Relatia Dintre Controlul Poluarii Si Biotehnologie

=== fOLII+ PREZENTARE ===

RELATIA DINTRE CONTROLUL POLUARII SI BIOTEHNOLOGIE

Diferite tulpini microbiene au fost izolate in scopul utilizarii lor la controlul diverselor forme de poluare chimica, de exemplu pentru descompunerea substantelor biocide, care sunt greu biodegradabile, a detergentilor, a materialelor din mase plastice sau a hidrocarburilor. Anumite bacterii din genul Pseudomonas poseda enzime de oxidoreducere sau hidroxilare ce descompun un numar mare de molecule de hidrocarburi sau compusi aromatici care sunt adesea foarte toxici( benzen, toluen, xilen). Mai multe tulpini de Pseudomonas putida poseda, in plasmide, gene care codifica sinteza acestor enzime.

Tehnicile ADN recombinant ar putea oferi posibilitatea de a se crea tulpini microbiene capabile sa descompuna si sa asimileze un numar mare de substante produse de industriile chimice care cel mai adesea nu sunt biodegradabile. De exemplu, in Japonia s-a izolat o tulpina apartinand actinomicetului Nocardia care ar putea distruge cauciucul in numai o saptamana. In plus, genele care codifica enzimele implicate in biodegradarea bifenililor policlorurati(PCB) ar putea fi integrate in genomul unui numar de 20 tulpini de Pseudomonas ce s-ar putea utiliza pentru descompunerea acestor substante in compusi lipsiti de toxicitate .

PEROXIREDOXINE

Peroxiredoxinele sunt peroxidaze, care fac parte din clasa oxidoreductazelor, clasa ce cuprinde enzimele care participa la procesele de oxidare biologica.

Majoritatea enzimelor din grupa peroxidazelor, enzime care utilizeaza H2O2 in calitate de oxidant, sunt homoproteide care pot folosi diferiti donori de hidrogen (glutation, citocrom c redus, NADH+H+, NADPH+H+,etc). Una din cele mai reprezentative enzime, donor: H2O2 oxidoreductaza sau peroxidaza ce catalizeaza reactia:

Donor+ H2O2 = Donor oxidat + H2O

Este inalt specifica pentru gruparea peroxidica, dar poate folosi in calitate de substrat reducator o mare varietate de substante.

Tot din aceasta clasa face parte si catalaza care are denumirea sistemica H2O2; H2O oxidoreductaza si catalizeaza reactia:

H2O2 + H2O2 = 2H2O + O2

Peroxiredoxinele sunt peroxidaze cu eficacitate mica ce utilizeaza tioli ca agenti reducatori. Ele apar a fi intr-o dezordine relativa, cu afinitate pentru substratul de hidroperoxid; afinitatile pentru substratul donor variaza considerabil intre subfamilii, cuprinzand GSH, tioredoxina, triparedoxina si CXXC in proteinele bacteriale AhpF.

Peroxiredoxinele sunt responsabile pentru apararea antioxidanta impotriva bacteriilor(AhpC), drojdii (tioredoxin peroxidaza), si tripanosomatide (triparedoxin peroxidaza). Ele sunt considerate motivul virulentei micobacteriilor si tripanosomatidelor.

In plantele superioare ele sunt implicate in balanta productiei de hidroperoxid in timpul fotosintezei .

La animalele superioare ele sunt implicate in reglarea redox a transmiterii si diferentierii celulare.

Reducerea hidroperoxizilor, ca o parte esentiala a apararii biologice antioxidante este prin definitie catalizata de peroxidaze.

Peroxiredoxinele sunt proteine fara nici un fel de grupa prostetica. Singurele resturi redox-activ sunt cisteinele, care doar in cazuri exceptionale pot fi inlocuite cu selenocisteinele. Secventele lor le clasifica ca o familie de proteine distincta care este neinrudita cu nici o alta familie de peroxidaze. Ca o regula, ciclul catalitic al peroxiredoxinelor utilizeaza in reactiile redox unul sau doua resturi de cisteina.

Un aliniament al secventelor de peroxiredoxine releva faptul ca doar cateva resturi sunt pastrate in totalitate in familia de peroxiredoxine. Resturile de cisteina sunt strict pastrate in domeniul N-terminal, care se pare ca sunt cele atacate de hidroperoxizi. In toate cazurile investigate schimbul acestor resturi de cisteina se face cu resturi de serina. Reactia acestor resturi de cisteina cu un hidroperoxid produce un derivat al acidului sulfenic. Un astfel de derivat al acidului sulfenic reactioneaza direct cu orice tiol accesibil pentru a forma o punte de sulf.

Peroxiredoxinele, necunoscute pana la sfarsitul anilor optzeci, au devenit intre timp o mare familie de proteine care este divizata in diferite forme moleculare si se intind peste toate domeniile vietii. In termeni enzimatici, ele sunt peroxidaze cu eficienta molara moderata. Dominatia comuna a intregii familii pare a fi reziduul de cisteina strict conservat, care este activat prin legaturi de hidrogen si interactii electrostatice pentru reducerea hidroperoxizilor, in timp ce pasii catalizei si substraturile donoare regenerante variaza de la o subspecie la alta . La speciile unde lipseste inalta eficienta a peroxidazelor, precum unele bacterii, drojdii si tripanosome, peroxiredoxinele pot reprezenta o linie majora de protectie impotriva daunelor produse de hidroperoxizi.

La plante ele sunt implicate in protectia impotriva bioprodusilor oxidanti ai fotosintezei. La animalele superioare ele sunt probabil insuficient de eficiente in competitia cu catalaza sau seleno-peroxidazele in protectia impotriva stresului oxidativ.

Studiul realizat de mine a avut ca scop cercetararea activitatii enzimatice a tioredoxinei de la Mycobacterium tuberculosis , enzima care se considera ca ar avea un rol important in protectia antioxidanta la nivel celular a organismelor impotriva bolii produse de Mycobacterium tuberculosis si anume tuberculoza.

La nivel mondial se estimează aproximativ 2 miliarde de purtători de tuberculoza. Ea afectează de obicei plămânii, dar si alte părti ale organismului, mai ales sistemul osos si creierul. Trebuie făcută diferenta între infectie si boală. Persoanele care sunt doar infectate nu se simt bolnave si nu au simptome. Infectia se poate prelungi toată viata, fără ca boala să se declanseze. Putem contracta tuberculoza la orice vărstă. Aceasta se transmite rapid, în special în rândul populatiei defavorizate, cu accesibilitate redusă la medic si prost hrănită.

Tuberculoza se manifestă prin  stare de slăbiciune generală, pierderea în greutate, febră si transpiratii nocturne. Simptomele tuberculozei pulmonare includ tusea persistentă, expectoratii sanguinolente si durerea de piept. La copiii de vârstă mică tuberculoza pulmonară se manifestă uneori doar prin oprirea cresterii sau un retard staturo-ponderal. Celelalte semne si simptome depind de localizarea bolii.

Bolnavii cu TB trebuie urmeze o  terapia curativă, care de obicei include două sau mai mult medicamente antituberculoase, timp de cel putin sase luni. Din păcate, unii bolnavi nu respectă schema si durata de tratament. Astfel apare tuberculoza multirezistentă, transmisibilă altor persoane.

Titlul lucrarii

Autor

Scop

1.

2.

Figura si ce reprezinta

Figura 2.2 – Structura tridimensionala a Tpx

Etapele principale ale studiului

Izolarea plasmidei Tpx cu ajutorul kiturilor Qaigen

Reactii de mutatie genetica cu ajutorul tehnicii PCR

Reactii de cuplare a produsilor PCR cu vectorul PET 22, provenit de la Escherichia coli

Transformarea produsilor in clone DH5α

Transformarea clonelor pozitive DH5α in clone BL 21

Etapele Tehnicii PCR:

-denaturarea ADN prin incubare la 94 grade C;

-asocierea primerilor la cele doua capete ale secventei de interes;

-extinderea primerilor prin activarea ADN polimerazei; se foloseste Taq-polimeraza care este termorezistentă și nu este distrusă de denaturările repetate prin temperatură mare în timpul reacției PCR.

Figura 3.2- Etapele tehnicii PCR

Figura 4.2- Amplificarea exponentiala a genei in PCR

Izolarea plasmidei Tpx

Pentru a putea incepe prima etapa a studiului se cultiva bacteria M.tuberculosis in eprubete, pe mediu de cultura Luria-Bertani (LB).

Se izoleaza apoi plasmidele cu ajutorul kitului: “ QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol”.

Se verifica plasmida obtinuta cu ajutorul reactiilor de restrictie. Reactiile de restrictie utilizeaza endonucleaze de restrictie. Endonucleazele de restrictie folosite in acest experiment sunt: Nde I , provenita de la Neisseria denitrificans, Xho I, provenita de la Xanthomonas halcicola, Hind III, provenita de la Hemophilus influenzae Rd.

Dupa reactia de restrictie , produsii rezultati se vizualizeaza cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza.

Principiul electroforezei pe gel de agaroza este bazat pe trecerea curentului prin gel ( de la polul negativ la polul pozitiv), iar ADN-ul fiind incarcat negativ, migreaza catre polul pozitiv. Fragmentele mari ( cu masa moleculara mare) migreaza mult mai incet si raman mai sus in gel decat fragmentele mai mici.

Dupa developare cu solutii speciale, sub actiunea radiatiilor UV, provenite de la o lampa, cuplata la un computer, apar niste spoturi care corespund fragmentelor ADN respective.

Figura 6.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsul de restrictie

Reactii de mutatie genetica cu ajutorul tehnicii PCR

Dupa verificarea plasmidei Tpx, se incepe etapa a doua a studiului si anume realizarea mutatiilor cu ajutorul tehnicii PCR.

Dupa realizarea reactiilor PCR, se vor verifica produsii rezultati, cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza.

Figura 8.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR

Figura 9.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR Tpx C60S Bw si Tpx C60S Fw

Figura 10.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR intregi Tpx C80S si Tpx C93S

Figura 11.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR intregi Tpx C60S si Tpx C80S

\

Figura 12.2- Electroforeza pentru produsul PCR intreg Tpx C60S

Reactii de ligare cu vectorul PET 22

Dupa obtinerea tuturor celor trei produse PCR intregi, Tpx C60S, Tpx C80S si Tpx C93S, si purificarea lor cu ajutorul kitului “ Qiaex II Agarose Gel Extraction Protocol ”, se poate trece la urmatoarea etapa a studiului si anume ligarea cu vectorul PET 22.

Figura 13.2 – Electroforeza pe gel de agaroza pentru plasmida PET 22

Dupa obtinerea vectorului PET 22, se realizeaza reactii de reastrictie pentru produsii PCR si pentru vectorul PET 22, pentru linearizarea acestora.

Se purifica probele cu kitul “ QAIEX II Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions”.

Dupa restrictionarea si purificarea produsilor PCR si a vectorului PET 22 se realizeaza ligarea intre cele doua componente.

Transformarea produsilor in clone DH5α

Dupa realizarea etapei de ligare a produsilor PCR cu vectorul, se poate trece la urmatoarea etapa de transformare a produsilor rezultati din ligare in clone DH5α .

Clonele pozitive sunt necesare pentru urmatoarea etapa.

Concluzii

Studiul a fost realizat asupra triparedoxinei (Tpx), o peroxiredoxina de la Mycobacterium tuberculosis, enzima care se considera ca ar avea un rol important in protectia antioxidanta la nivel celular a organismelor, impotriva bolii produse de Mycobacterium tuberculosis si anume tuberculoza.

Genomul enzimei Tpx de la Mycobacterium tuberculosis contine trei resturi active de cistena, care se vor inlocui cu resturi de serina, pentru a bloca formarea puntilor de sulf. Cele trei resturi de cisteina se afla in pozitia 60, 80 si 93.

Studiul s-a efectuat in mai multe etape, din prima etapa rezultand, dupa cultivarea bacteriei si izolarea cu ajutorul unui kit specializat, plasmida enzimei Tpx.

