilați au efect inhibitor asupra reverstranscriptazei HIV prin două mecanisme:

competiția cu nucleozidele naturale endogene la nivelul situsurilor de legare a reverstranscriptazei

blocarea elongației lantului de ADN rezultat prin reverstrancriere, datorita absenței radicalilor OH liberi și deci imposibilitații poziției din dideoxinucleozide de a participa la legaturi fosfodiesterice cu alte nucleozide.Acest mecanism este numit efect de stopare a lanțului.

Principalii inhibitori ai reverstranscriptazei )RT) analogi ai 2’, 3’dideoxinucleozidelor sunt reprezentați în tabelul 4.2:

Inhibitori ai RT- analogi ai 2’, 3’dideoxinucleozidelor

B. Inhibitorii nonnucleozidici ai reverstranscriptazei- NIRT

Inhibitorii nonnucleozidici ai RT sunt activi direct, fara a necesita fosforilare intracelulara.Structura tridimensionala a RT- azei a fost comparata cu palma mainii drepte cu degete, police si palma.La nivelul palmei se afla situl de legatura cu ARN; la nivelul degetelor se afla siturile de legatura cu dNTP, iar la nivelul degetului mic situl de legatura polimerazic.

Studiile cristalografice au demostrat mai putin ca inhibitorii nonnucleozidic ai RT blocheaza direst activitatea enzimei, fixandu-se la nivelul unui buzunar hidrofob, situat intre degetul mare si palma subunitatii p66 a RT, foarte aproape de situl catalitic.

Un inhibitor nonnucleozidic mai putin utilizat – foscarnetul ( trisodium fosfonoformat )- are o structura omologa cu pirofosfatul format in cursul integrarii nucleozidelor trifosforilate in lantul nascent de AND proviral. El inhiba astel reverstranscriptaza prin actiune la nivelul unui sit de recunoastere a pirofosfatilor.

Inhibitorii nonnuclozidici ai RT au o activitate antiretrovirala adesea modesta, iar utilizarea lor trebuie facuta numai in asociere cu alti inhibitori de RT.Intrebuintarea in monoterapie conduce rapid la aparitia de mutante rezistente.Efectul lor este extrem de bun in triterapie.

Inhibitorii nonnucloezidici ai RT in utilizarea clinica sunt prezentati in tabelul 4.6.

Tabel 4.6.Inhibitorii nonnucleozidici ai RT

NB Foscarnetul este inhibitor al replicarii CMV, activitatea antiretrovirala este moderata.

Un sumar al modalitatii de utilizare a inhibitorilor de reverstranscriptaza in practica este prezent in tabelul 4.9.

Tabel 4.9. Inhibitorii RT in practica

C Inhibitorii proteazei virale

Sinteza antiretroviralelor cu actiune antiproteazica a fost conceputa rational, pornind de la cunoasterea structurii moleculare de aspartilproteaza (p32), tipica pentru proteazele retrovirale. Proteaza p 32 are asemanari structurale cu retina.Cunostintele din anii ’80 privind moleculele peptido-mimetice care inhiba sistemul renina- angiotensina au fost folosite pentru sinteza antiproteazelor. Mecanismul de actiune se bazeaza pe rolul cheie al proteazei virale p32 in ciclul replicativ al HIV.Ea cliveaza precursorul gag- pol in proteine structurale ( p24, p17, p7) si in enzime virale ( intre care RT si proteaza p32 ). In cristalografie, proteaza apare ca un homodimer simetric alcatuit din 2 lanturi de 99 de aminoacizi fiecare. In structura cuaternara a proteazei se realizeaza o excavatie in care intra substratul enzimei.Doua tripeptide care au fiecare cate un reziduu de acid constituie situl catalitic.

Proteaza actioneaza la nivelul a 8 situri de clivaj intre aminoacizii aromatici: P-Phe si P- Tyr. Proteazele mamiferelor nu hidrolizeaza aceste legaturi; de aceea, actiunea antiproteazelor este virus specifica.

Proteaza este impachetata in virioni si clivarea catalizata de ea se produce simultan sau imediat dupa inmugurirea virionilor progeni la suprafata celulei infectate.inhibitia proteazei determina astfel producerea unor particule virale imature, neinfectioase.Antiproteazele sunt medicamente active ca atare; nu trebuiesc transformate in organism ca in cazul fosforilarii analogilor nucleozidici inhibitori de RT . Antiproteazele blocheaza maturarea si inhiba infectivitatea virionilor progeni atat in celulele infectate activ cat si in cele infectate cronic, penetrarea lor intracelulara fiind buna (inclusiv in macrofage si celule foliculare dendritice- CFD).

Antiproteazele sunt active impotriva izolatelor de HIV1 si 2, la o concentratie inhibitorie (IC 50 ) in vitro cuprinsa intre 2-60nM.Activitatea antiretrovirala este corelata cu capacitatea medicamentelor de a inhiba activitatea enzimei, desi concentratia necesara reducerii activitatii enzimatice cu 50% ( K1) este mai mica decat IC 50, fiind cuprinsa intre 0.1- 2 nM.Antiproteazele sunt practic inactive pe aspartilproteazele umane celulare, K1 pentru retina si pepsina fiind de cel putin 10.000nM.

Toate antiproteazele sunt metabolizate de citocromul P450, mai ales de izoforma 3 A4 .Absortia medicamentelor este maxima la 4 ore dupa administrarea orala, iar timpul de injumatatire variaza intre 1.8 – 5 ore. Penetrarea in lichidul cefalorahidian ( LCR ) pentru Ritonavir si Saquinavir este sub 1 %, mai ridicata in cazul Indanavirului ( intre 2.2- 76% ), poate si datorita legarii mai slabe a acestuia din urma de proteinele plasmatice. Numeroase efecte adverse au fost observate dupa administrarea inhibitorilor de proteaze,Toate antiproteazele dau reactii adverse gastro-intestinale, cresc transaminazele hepatice si produc intoleranta la glucoza.Un loc aparte il ocupa un sindrom ce asociaza lipodistrofie periferica ( o pierdere de circa 0.5 kg pe luna din grasimea de pe fata, membre, si partea superioara a trunchiului), adipozitate centrala, hiperlipemie, si rezistenta la insulina ( in unele cazuri chiar la diabet tip II ) .Carr si colaboratorii au propus un mecanism al patogenezei acestui sindrom ( Lancet, 1998 , 325, 1881-83), pornind de la omologia existenta intre regiunea catalitica a proteazei HIV 1 de care se leaga inhibitorii acestuia si doua proteine ce regleaza metabolismul lipidic: CRABP-1( cytoplasmtic retinoic acid binding protein type 1) si LTP ( low density lipoprotein receptor realted protein). Autorii sugereaza ca inhibitorii de proteaza inhiba generarea acidului cis 9 retinoic ( cis-9 RA) din acidul retinoic fie direct prin legare de CRABP-1, fie prin inhibitia izoformelor citocromului P 450 3A, care metabolizeaza acidul retinoic in cis 9 –RA. Aceasta conduce la stimularea scazuta a receptorului X al acidului retinoic si astfel la apoptoza si inhibitia diferentierii adipoxitelor periferice, cu eliberare si/sau cu depozitare scazuta de lipide. Alte efecte adverse ale antiproteazelor ca dermatite, alopecie, distrofia unghiilor, si uscaciunea buzelor, seamana cu reactii secundare cunoscute ale analogilor de acid retinoic ca isotretinoina, si pot fi tot o consecinta a alterarii metabolismului acidului retinoic.

Pe de alta parte inhibitia receptorului pentru lipidele cu densitate scazuta ( LRP) duce la reducerea clivarii acizilor grasi din trigliceridele circulante de lipoproteinlipaza din endoteliul vascular si la absorbtie hepatica scazuta a chilomicronilor, ceea ce genereaza hiperglicemie.Ca urmare se produce o redistribuire a grasimii in amdomen si sub influenta estrogenilor, la nivelul glandelor mamare.De asemenea, interferenta cu semnalizarea post receptor insulinic, competitia dintre caile de oxidare ale lipidelor si glucidelor in musculatura scheletica ( ciclu Randle) si inhibitia glicogen- sintetazei pot determina si rezistenta la insulina, cu diabet secundar de tip II la persoanele susceptibile.

Severitatea sindromului pare a fi proportionala cu capacitatea fiecarei antiproteaze de a inhiba citocromul P450 3A – Ritonavirul fiind cel mai puternic si asociat cel mai frecvent cu aceste reactii adverse.LPR este si receptorul primar implicat in clearence-ul a numeroase proteaze endogene, inclusiv activatorul tisular al plasminogenului, un important anticoagulant natural.Acest efect este confirmat de sangerarile excesive constatate la hemofilici aflati sub tratament cu antiproteaze.

Combinatia dintre analogii nucleozidici si inhibitorii de proteaza s-a dovedit a avea cea mai buna activitate antiretrovirala, determinand o profunda si sustinuta supresie a replicarii virale si implicit reducerea semnificativa a morbiditatii si prelungirea vietii pacientilor infectati cu HIV.

Tabel 4.10. Antiproteaze in aplicare clinica la inceputul anului

Nelfinavirul face parte dintr-o generatie noua de antiporteaze ,are efect antiviral puternic si in monoterapie, diminuand incarcarea virala de 100 de ori ( ca si ritonavir sau indinavir ).Riscul interactiunilor medicamentoase, desi prezent este mai mic ca la ritonavir.Nelfinavirul poate fi asociat cu macrolide si imidazol.

Ritonavirul este foarte actic in vitro ( IC90 = 8-40nM)avand o biodisponibilitate excelenta ( 70%).Ritonavirul blocheaza puternic citocromul P450 3A4 hepatic acre este implicat in metabolismul multor medicamente. In consecinta, asocierea Saquinavir-ului-Ritonavir permite cresterea concentratiei plasmatice a Saquinavirului de 50 -100 de ori fata de administrarea Saquinavir-ului singur.scaderea incarcaturii virale cu aceasta combinatie este foarte marcata.

Tabel 4.13. Inhibitori de proteaza in practica

D. Inhibitorii Fuziunii . O nouã clasã de medicamente antivirale afost introdusã în clinicã în 2003. Este vorba de inhibitorii fuziunii virus-celulã þintã, un mecanism de internalizare utilizat cu predilecþie de virusurile anvelopate. Primul compus din aceastã clasã de medicamente a fost aprobat de FDA ºi EMEA în martie 2003. Este vorba de enfuvirtide (cunoscut ºi ca T20), un peptid sintetic de 36 de aminoacizi, activ în infecþia cu HIV. Enfuvirtide se leagã de o regiune a glicoproteinei transmembranare a HIV – gp41, implicatã in fuziunea anvelopei virale cu celula þintã. Interacþia glicoproteinei virale superficiale – gp120- iniþial cu receptorul CD4, ºi apoi cu coreceptori specifici, determinã modificãri conformaþionale ale proiecþiei anvelopei HIV. In final, gp 41 capãtã o configuraþie în triplu ac de pãr care mediazã fuziunea. Alterarea acestei structuri cu peptide sintetice – ca enfuvirtide- blocheazã debutul replicãrii virale. Medicamentul, dezvoltat de Roche ºi Trimeris, este comercializat sub denumirea de FUZEON®. Acest compus este rezervat pacienþilor infectaþi cu tulpini HIV multirezistente la restul claselor de antiretrovirale. Douã studii internaþionale de fazã III se aflã în desfãºurare – TORO-1 în Statele Unite, Canada, Mexic ºi Brazilia (vezi Lalezari JP et al, NEJM, 2003, on line la www.nejm.org) ºi TORO- 2 în Europa ºi Australia (vezi Greenberg ML et al, the 10th Conference on retroviruses and Opportunistic Infections, Boston, 2003). Studiile au evaluat siguranþa ºi eficacitatea enfuvirtide administrat în combinaþie cu un regim antiretroviral optimizat, conþinând 3-5 antiretrovirale din cele 3 clase existente (NRTI, NNRTI, IP) comparativ cu regimul optimizat singur. Aproximativ 1 000 de pacienþi HIV pozitivi, cu cel puþin 6 luni de tratament anterior, cu tulpini HIV rezistente la medicamentele din cele 3 clase de antiretrovirale existente, ºi cu încãrcare viralã de minim 5000 copii ARN HIV/ml plasma au primit o dozã de 90 mg enfuvirtide, injectabil subcutan, de 2 ori pe zi, timp de 24 de sãptãmâni. Rezultatele aratã o scãdere a încãrcãrii virale de 1,69 log10 copii ARN HIV/ml în grupul cu enfuvirtide comparativ cu 0,76 log10 copii ARN HIV/ml în grupul control. De asemenea num/rul de celule CD4 a crescut în medie cu 76 celule/mm3 în grupul cu enfuvirtide comparativ cu numai 32 celule/mm3 în grupul control. Enfuvirtide a determinat relativ frecvent reacþii adverse locale, (disconfort, durere, eritem, induraþie, noduli) ºi mai rar reacþii adverse sistemice (vomã, greaþã, diaree, rash, eozinofilie, chisturi), a cãror severitate nu a dus însã la renunþarea la tratament. Nu se cunosc efectele adverse pe termen lung. Acest nou medicament pare a fi extrem de util în cazul pacienþilor cu terapii combinate multiple în antecedente, cu multirezistenþã ºi opþiuni terapeutice limitate.

