Evaluarea Diversitatii Genetice LA Salvia Sclarea L

EVALUAREA DIVERSITĂȚII GENETICE LA

SALVIA SCLAREA L.

CUPRINS

ADNOTARE

ANNOTATION

INTRODUCERE

CAPITOLUL 1. EVIDENȚIEREA DIVERSITĂȚII GENETICE LA PLANTE

1.1. Importanța studierii variabilității plantelor

1.2. Caracteristica generală a speciei Salvia sclarea L.

1.2.1. Descrierea morfologică a specie

1.2.2. Încadrarea sistematică și răspândirea specie

1.2.3. Aspecte biochimice ale specie

1.2.4. Proprietatile farmacologice ale specie

1.3. Selecția asistată de markeri moleculari

1.3.1. Tehnici utilizate în selecția asitată de markeri moleculari

1.3.2. Caracteristica tehnicii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

CAPITOLUL 2. MATERIALE ȘI METODE DE STUDIU

2.1. Obiectul de studiu

2.2. Metode de cercetare

2.2.1. Izolarea ADN-ului

2.2.2. Analiza calitativă și cantitativă a ADN-ului

2.2.3. Analiza RAPD

2.2.4. Calcularea similarității genetice

CAPITOLUL 3. VARIABILITATEA MOLECULARĂ ÎN CADRUL GENOTIPURILOR DE SALVIA SCLAREA L.

3.1. Polimorfismul genetic evaluat în baza primerilor RAPD

3.2. Diversitatea genetică a hibrizilor de salvie

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

BIBLIOGRAFIE

INTRODUCERE

Argumentarea importanței și actualității temei cercetate.

Plantele medicinale au constituit din cele mai vechi timpuri o importantă preocupare a omenirii, care prezintă o deosebită importanță din punct de vedere economic. Aceste specii, de mii de ani, reprezintă izvoare de materie primă pentru ramurile industriale precum: medicină, farmacologie, fitoterapie, aromaterapie, cosmetologie precum și alimentație. Încă de la începutul existenței sale, la început din instinct, apoi din intuiție și experiență, iar mai târziu printr-o abordare științifică și rațională, omul a folosit și continuă să folosească plantele medicinale în scopul vindecării bolilor și ameliorării sănătății.

Importanța plantelor medicinale este determinată de conținutul ridicat al acestor specii în diferite principii active cum ar fi uleiurile esențiale, antioxidanți naturali, fenoli, alcaloizi ș. a. În acest context, în paralel cu revigorarea metodelor terapeutice tradiționale, se constată că este necesară studierea complexă din punct de vedere biologic, ecologic, și agricol a plantelor medicinale; studierea compușilor chimici caracteristici, precum și elaborarea tehnologiilor cadru de cultivare specifică a fiecărei plante medicinale în parte.

În flora spontană a Republicii Moldova se întîlnește un spectru larg de specii de plante medicinale și aromatice (PMA). Însă potrivit Catalogului de soiuri de Plante al Republicii, elaborat de către Comisia de Stat pentru Testarea Soiurilor de Plante a Ministerului Agriculturii și Industriei Alimentare Moldova, ediția 2013, pentru cultivarea în complexul agroalimentar al țării sunt admise doar 20 de specii ce cuprind 29 de soiuri, dintre care 5 soiuri de Salvia sclarea L [catalog, 2013].

Salvia sclarea este o specie importantă din familia Lamiaceae, cu o istorie îndelungată de utilizare ca plantă medicinală. Importanța cercetării acestei specii, derivă din calitățile fitoterapeutice a principiilor active prezente în uleiul esențial extras din inflorescețele de șerlai.

Cercetarea la nivel genetic a genotipurilor de salvie, din Colecția de Plante Medicinale și Aromatice a IGFPP, care reprezintă un vast material initial pentru programele de ameliorare, este una din încercările contemporane de studiu efectuate în Republica Moldova. Aceste studii constituie o problemă actuală pentru țara noastră în vederea sporirii producției și satisfacerii cererii pieței în materie primă de șerlai. Cercetările moleculare actuale în acest domeniu au ca scop major evidențierea polimorfismului specific intrapopulațional, care prezintă o importanță deosebită în procesul de selecție a formelor înalt productive de șerlai cu interes economic deosebit.

Descrierea situației în domeniul de cercetare și identificarea problemelor de cercetare

Practic, toate progresele realizate până recent în domeniul geneticii și ameliorării plantelor de cultură și de interes economic, s-au bazat pe evaluarea caracterelor fenotipice. La moment, realizările științifice din ultimele decenii privind structura, expresia și manipularea genomurilor, determină o evoluție rapidă a cunoștințelor biologice, schimbând radical imaginea și conceptele referitoare la procesele fundamentale ale materiei vii. Astfel, strategiile clasice de evaluare a variabilității genetice sunt completate de tehnicile moleculare.

Cultura șerlaiului printre alte specii de PMA cultivate în Republica Moldova, rămâne una dintre cele mai răspândite în ceea ce privește suprafețele ocupate și producția care se obține sub formă de ulei volatil și concret solicitat pe piața mondială. În vederea sporirii producției materiei prime, salvia a cucerit atenția cercetătorilor. Însă studiile efectuate se limitează la cercetarea tehnologiilor de cultivare și de extracție a substanțelor biologic active. De asemenea au fost realizate programe de ameliorare, fiind certificate cca 5 soiuri de șerlai. Genotipurile de salvie supuse programelor de ameliorare, au fost selectate doar în baza caracterelor morfologice studiate. Astfel se atestă o lipsă a cercetărilor genetice și de biologie moleculară ce vizează acest obiect de studiu.

În acest context scopul prezentei lucrări constă în estimarea diversității intraspecifice la specia Salvia sclarea L. prin evaluarea polimorfismului genetic.

Obiectivele lucrării:

Evaluarea polimorfismului genetic la salvie în baza primerilor RAPD;

Estimarea gradului de similaritate genetică la hibrizii de salvie cercetați.

Metodologia cercetării

Metodologia cercetării a avut la bază realizarea experimentului științific (în condiții de laborator) și s-a axat pe utilizarea tehnicilor de analiză moleculară. În scopul obținerii unor datelor cu privire la nivelul polimorfismului genetic și a gradului de asemănare genetică, s-au utilizat concomitent metode cantitative (spectrofotometrie), calitative (RAPD-PCR, eletroforeză), și statistico-matematice de analiză. Pentru interpretarea datelor s-a utilizat metoda inductivă, deductivă, comparativă și explicația cauzală.

CAPITOLUL 1. EVIDENȚIEREA DIVERSITĂȚII GENETICE LA PLANTE

Biodiversitatea organismelor cuprinde diversitatea la nivel de ecosistem (diversitatea ecologică), între specii (interspecifică) și în cadrul speciilor (intraspecifică). Diversitatea intraspecifică constituie elementul cheie a evoluției organismelor, asigurînd capacitatea de adaptare la noile condiții de mediu (Alberto et al., 2011).

Biodiversitatea la nivel de specie se referă la varietatea de alele și combinații ale acestora, reflectată în diferențe fenotipice – trăsături morfologice (ex. culoarea, forma florii la plante), biochimice (ex. structura proteinelor, proprietățile izoenzimelor) etc. Mecanismele primordiale ce determină modificarea combinațiilor de alele în diferite populații și, finalmente, heterogenitatea populațiilor sunt selecția naturală, drift-ul genetic și fluxul de gene [Frankham, 2002]. Variabilitatea genetică reprezintă capacitatea (tendința) unui individ sau a unei populații de a varia sub raportul însușirilor genotipice și fenotipice. În practică, termenul de variabilitate genetică se folosește în cazul caracterelor fenotipice, iar termenul diversitate genetică atunci când se utilizează markeri moleculari [Enescu, 1997]. În acest context, diversitatea genetică reprezintă unitatea de bază în procesul evolutiv al organismelor, în măsura în care asigură capacitatea acestora de a se adapta la noile condiții de mediu, de a supraviețui și a coloniza habitate de amplitudine ecologică largă.

Tehnicile moleculare utilizate în evidențierea variabilității genetice oferă perspective promițătoare pentru avansarea cunoștințelor în domeniul biologiei vegetale și marchează un salt calitativ asigurat de perfecționarea metodelor de investigare, cristalizându-se aspectul molecular al fiziologiei plantelor și al științelor agricole în general. Metodele disponibile pentru studierea diversității genetice permit estimarea polimorfismului la nivel de ADN prin tehnici de amprentare genetică, care fac posibilă localizarea și vizualizarea directă, la nivel molecular, atât a genelor responsabile de fenogeneza unui anumit caracter calitativ (monogenic), cât și a sectoarelor de ADN .

Importanța studierii variabilității plantelor

În ultimele decenii a fost înregistrată o creștere a gradului de conștientizare cu privire la importanța conservării biodiversității, inclusiv a biodiversității agricole pentru o utilizare și dezvoltare durabilă. Acest principiu a stat la baza Convenției privind biodiversitatea biologică și Planul Global de Acțiune în Alimentație și Agricultură elaborate de Organizația Națiunilor Unite [Ramanatha, 2002]. În prezent accentul se pune pe înțelegerea distribuției și amplorii diversitatății genetice a speciilor de plante, astfel încât diversitatea genetică să fie cu rigoare conservată și utilizată eficient. Amploarea și distribuția diversității genetice în cadrul speciilor de plante depinde de cursul său evolutiv, sistemul de reproducere, factorii ecologici și geografici, fenomenele „gâtului de sticlă” prin care a trecut specia dată, și deseori de influența factorului uman. Niveluri ridicate de diversitate genetică a unei specii pot fi identificate în cadrul populațiilor individuale, sau pot fi împărțite între un număr diferit de populații.

Studierea diversității genetice la plante la nivel interpopulațional pune în evidență asocierea unor elemente ale genomului cu anumite capacități de adaptare a indivizilor la condițiile ecologice, climaterice, poziție geografică, etc. De asemenea poate fi identificat traseul și cartat arealul de raspândire a speciei cercetate [Claes, 1998].

Actualmente, o deosibită importanță prezintă evaluarea diversității genetice in interiorul populațiilor individuale. Cunoașterea gradului și modelului de variație genetică la nivel intrapopulațional oferă o serie de utilizări practice, în domenii cum sunt determinarea compoziției genetice și a calității semințelor utilizate în procesele de ameliorare, conservarea genetică, precum și sporirea producției de uleiuri esențiale și a diferitor compuși biochimici valoroși (sclareol, linalool, acid rosmarinic, etc.).

Identificarea și descifrarea structurii diferitelor gene prin metodele biologiei moleculare, a dus la stabilirea unor corelații între genotipuri și anumite însușiri calitative și cantitative ale productivității, însușiri de reproducție și rezistență la boli și dăunători. Prin urmare studierea și evaluarea diversității genetice, exclusiv prin metoda selecției asistate de markeri moleculari, ne oferă posibilitatea depistării unor gene majore ce afectează caracterele cantitative sau calitative, sau a unor gene minore, strâns înlănțuite cu aceste gene majore ce afectează aceste caractere cantitative. De asemenea prin utilizarea unor tehnici moleculare specifice, bazate pe analiza ADN (PCR, RFLP, RAPD, AFLP, SNP, STR, ARMS, etc.) se pot identifica și selecționa în populații, indivizi cu genotipuri dorite la nivelul locilor genelor ce codifică caracterele de interes, realizându-se în acest mod o selecție sigură, rapidă și eficientă în cadrul populațiilor studiate [Carșai 2009].

Un interes deosebit în domeniul variabilității plantelor îl reprezintă studierea diversității genetice la plantele medicinale și aromatice, în vederea asocierii unor markeri genetici cu caractere fenotipice cum sunt producția de substanțe biologic active. PMA reprezintă un interes major pentru economia mondială. Valorificarea potențialului plantelor medicinale și aromatice este foarte profitabilă, acestea constituie principalul furnizor de compuși fitochimici utilizați în diferite ramuri industriale: farmacie, medicină, alimentație, cosmetologie, fitoterapie, etc.

Una din aceste plante medicinale ce prezintă proprietăți valoroase, pentru care este apreciată la un nivel înal în industria parfumeriei și cea a aromaterapiei este și SalviaADN (PCR, RFLP, RAPD, AFLP, SNP, STR, ARMS, etc.) se pot identifica și selecționa în populații, indivizi cu genotipuri dorite la nivelul locilor genelor ce codifică caracterele de interes, realizându-se în acest mod o selecție sigură, rapidă și eficientă în cadrul populațiilor studiate [Carșai 2009].

Un interes deosebit în domeniul variabilității plantelor îl reprezintă studierea diversității genetice la plantele medicinale și aromatice, în vederea asocierii unor markeri genetici cu caractere fenotipice cum sunt producția de substanțe biologic active. PMA reprezintă un interes major pentru economia mondială. Valorificarea potențialului plantelor medicinale și aromatice este foarte profitabilă, acestea constituie principalul furnizor de compuși fitochimici utilizați în diferite ramuri industriale: farmacie, medicină, alimentație, cosmetologie, fitoterapie, etc.