Dupa izolare, s-a verificat masa moleculara a plasmidei cu ajutorul reactiilor de restrictie si a electroforezei pe gel de agaroza.

Dupa verificarea plasmidei Tpx, s-a inceput etapa a doua a studiului si anume realizarea mutatiilor cu ajutorul tehnicii PCR.

Pentru fiecare rest de cisteina activa s-a realizat initial reactii PCR “half-length”. Produsii rezultati au fost verificati cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza si apoi purificati cu un kit specializat.

Dupa purificarea produsilor PCR “half-length”, s-au realizat noi reactii PCR prin combinarea mutantilor PCR “half-length”, rezultand produsii intregi ( full-length).

Produsii intregi, carora li s-au verificat marimea masei moleculare, s-au ligat la vectorul plasmidial PET 22, provenit de la E. Coli, cu ajutorul unei ligaze.

Dupa realizarea etapei de ligare a produsilor intregi PCR cu vectorul, s-a trecut la urmatoarea etapa, si anume de transformare a produsilor rezultati din ligare in clone DH5α .

Clonele pozitive DH5α se vor transforma in clone BL 21, a caror activitate enzimatica va fi verificata.

=== parte experimentala ===

Capitolul 4. PARTEA EXPERIMENTALA

4.1 Scopul lucrarii

Acest studiu s-a desfasurat in perioada aprilie – septembrie 2003 la Departamentul de Biochimie si Biotehnologie din cadrul Universitatii Tehnice Braunscweig, Germania si a avut ca scop cercetararea activitatii enzimatice a tioredoxinei de la Mycobacterium tuberculosis , enzima care se considera ca ar avea un rol important in protectia antioxidanta la nivel celular a organismelor impotriva bolii produse de Mycobacterium tuberculosis si anume tuberculoza.

Studiul realizat in cadrul departamentului era extins si la cercetararea enzimelor produse de familia Tripanosoma, dar tema abordata de mine a fost in special mutatiile genetice asupra triparedoxinei (Tpx), o peroxiredoxina de la Mycobacterium tuberculosis.

In Figura 1.2 este reprezentat genomul enzimei Tpx de la Mycobacterium tuberculosis, care contine trei resturi active de cistena, care se vor inlocui cu resturi de serina, pentru a bloca formarea puntilor de sulf.

Cele trei resturi de cisteina se afla in pozitia 60, 80 si 93.

Figura 2.2 reprezinta structura tridimensionala a Tpx de la M. tuberculosis.

Figura 2.2 – Structura tridimensionala a Tpx

Etapele principale ale studiului au fost:

* Izolarea plasmidei Tpx cu ajutorul kiturilor Qaigen

( Plasmida reprezinta o structura inelara de ADN autoreplicante, de dimensiuni mai mici decat genomul bacterian)

* Reactii de mutatie genetica cu ajutorul tehnicii PCR

* Reactii de ligare cu vectorul PET 22, provenit de la Escherichia coli, cu ajutorul ligazelor (vectorul este transportorul ADN -ul in gazda-clona)

* Transformarea produsilor in clone DH5α

* Transformarea clonelor pozitive DH5α in clone BL 21

* Verificarea activitatii enzimatice

PCR permite amplificarea in vitro a genei de interes, prezentă într-o populație heterogenă de ADN. Pentru amplificarea secvenței țintă sunt necesari doi primeri oligonucleotidici care hibridizează cu secvențele complementare ce flanchează regiunea de interes; precursori dezoxinucleotidici și o ADN polimerază termorezistentă.

Tehnica PCR cuprinde urmatoarele etape:

-denaturarea ADN prin incubare la 94 grade C;

-asocierea primerilor la cele doua capete ale secventei de interes;

-extinderea primerilor prin activarea ADN polimerazei; se foloseste Taq-polimeraza care este termorezistentă și nu este distrusă de denaturările repetate prin temperatură mare în timpul reacției PCR.

Aceste trei operatiuni se repetă pentru un numar dorit de cicluri. Aceste cicluri se realizează cu ajutorul aparatului thermo-cycler [43].

Gena amplificată este supusă digestiei enzimatice cu endonucleaze de restrictie pentru identificarea situsurilor în care apar mutații.

Pentru secvențierea genei este necesară subclonarea genei într-un vector plasmidial. Aceasta implică amplificarea genei cu primeri ce conțin la capetele 3’si 5’ câte un situs unic de restricție prezent si în vectorul de clonare. După amplificare atât produsul de amplificare, cât și vectorul folosit pentru clonare vor fi supuși digestiei cu cele 2 enzime de restricție ale căror situsuri se află la capetele genei amplificate. Prin tratare cu ADN ligază a amestecului format din amplicon și vector se va obține un vector recombinat ce va conține gena într-o anumită orientare. Folosind primeri complementari cu secvența vectorului din vecinătatea genei se va realiza secvențierea genei, pornindu-se de la ambele capete ale acesteia [44].

Figura 3.2. Etapele tehnicii PCR

Figura 4.2. Amplificarea exponentiala a genei in PCR

a

b

Figura 5.2. a – regiunea sa de clonare/ expresie, b – structura vectorului PET-22

4.2 Izolarea plasmidei Tpx

Pentru a putea incepe prima etapa a studiului se cultiva bacteria M.tuberculosis in eprubete, pe mediu de cultura Luria-Bertani (LB), mediu care se formeaza astfel: la 1 L mediu se foloseste 10 g Bacto-Trypton, 5 g extract de drojdie, 10 g NaCl, care se dizolva in circa 200-300 mi apa; apoi se ajusteaza pH-ul la valoarea 7.4, cu o solutie de NaOH 2M, cu ajutorul pH-metrului; la final se completeaza cu apa pana la 1 L.

Se tine cultura peste noapte intr-un termostat la 37 grade C, pentru a se putea multiplica indeajuns.

Se izoleaza apoi plasmidele cu ajutorul kitului : “ QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol”.

Kitul este facut pentru pentru purificarea pana la 20 μg de plasmide ADN “high-copy” de la 1-5 ml culturi in LB.

Se utilizeaza cultura obtinuta mai sus si se urmeaza procedura urmatoare:

Se introduce cultura obtinuta mai sus in tuburi Ependorf de 1,5 ml si se centrifugheaza cu ajutorul unei microcentrifuge.

Se arunca supernatantul si se pastreaza celulele bacteriene sub forma de pelete.

Se resuspenda celulele bacteriene intr-o solutie tampon P1 si se transfera in tuburi Ependorf curate.

Se adauga o alta solutie tampon P2 si se amesteca cu grija, prin rasturnare de 4-6 ori.

Se adauga solutie tampon N3 si se amesteca imediat.

Se centrifugheaza 10 minute la viteza maxima.

Se ia supernatantul de la etapa 6 si se transfera in coloane speciale ‘QlAprep” prin decantare sau pipetare cu ajutorul unei pipette Ependorf

Se centifugheaza pentru 30-60 secunde. Se elimina supernatantul.

Se spala coloanele “QlAprep” prin adaugarea unei solutii tampon PB si centrifugand pentru 30-60 secunde.Se elimina supernatantul.

Se spala din nou coloanele cu o alta solutie tampon PE si se centrifugheaza 30-60 secunde.

Se elimina supernatantul si se centrifugheaza suplimentar pentru inca 1 minut pentru a elimina solutia de spalare reziduala.

Se plaseaza coloanele “QlAprep” in tuburi Ependorf de 1,5 ml curate.Pentru a elua ADN-ul se adauga solutie tampon EB, ce contine solutie Tris-Cl 10 mM , la pH=8,5, sau apa distilata sterile obtinuta cu ajutorul unui aparat numit “Milli Q Pore”, in centrul fiecarei coloane “QlAprep”, se lasa sa actioneze 1 minut si se centrifugheaza pentru inca 1 min.

Se verifica plasmida obtinuta cu ajutorul reactiilor de restrictie. Reactiile de restrictie utilizeaza endonucleaze de restrictie. O endonucleaza de restrictie are proprietatea unica de a recunoaste polindroame, care sunt crestate de-a lungul mai mult sau mai putin. Crestaturile mai mici sunt cateodata “ terminatii care se lipesc” , datorita tendintelor lor de a se insera la situsuri deschise ale plasmidelor sau cromozomilor in intregime, prin perechile de baze complementare. ADN-ul linear poate deveni circular, cand terminatiile ce se lipesc, sunt atrase una de cealalta. Acesta este modul prin care plasmidele si cateva genoame isi mentin forma circulara. Sute de nucleaze de restrictie sunt in prezent cunoscute, fiecare tip avand un polindrom genomic specific ca tinta. Endonucleazele sunt denumite prin combinarea primei litere a genului, primele doua litere ale speciilor si numarul endonucleazelor. Astfel Eco R I este prima endonuleaza gasita in Escherichia coli, si Hind II este a doua endonucleaza descoperita in Hemophilus influenzae.

Endonucleazele de restrictie folosite in acest experiment sunt: Nde I , provenita de la Neisseria denitrificans, in concentratie de 10 unitati/ μl, necesitand un minimum de 0.3 unitati de enzima pentru o degestie completa a 1 μg ADN in 16 ore la 37 grade C; Xho I, provenita de la Xanthomonas halcicola, in concentratie de 10 unitati/μl, necesitand un minimum de 0.1 unitati de enzima pentru o degestie completa a 1 μg AND in 16 ore la 37 grade C; Hind III, provenita de la Hemophilus influenzae Rd , in concentratie de 10 unitati/ μl, necesitand un minimum de 0.1 unitati de enzima pentru o degestie completa a 1 μg AND in 16 ore la 37 grade C.

O unitate reprezentand cantitatea de enzima necesara pentru digestia a 1 μg ADN intr-o ora la 37 grade C in 50 μl solutie tampon.

Dupa reactia de restrictie , produsii rezultati se vizualizeaza cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza.

ADN-ul se plaseaza in mici gauri la capatul unei placi formate dintr-un gel de agaroza special.

Gelul de agaroza este format din Agar-Agar in proportie de 0.8% in mediu Luria-Bertani, copt pentru circa 4-5 minute in cuptorul cu microunde.

Aparatul de electroforeza utilizeaza o solutie tampon TAE , care este formata din EDTA ( 0.5 M, pH=8.0 ), acid acetic, Tris si apa.

Principiul electroforezei pe gel de agaroza este bazat pe trecerea curentului prin gel ( de la polul negativ la polul pozitiv), iar ADN-ul fiind incarcat negativ, migreaza catre polul pozitiv. Fragmentele mari (cu masa moleculara mare) migreaza mult mai incet si raman mai sus in gel decat fragmentele mai mici.

Dupa developare cu solutii speciale, sub actiunea radiatiilor UV, provenite de la o lampa, cuplata la un computer, apar niste spoturi care corespund fragmentelor ADN respective.

Figura 6.2. Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsul de restrictie

In Figura 6.2. s-a vizualizat produsul restrictionat cu una din cele 3 enzime folosite, NdeI. Prima coloana din stanga reprezentand markerul de referinta folosit in concentratie mai mica, a doua coloana este markerul folosit in concentratie mai mare, iar cea de-a treia coloana reprezinta produsul de restrictie, avand marimea asteptata de 5.5 kbp.

Figura 7.2. Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii de restrictie, restrictionati cu doua din cele trei enzime, folosite individual si in amestec

In Figura 7.2. in coloana din stanga este reprezentat markerul de referinta, in cea de-a doua este produsul restrictionat cu amestecul de endonucleaze Nde I si Hind III, in cea de-a treia este produsul restrictionat cu Nde I si in cea de-a patra este produsul restrictionat cu Hind III.

4.3. Reactii de mutatie genetica cu ajutorul tehnicii PCR

Dupa verificarea plasmidei Tpx, se incepe etapa a doua a studiului si anume realizarea mutatiilor cu ajutorul tehnicii PCR.

