Procese Metabolice ALE Microorganismelor Si Aplicatii In Industria Alimentara
CUPRINS
CAPITOLUL 1. Procese metabolice ale microorganismelor si aplicatii in industria alimentara
1.1 INTRODUCERE: Metabolismul microbian – functii de baza
1.2 Bioenergetica microbiana (metabolism oxidativ energetic)
1.3 Fermentatia alcoolica
1.4 Fermentatia lactica
1.5 Fermentatia propionica
1.6 Fermentatia butirica
1.7 Procese metabolice aerobe (fermentatii oxidative)
– fermentatia acetica
– fermentatia gluconica
– fermentatia citrica
– fermentatii oxidative diverse
CAPITOLUL 2. Transformari microbiene ale compusilor macromoleculari.
2.1 Descompunerea amidonului si glicogenului.
2.2 Descompunerea celulozei, hemicelulozei.
2.3 Degradarea substantelor pectice.
2.4 Descompunerea lipidelor.
2.5 Degradarea acizilornucleici
2.6 Degradarea chitinei
2.7 Transformari microbiene ale protidelor
CAPITOLUL 3. Microbiota alimentelor si incidenta microorganismelor contaminate
3.1 Surse naturale de microorganisme
3.2 Consideratii generale asupra microbiotei alimentelor
CAPITOLUL 4. DISCUTII – CONSIDERATII GENERALE
Controlul microbiologic al produselor alimentare
4.1 Tehnici si metode de evaluare a microorganismelor.
4.2 Indicatori ai calitatii microbiologice a alimentelor.
4.3 Aspecte legislative privind calitatea microbiologica a alimentelor
4.4 Analiza riscurilor. Puncte critice de control (HACCP).
4.5 Microbiologia previzionala si aplicarea ei in industria alimentara.
84 pagini
=== l ===
CUPRINS
CAPITOLUL 1. Procese metabolice ale microorganismelor si aplicatii in industria alimentara
1.1 INTRODUCERE: Metabolismul microbian – functii de baza
1.2 Bioenergetica microbiana (metabolism oxidativ energetic)
1.3 Fermentatia alcoolica
1.4 Fermentatia lactica
1.5 Fermentatia propionica
1.6 Fermentatia butirica
1.7 Procese metabolice aerobe (fermentatii oxidative)
– fermentatia acetica
– fermentatia gluconica
– fermentatia citrica
– fermentatii oxidative diverse
CAPITOLUL 2. Transformari microbiene ale compusilor macromoleculari.
2.1 Descompunerea amidonului si glicogenului.
2.2 Descompunerea celulozei, hemicelulozei.
2.3 Degradarea substantelor pectice.
2.4 Descompunerea lipidelor.
2.5 Degradarea acizilornucleici
2.6 Degradarea chitinei
2.7 Transformari microbiene ale protidelor
CAPITOLUL 3. Microbiota alimentelor si incidenta microorganismelor contaminate
3.1 Surse naturale de microorganisme
3.2 Consideratii generale asupra microbiotei alimentelor
CAPITOLUL 4. DISCUTII – CONSIDERATII GENERALE
Controlul microbiologic al produselor alimentare
4.1 Tehnici si metode de evaluare a microorganismelor.
4.2 Indicatori ai calitatii microbiologice a alimentelor.
4.3 Aspecte legislative privind calitatea microbiologica a alimentelor
4.4 Analiza riscurilor. Puncte critice de control (HACCP).
4.5 Microbiologia previzionala si aplicarea ei in industria alimentara.
Bibliografie selectiva
CAPITOLUL 1.
PROCESE METABOLICE ALE MICROORGANISMELOR SI APLICATII IN INDUSTRIA ALIMENTARA
INTRODUCERE
1.1. Metabolismul microbian – functii de baza
Viata celulei microbiene in conditii compatibile cu aceasta este determinate de caracterele genetice care ii imprima un anumit metabolism, determinat de totalitatea reactiilor biochimice catalizate secvential de enzimele celulei vii, prin care se asigura transferul de masa si energie intre celula si mediul ambiant. Viata microorganismelor continuitatea lor genetica este asigurata de desfasurarea concomitenta a celor doua laturi interdependente ale metabolismului catabolismul si anabolismul.
Catabolismul
Denumit si metabolism degradativ este razultatul reactiilor biochimice realizate enzimatic prin care compusii macromoleculari sunt transformati in produsi usor asimilabili cu eliberarea concomitenta a energiei potentiale a compusilor cu rol de nutrient (reactii exergonice). cele doua functii specifice ale reactiilor de catabolism sunt:
– eliberarea energiei chimice din nutrienti (sau generalizat din molecule combustibil) si stocarea acestei energii in compusi macroergici prin reactii de fosforilare, energie disponibila pentru celula microbiana si folosita in procese vitale.
– cea de-a doua functie care se desfasoara concomitant cu eliberarea de energie, consta in conversia substantelor nutritive ale mediului ambiant in molecule precursori (glucide, aminoacizi, purine, pirimidine), respectiv subunitati constitutive ce servesc drept material de constructie pentru biostructura compusilor celulari.
Anabolismul
Denumit si metabolism constructive, de biosinteza, reprezinta totalitatea reactiilor biochimice endergonice catalizate de enzime, prin care se realizeaza biosinteza compusilor celulari, cresterea si reproducerea microbiana.
– Functia specifica anabolismului este cea de asamblare a subunitatilor rezultate prin catabolism in compusi cu rol plastic si functional (acizi nucleici, protide, lipide, polioze). Biosinteza acestor compusi necesita din partea celulei un consum de energie.
In cadrul metabolismului microbian are loc biosinteza si biodegradarea intracelulara a unor biomolecule de tipul proteinelor/enzimelor, care nu isi mai indeplinesc functiile in mod eficient si sunt transformate in biomolecule noi prin procese de turnover.
Microorganismele au potentialul genetic de a codifica si de a sintetiza peste 1000 de tipuri de enzime care catalizeaza specific, cai metabolice proprii. Echipamentul enzimatic complex al celulei microbiene este alcatuit din enzime constitutive sintetizate in mod neconditionat si obligatoriu in toate celulele microbiene si enzime adaptive (inductive) sintetizate in mod conditionat, cand mediul ambiant prin nutrientii oferiti impune adaptarea. Prin reglarea metabolismului, concentratia de enzime adaptive poate creste de 10 – 1000 ori in prezenta substratului inductive. Majoritatea enzimelor microbiene actioneaza endogen in citosol, in mediu apos sau lipidic si sunt localizate in mitocondrii pe suprafata interna a cristelor (enzime de oxido-reducere) in lizozomi (protease, lipase, fosfataze), in ribozomi (ARN-polimeraza, sintetaze) in plasmalema (permeaze) sau in statul intern al peretelui celular si in spatiul periplasmic (invertaza, amilaza, celulaze). Enzimele de tipul hidrolazelor actioneaza exogen ceea ce permite utilizarea de catre celula microbiana a compusilor macromoleculari din mediu in urma conversiei lor in molecule cu dimensiuni accesibile pentru transport in interiorul celulei.
Cai metabolice ale celulei microbiene
Pentru indeplinirea functiilor de baza a metabolismului microbian enzimele constitutive si inductibile ale celulei participa in calitate de biocatalizatori la realizarea diverselor ca ice pot reprezenta secvente de reactii catalizate de 2-20 enzime, ce pot fi grupate in :
Cai catabolice
Grupeaza reactii degradative, de simplificare, puternic exergonice catalizate de enzime prin care moleculele mari sunt transformate etapizat in produse intermediare, iar acestea pot prin oxidare sa fie transformate pana la produsi finali (CO2, H2O, alte gaze)
Degradarea catabolica se poate realize in trei etape succesive:
– Etapa I-a are loc in exteriorul celulei prin conversia macromoleculelor (polioze, protide, lipide) in compusi simpli solubili (aminoacizi, hexoze, pentoze, acizi grasi s.a) prin care se elibereaza aproximativ 1% din energia potentiala a compusilor organici, energie care se pierde sub forma de caldura in mediul in care are loc reactia, fara a fi folosita de celula microbiana. (fig.1.1)
– Etapa a II-a, are loc intracellular si consta in catabolizarea partiala a compusilor simpli in intermediari metabolici cu eliberarea in mod cuantificat a 1/3 din energia lor.
Fig.1.1 Etape ale metabolismului microbian.
Aceasta energie este folosita de celula atat pentru biosinteza cat si pentru formarea prin fosforilare a compusilor macroergici. Pe cai catabolice cunoscute: calea glicozei, Embden Mayarhof-Pernas, suntul pentozo-fosfat, calea tagatozei, calea Leloir, Entner Doudoroff s.a., compusii diversificati converg spre simplificare cu formarea unor cataboliti „cheie” cum ar fi piruvantul metabolizat in conditii anaerobe prin fermentatie in alcool, acid lactic, acid propionic, acid butiric s.a. sau in acetil-C0-A.
– Etapa a III-a consta in degradarea aeroba a compusilor intermediari pe o cale unica prin procese de respiratie la compusi finali CO2, H2O, si anume prin ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs). Aceasta etapa este puternic exergonica, este o cale folosita de microorganismele aerobe deoarece prin metabolizarea completa pana la CO2 si H2O a unei molecule de glucoza, celula poate sa stocheze o cantitate importanta de energie.
Cai anabolice
Sunt cai biosintetice prin care celula foloseste compusii simpli pentru constructia de biomolecule ce intra in structura inalt organizata a celulei. Caracteristic acestor cai este ca sunt consumatoare de energie eliberata la un moment dat precum si dupa necesitati, a energiei stocate in compusii macroergici.
Cai amfibolice
Sunt evidentiate de Davis 1961, consta in desfasurarea simultana a proceselor de degradare si biosinteza, ceea ce explica transformarile rapide care se produc in celula microbiana in conditii optime de viata.
Cai anaplerotice (colaterale)
Sunt cai alternative ce pot fi folosite de celula atunci cand accidental s-a produs inhibarea sau blocarea caii metabolice centrale.
1.2.Bioenergetica microbiana (metabolism oxidativ energetic)
Procurarea energiei ste o proprietate vitala a celulei microbiene si se realizeaza prin eliberarea energiei chimice a diferitelor alimente si formarea compusilor macroergici prin procesul de fosforilare.
In metabolismul energetic substratul nutritiv prin procese de oxidare si oxidoreducere pe cale enzimatica trece in substrat oxidat cu eliberarea de energie potentiala (Q1) substratul oxidat rezultat cu o energie potentiala diminuata (Q2) sufera in continuare transformari pana la produsii finali.
Substratul oxidat poate servi drept precursor sau daca nu este util celulei, se poate elimina in mediu. Cantitatea de energie obtinuta prin catabolism, poate fi folosita direct in fotosinteza, iar energia excedentara este stocata in compusi macroergici prin procesul de fosforilare denumit astfel deoarece componenta macroergica care stocheaza energia rezultata, contine grupari fosfat. Principalii compusi macroergici sunt: ATP considerat valuta forte a celulei, format din AMP~P~P (cu eliberarea a 30 kj/mol prin desfacerea legaturii macroergice); ADP acetil fosfatul (Acetat~P) (fig. 1.2.).
Fig.1.2. Procese metabolice cu participarea ATP
Modalitati de fosforilare
Fosforilarea fotosintetica intalnita la bacterii din diviziunea Photobacteria care folosesc energia radianta;
Fosforilare oxidative cand formarea compusilor macroergici cu fosfor are loc prin inmagazinarea energiei eliberate prin reactii de oxidare. Fosforilarea oxidativa are loc prin procese de respiratie aeroba si anaeroba.
Fosforilarea de substrat in urma formarii de compusi macroergici prin reactii de oxido-reducere prin care glucidele sunt transformate prin procese de fermentatie anaeroba in compusi intermediari, si acceptorul de H sau electroni este un compus organic.
Fosforilarea oxidativa
In acest tip de fosforilare eliberarea energiei potentiale din diverse substraturi de natura organica se realizeaza prin procese de oxidare care se pot desfasura pe trei cai, astfel:
– Reactii de oxidare prin pierdere de e-; are loc transfer de electroni de la substante cu potential de oxido-reducere negative la substante cu potential de oxido-reducere pozitiv.
Daca ne referim la potentialul redox al diferitelor medii, cele bogate in oxigen pot avea valori positive (maxim E0’= +0.82) iar mediile bogate in hidrogen au un potential negativ (maxim EH’= -0.41)
– Reactii de oxidare prin transfer de e- si H+ (prin transfer de H). Oxidarea prin transfer de hidrogen este folosita de microorganisme anaerobe si aerobe si acest transfer este realizat de enzime active la diferite valori ale potentialului de oxido-reducere. Astfel enzimele implicate in reactii de oxido-reducere sunt dehidrogenazele aerobe (aldehid-dehidrogenaza); anaerobe (alcool-dehidrogenazele).
Aceste dehidrogenaze au drept coenzime NAD+ sau NADP astfel incat aceste pot sa preia atomii de hidrogen trecand din forma oxidata (NAD+) in forma redusa (NADH+H+)
– Reactii de oxidare prin castig de O2 – cand in prezenta enzimelor care actioneaza la un potential de oxido-reducere pozitiv, are loc transferul de H acceptat de O2 din aer si se formeaza apa; aceasta reactie de oxidare este caracteristica microbiotei aerobe.
Respiratia aeroba este un metabolism dependent de oxigenul din aer iar produsele finale sunt CO2 si apa iar intreaga energie a substratului oxidat se elibereaza prin produsele finale ale respiratiei. Respiratia aeroba este foarte avantajoasa din punct de vedere energetic pentru celula microbiana, de aceea, atunci cand urmarim obtinerea de celule in cantitati mari (drojdie comprimata) sau obtinerea de substante intracelulare, cultivarea se face in conditii de aerare.
Respiratia aeroba este dependenta de cantitatea de oxigen din aer iar carbonul din compusul organic se regaseste in dioxidul de carbon.
Microorganismele aerobe dispun de o catena respiratorie diversificata in componenta careia intra dehidrogenaze, citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze. Numeroase bacterii pot oxida hidrogenul (Pseudomonas), amoniacul pana la NO2 (Nitrosomonas), sulful si H2S pana la sulfat (Thiobacillus)sau fierul Fe2+ la Fe3+ (Thiobacillus ferooxidans) cu rol important in circuitul natural al elementelor.
Respiratia anaeroba – substratul este transformat pana la CO2, iar e- sunt cedati prin procesul de oxidare unor compusi anorganici acceptori.
Aceasta respiratie este intalnita la bacteriile strict anaerobe cand acceptorul de electroni sau de hidrogen este un compus anorganic. Astfel bacteriile denitrificatoare pot transforma NO3 la azot molecular, cele metanogene pot transforma dioxidul de carbon cu formare de metan, bacteriile acetogene ale g. Clostridium pot transforma dioxidul de carbon in la acid acetic. Aceste bacterii obtin o cantitate mica de energie si pot creste in absenta oxigenului molecular, la un potential de oxidoreducere de -0.2 -0.3v. Tinand cont de mediile ce vin in contant cu O2 au un potential redox de +(0.2 ÷ 0.4) si pH=7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, in mediu se adauga substante cu caracter reducator ca: tioglicolat de Na, cistein-SH, sulfura de Na. substantele reducatoare permit mentinerea unui potential de oxido-reducere scazut si are loc dezvoltarea anerobilor in placi Petri, in contact cu aerul. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi si vase speciale numite anaerostate in care O2 este legat chimic, sau cultura se mentine in atmosfera de gaze inerte (CO2,N2)
Fosforilarea de substrat
Metabolismul oxidativ anaerob poate fi intalnit si la microorganisme facultativ anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a creste aerob utilizand oxigenul din aer (respiratie aeroba) sau anaerob utilizand compusi organici ca acceptori finali ai electronilor produsi prin catabolism.
Microorganismele facultativ anaerobe in conditii aerobe isi adapteaza echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare la produsii finali, utilizand preferential oxigenul cand este disponibil, datorita cantitatii mai mari de energie in cursul respiratiei: 36 moli ATP/mol glucoza asimilata (aerob) fata de 2-3 moli ATP/ mol glucoza fermentata (anaerob).
Putem considera celula microbiana ca o biochimica autonoma care prelucreaza nutrientii avand un avantaj din aceasta prelucrare: obtinerea de energie si de compusi rezultati din prelucrare, iar cei care nu sunt necesari sunt eliminati din fabrica (celula).
Microorganismele, in timpul fazelor ce alcatuiesc ciclul lor biologic se pot afla in: Trofofaza – in care caile amfibolice functioneaza preponderent energetic (respiratie) si plastic (acumulare de biomasa), este faza care corespunde metabolismului primar.
Idiofaza – este stare fiziologica in care caile metabolismului primar sunt comutate la biosinteza produsilor metabolici secundari.
In cursul acestor prelucrari metabolice in functie de stadiul de dezvoltare a celulei rezulta produsi de metabolism care pot fi impartiti in:
– produsi primari de metabolism – care se formeaza in stare activa de crestere exponentiala a celulei (trofofaza)si care sunt produsi esentiali pentru celula. Dintre produsii rezultati prin catabolism au valoare economica: alcoolii, acizii, sau prin anabolism: protide, enzime s.a.
– produsii secundari – apar in faza de declin (idiofaza) si care sunt produsi esentiali celulei: toxine, alcaloizi. Acesti produsi de metabolism se formeaza un mod natural in diferite habitaturi in care traiesc si s-au adaptat microorganismele sau in mod dirijat in conditii industriale pentru obtinerea produselor de metabolism microbian cu valoare economica.
Procesele fermentative ale microorganismelor utilizate in industria alimentara sunt prezentate in tabelul 1.1.
1.3. Fermentatia alcoolica
Fermentatia alcoolica este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reactii de oxido-reducere sub actiunea echipamentului enzimatic al drojdiei in produsi principali (alcool etilic si CO2) iar ca produsi secundari: alcooli superiori, acizi, aldehide s.a.
Agentii tipici ai fermentatiei alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot sa produca prin fermentarea glucidelor mai mult de 8o alcool etilic.
Fermentatia alcooica este un proces intalnit la numeroase organisme, dar care produc prin fermentare cantitati mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile. Astfel mai pot produce alcool etilic bacteriile: Bacillus macerans, Cl. acetonoetilicus, Zymomonas dar ele nu sunt considerate agenti tipici.
PROPRIETATI BIOTEHNOLOGICE ALE DROJDIILOR FERMENTATIVE
Pentru a putea fi folosite in practica drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate si selectionate in functie de unele proprietati care le recomanda pentru utilizare industriala, cum ar fi:
Puterea alcooligena care se refera la concentratia mare de alcool ce se poate acumula cand in mediu exista un exces de zahar. Drojdiile sunt sensibile la cresterea concentratiei in alcool si in timp ce drojdiile cu putere alcooligena slaba (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentratie in alcool de 4-6o drojdiile de vin si spirt (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae-cerevisiae) au o putere alcooligena mare si continua fermentatia alcoolica pana se acumuleaza 16-18o alcool.
Alcoolorezistenta se refera la capacitatea drojdiei de a continua fermentatia la cresterea concentratiei de alcool si de a demara fermentatia in prezenta de 8% alcool.
Sulfitorezistenta este capacitatea drojdiilor de vin de a produce fermentatia alcoolica o proprietate importanta a drojdiilor de vin care in prezenta unor concentratii de 200-500 mg SO2.dm-3 pot influenta negativ activitatea altor drojdii din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scaderii potentialului de oxidoreducere.
se presupune ca rezistenta la SO2 este datorata si capacitatii acestor drojdii de a excreta aldehida acetica ce poate lega SO2 care astfel isi reduce efectul levuristatic.
Capacitatea de floculare si pulverulenta – proprietati datorate structurii peretelui celular si a modificarii de pH si rH din timpul fermentatiei. Drojdiile floculante pot forma asociatii ce se depun mai usor, in timp ce drojdiile pulverulente se mentin mai mult timp in suspensie si produc o fermentatie mai avansata. Pentru drojdiile de sampanie se urmareste ca aceasta sa se depuna usor in gatul sticlei si prin operatia de degorjare sa se separe sedimentul, obtinandu-se o sampanie limpede.
Osmotoleranta se refera la capacitatea drojdiilor de a produce fermentatia in mediu cu concentratie crescuta de zahar. Aceste proprietati sunt recomandate drojdiilor folosite la obtinerea spirtului din melasa cu un randament superior in alcool etilic.
Frigofilia este o adaptare a drojdiilor de a produce fermentatia la temperaturi mai scazute de 10-15oC; astfel sunt evitate fermentatiile secundare iar in vin se acumuleaza mai multe substante de aroma.
Caracterul killer este intalnit la unele drojdii capabile de a sintetiza intracelular o toxina cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. In selectionarea drojdiilor de vin culturile care au caracter k dau randamente superioare deoarece in cursul fermentatiei are loc o autoselectie naturala (Anghel I et.al.,1991).
Factorii care influenteaza dinamica fermentatiei alcoolice
Fermentatia alcoolica in conditii industriale foloseste substraturi naturale bogate in zahar fermentescibil, iar viteza de fermentare si transformare a glucidelor in produsi primari si secundari este dependenta de numerosi factori care pot fi impartiti in doua mari categorii: factori biologici, dependenti de microagentii fermentarii, si factori fizico-chimici, dependenti de compozitia mediului supus fermentarii si conditiile mediului ambiant.
Factori biologici.
Inca din 1885-1887 a fost stabilit de catre Ed.Büchner ca fermentatia alcoolica este cauzata de enzimele elaborate de celula de drojdie, stabilindu-se natura enzimatica a fermentatiei.
Complexul zimazic celular obtinut prin mojararea celulelor de drojdie este format din 15 enzime care catalizeaza in diferite etape, procesele de oxidoreducere ale glucidelor fermentescibile si in final formarea de alcool etilic.
Enzimele cele mai importante sunt dehidrogenazele: glicerat-dehidrogenaza si alcool dehidrogenaza care au drept coenzima NAD+, cu rol de transfer de hidrogen in reactiile de catabolism.
Fermentatia decurge activ cand celulele de drojdie sunt in faza exponentiala sau la inceputul fazei stationare de crestere, in timp ce drojdiile autolizate, ca rezultat al hidrolizei proteinelor intracelulare si inactivarea enzimelor, isi pierd proprietatile fermentative. Viteza de fermentare depinde si de numarul de celule/cm3 mediu; viteza creste cu numarul de celule,prin viteza intelegand continutul de alcool format la 100 cm3 lichid in unitatea de timp. In pracica, din ratiuni economice, prin folosirea culturilor starter in industriile fermentative, concentratia de celule pentru declansarea rapida a fermentatiei este 106-107 cm-3.
Un alt factor il constituie spectrul de fermentare al glucidelor. Din studiul caracterelor fiziologice se cunoaste ca drojdiile produc fermentarea unui numar limitat de glucide ce pot fi transformate in alcool etilic si CO2 in conditii anaerobe, intre specii existand diferente.
Drojdiile fermentative au un spectru limitat de glucide
Astfel toate tulpinile de Saccharomyces cerevisiae pot fermenta D-glucoza, D-manoza si D-fructofuranoza (fara sa poata folosi D-fructopiranoza) si sa le asimileze in conditii aerobe cand acestea reprezinta sursa unica de carbon. In aerobioza, dupa epuizarea glucidelor drojdiile pot asimila alcoolul etilic.
Spre deosebire de membrana plasmica, peretele celular al drojdiei este permeabil pentru glucide. Se estimeaza ca fluxul de transpor al D-glucozei prin membrana plasmatica a lui Saccharomyces cerevisiae in timpul cresterii este de 120-240 n.mol min-1 (mg.su.drojdie)-1.
Permeazele pentru transferul D-glucozei, D-manozei si D-fructozei sunt constitutive si asigura transferul prin difuzie facilitata in timp ce transportul pentru D-galactoza este inductiv. Diglucidele si dintre triglucide – rafinoza, sunt hidrolizate de catre enzimele simple drojdiei in glucide simple.
Zaharoza si rafinoza sunt hidrolizate sub actiunea invertazei situata la nivelul peretelui celular dar exista evidente privind existenta unui transport specific pentru zaharoza. Se cunosc 2 forme de invertaza si anume o invertaza localizata in spatiul periplasmic care este responsabila pentru hidroliza extracelulara a zaharozei si o forma secundara de invertaza, intracelulara.
Invertaza este supusa represiei de catre glucoza incat daca D-glucoza este disponibila in mediu nu poate fi pusa in evidenta activitate invertazica extracelulara.
Maltoza este hidrolizata intracelular dupa ce are loc o absorbtie specifica de catre maltozopermeaza, actioneaza apoi maltaza (α-glucosidaza); ambele enzime sunt inductibile (Zimmerman F.K, Entian KD, 1997).
