Contribuții la Studiul Farmacognostic al Speciei Pleurotus Ostreatus

=== Contribuţii la studiul farmacognostic al speciei Pleurotus ostreatus ===

INTRODUCERE

Omul primitiv lua cele necesare din mediul înconjurător și căuta să vindece toate bolile cu ajutorul plantelor , mineralelor și produselor animale pe care le avea la îndemână . Omul căuta mijluace curative în mod empiric ; de aceea , numeroase plante medicinale folosite de medicina științifică actuală au o istorie foarte veche . Deoarece cauzele bolilor și tratamentul lor erau neînțelese de omul primitiv , pe lângă tratamentul cu plante el cerea ajutorul zeilor și al duhurilor .

Dupa trecerea multori ani de încercări , experiențe , nu s-au găsit de către medici și farmaciști metode de vindecare ( altele decât medicamente sintetice , chimioterapii , fioterapii pe bază de curenți etc.) care să nu fie nocive . Acestea aduc ameliorări , dar nu vindecări, atâta timp cât nu se elimină cauza care a produs boala .

Natura ne oferă avantaje clare . se elimină toxinele care cauzează boala și nu mai sunt afectate și alte organe . Incă din antichitate , înțelepții duceau o viață în armonie cu natura .

Fitoterapia modernă a devenit astăzi o știință interdisciplinară . Ea presupune o colaborare cât mai strâsă între medic , farmacist , chimist , fizician , biolog , matematician , psiholog , inginer sau tehnolog , având un unic scop : găsirea și aplicarea remediului cel mai potrivit bolnavului.

Farmacognozia este cea care restabilește relația între teoriile științifice și practicile medicinei tradiționale,ea cunoaște plantele și organele lor întrebuințate în terapeutică,precum și posibilitațile de prelucrare în vederea extragerii principiilor active.

PLAN DE REDACTARE

PARTEA TEORETICĂ

1.Date generale privind specia Pleurotus ostreatus

2.Sinonime

3.Încadrare sistematică

4.Descriere

5.Origine și răspândire

6.Compoziție chimică

7.Acțiune

8.Întrebuințări

9.Preparate farmaceutice

PARTEA EXPERIMENTALĂ

1.Obținere

2. Stabilirea identității

2.1.Examenul macroscopic

2.2.Examenul microscopic

2.3.Analiza chmică calitativă

3. Determinarea calității

3.1.Determinări preliminare

3.2.Dozarea principiilor active

4. Testarea acțiunii asupra celulei vegetale

CONCLUZII

PLEUROTUS OSTREATUS

Fig.1.Pleurotus ostreatus

PARTEA TEORETICĂ

1.DATE GENERALE PRIVIND SPECIA PLEUROTUS OSTREATUS

Una din cele mai cunoscute specii de ciuperci medicinale, cu regim nutritiv saprofit.

Are o foarte mare valuare alimentară , utilizată în arta culinară în feluri variate : ( supă , cu umplătură , cu sos , salată ) se poate cultiva pe cale industrială folosindu-se ca substrat rumeguș , coceni de porumb , ciocălăi . (1)

2.SINONIME

Se mai numește : – burete negru

– găinușa pădurii

– păstrav de fag

– păstrăvul cerului(1)

– burete de fag

– oyster (3)

3.ÎNCADRARE SISTEMATICĂ

Specia. Pleurotus ostreatus

Gen. Pleurotus

Fam. Pleurotaceae

Ordin. Agaricales

Clasa Basidiomycetae (2)

4.DESCRIREA SPECIEI

Ciupercă comestibilă, lignicolă,prezentă în grupuri mari,îmbricate,pe trunchiurile bâtrâne de arbori foioși,îndeosebi pe fag.

Cresc etajate,aplicate unele peste altele. Fig 2

Dintr-o bază comună pot porni mai multe ciuperci cu lungima piciorului diferită, pălăria orizontală, în formă de ureche sau scoică, diametrul 5-15 cm , cu margina răsucită.

Fața superioară netedă, cenușie, brun-cenușiu, cenușiu-maronie, negricioasă , se decolorează cu vârsta.

Fața inferioară cu lamele albicioase sau cenușii, foarte decurent, largi , anastomazate la bază.

Piciorul lateral, scurt de 1-4 cm, gros de 1-3 cm , alb-zbârlit , păros la bază, adeseori lipsește.

Carnea albă,moale,elastică,miros plăcut,gust dulce.

Sporii cilindrici sau ovoizi ( 8-12 x 3-4 microni ), hialini , netezi , albi în masă . dăunâtoare, produce putregaiul alb al lemnului.

În România, primele culturi au fost organizate începând cu anul 1973

Valorifică celuloza și hemiceluloza din substrat,cu conținut bogat de lignină, cele mai bune rezultate s-au obținut pe fag,plop,carpen și nuc , exemplele obținute pe salcie,cireș, stejar,arțar,cedru sunt necorespunzătoare.

În cultura întensivă se folosesc 8 cicluri pe an cu o producție de 90-100 kg pe metru pătrat,pentru 100 kg lemn lemnos se utilizează 2,5 litri miceliu soluție. Începe să se formeze când în aer temperatura este cca.15 grade celsius.

Fig 2.Pleurotus ostreatus

Fig.3. Pleurotus ostreatus

Fig.4. Pleurotus ostreatus

5.ORIGINE ȘI RĂSPÂNDIRE

Pleurotus ostreatus este răspândit în toate regiunile împădurite cu clima temperată și tropicală ale globului.În țara noastră această specie se dezvoltă cu predilecție pe suprafața trunchiurilor de arbori din pădurile de foioase, producând așa numitul putregai alb de lemn.(3)

6.COMPOZIȚIA CHIMICĂ

-mevinolin (lovastatin) – în special în corpul fructifer de P. ostreatus, P. saca și P. sapidus ; P. ostreatus produce cantități maxime de lovastatin când mediul de cultură conține nitrogen organic

-poliholozide: – pleuran (β-1,3-D-glucan) în majoritatea speciilor din genul Pleurotus sau diferiți polimeri alcătuiți din xiloză, glucoză, manoza și galactoză în diferite raporturi molare în P. pulmonarius ; o polizaharidă acidă alcătuită din glucoză, manoză, galactoză și acizi zaharici în P. ostreatus. β-D-glucani au fost identificați și în P. tuber-regium poliholozide în P. florida , P. sajor-caju

-lectine: în corpii de fructificație ai speciilor P. ostreatus și P. cornucopiae; lectinele din P. tuber-regium au specificitate pentru N-acetilglucozamină.

– glicoproteine de tip ubiquitină cu acțiune de ribonuclează în P. ostreatus; din P. tuber-regium a fost izolată proteina pleuturegin, peptida denumită eringin din P. eryngii cu masa moleculară de 10 kDa.

– aminoacizi esențiali în genul Pleurotus ; în corpul fructifer de P. ostreatus predomină alanina, acidul glutamic și ornitina; alături de acestia se mai găsesc: acid glutamic, valină, glutamină, glicină, leucină

– lipide, acid oleic și alți acizi grași nesaturați în P. ostreatus; glicoinozitolfosfosfingolipide: ceramide și cerebrozide în P. ostreatus; steroli în P. eryngii

– enzime: fenoloxidaze, de exemplu lacaze în P. eryngii, P. ostreatus, P. florida (și P. pulmonarius; glutamin-sintetaza în P. ostreatus, cisteinproteaza în P. ostreatus, D-glucoz-oxidază în P. ostreatus , o protează fibrinolitică în P. ostreatus, lipoxigenază în P. ostreatus , o proteaza antivirală (pleureryn) și peroxidaze în P. eryngi ; Mn-peroxidază în P. eryngi , ribonucleaze în P. tuber-regium , P. pulmonarius , P. eryngii, P. ostreatus, două superoxid dismutaze (SODm și SODc) care conțin mangan atomic și respectiv, trivalent în P. olearius. În P. pulmonarius au mai fost identificate enzimele: benzo-[a]-piren hidroxilază (Maspahy S. și colab., 1999), Mn-peroxidază, xilanază, celulază, ligninperoxidază, arilalcooloxidază și o enzimă implicată în degradarea aflatoxinei B1. Enzimele ligninolitice din P. sajor-caju degradează și juglona .