Pentru fiecare rest de cisteina activa se realizeaza urmatoarele reactii:

*mutatii pentru Tpx C60S:

1. Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

T7 Primer promoter

Primer de mutatie 1 ( Tpx C60S Bw)

Plasmida Tpx

Apa distilata

2. Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

T7 Primer terminator

Primer de mutatie 2 ( Tpx C60S Fw)

Plasmida Tpx

Apa distilata

*mutatii pentru Tpx C80S:

1. Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

T7 Primer promoter

Primer de mutatie 1 ( Tpx C80S Bw)

Plasmida Tpx

Apa distilata

2. Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

T7 Primer terminator

Primer de mutatie 2 ( Tpx C80S Fw)

Plasmida Tpx

Apa distilata

*mutatii pentru Tpx C93 S:

1. Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

T7 Primer promoter

Primer de mutatie 1 ( Tpx C93 S Bw)

Plasmida Tpx

Apa distilata

2. Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

T7 Primer terminator

Primer de mutatie 2 ( Tpx C93 S Fw)

Plasmida Tpx

Apa distilata

Reactiile se realizeaza in tuburi Ependorf speciale pentru astfel de reactii, si cu ajutorul aparatului thermo-cycler .

Conditiile pentru aparartul thermo-cycler in aceste cazuri sunt:

denaturarea initiala : 3 minute la 94 grade C

denaturarea: 0.5-1 minut la 94 grade C

maleabilizare: 0.5-1 minut la 50-68 grade C

extindere: 1 minut la 72 grade C

Numarul de cicluri este de 25-35.

Se va realiza dupa aceste cicluri o extindere finala la 72 grade C timp de 10 minute.

Dupa realizarea reactiilor PCR, se vor verifica produsii rezultati, cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza.

Figura 8.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR

In Figura 8.2 sunt reprezentati produsii reactiilor PCR pe care le-am amintit mai devreme. In prima coloana din stanga este markerul de referinta, in cea de-a doua si de-a treia coloana ar fi trebuit sa fie produsii proveniti de la Tpx C60S, in cea de-a patra coloana este produsul mutant Tpx C80S Bw, in cea de-a cincea coloana este produsul mutant Tpx C80S Fw, in cea de-a sasea coloana este produsul mutant Tpx C93 S Bw, iar in cea de-a saptea coloana este produsul mutant Tpx C93S Fw.

Produsii PCR obtinuti au masa moleculara asteptata, si anume 423 si respectiv 392 bp.

Pentru produsii proventi de la Tpx C60S, care nu au putut fi vizualizati in elecroforeza de mai sus, se repeata reactiile PCR.

Produsii PCR obtinuti , cu dimensiuni normale, adica mutantii Tpx C80S Bw, Tpx C80S Fw, Tpx C93S Bw, Tpx C93S Fw, vor fi extrasi din gelul de agaroza si vor fi purificati cu ajutorul kitului “ Qiaex II Agarose Gel Extraction Protocol”.

Cu kitul “ Qiaex II Gel Extraction ” extractia si purificarea fragmentelor ADN sunt bazate pe solubilizarea agarozei si selectarea, adsorbtiei cantitative a acizilor nucleici in particulele de silica-gel Qiaex II in prezenta de saruri concentrate. Elutia ADN-ului este facuta cu ajutorul unor solutii precum apa sau solutie tampon Tris.

Acest protocol este facut pentru extractia fragmentelor de ADN cu marimi de 40 pana la 50 bp din geluri de agaroza standard 0.3-2 % sau usor dizolvate in solutii tampon TAE sau TBE.

Modul de lucru al acestui protocol este urmatorul:

Se taie banda de ADN din gelul de agaroza cu un bisturiu ascutit si curat. Se minimalizeaza marimea bucatii de gel prin indepartarea excesului de agaroza. Se utilizeaza un tub Ependorf de 1.5 ml pentru procesarea de pana la 250 mg de agaroza.

Se cantareste bucata de gel intr-un tub necolorat. Se adauga trei volume de solutie tampon QX1 la un volum de gel pentru fragmente ADN cu marimi de 100 bp – 4 kbp, urmand urmatoarele instructiuni:

-Pentru fragmente ADN < 100 bp se adauga 6 volume solutie tampon QX1

– Pentru fragmente ADN > 4 kbp se adauga 3 volume solutie tampon QX1 plus 2 volume de apa

-Pentru geluri de agaroza > 2% se adauga 6 volume solutie tampon QX1

3. Se resuspenda Qaiex II prin vortexare timp de 30 secunde.

Se adauga Qaiex II conform instructiunilor de mai jos si se

amesteca:

pentru ADN < 2 μg se adauga 10 μl Qaiex II

pentru ADN intre 2-10 μg se adauga 30 μl Qaiex II

pentru fiecare 10 μg ADN suplimentar se adauga cate 30 μl Qaiex II in plus

Se incubeaza la 50 grade C timp de 10 minute pentru a se solubiliza agaroza si a se lega ADN-ul. Se amesteca prin vortexare la fiecare 2 minute pentru a mentine Qiaex II in suspensie. Se verifica daca culoarea mixturii este galbena.

Daca culoarea mixturii este portocalie sau rosie se adauga 10 μl acetat de sodiu 3 M , pH= 5.0 si se amesteca.Culoarea ar trebui sa devina galbena. Incubarea ar trebui continuata pentru inca 5 minute cel putin.

Adsorbtia ADN-ului la particulele Qiaex II este eficienta doar la pH<=7.5. Solutia tampon QX1 contine acum un indicator de pH care este galben la pH<= 7.5, si portocaliu sau violet la pH mai mare permitand determinarea usoara a pH-ului optim pentru legarea ADN- ului.

5. Se centrifugheaza proba pentru 30 secunde si se indeparteaza cu grija supernatantul cu o pipeta Ependorf.

Se spala peletele cu solutie tampon QX1. Se resuspenda peletele in solutia tampon prin vortexare. Se centrifugheaza pentru 30 secunde si se indeparteaza orice urma de supernatant cu pipeta. Aceasta etapa de spalare indeparteaza contaminantii de agaroza reziduali.

7. Se spala peletele de doua ori cu solutie tampon PE. Se resuspenda peletele in solutia tampon prin vortexare. Se centrifugheaza pentru 30 secunde si se indeparteaza orice urma de supernatant cu pipeta. Aceasta etape de spalare indeparteaza sarurile .

Se usuca peletele cu aer pentru 10-15 minute sau pana cand devin albe.

Daca s-au utilizat 30 μl de suspensie Qiaex II , uscarea peletelor se va face pentru aproximativ 30 minute. Nu se vor usca la vid deoareceacesta poate cauza suprauscarea . Suprauscarea peletelor poate avea ca

rezultat descresterea eficientei elutiei

9. Se elueaza ADN-ul adaugand Tris-Cl 10 mM , pH= 8.5 sau apa distilata, se resuspensa peletele prin vortexare. Se incubeaza conform instructiunilor de mai jos:

pentru fragmentele ADN < 4 kb se incubeaza la temperature camerei pentru 5 minute

pentru fragmentele ADN cu marimi intre 4-10 kb se incubeaza la 50 grade C pentru 5 minute

pentru fragmentele ADN > 10 kb se incubeaza la 50 grade C pentru 10 minute

Eficienta elutiei este dependenta de pH. Eficienta maxima a elutiei este atinsa cand pH-ul este intre 7.0 si 8.5. Cand se utilizeaza apa pentru elutie trebuie sa ne asiguram ca pH-ul este in scala, si se pastreaza preparatul la -20 grade C, altfel ADN-ul se poate degrada in absenta agentului tampon. ADN-ul purificat mai poate fi eluat si cu solutie tampon TE ( TRis-Cl 10 mM , EDTA 1mM, pH=8.0) dar EDTa poate inhiba reactiile de secventionare enzimatica.

10. Se cenrifugheaza pentru 30 secunde. Se pipeteaza cu grija supernatantul intr-un tub Ependorf curat. Supernatantul contine acum AND purificat.

11. Optional se repeata etapele 9 si 10 si se combina eluantii. O a doua elutie va creste productia de ADN cu aproximativ 10-15 %.

Produsii reactiilor PCR care au fost repetate pentru Tpx C60S Bw si Tpx C60S Fw se verifica cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza.

Figura 9.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR Tpx C60S Bw si Tpx C60S Fw

In Figura 9.2 este reprezentat in prima coloana din stanga markerul de referinta, in a doua coloana mutantul Tpx C60S Bw, in a treia coloana mutantul Tpx C60S Fw. Mutantii au marimea asteptata si anume 423 si 392 bp.

Dupa verificarea marimii corecte a mutantilor Tpx C80S Bw si Tpx C80S Fw, respectiv Tpx C93S Bw si Tpx C93S Fw, se vor realiza noi reactii PCR pentru a forma produsi intregi pentru Tpx C80S si Tpx C93S, prin combinarea mutantilor mai sus amintiti.

Reactiile PCR pentru produsii intregi se vor realize in felul urmator:

*pentru Tpx C80S:

Tpx C80S Bw

Tpx C80S Fw

T7 Primer promoter

T7 Primer terminator

Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

Apa distilata

*pentru Tpx C93S

Tpx C93S Bw

Tpx C93S Fw

T7 Primer promoter

T7 Primer terminator

Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

Apa distilata

Reactiile se realizeaza in tuburi Ependorf speciale pentru astfel de reactii, si cu ajutorul aparatului thermo-cycler . Conditiile pentru aparartul thermo-cycler in aceste cazuri sunt aceleasi casi in cazul reactiilor de mai sus.

Dupa realizarea reactiilor se verifica marimea fragmentelor formate, prin electroforeza pe gel de agaroza.

Figura 10.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR intregi Tpx C80S si Tpx C93S

In Figura 10.2 este reprezentant in prima coloana din stanga markerul de referinta, in cea de-a doua produsul intreg Tpx C80S, iar in cea de-a treia produsul intreg Tpx C93S. Marimea asteptata pentru cele doua produse PCR este de aprox. 700 bp, si precum se vede in figura de mai sus, doar Tpx C93S are marimea corespunzatoare.

Pentru produsul care nu au avut marimea corespunzatoare se repeata reactiile PCR ,adica pentru Tpx C80S. In paralel se se efectueaza reactiile PCR pentru realizarea produsului intreg si pentru Tpx C60S, dupa purificarea si extractia in prealabil cu kitul “ Qiaex II Agarose Gel Extraction Protocol ”:

Tpx C60S Bw

Tpx C60S Fw

T7 Primer promoter

T7 Primer terminator

Mastermix Taq Polimeraza de la Qiagen

Apa distilata

In Figura 11.2 este reprezentant in prima coloana din stanga markerul de referinta, in cea de-a doua produsul intreg Tpx C60S, iar in cea de-a treia produsul intreg Tpx C80 S. Marimea asteptata pentru cele doua produse PCR este de aprox. 700 bp. Din figura reiese faptul ca doar Tpx C80 S are marimea corespunzatoare.

Figura 11.2- Electroforeza pe gel de agaroza pentru produsii PCR intregi Tpx C60S si Tpx C80S

Deoarece produsul intreg Tpx C60S nu are marimea dorita se repeta reactia PCR pentru formarea acestui produs, conform procedeului explicat mai sus.

Se verifica noul produs format cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza, si se observa in Figura 12.2 ca acesta are marimea corespunzatoare, respectiv circa 700 bp.

Figura 12.2- Electroforeza pentru produsul PCR intreg Tpx C60S

Reactii de ligare cu vectorul PET 22

Dupa obtinerea tuturor celor trei produse PCR intregi, Tpx C60S, Tpx C80S si Tpx C93S, si purificarea lor cu ajutorul kitului “ Qiaex II Agarose Gel Extraction Protocol ”, se poate trece la urmatoarea etapa a studiului si anume ligarea cu vectorul PET 22.

Se cultiva vectorul PET 22 provenit de la E. coli pe mediu de cultura LB, dintr-o precultura realizata anterior. Cultura se efectueaza in pahare Erlenmeyer intr-un termostat la 37 grade C sub agitare continua. Dupa cultivare se izoleaza plasmida cu ajutorul kitului : “ QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol”. Plasmida cultivata se supune unei reactii de restrictie, cu ajutorul unei endonucleaze, in acest caz Hind III. Pentru realizarea acestei reactii se folosesc:

Plasmida PET 22

Endonucleaza Hind III

Apa distilata sterila Milli Q

Solutie tampon R+

Dupa restrictie se verifica daca are marimea corespunzatoare, adica aproximativ 5.5 kbp, cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza.

