Efectul Unor Extracte Vegetale Asupra Tulipinilor Fungice Izolate din Aeromicroflora

Agronomie

Efectul Unor Extracte Vegetale Asupra Tulipinilor Fungice Izolate din Aeromicroflora

Byadmin ianuarie 1, 2024

BIBLIOGRAFIE

Atlas, R. M., Diversity of microbial communities. În: Advances in microbial ecology, vol. 7 (Marshall, K. C., ed). [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], 1984, pp. 1-47.

Antoce A-O., Dinu L-D., Microbiologie – principii si tehnici de laborator, Ed. Ceres, 2002.

Bowen, G. D., ROVIRA, A. D., Microbial colonization of plant roots. Ann. Rev. Phytopathol 14, 1976, pp. 121-144.

Brock, T. D., Biology of microorganisms. Prentice-Hall, Inc., [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], 1974.

Daws L. F., Movement of air streams indoors. 17th Simposium of the society for general microbiology „Airborne microbes” (Gregory, P. H., Moneteith, J. L. Eds.), Cambridge, Univ. Press., 1967, pp. 31-56.

Hirst, J. M., Hursth, G. W., Long-distance spore transport. 17th Symposium of the Society for [NUME_REDACTAT] „Airborne microbes” (Gregory, P. H., Monteith, J. L., eds.), Cambridge, Univ. Press., Londra, 1967, pp. 307-344.

Ingold, C. T., Liberation mechanisms of fungi. 17th Symposium of the Society for [NUME_REDACTAT] „Airborne microbes” (Gregory, P. H., Monteith, J. L., eds.), Cambridge, Univ. Press., Londra, 1967, pp. 102-115.

Madigan M. T., Martinko J. M., Parker J., „[NUME_REDACTAT] of Microorganisms, Ed. Prentice-Hall, A IX-a, 2000, pp. 1-29.

Mănescu S., Microbiologie sanitară, Ed. Medicală, București, 1989, pp. 30-42.

Zarnea G., Tratat de [NUME_REDACTAT], Ed. Academiei, vol.5, București, 1994, pp. 558-575.

Zarnea G., Tratat de [NUME_REDACTAT], vol. 5, Ed. [NUME_REDACTAT], 1994, pp. 578-589.

Mojica B. 1998. Topic: Airborne pathogens. J. Urban. Health. 75:506-507. doi: 10.1007/BF0242769.

Sattler B, Puxbaum H, Psenner R. 2001. Bacterial growth in supercooled cloud droplets. Geophys. Res. Lett. 28:239. doi: 10.1029/2000GL011684.

Bauer H, Giebl H, Hitzenberger R, Kasper-Giebl A, Reischl G, Zibuschka F, Puxbaum H. 2003. Airborne bacteria as cloud condensation nuclei. J. Geophys. Res. 108:4658. doi: 10.1029/2003JD003545.

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Aeromicrobiology

www.discovermagazine.com

http://www.plante-medicinale

http://www.frunza-verde.ro/scortisoara

LUCRARE DE LICENȚĂ

EFECTUL UNOR EXTRACTE VEGETALE ASUPRA TULPINILOR FUNGICE IZOLATE DIN AEROMICROFLORA

Pag.

INTRODUCERE

Atmosfera este un mediu favorabil pentru supraviețuirea temporară a microorganismelor, care adesea în rezistă in stare latentă. Troposfera inferioară prezintă unele zone cu straturi dense de nori și favorizează prin umiditatea lor dezvoltarea microorganismelor [Zarnea, 1994].

Conceptul de „nori” microbieni este un concept nou. ,,Norii ’’microbieni pot cuprinde diferite categorii de microorganisme precum bacterii,fungi,protozoare dar si spori de criptogame si grauncioare de polen. Compoziția „norilor” microbieni este expusă permanent unor modificări cantitative și calitative determinate de particularitățile mediului fizic local. Determinările numerice și calitative se fac fie prin examinarea microorganismelor dezvoltate pe medii de cultură solidificate expuse aerului atmosferic, fie prin dispozitive speciale prevăzute cu filtre de membrană, bazate pe aspirația unui volum cunoscut de aer. Atât gravitația, cât și curenții de aer favorizează depunerea particulelor mai grele. Numeroase virusuri și microorganismele patogene care afectează căile respiratorii pot fi răspândite astfel prin intermediul aerului. Organismul uman dispune de mecanisme de îndepărtare a microorganismelor pătrunse pe caile respiratorii [Mănescu, 1989].

„Norii” de microorganisme din spațiile interioare provin, în mare măsură, de la exterior, prin interschimbul dintre atmosfera externă și aerul din camere cu care se amestecă. „Norii” de microorganisme sunt recirculați în spațiile interioare și dacă nu sunt reînnoiți continuu, concentrația lor scade progresiv ca rezultat al ventilației, al sedimentării și al morții. În absența agitației și a ocupanților unei încăperi, bacteriile sedimentează mai repede decât sporii fungici, deoarece, spre deosebire de aceștia, care „inoată” liber, sunt aderente de diferite particule sau substanțe reziduale [Zarnea, 1994]. O importanță deosebită revine unor bacterii patogene (Mycobacterium tuberculosis), care pot rămâne perioade îndelungate în stare viabilă, reprezentând un risc de contaminare [Mojica, 1998].

Inca din antichitate se cunoaste ca extractele si uleiurile vegetale au efect antimicrobian. Multe secole au fost folosite pe scara larga în medicina traditionala asa numitele extracte galenice: infuzii, decocturi, tincturi si extracte fluide, moi sau uscate obtinute din plante, preparate clasice care au cunoscut o mare popularitate.

De exemplu, Extractul de seminte de grapefruit (ESG) are proprietățile antifungice care ajută la combaterea infecției fungice prin distrugerea celulelor care au invadat intestinul. Substanțele active din extract, distrug membrana citoplasmatică a microbilor patogeni și prin aceasta pur și simplu îi înfometează, fără a dăuna organismului uman. După procesul metabolic, acest extract se transformă în organismul nostru într-o substanță alcalină, care distruge virușii, bacteriile, fungii și paraziții pe cale naturală ESG este un puternic antiseptic, are efect antiviral si antifungic, are proprietati anticancerigene, favorizeaza vindecarea ranilor si cicatrizarea datorita substantei naringen, are proprietatea de a scadea colesterolul, ajuta la prevenirea recurentei unor infectii precum cele de la nivelul unghiilor si cele cu Candida sp. si are rol de intaritor al imunitatii.

Extractul de menta contine un ulei volatil numit mentol, relaxeaza spasmele intestinale, calmeaza durerile abdominale si actioneaza ca decongestionant si calmant in aplicare topica. In plus, flavonoidele din extract au proprietati antivirale si antioxidante. Mecanismul propus in acest caz este reprezentat de actiunea terpenoizilor asupra celulei microbiene pe care o distruge.

Uleiul esential de scortisoara stimuleaza memoria, incetineste scaderea parului si ne ajuta sa scapam de kilogramele in plus (scortisoara este unul din alimentele cele mai bogate in antioxidanti) si ne mentine tineretea, ne combate stresul. Recent s-a descoperit faptul ca scortisoara echilibreaza glicemia stimuland insulina si joaca un rol important in prevenirea diabetului. In plus, scortisoara este foarte cunoscuta pentru proprietatile sale antivirale si antimicrobiene si pentru ca stimuleaza functionarea sistemului imunitar. La nivel de laborator s-a dovedit ca acest ulei determina o “ardere” a celulelor fungice si distrugerea acestora.