Compușii 1-octen-3-ol, octan-3-ol și actan-3-ona imprimă aroma corpului fructifer și miceliului proaspăt de P. ostreatus

Acid oxalic în P. ostreatus.

Acid 5-O-(α-D-xilopiranozil)-D-eritroascorbic , vitamine din grupul B: B1 sau tiamina, B2 sau riboflavina, B5 sau niacina, B6 sau piridoxina, B7 sau biotina, acid folic,

– minerale: cantități mari de Fe.

7. ACȚIUNE TERAPEUTICĂ

Hipocolesterolemiantă

– majoritatea speciilor din genul Pleurotus (P. ostreatus, P. sapidus, P. sacca) produc mevinolin și lovastatină care inhibă biosinteza colesterolului, cresc HDL-colesterolul și scad VLDL-colesterolul, acționând asupra HMG-CoA-reductazei ;

– P. ostreatus scade absorbția colesterolului, inhibă HMG-CoA-reductaza, crește HLDL-colesterolul, activitatea 7α-hidroxilazei hepatice, excreția prin materii fecale a sterolilor neutri și a acizilor biliari și scade valorile VLDL-colesterolului;

Pulberea uscată, extractul apos și cel etanolic scad colesterolul și triacilglicerolii din ser

– efectul hipocolesterolemiant al dietei cu P. ostreatus sau al fracțiunii poliholozidice a fost demonstrat și la șoareci sau hamsteri sirieni cu hipercolesterolemie ereditară sau care au primit în mod repetat alcool

– administrarea zilnică de 15-20 g masă uscată de P. ostreatus conduce la scăderea concentrațiilor plasmatice de colesterol la majoritatea pacienților. În cazul șoarecilor cu valori plasmatice normale ale colesterolului nu s-a observat acțiunea asupra HDL-, LDL-colesterolului, trigliceridelor și colesterolului total.

Efectul hipocolesterolemiant a fost demonstrat și pentru P. florida Eger.

Hipoglicemiantă

P. ostreatus scade glicemia postprandială la șoareci cu diabet insulino-dependent indus prin streptozocină, dar nu modifică insulinemia. Efectul hipoglicemiant a fost demonstrat și pentru fracțiunea poliholozidică solubilă în apă din P. citrinopileatus .

Antitumorală

Încă din 1969 a fost semnalată acțiunea antineoplazică a poliholozidelor din P. ostreatus

Ulterior s-a constatat că:

– pulberea uscată obținută din această specie reduce incidența tumorilor de colon provocate cu dimetilhidrazină, prin scăderea activității ornitin-decarboxilazei din colon. Efectul antitumoral în acest tip de cancer este explicat și prin inducerea apoptozei

– lectinele-dimeri extrase din corpurile de fructificație ale speciei P. ostreatus sunt hemaglutinante și au inhibat dezvoltarea celulelor tumorale de tip Sarcoma 180 și Hepatoma H-22 implantate animalelor de experiență;

– pleuranul (un β-glucan) previne apariția metastazelor ;

– poliholozida de tip α-glucan din miceliul de P. ostreatus are acțiune antiproliferativă și pro-apoptotic în cancerul de colon experimental HT-29 .

– fracțiunile poliholozidice din corpii de fructificație ai speciei P. sajor-caju (Fr.) Sing. (sin. P. pulmonarius), care conțin manoză, galactoză, xiloză și glucoză în raport molar 2:12:42:42; xiloză, manoză și galactoză în raport molar 9:35:56; glucoză și xiloză în raport molar 40:44 sau 62:36 au efect antitumoral dovedit experimental în sarcomul 180. Ribonucleaza cu masa molară de 12 kDa, izolată din această specie are acțiune antiproliferativă pe hepatomul HepG2 și leucemia L1210 .

– acțiune antitumorală pe S180 au și poliholozidele din P. citrinopileatus , denumit popular yuhuangmo . Efectul antiproliferativ al poliholozidei bogate în glucoză și manoză este corelat cu acțiunea imunostimulatoare . Fracțiunea poliholozidică extrasă în mediu alcalin și la cald din P. tuber-regium are efect antiproliferativ pe liniile tumorale experimentale HL-60 și Hep G2.

Imunomodulatoare

– fracțiunea poliholozidică (pleuranul) din P. ostreatus acționează in vivo asupra macrofagelor, efectul imunomodulator fiind mult crescut, în sensul stimulării activității fagocitare a leucocitelor, prin carboximetilarea acestui glucan. (1-3)- și (1-6)-glucanii din P. florida stimulează activitatea fagocitară a macrofagelor.

Antioxidantă

– pleuranul (β-D-glucan) din P. ostreatus crește activitatea superoxid dismutazei, glutation peroxidazei, glutation reductazei, glutation-S-transferazei, catalazei eritrocitare și inhibă peroxidarea lipidică ; Extractul obținut din P. citrinopileatus și caracterizat prin prezența ergosterolului și acidului nicotinic în cantitate mare este antioxidant pe radicalii liberi de difenilpicrilhidrazil și antihiperlipidemic.

– extractul alcoolic din P. pufmonarius inhibă peroxidarea lipidică și acționează asupra radicalilor hidroxil liberi, dar nu și asupra celor superoxid ;

– în cazul speciei P. abalones efectul antioxidant este asociat cu prezența compușilor fenolici ;

– proprietățile antioxidante și conținutul ridicat în fibre diminuă riscul apariției cancerului de colon.

Antiinflamatoare

– extractele metanolice obținute din P. florida au efect antiinflamator asemănător diclofenacului, în modelul inducerii inflamației acute sau cronice a labei de șobolan cu carrageen, respectiv formaldehidă. Efectul benefic al β-glucanului (pleuranul) în tratamentul colitei este explicat prin modificarea activității mieloperoxidazei dinn segmentul de colon inflamat și scăderea infiltrării neutrofilelor. Acest pleuran are rol imunomodulator în colita ulcerativă indusă cu acid acetic administrat intracolonic.

Antimicrobiană

P. ostreatus acționează pe Bacillus subtilis, pe Staphylococcus aureus și Escherichia coli și antifungică pe Aspergillus niger. P. ostreatus nu este activ pe Candida albicans. Compuși care inhibă dezvoltarea Staphylococcus aureus se găsesc și în P. griseus, P. multilus (Fr.)Sacc. și P. passeckerianus Pilat. Acțiunea speciei P. ostreatus pe P. aeruginosa, A. niger, B. subtilis și Fusarium oxysporum este explicată prin prezența p-anisaldehidei sau prin prezența seleniului care leagă chitina conținută în structura pereților celulari fungici. Din această specie a fost izolată și o peptidă antifungică, cu masa moleculară de 7 kDa; aceasta acționează pe F. oxysporum, Mycosphaerella arachidicola și Physalospora piricola .

Ribonucleaza cu masa moleculară de 12 kDa, izolată din P. sajor-caju inhibă F. oxysporum, M. arachidicola, P. aeruginosa, S. aureus. Efectul antifungic pe F. oxysporum și M. arachidicola a fost dovedit și pentru peptida eryngin din corpul fructifer de P. eryngii .

Antivirală

– fracțiunea proteică din P. ostreatus a prezentat in vitro efect inhibitor pe HIV, prin inhibarea activității revers-transcriptazei HIV-1 ;

– din corpul fructifer proaspăt de P. eryngii s-a izolat o protează (pleureryn) activă pe HIV-1 revers transcriptaza.

β-glucanii din P. tuber-regium nu sunt antivirali, dar derivații sulfatați ai acestora inhibă replicarea virală a virusurilor HSV-1 și -2, syncytal și influenza A.

Antihipertensivă

Extractul apos obținut din P. sajor-caju determină la administrare i.v. scăderea tensiunii arteriale la șobolanii de experiență, probabil prin scăderea filtrării glomerulare. Efect antihipertensiv al extractului apos obținut la cald și manitolului din P. cornucopiae (Tamogi-take mushroom) este explicat prin inhibarea ACE.