Figura 13.2 – Electroforeza pe gel de agaroza pentru plasmida PET 22

Figura 13.2 indica faptul ca plasmida vectorului PET 22 are marimea asteptata.

Dupa obtinerea vectorului PET 22, se realizeaza reactii de reastrictie pentru produsii PCR si pentru vectorul PET 22, pentru linearizarea acestora.

Reactiile de restrictie se realizeaza in tuburi Ependorf curate de 1.5 ml:

* Pentru produsii PCR:

Produs PCR purificat

Endonucleaza Hind III

Edonucleaza Nde I

Solutie tampon R +

* Pentru PET 22:

Plasmida PET 22

Endonucleaza Hind III

Edonucleaza Nde I

Solutie tampon R +

Apa distilata sterile Milli Q

Se incubeaza peste noapte intr-un termostat la 37 grade C.

Se inactiveaza endonucleazele la 70 grade C timp de 15 minute.

Se purifica probele cu kitul “ QAIEX II Protocol for Desalting and Concentrating DNA Solutions”.

Modul de lucru al protocolului este urmatorul:

Se transfera proba intr-un tub Ependorf curat. Se adauga 3 volume de solutie tampon QX1 la un volum de proba, pentru fragmentele ADN cu marimi cuprinse intre 100 bp – 4 kbp. Pentru fragmentele ADN < 100 bp se adauga 6 volume de solutie tampon QX1, iar pentru cele > 4 kbp se adauga 3 volume de solutie tampon QX1 si 2 volume de apa.

Se verifica daca culoarea mixturii este galbena. Daca culoarea mixturii este portocalie sau rosie se adauga 10 μl acetat de sodiu 3 M , pH= 5.0 si se amesteca.Culoarea ar trebui sa devina galbena. Adsorbtia ADN-ului la particulele Qiaex II este eficienta doar la pH<=7.5. Solutia tampon QX1 contine acum un indicator de pH care este galben la pH<= 7.5, si portocaliu sau violet la pH mai mare, permitand determinarea usoara a

pH-ului optim pentru legarea ADN-ului.

Se resuspenda QAIEX II prin vortexare 30 secunde.

Se adauga QIAEX II la ADN si se amesteca. Se incubeaza la temperature camerei pentru 1o minute. Se amesteca din 2 in 2 minute pentru a mentine QIAEX II in suspensie.

Se centrifugheaza proba pentru 30 secunde si se indeparteaza supernatantul.

Se spala peletele de doua ori cu solutie tampon PE.

Se usuca peletele cu aer pentru 10-15 minute sau pana cand devin albe. Nu se vor usca la vid deoarece acesta poate cauza suprauscarea .

Suprauscarea peletelor poate avea ca rezultat descresterea eficientei elutiei

Se elueaza ADN-ul adaugand Tris-Cl 10 mM , pH= 8.5 sau apa distilata, se resuspensa peletele prin vortexare. Se incubeaza conform instructiunilor de mai jos:

pentru fragmentele ADN < 4 kb se incubeaza la temperature camerei

pentru 5 minute

pentru fragmentele ADN cu marimi intre 4-10 kb se incubeaza la 50 grade C pentru 5 minute

pentru fragmentele ADN > 10 kb se incubeaza la 50 grade C pentru 10 minute

Eficienta elutiei este dependenta de pH. Eficienta maxima a elutiei este atinsa cand pH-ul este intre 7.0 si 8.5. Cand se utilizeaza apa pentru elutie trebuie sa ne asiguram ca pH-ul este in scala, si se pastreaza preparatul la 20 grade C, altfel ADN-ul se poate degrada in absenta agentului tampon.

ADN-ul purificat mai poate fi eluat si cu solutie tampon TE ( TRis-Cl 10 mM , EDTA 1mM, pH=8.0) dar EDTa poate inhiba reactiile de secventionare enzimatica.

Se cenrifugheaza pentru 30 secunde. Se pipeteaza cu grija supernatantul intr-un tub Ependorf curat. Supernatantul contine acum AND purificat.

Optional se repeata etapele 8 si 9 si se combina eluantii. O a doua elutie va creste productia de ADN cu aproximativ 10-15 %.

Dupa restrictionarea si purificarea produsilor PCR si a vectorului PET 22 se realizeaza ligarea intre cele doua componente.

Ligarea se realizeaza cu ajutorul unei enzime, numita ligaza, in acest experiment s-a folosit T4 ADN Ligaza de la firma “Invitrogen”, cu o concentratie de 1U/μl. Cantitatea de ligaza utilizata in general este de 1 U, iar raportul molar intre insertiile ADN si vector recomandat pentru o ligare rapida si producerea moleculelor circulare recombinate este de 3:1.

Pentru reactia de ligare se mai foloseste si o solutie tampon speciala, costituita din: Tris-HCl 250 mM ( pH=7.6 ), MgCl2 50 mM , ATP 5 mM, DTT 5 mM, polietilen-glicol- 8000 25%.

Reactiile de ligare se realizeaza astfel:

Ligaza

Solutie tampon pentru ligare

Plasmida vectorului PET 22 restrictionata si purificata

Produs PCR Tpx C60S restrictionat si purificat

2. Ligaza

Solutie tampon pentru ligare

Plasmida vectorului PET 22 restrictionata si purificata

Produs PCR Tpx C80S restrictionat si purificat

3. Ligaza

Solutie tampon pentru ligare

Plasmida vectorului PET 22 restrictionata si purificata

Produs PCR Tpx C93S restrictionat si purificat

Cele trei probe se pun intr-un intr-un thermo-cycler la 16 grade C timp de 16-24 ore.

Transformarea produsilor in clone DH5α

Dupa realizarea etapei de ligare a produsilor PCR cu vectorul, se poate trece la urmatoarea etapa de transformare a produsilor rezultati din ligare in clone DH5α .

Pentru realizarea etapei de transformare trebuiesc preparate celule competente( E. coli DH5α), care vor fi gazdele produsilor de ligare.

Prepararea celulelor competente se realizeaza astfel:

Se inoculeaza intr-un mediu de cultura LB sau SOB o precultura cu o densitate optica de inceput de 0.05. Densitatea optica se citeste cu ajutorul unui spectrofotometru.

Se incubeaza la 37 grade C sub agitare continua ( 180 rpm) pana la o densitate optica la 600 nm de 0.3 ( aprox. 4-7* 107 celule), ceea ce inseamna 1-2 ore, verificandu-se densitatea optica din sfert in sfert de ora.

La o densitate optica la 600 nm de 0.3 se vor umple tuburi de centrifuga sterile cu celulele obtinute si se vor tine la gheata timp de 15 minute.

Se centrifugheaza 15 minute , la 3500 rpm si 4 grade C.

Se decanteaza supernatantul si se resuspenta celulele in 1/3 volume solutie tampon RF1; se tin 15 minute la gheata.

Se entrifugheaza 15 minute , la 3500 rpm si 4 grade C.

Se decanteaza supernatantul in 1/12 volume solutie tampon RF2; se tin 15 minute la gheata.

Se prepara alicoturi in tuburi Ependorf racite inainte in azot lichid si se pastreaza la -70 -80 grade C.

Transformarea celulelor competente DH5α se realizeaza prin “ soc termic” astfel:

Se dezgheata celulele competente, tinandu-se la gheata 10-20 minute.

Se adauga AND-ul (produsii de ligare) in fiecare tub.

Se incubeaza pentru 30 minute in gheata.

Se incalzesc tuburile intr-o baie de apa timp de 2 minute la 42 grade C.

Se scot si se pun imediat in gheata.

Se adauga mediu de cultura SOB sau LB (+0.5% glucoza).

Se incubeaza timp de o ora la 37 grade C, sub agitare continua ( 180 rpm).

Se ia cu ajutorul unei pipete Ependorf o anumita cantitate din cultura obtinuta mai sus si se pipeteaza in placi cu agar si antibiotic . Se incubeaza la 37 grade C.

Placile cu agar si antibiotic se obtin din: Trypto-Bacter, extract de drojdie, clorura de sodiu si apa, in anumite proportii. Se ajusteaza apoi pH-ul la 7.4 cu NaOH, cu ajutorul pH-metrului. Se toarna continutul in pahare Erlenmeyer, iar in fiecare pahar se pune o anumita cantitate de Agar si se introduc paharele intr-un autoclav. Dupa terminarea programului autoclavului se racesc paharele pana la 50 grade C, se adauga antibioticul (Ampicilina) si se toarna continutul in placi. Placile se pot pastra la +4 grade C, timp de 1-2 saptamani.

Dupa aproximativ 24 ore de incubare, placile contin clone DH5α, unele negative care contin doar vectorul PET 22, altele pozitive ce contin produsii de ligare, adica vectorul impreuna cu insertiile (produsii PCR). Clonele negative sunt mai dese si au dimensiuni mai mici, pe cand cele pozitive sunt mult mai rare si au dimensiuni mai mari.

Clonele pozitive sunt necesare pentru urmatoarea etapa.

Concluzii

Studiul a fost realizat asupra triparedoxinei (Tpx), o peroxiredoxina de la Mycobacterium tuberculosis, enzima care se considera ca ar avea un rol important in protectia antioxidanta la nivel celular a organismelor, impotriva bolii produse de Mycobacterium tuberculosis si anume tuberculoza.

Genomul enzimei Tpx de la Mycobacterium tuberculosis contine trei resturi active de cistena, care se vor inlocui cu resturi de serina, pentru a bloca formarea puntilor de sulf. Cele trei resturi de cisteina se afla in pozitia 60, 80 si 93.

Studiul s-a efectuat in mai multe etape, din prima etapa rezultand, dupa cultivarea bacteriei si izolarea cu ajutorul unui kit specializat, plasmida enzimei Tpx.

Dupa izolare, s-a verificat masa moleculara a plasmidei cu ajutorul reactiilor de restrictie si a electroforezei pe gel de agaroza.

Dupa verificarea plasmidei Tpx, s-a inceput etapa a doua a studiului si anume realizarea mutatiilor cu ajutorul tehnicii PCR.

Pentru fiecare rest de cisteina activa s-a realizat initial reactii PCR “half-length”. Produsii rezultati au fost verificati cu ajutorul electroforezei pe gel de agaroza si apoi purificati cu un kit specializat.

Dupa purificarea produsilor PCR “half-length”, s-au realizat noi reactii PCR prin combinarea mutantilor PCR “half-length”, rezultand produsii intregi ( full-length).

Produsii intregi, carora li s-au verificat marimea masei moleculare, s-au ligat la vectorul plasmidial PET 22, provenit de la E. Coli, cu ajutorul unei ligaze.

Dupa realizarea etapei de ligare a produsilor intregi PCR cu vectorul, s-a trecut la urmatoarea etapa, si anume de transformare a produsilor rezultati din ligare in clone DH5α .

Clonele pozitive DH5α se vor transforma in clone BL 21, a caror activitate enzimatica va fi verificata.

=== parte teoretica ===

Capitolul 1. RELATIA DINTRE CONTROLUL POLUARII SI BIOTEHNOLOGIE

Purificarea apelor de canalizare si eliminarea unei mari proportii de materii organice din efluentii reziduali sunt realizate prin folosirea microorganismelor aerobe si a celor anaerobe. Rezultatele spectaculoase au fost obtinute, de exemplu, in urma tratarii efluentilor rezultati de la fabricile de drojdie de bere, undelemn si cidru, instalatile pentru producerea laptelui si branzeturilor si fabricile de amidon de cartof printr-un proces anaerob care recicleaza compusii biologic activi, produce o cantitata mai mica de sediment rezidual, reduce mirosurile neplacute intr-o masura semnificativa si genereaza metanul care este folosit in instalatiile alimentate cu combustibil ale fabricilor.

