Valorificarea Superioara a Principiilor Active din Paducel

LUCRARE DE DISERTAȚIE

VALORIFICAREA SUPERIOARĂ A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN PĂDUCEL

(Crataegus monogyna)

Capitolul I. SURSA VEGETALĂ – PĂDUCELUL (Crataegus monogyna)

Noțiuni generale ale genului Crataegus

"Numele genului Crataegus, familia Rosaceae, este derivat din cuvântul grecesc kratos însemnând duritatea lemnului acest gen cuprinde un grup complex de arbori și arbuști, originali din zonele Nord temperate, majoritatea între latitudinile 30° și 50° N".

Crataegus aparține subfamiliei Maloideae din familia Rosaceae, un grup natural de genuri complexe cu abilitatea de a se încrucișa liber (hibridizare).

În general se prezintă sub formă de arbori mari sau există ca arbuști dominanți în păduri. Unele specii sunt incontestabil arbuști, în timp ce altele pot crește la înălțimi de 12 m, deși majoritatea speciilor pot atinge dimensiuni ale arborilor de diferite proporții.

Păducelul se referă la arbustul Crataegus și este distribuit pe scară largă în întreaga regiune Nord temperată a lumii cu aproximativ 280 de specii.

Frunzele au 15 mm – 5 cm lungime, sunt netede și au marginile crestate cu trei sau șapte lobi. Florile cresc în grupuri de 5-12 cu margini colorate de la alb la roz, de la roz la roșu. Ele conțin ambele caractere masculine și feminine și sunt de obicei fertilizate de insecte, care sunt atrase de parfumul eliberat de flori.

Fructele false de formă ovală sunt cunoscute ca fructe de pădure de culoare roșu-verzui când apar la început, transformându-se în roșu aprins și apoi în roșu închis [1].

Utilizări tradiționale ale păducelului

"Păducelul (genul Crataegus, familia Rosaceae) este utilizat în medicină în calitate de remediu antiaritmic, cardiotonic, antihipertensiv, sedativ. Se utilizează florile și frunzele, recoltate în perioada butonizării și înfloririi, dar și fructele la etapa finală a dezvoltării. Există o gamă variată de produse farmaceutice din păducel, sub formă de extract uscat și tincturi" [2].

Un decoct din frunze și fructe necoapte din Crataegus aronia este folosit în tratamentul bolilor cardiovasculare, cancer, diabet și afecțiuni sexuale în medicina tradițională Arabă.

În Mexic, diabetul este tratat cu extracte de păducel. Acest tip de tratament poate avea beneficii considerabile în special la începutul stadiilor de dezvoltare ale bolilor.

În medicina tradițională, câteva specii de păducel sunt utilizate în general pentru tratarea afecțiunilor cardiovasculare incluzând: Crataegus pinntifida (păducelul chinezesc), Crataegus pubesens (păducelul mexican), Crataegus laevigata și Crataegus monogyna (Europa), Crataegus oxycantha și Crataegus aronica (Orientul Mijlociu), Crataegus phaenopyrum (păducelul american) și Crataegus ambigua (păducelul rusesc).

Păducelul (Crataegus pinntifida) are fructe comestibile utilizate în medicina tradițională chinezească pentru a scădea lipidele din plasmă.

Fructele uscate ale Crataegus pinntifida au fost utilizate în mod tradițional în medicina orientală și au fost folosite în băuturile fine din Taiwan [1].

1.3. Compoziția chimică a păducelului

Fructele, frunzele și florile de păducel conțin un număr de constituienți chimici, precum flavonoidele (0,1% – 1% în fructe, 1% – 2% în frunze și flori), proantocianidine oligomere (1% – 3% în fructe sau frunze și flori), acizi triterpenici (0,5 – 1,4% în fructe), acizi organici (2% – 6%), steroli și urme de amine cardioactive [3].

1.3.1. Compușii fenolici din păducel

Câteva grupări de compuși fenolici, incluzând procianidine, flavanole, flavonole, C-glicozil flavone, acizi fenolici, antociani și liganzi s-au identificat în diferite părți ale păducelului. În fructe, procianidinele oligomere și glicozidele lor sunt compușii fenolici majoritari, în timp ce favonolii, flavonol glicozidele și C-glicozil flavonele sunt predominante în frunze.

1.3.1.1. Procianidinele

Procianidinele din păducel sunt compuse în principal din (-)-epicatechina ca unitate flavan-3-ol. Doar în câteva rapoarte s-a menționat despre existența catechinei în specia Crataegus, fie sub formă de monomer sau ca și unitate constitutivă în procianidinele oligomere și polimere.

Procianidinele identificate până în acest moment sunt exclusiv de tip-B (flavan-3-ol legat prin legături simple C-4/C-8 sau C-4/C-6 legături inter-flavanole). Mai mult de 30 de procianidine oligomere au fost identificate în fructele și frunzele speciei Crataegus.

Conținutul și profilul procianidinelor glicozidice poate fi utilizat ca marcaj chemotaxonomic pentru identificarea diferitelor specii Crataegus.

Doar câteva structuri ale oligo-procianidinelor din păducel au fost determinate în detaliu. Este dificil de identificat toate procianidinele deoarece: conținutul lor din majoritatea compușilor din păducel este scăzut, purificarea și izolarea acestor compuși sunt dificile, absența informațiilor compușilor de referință, absența unei metode de analiză struncturală fiabilă.

1.3.1.2. Flavonolii și flavonol glicozidele

Quercitina, kampferolul și 8-metoxikampferolul sunt flavonol agliconii prezenți în păducel. Hiperozida, izoquercitina și rutina sunt adesea prezentate ca flavonol glicozidele majoritare. Cercetătorii au identificat agliconi și glicozide ale flavonolelor în C. monogyna, C. laevigata, C. pentagyna, C. nigra și C. azarolus.

1.3.1.3. C-glicozil flavonele

Majoritatea flavonelor din păducel sunt derivate ale apigeninei și luteolinei. Vitexina (apigenin- 8-C-glucozida) și derivatele sale precum vitexin- -O-ramnozida sunt cele mai cunoscute C-glicozil flavone care se găsesc în speciile de păducel identificate până în prezent.

Profilul flavonelor C-glicozidice din păducel poate fi un marcaj important chemotaxonomic în diferențierea speciilor de păducel. Vitexin- -O-ramnozida, vitexina și izovitexina au fost identificate în vârfurile înflorite ale C. monogyna, C. pentagyna și C. laevigata. Vitexin- -O-(4'''-O-acetil)-ramnozida este un compus predominant în C. monogyna dar nu a fost detectată în C. laevigata și C. pentagyna.

Prezența celor două legături (C8-C1' și C7-O-C2'') dintre unitățile de apigenină și fructoză este o trăsătură comună a acestor compuși.

1.3.1.4. Alți compuși fenolici

Acidul clorogenic a fost identificat atât în fructele cât și în frunzele speciilor de păducel. Totuși, izomerul acestuia, acidului 5-O-cafeoilchinic (acidul neoclorogenic) a fost descoperit doar în fructele C. grayana.

1.3.2. Acizii triterpenici

Acizii triterpenici au fost propuși a fi alt grup de compuși bioactivi din speciile de păducel. Probele au arătat faptul că acizii triterpenici au afecte benefice precum activitatea anti-canceroasă.

Acidul oleanolic și acidul ursolic sunt acizii triterpenici majoritari și au fost identificați în fructele de păducel. Totuși, doar acidul oleanolic a fost determinat în frunzele de păducel [4].

Capitolul al II-lea. APIGENINA

2.1. Flavonoidele

Flavonoidele sunt compuși fenolici omniprezenți în natură și clasificați potrivit structurii chimice în: flavonole, flavone, flavanone, izoflavone, catechine, antocianidine și calcone.

Flavonoidele au stârnit recent un interes considerabil datorită potențialelor efecte biologice asupra sănătății umane, în care acestea au activitate: antivirală, antialergică, antiagregantă, anti-inflamatoare, anti-tumorală și antioxidantă.

Indiferent de activitatea lor diversă farmacologică și fiziologică, utilizarea lor ca și medicamente și aditivi alimentari a fost restricționată datorită insolubilității lor în apă si absorbției scăzute. Asemenea compuși devin solubili în apă și stabili când sunt glicozilați și manifestă proprietăți biodisponibile și farmacologice [5].

Flavonele și izoflavonele conțin pe inelele A și C grupări hidroxilice și metoxilice. Dacă pe inelul heterociclic se află grupări hidroxilice, pigmenții se numesc flavanoli și izoflavanoli. Dintre flavonele mai răspândite, fac parte: apigenina, luteolina și quercitrina.

Flavonele sunt substanțe cristaline, de culoare galbenă, solubile în apă și alcool. În mediu alcalin, inelul piranic se deschide și se formează dicetone. Flavonele au maxime de absorbție cuprinse între 335-350 nm, iar flavanolii între 360-380 nm. Cu metalele, flavonele formează complecși.

Se dizolvă în acid sulfuric concentrat dând soluții galbene, datorită formării sărurilor de flaviliu. Flavonele prezintă în ultraviolet două sau trei benzi de absorbție caracteristice. Flavanolii care au un număr mare de grupări hidroxilice și metoxilice pe inelul A sunt intens colorați în galben [6].

2.2. Apigenina

Apigenina: 4', 5, 7 – trihidroxiflavona

(5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-1benzopiran

-4-onă) este un membru al subclasei flavonelor,

având formula moleculară: C15H10O5 și masa

moleculară: 270.24 g/mol.

Tabelul 1 – Principalele surse alimentare în care se găsește apigenina [7]

Fiind un flavonoid cu activitate biologică, se poate găsi din belșug într-o varietate de elemente constitutive dietetice, numeroase studii demonstrează faptul că apigenina poate influența tranziția celulelor de la cele normale la cancerigene, și poate fi considerat agent chemopreventiv, care stă la baza beneficiilor oferite de o dieta sănătoasă [8].

Se încearcă extracția apigeninei cu o eficiență ridicată și costuri reduse din complex-componentul materialului vegetal. Faptul că peretele celular vegetal este constituit din celuloză, hemiceluloză și pectină, constituie o barieră pentru eliberarea de substanțe intracelulare. Cele 3 elemente constitutive pot fi hidrolizate utilizând celulaza, β-glucozidaza, și pectinaza [9].

Apigenina alături de rutină, hiperozidă, kaemferol, acid crategolic, quercitină și vitexin-rahmnoză constituie principiile active cele mai importante din fructele de păducel Crataegus monogyna, ce prezintă și o activitate farmaceutică de importanță deosebită [10].

2.3. Proprietățile fizice ale apigeninei

Apigenina se prezintă sub forma unui solid cristalin de culoare gălbuie, care a fost folosit pentru vopsirea lânii. Aceasta este insolubilă în apă și ușor solubilă în metanol și etanol [11].

Tabelul 2 – Proprietățile fizice ale apigeninei [12]

2.4. Proprietățile chimice ale apigeninei

2.4.1. Cuplarea oxidativă a apigeninei

Cuplarea oxidativă a speciilor cu radicali liberi derivați din substraturile fenolice este acum în general acceptată ca și calea prin care mai multe produse naturale complexe sunt biosintetizate.
O astfel de cale a fost sugerată ca fiind implicată în formarea grupul de compuși cunoscuți ca și biflavoni, aceștia fiind larg distribuiți printre gimnosperme, posedă fragmentul de apigenină ca o caracteristică structurală comună.

Având în vedere succesul care s-a realizat în ultimii ani prin sintetizarea produselor naturale prin cuplarea oxidativă a monomerilor fenolici folosind un electron ca agent de oxidare, a fost un moment oportun de a se încerca sinteza biflavonilor printr-o astfel de metodă și de a se determina dacă produsul sau produsele rezultate prezintă aceleași moduri de cuplare precum cele care apar la compușii naturali.

Oxidarea apigeninei în soluție apoasă de carbonat de sodiu la temperatura camerei sub atmosferă de azot cu fericianură de potasiu a rezultat un produs care a fost identificat prin cromatografie pe strat subțire pe silicagel în amestec de toluen-formiat de etil-acid formic (5:4:1) pentru a forma un amestec nereacționat de apigenină și doi compuși cu valori ale Rf-ului similare cu cele ale amentoflavonei și hinokiflavonei.

