Aspecte Teoretice Privind Managementul Resurselor Genetice Si Conservarea Biodiversitatii

INTRODUCERE

Evoluția rapidă a civilizației, în ultimele doua sute de ani, a dus la o pierdere a diversității genetice a animalelor domestice. Aceasta periclitează posibilitățile de ameliorare și dezvoltare viitoare a animalelor domestice, implicit poate afecta în viitor durabilitatea dezvoltării actualei civilizaâii. În consecință, în ultimele decenii, s-a ridicat problema conservarii biodiversitatii ca o componentă a conservării mediului. Conservarea variației genetice a aparut ca o preocupare în Romania dupa anul 1960, însa a fost nesistematică și nu a impiedicat pierderea a numeroase rase de animale. După 1980, problema a intrat în atenția unor organizații internaționale și a început să fie abordată sistematic și în țara noastră. În prezent, Romania este membră a organizațiilor științifice și tehnologice internaționale și regionale (FMZ, FEZ, ICAR, FAO, INTERBULL), a ONG implicate în conservarea resurselor genetice (SAVE, DAGENE) sau a unor proiecte de studii internationale. Aceste organizatii au stabilit strategia mondială a conservarii și ameliorarii și impun elaborarea unor programe de manangement a resurselor genetice la toate speciile. De asemenea s-au stabilit priorități în cercetarea științifică consacrată identificarii, ameliorării, conservării și utilizarii resurselor genetice animale (Popa, 2009).

În prezent, Romania este deficitară în problematica utilizarii durabile a resurselor genetice (Draganescu, 2003 – Managementul durabil al resurselor genetice la animalele domestice dîn Romania. Raport de tara FAO), în principal din cauza elaborării unor programe naționale cu un caracter general, fără a ține cont de statusul populatiilor, determinat matematic cu maximum de acuratețe și certificat prin tehnici de biologie moleculară. Țara noastră va trebui sa facă eforturi speciale, în conformitate cu cerințele organizațiilor internaționale de profil, pentru dezvoltarea unor programe sustenabile în managementul resurselor genetice (Popa, 2009).

Obiectivul principal al prezentei lucrări este evidențierea rolului analizelor genealogice și utilizării tehnicilor de biologie moleculară în stabilirea statusului de risc al populațiilor de interes economic. Această acțiune este o componentă importantă în managementul resurselor genetice animale, toate strategiile privind viitorul populațiilor fiind conturate pe baza informațiilor provenite din identificarea, cartarea și caracterizarea resurselor genetice.

În acest context, scopul lucrării este reprezentat de: (1) efectuarea analizei genealogice a unei populații de cabaline în scopul determinării valorii unor parametri importanți ce permit încadrarea acesteia într-una din clasele de risc, în acord cu cerințele FAO; (2) identificarea unor eventuale neajunsuri, limitări sau probleme rămase neelucidate ale analizelor genealogice; (3) realizarea unei cercetări bibliografice privind posibilitățile de utilizare a tehnicilor de biologie moleculară în managementul resurselor genetice animale; (4) completarea studiului de caz cu propuneri privind utilizarea tehnicilor moleculare în stabilirea statusului populației analizate.

Cunoscând și stăpânind perfect tehnicile de biologie moleculară ca elemente constitutive ale procesului de identificare și evaluare a populațiilor, se poate asigura încrederea deplină în rezultatele obținute și pe baza lor pot fi elaborate strategii coerente privind managementul resurselor genetice.

CAPITOLUL I

ASPECTE TEORETICE PRIVIND MANAGEMENTUL RESURSELOR GENETICE ȘI CONSERVAREA BIODIVERSITĂȚII

Noțiunea de management al resurselor genetice (MRG) este relativ proaspăt intrată în limbajul de specialitate (1992, Convenția de la Rio).

Managementul resurselor genetice reprezintă totalitatea procedeelor de organizare și conducere a activităților care vizează utilizarea resurselor genetice (existente) în vederea atingerii unor obiective ca (Popa, 2009):

asigurarea securității alimentare (prin elaborarea unor programe de ameliorare populațiilor de animale domestice cu status normal, în vederea obținerii unui potențial productiv ridicat)

conservarea populațiilor vulnerabile

prezervarea populațiilor în pericol

Managementul resurselor genetice include: inventarierea populațiilor, ameliorarea genetică, conservarea sau prezervarea acestora, precum și exploatarea resurselor genetice (Drăgănescu, 1996, 2003, citat de Popa, 2009) – figura 1.1.

Fig. 1.1 – Managementul resurselor genetice (după Drăgănescu, 1970, 1979, 1996, 2003, citat de Popa, 2009)

1.1. Inventarierea resurselor genetice

Inventarierea resurselor genetice este apanajul taxonomiei.

Taxonomia este o știință care are drept scop studierea diversității lumii vii. Este un termen introdus de Condolle (1813).

Taxonomia (gr. taxis: așezare, aranjare; nomos: lege) este știința care se ocupă cu studiul ordonării, ierarhizării taxonilor specifici în funcție de legăturile și poziția lor filogenetică.

În timp, noțiunea de taxonomie a devenit sinonimă cu cea de sistematică.

Dacă taxonomia reprezintă studiul teoretic al clasificării, incluzând baze, principii, și reguli proprii, sistematica își propune clasificarea pe baze științifice a organismelor, pornind de la principiile enunțate de taxonomie (Popa, 2009).

În funcție de sistemul de referință, taxonul este o unitate, diferențiindu-se de alte unități similare prin anumite caracteristici, suficient de distinctă pentru a beneficia de o încadrare proprie. Taxonii sunt obiectele clasificării în biologie, rezultatul acesteia fiind ierarhia taxonomică (regn, încrengătură, clasă, ordin, familie, gen, specie).

1.1.1. Categoriile sistematicii zootehnice

În zootehnie, se disting două categorii sistematice: rasa și linia. În biologie, sistematica se oprește la nivel de specie, considerând rasa și linia ca variații intraspecifice (ceea ce și sunt). Acesta este motivul pentru care rasele nu au căpătat denumirea trinară (gen, specie, subspecie), ele nefiind inventariate de către biologi (Drăgănescu, 1979; Drăgănescu și Grosu, 2003; Grosu, 2003, 2005).

Rasele sunt agregate de populații, rar populații simple, diferențiate fenotipic, cu mărime genetică (efectivă) mare, cu drum evolutiv propriu. Spre deosebire de specie, rasele sunt interfertile (indivizi aparținând unor rase diferite, se pot împerechea între ei, iar produșii rezultați sunt viabili), deci nu posedă mecanism de izolare reproductivă. Din acest motiv, prin migrație (schimb de reproducători) diferențele fenotipice dintre rase pot dispărea. Izolarea reproductivă a rasei este făcută de către om, cu ajutorul registrelor genealogice (la rasele perfecționate), sau prin bariere geografice (la rasele locale).

Principalele tipuri de rase sunt următoarele (Drăgănescu 1979; Drăgănescu și Grosu, 2003):

– Rasele perfecționate – evoluează sub influența selecției artificiale și sunt izolate prin registre genealogice. Au o creștere a consangvinizării pe generație de 0,5-1% (10-20% pe secol la taurine și ovine), un coeficient de izolare reproductivă cuprins între 0,8 și 1, o creștere a homozigoției pe generație (F) în jur de 0,5 % și o mărime efectivă (Ne) de 100. Prezintă o structură ierarhică de subpopulații. Mai sunt cunoscute sub denumirea (improprie!) de "rase pure" (în sens de izolat reproductiv);

– Rasele locale – evoluează în mare măsură sub influența selecției naturale și au o structură insulară. Realizează o creștere a homozigoției de 0,2% pe genearție, coeficient de izolare reproductivă cuprins între 0,8 și 1, o mărime efectivă de 250-100);

– Semirasele – sunt rase în curs de formare (prin absorbție), diferențiate morfologic și fiziologic de alte comunități similare, însă neizolate reproductiv (se află în zona de iradiație genetică a unei alte populații – rasă perfecționată).

Linia este cea mai simplă unitate a ierarhiei taxonomice zootehnice. Este o populație simplă, al cărei drum evolutiv este dictat de selecție și/sau derivă genetică. Izolarea reproductivă este realizată sub controlul omului (Popa, 2009).

În funcție de creșterea medie a consagvinizări pe generație se disting următoarele categorii de linii (Drăgănescu și Grosu, 2003):

– Linia neconsangvinizată – este o populație simplă care evoluează sub influența selecției, evitând special consangvinizarea. Acest tip cuprinde practic toate populațiile zootehnice componente ale raselor implicate în producerea de hibrizi. Au un coeficient de izolare reproductivă de 0,8; F 1 % și Ne 50.

– Linia moderat consangvinizată – este tot o populație simplă care evoluează sub influența selecției, în condițiile unei consangvinizări moderate – r = 0.8…1; F 3 %; Ne 16. Este rar produsă în mod deliberat.

– Linia consangvinizată – este cea mai mică populație (chiar și 2 indivizi), cu o creștere de peste 6% a homozigoției pe generație (r = 0.8…1,; F > 6 %; Ne = 2-8). Se folosește pentru producerea de animale de laborator sau pentru încrucișare industrială în special la plante.

– Linia stabilă genetic – numită și populație de control, are F = 0,1 – 0,3 % și Ne = 500-150. Acest tip de linie se folosește în special ca rezervă de gene din populațiile pe cale de dispariție.

1.1.2. Statusul de risc al populațiilor de animale domestice

În ianuarie 2001, I.U.C.N. (International Union for Conservation of Nature and Natural Resources), clasifică speciile de animale sălbatice în mai multe categorii de risc (Cartea Roșie) – figura 1.1.

Fig. 1.2 – Categorii de risc la speciile sălbatice (după I.U.C.N., 2001)

FAO a inclus în preocupările sale și problema conservării, evaluării și folosirii resurselor genetice animale. Au fost organizate reuniuni consacrate conservării materialului genetic în general (1966), la taurine (1968), la porcine (1970), la păsări (1973) și la ovine (1975). În această direcție, o serie de țări au luat măsuri pentru conservarea resurselor genetice. Astfel, în Anglia există un trust al raselor rare, o asociație de amatori, susținători ai conservării raselor pe cale de dispariție (Grosu, 2003).

În România, primele acțiuni de conservare a resurselor genetice la animalele domestice au fost întreprinse după anii 1960. În 1963, au fost stocate 4000 doze de material seminal, provenit de la ultima fermă de elită a rase Sură de stepă. În anul 1967 se organizează în România, la Mamaia și apoi la Moșneni-Constanța, din inițiativa și sub conducerea tehnică a dr. ing. S. Țîrlea, cea mai mare genotecă avicolă, probabil prima de acest gen pe plan mondial. Genoteca avea ca obiectiv să prezerveze rasele și liniile de găini ce se găseau în acel moment în România și erau în pericol de dispariție (Grosu, 2003). Din păcate, în prezent genoteca nu mai există.

Pe modelul elaborat de I.U.C.N. pentru speciile sălbatice, la animalele domestice există câteva categorii de încadrare într-una din clasele de risc, diferite de la țară la țară, însă acceptate de F.A.O. (Grosu, 2003):

În Ungaria, Bodo I. (1990) propune utilizarea următoarelor categorii: (1) Normal status (nr. femele > 10 000); (2) Insecure status (5000 – 10 000); (3) Vulnerable status (1000 – 5000); (4) Endangered (100 – 1000) și (5) Critical status (sub 100).

În Germania se apreciază că o rasă devine în pericol când: (1) Ne scade sub 50; (2) Ne scade anual cu 10 %; (3) Numărul de crescătorii pe rasă scade sub 10; (4) Mai mult de 10 % din împerecheri au loc cu masculi din alte rase (5% din gene înlocuite anual) sau (5) Eficiența economică scade sub alte rase.

În România, C. Drăgănescu (2000) propune folosirea următoarelor categorii: (1) Dispărută (Extinct); (2) În dispariție (numai metiși); (3) În pericol (E – roșu ) – cu un număr de 10 masculi observați, echivalentul unui număr efectiv de 4 masculi; (4) Vulnerabilă (V – galben) – cu un număr observat de 10-65 masculi (Ne = 4-25 masculi) și necompetitive economic și (5) În afară de pericol – cu peste 65 masculi (Ne = peste 25 masculi).

1.1.3. Analizele genealogice ale populațiilor de animale de interes economic

Pentru încadrarea într-una din clasele de risc a populațiilor de animale domestice sunt necesare analize genealogice. Acestea pot fi efectuate numai în condițiile existenței unui minimum de informație genealogică (a pedigreelor, respectiv a Registrelor Genealogice de Rasă). Ele au mai fost numite istorii genetice, analize genetice sau analize mendeliene de către cel care a pus la punct conceptele și procedeele de lucru, Sewall Wright (Drăgănescu, 1970).

Studiile de istorie genetică au ca bază de date registrele genealogice, „cronici”, în adevăratul sens al cuvântului, ale evoluției populațiilor de animale domestice. Cunoașterea originii animalului are pentru ameliorare o importanță capitală, întrucât pedigreele reprezintă singura sursă de informare în legătură cu „ceea ce ar putea individul să fie” (Drăgănescu, 1970).

Astfel de studii trebuie obligatoriu introduse în managementul resurselor genetice, în vederea elaborării strategiilor, respectiv a programelor de ameliorare, conservare sau, după caz, prezervare a populațiilor (Popa, 2005, 2009).

Ca definiție, prin istorie genetică înțelegem o acțiune obligatorie în managementul resurselor genetice, reprezentată de un ansamblu de analize (de unde și denumirea) ce utilizează datele extrase din registrele genealogice pentru determinarea modului și condițiilor în care populația a evoluat sub efectul metodei de ameliorare și a selecției artificiale aplicate, și cele provenite din controlul oficial al performanțelor pentru estimarea efectului selecției și tendinței genetice. Toate acțiunile au ca principal scop stabilirea statusului de risc al populației analizate, necesar elaborării strategiilor (Popa, 2005, 2009).

În România, promotorul analizelor genealogice pentru populațiile de animale domestice și adesea unicul susținător este C. Drăgănescu, cercetări ce constituie baza de elaborare a primelor programe naționale de ameliorare pe specii (Labă, 2001; Popa, 2009).

Între anii 1966 – 1969, Drăgănescu și col. publică o serie de analize genealogice a taurinelor Simmenthal importate între anii 1948-1949, structura genealogică a taurinelor Brune elvețiene importate între anii 1948-1949, analiza genealogică a taurinelor Friză din România (1967) și apoi o serie de lucrări privind istoria (analiza) genetică a raselor Lipițan (1978), Trăpaș românesc (1986), analiza genetică a Noniusului românesc (1983), analiza genetică a liniei Romana – Leghorn (1984), analiza genetică la Țigaia de Slobozia, analiza genetică a Karakulului de Dulbanu (1972), etc. În analizele genetice, el elaborează pentru prima oară, pornind de la un model al biologilor și aplică o formulă de estimare a gradului de izolare reproductivă (Popa, 2005, 2009).

De asemenea, în teza sa de doctorat (1970) același autor urmărește evoluția mărimii efective la cabaline (Gidran-Rădăuți, Huțul-Lucina, Furioso North Star-Bonțida, Arab-Mangalia, Trăpaș-Dor Mărunt și Rușețu), la taurine (Brună-Bonțida, Brună-Dulbanu, Brună-Runcu, Simmenthal-Mediaș), suine (Alb de Rușețu, Bazna-Bonțida) și ovine (Țigaie-Slobozia, Karakul-Dulbanu).

La rasa Huțul din Herghelia Lucina, Popa R. și col. (2004) realizează o analiză genetică în vederea stabilirii statusului de risc al acesteia. Cercetarea reprezintă o premieră în România, autorii aplicând pentru prima dată metoda recursivă (Henderson și Cuninngham – 1976, citați de Grosu și col., 1997) în realizarea istoriei genetice a unei populații. Lechkun M. (2005) realizează, utilizând aceeași metodă de lucru, o istorie genetică a Lipițanului de Făgăraș.

La nivel internațional, cercetări referitoare la studiul diversității genetice în populațiile de cabaline, la contribuția strămoșilor importanți și la asemănarea cu alte populații au fost efectuate de o serie de autori, printre care: Orlandi M. și col. (1980) la o populație locală italiană, Maxwell J. (1995) la Spanish Arabian Horse, Cunningham E.T. și col. (2001) la rasa Pur Sânge Englez, O’Toole H.P. și col. (2001) la o populație locală irlandeză, Chiofalo L. și col. (2003) la populația de cai Sanfratellano, Thoren E. (2008) în teza sa de doctorat la Calul de Sport, Druml T. și col. (2009) la rasa Austrian Noriker, Valera M. și col. (2005) la calul Andaluz, I. Cervantes și col. (2009) la trei populații deschise de cabaline din Spania, derivate din rasa Arabă, Teegen R. și col. (2009) la rasa Trakehner, Sabbioni A. și col. (2007) la rasa Haflinger, etc.

Tot la cabaline, studii referitoare la gradul de consangvinizare au fost efectuate de Mahon și Cunningham (1982) la Pur Sânge Englez, MacCluer și col. (1983) la Trăpașul American (8,99%), Gandini și col. (1992) la rasa Haflinger Italian (6,59%), Pagnacco G. (1992) la aceeași rasă, de către Moureaux și col. (1996) la cinci rase crescute în Franța, Torshizi R.V. și col. (1998) la rasa PSE în Australia, Costa M.D. și col. (2002), Olsen H.F. și col. (2010) în cazul a două rase de cabaline din Norvegia, aflate în pericol: Døle și Nordland/Lyngen, pe baza analizei pedigreelor, etc.

La suine, primele rase analizate cu ajutorul metodei elaborate de Sewall Wright, sunt Poland China din S.U.A. (Lush și Anderson, 1939) și Landrace danez (Rottensten, 1957).

În România, cercetările privind istoria genetică a populațiilor de suine încep să fie efectuate în anii ’70, vizând în principal punerea în evidență a unor aspecte referitoare la evoluția genetică a nucleelor din diferite rase, în primii ani după import (Felicia Popovici, 1973, 1977, Zeneci, 1981, Dutcă, 1988, Drăgănescu, 1988, Gâț, 1988, etc.).

La această specie, studii moderne de analiză genealogică au fost întreprinse de Labă (2001) care elaborează primul soft de analiză genealogică ce utilizează metoda lui Wright și de Popa (2005) ce aplică metoda lui Henderson.

1.2. Conservarea biodiversității

Noțiunea de (bio)diversitate nu are o definiție clară în acest moment, existând diferențe semnificative în modul în care este definită, delimitată și studiată. Aceste divergențe duc la acumularea unor cantități impresionante de date care nu permit o analiză corectă și o interpretare adecvată (Cogălniceanu, 1999).

În prezent nu există o viziune unitară asupra conceptului de biodiversitate. Astfel, DeLong (1996), după ce a trecut în revistă un număr foarte mare de lucrări, a identificat 85 de definiții ale biodiversității, ce acoperă un domeniu extrem de larg (Cogălniceanu, 1999).