Uleiul esential din arborele de ceai ([NUME_REDACTAT]) este un ulei esential extras din frunzele plantei Malaleuca alterniforia (arborele de ceai), o planta originara din Australia. In fitoterapie sunt utilizate frunzele si ramurile tinere. Cel mai des se foloseste in scop medicinal uleiul volatil, care se gaseste in frunzele plantei. Frunzele sunt bogate in terpineol, cineol, pinen, terpinen. Uleiul de arbore de ceai are proprietati antiseptice si este folosit ca tratament adjuvant in tratarea ranilor si prevenirea infectarii lor. Au fost realizate foarte multe studii de laborator care au dovedit actiunile antiseptice, antimicrobiene, antifungice ale acestui ulei mai ales in ceea ce priveste combaterea infectiilor fungice, acneei sau infectiilor vaginale. Uleiul se utilizeaza de obicei diluat si nu se recomanda administrarea orala deoarece poate fi toxic.

Extractul din Echinaceae, este extras din plantece apartin genului Echinacea sp., (Echinacea angustifolia, Echinacea pallida și Echinacea purpurea) si este folosit la cresterea imunitatii si reducerea duratei infectiilor respiratorii superioare (faringita, laringita, amigdalita, rinosinuzita). Aceste actiuni sunt dovedite de studii stiintifice care utilizeaza diferite parti ale plantei (radacina, flori, frunze). Efectele benefice ale acestei plante se datorează conținutului său bogat în fenoli, alchilamide, polizaharide și uleiuri volatile

Extractul de brusture prezinta actiune antimicrobiana si antimicotica, coleretica si tonic-amara, laxativa, diuretica si diaforetica (depurativa), antitumorala. [NUME_REDACTAT] radix contine: lignani, in principal arctiozida (arctiina) sau arctigenolglucozida; 45% inulina; 10 – 15% poliene si poliine sulfurate, cu structura liniara (arctinol, arctinal, acid arctic, arctinona) sau ciclica (lappafen A), formate prin aditia arctinalului pe o lactona guaianolidica; principii amare; acizi polifenolcarboxilici; esteri cafeil-chinici; lipide; steroli; pectine; ulei volatil; acizi organici; saruri minerale. Alaturi de lignani (arctiozida), in frunze au mai fost identificate principii amare de tip lactone sescviterpenice cu structura germacranica (arctiopicrina).

Prezenta lucrare este structurată în două părți:

partea teoretica prezinta un sumar al cercetarilor referitoare la microorganismele existente in atmosfera si efectul unor extracte si uleiuri esentiale vegetale cu proprietati antifungice;

partea practica s-au recoltat tulpini fungice prezente in aeromicroflora si s-au testat efectul unor extracte hidroalcoolice si uleiuri esentiale vegetale (tinctura hidro-alcoolico-glicolica de propolis, extract hidroalcoolic de brusture, ulei esential de Tea tree, extract vegetal de usturoi si extract hidroalcoolic de echinacea asupra tulpinilor fungice selectate.

CAPITOLUL I – ATMOSFERĂ, HABITAT ȘI MEDIU PENTRU MICROORGANISME ÎN NATURĂ

1.1.Raspandirea microorganismelor prin intermediul „norilor microbieni’’

Microorganismele din aer provin în cea mai mare măsură din natură. La acestea se adăugă microorganismele provenite de la oameni și/sau animale. Frecvența și natura microorganismelor depinde de locul unde le urmărim prezenta. Astfel, în locurile slab populate, vor domina microorganismele provenite din natură, însă în zonele în care există colectivități omenești organizate, structura și densitatea florei microbiene din aer se schimbă [Madigan, 2000].

Deoarece atmosfera nu este un mediu favorabil pentru creșterea și dezvoltarea microorganismelor, majoritatea mor rapid iar cele care supraviețuiesc perioade îndelungate de timp rezistă sub formă de spori. Cu toate acestea, în troposfera inferioară sunt prezente numeroase microorganisme, unde există condiții favorabile pentru dispersarea lor datorită curenților de aer, microorganisme care provin din mediile terestre și acvatice. Unele localizări temporare în troposfera pot fi considerate ca și habitate pentru microorgansime [Sattler, 2001]. Astfel, după Atlas et al. (1987), dezvoltarea microorganismelor care pot profita de o intensitate adecvată a luminii, de prezența CO2 și a nutrienților minerali din nucleii de condensare este favorizată, prin umiditatea lor, de anumite zone cu straturi dense de nori [Hirst, 1967]. Teoretic, în în atmosferă din anumite zone industriale se regăsesc suficiente concentrații cu substanțe organice care ar putea permite creșterea heterotrofelor.

Anumite particularități ale microorganismelor favorizează supraviețuirea și dispersarea lor în atmosfera precum:

existența formelor de rezistență, îndeosebi spori ,capabili de supraviețuire pe termen îndelungat, fără consum de nutrienți, deci fără activități metabolice;

dimensiuni mici și densitate mică;

existența unor pereți celulari groși protectori;

numărul mare se spori eliminați în aer în unele cazuri, de un singur corp fructifer fungic;

existența pigmenților protectori fața de radiațiile solare;

S-a demonstrat experimental că tulpinile sălbatice de Micrococcus luteus care conțin pigment galben sunt rezistente la lumină, mutantele fiind omorâte prin procesul de fotooxidare care necesită O2, în timp ce mutantele de Helobacterium salinarium, care nu conțin caroten sunt mai sensibile decât celulele pigmentate [Zarnea, 1994].

Existența unor forme aerodinamice, care favorizează circulația laterală a vacuolelor cu gaze,etc.

Există însă și condiții care limitează supraviețuirea și dispersarea microorganismelor în atmosfera după cum urmează:

Cantitatea redusă de apă;

Scăderea progresivă a temperaturii cu înălțimea sub limita de toleranță a microorganismelor(-43o – 83oC în stratul superior al troposferei);

Concentrația mică a carbonului organic pentru heterotrofe;

Scăderea progresivă a oxigenului,care nu este compatibilă cu viața microorganismelor aerobe;

Efectul mutagen sau letal al radiațiilor [Zarnea, 1994] (Figura 1).

Figura 1. Ciclul de viata al microorganismelor in natura

(Sursa: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Aeromicrobiology)

Cu toate aceste condiții care limitează supraviețuirea și dispersarea microorganismelor în atmosferă, totuși atmosfera este considerată ca fiind mediul natural cu importanță majoră în difuzarea microorganismelor între diferite ecosisteme din hidro- sau litoecosfera [Ingold, 1967]. Cercetările lui Proktor și Parker din anul 1938 au demostrat că până la 5000m înălțime se găsesc atât bacterii precum Bacillus subtilis, Bacillus albolactis cât și fungi Penicillium globrum, Penicillium lanosum. În anul 1942, Zahell et al. a pus în evidență prezenta bacteriilor și fungilor până la 740km de coastă deasupra mării. Mai târziu, în anul 1964, Green și colaboratorii săi au găsit la altitudinea de 27.500 m înălțime, în special fungi din genurile: Alternaria, Aspergillus și Cladosporium.