După îndepărtarea parțială a apigeninei prin triturare cu metanol rece, reziduul cel mai puțin solubil a fost supus cromatografiei pe Sephadex LH-20 în metanol. Eluatul a fost monitorizat prin absorbția de undă la 254 nm, în acest mod produsul de reacție a fost separat în trei fracțiuni, care constă din apigenina, dimerul A (11%) și dimerul B (21%) respectiv, în ordinea eluției.

Pnetru fiecare fracțiune s-a identificat un singur spot pe plăcuța cromatorafică. Este interesant de remarcat că, deși Sephadex LH-20 este în mod normal privit ca un mediu de filtrare în gel, apigenina a precedat fracțiunile dimere la eluare și separare, trebuie, prin urmare, să fie realizate prin intermediul adsorbției diferențiate, demonstrând cu atât mai mult eficacitatea acestui material în coloana cromatografică pentru flavonoide.

Biflavonoidele naturale nu sunt formate prin cuplaj radicalic, ci mai degrabă prin atacul electrofil al radicalului la a doua moleculă de apigenină [13].

2.5. Rol și domenii de utilizare

Apigenina este utilizată în suplimente alimentare, în nutriție, în produsele farmaceutice și cosmetice. Aplicată în domeniul alimentar, aceasta este utilizată pe scară largă ca aditiv alimentar.

În domeniul produselor de sănătate, aceasta deține functia de întarire a stomacului, ușurează digestia și prevenirea sindromului postpartum iar în domeniul farmaceutic, este frecvent utilizată în tratarea bolilor coronariene și angină pectorală [14].

Aceasta posedă potențialul de a reduce riscul de cancer, deoarece are activitate anti-tumorală, de asemenea, ar putea fi utilă în alergii, deoarece aceasta poate avea proprietăți anti-inflamatorii.

S-a arătat că apigenina inhibă creșterea celulară, sensibilizează celulele canceroase la eliminarea prin apoptoză și împiedică dezvoltarea vaselor de sânge pentru a servi tumorii în creștere, de asemeni, a fost asociată cu o scădere sugestivă a riscului de cancer ovarian.

Acest flavonoid are de asemenea, acțiuni care modifică relația celulelor canceroase cu micromediul lor, este capabilă de a reduce absorbția glucozei celulelor canceroase, inhibă remodelarea matricei extracelulare, inhibă moleculele de adeziune celulară care participă la progresia cancerului.

Rezultatele comportamentale și biochimice indică proprietățile sale antidepresive, care pot fi mediate de efectele dopaminei din creier de șoarece.

Flavonoidul, apigenina, inhibă motilitatea și invazia celulelor carcinomului in vitro [5].

Capitolul al III-lea. PELE PROCESĂRII PRODUSULUI VEGETAL PENTRU OBȚINEREA APIGENINEI

3.1. Schema de valorificare a plantelor medicinale prin procesarea avansată

3.1.1. Procesarea primară

Procesarea primară constă în uscarea, condiționarea și ambalarea plantelor.

3.1.2. Procesarea avansată

Constă în transformarea materiilor prime obținute la procesarea primară în produse care se comercializează: produse fitoterapeutice (soluții extractive apoase, soluții extractive hidroalcoolice, pulberi lioflizate din soluții extractive), cosmetice, suplimente nutritive și dietetice, aditivi alimentari de aromatizare.

3.2. Schema tehnologică de valorificare a frunzelor de păducel prin procesarea avansată

3.3. Operațiile tehnologice realizate la procesarea avansată a frunzelor de păducel

3.3.1. Recepția

Materia primă se recepționeză pe loturi, în funcție de proveniență și calitate, pe bază de buletin de analiză, bon de predare, bon de consum în procesul de producție.

Recepția calitativă se face prin verificarea următorilor parametri: autenticitatea plantei, umiditate, conținut în corpuri străine organice și minerale, conținut de impurități.

3.3.2. Condiționare

Se îndepărtează impuritățile (definite conform specificației tehnice a materiei prime), corpurile străine organice și minerale. La sfârșitul operației se prelevează probe din produsul vrac și se verifică indicii calitativi menționați în specificația tehnică a produsului. Rezultatele se înregistrează în buletinul de analiză și trebuie să se încadreze în limitele prevăzute. Deșeul nevalorificabil se distruge conform normelor în vigoare.

3.3.3. Concișare/sitare

Produsul vegetal condiționat se trece prin tocatorul reglat pentru o lungime a fragmentelor egală cu 10 mm. Pe parcursul operației, se prelevează probe din produsul concisat și se verifică corectitudinea operațiilor efectuate. Deșeul valorificabil (fragmentele cu dimensiuni mai mari) se reintroduc în sistemul de tocare, dacă rezultatele analizei de laborator confirmă recuperarea produsului produsului util se face în condiții de eficiență economică. Deșeul nevalorificabil (fragmentele cu dimensiuni mai mici) se distruge conform normelor în vigoare.

3.3.4. Extracția compușilor bioactivi

Se realizează într-un extractor din inox sau sticlă, utilizând ca solvent o soluție de alcool etilic 30-50% în cazul preparării extractelor hidroalcoolice sau alcool 70% (pentru prepararea extractelor alcoolice – tincturi). Timpul de extracție este diferit în funcție de natura extractului.

3.3.5. Filtrarea

Soluția extractivă rezultată se filtrează pentru îndepărtarea impurităților solide. Datorită conținutului ridicat de particule solide din extract se utilizează în general sisteme de filtre cu plăci. Pachetul filtrant este constituit din plăci și rame realizate din material plastic sau din oțel inox. Filtrarea se face cu ajutorul pânzei filtrante sau cartoanelor speciale pentru filtrare. Deșeul nevalorificabil se distruge conform normelor în vigoare.

3.3.6. Purificarea și concentrarea soluției extractive

Se propune a se realiza prin metode moderne implicând tehnologiile membranare: microfiltrarea și ultrafiltrarea. Prin microfiltrare se îndepărtează compușii coloidali, precum și suspensiile de particule de dimensiuni cuprinse între 0,02 și 10 μm (virusuri, bacterii, drojdii) asigurându-se în această etapă clarificarea și sterilizarea extractului. Prin ultrafiltrare se realizează concentrarea extractului prin reținerea de către membrană a claselor de compuși cu mase moleculare mai mari decât porii membranei; prin alegerea membranei adecvate se poate realiza concentrarea extractului în compușii bioactivi de interes. Pentru aceste operații tehnologice se poate utiliza o instalație automatizată care are în componență un cartuș de microfiltrare și 1-2 cartușe de ultrafiltrare.

Avantajele utilizării acestor procese membranare sunt: procesarea extractelor la temperatura mediului abiant (cca. 20°C) evitând denaturarea și distrugerea unor compuși biologic activi termolabili, fără intervenția unor reactivi chimici și un consum de energie foarte scăzut.

3.4. Produsele rezultate în urma procesării avansate a păducelului (Crataegus monogyna, Fam. Rosaceae)

Extractul de păducel, alături de alte extracte din plante, intră în compoziția preparatelor cosmetice pentru îngrijirea tenurilor uscate, iritate (pe bază nervoasă) și a preparatelor de îngrijire corporală (ulei de masaj, creme), având un efect de calmare, relaxare și proprietăți antioxidante (prin flavonoidele conținute). Taninurile din compoziție îi conferă un efect ușor astringent și il fac util și în tratarea tenurilor grase, seboreice.

Extractul de păducel este folosit în preparate cosmetice destinate îngrijirii și igienei părului (șampon, balsam, mască) [15].

Capitolul al IV-lea. TEHNICI DE ACȚIE A APIGENINEI

4.1. Determinarea flavonoidelor din frunzele de păducel prin analiza HPLC

Conținutul în flavonoide din frunzele de păducel a fost măsurat, comparat și analizat utilizând spectrofotometria UV-VIS de două tipuri.

Pentru determinarea conținutului de flavonoide din păducel s-au luat în analiză 2 probe de frunze, acestea au fost uscate în etuvă la 50°C pentru 18 ore și măcinate printr-o moară Wiley pentru a trece printr-o plasă cu dimensiunea ochiurilor de 30-40 și stocate ermetic la 4°C. 10 g din fiecare probă au fost dizolvate în 30 mL metanol, apoi agitate într-o baie utra-sonică pentru 30 minute.

Extractele au fost filtrate pe hârtie de filtru Whatman de 0,5 μm pentru a elimina fibrele și materia nedizolvată, extractul a fost pre-concentrat la aburi de N2 până la proximativ 0,5 mL și apoi s-a completat volumul până la 1 mL cu faza mobilă, apoi 20 μL din filtratul apos au fost injectați în coloana HPLC.

Conținutul de flavonoide ce a fost determinat prin această metodă este următorul: querecetina (18,24%), kaemferol (16,59%) și apigenina (11,98%) [10].

4.2. Determinarea compușilor farmacologic activi din frunzele și florile de păducel (Crataegus monogyna) prin metoda HPLC-UV

"Procedura de standardizare cuprinde de asemenea dozarea procianidinelor totale prin metoda Folin-Ciocâlteu" [34].

Metoda HPLC propusă a permis de a simplifica considerabil procedura de preparare a probelor.

"Metoda Folin-Ciocâlteu, cunoscută sub numele de metoda de echivalare a acidului galic, este compusă dintr-un amestec de fosfomolibdat și fosfotungstat, acestea fiind utilizate pentru testul colorimetric in vitro al antioxidanților fenolici și polifenolici. Aceasta metodă este denumită după Otto Folin, Vintilă Ciocâlteu și Willey Glover Denis".

Reactivul folosit nu măsoară numai cantitatea de fenoli, dar și capacitatea totală de reducere a unei probe, de asemeni este folosit pentru testarea proteinei Lowry și reacționează cu unii compuși care au în compoziție azot, precum hidroxilamină și guanidină.

Acest reactiv s-a dovedit a fi reactiv la tioli, multe vitamine, baza nucleotidică guanina, trioze gliceraldehide, dihidroxiacetona precum și unii ioni anorganici, reactivul acesta este diferit de reactivul lui Folin, care este utilizat pentru a descoperi amine și compuși care conțin sulf.

Deoarece cu ajutorul acestei metode se măsoară conținutul de antioxidanți in vitro, reactivul a fost întrebuințat pentru a analiza alimente și suplimente alimentare în cercetare.

Capacitatea de absorbție a radicalilor cu oxigen este folosită ca metodă stas în industria alimentară pentru determinarea potențialului antioxidant în alimentele integrale, sucuri și aditivi alimentari [34].

Scopul acestei lucrări constă în elaborarea unor proceduri simple și eficace de dozare a mai multor compuși activi în specia C. monogyna care pot fi utilizate pentru standardizarea materiei prime și a produselor extractive.

S-a utilizat cromatograful de lichide din seria Jasco LC-2000, dotat cu două pompe, amestecător dinamic sau static (opțional) de presiune înaltă, injector manual, termostat de coloane și detector UV-VIS cu șir de diode. Componenții soluției tampon au fost cu grad de puritate absolută, iar acetonitrilul – pentru HPLC.

Metodele de dozare a compușilor activi din frunzele și florile de păducel, presupun hidroliza diferitor glicozide flavonice și flavonolice până la vitexină și quercetină înaintea separării cromatografice.

Această abordare permite analiza diferitor specii din genul Crataegus prin metode unificate, iar prepararea probelor pentru cele două grupe de flavonoizi este îndelungată și separată.

Separarea cromatografică s-a realizat pe coloana analitică cu faza inversă în gradient de concentrație a acetonitrilului în tampon fosfat.

Condițiile cromatografice au fost optimizate pentru atingerea rezoluției suficiente la durata minimă a analizei, luând în considerație faptul că profilul gradientului real diferă de cel programat și depinde de parametrii sistemului cromatografic, în special ai amestecătorului de solvenți.

Pentru analiza cantitativă s-a aplicat metoda standardului extern, utilizând soluția de calibrare cu conținut de acid clorogenic, hiperozidă și vitexin- -O-ramnozidă, a câte 40 mg/L fiecare.