Pornind de la ideea că diversitatea biologică este reprezentată de întreaga masă de variabilitate a organismelor vii și a habitatelor în care trăiesc acestea, se pot distinge patru componente ierarhice ale biodiversității (Cogălniceanu, 1999):

– Diversitatea specifică – este deseori confundată cu biodiversitatea deoarece este cel mai bine înțeleasă și a fost studiată de multă vreme de către taxonomiști. Ea se referă la varietatea speciilor la nivel local (biocenoză), regional (biom, regiune biogeografică) și global (biosferă). O categorie a acesteia, care permite stabilirea unor criterii de prioritate în conservare, este diversitatea taxonomică, care vizează varietatea taxonilor de rang superior;

– Diversitatea genetică – se referă la variabilitatea intraspecifică și care reprezintă însăși fundamentul procesului evolutiv. Studiul în acest domeniu este relativ recent, cunoscând o mare amploare ca urmare a progreselor înregistrate în genetică și biochimie;

– Diversitatea ecosistemică – se referă la nivelul la care au loc procesele evolutive și care include și o componentă nevie, respectiv biotopul. La acest nivel, măsurile de conservare își propun să mențină proprietățile și procesele ecologice caracteristice fiecărei componente (structura trofică, fluxul de energie și circuitele biogeochimice). Din punctul de vedere al costurilor este mult mai eficient să se opereze la nivel grosier al ecosistemului decât la nivelul fin al speciei. Speciile nu există izolat, pe lângă faptul că sunt alcătuite din populații diferite din punct de vedere genetic, toate sunt componente ale unei biocenoze, ocupă o anumită nișă funcțională. Fiecare specie depinde astfel de alte specii din cadrul ecosistemului;

– Diversitatea antropică sau etnoculturală – se referă la diversitatea etnică, lingvistică și culturală a comunităților umane.

Se mai poate descrie și o biodiversitate zootehnică, element căruia i se pot descrie toate cele patru componente ierarhice amintite mai sus (Popa, 2009).

Preocupările actuale pentru stoparea distrugerii biodiversității sunt justificate de rata enormă cu care aceasta este pierdută, fiind într-un real pericol de dispariție categorii întregi de componente ale sale. Biodiversitatea este sub o amenințare fără precedent ca urmare a presiunii antropice. Speciile dispar cu o rată de 10000 de ori mai mare decât rata naturală, în condițiile în care se estimează că au fost descrise mai puțin de 5% din specii. Dispar categorii întregi de ecosisteme, fără a se putea determina interacțiunile dintre componentele lor care să permită menținerea calității vieții pe planetă. Speciile care supraviețuiesc suferă de o reducere drastică a variabilității genetice. Distrugerea componentelor biodiversității reduce opțiunile viitoare ale umanității și amenință însăși posibilitatea continuității societății umane (Cogălniceanu, 1999).

În agricultură și zootehnie, conservarea resurselor genetice (a biodiversității în general) apare ca o necesitate stringentă în zilele noastre, aceasta deoarece intensivizarea agriculturii a determinat impunerea anumitor rase spre exploatare și excluderea altora. Ca urmare, unele dintre ele au devenit cosmopolite, iar altele au dispărut sau au intrat într-un declin numeric fără precedent (Popa, 2009).

De asemenea, conservarea resurselor genetice este determinată și de neputința de a reface structuri genetice dispărute. Odată cu populațiile dispărute se pierd și genele lor. Unele populații pot fi inutile la un moment dat, dar nu se știe dacă nu ar fi utile în viitor. Există rase de animale domestice care într-o anumită conjunctură erau inutile sau de o importanță minoră, după care să devină foarte valoroase economic (Cornish, Charolaise). Deoarece cel puțin până în prezent omul nu poate să creeze gene, se impune în continuare adoptarea unor măsuri privind conservarea și prezervarea resurselor genetice (Grosu, 2003, 2005).

Ineficiența economică este principalul factor favorizant al declinului sau dispariției populațiilor de animale domestice. Ca urmare a acesteia, populațiile fie au suferit scăderi numerice continue, până la o mărime efectivă ce a determinat intrarea în derivă genetică, fie au fost obiectul unor încrucișări de absorbție cu rase performante (Grosu 2003, 2005; Popa, 2009).

Necesitatea conservării resurselor genetice rezidă în câteva argumente și anume (Popa, 2009):

populațiile pot prezenta anumite gene neutre în prezent, dar posibil utile în viitor (de exemplu, cazul rasei Sură de Stepă, care este indemnă genetic la leucoză, dar ineficientă economic la cerințele actuale ale pieței);

populațiile amenințate cu dispariția pot poseda anumite calități care, la un moment dat, să le facă competitive pe o anumită piață (moda consumului produselor „ecologice” de un segment mic al pieței dispus să plătească un preț consistent);

rasele locale reprezintă patrimoniul cultural al unei țări;

populațiile locale pot constitui obiect de studiu, mai ales în ceea ce privește interacțiunea genotip-mediu (Drăgănescu și Grosu, 2003);

specia umană nu are dreptul de a distruge alte specii și trebuie garantat dreptul la existență al oricărei forme de viață (Cogălniceanu, 2009), etc.

Pentru speciile de interes economic (însă nu numai), noțiunea de conservare a resurselor genetice are două componente (Grosu, 2003):

Prezervarea – izolarea unui eșantion dintr-o populație pentru a o păstra fie ca genofond integrat, fie numai anumite gene din ea. Prezervarea se poate face in situ, ca animale vii, în mediul lor natural de viață, cu măsuri de a nu se afecta frecvența genelor și a genotipurilor și ex situ, în afara mediului natural, de regulă prin congelare (criogenic). Se aplică populațiilor cu status în pericol.

Conservarea prin gestiune, este acea parte a conservării care vizează modificarea genetică controlată a unei populații, ameliorarea ei genetică, cu scopul eficientizării ei economice. Deși metodele biotehnologice moderne permit să se întrevadă și conservarea separată a genelor, obiectul conservării îl reprezintă populația, unul din cele cinci nivele de organizare a materiei vii (genă, celulă, individ, populație, ecosistem), conservarea ei permițând și conservarea celorlalte nivele. Se mai numește conservare activă și se aplică populațiilor cu status vulnerabil, sub un strict control al consangvinizării (Popa, 2009).

1.3. Untilizarea resurselor genetice

Utilizarea resurselor genetice se referă la exploatarea acestora, sub toate formele și în diferite scopuri: economice (asigurarea securității alimentare, surse de medicamente, materii prime, etc.), științifice (studierea ecosistemelor, a legăturilor dintre acestea și a modului cum funcționează ele), culturale (o serie de tradiții ce țin de biodiversitatea etno-culturală au legătură cu anumite specii de plante și animale), etc.

Ca orice resursă, și cele genetice trebuie exploatate având permnent în vedere faptul că ele nu sunt inepuizabile. Ca urmare, exploatarea acestora trebuie să se supună principiilor dezvoltării durabile.

Lester Brown este unul din cercetătorii care au contribuit la definirea conceptului de dezvoltare durabilă: „Durabilitatea (Sustainability) este un concept ecologic cu consecințe economice”. „O societate durabilă este cea care își modelează sistemul economic și social, astfel încât resursele naturale și sistemele de suport ale vieții să fie menținute”.”Economia mondială s-a dezvoltat pe o cale care este de nesusținut”. „Componentele esențiale ale unei strategii pentru o dezvoltare durabilă sunt clare. Ele includ stabilizarea populației, reducerea dependenței de petrol, dezvoltarea resurselor de energii regenerabile, conservarea solului, protejarea sistemelor biologice ale pământului, reciclarea materialelor”.

CAPITOLUL II

MATERIAL ȘI METODĂ

Studiile monografice asupra populațiilor de animale reprezintă etape obligatorii în managementul resurselor genetice, în vederea elaborării strategiilor, respectiv a programelor de ameliorare, conservare sau prezervare, după caz (Popa, 2005; 2009).

Din păcate, actualmente în Romania sunt puțini aceia care au sesizat importanța capitală a unor astfel de studii asupra populațiilor de animale și din acest motiv ele sunt fie neglijate, fie constituie subiectul unor grave confuzii (Popa, 2009).

În prezent, Romania este deficitară în problematica utilizării durabile a resurselor genetice (Drăgănescu, 2003 – Managementul durabil al resurselor genetice la animalele domestice din Romania. Raport de țară FAO). În acest sens, determinarea statususlui de risc al populațiilor de interes economic, prin utilizarea unor metode ce conferă maximum de acuratețe, devine absolut obligatorie. Informațiile furnizate de astfel de studii monografice ("istorii genetice" sau "analize genealogice"cum au fost ele denumite de Drăgănescu în 1970) devin capitale pentru dezvoltarea unor programe sustenabile în managementul resurselor genetice.

2.1. Materialul cercetat

În vederea realizării obiectivelor propuse, materialul biologic utilizat în prezenta lucrare pentru determinarea statusului de risc, este constituit dintr-o probă aparținând efectivului matcă al Hergheliei Rușețu, din rasa Furioso North Star. Proba analizată este reprezentată de întreaga informație genealogică disponibilă în momentul analizei (30.01.2014), provenită de la 5 armăsari și 28 de iepe mamă.

Datele necesare au fost extrase din Registrul Genealogic al rasei. Pentru obținerea unor rezultate exhaustive, la nivelul individului a fost luată în considerare maximum de informație genealogică disponibilă (pe 5 generații în ascendență).

2.2. Metoda de lucru

În prezenta lucrare, descrierea metodei de lucru presupune atingerea a două aspecte:

a) prezentarea metodelor de lucru utilizate în studiul de caz;

b) sinteza bibliografică referitoare la utilizarea tehnicilor de biologie moleculară în determinarea managementul resurselor genetice.

2.2.1. Metoda utilizată pentru cuantificarea gradului de izolare reproductivă

Izolarea reproductivă a fost cuantificată pe baza coeficientului de izolare reproductivă, elaborat de S. Wright în 1921 (Drăgănescu, 1979; Drăgănescu și Sandu, 1987; Grosu și Popa, 2003):

în care:

AA = numărul de indivizi admiși la reproducție pe intervalul studiat cu ambii părinți autohtoni;

AI = numărul de indivizi admiși la reproducție pe intervalul studiat cu un părinte autohton și unul imigrant;

II = numărul de indivizi admiși la reproducție pe intervalul studiat cu ambii părinți imigranți (ei înșiși imigranți);

Coeficientul de izolare reproductivă ia valori în intervalul [-1, +1].

Când valoarea coeficientului variază între:

-1 și 0, efectivul analizat nu este o populație, ci el se află în zona de iradiație genetică a altei populații;

0 și +1, efectivul poate fi o populație.

Când C.I.R. = -1, se discută despre o completă deschidere reproductivă.

Când C.I.R. = +1, se discută despre o completă închidere reproductivă.

Pentru a considera un efectiv de animale ca fiind o populație, valoarea coeficientului de izolare reproductivă trebuie să se mențină în intervalul [0, +1] un număr suficient de mare de generații care să permită diferențierea populației.

2.2.2. Metoda utilizată pentru prelucrarea informației genealogice

Metoda propusă este cea elaborată de către Henderson și Cunningham (1976) – The Numerator Relationship Matrix – și prezentată pentru prima dată în România de Grosu și col. (1997). Metoda, numită recursivă sau tabulară, prezintă un avantaj enorm întrucât se pretează la computerizare.

Metoda presupune utilizarea informației extrase din Registrele Genealogice, codificarea acesteia și determinarea gradului de înrudire a fiecărui individ cu restul indivizilor din populație, precum și a consangvinizării acestora. Acești coeficienți de înrudire și consangvinizare sunt sistematizați sub forma unei matrice (tablou de elemente) cunoscută sub denumirea de A Matrix.

Această matrice a relațiilor de înrudire dintre indivizi (engl. additive relationship matrix) este de forma:

A =

Matricea A este pătrată (numărul de linii este egal cu numărul de coloane) și simetrică (axy = ayx).

După regulile lui Henderson (1976), A poate fi obținută pe baza următoarelor relații:

; ;

unde:

= relația de înrudire dintre individul x și tatăl lui y;

= relația de înrudire dintre individul x și mama lui y.

Fx = consangvinizarea individului x, egală cu jumătate din înrudirea părinților lui x: .

Fy = consangvinizarea individului y, egală cu jumătate din înrudirea părinților lui y:

Dacă unul sau ambii părinți ai lui y nu sunt identificați atunci sau / și este egal cu 0 pentru părintele care lipsește.

Marele avantaj al acestei metode este acela că matricea relațiilor de înrudire dintre indivizi (A) poate fi obținută direct dintr-o listă în care sunt trecuți indivizii analizați și părinții acestora, după următorul model (Grosu și Popa, 2003):

Pentru a calcula A recursiv, indivizii trebuie să fie grupați în ordinea generațiilor, ceea ce înseamnă că descendenții trebuie să fie precedați de părinții lor. După ordonare, fiecare individ primește un cod (un număr), iar în dreptul părinților se trec codurile corespunzătoare acestora. Indivizii care nu au părinți cunoscuți se consideră că fac parte dintr-o populație de bază neînrudită și neselecționată.

În România, metoda recursivă a fost utilizată în studiile genealogice pentru prima dată de Popa și col. (2004, 2005) cu scopul determinării statususlui de risc al unor populații de interes economic (rasa de cabaline Huțul și linia sintetică de porcine LSP-2000).

2.2.3. Metodologia utilizată pentru determinarea parametrilor analizei genealogice

Asemănarea cu alte populații

Asemănarea genetică cu alte populații se determină prin calcularea înrudirii medii dintre efectivul matcă analizat și indivizii aparținând altei (altor) populații. Acest lucru se face cu maximum de acuratețe, întrucât din matricea A se extrage înrudirea fiecărui reproducător în parte cu indivizi din alte populații, acestea se însumează și se împart apoi la suma observațiilor (Popa, 2005).

Asemănarea cu reproducători (strămoși) importanți

Studiul reproducătorilor importanți oferă informații despre metodica ameliorării în populația analizată și posibilitățile de evoluție în continuare a acesteia (numărul mic de strămoși, menținerea asemănării genetice cu reproducători remarcabili sau preferarea animalelor descendente din anumiți indivizi, pot duce la consangvinizare și drift genetic). În această ordine de idei, o asemănare mică cu reproducătorii fondatori și cu cei remarcabili constituie, pe de o parte, un avantaj întrucât, în acest mod nu se reduce mărimea genetică (efectivă) a populației, evitându-se astfel pericolul consangvinizării și oferind selecției o bază solidă de acțiune. Pe de altă parte însă, asemănarea scăzută cu reproducătorii remarcabili constituie un dezavantaj întrucât, deși populația are drum evolutiv propriu, acesta nu are o direcție clar subliniată (Popa, 2005).

Pentru calculul înrudirii populației cu strămoșii importanți, se va folosi aceeași procedură, numai că, în acest caz, se va extrage înrudirea fiecărui reproducător în parte cu reproducătorii remarcabili.

Înrudirea în sine a populației

Ca definiție, înrudirea în sine este înrudirea medie a tuturor indivizilor din populație (Drăgănescu și Sandu, 1987).

Conform acestei definiții, înrudirea în sine are trei componente: înrudirea între ei a masculilor, a femelelor între ele și a masculilor cu femelele. Ultimul component este cel mai important deoarece determină creșterea gradului de homozigoție la nivel de populație în generațiile succesive.

Din matricea A se extrag coeficienții de înrudire dintre animalele ce activează în momentul analizei la reproducție, iar prin însumare și raportare la numărul observațiilor se determină înrudirea medie la nivel de populație (Popa, 2005).

Consangvinizarea

Matricea lui Henderson permite calcularea, pe lângă înrudire, și a consangvinizării fiecărui individ în parte. Coeficienții de consangvinizare se găsesc în cadrul matricei pe diagonala principală, „adunați” la asemănarea genetică a fiecărui individ cu el însuși (1 sau 100%). Diferența față de 1 (luată în modul) reprezintă consangvinizarea animalului respectiv.

Consangvinizarea totală (pe total generații de informație genealogică) se determină prin media coeficienților de consangvinizare a indivizilor populației (Popa, 2005).

Pentru ameliorarea dirijată a animalelor, o importanță deosebită o reprezintă creșterea medie a consangvinizării pe generație, determinată prin relația (Drăgănescu, 1979; Drăgănescu și Grosu, 2003):

Consangvinizarea posibilă este consangvinizarea așteptată prin împerecherea întâmplătoare între ei a indivizilor a căror pedigree formează obiectul cercetării. Presupunând, în mod ipotetic, lipsa dirijării împerecherilor, consangvinizarea posibilă a mătcii se determină pe baza înrudirii medii (r), pe baza relației (Drăgănescu, 1979; Drăgănescu și Grosu, 2003):

Prin raportarea consangvinizării necurente totale la consangvinizarea posibilă, se obține indicele de subdivizare a populației, elaborat de Lush (1949, citat de Drăgănescu, 1979).

Mărimea efectivă (genetică) a populației

Există două noțiuni referitoare la mărimea populației: mărimea observată a populației care este dată de numărul de masculi și de femele de reproducție, numit și „efectiv matcă” și mărimea efectivă (sau genetică) a populației (influențată de creșterea consangvinizării).

Populațiile de animale domestice sunt foarte variabile ca mărime observată; mai multe componente concură la această variabilitate și fac adesea dificilă, dacă nu chiar imposibilă compararea mărimii lor observate (Drăgănescu și Sandu, 1987; Grosu și Popa, 2003):

raportul de sexe diferit;

inconstanța numerică de-a lungul generațiilor ("gâtuiturile filogenetice" sau "bottle-neck effect");

varianța mărimii familiei de reținuți de la fiecare părinte (ca urmare a selecției diferite de la o populație la alta).

Pentru a facilita compararea între populații (din punct de vedere genetic), S. Wright (1931, 1938, 1940, 1942) introduce termenul de „mărime efectivă” (Drăgănescu și Grosu, 2003).

Mărimea efectivă a unei populații (Ne) este mărimea unei populații imaginare, echivalentă cu cea reală, care dă aceeași creștere a consangvinizării pe generație, însă la care: (a) numărul de femele este egal cu numărul de masculi (raport de sexe de 1:1); (b) generațiile sunt constante numeric în succesiunea lor și (c) reproducția se face panmictic (în cazul reproducerii la întâmplare, varianța mărimii familiei este egală cu 2, conform distribuției lui Poisson).

În prezenta lucrare, mărimea efectivă a fost estimată:

pe baza efectivului matcă:

unde:

M = numărul de masculi din populație folosiți la reproducție

F = numărul de femele din populație folosite la reproducție

ținând cont de legătura dintre mărimea efectivă și creșterea consangvinizării pe generație (ΔF):

Numărul efectiv de masculi (Nm) a fost de terminat după relația:

2.2.4. Sinteza bibliografică

În procesul cercetării, o importanță deosebită îi revine documentării cât mai complete în informațiile deja existente pe fiecare domeniu.

Scopul documentării este acela de a crea o imagine cât mai completă a realității, a stării dintr-un anumit domeniu, raportat la o anumită perioadă de timp.

Rolul documentării în cercetarea științifică este acela de a crea un sistem de referință la care să se raporteze cercetările proprii, justificându-le astfel. Prin documentare se analizează rezultatele cercetărilor anterioare dintr-un anumit domeniu, identificându-se nivelul la care s-a ajuns, problemele rămase neclare, nerezolvate sau greșit interpretate. De asemenea, prin documentare pot fi identificate noi căi de rezolvare a chestiunilor evidențiate anteior.

Documentarea se realizează pe seama cercetării bibliografice. Aceasta are drept scop identificarea surselor și studierea datelor cuprinse în acestea. Pe baza lor se realizează sinteza bibliografică.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

CAPITOLUL III

ANALIZA GENEALOGICĂ A POPULAȚIEI DE CABALINE

FURIOSO NORTH-STAR

3.1. Originea populației Furioso North-Star din România

Populația de cabaline cunoscută sub denumirea Furioso North-Star reprezintă un cal jumătate sânge, cu însușiri intermediare pentru tracțiune și călărie (Mărginean și col., 1997).