Diferitele tulpini microbiene au fost izolate in scopul utilizarii lor la controlul diverselor forme de polutie chimica, de exemplu pentru descompunerea substantelor biocide, care sunt greu biodegradabile, a detergentilor, a materialelor din mase plastice sau a hidrocarburilor. Anumite bacterii din genul Pseudomonas poseda enzime de oxidoreducere sau hidroxilare ce descompun un numar mare de molecule de hidrocarburi sau compusi aromatici care sunt adesea foarte toxici( benzen, toluen, xilen). Mai multe tulpini de Pseudomonas putida poseda, in plasmide, gene care codifica sinteza acestor enzime. Dupa mai multe incrucisari Chakrabarty a selectionat o tulpina care avea mai multe plasmide si care se dezvolta rapid in petrolul brut.Ea ar putea fi utila in special pentru purificarea apelor de canalizare in care atat temperatura cat si parametrii de mediu pot fi controlati.

In mai mare masura decat descompunerea completa a unei molecule toxice, procesul de detoxifiere determina mai ales transformarea chimica a acesteia: fosforilare, metilare, acetilare, etc. Enzimele care catalizeaza aceste reactii de detoxifiere se afla sub controlul genelor situate in plasmide. Kellogg de la Universitatea Illinois a izolat o tulpina microbiana care poate metaboliza complet acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic, un ierbicid puternic folosit pe scara larga.El a izolat, de asemenea , mai multe microorganisme din statiile de epurare si le-a amestecat cu alte tulpini bacteriene purtatoare ale genelor care codifica enzimele implicate in descompunerea compusilor aromatici( toluen, xilen) ai unui derivat clorinat( 4-clorocatechol) si ai salicilatilor. Acesti microbi au fost apoi incubati intr-un chemostat in care

s-au putut dezvolta pe 2,4,5-triclorfenoxiacetic. Dupa zece luni de cultivare, rata de crestere a germenilor a crescut semnificativ si intreaga cantitate de 2,4,5-triclorfenoxiacetic a fost consumata in cateva zile, chiar daca aceasta substanta se gasea in concentratie foarte ridicata, de 1,5 mg/ml.

Tehnicile ADN recombinant ar putea oferi posibilitatea de a se crea tulpini microbiene capabile sa descompuna si sa asimileze un numar mare de substante produse de industriile chimice care cel mai adesea nu sunt biodegradabile. De exemplu, in Japonia s-a izolat o tulpina apartinand actinomicetului Nocardia care ar putea distruge cauciucul in numai o saptamana. In plus, genele care codifica enzimele implicate in biodegradarea bifenililor policlorurati(PCB) ar putea fi integrate in genomul unui numar de 20 tulpini de Pseudomonas ce s-ar putea utiliza pentru descompunerea acestor substante in compusi lipsiti de toxicitate [1].

Capitolul 2. PEROXIREDOXINE

2.1 Generalitati

Peroxiredoxinele sunt peroxidaze, care fac parte din clasa oxidoreductazelor, clasa ce cuprinde enzimele care participa la procesele de oxidare biologica. Aceasta clasa este divizata in 13 sublase, in sublasa 1.11 fiind incluse peroxidazele. Majoritatea enzimelor din grupa peroxidazelor, enzime care utilizeaza H2O2 in calitate de oxidant, sunt homoproteide care pot folosi diferiti donori de hidrogen (glutation, citocrom c redus, NADH+H+, NADPH+H+,etc). Una din cele mai reprezentative enzime, donor: H2O2 oxidoreductaza sau peroxidaza ce catalizeaza reactia:

Donor+ H2O2 = Donor oxidat + H2O

Este inalt specifica -pentru gruparea peroxidica, dar poate folosi in calitate de substrat reducator o mare varietate de substante.

Tot din aceasta clasa face parte si catalaza care are denumirea sistemica H2O2; H2O oxidoreductaza si catalizeaza reactia:

H2O2 + H2O2 = 2H2O + O2 [2]

Cunostintele prezente asupra peroxiredoxinelor sunt revazute cu amplificarea principiilor catalitice, afinitatile si functionarii biologice. Peroxiredoxinele sunt peroxidaze cu eficacitate mica ce utilizeaza tioli ca agenti reducatori. Ele apar a fi intr-o dezordine relativa, cu afinitate pentru substratul de hidroperoxid; afinitatile pentru substratul donor variaza considerabil intre subfamilii, cuprinzand GSH, tioredoxina, triparedoxina si CXXC in proteinele bacteriale AhpF. Peroxiredoxinele sunt responsabile pentru apararea antioxidanta impotriva bacteriilor(AhpC), drojdii (tioredoxin peroxidaza), si tripanosomatide (triparedoxin peroxidaza). Ele sunt considerate motivul virulentei micobacteriilor si tripanosomatidelor. In plantele superioare ele sunt implicate in balanta productiei de hidroperoxid in timpul fotosintezei [3]. La animalele superioare ele sunt implicate in reglarea redox a transmiterii si diferentierii celulare, aratant in amanunt efecte diferite.

Reducerea hidroperoxizilor, ca o parte esentiala a apararii biologice antioxidante este prin definitie catalizata de peroxidaze. Cea mai cunoscuta si cea mai populara este hemperoxidaza ce reactioneaza cu apa cu o viteza de reactie in jur de 107 M-1 s-1 si a fost pentru mult timp considerata ca cea mai rapida enzima ce catalizeaza reactii biomoleculare [4]. Eficienta extraordinara a enzimelor hem a fost cel mai insurmontabil obstacol pentru ca orice alta alternativa a sistemului peroxid de detoxifiere sa fie acceptata. De exemplu , dup ace glutation peroxidaza a fost descoperita ca o peroxidaza non-hem in 1957, a fost practic ignorata, pana ce o parte invizibila, dar efoicienta a fost descoperita in enzima: seleniul . Odata cu identificarea reziduului de selenocisteina redox-activ in centrul active al glutation peroxidazei, a fost raportata constanta de viteza in jur de 108 M-1 s-1, si comunitatea stiintifica a inceput sa accepte ca poate exista un antioxidant relevant ce apartine clasei catalazelor [5].

In 1988 alta proteina antioxidanta a fost descoperita in grupul Earl Stadtman , proteina antioxidanta tiol specifica a drojdiilor, TSA. Ea protejeaza glutamine sintetaza de inactivare oxidative in sistemul oxidative cu funcii mixte, ce cuprinde tioli, ioni de fier si oxigen.

In 1989 a proteina inrudita din Salmonella typhimurium a fost identificata ca AhpC peroxidaza a sistemului alchilhidroperoxid reductaza [6].

In final eficacitatea antioxidanta a TSA poate fi atribuita unei activitati specifice peroxidazelor, substratul donor specific fiind tioredoxina.

La mijlocul anilor nouazeci grupul profesorului Flohe a incercat sa izoleze o “ tripation peroxidaza” de la tripanosomatide, la acea vreme se credea cu fermitate ca aceasta ar fi un omolog al glutation peroxidazei [7]. O peroxidaza omoloaga TSA a fost identificata. Tripanosomatid peroxidaza utiliza o proteina inrudita tioredoxinei, triparedoxina( TXN) ca substrat donor.

Intre timp diverse subfamilii a proteinelor inrudite cu TSA au fost descoperite.Pana in Septembrie 2001, 320 de secvente complete au fost adunate in baza de date. Functionarea lor este in general necunoscuta, dar cu siguranta este foarte diversificata, ele sunt denumite general “ peroxiredoxine”[8]. Proprietatea catalitica, comuna peroxiredoxinelor apare ca fiind abilitatea de a reduce hidroperoxizii la tioli.

2.2 Proprietati catalitice de baza

Peroxiredoxinele sunt proteine fara nici un fel de grupare prostetica. Singurul resturi redox-activ sunt cisteinele, care doar in cazuri exceptionale pot fi inlocuite cu selenocisteinele. Secventele lor le clasifica ca o familie de proteine distincta care este neinrudita cu nici o alta familie de peroxidaze. Ca o regula, ciclul catalitic al peroxiredoxinelor utilizeaza in reaciile redox unul sau doua resturi de cisteina. Vitezele de reactie pentru reactiile cu hidroperoxizi cu valori de aproximativ 105 M-1 s-1, sunt mai mici comparativ cu cele ale selenoperoxidazelor.

Un aliniament al secventelor de peroxiredoxine releva faptul ca doar cateva resturi sunt pastrate in totalitate in familia de peroxiredoxine. Resturile de cisteina sunt strict pastrate in domeniul N-terminal, care se pare ca sunt cele care sunt atacate de hidroperoxizi. In toate cazurile investigate schimbul acestor resturi de cisteina se face cu resturi de serina. Reactia acestor resturi de cisteina cu un hidroperoxid produce un derivat al acidului sulfenic, care a fost detectat in structura hORF6 cu raze X, si cu instrumente chimice: 7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol in AhpC la Salmonella typhimurium. Un astfel de derivat al acidului sulfenic reactioneaza direct cu orice tiol accesibil pentru a forma o punte de sulf.

In Figura 1.1 este reprezentat aliniamentul a 27 peroxiredoxine reprezentand cinci parti majore ale familiei ( I, Peroxiredoxine cu doua resturi de cisteina; II, Peroxiredoxine cu un rest de cisteina; III, Prx-V; IV, TPX; V, BCP )

Resturile pastrate in toate peroxiredoxinele selectate sunt aratate in rosu; structura secundara , stabilita pentru PRXD2(Prx-II) uman este indicate deasupra secventelor. Numerele din spatele speciilor indica pozitia primului rest a secventei pertinente aratate. Cisteinele redox-active sunt marcate sageata rosie, resturile implicate in activarea cisteinei aflate in vecinatatesunt marcate cu o sageata albastra; punctele verzi indica resturi implicate in legarea de substratul specific a TPXPx

Fig. 1.1 Aliniamentul a 27 peroxiredoxine reprezentand cinci parti majore ale familiei

In unele peroxiredoxine care sunt echipate cu un singur rest de cisteina redox-activ, tiolul cu care reactioneaza va fi substrat reducator. Fig 2.1 indica formarea unui intermediar catalitic, in care substratul este puntea de sulf. Regenerarea starii reduse a enzimei se face cand un al doilea tiol ataca puntea de sulf. In esenta mecanismul este acelasi ca al peroxidazelor glutationului non-omolog.

Mecanismul majoritatii peroxiredoxinelor ce au un rest de cisteina aditional pastrat in domeniul distal pare a fi mult mai complex. Cisteina proximala oxidata rectioneaza prima data cu una distala. Cisteina distala se naste de la o a doua subunitate oligomerica inversata a enzimei, centrul activ este realizat de fiecare doua subunitati in cadrul proteinei homooligomerice [8]. Ciclul catalitic al peroxiredoxinelor cu doua resturi de cisteina este amplu argumentat de partea experimentala. Expunerea la hidroperoxizi constant duce la formarea de dimeri covalenti.

Puntile de sulf previzibile, cate doua intre fiecare pereche de dimeri oxidati, au fost clar detectati in TrxPx umana oxidata. Schimbul restului de cisteina distal pastrat cu restul de serina, a scazut mult sau a oprit activitatea specifica in cazul testarii cu substraturi specifice, cum s-a aratat pentru TrxPx a drojdiilor, pentru TXNPx a Crithidia fasciculate si Leishmania donovanii, si pentru AhpC de la Salmonella typhimurium [9]. Activitatea pe verificarea protectiei glutamine sintetazei este retinuta in acesti mutanti. In acest test ditiotretiol seveste ca substrat artificial cu masa moleculara mica, care poate reactiona mai bine cu restul de cisteina proximal, in concordanta cu Fig 2.1, care caracteizeaza catalizele peroxiredoxinelor cu un rest de cisteina. Aparent CXXC reactionate a substratelor cu masa moleculara mare, care sunt substrate tipice peroxiredoxinelor cu doua resturi de cisteina, nu reactioneaza usor cu restul de cisteina proximal, in timp ce tiolii cu masa moleculara mica pot.

In acest context se dezvaluie faptul ca unele peroxiredoxine cu un rest de cisteina au dovedit ca accepta glutationul ca substrat reducator [10].