Pentru analiza produsului vegetal s-a utilizat o tehnică simplă de preparare a probelor: circa materie primă fragmentată, se trece prin sita cu diametru orificiilor 1 mm, apoi se introduce în balon cu capacitatea 100 mL, se adaugă 50 ml alcool etilic 40%, se încălzește pe baia de apă la temperatura 60 timp de 30 min, amestecând periodic.

Conținutul balonului se filtrează prin tampon de vată într-un balon cotat cu capacitatea 100 mL. Tamponul cu materia primă se reîntorc în primul balon și extracția se repetă încă o dată în aceleași condiții. Extractul obținut se răcește până la temperatura și se completează până la volumul de 100 mL cu extract pur, apoi se centrifughează 5 min la 3000-. Câte 10 L probă obținută și a soluției standard se injectează consecutiv în sistemul cromatografic. Regăsirea analiților la aplicarea acestei tehnicii de extracție constituie circa 99% pentru glicozide flavonice și flavonolice și circa 96% pentru acizi oxicinamici.

La analiza produselor extractive din cu flori de păducel se aplică diluarea de 20-100 ori (pentru tincturi și extracte lichide) sau dizolvarea în alcool etilic 20-40% (pentru extractele uscate și formele farmaceutice solide), urmată de centrifugare sau filtrarea prin membrană.

Dozarea prin metoda HPLC a procianidinelor – uneia din grupele de substanțe active – este problematică, deoarece pe cromatograme se depistează doar catehina, epicatehina și unii oligomeri inferiori (detectați la 280 nm), care prezintă doar o parte minoră din conținutul total al procianidinelor.

Soluționarea acestei probleme este posibilă prin dozarea procianidinelor, exprimate ca suma compușilor fenolici, aplicând metoda Folin-Ciocâlteu, având în vedere faptul, că procianidinele constituie o parte majoră din cantitatea totală a componenților fenolici în această plantă.

Pentru a înlătura acest inconvenient s-a utilizat metoda modificată în varianta semi-micro. Esența modificării constă în majorarea valorii pH-ului amestecului reactant prin înlocuirea soluției carbonat de sodiu concentrat cu tampon carbonat-hidroxid. Ca rezultat timpul optim al reacției s-a micșorat până la 10-15 min.

Tehnica de lucru pentru dozarea sumei compușilor fenolici: 20 l probă, preparată pentru analiza HPLC, se diluează cu 2 ml apă, se adaugă 30 L reactiv Folin-Ciocâlteu, apoi se adaugă 400 L soluție tampon cu conținut de 0,4 mol/L Na2CO3 și 0,3 mol/L NaOH. În intervalul 10-15 min după adăugarea ultimului reactiv se citește absorbanța la lungimea de undă 740 nm, folosind în calitate de soluție de compensare amestecul de reactivi. Paralel se citește absorbanța probei de etalonare, preparate din 20 L soluție alcoolică de (-) epicatehină 0,5 mg/mL. Circa 75% din valoarea găsită aparține sumei procianidinelor.

Alte substanțe fenolice de asemenea reacționează cu reactivul Folin-Ciocâlteu, dar cu sensibilitatea redusă. Răspunsul relativ față de (-) epicatehină a constat 0.89 pentru acidul clorogenic, 0.64 pentru hiperozidă și 0.41 pentru vitexin- -O-ramnozidă [2].

Capitolul al V-lea. SINTEZA CHIMICĂ A APIGENINEI

În chimia organică există câteva metode utilizate pentru sinteza flavonelor, precum reacția Allan-Robinson și rearanjarea Wessely-Moser etc. Aceste metode sunt utilizate pentru obținerea flavonelor precum: apigenina (4',5,7-trihidroxiflavona), luteolina (3', 4', 5, 7-tetrahidroxiflavona) și tangeritina (4', 5, 6, 7, 8-pentametoxiflavona).

5.1. Sinteza flavonelor și izoflavonelor: reacția Allan-Robinson

Condensarea ο-hidroxiaril cetonei cu anhidrida acidului aromatic și sărurile de sodiu corespunzătoare, duce la formarea de flavonă sau izoflavonă. Reacția este cunoscută sub numele de sinteza sau reacția Allan-Robinson. Acetilarea deoxibenzoinei în condiții ușoare produce izoflavona, de exemplu: ω, p-nitrofenilfluoroacetofenona 5,7-dihidroxi-2-metil-4'-nitroizoflavona [16].

5.2. Rearanjarea Wessely-Moser

Rearanjarea Wessely-Moser (1930) a fost un instrument important în elucidarea structurii flavonoidelor. Aceasta implică conversia 5,7,8-trimetoxiflavonelor în 5,6,7-trihdroxiflavone cu hidroliza grupelor metoxi la grupările fenol.

De asemenea, are un potențial sintetic, de exemplu: această reacție de rearanjare are loc în mai multe etape conform Schemei 2: A deschiderea ciclului dicetonei, rotația legăturii B cu formarea acetilacetonei ca interacțiune cu fenilcetona și C hidroliza a două grupări metoxi și închiderea ciclului [18].

5.3. Sinteza apigeninei din floroglucinol

Este o metodă convenabilă și eficientă de obținere a apigeninei din floroglucinol. După cum reiese din Schema 4, apigenina a fost sintetizată din floroglucinolul 16 în cinci etape.

În prima etapă, floroglucinolul 16 a fost acilat la 1-(2,4,6-trihidroxi-fenil)-etanona 17 cu ajutorul rearanjării Fries [19]. Eficiența acestei transformări se știe că depinde în principal de cantitatea de BF3∙Et2O utilizată.

Rearanjarea Fries, numită după chimistul german Karl Theophil Fries, este o reacție de rearanjare a unui fenil ester la o hidroxi aril cetonă utilizând catalizatori ai acizilor Lewis (orice substanță care poate accepta o pereche de electroni pentru a forma o legatură coordinativă se numește acid Lewis , ex: NH4+, H3O+) [20].

Aceasta implică migrarea unei grupări acil de la fenil ester la inelul benzenic. Reacția este orto și para selectivă și una din cele două substanțe poate fi favorizată prin schimbarea condițiilor de reacție, cum ar fi temperatura și solventul.

În ciuda multor eforturi, un mecanism de reacție definitiv pentru rearanjarea Fries nu este disponibil. Dovezi pentru mecanismele inter- și intramoleculare au fost obținute prin așa-numitele experimente încrucișate cu reactanți micști. Progresul reacției nu depinde de solvent sau de substrat. Un mecanism acceptat pe scară largă implică un carbocation intermediar [19].

În cea de-a doua etapă, se realizează tratarea compusului 17 cu 2,5 echivalenți de dimetilsulfat (Me2SO4) în prezența carbonatului de potasiu în soluție de etanol la 80°C timp de 3 ore rezultând compusul 4 cu un randament bun.

În a treia etapă, are loc condensarea lui 18 cu anisaldehida 19 utilizând hidroxidul de potasiu etanolic rezultat în calcona 20, care a fost atunci tratată cu soluție de iod în DMSO, pentru a rezulta flavona 21.

În ultima etapă, flavona 21 a fost tratată cu hidroclorură de piridină pentru a se realiza demetilarea cu scopul de a se obține apigenina cu un randament bun. Sinteza apigeninei prin această metodă a fost realizată cu un randament global de 40% [20].

Modul operatoriu:

Toate reacțiile au fost monitorizate prin cromatografie pe plăcuță, puncte de topire s-au măsurat cu un aparat de tip YRT – 3 pentru determinarea temperaturii de topire și sunt necorectate. Spectrele IR au fost înregistrate pe Impact 400 Spectrometru FT-IR. Datele spectrale RMN au fost înregistrate pe un spectrometru RMN Bruker DRX 500.

1-(2,4,6-trihidroxi-fenil)-etanona (17): Floroglucinolul 16 (10 g) și anhidrida acetică (18 mL) au fost dizolvate în acetat de etil (40 mL), și BF3∙Et2O (13,8 g) a fost adăugat prin picurare. Amestecul de reacție a fost încălzit la 50°C pentru 10 ore. Apoi H2O (150 mL) a fost adăugată și amestecul de reacție a fost extras cu acetat de etil. După evaporarea solventului cu ajutorul rotavaporului, amestecul de reacție rezultat a fost recristalizat cu H2O pentru a rezulta compusul 17 (12 g); randament 86%, cristale de culoare galbenă, punct de topire: 219-220°C; IR (KBr/cm−1): 3201 (OH), 1616 (C=O); 1H RMN (400 MHz, CDCl3):12.23 (s, 2H, OH), 10.38 (s, 1H, OH), 5.79 (s, 2H, ArH), 2.50 (s, 3H, COCH3).

2-Hidroxi-4,6-dimetoxiacetofenona (18): Compusul 17 (16,8 g), K2CO3 (28 g) și p-toluensulfonat de metil (40,8 mL) în etanol (250 mL) au fost încălzite la 80°C timp de 3 ore. Amestecul de reacție a fost turnat în H2O (500 mL) apoi precipitatul a fost filtrat și recristalizat cu metanol pentru a da compusul 18 (13,3 g); randament 68%, cristale de culoare albă, punct de topire: 79-80°C; IR νmax (KBr/cm−1): 3461 (OH), 1619(C=O); 1H RMN (400 MHz, acetona-d6): 13.79 (s, 1H,OH), 6.10 (s, 1H, ArH), 6.07 (s, 1H, ArH), 3.84 (s, 3H, OCH3), 3.79 (s, 3H, OCH3), 2.53 (s, 3H, COCH3).

2'-Hidroxi-4,4',6'-trimetoxicalcona (20): Compusul 18 (3 g), anisaldehida 19 (2,5 g) și KOH (12 g) în metanol (250 mL) au fost lăsate sub agitare la temperatura camerei timp de 72 ore. Apoi amestecul de reacție a fost neutralizat până la pH = 7 cu o soluție de HCl 37%. Precipitatul obținut a fost îndepărtat prin filtrare, spălat cu apă și recristalizat cu etanol și s-a obținut compusul 20 (3,32 g); randament 87%, cristale de culoare galbenă, punct de topire: 114-115°C; IR νmax (KBr/cm−1): 3648 (OH), 1622 (C=O), 1580 (C=C); 1H RMN (500 MHz, CDCl3): 14.42 (s, 1H, OH), 7.83 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.57–7.56 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.94–6.92 (d, J = 8.3Hz, 2H), 6.11 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 3.91 (s, 3H, OCH3), 3.85 (s, 3H, OCH3), 3.84 (s, 3H, OCH3).

4',5,7-Trimetoxiflavona (21): Compusul 20 (2,5 g), iod (0,2 g) în DMSO (25 mL) au fost încălzite la 100°C timp de 4 ore. Apoi o soluție de NaHSO3 0,5% (50 mL) a fost adăugată pentru a înlătura iodul. Precipitatul format a fost îndepărtat prin filtrare, spălat cu apă și recristalizat cu un amestec etanol/apă (1:1) pentru a rezulta compusul 21 (2,15 g); randament 86%, cristale de culoare albă, punct de topire: 153-154°C; IR νmax (KBr/cm−1): 1647 (C=O), 1607 (C=C); 1H RMN (400 MHz, MeOD): 7.96–7.94 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.12–7.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.69 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 2.0 Hz,1H), 4.07 (s, 3H), 4.03 (s, 3H), 4.00 (s, 3H).

4',5,7-Trihidroxiflavona (22): Amestecul dintre compusul 21 (6,2 g) și un exces de hidroclorură de piridină (22,8 g) a fost încălzit la 180-190°C timp de 6 ore sub atmosferă de N2. Apoi amestecul rezultat a fost lăsat să se răcească la temperatura camerei și s-au adăugat etanol (20 mL) și H2O (100 mL). Amestecul de reacție a fost lăsat sub agitare timp de 10 minute. Precipitatul format a fost îndepărtat prin filtrare, spălat cu etanol și recristalizat cu etanol pentru a rezulta compusul 22 (4,9 g); randament 90%, cristale ce culoare galbenă, punct de topire: 345-346°C (lit.3 348–350 °C); IR νmax (KBr/cm−1): 3527 (OH), 1656 (C=O), 1445 (C=C); 1H RMN (500 MHz, CDCl3): 12.95 (s, 1H, OH), 10.84 (s, 1H, OH), 10.36 (s, 1H, OH), 7.92 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 6.18 (s, 1H) [21].