Microbi sunt cele mai de succes tipuri de viață pe Pământ, datorită capacității lor de a se adapta la medii noi, de a se reproduce rapid, și dispersa la nivel global. Aceasta notiunea de „nori ’’microbieni ca o componenta normala a atmosferei externe dar si a celei interioare este una relativ noua [Bauer, 2003]. Ideea existentei unor mici particule daunatoare care sunt purtate de vant, exista dinaintea descoperii microorganismelor de catre Leeuwenhoek (1675).

Dispersarea are loc prin intermediul unui număr mare de vectori, dar transportul prin intermediul vantului este cel mai comun mod de raspandire al microorganismelor. Vântul este responsabil pentru ridicarea celor mai multi microbi atmosferice din teren sau surse oceanice, dar este dificil să se determine exact modul in care celulele devin și rămân in aer. Aerogeologii au identificat o varietate de posibile mecanisme de ridicare a microorganismelor in atmosfera precum acțiunea valurilor de la suprafata oceanului, poluarea de la incendiile multe altele [Daws, 1967].

,,Norii ’’microbieni pot cuprinde diferite categorii de microorganisme precum bacterii, fungi, protozoare dar si spori de criptogame si grauncioare de polen. Structura lor sufera permanent modificari calitative si cantitative determinate de:

Particularitatile mediului fizic local;

Clima si anotimpul;

Vegetatia adiacenta;

Activitatile umane si ale animalelor;

Aportul de noi microorganisme;

Transportul la distanta;

Pierdere prin sedimentare sau prin moarte (Figura 2).

Astfel, determinarile numerice si calitative se realizeaza fie prin dispozitive speciale prevazute cu filtre de membrana, bazate pe aspiratia unui volum cunoscut de aer, fie prin examinarea microorganismelor dezvoltate medii de cultura solidificate care au fost expuse in prealabil la aer.

Figura 2. Ciclul bacteriilor din aerosoli

(Sursa: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Aeromicrobiology)

„Norii microbieni de zi” contin spori de Cladosporium sp., multi spori deshidratati de fungi imperfecti, uredospori ai mucegaiurilor de putregai si altele. Acestora li se adauga cantitati mari de polen de la arbori, plante ierboase sau buruieni, in functie de anotimp.

Noaptea, sporii „de zi” dispar si sunt inlocuiti de ”sporii de noapte” formati din cantitati enorme de Sporobolomyces sp. si Tilletiopsis sp.,de basidiospori de ciuperci cu palarie si sporii unor tipuri de actinomicete. Cand se face ziua, sporii de noapte dispar, fiind inlocuiti treptat cu cei de zi [Zarnea, 1994].

La inaltimea de 690m, sporii bacterieni si fungici sunt in numar egal, in timp ce la 1600m si 3127m, 90% din sporii capturati sunt bacterieni [Daws, 1967].

Norii de microorganisme din spatiile inchise provin in mare masura de la exterior, prin interschimbul dintre atmosfera externa si cea interna – reprezentantii unor microorganisme cu origine intramurala (Figura 3). Norii de microorganisme sunt recirculati in spatiile interioare si daca nu sunt reinnoiti continuu, concentratia lor scade rezultat al ventilatiei, al sedimentarii si al mortii (Figura 4).

Figura 2. Microflora (bacterii si fungi) caracteristica spatiilor interioare

(Sursa: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Aeromicrobiology)

Figura 3. Tipuri de microorganimse prezente in spatiile interioare in functie de originea lor: microorganisme din microbiota omului, microorganisme din sol si microorganisme asociate cu produsele alimentare

(Sursa: www.discovermagazine.com)

Multe microorganisme diferite pot fi sub formă de aerosoli în atmosferă, inclusiv virusuri, bacterii, fungi, drojdii și protozoare. Pentru a supraviețui în atmosferă, este important ca acesti microbi sa se adapteze la unele dintre caracteristicile climatice aspre ale lumii exterioare, incluzând temperatura, gaze și umiditate [Sattler, 2001]. Multe dintre microorganismele care sunt capabile să supraviețuiască condițiilor dure pot forma ușor endospori, care poate rezista la condiții extreme extreme [Zarnea,1994].

1.2.Viabilitatea si supravietuirea microorganismelor

Microorganismele pot fi intalnite virtual in orice mediu natural de pe Pamant, insa in anumite medii acestea pot fi expuse unor conditii de stres precum:

insuficienta sau lipsa de nutrienti intalnita in mediile acvatice, in sol, cu toate ca acesta este considerat un mediu bogat in nutrienti o mare parte din substantele organice sunt deosebit de stabile;

uscaciunea, respectiv lipsa apei necesare pentru desfasurarea activitatilor metabolice [Bauer, 2003].

In general, fungii sufera mai putin decat bacteriile din cauza lipsei apei;

variatii in concentratia O2 in liniile neadecvate tipului respirator al microorganismelor date;

oscilatii ale valorilor de pH dincolo de limitele fiziologice admise.

[NUME_REDACTAT] (1976), in prezenta unor factori de stres pot actiona o serie de mecanisme, cu rolul de a asigura viabilitatea si supravietuirea lor, in special, in cazul microorganismelor din sol. Dintre aceste mecanisme sunt de mentionat:

incetinirea ritmului de multiplicare si mentinerea unei populatii mult mai diminuata de crestere;

starea de latenta;

aparitia de forme vegetative de rezistenta capabile sa supravietuiasca fara sa creasca [Zarnea,1994].

Termenul de viabilitate a microorganismelor este definit diferit din punctul de vedere a mai multor cercetatori importanti.

Astfel, Valentine si Bradfield (1954) deosebesc bacteriile viabile, respectiv bacteriile capabile de a forma colonii dupa multiplicare, de cele vii, care respira si sunt mobile. Definitia este confuza pentru ca s-ar putea crede ca bacteriile viabile nu sunt vii.

Postgate (1969) defineste viabilitatea ca fiind proprietatea unei parti din populatia de microorganisme capabile de multiplicare atunci cand i se asigura „conditii optime de crestere” [Madigan, 2000].

Roszak si Colwell (1987) definesc viabilitatea in raport cu procesul de diviziune, respectiv cu capacitatea de a forma cel putin doua celule-surori cand o bacterie este depusa intr-un mediu favorabil.

Cu ajutorul unor tehnici autoradiografice, Hoppe (1978) a demonstrat ca microorganismele ce predomina in regiunile de coasta marine sunt reprezentate de bacterii care metabolizeaza activ, dar care nu formeaza colonii pe mediile uzuale cu agar (microorganisme viabile dar non-cultivabile VBNC). Se considera ca existenta lor poate fi apreciata numai prin tehnica numarului total de bacterii care metabolizeaza activ [Madigan, 2000].

Un procent greu de apreciat dintre aceste bacterii corespund, dupa Postgate unei stari tranzitorii intre viabilitate si moarte care sunt inca functionale,xdar nu se mai pot multiplica.

Studiile au demonstrat experimental ca dintr-o populatie a bacteriei Klebsiella aerogenes mentinuta infometata, in solutie tampon nenutritiv, dupa 24 de ore, 20% din celule erau viabile (produceau prin multiplicare colonii), in timp ce restul de 80% erau intacte, raspundeau la modificari in compozitia si variatiile de concentratie ale substantelor din mediu, sugerand ca sunt viabile, dar necultivabile. Ca urmare, Postgate le considera bacterii „pseudosenescente” pentru ca au pierdut capacitatea de a se multiplica ca urmare a expunerii la stres [Zarnea, 1994].