Datorita importantei pe care o prezinta alcoolul etilic de fermentare in practica industriala, in afara glucidelor fermentescibile se pot folosi substraturi naturale ce contin poliglucide (amidon, celuloza) care sunt hidrolizate in prealabil pe cale chimica sau enzimatica pana la formarea de glucide fermentescibile.
Aceasta zaharificare este obligatorie deoarece drojdiile de fermentare nu produc amilaze/celulaze si nu pot produce hidroliza enzimatica a poliglucidelor.
Un alt factor biologic este corelat cu comportarea drojdiilor fermentative in functie de accesul oxigenului in mediul supus fermentarii. In conditii anaerobe, prin imersare in must, celulele de drojdie produc fermentarea glucidelor obtinand o cantitate mica de energie (2moli ATP/mol glucoza fermentata). De aceea, ele trebuie sa prelucreze o cantitate mai mare de zahar pentru a obtine energie, iar cresterea numarului de celule are loc foarte lent.
Daca mediul de fermentare este puternic aerat, atunci are loc efectul Pasteur, prin care se observa conversia fermentatiei in respiratie deoarece in prezenta oxigenului, oxidarea se face pana la produsi finali (CO2 si H2O), iar cantitatea de energie este mult mai mare, pentru acelasi echivalent energetic consumandu-se o cantitate mai mica de zahar.
1 mol glucoza → 2 ATP (fermentatie)
1 mol glucoza → 36 ATP (respiratie)
Procesul de aerare este folosit la cultivare atunci cand intereseaza obtinerea unei cantitati mai mari de drojdie, de exemplu la obtinerea industriala a drojdiei comprimate sau a drojdiei furajere.
Efectul Pasteur este mai evident la specii de drojdii la care glicoliza este mai putin eficienta, in timp ce pentru drojdiile cu metabolism fermentativ puternic, acest efect este mai putin important, deoarece enzimele ce intervin in respiratie (aeroba) sunt supuse represiei in prezenta glucozei din mediu.(Zimmermann F.,1997).
In practica vinificarii, atunci can fermentatia decurge lent, ca rezultat al prezentei in mediu a unui numar mai mic de celule, se poate stimula cresterea de celule prin aerare. In industrii fermentative (spirt, vin, bere) nu se urmareste obtinerea de biomasa celulara, de aceea conditiile sunt anaerobe, astfel incat o cantitate mai mare de zahar este transformata in alcool etilic, iar cantitatea de drojdie reziduala la sfarsitul fermentarii este in cantitate mai mica.
Sacch. cerevisiae, in conditii strict anaerobe nu creste mai mult de 2-3 generatii. Drojdia necesita cantitati reduse de oxigen pentru sinteza de steroli cu rol de intermediari in biosinteza. In absenta oxigenului, mediul trebuie sa fie suplimentat cu ergosterol si acizi grasi pentru continuarea cresterii celulare.
Fermentatia alcoolica este influentata si de factori chimici si fizici, care actioneaza atat asupra vitezei de fermentare cat si a bilantului masic si a raportului dintre produsii primari si secundari.
Influenta factorilor fizico-chimici asupra fermentatiei alcoolice
Compozitia mediului de fermentare. Diferitele componente ale mediului pot fi metabolizate in mod diferit. De aceea, mai ales la vinuri, in functie de calitatea mustului, care este influentata de soiul si gradul de coacere a strugurilor, apar diferente de aroma.
Concentratia in zahar influenteaza direct proportional viteza de fermentare atunci cand se situeaza in limitele 5-12% (50-120 g zahar. dm-3). Cu cresterea concentratiei de zahar anumite drojdii mai sensibile sufera o inhibare in activitate prin procese de respiratie catabolica sau prin modificari la nivel de membrana datorata plasmolizei. Drojdiile de fermentare au in general osmotoleranta si de aceea produc fermentarea in bune conditii a mustului de struguri cu o concentratie de 170-250 g zahar. dm-3.
In fermentatia alcoolica industriala se folosesc diferite produse bogate in zahar, medii naturale ce contin si alte substante necesare pentru mentinerea activa si nutritia celulelor.
Astfel, daca mustul de struguri este folosit ca lichid fermentescibil la fabricarea vinului, la fabricarea berii se foloseste mustul de malt ce contine maltoza (80% din substanta solubila).
In industria spirtului si la obtinerea drojdiei comprimate se foloseste ca mediu de baza melasa, care are un continut de 45-55% zaharoza necristalizata.
Plamezile amidonoase pentru a putea fi folosite in fermentatie trebuie sa sufere mai intai o hidroliza enzimatica in urma careia se obtine glucoza, maltoza, dextrine cu molecule mici, care sunt apoi transformate in alcool etilic.
Zerul rezultat la fabricarea branzeturilor, cu un continut de 4,7% lactoza, poate fi folosit la obtinerea de alcool etilic folosindu-se drept agenti de fermentare drojdii din genul Kluyveromyces producatoare de lactaza.
Celuloza poate fi folosita drept substrat la obtinerea alcoolului carburant dupa hidroliza chimica si/enzimatica din care rezulta celobioza si cellodextrine ce pot fi fermentate de catre drojdii.
Concentratia in alcool. In mediile fermentative cu microbiota naturala, daca se ajunge la o concentratie alcoolica de 4-6o, se produce o incetinire a fermentarii la drojdii care nu au rezistenta la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuata de drojdii alcoolorezistente,acumulandu-se 18-20o alcool (1grad alcoolic = 1cm3. alcool) absolut/ 100 cm3 mediu fermentat.
La cresterea concentratiei in alcool se poate produce o solubilizare a lipidelor situate la nivelul membranei plasmatice, creste permeabilitatea la ioni si metaboliti si este inhibat transportul (absorbtia) glucidelor. Alcoolul poate actiona ca un denaturant al proteinelor si ca agent de inactivare a enzimelor.
Sensibilitatea drojdiilor la efectul de inhibare dat de alcool creste cu marirea temperaturii.
Drojdiile din genul Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae) prezinta o toleranta la alcool determinata genetic.
PH-ul are un rol important in formarea compusilor de fermentare, in functie de pH cunoscandu-se doua forme ale fermentarii: fermentarea alcoolica propriuzisa,ce se desfasoara la pH 3,5-5 cand produsul principal este alcoolul etilic si dioxidul de carbon, cu produsi secundari in cantitati mici, echilibrate si fermentarea la pH alcalin, cand in afara de alcool etilic si dioxid de carbon se formeaza in cantitate mai mare glicerol (pana la 30% din zaharul fermentat).
Mustul de struguri are un pH acid (≈3,6) de aceea la fabricarea vinurilor drojdiile sunt avantajate si au cele mai bune conditii de dezvoltare si activitate metabolica.
Substantele chimice existente sau adaugate mediului pot influenta procesul fermentativ.
-fosfatii au o influenta pozitiva deoarece participa la formarea acizilor adenilici, contribuie la formarea esterilor fosforici ai glucidelor, forme in care acestea sunt transportate in celula si fermentate.
-Dioxidul de sulf se adauga in cantitati de 200-500 mg.dm-3 pentru a permite activitatea drojdiilor fermentative care, spre deosebire de alte drojdii, sunt sulfitorezistente. In concentratii admise de tehnologie, SO2 influenteaza viteza de fermentare, favorizand activitatea drojdiilor tipice. Daca doza de SO2 introdusa este accidental mai mare, fermentarea alcoolica este deviata de la forma de baza deoarece dioxidul de sulf se combina cu aldehida acetica, ceea ce conduce la formarea in exces a glicerolului, a acidului acetic si a unor cantitati mai mici de alcool etilic.
Temperatura. Enzimele componente ale sistemului zimazic prezinta fiecare un optim de activitate, iar proprietatile sunt determinate genetic de caracterele de specie. Ffermentarea alcoolica poate avea loc intre 0-35oC. In functie de specia de drojdie predominanta sau folosita in cultura pura temperaturile optime sunt la:
28-30oC, pentru drojdia de spirt si de panificatie (Saccharomyces cerevisiae)
6-12oC, pentru drojdia de bere (Saccharomyces carlbergensis)
15-20oC, pentru drojdiile de vin (Saccharomyces cerevisiae var ellipsoideus si Sacch. oviformis), care produc o fermentare mai lenta la aceste temperaturi, dar conduc la obtinerea unui vin de calitate deoarece la temperaturi mai scazute se evita pierderile de substante volatile. (Djikan J.,1984)
Biochimismul formarii produsilor principali si secundari in fermentatia alcoolica propriu-zisa
Conversia prin fermentare in mediu acid a glucidelor, catalizata de enzime din drojdii se desfasoara in cinci etape principale:
Transformarea diferitelor tipuri de glucide in esteri ai glucozei si formarea esterului fructo-furanozo-1,6-difosfat. Este etapa in care se consuma energie prin transformarea ATP-ului in ADP.
Formarea triozelor- aldehida fosfoglicerica si si fosfodioxiacetona.
Transformarea triozelor pana la formarea de acid piruvic. Energia eliberata prin procesul de oxido-reducere este inmagazinata prin fosforilare de substrat.
Decarboxilarea acidului piruvic si formarea de aldehida acetica.
Aldehida acetica se reduce devenind acceptor de hidrogen si se formeaza alcoolul etilic.
Reactia globala a fermentatiei alcoolice in mediu acid:
Formarea produsilor secundari
In fermentatia alcoolica rezulta o diversitate de produse secundare. In vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substante diferite. Majoritatea lor rezulta prin fermentare, iar celelalte sunt dependente de compozitia mediului.
Fig.1.3. Biochimismul fermentatiei alcoolice (Cotea V.,1985)
Glicerolul se acumuleaza in mod normal in cantitati de 3,3 g/100g glucoza fermentata si are un rol benefic asupra calitatii vinului, conferindu-i „catifelaj”-ul. Glicerolul se formeaza prin fosfodioxiacetona in primele etape ale fermentarii, cand aldehida acetica se afla in cantitati mici.
Aldehidele se acumuleaza in mediul de fermentare. Cea mai importanta, aldehida acetica, la concentratii ce depasesc 2,5 mg.dm-3 influenteaza indirect gustul, deoarece prin oxidari duce la formarea de acid acetic.
Acizii provin atat din must cat si din procesul fermentativ. Ei dau aciditate volatila vinului (acid acetic, formic, propionic, butic) precum si o aciditate fixa ( acid lactic, succinic) care se regaseste in aciditatea totala a vinului.
Acid lactic se poate acumula in cantitati de 20 mg.dm-3 provenind din acidul piruvic care accepta H.
Acid acetic se acumuleaza in cantitati de 80-120 mg.dm-3. El poate avea rol in formarea esterilor (acetat de etil), iar la concentratii mai mari determina modificari de gust, ceea ce conduce la deprecierea vinului.
Acidul succinic se formeaza prin bioconversia glucidelor (poate prezenta 0,7% din cantitatea de zahar fermentat), fie din aminoacizi. Din acidul glutamic prin dezaminare hidrolitica se elibereaza amoniacul ce poate fi folosit de drojdii ca sursa de azot si rezulata acidul hidroxiglutaric din care se poate forma acidul formic si aldehida succinica. Prin oxidarea aldehidei rezulta acidul succinic.
Dupa F. Ehrlich acest tip de reactie se aplica la toti acizii α-aminati si explica formarea de aldehide care prin reactii de oxido-reducere de tip Cannizzaro produc alcooli si acizi (Motoc D,1962)
Exista si alte cai care explica acumularea acidului succinic in mediul de fermentatie (Fig. 1.4.)
Fig.1.4. Mecanisme de formare a acidului succinic
Alcoolii superiori rezulta atat din glucide, cat si din aminoacizi, acestia din urma constituind sursa principala, dupa ecuatia.
Dintre alcoolii superiori, care se acumuleaza care se acumuleaza mai ales in fabricarea spirtului, fac parte alcoolii amilic, izoamilic, propanol, butanol, care pot sa contribuie la formarea unor substante de aroma.
La fabricarea vinului alcoolii superiori (≈ 250 mg-3) sunt precursori de aroma deoarece se pot combina cu diferiti acizi rezultand esteri cu aroma caracteristica. De exemplu in vinuri, din fenilalanina se formeaza alcoolul feniletilic care da aroma de trandafir. Tinand cont de diversitatea aminoacizilor, se poate explica varietatea alcoolilor si esterilor formati. Alcoolii superiori ce se obtin la fabricarea spirtului distila la 130oC, obtinandu-se o fractiune de distilare numita ulei de fuzel, folosit in industria vopselurilor.
Diacetilul si acetoina se formeaza cand cantitatea de celule de drojdie este foarte mare. Prezenta in cantitati mici a acestor substante nu influenteaza calitatile senzoriale ale produsului. La concentratii de 0,4mg.dm-3 se sesizeaza gustul de diacetil, iar la concentratii mai mari apar modificari senzoriale nedorite. Gustul este sesizat mai ales in bere unde se formeaza si sub actiunea unor bacterii contaminante.
Mercaptanii apar cand gruparea OH din alcooli este inlocuita cu gruparea SH. Prezenta acestor substante cu gust neplacut este datorata actiunii unor drojdii cu calitati nedorite, asupra compusilor cu sulf din mediile fermentative.
Ca rezultat al formarii produselor secundare, in industria fermentativa se obtin produse diversificate, apreciate prin calitati senzoriale si nutritive.
Bilantul masic al fermentatiei alcoolice
Teoretic, din ecuatia generala a fermentatiei alcoolice dintr-un mol de glucoza, rezulta ca produse principale 2 moli de alcool etilic si 2 moli de CO2 si anume:
Randamentul teoretic (ηt) arata ca din 100g de glucoza se pot forma 51,1g alcool etilic.
ηt = 92/180 . 100 = 51,1
Un bilant apropiat de realitate este dat de Louis Pasteur (1860) care arata ca din 100g de glucoza se obtin prin fermentatie:
In acest bilant nu se tine cont de formarea altor produsi secundari: acizi, alcooli superiori s.a.
In practica vinificatiei se considera ca prin fermentarea unui must cu un continut de 170g glucide fermentescibile .dm-3 rezulta un vin cu ≈10o alcool. Pentru calculul:
– 1 grad alcoolic = 1 cm3 alcool absolut la 100cm3
– densitatea alcoolului absolut = 0,794
In cazul vinurilor albe cu grad alcoolic rezulta din 16,67g zahar fermentat.dm-3 iar in cazul celor rosii din 17,86 g.dm-3 (A.I. Popa, S. Teodorescu, 1990).
Bilantul energetic al fermentatiei alcoolice
Din punct de vedere energetic fermentatia alcoolica nu este avantajoasa pentru celula de drojdie, deoarece in anaerobioza prin fermentarea unui mol de glucoza celula consuma 2 moli de ATP in etapa de formare a esterilor fosforici, apoi inmagazineaza energia eliberata in 4 moli de ATP, astfel incat castigul net este de 2 moli ATP/mol glucoza fermentata. Energia potentiala a glucozei se regaseste in proportie de 92,5% in alcool etilic (alcoolul etilic are o mare putere energetica, de 1363 KJ/mol alcool), 2,5-3% energie inmagazinata in ATP, iar restul de energie se regaseste in produse secundare sau se pierde prin caldura.
Fermentatia in mediu alcalin
Este o fermentatie deviata de la fermentarea propriu-zisa atunci cand pH-ul mediului este alcalin. Acest lucru se obtine prin adaugare de NA2CO3 3% astfel incat din glucoza se formeaza alcool etilic, glicerol, acid acetic si dioxid de carbon.
Explicare formarii glicerolului in cantitati mai mari este datorata reactiilor de oxidoreducere ale aldehidei acetice in mediu alcalin (reactie Canizzaro).
Deoarece aldehida este blocata astfel, dehidrogenaza redusa (NADH+H+) este disponibila si reduce fosfodioxiacetona cu formarea de glicerol.
Cultura de Zygosaccharomyces acidifaciens folosita in primul razboi mondial la obtinerea glicerinei, la randul ei utilizata in producerea de nitroglicerina, poate produce prin fermentarea glucidelor in mediu alcalin, aprox.30g glicerol.dm-3.
Fermentatia sulfitica
Este fermentatia in care aldehida acetica formeaza in prezenta sulfitului de sodiu un compus sulfitic, iar dehidrogenaza in forma redusa favorizeaza formarea de glicerol.
Aceasta fermentatie poate avea loc la pastrarea marcurilor de fructe in prezenta SO2.
In afara de aspectele pozitive ale fermentatiei alcoolice la fabricarea: spirtului, vinului, distilatelor, berii, painii, poate prezenta si aspecte negative atunci cand se produce fermentarea spontana a unor produse bogate in zahar (siropuri, dulceturi, compot, miere). In acest caz fermentarea este data de drojdii osmotolerante care produc prin fermentare alcool etilic, CO2 si o cantitate apreciabila de acid acetic, ceea ce duce la deprecierea lor.
Fermentatii alcoolice neconventionale, produse de bacterii
Exista bacterii care pot produce cantitati apreciabile de alcool: Bacillus macerans, Leuconostoc, Clostridium acetono-etillicus iar Zymomonas mobilis si Zymo-monas anaerobica, produc prin fermentare 10o-16o alcool. Cu aceste bacterii pot fi fermentate derivatele celulozice, pentru obtinerea de alcool carburant.
Zymomonas mobilis formeaza alcoolul etilic pe calea Entner – Doudoroff producand prin fermentarea glucozei, alcool etilic si dioxid de carbon conform schemei:
Cu ajutorul bacteriilor se obtine alcool cu intrebuintari industriale, care nu este folosit in alimentatie deoarece bacteriile produc si substante secundare de aroma, iar randamentul de conversie este mai mic decat al drojdiilor.
1.4. Fermentatia lactica
Fermentatia lactica este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate sub actiunea echipamentului enzimatic al microorganismelor in acid lactic ca produs principal si ca produse secundare: diacetil, acetoina, acid acetic, alcool etilic si CO2.
Calea metabolica de producere a acidului lactic este frecvent intalnita in lumea microbiana, in schimb randamente superioare de conversie a glucidelor in acid lactic sunt intalnite la bacterii si mucegaiuri. Dintre acestea, bacteriile lactice, considerate agenti tipici ai fermentatiei sunt folosite industrial in biotehnologii alimentare, la industrializarea laptelui si a carnii, in panificatie, la conservarea produselor vegetale si la obtinerea acidului lactic.
Mucegaiuri selectionate ale genurilor: Aspergillus, Penicilium si Mucor pot fi cultivate submers cu aerare dirijata, pentru obtinerea industriala a acidului lactic.In conditii naturale acidului lactic se poate forma si in tesutul muscular prin procesul de glicoliza, prin secvente biochimice catalizate de enzime similare cu cele ale celulei microbiene.
Caractere morfo-fiziologice generale ale bacteriilor lactice
Bacteriile lactice sunt foarte raspandite in natura in diferite biotopuri: aparatul foliar al plantelor, in microbiota intestinala (in primii ani de viata sau cand in alimentatie predomina laptele), in cavitatea bucala, in microbiota pielii. Dintre sursele alimentare permanent asociate cu bacteriile lactice amintim laptele (in care bacteriile lactice prezente pe canalele galactofore sunt antrenate la mulgere) si legumele (varza, castraveti s.a)
Caractere morfologice
Bacteriile lactice reprezinta eterogenitate morfologica: principalele forme sunt derivate de la forma coccus, si se pot prezenta sub forma de streptococi (g. Lactococcus si g. Streptococcus), de diplococi (g. Leuconostoc), de tetrade (g. Pediococus); numeroase alte bacterii lactice se prezinta sub forma cilindrica, de bastonase cu dimensiuni variabile, izolate sau in lanturi lungi, incluse in genul Lactobacillus (Lactobacterium).
Caractere fiziologice
Bacteriile lactice sunt pretentioase din punct de vedere nutritiv si inmultirea lor are loc in medii cu compozitie chimica complexa. Ca surse de carbon si energie, bacteriile lactice pot sa produca asimilarea sau fermentarea pentozelor: riboza, xiloza, arabinoza, a hexozelor: glucoza, galactoza, diglucidelor: lactoza, maltoza, zaharoza. Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat in acid lactic, iar acidul citric in acetoina si diacetil. Acidul lactic nu poate fi folosit de catre bacteriile producatoare si acumularea sa prin fermentare conduce inhibarea inmultirii si incetinirea vitezei de fermentatie. Ca surse de azot, bacteriile lactice prefera aminoacizi, peptide si amide, fara sa poata folosi sarurile amoniacale. O exceptie este specia Lactobacillus casei care poate produce o hidroliza enzimatica a cazeinei.
Bacteriile lactice in general, din care cele termofile in special, neesita prezenta in mediu a unor factori de crestere, vitaminele: B2, B6, biotina, acidul para-aminobenzoic, acidul folic, acidul pantotenic.
Bacteriile lactice sunt acidotolerante: valorile minime de pH la cere are loc cresterea sunt de 4,3-4,8 pentru lactococi si 3,8-4,4 pentru lactobacili cu valori optime in domeniule de pH=4-6.
In raport cu oxigenul din aer, bacteriile lactice sunt anaerobe sau facultativ anaerobe. Prin crestere in medii lichide (bere, vin, sucuri) dau o tulburare persistenta si acrire, iar prin dezvoltarea in lapte produc coagularea acida a cazeinei, cand pH-ul se redue la 4,6 ca rezultat al formarii de acid lactic.
Bacteriile lactice sunt adaptate sa creasca intr-un domeniu larg de temperaturi (0-55o) cu valori optime in domeniu mezofil (20-25oC – streptobacterii, 30-35oC – lactococii Gram pozitivi sau 35-45oC – lactobacterii termofile). Sunt bacterii nesporulate si pot fi inactivate pe cale termica la temperaturi mai mari de 65oC (in 30 de minute) sau la 72-74oC in 15-20 de secunde (regim de pasteurizare a laptelui).
Caractere taxonomice si clasificarea bacteriilor lactice
Dupa punerea in evidenta a bacteriilor lactice ca agenti de acrire a berii de catre Louis Pasteur in 1875, multi cercetatori au studiat aceste bacterii atat de raspandite in natura.
O clasificare de referinta apartine lui Orla Jensen (1919), care imparte bacteriile lactice in doua mari grupe:
Bacterii lactice adevarate, care produc numai acid lactic cu un randament de 90-100% din zaharul consumat, bacterii Gram – pozitive, facultativ anaerobe.
Dintre genurile mai importante g. Thermobacterium si g.Streptobacterium in care erau inclusi lactobacili, g.Streptococcus (streptococi lactici) precum si genuri ce: β-coccus (actual g. Leuconostoc) si g. Tetracoccus (g. Pediococcus).
Pseudofermenti lactici (bacterii lactice atipice) care produc prin fermentatie cantitati mici de acid lactic si in cantitati superioare, gaze: CO2, H2, acid acetic s.a., bacterii Gram negative, aerobe. In aceasta grupa erau incluse bacteriile coliforme cu g. Escherichiae si g. Aerogenes (actual g. Enterobacter).
O noua clasificare, a lui Bergey, separa bacteriile lactice adevarate in familia Lactobacteriaceae in timp ce bacteriile coliforme se regasesc in familia Enterobacteriaceae.
Cea mai recenta clasificare apartine lui Kandler si Weiss (1986) care in afara de proprietatile fiziologice si tinctoriale ale bacteriilor lactice are la baza cunoasterea procentuala a continutului in baze azotate: guanina si citozina din structura acizilor nucleici, criteriu taxonomic stabil pe baza caruia s-au putut stabili similitudini sau diferentieri intre speciile cunoscute.
Conform acestei clasificari bacteriile lactice sunt incluse in familia LACTOBACILLACEAE cu urmatoarele genuri:
1. Genul Streptococus
1.1.Grupul streptococilor lactici inclusi in genul Lactococus cu speciile: Lactococcus lactis; Lactococcus lactis biovar diacetilactis; Lactococcus lactis biovar acetoinicus si Lactoscoccus lactis ssp cremoris (syn. Str. cremoris-streptococul smantanii). (Al. Zareky N.,1991).
1.2.Grupul viridans, bacterii ce apartin genului Streptococcus cu specii importante: Streptococcus salivarius subsp.thermophillus (SST) (syn. Streptococcus thermophillus) cultura folosita la fabricarea iaurtului si Str. bovis.
1.3 Grupul streptococilor fecali, denumiti si enterococi, cu specia reprezentativa Str. faecalis.
1.4 Grupul streptococior patogeni, cu speciile Str. pyogenes (agentul scarlatinei) si Str.agalactiae (agentul mastitei, transmisibil prin lapte colectat de la vaci bolnave).
