Efectul Apei Saracite In Deuteriu

Cuprins

EFECTUL APEI SĂRĂCITE IN DEUTERIU

ASUPRA EMBRIONILOR ZIGOTICI DE ZEA MAYS

Cuprins

1. INTRODUCERE

Vitroculturile prezinta un ansamblu de tehnici care presupune cultivarea in condiții aseptice a oricărei părți dintr-o plantă pe un mediu nutritiv, artificial, in vitro fiind o noțiune adoptată din limba latină, care înseamnă cultivarea în recipiente de sticlă și menținerea în viață a celulelor.

Prin culturile in vitro la plante se subînțelege, adeseori, tehnici de clonare, de micropropagare, de obținere de haploizi, dar si culturi de celule, de protoplaști, de calus etc.

Micropropagarea (vitrocultivarea) este o metodă rapidă de multiplicare a plantelor.

Urmare a micropropagarii la scara comerciala prin merclonare, realizata in anii1970, a fost automatizarea tehnicilor de culturi, de țesuturi si celule, producerea de semințe artificiale, etc (Cachiță și Ardelean, 2009).

Contribuții deosebite la micropropagare au fost aduse, de-alungul anilor prin îmbunătățirea aclimatizării plantulelor provenite din culturi in vitro, in momentul transferării lor in mediul natural de viată (Petruș – Vancea și colab., 2013).

În prezent tehnologia culturilor in vitro, progresele obținute in diversificarea culturilor, a fitoinoculilor au sprijinit dezvoltarea celui mai dinamic și promițător domeniu al biologiei experimentale, si anume ingineria genetică, lucru posibil prin utilizarea protoplaștilor. Conturarea unor noi direcții teoretice și aplicative bazate pe utilizarea vitroculturilor vegetale este in plină evoluție.

În lucrarea de față mi-am propus să studiez efectul apei sărăcite în deuteriu asupra cariopselor mature și a embrionilor zigotici maturi de porumb (Zea mays). Apa sărăcită în deuteriu (D), conține doar 25 ppm deuterium (izotop al hidrogenului), față de apele din natură, la care concentrația deuteriului este în jur de 150 ppm (Nutiu and Ardelean, 2002) și a fost utilizată cu succes în tratarea cancerului uman, ea acționând în diviziunea mitotică (Somlyai, 2001). În ultimii ani, efectul apei sărăcite în deuteriu asupra plantelor a fost tot mai mult studiat, încercându-se să se explice mecanismele de acțiune a acesteia la nivel tisular (Cachiță și colab., 2008 a și b; Petruș-Vancea și colab., 2008, 2010; Petruș-Vancea și Cachiță, 2009; 2011; 2013).

Doresc să mulțumesc Universității din Oradea pentru sprijinul acordat în realizarea prezentei lucrări, precum și d-nei sef lucr.dr. [NUME_REDACTAT].

2. CULTURILE IN VITRO VEGETALE-CARACTERISTICI GENERALE

2.1. Definiții. Scurt istoric.

Schaffer, in anul 1990, definea micropropagarea la plante ca fiind o înmulțire clonală operata in vitro, pentru aceasta folosind diferite tipuri de fitoinoculi, culturile primare fiind inițiate de variate explante, proceduri menite sa asigure o proliferare accelerată de mugurași, apoi, creșterea de lăstari.

[NUME_REDACTAT], micropropagarea reprezintă o multiplicare „miniaturizata” a plantelor in vitro, într-un regim aseptic si regenerarea controlată de clone – la nivelul materialului vegetal, pe medii de vitrocultura complexă (care conțin si substanțe de creștere, specifice), care, după adaptarea lor la viata ex vitro, se valorifică sub formă de material de plantat, liber de viroze.

Micropropagarea este o formă rapidă de multiplicare a plantelor folosită de decenii la scara industrială. Multe laboratoare clonează plante prin micropropagare, cu ajutorul unor protocoale bazate pe descoperirile facute in secolul trecut, dar care au suferit perfecționări pe parcursul anilor.

Clonarea organismelor a luat naștere incă de la inceputul anului 1838, când Schleiden si Schawnn au formula ipoteza totipotențialității celulei vegetale. In anul 1902, Haberlandt spunea că celulele plantelor sunt totipotente, asemănător cu celula ou sau zigot. Astfel, celulele somatice cultivate in vitro, pe medii artificiale adecvate asigurării vietii acestora, pot regenera o noua planta.

O etapă importantă a micropropagării este transtormarea plantulelor care au fost generate in vitro, la mediul septic de viată, respectiv integrarea lor in condițiile normale de viață, și anume aclimatizarea acestora la regimul de existenta ex vitro.

În domeniul vitroculturilor vegetale, termenul de aclimatizare are o semnificație aparte, si anume; adaptarea plantulelor generate in vitro la condițiile mediului septic de viață.

Aclimatizarea vitroplantulelor ex vitro trebuie sa se facă prin adoptarea de măsuri speciale de protejare a acestora in momentul transferării, prin evitarea evapotraspirației excesive, deoarece ele nu au diferențiat, din punct de vedere structural, aparatul stomatic, respectiv epiderma limburilor foliale fiind lipsită de cuticula. Mai mult decât atât, mezofilul folial al vitroplantulelor cultivate pe medii cu carbon – din punct de vedere fotosintetic – este nefuncțional, eventual existând un metabolism mixotrof, deoarece cloroplastele celulelor acestora dispun de masive depozite de amidon in stroma lor, ceea ce le face ineficiente.

Pe de altă parte, rădăcinițele vitroplantulelor sunt slab dezvoltate si sunt ineficiente in ceea ce privește aprovizionarea organelor aeriene cu apă si săruri minerale. Această situație precum si evapotranspirația necontrolată de epidermă, face ca exvitroplantulele să fie inapte de a suporta uscăciunea curenților de aer din atmosferă și iluminarea naturala, condiții la care plantele din condiții natural de viață prezintă adaptări specifice. Metodele de pregătire a vitroplantulelor, pentru atingerea unui proces ridicat de supraviețuire la aclimatizare, consta in adoptarea de măsuri care sa sustină aceste deficiențe, astfel incăt sa le fie asigurată exvitoplantulelor o creștere armonioasă, mai ales în ceea ce privește constituirea unui sistem radicular, apt de absorbție, precum și un bilanț hidric si nutrițional optim. Totodată, trebuie avut în vedere și asigurarea condiției optime unei cât mai armonioase dezvoltări a frunzulițelor, ca organe apte de fotosinteza, si nu in ultimul rând pentru dobândirea de cloroplaste cu structuri normale, necesare susținerii unui metabolism fotoautotrof.

In anul 1957, Skoog si Miller a publicat un articol in care s-a lansat ideea potrivit căreia, la plante, cresterea si morfogeneza sunt determinate de interacțiunile cantitative si calitative dintre auxine si citochinine. Acest raport – de auxină si citockinină – a fost denumit de catre Skoog si Miller ca fiind o balantă hormonală.

Murashige (1974) si-a adus o contribuție insemnată in dezvoltarea tehnologiilor micropropagarii plantelor prin descrierea stadiilor ce trebuie parcurse, precum si a constituientilor importanti care nu pot lipsi din compozitia mediilor de cultura.

Hvoslf-Eide si colaboratorii să-i, in anul 2003 au demonstrat faptul ca micropropagarea traditională presupune consum de energie si de timp, costuri ridicate de producție, în schimb, tehnicile bazate in mare parte pe automatizare si robotizare unor astfel de operațiuni, reducând aceste costuri cu 80-90%. In acest scop, au fost utilizate bioreactoare, procedurile de manipulare fiind robotizate.

Desjardins in 2005 a sesizat cateva aspecte contradictorii care au aparut in literatura de specialitate referitoare la efectul zaharozei introduse ca si componentă în mediile de cultură si impactul acesteia asupra evoluției nutriție mixotrofe sau fotoautotrofa a fitoinoculilor, in dependența de stadiul de dezvoltare fiziologică a plantulelor, situație cauzată de utilizarea unor metodologii diferite de stadiu, adoptate de către cercetători care au abordat o astfel de tematică, precum si a lipsei unor standarde eficiente si optime. Potrivit autorului vitroculturile sunt intoxicate cu concentrații mari de azot si acestea sunt afectate in mod negativ .

2.2. Etapele si condițiile de vitrocultura

Murashige (1974) a definit patru stadii ale micropropagarii la plante:

Inițierea de culturi aseptice

Multiplicarea culturilor

Preaclimatizarea vitroplantulelor

Transferarea ex vitro a plantulelor

In cadrul tehnicilor de cultivare in vitro a țesuturilor și celulelor vegetale, în general, trebuie să se aibă in vedere respectarea unor etape operaționale obligatorii, și anume:

Inființarea de culturi viabile

Incularea si creșterea dirijată a inoculilor

Subcultivarea inoculilor

Conservarea culturilor

Transferarea ex vitro a plantulelor

Aceste tehnici in vitro se bazează pe următoarele elemente:

asigurarea asepsiei

recoltarea explantelor din planta mama

inocularea explantelor pe un substrat nutritiv

incubarea și cresterea intr-un mediu ecofiziologic optim controlat

realizarea de subculturi

Inițierea unei culturi in vitro vegetale

Această primă etapă a micropropagării presupune prelevarea din mediul septic de viață a unor explante, după o prealabilă selecție, sterilizarea acestor fragmente vegetale și inocularea pe medii sterile. După inocularea, recipientele cu fitoinoculi sunt păstrate în camere de creștere, realizându-se astfel cultura primară.