Supravietuirea microorganismelor, dupa Morita (1980), este caracterizata ca si mentinere a viabilitatii in circumstante adverse, astfel incat microorganismul supravietuitor, ori de cate ori mediul redevine favorabil acestor procese, se poate manifesta prin reluarea activitatilor metabolice,a cresterii si inmultirii [Brock, 1974].

Pentru a supravietui, microorganismele recurg la mai multe strategii:

pot deveni temporar necultivabile pe medii conventionale, inactive, dar viabile;

utilizeaza cantitati minime de substrat pentru o crestere lenta;

trec in stare de latenta [Mojica, 1998].

Desi raportul suprafata/volum al hifelor fungice este mai putin favorabil pentru crestere decat cel al unei cantitati echivalente de microorganisme unicelulare, fungii au avantajul ca se extind pe suprafete considerabile. In aceste conditii, ei nu sunt pe toata lungimea hifelor in regiuni complet nefavorabile pentru crestere. Ca urmare, supravietuirea poate fi asigurata prin crestere locala, iar un alt factor favorizant pentru supravietuire este viteza redusa de crestere. Un alt avantaj decurge din posibilitatea agregarii hifelor pentru a forma filamente plurihifale sau rizomorfe complexe,adesea diferentiate. In acest caz, hifele externe exercita o functie protectoare pentru cele interne. In aceste conditii, daca cresterea fungilor are ca punct de plecare o regiune bogata in nutrienti, hifele pot circula pe distante foarte mari, printr-un sol complet lipsit de orice substrat nutritiv, pana cand intalnesc o noua regiune favorabila pentru crestere [Zarnea, 1994].

Garret (1956) a semnalat capacitatea fungilor patogeni, care ataca radacinile plantelor, de a creste saprofit, in absenta gazdei si de a trece rapid de la parazitism la un mod de viata saprofit, supravietuind indelungat prin colonizarea substantelor neanimate. Ei realizeaza acest fenomen printr-un raspuns complex care implica:

raspunsul rapid al propagulelor fungice latente si cresterea rapida dupa expunere la nutrienti solubili care difuzeaza din substrat;

elaborarea unei game largi de enzime capabile sa atace, in special, resturile vegetale rezistente;

producerea de antibiotice si alti compusi, care afecteaza microorganismele din sol;

toleranta fata de compusii nocivi elaborati de alte microorganisme din sol.

Termenul de latenta este folosit cu un grad important de ambiguitate,desi este evident ca in anumite medii naturale, pe langa microorganismele moarte, datorita conditiilor nefavorabile,un anumit procent sufera modificari metabolice importante care le permit sa supravietuiasca acestor conditii,uneori,perioade indelungate [Zarnea, 1994].

Microorganismele pot prezenta o stare de hipobioza in cursul careia supravietuiesc in absenta nutrientilor, stare in care au o rezistenta mai mare la actiunea agentilor letali. aceasta stare a fost indusa experimental prin expunerea la temperaturi scazute, lipsa de O2, deshidratare, expunere la concentratii mari de saruri sau combinatii ale acestora si mai ales la conditii ce simuleaza particularitatile mediului marin abisal [Zarnea, 1994].

Keilin (1959) a propus denumirea de „criptobioza” pentru a caracteriza starea unui organism a carui activitate metabolica devine greu masurabila,fara a prezenta semne vizibile de viata, datorita unei stari de latenta reversibila [Zarnea, 1994].

[NUME_REDACTAT] (1959), starea de hipobioza poate fi de 2 tipuri:

latenta in cursul careia activitatea metabolica este foarte mult redusa,dar inca detectabila

criptobioza,stare similara mortii,in cursul careia activitatea metabolica este absenta sau nedetectabila,desi organismele sunt departe de a fi moarte. Ea este intalnita in cazul sporilor bacterieni si fungici.

Susmann si Halvorson (1966), definesc latenta ca o intrerupere reversibila a dezvoltarii microorganismelor datorita diminuarii activitatilor lor metabolice,ca o necesitate primordiala pentru a asigura,spre exemplu,supravietuirea la infometare [Zarnea, 1994].

Starea de latenta explica discrepanta dintre numarul microorganismelor observate direct la microscop si numarul mic apreciat prin tehnicile de cultivare.Aceasta pentru ca nu toate microorganismele latente reusesc sa se adapteze la mediile bogate utilizate in laborator [Zarnea, 1994].

1.3.Longevitatea sporilor fungici in atmosfera

Cele mai multe date referitoare la durata viabilitatii sporilor bacterieni si fungici sunt relativ vechi si destul de contradictorii. In conditii controlate de laborator, durata maxima inregistrata difera in functie de natura microorganismelor si de conditiile de mediu. Astfel, durata de viata pentru Bacillus antharacis este de 47 de ani si de 75 de ani la Hemitrichia clavata (Tabel 1).

Sneath (1962) citeaza cazul unor spori de bacili termofili conservati timp de 118 ani in liofilizate. Date mai vechi, care mentionau izolarea de spori viabili din roci sau in depozite de carbuni din precambrian, sunt, in prezent, considerate ca bazate pe tehnici gresite [Zarnea, 1994].

Tabel 1. Longevitatea unor spori si forme vegetative si conditiile in care pot supravietui

(dupa Zarnea G., Tratat de [NUME_REDACTAT], vol. 5)

CAPITOLUL II – Extracte vegetale si plante cu efect antifungic

Activitatea antimicrobiană a extractelor naturale și a componentelor lor bioactive purificate poate fi determinată pe baza observării și cuantificării dezvoltării microbiene consecutiv aducerii în contact a microorganismelor cu agenții cu potențial antimicrobian. În literatura de specialitate sunt descrise mai multe metode și tehnici de evaluare și certificare a acestui potențial, dar din păcate sensibilitatea lor nu este constantă și comparabilă. Nu există un protocol standardizat de screening antimicrobian, doar numeroase variante (tehnici preluate și modificate în condițiile de lucru date). Din acest motiv, rezultatele sunt influențate în mod categoric de metoda aleasă [Atlas, 1984].

Extractele vegetale sunt utilizate inca din secolul al II-lea, Galenus mentioneaza astfel de preparate care contin principii active din produse naturale, separate pe cât posibil prin extractie, de componentele inerte. Multe secole au fost folosite pe scara larga în medicina asa numitele extracte galenice: infuzii, decocturi, tincturi si extracte fluide, moi sau uscate obtinute din plante, preparate clasice care au cunoscut o mare popularitate [Atlas, 1984].
Folosirea extractelor din plante ca o formă alternativă in tratamentului micozelor în general și al candidozelor, în special, s-a bucurat de o popularitate din ce în ce mai mare începând cu anii 1990 [Madigan, 2000]. Datele de literatură au demonstrat că există relații direct proporționale între tipul și concentrația compușilor fenolici (de tip acid fenolic, procianidine, flavonoide sau taninuri) din plantele medicinale și acțiunea antimicrobiană a acestor plante [Atlas, 1984]. Acești compuși sunt sintetizați de plante în scop de apărare față de dăunători microscopici (mucegaiuri sau virusuri) sau macroscopici (insecte). Mecanismul de acțiune implică biosinteza unor elicitori (molecule de apărare imună și toxine sintetizate, cu efect letal asupra dăunătorilor.