Una din aceste plante medicinale ce prezintă proprietăți valoroase, pentru care este apreciată la un nivel înal în industria parfumeriei și cea a aromaterapiei este și Salvia sclarea L. În prezent cercetările privind această reflectă studiul compușilor fitochimici, căile de sinteză a acestora și influența acestora asupra organismului uman.

În Republica Moldova date științifice cu privire la specia Salvia sclarea L. relevă rezultatele cercetărilor agro-tehnice, cum sunt perfecționarea tehnologiei de cultivare a acesteia [Crețu, 2009], cît și de ameliorare [Gonceariuc, 2002]. Astfel, studiul genetic al speciei reprezintă o noutate științifică în cercetările genetice din Republica Moldova.

Caracteristica generală a speciei Salvia sclarea L.

Salvia sclarea L. (salvia, șerlai) reprezintă una dintre cele mai importante PMA (European Pharmacopoeia 5.0: p. 1311) din familia Lamiacee, cu o istorie îndelungată de utilizare, în prezent fiind cultivată și valorificată pentru producția sa înaltă de ulei esențial. Numele latin al salviei indică clar importanța sa în fitoterapie: salvia (latin: salvare – a vindeca). Specia prezintă un interes economic sporit, fiind pe larg utilizată în diferite ramuri industriale precum: alimentație, medicină, farmacologie, fitoterapie, aromaterapie, parfumerie și cosmetologie.

Descrierea morfologică a specie

Salviei sclarea L. este o plantă erbacee, cunoscută ca plantă bienală sau perenă de scurtă durată [Clebsch, 2003]. Este o specie alogamă, entomofilă [Gonceariuc, 2002], având rădăcina de culoare brună, cu un diametru de 1,5 – 3 cm, pe care se formează numeroase rădăcini secundare scurte și subțiri. Tulpina S. sclarea este patrunghiulară, erectă, înaltă de 1,2 – 1,7 m, cu o grosime cuprinsă între 1 – 2 cm și acoperită cu numeroși peri glandulari. Chiar dacă specia dată e considerată bienală, sau după unii autori – perenă, tulpina ei este întotdeauna anuală și se termină cu inflorescența.

Frunzele opuse, lat ovate, sunt diferite ca mărime în funcție de locul pe tulpină. Frunzele din rozetă au pețiol lung, care lipsește la cele de pe tulpină. În funcție de poziția acestora dimensiunile limbului variază între 10 – 25 cm lungime și 7 – 15 cm lățime. Ambele fețe ale frunzelor sînt puternic încrețite și acoperite cu numeroși perișori, care le dau un aspect catifelat, avînd un rol deosebit în reglarea transpirației.

Florile de șerlai sunt grupate în inflorescențe mari, lungi de 20 – 60 cm, puternic ramificate, paniculiforme. Inflorescența este formată din 6 – 10 pseudoverticile, fiecare avînd cîte 4 – 6 flori, așezate la subsuoara unor bractee nepedunculate, colorate în alb-verzui. Corola este bilabiată, lungă de 2 – 2,5 cm, cu labiul superior violaceu (rar roz sau alb), iar cel inferior format din doi dinți laterali și o porțiune mediană curbată în jos. Staminele sunt în număr de 4, din care numai 2 sunt bine dezvoltate. Ovarul, superior are 4 ovule. Înflorește din iulie pînă la începutul lui septembrie, cu o perioada de înflorire ce durează aproximativ 25 – 30 de zile.

Fructele, impropriu numite semințe, sînt nucule, rotunde, mici, netede, cafenii deschis. Greutatea a 1000 de nucule este de aproximativ 3,5 – 4 g. În momentul maturării, caliciul se îndoaie, iar nuculele se scutură foarte ușor. În contact cu apa acestea se acoperă cu o masă mucilaginoasă, mărindu-și volumul. Imediat după ce se zvântă, semințele păstrează o parte din umiditate, dar nu-și pierd puterea de germinare [ Păun, 1988; Gonceariuc, 2002].

Încadrarea sistematică și răspândirea specie

Familia Lamiaceae cuprinde aproximativ 150 de genuri, cu peste 3000 de specii răspândite pe tot globul. Majoritatea plantelor din această familie, prezintă importanță medicinală, meliferă și ornamentală.

Salvia sclarea L. (Salvia sclarea L. → Salvia → Lamiaceae → Lamiales → Asteranae → Magnoliophyta → Angiosperme → Spermatophyta → Tracheophyta → Streptophyta → Viridaeplantae → Plantae) face parte din grupul plantelor medicinale și aromatice, fiind o specie importantă din genului Salvia L., gen care cuprinde 700-900 specii.

S. sclarea este o specie nativă din Bazinul Mediteranean, Nordul Africii și din zona Centrală a Asiei [Clebsch, 2003]. Se întîlnește în flora spontană în partea sudică și centrală a Europei, în nordul Africii, în Asia Mică, și din Iran și Afganistan ajunge în Caucaz și Crimeea[Păun, 1988]. Șerlaiul este cultivat în scopuri comerciale preponderent în Europa, în țările precum: Franța – 5000 ha, Bulgaria – 2000 ha și Grecia – 1000 ha [Caniard, 2012; europam.net].

În Republica Moldova această specie se cultivă din anul 1948. Suprafețele ocupate de șerlai fiind de 4 – 8 mii de hectare, în unii ani însă acestea ajungeau la 14 mii hectare [Musteață, 1980]. Din 1977 până în 1992 – 1994 specia se cultiva în 20 de gospodării agricole specializate: la Nord în raioanele Râșcani și Glodeni, în centrul Moldovei – raioanele Grigoropol, Criuleni, Anenii-Noi și Căinari, iar in zona de Sud în raioanele Cantemir și Leova [Gonceariuc, 2002].

În prezent suprafața de cultivare a salviei în Republica Moldova depășește 2500 ha, și se află în continuă ascensiune [Crețu, 2011]. Studiul tehnologiei de cultivare, cît și studiile biologice, biochimice și morfologice efectuate asupra acestei specii, servesc drept premiză pentru extinderea ariilor de cultivare și sporirea producției la hectar.

Aspecte biochimice ale specie

Salvia sclarea L. reprezintă o specie bogată în principii active – compuși aromatici volatili cu proprietăți specifice, ce se conțin în uleiul esențial. Obținut prin distilare cu vapori de apă din inflorescențe proaspete, uleiul volatil de șerlai constituie materia primă de mare importanță pentru diferite ramuri ale economiei. Ca materie primăse utilizează în primul rînd inflorescențele, iar în Pharmacopee Europeană 5, uleiul de S. sclarea se caracterizează prin următorul conținut: [European Pharmacopoeia 5.0: p. 1311.].

— α- și β-tuionă: pînă la 0,2 %;

— linalool: 6,5 – 24,0 %;

— acetat de linalil: 56,0 – 78,0 %;

— α-terpineol: pînă la 5,0 %;

— germacrene-D: 1,0 – 12,0 %;

— sclareol: 0,4 – 2,6%.

Conținutul de ulei volatil în frunzele proaspete este de 0,38%, iar în frunzele uscate de 0,39 – 2,54% . Randamentul mediu de obținere a inflorescențelor proaspete este de 6-12 t/ha, dintre care pot fi distilate 7-15 l de ulei esențial [cocrop.fao.org].

Șerlaiul este utilizat preponderent pentru producția și izolarea compusului diterpenic – sclareol. Acest compus este caracteristic speciei date, fiind izolat pentru prima dată din Salvia sclarea, de unde provine și denumirea de slareol. Conținutul de sclareol (C20H36O2), din volumul total de ulei esențial ia valori de la 0,002% pînă la 0,026%, însă uneori poate atinge indicele de 1,5%, în dependență de metoda de extracție [Caissard, 2012]. Pe lîngă sclareol a fost depistată și prezența izomerului său – 13-episclareol, ambii fiind biosintetizați din geranilgeranil-difosfat [Günnewich, 2013; Caniard, 2012]. De asemenea, în conținutul uleiului de salvie este identificat și oxidul de sclareol [Laville, 2012].

În uleiul esențial de șerlai, un conținut semnificativ îl au compușii: linaloolul și mai ales linalilacetatul, precum și hidrocarburile alifatice saturate ca heptacontantul (C27H56) și nesturate ca ocimenul și mircenul (C10H16). De asemenea se întâlnește și un compus sesqueterpenic din grupa guaianolidelor – cedrenul (C15H24). [Coiciu, 1962].

În componența biochimică a uleiului de salvie a fost constatată și prezența E, E-α-farnesen-ului, manoolului și 13-epimanool, precum și oxidul acestuia. În cadrul cercetărilor din ultimul deceniu asupra compoziției chimice a extrasului de Salvia sclarea, a fost posibilă izolarea a doi compuși noi din familia amphilectanelor – salviatriene A și B, ce prezintă un conținut de 4,5% și respectiv 1% din uleiul esențial de șerlai. Dintre compușii aromatici, constituenți ai uleiului de șerlai, se numără α-eudesmol, δ-cadinene și δ-amorphene [Laville, 2012].

Este important de menționat că principiile active nu se găsesc doar în inflorescențele de salvie, ci și în alte organe ale plantei. Astfel în extractul de rădăcinițe de salvie se găsesc două sunbstanțe cum sunt: salvipisona și aethiopinona [Walencka, 2007].

Semințele de Salvia sclarea au un conținut bogat de proteine, indicând o valoare de 17.66 % (+/- 0,11%) și 27.24 % ( +/- 1.32%) conținut de ulei esențial, iar cenușa ocupă 5,23 % ( +/- 0,04%). Dintre acizii grași au fost evidențiați acidul α-linoleic (C18H30O2) cu 52,1% (+/- 0,04%) și acidul oleic (C18H34O2) cu 22,05% (+/- 0,01%) [Yalcin, 2011].

Proprietatile farmacologice ale specie

Multitudinea de substanțe biologic active, ce se conțin în uleiul esențial extras din această plantă, conferă șerlaiului proprietăți farmacologice deosebite. Importanța acestei specii este marcată de prezența în cantități semnificative, în uleiul esențial, a compusului diterpenic – sclareol. Acesta este utilizat în parfumerie ca premergător pentru sinteza ambroxului, care este un excelent fixator de mirosuri.

În aromoterapie, uleiul de Salvia sclarea L. este utilizat drept relaxant pentru înlăturarea stresului, iar în medicină la tratarea astmului și a disfuncțiilor digestive [Dzamic, 2008]. De asemenea uleiul de salvie este eficace pentru combaterea dismenoreei, sau altfel spus a durerilor menstruale [Sundell, 1990].

Printre alte efecte tămăduitoare ale salviei se numără utilizarea ei ca antidepresiv, antiseptic, antispastic, carminativ, și afrodiziac [Dzamic, 2008]. În același timp uleiul de salvie este folosit pe scară largă la prelucrarea produselor alimentare de orice tip, precum și la fabricarea băuturilor alcoolice și nealcoolice [Lawless, 2002].

Proprietăți interesante pe care le evidențiază uleiul de șerlai sunt și acțiunea antimicrobiană și antifungică, cea din urmă datorită în exclusivitate prezenței în ulei a linalyl acetatului și a linaloolului [Dzamic, 2008].

Semințele de șerlai și-au găsit și ele întrebuințare în medicina naturistă. Acestea posedă un strat mucilaginos ce acoperă toată suprafața lor, motiv pentru care, încă din cele mai vechi timpuri, erau recomandate persoanelor cărora le nimerise un obiect străin în ochi. Semințele erau introduse în ochiul bolnavului, astfel ca impuritățile aderau la substratul mucilaginos al seminței și astfel erau ușor eliminate. Această practică a fost menționată pentru prima dată în anul 1653, de către Nicholas Culpeper în lucrarea „Complete Herbal”, în care autorul a numit planta de salvie – "ochiul curat" [bibliomania.com].

În cadrul unei serii de cercetări a fost demonstrat că sclareolul poate induce moartea celulelor leucemice prin declanșarea apoptozei. Aceasta a fost realizat printr-un mecanism specific, necunoscut încă în anul – 1999 [Dimas, 1999]. Mai tîrziu, cercetările realizate de Hatziantoniou și colaboratorii săi, au demonstrat că sclareolul încapsulat într-un liposome și administrat șoarecilor manifestă acțiune citotoxică precum și de inhibare a creșterii celulelor canceroase de diferite tipuri. Potrivit studiului dat sclareolul pare a induce o distrugere ireversibilă a celulelor tratate cu acesta, totuși mecanismul de acțiune încă nu se cunoaște în întregime, se presupune totuși ca ar implica apoptoza [Hatziantoniou, 2006].