Bazele formării rasei au fost puse la începutul secolului XIX în herghelia de la Mezöhegyes prin contopirea a două familii jumătate sânge, Furioso și North Star, dar abia din anul 1838 s-a imprimat o orientare mai clară asupra obiectivelor pentru care să se realizeze ameliorarea. În acest scop s-au utilizat în mod succesiv încrucișări cu Pur Sângele Englez și mai puțin cu Pur Sângele Arab (Mărginean și col., 1997).

Formarea rasei Furioso North-Star a început în anul 1841 când, absolut întâmplător, a fost adus în herghelia de la Mezöhegyes armăsarul Pur Sânge Englez Furioso, cu unicul scop de a ameliora iepele locale din herghelie. Consecință a valorii sale și a puterii mari de transmitere a caracterelor în descendență, el a devenit întemeietor al liniei ce-i poartă astăzi numele (Petre Spânu, 1928).

În 1852 este adus în aceeași herghelie armăsarul North-Star, tot englez, ce transmitea caracterele foarte fidel, obținând o descendență uniformă consecință a gradului ridicat de consagvinizare (prezenta o asemănare foarte ridicată cu strămoși importanți). Aceste calități l-au ajutat să devină întemeietor de linie, producând un număr important de iepe și câțiva armăsari (Petre Spânul, 1928).

Punctele comune în ascendența celor doi armăsari întemeietori (Furioso și North-Star) au contribuit la formarea tipului uniform Furioso North-Star, întrucât multe caractere ale lui Furioso se regăsesc și în substratul ereditar al lui North-Star și vice-versa. Cei doi armăsari au acționat simultan în herghelia de la Mezöhegyes, producând descendenți de mare valoare (Petre Spânul, 1928).

Cele două familii au fost crescute independent până în 1870 când s-a luat hotărârea contopirii lor. În acest scop s-au realizat încrucișări reciproce urmate de creșterea în rasă curată în scopul consolidării unui tip morfologic propriu. Periodic s-au realizat încrucișări de infuzie cu rasa Pur Sânge Englez în scopul corectării unor defecte de conformație (ambii întemeietori ai rasei prezentau crupă îngustă și un defect la nivelul mmbrelor numit "genunchi de oaie") cât și pentru menținerea unui temperament vioi. Datorită acestor încrucișări de infuzie indivizii din efectivul de Furioso North – Star prezintă azi o constituție mai fină, un temperament mai vioi și aptitudini remarcabile de călărie, nefiind de neglijat nici aptitudinile de carosier. Din această cauză populația este considerată drept cea mai reușită populație de jumătate sânge produsă la Mezöhegyes. Mersurile sunt corecte și cadențate iar deplasarea se face foarte ușor comparativ cu dezvoltarea corporală (Mărginean și col., 1997).

În anul 1920, efectivul de Furioso North-Star a fost transferat la herghelia Bonțida (18 km de Cluj). Aici s-a conturat creșterea pe linii genealogice (așa-numitele "linii de sânge" – Drăgănescu, 1979) cu scopul de a reduce consangvinizarea. În prezent există 4 astfel de linii, câte două pe fiecare întemeietor, formate la Bonțida.

La sfârșitul anilor '90, ca urmare a unor acțiuni iresponsabile, herghelia Bonțida este literalmente desființată, efectivul de Furioso North-Star fiind mutat la Herghelia Slatina. Aici a fost menținut până în 2011, când întreaga matcă și tineretul aferent s-au transferat la herghelia Beclean pe Someș. După mai puțin de 2 ani matca este transferată la Rușețu, unde există și în prezent. Armăsarii de montă publică și o parte din tineret sunt întreținuți în continuare la Slatina.

Actualmente, populația Furioso North-Star din România are caracter de unicat în Europa, fiind singura crescută în sistem de linii genealogice. Acest fapt a determinat menținerea consangvinizării la un nivel scăzut, ca urmare a creșterii constante a mărimii efective (genetice). La aceasta se adaugă infuzia foarte scăzută cu Pur Sânge Englez, practicată în celelalte țări, în special Ungaria, chestiune ce a determinat menținerea caracterelor originale și a temperamentului vioi, foarte apreciate la ora actuală în lume (Mărginean și col., 1997).

3.2. Statusul izolării reproductive a rasei Furioso North-Star din România

Întrucât la speciile de interes economic, raportul de sexe în matcă este diferit de 1:1 (în herghelii maximum 1:10 – Popa, 2009), valoarea coeficientului de izolare reproductivă a fost determinată pentru fiecare sex în parte și pe întreaga populație. De asemenea, izolarea reproductivă a fost cuantificată pe generația curentă (din momentul analizei) și pe două generații în ascendență cu scopul de a surprinde un eventual import de material biologic (imigrație). Acest din urmă aspect este facilitat și de existența generațiilor suprapuse (conviețuirea în același timp a bunicilor, părinților, nepoților).

Statusul izolării reproductive la efectivul Furioso North-Star din herghelia Rușețu este prezentat în tabelul 3.1.

Tabelul 3.1

Statusul izolării reproductive la efectivul din rasa Furioso-North Star,

Herghelia Rușețu

Datele prezentate în tabelul 3.1 arată că efectivul de cabaline Furioso North-Star din herghelia Rușețu poate fi considerat o populație ce evoluează independent (C.I.R. = 1,00). Valoarea coeficientului de izolare reproductivă din generația curentă relevă o completă închidere din punct de vedere reproductiv.

La nivelul generației I în ascendență se observă existența iepelor cu un părinte imigrant, momentul intrării în populație al acestuia fiind surprins la nivelul generației a II-a. În urma consultării informației genealogice (a pedigreelor) s-a identificat că este vorba de armăsarul Banal, din rasa Pur Sânge Englez, de proveniență ungurească (pe linie paternă).

La nivelul generației a II-a în ascendență, se constată existența a 7 iepe cu un părinte imigrant, însă fără a îndrepta evoluția populației spre cea din care au fost efectuate importurile (tot Pur Sânge Englez).

3.3. Statusul asemănării cu imigranții a rasei Furioso North-Star din România

Determinarea gradului de înrudire a populației cu indivizii imigranți relevă gradul de asemănare genetică cu populațiile din care provin importurile. În funcție de ordinul de mărime al acestui parametru, se poate pune în evidență o eventuală tendință de înlocuire a genofondului unei populații cu cel al imigrantului.

În informația genealogică disponibilă, studiată pentru cei 5 armăsari pepinieri și 28 de iepe mamă aparținând populației Furioso North-Star din herghelia Rușețu, au fost identificați 46 de indivizi imigranți (Pur Sânge Englez, Nonius). Aceștia au fost analizați în funcție de trei criterii: asemănarea medie cu armăsarii pepinieri, cu iepele mamă și cu populația în ansamblu.

Situația asemănării cu imigranții a efectivului matcă actual este prezentată în tabelul 3.2.

Tabelul 3.2

Situația asemănării cu imigranții ai populației FuriosoNorth-Star din România

În momentul analizei, asemănarea populației cu imigranții (tabelul 3.2) are o valoare foarte mică (1,51%), valoarea acestui parametru sugerând faptul că nu există pericol (nici măcare tendință) de înlocuire a genofondului populației Furioso North-Star din România cu cel al populațiilor din care provin imigranții.

Valorile prezentate în tabelul 3.2 arată faptul că importul de reproducători s-a constituit într-o infuzie nesistematică și foarte slabă ca intensitate caracterizată prin aceea că imigranții și descendenții lor au fost foarte puțin folosiți la reproducție sau, deși au avut descendenți, aceștia nu au fost reținuți în matcă (practic "morți genetic" pentru populație). Astfel, rezultatul infuziei a fost o asemănare mică a populației cu imigrantul în generații succesive.

3.4. Statusul asemănării cu reproducătorii (strămoșii) importanți ai rasei Furioso North-Star din România

Studiul reproducătorilor importanți oferă informații despre metodica ameliorării în populația analizată și posibilitățile de evoluție în continuare a acesteia (Drăgănescu, 1970).

Existența unor strămoși cu care părți din populație se aseamănă genetic mai mult decât cu oricare alți indivizi luați la întâmplare, denotă fie o selecție realizată după valoarea ascendenților (reținerea la reproducție a unor indivizi proveniți preponderent din anumiți părinți), fie dorința menținerii asemănării genetice cu câțiva reproducători remarcabili. Consecința este creșterea consangvinizării cu toată pleiada de consecințe nefavorabile pentru evoluția populației.

Transmiterea informației ereditare a strămoșilor importanți se face mai ales prin descendenții masculi ai acestora. Ca urmare am căutat să identificăm în informația genealogică disponibilă toți ascendenții masculi ai populației, pe care să-i ordonăm în funcție de înrudirea acestora cu efectivul matcă.

Populațiile de cabaline prezintă anumite particularități care fac foarte dificilă studierea strămoșilor importanți:

– sunt populații ce provin dintr-un număr mic de indivizi ("întemeietori");

– reproducția a fost și de multe ori este la nivel de "artă" și astfel sunt guvernate de puternice gătuituri filogenetice (înrudirea reproducătorilor cu un număr mic de strămoși din generațiile anterioare);

– particularitățile de reproducție și caracterele demografice uneori modeste ca valoare, pot determina imposibilitatea înlocuirii reformei și menținerea în activitate a unor reproducători bătrâni, ce vor avea un număr mai mare de descendenți, etc.

Consecință a acestor particularități, este foarte greu de stbilit cu certitudine, pe baza informației genealogice, dacă un ascendent este strămoș remarcabil propri-zis (în sensul că s-a dorit menținerea asemănării genetice cu el), sau a apărut în această poziție accidental (număr mai mare de descendenți reținuți din alte cauze decât deliberat).

Această polarizare a populației în raport cu strămoși remarcabili, indiferent de cauza ei, este nefastă pentru evoluția normală a ei. Hergheliile fiind populații mici, supuse permanent pericolului consangvinizării (Drăgănescu, 1978), pot intra rapid în zona driftului genetic fără un management eficient al reproducției (potrivirea împerecherilor).

În pedigreele consultate, pe 5 generații în ascendență, au fost identificați 74 de ascendenți masculi. În continuare, s-a determinat înrudirea medie a fiecăruia cu efectivul matcă din momentul analizei. După ordonare, s-a avut în vedere evidențierea acelora care se înrudesc cu populația cel puțin în proporție de 21% (pentru justificarea valorii, a se vedea înrudirea medie). Valorile sun prezentate în tabelul 3.3.

Tabelul 3.3

Reproducători importanți identificați în populația Furioso North Star

* Matcă actuală

Din datele prezentate în tabelul 3.3, se constată că au fost identificați cu maximum de certitudine 10 astfel de strămoși. Asemănarea mare cu populația a acestor ascendenți se explică prin adoptarea unui model de lucru specific hergheliilor. Astfel populația nu mai este menținută ca un tot, ci fragmentată în grupe polarizate, din cauzele expuse anterior.

Se observă astfel că în populația Furioso North-Star din România au fost selecționați cu precădere descendenții anumitor strămoși. Din diferite cauze, în matca actuală există continuatori de la un număr mic de strămoși. Practic s-a acordat o pondere mare anumitor genitori (valoroși ), crescând asemănarea populației cu ei. Se generează astfel consangvinizare, prin scăderea numărului efectiv de masculi (mărimii efective).

Pentru perspectiva populației, consecință a raportului de sexe diferit de 1:1, prezintă importanță mai ales strămoșii importanți ordonați în funcție de înrudirea cu efectivul actual de armăsari pepinieri – tabelul 3.4.

Tabelul 3 .4

Reproducători importanți înrudiți cu efectivul actual de armăsari pepinieri

* Matcă actuală

Din rezultatele prezentate în tabelul 3.4, se observă că doi strămoși prezintă o înrudire mare cu efectivul de armăsari pepinieri: NS XLII (29.59%) și F LXIV (28.66%), ceea ce înseamnă o participare însemnată la realizarea genofonddului populației.

Nu se remarcă existența printre reproducătorii remarcabili (sau în ascendența lor) a imigranților. Aceștia nu persistă în populație prin descendenții lor și astfel, din punct de vedere genetic, ei sunt morți.

3.5. Statusul înrudirii medii în populația Furioso North-Star din România

Înrudirea în sine a unei populații este înrudirea medie a tuturor indivizilor între ei, existentă la un moment dat. Astfe, acestui parametru i se pot descrie trei componente: înrudirea între ei a masculilor, a femelelor între ele și a masculilor cu femelele. Ultimul component este cel mai important deoarece determină creșterea medie a consangvinizării la nivel de populație în generațiile succesive (Drăgănescu, 1979; Labă, 2001; Popa, 2004, 2005).

Valoarea medie a înrudirii dintre masculii și femelele din matcă reprezintă un indicator de o importanță capitală în managementul resurselor genetice, întrucât el influențează, în mod direct, creșterea medie a homozigoției (a consangvinizării), cu toată pleiada de consecințe. Valoarea acestui parametru este necesar a putea fi determinată în orice moment al evoluției populației, întrucât ea este un indicator al respectării principiilor ce trebuie aplicate în populațiile mici, supuse permanent pericolului consangvinizării (Popa, 2009).

Într-o populație, când înrudirea medie este mai îndepărtată de veri primari (12,5%), proporția heterozigoției tinde către o constantă ca limită (diferită de 0). Dacă sistemul de împerechere nu se modifică (inclusiv panmixie), populația rămâne într-o stare de echilibru (Sewall Wright, 1921, citat de Drăgănescu 1970, 1979).

Prin construirea matricei relațiilor de înrudire dintre indivizi (A Matrix) au fost luate în considerare toate combinațiile posibile dintre aceștia, determinându-se o înrudire medie în populația analizată de 20,66% ± 0,92%. A fost luată în considerare întreaga informație genealogică, pe 5 generații în ascendență, gradul de completare a pedigreelor fiind de 100% – tabelul 3.5.

În condițiile unei înrudiri medii foarte mari, consagvinizarea în populația Furioso North-Star ar putea să hotărască drumul evolutiv al acesteia, conducând-o spre derivă genetică și dispariție în cazul lipsei unui sistem coerent de potrivire a perechilor (managementul reproducției).

Tabelul 3.5

Înrudirea armăsarilor pepinieri cu iepele mamă în momentul analizei

Diversitatea genetică scăzută nu poate permite evoluția normală a populației fără adoptarea unui sistem de selecție intrafamilială, urmată de încrucișare rotativă interfamilială (Drăgănescu, 1979; Drăgănescu și Grosu, 2003; Popa 2009). Acest sistem de împerechere are ca efect menținerea unei valori reduse a consangvinizării, prin dublarea mărimii efective a populației.

De asemenea, din analiza rezultatelor prezentate în tabelul 3.5, pot fi identificate 13 combinații armăsari pepinieri – iepe mamă între care există o înrudire directă de tip părinte – descendent sau frate-soră (r = 49,74%). Aceasta înseamnă că o mică parte din populație poate intra în derivă genetică în cazul abandonării sistemului de potrivire a împerecherilor.

Acest din urmă fapt este susținut și de înrudirea medie individuală a armăsarilor pepinieri cu iepele mamă – tabelul 3.6.

Tabelul 3.6

Înrudirea medie individuală a armăsarilor pepinieri cu iepele mamă

După cum se cunoaște, consangvinizarea reprezintă împerecherea între indivizi mai apropiat înrudiți decât media înrudirii în populație (Drăgănescu, 1979; Drăgănescu și Grosu, 2003; Popa, 2009).

Analizând rezultatele prezentate în tabelul 3.6, constatăm existența unor probleme acolo unde valoarea înrudirii armăsari – iepe depășește înrudirea medie în populație (20,66%). Cu o singură excepție, situația este întâlnită în cazul tuturor cuplurilor posibile. Astfel, ca în orice populație mică, supusă permanent pericolului consangvinizării, apare ca o necesitate stringentă respectarea sistemului de potrivire a perechilor.

3.6. Statusul consangvinizării în populația Furioso North-Star din România

Consangvinizarea totală (per total informație genealogică) pe 7,84 generații este de 0,0152 (1,52%) Astfel, creșterea medie a homozigoției pe generație este de 0,0019 (0,19%), valoare mult mai mică decât limita maximă de 1% pentru linia neconsangvinizată.

Creșterea aproape neglijabilă a consangvinizării se datorează strict sistemului de potrivire a împerecherilor, obligatori de practicat în herghelii (populații mici, supuse permanent pericolului consangvinizării): selecția intrafamilială urmată de încucișare rotativă interfamilială. Familiile la care ne referim sunt, de fapt, liniile genealogice ("de sânge" – întreaga descendență de sex masculin a unui armăsar întemeietor).

Pentru aplicarea acestei metode de selecție în herghelii (acolo unde se practică creșterea pe linii), este necesar ca matca să se împartă într-un număr de grupe corespunzător numărului de armăsari pepinieri (în general, 4-6). Descendenții fiecărei grupe se cresc separat, iar selecția se face separat între candidații din fiecare grup. Unul din sexe înlocuiește reforma în propriul grup (în herghelii obligatoriu masculul), iar celălalt sex înlocuiește reforma în grupa vecină, realizându-se astfel încrucișarea rotativă interfamilială (Drăgănescu, 1979; Drăgănescu și Grosu, 2003; Popa, 2009).

Reducerea consangvinizării prin această metodă se realizează pe două căi:

– întotdeauna armăsarul dintr-un grup (familie, "linie de sânge") este înlocuit la reproducție printr-unul din fiii săi, cu alte cuvinte, din fiecare familie este reținut întotdeauna la reproducție un singur descendent; în acest fel se reduce varianța mărimii familiei de reținuți la 0;

– întotdeauna armăsarul dintr-un grup (familie, "linie de sânge") va monta iepele din alt grup.

Această metodă de selecție este singura capabilă de a reduce creșterea gradului de homozigoție pe generație, prin dublarea mărimii efective a populației, ca urmare a anulării varianței mărimii familiei de reținuți.

Un parametru foarte important în analizele genealogice este consangvinizarea posibilă. Așa cum am precizat în capitolul referitor la materialul și metoda de lucru, consangvinizarea posibilă estimează consangvinizarea din viitorul populației în condițiile abandonării sistemului de potrivire a împerecherilor, sau trecerea la împerecherea de tip panmictic și se determină din înrudirea medie în populație.

În populația Furioso North-Star din herghelia Rușețu, valoarea acestui parametru este de 0,1152 (11,52%), valoare extrem de mare, ce o depășește pe cea a liniilor consangvinizate (ΔF>6%). Astfel, dacă reproducția s-ar face la întâmplare, sau după oricare alt sistem, posibilii descendenți ai mătcii ar avea o consangvinizare specifică indivizilor rezultatți din împerechere de semifrați, ceea ce ar conduce populația spre drift genetic.

3.7. Indicele de subdivizare în populația Furioso North-Star din România

Conform celor descrise în capitolul referitor la materialul și metoda de lucru, raportul dintre consangvinizarea necurentă (sub 6%) și cea așteptată prin împerecherea întâmplătoare între ei a indivizilor, este de 0,1319 deci populația nu este subdivizată în linii ca urmare a consangvinizării.

3.8. Statusul mărimii efective în populația Furioso North-Star din România

Valoarea mărimii efective dedusă din mărimea observată a populației (efectivul matcă) este de Ne = 16,97.

Consecință a aplicării sistemului de selecție și potrivire a împerecherilor descris, creșterea consangvinizării pe generație este foarte mică și astfel mărimea efectivă dedusă pe baza creșterii medii a homozigoției pe generație (Ne = 263,16) este net superioară.