5.4. Sinteza apigeninei cu ajutorul catalizatorilor Raney-Ni

După cum reiese din Schema 5 procedeul începe prin cicloadiția 1,3-dipolară a unui oxid de nitril aromatic la tributilstanil-acetilena pentru a rezulta 3-aril-5-tributilstanilizoxazolul 24. Oxidul de nitril a fost obținut prin clorinarea benzaldoximei corespunzătoare cu N-cloro-succinimida și tratamentul ulterior cu hidrogencarbonat de potasiu.

O grupare hidroxi (la fel ca în salicilaldehida oxima sau p-hidroxibenzaldehida oxima), o grupare metilendioxi sau două grupări metoxi (veratraldehida oxima) nu permit clorinarea nucleară.

Ο-Sililatul 2,4-dihidroxibenaldehida oxima a dat în mod selectiv clorura de hidroximoil, având în vedere că oxima neprotejată dă practic clorinare nucleară 100%.

Tributilstanil-substituit izoxazolul este supus reacției catalizate de Pd de tip Heck cuplat cu iodobenzenul. S-a aplicat această reacție direct 2-iodofenolului și s-a obținut compusul 26 cu un randament de 50%.

Scindarea reductivă a inelul asupra Raney-Ni și încălzirea ulterioară a 1,3-dicetonei 28 în acid acetic cu o cantitate catalitică de acid hidrocloric, a dus la formarea 4'-hidroxiflavonei 29. Această flavonă nu pare a fi un compus natural.

Cu toate acestea, cea mai mare provocare a fost prepararea flavonei extrem hidroxilată, apigenina 22, pentru care a fost necesar floroglucinolul monoiodinat ca și reactant. Acest compus este instabil și recent a devenit disponibil.

Din iodofloroglucinol s-a obținut compusul 27 cu un randament de aproximativ 35%. Reducerea și ciclizarea catalitică a dat apigenina 22, identică cu o probă autentică. În mod interesant, iodofenolul și compusul 24 ar putea fi utilizați fără protejarea grupărilor hidroxi [22].

Modul operatoriu:

3-(4-Hidroxifenil)-5-tributilstanilizoxazolul 24. La 4-hidroxibenzaldehida oxima (2,06 g) în 10 mL acetat de etil au fost adăugate consecutiv carbonatul acid de potasiu (3 g), o picătură de apă, tributilstanilacetilenă (3,15 g) și N-clorosuccinimada (2 g). Amestecul a fost lăsat sub agitare la temperatura camerei timp de 20 ore. Suspensia a fost filtrată printr-un strat de celită și apoi solventul a fost evaporat. Amestecul de reacție obținut a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu gel de silice (10% MeOH în CHCl3), cu un randament de 71% s-au obținut 3,21 g de compus 24. 1H RMN (CDCl3): δ 0,7-1,7 (27 H, m), 6,60 (1 H, s), 6,88 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 7,68 (2 H, d, J = 8,5 Hz).

3-(4-Hidroxifenil)-5-(2,4,6-trihidroxifenil)izoxazolul 27. Compusul 24 (450 mg) și PdCl2 (50 mg) în dioxan anhidru (10 mL) au fost încălzite la temperatura 105°C sub atmosferă de azot. Iodofloroglucinolul (400 mg) în dioxan anhidru a fost adăugat treptat câte 1 mL timp de 1 oră. Suspensia a fost încălzită până la temperatura de reflux timp de 3 ore, filtrată și evaporată iar produsul obținut a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu gel de silice (dietil eter), cu un randament de 35% s-au obținut 100 mg de compus 27. 1H RMN (CD3OD-CDCl3 1:2): δ 5,92 (2 H, s), 6,85 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,92 (1 H, s), 7,64 (2 H, d, J = 8,5 Hz).

4',5,7-Trihidroxiflavona (apigenina) 22. Compusul 27 (300 mg) a fost redus catalitic cu Raney-Ni într-o soluție de metanol, în prezența H3BO3. După 1 oră, o cantitate însemnată de hidrogen a fost absorbită. Amestecul de reacție a fost filtrat pe un strat de celită și solventul a fost evaporat sub vid. 1,3-Dicetona a fost adusă la reflux în AcOH (1,5 mL) și s-a adăugat o picătură de HCl concentrat timp de 1 oră. Amestecul de reacție rezultat a fost răcit, filtrat și precipitatul a fost recristalizat cu etanol pentru a rezulta apigenina 22 (40%), identică cu o probă autentică. 1H RMN (CD3OD): δ 6,18 (1 H, d, J = 2 Hz), 6,43 (1 H, d, J = 2 Hz), 6,56 (1 H, s), 6,90 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 7,82 (2 H, d, J = 8,5 Hz) [22].

5.5. Sinteza apigeninei utilizând iradierea cu ajutorul microundelor

O cale de sinteză a apigeninei utilizează iradierea cu ajutorul microundelor a β-cetoesterilor ca material de pornire cu un randament de 81% [21], 66% [23]. Cu toate acestea, materia primă, β-cetoesterul nu a putut fi obținut ușor [21].

Sinteza cu ajutorul microundelor oferă avantaje considerabile comparativ cu încălzirea convențională datorită încălzirii rapide și îmbunătățirii substanțiale într-o gamă lagă de reacții organice.

În mod frecvent se obțin reacții mai curate, totodată se îmbunătățește randamentul și selectivitatea. Cererea crescută de racții chimice curate și eficiente dată de reacțiile fără solvent, care atunci când sunt combinate cu iradierea prin intermediul microundelor, dau o abordare mai prietenoasa pentru mediu, necesară din punct de vedere economic și de mediu.

Recent au fost prezentate câteva studii privind aplicarea microundelor în sinteza flavonoidelor și neoflavonoidelor sau a cumarinelor 4-substituite, totuși nu s-a acordat atenție dezvoltării unei reacții bi-component într-o singură etapă pentru prepararea flavonelor.

În urma cercetărilor efectuate s-a realizat reacția dintre fenoli și β-cetoesteri pentru a se obține flavone în condiții foarte dure (250°C pentru o durată îndelungată) și s-a extins această metodă pentru un număr mare de flavone în ciuda randamentului scăzut în aceste ciclocondensații termice.

Problema în sine constă în provocarea de a găsi eficacitatea iradierii cu microunde. Conform cercetărilor efectuate, această reacție bi-component presupune câteva etape: transesterificarea, rearanjarea Fries care conduce la o β-dicetonă și ciclizarea la o γ-pironă; acestea decurg prin stări de tranziție dipolare și ar trebui să favorizeze efectul iradierii prin intermediul microundelor.

Flavonoidul, apigenina, a fost preparată din acetat de etil benzoil 30 și floroglucinolul 16 iar timpul de iradiere a fost de 3,8 minute și randamentul de 66% (Schema 6).

Modul operatoriu este destul de simplu și are loc prin amestecarea fenolului cu β-cetoesterul într-o eprubetă și iradierea cu ajutorul microundelor (800 W la ieșire) fără alt solvent sau solid.

Reacția poate fi catalizată sub controlul voltajului sau al temperaturii (240°C), fără diferențe semnificative în timpii de reacție sau randamente.

Mod operatoriu:

Un amestec de acetat de etil benzoil 30 (384 mg) și floroglucinol 16 (126 mg) a fost iradiat cu ajutorul microundelor (ETHOS D, Millestone, la 80% de o putere totală de 1000 W și o temperatură reglabilă de 240 °C) pentru 3 min.

Produsul brut a fost dizolvat în soluție apoasă 10% de NaOH (20 mL) și spălat cu dietil eter (2×20 mL), iar produsul rezultat a fost precipitat prin adăugarea HCI concentrat. Produsul obținut, a fost filtrat, spălat cu apă și uscat sub vacuum, pentru a rezulta apigenina 22 cu o puritate superioară și cu un randament global de: 66% [23].

Capitolul al VI-lea. METODE INSTRUMENTALE DE ANAĂ ACATE PENTRU IDENTIFICAREA APIGENINEI

6.1. Identificarea flavonoidelor utilizând fragmentarea retro-Diels-Alder (rDA)

Fragmentele rDA sunt deosebit de importante pentru caracterizarea structurală a agliconului și partea agliconului corespunzătoare conjugaților flavonoidelor.

Retro-Diels-Alder (rDA) apare în șase structuri ciclice, cuprinde membri ce conțin o dublă legătură și implică relocalizarea a trei perechi de electroni în inel ciclic. Rezultatul acestei fragemtări este scindarea legăturilor σ și formarea a două legături π.

Fragmentarea ciclului apigeninei poate fi utilizat pentru determinarea numărului și naturii substituienților de pe ciclul A [24].

6.2. Caracterizarea agliconilor flavonoidelor utilizând tandemul spectrometriei de masă ion negativ pe bază de cip – nanospray

S-au dezvoltat o multitudine de metode analitice pentru identificarea și cuantificarea flavonoidelor, majoritatea utilizând cromatografia de lichide de înaltă performanță și detecția cu ajutorul UV-VIS.

Totuși, identificarea flavonoidelor ca și compuși naturali prin intermediul sistemelor disperse este limitată pentru că este necesară cromatograma completă pentru toate grupările cromofore.

"Spectrometria de masă cuplată cu ionizarea cu electrospray a apărut ca o metodă de sensibilitate ridicată, selectrivitate și determinări rapide ale produselor naturale.

Dintre toate metodele de spectrometrie de masă, ionizarea cu electrospray în tandem cu spectrometria de masă utilizând energie de coliziune mică-inducând disocierea, a fost utilizată în acest caz datorită abilităților acestei tehnici de a analiza compuși naturali cu polarități medii spre mari".

Ionizarea cu nanospray este o îmbunătățire a metodei ESI pentru analiza unor probe de volume și concentrații mici [25].

6.3. Spectrometria de masă

Spectrometria de masă (MS) este o tehnică de investigare cu largi aplicații în chimia analitică, cum ar fi: determinarea maselor atomice și moleculare; compoziția izotopică a elementelor sau identificarea compușilor organici.

Pe lângă aceste aplicații, ea a devenit una dintre cele mai importante tehnici de detecție în cromatografie, fiind utilizată atât la identificarea analiților care eluează din coloana cromatografică, cât și la determinarea lor cantitativă.

6.3.1. Spectrul de masă

Spectrul de masă este reprezentarea bidimensională a abundențelor individuale ale fragmentelor moleculare ionice generate în procesul de ionizare în funcție de rapoartele masă/sarcină corespunzătoare (m/z). Fragmentele ionice sunt produse în etapa de ionizare a unei probe ce poate reprezenta un compus pur sau un amestec de componenți individuali.

6.3.2. Sistemul de introducere a probelor în spectrometrul de masă

Probele de interes pot fi aduse în zona de ionizare atât în fază gazoasă, cât și în fază condensată (lichidă sau solidă). Probele supuse analizei prin spectrometria de masă pot fi în egală măsură de natură organică sau anorganică. Probele de natură organică sunt supuse analizei prin spectrometrie de masă pentru a obține informația structurală sau confirmarea acesteia, de cele mai multe ori plecând de la cantități extrem de reduse.

Un spectrometru de masă este un instrument care măsoară masa unei molecule după ce aceasta a fost transformată în ioni. Nu se măsoară direct masa moleculei ci mai exact raportul masă/sarcină pentru un ion. În cazul în care sarcina este egală cu unu (z = 1) acest raport corespunde masei moleculare (ionului) dar există și cazuri în care z ≠ 1.

6.3.3. Interpretarea rezultatelor

Speciile ionice formate sunt separate pe baza masei lor și înregistrate. Rezultatul se prezintǎ sub forma unor linii (picuri) repezentând abundența ionilor în funcție de masa lor.

Prin definiție celui mai abundent ion i se atribuie valoarea 100, restul reprezentând procente din aceastǎ abundențǎ. Acest pic este denumit pic de bazǎ = PB.

Picul corespunzǎtor masei moleculare a compusului inițial (de fapt ionului molecular) este denumit pic molecular = PM.

Pe lângă linia ionului molecular și a liniilor izotopice, spectrul de masă mai conține și alte linii datorate ionilor (cationi sau radicali cationici) de fragmentare. Fragmentarea ionului molecular în spectrul de masa se face după anumite reguli specifice fiecărei clase de compuși [26].