2.1. Uleiul esential din arborele de ceai

Malaleuca alternifolia (arborele de ceai) este o specie recunoscută pentru proprietățile antimicrobiene deoarece produce un ulei volatil (tea tree oil) bogat în terpineol, terpinen și cineol, cu spectru larg de acțiune (Figura 5). Arbust inalt, original din Australia, face parte din familia Myrtaceae si este inrudit cu eucaliptul. Este o planta de cultura, ce prefera zonele mlastinoase din [NUME_REDACTAT] Wales sau cele din apropierea apelor. Frunzele au culoare verde intens si sunt alungite. Florile sunt de culoare alba, iar fructele sale sunt lemnoase, rotunde si mici (2 – 3 mm diametru).

In fitoterapie sunt utilizate frunzele si ramurile tinere. Cel mai des se foloseste in scop medicinal uleiul volatil, care se gaseste in frunzele plantei. Frunzele sunt bogate in terpineol, cineol, pinen, terpinen. Arborele de ceai are urmatoarele proprietati: antimicrobian, antimicotic, antiseptic, detoxifiant, usor antiinflamator si analgezic.

S-a raportat faptul ca frunzele din arborele de ceai contin cateva flavonoide care distrug membrana microbiana si au efect anticancerigen. In plus, Yassien et al. (2010) si Doddana et al. (2013) au dovedit efectul inhibitor al acestui extract asupra dezvoltarii fungului Candida albicans [Bowen, 1976].

Figura 5. Ulei esential de Tee tree

2.2. Extractul de brusture

Arctium lappa (brusture) este o plantă erbacee bienală din familia Asteraceae, cultivată în grădini pentru rădăcinile sale comestibile sau întâlnită frecvent ca buruiană. Extractul si tinctura de brusture (Figura 6) prezinta actiune antimicrobiana si antimicotica, coleretica si tonic-amara, laxativa, diuretica si diaforetica (depurativa), antitumorala.

Figura 6. Extract si ulei de brusture

[NUME_REDACTAT] radix contine: lignani, in principal arctiozida (arctiina) sau arctigenolglucozida; 45% inulina; 10 – 15% poliene si poliine sulfurate, cu structura liniara (arctinol, arctinal, acid arctic, arctinona) sau ciclica (lappafen A), formate prin aditia arctinalului pe o lactona guaianolidica; principii amare; acizi polifenolcarboxilici; esteri cafeil-chinici; lipide; steroli; pectine; ulei volatil; acizi organici; saruri minerale. Alaturi de lignani (arctiozida), in frunze au mai fost identificate principii amare de tip lactone sescviterpenice cu structura germacranica (arctiopicrina).

2.3. Extractul din [NUME_REDACTAT] sp. este o planta care in prezent este folosita pentru cresterea imunitatii si reducerea duratei infectiilor respiratorii superioare (faringita, laringita, amigdalita, rinosinuzita). Aceste actiuni sunt dovedite de studii stiintifice asupra diferitelor parti ale plantei (radacina, flori, frunze). Efectele benefice ale acestei plante se datorează conținutului său bogat în fenoli, alchilamide, polizaharide și uleiuri volatile. În prezent, în scopuri terapeutice, se folosesc 3 specii de Echinacea: Echinacea angustifolia, Echinacea pallida și Echinacea purpurea. Produsele pe bază de Echinacea sunt disponibile sub diverse forme farmaceutice (extracte, tincturi, comprimate, capsule, unguente), în compoziție unică sau în combinație cu alte plante, vitamine și minerale (Figura 7).

Figura 7. Extract de Echinacea

2.4. Extractul de cuisoare

Caryophyllus aromaticus (arborele ce produce cunoscutele „cuisoare”) este renumit pentru uleiul volatil bogat în eugenol cu certe proprietăți antibacteriene și antifungice (Figura 8). Pe piață exista produsul Sporyl ([NUME_REDACTAT] AG, Austria) destinat tratamentului dermatofitozelor la animale.

Figura 8. Ulei eteric de cuisoare

2.5. Extract din seminte de grapefruit (ESG)

ESG se produce prin amestecarea semințelor de grapefruit și pastă într-un lichid gros, foarte acid. După o prelucrare ulterioară, rămâne un lichid galben, vâscos, care are un gust amar puternic. De obicei, acesta este amestecat cu glicerină vegetală pentru a reduce gustul amar și aciditatea. Extractul din semințe de grapefruit este vândut fie sub formă de concentrat lichid sau sub formă de tablete (Figura 9). Ambele conțin glicerină vegetală, dar tabletele vor conține, de asemenea, o cantitate mică de umplutură, cum ar fi proteina de orez brun organic, care este recomandata in dietă anti-Candida. Extractul din semințe de grapefruit se poate folosi atât în uz intern cât și în uz extern.

Proprietățile antifungice a ESG ajută la combaterea infecției fungice prin distrugerea celulelor care au invadat intestinul. Substanțele active din extract, distrug membrana citoplasmatică a microbilor patogeni și prin aceasta pur și simplu îi înfometează, fără a dăuna organismului uman. După procesul metabolic, acest extract se transformă în organismul nostru într-o substanță alcalină, care distruge virușii, bacteriile, fungii și paraziții pe cale naturală.

Semințele de grapefruit conțin, de asemenea, o serie de substanțe chimice importante – vitaminele C si E, bioflavonoide – care poate ajuta la repararea celulelor afectate de infectie. Un bioflavanoid special, numit hesperedin, poate da un impuls natural pentru sistemul imun. Aciditatea naturală a extractului ajuta sistemul imun, prin restabilirea pH-ului natural a stomacului (aceasta poate deveni frecvent prea alcalin în timpul unei infecții cu Candida sp.). S-a mai constatat pentru probleme digestive ca la administrarea extractului de semințe de grapefruit acesta pastreaza bacteriile benefice din organismului, comparativ cu alte tratamente antimicrobiene, care pot lăsa intestinul gol de aceste organisme utile.

Extractul de grapefruit contine o multime de compusi cu efect antibacterian si antifungic, dar si antioxidanti care lupta cu radicalii liberi. Acesti compusi se numesc bioflavonoide, iar dintre acestea, din extractul de grapefruit se remarca hespedrin-ul, un stimulator natural al sistemului imunitar. Analiza chimica a extractului de grapefruit indica si un continut important de vitamina C, sterol, tocoferol, acid citric, liminoide si minerale. Dar beneficiile cele mai importante constau in efectul anticancerigen. De asemenea, un studiu realizat recent de microbiologii de la [NUME_REDACTAT] a aratat ca extractul din seminte de grapefruit este un dezinfectant la fel de eficient precum dezinfectantele cu potential toxic pentru oameni, animale si pentru mediu. Studiul a pus in evidenta si faptul ca extractul de grapefruit are un spectru larg de activitate fiind antiviral, antimicotic si antiprotozor, eficient inclusiv asupra bacteriei E. coli. Eficienta extractului este comparabila cu aceea a sapunului special folosit de chirurgi inainte de a intra in operatii [Bowen 1976].

Un alt studiu, publicat in [NUME_REDACTAT] of Alternative and [NUME_REDACTAT] sustine ca extractul de seminte de grapefruit este eficient in anihilarea a peste 800 de tulpini de bacterii, 100 de tulpini de fungi si asupra mai multor tipuri de paraziti. Nicio alta substanta naturala nu are un efect similar [Bowen, 1976].