De asemenea, în lumina aceleiași idei, numărul efectiv de masculi (Nm = 65,79) este superior mărimii observate (5 armăsari pepinieri).

3.9. Sinteza parametrilor de analiză genealogică în populația Furioso North-Star din România

Parametrii analizei genealogice pentru populația Furioso North-Star din România sunt prezentați în tabelul 3.7.

Tabelul 3.7

Parametrii analizei genealogice la populația Furioso North Star din România

Astfel, ca urmare a aplicării unui management corect al reproducției, populația Furioso North-Star se încadrează în rândul celor mari din punct de vedere genetic. Orice abatere poate fi însă catastrofală (a se vedea valoarea consagvinizării posibile), ceea ce îi conferă un anumit grad de vulnerabilitate.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

CAPITOLUL IV

POSIBILITĂȚI DE UTILIZARE A TEHNICILOR DE BIOLOGIE MOLECULARĂ ÎN MANAGEMENTUL RESURSELOR GENETICE

4.1. Deficiențele analizelor genealogice

Analizele genealogice prezintă o serie de neajunsuri care, din punctul nostru de vedere, fac din tehnicile de biologie moleculară un instrument ce are un rol important, nu doar unul auxiliar.

Rezultatele la care am ajuns în studiul de caz din prezenta lucrare, referitor la analiza genealogică a unei populații de cabaline, ne permit a lua decizii pertinente, în funcție de statusul de risc, în vederea elaborării strategiilor. Însă aceste rezultate pot fi coroborate cu cele obținute în urma aplicării tehnicilor moleculare, cu scopul creșterii acurateței evaluării.

Pentru viitorul populației și pentru eficientizarea muncii de evaluare a resurselor genetice, devine absolut necesară existența unei baze de date complet informatizată, în care să existe înregistrări efectuate cu maximum de acuratețe și certificate de tehnici de biologie moleculară.

Dintre aceste neajunsuri, pot fi citate următoarele:

Datele din registrele genealogice pot fi cunoscute de o manieră incompletă, caz în care orice analiză pe pedigree va avea o eroare asociată mare;

Înregistrarea originii fiecărui produs, până la a cincea generație în ascendență, reprezintă o muncă laborioasă și poate fi supusă erorii umane. Deși înscrierea de date în registrele genealogice se face cu maximum de responsabilitate, această activitate fiind vizată de mai multe persoane, erori se pot strecura, iar rezultatele vor fi denaturate. Astfel, existența unei erori de înregistrare a originii poate determina, pe lână rezultate denaturate, și erori în potrivirea perechilor, cu repercusiuni negative în managementul consangvinizării;

Datele din registrele genealogice pot fi obiect al fraudelor;

Mai ales în cazul populațiilor de cabaline, acțiunile de aplicare a dangalei (sau microciparea) și înscrierea originii pot fi însoțite de eroare umană, ca urmare a particularităților tehnologice;

Există specii de interes economic, ce fac parte din patrimoniul genetic și cultural, ce nu dețin nici un fel de date genealogice (bivolii, măgarii, unele rase de oi, porci, vaci, etc.). Pentru astfel de populații, ca și pentru speciile sălbatice, analizele genealogice sunt complet inutile;

Chiar în condițiile existenței informațiilor genealogice, nu întotdeauna este posibilă determinarea distanței genetice sau înrudirii dintre populații;

Informațiile din registrele genealogice sunt perisabile, etc.

4.2. Tehnici de biologie moleculară ce pot fi utilizate în managementul resurselor genetice

Aplicarea tehnicilor de biologie moleculară are un rol important în managementul resurselor genetice. Astfel, tehnicile de biologie moleculară au pus la dispoziția cercetătorilor instrumente de lucru în ameliorarea animalelor de interes economic (selecția pe baza markerilor moleculari), cartarea genoamelor diferitelor specii, stabilirea originii (a paternității), determinarea gradului de consangvinizare în populație, stabilirea distanțelor genetice între populații, evaluarea diversității genetice a populațiilor, realizarea cladogramelor (diagrame ce shematizează filogenia, istoria evolutivă a unei populații), etc.

Mai multe zone din hărțile de linkage sunt polimorfisme ADN anonime (ex. markerii RAPD, AFLP și markeri microsateliți) și nu corespund cu nici una din genele a căror funcție este cunoscută. Totuși, câțiva markeri moleculari (inclusiv ADNc, EST și markerii proteici) sunt markeri ai unor gene individuale. Markerii ADN sunt puși în evidență printr-o mare varietate de tehnici, foarte diferite în funcție de fiabilitate (repetabilitatea și robustețe), de dificultate, de costuri și natura polimorfismului pe care-l detectează. Din cauza acestor diferențe, alegerea uneia sau alteia dintre tehnici trebuie adaptată utilizări cerute și costurilor pe care le implică (Carșai Teodora și col., 2010).

Sub raport funcțional, ADN poate fi de două tipuri (Carșai Teodora și col., 2010):

ADN cu corespondenți de codare, cu secvențe unice (gene structurale) și repetitiv (familii de gene, izogene);

ADN fără corespondenți de codare (netranscris și netradus), înalt repetitiv, spațiator (dispus între secvențele unice) și ADN satelit (minisatelit și microsatelit).

Tehnicile moleculare pot fi bazate pe hibridare cu o sondă sau pe restrictarea cu o enzimă de restricție (RFLP) sau pe PCR (PCR, RAPD și AFLP) și pot detecta polimorfismul unui singur locus sau de la mai mulți loci, iar markerii pot fi moșteniți în manieră dominantă sau codominantă.

În principiu, tehnicile de biologie moleculară cu aplicabilitate în managementul resurselor genetice sunt:

1. Tehnica PCR (Ploymerase Chain Reaction);

2. Variante ale tehnicii PCR:

tehnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism );

tehnica AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism);

tehnicile MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling):

– tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA);

– tehnica DAF (DNA Amplification Fingerprint);

– tehnica AP-PCR (Arbitrary Primed PCR).

Tehnica RT-PCR (Reverse Transcription PCR);

Tehnica microsateliților SSR (Simple Sequence Repeats);

Tehnica EST (Expressed Sequence Tag);

Tehnica SCAR (Sequence Characterized Amplified Region);

Tehnica SNP (Single Nucleotid Polymorphism);

Tehnica STS (Sequence – Tagged Site);

Tehnica ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System – PCR).

3. Tehnica SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism);

4. Tehnici bazate pe secvențiere.

4.2.1. Tehnica PCR

Tehnica PCR sau reacția în lanț a polimerazei, dezvoltată la mijlocul anilor ’80, a revoluționat genetica moleculară, făcând posibilă studierea și analizarea genelor prin metode mult mai accesibile și foarte simple. Această tehnică a fost pusă la punct de Kary Mullis în anul 1983, plecând de la caracteristicile replicării ADN și anume, cu ajutorul enzimei ADN polimeraza care utilizează o catenă a ADN ca matriță pentru sinteza unei noi catene complementare. Prin această tehnică se produc un număr enorm de copii a unor secvențe de ADN (gene) fără a se apela la clonare (Vlaic A. și colab., 1997).

Tehnica PCR exploatează unele caracteristici ale replicării ADN, unde pentru amplificarea secvenței de ADN dorite se utilizează o secvență de oligonucleotide numită primer sau amorsă.

Primerii sunt secvențe scurte de 15 – 35 nucleotide, complementare capetelor 3’ ale secvenței de ADN ce se dorește a fi amplificată; ei sunt specifici fiecărei gene și sunt sintetizați cu ajutorul unor sintetizatoare automate de ADN. Pentru amplificarea secvențelor specifice de ADN, prin tehnica PCR, se folosește o soluție tampon (PCR buffer) în care se introduce ADN ce conține gena de interes, primerii sintetizați, Taq-polimeraza și cele patru tipuri de deoxinucleotid-trifosfați (dATP, dGTP, dCTP și dTTP).

Aplicații ale tehnicii PCR în managementul resurselor genetice:

– stabilirea genotipului la locii care codifică sinteza unor gene de interes în selecția animalelor (leptina, k-cazeina, β lactoglobulina, etc.);

– sexarea embrionilor (prin amplificarea unor secvențe de ADN de pe cromozomul Y);

– stabilirea paternității;

– identificaea indivizilor purtători ai unor gene mutante.

4.2.2. Variante ale tehnicii PCR

Tehnica RFLP

Această tehnică se bazează pe proprietățile de hibridare care există între două fragmente de ADN, prezentând un grad înalt de omologie (RFLP- bazat pe hibridare) și tehnica PCR – denumită PCR-RFLP, în care se evidențiază polimorfismele existente la nivelul situsurilor enzimelor de restricție (Vlaic A. și colab., 1997).

Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce identifică variațiile secvenței de ADN la nivelul unui situs de restricție, prin analiza RFLP. O sursă abundentă de markeri genetici, utilizați în tehnicile de cartare a genomului animal au la bază modificările unor secvențe de ADN care se produc la nivelul situsurilor de restricție.

Cu ajutorul RFLP se pot identifica variațiile genetice dintre indivizi doar la nivelul situsurilor de recunoaștere a enzimelor de restricție, respectiv dintre indivizii care posedă unul din cele trei genotipuri existente în locusul de interes (AA, Aa, aa) și nu se pot detecta variațiile la nivelul întregului genom, care la mamifere este de ordinul 3x 109 pb (Bekman , J.S. și colab., 1983).

Tehnica AFLP

Tehnicile moleculare care permit obținerea amprentelor genetice și vizualizarea polimorfismelor, a diferențelor dintre eșantioane la nivel de ADN, se bazează pe două principii: hibridare cu sonde sau amplificare prin reacția PCR. Polimorfismul bazat pe numărul de repetiții în tandem, a motivelor de tip satelit, este azi cel mai utilizat în studiul diversității genetice a raselor de animale și a soiurilor de plante (Vlaic A. și colab., 1997).

AFLP este o tehnică bazată pe punerea în evidență a polimorfismelor tot la nivelul situsurilor de restricție. Această tehnică a fost descrisă de Vos și colab. (1995) și se bazează pe amplificarea selectivă, cu ajutorul PCR, a unei categorii de fragmente obținute printr-o restricție particulară, care utilizează 2 enzime de restricție și adaptori, marele avantaj al metodei este acela că nu necesită informații preliminare despre genom (Carșai Teodora și col., 2010).

Marele avantaj al tehnicii AFLP este sensibilitatea în detectarea polimorfismului la nivelul genomului total.

Tehnica AFLP a devenit un standard molecular pentru clasificarea în sistematică a populațiilor distincte genetic. Polimorfismele identificate în ADN sunt transmise mendelian și utilizate apoi pentru genotipizare, identificarea markerilor moleculari și cartografierea genelor (Coșier Viorica și colab., 2007).

În managementul resurselor genetice, tehnica poate fi utilizată pentru:

studii de diversitate, respectiv pentru măsurarea variațiilor inter sau intrapopulaționale

pentru stabilirea distanței genetice

încadrarea taxonomică a unor entități distincte genetic.

pentru stabilirea hărților genetice.

Tehnicile MAAP

Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) face parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), alături de tehnicile DAF (Amplification Fingerprinting ) și AP-PCR (Arbitrary Primed PCR).

Lungimea primerului utilizat, este un criteriu principal de distincție între cele trei tehnici descrise anterior; astfel că pentru RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) sunt primerii decameri (9-10 pb), pentru DAF (DNA Amplification Fingerprint) primerii au 5-15 pb, iar pentru AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) primerii au lungimea de18-32 pb. Tehnicile AP-PCR și DAF pot releva numeroase benzi (până la 100) în timp ce RAPD-ul produce un număr mic de benzi, până la 10 (Welsh J. și colab., 1991, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

Avantajele tehnicilor MAAP constau în: simplitate, rapiditate, costuri scăzute, nu necesită cunoștințe anterioare despre genom, nu necesită digestie sau transfer pe o membrană, marcare radioactivă sau fluorescentă, cu ajutorul lor fiind generați markeri moleculari utilizând markerii deja disponibili (Welsh J. și colab., 1990).

Tehnica RAPD se bazează pe determinarea polimorfismului la nivel alelic în ceea ce privește producerea unor produși de amplificare sau lipsa lor, în urma utilizării unui primer oligonucleotidic, arbitrar, într-o poziție care să-i permită realizarea amplificării. Această variantă a tehnicii PCR nu necesită clonarea sau secvențierea ADN și poate detecta mai mulți loci simultan.

Tehnica RAPD fiind rapidă, poate fi utilizată în hibridări interspecifice, introgresia genelor, identificarea clonelor, descoperirea markerilor sex-linkați, măsurarea distanțelor genetice la plante, animale și om.

Tehnica DAF Caetano-Anolles și colab. (1991, citat de Carșai Teodora și col., 2010), au introdus o metodă numită DNA Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au folosit primeri scurți, cel mai adesea de lungime între 5 – 8 nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumiți parametrii PCR, folosind pași atât de joasă cât și de înaltă stringență, precum și un program al ciclurilor cu numai două temperaturi în loc de standardul cu trei. Produșii de amplificare au fost separați prin electroforeză în gel de poliacrilamidă și vizualizați prin colorare cu argint. Nivelul complexității profilului benzilor poate fi predeterminat prin manipularea condițiilor de reacție. Ca urmare a apariției mai multor variante de amprentare a întregului genom, bazate pe PCR cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles și colab., au propus în (1994), denumirea acestor metode înrudite cu numele generic de Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP).

Totuși, datorită simplității și utilității, numele și metoda originală RAPD, cunoaște cea mai largă răspândire. Această tehnică permite amplificarea unui număr mai mare de fragmente de dimensiuni foarte mici, care ulterior vor fi separate într-un gel de poliacrilamidă.

Tehnica AP-PCR

Tehnica AP-PCR utilizează primeri de 18 pb și a fost dezvoltată și utilizată ca metodă reprezentativă ( Sean, M. și colab., 2000).

Dezavantajele tehnicii constau în reproductibilitatea scăzută, iar schimbările de scurtă durată a condițiilor de reacție pot cauza benzi nereproductibile. O singură procedură cuprinde trei etape importante.

Tehnica RT-PCR

Această tehnică este tot o variantă a tehnicii PCR, în care amplificarea pornește de la ARN mesager (ARNm). În prezența enzimei revers transcriptaza, ARNm devine matriță pentru sinteza ADN complementar(ADNc), după care procesul de amplificare decurge în mod normal. Cuantificarea expresiei genice se bazează pe presupunerea că se păstrează o anumită proporționalitate între cantitatea de ADN de la începutul reacției și cantitatea produsului de amplificare (Park D.J și colab., 2004, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

Trebuie subliniat faptul că aplicarea reacției PCR la moleculele de ARN necesită o modificarea a reacției PCR în prima etapă. Pentru că molecula de ARN nu poate fi copiată în prezența Taq polimerazei, această etapă este catalizată de revers transcriptază, enzimă în prezența căreia este sintetizată molecula de ADN de pe matrița de ARN. Copia de ADN este apoi amplificată în prezența Taq polimerazei. Descoperirea enzimelor termostabile (ex. ADN-polimeraza -T obținută din bacteria Thermus thermophilus) cu ajutorul cărora pot fi obținute copii termostabile de ADN atât de pe matrițe de ADN cât și de pe matrițe de ARN face posibilă aplicarea RT – PCR în condițiile în care va fi necesară o singură reacție în prezența unei singure enzime (Brown T.A. și colab., 2002, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

În managementul resurselor genetice, metoda poate fi utilizată în stabilirea distanței genetice dintre populații, întrucât ea permite detectarea cu maximum de acuratețe a unor gene exprimate în cantități reduse.

Tehnica microsateliților SSR

La organismele procariote și eucariote o parte din ADN genomic este reprezentat de secvențe de ADN înalt repetitive, de complexitate mică și considerate noninformaționale.

Microsateliții sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt secvențe înalt repetate, care conțin motive de 2 – 5 perechi de baze, repetate în tandem și care flanchează o secvență unică de ADN. Se pare că aceștia sunt rezultatul crossing-overului inegal. Tehnica PCR este aceea care va fi utilizată pentru relevarea profilurilor individuale, furnizând markeri specifici de locus ce se transmit codominant. Un microsatelit nu este specific la un locus particular, dar regiunile flancatoare sunt specifice (Dakin E. și colab., 2004, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

Acești markeri bazați pe PCR sunt înalt polimorfici. Polimorfismul este determinat de diferențele existente în lungimea produșilor de amplificare. Acest polimorfism va duce la evidențierea mai multor alele la acest locus. Fiind o regiune înalt polimorfică se pot distinge foarte multe alele, dar care pot determina diferențele chiar și între indivizi înrudiți. Motivele repetate în tandem pot fi utilizate și ca sonde, dirijate către ADN genomic, unde să-și găsească regiunile complementare (Carșai Teodora și col., 2010).

Polimorfismul microsateliților reflectă moștenirea genetică și permite detectarea diferențelor între diferiți indivizi. Prin urmare, în managementul resurselor genetice, tehnica poate fi folosită cu succes pentru determinarea paternității, a gradului de înrudire (asemănare genetică) dintre indivizi, a nivelului consangvinizării într-o populație.

Tehnica EST

Această reacție bazată pe PCR necesită atât clonare cât și informații despre secvență, utilizând informațiile proiectului de secvențiere a genelor, când sunt generate clone de ADNc. Această secvență este folosită pentru designul unor primeri de 18 – 20 pb cu care se vor amplifica secvențe învecinate.

Markerul EST este de obicei detectat după mărime în produsul de amplificare și este un marker codominant (Denise E .A. și colab., 2003, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

În managementul resurselor genetice, tehnica este des utilizată, mai ales de companiile de ameliorare mari întrucât este extrem de costisitoare, în special pentru detectarea QTL (gene asociate cu locii caracterelor cantitative). De asemenea, tehnica poate fi folosită în cartarea genetică și stabilirea distanței genetice dintre populații.

Tehnica SCAR

În cadrul acestei tehnici, fragmentele de ADN amplificate prin tehnica PCR-RAPD, sunt clonate și pe baza lor se construiesc primeri specifici care vor avea lungime mai mare decât primerii RAPD.

Prin utilizarea primerilor SCAR în PCR, nu se rezolvă problema reproductibilității reduse, deseori întâmpinată de markerii RAPD. Obținerea unui marker codominant poate deveni un avantaj în plus, în convertirea markerilor RAPD în markeri SCAR (Giovannelli, J. și colab.,2002, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

Tehnica SNP

Această tehnică se caracterizează prin detectarea mutațiilor punctiforme la un locus particular, mutații determinate de substituția unei singure nucleotide cu alta. Prin această tehnică pot fi evidențiate diferențele de secvență existente între alele, cum ar fi substituția A în T de exemplu AAGGCTAA în ATGGCTAA (Jiang , R. și colab., 2004, citați de Carșai Teodora și col., 2010). Pentru ca o variație de secvență să fie considerată SNP ea trebuie să apară cu o frecvență de până în 1% în populație.

Tehnica este foarte utilizată în managementul resurselor genetice, în selecția asistată de markeri (MAS).

Tehnica STS

Această tehnică bazată pe PCR, detectează o secvență unică într-un punct definit din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertiți markerii genetici RAPD în markeri STS, pentru același locus. Tehnica nu necesită clonare dacă există informații anterioare despre secvență, pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 – 20 pb, poate fi conceput după secvența fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a amplifica ulterior fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi secvența unui produs PCR – RAPD sau a sondelor RFLP).