Politerapia antiretrovirală divergentă de înaltă eficiență -HAART

Fiecare medicament antiretroviral poate reduce încărcătura virală cu 0,5 -2 log10 ,dar numai combinarea a cel puțin trei medicamente,cu mecanism de acțiune diferit, determină o scădere marcată concentrației plasmatice a ARN HIV și previne selecția mutantelor rezistente. In general asocieriile medicamentoase se aleg pentru a permite:

un index terapeutic care sa tolereze variabilitati ( si erori) individuale largi;

administrarea a cat mai putine doze zilnic

evitarea selectiei mutantelor polirezistente, incusiv prin activarea glicoproteinei P ( pompa de eflux ) care dreneaza medicamentele extracelular.Pe de alta parte, aceeasi glicoproteina P poate facilita accesul unor medicamente in sanctuare astfel inaccesibile unor inhibitori de proteaza ( in SNC sau tractul genital, de exemplu).

Din 1996 efectul acestei terapii combinate a inceput sa fie vizibil .Conform statisticilor CDC, mortalitatea a scazut de la 29,4/100 in 1995 la 8,8/100 in 1997, iar incidenta infectiilor oportuniste cu Pneumocystis Carinii, Mycobacterium avium complex si virusul citomegalic) ascazut de la 21,9/100 in 1995 la 3,7/100 in 1997(NEJM, 1997 ,336, 1532).

Exista multiple optiuni terapeutice pentru inițierea și eventuala schimbare a tratamentului antiretroviral.

IP – inhibitor de protează, NRTI – inhibitor nucleozidic de reverstranscriptază, NNRTI – inhibitor de nonnucleozidic de reverstranscriptază.

Avantajele și dezavantajele între combinațiile antire3trovirale ce conțin inhibitori de protează ) PI) și cele ce conțin inhibitori nonnucleozidici ai reverstranscriptazei )NNRTI) sunt prezentate succint în cele ce urmează :

Tabel 5.1. Avantajele și dezavantajele diferitelor scheme terapeutice antiretrovirale

Mecanismul de acþiune a HAART. Sub triterapie se observã iniþial o scãdere rapidã a încãrcãrii virale cu mai mult de 2 log, la 2-4 sãptãmîni dupã iniþierea tratamentului. Scãderea se explicãprin acþiunea pe virionii liberi ºi pe celulele infectate, active din punct de vedere replicativ (împreunã, cele 2 compartimente reprezintã 99% din virusul plasmatic). Aceastã scadere este urmatã de o descreºtere lentã ce dureazã ani de zile, datoritã acþiunii antiretroviralelor pe celule dendritice, pe limfocitele ºi macrofagele infectate latent, cu un timp de supravieþuire lung: T1/2=1-4 sãptãmâni. Acest model permite predicþia unui termen de 2,3 – 3,1 ani de tratament pentru eliminarea HIV, cu excepþia unor sanctuare tisulare (creier, CFD, celule NK, tract genital) nedetectabile sau greu de investigat. Persistenþa virusului în aceste rezervoare poate necesita menþinerea unei terapii de susþinere toatã viaþa. De asemenea, la cateva sãptãmâni dupã iniþierea HAART existã creºteri semnificative în numãrul limfocitelor B ºi al celulelor CD4+ ºi CD8+ în sângele pacienþilor. Tehnicile de imunofenotipare au demonstrat cã celulele T cresc ca numãr pe baza expansiunii compartimentului celulelor de memorie, în timp ce celulele T naive ºi cele NK nu suferã schimbãri. Astfel, cresterea iniþiala în numarul limfocitelor T CD4+ observata dupa iniþierea HAART pare a fi datoratã redistribuirii celulelor T ºi nu proliferãrii acestora. Celule T naive sunt produse de novo, dar foarte lent, pe o perioadã de 6 luni de la iniþierea HAART. Acest fenomen se produce doar la indivizii care prezintã reduceri ale încãrcãrii virale ca rãspuns la tratament.

HAART ºi istoria naturalã a infecþiilor oportuniste în SIDA.

Efectul HAART asupra istoriei naturale a infecþiilor oportuniste din AIDS relevã capacitatea de refacere a rãspunsului imun ºi importanþa acestuia în patogenia unor infecþii oportuniste din AIDS. Douã categorii de schimbãri pot surveni în evoluþia infecþiilor oportuniste în urma aplicãrii HAART:

efecte benefice (vindecare sau ameliorare) ºi

efecte paradoxale (agravare sau recãderi).

Evoluþia sarcomului Kaposi (agent etiologic: herpesvirusul uman HH8), a leucoencefalopatiei progresive multifocale (agent etiologic: papovavirusul JC), a maladiei molluscum contagiosum (agent etiologic: poxvirusul molluscum contagiosum) ºi a unor infecþii fungice (criptosporidiaza ºi microsporidiaza) este ameliorata. Efecte paradoxale s-au înregistrat în infecþiile cu mycobacterii (Mycobacterium avium complex; M. leprae), în retinita cu virus citomegalic si în hepatita B. Reacþia paradoxala la HAART datorata acutizãrii ultimelor afecþiuni citate se explicã prin rolul terenului în patogenia infecþiilor. De multe ori agravarea simptomatologiei este interpretata ca o reacþie adversã la HAART când, dimpotrivã, semnaleazã tocmai rãspunsul la medicamente.

CAPITOLUL 4.

MONITORIZAREA VIRUSOLOGICA A EFICIENTEI TRATAMENTULUI IN INFECTIA HIV

Markerul predictiv cel mai bun al evolutiei clinice este nivelul viremiei.Doua cunoscute studii publitate in 1996 vin in sprijinul acestei afirmatii: MACS ( Multicenter AIDS Cohort Study – realizat pe 209 homosexuali, urmariti la 6 luni de tratament intre 1984-1995) si MHCS ( Multicenter Hemophilia Cohort Study –realizat pe 165 de pacienti hemofilici ,urmariti timp de 114 luni. MACS a aratat ca nivelul ARN/HIV plasmatic initial este predictiv pentru SIDA si deces, valori persistent ridicate la 2 bilanturi semestriale indicand risc major de progresie.timpul dintre instalarea SIDA si deces este in medie de 15 luni.De asemenea , nu exista corelatie intre nivelul incarcarii virale si numarul de celule CD4, acestea din urma neavand importanta prognostica decat la valori < 350 celule/ml. Politerapia divergenta a oferit posibilitatea diferentierii intre simptomele bolii si simptomele asociate reactiilor adverse sau toxicitatii medicamentelor.Intre ultimele, cele mai atent investigate au fost asociate cu administrarea PI: intoleranta la insulina, cresterea concentratiei colesterolului si trigliceridelor serice, redistribuirea tesutului adipos periferic ( lipodistrofia extremitatilor si adipozitatea trunchilui).

Evaluarea pacienților HIV înainte de inițierea tratamentului antiretroviral)ART este foarte importantă ,necesită o evaluare clinică si paraclinică a pacientului. Trebuie avut în vedere :

stadiu clinic al infecției 0 istoricul tratamentului cu ART , infecții oportuniste,tratamentul lor, momentul primei diagnosticării a infecției HIV,istoricul simptomatologiei și a tratamentului bolilor transmise sexual, posibilitatea sarcinii la femeie.

evaluarea inițială de laborator: confirmarea diagnosticului infecției HIV,statusul imun al pacientului reprezentat de numărul celulor CD4+ un bun indicator al funcției imune în infecția HIV,informații despre funcționalitatea renală, hepatică și hematologică a pacientului ,hemoleucograma, și frotiul de sânge periferic sunt necesare deoarece permit detectarea anemiei, neutropeniei, și trombocitopenie care apar frecvent drept complicații ale infecției HIV și ca efecte adverse la medicatia antiretrovirală, diagnosticarea tuberculozei,examenul histologic al leziunilor cutanate pentru confirmarea sarcomului Kaposi ,biopsie din ganglionii limfatici măriți, teste de determinare a incărcării virale ) ARN –HIV plasmatic ) util pentru a indica prognosticul infecției HIV.

OMS a formulat o serie de parametri biochimici usor de urmarit, accesibili si tarilor in curs de dezvoltare, pentru evaluarea tolerantei antiretroviralelor( Tabelul 4.14.).

Tabel 4.14. Monitorizarea prin laborator a tolerantei la ART

Monitorizarea tratamentului se realizeaza prin corelarea starii clinice cu date virusologice privind incarcarea virala si numarul celulelor CD4 pozitive, ambele masurate in sange .Scaderea incarcarii virale plasmatice la nivele nedetectabile este indicatorul eficitati tratamentului, infectia HIV fiind o infectie persistenta care ramane putin influentata de antiretrovirale (aRT) in special in rezervoarele virale constituie in ganglionii limfatici si sistemul nervos central (SNC).ARN/HIV plasmatic reflecta replicarea virala in organism (mai putin cea din celulele mononucleate circulante sau din ganglioni limfatici).Replicarea virala este insotita intotdeauna de variabilitate genetica datorita erorilor de incorporare in cursul reverstanscrierii .

In prezent o gama larga de teste de laborator sunt disponibile pentru diagnosticarea si monitorizarea pacientilor infectati HIV.

Testele virusologice utilizate pentru incarcarile virale si a rezistentei la antiretrovirale se realizeaza fie pe culturi celulare,caz in care se titreaza direct infectivitatea virala si fenotipul de sensibilitate,fie prin tehnici de biologie moleculara care evalueaza concentratia acidului nucleic viral si mutatiile punctiforme asociate genotipului rezistent.

In practica evaluarea incarcarii virale se realizeaza prin masurarea ARN/ HIV plasmatic.Valorile sale sunt corelate cu nivelul ADN proviral si cu incarcarea virala totala din organism.Replicarea virala este continua in cursul infectiei HIV (Ho,Science 1996),dar nivelul ARN/HIV plasmatic atinge valori maxime in primoinfectie si in satdiul de SIDA.In rest,valorile raman stabile (variatii <0.5log 10) la pacientii cu starea clinica neschimbata.

Dozarea incarcarii virale se poate face in mononucleare periferice (PBMC) sau in plasma. Pentru PBMC se utilizeaza titrarea virusului in dilutii sau PCR/ADN proviral cantitativ;iar pentru plasma-antigenemia p24(ELISA), titrarea virusului in dilutii limita, RT-PCR pentru ARN/HIV, bDNA pentru ARN/HIV, NASBA pentru ARN/HIV.