Antiaterogenă

Extractul etanolic din P. ostreatus sau ciuperca uscată au efect antiaterogen Administrarea la iepuri a unei diete bogate în această ciupercă previne formarea plăcii de aterom și reduce incidența unor afecțiuni coronariene. Acest efect a fost demonstrat și pentru P. florida.

Antiagregantă plachetară

– extractul metanolic obținut din P. florida are acțiune antiagregantă plachetară ;

De creștere a densității osoase

P. eryngii crește acțiunea fosfatazei alcaline din osteoblaste și determină in vivo la șobolanii cu osteoporoză indusă prin ovariectomie, creșterea densității osoase.

Alte acțiuni:

Prin teste efectuate pe celule de mamifere CHO-K1 și pe Salmonella thyphimurium s-a demonstrat că extractul alcoolic obținut din P. ostreatus are un slab efect mutagen în prezența sistemului activator metabolic S-9 .P. cornucopiae împiedică apariția de mutații prin tratarea cu radiații UV a culturilor de S. thyphimurium și Escherichia coli sau cu benzo-[a]-piren pe S. thyphimurium TA98 . P. sajor-caju nu are efect protector împotriva modificărilor produse de H2O2 asupra ADN-ului celular.

8. ÎNTREBUINȚĂRI

Chiar dacă astăzi în România aceste specii prezintă numai interes gastronomic, menționăm că pot constitui un adevărat tezaur terapeutic pentru persoanele cu hipercolesterolemie și pot fi un adjuvant prețios pentru diabetici, având în vedere că valoarea HDL-colesterolulului este scăzută la cei tratați cu hipoglicemiante.

Medicina tradițională chineză menționează P. ostreatus ca dietă ideală în prevenirea afecțiunilor cardiovasculare, datorită conținutul ridicat în fibre, steroli, proteine și microelemente, precum și aportului caloric redus. Poliholozidele de tip β-glucani din P. tuber-regium pot fi folosiți ca supliment nutritiv .

Valoarea alimentară deosebită, prin compoziție chimică, miros și gust plăcut, a determinat cultivarea acestei ciuperci în toată lumea (pentru obținerea unor randamente superioare se folosesc medii sintetice pe suport de polipropilen).

Efecte secundare

Au fost semnalate alergii datorate inhalării sporilor speciei P. ostreatus, P. cornucopiae, P. eringii și ai altor specii ale genului Pleurotus, dar și dermatite alergice de contact. Pentru diagnosticarea și terapia acestor alergii se pot obține preparate standardizate din ciupercile respective.

Aspecte toxicologice

P. olearius poate produce intoxicații .

Proteina denumită pleurotolysin are proprietăți hemolitice.

În literatura de specialitate este menționat efectul toxic al speciei P. ostreatus recoltată din Bagdad (Irak) la 1 – 4 zile după ploaie. S-a observat producerea de hemoragii intestinale, hepatice, pulmonare și renale la animale, doza toxică fiind de 3g/kg. Această specie poate acumula cantitați mari de cesiu radioactiv sau de mercur din mediul de cultură. P. eryngii poate acumula cantități mari de plumb .

9.PREPARATE FARMACEUTICE

MYCODEFENSE

MYCO DEFENSE este un amestec de ciuperci folosite de mii de ani in China și Japonia pentru proprietățile lor medicinale excepționale, confirmate de cercetările stiințifice din ultimele decenii: Cordyceps (Cordyceps sinensis), Maitake (Grifola Frondosa), Reishi (Ganoderma Lucidum), Yamabushitake (Hericium erinaceus), Himematsutake (Agaricus blazei Murrill), Shiitake (Lentinus Edodes), Zhu Ling (Polyporus umbellatus), Kawaratake (Coriolus versicolor), Hiratake (Pleurotus ostreatus), Chaga (Inonotus obliquus), Agarikon (Fomitopsis officinalis), Mesima (Phellinus linteu), vitamina C, ghimber.

Partea utilizată: miceliu, primordiu, sclerotiu, stem, fruct (toate fazele de creștere ale ciupercilor), Ghimbir – rădăcină.

Componente bioactive: betaglucani, heteroglucani, proteoglucani, cordycepin, galactomanani, arabinoxilani, ergosteroli, glicoproteine, hericenone, triterpene, nucleotide, germaniu

Efecte:

–         imunostimulator puternic (activează celulele imunocompetente);

–         adaptogen (stimulează selectiv funcțiile organismului ajutându-l să se adapteze fizic, psihic, imunitar);

–         tonifică energia Qi (energia vitală care susține întregul organism);

–         antitumoral excepțional: protejează celulele sănătoase, previne metastazele, inhibă angiogeneza (util și in degenerescență maculară), contracarează efectul prostaglandinelor care produc inflamații și impiedică maturizarea limfocitelor T;

–         adjuvant in chimioterapie (ex. impiedică anemia prin susținerea hematopoiezei);

–         hepatoprotector puternic (regenerează celula hepatică, detoxifiant, stimulează producția endogenă de interferon);

–         antidiabetic (reduce rezistența la insulină);

–         antiviral (ex: virusul Epstein-Barr care provoacă mononucleoză și sindrom de oboseală cronică, hepatic B, herpetic, HIV, Human Papilloma, sindrom Kaposi) și antibacterian (ex: bacteria Borelia care provoacă maladia Lyme), antifungic (micoze);

–         neuroregenerator (stimulează factorul de creștere neuronal);

–         scade nivelul colesterolului și al trigliceridelor, antihipertensiv;

–         tonic cardiac, pulmonar; digestiv, renal;

–         impiedică agregarea plachetară;

–         antialergic (inhibă producția de histamină);

–         tonic sexual.

Prezentare: flacon cu 60 capsule a 1000mg amestec ciuperci, 60mg vitamina C, 45mg Ghimbir rădăcină.

Mod de administrare: 2 capsule/zi sau conform recomandării consultantului de specialitate.

Producător: Nature's Way S.U.A.

PARTEA PRACTICĂ

Fig.5. Pleurotus ostreatus

1. OBȚINERE

Definiție: corpii de fructificație ai speciei Pleurotus ostreatus, păstrav, găinușa pădurii, familia Pleurotaceae.

Pentru această lucrare am folosit produsul vegetal comercializat prin supermarketul Selgros.

2. DETERMINAREA IDENTITĂȚII

S-a realizat prin aplicarea metodelor calitative de analiză (examen macroscopic, microscopic și chimic calitativ).

2.1. Examen macroscopic

Principiul metodei

Prin acest examen care reprezintă primul stadiu de investigare al produselor vegetale noi sau cunoscute, s-a urmărit observarea caracterelor morfologice detectabile cu ochiul liber sau la lupă și a celor organoleptice percepute prin gust sau miros. În acest mod este analizată întreaga varietate de produse vegetale ale căror caracteristici sunt determinate de natura organelor din care sunt constituite, poziția taxonomică a plantelor de la care provin și de forma lor de prezentare: produse întregi (in toto), fragmente (concissum) sau pulverizate (pulveratum). Examenul macroscopic se efectuează în ordinea precizării următoarelor elemente:

Aspectul prin care se stabilesc:

forma produsului (întreg sau fragmentat)

particularitățile fețelor

fractura

consistența

tipul secțiunii transversale și raportul dintre țesuturi (la lupă)

Dimensiunile se apreciază în:

cm pentru majoritatea produselor (folosind rigla)

mm pentru fructele și semințele mici (folosind hârtie milimetrică)

mm pentru celule, incluziuni celulare (granule de amidon, cristale etc. – folosind micrometrul ocular sau obiectiv).

Culoarea se observă la exterior și la interior.

Mirosul se percepe pe produsul ca atare, zdrobit între degete (frunze, flori)

sau pulverizat.

Gustul se determină pe produsul ca atare sau pe decoct (nu se înghite, se elimină și se clătește gura cu apă).

Examenele macroscopice de produse întregi sunt de cele mai multe ori suficiente pentru determinarea identității acestora. Caracterele organoleptice mai oferă și unele orientări asupra compoziției chimice a produselor analizate prin culoare, gust, etc. Pentru produsele vegetale pulverizate, examenul macroscopic dă unele informații care uneori nu sunt suficiente identificării, în care caz investigarea se continuă prin examenul microscopic.