Selectarea tipului de fitoinocul. Alegerea explantului, in vederea inițieri unei culturi in vitro este importantă, având in vedere multitudinea de factori care pot influenta calitatea acestuia, motiv pentru care, în selecționarea acestuia este recomandata să se țină seama de: genotipul, vârsta fiziologică și ontogenetică a plantelor mama selectate ca sursa de explant, anotimpul in care are loc prelevarea, dimensiunea viitorului fitoinocul etc (Petrus – Vancea și colab., 2013).

Mediile de cultură. De-alungul anilor au fost elaborate diferite rețete de medii de cultura, unele cu un conținut ridicat de săruri, în timp ce alte rețete prevăd o concentrație moderată de compuși anorganici, dar toate conțin dețin componente esențiale, organice si anorganice de care plantele au nevoie.

Tipul de recipiente de cultură. Această opțiune rămâne la latitudinea fiecărui cercetător și se face în funcție de: scopul urmărit în experiment, de tipul de culturi, de instrumentele utilizate la inoculare, de volumul de mediul de cultură, de numărul și mărimea fitoinoculilor, de viteza și modul de creștere al acestora etc.

Sticla din care sunt confecționate recipientele trebuie să fie transparentă si termostabilă, pentru a rezista procedurile de prestabilizare a acestora la etuvă, la 160-180 grade C, timp de 2-4 h. După ce mediile de cultură au fost preparate și repartizate in recipiente de sticlă, urmează a fi sterilizate prin autoclavare, respectiv prin căldură umedă, timp de 25 de minute, la cca. 1,2 atm.

Prelevarea si asepsizarea materialului vegetal. Metodele de dezinfectare a materialului vegetal provenit din mediul natural de viață se va face în funcție de: proveniența acestuia, apartenența lui genetica, cadrul ecologic din care provine, natura lui, organul si amplasamentul lui pe plantă, vârsta, fenofaza plantei donatoare de explante etc. Cea mai utilizată metodă de dezinfecție a materialului vegetal, după menținerea timp de 30 de secunde în alcool etilic 70%, este aceea de submersare a lui in soluție de hipoclorit de sodiu sau de calciu, de diferite concentrații, la care se adaugă câteva de picături de Tween 20, un detergent ce nu exercita efecte mutagene sau de traumatizare a țesuturilor, cu rol de a micșora tensiunea superficială la suprafata epidermei, facilizand contactul direct al agentului dezinfectant cu suprafata organelor de dezinfectat. După menținerea materialului vegetal timp de 5 – 30 minute, în funcție de natura acestuia, în agentul dezinfectant, urmează clătirea lui cu apa sterilă, timp de 25 de minute, în 5 ape.

Inocularea. Operatiunea de amplasare a materialului vegetal pe un substrat de cultura sterilizat, cu ajutorul unui instrumentar steril, in condiții sterile, poarta numele de inoculare. Instrumentarul utilizat la inoculare este sterilizat prin caldura umedă, la etuvă, timp de două ore, la temperatura de 170grade C. Apoi, intr-o hotă cu flux laminar de aer steril, cu tablia dezinfectată in prealabil, prin stergere cu alcool etilic 70%, instrumentarul se va steriliza, prin flambare, după fiecare utilizare. Mainile operatorului si suprafata mesei hotei trebuie dezinfectate periodic cu alcool. După dezinfectarea materialului vegetal, acesta va fi amplasat intr-o cutie Petri sterilă, pe o hârtie de filtru sterilizată și ea in prealabil. Inoculii vor fi dimensionați și inoculați imediat. Apoi, se acoperă recipientele cu folie de polietilenă, iar dupa inoculare culturile vor fi amplasate in camera de creștere.

Incubarea vitroculturilor. Din momentul amplasarii recipientelor cu fitoinoculi pe rafturi incepe faza de incubare și creștere a culturilor. In camerele de creștere climatizate, regimul ecofiziologic este cel cerut de natura inoculilor și a tipurilor de vitroculturi practicate.

Regenerarea la nivelul fitoinoculilor incepe odata cu apariția primelor multiplicări celulare.

Pregătirea si prelucrarea vitroculturii pentru o etapă viitoare, respectiv pentru subcultura sau pentru aclimatizarea exvitroplantulelor la condițiile vieții la mediul septic se face în functie de necesitățile laboratorului.

Conservarea vitroculturilor pentru păstrarea fitoinoculilor pe o durata cât mai lungă, cu mărimea intervalelor de subcultură, mai ales in cadrul resurselor genetice recalcitrante la înmulțirea vegetativă, ori a genotipurilor de elită, sau a unor plante rare, se poate realiza prin multiple metode, prin modificări in regimul ecofiziologic de menținere a vitroculturilor, prin utilizarea unor metode care vizează reducerea intensitații proceselor vitale, fie prin hipoxie, fie prin coborârea presiunii atmosferice, ori prin cresterea presiuni osmotice a subsratului de cultură etc.

Transferarea ex vitro a plantulelor si aclimatizarea lor la mediul natural de viată se poate face, după o anumită perioadă de vitrocultură, în funcție de specie. Plantulele generate in vitro pentru a putea fi crescute in mediul septic de viață, trebuie sa treacă printr-un proces de adaptare a lor la acest mediu, respectiv la condiții naturale.

2.3. Germinația in vitro

Germinarea semințelor constă în totalitatea modificărilor fiziologice și morfologice prin care embrionul din sămânța trece de la starea de repaus la starea activă de creștere, deci o trecere de la viața latentă la viața activă (Trifu și Bărbat, 1997).

Germinarea este un fenomen fiziologic ce determină sămânța aparent inertă să dea naștere la o plantulă, în condiții optime de mediu. Cuprinde un ansamblu de procese privind sămânța, care conduc, în primul rând, la ieșirea radiculei. Germinația are loc după trezirea embrionului din dormanță, atunci când condițiile de mediu sunt favorabile.

Alături de alți factori specifici, germinația semințelor este determinată necondiționat de acțiunea apei deoarece, numai în prezența acesteia, biocoloizii protoplasmei, prin hidratare, trec în stare activă, iar o parte dintre enzime devin active. Apa este necesară, în decursul perioadei de germinație, atât în desfașurarea diferitelor procese biochimice hidrolitice,cât și ca solvent al variatelor substanțe în celulă (Péterfi și Sălăgeanu., 1972).

Absorția apei de către sămânța se face prin inhibiție și este urmată de creșterea în greutate și în volum a seminței. Imbibitia este un fenomen fizic caracterizat prin producerea moleculelor de apa printre moleculele unei substanțe solide, determinând o mărime în volum și masa acestuia. Forța de imbibiție se datorează atracției moleculelor de apa de către sarcinile electrice ale particulelor coloidale sau de către anumite grupări hidrofile. La semințele uscate, amidonoase, de exemplu de gramiere și de leguminoase forța de imbibiție este foarte mare de,1 000-1 300atm, in funcție de concentrația coloizilor hidrofili prezenți în substraturile țesuturilor de rezervă.

2.4. Importanța biotehnologiei vegetale in agricultură

Biotehnologia oferă soluții tehnologice pentru aprovizionarea cu alimente, furaje și fibre, de a imbunatăți calitatea apei, oferirea de energii regenerabile, îmbunătățirea stari de sănătate a animalelor, și a oamenilor, ajută la biodiversității prin detectarea speciilor invazive. Cu toate acestea, biotehnologia este puțin probabil să și îndeplinească potențialul sau fără aplicarea unor politici adecvate regionale, nationale si unele cazuri globale pentru a susține aplicarea și dezvoltarea acestui domeniu. Bioeconomia poate fi gandită ca un domeniu in care biotehnologia contribuie la o parte importantă a producției economice. In curs de dezvoltare bioeconomia are posibilitatea de a implica trei elemente:utilizarea de cunostințe avansate din genetica si a proceselor complexe celulare, pentru a dezvolta noi procese si produse, utilizarea biomasei regenerabile si eficiente pentru bioprocese, susținerea producției durabile, precum si de integrare a cunoștințelor de biotehnologie in diferite sectoare.

Domeniul culturilor de țesuturi si celule vegetale reprezinta o ramura biotehnologica care a produs in secolul trecut o „revoluție verde” în agricultură si silvicultură, dar si o direcție de cercetare care deține astfel numeroase necunoscute. Studiile referitoare la investigarea reactivității, celulelor, țesuturilor, organelor sau a plantulelor aflate in regim de vitrocultură, și cele privind comportamentul vitroplantulelor in cazul transferării lor din in vitro, ex vitro, în mediul natural de viața, în funcțiile de condițiile ecofiziologice la care acestea urmează să se adapteze, în momentul treceri acestora in mediul septic, trebuie bine analizate și cunoscute, pentru a putea fi îmbunătățită calitatea materialului de plantat obținut prin vitrotehnici, ceea ce aduce beneficii economice importante.