Cultivarea PBMC in dilutii limita pentru dterminarea titrului viral urmeaza protocoale standardizate.Sangele de la pacient prelevat pe heparina este centrifugat in gradient Ficoll,separandu-se PBMC.Acestea se dilueaza cu rata 1/5, de la 1/5 la 1/3125 intr-o placa cu godeuri.Fiecare din cele 4 dilutii se cocultiva cu PBMC de la un donator seronegativ, iar replicarea virala se evalueaza prin detectia antigenului p24 in supernatant dupa 28 zile.Titrul este dat de ultma dilutie pentru care 50% din godeuri sunt pozitive pentru Ag p24 si se exprima in TCID 50/ 1000000PBMC (tissue culture infectious dose 50%).

Amplificarea genica cantitativa pentru ADN urmeaza protoculul de mai jos:

separarea PBMC si numararea lor;

extractia ADN celular;

amplificareavADN proviral dintr-o portiune conservata a genomului (gag sau pol) prin PCR (Polymerase Chain Reaction);

amplificarea simultana a unor etaloane de calibrare un numar cunoscut de copii provirale (ex ADN extras din linia 8E5/LAV care contine o singura copie de ADN pe celula);

hibridarea ADN amplificat cu o sonda marcata (enzimatic, cu digoxigenina sau cu izotopi radioactivi);

evaluarea cantitativa in raport cu etalonul;

Determinarea antigenemiei p24 se face cu truse ELISA cu sisteme de amplificare.Pragul detectiei variaza intre 6 – 40pg/ml.Sensibilitatea determinarii poate creste prin disocierea complexelor imune cu un tampon acid glicina/HCI.

Cuantificarea numarului de copii ARN/HIV plasmatic se face prin RT- PCR urmarind: extractia ARN plasmatic; reverstranscrierea ARN viral; amplificarea secventei tinta din ADN-ul proviral dupa Rt-PCR,simultan cu un standard intern constituit dintr-un ARNmodificat (partial deletat) in cantitate predeterminata,folosind aceleasi amorse; hibridarea cu sonde specifice salbatice (pentru ARN tinta) si mutante (pentru ARN standard de calibrare);deductia numarului de copii ARN/HIV plasmatic in raport cu numarul cunoscut din etalonul de calibrare, prin masurarea si compararea densitatii optice.

Cuantificarea ARN/HIV plasmatic se poate realiza si prin amplificarea semnalului.Tehnica foloseste sonde ADN-b(branched ADN: sonde ADN ramificate si marcate multiplu).Genomul viral este imobilizat de sonde care la randul lor se pot lega specific ADNb.Reactia de detectie foloseste un substrat chemoluminiscent si este proportionala cu ARN prezent in esantion.

Tehnica de amplificare genica interna(NASBA – nucleic acid sequenced based amplification).Tehnica combina reverstransrierea cu sinteza unui ADNds, transcrierea acestui ADN in ARN ,utilizand o ARN polimeraza.Particularitatea tehnicii consta in folosirea simultana a 3 molecule distincte de ARN in cantitati diferite. Aceste standarde sunt amplificate (cu amorse proprii) in acelasi tub de reactie cu ARN salbatic din proba . Cu ajutorul unor sonde specifice de ADNb se compara semnalul de chemoluminiscenta.

Sensibilitatea testelor de prima generatie pentru aprecierea nivelului ARN/HIV plasmatic era de 5000 – 10.000copii /ml.Astazi majoritatea testelor au limita inferioara a detectiei < 400 copii/ml , si exista in dezvoltare o generatie noua ce detecteaza pana la 20-50copii/ml.Acestea din urma includ testele : Roche Ultrasensitive ,Chiron bDNA versiunea 3 si NASBA versiunea 2 (vezi tabel 2.2)

Tabel 2.2Criterii definitorii pentru alegerea tehnicilor de evaluare a incarcaturii virale.

La scurt timp după inițierea ART, unele infecții oportuniste pot deveni clinic aparente ca rezultat al sindromului de reactivare imună și trebuie diagnosticateși tratate. Dacă apar simptome noi datorate efectelor adverse, acestea trebuie explicate pacientului și se încearcă un tratament asimptomatic.Apariția unor interacțiuni medicamentoase se traduce prin creșterea toxicitații sau scăderii eficienței terapeutice .cu cât durata unei terapii este mai lungă cu atât posibilitatea apariției interacțiunilor medicamentoase devine mai semnificativă.

Eficacitatea ART se poate observa prin îmbunătațirea stării clinice a pacientului și printr-un răspuns favorabil al markerilor biologici ai infecției HIV: numărul celuleor CD4+ și încărcarea virală . Indicatorii clinici de progresie a bolii și de răspuns la tratament sunt :

creșterea în greutate ,

scăderea frecvenței –severității infecțiilor oportuniste,

scăderea frecvenței –severității tumorilor asociate HIV.

In afara criteriilor virusologice, imunologice si clinice ale succesului terapeutic câteva aspecte colaterale trebuie considerate. Desi acestea nu sunt scopuri principale ale HAART ele sunt extrem de importante: reducerea costului, prevenirea si ameliorarea compliantei – o provocare constantã pentru fiecare clinician. La fiecare vizită medicală se va discuta în amănunt aderența la tratament.Pentru a anticipa dificultățile de aderență la ART trebuie adaptat și programul individual la orarul de medicație.Cooperarea strânsă între clinician, farmacist, consilier, pacient, familia este vitală.În stabilirea complianței s-au identificat următoarele puncte :

calitatea counseling-ului, fapt care duce la o bună aderență a pacientului pe parcursul terapiei.

disponibilitatea unei echipe medicale bine pregătite, accesibilă și devotată.

asigurarea unei rezerve constante de medicamente antiretrovirale.

PARTEA SPECIALA

1. PREMIZELE SI OBIECTIVELE STUDIULUI

Obiectivele tratamentului antiretroviral sunt:

diminuarea replicarii virale (inclusiv in rezervoarele de virus),

restaurarea imunologica (prin cresterea numarului de limfocite T CD4+),

ameliorarea statusului clinic al pacientului si imbunatatirea calitatii vietii.

Dupã 1995, utilizarea câtorva clase de antivirale, în cadrul unor scheme terapeutice complexe, a transformat infectia HIV într-o boalã cronicã cu o evoluþie de ani sau decade. Standardul actual al terapiei antiretrovirale este reprezentat de politerapia divergentã de înaltã eficientã cunoscutã sub sigla HAART (highly active anti retroviral therapy). Aceasta include multiple combinatii divergente de antiretrovirale, care, actionînd la niveluri diferite ale ciclului replicativ viral, permit diminuarea semnificativa si de durata a încãrcãrii virale, întarziind în acelasi timp aparitia mutantelor rezistente. Schemele terapeutice actuale urmãresc diminuarea încãrcãrii virale plasmatice sub 50 copii HIVARN per ml plasmã, nivel care reprezintã limita de detectie a kiturilor ultrasensibile folosite curent în clinicã. Cu toate acestea, patogenia infectiei HIV este complicatã de existenta unor compartimente tisulare si a unor rezervoare celulare în care dinamica productiei virale evolueazã independent de circulatia sistemicã si de terapie- ganglionii limfatici, tesutul limfoid asociat aparatului digestiv si sistemul nervos central. Chimioterapia afecteazã în principal replicarea viralã plasmaticã si numai marginal replicarea în rezervoare. Aici, limfocitele T de memorie sunt infectate latent si au o semiviatã de cel putin 6 luni. 99% din virusul circulant este produs de limfocitele T CD4 activate, care au o semiviatã de numai 1,6 zile. Din aceasta cauza, chiar în conditiile unei supresii de duratã, rezervoarele virale nu pot fi sterilizate si ele constituie sursa reluãrii replicãrii la nivel înalt în cazul întreruperii tratamentului sau a instalãrii rezistentei la terapie.

Pornind de la aceste date ne-am propus studiul retrospectiv al eficientei diferitelor scheme terapeutice utilizate in Romania in tratarea infectiei HIV la adolescenti supravietuitori de lunga durata, cu infectie HIV dobindita in primii ani de viata pe cale parenterala. Practic, obiectivele noastre au fost :

Evidentierea principalelor scheme de tratament antiretroviral folosite in tratarea copiilor si adolescentilor cu infectie HIV.

Studierea eficacitatii pe termen scurt a diferitelor scheme de tratament folosite, pe baza analizei in dinamica a statusului imunologic (monitorizat prin numarul de limfocite T CD4+) si a celui virusologic (monitorizat prin incarcarea virala- numar de copiiARN HIV/ml plasma).

2.PACIENTI SI METODE

2.1. Selectia pacientilor inclusi in studiu. Am evaluat eficienta tratamentului la 162 pacienti HIV pozitivi, monitorizati la institutul de virusologie „Stefan Nicolau” in perioada 2000-2006, aflati sub tratament antiretroviral in diferite scheme terapeutice. Diagnosticul infectiei HIV s-a stabilit prin 2 teste ELISA si a fost confirmat prin testul WESTERN BLOT. Pentru fiecare pacient a fost intocmita o fisa ARV care a cuprins:

Nume, Prenume

Varsta

Diagnostic

Semne si simptome clinice

Schema de tratament antiretroviral (incluzind data inceperii tratamentului, data schimbarii/stoparii acestuia; tipul antiretroviralelor, doza/zi, ritmul de administrare, modul de administrarea, efecte adverse) .

Rezultatele de laborator : nr de copii ARN HIV /ml, nr de limfocite T CD4+.

Distributia pe varsta si pe sexe a lotului studiat . In lotul studiat, distributia pe sexe a fost de 87 baieti si 75 fete.

Distributia pe grupele de varsta a lotului studiat

Se observa un numar relativ mare la cazuri, la pacientii cu varsta cuprinsa intre 13-15 ani si o distributie relativ crescuta intre fete si baieti.

2.2. Determinarea imunitatii celulare CD4 prin metoda microscopica Coulter

Pentru a evidentia microscopic doar limfocitele T CD4+, testul produs de Coulter Corporation, Miami, FL, SUA, Manual CD4 Count Kit foloseste 100 μl de sange venos prelevat pe EDTA K3 si doi reactivi alcatuiti din bile de latex inerte, “imbracate” in anticorpi monoclonali specifici fie pentru moleculele de CD4 (clona MY4), fie pentru moleculele de CD14 (clona T4). Molecula de CD14 este un marker de suprafata pentru monocite si este absenta pe suprafata limfocitelor de orice fel. Pentru eliminarea monocitelor kitul prevede o penetrare a celulelor cu microsfere de latex acoperite cu anticorpi monoclonali fata de antigenul monocitar CD14 care inhiba reactivarea monocitelor fata de anticorpii anti CD4 cu care este amestecat sangele in etapa urmatoare. Sangele total este incubat initial cu reactivul ce contine bilele cu anti CD14, de diametru foarte mic (0,5-0,7μm). In acest fel monocitele vor fi acoperite de aceste mici bile de latex facand imposibila interactiunea ulterioara a moleculelor de CD4 de pe suprafata lor cu anticorpii monoclonali anti CD4. Urmeaza incubarea cu reactivul ce contine bile de latex acoperite cu anti CD4 si avand un diametru mai mare (1,8-2,2 μm). Clona de anticorp monoclonal anti CD4 utilizata este identica cu cea utilizata pentru fenotipare flow-citometrica. Aceste bile vor “rozeta” in jurul limfocitelor T CD4+ facandu-le foarte usor de distins microscopic fata de celelalte limfocite. In final, pentru usurarea suplimentara a examinarii microscopice, este prevazuta liza hematiilor si colorarea nucleilor leucocitari cu un reactiv ce contine acid acetic (pentru liza hematiilor) si cristal violet (pentru colorarea nucleilor leucocitari). Citirea se face in camera hemocitometrica, numarandu-se toate celulele ce au rozetate in jurul lor cel putin trei bile mari de latex. Kit-ul prezinta un tabel, alcatuit de producator, pe baza caruia se poate obtine numarul de limfocite T CD4+ dintr-un microlitru (1mm³) de sange periferic in functie de numarul de rozete citite. Testul este rapid (aproximativ 10 minute pentru fiecare test), simplu din punct de vedere logistic si ca procedura tehnica .