Astfel, culoarea galbenă, roșie, albastră, portocalie a florilor și fructelor presupune prezența pigmenților flavonoidici sau carotenoidici, culoarea portocalie la scoarțe și organe subterane indică prezența derivaților antrachinonici, culoarea brună la frunze, organe subterane și unele cotiledoane este explicată de conținutul în taninuri catehice al acestor produse.

Gustul amar al produselor se poate datora prezenței substanțelor amare, heterozidelor cardiotonice sau a unor alcaloizi; gustul astringent poate indica prezența taninurilor; gustul aromat este atribuit prezenței uleiurilor volatile și rezinelor; gustul dulce se identifică cu prezența glucidelor. (4)

REZULTATE

Pălăria orizontală, în formă de ureche sau scoică, diametrul 5-15 cm ,cu margina răsucită.

Fața superioară netedă, cenușie , brun-cenușiu , cenușiu-maronie, negricioasă, se decolorează cu vârsta.

Fața inferioară cu lamele albicioase sau cenușii, foarte decurent, largi, anastomazate la bază.

Piciorul lateral,scurt de 1-4 cm, gros de 1-3 cm, alb-zbârlit, păros la bază, adeseori lipsește.

Carnea albă,moale,elastică,miros plăcut,gust dulce.

Sporii cilindrici sau ovoizi ( 8-12 x 3-4 microni ), hialini, netezi, albi în masă .

CONCLUZII

Coincidența acestor rezultate cu datele din literatura de specialitate a condus la concluzia că produsul analizat este Pleurotus Ostreatus.

fig.5.Pleurotus Osteartus

2.2 Examen microscopic

Acest examen, ce reprezintă o fază mai avansată a analizei calitative a produsului vegetal, urmărește identificarea țesuturilor și elementelor anatomice caracteristice ale secțiunilor preparatelor clarificate din pulberi sau produse fragmentate.

Caracterele anatomice ale diferitelor organe ale plantei servesc în unele cazuri și la precizarea poziției taxonomice a speciilor producătoare.

Principiul metodei

Preparatele microscopice se realizează prin metode diferite în funcție de natura, starea produsului (întreg, fragmentat sau pulverizat) consistența și chiar compoziția sa chimică.

Examenul microscopic al produselor vegetale pulverizate:

Produsul vegetal se pulverizează prin zdrobire sau măcinare, urmată de omogenizare prin cernerea pulberii (sita de 30 ochiuri/cm2).

Preparatul microscopic se obține utilizându-se un reactiv sau o soluție de clarificare a cărui alegere se face fie pentru clarificarea pulberii vegetale, fie pentru obținerea unor reacții caracteristice cormpușilor chimici ai pereților celulari sau ai conținutului celulelor.

Pe o lamă de microscop se aduc 2-3 picături din soluția de clorhidrat (R), în care se presară pulberea vegetală cu un ac spatulat. Preparatul astfel obținut se încălzește ușor deasupra uneî flăcări până se percepe un miros ușor înțepător. După răcire se acoperă cu o lamelă. Dacă este necesară prelungirea încălzirii se mai adaugă 1-2 picături din soluția de clorhidrat. Pentru punerea în evidență a elementelor lignificate se adaugă preparatului, inainte de acoperirea cu lamela, 1-2 picături de floroglucină în acid clorhidric (R).

Examenul microscopic al unei pulberi vegetale are ca scop precizarea organului din care este constituit produsul vegetal respectiv, prin identificarea elementelor anatomice comune organulul și stabilirea celor caracteristice produsulul.[6]

conform procedeului clasic și au fost examinate la microscopul Labophot-2 Nikon (ob. X1O, ob. X40). (4)

Rezultate

– miceliu cu hife filamentoase, pluricelulare, ramificate. Fig.6-7-8

– hife himeniale cu numeroși bazidiospori. Fig.9

– spori mici. Fig.10

Fig.6. Miceliu cu hife filamentoase, pluricelulare, ramificate. Ob.10X

Fig.7.Hife filamentoase.Ob.4X

Fig.8. Hife pluricelulare,celule seriate. Ob.40X

Fig.9 Hife himeniale cu numeroși bazidiospori.

Fig.10.Hife și spori.Ob 40X

Fig.11. Hife cu celulele dispuse cap la cap

Fig.12.Zonă himenială, bazidi cu bazidiospori

2.3. Examen chimic calitativ

Examenul chimic calitativ are ca scop stabilirea compoziției chimice a unei plante folosind extracția succesivă cu solvenți de polarități diferite.

În primul rând, produsul vegetal este extras cu un solvent nepolar :eter etilic,benzen, cloroform etc, apoi cu un solvent polar : etanol, metanol și în cele din urma cu apă. În extractul eteric se găsesc compuși chimici lipofili ( uleiuri volatile, substanțe grase, acizi grași și rezinici, alcaloiyi baze , agliconi flavonici, antrachinonici și cumarinici, steroli, triterpene și carotenoide ), iar în extractele alcoolic și apos, comupși chimici hidrofili ( polifenoli, alcaloizi săruri, aminoaciyi, glicozide polifenolice, sterolice și triterpenice, antociani și glucide ). Extractele respective sunt analizate separat, folosind metode corespunzătoare proprietăților fizico-chimice ale fiecărui grup de principii active.

Principiul metodei :

Examenul chimic calitativ a fost efectuat pe produs vegetal Pleurotus ostreatus. Pentru o extracție mai eficientă a principiilor active, produsul vegetal a fost mai întâi mărunțit, aopi extracția s-a făcut succesiv folosind solvenți cu polarități diferite – eter etilic și apă – obținându-se o soluție extractivă eterică și una apoasă. Fiecare dintre soluții a fost analizată chimic, urmărind constituenții solubili în mediul respective .

Identificarea grupelor de principii active s-a făcut folosind reactivi de culoare sau de precipitare specifici pentru compușii respective menționați în literature de specialitate.

A. Analiza soluției extractive eterice

Tehnică de lucru :

5 g produs vegetal pulverizat se extrage cu eter etilic prin agitare manuală, la temperatura mediului ambiant. Acest extract poate conține compuși chimici liposolubili : ulei volatil, steroli, triterpene, carotenoide, acizi rezinici, alcaloizi baze, agliconi flavonici, agliconi ai antracenozidelor (emodoli), cumarine, clorofilă. Identificarea acestor compuși chimici se face după următorul mers de analiza.

* Identificarea agliconilor flavonici

Flavonele sunt substanțe solide, cristalizate, colorate în galben de diferite intensități. Heterozidele flavonice sunt solubile în apă, alcool diluat și concentrat, solubile specific în acetat de etil, acetonă, insolubile în solvenți apolari.

Agliconii sunt solubili în alcool, acetat de etil, acetonă, insolubili în solvenți apolari. Heterozidele hidrolizează numai în prezența acizilor minerali (nu hidrolizează enzimatic) În condiții diferite, în funcție de atomul de Iegătură dintre aglicon și partea glucidică: 0-heterozidele hidrolizează ușor, C-heterozidele hidrolizează în prezența unor concentrații mari de acid, într-un timp mai îndelungat, la presiune ridicată și în prezența unor catalizatori.

Datorită grupării cetonice de la C flavonele se pot reduce cu hidrogen născând în mediu hidroalcoolic când se formează antocianidoli (reacția Shibata). Culoarea acestora poate fi roșie (flavonoli) sau portocalie (flavone).

Prezența grupărilor oxidril fenolice permite transformarea, în mediu alcalin, a flavonelor în fenoxizi de culoare galbenă mai intensă decât flavona inițială.