Biotehnologia vegetala modernă dispune de procedee care facilitează sporirea productivități culturilor agricole, dar si a calității produselor obținute, de exemplu o mai bună rezistență a acestora la transport, rezistența la secetă, la ger, la sărăturarea solurilor, la boli, scurtarea duratei de vegetație, sporirea producției de masă lemnoasă in silvicultură, obținerea de produși fitoterapeutici din plantele medicinale, etc. Metodele biotehnologice permit intr-o oarecare măsură, producerea de material de plantat liber de viroze, sau de alte boli, în funcție de tipul de vitrocultură adoptat, ceea ce înseamnă obținerea de culturi superioare din punct de vedere calitativ, dar si mai productiv.

3. MICROPROPAGAREA IN VITRO LA ZEA MAYS

3.1. Descrierea speciei

Porumbul este plantă anuală ierboasă, aparține familiei Graminaceae, genul Zea. Linne l-a denumit Zea mays. Numele genului Zea se pare că derivă de la cuvântul grecesc ”Zea”, care înseamnă: “eu trăiesc”, dar și “grâu îmbrăcat”. Numele speciei mays a fost întrebuințat chiar de Columb și derivă de la cuvântul “mahiz”, care reprezintă denumirea dată porumbului de către locuitorii insulei Haiti.

Fructul este de tip cariopsă îmbrăcat în golașă. Bobul este format din 3 părți: învelișul sau tegumentul, endospermul sau albumenul și embrionul (Deliu, 2000).

Tegumentul este format din două părți distincte; pericarpul sau învelișul fructului, ce provine din pereții ovarului și testa sau învelișul seminal, care rezultă din pereții ovarului.

Endospermul este țesutul de rezervă în care sunt depuse substanțele nutritive necesare creșterii și dezvoltării embrionului. La exteriorul lui se găsește un strat de celule regulat așezate, de forme aproape pătratică, pline cu grăunciori mărunți de aleuronă (stratul cu aleuronă), iar restul este alcătuit din celule mari în care se observă grăuncioare de amidon cu formă aproape sferică.

Embrionul zigotic este alcătuit din mugurașul sau gemula, la partea superioară având forma rotundă – vârf de creștere – acoperit de 2–3 frunzulițe. El este învelit de o teacă în formă de scufie numită coleoptilă, cu rol de protecție, ajutându-l în timpul germinației să spargă tegumentul. Din muguraș se formează părțile aeriene ale plantulei. Imediat sub muguraș se găsește cea de-a doua parte a embrionului numită hipocotil, tigelă sau tulpiniță, care face legătura între muguraș, radiculă (ce se află la partea inferioară a embrionului) și scutellum. Cea de-a treia parte a embrionului este radicula sau rădăcinița, formată dintr-o rădăciniță principală și 2-3 secundare .

Porumbul are un sistem radicular foarte puternic, fasciculat cu numeroase ramificații, care cuprinde, după durata activității, rădăcini provizorii și rădăcini permanente. In vitro se regenerează doar rădăcini provizorii. După locul de formare există rădăcini embrionare și rădăcini adventive (Deliu, 2000).

La germinație, porumbul emite o singură rădăcină embrionară, pivotantă, care la partea superioară dă naștere la ramificații scurte. O dată cu ramificația rădăcinii embrionare iau naștere – la baza mezocotilului sau chiar de pe el – un număr de 3-7 rădăcini, care, se diferențiază încă în bob. Acestea poartă denumirea de rădăcini adventive primare, iar numărul lor variază în funcție de soi. Rădăcina embrionară, împreună cu rădăcinile adventive primare constituie rădăcinile temporare, care timp de 2-3 săptămâni aprovizionează plantula de porumb cu apă și hrană. După acest timp, activitatea lor se reduce repede.

Coleoptilul poate atinge lungimea de 2-7 cm, iar frunzele, in vitro sunt în număr de 1 maxim două.

4. EFECTUL APEI SĂRĂCITE ASUPRA PLANTELOR

4.1. Apa sărăcită in deuteriu – caracteristici, proveniență

Este produsă de [NUME_REDACTAT] de Cercetare-Dezvoltare pentru [NUME_REDACTAT] din România, cu sediul la [NUME_REDACTAT]. Apa respectivă are o compoziție asemănătoare apei distilate, dar posedă un conținut mult mai scăzut in deuteriu-un izotop al hidrogenului-de cât în apa naturală sau cea distilată

Apa sărăcită in deuteriu se pare că a existat pe Pământ cu milioane de ani in urmă. O echipă de exploratori au descoperit, pe înățimile Tibetului, un sat in care oameni erau foarte sănătosi, sursa lor de apă fiind dintr-un ghețar care s-a dovedit că avea o concentrație în deuteriu cu mult mai redusă fătă de aceea obișnuită. Ulterior, s-a observat că și calota de gheață polara ține captivă apa săraca in deuteriu, asemănătoare cu cea din Tibet.

Cantitatea de deuteriu din apă din natură variază in funcție de latitudine, dar și de altitudine. Concentrația de deuteriu a apei naturale, de regulă, atinge o valoare de 150 ppm, la nivelul mării si de circa 130, ppm la o inaltime de 2000m. Cantitatea de deuteriu măsurată în apă este direct proportională cu conținutul de deuteriu al organismelor care trăiesc in mediul respectiv.

In anul 1931, Berge și Menzel au constatat ca, exista o diferența între masa atomică a oxigenului prin indentificarea prezenței izotopului hidrogenului, deuteriu, cu masa 2 și, ulterior, a izotopului tritiu, cu masa 3, din apa normala separându-se apoi apa grea si cea hiper grea, precum si apa semi grea. [NUME_REDACTAT] si Ardelean , in apele naturale concentrația de deuteriu este de aproximativ 150 ppm, iar denumirile de „apă ușoară”, „apa sărăcită în deuteriu”sau cea de „apă deuterizată” semnifică apa a cărei concentrații in deuteriu se situează sub această valoare .

Deuteriul este un izotop natural si stabil al hidrogenului, cu concentrația naturală în apă de pe scoarța pământului, situată între 144-150ppm, adică la un milion de părți de hidrogen coexistă 144-151 de părți deuteriu. Creșterea concentrației de deuteriu, peste cea normală conduce la obținerea apei grele, folosită în reactoarele nucleare. Cum apa grea are efecte inhibitoare și distructive asupra materiei vii, ducând chiar la suprimarea vieții, a apărut ipoteza că opusul ei, apa săracă în deuteriu, ar putea avea efecte benefice.

Apa sărăcită in deuteriu se produce folosind tehnicii de separare izotopică a hidrogenului din apă. In țara noastră, apa sărăcită in deuteriu a fost produsă la [NUME_REDACTAT] de Criogenie, în urmă cu mai bine de 15 ani, a pus la punct tehnologia de fabricare a apei grele, pentru [NUME_REDACTAT] de la Cernavodă. După ce apa grea a început să fie produsă la [NUME_REDACTAT]-Severin s-au continuat cercetările în domeniul separării izotopice si s-au pus la punct tehnologia de producere a apei sărăcite in deuteriu, care constă în sărăcirea apei naturale, reprezentată de apa potabilă, apa decarbonatată, condens de abur, apa demineralizată, apa distilată, rezultând,in final, o apă biologic activă. Aceasta este un procedeu complex, pentru care se folosesc instalații costisitoare, mari consumatoare de energie , din acest motiv prețul apei fiind ridicat.

4.2. Proprietăți fiziologice ale ASD

Apa cu un conținut de 25ppmD, potrivit lui Nutiu si Ardelean (2002), inhibă creșterile tumorale, la om și la animale stimuleaza reactivitatea vasculară și imunitatea naturală a organismelor, sporește rezistența acestora la dozele mici de radiații gamma, etc.

[NUME_REDACTAT] , ASD poate influența mitoza anarhică caracteristică tumorilor, prin sistarea acesteia. Autorul afirmă că deuteriul, pe lângă faptul că influențează metabolismul, mai are un efect important, acela de a interveni în diviziunea celulara. Ca să se dividă, o celulă trebuie să primească un prim semnal de diviziune, adică o valoare optimă a raportului dintre deuteriu si hidrogen. Studiile au arătat că atunci când o celulă începe să se dividă, își activează pompa membranară care elimină H din celulă. Prin evacuarea H din celula, în această rămâne. Deci creșterea concentrației în D și scăderea nivelului de H în aceasta declanșează semnalul de diviziune. Hiperhidria caracterizându-se printr-o diviziune haotică, extrem de accelerata,de tip neoplazic,am presupus ca prin administrare de apa cu un conținut scăzut in D, raportul dintre D si H fiind mai echilibrat , rata diviziunilor programate va scădea.

Rezultatele menționate au fost obținute utilizând ASD, cu o concentrație in deuteriu de 30 ppm, singura care se produce si se comercializează de Institutul de Criogenie din [NUME_REDACTAT]. Apa se comercializează în recipiente din material plastic de 2 l, sigilate.