Un alt studiu realizat mai recent de un grup de cercetători în frunte cu Noori, a confirmat faptul că sclareolul extras din Slavia sclarea ar avea acțiune antitumorală, ei avînd posibilitatea să și descrie acest mecanism de acțiune. Cercetările au vizat influența sclareolului asupra modulării celulelor T reglatoare (supresoare a celuleor T helper), care induc toleranța organismului față de autoantigeni. Posibilitatea de modulare a celulelor Treg facilitează transplantul de organe, inhibă dezvoltarea cancerului și a maladiilor autoimune.

Aceste celule T supresoare se acumulează în regiunea de creștere a tumorii și inhibă imunitatea antitumorală. Prin injectarea directă intratumorală a sclareolului s-a observat scăderea cantității de CD4+CD25+Foxp3+ T (tip de celulă Treg), și activarea celulelor T helper, ceea ce a și indus inhibarea creșterii tumorii [Noori, 2010].

De asemenea, uleiul de șerlai s-a dovedit a fi eficient și în tratarea disfuncției endoteliale induse de stresul cronic în cadrul unui studiu efectuat pe șobolani. Astfel, animăluțele supuse unui stres îndelungat au fost tratate cu ulei esențial de Salvia sclarea, în urma căruia a fost posibilă recuperarea lor și tratarea disfuncției endoteliale prin creșterea producției de NO și scăderea stresului oxidativ. Prin urmare o concentrație adecvată de salvie poate duce la eradicarea disfuncției endoteliale. Aceste rezultate indică faptul că uleiul de salvie poate fi eficace în prevenirea și tratamentul bolilor cardiovasculare determinate de expunerea la stres. [Yang, 2014).

Salvia sclarea impreună cu alte specii din genul Salvia au prezentat activitate antioxidantă împotriva radicalilor liberi din celulele nervoase. Astfel că extrasul din șerlai în concentrații ridicate, inhibă deteriorarea ADN-ului din neuroni, protejează celula de acțiunea H2O2, prevenind declanșarea procesului de apoptoză în celulele sănătoase [Asadi, 2010]. Aceste experimente din cadrul studiului prezentat mai sus au fost realizate în vitro. Totuși rezultatele obținute indică faptul că aceste plante, inclusiv șerlaiul pot candida în viitorul apropiat ca agenți pentru tratarea bolilor neurodegenerative.

Selecția asistată de markeri moleculari

Variabilitatea genetică a indivizilor ce formează o anumită populație, este reflectarea polimorfismului genetic existent la nivelul lor, adică a variației genetice inter- sau intrapopulaționale. Această variație este rezultatul recombinării genetice, mutațiilor și activității elementelor genetice transpozabile. Astfel, putem defini polimorfismul genetic ca fiind apariția într-o populație a două sau mai multor alele pentru un locus cu o frecvență mai mare decât cea pe care o poate menține mutația. Diferențele genetice care stau la baza variațiilor în cadrul speciilor de asemenea sunt reprezentate de polimorfismul genetic. În acest aspect, organisme cu genotipuri individuale, care se deosebesc după o serie de calități distincte, coexistă în cadrul unei populații, în calitate de membri egali.

Markerii genetici reprezintă forme diferite ale aceleiași gene care controlează expresii fenotipice mutante și permit identificarea prezenței unei gene la nivel individual. Aceștia se bazează pe polimorfismul genei la nivelul expresiei fenotipice în relație cu condițiile de mediu. Există trei tipuri de markeri genetici: morfologici, biochimici și moleculari. Cei din urmă sunt cei mai utilizați datorită numărului lor nelimitat, aceștia provenind din diferite tipuri de mutații ale ADN-ului: substituții (mutații punctiforme), rearanjamente (inserții sau deleții) sau erori în replicarea ADN-ului în tandem. Ei sunt neutri deoarece sunt localizați în regiuni necodate a ADN-ului, de asemenea, markerii moleculari sunt practic în număr nelimitat și nu sunt influențați de condițiile de mediu sau de stadiul de dezvoltare al plantelor [Winter 1995].

Descoperirea markerilor moleculari și utilizarea lor pentru detectarea și exploatarea polimorfismului ADN reprezintă una din cele mai semnificative realizări în domeniul geneticii moleculare. Selecția asistată de markeri moleculari oferă geneticienilor și amelioratorilor, posibilitatea de a depăși multe din problemele întâmpinate în timpul reproducerii convenționale. Existența unor variate tipuri de oligonucleotide ce diferă în ce privește principiul, metodologia și aplicațiile, necesită atenție în alegerea uneia sau alteia dintre metode pentru un anume scop. În prezent nu exista un tip de marker molecular care să asigure toate necesitățile cercetării moderne. În funcție de scopul urmărit se poate alege un anume tip de marker molecular. Cei mai utilizați markeri sunt cei bazați pe analiza ADN deoarece sunt prezenți la toate organismele vii. Aceștia pot fi strâns legați de un mare număr de trăsături agronomice și de rezistența la boli, existente în majoritatea speciilor de cultură [Gupta 1999, Philips 2001]. Oligonucleotidele ADN pot fi generate în număr foarte mare și pot servi unor scopuri relevante pentru îmbunătățirea calității culturilor.

Pentru a putea avea aplicabilitate maximă în diferitele programe de selecție asistată, markerii moleculari trebuie să:

prezinte o transmitere codominantă în descendență, adică să permită determinarea statutului homozigot sau heterozigot al organismelor diploide;

aibă o natura înalt polimorfă;

aibă o frecvență mare în populații (peste 10%);

nu fie influențați de condițiile de mediu și să nu fie supuși presiunii de selecție;

fie determinați rapid, la un cost cât mai redus;

poată fi obținuți din orice țesut, în orice etapă de dezvoltare ontogenetică;

prezinte o reproductibilitate mare;

ofere posibilitatea schimbului de date între laboratoare.

Markerii moleculari în funcție de metoda lor de detecție pot fi bazați pe hibridizare, pe PCR, și bazați pe secvențe ADN. În general cei mai valoroși markeri genetici sunt cei mai polimorfici. Aceștia sunt cei pentru care un individ prezintă 2 forme diferite și pentru fiecare formă diferite variante cu frecvențe apreciabile în populație. Polimorfismele reflectă alterări ale secvențelor ADN care pot fi demonstrate prin tehnologii ADN. Proteine alterate, enzime sau antigene și caractere anormale pot toate indica polimorfisme.

Markerii moleculari au o importanță deosebită în aprecierea componenței ereditare a organismului și reprezintă principalele forțe motrice ale ameliorării. Astfel, aceștia se utilizează pe larg datorită numărului nelimitat, provenind din diferite tipuri de mutații ale ADN-ului: substituții (mutații punctiforme), rearanjamente (inserții sau deleții) sau erori în replicarea ADN-ului în tandem, fiind neutri deoarece sunt localizați în regiuni necodificatoare a moleculei de ADN, care sunt practic în număr nelimitat fiind influențați de condițiile de mediu sau de stadiul de dezvoltare al plantelor [Winter 1995].

Markerii moleculari care sunt strâns linkați cu gene importante în sens agronomic sunt folosiți ca instrumente moleculare pentru selecția asistată de markeri în ameliorarea plantelor. Cu ajutorul acestora se urmărește efectuarea unei selecții indirecte a caracterelor de interes folosind strânsa legătură (linkage-ul) dintre gena sau genele care controlează caracterul și un marker molecular, metodă ce poartă numele de selecție asistată de markeri (MAS – Marker Assisted Selection) [Bertrand, 2008].

Selecția asistată de markeri constă în identificarea unei legături strânse între genele care controlează caractere agronomice și markeri moleculari, precum și utilizarea acestor markeri ]n programele de ameliorare. Genele sunt moștenite împreună, iar prin prezența uneia (gena marker, la care este cunoscută secvența de nucleotide) se confirmă că și cealaltă genă ce determină caracterul dorit este prezentă în acel individ.

Selecția asistată de markeri moleculari (MAS) este o metodă de selecție indirectă care presupune selecția plantelor purtătoare a regiunilor care sunt implicate în expresia caracterelor de interes (plante rezistente) prin oligonucleotide [Landjeva 2007].

În prezent selecția asistată de markeri moleculari este axată pe:

selecția caracterelor cu importanță economică, pentru care metodele bazate numai pe fenotip sunt dificile sau necesită costuri ridicate;

selecția caracterelor cantitative;

piramidarea genelor de rezistență;

Selecția asistată de markeri moleculari este considerată o metodă foarte utilă în ameliorarea pentru rezistența la boli a speciilor cultivate. În primul rînd pentru că identificarea genotipului de rezistență prin testarea în câmp este costisitoare, necesită timp îndelungat și este foarte mult influențată de condițiile de mediu. Însă cu ajutorul markerilor se elimină influența mediului în selecție. Selecția se poate realiza fără a recurge la teste de inoculare, permițând astfel evitarea erorilor asociate cu utilizarea acestor proceduri, fiind posibilă ameliorarea rezistenței în arealuri unde patogenul nu există. Astfel, schema de selecție este accelerată întrucât selecționerii pot conchide prezența genei prin prezența markerului înaintea expresiei fenotipice. În același timp markeri linkați cu diferite gene de rezistență oferă posibilitatea combinării mai multor gene (piramida genelor) atunci când selecția anumitor gene în prezența altor gene este dificilă.

Tehnici utilizate în selecția asitată de markeri moleculari

Utilizarea succesiunilor polimorfe de ADN în calitate de sisteme de marcare create pe bază de PCR, a rezolvat problema impregnării genomului și a permis marcarea, practic a oricăror regiuni de ADN. De asemenea, metodele de înaltă performanță de analiză a polimorfismului ADN a condus la crearea noului tip – SNPs, care unește o parte semnificativă de markeri – ADN, priviți anterior ca grupuri independente (PCR – RFLP, SSCP ș.a.) [Pop 2003].

Tehnicile moleculare utilizate pe larg de către cercetători pentru analiza polimorfismului molecular sunt analiza AND-lui polimorf amplificat (Random Amplified Polymorphic DNA – RAPD); Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție (Restriction Fragment Length Polymorphisms – RFLP); studiul markerilor microsateliți (Sequence Characterized Amplified Regions SCAR), polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP), etc. [Powell, 1996; Garcia 2004].

Tehnicile cele mai avansate în selecția asistată pentru anumite caractere dorite implică utilizarea markerilor ADN, care au la bază folosirea enzimelor de restricție, fie pe tehnologia PCR sau mixtă, fiind clasificate în trei grupuri de bază [Koranyi, 1988]: tehnici bazate pe PCR, tehnici cu primeri arbitrari sau semiarbitrari sau cu profiluri multi-locus și tehnici de analiză prin restricție.

Caracteristica tehnicii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Tehnica RAPD se bazează pe determinarea polimorfismului la nivel alelic în ceea ce privește producerea unor produși de amplificare sau lipsa lor, în urma utilizării unui primer oligonucleotidic, arbitrar, într-o poziție care să-i permită realizarea amplificării. Această variantă a tehnicii PCR nu necesită clonarea sau secvențierea ADN și poate detecta mai mulți loci simultan [Carsai, 2009].

Principiul tehnicii este simplu: ADN izolat de la un individ este supus unei reacții PCR utilizând primeri oligonucleotidici, împerecheați aleator (8 – 12 perechi de baze), care vor hibrida la secvențele sale complementare, în cazul în care acestea există. Dacă din întâmplare, doi primeri consecutivi, aflați în vecinătate, se atașează la matriță în sensuri opuse, fiecare pe una din cele două catene, la o distanță nu prea mare unul de celălalt, fragmentul delimitat de ele va fi amplificat, iar dacă unul din cele două situsuri este absent la unul din indivizi, la acesta amplificarea nu va avea loc, evidențiindu-se un polimorfism de prezență/absență [Williams I. și colab., 1990]. O astfel de situație, care permite amplificarea randomizat, în mai multe puncte, poate fi realizată la nivelul întregului genom.

Polimorfismul detectat prin RAPD este folosit ca și marker molecular. Markerii RAPD se comportă ca markeri dominanți când sunt urmăriți în descendență. Acest comportament rezultă din faptul că un fragment amplificat este prezent în gel (ca o alelă dominantă A) sau absent (ca alelă recesivă a). În analiza descendenților, un fragment este observat în stare homozigotă (analog cu AA), fiind amplificat atât ADN de la un părinte, cât și de la celălalt, sau în stare heterozigotă (analog cu Aa), când este amplificat numai ADN provenit de la unul din părinți, celălalt prezentând un polimorfism reperezentat prin absența fragmentului [Saez R. și colab., 2004].

În stare heterozigotă, absența fragmentului de la unul din părinți este mascată de prezența benzii datorată fragmentului amplificat de la celălalt părinte. Prin urmare, analiza RAPD nu poate discerne între starea homozigotă (AA) și cea heterozigotă (Aa).