Polimorfismul este în general detectat ca o diferență de mărime în produsul de amplificare STS față de produsul RAPD, de la același locus. Dacă nu există nici o diferență de mărime, se apelează la restricția enzimatică pentru a tăia produșii de amplificare și pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi astfel detectat un polimorfism de câteva nucleotide. Din moment ce primerii STS sunt mai lungi decât primerii RAPD și bazați pe o secvență specifică, această metodă detectează polimorfismul de la același locus, fiind potrivită pentru studii de cartare genică. Dezavantajul metodei este că proiectarea și crearea primerilor poate implica o investiție importantă ( Roach J. C. și colab., 2000, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

Tehnica ARMS-PCR

O modificare a metodei PCR, care permite detecția mutațiilor punctiforme cunoscute, prin amplificare cu primeri specifici de alelă, este metoda ARMS-PCR. Aceasta este o metodă care nu implică utilizarea izotopilor radioactivi, iar genotipizarea este posibilă prin simpla examinare a migrării produsului PCR prin elecroforeză în gel de agaroză. Tehnica este cunoscută ca detectarea mutațiilor prin amplificare refractară, descrisă pentru prima dată de Newton C.R. și colab. (1989, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

În managementul resurselro genetice, metoda popate fi utilizată în stabilirea distanței genetice dintre populații, întrucât cu ajutorul ei pot fi detectate diferite variații în secvența de ADN (mutații punctiforme).

4.2.3. Tehnica SSCP

Această tehnică este utilă în detectarea polimorfismului determinat de cel puțin o nucleotidă. Evidențierea polimorfismului se face în timpul electroforezei în gel de poliacrilamidă. Acest polimorfism se bazează pe diferențele de conformație ale unei singure catene (mutantă) ce diferă de cealaltă într-un singur punct, datorită unei substituții, deleții sau inserții (Barroso , A. și colab., 1998, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

În anumite condiții, acizii nucleici dintr-o catenă de ADN formează în soluție o structură secundară. Structura secundară depinde de compoziția în baze, structură care poate fi alterată și de substituția unei singure nucleotide. Această diferență va determina o mobilitate electroforetică diferită în condițiile unui gel nedenaturat (gel de poliacrilamidă nedenaturat). Vizualizarea fragmentelor ce urmează a fi detectate se face după o prealabilă colorare cu argint sau după marcarea radioactivă (Abba , M.C. și colab.,2001, citați de Carșai Teodora și col., 2010).

4.2.4. Tehnici bazate pe secvențiere

Secvențierea ADN poate fi făcută prin procedee chimice (metoda Maxam și Gilbert) sau cu ajutorul terminatorilor de lanț (metoda dideoxi sau Sanger), aceasta din urma fiind astăzi utilizată mai mult. Prima metodă a fost pusă la punct de către Maxam si Gilbert (1977) și este de fapt o clivare chimică. Cea de-a doua, metoda dideoxi sau Sanger, a fost pusă la punct în același an de către Sanger și se bazează pe întreruperea controlată a sintezei enzimatice a ADN, amplificat prin PCR (Carșai Teodora și col., 2010).

O altă tehnică este secvențierea automată, în cazul căreia, catena de ADN care va intra în reacția de secvențiere depinde de primerul utilizat, putând fi supusă secvențierii atât catena sens cât și cea antisens. În studiile de secvențiere a genelor, pentru precizia rezultatelor obținute sau atunci când sunt căutate mutații punctiforme, se recomandă secvențierea ambelor catene și compararea rezultatelor obținute. În acest caz, este necesară cunoașterea ambilor primeri, care să inițieze sinteza genei ce urmează să fie descifrată (Carșai Teodora și col., 2010).

Reacția de secvențiere începe întotdeauna după ce ADN supus secvențierii a fost inițial amplificat prin PCR, purificat și cuantificat (Coșier Viorica, 2007).

În managementul resurselor genetice, tehnicile de secvențiere pot fi utilizate pentru cartarea genetică.

4.3. Stadiul actual al cunoașterii privind utilizarea tehnicilor de biologie moleculară în managementul resurselor genetice

4.3.1. Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară la taurine

Taurinele sunt o resursă genetică ce joacă un rol important în asigurarea securității alimentare a omenirii. Populațiile de taurine au constituit subiectul unor programe de ameliorare ce au urmărit îmbunătățirea genetică continuă în direcția caracterelor asociate cu producțiile de lapte și carne. Acest lucru a dus la formarea unor rase înalt specializate însă, în același timp, a determinat și pierderea unor resurse genetice valoroase sau diminuarea mărimii unor rase locale până la un nivel ce le-a impus acestora un status vulnerabil sau în pericol.

În această ordine de idei, utilizarea tehnicilor de biologie moleculară la taurine se face, ca și în cazul altor specii importante economic, în vederea determinării originii (paternității), evaluării diversității (înrudirea populațiilor între ele), stabilire QTL pentru selecția asistată de markeri, asigurarea trasabilității produselor, etc.

În decursul timpului au fost efectuate o multitudine de cercetări ce vin să confirme utilitatea tehnicilor de biologie moleculară în managementul resurselor genetice taurine. Astfel au fost publicate studii referitoare la markerii microsateliți pe taurinele europene (MacHugh, 1998; Del Bo și col., 2001; Canon și col., 2001; Mateus și col., 2004), pa taurinele africane (Ibeagha-Awemu și Erhardt, 2005) și cele asiatice (Kim și col., 2002; Mao și col., 2008).

Posibilitatea utilizării markerilor moleculari ADN, în special markerii microsateliți și SNP pentru identificarea indivizilor și stabilirea paternității a fost, de asemenea, intens studiată (Koskinen, 2003; Liron și col., 2004; Ayres, 2005; Heaton și col., 2005). Puține lucrări sunt însă dedicate utilizării acestor tehnici penrtu asigurarea trasabilității produselor provenite de la această specie. În vederea atingerii acestui obiectv, au fost deja propuse o serie de metode de lucru, cu o abordare fie deterministică, fie probabilistică (Maudet și col., 2002; Ciampolini și col., 2006; Dalvit și col., 2008b). Abordarea deterministică se bazează pe detectarea unor alele specifice unei anumite rase, în general asociate cu culoarea robei. Până în prezent, au fost stabilite o serie de astfel de alele specifice ce permit discriminarea în mozaicul raselor (Maudet și col., 2002; Casellas și col., 2004). Abordarea probabilistică utilizează adesea markerii microsateliți și are costuri asociate destul de mari, ca urmare a numărului mare de markeri ce trebuie investigați pentru o discriminare corectă (Ruzzante și col., 2001). Mergând pe această idee, Negrini și col. (2008) elaborează o cercetare referitoare la utilizarea SNP în trasabilitatea produselor, rezultatele obținute confirmând viabilitatea utilizării SNP în stabiliraea apartenenței indivizilor la un anumit grup genetic.

Pentru inventarierea resurselor genetice, studierea variabilității intra și interpopulaționale (diversitatea genetică) prezintă importanță capitală în stabilirea statusului de risc și a stabilirii strategiilor de ameliorare, prezervare sau conservare activă, după caz. În acest sens, Georgescu și col. (2009) realizează prima cercetare din România bazată pe analiza markerilor microsateliți, în vederea stabilirii diversității genetice și a relațiilor filogenetice, pe cinci rase de taurine: Sura de Stepă, Bălțată Românească, Bălțată cu Negru Românească, Bruna de Maramureș și Montbeliarde. Pe lângă alți parametri importanți obținuți (variabilitate, consangvinizare, HWE), în studiu se indică foarte clar faptul că Sura de Stepă (rasă locală românească) este perfect distinctă de alte populații de taurine. Montbeliard și Bălțata Românească au o origine comună, făcând parte din tulpina Simmnetal (cea mai mică distanță genetică). Bruna și BNR au, de asemenea, origine comună.

Rezultatele obținute sunt extrem de interesante. După cum este binecunoscut, Bălțata Românească provine din Sura de Stepă în urma unui proces de aborbție cu Simmental. Faptul că rezultatele indică o distanță genetică mare între cele două rase, confirmă faptul că genofondul Surei de Stepă a fost înlocuit în totalitate de Simmental (în zonele unde a acționat absorbția), iar singurul nucleu existent astăzi de Sură de Stepă (SCDB Dancu, Iași) trebuie obligatoriu prezervat prin programe coerente. În aceeași ordine de idei, Bruna de Maramureș are la bază tot Sura de Stepă supusă absorbției cu rasa Brună de Austria (provine din Bruna Alpină, Elveția – Brună Schwitz).

4.3.2. Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară la bivoli

Bivolii fac parte din grupa speciilor foarte importante din punct de vedere economic, în multe țări asiatice și o parte din Europa. Exploatați pentru producțiile de carne și lapte, odată cu creșterea cerinței pentru aceste produse, ei au devenit obiect al programelor de ameliorare genetică. În vederea inventarierii resurselor genetice, respectiv pentru identificarea diferitelor grupe genetice (rase) la bivolul de mlaștină, au fost elaborate o serie de studii pe ADN mitocondrial, utilizând tehnica PCR-RFLP. Astfel, o serie de studii (Bhat și col., 1990; Amano și col., 1994; Tanaka și col., 1995) au pus în evidență existența unor diferențe între rasele de bivoli.

De asemenea, o serie de cercetări au fost efectuate pe populațiile de bivoli de mlaștină referitoare la variabilitatea ADN mitocondrial, bucla D. Aceasta este o regiune non-informațională, dar foarte importantă din punct de vedere funcțional și este cea mai variabilă regiune din ADN-ul mitocondrial de la mamifere, chiar la nivel intraspecific. Acest aspect este extrem de util în studiile privind variabilitatea între populațiile din cadrul aceleiași specii (Upholt și David, 1977; Simonsen și col., 1998; Kierstein și col., 2004). Srisakwattana K și col. (2007) realizează o astfel de cercetare pe exemplare de bivol de mlaștină tailandez, utilizând tehnica PCR-RFLP pentru a analiza variabilitatea în populația de bivoli. Au fost utilizate trei sisteme de restricție (Ava II, Bam H I, Hae III) pe 49 de probe. Rezultatele au pus în evidență existența mai multor grupe genetice (rase) în cadrul bivolului de rasă tailandez

În vederea elaborării unor strategii de ameliorare coerente, pentru utilizarea optimă și eventual conservarea resurselor genetice, este esențial a înțelege structura genetică și gradul de înrudire dintre rasele de bivoli existente. Pentru a atinge acest deziderat, studierea structurii genetice a populațiilor de bubaline cu ajutorul microsateliților devine o prioritate (Goncalves și col., 2006). Aceștia sunt markeri genetici (moleculari) foarte buni pentru cartarea genomului, testarea paternității, genetica populațiilor, conservarea resurselor genetice (Jarne și Lagoda, 1996). În acest context, Venancio și col. (2007) au studiat și introdus în baza de date 6 astfel de microsateliți, utilizând pentru izolarea acestora metoda hibridizării selective la bivolul de râu.

În dorința sa de îmbunătățire genetică a caracterelor asociate producției de lapte și carne, numeroase studii au fost orientate pe identificarea SNP (single nucleotide polymorphism). Acești markeri sunt foarte frecvenți de-a lungul genomului și identificarea este primul pas în studiile de asociere a lor cu unele caractere de interes economic și utilizarea ca markeri moleculari în selecția reproducătorilor.

Numeroase studii efectuate pe populații de bovine au raportat asocieri între SNP și caractere importante economic. Astfel, Buchanan și col. (2002), Schenkel și col. (2005) a prezentat asocieri între SNP la gena ce determină sinteza leptinei și caractere legate de calitatea carcasei și a cărnii. Leptina este o proteină implicată în reglajul consumului de hrană, metabolismului lipidelor, balanța energetică a organismului, reproducție și hematopoieză. La bovine (taurine și bubaline) gena leptinei poate fi considerată un potențial QTL ce influențează câteva caractere de producție și reproducție (Buchanan și col., 2003; Liefers și col., 2002; Vallinoto și col., 2004; Orru și col., 2007).

AMPK (5'-activated protein kinase), numită și PRKA este un complex proteic heterotrimeric ce reglează metabolismul energetic celular în răspunsul stresului nutrițional la mamifere (Carling, 2004). Lungimea totală a genei AMPK este de 6500 perechi de baze. Consecință a extinderii așezărilor urbane, disponibilul de teren necesar hrănirii animalelor descrește continuu și, ca urmare, devine necesară o selecție a animalelor în direcția rezistenței la stresul nutrițional. Fosfolilarea este catalizată de o kinază din amonte, numită AMPKK (AMP-activated protein kinase kinase), care este direct activată de AMP (Hawley și col., 1996) sau de legarea AMP de AMPK și AMPKK (Hardie și col., 1998). AMPK este un complex enzimatic heterotrimeric compus din subunități α (α1, α2, α3), β (β1, β2, β3) și y (y1, y2, y3) ce joacă un rol major în protecția celulară la pierderea de ATP. Diferitele combinații depind de tipul țesutului și au diferite niveluri de activitate (Kemp și col., 1999). În această ordine de idei, Babar și col. (2007) comunică o evaluare efectuată la bivoli din rasele Nili, Ravi și Nili Ravi din Pakistan. Ei au prezentat asocieri între SNP la gena PRKAG3 și conținutul de glicogen muscular ce influențează calitatea cărnii (influențează procesele de maturare a cărnii postmortem). SNP identificate la gena AMPK pot fi utilizate ca markeri pentru selecția în vederea utilizării efeiciente a energiei.

K-cazeina este o proteina care formeaza în mare masura brânza si reprezinta 12% din totalul cazeinei care formează complexul cazeinei secretată de celulele epiteliale ale ugerului. Aceasta proteină influențează procesul de coagulare al laptelui și continutul proteic al acestuia. K-cazeina este o proteină din lapte ce determină mărimea și funcțiile specifice ale miceliilor din lapte (Gutierrez și col., 1996). Aceste micelii sporesc solubilitatea mineralelor și facilitează transferul nutrienților de la mamă la produsul de concepție.

Această proteină a fost studiată cu precădere la taurinele de lapte. La acestea au fost descoperite mai multe alele care codifică forme diferite ale k-cazeinei. Dintre acestea, alelele A și B sunt întâlnite cu o frecvență mai mare în populațiile de bovine. Forma sau alela B a genei k-cazeină este asociata cu un lapte de calitate superioară, deoarece conținutul său în cazeină este mult mai mare și prezintă proprietăți de coagulare mult mai bune decat o poate face alela A. Timpul de agregare al miceliilor (timpul de coagulare sau închegare a laptelui) este mai scurt, din care cauză și frăgezimea și volumul coagulului sunt mai bune. În prezent se cunoaște ca vacile care poseda alela B a k-cazeinei, în doza dublă (genotip homozigot BB) produc un lapte de calitate superioară.

K-cazeina are o legătură peptidică labilă care este scindată la nivelul intestinului sub acțiunea reninei pentru a produce o peptidă insolubilă (para k-cazeina sau PKC), precum și o glicopeptidă hidrofilică solubilă numită caseino-macropeptidă sau CMP (Qian și col., 1995). Gena care determină sinteza k-cazeinei este numită CSN3. La bivolul de apă, gena CSN3 a fost cartată și plasată la nivelul cromozomului 7 (Iannuzzi și col., 2003).

Pentru k-cazeină, Masina și col. (2007) au determinat secvența de nucleotide pentru gena CSN3, la bivolul de râu. Au fost secvențiate 2 clone suprapuse din baza de date ale bivolului de râu. Secvența totală a fost constituită din 14700 nucleotide conținute de întreaga CSN3, la care s-au adăugat 1057 nucleotide din amonte și 476 din aval. Gena este organizată în 5 exoni variind în lungime de la 33 nucleotide (exon 3) la 517 nucleotide (exon 4) și 4 introni variind în lungime de la 1862 nucleotide (intron 4) la 5907 nucleotide (intron 2). Mutațiile în acești exoni sunt responsabile de diferențele calitative și cantitative ale expresiei genice la vaci și capre (Di Stasio și col., 2000; Chiatti și col., 2005). Autorii cercetării au pus în evidență o omologie perfectă (100%) în secvențierea exonilor cu k-casein mRNA de la bubaline (secvențiat în întregime – Mukesh și col., 2006) și o omologie variind între 94,8% și 100% cu exonii CSN3 de la taurine. La bivolul de apă, intronul 3 conține secvențe repetate de ADN extra, cu 103 nucleotide mai mult decât la vaci. Între bivoli și vaci s-a evidențiat o omologie de 94,3% la acest nivel. Astfel, prezența sau absența acestei inserții poate fi utilizată în trasabilitatea laptelui provenit de la cele două specii.

Laptele este un aliment important ca urmare a conținutului său în acid linoleic conjugat (CLA), un acid gras sintetizat în glanda mamară sub acțiunea unei enzime numită Stearoyl CoA-Desaturază (SCD). Acest acid se pare că ar avea ceva efecte pozitive în prevenția și tratamentul unor boli precum cancer, diabet, HTA, obezitate (Park și col., 2000; Miller și Stanton, 2001; Agnieska și Ntambi, 2005). Acest acid gras este compus din izomeri cu 18 atomi de carbon și două duble legături. Izomerii cis-9 trans-11CLA și trans-10 cis-12 CLA se pare că au cea mai mare activitate biologică (Pariza, 2000). SCD este responsabilă de convertirea acidului vacenic din circulația sangvină în CLA, la nivelul glandei mamare (Griinari și col., 2000). Diverse studii au arătat că bivoli întreținuți în aceleași condiții de hrănire au diferite neveluri de CLA în lapte, unul din motive fiind, se pare, nivelul diferit de SCD din glanda mamară (Fernandes, 2004). Camargo și col. (2007) explică aceste diferențe prin ipoteza existenței unui polimorfism al genei ce determină sinteza SCD care, modificând structura enzimei, determină și modificări în funcții. Astfel, autorii au încercat să identifice posibile polimorfisme în gena SCD la bivolii Murah, utilizând tehnica PCR-RFLP și să determine posibile corelații cu cantitatea de CLA din lapte (în scopul selecției ulterioare a animalelor în această direcție). Din păcate, probele prelevate de la 55 de femele în lactație nu au permis identificarea unui polimorfism în regiunea genei ce determină sinteza SCD și nici o corelație cu conținutul în CLA.

În aceeași ordine de idei, Lima și col. (2007) au încercat caracterizarea genetică a regiunii SCD la bubaline, utilizând tehnici de secvențiere. Analiza comparativă în BLASTn (BLASTnucleotide to nucleotide – NCBI) au arătat similarități cuprinse între 85% și 97% între secvențele identificate la bubaline și cele de la om, șoarece, șobolan, porci, taurine, caprine și ovine. Secvențele obținute au fost introduse în GenBank.

Referitor la analiza transcripției genelor ce codifică SCD, comparativ cu alte specii, la bivoli există puține cercetări. La taurine au fost identificate 8 SNP și unul dintre ele, (T→C) la nucleotida 231 din exonul 5, este responsabil de schimbarea Val→Ala (Taniguchi și col., 2004). Alela C a fost asociată cu cu un conținut ridicat de acizi mononesaturați în carcasă și pozitiv corelat cu un index de desaturare mare în lapte (Medrano, 2002). Această stare de fapt i-a determinat pe Pauciullo și col. (2007) să studieze această problemă la bivolul de râu mediteranean, pe baza unor probe extrase de la femele aflate în lactație, comparabile ca vârstă, tip de alimentație, întreținere și stadiu al lactației. Analizele electroforetice ale produselor obținute prin RT-PCR și secvențierea ulterioară au arătat existența a cel puțin 5 populații diferite de ARNm. Populația cea mai bine reprezentată este corect asamblată (aprox. 1300 perechi de baze), urmată de una care lipsită de aprox. 750 perechi de baze, corespunzătoare exonilor 3, 4 și 5 și pațial exonilor 2 și 6.