6.4. Spectrometria de absorbție în IR

"Domeniul IR cuprinde radiațiile între 0,8 μm și 200 μm, sau, în numere de undă, între 12500 cm-1 și 50 cm-1. Regiunea cea mai utilă din punct de vedere analitic este cuprinsă între 3600 cm-1 și aproximativ 300 cm-1 (2,8-33 μm) ".

Între 12500 cm-1 și 4000 cm-1 este domeniul IR apropiat, iar între aproximativ 4000 cm-1 și 650 cm-1 este domeniul IR mediu. Domeniul IR îndepărtat este cuprins între 650 cm-1 și 50 cm-1 și nu este utilizat decât în mică măsură în scopuri analitice. Sub 50 cm-1 radiațiile aparțin domeniului microundelor.

Spectrul de absorbție în IR este un spectru de benzi care se datoresc unor tranziții între stări energetice de vibrație ale atomilor care constituie moleculele, peste care se suprapun tranziții între stări energetice de rotație.

Cea mai importantă utilizare a spectrometriei de absorbție în infraroșu este la identificarea și la determinarea structurii unor compuși. Această metodă se aplică și pentru determinări cantitative, însă în mai mică măsură. Pentru trasarea unui spectru în infraroșu, de mare importanță este pregătirea probelor pentru analiză.

6.4.1. Pregătirea probelor în vederea înregistrării spectrului în IR

Dacă proba de analizat este lichidă la temperatura obișnuită trasarea spectrului se face utilizând proba ca atare sau o soluție a acesteia. Concentrația probei și grosimea de strat trebuie astfel alese încât transmitanța să fie cuprinsă între 15 și 70 %.

Probelor solide li se poate trasa spectrul fie după dizolvare într-un solvent adecvat, fie în următoarele moduri:

se obține o pastă din proba fin mojarată și un mediu lichid cum ar fi ulei de parafină (nujol), hexaclorobutadienă, perfluorokerosen. Pasta se întinde pe o fereastră transparentă și i se trasează spectrul. Metoda este rapidă, dar este indicată în special pentru o analiză calitativă.

proba fin mojarată este amestecată cu pulbere de bromură de potasiu (sau altă halogenură alcalină) și este presată la vid până când se obține o pastilă transparentă, pentru care este trasat spectrul. Prin această metodă se pot efectua ușor analize cantitative deoarece se pot determina cu precizie cantitățile de probă și eventual de standard intern introduse într-o pastilă.

Pentru analiza gazelor se întrebuințează celule cu grosime mare (10 cm). Pentru determinarea unor componenți în cantitate mică drumul radiației prin celulă poate fi multiplicat utilizând un sistem de oglinzi, drumul efectiv parcurs de fasciculul de radiații putând ajunge la zeci de metri [27].

6.5. Rezonanța magnetică nucleară

Rezonanța magnetică nucleară (RMN) este una dintre tehnicile cele mai fiabile de investigare a materiei fiind aplicată atât în studiul lichidelor, solidelor și gazelor.

Spre deosebire de alte tehnici de investigare a materiei, rezonanța magnetică nucleară este complet ne-perturbativă și ne-distructivă.

"Rezonanța este fenomenul de oscilație cu aceeași frecvență a doi oscilatori care transferă energie. Fenomenul rezonanței magnetice nucleare se bazează pe proprietatea nucleelor de a prezenta moment magnetic.

Se poate obține rezonanța magnetică nucleară prin aplicarea unui câmp electromagnetic de frecvență variabilă și observarea frecvenței la care nucleele magnetice intră în rezonanță cu câmpul indus".

6.5.1. Deplasarea chimică

"Electronii atomilor prezintă un spin electronic iar acesta interacționează la rândul lui cu câmpul B aplicat pentru a da momentul unghiular electronic, notat δB. Acest câmp suplimentar, manifestat local pe fiecare nucleu se exprimă prin: δB = – σ·B. În care σ se numește constantă de ecranare pentru nucleul studiat. De obicei σ este pozitiv, dar poate fi și negativ".

Din punct de vedere experimental prezintă importanță deplasarea relativă față de referință va rezona un nucleu cu o deplasare chimică δ cunoscută. Chiar dacă frecvența de rezonanță nu depinde numai de imediata vecinătate a atomului, domeniul tuturor valorilor posibile de deplasare chimică ale unui nucleu dintr-o grupare formează un interval de deplasări chimice posibile.

Spectrele RMN oferă informații cu privire la: numărul, poziția și intensitatea semnalelor apărute în spectru [29].

6.5.2. Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară a hidrogenului (1H RMN)

Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (RMN) este tipul care au avut cel mai mare impact asupra determinării structurii compușilor organici.

Deoarece nucleele sunt încărcate cu o sarcină electrică și generează un câmp magnetic de rotație, aceste nuclee de filare acționează ca magneți mici. Cele mai importante nuclee pentru a determina structura moleculară sunt: 1H și 13C, un izotop stabil, neradioactiv al carbonului.

1H (Z = 1, N = A – Z = 0) → I = 1/2 prezintă un interes deosebit datorită abundenței izotopice și a răspândirii în compușii organici.

6.5.3. Măsurarea unui spectru 1H RMN

Pentru a se obține un spectru 1H RMN se iau câteva miligrame din compusul studiat, apoi se dizolvă într -un solvent inert care nu conține nuclee de 1H, se iau în considerare numai atomi de hidrogen ai moleculei de studiat .

Solvenții utilizați conțin molecule ai căror atomi de hidrogen au fost înlocuiți cu deuteriu ca CDCI3 și MeOD. Poate fi, de asemenea, adăugată o cantitate mică dintr-un compus de referință (TMS). Soluția, aflată într- un tub subțire de sticlă este plasat în centrul unei bobine cu radiofrecvență (rf), între polii unui magnet puternic.

Nucleele de hidrogen sunt apoi aliniate paralel sau antiparalel la câmpul magnetic. Apoi, bobinei se aplică o cantitate mai mare de energie. Când această energie corespunde exact cu diferența de energie între momentele de spin de energie joasă și înaltă, acesta este absorbit de nuclee. Înregistrarea energiei absorbite de probă funcție de frecvența aplicată de bobina rf dă spectrul 1H RMN [30].

6.5.4. Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară a carbonului (13C RMN)

În timp ce spectroscopia RMN 1H oferă informații cu privire la dispunerea atomilor de hidrogen într-o moleculă, spectroscopia 13C RMN furnizează informații cu privire la scheletul de carbonului. Izotopul cel mai abundent de carbon, sau carbon-12, nu are de spin nuclear cu inversul carbon 13. Cu toate acestea, carbon-13 este de numai 1,1% din atomii de carbon se găsesc în natură. În plus, diferența de energie între statele de spin de nivel înalt și scăzut a 13C este foarte mic. Din aceste două motive, spectrometre 13C RMN trebuie să fie extrem de sensibile. Spectrometrele RMN-TF (transformatei Fourier) cu domeniul mare, sunt destul de puternice și sensibile, motiv pentru spectroscopie 13C RMN, a devenit o tehnică foarte utilizată [32].

RMN-ul 13C nu este direct legat de scheletul de carbon, ci doar protonul atașat la acesta.

Numărul semnalelor oferă informații cu privire la cât de mulți atomi de carbon sunt diferiți sau echivalenți

Divizarea unui semnal determină cât de mulți atomi de hidrogen sunt atașati la fiecare carbon. (regula N +1)

Deplasarea chimică oferă informații cu privire la hibridizare (sp3, sp2, sp) a fiecărui carbon.
Pentru fiecare carbon multiplicitatea semnalului depinde de cât de multe protoni pe fixează pe acestea [26].

Capitolul al -lea. SINTEZA ȘI ACTIVIT BIOLOGICĂ A IVAȚILOR APIGENINEI

Rezistența la multe medicamente atrage tot mai mult atenția în ultimii ani, datorită utilizării pe scară largă a antibioticelor. Tulpinile rezistente reduc durata de viață a medicamentelor. Aceste neajunsuri conduc la o nevoie urgentă la nivel global pentru găsirea de noi medicamente cu efecte antimicrobiene, în special din resurse naturale.

Compusul natural, apigenina a fost raportată ca având potențială activitate antimicrobiană. Între timp, s-au descoperit diverși compuși care posedă amino-alchilare în poziția 7-O și s-au dovedit a avea activități biologice semnificative.

S-a realizat sinteza a două serii de derivați ai apigeninei, în care sistemul ciclic al apigeninei este legat de diferite amine separate prin distanțiere la carbon – 2 sau carbon – 3 la poziția C-7 pentru a spori lipofilicitatea lor.

Activitățile antiproliferative ale acestor derivați au fost testate împotriva a patru linii de celule canceroase umane și anume, plămân uman (A549), col uterin uman (HeLa), ficat hepatocelular uman (HepG2), și sân uman (MCF-7) celulele canceroase, folosind o testare standard cu bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazoliu (MTT). Au fost de asemenea investigate activitățile antibacteriene ale acestor derivați [33].

7.1. Sinteza derivaților apigeninei

Sinteza compușilor 3a-3j și 4a-4j a fost realizată conform căii generale prezentate în Schema 3. Compușii 2a și 2b au fost intermediarii cheie pentru sinteza compușilor țintă. Aceștia au fost preparați prin alchilarea grupărilor 7-hidroxi utilizând cantități excesive de 1,2-dibromoetan sau 1,3-dibromopropan în prezența carbonatului de potasiu (K2CO3) ca bază în N,N-dimetilformamidă (DMF) anhidră la 120°C pentru 2 ore.

Pentru a crește activitatea biologică a apigeninei, s-au sintetizat derivați ai apigeninei, în care sistemul ciclic al apigeninei a fost legat de radicalii alchil amine prin diferite distanțieri la poziția C-7 pentru a spori lipofilicitatea lor.

Reacția 2a și 2b cu diferite alchil amine ciclic și non-ciclice în DMF anhidră la 80°C pentru 2-4 ore a condus la obținerea 3a-3j și respectiv 4a-4j. Compușii din seria 1 (3a-3j) conținând un distanțier la carbonul 2 între apigenină și radicalii substituiți, în timp ce compușii din seria 2 (4a-4j) conțin un distanțier la carbonul 3.

Acești compuși au fost creați pentru a testa importanța substituției, odată cu mărimea grupărilor conectate. Toți compușii sintetizați au dat rezultate analitice și spectroscopice satisfăcătoare, care au fost în deplină conformitate cu structurile lor descrise.

Modul operatoriu

Sinteza compusului (2a) 7-(2-Bromoetoxi)-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. La o soluție de 1 (1,35 g, 5 mmol) în 100 mL de DMF anhidră, au fost adăugate 1,2-dibromoetan (23,5 g) și carbonat de potasiu anhidruu (0,7 g), apoi s-a încălzit la 120°C timp de 2 ore. După terminarea reacției, amestecul rezultat a fost răcit la temperatura camerei și filtrat. Filtratul a fost concentat și reziduul obținut a fost purificat prin cromatografie pe coloană (Eter de petrol/Acetat de etil = 2:1) pentru a obține compusul 2a cu un randament de 70%, cristale de culoare galbenă, punct de topire: 226–228°C.

Sinteza compusului (2b) 7-(3-Bromopropoxi)-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. La o soluție de 1 (1,35 g) în 100 mL DMF anhidră, au fost adăugate 1,3-dibromopropan (25,5 g) și carbonat de potasiu anhidruu (0,7 g), apoi s-a încălzit la 120°C timp de 2 ore. După terminarea reacției, amestecul rezultat a fost răcit la temperatura camerei și filtrat. Filtratul a fost concentat și reziduul obținut a fost purificat prin cromatografie pe coloană (Eter de petrol/Acetat de etil = 2:1) pentru a obține compusul 2b cu un randament de 68%, ace de culoare galben-pal, punct de topire: 226–228°C.

Sinteza compusului (3a) 7-[2-(Dietilamino)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. La o soluție de 2a (0,37 g) în 30 mL de DMF anhidră, se adaugă dietilamină (0,73 g), apoi se încălzește la 80°C pentru 3 ore. Solventul a fost evaporat și reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană pentru a obține compusul 3a cu un randament de 70%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 237–238°C.

Sinteza compusului (3b) 7-[2-(Etilamino)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă.