Grupările oxidril alcoolice din vecinătatea grupării ceto permit formarea de chelați cu metale bi- și trivalente, colorați în galben mai intens decât flavona inițială.

a) Reacția Shibata (cianidolului)

Principiul metodei:

Reducerea grupării cetonice a flavonelor cu hidrogen nativ (rezultat în reacția dintre magneziu și acid clorhidric concentrat). Se formează clorura de oxoniu colorată în roșu

quercetol (galben) clorură de cianidol

roșie

Reactivi necesari:

acid clorhidric concentrat

magneziu metalic

Tehnica de lucru:

1 ml soluție se introduce într-o eprubetă cu câteva fragmente de magneziu metalic (span). La adăugarea de 4-6 picături de acid clorhidric concentrat apare o colorație roșie sau portocalie.

b) Reacția cu hidroxidul de sodiu (NaOH)

Principiul metodei:

Dizolvarea flavonozidelor în alcalii cu obținerea de fenolați (flavoxizi) intens colorați în galben.

quercetol fenoxid

galben

Reactivi necesari:

soluție hidroxid de sodiu 5%

Tehnica de lucru:

La 1 ml soluție de analizat se adaugă 1 ml soluție hidroxid de sodiu 5%. În cazul unei reactii pozitive colorația galben a soluției de analizat se intensifică față de cea a martorului în care nu s-a adăugat soluție de NaOH 5%.

c) Reacția cu clorura de aluminiu (AlCl3)

Principiul metodei:

Chelatarea cu săruri ale metalelor bi- și trivalente.

Flavonele cu grupări libere la C3 sau C5 formează împreună cu gruparea ceto de Ia C4 chelați în poziția orto(I) sau para(II). Acești compuși se pot obține și atunci când pe nucleu există două grupări -OH vicinale, iar mediul de reacție este alcalin, pentru că în aceste condiții gruparea -OH din 4 se transformă în grupare cetonică prin tautomerie -poziție para (III). Chelații obținuți sunt de culoare galbenă intensă și au o fIuorescență galben-verzuie sau albastră în UV.

Reactivi necesari:

soluție de acetat de sodiu 10%

soluție clorură de aluminiu 2,5%

Tehnica de lucru:

La 1 ml soluție de analizat se adaugă 0,5 ml acetat de sodiu (R) și 1 ml clorură de aluminiu 2,5%. Colorația galbenă a soluției de analizat se intensif

* Identificarea emodolilor

Reacția Bontrager

Principiul metodei:

Se bazează pe proprietatea agliconilor forme oxidate (antrachinone) de a trece din emodoli în fenoxizi (emodinați) de culoare roșie-vișinie, în prezența soluțiilor alcaline. Sensibilitatea reacției este de10-5. Aceasta poate fi efectuată direct pe produsul vegetal, pe microsublimat sau în soluție apolară de agliconi. Agliconii cu funcție carboxilică formează fenoxizi chiar în prezența carbonatului acid de sodiu.

Reactivi necesari:

soluție HCI 10%

soluție NaOH 10%

Tehnica de lucru:

Soluția extractivă apoasă se hidrolizează cu HCI 10 % și se extrage apoi cu eter. Se iau 3-4 ml soluție eterică într-o eprubetă și se adaugă 0,5-1 ml soluție NaOH 10%. În cazul unei reacții pozitive stratul inferior apos se colorează în roșu iar cel superior, apolar, se decolorează.

* Identificarea sterolilor sau a triterpenelor

Reacția Liebermann – Burchard:

Principiul metodei:

Formarea unei colorații violet sau verde (datorită formării unui dimer) în prezența H2SO4 concentrat și a anhidridei acetice.

Reactivi necesari:

H2SO4 concentrat

anhidrida acetică

Tehnica de lucru:

Din soluțiile hidrolizate, extrase cu eter, se iau 3-4 ml, se evaporă la sicitate, pe baia de apă, iar reziduul se dizolvă cu 1-2 ml soluție anhidridă acetică; 0,5-1 ml servesc ca martor și restul se toarnă cu grijă peste un volum egal de H2SO4 concentrat. Apariția unei colorații violet indică o reacție pozitivă.

* Identificarea alcaloizilor

Alcaloizii sunt substanțe organice cu caracter bazic ce conțin în moleculă un atom de N heterociclic și au activitate farmacodinamică specifică și toxicitate ridicată.

Deși prezintă structuri chimice foarte variate, toți alcaloizii se comportă aproape identic față de anumiți reactivi denumiți reactivi generali ai alcaloizilor din care fac parte două categorii: reactivi generali de precipitare și reactivi generali de culoare. Reacțiile de precipitare se efectuează pe sărurile alcaloizilor (deci în mediu acid apos), iar cele de culoare pe rezidiile bazelor alcaloidice.

•Reacții de precipitare

Principiul metodei:

Toți alcaloizii, cu mici excepții, dau cu reactivii de precipitare precipitate albe, galbene, portocalii, brune și mai rar alte culori.

Reactivi necesari:

acid clorhidric 2%

reactiv Mayer (soluție apoasă de tetraiodomercuriat de potasiu cu adaos de clorhidrat)

reactiv Bertrand (soluție apoasă de acid silicotungstic)

Tehnica de lucru:

10 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de nisip. Reziduul se dizolvă în 1,5 ml acid clorhidric 2% prin amestecare cu o mică baghetă de sticlă la cald (pe baia de apă). Soluția decantată se împarte în trei eprubete, în volume egale. La una din probe (eprubete) se adaugă 2-3 picături de reactiv Mayer (R), la a doua probă se adaugă 2-3 picături de reactiv Bertrand (R) și ultima eprubetă servește ca probă martor.

Dacă probele tratate cu reactivi dau opalescențe sau precipitate evidente (de culoare alb-gălbuie), alcaloizii sunt prezenți. (5)

B. Analiza solutiei extractive apoase

* Identificarea compușilor reducători

Principiul metodei:

Se bazează pe proprietatea lor de a reduce soluția de reactiv Fehling la oxid cupros.

Reactivi necesari:

soluție Fehling I (soluție apoasă de sulfat de cupru)

soluție Fehling II (soluție apoasă de tartrat de sodiu și potasiu în hidroxid de sodiu)

Tehnica de lucru:

Peste 3 ml soluție se adaugă un amestec constituit din părți egale de soluție Fehling I și II și se încălzesc pe baia de apă. Apariția unui precipitat roșu-brun care se depune în timp indică prezența compușilor reducători.

* Identificarea ozelor și poliholozidelor

Ozele simple se identifică datorită caracterului reducător prin reacția cu reactivii Fehling sau Tollens și prin cuplarea cu o-toluidina sau fenilhidrazinele.

Poliholozidele se identifică prin reacția de culoare cu hematoxilina sau prin precipitare în alcool.

a) Reacția Molish

Este comună pentru ozele simple și pentru poliholozide.

Principiul metodei:

Condensarea furfuralului cu timol, în cazul poliholozidelor în urma depolimerizării cu H2SO4 concentrat.

Reactivi necesari:

H2SO4 concentrat

timol

Tehnica de lucru:

10 ml soluție extractivă apoasă se concentrează la sec într-o capsulă de porțelan. Peste reziduu se aduc 1- 2 picături H2SO4 concentrat și după 3-5 minute se aduce o picătură de timol. În cazul unel reacții pozitive apare o colorație roșie.

b) Precipitarea în alcool și colorarea cu hematoxilină

Principiul metodei:

Se bazează pe precipitarea poliholozidelor în alcool și colorarea precipitatului cu hematoxilină:

hematoxilina hemateina

Reactivi necesari:

metanol

hematoxilină

Tehnica de lucru:

10-15 ml soluție extractivă apoasă se concentrează la 2 ml într-o capsulă de porțelan. După răcire, soluția concentrată se toană în fir subțire peste 20 ml metanol. În cazul prezenței poliholozidelor se va obține un precipitat care, în prezența hematoxilinei se va colora în violet datorită hemateinei.

* Identificarea compușilor polihidroxifenolici (ODP- uri)

Reacția Arnow

Principiul metodei:

Constă în proprietatea fenolilor de a forma cu acidul azotos nitrozoderivați care se izomerizează spontan în izonitrozoderivați sau oxime care, datorită caracterului lor slab acid, se dizolvă în soluții alcaline dând colorații roșii.

acid cafeic nitrozoderivat oxima acidului

cafeic- roșie

Reactivi necesari:

soluție HCI 0,1 N

reactiv Arnow

soluție NaOH 0,1 N

Tehnica de lucru:

La 0,5 ml soluție de analizat se adaugă 1 ml HCI 0,1 N, 1 ml reactiv Amow și 1 ml soluție NaOH 0,1 N. În cazul unei reacții pozitive se obține o colorație roșie.