În cazul markerilor codominanți însă (în care fiecare părinte posedă o bandă distinctă, pe care celălalt nu o posedă), starea heterozigotă (AB) în descendență (prezența ambelor benzi în hibridul din Fi) poate fi deosebită de stările homozigote (AA) și (BB).

Markerii RAPD sunt rezultați prin amplificarea PCR a unor segmente necunoscute de ADN genomic cu ajutorul unei amorse decamere aleatoare, care au fost utilizați intens în mai multe studii, astfel, datorită posibilității de a analiza un număr considerabil de loci în diferite regiuni ale genomului metoda se utilizează în aspectul identificării genelor, studierii variabilității genetice a populațiilor, elaborarea de hărți cromozomiale, studiul relațiilor filogenetice etc [Cheng, 1998; Joy, 2008].

Modificarea unei singure baze în genom este suficientă pentru a împiedica atașarea primerului în acel loc și a împiedica amplificarea fragmentului delimitat de acel primer. Analiza RAPD poate detecta modificarea unei singure baze în ADN genomic, astfel în practică este dificil să se cunoască frecvența cu care este menținută o anumită alelă prin mutație. Se consideră că există un polimorfism, dacă cea mai comună alelă pe un locus are o frecvență de 99%. Cu alte cuvinte, polimorfismul se caracterizează prin lipsa aceleiași alele pe un locus la minimum 1% din numărul de indivizi dintr-o populație, sau în cazul SNP-urilor (Single Nucleotid Polymorphism) – nu prezintă aceeași nucleotidă într-un anumit locus [nature.com].

Polimorfismul detectat de RAPD poate rezulta din câteva tipuri de modificări:

inserția unei secvențe mari de ADN, între secvențele de atașare a primerilor, care fac fragmentul delimitat de aceste secvențe prea mare pentru a fi amplificat;

deleția unui fragment de ADN ce conține unul din situsurile de atașare a primerilor duce de asemenea la lipsa amplificării segmentului;

substituția unui nucleotid poate afecta hibridarea primerului la un anumit situs de atașare, putând evidenția sau nu un polimorfism (dispariția unei benzi);

inserția sau deleția unui mic fragment de ADN poate duce la modificarea mărimii unui fragment amplificat și a poziției benzii în gel [Pop, 2013].

Un studiu realizat de Williams și colab. 1990 a arătat că 95% din fragmentele RAPD se comportă ca markeri dominanți (un singur fragment amplificat distinctiv la unul sau ambii părinți și descendenți) și sub 5% se comportă ca markeri codominanți.

Utilizarea reacției PCR și a unei amorse (primer) cu secvențe arbitrare de nucleotide, în ansamblu denumită metoda RAPD, s-a constatat că poate evidenția polimorfismul din structura amplificată a ADN-ului. Această tehnică și-a găsit rapid largi aplicații în: studiul genomului, gene tagging, chromosome tagging, studiul populațiilor, cel filogentic și identificarea variațiilor genotipurilor [Pop, 2003].

CAPITOLUL 2. MATERIALE ȘI METODE DE STUDIU

Tehnicile moleculare utilizate pentru studierea polimorfismului la nivel molecular vizează, mai întâi de toate metodele de amprentare genetică, care fac posibilă localizarea și vizualizarea directă, atât a genelor responsabile de fenogeneza unui anumit caracter calitativ (monogenic), cât și a sectoarelor de ADN, denumite generic markeri moleculari, care delimitează anumite gene majore sau anumiți loci cantitativi, prezenți în vecinătatea lor.

Cercetările prezentate sunt axate pe evidențierea variabilității specifice intrapopulaționale la salvie. În acest context, pentru obținerea unor date de ansamblu asupra celor genotipurilor de Salvia sclarea L. incluse în studiu, s-au aplicat concomitent metode genetice (spectrofotometria și analiza acizilor nucleici prin RAPD-PCR) și statistico-matematice de analiză.

Obiectul de studiu

În cadrul cercetărilor au fost analizate 27 genotipuri de Salvia sclarea L. din colecția de Plantelor Aromatice și Medicinale, Institutul de Genetică, Fiziologie și Protecție a Plantelor (IGFPP), AȘM . Materialul studiat a fost oferit cu amabilitate de doamna doctor habilitat în științe agricole Maria GONCEARIUC.

Materialul vegetala fost recoltat în faza de creștere și dezvoltare de rozetă de 4-6 perechi de frunze, perioada de vegetație fiind anul III pentru formele parentale și anul II de vegetație pentru formele hibride. Este de menționat că unii hibrizi cercetați au în comun una din liniile parentale, cea maternă sau paternă (Tabelul 2.1).

Metode de cercetare

Polimorfismul intraspecific la Slavia sclarea L. a fost descris în baza rezultatelor obținute în urma aplicării metodei RAPD – PCR. Prelucrarea datelor obținute în baza tehnicii de analiză moleculară – RAPD, s-a realizat în cadrul Laboratorului de Bioinformatică, CBM, UnAȘM.

Izolarea ADN-ului

Extragerea și purificare ADN a fost realizată prin metoda standart (CTAB), în conformitate cu protocolul lui Murray și Thomson cu anumite modificări [Murray 1980].

Tabelul 2.1.

Materialul vegetal fixat în azot lichid a fost majorat pînă la consistența de praf, ulterior a fost adăugată soluția CTAB la care a fost adăugat acid ascorbic și β-mercaptoetanol. Pentru liza țesuturilor și extragerea ADN-ului a fost incubat al 65 ºC timp de 60 min, inversînd tuburile la fiecare 15 min. Deproteinizarea și purificarea ADN-ului de pigmenți și polizaharide a fost realizată prin adăugarea soluției de cloroform:izoamilic (24:1). Sedimentarea ADN-ului izolat s-a realizat cu izopropanol. Purificarea ADN-ului a fost efectuată în prezența alcoolului etilic de 76%. Probele uscate s-au dizolvat în 50 μl H2O sterilă.

Analiza calitativă și cantitativă a ADN-ului

Vizualizarea probelor de ADN extrase, precum și a produselor de amplificare RAPD și a ampliconilor produși în reacțiile PCR s-a realizat prin electroforeza în gel de agaroză de 0,8 – 1, 5%, în prezența bromurii de ethidiu în camera electroforetică (Biocom, Rusia), care conține tampon TAE 1x. Pentru colorarea probelor s-a folosit soluție de bromfenol. Separarea fragmentelor s-a realizat în cîmp electric prin migrarea de la – la +. Intensitatea curentului depinde de lungimea gelului și s-a calculat conform regulii 10 V/cm. Vizualizarea și documentarea rezultatelor a fost efectuată la transiluminator (Consort) în spectrul UV.

Ampliconii s-au analizat în prezența unor probe-martor avînd mase moleculare de: 100 – 5000 pb GeneRuler ExpressDNA Ladder (ThermoScientific).

Estimarea cantitativă a acizilor nucleici s-a efectuat prin analiza spectrofotometrică în cuve cu 68 μl de apă autoclavată și 2 μl de probă. Măsurările s-au efectuat 260, 280 și 230 nm. Raportul A260/A280 calculat indică puritatea probelor. Concentrația acizilor nucleici se calculează conform formulelor:

A260 x factor de diluție x 40 = μg ARN/ml;

A260 x factor de diluție x 50 = μg ADN/ml.

Analiza RAPD

Amplificarea RAPD – PCR a fost realizată într-un mediu de 15 µl, cu următoarea compoziție: 50 ng ADN, 200µlM dNTP (ThermoScientific) de fiecare tip, 0,4 – 0,6 µlM primer, 1 unități/pe reacție Dream Taq DNA Polymerase (ThermoScientific), în soluție tampon corespunzătoare și 2,5 mM MgCl2 (Fermentas) [Martea, 2013].

Analiza s-a efectuat cu 20 primeri RAPD (OPA2, OPA9, 28, OPG06, OPG05, OPB03, OPJ01, OPU11, OPE17, OPG6, UBC250, UBC251, Oligo9_A1, Oligo10_A2, Oligo11_A3, OPK17, OPB10, OPB01, PG10, OPH15) (Tabelul. 2.2.).

Tabelul 2.2.

Primerii utilizați în amplificarea ADN

Pentru amplificare a fost utilizat amplificatorul GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) cu următorul program: 3 minute la 950 C – predenaturare, urmată de 35 de cicluri cu următorul profil de de temperatură:

45 secunde la 950 C – denaturare

1 minut la 34 – 36 0C – fixarea primerilor

1 minut la 720 C – extensie

și extensia finală 5 minute la 720 C.

Calcularea similarității genetice

Clusterizarea genotipurilor de salvie în baza produselor de amplificare RAPD a fost realizată în baza matricelor de similaritate genetică, care au stat la baza elaborării dendrogramelor de repartiție. Instrumentul utilizat a fost UPGMA – Unweighted Pairwise Group Method with Arithmetic mean – (http://genomes.urv.cat/ UPGMA/index.php) [Farkas, 2008]. Pentru stabilirea similarității, a fost utilizat coeficientul Jaccard (Tanimoto), precum și datele privind prezența/absența fragmentelor de amplificare pentru genotipurile a 10 hibrizi în baza a 20 de primeri.

CAPITOLUL 3. VARIABILITATEA MOLECULARĂ ÎN CADRUL GENOTIPURILOR DE SALVIA SCLAREA L.

În scopul valorificării rezultatelor obținute în programele de ameliorare, actualmente se aplică metodele moleculare [Arif et al. 2010], inclusiv PCR-RAPD, care a fost foarte puțin explorată în cadrul PMA și respectiv a speciei S. sclarea L.

Analiza genetică a materialului ameliorativ a permis constatarea variabilității intraspecifice în cadrul genotipurilor de Salvia sclarea L., fiind demonstrat un nivel înalt de polimorfism în funcție de numărul și dimensiunea produselor identificate. Studiul diversității genetice a formelor parentale evidențiază diferențe majore și aprofundează cunoștințele privind selecția asistată de markeri moleculari în cadrul programele de ameliorare a speiei.

Polimorfismul genetic evaluat în baza primerilor RAPD

Fragmentele identificate la S. sclarea L. au evidențiat prezența unei heterogenități înalte a materialului ameliorativ după numărul de locus-uri, dimensiune și conținut. În acest context, benzile polimorfe depistate, pot fi utilizate în scopul elaborării unor markeri moleculari pentru identificarea acestor genotipuri [Duca, 2006].

Produsele de amplificare obținute în baza a 20 primeri RAPD au prezentat dimensiunea diferită ce a variat în intervalul 150 – 3100 perechi de baze (pb), fiind demonstrat un nivel diferit de polimorfism în funcție de numărul și dimensiunea produselor identificate.

Spectrele electroforetice obținute au fost evaluate privind prezența/absența fragmentelor de amplificare, astfel în urma cercetărilor au fost relevate un număr total de 2143 produse de amplificare. Pentru genotipurile de Salvia sclarea L. cel mai informativ primer s-a dovedit a fi OPG10 (189 benzi), urmat de UBC250 (169 benzi) și respectiv OPA2 (165 benzi) (Figura 3.1.).

Fig. 3.1. Numărul total de amplificări pentru fiecare primer

În cadrul studiului, se atestă că cel mai înalt randament de amplificare a fost înregistrat în cazul hibridului [S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 – 163 fragmente de amplificare, fiind urmat de [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 (136 benzi), dintre formele parentale s-au remarcat [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 și M-69 655 S9 care au prezentat un număr total de 146 și respectiv 135 de ampliconi (Figura 3.2.).

Fig. 3.2. Numărul total al fragmentelor de amplificare pentru fiecare genotip

Avaluarea numărului total de fragmente evidențiate pentru fiecare primer evidențiază valori ce se încadrează în intervalul 12 – 30 fragmente. Se relevă că cel mai mare numărul de benzi a fost obținut în cazul decamerului UBC 250 – 30 benzi, care este, urmat de OPK17 cu 27 benzi, ceilalți primeri investigați au format între 12 și 23 fragmente (Figura 3.3.).

Fig. 3.3. Numărul total debenzi evidențiate pentru fiecare primer în general

În același timp, pentru fiecare primer a fost evaluat numărul de benzi specifice și polimorfice (Tabelul 3.1.).

Tabelul 3.1. Numărulul total de fragmente obținute pentru fiecare primer

Generalizând rezultatele obținute, pentru materialul ameliorativ de salvie cercetat a fost se atestă un total de 381 fragmente, dintre care 15% sunt sunt specifice și 85% polimorfice. Fragmentele specifice și cele polimorfice au fost analizate prin compararea ponderii lor față de numărul total de fragmente pentru fiecare dintre primeri (Tabel 3.1.).

Se constată că în cazul benzilor specifice ponderea cea mai mare a fost relevă la primerul OPG06, urmat de A1 (Figura 3.4.), totodată cele mai multe fragmente polimorfice au fost identificate în cazul UBC250 (Figura 3.5.), care a arătat cele mai multe fragmente de amplificare dintre toți primerii testați – 30 benzi.