La o soluție de 2a (0,37 g) în 30 mL de DMF anhidră, se adaugă etilamină (0,45 g), apoi se încălzește la 80°C pentru 3 ore. Solventul a fost evaporat și reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană pentru a obține compusul 3b cu un randament de 67%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 202–203°C.

Sinteza compusului (3c) 7-[2-(Propilamino)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și propilanină (0,59 g). Se obține compusul 3c cu un randament de 75%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 242–244°C.

Sinteza compusului (3d) 7-[2-(n-Butilamino)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și n-butilamină (0,73 g). Se obține compusul 3d cu un randament de 73%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 247–248°C.

Sinteza compusului (3e) 7-[2-(terț-Butilamino)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și terț-butilamină (0,73 g). Se obține compusul 3e cu un randament de 71%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 263–265°C.

Sinteza compusului (3f) 7-[2-(2′-Hidroxietilamino)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-chroman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și etanolamină (0,61 g). Se obține compusul 3f cu un randament de 73%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 224–226°C.

Sinteza compusului (3g) 7-[2-(Ciclohexilamino)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-chroman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și ciclohexilamină (0,99 g). Se obține compusul 3g cu un randament de 68%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 269–270°C.

Sinteza compusului (3h) 7-[2-(Pirolidin-1-il)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și pirolidină (0,71 g). Se obține compusul 3h cu un randament de 70%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 252–254°C.

Sinteza compusului (3i) 7-[2-(Morfolin-4-il)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și morfoline (0,87 g). Se obține compusul 3i cu un randament de 75%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 199–200°C.

Sinteza compusului (3j) 7-[2-(Piperazin-1-il)etoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,37 g) și piperazină (0,86 g). Se obține compusul 3j cu un randament de 65%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 229–230°C.

Sinteza compusului (4a) 7-[3-(Dietilamino)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și dietilamină (0,73 g). Se obține compusul 4a cu un randament de 73%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 227–229°C.

Sinteza compusului (4b) 7-[3-(Etilamino)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și etilamină (0,45 g). Se obține compusul 4b cu un randament de 75%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 226–228°C.

Sinteza compusului (4c) 7-[3-(Propilamino)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și propilamină (0,59 g). Se obține compusul 4c cu un randament de 78%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 220–221°C.

Sinteza compusului (4d) 7-[3-(n-Butilamino)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și n-butilamină (0,73 g). Se obține compusul 4d cu un randament de 71%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 246–248°C.

Sinteza compusului (4e) 7-[3-(terț-Butilamino)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și terț-butilamină (0,73 g). Se obține compusul 4e cu un randament de 69%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 163–165 °C.

Sinteza compusului (4f) 7-[3-(2′-Hidroxietilamino)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și etanolamină (0,61 g). Se obține compusul 4f cu un randament de 67%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 244–246°C.

Sinteza compusului (4g) 7-[3-(Ciclohexilamino)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-chroman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și ciclohexilamină (0,99 g). Se obține compusul 4g cu un randament de 62%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 160–162°C.

Sinteza compusului (4h) 7-[3-(Pirolidin-1-il)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și pirolidină (0,71 g). Se obține compusul 4g cu un randament de 62%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 269–270°C.

Sinteza compusului (4i) 7-[3-(Morfolin-4-il)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și morfolină (0.87 g). Se obține compusul 4i cu un randament de 65%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 178–180°C.

Sinteza compusului (4j) 7-[3-(Piperazin-1-il)propoxi]-5-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-croman-4-onă. Se obține conform descrierii pentru 3a cu 2a (0,39 g) și piperazină (0,86 g). Se obține compusul 4j cu un randament de 70%, pudră de culoare galben-pal, punct de topire: 164–166°C [33].

7.2. Activitatea antibacteriană a derivaților apigeninei

Toți compușii sintetizați au fost testați preliminar pentru activitatea lor antibacteriană in vitro împotriva a două bacterii Gram-pozitive [Staphylococcus aureus ( 25923) și Bacillus subtilis ( 6633)] și două bacterii Gram-negative [Escherichia coli ( 25922) și Pseudomonas aeruginosa ( 27853)] prin metoda de difuzie pe disc.

Ampicilina și tetraciclina au fost utilizate pentru controlul pozitiv și dimetilsulfoxidul (DMSO)- turnat pe disc a fost utilizat pentru controlul negativ. Majoritatea compușilor sintetizați au afișat activități bacteriene moderate spre excelente împotriva celor patru bacterii folosite la o doză de 1000 μg/mL (Tabelul 3). Compușii care prezintă zone de inhibiție de cel puțin 10 mm au fost
considerați activi și au fost evaluați în continuare pentru concentrațiile minime inhibitorii (MICs).

Tabelul 3 – Zonele de inhibiție (IZ, în mm) (media a ± SD b ) ale derivaților apigeninei sintetizați [33]

a reprezintă o valoare medie a diametrelor măsurate; b SD denotă deviația standard

Valorile MIC sunt prezentate în Tabelul 4. Toți derivații apigeninei sintetizați au arătat activități antibacteriene mai ridicate decât la apigenina părinte. Aceștia au prezentat o mai bună inhibare a bacteriilor Gram-pozitive decât ale celor Gram-negative, cu valori ale MIC de la 1,95 μg/mL până la 15,63 μg/mL.

Dintre 3a-3j, care conțin un carbon-2 distanțier, 3g-3j cu ciclu N-heterociclic la poziția C-7 a afișat o zonă cu puternică activitate antibacteriană de la 3,91 μg/mL la 15,63 μg/mL. În plus, 3i a prezentat activitate antibacteriană predominantă cu valorile MIC de 3,91, 3,91, 7,81, și 7,81 μg/mL împotriva S. aureus, B. subtilis, E. coli, și respectiv P. aeruginosa.

Aceste rezultate au fost apropiate de proprietățile antibacteriene cu spectru larg, antibioticul tetraciclina, cu valorile MIC corespunzătoare de 1,95, 3,91, 3,91, și respectiv 3,91 μg/mL. Alți compuși 2-carbon distanțați (3a-3f), cu substituenți alifatici în lanț, a demonstrat o activitate inhibitorie mai mică decât 3g-3j. Acest rezultat sugerează faptul că, compușii heterociclici cu radicali în poziția C-7 a apigeninei au avut activitate mult mai mare decât a compușilor cu catene alifatice.

Compuși 4a-4j au prezentat rezultate similare. Inelele N-heterociclice plasate în 4g-4j, au arătat o activitate antibacteriană mai bună decât alți compuși, și anume, 4a-4f, în radicalul carbon-3 din derivații apigeninei. În plus, 4i a prezentat o activitate inhibitoare remarcabilă la valori ale MIC de 1,95, 3,91, 3.91, și 3.91 μg/mL împotriva S. aureus, B. subtilis, E. coli, și P. aeruginosa, respectiv, care este comparabil cu martorul pozitiv, tetraciclina (1,95, 3,91, 3,91, și 3,91 μg/mL), deși inferioară mult ampicilinei (0,06, 0,12, 0,98, și 0,49 μg/mL).

Compușii 4a-4j, care conțin un radical la carbon-3, au demonstrat o activitate antibacteriană mai mare decât 3a-3j. Acest fenomen putea fi cauzat de lipofilia superioară a 4a-4j la 3a-3j, care ar fi putut crește permeabilitatea membranei celulelor. Activitatea biologică a unei anumite substanțe este dependentă de o sumă complexă de proprietăți individuale, inclusiv structura compusului, afinitatea pentru locul țintă, și supraviețuirea în mediul aplicat, supraviețuirea în cadrul sistemului biologic, proprietățile de transport, precum și de starea organismului țintă. Studiile aprofundate privind relația structură-activitate (SARs) privitoare la această clasă de compuși antibacterieni sunt în prezent în curs de investigare activă și vor fi raportate în timp util [33].

Tabelul 4 – Valorile MIC ale derivaților apigeninei sintetizați împotriva a patru tulpini bacteriene[33]

Tabelul 4 – Valorile MIC ale derivaților apigeninei sintetizați împotriva a patru tulpini bacteriene

a Media a trei experimente paralele

7.3. Activitatea antiproliferativă a derivaților apigeninei

Efectele inhibitoare ale tuturor derivaților apigeninei, 3a-3j și 4a-4j, au fost testate prin evaluarea proliferării celulare privind A549, HeLa, HepG2, și linii celulare MCF-7. Rezultatele au fost rezumate în Tabelul 5.

Tabelul 5 – Activitatea antiproliferativă (IC50) ale derivaților apigeninei sintetizați împotriva A549, HeLa, HepG2, și liniile celulare MCF-7 [33]

Toți derivații sintetizați, 3a-3j și 4a-4j, au demonstrat o activitate antiproliferativă relativ mare comparativ cu apigenina părinte. Compușii 3a-3j, care conțin un radical carbon-2, au avut activități moderate împotriva celor patru linii de celule canceroase selectate.

În această serie, 3g-3j, cu jumătate concentrație inhibitorie maximă (IC50) care variază de la 17 μg/mL până la 71 μg/mL, au arătat activități mai bune decât 3a-3f. Efectul notabil a fost exercitat de 3j, care a avut cele mai mici valori ale IC50 împotriva celor patru celule canceroase,
în special împotriva celulelor HeLa (IC50 = 17 pg / ml). În mod similar, 4a-4j, 4g-4j au fost expuse unor activități mai puternice decât 4a-4f. Compusul 4j a demonstrat o activitate remarcabilă împotriva celor patru linii de celule canceroase.

Așa cum se arată în Tabelul 5, compararând cu compușii cu radical la carbon-2, cu acei compuși cu radical la carbon-3 conținand compușii 4a-4j, s-a arătat o ușoară creștere a activității antiproliferative împotriva celor patru linii de celule canceroase. Acest rezultat, este posibil să fi fost cauzat de alungirea catenei laterale alchil de la doi la trei atomi de carbon, ceea ce a oprit activitatea de modulare, cu derivați la puntea-C3 fiind cei mai activi.

Compușii care conțin lanțuri de cicluri amino N-heterociclice la catenele laterale (3g-3j și 4g-4j) arată activități mai bune față de cele patru linii de celule canceroase, decât la cele care conțin catene laterale de amino alchil. Acest rezultat poat fi atribuit lipofilicității creșterii acestor compuși, care ar putea influența capacitatea lor pentru a-și atinge obiectivul prin difuzie transmembranară. În cele mai multe cazuri, prezența sau introducerea diferitelor grupări funcționale într-un compus nu permite o explicație exactă privitoare la tipul și intensitatea activității biologice a acestuia [33].

Capitolul al VIII-lea. STUDIU COMPARATIV: APIGENINA VS. IVAȚI

Capitolul al IX-lea. POSIBILITĂȚI DE VALORIARE ALE APIGENINEI

9.1. Rolul apigeninei în alimentație

Apigenina este un compus chimic natural care se găsește în păducel, fructe, legume, mirodenii și plante aromatice. O dietă bogată în acest flavonoid, este asociată cu un risc redus de probleme cardiace, neurologice și are beneficii împotriva mai multor tipuri de cancer.

Acest tip de dietă poate încetini chiar și procesul de îmbătrânire, datorită gamei largi de beneficii. Cu toate acestea, din cauza biodisponibilității reduse, dieta trebuie să fie foarte bogată în flavonoizi și în special apigenină [35].

9.2. Apigenina și bolile cardiovasculare

Flavonoide au efect relaxant asupra sistemului nervos central, care poate ajuta la scăderea tensiunii arteriale. Efectul relaxant al mușețelului este în mare parte atribuit acestui principiu activ puternic, care este capabil de a modula receptorii GABA în creier.

Deși are și alte beneficii pentru sănătate, cel mai important este capacitatea sa de a crește numărul proteinelor reglatorii steroidogenic acute, cunoscute ca StAR. Această proteină este necesară pentru producerea de hormoni, deoarece ajută la transportul colesterolului, prin care toți hormonii sunt transformați în celule.

Pe măsură ce procesul de îmbătrănire se accentuează, se reduce numărul proteinelor StAR. Cu cât numărul StAR scade, cu atât scade și producția hormonală care accelerează în cele din urmă procesul de îmbătrânire și duce la boli legate de varstă. Cu toate acestea, o dieta bogată în apigenină și un stil de viață sănătos pot avea beneficii esențiale în procesul de îmbătrânire.