2. Genul Lactobacillus (syn. Lactobacterium), include aproximativ 50 de specii clasificate in functie de temperatura optima de activitate si modul de fermentare a glucidelor in homofermentativi – lactobacili care produc numai acid lactic si cantitati minore de substante de aroma si in heterofermentativi – lactobacili producatori de acid lactic, acid acetic, diacetil, CO2.
2.1. Lactobacili homofermentativi
a) Termofili (T0=40-50oC)
Lactobacillus delbruecki, subspecia delbruecki
Lactobacillus delbruecki, subspecia lactis
Lactobacillus delbruecki, subspecia bulgaricus (syn. Lactobacterium bulgaricum,
LDB – cultura pentru prepararea iaurtului).
b)Mezofili (T0=30-35oC)
Lactobacillus acidophillus
Lactobacillus helveticus
2.2. Lactobacili facultativ heterofermentativi mezofili
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei
Lactobacillus sake
2.3. Lactobacili heterofermentativi, mezofili
Lactobacillus brevis
Lactobacillus viridiscens, Lb. fermenti
Lb. iulinus (syn. Sporolactobacillus inulinus, fermenteaza inulina)
Lb. bifidum (syn. g. Bifidobacterium bifidus)
3.Genul Leuconostoc – include bacterii sub forma de coci, diplococi, heterofermentativi – produc prin fermentatie acid lactic, alcool etilic, CO2, iar prin biosinteza, poliglucidele de tip dextran; sunt mezofile. Specia cu importanta practica: Leoconostoc mesenteroides sbsp cremoris – bacterii care pot folosi ca sursa de carbon citratii pentru a forma diacetil.
Leu. mesenteroides si Leu. mesenteroides ssp. dextranicum – sunt producatoare de dextran prin conversia zaharozei si polimerizarea dextrozei.
4. Genul Pediococcus – include bacterii lactice homofermentative, mezofile, cu temperatura optima la 30oC, cu specia reprezentativa: pediococcus acidi lactici, (Pediococcus cerevisiae).
Cai de formare a produsilor principali si secundari in fermentatia lactica
In functie de echipamentul enzimatic al bacteriilor lactice si surse de carbon fermentescibile difera biochimismul formarii produsilor de fermentatie.
1. Bacteriile lactice homofermentative
Produc fermentarea anaeroba a hexozelor pe calea Embden – Mayerhof – Parnas (EMP) pana la formarea acidului piruvic, apoi fiind lipsite de enzima piruvat decarboxilaza, acidul piruvic devine acceptor de hidrogen.
In fermentatia homolactica, forma predominanta a acidului lactic este dependenta de stereospecificitatea lactatdehidrogenazei (lactococii formeaza L(+) – lactat si lactobacilii D(-) lactat), dar si de prezenta lactat racemazei, care atunci cand este activa in celula microbiana, rezulta prin fermentatie, amestecul racemic (D, L – lactat):
Ecuatia globala a fermentatiei homolactice:
Pentru a fi fermentate, glucoza, galactoza si lactoza pot fi transportate ca atare in celula printr-un sistem activ de permeaze prezent la Streptococcus salivarius subspecia thermophillus (SST) si lactobacilii termofili, sau prin transport activ catalizat de sistemul fosfotransferaza – fosfoenolpiruvat (PT-PEP) prezent la bacterii ale genului Lactococcus si Lacobacillus sp., cu formarea esterilor fosforici.
Lactoza sau lactozo – P in celula bacteriana sub actiunea β-galactozidazei (lactazei) este transformata in glucidele componente.
In timp ce glucoza este metabolizata direct pe calea EMP, galactoza este transformata pe calea D-tagatozei 6P (Fig.1.5.) sau calea Leloir (Fig.8.6).
Fig.1.5. Calea D-tagatozei 6P
Fig.1.6. Calea Leloir de metabolizare a galactozei
Calea glicolitica (Embden Mayerhof Parnas) de fermentatie a glucozei si a produsilor intermediari rezultati din galactoza/lactoza, se prezinta simplificat in fig 1.7.:
Fig.1.7. Fermentatia lactica produsa de bacterii homofermentative
In fermentatia homolactica se pot forma in cantitati mici substante de aroma, diacetil si acetoina, fie prin metabolizarea glucidelor (fig.1.8.) (g. Lactococcus), fie a citratilor (fig.1.9.), care asigura o sursa suplimentara de acid piruvic.
Fig1.8. Formarea diacetilului din glucide
Lactococii aromatizanti (L. lactis-biovar diacetylactis, L. lactis ssp cremoris) produc in lapte cantitati de 0.1-1.3 mg% diacetil care pot fi marite prin adaos de citrat, controlul aciditatii si al gradului de aerare.
Fig.1.9. Formarea diacetilului din citrati
Lactobacillus delbruecki subspecia bulgaricus poate forma aldehida acetica din surse similare cu rol in formarea aromei specifice a iaurtului, optim, atunci cand raportul intre aldehida acetica si diacetil este de 2,8.
2. Bacteriile lactice heterofermentative produc fermentatia anaeroba a glucidelor (pentoze, hexoze) pe calea pentozo-fosfatului (6P-gluconatului)
In functie de specie difera si natura produselor de fermentatie. Astfel Lactobacillus brevis produce prin fermentatie heterolactica: acid lactic, acid acetic si CO2 in timp ce Leuconostoc mesenteroides – acid lactic, etanol si CO2 (fig1.10.).
Fermentatia heterolactica se poate produce si pe calea fructozo-6P, fara formare de CO2 sub actiunea lui Lactobacillus bifidus, dupa ecuatia generala:
Bifidobacteriile care reprezinta 95% din microbiota intestinala a sugarilor, pot fi folosite pentru obtinerea unor produse lactate cu efect terapeutic.
Aspecte practice ale fermentatiei lactice
Fermentatia lactica dirijata este folosita in industrializarea laptelui cand se folosesc culturi pure selectionate de bacterii lactice la obtinerea produselor lactate acide (lapte acru, sana, chefir, lapte acidofil, iaurt, smantana fermentata), a untului si la fabricarea branzeturilor.
Pentru conservarea prin murare a produselor vegetale sunt create conditii pentru activitatea fermentativa a bacteriilor lactice din microbiota epifita a plantelor, cu formarea de acid lactic s.a., la murarea verzei, tomatelor, castravetilor, maslinelor si insilozarea furajezelor verzi. Fermentatia lactica intervine spontan la fermentarea boabelor de cacao si cafea cu rol pozitiv in obtinerea unor produse de calitate. In industria panificatiei activitatea fermentativa a bacteriilor lactice din microbiota fainii sau a
Fig.1.10. Biochimismul fermentatiei heterolactice
culturilor selectionate contribuie de cea a drojdiei de panificatie la formarea aromei si la cresterea in volum a paninii.
Activitatea excesiva a bacteriilor lactice, poate conduce la deprecierea calitatii si la alterarea unor produse (acrirea berii, borsirea vinului) sau pierderi de zaharoza la difuzie, in industria zaharului.
1.5. Fermentatia propionica
Fermentatia propionica este un proces anaerob prin care substratul fermentescibil, acidul lactic, sub actiunea complexului de enzime ale bacteriilor propionice – agentii tipici – este transformat in: acid propionic, acid acetic, CO2 si energie.
In afara bacteriilor propionice (g. propionibacterium), formarea prin catabolism a acidului propionic este intalnit la bacterii anaerobe ale g. Clostridium (Cl. propionicum) si g. Veillonella.
Bacteriile propionice descoperite in 1906 de E.V. Freudenreich si O. Jensen sunt raspandite in natura in: tractul digestiv al animalelor, in lapte si branzeturi, din care pot fi izolate.
Caractere morfofiziologice ale bacteriilor propionice
Bacteriile propionice se prezinta sub forma de bastonase subtiri si scurte, cu capetele rotunjite si dimensiuni (2-4)x(0,5)μm. In conditii nefavorabile se produce o aplatizatie a terminatiilor celulei avand o forma similara cu cea a corinebacteriilor.
Sunt bacterii imobile, Gram pozitive, anaerobe. Isi pot obtine energia necesara proceselor vitale pe cale fermentativa, anaerob, dar pot fi microaerotolerante deoarece au in catena respiratorie, catalaza si citocromi. In aerobioza cresc greu si prezinta forme alungite, ramificate V, Y sau chinezisme. Pe mediu de bulion carne agar formeaza colonii lenticulare de culoare alba, crem, galben, rosu.
Ca sursa de carbon si energie bacteriile propionice prefera lactatii cu acid lactic (L+), citratii, malatul, glicerolul, glucide: lactoza, maltoza, glucoza, galactoza. Ca surse de azot pot folosii: peptone, peptide, aminoacizi, (esentiali pentru crestere). Necesita prezenta unor factori de crestere, dintre care biotina si acidul pantotenic sunt necesari pentru producerea vitaminei B12.
Din punct de vedere al nutritiei minerale necesita in primul rand magneziu si in cantitati mici: Na, P, K, Mn, Cl, Ca, S, Fe. Prezenta clorurii de sodiu in concentratii mai mari de 3% incetineste viteza de crestere a bacteriilor propionice, cresterea fiind posibila pana la max. 6,5% NaCl.
Sunt bacterii mezofile, cu temperatura optima la 30oC si temperaturi minime 2,8-7,2oC. Prin pasteurizarea laptelui, bacteriile propionice prezente in mod natural in lapte, sunt inactivate.
Se dezvolta optim in medii cu pH 6,5-7, cresterea fiind oprita la pH=5.
Clasificarea bacteriilor propionice
Bacteriile propionice – agenti tipici ai fermentatiei propionice, sunt cuprinse in genul Propionibacterium, familia Lactobaccilaceae, cu urmatoarele specii (tabelul 1.2.)
Tabel 1.2.
Bacterii propionice
Dupa alti autori bacteriile propionice fac parte din familia Propionibacteriaceae, ordinul Actinomycetales.
Biochimismul fermentatiei propionice
In fermentatia propionica, substratul fermentescibil (acidul lactic) este metabolizat anaerob, conform reactiei generale:
Aspecte practice ale fermentatiei propionice
Fermentatia propionica dirijata este folosita la fabricarea branzeturilor (Schweitzer, Ementhal), cu rol pozitiv in formarea ochiurilor, (alveole rezultate prin difuzia lenta a CO2, rezultat din fermentatie sau prin decarboxilarea aminoacizilor), in formarea gustului specific si cresterea valorii alimentare, ca urmare a formarii de catre bacteriile propionice a vitaminei B12.
In industria panificatiei, fermentatia propionica produsa de bacterii propionice adaptate la mediul aluat, conduce la formarea suplimentara a CO2 cu rol in cresterea volumului si a acidului propionic cu efect fungistatic ce previne mucegairea painii la pastrare.
In conditii naturale bacteriile strict anaerobe producatoare de acid propionic au un rol ecologic in circuitul natural al carbonului si in formarea rezervelor de biogaz (CH4+CO2).
Formarea acidului propionic are loc pe calea metil-malonil-coenzimei A transcarboxilazei (fig.1.11.).
Fig.1.11. Biochimismul fermentatiei propionice
In urma fermentatiei propionice raportul propionat/acetat variaza intre 1:1 la 1:5, iar cel al CO2/acetat intre 0,9-6,1 in functie de specie si conditiile de mediu (fig.1.12). (Gottschalk G.,1982)
Fig.1.12. Formarea produsilor secundari in fermentatia propionica
1.6.Fermentatia butirica
Fermentatia butirica reprezinta un proces anaerob prin care diversele surse de carbon sunt metabolizate sub actiunea bacteriilor butirice in produsi principali ai fermentatiei: acid butiric si gaze: CO2; H2. In functie de specii si conditii de fermentare se mai pot forma pe cai deviate de la fermentatia butirica propriuzisa solventii: butanol, propanol, etanol, acetona.
Caractere morfofiziologice si taxonomice ale bacteriilor butirice
Bacteriile butirice sunt raspandite in sol prin materii de dejectie si rezista mult timp in stare sporulata. Au forma de bastonase drepte, singulare, mobile si capacitatea de a sporula formand un endospor cu dimensiunea mai mare decat a celulei vegetative, ceea ce duce la deformarea celulei.
Sunt bacterii Gram pozitive si cresc numai in conditii anaerobe fiind lipsite de catalaza si citocromi. Unele specii ale genului pot fi aerotolerante (ex. Cl. acetobutylicum) (tab.1.3.).
Tabel 1.3.
Caractere fiziologice ale bacteriilor din g. Clostridium
Pentru crestere necesita temperaturi in domeniu mezofil sau termofil. In timp ce formele vegetative sunt inactivate la temperaturi de pasteurizare, endosporii sunt termorezistenti si pentru distrugere sunt necesare regimuri de sterilizare (121oC/4-10 minute, in mediu cu vapori de apa). In raport cu pH-ul, clostridiile necesita un pH apropiat de neutru si cresterea este oprita la valori de pH=4,0-4,5.
Din punct de vedere fiziologic speciile genului Clostridium, familia Bacillaceae, se diferentiaza prin diversitatea substraturilor folosite pe cale fermentativa si a produsilor de catabolism, in urmatoarele grupe.
Unele specii ale genului sunt patogene-toxicogene ca de exemplu: Clostridium botulinum, Clostridium perfringens si Clostridium tetanomorphum.
Clostridium botulinum produce 7 neurotoxine imunologic diferentiate, cu actiune paralizanta. Tulpini ale speciei pot fi individualizate in 4 grupe de baza caracterelor lor biochimice (proteolitice, lipolitice, glucidolitice) sensibilitatea la oxigen si la bacteriofagi. Ingestia alimentelor ce contin toxine preformate produce intoxicatii tipice. Daca are loc ingerarea atat a toxinei preformate, a bacteriilor inclusiv a endosporilor, aceste inving bariera gastrica, se localizeaza in intestin unde produc toxinele lor si ca efect se produce intoxicarea botulinica. (Gottschalk G., 1982)
Biochimismul fermentatiei butirice
are loc dupa ecuatia generala:
Etapele procesului sunt prezentate in figura 1.13.
Fig.1.13. Biochimismul fermentatiei butirice
Reactiile secventiale sunt catalizate de urmatoarele enzime:
1 – Sistemul fosfotransferazic EMP
2 – Piruvat-ferodoxin-oxidoreductaza
3 – Hidrogenaza
4 – Acetil CoA transferaza (tiolaza)
5 – L(+) b-hidroxibutiril CoA-dehidrogenaza
6 – L3 hidroxiacil CoA-hidrolaza (crotonaza)
7 – Butiril – CoA – dehidrogenaza
8 – CoA – transferaza
9 – Fosfotransacetilaza
10 – Acetokinaza
Aspecte practice ale fermentatiei butirice
Fermentatia butirica se poate folosi industrial la fabricarea acidului butiric. In acest scop se folosesc plamezi amidonoase zaharificate cu enzime din malt, se face inocularea cu Clostridium butyricum si fermentarea are loc anaerob, la 35-40oC timp de 8-10 zile, in prezenta de carbonat de calciu. Pentru obtinerea acidului butiric, in plamanda fermentata se adauga sulfat de sodiu. Butiratul de sodiu se separa de sulfatul de calciu prin filtrare si dupa concentrare, in prezenta de acid sulfuric se elibereaza acidul butiric.
Acidul butiric sub forma esterificata este folosit la fabricarea unor esente, deoarece butiratul de metil are aroma de mar, iar butiratul de etil, aroma de para sau ananas, esente folosite la obtinerea produselor zaharoase.
Fermentatia butirica, atunci cand are loc la fabricarea sau conservarea produselor alimentare, influenteaza negativ calitatea acestora. Astfel, la fabricarea branzeturilor, cand laptele este contaminat cu bacterii butirice, rezistente la pasteurizare, in timpul maturarii odata cu formarea lactatului de calciu si cresterea pH-ului are loc germinarea sporilor si in urma activitatii lor se produce defectul de „balonare tarzie” a branzeturilor caracterizat prin deformare, rupturi in pasta si miros dezagreabil de acid butiric.
Fermentatia butirica poate fi ocazional detectata la fabricarea spirtului din materii amidonoase, cand acidul butiric rezultat are un efect inhibitor asupra drojdiilor, agenti ai fermentatiei alcoolice.
La fabricarea bauturilor alcoolice, daca la obtinerea pe cale fermentativa a alcoolului s-a format si acid butiric, acesta ajunge in distilat caruia ii imprima un gust neplacut.
Daca fermentatia butirica spontana are loc in spatii inchise, gazele generate prin fermentatie pot deveni explozive.
Bacterii ale genului Clostridium pot fi agenti de alterare a conservelor, alterare caracterizata prin bombaj si pierderea valorii alimentare.
Bacterii ale g. Clostridium – producatoare de solventi
Bacteriile genului Clostridium pot sa produca fermentatii derivate de la fermentatia butirica, cu acumularea in mediu a unor solventi: acetona, alcool etilic, butanol, propanol.
Clostridium acetobutylicum produce solventi dupa urmatoarea ecuatie generala:
In fermentapile derivate produsii finali rezulta din catabolitii intermcdiari formafi in fermentatia butirica, astfel:
Formarea butanolului
Formarea acetonei
Formarea propanolului (Clostridium butylicum)
Formarea alcoolului etilic (Clostridium acetoethylicum)
Fermentatiile derivate au aplicatii practice in valorificarea unor cereale de calitate inferioara, tarate de ovaz s.a. De exemplu din 1000 kg porumb se pot obtine 163 kg butanol, 70 kg acetona, 407 kg CO2, 11 kg H2. Din 1000 kg tarate de ovaz se pot obtine 72 kg alcool etilic si 39 kg acetona, 14 kg acizi volatili. (Motoc D.,1960)
Solventii sunt utilizati la fabricarea lacurilor (butanol), in industria matasii artificiale (acetona) pentru sinteza alcoolului metilic (CO2, H2) s.a.
1.7. Procese metabolice aerobe (fermentații oxidative)
Spre deosebire de fermentațiile propriu-zise anaerobe, fermentațiile: acetică, gluconică, citrică ș.a. sunt procese oxidative simple, care se desfășoară în condiții aero¬be și se diferențiază de metabolismul oxidativ (respirație), prin aceea că oxidarea este limitată, rezultând în condiții industriale acizi organici cu mare valoare economică.
Fermentația acetică
Fermentația acetică este un proces metabolic aerob prin care substratul (alcoolul etilic) este oxidat în prezența oxigenului din aer, sub acțiunea echipamentului enzimatic al bacteriilor acetice, în acid acetic ca produs principal al fermentației.
Istoric și caractere taxonomice ale bacteriilor acetice
Pentru prima dată sunt izolate în 1837 de către F.T. Kiitzing din oțet. Primele studii sistematice ale acestor bacterii sunt făcute de L. Pasteur (1868) care arată că acestea sunt responsabile pentru transformarea alcoolului în acid acetic. Pe parcursul anilor, acestea au fost incluse în diferite genuri cu denumirea de: Mycoderma (Persoon 1822), Acetobacterium (Ludwig 1898), Acetomonas (Orla-Jensen 1909). Denumirea Acetobacter este propusă de Beijerink în 1909, în 1935 Asai propune diferențierea bacteriilor acetice în două genuri: Acetobacter și Gluconobacter (în care erau incluse bacterii care produc acid gluconic). In 1954, Leifson în funcție de mobilitate, separă bacteriile genului Acetobacter în două genuri, respectiv Acetomonas (gen care prezintă caractere comune cu g. Gluconobacter) și Acetobacter.
In clasificarea lui Bergey, bacteriile acetice sunt incluse în familia Pseudomonadaceae (g. Acetobacter și g. Gluconobacter).
In prezent, prin studii genetice se consideră că ambele genuri trebuie regrupate în aceeași familie: Acetobacteriacee.
Caractere morfologice și fiziologice ale bacteriilor acetice
Bacteriile acetice sunt bacterii strict aerobe sub formă de bastonașe, Gram-nega-tive, grupate în perechi sau lanțuri, cu dimensiuni variabile (0,5-0,8) (0,9-4,2)/zm. Pot fi imobile sau mobile, cu cili polari sau peritrichi. In mediu acid, în timp, pot apare forme de involuție, ramificate, care își pierd capacitatea de reproducere.
In medii lichide (staționar) se dezvoltă sub forma unui voal fragil care cu creșterea în dimensiuni ascensionează pe pereții vasului (A. ascendens, A. aceti). Alte specii:
A.xylinum, A. xilinoides, formează un strat gelatinos de natură fi.glucanică (coloidal și fibros) în vin oțetit sau în oțet.
Bacteriile acetice sunt mezofile (temperatura optimă 30°C) și produc fermentația acetică într-un domeniu larg de temperaturi 0-35°C. Au o termorezistență scăzută în mediu lichid cu pH acid, inactivarea lor are loc la 60°C/min., în timp ce bacteriile reținute pe suporturi solide (doage de lemn) sunt inactivate la temperaturi mai ridicate (100°C).
Bacteriile acetice sunt tolerante la acid și concentrații de până la 2° acetice activează creșterea celulară. Rezistența la acid acetic se poate explica prin aceea că membrana acestor bacterii are un conținut ridicat în acizi grași saturați, motiv pentru care este relativ impermeabilă la acidul acetic care se găsește sub formă nedisociată în mediile fermentate industrial.
Valoarea optimă de pH pentru creștere este 5,5 și pH-ul limită 2,5.
Au un echipament enzimatic complex în care sunt prezente dehidrogenaze foarte active, localizate în sisteme membranare cuplate cu lanțul citocromic, enzime ale ciclului Krebs, ș.a. care le permite oxidarea a aproximativ 80 de compuși (alcooli, glucide, acizi organici).
Dintre sursele de carbon utilizate preferențial, alcoolul etilic este oxidat la acid acetic, iar glucoza la acid gluconic sau acid 5-cetogluconic. Bacteriile din g. Acetobacter pot să oxideze și acetații la C02 și H20 când alcoolul etilic a fost consumat din mediu, deoarece alcoolul etilic inhibă activitatea enzimelor de oxidare a acetatului. Important este că acidul acetic inhibă propria sa oxidare la concentrații mai mari de 8° acetice la pH=3.
Ca surse de azot pot să folosească sărurile de amoniu, aminoacizii și peptidele. De aceea ele se pot dezvolta în medii minerale numai dacă se adaugă extract de drojdie. Bacteriile acetice sunt auxotrofe față de vitaminele: acid para-aminobenzoic, niacina, tiamina și acidul pantotenie.
Bacteriile sunt răspândite în natură pe produse vegetale (fructe, frunze, flori) și transportul lor este favorizat de insecte (musculița de oțet: Drosophilla) și nematode (Aqvilula aceti).
W. Hennerberg propune o clasificare tehnologică a bacteriilor acetice în funcție de cantitatea de acid acetic produsă, concentrația de alcool din mediu și biotop, în patru grupe:
1. Bacterii acetice din plămadă: Gluconobacter suboxidans și Acetobacter industrium.
2. Bacterii acetice din bere: A. aceti – suportă 11% alcool și poate produce 6,6% acid acetic. A pasteurianum suportă 9,5% alcool și produce 6,2% acid acetic. Alte specii: A. kutzingianum, A. rancens.
3. Bacterii acetice din vin; A. orleans – poate produce 9,3° acid acetic; A. ascendens, A. xilinum suportă 7% alcool și produce 4,5° acid acetic și alțe produse secundari.
4. Bacterii acetice de fermentație rapidă, izolate din acetatoare, au o mare ca¬pacitate de acidifiere, cu speciile A. schiitzenbachii (ll-140acetice), A. ncctigenum, A. curvum.
Identificarea speciilor apartinand genului Acetobacter este dificila. In continuare se prezinta o schema simplificata in functie de produsele rezultate prin oxidarea partiala sau finala a alcoolului etilic prin care se pot identifica unele specii folosite industrial.
Tabel 1.4
Cheie de identificare pentru specii ale genului Acetobacter
Biochimismul fermentației acetice
Fermentația acetică se desfășoară după reacția globală:
CH3-CH2-OH+02 -» CH3-COOH+H20
Din punct de vedere energetic, prin oxidarea alcoolului etilic rezultă 455 kj/ mol (6 moli ATP)
Alcoolul etilic este oxidat în aldehidă acetică în prezența alcool-dehidrogenazei (1). Are loc legarea chimică a unui mol de apă (2) și se formează acetaldehida-hidratată care în prezența aldehid dehidrogenazei (3) cedează 2H+care este transferat de către enzime ale catenei respiratorii celulare (4) pe oxigenul molecular și se acumulează acid acetic – produs principal al fermentației (fig. $.14).
Importanța practică a fermentației acetice
Deoarece obținerea vinului se cunoaște de peste 10000 de ani, se presupune că și obținerea oțetului are aceeași vechime. Obținerea industrială este descrisă din 1670 și în prezent producția mondială anuală depășește 106 t/acid acetic pur, obținut prin fermentarea diferitelor materii prime: soluții alcoolice, vin, cidru, malț, bere, orez. In cazul materiilor amidonoase, se face în prima etapă zaharificarea, apoi fermentația alcoolică cu drojdii și în final are loc acidifierea cu bacterii acetice selecționate. Consumul pe cap de locuitor și an poate varia între 0,2-38 1 (A.H. Rose, 1978).