Fig. 3.4. Benzi specifice, din numărul total de fragmente pentru fiecare primer (%)

Fig. 3.5. Benzi specifice, din numărul total de fragmente pentru fiecare primer (%)

Diversitatea genetică a hibrizilor de salvie

Evaluarea polimorfismului genetic realizată în aspectul caracterizării germoplasmei și evaluării diversității intraspecifice, oferă o perspectivă deosebită în descrierea relațiilor intraspecifice, fiind un indice important în selectarea formelor parentale pentru obținerea hibrizilor performanți și caracterizarea germoplasmei.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPA2

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPA2 (TGCCGAGCTG) a pus în evidență un număr de 18 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 200 – 1550 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentele de 500 și 750 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale, se constată la (K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4, (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15) și M-69 655 S9, iar cu cel mai mare număr de fragmente la formele hibride se remarcă la următoarele genotipuri: [S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1, [S. s.Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50) F1 x 0-48 )F6] F1, [S. s.Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7 și [ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1.

Șapte dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 3 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2

Analiza hibridului [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 15 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 200 – 1300 pb. Linia maternă și cea paternă relevă câte 9 benzi fiecare, iar la forma hibridă sunt evidențiați – 8 ampliconi.

Hibridul [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și formele sale parentale au relevat 15 ampliconi cu masa moleculară 200 – 1300 pb, la linia maternă 9 fragmente, 8 benzi în cazul formei paterne, și 9 fragment – forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 15 ampliconi cu masa moleculară 200 – 1300 pb, la linia maternă 10, 8 în cazul formei paterne, și la forma hibridă – 7 benzi.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPA9

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPA9 (TGTACCCGTC) a pus în evidență un număr de 20 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 260 – 2500 pb. Dintre datele obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 1000 pb. Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6, iar dintre hibrizi la următoarele genotipuri: [S. s.Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7 și [ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1.

Doisprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un rezultat. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 5 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1

[M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7] F1

[Cr. p. 11 S11 x (S. s. Turkmen/N S7] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

Hibridul [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și formele sale parentale prezintă un cadru general de 16 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 260 – 1950 pb. Linia maternă și cea paternă relevă câte 9 benzi fiecare, iar la forma hibridă se remarcă 8 ampliconi.

La nivelul hibridului [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 19 ampliconi cu masa moleculară 260 – 2500 pb, la formele parentale se evidențiază cîte 9 fragmente, iar la forma hibridă – 7.

Analiza hibridului [M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 10 ampliconi cu masa moleculară 260 – 2500 pb, la linia maternă 9 fragmente, 9 benzi în cazul formei paterne, și 2 – forma hibridă.

[Cr. p. 11 S11 x (S.s.Turkmen/N S7]F1 și formele sale parentale au evidențiat 14 ampliconi cu masa moleculară 300 – 1950 pb, la linia maternă 7 fragmente, 9 benzi în cazul formei paterne, și 8- forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 15 benzi cu masa moleculară 260 – 2500 pb, la linia maternă 9 fragmente, 5 benzi în cazul formei paterne și 8 ampliconi – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPB01

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPB01 (GTTTCGCTCC) a pus în evidență un număr de 19 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 400 – 2500 pb. Cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 400 pb. Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale, se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7, iar dintre hibrizi cu cel mai mare număr de fragmente se remarcă la [S. s. Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50) F1 x 0-48) F6] F1. Doisprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 4 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[Cr. p. 11 S11 x (S. s. Turkmen/N S7] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2

Analiza hibridului [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 10 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 400 – 2000 pb. Linia maternă și cea paternă relevă câte 4 și respectiv 5 benzi, iar la forma hibridă sunt evidențiați – 6 fragmente de amplificare.

La nivelul hibridului [Cr. p. 11 S11 x (S. s. Turkmen/N S7] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 6 ampliconi cu masa moleculară 400 – 1500 pb, la linia maternă 1 fragment, 4 benzi în cazul formei paterne, și 4 – forma hibridă.

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și formele sale parentale au relevat 11 ampliconi cu masa moleculară 400 – 2000 pb, la linia maternă 6 fragmente, o bandă în cazul formei paterne, și 8 – forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 5 ampliconi cu masa moleculară 400 – 1400 pb, la linia maternă 4 fragmente, o bandă în cazul formei paterne, și 2 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPB03

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPB03 (CATCCCCCTG) a pus în evidență un număr de 23 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 260 – 2400 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentele de 800 și 1000 pb. Pe parcursul analizei au fost determinate aparițiile unor benzi specifice: 260, 300, 850 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7, iar dintre hibrizi la [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1.

Nouă dintre genotipuri nu au prezentat nici un rezultat

Analiza hibridului [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 18 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 300 – 1900 pb, la linia maternă 14 fragmente, 3 benzi în cazul formei paterne, și 8 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPB10

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPB10 (CTGCTGGGAC) a pus în evidență un număr de 17 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 290 – 2100 pb. Dintre fragmente obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 750 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale, se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6 și (K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 , iar dintre hibrizi la [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x (S1122 528S3 x S. s. Tian-Shan/sud) F5 x S. s. Tian-Shan/sud)B5 ]F1. Unsprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 3 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[Cr. p. 11 S11 x (S. s. Turkmen/N S7] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

Analiza hibridului [S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 8 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 290 – 1900 pb. Linia maternă și cea paternă relevă cîte 3 benzi și respectiv 2 benzi, iar pentru forma hibridă sunt evidențiați – 7.

În cazul [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 se relevă un total de 5 ampliconi (450 – 1500 pb), dintre care forma hibridă descrie 3 benzi, forma maternă – 2 și forma paternă 3 fragmente.

[Cr. p. 11 S11 x (S. s. Turkmen/N S7] F1 formele sale parentale descriu 4 ampliconi cu masa moleculară 500 – 1200 pb, la linia maternă 2 fragmente, 3 benzi în cazul formei paterne, și 1 amplicon – forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 6 ampliconi cu masa moleculară 290 – 1500 pb, la linia maternă 2 fragmente, o bandă în cazul formei paterne, și 6 ampliconi – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPE17

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, în cazul primerului OPE17 (CTACTGCCGT) a pus în evidență un număr de 13 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 500 – 5000 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 1400 pb. Pe parcursul analizei a fost determinată apariții unei benzi specifice, cum este banda de 2100 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 și M-69 655 S9, iar dintre hibrizi [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1.

Unsprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPG05

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPG05 (CTGAGACGGA) a pus în evidență un număr de 17 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 350 – 1700 pb. Cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 450 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S63, iar dintre hibrizi [S. s.Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7. Nouă dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 4 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2

Analiza hibridului [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 8 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 450 – 1600 pb. Cele trei genotipuri evidențiază câte 6 benzi fiecare.

Hibridul [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și formele sale parentale au prezentat 12 ampliconi cu masa moleculară 400 – 1600 pb, la formele parentale se constată câte 6 benzi, 8 la forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 11 ampliconi cu masa moleculară 400 – 1600 pb, la linia maternă 6 fragmente, o bandă în cazul formei paterne, și 8 – forma hibridă.

În cazul [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2 și a formelor sale parentale se relevă 6 ampliconi cu masa moleculară 400 – 1500 pb, la linia maternă 5 fragmente, o bandă în cazul formei paterne, și 3 benzi – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPG06

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPG06 (GGTCCCTGAC) a pus în evidență un număr de 20 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 200 – 3000 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 550 pb. Pe parcursul analizei au fost determinate apariții ale unor benzilor specifice de 300, 500, 950, 1000, 1700, 1800 și 2800 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la S. s. Turkmen/N S7 și (0-57 S5 x 0-21S4)F8, iar dintre hibrizi în cazul [S. s. Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50) F1 x 0-48 )F6] F1.

Șaisprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPG10

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPG10 (AGGGCCGTCT) a pus în evidență un număr de 17 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 400 – 2000 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentele de 450, 600 și 750 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la M-69 655 S9, iar dintre hibrizi la [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1. Opt dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 4 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x (Rubin x S1122 9S3)F1 x (0-56 x V-24)F1)F7 ] F1

[ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1

[M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

Analiza hibridului [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x (Rubin x S1122 9S3)F1 x (0-56 x V-24)F1)F7 ] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 13 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 400 – 1800 pb. Linia maternă și cea paternă relevă cîte 11 benzi și respectiv 6 benzi fiecare, iar la forma hibridă sunt evidențiați – 6 fragmente.

La nivelul hibridului [ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 13 ampliconi cu masa moleculară 400 – 1800 pb, la linia maternă 11 fragmente, 5 benzi în cazul formei paterne, și 8 – forma hibridă.

La nivelul hibridului [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 15 ampliconi cu masa moleculară 400 – 2000 pb, la linia maternă 8 fragmente, 5 benzi în cazul formei paterne, și 10 – forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 14 ampliconi cu masa moleculară 400 – 2000 pb, la linia maternă 8 fragmente, 4 benzi în cazul formei paterne și 12 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPG6

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPG6 (GGTCCCTGAC) a pus în evidență un număr de 13 fragmente. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 300 – 1600 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 400 pb. Pe parcursul analizei a fost determinată apariția benzii de 600 pb, care este o bandă specifică. Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (0-57 S5 x 0-21S4)F8 și (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7, iar dintre hibrizi la [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1.

Unsprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 3 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7] F1

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2

Analiza hibridului [S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 10 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 400 – 1600 pb. Liniile maternă și cea paternă relevă câte 4 benzi și respectiv 2 benzi fiecare, iar la forma hibridă sunt evidențiați – 9 ampliconi.

În cazul hibridului [M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 10 ampliconi cu masa moleculară 300 – 1600 pb, la linia maternă 8 fragmente, 9 benzi în cazul formei paterne, și 7 ampliconi – forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 10 ampliconi cu masa moleculară 300 – 1600 pb, la linia maternă 2 fragmente, 9 benzi în cazul formei paterne și 2 ampliconi – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPH15

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPH15 (AATGGCGCAG) a pus în evidență un număr de 18 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 200 – 2050 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 600 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6 și S1122 528S3 x S. s. Tian-Shan/sud) F5 x S. s. Tian-Shan/sud)B5, iar dintre hibrizi în cazul [S. s. Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50) F1 x 0-48 )F6] F1 și [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2.

Unsprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 2 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1

Analiza hibridului [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 9 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 200 – 1250 pb. Linia maternă și cea paternă relevă 4 și respectiv 9 benzi, iar la forma hibridă sînt evidențiați – 7 ampliconi.

La nivelul hibridului al doilea [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 12 ampliconi cu masa moleculară 200 – 1300 pb, la linia maternă 9 fragmente, 7 benzi în cazul formei paterne, și 6 ampliconi – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD-OPJ01

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPJ01(CCCGGCATAA) a pus în evidență un număr de 12 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 400 – 1500 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 650 pb. Pe parcursul analizei nu au fost determinate apariții ale unor benzi specifice. Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6, iar dintre hibrizi la [S. s.Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7.

Doisprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 2 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1

[M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1

Analiza hibridului [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 11 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 400 – 1500 pb. Linia maternă și cea paternă relevă cîte 8 și respectiv 2 benzi fiecare, iar la forma hibridă sînt evidențiați – 8 ampliconi.

La nivelul hibridului [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 9 ampliconi cu masa moleculară 400 – 1250 pb, la linia maternă 7 fragmente, 2 benzi în cazul formei paterne, și 7 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPK17

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPK17 (CTACTGCCGT) a pus în evidență un număr de 27 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 150 – 1800 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 500 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S63 și M-69 655 S9 iar dintre hibrizi la genotipurile [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 și [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2.

Doisprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 5 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1

[Cr. p. 11 S11 x (S. s. Turkmen/N S7] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2

Analiza hibridului [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 18 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între150 – 1250 pb. Linia maternă și cea paternă relevă cîte 5 benzi fiecare, iar la forma hibridă sînt evidențiați – 10 ampliconi.

La nivelul hibridului [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 19 ampliconi cu masa moleculară 150 – 1800 pb, la linia maternă 5 fragmente, 11 benzi în cazul formei paterne, și 8 ampliconi – forma hibridă.

Hibridul [Cr. p. 11 S11 x (S.s.Turkmen/N S7] F1 și formele sale parentale a relevat 10 ampliconi cu masa moleculară 150 – 950 pb, dintre aceștia se remarcă la linia maternă 1 fragmente, 5 benzi în cazul formei paterne și 7 – forma hibridă.

În cazul [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 17 ampliconi cu masa moleculară 150 – 1800 pb, la linia maternă 5 fragmente, 3 benzi în cazul formei paterne, și 11 – forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 10 ampliconi cu masa moleculară150 – 1800 pb, la linia maternă 7 fragmente, 4 benzi în cazul formei paterne, și 3 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – OPU11

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul OPU11 (CAATCGCCGT) a pus în evidență un număr de 23 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 300 – 4500 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 600 pb.