Flavonoidele sunt de asemeni inhibitori ai de aromatazei naturale. Acestea reduc riscul de formare al cheagurilor de sânge și cresc producția mai multor tipuri de hormoni, prin inhibarea enzimei aromatază, care crește odată cu vârsta. Apigenina poate fi folosită chiar și pentru a reduce riscul de ateroscleroză și atac de cord [35].

9.3. Acțiunea apigeninei împotriva cancerului

Apigenina poate reduce riscul de cancer de prostată, de sân, de stomac, al vezicii urinare, precum și leucemia. Flavonoidele au puternice caracteristici antioxidante și anti-inflamatorii, acestea fiind principalele caracteristici care ajută în lupta împotriva cancerului.

Apigenina poate anula, de asemenea, efectul medicamente imunosupresoare stimulând astfel sistemul imunitar, care distruge celulele canceroase. Cu toate acestea, apigenina poate avea reacții adverse, în cazul de transplant de organe din această cauză.

Capacitatea sa de a reduce și de a bloca excesul de estrogen de legătura cu receptorii săi, este motivul principal pentru care flavonoidele pot reduce riscul și încetini metastazarea celulelor canceroase, mai ales în cazul cancerului de sân și al celui de prostată [35].

9.4. Produse farmaceutice cu apigenină

9.4.1. Natur Power Taurină cu Apigenină

Se prezintă sub formă de supliment alimentar cu un conținut în taurină, apigenină și polifenoli. Mecanismele prin care apigenina își manifestă efectul antitumoral sunt numeroase.

Acest supliment alimantar are un efect antimetastazic marcant, care este cel mai important factor în prelungirea duratei de viață, respectiv supraviețuirea pacienților bolnavi de cancer. "Compoziție: taurină, complex de bioflavonoide Flavin7 (extract uscat de sâmburi de struguri roșii, extract uscat de semințe de sorg, extract uscat de semințe de mure, extract uscat de coji de cireșe negre, extract uscat de semințe de coacăze negre, extract uscat de semințe de coacăze roșii, extract uscat de coji de prune, extract de coji de mere), gelatină, ceai verde, polen de mușețel".

Flavonoidele din fructe sau legume și din extractul de germeni de grâu sunt folosite în mod tradițional ca și adjuvanți în tratamentul cancerului și a bolilor cardio-vasculare. Datorită numărului limitat de studii clinice disponibile, până în prezent nu s-au cunoscut exact acele flavonoide specifice care prezintă efect de prevenire a cancerului.

"Recent s-a reușit însă identificarea principalului flavonoid cu efect antitumoral din compoziția germenilor de grâu – apigenina. Conform rezultatelor unui studiu clinic recent, efectuat în Germania s-a demonstrat că extractele de flavonoide de generația a doua care conțin apigenină reprezintă un progres enorm în terapia alternativă a cancerului pe viitor. Acest studiu clinic evidențiază efectul apigeninei de a împiedica reînnoirea diferitelor tipuri de cancer post-operator".

"Studiul desfășurat pe parcursul a mai multor ani s-a efectuat pe pacienți cu cancer de colon, respectiv polipi intestinali. Cel mai important rezultat obținut în cursul acestui studiu clinic a fost faptul că în grupul de pacienți cărora li s-au administrat extracte de flavonoide cu apigenină numărul recidivelor înregistrate a fost foarte scăzut în comparație cu grupul de pacienți martor, cărora nu li s-au administrat aceste preparate și unde numărul recidivelor a fost de aproape 50%. Studiul clinic german demonstrează în mod unanim că un consum deliberat al flavonoidelor selecționate poate contribui la mărirea șanselor de supraviețuire a pacienților cu cancer".

Utilizarea apigeninei prezintă importanță datorită faptului că mecanismul de acțiune al acestei substanțe este foarte asemănător cu cel al medicamentelor modificatoare ale răspunsului biologic, utilizate din ce în ce mai frecvent în tratamentul cancerului. Preparatele pe bază de apigenină sunt deosebit de utile în completarea chemoterapiei, radioterapiei și altor terapii biologice antitumorale.

"Apigenina inhibă activitatea unei game largi de factori de creștere a celulelor tumorale. Medicamentele modificatoare ale răspunsului biologic au capacitatea de a inhiba în general un singur tip de factor de creștere, motiv pentru care – în cele mai multe cazuri – efectul acestor preparate va fi de scurtă durată, deoarece celulele tumorale „învață” să evite factorul de creștere blocat. Această situație nu apare și în cazul apigeninei, deoarece aceasta are capacitatea de a influența activitatea mai multor factori de creștere simultan".

Numeroase studii au dovedit faptul că apigenina este eficace în tratamentul mai multor tipuri de cancer. Spre exemplu, în cancerul intestinal, mamar, pulmonar, ovarian, de prostată, cutanat, în leucemie, cancerul glandei tiroide, a stomacului, cancerul de pancreas, melanom, tumori hepatice – apigenina a blocat eficient creșterea tumorilor, respectiv procesul de metastazare.
Mod de administrare: 3×1 capsule/zi. Principii nutritive în doza zilnică recomandată 3 capsule: apigenină: 24,5 mg, total polifenoli: 15,5 mg ( din care: flavonoizi: 10.85 mg și resveratrol: 0,0077 mg), taurină: 800 mg și ceai verde: 200 mg [36].

9.4.2. Extract hidroalcoolic de păducel

"Păducelul este eficient datorită complexului de principii active, capacitatea sa curativă fiind însă mult diminuată prin prelucrarea termică a plantei (ceaiurile fiind obținute de obicei prin fierberea produsului), din acest motiv, se recomandă administrarea păducelului sub formă de pulbere, macerat la rece sau tinctură, forme de extracție care păstrează nealterate proprietățile plantei".

Compoziție: flavonozide (hiperozidă, rutozidă, kaempferol, vitexină), proantocianidoli, taninuri catechice (catechol și epicatechol), flobafene, acizi triterpenici (ursolic, oleanolic, crategolic), cumarine (esculetozida), acizi fenolici (cafeic și clorogenic), amine, aminopurine, β-sitosterol.

Acțiuni: vasodilatator coronarian, îmbunătățește irigarea cordului, antiaritmic, antihipertensiv, acest produs are capacitatea de a restabili circulația în zonele necrozate după infarctul miocardic, β-blocant, cardiotonic, sedativ.

Indicații: se utilizează cu rezultate bune ca adjuvant în: tulburări de ritm cardiac (tahicardie, palpitații, extrasistole), insuficiență cardiacă, cardiopatie ischemică, angină pectorală, infarct miocardic, hipertensiune arterială, scleroză cardiacă, ateroscleroză incipientă, distonii neurovegetative, anxietate, nevroze.

Administrare: se ia, de regulă, câte o linguriță de tinctură diluată în 100 mL de apă (jumătate de pahar), de 3-4 ori pe zi, pe stomacul gol.

Contraindicații: sarcină, alergie la păducel [37].

9.4.2.1. Obținerea extractelor hidroalcoolice din păducel

9.4.2.2. Operațiile tehnologice realizate pentru obținerea extractelor hidroalcoolice

Recepție – Materia primă se recepționează pe loturi, în functie de proveniență și calitate, pe bază de buletin de analiză, bon de predare, transfer, restituire din gestiunea de materii prime, bon de consum în procesul de producție.

Condiționare – se îndepărtează impuritățile (definite conform specificației tehnice a materiei prime), corpurile străine organice și minerale. La sfârșitul operației se prelevează probe din produsul vrac și se verifică indicii calitativi menționați în specificația tehnică a produsului.

Concișare/sitare – Produsul vegetal condiționat se trece prin tocătorul reglat pentru o lungime a fragmentelor egală cu 10 mm. Pe parcursul operației, se prelevează probe din produsul concișat și se verifică corectitudinea operațiilor efectuate.

Deșeul valorificabil (fragmentele cu dimensiuni mai mari) se reintroduc în sistemul de tocare, dacă rezultatele analizei de laborator confirmă recuperarea produsului util, se face în condiții de eficiență economică.

Deșeul nevalorificabil (fragmentele cu dimensiuni mai mici) se distruge conform normelor in vigoare.

Extracția compușilor bioactivi – se realizează într-un extractor din inox sau sticla, utilizând ca solvent un amestec de apă-alcool (soluție de alcool etilic 30-50% – în cazul preparării extractelor hidroalcoolice) sau alcool 70% (pentru prepararea extractelor alcoolice – tincturi). Timpul de extracție este diferit în funcție de natura extractului.

Filtrarea – Soluția extractivă rezultată se filtrează pentru îndepărtarea impurităților solide. Datorită continuțului ridicat de particule solide din extract se utilizează în general sisteme de filtre cu plăci. Pachetul filtrant este constituit din plăci și rame realizate din material plastic sau din oțel inox. Filtrarea se face cu ajutorul pânzei filtrante sau cartoanelor speciale pentru filtrare.

Purificarea și concentrarea soluției extractive – se propune a se realiza prin metode moderne implicând tehnologiile membranare: microfiltrarea și ultrafiltrarea.

Prin microfiltrare se îndepărtează compușii coloidali, precum și suspensiile de particule de dimensiuni cuprinse între 0,02 si 10μm (virusuri, bacterii, drojdii) asigurându-se în această etapă clarificarea și sterilizarea extractului. Prin ultrafiltrare se realizează concentrarea extractului prin reținerea de către membrană a claselor de compuși cu mase moleculare mai mari decat porii membranei.

Avantajele utilizării acestor procese membranare sunt: procesarea extractelor la temperatura mediului ambiant (cca. 20°C) evitând denaturarea și distrugerea unor compuși biologic activi termolabili, fără intervenția unor reactivi chimici și un consum de energie foarte scăzut [15].

CONCLUZII

Flavonoidele au stârnit recent un interes considerabil datorită potențialelor efecte biologice asupra sănătății umane, în care acestea au activitate: antivirală, antialergică, antiagregantă, anti-inflamatoare, anti-tumorală și antioxidantă.

"Păducelul își datorează eficiența complexului de principii active, capacitatea sa curativă fiind însă mult diminuată prin prelucrarea termică a plantei (ceaiurile fiind obținute de obicei prin fierberea produsului), motiv pentru care, se recomandă administrarea păducelului sub formă de pulbere, macerat la rece sau tinctură, forme de extracție care păstrează nealterate proprietățile plantei".

Apigenina este utilizată în suplimente alimentare, în nutriție, în produsele farmaceutice și cosmetice. Aplicată în domeniul alimentar, aceasta este utilizată pe scară largă ca aditiv alimentar.

În domeniul produselor de sănătate, aceasta deține functia de întarire a stomacului, ușurează digestia și prevenirea sindromului postpartum iar în domeniul farmaceutic, este frecvent utilizată în tratarea bolilor coronariene și angină pectorală.

Aceasta posedă potențialul de a reduce riscul de cancer, deoarece are activitate anti-tumorală, de asemenea, ar putea fi utilă în alergii, deoarece aceasta poate avea proprietăți anti-inflamatorii.

S-a arătat că apigenina inhibă creșterea celulară, sensibilizează celulele canceroase la eliminarea prin apoptoză și împiedică dezvoltarea vaselor de sânge pentru a servi tumorii în creștere, de asemeni, a fost asociată cu o scădere sugestivă a riscului de cancer ovarian.

Extractul de păducel, alături de alte extracte din plante, intră în compoziția preparatelor cosmetice pentru îngrijirea tenurilor uscate, iritate (pe bază nervoasă) și a preparatelor de îngrijire corporală (ulei de masaj, creme), având un efect de calmare, relaxare și proprietăți antioxidante (prin flavonoidele conținute).

Taninurile din compoziție îi conferă un efect ușor astringent și il fac util și în tratarea tenurilor grase, seboreice.

Extractul de păducel este folosit în preparate cosmetice destinate îngrijirii și igienei părului (șampon, balsam, mască).