Valorile normale ale limfocitelor T CD4 + variaza pentru majoritatea laboratoarelor intre 800-1500celule/mm3 cu limite ale deviatiilor standard de la 500 la 1400celule/mm3. Frecventa de testare se hotaraste in functie de numarul de celule CD4, in felul urmator:

pentru <350celule/mm3 – se recomanda o testare la fiecare 3 pana la 4 luni

pentru >350celule/mm3 – se recomanda o testare la fiecare 3 pana la 6 luni

pentru <50celule/mm3 – se recomanda oricand retestare.

2.3.Evaluarea cantitativa a ARN-ului HIV 1 plasmatic s-a efectuat prin RT- PCR cu un kit comercial AMPLICOR HIV1 MONITOR TEST 1.5 ROCHE. Incarcatura virala a fost exprimata in numar de copii ARN HIV /ml , limita inferioara de detectie a testului fiind de 400 copii ARN HIV/ ml. Determinarea incarcarii virale (numarul de copii ARN-HIV/ml). bEvaluarea cantitativă a ARN-ului HIV1 plasmatic s-a efectuat prin RT- PCR, cu un kit comercial AMPLICOR HIV1 MONITOR TEST vs. 1.5, Roche. Incarcarea virala a fost exprimata în număr de copii ARN HIV/ml (limita inferioară de detecție a testului fiind de 400 copii ARN HIV/ml). Acest test se bazeaza pe cinci procese:

prepararea probei de lucru;

reverstranscrierea ARN-ului tinta in cADN complementar;

amplificarea prin PCR a cADN-ului tinta utilizand primeri complementari specifici HIV-1;

hibridizarea ADN-ului amplificat cu sonde oligonucleotidice specifice tintei;

detectia ADN-ului amplificat si marcat printr-o metoda colorimetrica.

Testul AMPLICOR HIV-1 MONITOR, vs. 1.5 permite reverstranscrierea si amplificarea simultana a ARN-ului HIV-1 de testat si a ARN-ului HIV-1 standard de cuantificare cu ajutorul unor primeri specifici atat pentru ARN-ul HIV-1 de testat cat si pentru ARN HIV-1 standard de cuantificareStandardul de cuantificare este un ARN transcris non-infectios care contine locusuri de legare a primerilor identice cu cele ale ARN-ului tinta HIV-1 si o regiune unica de legare a sondei care permite standardului de cuantificare amplificat sa se diferentieze de ampliconul HIV-1 de testat. Standardul de amplificare este incorporat in fiecare proba intr-un numar de copii cunoscute si se pastreaza in timpul pregatirii probelor, reverstranscrierii, amplificarii prin PCR, hibridizarii si detectiei impreuna cu tinta HIV-1, amplificandu-se simultan. Nivelul de ARN HIV-1 din probele de testat este determinat prin compararea semnalului HIV-1 cu semnalul standardului de cuantificare pentru fiecare proba in parte. Standardul de cuantificare compenseaza efectul inhibitor si controleaza procesul de amplificare astfel incat permite cuantificarea corecta a fiecarei probe testate. Selectarea secventei ARN tinta pentru HIV-1 depinde de identificarea regiunilor din genomul HIV-1 cu secvente inalt conservate. De asemenea, selectia primerilor si sondelor este foarte importanta si trebuie sa se faca dupa reguli similare pentru a obtine o performanta buna de detectie a genotipului HIV-1. Testul AMPLICOR HIV-1 MONITOR, vs. 1.5 utilizeaza primerii SK145 si SKCC1B pentru a defini o secventa de 155 nucleotide din regiunea inalt conservata a genei gag. Gena gag codifica antigene specifice de grup sau proteinele structurale capsidare ale virionului. Genele gag au in general 1500 de nucleotide in lungime si sunt localizate in pozitia 789-2290 in genomul HIV-1. Secventa nucleotidica a primerilor a fost optimizata pentru amplificarea subtipurilor HIV-1 din grupul M.

Revers transcrierea. Reactiile de reverstranscriere si de amplificare prin PCR sunt catalizate cu ajutorul enzimei recombinante termostabile polimeraza ADN Thermus thermophilus (rTth pol). Aceasta enzima, in prezenta manganului si in conditii speciale de tamponare are atat activitate de reverstranscriere cat si de polimeraza ADN. Astfel este posibil ca reverstranscrierea si amplificarea PCR sa aiba loc in acelasi amestec de reactie. Probele pregatite vor fi adaugate amestecului de amplificare in tuburi de reactie in care se va produce reverstranscrierea si amplificarea PCR. Primerul antisens (SKCC1B) si primerul sens (SK145) sunt biotinilati la capatul 5’. Amestecul de reactie este incalzit pentru a permite aditia specifica a primerului antisens la secventa tinta a ARN-ului HIV-1 si la ARN-ul HIV-1 standard de cuantificare. In prezenta Mn2+ si excesului de dNTP, incluzand deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina, deoxiuridina si deoxitimidina trifosfat, rTth pol extinde primerul aditionat, de la secventa tinta, formand o spira complementara, cADN.

Amplificarea tintei. Dupa reverstranscrierea secventei tinta a ARN-ului HIV-1 si a ARN-ului HIV-1 standard de cuantificare, amestecul de reactie este incalzit pentru a denatura hibridul ARN/cADN si pentru a expune secventele tinta. In timp ce amestecul se raceste, primerul sens SK145 aditioneaza specific la spira ADN-ului complementar, rTth pol elongheaza primerul, si este sintetizata o spira ADN secundara. Astfel primul ciclu PCR este complet, rezultatul fiind o copie de ADN dublu spiralat a secventei tinta a ARN-ului HIV-1 de testat si a ARN-ului HIV-1 standard de cuantificare. Amestecul de reactie este incalzit din nou pentru a separa ADN-ul dublu spiralat rezultat si apoi pentru a expune secventele tinta la primeri. Dupa racirea amestecului, primerii SK145 si SKCC1B aditioneaza ADN-ul tinta. rTth pol, in prezenta Mn2+ si excesului de dNTP, elongheaza primerii aditionati de-a lungul matritei tintei pentru a produce o molecula de ADN dublu spiralat de 155 perechi de baze, numita amplicon. Procesul se va repeta un numar fix de cicluri, in fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de ADN amplificat. Amplificarea are loc numai in regiunea dintre primeri a genomului HIV-1; nu este amplificat intreg genomul HIV-1.

Amplificarea selectiva. Testul AMPLICOR HIV-1 MONITOR, vs. 1.5 permite amplificarea selectiva a acidului nucleic tinta din proba de testat datorita utilizarii AmpErase®-ei (UNG, uracil-N-glicazilat) si a deoxiuridinei trifosfat (dUTP). AmpErase® recunoaste si catalizeaza distrugerea spirei de ADN ce contine deoxiuridina dar nu si ADN-ul ce contine timidina. In conditii naturale deoxiuridina nu este prezenta in ADN, dar este intotdeauna prezenta in amplicon datorita utilizarii deoxiuridinei trifosfate ca unul din reactivii dNTP din Master Mix; deci numai ampliconul contine deoxiuridina. Deoxiuridina tinde sa contamineze ampliconul susceptibil la distrugerea cu AmpErase inaintea amplificarii ADN-ului tinta. AmpErase, care face parte din reactivii din Master Mix, catalizeaza clivarea ADN-ului care contine deoxiuridina la rezidiile de deoxiuridina, deschizand lantul deoxiribozei in pozitia C-1. Atunci cand este incalzit la un pH alcalin al Master Mix in prima etapa din thermal cycler, lantul de ADN al ampliconului se rupe la nivelul deoxiuridinei, distrugand ADN-ul neamplificabil. AmpErase este inactiv la temperatura de peste 55º C, pe tot parcursul etapelor din thermal cycler, deci nu poate distruge ampliconul tinta. Dupa amplificare, orice enzima reziduala va fi denaturata prin aditia solutiei de denaturare, prevenind degradarea ampliconului tinta. In testul AMPLICOR HIV-1 MONITOR, vs. 1.5, s-a demonstrat ca AmpErase poate inactiva cel putin 103 copii ale ampliconului HIV-1 care contin deoxiuridina.

Reactia de hibridizare. Dupa amplificarea prin PCR, ampliconul HIV-1 de testat si cel al standardului de cuantificare sunt denaturati chimic pentru a forma ADN-ul simplu spiralat prin aditia solutiei de denaturare. Se adauga alicote ale apliconului denaturant pentru a separa godeurile unei microplaci peliculizata cu sonde oligonucleotidice specifice pentru HIV-1 (SK102) si specifice standardului de cuantificare, (CP35). Ampliconul standardului de cuantificare si ampliconul de testat sunt peliculizate in microgodeuri prin hibridizare cu sonde oligonucleotidice. Pentru obtinerea unor rezultate cantitative in dinamica sunt analizate dilutii seriale ale ampliconului denaturant in placa cu microgodeuri.

Detectia. Dupa reactia de hibridizare, placa cu microgodeuri este spalata pentru a indeparta orice urma de material nelegat si se adauga conjugatul, (streptavidina – peroxidaza), cuplat cu avidina in fiecare godeu al placii. Conjugatul se va lega de ampliconul marcat cu biotina hibridizand sondele oligonucleotidice (SK102 si CP35) specifice secventei tinta legate de placa. Placa este apoi spalata pentru a indeparta conjugatul nefixat si se adauga substratul ce contine peroxid de hidrogen si 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina. In prezenta peroxidului de hidrogen, peroxidaza deja legata catalizeaza oxidarea tetrametilbenzidinei si duce la formarea unui complex colorat. Reactia este stopata prin aditia unui acid slab si apoi este masurata densitatea optica la 450nm cu ajutorul unui cititor automat.

Cuantificarea ARN-ului HIV-1. Testul AMPLICOR HIV-1 MONITOR, vs. 1.5 cuantifica ARN-ul viral HIV-1 utilizand o a doua secventa tinta (standardul de cuantificare), care este adaugata la proba de testat intr-o concentratie bine determinata. Standardul de cuantificare este o molecula ARN ne-infectioasa de 233 nucleotide cu regiuni de legare a primerilor identice cu cele ale secventei tinta de testat. Standardul de cuantificare HIV-1 contine locusuri de legare a primerilor SK145 si SKCC1B si genereaza un produs de amplificare de aceeasi lungime (155 baze) si compozitie ca si secventa tinta. Regiunea de legare a sondelor a ampliconului standardului de cuantificare a fost modificata pentru a diferentia ampliconul standardului de cuantificare de ampliconul secventei tinta a probei testate.