O a treia varianta a schemei de baza a fost elucidata prin analize chimice: in peroxiredoxina V umana, iar N-cisteina proximala ( C47) apare ca fiind oxidata prima, dar acidul sulfenic rezultat reactioneaza apoi cu un rest de cisteina (C 151) in cadrul aceleasi subunitati.

Fig 2.1 Schema reactiei peroxiredoxinelor cu un rest de cisteina

Fig 3.1 Schema reactiei peroxiredoxinelor cu doua resturi de cisteina

2.3 Cinetica

Ambele scheme catalitice cuprind oxdarea enzimei, derivatizarea de catre substrat si regenerarea initiala, prezente ca etape independente, ce satisface definitia mecanismului de substitutie a enzimei, care ar trebui observat ca un model de mecanism tip ping-pong in analiza cinetica a starii stabile [11]. Acest comportament kinetic, care din intamplare este caracteristic peroxidazelor in general, a fost intr-adevar observat pentru TXN-Pxs la C. fasciculata, T. Cruzi si L. donovanii, precum si pentru AhpC la Helicobacter pylori. Deci, viteza la o concentratie data a substratului, v , poate fi descrisa de ecuatia Dalziel reactii cu doua substraturi, in care termenul Φ1,2[A] [B] este zero:

[E] / v = Φ0 + Φ1 / [A] + Φ2 / [B] + Φ1,2 [A] [B] (1)

In ceasta ecuatie [E] inseamna molaritatea totala a enzimei, [A] si [B] sunt concentratiile substratului , si coeficientii empirici Φ0, Φ1, Φ2, Φ1,2 sunt caracteristici funtionale a fiecarei enzime in parte. In cele mai multe cazuri s-a mentionat ca nu numai coeficientul Φ1,2 , ci si Φ0 s-a dovedit a fi zero. Datorita faptului ca Φ0 este valoarea reciproca a kcat, o valoare reala a vitezei maxime nu poate fi nici masurata, nici extrapolata. Asta inseamna ca formarea complecsilor enzimelor sau intermediarilor cu substraturile in Fig 2.1 sau 3.1 este mai lenta decat orice alta reactie consecutiva in cadrul complecsilor. In aceste cazuri intelesul fizic al Φ1 si Φ2 este corect. Φ1 este valoarea reciproca pentru constanta de viteza k’1=k+1 –k-1, care descrie asocierea enzimei reduse cu hidroperoxidul. Corespunzator, M2 este valoarea reciproca pentru k’4 ( k’4= k+4 – k -4) in Fig 3 si k’3 (( k’3= k+3 – k -3) in Fig 2.1. Mult mai simplu Φ1este reprezentat ca sansa a hidroperoxidului de a se ciocni cu un rest de cisteina proximal , si Φ2 descrie afinitatea enzimei oxidate de a reduce substratul. Daca termenul Φ0 indepentent de substrat adopta o valoare reala, o constata a vitezei desrie o reactie in cadrul complexului si este viteza limita, ca in ecuatia cinetica tipica a lui Michaelis-Menten. Astfel de schimbari de la cinetica peroxidazelor la cinetica Michaelis-Menten a fost observata cand in CfTXNPx restul de cisteina distal a fost inlocuit cu un rest de serina [12]. Mutatia isosterica nu afecteaza semnificativ afinitatea TXN la peroxidaza, dar reactia consecutiva in complex este incetinita substantial, deoarece TXN este acum in stanga cu singura sansa de a reactiona direct cu restul de cisteina proximal oxidat, ca in Fig 2.1 , care este o scurtatura catalitica care aparent nu este eficienta pentru peroxiredoxinele cu doua resturi de cisteina [13].

Un model cinetic mult mai complex a fost recent descoperit in analizele cinetice pe TXNPx mitocondrial la L. infantum. Datele [14] au sugerat un mecanism central complex care , in orice caz, apare incompatibil cu catalizele chimice prezentate mai sus.probabil, natura ologomerica a peroxiredoxinelor a fost luata in considerare cand s-a incercat sa se explice astfel de devieri de la modelul ping-pong.

2.4. Peroxiredoxinele in contextul biochimic

2.4.1. Sistemul bacterial Alchil hidroperoxid reductaza

Cele mai multe bacterii reduc H2O2 si hidroperoxizii organici cu consum de NADH si NADPH cu ajutorul a doua componente a sistemului cuprinzand AhpF FAD-dependent disulfid reductaza si peroxiredoxina-tip peroxidaza AhpC [15]. Genele sunt sub controlul oxyR regulonului care raspunde la stresul oxidativ. Mutantii S. typhimurium dezechilibreaza sistemul sau distruge oxyR regulonul, sunt hipersensibili la H2O2 si alchil hidroperoxizi. Exista mici dubii cu privire la faptul ca sistemul este incarcat cu protectie antioxidanta intr-o varietate mare de enterobacterii.In cateva specii bacteriene AhpC nu este direct redusa de AhpF.H. pylori si M. Tuberculosis nu contin nici o AphF functionala si nici oxyR regulonul ce se gaseste in enterobacterii.In cazul H. pylori AhpC s-a dovedit totusi a fi esentiala pentru viabilitate [16]. In M. tuberculosis AhpC este in mod normal exprimata la un nivel scazut, dar supraexprimata in izolatele de sinteza rezistente la izoniazida. Rezistenta la izoniazida se datoreste deficientei de catalaza, care este ceruta pentru a activa medicamentului. Catalaza-negativa produsa experimental care nu supraexprima AhpC s-a dovedit a fi avirulenta. Spre deosebire de alte specii de micobacterii, M. tuberculosis si M. aureus sunt incapabile sa supraexprime AhpC in raspunsul la stresul oxidativ.Aceasta indica faptul ca M. tuberculosis elibereaza in mod normal catalaza pentru metalolismul H2O2, dar depinde de AhpC daca catalaza lipseste. Cum AhpC este redusa in Mycobacteria ramane necunoscut indeajuns. Incercand sa se substituie AhpF de catre micotiol reductaza omoloaga si micotiol sau sistemul tioredoxin/ tioredoxin reductaza nu s-a ajuns la nici un rezultat.

Relevanta AhpC in protectia antioxidanta bacteriana pare a fi dependenta de nivelul altor proteine antioxidante [17], precum s-a decris mai devreme pentru M. tuberculosis, unde rolul sau este nemascat de deficienta de catalaza. Raspandirea larga a peroxizilor care pot fi redusi in general de peroxiredoxine in contradictie cu catalaza subliniaza deasemenea importanta AhpC. In metabolismul H2O2, AhpC tipice sunt mai putin eficiente comparate cu catalaza.

Peroxiredoxinele ce contin selenocisteina au fost descoperite in Eubacterium acidaminophilum anaerob, luand in consideratie superioritatea seleniului asupra catalizei sulfului, pot concura cu orice alta peroxidaza. Din nefericire, contextul metabolic a acestui tip de peroxiredoxine si relevanta lor psihologica nu au fost rezolvate pana in prezent.

In fitipatogenetica Xanthomonas compestris mecanismele de aparare par a fi complexe; in completarea AhpC, o noua gena, ohr [18], care schimba rezistenta hidroperoxizilor a fost descoperita.

2.5 Peroxiredoxinele la protozoare

In Plasmodium falciparum, agentul cauzator al malariei topicale, o peroredoxina cu un rest de cisteina doua peroxiredoxine cu doua resturi de cisteina au fost gasite.mai tarziu s-au dovedit a fi tioredoxin peroxidaze, activitatea primei peroxiredoxine a fost slaba sau indoielnica. Ea apare prematur sa aprecieze relevanta acestor proteine in apararea antioxidanta plasmodiala care pana acum a fost discutata depinzand de glutation. De fapt, reteaua antioxidanta la spaciile Plasmodium ramane inca necunoscuta. O gena specifica de glutation peroxidaza a fost identificata in P. falciparum; gena s-a dovedit [19] a prefera mai degraba tioredoxina decat GSH ca substrat reducator. Importanta relativa a varietatii tioredoxin peroxidazelor, apartinand fiecarei peroxiredoxine sau familii GPx, ramane a fi elucidata.

In Kinetoplastida, care cuprinde patogeni importanti ai genurilor Trypanosoma si Leishmania, peroxiredoxinele sunt peroxidaze terminale a unicei cascade de oxidoreductazecare reduce hidroperoxizi cu un consum de NADPH. Ca o prima rezolvare pentru insecta patogena Crithidia fasciculata, triparedoxina, reduce un spectru larg de peroxiredoxine-tip peroxidaza [20], care a fost denumita triparedoxin peroxidaza( TXN-Px). TXN este redusa de bis( glutationil) –derivatul spermidinei, de tripationa [T(SH)2], care sunt cunoscute de aproape doua decenii. Tripationa oxidata astfel formata este redusa de tripation reductaza (TR), un membru al familiei de flavin-dependente disulfid reductaze. Relevanta sistemului in protectia antioxidanta a fost coroborata de genetici inverse: cand sinteza de TR a fost inchisa de un vector “knock-out” in T. Brucei, parazitul devine evident mai sensibil la moartea produsa de H2O2 si pierderea virulentei. In concordanta, blocarea activitatii TR de un dominant-negativ in L. Donovani rezulta in supravietuirea primejdioasa in fagocite. Trebuie de asemenea mentionat ca ca abrogarea activitatii TR in T. Brucei a rezultat in lipsa proliferarii. Acest efect nu este atribuit unui efect antioxidant primejdios, dar poate fi explicat de TXN [21] , fiind deasemenea un substrat pentru nucleotid reductaza in tripanosomatide. Indiferent de rolul lor metabolic, componentele sistemului pot fi cosiderate ca fiind esentiale pentru viabilitatea si virulenta parazitilor si au atras un interes considerabil pentru dezvoltarea medicamentelor tripanocide. In consecinta, enzimele implicate incluzand peroxiredoxinele au fost intre timp clonate si investigate in detaliu de la majoritatea patogenilor si cateva prototipuri au fost analizate din punct de vedere structural. Cea mai recenta descperire in domeniu sunt peroxiredoxine cu o secventa mitocondriala, si a fost descoperita in T. cruzi infantum si T. brucei. Aceste variante mTXNPx deservesc interese particulare, in timp ce kinetoplastida este cunoscuta a genera H2O2 ca produs al metabolismului energetic mitocondrial. TNXPx mitocondriale din T. cruzi si L. infantum s-au aratat ca sunt relevante in protectia antioxidanta, fapt demonstrat prin tehnici genetice. Aceast fapt nu este surprinzator in timp ce tripanosomatidele patogenice sunt lasate fara alternative. Lor le lipseste oricare sistem antioxidant eficient precum catalaze sau GSH-dependent selenoperoxidaze.

In Entamoeba histolyca o peroxiredoxina cu 29 kDa a fost detectata [22] si s-a aratat a fi o peroxidaza cu DTT sau cu tioredoxina , dar nu cu AhpF ca la S. typhimurium. A fost deasemenea aratata o activitate substantiala cand a fost testata TXN2 la C. fasciculata.Aceasta descoperire este interesanta, in timp ce Ondarza a descoperit tripanotiona, stratul reducator a TXN, ca fiind prezent in E. histolyca. Aceasta observatie provocata de Ariyanayagam si Fairlamb,si pretinde ca Entamoeba este incapabila sa sintetizeze tripanotiona si ca nici nu ar contine GSH. Ondarza a demonstrat mai tarziu activitatea tripanotion sintetazei in E. histolyca si a insistat pe abilitatea parazitului de a produce tripanotiona cu ajutorul GSH reluand de la gazda [23]. Identificarea substratului donora peroxiredoxinei entamoebale si furnizarea cu echivalenti de reducere raman astfel o provocare continua.

2.6 Peroxiredoxinele in drojdii, alge si plante superioare

Cum se mentioneaza si la inceput, peroxiredoxina drojdiilor cu doua resturi de cisteina, TSA, nu a fost primul exemplu din aceasta familie care a fost descoperit, dar a fost primul arata ca fiind redus specific de catre tioredoxina. Sistemul peroxidazei drojdiilor este mult mai complex decat sistemul enterobacterial cu doua componente al alchil peroxid reductazei. Aceasta seamana cu sitemul bacterian , care este alimentat in cele din urma de un membru a flavin-dependent disulfid reductaza, aici tioredoxin reductaza. In cele mai multe bacterii [24], AhpF reduce direct AhpC peroxiredoxina prin transferarea initiala a echivalentilor reducatori din centrul redox-activ principal la CXXC in partea N-terminala si de aici la AhpC, in timp ce in drojdii rolul centrului redox secundar este preluat de tioredoxina cu CGPC analogi.