BIBLIOGRAFIE

[1] KUMAR D., ARYA V., BHAT Z.A., KHAN N.A., PRASAD D.N. – The genus Crataegus: chemical and pharmacological perspectives, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 22: 1187-1200, 2012

[2] CASIAN A., CASIAN I., UNGUREANU I. – Contribuții la standardizarea frunzelor cu flori de Crataegus monogyna Jacq. și Crataegus curvisepala Lindm. și a produselor extractive, Farmacognozie și Botanică Farmaceutică, 468-472, 2014

[3] LIU P.Z., KALLIO H., YANG B.R. – Composition of Hawthorn (Crataegus spp.) fruits and leaves and emblic leafflower (Phyllanthus emblica) fruits, Department of Biochemistry and Food Chemistry, Finland, 2012

[4] CHANG Q., ZUO Z., HARRISON F., CHOW MS. – Hawthorn, Journal of Clinical Pharmacology, 42: 605-612, 2002

[5] GURUNG RB., OH TJ. K, SOHNG JK. – Enzymatic synthesis of apigenin glucosides by glucosyltransferase (YjiC) from Bacillus licheniformis DSM 13, Molecules and Cells, 36: 355-61, 2013

[6] MOȚA C., ROȘU A., CÂMPEANU GH. – Compuși bioactivi de origine vegetală. Abordări biotehnologice, Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii, București, 2014

[7] http://www.naturlife.hu/?page_id=25&lang=ro accesat la data de 22/06/2014

[8] GUPTA S., AFAQ F., MUKHTA H. – Selective growth-inhibitory, cell-cycle deregulatory and apoptotic response of apigenin in normal versus human prostate carcinoma cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 287: 914-920, 2001

[9] WILKINS MR., WIDMER WW., GROHMANN K., CAMERON RG. – Hydrolysis of grapefruit peel waste with cellulase and pectinase enzymes, Bioresource Technology, 98: 1596-1601, 2007

[10] HAMAHAMEEN B.A., JAMAL B. – Determination of flavonoids in the leaves of hawthorn (Crataegus Azarolus) of Iraqi Kurdistan Region by HPLC Analysis, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics, 3: 67-70, 2013

[11] http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB1384541.htm accesat la data de 10/11/2013

[12] http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/520-36-5 accesat la data de 8/01/2014

[13] MOLYNEUX R.J., WAN A.C., HAD JR., HADDON W.F. – Oxidative coupling of apigenin, Tetrahedron Letters, 26: 1409-1416, 1970

[14] http://www.naturalplantextract.com/herbal-extract/hawthorn-extract.html accesat la data de 7/01/2013

[15] PĂUN G., GHEHE O., DIACONU M. – Procesare avansată a plantelor medicinale, INCDSB – Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Științe Biologice, București, 2011

[16]http://universitypublishingonline.org/foundation/chapter.jsf?bid=CBO9788175968295&cid=CBO9788175968295A133 accesat la data de 12/01/2014

[17] http://en.wikipedia.org/wiki/Flavones accesat la data de 1/12/2013

[18] http://flavone.askdefine.com/ accesat la data de 11/01/2014

[19] http://en.wikipedia.org/wiki/Fries_rearrangement accesat la data 15/12/2013

[20] http://ro.wikipedia.org/wiki/Teoria_acido-bazic%C4%83 accesat la data 13/01/2014

[21] WANG J., ZHOU R-G., WU T., YANG T., QIN Q-X., LI I., YANG B., YANG J., – Total synthesis of apigenin, Journal of Chemical Research, 36: 121-122, 2012

[22] GOTHELF K., , TORSSELL K. B.G. – A convenient synthesis of flavones. Synthesis of apigenin, Acta Chemica Scandinavica, 46: 494-495, 1992

[23] SEIJAS J.A., VA’ZQUEZ-TATO M.P., CARBALLIDO-REBOR R., – Solvent-free synthesis of functionalized flavones under microwave irradiation, Journal of Organic Chemistry, 70: 2855-2858, 2005

[24] http://www.authorstream.com/Presentation/aSGuest138940-1466016-mass-spectroscopy-flavonoid/ accesat la data de 10/01/2014

[25] GATES P. J., LOPES N. P. – Characterisation of flavonoid aglycones by negative ion chip-based nanospray tandem mass spectrometry, International Journal of Analytical Chemistry, 2012: 1-7, 2012

[26] http://cachescan.bcub.ro/2008_05_28/cap_13_1_pagini_230_242.pdf accesat la data de 20/01/2014

[27] DĂNEȚ A. F. – Analiză instrumentală, Partea I, Editura Universității din București, București, 2010

[28] http://ika-chemistry.blogspot.ro/ accesat la data de 23/01/2014

[29] JÄNI L., NAȘCU H. I. – Chimie analitică și instrumentală, Editura AcademicPres & AcademicDirect, București, 2009

[30]http://www.cheneliere.info/cfiles/complementaire/chimie_organique_01/pdf/05_Spectroscopie_par_resonance_magnetique_nucleaire_%28RMN_1H%29.pdf accesat la data de 5/01/2014

[31] LIU R., ZHANG H., YUAN M., ZHOU J., TU Q., LIU, J.-J., WANG J. – Synthesis and biological evaluation of apigenin derivatives as antibacterial and antiproliferative agents, Molecules, 18: 11496-11511, 2013

[32]http://www.cheneliere.info/cfiles/complementaire/chimie_organique_01/pdf/05_Spectroscopie_par_resonance_magnetique_nucleaire_%28RMN_13C%29.pdf accesat la data de 10/01/2014

[33] LIU R., ZHANG H. , YUAN M., ZHOU J., TU Q., LIU J.-J. și WANG J. – Synthesis and biological evaluation of apigenin derivatives as antibacterial and antiproliferative agents, Molecules and Cells, 18: 11496-11511, 2013

[34] http://en.wikipedia.org/wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent accesat la data de 25/06/2014

[35] http://www.heart-health-guide.com/apigenin.html accesat la data de 25/06/2014

[36] http://www.vitacrystal.ro/termekeink_flavitamin.php accesat la data de 26/06/2014

[37] http://www.paradisulverde.com/Magazin-On-line/Altele/Supliment/EXTRACT-HIDROALCOOLIC-PADUCEL-50ml-DACIA-PLANT.html accesat la data de 26/06/2014

BIBLIOGRAFIE

[1] KUMAR D., ARYA V., BHAT Z.A., KHAN N.A., PRASAD D.N. – The genus Crataegus: chemical and pharmacological perspectives, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 22: 1187-1200, 2012

[2] CASIAN A., CASIAN I., UNGUREANU I. – Contribuții la standardizarea frunzelor cu flori de Crataegus monogyna Jacq. și Crataegus curvisepala Lindm. și a produselor extractive, Farmacognozie și Botanică Farmaceutică, 468-472, 2014

[3] LIU P.Z., KALLIO H., YANG B.R. – Composition of Hawthorn (Crataegus spp.) fruits and leaves and emblic leafflower (Phyllanthus emblica) fruits, Department of Biochemistry and Food Chemistry, Finland, 2012

[4] CHANG Q., ZUO Z., HARRISON F., CHOW MS. – Hawthorn, Journal of Clinical Pharmacology, 42: 605-612, 2002

[5] GURUNG RB., OH TJ. K, SOHNG JK. – Enzymatic synthesis of apigenin glucosides by glucosyltransferase (YjiC) from Bacillus licheniformis DSM 13, Molecules and Cells, 36: 355-61, 2013

[6] MOȚA C., ROȘU A., CÂMPEANU GH. – Compuși bioactivi de origine vegetală. Abordări biotehnologice, Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de Biotehnologii, București, 2014

[7] http://www.naturlife.hu/?page_id=25&lang=ro accesat la data de 22/06/2014

[8] GUPTA S., AFAQ F., MUKHTA H. – Selective growth-inhibitory, cell-cycle deregulatory and apoptotic response of apigenin in normal versus human prostate carcinoma cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 287: 914-920, 2001

[9] WILKINS MR., WIDMER WW., GROHMANN K., CAMERON RG. – Hydrolysis of grapefruit peel waste with cellulase and pectinase enzymes, Bioresource Technology, 98: 1596-1601, 2007

[10] HAMAHAMEEN B.A., JAMAL B. – Determination of flavonoids in the leaves of hawthorn (Crataegus Azarolus) of Iraqi Kurdistan Region by HPLC Analysis, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics, 3: 67-70, 2013

[11] http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB1384541.htm accesat la data de 10/11/2013

[12] http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/520-36-5 accesat la data de 8/01/2014

[13] MOLYNEUX R.J., WAN A.C., HAD JR., HADDON W.F. – Oxidative coupling of apigenin, Tetrahedron Letters, 26: 1409-1416, 1970

[14] http://www.naturalplantextract.com/herbal-extract/hawthorn-extract.html accesat la data de 7/01/2013

[15] PĂUN G., GHEHE O., DIACONU M. – Procesare avansată a plantelor medicinale, INCDSB – Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Științe Biologice, București, 2011

[16]http://universitypublishingonline.org/foundation/chapter.jsf?bid=CBO9788175968295&cid=CBO9788175968295A133 accesat la data de 12/01/2014

[17] http://en.wikipedia.org/wiki/Flavones accesat la data de 1/12/2013

[18] http://flavone.askdefine.com/ accesat la data de 11/01/2014

[19] http://en.wikipedia.org/wiki/Fries_rearrangement accesat la data 15/12/2013

[20] http://ro.wikipedia.org/wiki/Teoria_acido-bazic%C4%83 accesat la data 13/01/2014

[21] WANG J., ZHOU R-G., WU T., YANG T., QIN Q-X., LI I., YANG B., YANG J., – Total synthesis of apigenin, Journal of Chemical Research, 36: 121-122, 2012

[22] GOTHELF K., , TORSSELL K. B.G. – A convenient synthesis of flavones. Synthesis of apigenin, Acta Chemica Scandinavica, 46: 494-495, 1992

[23] SEIJAS J.A., VA’ZQUEZ-TATO M.P., CARBALLIDO-REBOR R., – Solvent-free synthesis of functionalized flavones under microwave irradiation, Journal of Organic Chemistry, 70: 2855-2858, 2005

[24] http://www.authorstream.com/Presentation/aSGuest138940-1466016-mass-spectroscopy-flavonoid/ accesat la data de 10/01/2014

[25] GATES P. J., LOPES N. P. – Characterisation of flavonoid aglycones by negative ion chip-based nanospray tandem mass spectrometry, International Journal of Analytical Chemistry, 2012: 1-7, 2012

[26] http://cachescan.bcub.ro/2008_05_28/cap_13_1_pagini_230_242.pdf accesat la data de 20/01/2014

[27] DĂNEȚ A. F. – Analiză instrumentală, Partea I, Editura Universității din București, București, 2010

[28] http://ika-chemistry.blogspot.ro/ accesat la data de 23/01/2014

[29] JÄNI L., NAȘCU H. I. – Chimie analitică și instrumentală, Editura AcademicPres & AcademicDirect, București, 2009

[30]http://www.cheneliere.info/cfiles/complementaire/chimie_organique_01/pdf/05_Spectroscopie_par_resonance_magnetique_nucleaire_%28RMN_1H%29.pdf accesat la data de 5/01/2014

[31] LIU R., ZHANG H., YUAN M., ZHOU J., TU Q., LIU, J.-J., WANG J. – Synthesis and biological evaluation of apigenin derivatives as antibacterial and antiproliferative agents, Molecules, 18: 11496-11511, 2013

[32]http://www.cheneliere.info/cfiles/complementaire/chimie_organique_01/pdf/05_Spectroscopie_par_resonance_magnetique_nucleaire_%28RMN_13C%29.pdf accesat la data de 10/01/2014

[33] LIU R., ZHANG H. , YUAN M., ZHOU J., TU Q., LIU J.-J. și WANG J. – Synthesis and biological evaluation of apigenin derivatives as antibacterial and antiproliferative agents, Molecules and Cells, 18: 11496-11511, 2013

[34] http://en.wikipedia.org/wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent accesat la data de 25/06/2014

[35] http://www.heart-health-guide.com/apigenin.html accesat la data de 25/06/2014

[36] http://www.vitacrystal.ro/termekeink_flavitamin.php accesat la data de 26/06/2014

[37] http://www.paradisulverde.com/Magazin-On-line/Altele/Supliment/EXTRACT-HIDROALCOOLIC-PADUCEL-50ml-DACIA-PLANT.html accesat la data de 26/06/2014