In limitele liniare ale testului densitatea optica (DO) a fiecarui godeu al placii este proportionala cu cantitatea de amplicon HIV-1 sau a ampliconului standardului de cuantificare din godeuri. DO totala este calculata prin inmultirea densitatii optice a fiecarui godeu cu factorul de dilutie pentru acel godeu. DO totala calculata pentru proba HIV-1 si pentru standardul de cuantificare este proportionala cu cantitatea de ARN HIV-1 din proba, respectiv din standardul de cuantificare, prezenta in fiecare reactie de amplificare PCR. Cantitatea de ARN HIV-1 din fiecare proba se calculeaza prin impartirea DO totale a ARN-ului HIV-1 al probei la DO totala a standardului de cuantificare HIV-1 si a numarul initial de molecule ARN din standardul de cuantificare HIV-1, utilizand urmatoarea ecuatie:

DO totala HIV-1 x nr. initial de copii ARN din SQ x factorul de vol. al probei = DO totala a SQ = numarul de copii ARN HIV-1/ml unde :

DO totala HIV-1 reprezinta DO totala calculata pt. ampliconul HIV-1

DO totala a SQ reprezinta DO totala calculata pt. ampliconul standardului de cuantificare HIV-1

Nr. Initial de copii din SQ reprezinta numarul de copii din standardul de cuantificare al fiecarei reactii, informatie specifica pt. fiecare lot

Factorul de vol. al probei reprezinta factorul de convertire al copiilor/PCR la copii/ml (valoarea acestuia fiind de 40)

3. REZULTATE

3.1. Schemele de tratament utilizate. In tabelul 3.1 am rezumat toate medicamentele ARV utilizate in diferite combinatii

Tabel 3.1. Medicamentele antiretrovirale utilizate in lotul studiat

Cele mai des utilizate medicamente au fost pe departe inhibitorii de proteaza: ritonavirul (81,7%) care a fost administrat ca booster in diverse combinatii si lopinavirul (73,7%). Urmeaza inhibitorii de reverstranscriptaza: nucleozidici, la o distanta de cateva procente: didanozina (48,9%), lamivudina (38,6%), zidovudina (33,5%), si non-nucleozidici, la o distanta ceva mai mare: nevirapina(10,2%), efavirenz(16,8%) (figura 3.1)

Tratamentul antiretroviral a fost inceput inainte ca pacientii sa fie admisi in acest studiu, cu 7±6 luni inainte de initierea monitorizarii, astfel ca in anul 2002 pacientii aveau o durata medie de tratament de 13±6 luni.

Figura 3.1. Medicamentele antiretrovirale administrate lotului studiat

In total s-au administrat 13 medicamente antiretrovirale si, aditional, in combinatiile cu inhibitori de proteaza s-a folosit ritonavir pentru a potenta efectul acestora. Ritonavirul a fost asociat in doza booster (de crestere a eficacitatii) de cel mult 200mg x 2/zi cu: amprenavir, lopinavir si saquinavir. Majoritatea pacientilor la care ritonavirul a fost folosit ca booster au folosit o combinatie standard, Kaletra: lopinavir + ritonavir. Medicamentele utilizate de mai putin de 10% dintre pacienti au fost: zalcitabina, abacavir, saquinavir, amprenavir.

S-a observat ca in lotul de pacienti studiat , exista o varietate de scheme de tratament folosite , atat de prima intentie terapeutica cat si ca scheme alternative.

Scheme de tratament folosite si numarul de cazuri in care au fost folosite:

Cu toate acestea, la sfarsitul perioadei de monitorizare majoritatea pacientilor, 87.7%, se incadrau in trei scheme mari de terapie antiretrovirala, iar restul erau naivi:

A – 2 inhibitori de reverstranscriptaza: nucleozidici asociati cu 1 inhibitor de reverstranscriptaza: non-nucleozidic: 2INRT+1INNRT;

B. 2 inhibitori de reverstranscriptaza: nucleozidici asociati cu 1 inhibitor de proteaza: : 2INRT+1IP

C. 2 inhibitori de reverstranscriptaza nucleozidici asociati cu 2 inhibitori de proteaza 2INRT+1IP+RTV;

Combinatia 2INRT+1IP+RTV a fost cel mai frecvent folosita cu un procent minim de 54.2% si maxim de 66.7%.

Figura 3.2: Tipul de tratament antiretroviral

3. 2. Eficienta clinica a schemelor de tratament Pentru aprecierea eficacitatii tratamentului antiretroviral, am comparat rezultatele obtinute la cei 129 adolescenti aflati sub tratament antiretroviral cu cele provenite de la lotul mai restrans al celor 32 adolescenti care la initierea studiului nu întruneau criteriile de initiere a terapiei. Dupã 12 si 24 luni de urmarire, la pacientii cu imunosupresie severa si moderata, aflati sub tratament ART, s-a înregistrat o crestere a valorii medii a numarului de celule CD4/mm3 cu ~ 294 CD4/mm3 si o scadere drastica a încarcarii virale cu schimbarea ordinului de marime a numãrului de copii ARN/HIV de la 105 la 104.

In functie de schema terapeutica utilizata am evaluat statutul de progresor al infectiei HIV. Astfel am observat ca indiferent de tipul de terapie utilizata, non-progresorii se regasesc intr-un procent mult mai mare decat progresorii. Avand in vedere gradul bun de aderenta al pacientilor la tratament putem sa afirmam ca terapia 2INRT+1IP a fost cea mai eficienta din acest punct de vedere cu un procent de 100% pacienti non-progresori, tabel 3.2. si figura 3.3.

Tabel 3-2. Progresia HIV in functie de tratament.

Figura 3.3: Progresia HIV in functie de tratament

La cele doua evaluari anuale, din punct de vedere clinic am observat ca indiferent de tipul de terapie urmat, un procent din pacienti a trecut din stadiul clinic B in stadiul C. Acest procent este diferit in felul urmator: pentru naivi si pentru combinatia 2INRT+1IP+RTV procentele sunt apropiate: 14,3% si 15,4% in timp ce pentru combinatia 2INRT+1INNRT se poate observa cel mai mare procent de pacienti care trec din stadiul B in C: 60%.figura 3.4.

Terapia care contine INNRT a fost terapia care sub care starea clinica a pacientilor progresori s-a deteriorat cel mai frecvent. Inhibitorii non nucleotidici de reverstranscriptaza administrati au fost nevirapina si efavirenz.

Figura3.4. Stadializarea lotului in functie de terapie

3.3. Eficienta imunologica a schemelor de tratament. Pentru a evalua eficienta schemelor de tratament , am analizat rezultatele de laborator , continand numarul de limfocite T CD4+ si viremia , numarul de copii ARN-HIV/ml, iar pentru studiul eficientei s-au luat in calcul analizele facute in timpul unui an de tratament ARV. La initierea tratamentului antiretroviral statusul imunologic al pacientilor era :CD4 < 100 – 22 de pacienti

CD4 100-200 – 33 de pacienti

CD4 200-500 – 65 de pacienti

CD4 > 500 – 43 de pacienti

In functie de severitatea imunosupresiei, la debutul monitorizarii, pacientii erau distribuiti astfel:

– 34.8%  cu imunosupresie severa (numar de celule CD4+ sub 200/mm3)-;

– 39.1% cu imunosupresie moderata (numar de celule CD4+ între 200-500/mm3) ;

– 26.1%.imunocompetenti (numar de celule CD4+ peste 500/mm3);

Pacientii naivi, netratati au fost cuprinsi intre 9.5% la pacientii imunocompetenti cu numar de CD4 peste 500/mm3 si 25% la pacientii cu SIDA imunologic, cu numar de celule CD4+ sub 100/mm3;

In cazul schemei 2INRT+1IP+RTV se evidentiaza un beneficiu terapeutic mai consistent, vizibil dupa un an de tratament cand se ating valorile medii 460 adica limita de imunocompetenta

3.4. Eficienta virusologica a schemelor de tratament. La inceputul tratamentului am avut urmatoarea distributie in functie de incarcarea virala:

61 copii cu incarcare virala nedetectabila, totalizand un procent de 37,65%; 47copii,29.01 %, cu incarcare virala< 103 copii ARN-HIV/ml; 36 copii, 22.22%, cu > incarcare virala intre104-105 copii ARN-HIV/ml; si 18 copii ,11.11% cu incarcare virala > 106. copii ARN-HIV/ml. Dupa 12 luni de monitorizare la analiza per ansamblu a grupului modificarile au fost semnificative: s-a putut observa o usoara crestere a procentului de pacienti cu incarcare virala nedetectabila, 46.29%; precum si scadere a procentului de pacienti cu incarcare virala detectabila:

Redam in figurile de mai jos influenta tratamentului asupra nivelului replicarii virale plamatice, precum si o comparatie intre viremia la pacienti tratati si la naivi. .

Succesul virusologic este egal cu scãderea încãrcãrii virale sub limita detectiei testelor de sensibilitate (50-400copii/ml). Aceasta înseamnã cã descresterea rapidã si completã a încãrcãrii virale semnaleazã un efect benefic de lungã duratã. Din nou, schema terapeutica ce a asociat 2INRT+1IP+RTV ca booster a adus cele mai bune rezultate in termeni de supresie a replicarii virale plasmatice.

3.5. Analiza pacientilor cu esec terapeutic. La un numar de 25 de pacienti tratamentul antiretroviral nu a determinat supresia incarcarii virale si restaurarea imunologica corespunzatoare. Acestia reprezinta 16,1% din lotul studiat, dintre ei 28% erau naivi iar restul urmau 2 scheme terapeutice: 20% – 2INRT+1INNRT si 52% – 2INRT+1IP+RTV.

Per ansamblu la nivel baseline, la acesti pacienti, incarcarea virala a avut o valoare medie de 79 963,4±1 63010copii/ml si numarul de limfocite TCD4 a fost de 327±253celule/mm3. Dupa 24 luni de monitorizare am observat o crestere a incarcarii virale pana la 21 9620±23 0656copii/ml si o scadere a numarului de limfocite T CD4 pana la 179±90celule/mm3. La acesti pacienti, daca initial valoarea medie a numarului de limfocite T CD4 era peste 200 celule/mm3, in final acesta a scazut sub pragul de 200 celule/mm3 indiferent daca pacientii erau tratati sau nu, figura3.5.

Figura3.8. Deteriorarea imunologica a lotului de progresori

Studiile de amploare realizate in ultimii ani au definit esecul terapeutic drept o crestere a încãrcãrii peste 5000 copii/ml. Riscul relativ al esecului este de 20 ori mai mare la bolnavi care sub tratament ating valori sub 200 copii decât la cei la care aceste valori au depãsit totdeauna 400 copii ARN HIV.In lotul nostru, deteriorarea virusologica s-a concretizat prin cresterea valoarii medii a incarcarii virale atat la pacientii progresori tratati cat si la cei fara tratament.

Figura3.9. Valoarea medie a incarcarii virale la lotul de progresori

Analiza statistica a cresterii valorilor medii s-a dovedit foarte semnificativa in cazul pacientilor progresori naivi (p<0.001,odds ratio 0.2730, 95% CI= 0.2683-0.2778) si celor tratati cu 2INRT+1INNRT(p<0.001, odds ratio 0.2132, 95% CI= 0.2091-0.2174) si foarte semnificativa in cazul pacientilor progresori tratati cu 2INRT+1IP+RTV(p<0.015,odds ratio 1.018, 95% CI= 1.007-1.029).

Toate aceste evaluari probeaza ideea ca terapia cu inhibitori non nucleozidici de reverstranscriptaza induce o deteriorare mai accentuata a statusului imunologic si virusologic

4. Discutii.

Pe baza modelelor matematice derivate din scăderea viremiei în cursul HAART s-a estimat că eradicarea replicării ar putea fi obținuta in 2,3 -3,1 ani, cu conditia supresiei totale a ciclului replicativ viral în acest interval.Studiile clinice care au o durată de supraveghere de peste 72 saptamani au aratat ca supresia este reală la peste 70-80% din bolnavii sub HAART. Exista insa citeva probleme importante ce trebuie atent considerate:

a)supresia totală nu este sinonimă cu nedetectarea viremiei cu testele obișnuite

b)exista comportamente tisulare unde aRT nu sunt la fel de active

c)la încetarea triterapiei, la multi bolnavi s-a observat reluarea replicării.