Fermentația acetică spontană, întâlnită la fermentarea boabelor de cacao are un rol pozitiv în formarea compușilor de aromă și obținerea unor boabe de calitate superioara.
Fig.1.14. Biochimismul fermentatiei acetice
Bacteriile acetice A. xylinum pot fi folosite pentru obținerea de β glucani folosiți la fabricarea de membrane filtrante pe bază de acetat de celuloză.
Gluconobacter suboxidans poate fi folosit pentru oxidarea manitolului în fractoză și a glicerolului în dehidroxi-acetonă folosită în cosmetică.
Importanță practică o are și oxidarea sorbitolului și formarea de L-sorboză, ma¬teria primă în sinteza acidului L-ascorbic (vitamina C).
Fermentația acetică nedorită a vinului, berii, păstrate cu "gol de aer" conduce la deprecierea calității lor. In cazul vinurilor, procesul este considerat o boală, deoarece acrirea are loc în întregul volum, deși bacteriile acetice aerobe se dezvoltă la suprafață. Acidul acetic format sub voal are o densitate mai mare decât a alcoolului încât se produce o circulație a compușilor reactanți care conduce la acrirea totală a produsului.
Fermantatia gluconica
Fermentația gluconică este un proces oxidativ simplu prin care glucoza, în prezența oxigenului din aer și a sistemului enzimatic al microorganismelor selecționate este transformata in acid gluconic ca produs principal.
Agenții tipici ai fermentației gluconice sunt bacteriile din g. Gluconobacter (Acetomonas), g. Moraxella și mucegaiuri din genulAspergillus: A. niger, A. phoenicis, A. wenti și ale genului Pmicilium: P. chrysogenum, P. luteum.
Biochimismul oxidarii biologice a glucozei (Fig. 1.15.)
Fig.1.15. Biochimismul fermentatiei gluconice
Importanta practica a fermentatiei gluconice
Acidul gluconic se obține pe cale fermentativă cu culturi fungice folosind ca substrat melasa diluată (10-20% zaharoză), repartizată în tăvi cu suprafață mare. După inoculare cu spori ai mucegaiului selecționat acesta se dezvoltă la suprafață formând o dermă groasă ce produce lent oxidarea glucozei rezultată prin inversia zaharozei. Procedeul este lent și în ultimii ani a fost înlocuit cu metode submerse cu aerare, în bioreactoare în care procesul este accelerat și randamentul de conversie al glucozei la acid gluconic este de 80-90% în timp de 18 ore la 25-30°C și pH=3. Prin adăugare de carbonat de calciu se formează gluconatul de calciu, din care prin procedee chimice se purifică acidul gluconic.
Biomasa rezultată în perioada fermentării poate fi valorificată pentru recuperarea glucozoxidazei intracelulare. Dintre multiplele aplicații ale acidului gluconic, mai importante sunt următoarele:
– folosirea gluconaților de Ca și Fe, în terapeutică.
– la obținerea prafului de copt
– Gluconolactona, produs intermediar al fermentației este folosit în industria preparatelor de carne, deoarece le conferă un gust acrișor, împiedică activitatea bacte¬riilor de putrefacție și menține culoarea roșie naturală a compoziției salamurilor (tip Tivoli).
– Acidul gluconic în amestec cu soda caustică este folosit pentru îndepărtarea rapidă a sărurilor insolubile de magneziu.
– Acidul 2 ceto-gluconic este folosit la obținerea acidului D-araboascorbic -substanță cu efect antioxidant folosit la prevenirea râncezirii alimentelor cu conținut ridicat în lipide.
Fermentatia citrica
Fermentația citrică este un proces oxidativ complex prin care substratul glucidic (zaharoza) este metabolizat la compuși intermediari de oxidare cu acumulare în mediu a acidului citric ca produs principal.
Producerea acidului citric cu ajutorul mucegaiurilor din g. Aspergillus este cunoscută din 1913 (patent Zahorski) și pe scară industrială din 1923, ca urmare a cercetărilor efectuate de Currie. O primă fabrică de producere a acidului citric a fost construită în 1928 în Praga, proces care a fost extins și în alte țări. In țara noastră, secția de acid citric (Giurgiu) – aplică procedeul prin cultivare de suprafață asigurând necesarul de acid citric pentru industria alimentară.
Agenții tipici ai fermentației citrice sunt tulpini selecționate ale speciei Aspergillus niger care produc activ citrat sintetază. Acidul citric se poate obține cu un bun randament (52 g.dm"3) și prin cultivarea drojdiilor cu specia Candida oleophilla, pe medii cu parafine.
In condiții normale mucegaiurile nu acumulează acizi organici care sunt metabolizați prin ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs). Pentru creșterea randamentului în acid citric, când pentru fermentație se folosește ca materie primă melasa, aceasta se tratează cu ferocianură de potasiu pentru îndepărtarea prin precipitare a: Mg, Fe, Mn, Zn, Cu, metale care influențează acumularea de acid.
Ca rezultat al eliminării acestora, crește activitatea enzimei de condensare, în schimb enzime ale ciclului Krebs: aconitat – hidrataza care necesită fier și izocitrat dehidrogenaza care necesită mangan, în absența cofactorilor trec în stare inactivă și deci este oprită secvența biochimică de transformare a acidului citric prin ciclul Krebs și astfel aceasta se acumulează în mediul de cultură.
Fig.1.16. Biochimismul fermentatiei citrice
Producerea industriala a acidului citric
Prin culturi de suprafață pe medii cu melasă diluată tratată cu ferocianură de potasiu, după sterilizare și răcire în tavă, se inoculează cu spori de A. niger. (3-4 g spori/100 m2 suprafață mediu) și fermentarea are loc la 30-35°C. La suprafață se dezvoltă o dermă cu suprafață cutată prin creșterea aerobă a miceliului (vegetativ și reproducător). Fermentația durează 6-8 zile cu un randament de conversie a zaharozei în acid citric de 70-72% (1 m2 suprafață miceliu poate să producă 500-800 g acid citric în 24 h). După separarea biomasei, aceasta poate fi valorificată ca sursă de enzime/ proteine, iar din mediul fermentat prin metode fizico-chimice se separă acidul citric cristalizat.
Acidul citric se poate obține și prin metode submerse în bioreactoare cu aerare dirijată, prin procedee discontinue sau continue, cu reducerea duratei de fermentație și creșterea randamentului la valori de 80-85% în acid citric.
Importanta fermentatiei citrice
Acidul citric este principalul acid folosit în industria alimentară, pentru fabricarea băuturilor răcoritoare, a produselor zaharoase.
Este folosit în calitate de conservant al culorii produselor păstrate in stare congelată, are proprietăți antioxidante și rol de anticoagulant al sângelui.
In industria farmaceutică intră în componența pulberilor efervescente.
Cifratul de sodiu este recomandat în compoziția detergenților, înlocuind fosfații, care prin deversare în ape favorizează proliferarea excesivă a algelor.
Acidul citric sub formă cristalizată prin încălzire la 170°C se transformă în acid itaconic utilizat la fabricarea rășinilor schimbătoare de ioni.
Fermentatii oxidative diverse
Prin fermentații oxidative (aerobe) se mai pot obține și alți acizi, de exemplu: acidul fumărie cu culturi din g. Aspergillus, Penicillium, important pentru obținerea aldehidei maleicc, materie primă pentru obținerea rășinilor sintetice.
Acidul kojic obținut prin cultivarea lui Aspergillus oryzae este folosit ca reactiv în chimia analitică și intră în compoziția unor insecticide.
Acidul ustilagic obținut cu culturi de micromiecte ale g. Ustilago este folosit în industria parfumurilor.
Este important de subliniat că fermentațiile pot avea loc în mod spontan în condiții naturale, favorizând transformarea compușilor organici din materia nevie în compuși mai simpli, accesibili pentru alte grupe de microorganisme, transformări ce permit un circuit natural al carbonului.
Majoritatea fermentațiilor descrise stau la baza biotehnologiilor alimentare când prin utilizarea culturilor starter se obțin produse cu mare valoare economică.
CAPITOLUL 2.
Transformari microbiene ale compusilor macromoleculari
Se apreciază că din energia radiațiilor solare care cad anual pe pământ, echivalentă cu 3xl024J convertită prin fotosinteză în energia chimică a combinațiilor organice se acumulează 2×1011 tone C/an. Din această biomasă vegetală cea mai mare parte o constituie celuloza, substanțele pectice, amidonul și în cantități mai reduse; lipide, acizi nucleici ș.a.
2.1. Descompunerea amidonului si glicogenului
Transformările acestor polioze poate fi produsă de microorganisme ce produc enzime extracelulare care produc hidroliza acestor compuși macromoleculari la molecule simple (glucoza, maltoză) ce pot fi transportate prin membrana celulară.
Dintre enzimele microbiene care hidrolizează amidonul fac parte: α-amilaza, β-amilaza și glucoamilaza, enzime extracelulare elaborate de bacterii, mucegaiuri și drojdii.
Bacteriile genului Bacillus: B. subtilis, B. subtilis var. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. maceram, B. sthearothermophillus sunt producătoare de a-amilaze active la 55-60°C dar și la temperatura de 90°C, termostabile, culturi folosite pentru obținerea amilazelor pe cale industrială.
Alte specii ale genului ca: B. cereus var. mycoides, B. megaterium, B. polymixa sunt producâtore de β-amilază, enzimă zaharogenă, care prin hidroliza legăturilor α 1-4 glucozidice eliberează molecule de maltoză.
Mucegaiurile produc mai ales α-amilază și glucoamilaza (Aspergillus, Mucor și Rhizopus) diferitele specii diferențiindu-se prin raportul între α-amilază și glucoamilaza.
Dintre buni producători de α-amilaze fac parte Aspergillus niger și Aspergillus oryzae, tulpini selecționate ce produc enzime stabile în domeniul acid și care au o termorezistență inferioară amilazelor bacteriene. Dintre speciile producătoare de glucoamilază (amiloglucozidază); A. awamori, A. usami, A. niger, Rhizopus delemar, active la pH acid (4-4,5) și temperaturi de 55-65°C cu temperaturi de inactivare mai mari de 65-70°C.
Deși se cunosc aproximativ 100 de specii de drojdii care produc α-amilază și glucoamilază, mai importante sunt specii ale genului Saccharomycopsis cu speciile S. bispora, S. fibuligera și genurile Schwanniomyces, Trichosporon, Candida.
Hidroliza enzimatică a amidonului, cu enzime vegetale (din malț) sau enzime microbiene cu formare de glucide fermentescibile este un proces cu mare importanță practică în biotehnologia spirtului, a berii, a panificației sau pentru obținerea siropurilor dulci, a dextrinelor, a maltozei, a glucozei cristalizate ș.a.
Desigur că degradarea amidonului în condiții naturale prezintă o pierdere, iar materiile prime (semințe, cereale) sau produse alimentare bogate în amidon, suferă ușor mucegăirea și deprecierea tocmai pentru că amidonul este o sursă importantă de carbon și energie pentru microorganismele capabile să producă amilaze inductive, extracelulare.
2.2. Descompunerea celulozei, hemicelulozei
Celuloza este un poliglucid foarte răspândit în materiile prime de origine vegetală și în structura pereților celulari ai fungilor. Celuloza ajunsă în sol și ape după moartea plantelor este transformată în timp sub acțiunea microorganismelor capabile să producă enzime celulozolitice și anume a micromicetelor – agenți ai putrezirii și a unor bacterii aerobe și anaerobe. Hidroliza generală a celulozei are loc după schema (Fig.2.1.)
Fig2.1. Hidroliza enzimatica a celulozei
Produșii intermediari de hidroliză sunt metabolizați în mod diferențiat în funcție de natura microorganismelor și prezența/absența oxigenului din aer.
Degradarea aeroba a celulozei.
Se caracterizează prin formarea de celobioză sau glucoza, a hidroxiacizilor și prin oxidare se eliberează C02 și H20. Dintre bacteriile aerobe care asimilează celuloza fac parte bacterii cu forme spiralate aparținând genurilor: Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas. Dintre micromicete, au activitate celulozolitică superioară specii ale genurilor: Botryotinia, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma și Tricothecium. Dintre acest culturi, o importanță industrială o au bacteriile din genul Cellulomonas, care pot fi cultivate aerob pe deșeuri vegetale, hârtie ș.a., iar biomasa rezultată prin înmulțire este valoroasă prin conținutul în proteine (46,2%). Prin studiul compoziției proteinei în aminoacizii esențiali se constată prezența în cantitate mare a lizinei (7,6g/ 100 g proteine), la valori egale cu cea existentă în lapte, iar metionina în concentrație de 2,01 g/100 g proteină, egale cu cea din proteina de referință FAO.
Dintre fungi, tulpini selecționate ale genului Trichoderma, Trich.reesei (viridae) și Aspergillus (A. niger) sunt buni producători de celulaze și folosite industrial ca surse de enzime.
Pe cale aerobă, ca urmare a unor relații de sinergism între grupe de microorganisme ale aceluiași biotop, este posibilă și degradarea ligninei când în asociație se află Mucor racemosus, Merulis lacrimans ș.a.
Degradarea anaeroba a celulozei
Are loc permanent în sedimente și în mâlul apelor, la fermentarea compostului, în rumenul ierbivorelor, în profunzimea solului, în soluri inundate, lacuri termale.
In transformarea celulozei se pot distinge trei etape, în funcție de natura produselor de fermentație.
După hidroliză celulozei la compuși simpli sub acțiunea unei microbiote eterogene alcătuite din bacterii anaerobe și facultativ anaerobe din familia Enterobacteriaceac, Bacillaceae (G. Clostridium) se acumulează alcooli și acizi, C02, H2 (etapa I).
Produsele rezultate în acest stadiu sunt folosite de bacteriile acetogene producătoare de acid acetic pe cale anaerobă (etapa Il-a), astfel:
In etapa a III-a denumită metanogenă sunt active bacteriile metanogene strict anaerobe din g. Methanobacterium (M. ruminantium, M. formicicum, M. mobilis, M. farkeri ș.a.)
Fig. 2.2. Formarea metanului pe cale microbiana
Bacteriile anaerobe pot folosi acidul acetic ca sursă energetică și produc metan:
Cu atomi marcați s-a constatat că 73% din metan rezultă din acidul acetic format în faza acetogenă. Metanobacteriile mai pot forma metan prin reacția:
In afara acestor procese naturale care explică formarea zăcămintelor de metan, în ultimele decenii metanogeneza dirijată în scopul obținerii de biogaz, prin prelucrarea microbiologică a dejecțiilor animale ia amploare, deoarece se realizează concomitent protecția mediului și valorificarea energetică a metanului și a hidrogenului.
Conversia compușilor reziduali are loc în metanotancuri, când în primul stadiu se observă o scădere a concentrației de oxigen și hidrogen, urmează stadiul de degradare activă a C02 și H2, apoi are loc reducerea acestor gaze și se acumulează biogazul, în care concentrația de metan reprezintă 60-80%. Durata procesului de formare a metanului poate fi de 180-500 zile; biogazul eliberează prin ardere o energie echivalentă cu 194,4 kcal/mol (811 kj/mol). După stagnarea procesului de metanogeneza, mediul rezidual, bogat în microorganisme poate fi folosit ca îngrășământ biologic.
Un nou combustibil care se poate obține prin fermentarea anaerobă a celulozei este hidrogenul; dacă la arderea unui kilogram de metan se eliberează 1200 kcal, la arderea aceleasi cantitati de hidrogen se obtin 28.000 kcal.
Procesul poate fi dirijat prin folosirea a 2 culturi microbiene: alge microscopice și bacterii care produc hidrogen.
In fermentația hidrogenică a celulozei cantitatea de gaze rezultate reprezintă 1/3 din celuloză, când fermentarea se produce cu Baccilus cellulose hidrogenicus, Bacillus cellulose dissolvens (temperatura optimă, 35°C) și Clostridium thermocellus (T0=65oC).
2.3. Degradarea substantelor pectice
Substanțele pectice sunt conținute în cantitate mare în fructe, legume, tulpini, rădăcinoase sub formă de protopectină insolubilă, parțial asociată cu arabanii pereților celulelor vegetale, cu celuloză și alte polioze. După recoltarea fructelor, a legumelor, în timpul conservării lor sau în straturile superficiale ale solurilor, prin activitatea microorganismelor are loc hidroliza substanțelor pectice având ca efect înmuierea țesutului vegetal și pierderea rezistenței lui față de agenții de putrezire.
Protopectină insolubilă poate fi transformată în pectină solubilă-heteropoliglucid format din acizi poligalacturonici solubili în apă (acizi D-poligalacturonici legați prin legături α-1, 4-esterificați cu alcool metilic) sub acțiunea protopectinazei produse de mucegaiuri și bacterii.
Fig. 2.3. Hidroliza enzimatica a substantelor pectice
Pectina, sub acțiunea pectin-metilesterazei este hidrolizată la acizi pectici -respectiv acizi poligalacturonici neesterificați, care eliberează acizi D-galacturonici, sub acțiunea catalitică a poligalacturonazelor.
Dintre bacterii, produc pectin-metilesteraze cele ale g. Erwinia, Xanthomonas și Bacillus (ex. B. polimixa), mucegaiuri, cu speciile Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, ale genurilor Fusarium și Selerotinia.
Agenți producători de poligalacturonaze: Aspergillus niger, Penicillium expansum, Byssochlamys fulva și Clostridium felsineum. Dintre aceste tulpini sunt performante Aspergillus niger și Botryotinia fuckeliana (Botrytis tinerea), care se folosesc pentru obținerea de endo și exopoligalacturonaze folosite în industria sucurilor de fructe, preparate care trebuie să fie lipsite de pectinesteraze care catalizează hidroliza legăturilor externe ale pectinei solubile cu eliberare de alcool metilic (toxic pentru organismul uman).
Descompunerea naturală a substanțelor pectice este folosită ocazional în România, la "topirea" inului și a cânepii, care are loc după imersarea plantelor în apă, sub acțiunea bacteriilor din speciile: Pseudomonas fluorescens, Clostridium felsineum, Granulobacter pectinovorum.
2.4. Descompunerea lipidelor
Lipidele prezente în materia nevie, de origine vegetală și animală care ajung în habitaturi naturale, precum și cele conținute în materii prime (semințe oleaginoase) sau produse alimentare pot suferi transformări sub acțiunea microorganismelor producătoare de lipaze extracelulare.
Sub acțiunea lipazelor are loc hidroliza lipidelor cu formare de glicerol ce poate fi metabolizat pe calea EMP și acizi grași, care sunt metabolizați pe calea /3-oxidării cu eliberarea de acetil-CoA din lanțul hidrocarbonat a acestora și o cantitate de energie folosită de celula microbiană pentru creștere și reproducere. Astfel prin oxidarea completă a acidului palmitic (până la CO2 și H2O), se eliberează o cantitate de energie echivalentă cu 130 moli de ATP.
Lipazele sunt sintetizate de numeroase microorganisme: mucegaiuri (g. Rhizo-pus,g. Mucor, g. Aspergillus, g. Fusarium, g. Penicillium, g. Geotrichum ș.a.) drojdii ale g. Candida și bacterii din g. Pseudomonas, Bacillus s.a..
Prin dezvoltarea microorganismelor lipolitice pe materii prime oleaginoase sau produse cu conținut ridicat în lipide (smântână, unt, margarina ș.a.) are loc o pierdere a valorii alimentare, ca urmare a râncezirii hidrolitice.
Cu microorganisme selecționate ale g. Rhizopus și Aspergillus, se pot obține preparate enzimatice cu activitate lipazică ce pot fi utilizate la fabricarea brânzeturilor pentru îmbunătățirea aromei, în terapeutică împreună cu lipaza pancreatică pentru îmbunătățirea digestiei și în industria detergenților.
2.5. Degradarea acizilor nucleici
Acizii nucleici conținuți în toate celulele eucariote, procariote și în particolele virale pot fi degradați pe cale microbiană de către microorganisme care pot sintetiza ribonucleaze și dezoxiribonucleaze. Pot produce degradarea acizilor nucleici cu formarea de 2,3 – ciclonucleotide și fosfați, bacterii ale genurilor: Staphylococus, Bacillus, Clostridium ș.a.
Referitor la acizii nucleici conținuți în produse alimentare (de origine vegetală, animală sau microbiană) în organismul uman, bazele purinice din componența acizilor nucleici sunt transformate în acid uric cu o solubilitate mică, ce se elimină normal prin urină. Când în alimentație se folosește biomasă microbiană (SCP), deoarece în celula microbiană conținutul în acizi nucleici este mai mare decât în celulele vegetale/ animale, OMS recomandă ca în dietă conținutul de acizi nucleici să nu depășească 2 g/24 ore. La depășirea dozei, în plasma sanguină și urină, crește concentrația în acid uric și apare risc de îmbolnăvire (gută). La alte organisme: pești, amfibii, animale (vite, porci), sub acțiunea uricazei, acidul uric este transformat în alantoină, compus mai solubil, încât consumul de produse cu un conținut ridicat de acizi nucleici/purine nu este dăunător.
2.6. Degradarea chitinei
Chitina – poliglucid cu azot – prezent mai ales în aripile insectelor, la viermi, moluște, dar și în structura pereților celulari ai fungilor poate fi degradat sub acțiunea chitinazei, produsă de Pseudomonas chitinovorans, cu eliberare de N-acetilglucozamină.
O degradare pe cale microbiană suferă și compușii organici aromatici (vitamine, aminoacizi), care sunt transformați de către mucegaiuri și bacterii în compuși mai simpli: fumarat, acetoacetat, succinat.
2.7. Transformari microbiene ale protidelor
Protidele sunt compuși macromoleculari ce au în componență: C, H, O, N, S, P, elemente cu rol vital pentru toate formele de viață. In celula vie, protidele au rol structural și funcțional (enzime), iar după moartea fiziologică a organismelor, prin procese de proteoliză enzimatică, protidele sunt transformate în compuși mai simpli ce pot servi, ca sursă de azot pentru microorganismele implicate în circuitul natural al azotului (fig. 2.4.).
Protidele conținute în materia organică nevie, care se acumulează în sol și ape, prin moartea plantelor, animalelor, microorganismelor, pot fi hidrolizate sub acțiunea proteazelor extracelulare produse de către bacteri și mucegaiuri – agenți ai putrefacției (degradarea protidelor de origine animală) și ai putrezirii (degradarea protidelor de origine vegetală).
Spre deosebire de bacterii și mucegaiuri, drojdiile nu pot folosi protidele în procesul de nutriție deoarece ele conțin proteaze intracelulare, care se pot elibera din celule numai prin dezintegrarea învelișurilor celulare sau după moartea celulelor prin autoliză.
Fig.2.4. Schema generala a proteolizei
Formarea produsilor finali ai putrefactiei are loc prin dezaminarea aminoacizilor pe una din urmatoarele cai:
Dezaminare oxidativa
a)
(Mucegaiuri, bacterii aerobe)
b) Prin hidroliza in prezenta dehidrogenazelor specifice produse de bacterii ale genului Bacillus, Clostridium:
Escherichia coli produce 3 transaminaze si pot produce transaminarea pe piruvat in calitate de acceptor al gruparii [-NH2].
– Dezaminarea desaturata, poate fi produsa de bacterii aerobe si anaerobe (Proteus, Pseudomonas, Clostridium), dupa reactia generala:
– Dezaminarea reductiva e intalnita la bacterii strict anaerobe ale genului Clostridium:
– Decarboxilarea aminoacizilor are loc intracelular sub actiunea aminoacid decarboxilazelor active mai ales in mediu acid, cu formarea de amine, dupa reactia generala:
Aminoacizi Amine biogene toxice
ornitina → putresceina
lizina → cadaverina
triptofan → triptamina
histidina → histamina
Fig.2.4. Transformari ale protidelor in celula microbiana
Produșii intermediari ai proteolizei, cu molecule mici pot fi folosiți ca sursă de azot, carbon și energie, deoarece pot fi transportați și metabolizați intracelular cu eliberare de energie (Q).
Protcoliza prezintă aspecte particulare în celula microbiană în funcție de starea fiziologică a celulei. Astfel în celula vie are loc fenomenul de turnover prin care proteinele "vechi" care nu își mai îndeplinesc cu eficiență rolul lor funcțional sunt degradate intracelular până la aminoacizi, care vor servi drept "unități constructive" pentru biosinteza proteinelor noi, a enzimelor adaptive ș.a. (Zarnea, 1984)
Autoliza (proteoliza intracelulară) este un proces ireversibil, care conduce la moartea fiziologică a celulei, când în condiții vitrege de viață, în absența nutrienților, a apei și energiei necesare pentru biosinteza, aminoacizii rezultați prin transformarea proteinelor sunt în continuare catabolizați cu formarea produșilor finali ai putrefacției (fig.2.4.)