Numărul cel mai mare de benzi, în cadrul liniilor parentale se constată la (K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4, iar dintre hibrizi la [Cr. p. 11 S11 x (S.s.Turkmen/N S7] F1.

Zece dintre genotipuri, nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 3 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1

[M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2

Analiza hibridului [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 13 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 300 – 2500 pb. Linia maternă și cea paternă relevă câte 10 benzi și respectiv 3 benzi fiecare, iar la forma hibridă sînt evidențiați – 2 ampliconi.

La nivelul hibridului [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 16 ampliconi cu masa moleculară 300 – 2700 pb, la linia maternă 9 fragmente, 3 benzi în cazul formei paterne, și 13 – forma hibridă.

La nivelul hibridului [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 19 ampliconi cu masa moleculară 300 – 4500 pb, la linia maternă 11 fragmente, 9 benzi în cazul formei paterne, și 9 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – UBC215

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul UBC215 (TCTCCGCCTT) a pus în evidență un număr de 18 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 300 – 2500 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 750 pb. Pe parcursul analizei au fost determinate apariții ale unor benzi specifice, cum sunt benzile de 400, 850, 950, 2000 și 2100 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (M-55+130 S4 x (K-44 x L-15)F2 x 0-47)F6 , iar dintre hibrizi la [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 și [M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7] F1.

Unsprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 3 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1

Analiza hibridului [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 9 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 300 – 1100 pb. Linia maternă și cea paternă relevă câte 5 benzi fiecare, iar la forma hibridă sînt evidențiați – 4 ampliconi.

La nivelul hibridului [ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 13 ampliconi cu masa moleculară 300 – 2500 pb, la linia maternă 8 fragmente, 6 benzi în cazul formei paterne, și 6 – forma hibridă.

În cazul hibridului [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 12 ampliconi cu masa moleculară 300 – 1650 pb, la linia maternă 8 fragmente, 5 benzi în cazul formei paterne, și 4 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – UBC250

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul UBC250 (CGACAGTCCC) a pus în evidență un număr de 30 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 280 – 2800 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 500 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6, (M-55+130 S4 x (K-44 x L-15)F2 x 0-47)F6 și M-69 655 S9, iar dintre hibriziîn cazul genotipului [S. s. Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7. Opt dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 3 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1

[(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2

Analiza primului hibrid [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 18 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 350 – 2000 pb. Linia maternă și cea paternă relevă cîte 6 și respectiv 13 benzi fiecare, iar la forma hibridă sunt evidențiați – 9 fragmente.

La nivelul hibridului [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 14 ampliconi cu masa moleculară 300 – 1900 pb, la linia maternă 6 fragmente, o bandă în cazul formei paterne, și 11 ampliconi – forma hibridă.

Hibridul [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2 și formele sale parentale au prezentat 14 ampliconi cu masa moleculară 350 – 1250 pb, la linia maternă 9 fragmente, o bandă în cazul formei paterne, și 8 ampliconi – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD 28

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul 28 (AGGTCACTGA) a pus în evidență un număr de 16 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 280 – 1600 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentele de 450 și 500 pb. O particularitate deosebită pe parcursul analizei a fost determinată de apariția a 5 benzi specifice: 280, 350, 650, 700 și 1600 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la M-69 655 S9, iar dintre hibrizi la [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2.

Doisprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon. Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru 3 dintre hibrizi și formele lor parentale:

[S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1

[M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1

[Cr. p. 11 S11 x (S. s. Turkmen/N S7] F1

Analiza hibridului [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a formelor parentale ale acestuia prezintă un cadru general de 4 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 350 – 750 pb. Liniile parentale relevă cîte 2 benzi, și 3 – F1.

La nivelul hibridului [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 11 ampliconi cu masa moleculară 280 – 1250 pb, la linia maternă 2 fragmente, 7 benzi în cazul formei paterne, 5 ampliconi – forma hibridă.

Hibridului [Cr. p. 11 S11 x (S.s.Turkmen/N S7] F1 și formele sale parentale au evidențiat 8 ampliconi cu masa moleculară 350 – 1200 pb, la linia maternă 3 fragmente, 2 benzi în cazul formei paterne, 4 ampliconi – forma hibrid.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – A1

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul A1 (GGTGCGGGAA) a pus în evidență un număr de 21 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 300 – 2500 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentul de 350 pb. Pe parcursul analizei au fost determinate apariții ale unor benzi specifice, cum sunt benzile de 500, 650, 1000, 1300, 1550, 1650 și 2500 pb.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale se constată la M-69 655 S9, iar dintre hibrizi cu cel mai mare număr de fragmente se remarcă: [Cr. p. 11 S11 x (S.s.Turkmen/N S7] F1.

Unsprezece dintre genotipuri nu au prezentat nici un amplicon.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – A2

Studiul produselor de amplificare a ADN la salvie, cu primerul A2 (AAGAGCCCGT) a pus în evidență un număr de 17 fragmente de amplificare. Benzile analizate au masa moleculară cuprinsă între de 260 – 3100 pb. Dintre ampliconii obținuți, cea mai mare frecvență o prezintă fragmentele de 1200, 750, 1450 și 600 pb. O particularitate deosebită pe parcursul analizei a fost determinată de apariția unei benzi specifice (500 pb), în cazul formei hibride [M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7]F1.

Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale, se constată la Cr.p. 160 S11, (K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5, (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7 și (K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4, iar dintre hibrizi la [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1. Un număr considerabil scăzut de ampliconi este atestat la genotipurile (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 , [S. s. Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50)F1 x 0-48 )F6]F1 și în cazul hibridului [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 aceste rezultate ar putea fi explicate prin faptul că, majoritatea regiunilor amplificate de primerul A3 prezintă un caracter de tip codominant.

Dintre cele 13 grupuri de salvie investigate, prezentăm rezultatele pentru două dintre hibrizi și formele parentale:

[M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1

[M-69 655 S9 x (K-36 x 0-41)F20-19)F1 xL-15)B5]F1

[M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7]F1

În baza analizei RAPD toate formele parentale [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57S5x0-21S4)F8]F2, [(M-55+130S4 x (K-44xL-15)F2 x 0-47)F6 x (M-44S4x L-15)F1 x L-15)B6]F2 și (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 au evidențiat printr-un nivel înalt al diversității genetice – criteriu important în formarea combinațiilor hibride de perspectivă.

Hibridul [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 prezintă un cadru general de 8 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 400 – 1450 pb. Linia maternă relevă 3 benzi, forma paternă – 6 benzi și un ampliconi la genotipul hibrid.

Analiza hibridului [M-69 655 S9 x (K-36 x 0-41)F20-19)F1 xL-15)B5]F1 și a formelor parentale prezintă un cadru general de 12 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 290 – 1600 pb. Linia maternă relevă 3 benzi, forma paternă – 11 benzi și 7 – F1.

La nivelul hibridului [M-69 655 S9 x (M-69 429-82 S3 x 0-40 S5)F7]F1 și a formelor sale parentale au fost evidențiați 12 ampliconi cu amsa moleculară 290 – 1450 pb, la linia maternă 3 fragmente, 10 benzi în cazul formei paterne, 6 – forma hibridă.

Diversitatea genetică evaluată în baza primerilor RAPD – A3

Materialul analizat a cuprins 13 hibrizi și zece forme parentale, analiza produselor RAPD obținute cu primerul A3 (CCCGTCAGCA) a pus în evidență o serie de profiluri electroforetice . Numărul cel mai mare de ampliconi, în cadrul liniilor parentale, s-a constatat la (K-50)F5 x S 1122 (102+113)F2 x K-43)F4 , iar în cazul hibrizilor la genotipul [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8]F1. Cea mai mare frecvență este relevată în cazul ampliconilor A3550, A3700, A3750, A3950 și A31050.

O particularitate deosebită, a fost determinată prin apariția a două benzi specifice (800 pb), prima în cazul hibridului [S. s. Turkmen/N S7 x (K-36 x0-41)F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și a doua bandă specifică (400 pb) prezentă la forma parentală (K-36 x0-41)F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15) F8, care ulterior pot fi utilizați în elaborarea markerilor moleculari.

Rezultate complexe integrale, au fost relevate pentru 3 grupuri genetice, care includ hibrizii:

[(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11]F1,

[M-69 655 S9 x (K-36 x0-41)F20-19)F1 xL-15)B5]F1,

[(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57S5x0-21S4)F8]F2

Profilul hibrizilor de salvie și a formelor parentale ale acestora, obținut cu primerul A3 a prezentat 18 ampliconi, care au fost puși în evidență de spectre electroforetice heterogene atît după dimensiune, care se includ în limita de valori ale greutății moleculare 350 – 2100 pb, cât și după intensitatea fluorescenței, aceasta sugerând cantități diferite ale produsului de amplificare. În baza analizei spectrelor electroforetice se constată că un nivel înalt al diversității genetice este atestat în cazul genotipului matern (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7, M-69 655 S9 și patern (Cr.p. 160 S11, (K-36 x0-41)F20-19)F1 x L-15)B5, (0-57S5x0 – 21S4)F8) – criteriu important în formarea combinațiilor hibride de perspectivă.

Rezultatele pentru hibridul [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr.p. 160 S11] F1 și a formelor parentale prezintă 13 ampliconi cu masa moleculară de 350 – 2100 pb – linia maternă relevă 11 benzi, forma paternă – șase benzi și F1 – doi ampliconi. A fost obținut un fragment specific de 1750 pb.

Analiza RAPD a hibridului [M-69 655 S9 x(K-36 x0-41)F20-19)F1 xL-15)B5] F1 și a formelor parentale a determinat prezența a 11 ampliconi cu masa moleculară cuprinsă între 450 – 2100 pb. Linia maternă prezintă 7 fragmente, un total de trei benzi sunt în cazul formei paterne, hibridul – 5 ampliconi. La linia paternă lipsesc fragmentele de 160, 650, 500 și 450 pb, prezente la genotipul matern, iar la forma F1 lipsesc componenții electroforetici de 1050 și 700 pb, prezenți la părinți.

Hibridul [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57S5x0 – 21S4)F8] F2 și formele sale parentale se caracterizează prin 14 componenți polinucleotidici cu dimensiuni de la 350 la 2000 pb, linia maternă relevă 12 benzi, forma paternă – șase benzi și doi ampliconi – hibridul analizat. La linia paternă au lipsit ampliconii de 2000, 1500, 1450, 650, 500, 450, 400 și 350 pb, prezenți la genotipul matern, iar la forma hibridă au lipsit fragmentele de 1050, 950, 850 și 700 pb prezente la părinți. S-au evidențiat patru ampliconi specifici A3400, A3450, A3650 și A31450.

Distanța genetică în cadrul genotipurilor studiate

Analiza similarității genetice a genotipurilor în cadrul formelor de salvie, a fost realizată prin calcularea matricelor de similaritate genetică, în baza produselor de amplificare RAPD. Matricele au stat la baza elaborării dendrogramelor de repartiție a genotipurilor, relevînd gradului de înrudire a acestora.

Pentru analiză au fost utilizate datele privind prezența/absența fragmentelor de amplificare pentru genotipurile a 10 hibrizi în baza a 20 de primeri.

Studiul relațiilor intraspecifice în baza ampliconilor evidențiați prin RAPD-PCR la hibrizii de salvie a relevat prezența a trei clustere de bază: A, B și C, care la rîndul lor sunt constituite din clustere minore (Figura 3.5.), coeficientul de similaritate fiind cuprins între 1.35 – 5,45.

Fig. 3.5. Dendograma de repartiție a formelor hibride de salvie

Clusterul A cuprinde 3 hibrizi și este caracterizat prin prezența unui grup minor – A1 și a formei hibride [S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1. În cadrul clusterului minor A1 se includ hibrizii:

[S. s.Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50) F1 x 0-48 )F6] F1

[S. s.Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7 .

Se atestă că acești hibrizi arată cel mai înalt grad de similaritate genetică cu un coeficient de 5,45. Aceast indice mare de înrudire se datorează faptului că genotipurile grupate în clusterul A dețin aceeași linie maternă -1.

Cei 4 hibrizi grupați în clusterul B s-au repartizat în două subclustere minore – B1 și B2. Genotipurile [(V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x (S1122 528S3 x S. s.Tian-Shan/sud) F5 x S. s.Tian-Shan/sud)B5 ]F1 și [ (V-24-86 809 S3 x 0-33 S6)F7 x Cr. p. 160 S11] F1 formează grupul B1 și relevă un coeficient de similaritate de 4.83. În culsterul B2 – [M-69 655 S9 x(K-36 x 0-41)F20-19)F1 x L-15)B5] F1 și [Cr. p. 11 S11 x (S.s.Turkmen/N S7] F1 au fost grupate împreună. Aceștia sunt apropiați din punct de vedere genetic în măsură de 50 la sută ( coeficientul 0.5). Similaritatea genetică dintre formele hibride din grupul B1, ca și în cazul clusterului A1, este determinată de prezența comună a liniei materne – 3. Hibrizii din clusterul B2, care nu au forme paterne comune, evidențiază un coeficient de similaritate mai mare ca cel din cazul grupului B1.