O serie de experimente au demonstrat că apa cu conținut scăzut în deuteriu poate fi folosită cu rezultate deosebite și fără nici un efect toxic. In plus ,are influență asupra diviziunii celulare. Cu cât concentrația de deuteriu din apă este mai mică, cu atât va fi mai lent procesul de diviziune celulară, ceea ce inseamnă că îmbătrânirea organismului va fi încetinită. De asemenea, în cazul unei diviziuni celulare rapide, cresc și șansele apariției defectelor de diviziune.

La plante, investigarea influenței exercitate de către tratamentele cu ASD a fost făcută de către Somlayi si colaboratorii si de către Belea, prin aplicarea lui, la nivelul materialului semincer prin inhibarea acestuia prealabil puneri la germinat, precum și a creșterii plantelor derivate din embrionii acestora, tot pe medii umectate cu respectiva apa. Autori citați au constatat faptul că, in general, la 5-6 zile de la punerea la germinat a materialului semincer prealabil submersat in apă sărăcită in deuteriu, pe un substrat udat tot cu ASD, cu o concentrație de deuteriu de 20ppm, valorile lungimii lăstarilor și a rădăcinițelor plantulelor rezultate din embrionii acestora au fost mai reduse decât dimensiunile biometrizate la plantele lotului martor, care a fost pus la germinat pe substrat umectat cu apă distilată, efect de inhibare care a dispărut după 10-12 zile de la punerea acestora la germinat, ceea ce a demonstrat –dupa autorii citati – o capacitate de adaptare a plantelor in limite relativ largi, la mediul cu concentrație scăzută în deuteriu. Alte experimente efectuate cu ASD asupra plantelor au arătat că aceasta inhibă creșterea plantelor, în special rizogeneza la 10 culturi de specii, în primele stadii ale dezvoltării.

Studii recente efectuate de către cercetători români privesc elaborarea de metodele experimentale de utilizare a ASD în studii de influență a acesteia asupra germinării semințelor, precum și de aplicare a respectivelor metodele pentru studierea acțiunii acestei ape asupra celulelor vii. Autorii citați anterior au descoperit un efect important al ASD în inhibarea diviziunii celulare, atât la plante cât și la animale. Pentru studierea efectului ASD la plante Berdea si colaboratorii au măsurat conținutul de deuteriu din apa extrasă din plantele care au fost udate cu ASD, comparativ cu cel provenite de la plantele udate cu apa normală. Efectul ASD a fost de scădere a ratei de germinare si a aceleia de creștere.

Facultatea germinativă a cariopselor de porumb maxim a fost înregistrată doar la lotul inhibat în ASD de un 1h, la omologul acestuia de pe AD, facultatea germinativă a fost de 93%. La ambele loturi menționate timp de 6h sub cele două tipuri de ape, facultatea germinativă a fost de 96%. Cel mai mic procent de germinație s-a marcat in cazul inhibării cariopselor de porumb timp de 12h in AD, la omologul acestui lot, germinat și crescut pe hârtie de filtru umectată cu ASD facultatea germinativă a fost de 96%. La cariopsele îmbibate 24h in cele două tipuri de ape a fost semnalată o facultate germinativă de 93%. In urma inhibării cariopselor de porumb, timp de 1h si 6h în ASD, embrionii proveniți din cariopsele tratate au reprezentat o stimulare a creșterii pana la 100% in ceea ce privește talia rădăcinițelor si a coleoptilelor. In cazul menționării cariopselor la inhibat în ASD, timp de 12 și 24h, acestea au generat plantule ale căror sporuri de creștere , în ceea ce privește lungimea frunzulițelor, au depășit cu 200% creșterea medie a taliei frunzulițelor lotului martor corespunzător.

Rolul apei în viața plantelor

In mare parte rolul apei in viața plantelor se datorează însușirilor ei fizice.

Temperatura la care are loc evaporarea apei este mai mare ca a altor lichide, 1g de apă lichidă necesitîâd 536 calorii pentru transformarea ei in stare de vapori. Această însușire a apei determină, o dată in plus, prin evapotrnspirație, menținerea corpului plantelor la temperaturi fiziologice optime în cazul unei iradieri solare puternice. O alta însușire a apei care ajută în termoreglarea organizmului plantelor este conductibilitatea termică ridicată a apei, comparativ cu alte lichide, iar prin tensiunea sa superficială relativ ridicată, care este depășită doar de aceea a mercurului, apa are un rol însemnat în fenomenele de absorție și de conducere a soluțiilor prin țesuturile plantelor.

Insușirea apei de a fi transparentă, adică de a permite trecerea razelor luminoase prin masa ei, joacă un rol important în fenomenul de fotosinteză .

Având o constantă dielectrică mare, apa participă la menținerea multor substanțe în stare disociată, sub formă de ioni, ceea ce prezintă o mare însemnătate în realizarea fenomenelor de absorbție.

Datorită polarității pronunțate a moleculei apei, aceasta participă la fenomenele de hidratare, caracteristice multor substanțe chimice, în principal al coloizilor proteici, dar și a materialelor pectice și pectocelulozice, prin apropierea unui pol al moleculei sale de polul opus al substanței respective.

Apa endocelulara, mai ales din sucul vaculos, participă la fenomenul de creștere, de absorție a substanțelor din mediul încojurător și la conducerea diferitelor substanțe de la un organ la altul al plantei.

Apa ea parte la fenomenele de hidroliză, de oxidare și de reducere, dar și la o multitudine de procese fiziologice și metabolice cum este fotosinteză sau alte lanțuri biochimice de asimilație și dezasimilație.

Prin faptul că biomembranele, protoplasma sunt hidratate, apa contribuie la stabilitatea biostructurilor, la interelaționarea diferitelor organite celulare, și chiar a peretelui pectocelulozic, în cadrul aceluiaș organ, precum și intre organe ale aceleași plante, ceea ce contribuie la menținerea unitați funcționale a intregului sistem vegetal, Totodată, apa din substratul pe care organismul vegetal traiește contribuie la realzarea legăturii plantei cu mediul înconjurător.

Rolul apei in celula vegetală

Studiul proceselor fiziologice care au loc la nivelul organismului plantei se bazează pe cunoașterea ultrastructurii celulei vegetale și a reacțiilor de biologie moleculara care se desfașoară la nivelul diferitelor organite celulere și, per ansamblu a celulei, în funcție de gradul ei de diferențiere și de rolul jucat de aceasta în corpul plantei.

Celulele diferitelor organisme și chear unuia și aceleiaș organism au trăsăturile lor specifice, în primu rând deosebindu-se morfologic, biochimic și, în sfârșit, funcțional, în dependența de gradul de dezvoltare a țesuturilor, respectiv a organelor carora le apațin .

Celulele cormofitelor sunt extrem de variate ca mărime, structura și funcțiune, stadiul de dezvoltare ontogenetică a țesutului sau a organului respectiv își pune puternic amprenta asupra acestora, conținutul de apă din celule diferind în dependența de rolul țesuturilor la momentul dat, în viața plantei.

Apa este partea componentă obligatorie a fiecărei celule vii. Ea inhibă-mai mult sau mai puțin-toate țesuturile organismelor vegetale vii sau moarte și formează în plante o fază continuă. Forțele care rețin apa în celule sunt foarte fizice cum sunt cele de capilaritate, de inhibiție și forțele osmotice, dar si cele fiziologice, datorate biomembranelor.

Conținutul total de apă în țesuturile vegetale este foarte variabil si dinamic, în celulele și țesuturile plantelor deosebindu-se două forme de apă lichidă: liberă și legată.

Apa legată se împarte în:

osmotic legată

coloidal legată

apă mobilă.

Apa legată, într-o măsură mai mare sau mai mică este structurată și reținută cu forțe mari în celule. Ea constituie un element structural al membranei, se găsește în spațiul dintre membranele interne și externe ale mitocondriilor matricial organitelor, etc.

Apa liberă posedă o mobilitate mare. Ea se găsește în vacuole și în țesuturile

conducătoare, etc. Prin ea se efectuează transportul și schimbul de substanțe nutritive dintre diferitele părți ale organismului vegetal. Datorită ei organele și țesuturile plantei se mențin în stare de turgescența, crescându-se, astfel, condițiile necesare procedeelor biochimice. Formele de apa din celule pot trece din una în alta, deoarece nu există apă complet liberă și apă complet legată, notiunile fiind relative.