*Identificarea flavonelor

Identificarea flavonelor în soluție extractivă apoasă se face pe baza reacțiilor menționate mai sus ( r.Schibata. r. cu NaOH și r.AlCl3), acestea fiind reacții de identificare commune pentru flavonozide și agliconi flavonici.

*Identificarea antocianozidelor

Principiul metodei

Antocianozidele hidrolizează în mediu acid la încălzire cu eliberarea antocianidolilor care cristalizează sub formă de săruri de flaviliu, solubil în apă, alcool, insolubil în solvenți organici nepolari.

Prin alcalinizare, se formează întâi o pseudobază care prin eliminare de apă trece într-o formă chinonică violetă, apoi în exces de alcalii se obține sarea chinonei respective colorată în albastru – verde.

Antocianii care posedă 2 sau 3 grupări OH învecinate formează compuși chelatici cu ionii metalelor trivalente ( Al3+ , Fe3+ ) de culoare albastră.

Tehnica de lucru

Peste 1 ml soluție apoasă se adaugă 1 ml NaOH rezultând colorații diferite în funcție de pH : colorație roșie la pH mai mic de 7, violet la pH= 7-8 , fenoxid albastru la pH= 8, și colorație galbenă (calchonă) la pH=12.

* Identificarea proantocianilor

Antocianii sunt substanțe solide, cristalizate, colorate, solubile în alcool concentrat sau diluat și în solvenți organici apolari; la pH=7, insolubili în apă. În apa acidulată (pH < 3) formează săruri de oxoniu solubite, colorate în roșu Cu bazele formează fenoxizi solubili de diferite nuanțe, de la violet la albastru.

Se presupune că la pH = 7, antocianii sunt derivați de 2-fenil-β cromen-3-ol, labil, care se stabiIizează prin aromatizare în mediu acid, când trec în săruri de oxoniu.

2 fenil-β-cromen cation oxoniu

Heterozidele hidrolizează prin încălzire cu acizi diluați cu eliberarea antocianidolilor. Prin alcalinizare, dacă se adaugă soluții alcaline treptat și modificarea pH-ului este lentă se obține mai întâi o pseudobază incoloră (instabilă la pH = 7) apoi forma chinonică violetã (stabilă la pH foarte slab bazic), fenoxid de culoare albastră (stabil Ia pH = 8-10); la pH = 12 se obțin calchone colorate în galben.

În sucul vacuolar (pH ≈3); ar putea avea loc adiția nucleofilă a apei care ar destabiliza structura oxonică. Se presupune însă că plantele pot preveni astfel de reacție prin acilare, co-pigmentare intermoleculară cu flavonoidele, chelatare cu metalele și autoasocierea.

Fenoxid (albastru) Fenoxid (albastru)

pH =8 pH =8

Principiul metodei:

Se bazează pe proprietatea acestora de a se transforma în antociani prin refluxare în mediu acid, conform reacției:

Reactivi necesari:

soluție de acid clorhidric 10 %

Tehnica de lucru:

10 ml soluție extractivă apoasă nehidrolizată se concentrează la reziduu. Acesta se reia cu 10 ml HCI și se divide în două porțiuni egale care se aduc în două eprubete. Una dintre ele se menține într-o baie de apă în fierbere timp de 30 de minute pentru transformarea proantocianidolulul în antocian, cealaltă servește drept martor. După răcire ambele soluții sunt agitate cu 3 ml butanol (pentru extracția antocianilor). Dacă soluția butanolică obținută prin încălzire prezintă o intensitate mai mare a culorii decât proba martor, în soluția de analizat există proantociani.

* Identificarea saponozidelor

Saponozidele triterpenice precipită cu acetatul neutru de plumb. Solubilitatea în apă a saponozidelor cu grupări carboxilice poate fi mărită prin alcalinizarea soluției (cu hidrogenocarbonați, carbonați, fosfați). Se formează săruri mai solubile.

Saponozidele triterpenice hidrolizează enzimatic, treptat, mai ușor decât cele sterolice, cu formare de heterozide secundare sau prosapogenoli și oze. La început se scindează hexozele, apoi pentozele și în final acizii uronici. Hidroliza acidă, deși totală, este nespecifică în mediu de reacție regăsindu-se agliconii, ozele și eventual acizii uronici sau acizii organici care participă la structura saponozidei respective.

a) Proba de spumefiere: se execută asupra soluției extractive apoase care se agită timp de 15 sec într-o eprubetă cu diametrul de 16 mm. Se formează o coloană de spumă care persistă cel puțin 15 mm.

b) Reacția cu acetatul de plumb: saponozidele triterpenice reacționeză cu acetatul de plumb 5% când se formează un precipitat alb.

c) Reacția cu hidroxid de bariu: saponozidele formează cu hidroxidul de bariu un precipitat alb.

* Identificarea taninurilor

Taninurile sunt substanțe solide, amorfe. Combinațiile cu masă moleculară mică pot cristaliza, fiind incolore. Taninurile se dizolvă în apă la cald, mai greu la rece, formând soluții coloidale (solubilitatea variază cu gradul de condensare) în alcool, acetonă, acetat de etil; sunt insolubile în eter, cloroform, benzen, eter de petrol, sulfură de carbon și în alți solvenți organici apolari.

Au gust astringent, fiind lipsite de miros; au activitate optică și sunt higroscopice. Sunt absorbite de pulberea de piele, cărbune, vată, oxid de aluminiu, caolin. Acizii și sărurile minerale precipită taninurile din soluțiile coloidale.

Fiind fenoli cu caracter reducător (reduc reactivii Tollens, Fehling și KMnO4, H2O2, I2) dau colorații caracteristice cu sărurile de Fe (III): verde-negricios în cazul taninurilor catehice și albastru-negricios când sunt prezente taninurile galice. Caracterul acid se datorează grupărilor -COOH și -OH fenolice libere.

Cu proteinele (substanțe amidice) taninurile formează combinații macromoleculare tridimensionale, impermeabile și impenetrabile (se stabilesc punți de hidrogen cu grupările polare ale proteinelor).

Principiul metodei:

Se bazează pe proprietatea taninurilor de a determina colorații albastre (taninuri galice) sau verzi (taninuri catehice) în prezența sărurilor de Fe+3. Pentru decelarea exactă a tipului de tanin existent se precipită taninurile catehice sub formă de flobafene (precipitat roșu) cu reactiv Styassny. După separarea precipitatului, în filtrat se execută reacția cu Fe+3 în scopul identificării taninurilor galice. O colorație albastru- negricioasă indică o reacție pozitivă.

Reactivi necesari

reactiv Styassny (amestec HCI : CH2O = 1: 2)

soluție FeCI3 1% sau alaun feric 1%

soluție acetat de sodiu 10%

Tehnica de lucru:

Peste 2 ml soluție apoasă se adaugă 0,5 ml soluție FeCl3 1%. Se formează o colorație verde-brună datorită prezenței taninurilor catehice. Separat se încălzește la fierbere pe baia de apă, timp de 30 minute o probă de 4 ml soluție apoasă și o cantitate echivalentă de reactiv Styassny. Se formează un precipitat roșu care se filtrează prin hârtie de filtru. Filtratul se neutralizează cu soluție de acetat de sodiu10 % și se adaugă 2- 4 picături soIuție FeCI3 1%. Colorarea în albastru a soluției indică prezența taninurilor galice.

* Identificarea alcaloizilor

Alcaloizii sunt substanțe organice cu caracter bazic ce conțin în moleculă un atom de N heterociclic și au activitate farmacodinamică specifică și toxicitate ridicată.

Deși prezintă structuri chimice foarte variate, toți alcaloizii se comportă aproape identic față de anumiți reactivi denumiți reactivi generali ai alcaloizilor din care fac parte două categorii: reactivi generali de precipitare și reactivi generali de culoare. Reacțiile de precipitare se efectuează pe sărurile alcaloizilor (deci în mediu acid apos), iar cele de culoare pe rezidiile bazelor alcaloidice.

•Reacții de precipitare

Principiul metodei:

Toți alcaloizii, cu mici excepții, dau cu reactivii de precipitare precipitate albe, galbene, portocalii, brune și mai rar alte culori.