Agentii microbieni ai procesului de degradare a protidelor
Pot produce enzime proteolitice majoritatea bacteriilor organotrofe, actinomicete și mucegaiuri.
Putrefacția este produsă de bacterii aerobe, facultativ anaerobe și strict anae-robe, care se dezvoltă optim pe produse cu pH…7 și activitatea lor este oprită la pH=4. Procesul este inițiat de către bacteriile aerobe care se pot dezvolta în mediu cu pH acid (4,5-5,5) și care pregătesc condițiile pentru bacteriile anaerobe prin consum de oxigen și formarea produșilor intermediari de hidroliză: peptide și aminoacizi.
1) Bacteriile aerobe de putrefacție aparțin următoarele genuri:
1.1 Genul Pseudomonas – cu bacterii în formă de bastonașe drepte sau curbate, mobile cu cili polari și Gram negative. Sunt strict aerobe, catalazo-pozitive și pot să crească într-un interval de temperaturi de la +4°C la +43°C, producând alterarea alimentelor (carne, lapte etc.) păstrate în condiții de refrigerare. Produc proteaze cu activitate optimă între 30 și 45°C și pH între 6,5 și 8, caracterizate printr-o termostabilitate ridicată (D140=l-2 minute).
Habitatul lor obișnuit este solul, apa dulce, apa de țărm a mărilor. Majoritatea speciilor sunt saprofite dar se cunosc și specii patogene (P. oeruginoso – bacterie de putrefacție, prezentă în ape naturale, ape de canal, pe vegetale, produse alimentare, de unde ajungând pe piele produce infecții purulente; P. moliei este agentul morvei, trasmisibilă la om).
Dintre bacteriile de putrefacție frecvent întâlnite fac parte P. fluorescens, P. putido, P. putrefociens, P. frogi bacterii psihrotrofe, implicate în alterarea cărnii refrigerate. Genul cuprinde 29 specii bine studiate și alte 236 insuficient definite, având caractere de gen.
1.2. Genul Bacillus (28 specii), cu bacterii sporogene Gram pozitive, aerobe si mezofile. Dintre bacteriile de putrefactie frecvent intalnite ca ca agenti de alterare: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megatherium, B. sthearothermophillus, B. coagulans. Ele produc hidroliza gelatinei și prin degradarea aminoacizilor cu sulf eliberează H2S.
Bacillus subtilis produce catalază, poate hidroliza amidonul și protidele. B. cereus se prezintă sub formă de bastonașe (1-1,2) (3-5) jum cu capete ușor rotunjite, în lanțuri scurte, se dezvoltă la o temperatură minimă 15-20°C și maximă 35-45°C.
1.3. Genul Proteus – cuprinde bacterii nesporulate mobile, Gram negative, dau lichefierea gelatinei. Specii răspândite: Proteus vulgarii și Proteus mirabilis.
Alte bacterii de putrefacție mai aparțin g. Flavobacterium și g. Alcaligenes, agenți de alterare a cărnii, peștelui, în condiții de refrigerare.
2) Bacterii facultativ anaerobe de putrefacție aparțin g. Escherichia,
Enterobacter, Enterococcus (streptococii fecali), sunt de origine fecală, Gram negative
nesporulate.
3) Bacteriile anaerobe pot fi sporulate sau nesporulate și în dezvoltarea lor pe un produs intrat în putrefacție se observă o anumită succesiune. In primele 2 zile sunt
prezente bacterii din g. Micrococcus, Staphylococcus; după 3-4 zile predomină Bacillus
putidum și Clostridium sporogens și după 7-8 zile, Clostridium putrificus, Diplococcus
griseus, Bacilluspostumus, bacterii care produc atât hidroliza protidelor cât și a lipidelor.
3.1. Genul Clostridium include bacterii cu formă de bastonașe mari, izolate sau în lanț, anaerobe, Gram pozitive, sporogene, majoritatea mobile.
Clostridiile proteolitice – degradează protide,produc H2S, hidrolizează gelatina (C. sporogenes, C. putrefaciens, C. perfringens, C. nigrificans ș.a.).
Pentru punerea în evidență a bacteriilor de putrefacție într-un produs alimentar, după omogenizare și antrenarea microbiotei în ser fiziologic steril, acesta se inoculează în eprubete cu apă peptonată 1% și după 24 ore de activitate se vor pune în evidență produșii finali ai proteolizei (amoniac, H2S, indol), capacitatea bacteriilor de a pro¬duce hidroliza gelatinei prin teste biochimice (teste H pentru evidențierea H2S; I pentru indol și L – lichefierea pe cale enzimatică a gelatinei) (D. Bârzoi, 1985)
Practic nu există compus organic, care să nu fie degradat la compuși simpli, ca urmare a adaptării microorganismelor; dacă acest fapt nu ar fi real, ar fi evidente acumulări în timp, dezechilibre naturale, catastrofe ecologice.
CAPITOLUL 3
Microbiota alimentelor si incidenta microorganismelor contaminate
Valoarea alimentară a unui produs este dată de valoarea nutritivă, senzorială și de gradul de inocuitate, respectiv absența din alimente a microorganismelor patogene, a substanțelor toxice microbiene și a organismelor care produc infestarea (ouă, larve, insecte).
Produsele alimentare conțin în mod constant și în număr variabil diferite microorganisme. In sistemul biologic microorganisme-aliment-om, determinismul microbian are o mare importanță tehnologică, social-economică, valoare igienico-sanitară și microbiologică fiind inclus în calitățile alimentului, hrana reprezentând o condiție de existență a organismului ce condiționează sănătatea, "izvor natural care trebuie păstrat <:a cea mai mare bogăție a lumii". Alimentul, privit ca factor al mediului extern devine produsul unic care se integrează din punct de vedere metabolic direct în organism condiționând sănătatea acestuia.
Studiul microbiotei alimentelor a condus la stabilirea în diferite țări a unei legislații privind gradul de contaminare cu microorganisme a alimentelor, formarea microbiotei în condițiile proceselor tehnologice de prelucrare a alimentelor, rolul microorganismelor la creșterea valorii biologice și alimentare, rolul etiologic al unor alimente în transmiterea microorganismelor patogene.
In urma consumului de alimente, accidental, se pot produce îmbolnăviri datorate în cele mai multe cazuri, ingerării de substanțe toxice, ca de exemplu:
– Indigestie, prin consum în exces;
– Toleranță sau sensibilitate (anafilaxie, anticorpi)
– Toxine din alge (dinoflagelate, saxitoxină)
– Intoxicații cu metale (As, Se, Pb, ș.a.)
– Substanțe chimice din lucrări agricole și gospodărie (insecticide, pesticide, sodă)
– Zootoxine (se pot acumula în alimente marine)
– Substanțe produse de protozoare ce dau boli (dezinteria amibiană, gastroenterite, ș.a)
– Infestarea cu helminți, nematode dau boli ca: teniaza, trichinoza Infectii microbiene (bacterii si fungi patogeni)
Intoxicații (prin ingerarea de alimente în care sunt prezente toxine bacteriene și/fungice).
Este cert că dintre grupele enumerate, frecvența cea mai mare o au îmbolnăvirile provocate de activitatea diferențiată a microorganismelor în aliment sau în organismul animal, când acestea au fost vehiculate prin alimente contaminate.
Poluarea microbiană se referă la căile prin care în produsele alimentare pot ajunge ocazional, microorganisme de alterare a alimentelor, sau microorganisme patogene/ toxicogene (agenți ai îmbolnăvirilor prin consum de alimente contaminate).
3.1. Surse naturale de microorganisme
Microorganismele în cursul evoluției, datorită capacității lor uimitoare de adaptare sunt prezente oriunde există condiții minimale pentru viață, fiind întâlnite în toate habitaturile naturale, în sol, ape, în/pe organisme vegetale și animale, iar răspândirea lor nu este influențată de factori geografici, geologici, istorici ș.a.
Microbiota solului
Răspândirea microorganismelor în natură depinde de mulți factori dintre care o mare importanță revine prezenței apei, substanțelor nutritive, temperaturii, reacției mediului ș.a. condiții existente în sol, considerat rezervorul natural principal de microorganisme din care acestea se răspândesc în aer, ape.
Modul de repartizare a microbiotei în sol este neuniform fiind mai numeroasă în straturile superficiale aerate, mai bogate în nutrienți și scad cantitativ în profunzime. Compoziția microbiotei diferă în funcție de tipul de sol; cantitativ se apreciază că solurile argiloase pot conține până la 2.108.g-1 iar cele podzolice 2. IO9 microorganisme.g"1.
In componența solului intră predominant eubacterii și actinomicete, drojdii și fungi filamentoși. Dintre bacteriile patogene din sol, transmisibile la om și animale sunt citate în literatură, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, ș.a, ca și microorganismele fitopatogene agenți de îmbolnăvire a plantelor.
Straturile superioare ale solului constituie o lume în care diferitele specii se înmulțesc și are loc o luptă continuă pentru existență, spațiu și nutrienți, încât în biotop se stabilește în timp, un echilibru condiționat atât de factorii de mediu cât și de interrelațiile predominant antagonice între microorganisme.
Biomasa activă alcătuită din microorganisme, evaluată în funcție de număr de celule per gram de sol, (în cantitate de 2,5-10 tone în stratul arabil al unui hectar), are un rol imens în formarea humusului, în asigurarea circuitului natural al principalelor elemente biogene, în menținerea compoziției atmosferei, în menținerea vieții pe pământ,reprezentand principala veriga de legatura intre mediul abiotic si biotic.
Prin intermediul curenților atmosferici, ai factorilor biologici, microorganismele din sol sunt antrenate în aer unde au o existență temporară și prin sedimentare contaminează și produsele alimentare.
Microbiota apelor
In cursul evoluției, numeroase microorganisme s-au adaptat la condițiile existente în ape consumând cantitățile mici de substanțe organice și anorganice dizolvate. Din punct de vedere cantitativ numărul de microorganisme variază în limite largi de la 10.cm3 în apa de izvor până la concentrații de 1011.cm-3 în ape fecalo-menajerc, în funcție de sursele ocazionale de contaminare, compoziția chimică, tipul de apă, gradul de agitare/aerare și alți factori fizico-chimici și biologici.
Microorganismele contaminante ale apelor care pot proveni din sol, din materii de dejecție (ale animalelor, păsărilor, cu o încărcare de aproximativ 109.g-1) sau transmise prin aer (max. 500-106.m-3) ajungând în ape pot să supraviețuiască un timp destul de îndelungat (de exemplu bacteriile coliforme ale genuluiEschericbia rezistă în apa de râu 283 de zile). O parte din microorganismele contaminante ale apelor naturale pot să fie lizate de către bacteriofagi, să fie consumate de protozoare sau în absența unor condiții minime de existență celulele sedimentează, intră în faza de autoliză și îmbogățesc apele în materie organică biodegradabilă.
Un grup numeros și eterogen îl formează microorganismele care s-au adaptat la condițiile existente și se înmulțesc în ape folosind în nutriție substanțe organice ajunse accidental prin materia moartă (cu o încărcătură microbiană ridicată), precum și substanțe minerale existente în compoziție sau eliberate în urma metabolismului microbian. Prin această activitate microorganismele cu habitatul în ape au un rol imens în mineralizarea și circulația materiei organice nevii, în menținerea lanțului trofic al organismelor acvatice, în depoluarea naturală a apelor.
Caracterizarea morfologică a bacteriilor cu habitatul în ape.
Dintre grupele de microorganisme componente ale biocenozelor acvatice și care pot să producă degradarea substanțelor organice din ape, mai importante sunt bacteriile, în timp ce drojdiile și lungii filamentoși au un rol minor.
♦Bacteriile de putrefacție, produc enzime proteolitice extracelulare care degradează proteinele din materia organică moartă până la produși finali (gaze, amine, acizi grași, compuși indolici). Grupul cuprinde bacterii aerobe din genurile Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, bacterii anaerobe facultative din genurile Pro-teus, Sarcina, Escherichia și strict anaerobe, din genul Clostridium.
♦Nitrozobacteriile sunt bacterii care oxidează amoniacul la nitriți, în condiții aerobe. Deoarece aceste bacterii au un timp de generație în ape de 10-12 ore, nu se admite prezența nutriților în apa potabilă, deoarece existența lor semnifică o contaminare recentă cu materie organică ne vie.
♦Nitrobacteriile din genurile Nitrobacter și Nitrococcus oxidează nitriții în prezența oxigenului molecular cu formarea de nitrați. Deoarece acest proces este exergonic aceste bacterii pot concomitent să reducă CO2 transformându-l în compuși celulari proprii.
In apa potabilă se admite o concentrație maximă de 10 mg -dm3 deoarece se consideră că timpul scurs de la contaminarea inițială a fost atât de îndelungat încât eventualele microorganisme patogene nu mai supraviețuiesc și s-a produs mineralizarea materiei organice.
♦Bacteriile denitrificatoare sunt active în condiții anaerobe când are loc denitrificarea și nitrații sunt reduși succesiv în nitriți, oxid de azot, protoxid de azot și azot molecular.
♦Bacteriile care oxidează hidrogenul, fac parte dintr-un grup eterogen ce conține 15 genuri dintre care genul Alccdigenes, Pseudomonas ș.a care oxidează în aerobioză hidrogenul gazos rezultat din procese fermentative concomitent cu fixarea C02 din mediu. In condiții anaerobe cea mai mare parte din hidrogen este folosită pentru producerea de metan, H2S și azot molecular.
♦Carboxibacteriile sunt bacterii aerobe care folosesc oxidul de carbon, toxic pentru alte microorganisme, în calitate de unică sursă de carbon si energie (g. Pseudomo¬nas, g. Achromobacter). Aceste bacterii pot să folosească și acizi, metanol, formiat, H2.
♦Bacterii metilotrofe care pot folosi metanul și alte combinații – C în calitate de sursă de carbon și energie și aparțin genurilor: Proteus, Campylobacter, Vibrio, Methylomonas, Pseudomonas.
Bacterii ce intervin în metabolismul sulfului.
♦Bacterii sulf oxidante dintre care cele ale genului Thiobacillus pot să oxideze sulful elementar, hidrogenul sulfurat precum și compușii cu fier bivalent.
Prin oxidarea compușilor volatili ai sulfului și producerea de acid sulfuric favorizează coroziunea conductelor și a altor structuri metalice submerse în ape, a betonului. Tolerează variații mari de temperaturi și pH (1-9).
♦Bacteriile sulfat reducătoare produc reducerea sulfaților la H2S și sunt larg răspândite în medii acvatice anaerobe. Au rol în coroziune, în poluarea apelor dând miros dezagreabil datorat acumulării de hidrogen sulfurat și înegrirea apelor și a sedimentelor, datorată precipitării sulfurii de fier. In culturile mixte cu bacterii metanogene, bacterii ale genului Desulfribrio pot să furnizeze acetat, cu rol de precursor al metanului.
♦Bacterii metanogene, cuplează oxidarea hidrogenului cu reducerea concomitentă a C02 care poate să fie parțial folosit pentru sinteza compușilor celulari sau este redus la metan.
♦Bacterii care utilizează compuși ai fierului. Ferobacteriile observate în bazine și ape cu conținut ridicat în fier pot fi bacterii filamentoase (g. Spherotillus șiLeptothrix), care formează teci mucilaginoase impregnate cu hidroxid feric sau de mangan și bacterii nefilamentoase (g. Gallionella, g.Ferobacillus) care pot folosi dioxidul de carbon din aer și obțin energia prin oxidarea Fe2+ cu formarea de hidroxid feric insolubil în apă, colorând apele în portocaliu.
Bacterii transmisibile prin ape, contaminante ale alimentelor.
Gradul de încărcare cu microorganisme al apelor este dependent de o serie de factori dintre care se evidențiază prin importanță următorii:
– Sursele de poluare si frecventa lor;
– Natura microorganismelor contaminante;
– Prezența de substanțe nutritive asimilabile – surse energetice pentru creștere a microorganismelor;
– Prezența în ape a unor substanțe nocive, de obicei aduse cu apele reziduale industriale;
– Prezența bacteriofagilor (care produc liza bacteriilor sensibile), a protozoarelor;
– Factori fizici: temperatură, grad de aerare/agitare.
Apele de izvor și apele din pânza freatică au un număr mai redus de microorganisme; în acest caz apa metcoritică cu microorganisme preluate din atmosferă se filtrează prin diversele straturi ale solului și se acumulează atunci când întâlnește un strat argilos impermeabil, motiv pentru care sunt considerate ape potabile, având un număr redus de microorganisme de 20-300 bacterii.cm-3.
Apa potabilă este o apă naturală pură (limpede, incoloră, inodoră) care conține un număr cât mai mic de microorganisme și este lipsită de microorganisme patogene. Pentru ca o apă care alimentează un centru populat cu peste 70.000 locuitori să fie considerată potabilă, numărul total de bacterii nu trebuie să depășească 20.cm-3 iar bacteriile coliforme să nu depășească 0-3.dm-3; în centre mai mici se admit 100 bacterii.cm-3 și mai puțin de 10 Escherichia coli. dm-3, în centre cu apă din fântâni se admit în mod excepțional 300 bacterii.cm-3 și mai puțin de 100 Escherichia coli. dm-3.
Epidemiile datorate microorganismelor patogene de origine intestinală: febra tifoidă, holera, leptospiroze, poliomelită, hepatita epidemică sunt adesea de origine hidrică. (E.Duca, 1979). In tabelul 3.1 se dau principalele boli datorate consumului de apă contaminată cu microorganisme patogene.
Tab.3.1
Boli transmisibile prin ape
Microbiota aerului
Dispersarea microorganismelor în natură are loc din sol, ape, surse biologice și datorită masei reduse a microorganismelor de obicei atașate de particole de sol, se pot menține sub forma unui "nor" invizibil ce este purtat de curentii de aer la distante mari în atmosferă sau în spațiile interioare. Ploaia în general captează particolele și microorganismele din aer, mai eficient dacă picăturile au diametrul de 2 mm. In absența curenților de aer poate avea loc sedimentarea gravitațională și în funcție de dimensiune, viteza de depunere poate fi de 0,002-3 cm.sec-1 (Zarnea G.,1994)
Prin intermediul aerului, de la indivizii bolnavi se pot transmite virusuri și microorganisme patogene ce sunt expulzate prin strănut, tuse și vorbit. Astfel, prin strănut se pot produce aproximativ un milion de picături cu dimensiuni mai mici de 100 jim și câteva mii de picături mai mari, formate din salivă și mai rar din secreții nazale, care favorizează transmiterea agenților patogeni, în timp ce prin vorbit se pot elimina în jur de 250 de picături la 100 de cuvinte. Cele mai periculoase sunt picăturile cu dimensiuni mici, ce pot conține una sau mai multe bacterii și care se usucă instantaneu și se mențin în aer prelungind perioada de infecțiozitate. In afara virusulor (Adenovirus, Influenza etc) și a bacteriilor (Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae, Streptococcuspneumoniae etc care afectează sistemul respirator), aerul poate să conțină spori de mucegaiuri care pot genera unele stări alergice sau de hipersensibilitate.
Concentrația de celule în aer variază în funcție de zonă: aerul este pur în locurile acoperite veșnic cu zăpadă. In orașe, parcurile pot avea aprox. 200 microorganisme.m-3 , pe străzi 5.102.↔..5.104.m-3, în încăperi populate până la 3.105 iar în grajduri chiar 2.106.m-3 aer.
In industria alimentară se consideră că aerul corespunde din punct de vedere microbiologic dacă numărul microorganismelor (bacterii aerobe, fungi) determinat prin metoda depunerii nu depășește valori de 103.m-3.
Surse biologice
Se consideră că în industria alimentară practic este imposibilă evitarea contactului uman direct sau indirect cu alimentul. Din acest motiv omul poate fi o sursă importantă de contaminare cu microorganisme dintre care un risc crescut îl dau patogenii transmisibili de la indivizii bolnavi.
Microorganismele adaptate la condițiile oferite de organismul uman/animal, alcătuiesc microbiota rezidentă, formată din specii organotrofe care trăiesc în depozitele de materie organică din colon, spații interdentare, carii, subunghial, interdigital, capabile să trăiască și în mediile externe și din microbiota comensală compusă din specii incapabile să crească în mediu extern, care se dezvoltă pe mucoase, piele, foliculi piloși, glande sebacee, etc. Se poate distinge și o microbiota flotantă (temporară sau tranzitorie) reprezentată de specii colectate din mediul extern, cu un timp de persistență de zile-luni, fiind mai puțin adaptate la condițiile de pe mucoase și tegumente.
Microbiota intestinală.
Este specifică, alcătuită din aproximativ 400 tipuri diferite de microorganisme aflate în interacțiune între ele și concomitent cu gazda. Cavitatea și mucoasa bucală este nnnnbt3 strenmmri facultativ anaerobi, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus și bacterii Gram negative din fam. Bacteroidaceae. Bacteriile din gură, din alimente și din apă ajung în stomac unde are loc o selecție condiționată de aciditatea gastrică, (pH 1-2) încât duodenul și jejunul superior sunt practic sterile, iar concentrația de celule vii este sub 1000.cm-3. La naștere fătul este steril dar după faza de alăptare are loc popularea și numărul ajunge la aprox. 104.g-1 în stomac și intestinul subțire, în care predomină bacterii facultativ anaerobe. In ileumul distal și mai ales în colon sunt prezente bacteriile strict anaerobe, numărul lor ajunge la valori de 109-1011.g-1 și se elimină prin materii fecale.
Microbiota intestinală este o populație extrem de eterogenă din care fac parte bacterii: bifidobacterii, streptococi coliformi, peptostreptococi ș.a. , numeroase specii de mucegaiuri, drojdii, protozoare, bacteriofagi, enterovirusuri. La copii predomină bacterii facultativ anaerobe {Escherichia coli, Enterococcus faecalis și Enterococcus bovis) și microaerofile (Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus gasseri) urmate de anaerobi ce devin predominanți la adulți și aparțing. Bacteroides și Clostridium.
Unele bacterii plutesc în conținutul intestinal altele sunt asociate cu peretele intestinal ce are rol de factor colonizator. De asemenea bacteriile se pot atașa de particole de alimente și asigură un contact direct al enzimelor cu substratul. (Frank H.K., 1992).
Microbiota intestinală este o sursă imensă de enzime ce transformă nutrienții care trec prin tract și are un rol important în sinteza de vitamine și aminoacizi, în degradarea amidonului în glucide simple, în fermentarea poliglucidelor neamidonoase, în formarea de acizi grași volatili, în degradarea proteinelor la: aminoacizi, amine, amoniac. Unele specii dau hidrogenarea acizilor grași nesaturați, transformă acizii primari la acizi secundari, dau transformarea colesterolului la alți steroli, reduc nitrații la nitriți, produc toxine și carcinogeni. La animalele rumegătoare au un rol în digestia alimentelor.
Cea mai importantă funcție a microbiotei gastrointestinale este aceea de protecție față de infecții microbiene, fiind sursa majoră de antigeni în organismul animal. Nivelul celulelor în plasmă și imunoglobulinele sunt mai scăzute la indivizii liberi de microorganisme.
Prin materii fecale odată cu microbiota saprofită se elimină și microorganisme patogene de la om sau animale, bolnave sau purtătoare, sănătoase. De la acestea pot fi transmise omului aproximativ 160 de infecții din care 80 majore. (E. Duca, 1979).
In microbiota normală a pielii există specii rezindente aparținând speciilor Sta-phylococcus epidermidis, Propionibacterium acncs și Escherichia coli, încât în pliuri umede ale pielii numărul de bacterii este mare de 4.105 – 106.cm-2. Specia temporal, frecvent întâlnită este Staph. aureus ce poate fi prezentă, la unii purtători, în cavitatea nazală. De pe mâini mai ales prin nerespectarea condițiilor de igienă, acestea trec pe aliment, la manipularea acestuia.
In cazul nerespectării condițiilor de igienă răspândirea microorganismelor contaminante poate fi datorată altor surse biologice, prin intermediul insectelor, rozătoarelor, care pot transfera microorganisme din zonele murdare în zone curate, inclusiv pe alimente.
Consideratii generale asupra microbiotei alimentelor
Microbiota alimentelor in functie de natura microorganismelor, poate fi diferentiata in microbiota specifica si nespecifica.