Rolul apei in vitroculturile vegetale

In principiu, cerințele de apă ale fitoinoculilor, respectiv ale vitroplantulelor sunt diferite de cele ale plantelor cultivate in condiții normale de viată, dar din cauza condițiilor speciale care trebuie întrunite în realizarea procesului de micropropagare, se poate spune că pe durata creșterii, plantelor, a țesuturilor sau a celulelor, în alte condiții de cele naturale. Tehnicile de cultivare „in vitro” a explantelor, începând din momentul exploatării și până în momentul reîncadrării neoplantulelor generate în condiții aseptice, la viata „ex vitro”, fac ca celulele acestora să treacă prin variate situații de stres . In micropropagare, în fazele de inițiere a vitroculturilor trebuie evitat șocul de deshidratare a țesuturilor explantelor. De asemenea, condițiile de incubare a fitoinoculilor, și pe parcursul evoluției lor, trebuie evitată deshidratarea acestora, dar și a mediilor de cultură. Absorția și eliminare a apei la vitroculturi, diferă de procesele respective desfașurate la plantulele cultivate în condițiile naturale. In cazul unui excedent de apa, la nivelul vitroculturilor poate să se instaleze in celulă fenomenul de hiperhidrie, vizibil morfologic printr-o transparentizare a frunzelor și tulpinilor vitroplantulelor, ca o consecință a filtrării apei în spațiile intercelulare, înlocuindu-se aerul din ele.

Chiar daca sunt asigurate condițiile optime de cultură și de dezvoltarea lor ale fitoinoculilor, în vitrocultura, după inoculare, există în al doilea moment de stres, greu de depășit, în care se face trecerea plantulelor neoformate „in vitro”. la condițiile mediului septic, în faza de aclimatizare a acestora la viața „ex vitro”. Șocul hidric produs în perioada de transfer este deosebi tde puternic și , de foarte multe ori, poate fi fatal exvitroplantulelor.

In perioada de aclimatizare, deficitul hidric generat prin imposibilitatea vitroplantulelor de a se aproviziona cu apă , lipsa cuticulei, precum și disfuncția aparatului stomatic, impune, în primul rând, asigurarea unei umidității ridicate în jurul plantulelor scoase din „vitro” în mediul septic.

La vitroplantulelor, stratul protector suprapus peretelui extern al celulelor epidermale este extrem de redus sau chear lipseste. Pe de alta parte, aparatul stomatic este necorespunzător dezvoltat, iar stomatele sunt larg deschise, iar la cele hipehidrice , ele sunt nefuncționale. O astfel de plantulă este total nepregătită pentru a suporta contactul direct cu mediul natural.

Deoarece pierderea apei din țesuturi , prin deshidratare sau pe cale osmotică, conduce la descreșterea turgescenței, situsție incompatibilă, în final, cu buna funcționare a celulelor și cu viața fitoinoculilor.

Vitroplantulele transpiră , eliminând o parte de apă în admosferă, din recipiente. In camerele de creștere neclimatizate apare un proces de condensare a apei pe pereți recipienților. Odată cu acest proces are loc și o dezechilibrare a raportului ionic, culturile putând intra în senescență și muri. O astfel de situație impune repicarea culturilor pe medii poaspete.

Studii proprii privind efectul apei sărăcite în deuteriu asupra embrionilor

Zigotici maturi de zea mays

Material si metoda

Materialul vegetal utilizat în experimentele din prezenta lucrare a constat din cariopse de porumb(zea mays)imaturi sau maturi, prelevate de pe știuleți în faza de coacere în lapte (imature), respectiv intr-un stadiu avansat de coacere(mature), după o prealabilă spălare a știuleților-împănușați fiind-sub jet de apă sub robinet, a urmat o submersare totală a acesteia, timp de două minute, în alcool etilic de 96grade, operațiune secondată de o clătire repetată a lor cu apa de robinet, sub jet.

Știuleții astfel dezinfectații le au fost îndepărtate pănușile protectoare iar cariopsele au fost prelevate si submerse, timp de 10 minute, respectiv 30 minute, în hipoclorit de sodiu, cu un conținut de clor la care sa adaugat câteva picături de Tween 20. După submersare în hipoclorit, cariopsele au fost trecute prin 5 bai de apa sterilă, în care au fost menținute 5 minute, în fiecare baie. Toate aceste operațiuni de sterilizare a materialului vegetal s-au desfășurat în condiții sterile, în interiorul hotei cu flux laminar de aer steril, aflat in funcțiune.

Pentru procedurilele de sterilizare, cariopsele de porumb, atât cele imature, cât și cele mature, au fost împărțite in patru loturi:

cariopse sterile timp de 10 minute si inoculate ca atare întregi.

cariopse sterile timp de 10 minute, in care a fost înlaturate pericardul și endospermul „in vitro” inoculandu-se doar embrionul.

cariopse sterile timp de 30 minute, și inoculate ca atare întregi.

cariopse sterile timp de 30 minite, în care a fost înlăturat pericardul și endospermul inoculandu-se doar embrionul.

Mediul de cultură utilizat în experiment a fost mediul Murashige-Skoog MS(1962) ½ modificat de noi, adică cu un adaos de cate 1g/1 vitamine , lipsit de glicină, cu numai 20g/l zaharoza , in loc de 30g/l si 7g/l agar-agar, cum prevede reteta originala, cu adaos de 2,4-Dcu diferite concentrații 2,5mg/l(V1), 5mg/l(V2) și 10mg/l(V3), pentru cariopsele imature, iar partea a doua a experimentului de 5mg/L(V1), 10mg/l(V2) și 15mg/l(V3) pentru cariopsele mature.

Soluția de 2,4-D a fost preparata prin solubilizarea regulatorului de creștere în alcool etilic iar încorporarea soluției în mediu s-a realizat în final prealabil autoclavârii. Mediile au fost sterilizate prin autoclavare , timp de 20 de minute, la temperaturi de 121gradeC.

După inoculare, culturile au fost trecute pe rafturi iluminate cu tuburi florescente, cu.emitere de lumina alba in regim fotoperiodic de 16-24 de ore și o intensitate de 1700 lucsi, temperatura mediului ambiant a oșcilat între 24 10C, ziua și între 20 10C , noaptea.

Primele modificări ale aspectului vitroculturilor au fost observate încă dupa 48 de ore de la inoculare, dar biometrizări au fost facute la 14 zile de la inoculare. Biometrizările au constat din determinarea următorilor parametri:facultatea germinativă, lungimea rădăciniței embrionare, lungimea coleoptilului, lungimea frunzuliței și talia întregii plantule, obținute prin însumarea ultimilor trei parametri menționați.

Datele obținute au fost prelucrate matematic, calculându-se mediile aritmetice la fiecare parametru și varianta experimentală, în parte, iar valorile obținute la variantele cu adaos de 2,4-D , în concentrații diferite au fost raportate la valorile înregistrate la martor (V0), mediu de cultura lipsit de regulator de creștere.

Rezultate si discuții

Experimente efectuate cu cariopse imature

La 14 zile de la inocularea cariopselor imature, sterilizate timp de 10 minute sau 30 de minute, mediul de cultură optim s-a dovedit a fi V1, cu 2,5 mg/l 2,4-D, atât în ceea ce privește facultatea germinativă, care a fost de 75% la cariopsele variantei sterilizate 10 minute și de 100% la cariopsele sterilizate 30 de minute, cât și creșterea vitroplantulelor, în special în ceea ce privește lungimea coleoptilului și a frunzuliței, care prezentau sporuri față de martorul lipsit de regulatori de creștere (V0) de aproximativ 750% , respectiv de 130%, la ambele durate de sterilizare.

Concluziile autorilor au fost următoarele: 1. Mediul de vitrocultură optim pentru germinarea și apoi creșterea vitroplantulelor de porumb a fost mediul martor, lipsit de regulatori de creștere (lipsit de 2,4 –D), iar timpul de sterilizare 10 minute; 2. Facultatea germinativă a inoculilor de tip cariopse și embrioni proveniți din cariopse mature, sterilizate timp de 10 minute, au fost superioare celor înregistrate la variantele omoloage, constând din cariopse și embrioni proveniți din cariopse imature. Nu aceeași situație s-a observat la cariopsele și embrioni proveniți din cariopse sterilizate timp de 30 minute; 3. Facultatea germinativă a embrionilor, atât mature cât și imature a fost inferioare celei înregistrate la cariopsele inoculate întregi (imature respectiv mature), sterilizate timp de 30 de minute, iar cea mai intensă creștere a fost observată la vitroplantulele provenite din embrioni pe mediu de cultura lipsit de moderator de crestere-V0 embrioni proveniti din cariopse, atat mature cât și imature, sterilizate timp de 10 minute, respectiv 30 minute; 4. Daca tipul de inocul cel mai bun s-a dovedit a fi embrionul, in ceea ce privește , timpul de sterilizare optim, al cariopselor de porumb în vederea inițierii de vitrocultiură, s-a dovedit a fi cele de 10 minute; 5. Calusogeneza apare doar la inoculii proveniți din cariopse mature.

II. CERCETĂRI PROPRII

II. 1. SCOPUL EXPERIMENTELOR

Motivația alegerii temei

Apa este un lichid mult studiat și cel mai puțin înțeles. Rolul apei în viața plantelor este bine cunoscut, cu toate că mecanismele prin care aceasta acționează la nivel celular nu sunt pe deplin elucidate.

În cazul culturilor in vitro apa se constituie într-un element esențial în prepararea mediilor de cultură, iar, la rândul lor, culturile de țesuturi și celule vegetale constituie un instrument de cercetare deosebit de valoros în studiile de fiziologie vegetală, de biologie celulară și moleculară, dar în același timp și o foarte modernă metodă de obținere a diferitelor specii de plante de interes economic, la scară industrială.