Pe baza pragului de sensibilitate: se pot defini cel puțin trei categorii de teste de evaluare a viremiei (prag inferior : 200/500copii ARN/HIV) ; teste hipersensibile( prag inferior: 20 copii ARN/HIV); și teste de cercetare ) prag inferior ( 1-2 copii ARN/HIV).

Cu testele hipersensibile se apreciază că numărul bolnavilor care rămân viremiei chiar sub triterapia trece de 50%.Și cu aceste teste, rezultatele negative trebuie interpretate cu rezerve pentru că există comportamente în organism unde producția virusului continuă în ciuda viremiei absente.Lipsa viremiei plasmatice nu inseamă că virusul nu mai poate fi detectat in ganglionii limfatici, în amigdale sau în alte țesuturi. Comportamentele care pot servi drept sanctuare pentru virus sunt SNC și tractul genital. Concentrația medicamentelor dincolo de bariera hematoencefalică reprezintă numai o fracțiune din cea plasmatică.În al doilea rând, exista particularitați replicative în celulele nonlimfoide care pot face virusul mai puțin vulnerabil la antiretrovirale. Scăderea viremiei, indiferent de compartimentul tisular, este urmarea a două evenimente: 1) clearence-ul particulelor virale; 2) diminuarea celulelor care produc virus prin scăderea numărului non infectate

După inițierea tratamentului aRT se observă două faze în scăderea viremiei: faza de scădere rapidă, în 2-3zile și faza de scădere lentă, în 4-14zile. Odată cu scăderea viremiei seproduce creșterea semnificativă a numărului de limfocite CD4 pozitive ca urmare a proliferării periferice (turnover-ul zilnic : 1,8 x 10 9 celule ) ; a redistribuirii limfocitelor din alte situri anatomice; a scăderii turnover-ului, apreciat prin scăderea lungimii telomerelor. Reluarea ciclului replicativ la întreruperea HAART a fost atribuita prezenței unor rezervoare de virus infectate latent sau restabilirii proprietăților replicative ale unor provirusuri defective (Chun T.W.Proc Natl Acad. Sci USA 1997;94:13193-97; Wrong J.M. Science 1997;278;1291-95).

Reactiile adverse și dificulatea de-a urma un tratament complex și îndelungat îi determină pe mulți pacienți să întrerupa tratamentul.Această opțiune a fost testată și în unele studii care au încercat să simplifice posologia după câteva luni de răspuns bun la triterapie, cu alte cuvinte, la bolnavii aviremici pentru un interval de câteva luni.Rezultatele preliminare a două studii prezentate la simpozionul “ The body fights back “, Chicago,februarie 1998 sunt descurajate.Foarte rapid pacienții care au trecut la monoterapie (cu inhibitori de protează ) sau chiar la biterapie prezintă viremie detectabilă.Substratul acestui eșec este prezența unor mutante în populația virală rezistente la umnele medicamente.Este cunoscut că pentru apariția rezitenței la antiproteaze sunt necesare mai multe mutații simulatne, pe când rezistența la lamivUdină, de exemplu, este achiziționată în urma unei mutații unice.Prezența mutantelor virale este cu atât cu cât viremia reziduală este mai înaltă și cu cât durata tratamentului este mai lungă.

Încărcarea virală- numărul de copii de ARN HIV per mililitru de plasmă și numărul limfocitelor CD4 sunt markerii plasmatici utilizați obișnuit pentru monitorizarea terapiei .De asemenea, pacienții cu ART trebuie atent urmăriți pentru a evalua complianța – aderența și tolerabilitatea la tratament. La începutul tratamentului se recomandă controlul lunar la pacienților și odată stabilizați trebuie controlați o data la 3 sau 4 luni.Apariția unor infecții oportuniste poate spori numărul examinărilor, astfel că planificarea lor trebuie să se plieze nevoilor pacienților. Scheme terapeutice actuale urmăresc diminuarea încărcării virale plasmatice sub 50 copii HIV ARN per ml plasmă, nivel care reprezintă limita de detectie a kiturilor ultrasensibile folosite curent în clinică. Scăderea concentrației ARN HIV plasmatic sub HAART este mult mai lentă la copii, comparativ cu adulții.Aceste date ar putea explica prportia redusă de copii sub 50 % în studiile realizate până acum, ce ating nivele nedetectabile ale încărcării virale ) 400 copii ARN HIV – ml sub tratament .De aceea, pediatrii pot opta pentru amânarea schimbării terapiei la copii cu status clinc bun, și nivel CD4 stabil, chiar în prezența eșecului virusologic.

Cei câțiva ani de experiență clinică cu politerapia divergentă au subliniat aspecte particulare de mare importanță practică. Astfel:

HAART nu suprimă complet replicarea HIV

rezervoarele replicării latente HIV se stabilesc încă în timpul seroconversiei

HAART scade semnificativ viremia plasmatică, dar nu influențează sinteza citokinelor proinflamatorii care mențin microclimatul necesar persistenței HIV în rezervoare )sanctuare)

Câteva strategii au fost încercate pentru eliminarea HIV din rezervoare:

întreruperi intermitente ale HAART pentru stimulare imună SIT = Franco Lori :pacientul din Berlin,NEJM 1999,340,1683=

întreruperi structurate ale tratamentului STI ) A. Faucci Durban Conference)

administrarea HAART + IL2 ,pentru drenarea rezervoarelor,

administrarea HAART+ hidroxiuree. Hidroxiureea nu prezintă activitate antiretrovirală directă și nu este considerată un medicament antiretroviral . Hidroxiureea administrată în asociație cu Didanozina și cu stavudina exercită un efect inhibitor sinergic asupra HIV,determinând o scădere adițională de 0,5 log 10 a încărcării virale, fără a înfluența numărul de limfocite CD4.

Schimbarea regimului antiretroviral se ia in considerare în condițiile scăderii suboptimale a viremiei după inițierea terapiei sau a creșterilor semnificative ale viremiei după inițierea terapiei sau a creșterilor semnificative ale viremiei după perioade de supresie.Schimbarea tratamentului trebuie să ia în considerare aderența la tratament, toxicitate și interacțiunile medicamentoase.

Monitorizarea eșecului depinde de nivelul viremiei, istoricul tratamentulelor aplicate fiecărui bolnav ,rezultatele testelor de rezistență și opțiunile terapeutice disponibile.

Pentru monitorizarea eficacității terapiei antiretrovirale frecvența sugerată a determinărilor de ARN HIV este :

la inițierea tratamentului : două determinări la interval de 2-4 săptămâni ,

sub tratament: la 3- 4 luni asociat cu determinarea numărului de celule CD4,

la schimbarea terapiei : la 3 -4 luni săptămâni după începerea noii combinații sau mai des în funcție de necesități .

În practică, măsurarea încărcării virale se face:

în vederea stabilirii unei valori de referință precoce,la toți pacienți ,

semestrial, pentru supraveghere, în absența tratamentului

la începerea tratamentului, la o lună de la debut și ulterior de 2-4 ori pe an, în funcție de nivelul bazal, de schema terapeutică și de nivelul CD4

numsi în perioade în care starea clinică a pacientului este stabilă la cel puțin 4 săptămâni distanță de la o eventuală infecție intercurentă sau de o imunizare,

în același laborator și prin aceeași tehnică, pentru asigurarea calității și reproductibilității rezultatelor.

Pragul de 50-400 copii ARN HIV /ml este arbitrar iar cifre de acelasi ordin sau chiar pânã la 1000 copii/ml pot fi urmarea unor inexactitãti metodologice. Un singur croseu (“rebound” sau “blip”) poate fi irelevant. Numeroase studii au indicat continuarea replicãrii si dezvoltarea rezistentei chiar la pacienti cu viremie sub prag. In fapt 50 copii/ml înseamnã cã 5 litri de sânge contin 250.000 virioni si cu sigurantã mult mai multi în organele limfoide si în rezervoare. Viremia nemãsurabilã înseamnã numai “sub pragul de detectie” si nimic mai mult. Totusi, nivelul viremiei are o semnificativã valoare prognosticã.

Totusi, morbiditatea si mortalitatea pot scãdea chiar dacã viremia depãseste putin pragul . Acest aspect trebuie retinut în cazul pacientilor care au putine optiuni de tratament. In aceste cazuri se poate renunta la determinarea încãrcãrii virale drept criteriu al succesului terapiei. La bolnavii infectati cu tulpini multirezistente succesul virusologic nu este posibil iar evaluarea numãrului CD4 este prioritarã. Pacientii pot rãmâne clinic si imunologic stabili lungi intervale chiar cu o supresie insuficientã a viremiei.

Startul întârziat al terapiei poate contribui la alterarea rãspunsului imun împotriva HIV, a infectiilor oportuniste si a altor patogeni. Multi cercetãtori au sugerat cã restaurarea imunologicã calitativã nu tine pasul cu imunorestaurarea cantitativã. Cu toate acestea urmãtoarele observatii concordante sustin realitatea restaurãrii imunologice:

chiar bolnavii cu SIDA pot renunta la profilaxia infectiilor oportuniste odatã ce CD4+ >200/uL;

multe simptome sau evenimente SIDA se rezolvã sau se rãresc;

Aproape toate studiile demonstreazã corelatia clarã între numãrul CD4 la initierea HAART si evolutia spre SIDA sau deces . Nivelul bazal al CD4+ sub 50/uL, sau mentinerea nivelului scãzut dupã HAART sunt factori de risc pentru progresia clinicã. In 2002 a fost publicat cel mai consistent studiu privind aceastã problemã Egger si colaboratorii, tabel 2.2.-3.

Nivelul bazal al CD4 sub 200 CD4+/uL înseamnã risc crescut de progresie, în timp ce numai nivel foarte înalt al viremiei (peste 105 copii) se asociazã cu aceeasi tendinta. Astfel de rezultate au fost semnalate numai dupã 3 ani de urmãrire; pe termen lung, cifrele pot fi mai relevante. In special bolnavii cu numãr foarte scãzut de CD4+ (>50/uL) continuã sã aibã risc ridicat pentru evolutia cãtre SIDA . In alte studii, riscul continuã sã fie înalt si la un numãr de CD4+ sub 200/uL . Un studiu italian a demonstrat asocierea riscului crescut al progresiei clinice cu un numãr CD4+ care nu creste si rãmâne sub 50/uL (Cozzi Lepri si colab., 2001).

Cel mai larg studiu dedicat acestui aspect a fost publicat în 2002 de ART Cohort Collaboration. Au fost introduse atunci mai multe serii, in total fiind analizati aproximativ 13.000 pacienti sub HAART. Datele par evidente (Egger 2002 si colab.,). Nivelul bazal al CD4+ se coreleazã cert cu probabilitatea evolutiei spre SIDA si spre deces. Comparativ cu bolnavii care au început HAART sub 50 CD4+/uL riscul a fost semnificativ mai scãzut la bolnavii cu numãr mai mare al limfocitelor T helper.

Trebuie semnalate diferentele moderate între grupele cu nivel CD4+ peste 200/ CD4+/uL. Incãrcarea viralã la initierea terapiei a fost relevantã numai la pacientii cu valori foarte înalte >100.000 copii/ml. Toate seriile au prezentat incidentã scãzutã a mortalitãtii si morbiditãtii. Este logic cã un deficit imunologic semnificativ va necesita timp mai lung pentru ameliorare sub HAART iar pânã ce aceasta se produce pacientii rãmân cu risc. Un sistem imun devastat nu se poate reface rapid.

La valori peste 200 CD4+/ul situatia devine mai complicatã. Cele mai multe studii nu au adus argumente privind initierea mai timpurie a terapiei (>350/ CD4+/uL).

Tabelul de mai jos sintetizeazã acest aspect (Tabel 2.2.-4.). In meta-analiza a trei studii mari europene citate anterior, diferenta a fost minimã. Rata evolutiei spre SIDA a fost 2,3 versus 1,8, rata mortalitãtii 1 versus 0,7 per 100 bolnavi. Aceasta înseamnã numai un singur nou caz SIDA la 200 pacienti. Pentru detectarea diferentelor sunt necesare studii largi aleatorii (randomizate).