4.3.3. Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară la cabaline

Cabalinele reprezintă o resursă genetică extrem de importantă la nivel mondial. Calul a avut și are un rol deosebit din punct de vedere istoric, etno-cultural, social și economic.

Ca urmare a modului de formare și evoluției populațiilor de cabaline, acestea sunt, în prezent, entități biologice foarte vulnerabile, dacă ne referim la gradul mare de consagvinizare acumulat (de multe ori indus deliberat) și ținut sub control cu destul de multă dificultate.

În general, crescătorii de cabaline (indiferent de forma de proprietate) oferă date privind evidența originii diferitelor organisme coordonatoare ale activității (societăților de creștere, agenții guvernamentale, etc.) care le introduc în registre (Stud-book) pentru a genera pedigreele.

Așa cum am arătat în subcapitolul 4.1, înregistrările originii produșilor sau înscrierile în registrele genealogice pot fi supuse erorii umane sau fraudei. Pentru înlăturarea acestora, sau în caz de litigii, în creșterea și exploatarea cabalinelor utilizarea tehnicilor de biologie moleculară devine o chestiune de bun simț, ce ar trebui promovată la rang de rutină.

Problemele pe care utilizarea tehnicilor de biologie moleculară dorește să le elucideze în cazul populațiilor de cabaline se referă la stabilirea originii raselor, a gradului lor de înrudire, construirea cladogramelor (arbore filogenetic), stabilirea paternității, evaluarea gradului de consangvinizare, etc., prin utilizarea, în general, a markerilor microsateliți. De asemenea, tehnicile de biologie moleculară au aplicabilitate în stabilirea diagnosticului unor boli extrem de grave la această specie. Un exemplu în acest sens este arterita virală ecvină, o boală ce se transmite prin actul montei. Moartea este foarte rară la adulți, însă iepele infectate pot avorta, sau mânjii pot suferi moarte rapidă prin pneumonii su enterite. Boala a crescut mult în prevalență, consecință a schimbului de reproducători sau material seminal. Diagnosticul se poate pune prin evidențierea acidului nucleic viral în probele de țesut recoltate de la animalul viu sau în urma necropsiei, prin RT-PCR. Vom încerca o scurtă prezentare a rezultateor unor astfel de cercetări.

Conservarea resurselor genetice locale reprezintă, în acest moment, o prioritate. Multe rase locale au suferit în decursul timpului încrucișări cu diferite rase mai performante, sau a fost subiectul unor procese de absorbție. Pierderea resurselor genetice sau a variabilității acestora fiind un proces ireversibil, numeroase cercetări au fost orientate în direcția evaluării statusului populațiilor locale, cu referință la ponderea infuziei, gradul de înrudire cu alte populații, distanța genetică față de ele, etc.

Calul de Pantaneiro este o rasă locală din Brazilia, foarte bine adaptată la condițiile din zonele inundabile, utilizat la transportul fermierilor la câmp, sau la condusul vitelor la pășune. Remarcabil la această rasă este rezistența genetică la anemia infecțioasă. Din păcate, așa cum s-a întâmplat cu multe populații locale, această rasă a suferit diferite infuzii, în special cu rasa Arabă și Pur Sânge de Galop, cu scopul îmbunătățirii conformației și taliei (Balieiro, 1971). Aceste infuzii au determinat scăderea drastică a efectivelor, consecință procesului de absorbție și a pierderii rezistenței genetice la anemia infecțioasă. În prezent, există un program de conservare a acestei populații elaborat de asociația de crescători ai rasei (Santos, 2001).

Caracterizarea genetică este primul pas în conservarea resurselor genetice, cu consecințe în stabilirea strategiilor de creștere. În acest sens, Cothran și col. (1998), utilizând markeri biochimici, au observat că populația de Pantaneira nu a fost influențată de încrucișările recente cu alte rase. În antiteză însă, utilizând tehnici de biologie moleculară, Miserani și col. (2002) au pus în evidență o variabilitate fenotipică mare între indivizii proveniți din diferite locații. Sereno (2002), utilizând analiza markerilor microsateliți, a găsit de asemenea un grad mare de variabilitate la această populație și o asemănare genetică mare cu calul de origine iberică. Andrea Alves de Egito și col. (2007), mergând pe aceeași idee, au determinat prin RAPD-PCR și utilizând tehnici de taxonomie numerică, gradul de asemănare genetică a calului de Pantaneiro cu rasa Arabă, Pur Sânge Englez, Mangalarga Marchador. Rezultatele au pus în evidență existența unei distanețe genetice mari între populația locală și rasa Arabă, însă o înrudire mare cu Mangalarga Marchador.

Calul Caspian (Caspian Arabian horse – pony breed) este un cal cu un temperament extraordinar, cu mișcări elegante, destul de docil, calități ce-l fac foarte apreciat pentru spectacolele cu ponei. Se pare că el este rezultatul hibridizării naturale dintre Equus caballus și Equus prezwalskii (Hatami și Pandit, 1979). Seyedabadi H. și col. (2006) au realizat o cercetare cu scopul de a verifica corectitudinea datelor înscrise în registrul genealogic al rasei, utilizând 7 markeri microsateliți. Recomandările Societății Internaționale de Genetică Animală (ISAG) precizează faptul că un individ este eliminat din registrul genealogic în cazul existenței unei incompatibilități la cel puțin doi markeri. Rezultatele cercetării au pus în evidență faptul că nu există probleme de origine incertă la Calul Caspian. Studii similare au mai fost întreprinse de Cho (2002) la Pur Sânge Englez, Lee și Cho (2006) la PSE din Coreea. De asemenea, Khanshour și col. (2013), analizând acuratețea informațiilor din pedigreele calului Arab din Siria și gradul de consangvinizare, pe baza informațiilor provenite de la 16 markeri microsateliți (5,69 alele per locus), au constatat un grad scăzut de consangvinizare (pierderi nesemnificative ale heterozigoției, ca urmare a metodei de creștere pe linii) și acuratețe mare a datelor din registrul genealogic.

Marletta și col. (2006) au analizat diversitatea genetică și au determinat gradul de înrudire dintre câteva rase de cabaline din zona mediteraneană, utilizând markerii microsateliți. Probele au provenit de la 7 rase spaniole, trei italiene și PSE din Spania. Numărul total de animale a fost de 682 capete, în medie 62 indivizi per rasă, markerii microsateliți au fost furnizați de 128 alele, în medie 10,7 alele per locus. Datele moleculare au fost utilizate în relațiile statistice clasice de determinare a gradului de înrudire, de consangvinizare, de origine comună (coancestry). Rezultatele au arătat o diversitate genetică mare intrarasă (lipsa strămoșilor remarcabili) un coeficient de origine comună ridicat, rasa Losino fiind cea care a contribuit cel mai mult la formarea populațiilor analizate. Studii similare au fost efectuate de Achmann și col. (2004) la rasa Lipițan pe probe extrase din 7 herghelii naționale, de Tozaki și col. (2003) care au analizat 11 rase asiatice și gradul lor de asemănare genetică (origine coomună) cu populații europene, Cunningham și col. (2001) la PSE, Cothran și col. (1998), Nozawa și col. (1998), Canon și col. (2000), Juras și col. (2003), Aberle și col. (2004), Solis și col. ( 2005), etc.

La rasele locale din Portugalia (Lusitano, Sorraia și Garrano), Luis și col. (2006) analizează diversitatea genetică și gradul de asemănare genetică dintre ele, utilizând polimorfismul a 17 proteine și 12 markeri microsateliți. Cercetările au evidențiat o variabilitate genetică mare la Garrano și Luisitano, însă un nivel al acesteia foarte scăzut la Sorraia. Informațiile furnizate de tehnicile de biologie moleculară au permis încadrarea acesteia din urmă în grupa populațiilor cu status în pericol.

Rasa Huțul este singura rasă locală de cabaline din România, specializată pentru port samar, perfect adaptată la condițiile montane. Încă din 1979, FAO a inclus-o în grupa populațiilor protejate. La această rasă, Georgescu și col. (2008) întreprind o cercetare pentru stabilirea distanței genetice dintre Huțul și PSE, Arab și CSR. Rezultatele obținute indică diferențierea clară a acestora, iar rasa Huțul se delimitează net de celelalte, neavând origine comună.

4.4. Propuneri privind utilizarea tehnicilor de biologie moleculară în elaborarea analizei populației Furioso North-Star

Așa cum am prezentat în subcapitolul 4.1, analizele genealogice prezintă o serie de neajunsuri, care sunt generate de limitările și perisabilitatea informațiilor provenite din registrele genalogice. Fără a le minimiza importanța, ele fiind utilizate în prezent peste tot în lume în caracterizarea populațiilor de cabaline, informațiile furnizate trebuie completate cu cele provenite din utilizarea tehnicilor de biologie moleculară.

La populația Furioso North Star din herghelia Rușețu, informațiile care trebuie să completeze analiza genealogică și problemele care trebuie elucidate se referă la:

certificarea relațiilor de înrudire dintre indivizii ce formează "turma de bază": armăsarii pepinieri și iepele mamă;

certificarea originii fiecărui produs;

stabilirea relațiilor de înrudire (implicit distanța genetică) cu alte rase de cabaline, în special: Gidran, Nonius și Pur Sânge Englez;

stabilirea înrudirii efectivului matcă cu reproducători remarcabili;

stabilirea gradului de aemănare genetică cu alte crescătorii de Furioso North-Star, pentru a stabili dacă populația din România are un drum evolutiv propriu, distict de cel al altor populații;

completarea informațiilor referitoare la consangvinizarea existentă;

evaluarea statusului de sănătate a populației; etc.

O analiză completă, bazată pe studiul pedigreelor și utilizarea tehnicilor de biologie moleculară, poate oferi informații complete despre trecutul populației, despre posibilitățile de evoluție în continuare ale acesteia, iar pe baza lor pot fi emise strategii coerente legate de managementul resurselor genetice reprezentate de această rasă.

De asemenea, tehnicile de biologie moleculară pot fi utilizate la cabaline pentru depistarea indivizilor purtători ai unor boli cu grad mare de difuzibilitate și care generează pierderi economice importante (anemie infecțioasă, arterită virală, etc.), precum și depistarea candidaților la intrarea în matcă eventual purtători ai unor boli ereditare, chestiune ce ar permite asanarea genetică a populației.

Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară la speciile importante economic și rezultatele obținute în atât de multe domenii de interes, cetifică utilitatea acestora și obligă la continuarea cercetărilor.

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

Prezenta lucrare și-a propus evidențierea rolului analizelor genealogice și utilizării tehnicilor de biologie moleculară în stabilirea statusului de risc al populațiilor de interes economic. Astfel, scopul prezentei lucrări este reprezentat de: (1) efectuarea analizei genealogice a unei populații de cabaline în scopul determinării valorii unor parametri importanți ce permit încadrarea acesteia într-una din clasele de risc, în acord cu cerințele FAO; (2) identificarea unor eventuale neajunsuri, limitări sau probleme rămase neelucidate ale analizelor genealogice; (3) realizarea unei cercetări bibliografice privind posibilitățile de utilizare a tehnicilor de biologie moleculară în managementul resurselor genetice animale; (4) completarea studiului de caz cu propuneri privind utilizarea tehnicilor moleculare în stabilirea statusului populației analizate.

În urma efectuării cercetărilor, se pot desprinde concluziile ce urmează:

Analizele genealogice sunt o componentă indisolubilă a managementului resurselor genetice, ele reprezentând "punctul 0" al oricărui program de ameliorare, prezrvare sau conservare, după caz. Nici o decizie optimizată nu se poate lua fără rezultatele provenite din analizele genealogice. Cercetările efectuate continuu la nivel internațional vin să confirme aceste afirmații;

Rezultatele cercetărilor proprii din studiul de caz reflectă faptul că Furioso North-Star din România este o populație cu drum evolutiv propriu, perfect distinct de a altor populații de cabaline. Rezultatele analizei genealogice evidențiază existența unei populații mari din punct de vedere genetic, consecință a sistemului de împerechere bazat pe principiul rotației interfamiliale (între liniile/curentele de sânge). Consangvinizarea posibilă (cea care ar apărea prin abandonarea potrivirii împerecherilor) mare relevă faptul că orice abatere de la sistemul de împerechere are repercusiuni catastrofale pentru viitorul populației, ceea ce îi conferă acesteia un grad ridicat de vulnerabilitate;

Analizele genealogice prezintă o serie de limitări, de neajunsuri, iar pentru eficientizarea muncii de evaluare a resurselor genetice, rezultatele obținute în urma acestora trebuie certificate prin tehnici de biologie moleculară;

În principiu, tehnicile de biologie moleculară cu aplicabilitate în managementul resurselor genetice sunt: tehnica PCR și variantele acesteia, tehnica SSCP și tehnicile de secvențiere;

Sinteza bibliografică realizată a pus în evidență faptul că tehnicile de biologie moleculară pot fi utilizate, în funcție de specie, la: selecția animalelor pe baza markerilor moleculari, cartarea genoamelor diferitelor specii, stabilirea originii (a paternității), determinarea gradului de consangvinizare în populație, stabilirea distanțelor genetice între populații, evaluarea diversității genetice a populațiilor, realizarea cladogramelor, trasabilitatea produselor de origine animală;

La populația ce face obiectul studiului de caz din prezenta lucrare, propunem utilizarea tehnicilor de biologie moleculară pentru stabilirea cu maximum de acuratețe a înrudirii medii în populație, a consagvinizării totale și pe generație, a distanței genetice față de alte populații de cabaline (în special PSE, și rasele "jumătate sânge englez": Gidran și Nonius), a asemănării genetice cu alte crescătorii, a statusului de sănătate a efectivului;

Este foarte clar că utilizarea tehnicilor de biologie moleculară în evaluarea populației are costuri asociate care nu sunt mici. Precizăm însă că acțiunea presupune investiții mari la începutul ei, atunci când trebuie analizat întregul efectiv matcă și tineretul aferent, acestea diminuându-se semnificativ, ulterior nefiind necesară decât analizarea câtorva indivizi pe an;

Pentru viitorul populației și pentru eficientizarea muncii de evaluare a resurselor genetice, devine absolut necesară existența unei baze de date complet informatizată, în care să existe înregistrări efectuate cu maximum de acuratețe și certificate de tehnici de biologie moleculară. Această bază de date trebuie să permită evaluarea statusului populației în absolut orice moment al evoluției sale.

BIBLIOGRAFIE

Aberle K.S. et al, 2004. Genetic diversity in German draught horse breeds compared with a group of primitive, riding and wild horses by means of microsatellite DNA markers. Animal Genetics, 35: 270-7;

Achmann R. et al, 2004. Microsatellite diversity, population subdivision and gene flow in the Lipizzan horse. Anim. Gen. 35: 285-292;

Agnieska D., Ntambi J., 2005. The role of Stearoyl-CoA-Desaturase in the control of metabolism. Prostaglandins, Leucotrienes and Essential Fatty Acids, 73: 35-41;

Alves do Egito Andrea et al., 2007. Genetic variability of Pantaneiro horse using RAPD-PCR markers. R. Bras. Zootec., v. 36, n. 4, pp. 799-806;

Amano T. et al, 1994. Genetic variants of ribosomal DNA and mitochondrial DNA between swamp and river buffaloes. Animal Genetics 25: 29-36;

Ayres K.L., 2005. The expected performance of single nucleotid polymorphism loci in paternity testing. Forensinc Science International 154, 167-72;

Baleiro E.S., 1971. Subsidio ao estudo do cavalo Pantaneiro Sao Paolo. Anuarion Comissao Coordenadora da Criacao do Cavalo Nacional, Brasilia: Ministero da Agricultura, 59-65;

Bbar M.E. et al, 2007. Evaluation of AMPK genes as candidates for production traits in buffalo breeds of Pakistan. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 345-348;

Bhat P.B. et al, 1990. Polymorphism of mitochondrial DNA in cattle and buffaloes. Biochemical Genetics 28, 7/8;

Buchanan F.C. et al, 2002. Association of a missense mutation in the bovine leptin gene with carcass fat content and leptin mRNA levels. Genet.Sel. Evol. 34: 105-116;

Buchanan F.C. et al, 2003. Hot Topic: an association between a leptin single nucleotid polymorphism and milk and protein yeld. J. Diary Sci.. 86: 3164-3166;

Camargo G.M.F. et al, 2007. Use PCR-RFLP in the gene of the enzyme Stearoyl-CoA-Desaturase in Bubalus bubalis. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 307-309;

Canon J. et al, 2000. The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data. Animal genetics, 31: 39-48;

Cañón J., Alexandrino P., Bessa I., Carleos C., Carretero Y., Dunner S., Ferran N., Garcia D.,Jordana J., Laloë D., Pereira A., Sanchez A., Moazami-Goudarzi K., 2001. Geneticdiversity measures of local European beef cattle breeds for conservation purposes. Genetics Selection Evolution, 33, pp. 311–332, ISSN 0999-193X;

Carling D., 2004. The AMP-activated protein kinase. Trends Biochem. Sci., 24, pp. 22-25;

Carșai Crina și col., 2010. Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecției asistate de markeri genetici la taurine. Teză de doctorat, USAMV Cluj;

Casellas J. et al, 2004. Genetic diversity measures of the bovine Alberes breed using microsatellites, variability among herds and types of coat colour. Journal of Animal Breeding and Genetics 121, 101-10;

Cervantes I., Gutierrez J.P., Molina A., Goyache F., Valera M., 2009. Genealogical analyses in open populations: the case of three Arab-derived Spanish horse breeds. J. Anim. Breed. Genet. 126: 335-347, ISSN 0931-2668;

Chiofalo L., Portolano B., Liotta L., Rundo Sotera A., Finocchiaro R., 2003. Demographic characterization, inbreeding and genetic variability within Sanfratellano population horse from genealogical data. Ital. J. Anim. Sci.2 (suppl. 1): 592-594;

Cho G.J., 2002. Microsatellite DNA polymorphism of Thoroughbred horses in Korea. Korean J. Genet., 24: 177-182;

Ciampolini R. et al, 2006. Statistical analysis of individual assignment test among four cattle breeds using fifteen STR loci. Journal of Animal Science 84, 11-19;

Cogălniceanu D., 1999. Managementul capitalului natural. Ed. Ars Docendi, București;

Costa M.D., Bergmann J.A.G., Rezende A.C., 2002. Inbreeding in the Brazilian horse breed Managalarga Marchador. 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, France;

Coșier Viorica, 2007. Inginerie genetică, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, ISBN 978-973-751-437-8;

Cothran E.G. et al, 1998. Genetics of the Pantaneiro horse of the Pantanal region of Brazil. Genetics and Molecular Biology, 21: 343-349;

Cunningham E.P. et al, 2001. Microsatellite diversity, pedigree relatedness and the contributions of the founder lineages to thoroughbred horses. Anim. Gen., 32: 360-364;

Cunningham E.P., Dooley J.J., Splan R.K., Bradley D.G., 2001. Microsatellite diversity, pedigree relatedness and the contribution of founder lineages to thoroughbred horses. Anim. Genet. 32, 360-364;

Dalvit C. et al, 2008b. Genetic traceabilityof meat using microsatellite markers. Food Research International 41, 301-7;