În cadrul clusterului C se includ hibrizii [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 care prezintă un nivel mediu de similaritate genetică, înregistrând un coeficient de 4.71.

În același timp se constată că unul din hibrizi – [(K-50)F5 x S 1122(102+113)F2 x K-43)F4 x (0-57 S5 x 0-21S4)F8] F2, este evdențiat în afara grupurilor obținute. Astfel el a înscris cele mai mari valori ale distanței genetice în raport cu celelalte genotipuri – 0.43 – 0.83.

În concluzie, calcularea distanței genetice a relevat că cei mai apropiați hibrizi sunt [S. s.Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50) F1 x 0-48 )F6] F1 și [S. s.Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7 grupate în același cluster, iar distanță genetică maximă a fost evidențiată în cazul hibridului [S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și hibrizii [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 din clusterul C.

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

Analiza genetică a materialului ameliorativ a permis constatarea unei variabilității intraspecifice în cadrul genotipurilor de Salvia sclarea L., fiind demonstrat un nivel înalt de polimorfism în funcție de numărul și dimensiunea produselor identificate.

Studiul diversității genetice a formelor hibride de S. sclarea evidențiază diferențe majore și aprofundează cunoștințele privind selecția asistată de markeri moleculari în cadrul programele de ameliorare a speciei.

20 primerii RAPD testați în cadrul cercetărilor pot fi utilizați în scopul: amprentării sau evidențierii autenticității genotipurilor, precum și determinarea polimorfismului genetic intraspecific în cadrul speciei S. sclarea L.

A fost stabilit că pentru S. sclarea L. cel mai informativ dintre primerii RAPD testați este OPG10, iar în cadrul grupelor genetice cercetate se evidențiază primerii OPA9 și OPK17.

Calcularea distanței genetice a relevat că cei mai apropiați hibrizi sunt [S. s.Turkmen/N S7 x (S-1122 528 S3 x K-50) F1 x 0-48 )F6] F1 și [S. s.Turkmen/N S7 x (Rubin x S1122 9 S3)F1 x (0-56 x V-24) F1)] F7 grupate în același cluster, iar distanță genetică maximă a fost evidențiată în cazul hibridului [S. s.Turkmen/N S7 x (K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)F8] F1 și hibrizii [M-69 655 S9 x (S-1122 528 S3 x (Rubin x S-786)F1 x (0-33 S3 x L-15) F7) F7] F1 și [(K-36 x 0-41) F2 x 0-19)F1 x 0-22) B4 x L-15)] F7 x (M-44 S4 x L-15) F1 x L-15)] B6] F2 din clusterul C.

BIBLIOGRAFIE

Alberto F., Bouffier L., Louvet J-M., Lamy J-B., Delzon S., & Kremer A. Adaptive responses for seed and leaf phenology in natural populations of sessile oak along an altitudinal gradient. Journal of evolutionary biology,2011, nr. 24, p. 1442–1454. doi: 10.1111/j.1420-9101.2011.02277.x

Ali Md. S., Asim A.S., Bashamboo S., Malik P.K., et. al. Characterization of a species-specific repetitive DNA from a highly endangered wild animal, Rhinoceros unicornis, and assessment of genetic polymorphism by microsatellite associated sequence amplification (MASA). Gene, 1999, nr. 228, p. 33-42.

Arif I.A., Bakir M.A., Khan H.A., et. al. Application of RAPD for molecular characterization of plant species of medicinal value from an arid environment. Genet. Mol. Res., 2010, vol. 9, nr. 4, p. 2191-2198.

Asadi S., Ahmadiani A., Esmaeili M. A., Sonboli A., Ansari N., Khodagholi F. In vitro antioxidant activities and an investigation of neuroprotection by six Salvia species from Iran: a comparative study. Food Chem Toxicol, 2010, vol. 48, nr. 5, p. 1341-9. doi: 10.1016/j.fct.2010.02.035.

Atienzar F. A., Evenden A. J., Jha A. N., Depledge M. H. Use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for the detection of DNA damage and mutations: possible implications of confounding factors. Biomarkers, 2002, vol. 7, nr. 1, p. 94-101.

Bertrand C., Collard Y. and Mackill David J. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2008, vol. 363, nr. 1491, p. 557–572. doi: 10.1098/rstb.2007.2170.

Caniard A., Zerbe P., Legrand S., et al. Discovery and functional characterization of two diterpene synthases for sclareol biosynthesis in Salvia sclarea (L.) and their relevance for perfume manufacture. BMC Plant Biology, 2012, nr. 12:119.

Carsai T. C., Vlaic A., Coșier V., Balteanu V. A. Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecției asistate de markeri genetici la taurine. Editura Bioflux, Cluj-Napoca, 2009, Versiunea online. ISBN 978-606-92029-6-8.

Cheng K.T., Su C.H., Chang H.C et al. Differentiation of genuines and counterfeits of Cordyceps species using random amplified polymorphic DNA. Planta Medica, 1998, nr. 64, p. 451-3.

Claes Ramel.Biodiversity and intraspecific genetic variation. Pure & Appl. Chem., 1998, vol. 70, nr. 11, p. 2079-2084. Printed in Great Britain. IUPAC.

Clebsch B., Barner C. D. The New Book of Salvias. Timber Press, 2003, 261 p. ISBN 978-0-88192-560-9.

Coiciu E., Racz G. Plante medicinale și aromatice. București, 1962, p. 534-538.

Dimas K., Kokkinopoulos D., Demetzos C., et. al. The effect of sclareol on growth and cell cycle progression of human leukemic cell lines. Leukemia Research, 1999, nr. 23, p. 217–234.

Dimas K., Kokkinopoulos D., Demetzos C., et. al. The effect of sclareol on growth and cell cycle progression of human leukemic cell lines. Leukemia Research, 1999, nr. 23, p. 217–234.

Duca M., Căpățană A., Barbacar, N. Moștenirea ampliconilor ADN la diverse genotipuri de floarea-soarelui. Bul. Acad. de Științe a Moldovei. Științele vieții, 2006, nr. 2, p. 58-65.

Džamić A., Soković M., Ristić M., Grujić-Jovanović S., Vukojević J., & Marin P. D. Chemical composition and antifungal activity of Salvia sclarea (Lamiaceae) essential oil. Archives of Biological Sciences, 2008, vol. 60, nr. 2, p. 233–237. doi.org/10.2298/ABS0802233D.

Džamić A., Soković M., Ristić M., Grujić-Jovanović S., Vukojević J., & Marin P. D. Chemical composition and antifungal activity of Salvia sclarea (Lamiaceae) essential oil. Archives of Biological Sciences, 2008, vol. 60, nr. 2, p. 233–237. doi.org/10.2298/ABS0802233D.

Enescu V., Cherecheș D., Bândiu C. Conservarea biodiversității și a resurselor genetice forestiere. S.C. Agris-Redacția Revistelor Agricole, București, 1997, 439 p

Farkas A., Papp N., Horvath G., Nemeth T. S., Szabo I., Nemeth T. Rapd based genetic diversity among Salvia officinalis populations. Farmacia, 2008, vol. LVI, nr. 3, p. 339-343.

Frankham R., Ballou J.D., Briscoe D.A. Introduction to conservation genetics. Cambridge University Press, ambridge, United Kingdom, 2002, 617 p.

Garcia A. F., Benchimol L. L., Barbosa A. M., Geraldi I. O., Souza C. L. Jr., and Souza A. P. Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines. Genetics and Molecular Biology, 2004, vol. 27, nr. 4, p. 579-588.

Günnewich N., Higashi Y., Feng X., Choi K. B., Schmidt J., Kutchan T. M. A diterpene synthase from the clary sage Salvia sclarea catalyzes the cyclization of geranylgeranyl diphosphate to (8R)-hydroxy-copalyl diphosphate. Phytochemistry, 2013, nr. 91, p. 93-9. doi:10.1016/j.phytochem.2012.07.019.

Hatziantoniou S., Dimas K., Georgopoulos A., Sotiriadou N., & Demetzos C. Cytotoxic and antitumor activity of liposome-incorporated sclareol against cancer cell lines and human colon cancer xenografts. Pharmacological Research : The Official Journal of the Italian Pharmacological Society, 2006, nr. 53, p. 80–87. doi.org/10.1016/j.phrs.2005.09.008.

Hatziantoniou S., Dimas K., Georgopoulos A., Sotiriadou N., & Demetzos C. Cytotoxic and antitumor activity of liposome-incorporated sclareol against cancer cell lines and human colon cancer xenografts. Pharmacological Research : The Official Journal of the Italian Pharmacological Society, 2006, nr. 53, p. 80–87. doi.org/10.1016/j.phrs.2005.09.008.

Joy P., Maridass M. Inter species relationship of cinnamomum species using RAPD marker analysis. Ethnobot Leaf, 2008, nr. 12, p. 476-480.

Koranyi P. Characterization and puritz cheking of sunflower (Helianthus annuus L.) lines and hzbrids of sunflower. Biochem. Identification of varieties: Mater.III Int.Symp. ISTA, L., USSR, 1987-1988, p. 231-236.

Laville R., Castel C., Filippi J. J., Delbecque C., Audran A., Garry P. P., Legendre L., Fernandez X. Amphilectane diterpenes from Salvia sclarea: biosynthetic considerations. J Nat Prod, 2012, vol. 75, nr. 2, p. 121-6. doi: 10.1021/np2004177.

Lawless Julia. Encyclopedia of Essential Oils: The Complete Guide to the Use of Aromatic Oils in Aromatherapy, Herbalism, Health and Well-Being, Ed. Harper Collins Publishers, London, 2002, 608 p.

Martea R., Port A., Gonceariuc M., Duca M. Estimarea diveristății genetice la Salvia sclarea L. Simpozionul Științific Biotehnologii avansate – Realizări și Perspective, Chișinău, 2013, Teze, p. 164.

Murray M.G.; Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res, 1980, vol. 8, nr. 19, p. 4321-4325.

Noha A. R., Hoda M., Nahed H. G., and Mahmoud M. R. Typing of Salmonella Typhi strains isolated from Egypt by RAPD PCR. 3 Biotech, 2012, vol. 2, nr. 1, p. 17–25.

Noori S., Hassan Z. M., Mohammadi M., Habibi Z., Sohrabi N., & Bayanolhagh S. Sclareol modulates the Treg intra-tumoral infiltrated cell and inhibits tumor growth in vivo. Cellular Immunology, 2010, vol. 263, nr.2, p. 148–153. doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.02.009.

Noori S., Hassan Z. M., Mohammadi M., Habibi Z., Sohrabi N., & Bayanolhagh S. Sclareol modulates the Treg intra-tumoral infiltrated cell and inhibits tumor growth in vivo. Cellular Immunology, 2010, vol. 263, nr.2, p. 148–153. doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.02.009.

Păun E., Mihalea A., Dumitrescu A., Verzea M., Coșocariu O. Tratat de plante medicinale și aromatice cultivate. București, 1988, vol.II, p. 231 – 243.

Pop R., Ardelean M., Pamfil D., Gaboreanu M. I. The efficiency of different DNA isolation and purification protocols in ten cultivars of Vitis Vinifera. Bul. USAMV, 2003, nr. 59, seria ZB, p. 259-261.

Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding, 1996, vol. 2, nr. 3, p. 225-238.

Ramanatha Rao V., Hodgkin T. Genetic diversity and conservation and utilization of plant genetic resources. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2002, nr. 68, p.1–19.

Saez R., Sanz Y., Toldra F. Instituto de Agroquímica y Tecnologia de Alimentos (C.S.I.C.), Apartado 73, 46100 Burjasot, Valencia, ESPAGNE, 2004, vol. 66, nr. 3, p. 659-665.

Sundell G., Milsom I., Andersch B. Factors influencing the prevalence and severity of dysmenorrhoea in young women. Br J Obstet Gynaecol,1990, vol. 97, nr. 7, p. 588-94.

Verma R.S., Chauhan A., Rahman L., Verma R. K. Aroma Profile of Clary Sage (Salvia sclarea L.): Influence of Harvesting Stage and Post Harvest Storage in Uttarakhand Hills. Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, 2011, nr. 5, p. 139-142.

Walencka E., Rozalska S., Wysokinska H., Rozalski M., Kuzma L., Rozalska B.Salvipisone and aethiopinone from Salvia sclarea hairy roots modulate staphylococcal antibiotic resistance and express anti-biofilm activity. Planta Med, 2007, vol. 73, nr. 6, p. 545-51.

Williams J.G.K., Kubelik A.R., LIVAK K.J. DNA Polymorphism Amplified by Arbitrary Primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res, 1990, nr. 18, p. 6231-6235.