Microbiota specifica
Este alcătuită din microorganisme cultivate denumite și culturi starter introduse dirijat în produs, în scopul obținerii unor transformări dorite. In aceeași categorie intră și microbiota care se formează în etape tehnologice determinate (la murarea verzii și a altor legume, la fermentarea mustului ș.a) și care realizează însușiri senzoriale și de compoziții obligatorii, cu o influență pozitivă asupra calității alimentelor.
Microorganismele benefice introduse în mod dirijat sub formă de culturi pure pentru creșterea calității produselor alimentare nu sunt considerate contaminanți deși, în funcție de condițiile de activitate și durata în care ele sunt active, acestea pot sa producă uneori defecte senzoriale.
Microorganismele necesare în fermentația alimentelor pot fi adăugate sub formă de monoculturi/culturi mixte, sau în anumite cazuri nu se adaugă culturi, dacă microorganismele dorite, se cunoaște că sunt prezente în număr mare în materia primă. De exemplu, la murarea verzii, a murăturilor, a măslinelor, la fermentarea boabelor de cafea, cacao, materia primă conține o cantitate suficientă de microorganisme dorite, care vor acționa intr-o succesiune proprie, dacă vor fi păstrate condițiile adecvate pentru fermentare. In aceste condiții nu este necesară sau avantajoasă adăugarea de culturi pure. In schimb folosirea culturilor starter penttu desfășurarea unei fermentații controlate se practică în multe biotehnologii alimentare la fabricarea produselor lactate acide, a brânzeturilor, untului, pâinii, berii, spirtului și băuturilor alcoolice, oțetului ș.a. (Larpent J., 2000)
Principii generale la prepararea și păstrarea culturilor starter.
Culturile pentru fermentarea alimentelor sunt selectate după proprietățile lor biotehnologice dorite și pe baza stabilității lor, respectiv, capacitatea de a produce con¬stant schimbări eficiente și produse de calitate superioară. Selecționarea culturilor și îmbunătățirea performanțelor lor se realizează în institute de cercetări, învățământ, laboratoare, iar culturile valoroase sunt păstrate în colecții de microorganisme.
Pentru menținerea purității și activității culturii pure se folosesc diferite metode, dintre care în practică se folosește transferul periodic pe un mediu adecvat, incubarea până când cultura atinge un maximum al fazei staționare de creștere și apoi păstrarea la temperaturi suficient de scăzute pentru a preveni creșterea în continuare a culturii. Se știe că un transfer frecvent al unei culturi insuficient de stabile poate conduce la modificări nedorite în caracteristicile acesteia.
Se practică prepararea de culturi stoc atunci când se urmărește păstrarea culturii un timp îndelungat fără transfer pe mediu de cultură proaspăt. Aceste culturi rămân stabile și sunt folosite atunci când s-a produs pierderea culturii sau a unor proprietăți utile. Pentru obținerea culturilor stoc frecvent se folosește liofilizarea, păstrarea culturilor sub strat de ulei de parafină steril, bacteriile se pot păstra la temperatura camerei luni/ ani pe slant agar cu 1% NaCl, iar endosporii bacterieni și fungii în eprubete cu sol steril.
Prepararea culturilor de producție se realizează pornind de la cultura stoc sau de la o cultură activă la care se verifică în prealabil puritatea. Aceste culturi sunt destinate inoculării unor cantități mari de mediu fermentativ, încât pentru demararea procesului fermentativ sunt necesare culturi de producție intermediare realizate prin pasaje, până la obținerea culturii starter finale.
Cultura starter trebuie să conțină numai microorganismele dorite, într-o concentrație corespunzătoare de celule (maximă, uniformă) cu un raport optim între celule în cazul culturilor mixte, să cuprindă celule vii, active (la sfârșitul fazei exponențiale de creștere) în momentul utilizării în calitate de inocul și dacă este necesar, să prezinte o rezistență adecvată la unele condiții nefavorabile.
In scopul menținerii uniformității culturilor de producție în practica industrială se folosesc metode standardizate de preparare și sterilizare a mediului de cultură, cu menținerea temperaturii și duratei de termostatare la inoculare. Regimul de cultivare este specific, dar de obicei temperatura este apropiată cu temperatura optimă pentru creștere, iar durata de cultivare este astfel stabilită încât cultura să fie gata, atunci când este necesară. (Dacă acest lucru nu este posibil se recomandă păstrarea la rece pentru a opri evoluția culturii).
Culturile mixte utilizate mai ales la fabricarea produselor lactate acide și a brânzeturilor se obțin prin cultivarea concomitentă, dar în acest caz speciile trebuie să fie compatibile, sau aceste se cultivă separat și se amestecă în momentul inoculării, când se menține mai bine echilibrul numeric între speciile componente ale culturii mixte.
In industria alimentară se folosesc următoarele tipuri de culturi starter:
■Culturi de bacterii – bacterii lactice, bacterii propionice, bacterii acetice;
■Culturi de drojdii la fabricarea berii, a pâinii, spirtului, vinurilor;
■Culturi de mucegaiuri la fabricarea brânzeturilor, a salamurilor crude. Aspectele microbiologice privind calitatea culturilor starter vor fi discutate în
cadrul proceselor biotehnologice specifice diverselor produse alimentare.
Microbiota nespecifică. Particularități ale microorganismelor contaminante
Include microorganismele care ajung în organe si țesuturi ale organismelor vii, în cazul îmbolnăvirii sau distrugerii funcțiilor de barieră, în condiții de traume, înfometare, supraîncălzire/suprarăcire a acestora. Când nu se păstrează condițiile sanitare în etapa de pregătire, prelucrare, transport și păstrare este posibilă o contaminare secundară, directă sau indirectă, cu microorganisme din diferitele habitaturi naturale ce reprezintă surse naturale de microorganisme (sol, ape, aer, omul, animale, insecte).
Microbiota nespecifică poate fi reprezentată de microorganisme organotrofe (saprofite) si microorganisme patogene.
Microorganismele contaminante pot fi grupate, în funcție de proprietățile și acțiunea lor asupra alimentelor, astfel:
Microorganisme organotrofe (saprofite)
Sunt foarte răspândite în natură și produc alterări ale alimentelor când se află în număr mare, ca rezultat al acțiunii lor asupra compușilor organici din aliment. Microorganismele care produc alterarea produselor alimentare au mai ales activitate proteolitică și lipolitică. Contaminarea produselor alimentare și înmulțirea microorganismelor în produse este nedorită deoarece ele scad valoarea nutritivă și biologică încât în unele cazuri fac imposibilă folosirea produsului în nutriție. Alături de modificarea însușirilor senzoriale, aceste microorganisme pot produce compuși toxici.
Microorganismele saprofite prezente în produse pot condiționa într-o serie de cazuri dezvoltarea unor procese biochimice obligatorii și deci să condiționeze calitatea alimentelor. In acest caz, ele devin specifice pentru microbiota dată a produsului, de exemplu – bacteriile factice. Având însușiri antagoniste în raport cu alte microorganisme, acestea, adesea, asigură conservarea produselor alimentare și consumul este lipsit de pericol epidemiologie.
Alterarea microbiană.
Garanția microbiologică a alimentului este guvernată de un control riguros al echilibrului între condițiile oferite de aliment și mediu, procesare și gradul de contaminare.
Pentru ca alterarea microbiană să aibă loc este necesar ca în primul rând să existe condiții favorizante, nutritive și ambientale, care să permită creșterea microorganismelor și în al doilea rând, ca microorganismele vii aflate în/pe aliment să crească în condițiile oferite de acesta. Inițierea alterării este dependentă atât de numărul cât și de natura microorganismelor contaminante. După contaminare, microorganismele își adaptează metabolismul la mediul oferit de aliment și după faza lag, trec în faza exponențială de creștere. Cunoașterea acestor procese permite extinderea vieții sigure a alimentului dacă contaminarea inițială este controlată prin asigurarea unei prelucrări corespunzătoare.
Creșterea microorganismelor este afectată și controlată prin anumiți factori ecologici care pot fi divizați în grupul factorilor intrinseci uneori greu de controlat: compoziția chimică, indicele de activitate al apei sau umiditatea relativă de echilibru, pH-ul și capacitatea tampon, potențialul de oxido-reducere, structura biologică și prezența unor constituienți antimicrobieni. Factorii extrinseci mai ușor controlabili, includ temperatura de păstrare și durata de păstrare, efectele unor procese asupra aw prin sărare, afumare sau uscare, variația de pH, tratarea cu radiații, adăugarea de C02 (de exemplu la ambalarea în atmosferă controlată), sau adaos de conservanți. Supraviețuirea și creșterea atât a agenților de alterare cât și cea a patogenilor este influențată de acești factori.
Alimentele perisabile sunt în primul rând cele cu compoziție chimică complexă și un conținut ridicat de apă, ca de exemplu: carnea, peștele, produsele lactate, vegetale, fructe. Dintre acestea produsele de origine animală au un pH apropiat de neutru, conțin cantitati mari de proteine si lipide si sunt conservate la temperaturi scazute. Aceste condiții favorizează creșterea bacteriilor Gram negative cu specii ale genului Pseudomo-nas, Acinetobacter (Moraxella) care prin activitatea lor proteolitică și lipolitică dau produși de alterare cu miros și gust putrid.
Vegetalele proaspete conțin o cantitate mare de glucide și mai puține proteine. Deși au un pH neutru se caracterizează prin capacitatea de protecție dată de înveliș, față de activitatea microbiană. Din acest motiv alterarea predominantă constă în putrezirea umedă cu înmuierea țesutului ca urmare a activității pectolitice a mucegaiurilor și a unor drojdii. Alterarea fructelor coapte este dată de mucegaiuri.
Tehnologiile folosite în păstrarea alimentelor au drept scop distrugerea sau inhibarea creșterii microorganismelor de alterare și a celor care dau îmbolnăviri sau se caracterizează prin producerea de toxine. Astfel: tratamentele termice, sărarea, uscarea și congelarea alimentelor reprezintă căi de inhibare a microbiotei naturale sau a unor contaminanți introduși prin manipulare și procesare.
Prin păstrarea la rece a alimentelor este întârziată creșterea majorității bacteriilor producătoare de toxine cu excepția celor din genul Listeria și Tersinia, în schimb alterarea continuă cu o rată foarte redusă. Cea mai bună extindere a duratei de viață a alimentelor este realizată la cea mai scăzută temperatură la care nu se produc prejudicii în structura alimentului. La temperaturi sub -8°C creșterea microbiană este oprită și alimentele păstrate prin congelare nu se alterează microbiologic. Dar enzimele microbiene pot rămâne active la aceste temperaturi și alimentele congelate, care conțin un număr mare de microorganisme, dezvoltă în timp un miros neplăcut întâlnit mai ales la alimente cu conținut ridicat în lipide. In alimentele acide cu pH de aproximativ 4,5 au condiții de dezvoltare mai ales drojdiile și mucegaiurile, ce dau alterarea când concentrația de zahăr sau sare este prea mare pentru a permite creșterea bacteriilor.
In alimentele tratate termic majoritatea patogenilor sunt distruși și pot supraviețui doar sporii bacterieni și forme vegetative termodurice. In mod obligatoriu se previne contaminarea după ce a avut loc tratamentul termic, deoarece patogenii ar putea avea acces prin ambalaj și pentru că bacteriile de alterare au fost distruse, aceștia pot crește fară să dea alterarea senzorială a produsului încât alimentele devin riscante în consum, (nu avertizează consumatorul de pericol potențial).
Din grupul alimentelor stabile în condiții normale de păstrare fac parte alimentele conservate și ambalate aseptic. In urma tratamentului termic se obține o sterilizare comercială termen care semnifică distrugerea tuturor microorganismelor capabile de creștere în aliment. In cazul în care rămân supraviețuitori aceștia în general nu prezintă un pericol. In alimentele cu aciditate redusă se aplică o formulă de sterilizare care să asigure reducerea numărului de spori de Clostridium botulinum cu un factor de 10-12. Pentru alte alimente: cereale, orez nuci/alune, aw, compoziția și structura anatomică sunt importante pentru conservabilitatea produselor. în general creșterea microbiană nu poate avea loc la aw mai mic sau egal cu 0,6, cu o stabilitate de 1 an la valori de 0,7 și egală cu 6 luni la valori mai mari de 0,75, încât la valori peste 0,78 este probabilă alterarea rapidă.
Mucegaiurile pot cauza alterarea cerealelor când umiditatea migrează datorită diferențelor de temperaturi și odată inițiată germinarea sporilor și creșterea hifală, alterarea poate fi totală datorată creșterii stimulate prin mărirea umidității boabelor rezultata din activitatea metabolica a mucegaiurilor.
Alterarea microbiană a alimentelor este un proces competitiv între bacterii, drojdii și mucegaiuri printre care, drojdiile joacă un rol neînsemnat deoarece ele constituie un procent redus din populația inițială, (cresc mai lent comparativ cu majoritatea bacteriilor, iar creșterea lor poate fi limitată de substanțe rezultate din metabolismul bacterian). Astfel, condițiile care le favorizează creșterea includ un număr inițial scăzut de bacterii comparativ cu cel al drojdiilor, sau condiții restrictive pentru bacterii… (Walker H.W, 1977)
Microorganismele de alterare făcând parte din microbiota nespecifică ocazional spontană sunt întotdeauna prezente pe alimente neprocesate; patogenii pot fi prezenți pe materii prime proaspăt recoltate sau pot fi contaminanți ai mediului ambiant, în orice stadiu, în timpul manipulării sau procesării. Supraviețuirea patogenilor și creșterea sau producerea de toxine în aliment va depinde de factorii menționați, de competiția pentru nutrienți în ecosistemul reprezentat de aliment și de fiziologia lor. (Zeuthen P. et al., 1990).
Grupul microorganismelor de alterare include bacterii, drojdii și mucegaiuri care dau modificări nedorite ale calităților senzoriale și nutritive ale alimentului (modificări de aromă, miros, gust, culoare, textură, consistență).
In funcție de caracterele lor se pot distinge:
♦Microorganisme psihrotrofe care cresc relativ rapid în domeniul temperaturilor comerciale de refrigerare, ca de ex. specii ale genurilor Pseudomonas, Psychrobacter, Achromobacter, Flavobacterium ș\Alcaligenes. Când bacteriile psihrotrofe se află în număr mare produc deprecierea și defecte fizice în alimente. Prezența în număr mare în alimentele refrigerate cum ar fi produse lactate, carne ș.a reflectă că a avut loc o creștere a populației inițiale în timpul păstrării sau o contaminare masivă înainte sau în timpul păstrării la rece.
♦Microorganismele termodurice, sunt organisme care supravețuiesc într-o mare măsură, la tratamente la cald. Cele termofile pot să reziste la astfel de tratamente și să crească la temperaturi ridicate. Bacteriile termodurice prezintă interes în indusnia laptelui deoarece pot supraviețui la pasteurizare. Cuprind specii din genurile: Micrococcus, En-terococcus, Lactobacillus, Bacillus și Clostridium.
♦Microorganisme lipolitice produc degradarea oxidativă și hidrolitică a lipidelor din smântână, unt, margarina ș.a. Din acest grup fac parte bacterii din genurile Pseudomo¬nas, Bacillus și Staphylococcus, mucegaiuri ale genurilor Rhizopus, Aspergillus și Penicil-lium; dintre drojdii, genurile Candida, Rhodotorula și Hansenula conțin multe specii cu activitate lipazică.
♦Microorganisme proteolitice produc prin hidroliza protidelor substanțe ce dau alterarea alimentelor. Speciile proteolitice aparțin genurilor: Bacillus, Clostridium, Pseudomonas și Proteus ș.a. Dintre bacteriile de putrefacție Enterococcus faecalis poate produce după proteoliză o fermentație acidă. Bacteriile de putrefacție degradează alimentele bogate în proteine din care, prin acest proces, se pot acumula substanțe toxice (amine biogene). Aminele produc și modificări de gust și miros, ceea ce avertizează consumatorul de prezența produșilor de putrefacție. Histamina însă este lipsită de gust și miros, astfel încât este posibilă consumarea produselor și îmbolnăvirea. Histamina este produsă prin acțiunea lui Achromobacter histaminicus în produsele de carne. Bacterii din genul Proteus pot să producă nitrozamine (β nitrozodimetilamina cu efect cancerigen) si alti compuși ca metilmercaptan, dimetilsulfuri, cu efect toxic).
♦Microorganisme halofile necesită pentru creștere cantități mici de sare: 2-5% (slab halofili), 5-20% (moderat halofili) și 20-30% (extrem halofili). Sunt considerate microorganisme halotolerante cele care sunt capabile să crească în medii cu peste 5% sare și dintre acestea unele pot fi implicate în alterare sau pot fi patogene ca de exemplu Staphylococcus aureus și Clostridium perfringens. Bacteriile slab halofile au biotopul în apa mărilor și oceanelor. Dintre acestea fac parte bacterii psihrotrofe din genurile Pseudomonas, Momxella, Acinetobacter șiFlavobactmum care contribuie la alterarea cărnii de pește. Majoritatea moderat halofîlelor sunt implicate în alterarea alimentelor sărate, sunt specii Gram pozitive și aparțin familiei Bacillacceae șiMicrococcaceae. Extrem halofilii cresc greu și pot produce pigmentarea în roșu a peștelui sărat, a baconului și aparțin genurilor Halobacterium șiHalococcus. Dintre drojdii sunt halotolerante specii ale genului Debaryomyces.
♦Microorganisme osmofile sunt întâlnite frecvent în grupul drojdiilor care pot crește în soluții concentrate de zahăr și pot cauza alterări ale mierii, gemurilor, melasei, siropurilor, sucurilor concentrate de fructe ș.a și aparțin genului Zygosaccharomyces.
♦Microorganisme pectinolitice degradează substanțele pectice din fructe, legume și reduc capacitatea de gelificare sau cauzează înmuierea fructelor în timpul păstrării. Speciile pectinolitice includ bacterii din genurile: Achromobacter, Aeromonas, Arthrobactcr, Bacillus, Enterobacter, Erwinia, drojdii și numeroase specii de mucegaiuri.
♦Microorganisme acidogene sunt microorganisme care produc prin fermentare acizi și dau alterare prin acrirea în exces a alimentelor. Cel mai important grup aparține bacteriilor lactice cu specii aparținând genurilor: Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus și Leuconostoc. Pot produce acizi, specii ale bacteriilor sporogene aparținând genurilor Bacillus și Clostridium. Alte bacterii care dau acrirea vinului, a berii, aparțin genului Acetobacter. Mai pot produce acizii citric, oxalic ș.a., unele specii de mucegaiuri.
♦Bacterii sporogene agenți de alterare a conservelor. La controlul microbio¬logic al conservelor sunt determinate următoarele grupe de bacterii:
-Aerobi mezofili, specii ale genului Bacillus care cresc la 35°C, iar creșterea este absentă la 55°C. Dau alterarea plat acidă a conservelor cu pH>4,6. Endosporii au o termorezistență moderată.
-Anaerobi mezofili sunt bacterii anaerobe de putrefacție care pot descompune protide, peptide, aminoacizi, cu formarea produșilor finali: hidrogen sulfurat, metil si etil sulfuri, mercaptani, amoniac, indol. Cresc într-un domeniu de temperaturi între 10°…50°C, cresc rapid în conserve cu aciditate redusă (pH=6…7). Din grup fac parte specii ale genului Clostridium (C. sporogencs, C. bifermentans, C. putrefaciens, C. histolyticum). Dezvoltarea acestora este un indiciu al contaminării ingredientelor și o stare igienică necorespunzătoare a echipamentului.
Prin analiza microbiologică se mai pot determina:
-Bacterii sporogene, agenți ai acririi conservelor fără bombaj, cu specia Bacillus coagulans izolat din pastă și suc de roșii, de asemenea din smântână, lapte concentrat.
-Bacterii sporogene termofile facultativ aerobe care se dezvoltă în alimente conservate cu aciditate mică fermentând glucidele, produc acizi care dau acrirea și cantități mici de gaze care nu dau bombajul evident al recipientului. Se dezvoltă numai dacă produsele conservate sunt meținute în domeniul optim pentru termofile. Specia reprezentativa este Bacillus stearotherophillus.
-Bacteriile termofîle strict anaerobe produc fermentarea glucidelor cu eliberarea unor cantități mari de gaze și acizi prin fermentarea glucidelor. Nu produc hidrogen sulfurat au temperatura optimă pentru creșterea la 55°C. Produc alterarea cu bombaj a conservelor (Clostridium thermosaccharolyticum).
-Bacterii sporogene de alterare cu înnegrirea produsului. Alterarea este dato¬rată creșterii bacteriilor din genul Clostridium, cu specia Clostridium nigrificans, ca urmare a reacției între sulfuri și fierul solubilizat din ambalajul metalic. (Refai M.K., 1979).
In concluzie, microorganismele componente ale microbiotei nespecifice, contaminante, pot fi grupate, în funcție de activitatea lor metabolică si efectul lor asupra calității nutritive și sanitare a alimentului (Tab.3.2)
Tab.3.2
Gruparea microorganismelor care dau alterari ale calitatii alimentelor
Microorganisme agenți ai intoxicațiilor alimentare.
îmbolnăvirea este cauzată prin consum de alimente în/pe care s-au dezvoltat microorganisme care elaborează metaboliți cu efect toxic. Perioada de incubație și simptomele evidențiate prin investigații pot fi corelate cu alimentul ingerat (în special pentru bacterii).
♦Mucegaiurile toxicogene
Produc intoxicații denumite micotoxicoze cu o perioadă de incubare prelungită încât este dificilă asocierea îmbolnăvirii, cu alimentul incriminat. Mucegaiurile pot forma colonii la suprafața produsului și în etapa de creștere colonială, o dată cu apariția sporilor, pot să sintetizeze produși secundari de metabolism de natură hidrocarbonată cu o toxicitate deosebit de ridicată. Omul și animalele pot să sufere intoxicații prin consum de alimente mucegăite, intoxicații care se manifestă prin îmbolnăviri ale diferitelor organe (ficat, rinichi ș.a). Dintre bolile produse prin consum involuntar de micotoxine fac parte: ergotismul, aleucie toxică alimentară (ATA), hepatocarcinogeneza, nefrotoxicoze, simdromul hemoragie, poliurie, ș.a.
Micotoxicozele nu sunt transmisibile și apariția sau gravitatea lor este în funcție de natura micotoxinei și doza ingerată. Micotoxinele fungice au o toxicitate ridicată și concentrația maximă admisă pentru produse mucegăite, pentru a fi acceptate în consum, este foarte redusă (CMA = 5-30 μg.kg-1 produs alimentar). Majoritatea micotoxinelor acționează prin inhibarea acțiunii enzimelor implicate în sinteza de proteine, pot pro¬duce modificări în structura acizilor nucleici și efectul se manifestă printr-o înmulțire anarhică a celulelor cu apariția tumorilor maligne. Deoarece aceste micotoxine nu conțin azot în moleculă, ele nu pot fi inactivate pe cale termică, fiind deosebit de termostabile. Sunt rezistente la acțiunea factorilor de mediu, se oxidează foarte greu și efectul lor se poate manifesta ani de zile. Același mucegai poate să producă mai multe tipuri de micotoxine și aceeași micotoxină poate fi produsă de mai multe specii sau genuri. Nu se cunosc metode eficiente pentru eliminarea totală a micotoxinelor din alimente. Calea unică pentru evitarea formării lor este prevenirea dezvoltării mucegaiurilor pe alimente. Deși nu toate mucegaiurile produc micotoxine, este recomandat a nu se consuma produse mucegăite pentru eliminarea riscului de intoxicație.
Produc micotoxine specii aparținând următoarelor genuri:
-Genul Aspergillus : Reprezentanții genului produc aflatoxine denumite astfel de la specia Aspergillus flavus; se cunosc 12 aflatoxine dintre care cele mai toxice sunt: B1, B2, G1, G2. Inițialele provin de la fluorescenta pe care o dau aceste toxine prin expunerea plăcii cromatografice la radiații UV cu λ = 360 nm (blue = albastru, green=verde), în timp ce numerele se referă la ordinea de migrare pe cromatogramă. Aflatoxinele Ml, M2 cu toxicitate mai redusă, pot fi detectate în laptele provenit de la animalele hrănite cu furaje (mucegăite cu specii toxicogene).
Mai produc aflatoxine unele tulpini ale speciilor: Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus Aspergillus wenti. Aflatoxinele au efect toxicogen asupra animalelor și produc ciroze în 3 săptămâni de la ingerarea acestora cu 1 mg/kg corp. încălzirea la 120°C, timp de 4 h, nu distruge în totalitate aceste micotoxine. Aflatoxinele nu sunt solubile în apă, ci în solvenți organici, dar aceștia nu pot fi folosiți pentru îndepărtarea micotoxinelor deoarece prin extracție se pierde valoarea alimentară a produsului.