Del Bo L., Polli M., Longeri M., Ceriotti G., Looft C., Barre-Dirie A., Dolf G. and Zanotti M., 2001. Genetic diversity among some cattle breeds in the Alpine area. Journal of Animal Breeding and Genetics, 118, pp. 317-325, ISSN 0931-2668;

Drăgănescu C., 1970. Cercetări privind metodica folosită în practica ameliorării animalelor din românia. Teză de doctorat, IANB București;

Drăgănescu C., 1979. Ameliorarea animalelor. Ed. Ceres, București;

Drăgănescu C., Grosu H., 2003. Ameliorarea animalelor. Editura AgroTehnica, București;

Drăgănescu C., Grosu H., 2003. Ameliorarea animalelor. Editura AgroTehnica, București;

Drăgănescu C., Kinda Z., 1983. Istoria genetică a calului Nonius Românesc. Lucrări Științifice I.A.N.B. București, seria D, vol. XXVI, p. 97-103;

Drăgănescu C., Sandu Gh., 1987. Procedee cantitative elementare în ameliorarea animalelor domestic. Îndrumător de lucrări practice, IANB București;

Drăgănescu C., Scornea Lucreția, 1986. Istoria genetică a Trăpașului Românesc (II: 1962-1966). Lucrări Științifice I.A.N.B. București, seria D, vol. XXIX, p. 69-73;

Drăgănescu C., Zeneci N., 1977/1978. Istoria genetică a calului Lipițan de Făgăraș. Lucrări Științifice I.A.N.B. București, seria D, vol. XXI;

Drăgănescu Condrea, 1988. Unele aspecte ale istoriei genetice, performanțelor și perspectivei Hampshire-ului în România. Lucrări științifice, vol. IV, I.C.P.C.P. Periș;

Druml T., Baumung R., Solkner J., 2009. Pedigree analysis in the Austrian Noriker draught horse: genetic diversity and the impact of breeding for coat color on population structure. Anim. Breed. Genet. 126, 348-356;

Dutcă A., 1986. Analiza genetică a populațiilor Marele Alb, Landrace și Duroc de la Avrig. Raport tehnic de recepție, I.C.P.C.P. Periș;

Fernandes S.A.A., 2004. Levantamento exploratorio da producao composicao e perfil de acidos graxos no leite de bufalas em cinco fazendas do estado de Sao Paolo. Tese doutorado, ESALQ, USP-Priracicaba;

Gandini G.C., Bagnato A., Miglior F., Pagnacco G., 1992. Inbreeding in the Italian Haflinger horse. J. Anim. Breed. Genet. 109, 433-443;

Gâț Viorel și col., 1988. Evoluția populației Hampshire de la S.C.P.C.P. Gornești. Lucrări științifice, vol. IV, I.C.P.C.P. Periș;

Georgescu S. E. et al, 2009. Genetic diversity among Romanian cattle breeds with a special focus on the Romanian Steppe Breed. Romanian Biotechnological Letters, vol. 14, No 1, pp. 4194-4200;

Georgescu S.E. et al, 2008. The genetic structure of indigenous Romanian Hucul horse breed inferred from microsatellite data. Romanian Biotechnological Letters, vol. 13, No 6, pp. 4030-4036;

Goncalves E.C. et al, 2004. Isolation and characterization of microsatellite loci in Amazonian red-handed howlers Alouata belzebul. Molecular Ecology 4: 406-408;

Griinari J.M. et al, 2000. Conjugated linoleic acid is synthetized endogenoulsy in lactating cows by Δ9-desaturase. J. Nutr., 130: 2285-2291;

Grosu H., 2003. Programe de ameliorare. Editura AgroTehnica, București;

Grosu H., Lungu S., Kremer V.D., 1997. Modele liniare utilizate în ameliorarea genetică a animalelor. Editura Coral Sanivet, București;

Grosu H., Pascal Oltenacu – coord., 2005. Programe de ameliorare genetică în zootehnie. Editura Ceres, București;

Grosu H., Popa R., 2003. Tehnici elementare de analiză și evaluare în ameliorarea genetică a animalelor. Îndrumător de lucrări practice, USAMV București;

Gutierrez A.A. et al, 1996. Alterations of the physical characteristics of milk from transgenic mice producing bovine k-casein. Journal of Diary Scinece, 79: 791-799;

Hardie D.G. et al, 1998. The AMPactivated/SNF1 protein kinase subfamily: metabolic sensors of the eukariotic cell? Annu. Rev. Biochem., 67, 821-855;

Hatami H., Pandit R.V., 1979. A cytogenetic study of the Caspian pony. J. Reprod. Fertil. 57: 331-3;

Hawley S.A. et al, 1996. Characterization of the AMP-activated protein kinase kinase from rat liver and identification of threonine 172 as the major site at which it phosphorylates and activates AMPactivated protein kinase. J. Biol. Chem., 271: 27879-27887;

Heaton M.P. et al, 2005. Use of bobine single nucleotid polymorphism markers to verify sample traking in beef processing. Journal of the American Veterinary Medical Association 226, 1311-4;

Ianuzzi L. et al, 2003. The river buffalo cytogenetic map: assignment of 64 loci by fluorescence in situ hybridization and R-banding. Cytogenetic and Genome Research, 102: 65-75;

Ibeagha-Awemu E.M. and Erhardt G., 2005. Genetic structure and differentiation of 12 African Bos indicus and Bos taurus cattle breeds inferred from protein and microsatellite polymorphisms. Journal of Animal Breeding and Genetics, 122 (1), pp. 12-20, ISSN 0931-2668;

Jarne P., lagoda P.J.L., 1996. Microsatellites from molecules to populations and back. Trends Ecol Evol, 11: 424-429;

Juras R. et al, 2003. Genetic analysis of three Lithuanian horse breeds. Acta Agriculturae Scandinavica, 53: 180-5;

Kemp B.E. et al, 1999. Dealing with energy demand: the AMP activated protein kinase. Trends Biochem Sci 24: 22-25;

Khanshour A.M. et al, 2013. Microsatellite analysis for parentage testing of the Arabian horse breed from Syria. Turkish J. Vet. and Anim. Sci., 37: 9-14;

Kierstein G. et al, 2004. Analysis of mitochondrial D-loop region casts new light on domestic water buffalo phylogeny. Molecular Phylogenetics and Evolution 30(2): 308-324;

Kim K.S., Yeo J.S., Choi C.B., 2002. Genetic diversity of north-east Asian cattle based on microsatellite data. Animal Genetics, 33, pp. 201–204, ISSN 0268-9146;

Koskinen M.T., 2003. Individual assignment usin microsatellite DNA reveals unambigous bred identification in the domestic dog. Animal Genetics 34, 297-301;

Labă Marian, 2001. Istoria genetică a porcului Landrace de Avrig. Teză de doctorat, U.S.A.M.V. București;

Lee S.Y., Cho G.J., 2006. Parentage testing of Thoroughbred horse in Korea using microsatellite DNA typing. J. Vet. Sci.i, 7: 63-67;

Leifers L.C. et al, 2002. Association between leptin gene polymorphism and production, live weight, energy balance, feed intake and fertility in Holstein heifers. J. Diary Sci., 85: 1633-1638;

Lima A.L.F. et al, 2007. Partial genetic characterization of Stearoyl CoA-Desaturase's structural region in Bubalus bubalis. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 287-290;

Liron J.P. et al, 2004. Assignment of paternity in a judicial dispute between two neighbour Holstein dairy farmers. Journal of Forensic Science 49, 96-8;

Luis C. et al, 2006. Genetic diversity and relationship of Portuguese and other horse breeds based on protein and microsatellite loci variation. Animal Genetics, 38: 20-27;

MacCluer J., Boyce B., Buke L., Weitzkamp D., Pfenning A., Parsons C., 1983. Inbreeding and pedigree structure in Standardbred horses. J. Heredity 74, 394-399;

MacHugh D.E., Loftus R.T., Cunningham P., Bradley D.G., 1998. Genetic Structure Of Seven European Cattle Breeds Assessed Using 20 Microsatellite Markers. Animal Genetics, 29, pp. 333-340, ISSN 0268-9146;

Mahon G.A.T., Cunningham E.P., 1982. Inbreeding and the inheritance of fertility in the thoroughbred mare. Livest. Prod. Sci. 9, 743-754;

Mao Y, Chang H, Yang Z, Zhang L, Xu M, Chang G, Sun W, Song G, Ji D., 2008. The analysis of genetic diversity and differentiation of six Chinese cattle populations using microsatellite markers. Journal of Genetics and Genomics, 35, pp. 25-32, ISSN 1673-8527;

Marletta D. et al, 2006. Analysis of genetic diversity and the determination of relationship among western Mediterranean horse breeds using microsatellite markers. J. Anim. Bred. Genet., 13: 315-325;

Masina P. et al, 2007. Water buffalo kappa-casein gene sequence. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 353-355;

Mateus J.C., Penedo M.T., Alves V.C., Ramos M. and Rangel-Figueiredo T., 2004. Genetic diversity and differentiation in Portuguese cattle breeds using microsatellites. Animal Genetics, 35, pp. 106-113, ISSN 0268-9146;

Maudet C. et al, 2002. Genetic diversity and assignment test among seven Franch cattle breeds based on microsatellite DNA analysis. Journal of Animal Science 80, 942-50;

Maxwell J., 1995. Spanish Arabian Horses Families. Alexander Heriot and Co. Ltd, England.

Mărginean Gh. – coord., 1997. Tratat de hipologie. Editura Ceres, București;

Medrano J.F., 2002. Modification of the composition of milk fat in diary cows utilizing genetic selection. California Dairy Research Foundation, Nutrition and Health;

Miller A., Stanton C., 2001. Modulation of arachidonic acid distribution by conjugated linoleic acid isomers and linoleic acid in MCF-7 and SW480 cancer cells. Lipids, 36: 1161-1168;

Miserani M.G. et al, 2002. Avalicao dos fatores que influem nas medidas lineares do cavalo Pantaneiro. Revista Brasileira de Zootecnia, 31: 335-341;

Moureaux S., Verrier E., Ricard A., Meriaux J.C., 1996. Genetic variability within French race and riding horse breeds from genealogical data and bloog marker polymorphism. Genet. Sel. Evol. 28, 83-102;

Negrini R. et al, 2008. Assessing SNP markers for assigning individuals to cattle populations. Animal Genetics 40, 18-26;

Nozawa K. et al, 1998. Phylogenetic relationship among Japanese native and alien horses estimated by protein polymorphisms. Journal of Equine Science, 9: 53-69;

O’Toole H.P., Brophy D., Kellherl D., Aldridge L., Quinn K., 2001. Characterisation of the Irish draught horse population in Ireland. Irish Draught Horse Society, Dublin, Ireland;

Olsen H.F., Klemetsdal G., Ruane J., Helfjord T., 2010. Pedigree structure and genetic variation in the two endangered Norwegian horse breeds: Dole and Nordland/Lyngen. Animal Science, vol. 60, Issue , 13-22;

Orlandi M., Colombani B., 1980. Il Cavallo Avelignese: caratteristiche morfologiche degli stalloni iscritti al libro genealogico in rapport alle diverse line di sangue. Ann. Fac. Med. Vet. di Pisa 33: 193-200;

Orru L. et al, 2007. DNA polymorfisms in River Buffalo leptin gene. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 342-344;

Pagnacco G., 1992. Inbreeding in the Italian Haflinger horse. Journal of Animal Breeding and Genetics, 109(6), 433-443;

Pariza M.W. et al, 2000. Mechanisms of action of conjugated linoleic acid: evidence and speculation. Proc. Soc. Esptl. Biol. Med., 223(8): 8-13;

Park Y. et al, 2000. Modulation of MCF-7 breast cancer signal transduction by linoleic acid in culture. Anticancer Res., 20: 669-676;

Pauciullo A. et al, 2007. Preliminary analysis of Stearoyl CoA-Desaturase gene transcripts in River Buffalo. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 283-286;

Popa R. A., Săndulescu Dana, Drăgotoiu Tomița, Maftei M., 2004. Parametri importanți ai analizei genetice la calul Huțul de Lucina. Lucrări Științifice, Seria Zootehnie, vol. 47, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iași, p. 279-282, ISSN 1454-7368.

Popa R., 2005. Cercetări privind optimizarea unui program de ameliorare la o linie paternă de porci în condiții de însămânțări artificiale. Teză de doctorat, USAMV București.

Popa R., 2009. Programe de ameliorare. Ed. Printech, București;

Popovici Felicia și col., 1973. Aspecte ale dinamicii genetice a nucleelor de Hampshire, Duroc și Yorkshire în primii ani după import. Lucrări științifice, vol. I, S.C.C.C.P. Periș;

Popovici Felicia și col., 1977. Evoluția factorilor de care depinde dinamica genetică la populațiile de porcine crescute în unitățile de selecție. Lucrări științifice, vol. II, S.C.C.C.P. Periș;

Qian Z.Y. et al, 1995. Sheep k-casein peptides inhibit platelet aggregation. Biochemica et Biophysica Acta, 1244: 411-417;

Ruzzante D.E. et al, 2001. Distribution of individual inbreeding coefficients, relatedness and influence of stocking on native anadromous brown trout population structure. Molecular Ecology 10, 2107-28;

Sabbioni A., Beretti V., Trezzi Maria Francesca, Superchi Paola, 2007. Genetic variability and population structure in the Italian Halinger Horse from pedigree analysis. Ann. Fac. Medic. Vet. di Parma, vol. XXVII, p. 199-210;

Santos S.A. et al, 2001. A review of conservation and management of the Pantaneiro horse in the Brazilian Pantanal. Animal Genetic Resources Information, vol. 31, pp. 75-86;

Schenkel F.S. et al, 2005. Association of single nucleotid polymorphism in the leptin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. J. Anim. Sci., 83:2009-2020;

Sean M. Cusick and Daniel J. O'Sullivan, 2000. Use of a Single,Triplicate Arbitrarily Primed-PCR Procedure for Molecular Fingerprinting of Lactic Acid Bacteria Department of Food Science and Nutrition and Department of Microbial Engineering, University of Minnesota, St. Paul, Minnesota 55-108;

Sereno F.T.P.S., 2002. Caracterizacion genetica del caballo Pantaneiro. Cordoba: Universidad de Cordoba, Tesis (Doctoral in Genetica Animal);

Seyedabadi H. et al, 2006. Parentage verification of Iranian Caspian horse using microsatellites markers. Iranian Journal of Biotechnology, vol. 4, no 4, 260-264;

Simonsen B.T. et al, 1998. Population structure of African buffalo inferred from mtDNA sequences and microsatellite loci: high variation but low differentiation. Molecular Ecology 7: 225-37;

Solis A. et al, 2005. Genetic diversity within and among four South European native horse breeds based on microsatellite DNA analysis: implication for conservation. Journal of Heredity, 96: 670-8;

Spânul P., 1928. Herghelia Națională Bonțida. Monografie. Editura Ministerul Agriculturii și Domeniilor;

Srisakwattana C. et al, 2007. PCR-RFLP of mitochondrial DNA of swamp buffaloes in breeding station. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 334-337;

Tanaka K. et al, 1995. Nucleotide diversity of mitochondrial DNAs between the swamp and the river types of domestic water buffaloes, Bubalus bubalis, based on restriction endonuclease cleavage petterns. Biochemical Genetics 33: 137-148;

Tanigughi M. et al, 2004. Genotype of Stearoyl-CoA desaturase is associated with fatty acid composition in Japanese Black cattle. Mammalian Genome, 14:142-148;

Teegen R., Edel C., Thaller G., 2009. Population structure of the Trakehner Horse breed. Animal 3:1, pp 6-15;

Thoren E., 2008. International Sport Horse data for genetic evaluation. Doctoral Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala;

Torshizi R.V., Nicholas F.W., Tier B., 1998. Inbreeding in Australian Thoroughbred horses and the implications of “SHUTTLE” stallions. 6th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production;

Tozaki T. et al, 2001. Microsatellite variation in Japanese and Asian horses and their phylogenetic relationship using a European horse outgroup. J. Hered., 94: 374-380;

Upholt W.B., David I.B., 1977. Mapping of mitochondrial DNA of individual sheep and goats; rapid evolution in the D-loop region. Cell 11: 571-583;

Valera M., Molina A., Gutierrez J.P., Gomez J., Goyache F., 2005. Pedigree analysis in the Andalusian horse: population structure, genetic variability and influence of the Carthusian strain. Livestock Production Science 95: 57-66;

Vallinoto M. et al, 2004. Moleculat cloning and analysis of the swamp and river buffalo and river buffalo leptin gene. Animal Genetics, 34: 462-504;

Venancio L.P.R. et al, 2007. Microsatellite loci isolation from river buffalo using enriched partial genomic libraries. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 338-341;

Vlaic, A., 1997. Inginerie genetică. Realizări, speranțe și neliniști. Ed. Promedia Plus, Cluj-Napoca;

Welsh J., Mcclelland M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucl. Acid Res, 19, 861-866;

Zeneci Nicolae, 1981. Analiza genetică a unei populații Landrace belgian utilizată la realizarea de linii sintetice. Lucrări științifice, vol. III, S.C.C.C.P. Periș;

BIBLIOGRAFIE

Aberle K.S. et al, 2004. Genetic diversity in German draught horse breeds compared with a group of primitive, riding and wild horses by means of microsatellite DNA markers. Animal Genetics, 35: 270-7;

Achmann R. et al, 2004. Microsatellite diversity, population subdivision and gene flow in the Lipizzan horse. Anim. Gen. 35: 285-292;

Agnieska D., Ntambi J., 2005. The role of Stearoyl-CoA-Desaturase in the control of metabolism. Prostaglandins, Leucotrienes and Essential Fatty Acids, 73: 35-41;

Alves do Egito Andrea et al., 2007. Genetic variability of Pantaneiro horse using RAPD-PCR markers. R. Bras. Zootec., v. 36, n. 4, pp. 799-806;

Amano T. et al, 1994. Genetic variants of ribosomal DNA and mitochondrial DNA between swamp and river buffaloes. Animal Genetics 25: 29-36;

Ayres K.L., 2005. The expected performance of single nucleotid polymorphism loci in paternity testing. Forensinc Science International 154, 167-72;

Baleiro E.S., 1971. Subsidio ao estudo do cavalo Pantaneiro Sao Paolo. Anuarion Comissao Coordenadora da Criacao do Cavalo Nacional, Brasilia: Ministero da Agricultura, 59-65;

Bbar M.E. et al, 2007. Evaluation of AMPK genes as candidates for production traits in buffalo breeds of Pakistan. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 345-348;

Bhat P.B. et al, 1990. Polymorphism of mitochondrial DNA in cattle and buffaloes. Biochemical Genetics 28, 7/8;

Buchanan F.C. et al, 2002. Association of a missense mutation in the bovine leptin gene with carcass fat content and leptin mRNA levels. Genet.Sel. Evol. 34: 105-116;

Buchanan F.C. et al, 2003. Hot Topic: an association between a leptin single nucleotid polymorphism and milk and protein yeld. J. Diary Sci.. 86: 3164-3166;

Camargo G.M.F. et al, 2007. Use PCR-RFLP in the gene of the enzyme Stearoyl-CoA-Desaturase in Bubalus bubalis. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 307-309;

Canon J. et al, 2000. The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data. Animal genetics, 31: 39-48;

Cañón J., Alexandrino P., Bessa I., Carleos C., Carretero Y., Dunner S., Ferran N., Garcia D.,Jordana J., Laloë D., Pereira A., Sanchez A., Moazami-Goudarzi K., 2001. Geneticdiversity measures of local European beef cattle breeds for conservation purposes. Genetics Selection Evolution, 33, pp. 311–332, ISSN 0999-193X;