Figura 9. Extract din seminte de grapefruit

Literatura de specialitate aminteste urmatoarele propriteati ale extractului de seminte de grapefruit: este un puternic antiseptic, are efect antiviral si antifungic, are proprietati anticancerigene, favorizeaza vindecarea ranilor si cicatrizarea datorita substantei naringen, are proprietatea de a scadea colesterolul, ajuta la prevenirea recurentei unor infectii precum cele de la nivelul unghiilor si cele cu Candida sp. si are rol de intaritor al imunitatii [xxx].
Rezultatele recentelor cercetări au arătat că acest produs poate fi o nouă modalitate naturală și eficientă pentru dezinfecție: pentru secțiile de boli infecțioase ale spitalelor, în sălile de operație, dezinfectarea apei potabile, dezinfectarea apei din bazine, în industria alimentară. Substanțele active ale extractului, se descompun natural, rapid și fără produși secundari toxici, astfel nu dăunează mediului înconjurător.

Studiul publicat în anul 1990 in Journal of [NUME_REDACTAT] asupra de extractului din semințe de grapefruit (ESG) a demonstrat că ESG este "extrem de eficient împotriva diferitelor drojdii și mucegaiuri (Candida sp., Geotrichum sp., Aspergillus sp. și PeniciIlium sp.) [Madigan, 2000].

2.6. Ceapa si usturoiul

Allium cepa este originara din regiunile de stepa ale Asiei centrale, aceasta a fost intrebuintata in alimentatie de timpuriu in Egiptul antic si in [NUME_REDACTAT], fiind astfel una dintre cele mai vechi plante de cultura. Proprietatile sale reies, asa cum era de asteptat, din compozitia chimica a plantei si din reactiile care au loc la nivelul sistemului digestiv detinut de organismul uman. Valoarea nutritiva este reflectata de continutul sporit de vitamina A, vitamina B, vitamina C, calciu, fosfor, potasiu, carbohidrati, proteine si calorii. Chiar daca are o concentratie mai mica de compusi ai sulfului comparativ cu usturoiul, ceapa prezinta efecte antibacteriene si antifungice. Printre bacteriile importante combatute de ceapa se numara Bacillus subtilis si Salmonella sp. [Bowen 1976].

Allium sativum (usturoi) este o plantă comestibilă, utilizată ca aliment și condiment (Figura 10). În medicina populară este considerat, alături de ceapă, un adevărat medicament, datorită conținutului bogat de vitamine și substanțe minerale. [NUME_REDACTAT] antic și în timpul romanilor, usturoiul era cunoscut ca un mijloc preventiv al bolilor contagioase. Ulterior s-a stabilit că efectul usturoiului, în combinație cu mierea de albine, sau alte produse naturale, este benefic în prevenirea sau ameliorarea bolilor cardiovasculare, a tulburărilor digestive, sau a pneumopatiilor. În afară de efectul antimicrobian, are și un efect antihelmintic (contra viermilor intestinali) deoarece contine 0.1 – 0.36% ulei volatil in constitutia caruia intra o serie de compusi organosulfurici precum: alicina, dialil-sulfid (DAS), diallil-disulfid (DADS), diallil-trisulfid (DATS), metil-allil-disulfid, metil-allil-trisulfid, 2-vinil-l,3-dithiin, 3-vinil-l,2-dithiin si ajoena.

Figura 10. Usturoiul contine alicina si ajoena, substante cu efect antimicrobian

2.7. [NUME_REDACTAT] este un produs natural rezinic, obținut prin activitatea familiilor de albine, implicând colectarea și prelucrarea primară a exsudatelor mugurilor diverselor plante (Figura 11). Propolisul este compus din rășini vegetale, balsam de diferite compoziții, ceară, uleiuri eterice, fier, microelemente (cupru, zinc, mangan, cobalt) la care se adaugă polen, flavonoide, secreții ale glandelor salivare ale albinelor. Compoziția chimică reprezintă un amestec de substanțe, în special: derivații flavonici, acidul ferulic (activ contra germenilor Gram pozitiv și Gram negativ), ceruri, aminoacizi, balsamuri, fermenți, microelemente (siliciu, magneziu, cupru, molibden, arsen, staniu, aluminiu, vanadiu, wolfram, fier, aur, iridiu, calciu, cadmiu, cobalt, stronțiu), substanțe antibiotice, rășini, acizi aromatici, acizi. Compoziția propolisului variază în funcție de specia vegetală de pe care s-a cules, dar, în medie, acesta conține 55% rășini și balsamuri, 30% ceruri și 10% uleiuri eterice, proporții care sunt asemănătoare pentru orice fel de propolis.

Figura 11. Extract de propolis

2.8. Extractul de menta

Mentha piperita ( menta ) este una dintre cele mai vechi plante, cunoscută si utilizată cu milenii în urma in scopuri aromatizante si pentru vindecare.Contine un ulei volatil numit mentol, relaxeaza spasmele intestinale, calmeaza durerile abdominale si actioneaza ca decongestionant si calmant in aplicare topica. In plus, flavonoidele din extract au proprietati antivirale si antioxidante. Mecanismul propus in acest caz este reprezentat de actiunea terpenoizilor asupra celulei microbiene pe care o distruge.

In prezent sunt cunoscute numeroase subgenuri, specii si varietăti de mentă, fiecare

avand proprietăti distincte din punct de vedere biologic si terapeutic.

De la Mentha piperita se folosesc frunzele

[NUME_REDACTAT], sau herba de mentă

[NUME_REDACTAT] atunci cand se utilizează la extragerea de ulei volatile. In literatura de specialitate se scrie că Mentha piperita

este folosită intern ca un ceai,tinctură, ulei sau extracte ,si

aplicat extern ca un masaj sau alifie. Botanitii consideră menta

ca un astringent, antiseptic,cu proprietăti

antipiretice, antispastice, antitimicrobiene, , stimulant, si cu proprietăi

anti-îmbătranire.

(Sursa: http://www.plante-medicinale )

2.8. Uleiul esential de scortisoara

Uleiul esential de scortisoara stimuleaza memoria, incetineste scaderea parului si ne ajuta sa scapam de kilogramele in plus (scortisoara este unul din alimentele cele mai bogate in antioxidanti) si ne mentine tineretea, ne combate stresul. Recent s-a descoperit faptul ca scortisoara echilibreaza glicemia stimuland insulina si joaca un rol important in prevenirea diabetului. In plus, scortisoara este foarte cunoscuta pentru proprietatile sale antivirale si antimicrobiene si pentru ca stimuleaza functionarea sistemului imunitar. Uleiul esential de scortisoară are efect asupra a 99,99% dintre microbi, fiind eficient chiar și asupra celor rezistenti la antibiotice. La nivel de laborator s-a dovedit ca acest ulei determina o “ardere” a celulelor fungice si distrugerea acestora.

(Sursa: http://www.frunza-verde.ro/scortisoara)

CAPITOLUL III – MATERIALE SI METODE

3.1.Recoltarea probelor de aer

In această lucrare am folosit metoda clasica de recoltare a probelor de aer, numita metoda de recoltare prin sedimentare sau metoda Koch (“standard plate count method”).