Sistemul drojdiilor ramane mai simplu decat sistemul tripanosomatidelor mentionat mai sus, el nu cere un mediator cu masa moleculaua mica ca tripanotiona pentru a transfera echivalentii reducatori de la disulfid reductazala tioredoxina [25]. Toate aceste sisteme sunt compuse din proteine omoloage : tioredoxin reductaza este omoloaga cu tripation reductaza si AhpF, la fel si cu glutation reductaza si lipoamid dehidrogenaza, si triparedoxinele sunt rude indepartate ale ale tioredoxinelor, care impart cu AhpF CXXC care sunt indispensabile pentru reducerea AhpC.

In ceea ce priveste rolul fiziologic al tioredoxin peroxidazei in S. Cerevesiae putem afirma sigur [26] ca este singurul spectru larg de peroxidaze bine caracterizat in aceste specii. Drojdiile nu au nici o peroxidaza ce contine seleniu care ar putea face fata hidroperoxizilor organici. De fapt, intregului genom al drojdilor, care intre timp a fost secventionat , ii lipsesc toate genele care ar putea produce biosinteze a oricarei selenoproteine. Genele tip GPx [27] in omologii cisteinei codate a drojdiilor a GPx, care, prin analogie, pot fi peroxidaze putin eficiente. In plus , cu 0.7% din totalul proteinelor solubile a drojdiilor cu crestere aeroba, tioredoxin peroxidaza este destul de abundenta, si prin aceasta poate compensa eficienta sa molara moderata. Enzima poate fi considerata un instrument antioxidant major pentru drojdii. Un mutant cu deficienta de TSA a crescut la fel de bine ca tipul descoperit inainte, in conditii anaerobe, dar a crescut mai putin in conditii aerobe, in particular cand a fost prezent si un stress oxidativ.

Dupa ce legatura tioredoxina/peroxiredoxina a fost stabilita in drojdii ,si apoi si pentru cateva peroxiredoxine ale mamiferelor, s-a descoperit prin analogie ca ca regenerarea peroxiredoxinelor cu doua resturi de cisteina active este mediata de tioredoxina la plante. Dar dovezile experimentale au fost putine. In ciuda faptului ca un numar mare de gene ale peroxiredoxinelor au fost gasite in alge si plante superioare, numai cateva exemple au fost investigate in detaliu [28].O peroxiredoxina cu doua resturi de cisteina cu 28 kDa a fost clonata de la alga verde-albastra Synechocystis si relevanta sa functionala a fost investigata prin ruperea genei. Mutantul descoperit anterior [29] a aratat descresterea vitezelor de crestere si o descrestere a productiei in fotosinteze la intensitati mici ale luminii comparativ cu organismul descoperit pentru prima data. S-a concluzionat ca enzima nu este esentiala pentru supravietuire, dar poate avea un rol esential de protectie impotriva hidroperoxizilor derivati din fotosinteza. Ideea ca peroxiredoxinele sunt utilizate de plantele fotosintetice ca antioxidanti este mai departe sprijinita de studii pe ‘BAS1 ‘ in Arabidopsis thaliana. ‘BAS1’ este o peroxiredoxina cu doua resturi de cisteina tipica plantelor superioare si care a fost descoperita si in orz si in spanac. BAS1 este o proteina codata nuclear exprimata initial cu o extensie N-terminala, stiuta fiind mai demult ca fiind sursa majora de superoxid, H2O2 si lipid peroxizi in plantele superioare. Ca proteina matura,BAS1 a fost localizata in stroma cloroplastelor ca o proteina cu masa moleculara de 28 kDa. Localizarea sa in cloroplaste indeplineste observatia ca BAS1 este restrictionata in partile verzi ale plantei, unde nivelul sau este in paralel cu activitatea fotosintetica. Nivele reduse de BAS1 in A. thaliana, au fost asociate cu productii reduse a fotosistemului II, transportul electronilor si degradarea proteinei care sunt sensibile la stresul foto-oxidativ, precum proteina D1 a fotosistemului II, Rubisco si LHC II. Un rol antioxidant a BAS1 este mai departe sustinut de reglarea exprimarii sale [30].

Peroxiredoxinele cu doua resturi de cisteina a drojdiilor, algelor si plantele superioare sunt implicate in protectia antioxidanta ca peroxidaze cu spectru larg, in timp ce contextul biochimic al peroxiredoxinelor cu doua resturi de cisteina ramane evaziv. Contributia relativa a peroxiredoxinei-tip peroxidaza la metabolismul hidroperoxizilor este greu de prevazut [31]. In plantele superioare , ascorbat peroxidaza care exista ca o forma citosolica si cloroplastica, este acceptata ca fiind responsabila pentru metabolismul H2O2 . Forma citosolica are rolul de a proteja plantele de tutun impotriva expunerii la ozon. Membrii familiei GPx sunt detectati in multe plante.

Pana la secventionarea, toti s-au dovedit a fi omologi cu sulf a selenoperoxidazelor din mamifere, cele mai multe asemanatoare cu fosfolipid hidroperoxid glutation peroxidaza. Prin analogie, se crede ca ei actioneaza pe o raza mare de actiune a hidroperoxizilor , deocamdata cu eficienta scazuta , date cu privire la specificitatea si cinetica lor find putine [32]. Un omolog al GPx in plantele de citrice a fost descoperit ca fiind o proteina asociata cu rol in stressul sarurilor,in timp ce un +asemenea omolog la Malus pumila este indus de expunerea la frig. Ambele observatii nu indica sigur o functie antioxidanta a acestei familii GPx [33].

2.6 Peroxiredoxinele la animale

Prima gena secventionata a peroxiredoxinelor animale a fost detectata in creierul sobolanului de catre Chae. Apoi peroxiredoxine animale au fost descoperite prin secventionarea genomului la C. elegans, ca rezultat al cautarilor pentru sisteme de protectie antioxidante in parazititi metazoare, sau in mamifere, adesea factori specifici formati in tesuturi particularesau in raspunsul la oarecare stimuli. Proteina stress macrofaga MSP23, acum Prx-l la soarece, factorul osteoblast OSF3, produsul genetic MER5 al celulelor eritroleucemice, acum numite Prx-III, factorii naturali ce intensifica moartea celulelor A si B, acum clasificati ca Prx-I si II umane, si proteina legata de hem HBP23 de la sobolani sunt suficiente exemple pentru acest grup [34]. Multe dintre peroxiredoxinele animale sunt cunoscute doar ca secvente deduse. Peroxiredoxinele metazoarelor parazite sunt discutate ca fiind instrumente antioxidante care protejeaza parazitul impotriva atacurilor oxidative ale fagocitelor gazdelor. Presupusa lipsa a enzimelor alternative hidroperoxid reducatoarein nematodele si trematodele parazite este adesea motivul suficient pentru a atribui un important rol antioxidant peroxiredoxinelor descoperite [35]. Doua “tioredoxin peroxidaze” , Bm-tpx-1 si Bm-tpx-2, au fost identificate in Brugia malayi. Bm-tpx-1 a fost pusa in evidenta cu imunohisto-chimia si localizata in celulele hipodermei, cateodata in cordul lateral, si nu inca la suprafata parazitului, unde ar trebui sa fie daca ar apara paraziul de H2O2 exogen. O localizare similara a fosr decoperita pentru “ peroxiredoxin 2 proteina” ( Ov-Pxn-2) a parazitului Onchocerca voluvulus [36].

In larve, enzima a fast vazuta in hipoderm si in cuticule.In viermii adulti, siturile de expresie pronuntate sunt in intestin si epiteliul uterin. Mai tarziu s-a crezut ca descarcarea enzimei la embrioni si microfilarie , inainte ca ei sa fie eliberati , trebuie sa faca fata sressului oxidativ generat de gazda.

In parazitul cainelui Dirofilaria immitis o peroxiredoxina cu un singur rest de cisteina a fost identificata [37].S-a evidentiat o distributie similara ca la Ov-tpx-2. Produsul recombinant prosul in E. coli a aratat ca reduce H2O2 cu co-substratul artificial DTT.

La om, sase peroxiredoxine distincte au fost identificate si dovezile de circumstanta sprijina supozitia ca aceata multiplicare este un fenomen general la mamifere.Bazate pe similariati secventiale sase tipuri de peroxiredoxine la mamifere , Prx-I si II au fost gasite [38]. Enzimele mamiferelor de tip V sunt peroxiredoxine monomere cu doua resturi de cisteina, care nu accepta tioredoxine. Peroxiredoxina umana tip VI s-a demostrat a avea activitate glutation peroxidaza.Prx este limitata la mitocondrii. Analizele cinetice care permit estimarea vitezelor si concentratiile substratului fiziologic din ecuatiile vitezei nu au fost demonstrate pentru nici o peroxidaza de la mamifere, dar eficacitatile molare a acestor enzime sunt in general mai mici decat a glutation peroxidazelor ce ontin seleniu sau a catalazelor. Intrebarile care s-au pus au fost la ce sunt bune aceste peroxiredoxine la mamifere si de ce sunt atat de multe?

Ideea ca ele ar putea fi diferite putin de instrumentele antioxidante precum glutationperoxidaza si catalaza ar putea fi luate in considere. O situatie unde oricare din peroxiredoxine poate concura cu catalaza pentru substratul comun H2O2 pare sa nu existe.Ca o regula catalaza este prezenta in metabolismul H2O2 in peroxizomi si, in conditiile unei concentratii normale si eficacitate molara, este imbatabila in protectia acestiu compartiment celular. Mult mai realist, peroxiredoxinele pot fi cosiderate instrumente de urgenta pentru protectia altor compartimente celulare in cazul deficientei de seleniu [39]. In conditii normale o competitie a peroxiredoxinelor cu GPx (GPx-1) poate fi vazuta daca concentratia molara a primelor este cu 2 pana 3 ordine de marime mai mare .O furnizare mult mai eficienta a Prx-I-III cu tioredoxine reduse decat a GPx cu GSH poate fi deasemenea exclusa. Ambele sisteme de furnizare, regenerarea Trx si GSH , utilizeaza aceasi sursa de echivalentei de reducere, NADPH si nu exista nici o dovada pentru o utilizare preferentiala de NADPH a tioredoxin reductazei. Daca sistemul glutation peroxidazei termina echivalentii de reducere, aceasta se intampla de obicei datorita insuficientei regenerari a NADPH care paote afecta in mod egal si sistemul tioredoxin peroxidazei. Sistemul glutationului cu 1-10 mM GSH redus este apreciabil mai bine tamponat decat oricare sistem al tioredoxinei [40]. Pe scurt, un rol important al tioredoxin peroxidazelor la mamifere precum protectia antioxidanta poate fi considerat putin probabil.

In contrast, o dovada evidenta sustine un potential rol al peroxiredoxinelor de la mamifere in fenomene reglatorii [41].

2.7 Concluzii asupra peroxiredoxinelor

Peroxiredoxinele, necunoscute pana la sfarsitul anilor optzeci, au devenit intre timp o mare familie de proteinecare este divizata in diferite forme moleculare si se intind peste toate domeniile vietii. In termeni enzimatici, ele sunt peroxidaze cu eficienta molara moderata. Dominatia comuna a intregii familii pare a fi reziduul de cisteina strict conservat, care este activat prin legaturi de hidrogen si interactii electrostatice pentru reducerea hidroperoxizilor, intimp ce pasii catalizei si substraturile donoare regenerante variaza de la o subspecie la alta [42]. La speciile unde lipseste inalta eficienta a peroxidazelor, precum unele bacterii, drojdii si tripanosome, peroxiredoxinele pot reprezenta o linie majora de protectie impotriva daunelor produse de hidroperoxizi.