Carling D., 2004. The AMP-activated protein kinase. Trends Biochem. Sci., 24, pp. 22-25;

Carșai Crina și col., 2010. Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecției asistate de markeri genetici la taurine. Teză de doctorat, USAMV Cluj;

Casellas J. et al, 2004. Genetic diversity measures of the bovine Alberes breed using microsatellites, variability among herds and types of coat colour. Journal of Animal Breeding and Genetics 121, 101-10;

Cervantes I., Gutierrez J.P., Molina A., Goyache F., Valera M., 2009. Genealogical analyses in open populations: the case of three Arab-derived Spanish horse breeds. J. Anim. Breed. Genet. 126: 335-347, ISSN 0931-2668;

Chiofalo L., Portolano B., Liotta L., Rundo Sotera A., Finocchiaro R., 2003. Demographic characterization, inbreeding and genetic variability within Sanfratellano population horse from genealogical data. Ital. J. Anim. Sci.2 (suppl. 1): 592-594;

Cho G.J., 2002. Microsatellite DNA polymorphism of Thoroughbred horses in Korea. Korean J. Genet., 24: 177-182;

Ciampolini R. et al, 2006. Statistical analysis of individual assignment test among four cattle breeds using fifteen STR loci. Journal of Animal Science 84, 11-19;

Cogălniceanu D., 1999. Managementul capitalului natural. Ed. Ars Docendi, București;

Costa M.D., Bergmann J.A.G., Rezende A.C., 2002. Inbreeding in the Brazilian horse breed Managalarga Marchador. 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, France;

Coșier Viorica, 2007. Inginerie genetică, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, ISBN 978-973-751-437-8;

Cothran E.G. et al, 1998. Genetics of the Pantaneiro horse of the Pantanal region of Brazil. Genetics and Molecular Biology, 21: 343-349;

Cunningham E.P. et al, 2001. Microsatellite diversity, pedigree relatedness and the contributions of the founder lineages to thoroughbred horses. Anim. Gen., 32: 360-364;

Cunningham E.P., Dooley J.J., Splan R.K., Bradley D.G., 2001. Microsatellite diversity, pedigree relatedness and the contribution of founder lineages to thoroughbred horses. Anim. Genet. 32, 360-364;

Dalvit C. et al, 2008b. Genetic traceabilityof meat using microsatellite markers. Food Research International 41, 301-7;

Del Bo L., Polli M., Longeri M., Ceriotti G., Looft C., Barre-Dirie A., Dolf G. and Zanotti M., 2001. Genetic diversity among some cattle breeds in the Alpine area. Journal of Animal Breeding and Genetics, 118, pp. 317-325, ISSN 0931-2668;

Drăgănescu C., 1970. Cercetări privind metodica folosită în practica ameliorării animalelor din românia. Teză de doctorat, IANB București;

Drăgănescu C., 1979. Ameliorarea animalelor. Ed. Ceres, București;

Drăgănescu C., Grosu H., 2003. Ameliorarea animalelor. Editura AgroTehnica, București;

Drăgănescu C., Grosu H., 2003. Ameliorarea animalelor. Editura AgroTehnica, București;

Drăgănescu C., Kinda Z., 1983. Istoria genetică a calului Nonius Românesc. Lucrări Științifice I.A.N.B. București, seria D, vol. XXVI, p. 97-103;

Drăgănescu C., Sandu Gh., 1987. Procedee cantitative elementare în ameliorarea animalelor domestic. Îndrumător de lucrări practice, IANB București;

Drăgănescu C., Scornea Lucreția, 1986. Istoria genetică a Trăpașului Românesc (II: 1962-1966). Lucrări Științifice I.A.N.B. București, seria D, vol. XXIX, p. 69-73;

Drăgănescu C., Zeneci N., 1977/1978. Istoria genetică a calului Lipițan de Făgăraș. Lucrări Științifice I.A.N.B. București, seria D, vol. XXI;

Drăgănescu Condrea, 1988. Unele aspecte ale istoriei genetice, performanțelor și perspectivei Hampshire-ului în România. Lucrări științifice, vol. IV, I.C.P.C.P. Periș;

Druml T., Baumung R., Solkner J., 2009. Pedigree analysis in the Austrian Noriker draught horse: genetic diversity and the impact of breeding for coat color on population structure. Anim. Breed. Genet. 126, 348-356;

Dutcă A., 1986. Analiza genetică a populațiilor Marele Alb, Landrace și Duroc de la Avrig. Raport tehnic de recepție, I.C.P.C.P. Periș;

Fernandes S.A.A., 2004. Levantamento exploratorio da producao composicao e perfil de acidos graxos no leite de bufalas em cinco fazendas do estado de Sao Paolo. Tese doutorado, ESALQ, USP-Priracicaba;

Gandini G.C., Bagnato A., Miglior F., Pagnacco G., 1992. Inbreeding in the Italian Haflinger horse. J. Anim. Breed. Genet. 109, 433-443;

Gâț Viorel și col., 1988. Evoluția populației Hampshire de la S.C.P.C.P. Gornești. Lucrări științifice, vol. IV, I.C.P.C.P. Periș;

Georgescu S. E. et al, 2009. Genetic diversity among Romanian cattle breeds with a special focus on the Romanian Steppe Breed. Romanian Biotechnological Letters, vol. 14, No 1, pp. 4194-4200;

Georgescu S.E. et al, 2008. The genetic structure of indigenous Romanian Hucul horse breed inferred from microsatellite data. Romanian Biotechnological Letters, vol. 13, No 6, pp. 4030-4036;

Goncalves E.C. et al, 2004. Isolation and characterization of microsatellite loci in Amazonian red-handed howlers Alouata belzebul. Molecular Ecology 4: 406-408;

Griinari J.M. et al, 2000. Conjugated linoleic acid is synthetized endogenoulsy in lactating cows by Δ9-desaturase. J. Nutr., 130: 2285-2291;

Grosu H., 2003. Programe de ameliorare. Editura AgroTehnica, București;

Grosu H., Lungu S., Kremer V.D., 1997. Modele liniare utilizate în ameliorarea genetică a animalelor. Editura Coral Sanivet, București;

Grosu H., Pascal Oltenacu – coord., 2005. Programe de ameliorare genetică în zootehnie. Editura Ceres, București;

Grosu H., Popa R., 2003. Tehnici elementare de analiză și evaluare în ameliorarea genetică a animalelor. Îndrumător de lucrări practice, USAMV București;

Gutierrez A.A. et al, 1996. Alterations of the physical characteristics of milk from transgenic mice producing bovine k-casein. Journal of Diary Scinece, 79: 791-799;

Hardie D.G. et al, 1998. The AMPactivated/SNF1 protein kinase subfamily: metabolic sensors of the eukariotic cell? Annu. Rev. Biochem., 67, 821-855;

Hatami H., Pandit R.V., 1979. A cytogenetic study of the Caspian pony. J. Reprod. Fertil. 57: 331-3;

Hawley S.A. et al, 1996. Characterization of the AMP-activated protein kinase kinase from rat liver and identification of threonine 172 as the major site at which it phosphorylates and activates AMPactivated protein kinase. J. Biol. Chem., 271: 27879-27887;

Heaton M.P. et al, 2005. Use of bobine single nucleotid polymorphism markers to verify sample traking in beef processing. Journal of the American Veterinary Medical Association 226, 1311-4;

Ianuzzi L. et al, 2003. The river buffalo cytogenetic map: assignment of 64 loci by fluorescence in situ hybridization and R-banding. Cytogenetic and Genome Research, 102: 65-75;

Ibeagha-Awemu E.M. and Erhardt G., 2005. Genetic structure and differentiation of 12 African Bos indicus and Bos taurus cattle breeds inferred from protein and microsatellite polymorphisms. Journal of Animal Breeding and Genetics, 122 (1), pp. 12-20, ISSN 0931-2668;

Jarne P., lagoda P.J.L., 1996. Microsatellites from molecules to populations and back. Trends Ecol Evol, 11: 424-429;

Juras R. et al, 2003. Genetic analysis of three Lithuanian horse breeds. Acta Agriculturae Scandinavica, 53: 180-5;

Kemp B.E. et al, 1999. Dealing with energy demand: the AMP activated protein kinase. Trends Biochem Sci 24: 22-25;

Khanshour A.M. et al, 2013. Microsatellite analysis for parentage testing of the Arabian horse breed from Syria. Turkish J. Vet. and Anim. Sci., 37: 9-14;

Kierstein G. et al, 2004. Analysis of mitochondrial D-loop region casts new light on domestic water buffalo phylogeny. Molecular Phylogenetics and Evolution 30(2): 308-324;

Kim K.S., Yeo J.S., Choi C.B., 2002. Genetic diversity of north-east Asian cattle based on microsatellite data. Animal Genetics, 33, pp. 201–204, ISSN 0268-9146;

Koskinen M.T., 2003. Individual assignment usin microsatellite DNA reveals unambigous bred identification in the domestic dog. Animal Genetics 34, 297-301;

Labă Marian, 2001. Istoria genetică a porcului Landrace de Avrig. Teză de doctorat, U.S.A.M.V. București;

Lee S.Y., Cho G.J., 2006. Parentage testing of Thoroughbred horse in Korea using microsatellite DNA typing. J. Vet. Sci.i, 7: 63-67;

Leifers L.C. et al, 2002. Association between leptin gene polymorphism and production, live weight, energy balance, feed intake and fertility in Holstein heifers. J. Diary Sci., 85: 1633-1638;

Lima A.L.F. et al, 2007. Partial genetic characterization of Stearoyl CoA-Desaturase's structural region in Bubalus bubalis. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 287-290;

Liron J.P. et al, 2004. Assignment of paternity in a judicial dispute between two neighbour Holstein dairy farmers. Journal of Forensic Science 49, 96-8;

Luis C. et al, 2006. Genetic diversity and relationship of Portuguese and other horse breeds based on protein and microsatellite loci variation. Animal Genetics, 38: 20-27;

MacCluer J., Boyce B., Buke L., Weitzkamp D., Pfenning A., Parsons C., 1983. Inbreeding and pedigree structure in Standardbred horses. J. Heredity 74, 394-399;

MacHugh D.E., Loftus R.T., Cunningham P., Bradley D.G., 1998. Genetic Structure Of Seven European Cattle Breeds Assessed Using 20 Microsatellite Markers. Animal Genetics, 29, pp. 333-340, ISSN 0268-9146;

Mahon G.A.T., Cunningham E.P., 1982. Inbreeding and the inheritance of fertility in the thoroughbred mare. Livest. Prod. Sci. 9, 743-754;

Mao Y, Chang H, Yang Z, Zhang L, Xu M, Chang G, Sun W, Song G, Ji D., 2008. The analysis of genetic diversity and differentiation of six Chinese cattle populations using microsatellite markers. Journal of Genetics and Genomics, 35, pp. 25-32, ISSN 1673-8527;

Marletta D. et al, 2006. Analysis of genetic diversity and the determination of relationship among western Mediterranean horse breeds using microsatellite markers. J. Anim. Bred. Genet., 13: 315-325;

Masina P. et al, 2007. Water buffalo kappa-casein gene sequence. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 353-355;

Mateus J.C., Penedo M.T., Alves V.C., Ramos M. and Rangel-Figueiredo T., 2004. Genetic diversity and differentiation in Portuguese cattle breeds using microsatellites. Animal Genetics, 35, pp. 106-113, ISSN 0268-9146;

Maudet C. et al, 2002. Genetic diversity and assignment test among seven Franch cattle breeds based on microsatellite DNA analysis. Journal of Animal Science 80, 942-50;

Maxwell J., 1995. Spanish Arabian Horses Families. Alexander Heriot and Co. Ltd, England.

Mărginean Gh. – coord., 1997. Tratat de hipologie. Editura Ceres, București;

Medrano J.F., 2002. Modification of the composition of milk fat in diary cows utilizing genetic selection. California Dairy Research Foundation, Nutrition and Health;

Miller A., Stanton C., 2001. Modulation of arachidonic acid distribution by conjugated linoleic acid isomers and linoleic acid in MCF-7 and SW480 cancer cells. Lipids, 36: 1161-1168;

Miserani M.G. et al, 2002. Avalicao dos fatores que influem nas medidas lineares do cavalo Pantaneiro. Revista Brasileira de Zootecnia, 31: 335-341;

Moureaux S., Verrier E., Ricard A., Meriaux J.C., 1996. Genetic variability within French race and riding horse breeds from genealogical data and bloog marker polymorphism. Genet. Sel. Evol. 28, 83-102;

Negrini R. et al, 2008. Assessing SNP markers for assigning individuals to cattle populations. Animal Genetics 40, 18-26;

Nozawa K. et al, 1998. Phylogenetic relationship among Japanese native and alien horses estimated by protein polymorphisms. Journal of Equine Science, 9: 53-69;

O’Toole H.P., Brophy D., Kellherl D., Aldridge L., Quinn K., 2001. Characterisation of the Irish draught horse population in Ireland. Irish Draught Horse Society, Dublin, Ireland;

Olsen H.F., Klemetsdal G., Ruane J., Helfjord T., 2010. Pedigree structure and genetic variation in the two endangered Norwegian horse breeds: Dole and Nordland/Lyngen. Animal Science, vol. 60, Issue , 13-22;

Orlandi M., Colombani B., 1980. Il Cavallo Avelignese: caratteristiche morfologiche degli stalloni iscritti al libro genealogico in rapport alle diverse line di sangue. Ann. Fac. Med. Vet. di Pisa 33: 193-200;

Orru L. et al, 2007. DNA polymorfisms in River Buffalo leptin gene. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 342-344;

Pagnacco G., 1992. Inbreeding in the Italian Haflinger horse. Journal of Animal Breeding and Genetics, 109(6), 433-443;

Pariza M.W. et al, 2000. Mechanisms of action of conjugated linoleic acid: evidence and speculation. Proc. Soc. Esptl. Biol. Med., 223(8): 8-13;

Park Y. et al, 2000. Modulation of MCF-7 breast cancer signal transduction by linoleic acid in culture. Anticancer Res., 20: 669-676;

Pauciullo A. et al, 2007. Preliminary analysis of Stearoyl CoA-Desaturase gene transcripts in River Buffalo. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 283-286;

Popa R. A., Săndulescu Dana, Drăgotoiu Tomița, Maftei M., 2004. Parametri importanți ai analizei genetice la calul Huțul de Lucina. Lucrări Științifice, Seria Zootehnie, vol. 47, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iași, p. 279-282, ISSN 1454-7368.

Popa R., 2005. Cercetări privind optimizarea unui program de ameliorare la o linie paternă de porci în condiții de însămânțări artificiale. Teză de doctorat, USAMV București.

Popa R., 2009. Programe de ameliorare. Ed. Printech, București;

Popovici Felicia și col., 1973. Aspecte ale dinamicii genetice a nucleelor de Hampshire, Duroc și Yorkshire în primii ani după import. Lucrări științifice, vol. I, S.C.C.C.P. Periș;

Popovici Felicia și col., 1977. Evoluția factorilor de care depinde dinamica genetică la populațiile de porcine crescute în unitățile de selecție. Lucrări științifice, vol. II, S.C.C.C.P. Periș;

Qian Z.Y. et al, 1995. Sheep k-casein peptides inhibit platelet aggregation. Biochemica et Biophysica Acta, 1244: 411-417;

Ruzzante D.E. et al, 2001. Distribution of individual inbreeding coefficients, relatedness and influence of stocking on native anadromous brown trout population structure. Molecular Ecology 10, 2107-28;

Sabbioni A., Beretti V., Trezzi Maria Francesca, Superchi Paola, 2007. Genetic variability and population structure in the Italian Halinger Horse from pedigree analysis. Ann. Fac. Medic. Vet. di Parma, vol. XXVII, p. 199-210;

Santos S.A. et al, 2001. A review of conservation and management of the Pantaneiro horse in the Brazilian Pantanal. Animal Genetic Resources Information, vol. 31, pp. 75-86;

Schenkel F.S. et al, 2005. Association of single nucleotid polymorphism in the leptin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. J. Anim. Sci., 83:2009-2020;

Sean M. Cusick and Daniel J. O'Sullivan, 2000. Use of a Single,Triplicate Arbitrarily Primed-PCR Procedure for Molecular Fingerprinting of Lactic Acid Bacteria Department of Food Science and Nutrition and Department of Microbial Engineering, University of Minnesota, St. Paul, Minnesota 55-108;

Sereno F.T.P.S., 2002. Caracterizacion genetica del caballo Pantaneiro. Cordoba: Universidad de Cordoba, Tesis (Doctoral in Genetica Animal);

Seyedabadi H. et al, 2006. Parentage verification of Iranian Caspian horse using microsatellites markers. Iranian Journal of Biotechnology, vol. 4, no 4, 260-264;

Simonsen B.T. et al, 1998. Population structure of African buffalo inferred from mtDNA sequences and microsatellite loci: high variation but low differentiation. Molecular Ecology 7: 225-37;

Solis A. et al, 2005. Genetic diversity within and among four South European native horse breeds based on microsatellite DNA analysis: implication for conservation. Journal of Heredity, 96: 670-8;

Spânul P., 1928. Herghelia Națională Bonțida. Monografie. Editura Ministerul Agriculturii și Domeniilor;

Srisakwattana C. et al, 2007. PCR-RFLP of mitochondrial DNA of swamp buffaloes in breeding station. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 334-337;

Tanaka K. et al, 1995. Nucleotide diversity of mitochondrial DNAs between the swamp and the river types of domestic water buffaloes, Bubalus bubalis, based on restriction endonuclease cleavage petterns. Biochemical Genetics 33: 137-148;

Tanigughi M. et al, 2004. Genotype of Stearoyl-CoA desaturase is associated with fatty acid composition in Japanese Black cattle. Mammalian Genome, 14:142-148;

Teegen R., Edel C., Thaller G., 2009. Population structure of the Trakehner Horse breed. Animal 3:1, pp 6-15;

Thoren E., 2008. International Sport Horse data for genetic evaluation. Doctoral Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala;

Torshizi R.V., Nicholas F.W., Tier B., 1998. Inbreeding in Australian Thoroughbred horses and the implications of “SHUTTLE” stallions. 6th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production;

Tozaki T. et al, 2001. Microsatellite variation in Japanese and Asian horses and their phylogenetic relationship using a European horse outgroup. J. Hered., 94: 374-380;

Upholt W.B., David I.B., 1977. Mapping of mitochondrial DNA of individual sheep and goats; rapid evolution in the D-loop region. Cell 11: 571-583;

Valera M., Molina A., Gutierrez J.P., Gomez J., Goyache F., 2005. Pedigree analysis in the Andalusian horse: population structure, genetic variability and influence of the Carthusian strain. Livestock Production Science 95: 57-66;

Vallinoto M. et al, 2004. Moleculat cloning and analysis of the swamp and river buffalo and river buffalo leptin gene. Animal Genetics, 34: 462-504;

Venancio L.P.R. et al, 2007. Microsatellite loci isolation from river buffalo using enriched partial genomic libraries. Italian Journal of Animal Science, vol. 6, suppl. 2, part. 1, pp. 338-341;

Vlaic, A., 1997. Inginerie genetică. Realizări, speranțe și neliniști. Ed. Promedia Plus, Cluj-Napoca;

Welsh J., Mcclelland M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucl. Acid Res, 19, 861-866;

Zeneci Nicolae, 1981. Analiza genetică a unei populații Landrace belgian utilizată la realizarea de linii sintetice. Lucrări științifice, vol. III, S.C.C.C.P. Periș;