Principiul metodei:

Procedeul standard presupune recoltarea microorganismelor aerobe și facultative anaerobe, autoînsămânțate prin depunere gravitațională pe plăci Petri ce conțin mediul de cultura adecvat. Metoda se bazează pe ipoteza aproximativă ca din fiecare spor sau celula depusă pe mediul de cultura adecvat se formează o singură colonie. Pentru a se calcula numărul de germeni aflați într-un anumit volum de aer, se recomandă expunerea cutiilor Petri cu mediul de cultură adecvat timp de 5 minute sau expuneri de timp multiplu de 5 minute (10, 15, 20 minute etc. pana la o ora)

Recoltarea probelor s-a realizat în zone intens circulate din clădirea de Vinificație a [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (notata:V- clădirea de Vinificație, etajul 2 si parter). [NUME_REDACTAT] cu mediu pentru izolarea fungilor (mediul Czapek –Dox) au fost plasate la distanța de 1 metru fața de pardosea și 2 metri una fața de alta (Figura 12). Pentru a analiza condițiile și influenta pe care o are altitudinea asupra aeromicroflorei, plăcile au fost expuse la parter și etajul 2 al clădirii. Timpul de expunere a fost de 15 min. Dupa acest interval plăcile au fost incubate la termostat, la temperatura de 26oC, timp de 72 de ore.

Această metodă are o serie de calitați și avantaje indiscutabile, în primul rând este o metodă foarte simplă, dar prezinata si o serie de limite [Manescu, 1989]

Figura 12. Amplasarea placilor folosite pentru recoltarea probelor

3.2. Examinarea macroscopica a tulpinilor fungice selectate

Tulpinile fungice izolate in etapa precedenta (F1, F2 si F3) si o tulpina de C. albicans provenita din Colectia de Culturi a Laboratorului de Microbiologie au fost analizate macroscopic si microscopic pe preparate proaspete folosind tehnica de examinare pe preparate proaspete lamă/lamelă.

Dupa insamantarea si dezvoltarea tulpinilor fungice pe medii nutritive solide repartizate in placi Petri si mentinute la termostat la temperatura de 28oC timp de 72 de ore,se pot observa caractere de cultura. Observațiile realizate în urma dezvoltării mucegaiurilor pe mediu solid se referă la:

ritmul de creștere a hifelor: rapid/lent;

topografia generală a coloniei: netedă/neregulată/reliefată;

textura coloniei: catifelată/pufoasă/fibroasă/prăfuită;

pigmentarea coloniei (la suprafață și în profunzime) și modul în care virează în timp culoarea coloniei;

culoarea culturii și a mediului: microorganisme cromofore/ paracromofore/cromopare.

Examinarea mucegaiurilor se face cu ajutorul lupei de mărire și poate fi completată cu un studiu asupra structurilor sporifere (forma, modul de formare, dispoziția și forma sporilor), pentru care este necesară utilizarea stereomicroscopului [Antoce & Dinu, 2002].

Examinarea microscopica a tulpinilor fungice selectate

Pentru examinarea microscopică a morfologiei (forma celulelor sau a filamentelor, modul lor de formare, prezența pseudomiceliului etc.) și a structurilor sporifere s-au folosit tehnicile clasice de observare a microorganismelor, respectiv tehnica examinarii intre lama si lamela. Colorantul vital folosit de obicei deoarece măreste contrastul hifelor față de fondul preparatului este colorantul Blue-cotton în lactofenol, care colorează citoplasma hifelor și conidioforii tineri în albastru deschis. Alt colorant vital des utilizat este albastru de metil 0.2% care coloreaza citoplasma celulelor in albastru [Antoce & Dinu,2002].

Acest experiment s-a realizat prin tehnica examinarii intre lama si lamela care presupune urmatoarele etape:

Pe o lama curata si degresata prin flambare si racire se depune cu pipeta o picatura de colorant vital, respectiv de albastru de metil 0.2%, amestecand cu o picatura de suspensie celulara, respectandu-se conditiile de manipulare aseptica;

Deasupra picaturii se aseaza lamela,astfel incat sa se evite formarea bulelor de aer;

Excesul de suspensie se indeparteaza prin tamponare usoara si absorbtie cu hartia de filtru, apoi preparatul se observa la microscop.

3.4. Testarea efectului extractelor vegetale asupra tulpinilor fungice selectate

S-au investigat proprietățile antifungice ale unor extracte hidroalcoolice, uleiuri esențiale si tincturi obținute din diferite specii vegetale față de tulpini fungice selectate (F1, F2 si F3 izolate din atmosfera si o tulpina de Candida albicans). Tulpina C. albicans este provenita din Colectia de Culturi a Laboratorului de Microbiologie. Extractele vegetale utilizate au fost: tinctura hidro-alcoolico-glicolica de propolis (P), extract hidroalcoolic de brusture (B), ulei esential de Tea tree (TT), extract vegetal de usturoi – mujdei (U) si extract hidroalcoolic de echinacea (E), produse procurate de la PLAFAR Bucuresti (Figura 13).

Figura 13. Tincturile si uleiuri esențiale utilizate: tinctura hidro-alcoolico-glicolica de propolis (P), extract hidroalcoolic de brusture (B), ulei esential de Tea tree (TT) si extract hidroalcoolic de echinacea (E)

Pentru realizarea experimentului s-au pus cate 5 – 6 picaturi din fiecare extract vegetal pe mediul de cultura si apoi acesta a fost imprastiat cu ansa Drigalski, sterilizata prin flambare. Microorganismul testat a fost ulterior insamantat prin inundare folosindu-se 1 ml de suspensie de spori. In fiecare experiment s-a insamantat o placa control negativ (CN), care nu contine extract vegetal. Rezultatele au fost inregistrate dupa 24 – 72 ore de cultivare la 26 – 28oC si au fost evaluate calitativ, exprimand gradul de dezvoltare a fungului pe placa insamantata (- nu s-a dezvoltat, + dezvoltare slaba, ++ dezvoltare moderata si +++ dezvoltare excesiva).

3.5.Medii de cultură si reactivi

1. [NUME_REDACTAT] – mediul de cultură pentru fungi, a avut următoarea alcătuire (g/l): glucoză 30.0, extract de drojdie 5.0, NaNO3 3.0, KCl 0.5, MgSO4 x 7 H2O 1.0, FeSO4 0.01, agar 20.0, pH 6.0. Adăugarea a 40 µg streptomicină/ml de mediu răcit la 45-50oC si pH micsorat face ca mediul să fie deosebit de selective pentru mucegaiuri si levuri. Mediul se sterilizează la autoclav la temperatura de 121oC, timp de 15 minute.

2.Solutie de Blue-cotton in lactofenol:

– Blue-cotton 0,05 g

– Acid lactic 20,0 g

– Fenol (cristale) 20,0 g

– Glicerol 40,0 g

– Apă distilată 20,0 ml

Se dizolvă cristalele de fenol în amestecul format din celelalte ingrediente, la cald, amestecând ușor, continuu.

3.Albastru de metil 0.2%

4.Tinctura hidro-alcoolico-glicolica de propolis – Ingrediente: apă purificată, alcool etilic (85% vol.), propolis, (30%). Raport produs apicol/alcool etilic – 1:3. Compania producatoare PARAPHARM SRL.