Yalcin H., Ozturk I., Tulukcu E., Sagdic O. Effect of γ-irradiation on bioactivity, fatty acid compositions and volatile compounds of clary sage seed (Salvia sclarea L.). J Food Sci, 2011, vol. 76, nr. 7, p. 1056-61. doi: 10.1111/j.1750-3841.2011.02331.x.

Мустяцэ Г. И. Култиваря плантелор ароматиче. Картя Молдовеняскэ, Кишинэу, 1980.

Catalogul Soiurilor de Plante pentru anul 2013, Ministerul Agriculturii și Industriei Alimentare, Chișinău 2013, ÎS Editura didactică de stat ,,Lumina", 124 p.

European Pharmacopoeia 5th Ed. Main Volume 5.0, 2005 with Supplements 5.1 and 5.2 (European Pharmacopoeia), Council of Europe, 2004, 2727 p.

Clary, or More Properly Clear-Eye. http://www.bibliomania.com/2/1/66/113/frameset.html, (accesat 05.05.15).

Production of Medicinal and Aromatic Plants in Europe. http://www.europam.net/index.php-?option=com_content&view=article&id=6:inventory-production-of-apsq&catid=8:inventory-production-of-mapsq&Itemid=11, (accesat 19.04.15).

Single Nucleotid Polymorphism. http://www.nature.com/scitable/definition/single-nucleotide-polymorphism-snp-295, (accesat 17.12.14).

BIBLIOGRAFIE

Alberto F., Bouffier L., Louvet J-M., Lamy J-B., Delzon S., & Kremer A. Adaptive responses for seed and leaf phenology in natural populations of sessile oak along an altitudinal gradient. Journal of evolutionary biology,2011, nr. 24, p. 1442–1454. doi: 10.1111/j.1420-9101.2011.02277.x

Ali Md. S., Asim A.S., Bashamboo S., Malik P.K., et. al. Characterization of a species-specific repetitive DNA from a highly endangered wild animal, Rhinoceros unicornis, and assessment of genetic polymorphism by microsatellite associated sequence amplification (MASA). Gene, 1999, nr. 228, p. 33-42.

Arif I.A., Bakir M.A., Khan H.A., et. al. Application of RAPD for molecular characterization of plant species of medicinal value from an arid environment. Genet. Mol. Res., 2010, vol. 9, nr. 4, p. 2191-2198.

Asadi S., Ahmadiani A., Esmaeili M. A., Sonboli A., Ansari N., Khodagholi F. In vitro antioxidant activities and an investigation of neuroprotection by six Salvia species from Iran: a comparative study. Food Chem Toxicol, 2010, vol. 48, nr. 5, p. 1341-9. doi: 10.1016/j.fct.2010.02.035.

Atienzar F. A., Evenden A. J., Jha A. N., Depledge M. H. Use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for the detection of DNA damage and mutations: possible implications of confounding factors. Biomarkers, 2002, vol. 7, nr. 1, p. 94-101.

Bertrand C., Collard Y. and Mackill David J. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2008, vol. 363, nr. 1491, p. 557–572. doi: 10.1098/rstb.2007.2170.

Caniard A., Zerbe P., Legrand S., et al. Discovery and functional characterization of two diterpene synthases for sclareol biosynthesis in Salvia sclarea (L.) and their relevance for perfume manufacture. BMC Plant Biology, 2012, nr. 12:119.

Carsai T. C., Vlaic A., Coșier V., Balteanu V. A. Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecției asistate de markeri genetici la taurine. Editura Bioflux, Cluj-Napoca, 2009, Versiunea online. ISBN 978-606-92029-6-8.

Cheng K.T., Su C.H., Chang H.C et al. Differentiation of genuines and counterfeits of Cordyceps species using random amplified polymorphic DNA. Planta Medica, 1998, nr. 64, p. 451-3.

Claes Ramel.Biodiversity and intraspecific genetic variation. Pure & Appl. Chem., 1998, vol. 70, nr. 11, p. 2079-2084. Printed in Great Britain. IUPAC.

Clebsch B., Barner C. D. The New Book of Salvias. Timber Press, 2003, 261 p. ISBN 978-0-88192-560-9.

Coiciu E., Racz G. Plante medicinale și aromatice. București, 1962, p. 534-538.

Dimas K., Kokkinopoulos D., Demetzos C., et. al. The effect of sclareol on growth and cell cycle progression of human leukemic cell lines. Leukemia Research, 1999, nr. 23, p. 217–234.

Dimas K., Kokkinopoulos D., Demetzos C., et. al. The effect of sclareol on growth and cell cycle progression of human leukemic cell lines. Leukemia Research, 1999, nr. 23, p. 217–234.

Duca M., Căpățană A., Barbacar, N. Moștenirea ampliconilor ADN la diverse genotipuri de floarea-soarelui. Bul. Acad. de Științe a Moldovei. Științele vieții, 2006, nr. 2, p. 58-65.

Džamić A., Soković M., Ristić M., Grujić-Jovanović S., Vukojević J., & Marin P. D. Chemical composition and antifungal activity of Salvia sclarea (Lamiaceae) essential oil. Archives of Biological Sciences, 2008, vol. 60, nr. 2, p. 233–237. doi.org/10.2298/ABS0802233D.

Džamić A., Soković M., Ristić M., Grujić-Jovanović S., Vukojević J., & Marin P. D. Chemical composition and antifungal activity of Salvia sclarea (Lamiaceae) essential oil. Archives of Biological Sciences, 2008, vol. 60, nr. 2, p. 233–237. doi.org/10.2298/ABS0802233D.

Enescu V., Cherecheș D., Bândiu C. Conservarea biodiversității și a resurselor genetice forestiere. S.C. Agris-Redacția Revistelor Agricole, București, 1997, 439 p

Farkas A., Papp N., Horvath G., Nemeth T. S., Szabo I., Nemeth T. Rapd based genetic diversity among Salvia officinalis populations. Farmacia, 2008, vol. LVI, nr. 3, p. 339-343.

Frankham R., Ballou J.D., Briscoe D.A. Introduction to conservation genetics. Cambridge University Press, ambridge, United Kingdom, 2002, 617 p.

Garcia A. F., Benchimol L. L., Barbosa A. M., Geraldi I. O., Souza C. L. Jr., and Souza A. P. Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines. Genetics and Molecular Biology, 2004, vol. 27, nr. 4, p. 579-588.

Günnewich N., Higashi Y., Feng X., Choi K. B., Schmidt J., Kutchan T. M. A diterpene synthase from the clary sage Salvia sclarea catalyzes the cyclization of geranylgeranyl diphosphate to (8R)-hydroxy-copalyl diphosphate. Phytochemistry, 2013, nr. 91, p. 93-9. doi:10.1016/j.phytochem.2012.07.019.

Hatziantoniou S., Dimas K., Georgopoulos A., Sotiriadou N., & Demetzos C. Cytotoxic and antitumor activity of liposome-incorporated sclareol against cancer cell lines and human colon cancer xenografts. Pharmacological Research : The Official Journal of the Italian Pharmacological Society, 2006, nr. 53, p. 80–87. doi.org/10.1016/j.phrs.2005.09.008.

Hatziantoniou S., Dimas K., Georgopoulos A., Sotiriadou N., & Demetzos C. Cytotoxic and antitumor activity of liposome-incorporated sclareol against cancer cell lines and human colon cancer xenografts. Pharmacological Research : The Official Journal of the Italian Pharmacological Society, 2006, nr. 53, p. 80–87. doi.org/10.1016/j.phrs.2005.09.008.

Joy P., Maridass M. Inter species relationship of cinnamomum species using RAPD marker analysis. Ethnobot Leaf, 2008, nr. 12, p. 476-480.

Koranyi P. Characterization and puritz cheking of sunflower (Helianthus annuus L.) lines and hzbrids of sunflower. Biochem. Identification of varieties: Mater.III Int.Symp. ISTA, L., USSR, 1987-1988, p. 231-236.

Laville R., Castel C., Filippi J. J., Delbecque C., Audran A., Garry P. P., Legendre L., Fernandez X. Amphilectane diterpenes from Salvia sclarea: biosynthetic considerations. J Nat Prod, 2012, vol. 75, nr. 2, p. 121-6. doi: 10.1021/np2004177.

Lawless Julia. Encyclopedia of Essential Oils: The Complete Guide to the Use of Aromatic Oils in Aromatherapy, Herbalism, Health and Well-Being, Ed. Harper Collins Publishers, London, 2002, 608 p.

Martea R., Port A., Gonceariuc M., Duca M. Estimarea diveristății genetice la Salvia sclarea L. Simpozionul Științific Biotehnologii avansate – Realizări și Perspective, Chișinău, 2013, Teze, p. 164.

Murray M.G.; Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res, 1980, vol. 8, nr. 19, p. 4321-4325.

Noha A. R., Hoda M., Nahed H. G., and Mahmoud M. R. Typing of Salmonella Typhi strains isolated from Egypt by RAPD PCR. 3 Biotech, 2012, vol. 2, nr. 1, p. 17–25.

Noori S., Hassan Z. M., Mohammadi M., Habibi Z., Sohrabi N., & Bayanolhagh S. Sclareol modulates the Treg intra-tumoral infiltrated cell and inhibits tumor growth in vivo. Cellular Immunology, 2010, vol. 263, nr.2, p. 148–153. doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.02.009.

Noori S., Hassan Z. M., Mohammadi M., Habibi Z., Sohrabi N., & Bayanolhagh S. Sclareol modulates the Treg intra-tumoral infiltrated cell and inhibits tumor growth in vivo. Cellular Immunology, 2010, vol. 263, nr.2, p. 148–153. doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.02.009.

Păun E., Mihalea A., Dumitrescu A., Verzea M., Coșocariu O. Tratat de plante medicinale și aromatice cultivate. București, 1988, vol.II, p. 231 – 243.

Pop R., Ardelean M., Pamfil D., Gaboreanu M. I. The efficiency of different DNA isolation and purification protocols in ten cultivars of Vitis Vinifera. Bul. USAMV, 2003, nr. 59, seria ZB, p. 259-261.

Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding, 1996, vol. 2, nr. 3, p. 225-238.

Ramanatha Rao V., Hodgkin T. Genetic diversity and conservation and utilization of plant genetic resources. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2002, nr. 68, p.1–19.

Saez R., Sanz Y., Toldra F. Instituto de Agroquímica y Tecnologia de Alimentos (C.S.I.C.), Apartado 73, 46100 Burjasot, Valencia, ESPAGNE, 2004, vol. 66, nr. 3, p. 659-665.

Sundell G., Milsom I., Andersch B. Factors influencing the prevalence and severity of dysmenorrhoea in young women. Br J Obstet Gynaecol,1990, vol. 97, nr. 7, p. 588-94.

Verma R.S., Chauhan A., Rahman L., Verma R. K. Aroma Profile of Clary Sage (Salvia sclarea L.): Influence of Harvesting Stage and Post Harvest Storage in Uttarakhand Hills. Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, 2011, nr. 5, p. 139-142.

Walencka E., Rozalska S., Wysokinska H., Rozalski M., Kuzma L., Rozalska B.Salvipisone and aethiopinone from Salvia sclarea hairy roots modulate staphylococcal antibiotic resistance and express anti-biofilm activity. Planta Med, 2007, vol. 73, nr. 6, p. 545-51.

Williams J.G.K., Kubelik A.R., LIVAK K.J. DNA Polymorphism Amplified by Arbitrary Primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res, 1990, nr. 18, p. 6231-6235.

Yalcin H., Ozturk I., Tulukcu E., Sagdic O. Effect of γ-irradiation on bioactivity, fatty acid compositions and volatile compounds of clary sage seed (Salvia sclarea L.). J Food Sci, 2011, vol. 76, nr. 7, p. 1056-61. doi: 10.1111/j.1750-3841.2011.02331.x.

Мустяцэ Г. И. Култиваря плантелор ароматиче. Картя Молдовеняскэ, Кишинэу, 1980.

Catalogul Soiurilor de Plante pentru anul 2013, Ministerul Agriculturii și Industriei Alimentare, Chișinău 2013, ÎS Editura didactică de stat ,,Lumina", 124 p.

European Pharmacopoeia 5th Ed. Main Volume 5.0, 2005 with Supplements 5.1 and 5.2 (European Pharmacopoeia), Council of Europe, 2004, 2727 p.

Clary, or More Properly Clear-Eye. http://www.bibliomania.com/2/1/66/113/frameset.html, (accesat 05.05.15).

Production of Medicinal and Aromatic Plants in Europe. http://www.europam.net/index.php-?option=com_content&view=article&id=6:inventory-production-of-apsq&catid=8:inventory-production-of-mapsq&Itemid=11, (accesat 19.04.15).

Single Nucleotid Polymorphism. http://www.nature.com/scitable/definition/single-nucleotide-polymorphism-snp-295, (accesat 17.12.14).