Alte micotoxine, sterigmatocistine, produse de Aspergillus versicolor, A.nidulans, A. rugulosum, pot avea acțiune cancerigenă; ochratoxine, elaborate dc A.ochmceus dau îmbolnăviri la nivelul rinichilor, clavacina, produsă de, Aspergillus clavatus au o toxicitate mai redusă. Alte micotoxine produse de specii ale genului Aspergillus cu o toxicitate mai mică sunt: fumagilina, gliotoxina și acidul helvolic produse de A. fumigatus, acidul terreic, teracina și flavipirina (A.terreus), candidulina, acidul kojic (A.candidum) și nidulina (A.nidulans).
-Genul Penicillium – Specii ale genului pot produce peste 60 de toxine mai ales când se dezvoltă pe cereale și furaje. Dintre speciile producătoare fac parte: P. islandicum care se dezvoltă pe orez și produce 2 micotoxine: islanditoxina și luteoskirina. Pe fructe, se dezvoltă P.expansum care produce putrezirea albastră și sticloasă a merelor și sintetizează patulina. Se poate dezvolta pe cereale si produse de panificatie. Patulina este rezistentă la temperaturi ridicate, la pH acid și are efect cancerigen. Dacă sucul de fructe este supus fermentației, o parte din toxină se elimină din lichidul fermentat. Experimentări de tratare termică a toxinei pure în soluții cu valori diferite de pH, demonstrează că timpul necesar pentru distrugerea patulinei la 105°-125°C este mai mare în soluții cu pH 3,5 decât la 5,5. Diferite produse ce conțin grupări SH ca cisteina și glutationul au efect protector asupra inactivării termice a micotoxinei.
Alte specii: P. citrinum – produce citrinina pe orez decorticat, cauzând afecțiuni renale; P. citreoviridae – citreoviridina, toxină ce produce la om dereglări nervoase, simptome cardiace similare cu cele întâlnite în boala beri-beri; P. cyclopium – întâlnit pe cereale și legume produce acidul ciclopiazonic care poate cauza paralizia și moartea păsărilor ce au consumat porumb mucegăit. P. rubrum produce rubratoxina B cu acțiune sinergică cu aflatoxinele. P. viridicatum se dezvoltă pe orz și orez producând o micotoxină ce determină o degenerare a celulelor renale.
-Genul Fusarium – produce trichothecene care pot fi sintetizate și la temperaturi scăzute, deosebit de rezistente în timp (mucegaiurile pot să moară dar toxina rezistă ani de zile). Specii toxicogene: F. sporotrichoides produce sporofusariogenina producătoare de ATA ce se manifestă prin apariția pe piele a unor pete specifice, anghina pectorală, diateze hemoragice, afecțiuni ale măduvii, dând simptome similare cu cele produse prin iradiere cu radiații ionizante sau otrăvirea cu benzen.
Producerea sporofusariogeninei este mai intensă la temperaturi scăzute în domeniul temperaturilor 0…-10°C. Aceeași toxină este elaborată de F. poae și F tricinctum.
F. nivali se dezvoltă în special pe cereale și produce trei tipuri de toxine: fusarenoma, fusarenoma X și nivalenolul, toxine care determină în organismul animal o proliferare anarhică a celulelor, hematopoeză și simptome similare ATA (aleukie toxică alimentară).
F. graminearum produce zearolenona care în concentrație de 1 mg/kilocorp produce în 48 de ore o vulvovaginită specifică.
-Genul Rhizopus – specii ale genului produc micotoxine ce dau stări de oboseală și poliurie.
-Genul Cladosporium poate produce la temperaturi scăzute toxine de tipul acizilor tricarboxilici nesaturați care dau simptome caracteristice ATA. Astfel CI. epiphilum produce acidul epicladosporic și CI. fagi acidul fagicladosporic.
-Claviceps purpurea produce scleroți ce conțin alcaloizi printre care ergotinina, ergotoxina și ergotamina și care produc o acțiune vasoconstrictoare, contractarea mușchilor netezi.
Pe nutrețuri, cereale, porumb și furaje se mai pot întâlni mucegaiuri toxicogene ca Ustilago, Stachybotris, Wahmia, Dendrodochium toxicum ș.a. Consumul de furaje contaminate cu mucegaiuri toxicogene poate cauza moartea animalelor (cazuri mai frecvent întâlnite la oi și cai), iar dacă animalul nu a ingerat doza letală, micotoxinele se acumulează în diverse țesuturi/organe, sau se pot elimina prin lapte, iar în cazul păsărilor, prin ouă.
♦Bacterii toxicogene.
Dintre agenții bacterieni ai intoxicațiilor prin alimente contaminate fac parte urmatoarele specii:
Clostridium botulinum este un saprofit care crește rar în organisme vii, capabil de a produce toxine prin creșterea în alimente. Este o bacterie sporogenă cu habitatul în sol, Gram pozitivă, anaerobă, cu dimensiuni de (3-8)x(0,5-0,8) fim cu capete rotunjite. Nu fermentează lactoza, produce H2S și lichefierea gelatinei. Nu reduce nitrații și nu produce indol. Produce 8 toxine de natură proteică diferențiate din punct de vedere imunologic. Tulpinile producătoare de neurotoxine A,B,E, dau botulismul la om și produc sindrom neuroparalitic cu efect letal. Manifestarea stării de boală are loc după 1-10 zile și cazurile letale ajung până la 68% . După ingerarea toxinei botulinice după 8-36 ore apar stări de vomă, dureri abdominale și diaree, apoi starea de uscăciune în gură, dilatarea pupilelor, viziune dublată, dificultăți respiratorii, căderea mușchilor faciali, paralizia mușchilor ce funcționează reflex, iar moartea este datorată asfixierii, stopului cardiac, infecțiilor pulmonare. Toxinele botulinice au o toxicitate ridicată (o doză de 0,2 μg poate omorî un om de 100 kg).
Clostridium botulinum poate produce toxina E sub formă de pretoxine – un complex netoxic care este protejat față de procesele digestive și astfel intră în circuitul sangvin. Ingerate oral sunt absorbite în intestinul superior, sunt transportate în sistemul limfatic unde pretoxinele sunt hidrolizate în derivate proteice toxice, acestea sunt transportate prin sânge și produc blocajul sinaptic, favorizând eliberarea acetil colinei din nervii periferici. Toxinele de tip C și D dau îmbolnăviri la păsări si alte mamifere.
Prin studiul unui număr de 1700 cazuri în USA, 17,8% s-au datorat consumului de vegetale (fasole verde, spanac, ciuperci), fructe 4,1%; pește, 3,6%; condimente, 2,2%; preparate din carne 0,8%, produse lactate 0,5% si pui 0,1%. Intoxicația se produce mai ales prin consum de pește și conserve de pește, conserve vegetale, insuficient sterilizate. Aceasta se explică prin faptul că bacteriile sub formă de spori sunt inactivate la 120°C după 4-10 min, în timp ce la fierbere (100°C) sunt necesare 6 h pentru inactivarea lor termică. Dacă sterilizarea nu este suficientă la pregătirea conservelor, endosperii supraviețuitori ai tratamentului termic pot germina la păstrare si în stare activă de creștere, produc toxine.
Prin dezvoltarea lui C. botulinum, carnea și alte alimente bogate în proteine, vegetalele cu aciditate scăzută, capătă un miros alterat sau se formează gaze prin procese de fermentație, aspect care însă nu poate fi sesizat în alimente cu aciditate mai ridicată sau cu un conținut redus în proteine. Producerea toxinelor este oprită în alimente cu pH<4,5, iar în condiții optime de cultură este inhibat la concentrații de 8%-10% NaCl.
Tulpini non-proteolitice tip E au un minim de creștere la temperatura 3,3°C când pot produce toxine lent, în 4…6 săptămâni și prezintă risc la conservarea produselor refrigerate, mai ales a peștelui și a moluștelor. Deoarece creșterea acestor bacterii și formarea toxinelor poate avea loc la temperauiri scăzute, se iau măsuri stricte de precauție pentru a preveni contaminarea și creșterea în produs înainte de consum, în special la produsele care nu suferă în prealabil un tratament termic. Deși C. botulinum este un anaerob, pentru creștere nu este obligatorie absența oxigenului. Toxinele pot rezista in mediu acid, la rece, în schimb sunt termolabile și pot fi inactivate prin încălzire la 80°C, în timp de 5-60 de minute, sau prin fierbere câteva minute, încât încălzirea adecvată a alimentelor conservate, a mâncărurilor înainte de ingestie poate preveni botulismul.
C. botulinum poate fi inhibat prin adăugarea de săruri, asociate cu păstrarea de temperaturi scăzute. In special sunt eficienți nitriții dar prezența acestora în alimente poate fi asociată cu producerea potențială a nitrozaminelor cancerigene, încât orice reducere a conținutului în nitriți trebuie să fie echilibrată în raport cu creșterea riscului de botulism. Concentrația în nitriți necesară pentru inhibarea lui C. botulinum crește cu mărirea temperaturii încât acest fapt reduce siguranța în consum (Zeuthen I, 1990)
Staphylococcus aureus este agentul specific responsabil pentru enterointoxicații. Prezintă forma sferică cu diametrul celulei de 0,5-1,5 fim, Gram pozitiv, în perechi, tetrade sau ciorchini. Fermentează anaerob glucidele. Necesită pentru creștere acid nico-tinic și este favorizat de prezența tiaminei. Nu crește în medii sintetice sau în alimente lipsite de aminoacizi și proteine. In alimente bogate în proteine și lipsite de glucide crește aerob, iar prezența surselor de carbon favorizează creșterea anaerobă. S.aureus reduce inițial nitrații la nitriți și tolerează fără să aibă nevoie, NaCl în concentrații de 10-15% (Ayres, J.C.,1979). Crește în domeniul de temperaturi 6,6°C-45,5°C, posedă catalază, fosfatază și dezoxiribonuclează și rezistă la acțiunea litică a lizozimului. Produce intoxicații alimentare prin elaborarea de enteroxine foarte termostabile, cu rată redusă de letalitate și cu o perioadă scurtă de incubare chiar după 30 minute de la ingerare, în general după 3-6 ore. Se transmite de la indivizii purtători de tulpini enterotoxice la care rezidă ca saprofit în fosa nazală și se elimină prin secreții nazale și expectorație, fiind ejectat în picături, prin tuse și strănut. Se mai transmite în timpul fumatului când degetele ating buzele sau nasul, în timpul mâncatului, prin intermediul tacâmurilor. Este rezident de tranzit al pielii și părului și permanent în tractul intestinal, încât contaminarea este categoric datorată unei manipulări și procesări neigienice a alimentelor.
Intoxicațiile stafilococice sunt asociate cu consumul unor alimente gata preparate păstrate la temperatura camerei: creme, frișca, produse de patiserie, plăcintă de carne, ouă, șuncă, lapte de la animale bolnave, brânză, supe. Cu excepția laptelui și a brânzeturilor care pot fi contaminate de la animale bolnave de mastită, celelalte sunt contaminate prin intermediul omului. Specia Staph. aureus se dezvoltă și se înmulțește bine la 37°C într-un domeniu larg de pH (4,2-9,3) și în prezența unei concentrații de până la 15% sare. Toxinele pot fi elaborate după 3-6 ore de creștere a stafilococilor în produsul alimentar, iar starea de boală se manifestă la scurt timp după ingerare, având ca simptome stări de greață, vomă, crampe abdominale, stări de prostație și durează câteva ore până la zile. Riscul de intoxicație crește deoarece prin dezvoltarea acestor bacterii, nu apar în mod obligatoriu modificări de gust și miros ale alimentului chiar când numărul lor este de sute de milioane per gram.
Staphylococcus aureus poate produce enterotoxine A, B, C1,2 ,D, E, hemolizine, leucocidină, coagulaza. Dintre acestea, toxina A este un metabolit primar ce este produs în faza logaritmică de creștere într-un domeniu larg de pH. Este forma predominantă în înbolnăviri prin consum de alimente care sunt consumate atunci când stafilococii cresc activ. Toxinele B si C sunt elaborate in faza logaritmica tarzie, faza stationara de creștere, la pH neutru. Toxinele se produc mai rapid la 37°C, după aproximativ 3 zile la 20°C și după o perioadă mai lungă prin păstrare la temperaturi mai scăzute.
Metodologia modernă de analiză poate detecta concentrații de 1 μg.g-1 care echivalează cu o populație de 106-107 celule viabile, g-1. Enterotoxinele sunt simple proteine cu mase moleculare mici, de fapt lanțuri peptidice, solubile în apă și soluții de sare, rezistente la acțiunea enzimelor proteolitice. Activitatea enterotoxinei A scade la 50% după încălzirea la 60°C, 20 minute si mai puțin de 50% din toxina B a fost distrusă prin încălzire la 100°C, timp de 5 minute. Pentru a da simptomul toxic sunt necesare doze de 1-4 μg de toxină de tip A, sau 20-25 μg de tip B per gram de aliment. Sarea în concentrație de 2-3% inhibă elaborarea de toxină B în timp ce nitriții nu influențează toxicogeneza. Intoxicația stafilococică este aproape întotdeauna asociată cu alimente care au fost încălzite sau care nu au bacterii competitive care să interfere cu creșterea stafilococilor. Astfel, când alimentele se încălzesc, saprofiții se dezvoltă rapid la temperaturi de până la 20°C și inhibă stafllococii, ca rezultat al consumului de acid nicotinic factor esențial pentru Staphylococcus aureus (Ayres, J.C.1979).
Microorganisme patogene transmisibile prin alimente.
Bacterii agenți ai toxiinfecțiilor alimentare.
Bacteriile care produc toxiinfecții alimentare sunt patogene sau facultativ patogene. Ele se dezvoltă pe alimente fără a produce modificări senzoriale care să avertizeze consumatorul și produc îmbolnăviri la om atunci când gradul de contaminare al alimentului respectiv, este mare. Starea de boală apare în scurt timp de la ingerarea alimentului (2-12 h) și se caracterizează prin stări de vomă, diaree, dureri abdominale acute, care determină scăderea capacității de muncă a omului și in funcție de cantitatea de substanță toxică ingerată și de starea organismului, efectul poate fi letal. In general, starea de toxiinfecție poate dura câteva zile după care are loc vindecarea.
Dintre agenții toxiinfecțiilor alimentare, fac parte bacterii aparținând următoarelor genuri/specii:
– Salmonella, cuprinde specii ce sunt agenți importanți ai toxiinfecțiilor alimentare: Salmonella enteridis, S. dublin, S. virchow, S. typhymurium ș.a. Aproape toate alimentele pot fi contaminate în condiții neigienice de manipulare. Aceste bacterii se pot înmulți pe alimente, dar nu produc modificări senzoriale; sunt frecvent întâlnite în ouă proaspete, congelate sau sub formă de pulbere, în lapte praf, pe carnea de pui, cârnați, homari, scoici ș.a. Peste 40% din puii tăiați și comercializați pot fi contaminați cu bacterii. De la aceștia, indirect se pot contamina alte alimente în timpul păstrării sau preparării, încât este o cale majoră pentru Salmonella de a pătrunde în hrană. Toxinele sunt intracelulare, deci se formează și rămân în celula bacteriei. După consumul produsului are loc sub acțiunea HC1 din stomac distrugerea celulei bacteriene și eliminarea toxinei din celule. Cea mai frecvent întâlnită specie, S. enteridis este mai termorezistentă față de alte specii. In cazul fierberii ouălelor dacă gălbenușul a rămas fluid salmonelele pot supraviețui. Controlul infecțiilor cu salmonele este dificil deoarece ele pot creste la temperaturi scazute de 6oC, mor lent in timpul pastrarii alimentelor prin congelare, dar rezistă în produse uscate și pot fi eliminate din alimente numai prin tratament termic adecvat.
Deși bacteriile pot fi distruse ușor, au indicele de reducere decimală D60 = 2-5 minute, enterotoxinele sunt mai termostabile, astfel încât la 60°C sunt inactivate în 16h, iar la 80°C în 5-19 min. In gastroenterite bacteriile se multiplică în lumenul intestinal și sindromul este evident după incubare 12-14 (7-72) ore după consum.
-Shigella (Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. sonnei) sunt bacterii patogene de origine intestinală transmisibile prin apă, care nu cresc în alimente. Sunt bacterii Gram negative, imobile sub formă de bastonașe scurte, nu fermentează lactoza, sunt facultativ anaerobe si sunt inactivate la temperaturi mai mari de 47°C. Contaminarea accidentală a alimentelor (cu excreții ale indivizilor bolnavi de dezinterie) și ingestia unui număr de minimum 108 celule aparținând lui Sh. dysenteriae, după o incubare de 4-7 zile, ca urmare a producerii de exotoxine proteice cu activități citotoxice, neurotoxice și enterotoxice, au loc inflamații și ulcerații ale intestinului. Persoanele bolnave pot fi purtători ai bacteriilor parogene, timp de câteva săptămâni.
-Listeria monocytogenes produce rar listerioze (letalitate în 20-50% din cazuri) cu o perioadă de incubație de câteva săptămâni. Recent s-a stabilit că aceste bacterii foarte răspândite în apă, sol, plante, pot fi vehiculate prin alimente. Este o bacterie psihrotrofa și crește în alimente păstrate prin refrigerare (vegetale, lapte, brânză), alimente gata preparate, consumate după reîncălzire, în care produc listeriolizină. Este răspândită în mediul ambiant și a fost găsită în 5-10% din probele de alimente examinate iar eliminarea sa totală este dificilă; crește la temperaturi scăzute, necesită concentrații ridicate în săruri pentru inhibiție și crește în domeniu larg de pH (5-9). Este sensibilă la temperaturi ridicate și tratamentul la 70°C, timp de 2 minute este suficient pentru a reduce nivelul la limite lipsite de risc. Detectarea bacteriilor în alimente este dificilă și cele mai rapide metode durează minimum 4 zile. Bacterii din genul Listeria au fost găsite în lapte nepasteurizat, pește afumat la rece, în unele brânzeturi, în particular în Brie si Camembert. Pe vegetale pot crește după ce acestea au fost tăiate, în contact cu sucul celular. Se apreciază că 25% din cele aproximativ 1600 de cazuri depistate anual, pot avea efect letal. (Buazzi M., 1992)
-Escherichia coli poate prezenta tulpini oportunist patogene cu serotipuri enterotoxice – agenți ai enteritei infantile, enteropatogene, care se pot dezvolta pe epiteliul intestinal, verocytotoxice – produc colite hemoragice, (se transmit prin alimente și produc infecția chiar când numărul de celule este foarte redus) și serotipuri enteroinvazive asemănătoare toxonomic cu bacterii din genul Shigella dysenterie.
Enterotoxinele produse de E. coli sunt endotoxine legate ferm de peretele celular, pot fi proteine termolabile care se inactivează la 60°C în 30 de minute și se distrug complet la pH 3,5-5, rezistente la acțiunea tripsinei. Enterotoxinele termostabile cu masă moleculară redusă nu își pierd activitatea la 100°C, în timp de 2 minute și sunt rezistente la pH în domeniul 1-9, fiind inactivate la pH > 11. Majoritatea tulpinilor normal întâlnite în microbiota intestinală aparținând lui E. coli sunt lipsite de risc si pot fi folosite ca indicatori igienico-sanitari în controlul microbiologic al alimentelor. Pot contamina alimentele prin intermediul apei poluate cu materii fecale și supraviețuiesc, indiferent dacă alimentul e conservat prin frig.
-Proteus cuprinde bacterii Gram negative eliminate prin dejecțiile oamenilor sănătoși și care produc dezaminarea fenilalaninei până la acid fenil piruvic după 18-24 ore la 37°C. Observațiile ecologice evidențiază predominant specia Proteus mirabilis în fecale de bovine și Proteus vulgaris în reziduri rezultate în industria cărnii. In număr mare pot produce prin ingerarea alimentului contaminat toxiinfecții alimentare și gastroenterite.
-Tersinia enterocolitica produce enterite caracterizate prin diaree, febră și dureri abdominale (manifestări similare apendicitei), în special la copii. La bătrâni poate produce septicemii și complicații cum ar fi artrite, meningite, infecții la nivelul ficatului și inimii. Este o bacterie psihrotrofa, Gram negativă sub formă de bastonașe cu dimensiuni 1,2×0,6 μm, lactozo-negativă și poate crește și la temperaturi de 0-4°C; a fost izolată din lapte, smântână, înghețată, carne de porc, vită, pui și legume. T.pseudotuberculosis are virulența mai mare la temperaturi scăzute de cultivare. Răcirea rapidă a alimentelor și congelarea la -18°C exclude înmulțirea bacteriilor din g. Tersinia în carne. (Bodnariuk P., 1998)
-Vibrio parahemolyticus este o bacterie halofilă izolată din ape marine (zone tropicale). Se transmite prin scoici, crustacee, pește. După consumul produsului contaminat în care numărul de celule depășește 106.g-1, după o perioadă de 12-24 ore, toxiinfecția se manifestă prin diaree, asociată cu dureri abdominale acute. Este halotolerant și necesită sare pentru creștere; supraviețuiește în alimente refrigerate dar creșterea nu are loc la temperaturi sub 10°C.
-Vibrio eholerae poate produce holera și o diaree explozivă, cu efect letal în peste 40% cazuri dacă nu se aplică un tratament adecvat. Poate crește pe diferite alimente și se consideră că holera demarează ca o toxiinfecție alimentară.
-Aeromonas cuprinde bacterii ce sunt contaminanți comuni ai alimentelor cu aciditate redusă și aw ridicat, păstrate la temperatura camerei sau prin refrigerare. Produce cytotoxina și hemolizina dând stări diareice la copii. Au rol minor în toxiinfecții alimentare. Frecvența lor în carnea de pui ajunge la 80%, în carnea preparată până la 37% și 22% în salate. Speciile de interes, ce pot fi virulente sunt: Aeromonas hydrophyla, A. sorbia si A. cavia.
-Streptococcus (Enterococcus): S. faecalis, S. bovis, S. durans, provoacă posibile stări de toxiinfecție când concentrația bacteriilor în produs este de 106-107.g-1.
-Bacillus cereus și în ultimii ani, Bacillus lichenformis și Bacillus subtilis pot fi implicate în producerea de îmbolnăviri cu etiologie mixtă (intoxicație și infecție). Aceste bacterii pot produce sindrom emetic (grețuri, stări de vomă) observat după 1-5 ore după consum, frecvent prin consum de orez fiert/prăjit sau sindrom manifestat prin stări diareice după 8-16 ore, ca urmare a consumului de alimente reîncălzite, preparate cu boia de ardei sau alte condimente ce pot contine un numar mare de spori. B. cereus poate creste la temperaturi scazute de 10oC, dar se considera ca toxinele pot fi elaborate la temperaturi peste 15oC.
Tab.3.3.
Domeniul de temperatura pentru cresterea bacteriilor, germinarea sporilor si producerea toxinelor.
– Clostridium perfringens denumit anterior C. welchii se elimină prin materiile de dejecție ale omului și animalelor și prin nerespectarea condițiilor de igienă pot contamina alimentele, dar se poate transmite și prin sol, praf, ape, condimente ș.a. Creșterea lui pe produse (alimente cu carne gata preparate, insuficient tratate termic) este asociată cu formare de acid butiric și gaze; CI. perfringens tip C produce enterite necrotice. Poate produce mai multe tipuri de exotoxine, de tipul lecitinazei, care prin acțiune asupra lecitinei formează fosforilcolina, (cauza deranjamentelor intestinale), colagenază, hialuronidaza, dezoxiribonucleaza, hemolizine și substanțe necrozante. Din cele 8 tipuri de toxine tipul A și C sunt implicate în intoxicații alimentare și infecție. Este cunoscut prin capacitatea sa de a supravietui in mancaruri gatite (de carne, pui), care nu au fost păstrate la rece în mod corespunzător, deoarece majoritatea tulpinilor nu cresc sub 15°C și un număr redus de izolate au crescut la 6°C.
Unii spori rămân viabili după fierbere și prin păstrare la cald germinează și prin activitatea lor generează toxine. Timpul de generație în condiții optime de viață este de 9,5 minute. Creșterea este inițiată în timpul răcirii începând de la 43°C și continuă rapid până la răcirea completă. Pentru producerea stării de toxiinfecție este necesar un număr de celule mai mare de 106.g-1 și se manifestă după 1 oră de ingerare și e caracterizată prin diaree, crampe abdominale, mai rar dureri de cap, deshidratare și stare de prostație. După ingestia alimentului contaminat are loc multiplicarea bacteriilor în intestinul subțire, producerea de enterotoxine și eliberarea de toxine prin liza celulelor.
– Campylobacter sp. nu cresc în alimente la temperaturi sub 25°C și necesită condiții speciale de compoziție a aerului (5% oxigen, 10% dioxid de carbon) dar supraviețuiesc la temperaturi scăzute și produc contaminarea alimentelor conservate prin frig, frecvent a cărnii de pui. Apare în statistici recente,ca agent al intoxicațiilor alimentare în 50% dintre cele identificate în Anglia.