Pe de altă parte, germinația semințelor este determinată necondiționat de acțiunea apei, deoarece, numai în prezența acesteia, biocoloizii protoplasmei, prin hidratare, trec în stare activă, iar o parte din enzime devin active. Apa este indispensabilă, în decursul perioadei de germinație, atât în desfășurarea diferitelor procese biochimice hidrolitice, cât și ca solvent al diferitelor substanțe în celulă.

Nevoia de apă a plantelor cultivate in vitro este aceeași cu aceea a plantelor cultivate in vivo, dar, datorită condițiilor speciale care trebuie întrunite în realizarea procesului de micropropagare, se poate spune că, pe durata creșterii plantelor, a țesuturilor sau a celulelor, în alte condiții decât cele naturale, acestea trăiesc în stare de stres. În recipientele de culturi in vitro, apa suferă un circuit închis. Vitroplantulele transpiră, eliminând o parte din apă în atmosfera din recipiente. O altă cantitate de apă se eliberează în atmosfera in recipiente, din mediul de cultură, prin evaporare.

Apa sărăcita in deuterium este considerate un bun remediu in tratarea cancerului, prin actiunea ei directa asupra diviziunii celulare, având efecte inhibitorii. Mecanismul exact al actiunii ASD la nivel celular sau molecular nu este pe deplin cunoscut, iar orice studiu vizând efectul acesteia asupra plantelor, poate fi util în explicarea unor fenomene.

În literatura de specialitate există numeroase cercetări axate pe studierea influenței exercitate de către diferitele tipuri de ape, asupra creșterii și dezvoltării plantelor aflate in vitro, fapt reflectat în numeroasele seminarii și simpozioane axate pe această tematică, detaliate în partea teoretică a lucrării de față. Cercetările realizate până în prezent cu referire la efectul pe care îl poate exercita apa sărăcită în deuterium privesc fenomenelor de germinație la trei specii de plante, și anume la grâu, la porumb, la ridichi, la secară, la triticale (Cachiță și colab., 2002; Petruș și colab., 2004; Petruș-Vancea și colab., 2010) sau asupra protocormilor de Cymbidium (Petruș și colab., 2004; Blidar și colab., 2004; 2005 b; Katona și Petrus-Vancea, 2012) sau asupra vitropantulelor de Coleus (Radoveț – Salinschi și Cachiță, 2005 b), ori exvitroplantulelor de Pistia (Beleș și Cachiță, 2006) sau asupra calusogenezei și a hiperhidriei (Cachiță și colab., 2008 a,b,c și d; Petruș- Vancea și colab., 2008; Petruș-Vancea, 2011 a, b; Petruș-Vancea si Cachiță, 2011 a, b).

Obiectivul cercetării

În cadrul experimentelor care fac obiectul prezentei lucrări de diplomă, ne-am propus să continuăm cercetările asupra efectului apa sărăcită în deuteriu (ASD) asupra plantelor, realizate de către colectivul de botaniști de la Universitatea din Oradea (care au început în anul 2001, vezi Cachiță și Petruș, 2002).

Obiectivul general al lucrării a constat în studierea efectului apei sărăcite în deuteriu asupra germinației cariopselor mature, respectiv a embrionilor zigotici de porumb (Zea mays).

II.2. MATERIAL ȘI METODĂ

II.2.1. Etapele inițierii culturii in vitro

II.2.1.1. Pregătirea, asepsizarea sticlăriei și a camerei de inoculare

Prima etapă presupune presterilizarea la sec (prin căldură uscată) a sticlăriei și instrumentarului, în etuvă. Anumite forme de bacili sunt termorezistenți, astfel încât am realizat presterilizarea sticlăriei, timp de 240 minute la 120ºC (Cachiță, 1987).

Recipientele utilizate în cadrul experimentelor au constat din eprubete din sticlă termorezistentă, incoloră cu înălțimea de 7 cm și diametrul de 2 cm.

Prealabil presterilizării, recipientele au fost spălate cu apă cu detergent și limpezite sub jet de apă de robinet.

Instrumentarul necesar inoculării a fost învelit în folie de aluminiu și împreună cu capsulele Petri cu hârtia de filtru au fost sterilizate prin căldură uscată la etuvă, timp de 2 ore, la 120ºC.

Recipientele cu mediile de cultură au fost acoperite cu folie de aluminiu și autoclavate.

Folia de polietilenă, cu ajutorul căreia au fost obturate vasele cu mediile de cultură, după inoculare, s-a dezinfectat, prealabil, în alcool etilic 70º, timp de 5 minute.

Cu 30 de minute înaintea începerii operațiunilor de inoculare s-au șters cu alcool etilic 70º suprafața mesei din boxa și toate suprafețele din interiorul camerei de inoculare.

În momentul inoculării, operatorii au fost echipați cu halat, mască, bonetă (toate dezinfectate); dezinfectarea mâinilor s-a realizat cu alcool etilic 70º. Instrumentele sterilizate la etuvă la 170ºC au fost introduse în alcool, apoi flambate și răcite, după fiecare utilizare.

II.2.1.2. Prepararea mediilor de cultură utilizate în experimente

Mediul de cultură utilizat în experimentele care fac obiectul prezentei lucrări a fost cel Murashige-Skoog (MS) (1962), modificat de noi (Tabelul. …).

Tabelul….. [NUME_REDACTAT]-Skoog (MS) (1962) (după Cachiță, 1987).

Soluție de MACROELEMENTE – Stoc I

Soluție de MICROELEMENTE – Stoc II

Soluția de FeEDTA 40 mg/l – Stoc III

Soluție de VITAMINE – Stoc IV

Soluții de REGULATORI DE CREȘTERE

ZAHAROZĂ 30 g/l

DIFCO BACTO-AGAR 10 g/l

Mediul de cultură MS (1962) conține, în principal toți ioni minerali esențiali dezvoltării cormofitoinoculilor, concentrația ionică totală a mediului fiind cea mai ridicată, dintre toate mediile de cultură utilizate și anume de 93,3 mM.

Compoziția chimică a mediului MS am modificat-o astfel: vitaminele tiamină HCl, piridoxină HCl și acid nicotinic, în loc de 0,1 mg/l sau 0,5 mg/l, cât era prevăzut în rețeta originală, au fost adăugate câte 1 mg/l și s-au scos aminoacizii, s-a introdus câte 20 g/l zaharoză, în loc de 30 g/l și de 7 g/l agar-agar, în loc de 10 g/l; pH-ul mediului de cultură a fost întotdeauna ajustat la valoarea de 5,7, prealabil autoclavării acestuia.

Pentru asigurarea unui randament sporit, în prepararea mediilor de cultură am folosit soluții concentrate stoc, pe care le-am diluat la momentul utilizării, la cantitățile prevăzute, potrivit rețetei adoptate. Am preapart soluții stoc separate de: macroelemente, microelemente, Fe chelatizat (FeEDTA), vitamine. Mezo-inozitolul s-a adăugat sub formă de pulbere, în momentul preparării mediului de bază.

Soluțiile de substanțe anorganice au fost păstrate la frigider (+4 0C), vitaminele în congelator (în sticle de material plastic, porționate în cantități de cca. 10 ml).

Modul de preparare a soluției finale:

Pentru prepararea a 1000 ml de mediu de cultură, la 800 ml apă distilată (sau sărăcită în deuteriu sau Pi) s-au adaugat: 100 ml soluție stoc I (macroelemente), 1 ml soluție stoc, II (microelemente), 5 ml soluție stoc III (FeEDTA), 1 ml soluție stoc IV (vitamine). Apoi, am adăugat, mezo-inozitolul, zaharoza, agarul, iar în final, s-a adus totul la 1000 ml, s-a ajustat pH-ul la valoarea de 5,7, după topirea agrului.

Mediul de cultură a fost porționat cu ajutorul unui dispozitiv de construcție specială, în vase de cultură, care au constat din recipiente din sticlă incoloră, termorezistentă, cu înălțime de 7 cm și cu un diametru de 2 cm. Cantitatea de mediu porționată în fiecare recipient a fost de 5 ml, lucrându-se cu câte 40 de recipient per variantă de mediu.

Sterilizarea mediilor de cultură și a apei am făcut-o prin autoclavare, cu ajutorul unei oale de fiert (Kukta). Durata autoclavării a fost de 15-20 minute din momentul ieșirii vaporilor prin supapă.

II.2.1.3. Asepsizarea materialului vegetal

Materialul vegetal utilizat în experimentele de față a constat din cariopse mature și embrioni zigotici de porumb ([NUME_REDACTAT])

Pentru asepsizarea materialului semincer, boabele au fost submersate, timp de 30 de minute, în hipoclorit de sodiu, cu un conținut de clor activ de 42 G/DM3 și hidroxid liber de 5-8 G/DM3 procurat din comerț, la care s-a adăugat câteva picături de TWEEN 220. Toată acțiunea de asepsizare a fost desfășurată la hota aflată în funcțiune.