Reactivi necesari:

acid clorhidric 2%

reactiv Mayer (soluție apoasă de tetraiodomercuriat de potasiu cu adaos de clorhidrat)

reactiv Bertrand (soluție apoasă de acid silicotungstic)

Tehnica de lucru:

10 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de nisip. Reziduul se dizolvă în 1,5 ml acid clorhidric 2% prin amestecare cu o mică baghetă de sticlă la cald (pe baia de apă). Soluția decantată se împarte în trei eprubete, în volume egale. La una din probe (eprubete) se adaugă 2-3 picături de reactiv Mayer (R), la a doua probă se adaugă 2-3 picături de reactiv Bertrand (R) și ultima eprubetă servește ca probă martor.

Dacă probele tratate cu reactivi dau opalescențe sau precipitate evidente (de culoare alb-gălbuie), alcaloizii sunt prezenți. (5)

Rezultate și discuții

Rezultatele examenului chimic calitativ sint prezente în tabelele 1 – 3. se poate observa că în produsul vegetal studiat ( ciuperca Pleurotus ) am identificat:

În soluție eterică – agliconi sterolici și terpenici

Alcoolică – compuși azotați

Apoasă – triterpene

– poliuranide

– oze , polizaharide

– compuși azotați

– compuși reducători

Tabelul 1.Date experimentale obținute la examenul chimic calitativ pe soluții extractive eterice

Tabelul 2.Date experimentale obținute la examenul chimic calitativ pe soluție extractivă alcoolică

Tabelul 3.Date experimentale obținute la examenul chimic calitativ pe soluție extractivă apoasă

3. Determinarea calității

Pentru stabilirea calității unui produs vegetal sunt necesare determinări preliminare (verificarea umidității, determinarea reziduului prin calcinare și a substanțelor solubile) și dozarea principiilor active.

3.1. Determinări preliminare

Determinarea umidității

Pentru asigurarea conservării produselor vegetate, acestea trebuie să aibă un grad de umiditate care să se încadreze în anumite limite. Cantitatea de apă din produsele vegetale este influențată de gradul de uscare, de mediul ambiant și de compoziția chimică a acestora.

Principiul metodei

Procedeele de determinare a conținutului de apă din produsele vegetale sunt diferite (uscare la etuvă, uscare la vid, uscare la exicator, antrenare cu vapori de solvenți organici).

Dintre aceste posibilități s-a ales uscarea la etuvă folosind produs vegetal uscat. Pentru uscare produsul vegetal trebuie menținut la temperatura ambiantă timp de câteva zile.

Tehnica de lucru:

Într-o fiolă de cântărire adusă la greutate constantă prin încălzire la etuvă, la aceeași temperatură la care urmează să se facă și uscarea, și răcită în exicator, se introduc 3-5 g probă de analizat; diametrul fiolei se alege astfel încât cantitatea de material luat în lucru să nu depășească un strat mai gros de 5 mm. Fiola cu produs vegetal mărunțit (sita IV) se menține patru ore la etuvă la 100-105 °C, se răcește în exicator și se cântărește. Se continuă uscarea câte 60 de minute, răcirea în exicator și cântărirea până la greutate constantă.

Rezultate și discuții

Prin aplicarea acestei metode am stabilit pentru produsul studiat o valoare a umidității cuprinsă între 80 – 81,7 %

Determinarea substanțelor solubile

Substanțele solubile reprezintă cantitatea de constituienți chimici dintr-un produs vegetal, care se dizolvă într-un anumit solvent (alcool, apă, eter). Am determinat substanțele solubile în apă, în eter și în alcool datorită particularităților observate în cadrul examenului chimic calitativ.

Principiul metodei

Pentru determinare am folosit metoda prevăzută în Farmacopeea Română ediția a X-a.

Tehnica de lucru

0,5-1,0 g produs vegetal pulverizat (VI) se cântărește la balanța analitică și se aduc într-un flacon cu dop rodat; se adaugă 10-20 g din solvent și se agită energic de câteva ori. Se lasă la macerat 23 ore, se agită din nou timp de 1 oră și se filtrează, îndepărtând primele porțiuni de filtrat.

10,0 g filtrat se evaporă la sicitate pe baia de apă, într-o fiolă de cântărire în prealabit cântărită. Fiola de cântărire cu reziduu se usucă în etuvă, la 1050C, timp de 3 ore, se răcește în exicator și se cântărește.

Reziduu reprezintă substanțe solubile și se raportează la 100 g produs vegetal.(7)

Rezultate și discuții

Rezultatele obținute prin aplicarea acestei metode sunt următoarele:

substanțe solubile în apă: 23,3 – 23,8 g %

substanțe solubile în alcool: 17,2 – 17,6 g %

substanțe solubile în eter: 12,6 – 12,8 g %

Concluzii

Din rezultatele obținute prin această metodă se observă că în produsul vegetal Pleurotus predomină substanțele solubile în apă urmate de cele solubile în alcool și apoi cele solubile în eter.

3.2. Dozarea principiilor active

S-a considerat necesar să se determine conținutul în poliholozide.

Determinarea cantitativã a poliholozidelor

Metoda gravimetrică

Principiul metodei:

Constă în precipitarea poliholozidelor în mediu alcoolic.

Prepararea soluției de analizat:

1,000 g produs vegetal s-a extras de două ori cu câte 20 ml apă distilată, la fierbere, după care s-a filtrat prin vată. Soluția extractivă obținută s-a concentrat la 20 ml.

Tehnica de lucru:

Soluția extractivă apoasă care s-a supus concentrării după răcire s-a tunat în fir subțire într-un pahar Berzelius peste o cantitate de zece ori mai mare de metanol concentrat. Precipitatul obținut s-a lăsat în repaus timp de 24 ore după care s-a filtrat cantitativ printr-o hârtie de filtru anterior ținută în exsicator și apoi cântărită. Hârtia de filtru cu precipitatul s-a menținut timp de 48 ore în exicator după care s-a cântărit.

Calculul

Se face diferența între cele două mase cântărite (hârtia de filtru și hârtia de filtru cu precipitatul) și se raportează la 100 g produs vegetal (substanță uscată).

C% – concentrația în taninuri catehice exprimată în grame

mb – masa hârtiei de filtru cu precipitat

ma – masa hârtiei de filtru

g – cantitatea de produs vegetal cântărită

Rezultate și discuții

Prin raportarea cantității de precipitat obținută la 100 g produs vegetal (substanță uscată) s-a determinat un conținut de 5,7 – 5,9 g % poliholozide în produsul Pleurotus

4.TESTAREA ACȚIUNII ASUPRA CELULEI VEGETALE

Material și metodă

Testarea acțiunii soluției extractive apoase obținute din Pleurotus, asupra alungirii radiculare și asupra filmului mitotic al celulei vegetale, s-a realizat prin metoda profesorului dr Gr Constantinescu (metoda fitobiologică – testul Triticum).

Principiul metodei:

Constă în determinarea diluției maxime active a substanței studiate care, în funcție de durata de acțiune, influențează alungirea radiculară și filmul cariochinetic. Pentru testare s-a întrebuințat o singură soluție extractivă.

Pregãtirea soluției de analizat

S-a preparat o soluție apoasă 5% prin refluxarea cu apă a produsului Pleurotus Osteartus.

Pentru a observa influența concentrației asupra alungirii radiculare și mitozei, din soluția de analizat au fost obținute mai multe diluții, folosind volume diferite din soluția de testat și completând la 15 ml cu apă distilată (tabelul nr. 4).

Tabelul nr. 4. Concentrația soluțiilor de analizat

Materialul biologic pe care s-au efectuat cercetările a fost constituit din rădăcini embrionare de grâu (Triticum vulgare Mill, soiul Dropia, Gramineae, provenit de Ia ICCPT Fundulea).

Germinarea semințelor

Cariopsele de grâu, selecționate pentru a fi cât mai omogene, se îmbibă cu apă distilată, timp de 24 ore, la temperatura din laborator (18- 25oC), după care se pun la germinat în cutii Petri, cu diametrul de 15-20 cm, pe substrat de hârtie de filtru umectată cu apă. Când lungimea rădăcinilor principale atinge 1 cm, se introduc câte 5-6 cariopse germinate într-o cutie Petri, cu diametrul de 10 cm, care conține 5 ml soluție de testat și se păstrează la temperatura camerei.