5.Extract hidroalcoolic de brusture – Ingrediente: apa purificata, alcool etilic (40% vol.), brusture (Arctium lappa) radacini (27%). Raport planta/alcool etilic – 1:3,7. Compania DACIA PLANT SRL.

6.Extract hidroalcoolic de Echinacea – Ingrediente: apă purificată, alcool etilic (40% vol.), Echinacea (Echinacea purpurea) – părți aeriene (27%). Raport plantă/alcool etilic – 1:3,7. Compania DACIA PLANT SRL.

7.Ulei esential de Tea tree

8.Extract vegetal de usturoi (mujdei) – se prepară prin zdrobirea cățeilor de usturoi într-un mojar, cu apă.

CAPITOLUL IV – REZULATE

4.1. Recoltarea probelor de aer

Determinările numerice si calitative ale germenilor vehiculati pe cale aerogenă se realizează fie prin examinarea microorganismelor dezvoltate pe medii de cultura solidificate si expuse aerului atmosferic, fie cu ajutorul unor dispozitive speciale prevăzute cu filter de membrane sau bazate pe aspirarea unui volum cunoscut de aer. Toate metodele de recoltare a probelor de aer au un grad de selectivitate, în sensul că nu pot evidentia toate tipurile de microorganism prezente într-un mediu. Analiza finală a rezultatelor se bazează în primul rând pe repetarea experimentelor si pe o prelucrare statistică a datelor obtinute [Mănescu, 1989].

Metoda folosită în lucrarea noastră pentru a recolta probele microbiene este metoda Koch, care constă în recoltarea microorganismelor aerobe/facultativ anaerobe autoînsământate prin depunere gravitationala pe plăci Petri cu mediul de cultură adecvat.

În cursul experimentelor au fost realizate două recoltări, primăvara în luna martie si in mai. Au fost recoltate probe din zone intens circulate (parter-P, si etaj 2- Et.2) din cladirea Vinificatiei (notata V) situata in [NUME_REDACTAT] – Universitatea de [NUME_REDACTAT] si [NUME_REDACTAT] (USAMV) Bucuresti.

S-au recoltat in total 6 tulpini fungice, din care au fost selectate 3 tulpini, notate F1, F2 si F3.

4.2. Analiza microbiologica a tulpinilor fungice selectate

Tulpinile selectate F1, F2 si F3 au fost caracterizate din punct de vedere microbiologic – macroscopic (Tabel 2, Figura 14, Figura 15, Figura 16) si microscopic (Figura 17, Figura 18, Figura 19).

Tabel 2. Analiza microbiologica a tulpinilor fungice selectate

Figura 14. Tulpina fungica selectata F1 – aspect macroscopic

Figura 15. Tulpina fungica selectata F2 – aspect macroscopic

Figura 16. Tulpina fungica selectata F3 – aspect macroscopic

Figura 17. Tulpina fungica selectata F1 (tal filamentos) – aspect microscopic

Figura 18. Tulpina fungica selectata F2 (spori fungici) – aspect microscopic

Figura 19. Tulpina fungica selectata F3 (tal filamentos) – aspect microscopic

Tulpina de fung imperfect Candida albicans, provenita din Colectia de Culturi a Laboratorului de Microbiologie si folosita in experimentele ulterioare este prezentata in Figura 20.

Figura 20. Tulpina fungica de Candida albicans – aspect macroscopic

4.3. Efectul extractelor vegetale asupra tulpinilor fungice selectate

Rezultatele obtinute sunt prezentate in Tabel 3.

Se observa faptul ca uleiul esential de [NUME_REDACTAT] (TT) a inhibat complet toate tulpinile fungice studiate.

Tinctura hidro-alcoolico-glicolica de propolis (P) a inhibat tulpina F2 si C. albicans si a avut efect partial pe tulpina F3.

Extractul hidroalcoolic de brusture (B) a inhibat dezvoltarea tulpinilor F1 si F2, dar efectul sau asupra tulpinilor F3 si C. albicans este mai redus.

Extractul hidroalcoolic de Echinacea (E) a avut cel mai puternic efect pe tulpina F2 si a inhibat usor tulpina F1 si C. albicans. Totusi, acest extract nu a avut efect pe tulpina F3.

Extractul vegetal de usturoi a avut efect asupra tulpinilor F1 si C. albicans, dar cele doua tulpini nu au fost inhibate complet.

Tabel 3. Efectul extractelor vegetale asupra tulpinilor fungice selectate

-fungul nu s-a dezvoltat; + dezvoltare slaba, ++ dezvoltare moderata si +++ dezvoltare excesiva

Figura 21. Efectul extractului vegetal de usturoi, extractului hidroalcoolic de Echinacea si extractului hidroalcoolic de brusture asupra dezvoltarii tulpinii fungice F1

Figura 22. Efectul extractului hidroalcoolic de brusture ,extractului vegetal de usturoi, extractului hidroalcoolic de Echinacea, tincturii hidro-alcoolico-glicolica de propolis si a uleiului esential de Tea tree asupra dezvoltarii tulpinii fungice F2

Figura 23. Efectul extractului hidroalcoolic de Echinacea, extractului hidroalcoolic de brusture , tincturii hidro-alcoolico-glicolica de propolis, extractului vegetal de usturoi,,si a uleiului esential de Tea tree asupra dezvoltarii tulpinii fungice F3

Figura 24. Efectul uleiului esential de Tea tree , tincturii hidro-alcoolico-glicolica de propolis, extractului hidroalcoolic de brusture, extractului vegetal de usturoi si extractului hidroalcoolic de Echinacea asupra dezvoltarii tulpinii de Candida albicans

[NUME_REDACTAT] realizate au avut ca prim scop realizarea unei documentari asupra cercetarilor referitoare la microorganismele existente in atmosfera exterioara si in atmosfera spatiilor interioare, precum si a modului lor de supravietuire.

In partea practica :

S-au izolat in total 6 tulpini fungice prezente in aeromicroflora din spatiile interioare ale Cladirii de Vinificatie din cadrul [NUME_REDACTAT] – Universitatea de [NUME_REDACTAT] si [NUME_REDACTAT] (USAMV) Bucuresti. Tulpinile au fost recoltate primavara, de la diverse etaje (parter si etajul 2 ) ale cladirii;

S-au selectat 3 tulpini fungice, notate F1, F2 si F3 care au fost caracterizate microbiologic (macroscopic si microscopic);

S-a analizat din punct de vedere calitativ efectul unor extracte vegetale (brusture, usturoi, Echinacea), tincturi (Propolis) si uleiuri esentiale ([NUME_REDACTAT]) asupra dezvoltarii tulpinilor fungice selectate (F1, F2 si F3) si tulpinii fungice de Candida albicans si s-a constatat ca:

uleiul esential de [NUME_REDACTAT] (TT) a inhibat complet toate tulpinile fungice selectate;

extractul de usturoi nu a avut efect asupra dezvoltarii tulpinilor studiate;

tinctura de Propolis a inhibat dezvoltarea fungului C. albicans si a tulpinii F2, dar nu a avut efect asupra tulpinii F3;

extractul hidroalcoolic de Echinacea (E) si extractul de brusture au avut efect moderat si slab asupra dezvoltarii fungilor studiati.

Tulpina fungica F3 as-a dovedit a fi cea mai rezistenta la actiunea extractelor vegetale, tincturilor si uleiurilor esentiale studiate.