Surprinzãtor, un studiu caz control elvetian a arãtat o diferentã semnificativã (Opravil si colab., 2002). 283 bolnavi care au început HAART la nivele peste 350 CD4+/uL au fost comparati dupã vârstã, sex, nivel CD4 si al încãrcãrii virale si dupã grupa de risc privind achizitia infectiei HIV cu bolnavi control care nu au fost tratati cel putin 12 luni. Dupã urmãrire, trei ani mai târziu, riscul evolutiei spre SIDA a fost mai mult decât dublu în grupul netratat. Partizanii initierii timpurii a terapiei vor gasi multe argumente în acest studiu. O problemã esentiala rãmâne dacã analizam îndeaproape cei 42 de bolnavi care au progresat spre stadiul clinic B si cele 10 noi cazuri SIDA apãrute la pacientii netratati. Putem compara cele 8 cazuri de pneumonii limfoide, 10 cazuri de leziuni orale, 9 cazuri de herpes, 9 de trombocitopenie si cele câteva cazuri de tuberculoza, penumonie, candidoze, cu efectele adverse ale terapiei antiretrovirale? Peste o treime (35%) din pacientii tratati au întrerupt HAART: 51 – datorita acuzelor gastrointestinale, 25 – datoritã problemelor neurologice sau renale sau lipodistrofiei.

NA=neanalizat

Factori multiplii influenteazã restaurarea imunologicã: vârsta, dimensiunea timusului, extensia degenerãrii timusului, durata imunosupresiei. Cum unele din aceste criterii nu pot fi evaluate la initierea terapiei, surprinzãtor de multe studii au arãtat cresteri similare ale numãrului CD4+. Totusi, restaurarea imunologicã este rar completã dupã nivele bazale joase ale CD4+. Cu cât sistemul imun este mai afectat cu atât recuperarea este mai putin probabilã (atingerea pragului de 500 CD4+/uL). Ingrijoratoare este si situatia a 10-15% pacienti cu rãspuns discordant la care HAART scade viremia însã CD4+ rãmâne la valori joase. Riscul relativ pentru esecul virusologic creste la bolnavii cu imunosupresie severã (<100 CD4) sau încãrcare viralã înaltã (>106 copii ARN/uL). Intre aceste valori nu se înregistreazã diferente pe straturi.

Cei mai importanti factori de risc pentru esecul virusologic sunt (1) tratament antiretroviral extensiv (selectia unor mutante rezistente) si (2) lipsa aderentei la terapie. Termenul de intensificare a terapiei antiretrovirale este des utilizat dar nu este bine încã definit. Pentru unii semnificã adaugarea unuia sau mai multor antiretrovirale la terapii care nu au reusit sa scada încarcarea virala sub limita detectabila în timp scurt (de exemplu dacã dupa 12-16 saptãmani nu se ajunge sub 500 copii/ml). Pentru altii intensificare înseamna adaugarea unuia sau mai multor antiretrovirale la o terapie initiala numai în momentul recãderii adicã al reboundului încãrcãrii virale. În fine, existã persoane pentru care intensificare semnificã completarea terapiilor care au dat supresie virala în scopul prelungirii duratei efectului antiviral. La prima vedere aceastã a 3 conceptie pare sa încalce principala regula a tratamentului antiretroviral aceea de a nu aduga niciodatã un singur medicament la o terapie care esueaza. Totusi, existã date care demonstreaza contrariul. De exemplu, adaugarea abacavirului sau a hidroxiureei la un regim AZT + 3 TC poate aduce reale beneficii. Dar nici o schema de tratament nu poate fi infailibila si de aceea clinicianul trebuie sa aiba la îndemana terapii de salvare in cazul esecului. Investigarea noilor strategii de salvare este problematicã pentru cã si gasirea unui numar suficient de mare si de omogen de pacienti este dificilã. Desi bolnavi infectati cu tulpini multirezistente nu sunt greu de gasit, fiecare bolnav are un istoric terapeutic propriu, are mutatii responsabile de rezistentã proprii si diferite premize pentru o posologie de salvare. O altã strategie obisnuitã în terapia de salvare este utilizarea dozelor joase de ritonavir (asa cum sunt în Kaletra) pentru a amplifica nu numai lopinavirul dar si alti IP ca saquinavir, amprenavir si indinavir.

Datele in vitro au arãtat ca acest efect este mai pronuntat pentru Saq, existând sinergie între cei doi IP (Molla 2002). Minidoza de ritonavir în Kaletra (doza standard) pare sã fie suficientã pentru 1000 mg Saq de doua ori pe zi (bid) asa cum aratã studiile farmacokinetice (Stephan 2002). Interactiile farmacokinetice nefavorabile care au fost demonstrate între amprenavir si lopinavir/r de exemplu (Bach 2002) nu par sa afecteze saq si lopinavir/r. Cu toate acestea, prima combinatie pare sã atingã rezultate rezonabile cu adãugarea unui nou impuls cu ritonavir (200 mg) Raguin 2002.

Pe de altã parte, un studiu mic a observat rãspunsuri mai bune cu combinatia lopinavir/r + saquinavir decât cu lopinavir/r + amprenavir (Zala 2002).

Intr-un studiu german cu bolnavi intens pretratati (în medie 9 diferite combinatii!) care au fost comutati din diferite motive (rezistentã, toxicitate) la combinatia Kaletra + Saq, 19 din 33 au atins o viremie sub 50 copii/ml dupã 24 sãptãmâni (Staszewski 2002). Mai multi pacienti întrerupseserã tratamentul înainte de-a relua terapia de salvare.

In oricare din centrele clinice mari, mai mult de 30-40 combinatii sunt utilizate. Studiul OPTIMA (Options in Management with Antiretrovirals) analizeazã diferite strategii ca Mega HAART sau întreruperi ale tratamentului de trei luni la 1700 bolnavi, înaintea unui nou regim. Rezultatele nu vor fi disponibile pentru un timp si pânã atunci trebuie sã ne raportãm la datele unor studii necontrolate care analizeazã între 20-100 pacienti pentru salvare.

Cel putin o concluzie rezulta din aceste studii – cu cât încãrcarea viralã este mai mare la esecul unui regim IP, cu atât mai mici sunt sansele de succes pentru o urmãtoare combinatie (Chavanet 2001, Deeks 1999, Hall 1999, Paredes 1999, Mocroft 2001). Cu cât virusul are mai mult timp sã dezvolte rezistentã cu atât devine mai imprevizibil.

Mai mult, diferite studii au arãtat cã de obicei numai 30-50% din bolnavii care esueazã sub un regim IP sunt capabili sã atingã viremii sub pragul de detectie la combinatii amplificate ca ritonavir/saquinavir (Deeks 1998, Patkenhener si colab. 1999, Hall si colab. 1999, Paredes si colab. 1999). Rãspunsurile la R/Saq pot fi usor ameliorate dacã regimul initial contine nelfinavir (Tebas 1999) datoritã probabil mutatiei D30N specificã pentru nelfinavir.

Urmând dictonul “mai mult, mai bine” mai multe studii au arãtat cã intensificarea combinatiilor terapeutice descrise ca Mega, Giga HAART pot fi întradevãr eficiente. Succesul acestor studii, în mare parte necontrolate, poate fi discutabil. In combinatii de 5 sau 6 medicamente o supresie suficientã a încãrcãrii virale a fost atinsã la un procent variabil de bolnavi (22-52%). Grossman 1999, Miller 2000, Montaner 2001, Piketty 2002, Youle 2002.

Apare intrebarea daca intreruperile terapeutice înaintea initierii unor astfel de regimuri ranforsate aduc vreun beneficiu suplimentar. In studiul Giga HAART (Kateama 2002) bolnavi cu istoric terapeutic extrem de încãrcat cu infectie HIV avansatã (<100 CD4/ml si viremie > 50.000 copii/ml) au început sa fie tratati dupã o întrerupere de pânã la 8 sãptãmâni cu o combinatie de 7-8 medicamente: 3-4 INRT, 3 IP si HU (hidroxiuree). In grupul care întrerupsese tratamentul efectul dupã 24 sãptãmâni a fost semnificativ mai bun, descresterea încãrcãrii virale fiind de 0,29 versus 1,08 log. Acest rezultat promitãtor trebuie confirmat.

Dupã anumiti sceptici, toate studiile de salvare, trebuie spus fãrã menajamente, pot fi considerate ca administrarea unor cockteiluri otrãvitoare, si acest tratament poate fi acceptat numai pe termen scurt. Mai multe aspecte trebuie considerate. Regimurile HAART nu sunt individualizate. Mai mult, succesul lor este functie de trei variabile:

rezistentã

concentratie plasmaticã

aderentã

Ultimul aspect este dificil cu un astfel de regim. Numai pacientii bine informati si extrem de complianti pot fi astfel tratati. In plus interactiile între medicamente sunt greu de prevazut în asemenea situatii iar concentratia plasmaticã nu va putea fi niciodatã mãsuratã. In ciuda tuturor discutiilor privind Mega sau Giga HAART, pentru anumiti pacienti, atingerea pragului de detectie a încãrcãrii virale ca scop al tratamentului trebuie abandonat. Câteodatã este mai întelept sa cobori pretentiile si sã astepti medicamente noi ca inhibitorii internalizarii sau tipranavir. Acesti bolnavi trebuie monitorizati în centre mari unde optiunile terapeutice noi sunt disponibile mai devreme si unde clinicienii au expertiza regimurilor intensificate. Irosirea unui singur nou medicament prin adãugarea lui într-o combinatie trebuie evitatã, cel putin 2-3 noi medicamente mai eficiente trebuie adãugate deodata.

STI (“structured treatment interruptions”) si SIT ("structured intermittent therapy") sunt douã strategii propuse pentru controlul îndelungat al infectiei HIV. Aceste strategii pleacã de la douã premize: prima tine de incapacitatea HAART de-a eradica infectia (în special din rezervoare); iar cea de-a doua de complianta scãzutã a majoritãtii pacientilor în raport cu efectele adverse ale HAART pe termen lung.

STI presupune pauze în tratament sub controlul viremiei. Pauzele pot fi îndelungate, în mãsura în care pacientul retine un “set point” nedetectabil al încãrcãrii virale (<500 copii ARN HIV/ml plasmã) fãrã tratament.

SIT recomandã arbitrar scheme de tratament – 7 zile cu HAART, 7 zile pauzã. Perioadele intermitente fãrã terapie ar determina reluarea replicãrii, un adevãrat booster pentru sistemul imun. Totodatã, pauzele sporesc complianta si scad costul terapiei. Rãmâne de vãzut în ce mãsurã pauzele nu cresc riscul selectiei mutantelor rezistente.

CONCLUZII

1. Standardul actual al terapiei antiretrovirale este reprezentat de politerapia divergentã de înaltã eficientã – HAART (highly active anti retroviral therapy), ce include multiple combinatii divergente de antiretrovirale, care, actionînd la niveluri diferite ale ciclului replicativ viral, permit diminuarea semnificativa si de durata a încãrcãrii virale, întarziind în acelasi timp aparitia mutantelor rezistente.

2. Pentru a aprecia eficienta diferitelor combinatii terapeutice asupra pogresiei infectiei HIV am analizat retrospectiv un lot 129 adolescenti HIV pozitivi aflati sub tratament antiretroviral cu 32 adolescenti care la initierea studiului nu intruneau criteriile de initiere a terapiei. Dupã 12 si 24 luni de urmarire, la pacientii cu imunosupresie severa si moderata, aflati sub tratament ART, s-a inregistrat o crestere a valorii medii a numarului de celule CD4/mm3 cu ~ 294 CD4/mm3 si o scadere drastica a incarcarii virale cu schimbarea ordinului de marime a numarului de copii ARN/HIV de la 105 la 104.