Evaluarea creșterii în lungime a rădăcinilor

Se folosește tehnica măsurătorilor lineare, apreciind alungirea rădăcinii principale din momentul inițial al tratamentulul, respectiv din prima zi, la intervale de 24 ore, pe parcursul a 5 zile, considerând această perioadă drept faza cea mai activă de creștere. Rezultatele se exprimă comparativ cu un martor M, unde s-a utilizat apa distlatã în locul soluției de cercetat. Se fac observații asupra modificărilor morfologice: aspectul și numărul radicelelor, aspectul și lungimea epicotilulul.

Obținerea preparatelor microscopice

Examenul microscopic urmărește modificările filmului mitotic induse în vârfurile radiculare de Triticum vulgare. Studiul se face comparativ cu un martor (apă distilată) menținut în aceleași condiții cu probele. Rădăcinile embrionare de grâu au fost secționate la aproximativ 5 mm distanță de vârf și colorate cu orceină acetică diluată, conform procedeulul La Cour. Orceina este un colorant natural extras din lichenii din genurile Racella și Lecanora. Procedeul se bazează pe afinitatea pentru cromatină a orceinei în mediu acid (pH- ul acid este necesar pentru hidroliza materialului aromatic din meristeme, care apoi se colorează în roșu – violet).

Prepararea soluției mamă de orceină acetică

Se încălzesc 100 ml acid acetic glacial p.a. la temperatura de fierbere și se adaugă 2,2 g orceină p.a., apoi se lasă 2- 3 minute pe foc. Se răcește și se filtrează. Se păstrează la loc întunecos, în flacoane bine închise.

Prepararea soluției standard de orceină acetică 1%

Se amestecă 45 părți soluție mamă de orceină acetică cu 55 părți apă bidistilată. Prin adăugarea unei părți de soluție HCI 1N la 10 părți soluție standard în momentul întrebuințării, se obține soluția diluată de orceină acetică utilizată la colorare.

Colorarea meristemelor radiculare

Se folosesc creuzete mici de porțelan, cu diametrul de 3 cm, în care se pipetează câte 1,5 ml din soluția diluată de orceină acetică. Se secționează vârfurile radiculare de 5 mm și se introduc în această soluție. Creuzetele se încălzesc 1-2 minute pe sită de azbest la bec de gaz până la degajarea primilor vapori de acid acetic Se acoperă și se lasă în repaus 10 minute – 2 ore Vârfurile radiculare astfel colorate se pun pe o lamă de microscop, într-o picătură de soluție diluată de orceină, se acoperă cu o lamelă și se presează până la strivirea materialului de cercetat.

Preparatele se studiază folosind un microscop Labophot 2 Nikon, cu obiectivele 40x și lOOx (în imersie de ulei de cedru).

Rezultate și discuții

Rezultatele obținute prin măsurarea lungimilor rădăcinilor principale, timp de 5 zile consecutiv, sunt înregistrate în tabelele nr 5- 9

Alungirea rădăcinilor embrionare de Triticum vulgare, exprimată în cm, în funcție de timpul de acțiune exprimat în zile și de concentrația soluției de testat este exprimată în graficul din figura nr

Modificările macroscopice ale rădăcinilor embrionare și ale epicotilului, în funcție de tipul și concentrația soluției testate, după 120 de ore, sunt înregistrate în tabelul nr. 11

Tabelul nr. 5. Alungirea radiculară la martor și după menținerea

în soluțiile de testat (după 24 ore)

Tabelul nr.6. Alungirea radiculară la martor și după menținerea

în soluțiile de testat (după 48 ore)

Tabelul nr.7. Alungirea radiculară la martor și după menținere

în soluțiile de testat (după 72 ore)

Tabelul nr.8. Alungirea radiculară la martor și după menți

în soluțiile de testat (după 96 ore)

Tabelul nr.9. Alungirea radiculară la martor și după menținere

în soluțiile de testat (după 120 ore)

Tabelul nr. 10. Alungirea radicularã la martor și după menținerea în soluțiile de testat

Figura nr.13. Aspectul plantulelor de Triticum după 120 ore

Tabelul nr. 11. Observații macroscopice asupra plantulelor de grâu menținute 120 de ore in soluțiile testate

Din tabelele, graficele și fotografiile prezentate reiese că inhibarea creșterii în lungime a rădăcinii principale, de către soluția de analizat obținută din Pleurotus, este direct proporțională cu concentrația. Astfel, la concentrații cuprinse în intervalul 5 și 2,5 are loc inhibarea totală a alungirii radiculare, iar la concentrații mici de 0,33 se obțin valori apropiate de cele ale martorului.

Rezultatele studiului influenței extractelor testate asupra alungirii radiculare, precum și modificările macroscopice evidențiate de Testul Triticum, au impus necesitatea efectuării cercetărilor la nivel celular, prin examinare microscopică, conform tehnnicii menționate.

Pentru a putea interpreta modificările filmului mitotic induse de soluțiile testate, s-au observat mai întâi fazele mitozei normale ( la martor ): interfază, profază, metafază, anafază, telofază.

În interfază nucleul celulelor meristematice este bine conturat, are aspect granular, reticulat, se observă nucleolli; cromozomii nu sunt individualizați (cromatina este dispusă sub formă de rețea).

În profază carioteca și nucleii nu se mai observă (se dezorganizează), se individualizează cromozomii (prin spiralizare și scurtarea filamentelor de cromatină), dar dispoziția lor este neregulată.

În anafază cromozomii onocromatidici migrează spre cel doi poli, ajungând la jumătatea distanței dintre ecuator și poli (aspect diaster).

În telofază se formează nucleii fii (cromozomii monocromatidici ajunși la poli se despiralizează, refac rețeaua de filamente de cromatină, carioteca și nucleolii se reorganizează). La sfârșitul acestei faze se observă aparițiamembranei despărțitoare a celor două celule fiice.

Modificările filmului mitotic induse de soluția de analizat sunt redate în tabelul nr. 12.

Tabelul nr. 12. Modificările cariochinetice produse de extractele obținute din Pleurotus

Comparând rezultatele examenului macroscopic cu cele ale examenului microscopic, putem afirma că efectul de inhibare aproape totală a alungirii radiculare, observat la primele două concentrații, se datorează acțiunii asupra diviziunii celulare.

Discuții

Prin examinarea macroscopică a probelor timp de 120 de ore s-a observat că, în funcție de concentrație, are loc inhibarea totală sau parțială a creșterii rădăcinii principale.

Prin examinarea microscopică a probelor după 24 de ore s-au observat o serie de modificări constând în :

Efect mitoinhibitor și ușor efect citotoxic evidențiat prin nuclei cu nucleoli hipertrofiați.

Efectul mitoinhibitor apare la primele trei concentrații în funcție de concentrație, dupa cum reiese din grafic.

CONCLUZII

1. Lucrarea cuprinde o parte teoretică, în care am reușit sistematizarea datelor găsite în literatura de specialitate cu privirea la specia Pleurotus ostreatus.

2. Partea experimentală începe cu examenul macroscopic urmat de examenul microscopic, ce a permis stabilirea următoarelor elemente anatomice ale speciei Pleurotus ostreatus:

– hife articulate, ramificate

– spori mici, rotunzi

– hife pluricelulare, septate

3. Prin efectuarea examenuluifitochimic am reușit identificarea în acest produs a următorilor compuși : agenți sterolici și triptanici, compuși azotați, saponozide, poliuronide, oze, polizaharide și compuși reducători.

4. In cadrul analizei cantitative efectuate au fost dozate substantele solubile in eter, alcool, apa si polizaharidele

5. Prin testarea acțiunii extractului apos asupra divizunii celulei vegetale am demonstrat că acest efect constă în citotoxicitate ușoară sau mitoinhibiție, în funcție de concentrația soluției, și anume : efect mitoinhibitor la concentrații cuprinse între 5 – 2,5 %

În urma cercetărilor efectuate putem spune că specia Pleurotus ostreatus comercializată în România are o compoziție asemănătoare celei din alte zone geografice (despre care există date în literatura de specialitate).