La plante ele sunt implicate in protectia impotriva bioprodusilor oxidanti ai fotosintezei. La animalele superioare ele sunt probabil insuficient de eficiente in competitia cu catalaza sau seleno-peroxidazele in protectia impotriva stresului oxidativ. In schimb, un scenariu tulburator al observatiilor, incepand de la descoperirile intamplatoare pana la asociatii neasteptate cu proteine ale sistemului imunitar si interferente cu actiunea citocinei, scoate in evidenta roluri distincte ale peroxiredoxinelor in reglarea metabolica si diferentierea celulara.

Capitolul 3. TUBERCULOZA SI BOLILE TROPICALE

Tuberculoza este cauzată de Mycobacterium tuberculosis. La nivel mondial se estimează aproximativ 2 miliarde de purtători. Ea afectează de obicei plămânii, dar si alte părti ale organismului, mai ales sistemul osos si creierul. Trebuie făcută diferenta între infectie si boală. Persoanele care sunt doar infectate nu se simt bolnave si nu au simptome. Infectia se poate prelungi toată viata, fără ca boala să se declanseze. Putem contracta tuberculoza la orice vărstă. Aceasta se transmite rapid, în special în rândul populatiei defavorizate, cu accesibilitate redusă la medic si prost hrănită.

Tuberculoza se transmite prin aerul pe care îl inspirăm. Când o persoană bolnavă tuseste sau strănută microbii se răspândesc în aer. Contaminarea se produce când inspirăm microbii prezenti în aer. În unele cazuri boala poate fi transmisă de vite, de exemplu consumând laptele nepasteurizat de la un animal infectat. Perioada de incubatie este de 4-12 săptămâni, dar infectia poate să persiste luni sau ani înaintea aparitiei bolii. Un bolnav este contagios mai multe săptămâni după începerea tratamentului. Copiii sub 3 ani si vârstnicii sunt cei mai expusi riscului de îmbolnăvire, desi oricine poate să fie afectat. Persoanele al căror sistem imun este slăbit, de exemplu cei cu HIV/SIDA, contractează mult mai usor boala. În ultimul timp a sporit preocuparea legată de TB, deoarece microorganismul a dezvoltat rezistentă la medicamente.

Tuberculoza se manifestă prin  stare de slăbiciune generală, pierderea în greutate, febră si transpiratii nocturne. Simptomele tuberculozei pulmonare includ tusea persistentă, expectoratii sanguinolente si durerea de piept. La copiii de vârstă mică tuberculoza pulmonară se manifestă uneori doar prin oprirea cresterii sau un retard staturo-ponderal. Celelalte semne si simptome depind de localizarea bolii.

  Tuberculoza slăbeste organismul în general, sporind probabilitatea ca persoana afectată să contracteze alte boli,  sau determină agravarea celor existente.

Bolnavii cu TB trebuie urmeze o  terapia curativă, care de obicei include două sau mai mult medicamente antituberculoase, timp de cel putin sase luni. Din păcate, unii bolnavi nu respectă schema si durata de tratament. Astfel apare tuberculoza multirezistentă, transmisibilă altor persoane.

Cea mai bună metodă de protectie a copiilor contra tuberculozei este imunizarea cu vaccinul BCG.

Tripanosomiaza sau boala somnului este endemimica intr-o regiune vasta de Africa. Se cracterizeaza prin prezenta insectei tzetze( Glosssina palpalis), gazda intermediara a parazitilor sanguini-protozoare din speciile Trypanosoma rhodensience si T. gambiense .aproximativ 50 milioane personae sunt supuse riscului direct de a contracta boala, annual fiind raportate mai mult de 20 000 de cazuri noi.

Animalele domestice sunt de asemenea, foarte receptive la tripanosomiaza, trei specii fiind importante din acest punct de vedere: Trypanosoma Brucei, T. Congolese si T. vivax. Sub forma sa acuta sau forma “ nagana” tripanosomiaza este letala pentru taurine. In cazurile in care gazdele infectate rezista , parazitii trimisi prin insecte tzetze induc avort si sterilitate, precum si scaderea productiei de lapte si a capacitatii de munca a animalelor. Aceasta boala este factorul limitativ major al cresterii animalelor din zona africana intertropicala pe o suprafata de 10 milioane kilometri patrati care corespunde ariei de raspandire a insectei tzetze si in care exista numai 45 milioane animale domestice. In plus efectivele de taurine parazitate asigura o productie de carne si lapte de numai 20%din potentialul lor real. Ca urmare parazitii care afecteaza speciile de animale domestice vor fi responsabile pentru pierderi anuale in productia de carne estimate la 57 bilioane dolari.

Regiunile infectate sunt limitate la zonele umede in care rezervele de furaje sunt abundente dar in care traiesc cele 22 specii de insecte tzetze cunoscute in prezent. Pana la jumatatea deceniului al saselea, metodele de comatere a bolii au constat in aplicarea unor programe de eradicare a insectei tzetze prin pulverizarea insecticidelor. Introducerea in aceste zone a masculilor de tzetze sterili si utilizarea capcanelor cu insecticide au permis eradicarea insectelor pe o suprafta de 3500 kilometrii patrati.au fost folosite capcane cu Pheromone ( o substanta biologica atractanta specifica) in vederea folosirii de catre crescatorii de taurine.

Se efectueaza de asemenea, cercetari cu privire la fenomenul de tripano-toleranta la rasele de taurine care, spre deosebire de rasele de zebu cu cocoasa, snt capabile sa se dezvolte in zonele infestate. O mai buna intelegere a tripano-tolerantei si a modului de transmitere a acesteia va permite realizarea selectiei pe baza criteriului resistentei si a altor calitati de crestere. Tripano-toleranta a fost deasemenea indusa la rasele de taurine receptive.

Elaborarea unui vaccin contra parazitului constuie o alta directie de cercetare care poate conduce la prevenirea tripanosomiazei atat la oameni cat si la animale.

Tripanosomele au forme distincte in diferite statii ale complexului lor ciclu vital in timpul fazei de dezvoltare in intestinal intermediar al insectei si apoi in glandele sale salivare (forma metaciclica) ca si in timpul fazei de proliferare in sangele uman. Chiar daca acesti paraziti sunt in continuu expusi in circuitul sangvin actiunii sistemului imun al mamiferelor infestate( spre deosebire de Plasmodium, care in timpul unei parti din ciclul vital, e sechestrat in ficat sau in gobulele rosii), ei sunt capabili sa evite mijloacele de aparare ale gazdei prin schimbarea antigenelor care formeaza invelisul lor superficial. In timp ce noi anticorpi sunt produsi pentru a reactiona cu antigenele noi de suprafata, tripanosomele s-au eliminat si au inlocuit invelisul propriu cu unul diferit din punct de vedere antigenic. Sistemul imun al gazdei este suprasolicitat sin nu mai face fata proliferarii parazitilor mai intai in vasele sanguine si ganglionii limfatici, ulterior in sistemul nervos central; inflamarea membranelor externe ale encefalului determina starea de letargie, coma si in final moartea.

Lucrari de cercetare referitoare la structura invelisului de suprafata al celulei parazitare si la proteinele antigenice de suprafata al celulei parazitare si la proteinele antigenice de suprafata ale acesteia au fost efectuate. S-a aratat ca invelisul de suprafata consta intr-o matrice de molecule glicoproteice care sunt identice la toti indivizii apartinand aceleiasi clone de tripanosome. Aceste antigene de suprafata au fost denumite glicoproteine variabile de suprafata sau VSG. Exista gene diferite care codifica glicoproteinele( antigenele) de suprafata ale tripanosomelor.

Van der Ploeg de la Universitatea Amsterdam a costatat ca genele VSG ale tripanosomelor sunt localizate in cromozomi inclusi in mai multe clase: (1) minicrozomomi, formati din aproximativ 100 000 nucleotide; (2) cromozomi mici, de 2-7 ori mai lungi; (3) molecule de dimensiuni mijlocii care includ aproximativ doua milioane de nucleotide; (4) cromozomi care depasesc aceasta lungime. Rezulta de aici ca exista mai mult de un situs in genomul tripanosomelor in care genele VSG pot fi activate. Proximitatea fata de un telomer nu este singura conditie pentru exprimarea genei VSG.

Transcrierea in ARN mesager implica numai cate o gena VSQ, aceasta fiind totdeauna situate langa un telomer. Pentru a fi transcrisa, o gena interioara trebuie sa fie duplicata si transloca la unul din numeroasele situsuri de exprimare localizate langa telomere. Pe de alta parte, o gena VSG legata de telomere nu trebuie sa fie in mod obligatoriu duplicata pentru a fi exprimata. Diversitatea antigenica rezultata din exprimarea genei VSG poate fi amplificata prin recombinare genetica.

Se pare, totusi, ca mecanismele exprimarii successive a genei VSG sunt atat de complexe si variate incat este aproape imposibil sa fie complet definite, astfel ca elaborarea unui vaccin contra tripanosomelor din circuitul sanguine este improbabila.

Ar fi totusi posibila realizarea unui vaccin contra formei metaciclice a tripanosomelor , care reprezinta stadiul final de dezvoltare in glandele salivare ale insectei tzetze; in acest stadiu parazitul se transmite la gazda umana.

Un grup de biologi de la Laboratorul International pentru Cercetari in Patologia Animala de la Nairobi, lucrand in colaborare cu Universitatea Edinburgh si Institutul Tropical Elvetian, a reusit sa mentina culturi in vitro ale mai multor specii de tripanosome, in special T. Congolese. Capacitatea lor de productie a fost de 100-200 milioane paraziti pe zi.

Ei au vaccinat un lot de opt capre cu antigene ale formei metaciclice de T. Congolese obtinute din culturile in vitro si inactivate prin ultrasonicare; un alt lot de zece capre a fost pastrat martor. Dupa doua luni toate caprele au fost intepate de insecte tzetze si asfel toate s-au infectate cu T. Congolese. Au supravietuit numai cele opt capre imunizate in timp ce celelalte au murit in urma infectiei. Rezulta ca un vaccin capabil sa neutralizeze un numar limitat de antigene ale formei metaciclice va fi eficient in prevenirea tripanosomiazei.

Investigatiile de laborator cu privire la tripanosome, initiate la mijlocul deceniului al optulea, in mod special cu referire la Typanosoma Brucei care se dezvolta cu usurinta la animalele de experienta dar nu la om, au contribuit semnificativ la perfectionarea cunostintelor in legatura cu antigenele variabile ale invelisului de suprafata al parazitului, structura lor si modul in care proteinele de suprafata se ataseaza, exprimarea genelor care codifica aceste antigene si controlul molecular al exprimarii genelor in cromozomi. Asfel de date fundamentale vor oferi o mai buna intelegere a naturii si mecanismul variabilitatii antigenice a parazitului, constituind premise ale elaborarii in urmatorii cativa ani a unui vaccin contra tripanosomiazei, concomitent cu cultivarea pe scara larga a parazitului in vitro; aceasta realizare va avea un considerabil impact asupra dezvoltarii cresterii taurinelor in regiunile tropicale umede in Africa.

In tarile din America Latina, 10-20 milioane persoane sunt afectate de boala Chagas care este o problema majora de sanatate publica, fiind produsa de o alta specie de tripanosome, T. cruzi. Boala constituie o amenintare serioasa pentru copiii mici. Ea poate fi de la inceput letala sau cel mai adesea, evolueaza printr-o forma cronica, cu grave repercursiuni tardive asupra cordului si tractului digestiv. Trypanosoma cruzi constituie subiectul unor cercetari active in Brazilia. Lafaille si Goldenberg, de la Departamentul de Biochimie si Biologie Moleculara al institutului Oswaldo Cruz, au reusit sa cloneze genele care codifica antigenele de suprafata ale formei infestate a parazitului. Proteinele recombinate au reactionat intens cu serurile pacientilor. Structura si organizarea acestor gene, ca si produsele lor, au fost studiate de cercetatorii brazilieni care au urmarit folosirea rezultatelor lor la perfectionarea diagnosticului bolii Chagas [1].