După submersare în hipoclorit, cariopsele au fost trecute prin 5 băi de apă sterilă, în care au fost menținute timp de câte 5 minute în fiecare, cu scopul de a îndepărta chiar și ultimele urme de clor din materialul vegetal.

Pentru a reuși extragerea embrionilor din cariopsele mature, acestea au fost menținute în apă sterilă, timp de 24h. Prelevarea embrionilor s-a realizat în condiții sterile, la hotă, cu ajutorul bisturiului.

Tabelul … Protocol experimental (ASD – apă sărăcită în deuteriu; AD – apă distilată).

II.2.2. Inocularea și condițiile de vitrocultură

Inocularea s-a realizat după răcirea mediilor de cultură, iar obturarea recipientelor de cultură s-a realizat cu folie de polietilenă transparentă, în dublu strat, fixată cu inele de cauciuc.

Principiile de bază ale inoculării au fost respectate cu strictețe, operațiunile desfășurându-se într-o incintă asepsizată, în hota cu flux laminar, vertical, de aer steril, respectându-se regimul de asepsie.

După inoculare, vasele de cultură au fost obturate cu folie incoloră de polietilenă și au fost trecute pe rafturi, iluminate fiind cu lumină fluorescentă, albă, având o intensitate luminoasă de 1700 lucși și o fotoperioadă de 16 h lumină/24 h; culturile au fost menținute la un regim termic cuprins între 23C 2oC, în perioada de lumină și de 20C 2oC, în perioada de întuneric.

Rata germinației reprezintă procentul de cariopse la care s-a putut observa un început de germinație, din totalul de cariopse puse la germinat (individual în recipientele de cultură).

S-a măsurat numai lungimea rădăciniței embrionare și nu și dimensiunile rădăcinițelor secundare sau a ramificațiilor acestora. Lungimile coleoptilelor și ale frunzulițelor au fost biometrizate la momentul când acestea au fost neoformate din embrionul cariopselor.

La 14 zile de la punerea la germinat (la finele experimentului) pentru căntărirea greutății proaspete și apoi a celei uscate au fost sacrificate toate plantulele din fiecare variantă experimentată. După cântărirea – la o balanță analitică digitală – a greutății proaspete a plantulelor, aceastea au fost puse în folie de aluminiu, pe variante experimentale și amplasate în etuvă, la temperatura de 115ºC, unde au fost menținute timp de trei zile, după care a fost cântărită și greutatea uscată a acestora.

Datele obținute au fost prelucrate matematic, calculându-se mediile aritmetice la fiecare parametru și variantă experimentală, în parte, iar valorile astfel obținute la nivelul variantelor experimentale în care mediile de cultură au fost preparate cu apă sărăcită în deuterium, au fost raportate la valorile medii înregistrate la nivelul lotului martor (V0), a căror vitroplantule au fost cultivate pe medii preparate cu apa distilată, acestea fiind considerate 100%, iar valorile procentuale rezultate au fost reprezentate grafic.

II.2.4. Metode de prelucrare statistică a rezultatelor obținute în urma efectuării de măsurători biometrice

Datele obținute au fost prelucrate statistic, cu ajutorul programului pentru calculator [NUME_REDACTAT], 2003, calculându-se media aritmetică, varianța, abaterea standard și testul t.

Media aritmetică a valorilor fiecărui tip de biometrizare, înregistrată la martor (de pe medii preparate cu AD) a fost raportată la media omoloagă, corespunzătoare biometrizărilor efectuate la plantulele provenite de pe medii preparate cu ASD, valori fiind luate în calcul ca 100% și procentul obținut a fost reprezentat grafic.

Media aritmetică () este indicele de poziție cel mai cunoscut și cel mai frecvent folosit pentru definirea mijlocului unui șir de valori. Calculul ei a fost realizat prin simpla însumare a valorilor variabilelor:

= , , =

Σ= semnul sumei, n = numărul variabilelor, x = valorile variabilelor

Media aritmetică trebuie să fie aceeași, indiferent de metodele folosite pentru calcularea ei. Ea reprezintă o valoare estimativă necesară, dar nu și suficientă pentru a caracteriza o întreagă populație (Butnaru și Moisuc, 1979), deoarece nu scoate în evidență anumite particularități esențiale ale șirului de variație, cum ar fi dispersia în jurul mediei, gradul de variabilitate al șirului etc. Pentru a caracteriza exact variabilitatea dintr-o populație, trebuie să cunoaștem dispersia valorilor individuale în jurul mediei, iar gradul de dispersie în jurul mediei se poate calcula cu ajutorul varianței și a abaterii standard, care sunt cei mai siguri indici ai acesteia, deoarece ei reprezintă abaterea fiecărei variabile față de medie. Deoarece suma abaterilor este egală cu zero (Σ (x – ) = 0), acestea se ridică la pătrat (Σ (x – )2 ≠ 0). Varianța și abaterea standard se calculează împreună, deoarece, abaterea standard (s) este rădăcină pătrată a varianței (s2).

Varianța se definește ca raportul dintre suma pătratelor abaterilor individuale, față de media aritmetică (SPA) și numărul gradelor de libertate (GL): s2 =

Gradele de libertate (GL) reprezintă numărul valorilor ce pot varia independent (liber) și este egal cu numărul de observații mai puțin una (n-1), iar în cazul comparării a două șiruri de valori (a două populații) acesta se calculează astfel: GL = (n1 + n2 ) – 2.

Practic, după cum afirmă Butnaru și Moisuc (1979), varianța și abaterea standard se calculează direct, cu ajutorul valorile mediei aritmetice, caz în care expresia Σ (x – )2 se înlocuiește cu expresiile:

– sau – .

În acest caz, formula varianței devine:

S2 = .

Diferența limită între două variante indică gradul de semnificație a diferențelor dintre două populații și se calculează conform formulelor:

DL = sđ x t

DL5% = sđ x t 5%

DL1% = sđ x t 1%

DL0,1% = sđ x t 0,1%

unde: – DL – diferența limită;

– valorile t5%, t1% și t 0,1% se i-au din tabelele de transgresiune pentru cele trei grupe de semnificație (P – 5%, P – 1% și P – 0,1%) realizate în funcție de gradul de libertate GL;

– sđ – abaterea standard a diferenței.

Interpretarea rezultatelor (semnificația):

±d < DL5% – diferența este nesemnificativă, notată „ns”;

DL5% ≤ ±d < DL1% – diferența este semnificativă, notată „*” (pentru +d, diferența este pozitivă, iar pentru –d, diferența este negativă);

DL1% ≤ ±d < DL0,1% – diferența este distinct semnificativă, notată „**”;

±d ≥ DL0,1% – diferența este foarte semnificativă, notată „***”

II.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

II.3.1. Rezultate înregistrate la 72 de ore de la punerea la germinat a cariopselor și a embrionilor zigotici de porumb (Zea mays)

Facultatea germinativă a fost maximă la cariopsele germinate pe medii preparate cu apă sărăcită în deuteriu (Fig…).

Fig…. Exprimare procentuală a germinației embrionilor, respectiv a cariopselor de porumb (Zea mays), la 72 h de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), apă sărăcită în deuteriu (V1E), apă distilată (V0C), apă sărăcită în deuteriu (V1C).

Rezultate asupra cariopselor de porumb

La 72 de zile de la inoculare dacă la varianta cu apă distilată s-au pus în evidență doar rădăcinițele embrionare, la lotul pus la germinat n apă distilată, procesul a fost mai avansat, identificându-se și tulpinița (Fig….).

V0C V1C

Fig…… Aspecte ale germinației cariopselor de porumb (Zea mays), la 72 h de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0C), apă sărăcită în deuteriu (V1C) (bara reprezintă 1 cm).

Rezultate asupra embrionilor zigotici de porumb

La fel ca și la cariopse, embrionii germinația a fost mai avansată pe medii cu apă sărăcită (Fig….). În acest moment al experimentului s-a observat că plantulele provine din germinația embrionilor erau mai mari, germinația fiind mai avansată, comparativ cu aceea identificată la lotul provenit din cariopse, probabil datorită faptului că prezența tegumentului seminal a împiedicat dezvoltarea, iar lipsa endospermului nu afectat embrionii scoși din cariopsă, deoarece mediul de cultură a suplinit acest lucru.

V0E V1E

Fig…… Asp ecte ale germinației embrionilor zigotici de porumb (Zea mays), la 72 h de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), apă sărăcită în deuteriu (V1E) (bara reprezintă 1 cm).

II.3.2. Rezultate înregistrate la 7 zile de la punerea la germinat a cariopselor și a embrionilor zigotici de porumb de porumb (Zea mays)

A. Rezultate asupra cariopselor de porumb

În general, indicii de creștere au fost superiori la lotul cultivat pe medii preparate cu apă sărăcită în deuteriu (Tabelul …), cu excepția numărului de rădăcinițe (Fig…. și Fig….), dar toate diferențele, fie pozitive, fie negative au fost nesemnificative din punct de vedere statistic (Tabelul ….). Așadar în primele zile de germinație, rizogeneza a fost inhibată de prezența apei sărăcite în deuteriu, fapt semnalat și de către Petruș și colaboratorii (2011).