3. Cele mai frecvent utilizate scheme terapeutice utilizate in Romania in tratarea infectiei HIV la adolescenti supravietuitori de lunga durata, cu infectie HIV dobindita in primii ani de viata pe cale parenterala sunt:

2 INRT+1INNRT;

2INRT+1IP+RTV;

2INRT+1IP;

4. In functie de schema terapeutica utilizata am evaluat statutul de progresor al infectiei HIV. Pentru stabilirea prognosticului am luat in considerare atit criteriile imunologice, cit si cele virusologice:

copii cu prognostic rezervat – progresorii, sunt pacientii cu un numar de limfocite T CD4+ sub 200 celule/ml si incarcare virala peste 55000 copii ARN-HIV/ml,

copii cu prognostic bun – non-progresorii, sunt cei cu un numar de limfocite T CD4+ peste 200 celule/ml si incarcare virala sub 55000 copii ARN-HIV/ml.

Astfel am observat ca indiferent de tipul de terapie utilizata, non-progresorii se regasesc intr-un procent mult mai mare decat progresorii.

5. Dupa 24 de luni de monitorizare majoritatea copiilor 83.9% sunt non-progresori si doar 16.1% se incadreaza in categoria progresorilor, cu deteriorare mai accentuata a statusului clinic si virusologic. Majoritatea pacientilor din ultima categorie au inclusi inhibitori non nucleozidici de reverstranscriptaza in schema de terapie antiretrovirala

6. Utilizarea combinațiilor între agenții antiretrovirali are ca scop supresia maximă a replicării virale și reprezintă standardul de tratament. Studiul retrospectiv al eficientei diferitelor scheme terapeutice indica un beneficiu maxim al combinatiei 2INRT+1IP+RTV

7. Cel mai mare impact asupra restaurarii imunologice l-a avut schema de tratament Videx+Zerit+Kaletra, urmata de Combivir + Kaletra, acestea fiind si asocierile cu impact maxim asupra reducerii incarcarii virale.

8. Avand in vedere gradul bun de aderenta al pacientilor la tratament putem sa afirmam ca terapia 2INRT+1IP a fost cea mai eficienta atit din punct de vedere clinic cit si imunologic si virusologic.

BIBLIOGRAFIE

Cernescu C – Virusologie medicala, editura Medicala

Harrison – Principii Medicina Interna vol II, Teora, Editia 14

Zachariah R, Fitzgerald M, Does antiretroviral treatment reduce the fatality among HIV positive patients with tuberculosis in Malawi? The International journal of tuberculosis 11(8): 848-53, 2007 Aug.

Ofotokun I, Chuck SK, Hitti JE, Antiretroviral pharmacokinetic profile,a review of sex difference, Gender Medicine,4(2) :106-19, 2007 , Jun

Giambenedetto SD, Bacarelli A,Genotypic resistance to Lopinavir and Fosamprenavir with or without ritonavir of clinical isolated from patients failing protease inhibitors containing HAART regimens ,scandinavian journal of infections disease,39(9) : 813-8,2007

CleijsenRM,van de Ende ME,Therapeutic drug monitoring of HIV protease inhibitors atazanavir in clinical practice, Journal Antimicrobial Chemotherapy, 2007 17 Aug

Bracher L, Valerius NH, Long term effectiveness of HAART in perinatally HIV infected children in Denmark, Scand J Infect Disease, 2007, 39( 9) ; 799-804.

Nieuwkerk PT, Hillebrand- Haverkort ME, Quality of life after starting HAART therapy for chronic HIV-1 infection at different CD4 cells counts,J Acquir Immune Defic Syndr 2007 Aug 15, 45 ( 5):600-601.

Ruiz L, Paredes R,Gomez G, antiretroviral therapy interruption guided by CD4 cells and plasma HIV RNA levels in chronically HIV-1 infected patients, AIDS 2007 Jan 11, 21 ( 2): 169-78.

Del Mar Gutierrez M, Mateo G, Strategies in the treatment of HIV 1 associated adipose redistribution syndrome,Expert opinion Pharmacotherapy, 2007 Aug, 8( 12) : 1871-84.

Rozera G, Abbate I, Virological characterization of patients treated early is able to control HIV-1 replication after multiple cycles of structured therapy interruption J Med Virol. 2007 Aug;79(8):1047-54.

Jacobson JM, Turner BJ, Trials that matter: CD4+ T-lymphocyte count-guided interruption of antiretroviral therapy in HIV-infected patients, Ann Intern Med. 2007 May 1;146(9):682-3.

Steven G Deeks, Antiretroviral treatment of HIV infected adult BMJ 2006, June.

Eduard J, Mills, adherence to antiretroviral therapy in sub Saharian africa and North America ,JAMA, 2006, Aug.

Arvieux C, Tribut O, Amprenavir or Fosamprenavir + ritonavir in HIV infection pharmachology, efficacy and tolerability profile, Drugs, 2005, 65(5):633-59 .

Nachman SA, Lindsey JC Growth of human immunodeficiency virus-infected children HAART.
Pediatr Infect Dis J. 2005 Apr;24(4):352-7.

Ananworanich J, Siangphoe U, Hill A, Highly active antiretroviral therapy (HAART) retreatment in patients on CD4-guided therapy achieved similar virologic suppression compared with patients on continuous HAART: the HIV Netherlands Australia Thailand Research, AIDS 2005 aug 15, 39( 5):523-9.

Cardiello PG, Hassink E, A prospective, randomized trial of structured treatment interruption for patients with chronic HIV type 1 infection.
Clin Infect Dis. 2005 Feb 15;40(4):594-600.

Management of HIV –1 infection with a combination of Nevirapine, Stavudine, and Lamivudine, a preliminary report on the Nigerian antiretroviral program, Journal of aquired immune deficiency syndrome, 2005, Sept 1.

Maggielo F, Ripamonti D ,Effect of prolonged discontinuation of successful antiretroviral therapy on CD4 T cells: a controlled, prospective trial.
AIDS. 2004 Feb 20;18(3):439-46.

Boffito M, Dickenson L,Steady state pharmacokinetics of saquinavir hard gel/ritonavir/fosamprenavir in HIV –1 infected patients, Journal AIDS ,2004 Nov. 37(3):1376-84

Corbett AH, Eron JJ, The pharmacokinetics , safety and initial virologic response of a triple protease inhibitor salvage regimen containing amprenavir, saquinavir, ritonavir,Journal AIDS, 2004 Aug. 36(4):921-8.

Handforth J,Sharland M,Triple nucleoside reverse transcriptase inhibitor therapy in children.
Paediatr Drugs. 2004;6(3):147-59

Elrefaei M, McElroy MD, Central memory CD4+ T cells in chronic HIV infection are not restored by antiretroviral therapy, The Journal of Immunology,2004 173(3):2184-9.

Mocroft A, Lundgren JD, Starting highly active antiretroviral therapy why, when, and response to HAART, Journal of antimicrobial Chemotherapy, 2004 54(1):10-3.

Bocket L, Ajana F,Viget N ,Thymidine analogue mutations in antiretroviral naive HIV–1 patients on triple therapy including either zidovudine and stavudine, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 53(1): 89-94, Jan 2004.

Saag MS, Initiation of antiretroviral therapy: implications of recent findings.
Top HIV Med. 2004 Jul-Aug;12(3):83-8.

Jaafar A, Massip P, HIV therapy after treatment interruption in patients with multiple failure and more than 200 CD4+ T lymphocyte count.
J Med Virol. 2004 Sep;74(1):8-15.

Nellen JF, Wit FW, Virologic and immunologic response to highly active antiretroviral therapy in indigenous and nonindigenous HIV-1-infected patients in the Netherlands.J Acquir Immune Defic Syndr. 2004 Aug 1;36(4):943-50.

Buckingham SJ, Haddow LJ, Immune reconstitution inflammatory syndrome in HIV-infected patients with mycobacterial infections starting highly active anti-retroviral therapy.
Clin Radiol. 2004 Jun;59(6):505-13.

Brigido L, Rodriguez R, CD4+ T-cell recovery and clinical outcome in HIV-1-infected patients exposed to multiple antiretroviral regimens: partial control of viremia is associated with favorable outcome.
AIDS Patient Care STDS. 2004 Apr;18(4):189-98

Boschi A, Tinelli C, CD4+ cell-count-guided treatment interruptions in chronic HIV-infected patients with good response to highly active antiretroviral therapy.AIDS. 2004 Dec 3;18(18):2381-9.

Sabin CA, Smith CJ ,Late presenters in the era of highly active antiretroviral therapy: uptake of and responses to antiretroviral therapy.
AIDS. 2004 Nov 5;18(16):2145-51.

Mocroft A, Gatell J, Causes of death in HIV infection: the key determinant to define the clinical response to anti-HIV therapy.
AIDS. 2004 Nov 19;18(17):2333-7.

Loufty MR, Raboud JM, Predictive value of HIV-1 protease genotype and virtual phenotype on the virological response to lopinavir/ritonavir-containing salvage regimens.
Antivir Ther. 2004 Aug;9(4):595-602.

Kitchen CM, Burger H, Evolution of human immunodeficiency virus type 1 coreceptor usage during antiretroviral Therapy: a Bayesian approach.
J Virol. 2004 Oct;78(20):11296-302.

Plipat N, Ruan PK,Rapid human immunodeficiency virus decay in highly active antiretroviral therapy (HAART)-experienced children after starting mega-HAART.
J Virol. 2004 Oct;78(20):11272-5.

Hung CC, Chang SC, Impact of highly active antiretroviral therapy on incidence and management of human immunodeficiency virus-related opportunistic infections.
J Antimicrob Chemother. 2004 Nov;54(5):849-53

Raguin G, Chene G, Salvage therapy with amprenavir, lopinavir and ritonavir 200 mg/d or 400 mg/d in HIV-infected patients in virological failure.
Antivir Ther. 2004 Aug;9(4):615-25.

Gil P, Estrada V ,Long-term efficacy and safety of protease inhibitor switching to nevirapine in HIV-infected patients with undetectable virus load.
Clin Infect Dis. 2004 Oct 1;39(7):1024-9.

Johnson M, Peters B,Saquinavir/low-dose ritonavir: its use in HIV infection.AIDS Rev. 2003 Jan-Mar;5(1):44-51

Simona Ruta- Chimioterapia infectiei HIV, 2003

Cvetkovic R S, Goa KL ,Lopinavir/ritonavir a review of its use in the management of HIV infection, Drugs, 2003, 63(8):769-802

Van Rossum AM, de Groot R, Efficacy of highly active antiretroviral therapy in HIV-1 infected children.
Lancet Infect Dis. 2002 Feb;2(2):93

VeldkampA, Mulder JW, Combination of protease inhibitors for the treatment of HIV-1-infected patients: a review of pharmacokinetics and clinical experience.
Antivir Ther. 2001

Moyle GJ ,Back DPrinciples and practice of HIV-protease inhibitor pharmacoenhancement.HIV Med. 2001 Apr;2(2):105-13.

Hellinger JA, Cohen CJ Efficacy of nelfinavir in patients switched from ritonavir/saquinavir combination antiretroviral therapy.
HIV Clin Trials. 2000 Sep-Oct;1(2):25-8.

Kravcik S, Pharmacology and clinical experience with saquinavir.
Expert Opin Pharmacother. 2001 Feb;2(2):303-15

Scott LJ, Perry CM ,Delavirdine: a review of its use in HIV infection.
Drugs. 2000 Dec;60(6):1411-44.

Figgit DP, Plosker GL, Saquinavir soft-gel capsule: an updated review of its use in the management of HIV infection.
Drugs. 2000 Aug;60(2):481-516.