Tabelul. ….Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 7 zile de la punerea cariopselor la germinat pe următoarele medii de cultură: V0 – mediu de cultură MS, preparat cu apă distilată (AD), V1 – mediu de cultură MS, preparat cu apă sărăcită în deuteriu (ASD).

V0-martor

V1-ASD

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Fig. Exprimarea procentuală a valorilor medii ale indicilor de creștere ai vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 7 zile de la germinație, provenite din cariopse amplasate pe medii de cultură preparate cu apă sărăcită în deuteriu (V1E), comparativ cu martorul, embrioni zigotici cultivați pe medii preparate cu apă distilată (V0E), a căror valori au fost considerate ca fiind 100%.

V0C V1C

Fig…… Asp ecte ale vitroplantulelor provenite din cariopse de porumb (Zea mays), la 7 zile de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), apă sărăcită în deuteriu (V1E) (bara reprezintă 1 cm).

B. Rezultate asupra embrionilor zigotici de porumb

Sporurile de creștere ale plantulelor de porumb cultivate pe medii cu apă sărăcit în deuteriu au foarte semnificative, comparativ cu martor, în ceea ce privește lungimea rădăciniței (Tabelul … și Fig.). Dacă la plantulele provenite din cariopse, rizogeneza a fost inhibată de prezența ASD, la embrionii zigotici, puși la germinat direct pe mediu preparat cu o astdel de apă, rizogeneza a fost foarte semnificativ stimulată. Posibil ca unii compuși din endosperm să reacționeze cu apa și să producă inhibiția, sau accesul mai greu la apă din cauza tegumentului seminal ar fi o altă ipoteză la care ne-am gândit în explicare acestui fenomen.

Tabelul. ….Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 7 zile de la punerea embrionilor zigotici la germinat pe următoarele medii de cultură: V0 – mediu de cultură MS, preparat cu apă distilată (AD), V1 – mediu de cultură MS, preparat cu apă sărăcită în deuteriu (ASD).

V0-martor

V1-ASD

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Fig. Exprimarea procentuală a valorilor medii ale indicilor de creștere ai vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 7 zile de la germinație, provenite din embrioni zigotici amplasați pe medii de cultură preparate cu apă sărăcită în deuteriu (V1E), comparativ cu martorul, embrioni zigotici cultivați pe medii preparate cu apă distilată (V0E), a căror valori au fost considerate ca fiind 100%.

V0E V1E

Fig…… Asp ecte ale vitroplantulelor provenite din embrioni zigotici de porumb (Zea mays), la 7 zile de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), apă sărăcită în deuteriu (V1E) (bara reprezintă 1 cm).

II.3.3. Rezultate înregistrate la 14 zile de la punerea la germinat a cariopselor și a embrionilor zigotici de porumb (Zea mays)

La 14 zile de la punerea la germinat pe medii sterile, rata germinației a fost maxima embrioni și doar de 80%, 95 % la cariopse (Fig…). Totuși, lotul pe apă sărăcită s-a comportat mai bine, decât cel cultiva pe apă distilată.

Fig…. Exprimare procentuală a germinației embrionilor, respectiv a cariopselor de porumb (Zea mays), la 14 zile de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), apă sărăcită în deuteriu (V1E), apă distilată (V0C), apă sărăcită în deuteriu (V1C).

Greutatea proaspătă, dar și cea uscată a fost redusă la lotul de plantule provenit din embrioni și cultiva pe medii preparate cu AD (Fig….). Cea mai mare masă vegetală a fost înregistrată la lotul provenit din embrioni și cultivați pe medii cu ASD.

Fig…. Greutatea proaspătă și uscată a vitroplantulelor provenite din embrioni, respectiv din cariopse mature de porumb (Zea mays), la 14 zile de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), apă sărăcită în deuteriu (V1E), apă distilată (V0C), apă sărăcită în deuteriu (V1C).

A. Rezultate asupra cariopselor de porumb

La 14 zile de la punerea la germinat pe medii aseptice, vitroplantulele cultiva pe medii cu ASD, provenite fiind din cariopse mature de porumb au prezentat inhibiții semnificative statistic, înceea ce privește indicii de creștere vizând atât rizogeneza, cât și caulogeneza. Astfel că, dacă ASD a avut un efect stimulator asupra dezvoltării embrionului, în primele 7 zile de germinație, acest efect se pierde, devenind chiar un inhibitor a creșterii. Dacă rizogeneza a fost inhibată chiar de la startarea dezvoltării embrionului, la 14 zile de la inițierea culturilor, a fost inhibată semnificativ și caulogeneza (Tabelul… și Fig. ..), de altfel, ASD fiind cunoscută ca un inhibitor al diviziunilor celulare, implicit a creșterii.

Tabelul. ….Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 14 zile de la punerea cariopselor la germinat pe următoarele medii de cultură: V0 – mediu de cultură MS, preparat cu apă distilată (AD), V1 – mediu de cultură MS, preparat cu apă sărăcită în deuteriu (ASD).

V0-martor

V1-ASD

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Fig. Exprimarea procentuală a valorilor medii ale indicilor de creștere ai vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 14 zile de la germinație, provenite din cariopse amplasate pe medii de cultură preparate cu apă sărăcită în deuteriu (V1E), comparativ cu martorul, embrioni zigotici cultivați pe medii preparate cu apă distilată (V0E), a căror valori au fost considerate ca fiind 100%.

V0C V1C

Fig…… Asp ecte ale vitroplantulelor provenite din cariopse de porumb (Zea mays), la 14 zile de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0C), apă sărăcită în deuteriu (V1C).

Rezultate asupra embrionilor zigotici de porumb

În ceea ce privește creșterea vitroplantulele provenite din embrioni zigotice, se observă sporuri, chiar distinct semnificative (Tabelul….) în ceea ce privește rizogeneza – exprimată prin lungimea rădăciniții – la lotul cultivat pe medii cu ASD, situație care se perpetuează în acest experiment, ceea ce ne sugerează din nou că ipoteza stabilită la 7 zile, legată de posibile explicații a fenomenului rămâne în continuare valabilă. Sporurile privind indicii care exprimă caulogeneza au atins chiar valori de 30-40% (Fig….).

Tabelul. ….Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 14 zile de la punerea embrionilor zigotici la germinat pe următoarele medii de cultură: V0 – mediu de cultură MS, preparat cu apă distilată (AD), V1 – mediu de cultură MS, preparat cu apă sărăcită în deuteriu (ASD).

V0-martor

V1-ASD

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Fig… Exprimarea procentuală a valorilor medii ale indicilor de creștere ai vitroplantulelor de porumb (Zea mays), la 14 zile de la germinație, provenite din embrioni zigotici amplasați pe medii de cultură preparate cu apă sărăcită în deuteriu (V1E), comparativ cu martorul, embrioni zigotici cultivați pe medii preparate cu apă distilată (V0E), a căror valori au fost considerate ca fiind 100%.

V0E V1E

Fig…… Asp ecte ale vitroplantulelor provenite din embrioni zigotici de porumb (Zea mays), la 14 zile de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), apă sărăcită în deuteriu (V1E).

În special fitoinoculii constând din embrioni zigotici au prezentat, la bază un intens proces de calusogeneză (Fig….). Un fapt deosebit de important a fost acela că pe medii preparate cu ASD nu a fost semnalată apariția de formațiuni calusale fapt prezentat de Petruș și Cachita (2011), la sfecla de zahăr, o altă specie predispusă la acest fenomen, în condiții de vitrocultură. Vitroplantulele provenite din cariopse au dispus de o neoformare de calus mai diminuată, comparativ cu cele provenite din embrioni, probabil că resturile de endosperm rămase la suprafața embrionilor zigotice în momentul extragerii lor au favorizat această intensificare a calusogenezei la acest nivel.

A B

C

Fig…… Asp ecte ale calusului regenerat la baza vitroplantulelor provenite din embrioni zigotici de porumb (Zea mays), la 14 zile de la inițierea culturilor, pe medii aseptice preparate cu apă distilată (V0E), in recipient (A, B) și ex vitro (C) (bara reprezintă 1 cm).

CONCLUZII

Dacă într-o primă etapă a germinației apa sărăcită în deuteriu, cu 25 ppm D, a stimulat creșterea vitroplantulelor provenite din cariopse mature, cu excepția rizogenezei, efectul inhibitor al acesteia s-a evidențiat și asupra caluogenezei în perioada de creștere a vitroplantulelor.

Apa sărăcită în deuteriu, cu 25 ppm D a determinat stimularea atât a germinației, cât și a creșterii vitroplantulelor de porumb (Zea mays), provenite din embrioni zigotici.

La porumb a fost eliminat în întregime fenomenul nedorit de calusogeneză la baza fitoinoculilor prin punerea la germinat a embrionilor zigotici, respectiv a cariopselor mature pe medii preparate cu apă sărăcită în deuteriu, cu 25 ppm D, un aspect deosebit de important pentru producătorii în domeniu, metoda fiind una ecologică și bio-economică de prevenire a formării de calus.