In calitate de agenți ai toxiinfecțiilor alimentare sunt vizate și genuri mai puțin studiate ca: Enterobacter, Citrobacter, Hafnia, Klebsiella, și altele, cărora în ultimii ani li se acordă o mare importanță. Mai sunt denumite și bacterii nonfecale fiind prezente pe produse vegetale, în ape, fiind constituienți normali ai microbiotei aerului, pe suprafețe, ambalaje, mâini, de pe care pot fi transferate la manipularea alimentelor.
Deoarece dezvoltarea bacteriilor este corelată cu temperatura, în tab.10.3 sunt prezentate valori de temperaturi la care este posibilă creșterea și elaborarea de toxine.
♦Microorganismele strict patogene
Nu se pot înmulți în alimente, dar pot fi transferate de la om și animale bolnave, prin ingerare de produse ocazional contaminate, la indivizii sănătoși, dând prin infecție după o perioadă de incubare și învingerea forțelor de apărare ale organismului, îmbolnăviri specifice. Răspândirea patogenilor poate fi oprită prin evitarea căilor de acces la aliment, fie prin tratamente care asigură distrugerea sau eliminarea lor.
Bacteriile agenți ai toxiinfecțiilor prin consum de alimente contaminate pot pătrunde în organism si pe cale sanguină devenind strict patogene producând boli ca: furunculoze și infecții cutanate (Staphylococcus aureus), colibaciloze (Escherichia coli), febra tifoidă sau febra enterică când infecția se face cu Salmonella typhi si Salmonella paratyphi. Febra tifoidă spre deosebire de salmoneloze epidemiologice este mai severă, infecția poate avea loc chiar prin ingerarea câtorva celule de către un adult pentru a se produce boala, caracterizată prin febră ridicată și ulcerații ale intestinului subțire, care conduc la peritonite. Perioada de incubare este de 7-21 zile când bacteriile trec prin sistemul limfatic infectând splina, ficatul și bila, care constituie un mediu excelent pentru creștere. Bolnavii pot elimina prin materii fecale bacterii vii timp de 12 săptămâni și chiar ani de zile, fiind astfel transportori ce pot prin manipulare să contamineze alimente ce sunt consumate de alți oameni.
In unele cazuri produsele obținute de la animale bolnave pot fi o sursă de infecție cu bacterii agenți ai tuberculozei(Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis), ai brucelozei (Brucella abortus, Brucella melitens), ai difteriei (Corynebacterium diphteriae), diareei infecțioasc (Campylobacter), antraxului (Bacillus anthracis).
♦Ricketsiile pot produce febra Q. Dintre acestea Coxiella burnetii se poate transmite prin lapte provenit de la vaci bolnave, are o termorezistență ridicată si poate supraviețui în produse insuficient pasteurizate.
♦Virusurile (enterovirusuri, adenovirusuri, rotavirusuri) pot produce gastroenterite, hepatite (Enterovirus 72 tip A), encefalite, poliomielita ș.a.
Virusurile nu se înmulțesc în alimente dar pot fi vehiculate prin intermediul acestora. Enterovirusurile au o termorezistență de o oră la 50°C, în timp ce virusurile Coxsackie rezistă la 70-80°C, timp de 30 minute, atunci când se află în lapte. Virusurile care dau hepatita A pot fi transmise prin manipularea neigienică a alimentelor sau prin consum de produse brute (insuficient tratate sau recoltate din ape contaminate).
Microorganismele patogene transmisibile prin alimente dau anual zeci de milioane de cazuri de îmbolnăviri intestinale. Pentru oamenii sănătoși disconfortul produs de diversele simptome (starea de voma, crampe abdominale și diaree) poate fi de scurtă durată, în schimb la oamenii cu imunitate slabă (cum ar fi cei bolnavi de SIDA) simptomele sunt mai severe, infecția este greu de tratat și poate avea efect letal.
Pentru siguranța alimentației este important de a lua toate precauțiile necesare pentru a minimaliza hazardul de a se produce infecții prin alimente contaminate deoarece se poate admite ca o regulă cardinală că "orice materie primă de origine animală ce poate fi folosită drept aliment trebuie să se admită "a priori" că este contaminată cu microorganisme periculoase. In nici un caz, decât asumându-se un risc ridicat, nu se va consuma lapte nepasteurizat sau produse crude sau insuficient tratate termic din: ouă, pui, pește, scoici sau carne .
Trebuie subliniat că, termenul general pentru îmbolnăviri ale omului, cauzate prin ingerarea de alimente contaminate, întâlnit în literatura de specialitate prin traducere din limba engleză (Food poisoning) este cel de toxiinfecție alimentară sau intoxicație alimentară.
Se recomandă o distincție între îmbolnăviri, în funcție de activitatea agenților microbieni care le cauzează, astfel:
■Infecția când alimentele sau apa acționează ca vehiculant sau ca transmițător de microorganisme patogene, care se înmulțesc în organisme vii.
■Intoxicația când microorganismele produc toxine în aliment (Staph. aurcus, botulism, micotoxinc).
■îmbolnăvire prin consum de alimente contaminate masiv cu microorganisme organotrofe, saprofite sau alte bacterii oportuniste, ex. (Clostridium perfingens)
■îmbolnăvire prin consum de. alimente ce conțin substanțe chimice cu efect toxic produse prin activitatea unor microorganisme, de exemplu histamina, amine biogene, nitriți (Frank K.H. 1989).
■Pentru acuratețea exprimării se recomandă folosirea termenului de contaminare atunci când microorganismele ajung din diferite surse, de exemplu: pe produse alimentare procesate (nevii).
■Termenul de infestare exprimă în mod corect contaminarea cu: insecte, larve, ouă, nematozi ș.a.
DISCUTII – CONSIDERATII GENERALE
CAPITOLUL 4
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL PRODUSELOR ALIMENTARE
Scopul controlului microbiologic al alimentelor este cel de a garanta siguranța igienei pentru consum. La obținerea produselor alimentare de calitate bună se urmărește păstrarea la nivelul minim cel mai scăzut al microorganismelor, din motive estetice, pentru siguranță în consum și prelungirea vieții produsului.
Prin control microbiologic se pune în evidență prezența, tipul de microorganisme și numărul lor prin metode microbiologice, precum și/sau compușii rezultați prin activitatea microbiană, prin metode chimice (cum ar fi determinarea acidității, a nitriților, diacetilului ș.a.).
4.1. Tehnici si metode de evaluare a microorganismelor
Analizele microbiologice trebuie să fie reproductibile, rapide, sensibile, specifice și convenabile ca cost și pot fi cantitative sau calitative. Complexitatea metodelor de evaluare este datorată diversității speciilor de microorganisme aflate în aceeași probă, stresului bacteriilor datorat tratamentelor tehnologice care le mărește faza de latența, uneori nivelului scăzut de contaminare și a duratei de timp necesară pentru creșterea microbiană (Leveau, J.Y. 1998).
Numărul de microorganisme în preparatele proaspete reflectă condițiile în care s-a obținut materia primă cât și condițiile de procesare, depozitare, manipulare s.a. Din punct de vedere teoretic dacă se ține seamă de faptul că țesutul vegetal și animal (intern al organismelor vii și sănătoase) este steril, există posibilitatea ca multe alimente să fie libere de microorganisme.
Se consideră că, cu mici excepții, este dificil a se cunoaște care este cel mai mic număr de microorganisme în condiții corespunzătoare de prelucrare, datorită numeroșilor factori de variație ce pot interveni. (Jay, 1992).
La examinarea microbiologică a alimentelor, atât de importantă pentru calitatea produselor, pentru determinarea numărului de microorganisme se cunosc metode de bază, dar fiecare dintre acestea prezintă anumite limite și nu reflectă numărul exact al celulelor existente în momentul analizei. Acestea sunt:
♦Metoda culturală standard de numărare a celulelor vii în plăci cu mediu adecvat (Standard plate count-SPC) este cea mai răspândită tehnică pentru numărarea celulelor vii sau a unităților formatoare de colonii (ufc) la determinarea numărului total de bacterii aerobe mezofile, numit impropriu, NTG (număr total de germeni). Trebuie menționat că o colonie nu se formează întotdeauna dintr-o singură celulă. Bacteriile pot fi în asociații, sub formă de lanțuri, de exemplu, care nu se desfac atunci când se pregătește proba și se execută diluțiile pentru analiză, de aceea este mai reală exprimarea în ufc.
Precizia rezultatelor, atunci când se determină celulele vii dintr-un produs alimentar este în funcție de următorii factori: metoda aplicată la recoltarea probei, distribuția microorganismelor în proba recoltată, natura microbiotei produsului, dacă mediul nutritiv folosit este adecvat pentru microorganismele prezente, timpul și durata de termostatare, pH, aw, tipul de diluant, numărul relativ de microorganisme în probă, relațiile posibile de antagonism. Deci, atunci când microbiota produsului este necunoscută, nu există metodă culturală precisă pentru determinarea numărului total de celule vii.
Numărul obținut pentru bacterii aerobe mezofile la cultivarea pe mediul TEGA (triptonă, extract de drojdie, glucoza agar) cu incubare la 30°C și exprimare în ufc.g-1 nu este corelat obligatoriu cu siguranța în consum a alimentului deoarece mulți patogeni nu cresc în aceste condiții culturale. Acesta poate fi ca un indicator al condițiilor stan¬dard de igienă și a controlului temperaturilor aplicate în tehnologie (la pasteurizare, sterilizare). Gradul relativ de precizie, ca și durata de 48 ore necesară pentru dezvoltarea coloniilor sunt compensate de posibilitatea de studiu microscopic, în scopul definirii naturii, izolării în culturi pure, a identificării microorganismelor formatoare de colonii. La numărarea coloniilor dezvoltate în plăci Petri standard (cu diametrul de 8-9 cm) se consideră util ca numărul de colonii pe placă să nu depășească 300 deoarece depășirea acestei concentrații presupune că datorită izoantagonismului microbian se reduce numărul real al coloniilor capabile să crească. Pentru reducerea erorilor statistice se recomandă să fie inoculate mai multe plăci din diluții succesive, se stabilește media aritmetică la plăcile aparținând celei mai mici diluții în care per placă se află mai puțin de 300 de colonii și se determină intervalul de încredere (p) de 95% cu relația:
unde: n este numărul de plăci din diluția aleasă;
X- media aritmetică a numărului de colonii din această diluție
nX- numarul total de colonii numarate in toate placile apartinand aceleasi dilutii.
♦Metoda de determinare a numărului cel mai probabil de microorganisme prin determinarea statistică a celulelor vii sau/și a produselor rezultate prin activitatea lor, este simplu de executat, dar consumă timp, medii, manoperă și nu este suficient de precisă. Inițiată de McCrady în 1915 mai este folosită pentru determinarea coliformilor totali și a celor fecali.
♦ Tehnici de reducere a coloranților (albastru de metilen, resazurina) care estimează numărul de celule vii care posedă capacitate reducătoare (reductaze active), deoarece timpul pentru reducerea colorantului și modificarea culorii este invers proporțională cu numărul microorganismelor vii. Metodele sunt simple, în schimb precizia este relativă, deoarece în mediu pot exista substanțe cu caracter reducător, iar microorganismele în funcție de natura și starea lor fiziologică, nu reduc cu o intensitate egală colorantul.
♦Metode microscopice directe de numărare pentru celule vii și moarte. Dintre cele mai frecvente sunt cele realizate cu camere de numărare (Thoma ș.a. pentru drojdii și spori de mucegaiuri), metoda Breed pentru bacterii lactice. Deși rapide, prezintă dezavantajul că se numără și celulele moarte, că se pot face erori datorită distribuției neuniforme a celulelor, sau prin confuzie, la numărarea unor particole din aliment.
♦Metode moderne de determinare a numărului total utilizează membrane filtrante, pentru analiza laptelui, apei ș.a. când filtrul reține bacterii, drojdii și mucegaiuri, se adaugă un colorant fluorescent, se spală excesul de colorant și prin microscopie în u.v. se face numărarea pe fond negru al microorganismelor cu fluorescentă. Metoda este cunoscută cu acronym DEFP (Direct Epifluorescent Filter Technique).
Pentru numărarea celulelor în medii lichide se mai pot folosi metode citometrice în flux continuu, sau determinarea unor compuși celulari specifici, prin determinarea de ATP (acidul adenozin trifosforic) a lipopoliglucidelor, a glucozaminei pentru evaluarea fungilor, a aflatoxinelor prin fluorescentă ș.a.
4.2. Indicatori ai calitatii microbiologice a alimentelor
Pentru a reflecta calitatea microbiologică a produselor alimentare în timpul fabricației, fie în timpul conservării, cât și pentru a asigura protecția față de microorganismele patogene transmisibile prin alimente se pot folosi microorganisme indicatori care trebuie să îndeplinească următoarele condiții:
-să fie prezente în toate alimentele a căror calitate este cercetată în vederea aprecierii;
-creșterea acestora și numărul lor trebuie să prezinte o corelație directă, negativă, cu calitatea produsului;
-să fie ușor și rapid detectate, ceea ce presupune ca acestea să se diferențieze de alte microorganisme prezente în produsul analizat, iar creșterea să nu fie influențată de alte microorganisme din microbiota alimentului.
Termenul de organism indicator poate fi aplicat oricărui grup taxonomic, fiziologic sau ecologic, a cărei prezență sau absență furnizează o evidență indirectă privind o caracteristică a modului de prelucrare, a istoriei probei (sursă, durată). Acest termen a fost introdus ca un marker, care să indice eventuala prezență a unor patogeni similari ecologic cu organismul indicator (index) (Harrigan W.F et al., 1991).
Organismele indicator sunt grupe (sau specii) bacteriene a căror prezență în alimente peste o anumită limită numerică se consideră a indica expunerea la astfel de condiții, care ar putea introduce organisme de hazard și/sau înmulțirea de specii patogene sau toxicogene. Acești indicatori au valoare în asigurarea atât a calității cât și a siguranței în consum a alimentului (fără risc de îmbolnăvire).
Interpretarea din punct de vedere igienic a prezenței în produse alimentare a unui grup sau altul de microorganisme este condiționată de prezența microorganismelor indicatori ai contaminării cu materii fecale, prezența și caracteristica unor microorganisme-indicatori tehnologici, rolul microorganismelor în formarea calității, influența cnzimelor eliberate de aceste microorganisme asupra compoziției și valorii biologice a produsului, posibilitatea lor de a produce toxiinfecții în anumite condiții date.
Indicatori ai calității biologice
Pot fi utilizați indicatori ai calității, microorganisme de alterare, care în urma creșterii în aliment duc la alterarea alimentului. Prezența lor poate fi detectată prin determinarea prin metode chimice a produselor lor de metabolism. Astfel se pot determina diamine (cadaverina, putresecina, histamina) în produse de carne. In sucul de portocale diacetilul produce modificări de aromă chiar la concentrații de 0,8 ppm si denotă ințierea alterării.
In conserve de somon, prezența alcoolului în concentrații mai mari de 75 ppm presupune alterarea (Jay, J. 1992).
Toți reprezentanții genului Protcus au proveniență fecală și deși se află în număr mai mic decât coliformii, pot avea valoare de indicator pentru evaluarea eficienței proceselor tehnologice fermentative (în brânză numărul crește în primele 48 ore de maturare și arc loc reducerea și moartea acestora după aprox. 25 zile), pentru aprecierea duratei și a condițiilor de păstrare a alimentelor (în carne tocată, păstrată la rece, se menține gradul inițial de contaminare, iar la temperatura camerei numărul lor a crescut la 105.g-1 după 24 ore și la valori 108.g-1 după 72 ore).
Indicatori ai siguranței alimentelor.
Se folosesc pentru a confirma siguranța în consum și gradul de inocuitate microbiană a alimentului. Microorganismele utilizate în acest scop trebuie să fie ușor de detectat, să se distingă de microorganisme însoțitoare, să prezinte o asociație constantă cu microorganismele patogene a căror nrezentă ar trebui să o poată indica, să persiste mai mult decât patogenii și drept condiție suplimentară să fie absenți, sau în număr minim, în alimente în care sunt absente microorganisme patogene.
Au rol de microorganisme indicatori igienico-sanitari următoarele grupe:
♦Bacteriile coliforme. Conform definiției ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate, oxidazo-negative, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot să se înmulțească în prezența sărurilor biliare (care inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor agenți cu proprietăți echivalente), capabile de a fermenta lactoza cu producere de acizi și gaze, în 48 ore la temperaturi de 35-37°C.
Pe baza acestei definiții, grupul coliformilor cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Entcrobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, CitrobPtcter freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter amalonatica
Din punct de vedere fiziologic și în funcție de sursă, coliformii pot fi divizați în:
-Coliformi fecali (CF) caracterizați prin creștere rapidă în 16 ore în mediu de bulion nutritiv, la 41°C și mai puțin activ la 44°C. Nu se înmulțesc la 44°C și sunt coliformi mezofili.
-Coliformi nonfecali (CNF) de origine acvatică sau telurică, se înmulțesc la 4°C in 2-4 zile, sunt incapabili să crească la 41°C sau la 44°C și sunt coliformi psihrotrofi. Astfel pentru testul de comportare la temperaturi ridicate, temperatura adecvată pentru separarea coliformilor și stabilirea sursei de contaminare a alimentelor este de 41°C (44°-44,5°C) deoarece la această temperatură timpul de generație este cel mai scăzut pentru coliformii fecali, în timp ce la coliformii nonfecali creșterea este absentă.
Escherichia coli este un indicator al poluării fecale (se elimină pe aceeași cale ca și bacteriile patogene de origine intestinală, prezente la indivizii bolnavi). Supraviețuiește un timp mai îndelungat în alimente cu pH acid, comparativ cu bacteriile patogene sau moare odată cu acestea în alte medii.
E. coli are un domeniu al temperaturilor de creștere între -2°… 50°C, la valori de pH 4,4… 9 se poate înmulți în ape, alimente.
♦Enterococii fecali. Includ speciile Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium sunt de origine fecală dar se găsesc și în microbiota naturală a vegetalelor, încât prezența lor în alimente nu are semnificație sanitară. Spre deosebire de coliformi nu se pot înmulți în apă și se caracterizează printr-o rezistență superioară la temperaturi negative, (deoarece numărul de enterococi nu se schimbă în timpul congelării) și prin supraviețuirea în alimente congelate.
Printr-un studiu comparativ, prin păstrarea la temperatura de -20°C timp de 1-3 luni, au supraviețuit 81% din enterococi și 75% din coliformi, iar după păstrarea timp de un an, gradul de supraviețuire a fost de 89% pentru enterococi și numai de 60% pentru coliformi. In timp ce Escherichia coli moare în alimente congelate după 2 luni, enterococii pot supraviețui peste 2 ani (Holod. T., 1988). Datorită acestei proprietăți, metoda de determinare a enterococilor fecali este recomandată în controlul microbio¬logic al produselor congelate și a produselor gata preparate, păstrate în stare congelată. Pentru cultivare se folosește bulion nutritiv glucozat cu 0,75% sare și adaos de azidă de sodiu 20 mg% care inhibă bacteriile însoțitoare și nu influențează dezvoltarea enterococilor. în unele norme se admit în alimente, până la 104-105 celule.g-1 și un titru mai mic de 0,1 g.
Bifidobacteriile. Pot fi folosite ca indicatori ai unei contaminări fecale recente, deoarece frecvența lor în materii fecale umane este de 10-100 ori mai mare decât a coliformilor si enterococilor. Se cunosc 25 specii; se prezintă sub formă de bastonașe imobile, au domeniul de temperaturi de creștere între 25°…45°C și de pH 5…8. Bifîdobacteriile sunt exclusiv de origine fecală, (mai pot fi întâlnite și la porci fiind absente la vite, păsări) și supraviețuiesc în aliment un timp mai scurt decât coliformii.
4.3. Aspecte legislative privind calitatea microbiologica a alimentelor
Fiecare țară are o legislație proprie ce constă în legi și reglementări care prevăd compoziția alimentelor, standarde și specificații microbiologice pe care trebuie să le îndeplinească alimentele pentru a avea calitatea corespunzătoare și pentru a prezenta siguranță în consum. Diferitele reglementări pot conține standarde și specificații microbiologice pentru alimentele ușor perisabile, măsuri igienico-sanitare ce trebuiesc luate la preparare, păstrare, distribuție, proceduri sau parametri de procesare (cum ar fi tratamentele termice), calificarea și educația celor care manipulează alimentele, inspectarea și controlul respectării acestora.
Standardele microbiologice sau specificațiile pentru unele produse alimentare trebuie să includă o prezentare a microorganismelor sau a toxinelor pe care acestea le-ar putea elabora, o descriere a metodologiei de recoltare a probelor destinate analizei microbiologice, limitele microbiologice, respectiv concentrația de microorganisme sau toxine per unitatea de produs, metode analitice precise ce trebuiesc folosite la recoltare, omogenizare, efectuarea diluțiilor, mediile de cultură, temperatură și timp de cultivare, interpretarea rezultatelor.
O deosebită importanță o are standardizarea metodelor de laborator pentru controlul microbiologic al produsului alimentar sau cel care se efectuează în diferite etape tehnologice de fabricare, păstrare, comercializare etc.
Incepând din 1962 este formată Comisia Internațională pentru Specificații Microbiologice pentru Alimente (ICMSF) în scopul stabilirii unui acord internațional de metodologii de laborator pentru a fi folosite la analiza produselor alimentare și care să includă descrierea metodelor celor mai adecvate, ținând cont că acestea pot influența enorm asupra preciziei rezultatelor. De asemenea Organizația Internațională de Standarde (ISO) publică procedurile standard recomandate pentru analiza microbiologică a alimentelor.
Definirea și aplicarea criteriilor microbiologice.
Un criteriu microbiologic reprezintă o valoare (de exemplu număr de organisme per gram de aliment), sau un domeniu ce poate fi stabilit prin efectuarea unor proceduri definite și care poate fi folosit pentru ca produsul alimentar să fie acceptat.
Criteriile microbiologice pot fi incluse în cadrul standardelor, specificațiilor sau a recomandărilor.
Standardul microbiologic este obligatoriu, este inclus într-o lege sau reglementare de control a modului în care alimentul este obținut, procesat, depozitat, sau importat.
Specificațiile microbiologice pot fi incluse într-un cod practic care atenționează pe cei ce lucrează în domeniu despre obligativitatea respectării condițiilor igienice sanitare în scopul creșterii inocuității alimentului.
îndrumarul microbiologic, care este folosit atunci când pentru produsul fabricat sunt absente standarde sau specificații.
Comisia Internațională pentru Specificații Microbiologice pentru Alimente
recomandă un plan de evaluare a alimentelor stabilit pe baze statistice ce poate fi un ghid pentru utilizarea la nivel internațional, care să faciliteze consumul fără risc, exportul/ importul acestora. Un astfel de plan include numărul de probe (n) care trebuie să fie examinate, numărul de microorganisme (s) prezente într-un gram sau cm3 de aliment, valorile (m și M) unde m este valoarea la care nu se poate produce nici un prejudiciu și M este valoarea peste care lotul (respectiv cantitatea de alimente, produse, manipulate în condiții uniforme) este respins, iar indicele C numărul maxim de probe de analiză cu valori între m și M pentru ca lotul să fie acceptat (Refai K 1979).
In cazul unor produse alimentare, decizia de acceptare este în funcție de prezența sau absența unui grup de microorganisme. In cadrul acestui plan cu doi parametri, se iau în considerație numărul de probe de analiză și dintre acestea numărul de probe pozitive. De exemplu, dacă n=10 și c = 0 înseamnă că, dacă o probă este pozitivă din cele 10 examinate lotul va fi respins, iar dacă de exemplu c = 2 înseamnă că dacă una sau două probe sunt pozitive, lotul este acceptat dacă numărul este mai mare de 2 lotul este respins.
ICMSF recomandă si planuri în care se iau în considerație 3 parametri și anume n- numărul de probe ce trebuiesc analizate dintr-un lot, c1 – numărul de probe acceptate de a avea un număr de microorganisme în exces față de valoare m (minimă, lipsită de risc) și c2=0ceea ce înseamnă că nici o probă din cele n analizate nu se admite de a avea un număr în exces față de valoarea M (maximă); prin depășire, valoarea ar reprezenta o populație microbiană neacceptată fie că aceasta poate include microorganisme de risc pentru sanatatea consumatorilor sau este cauza alterarii senzoriale detectabile.
In tabelul 4.1. se dau valori pentru principalii parametri recomandati pentru evaluarea microbiologica a unor produse alimentare.
Tab.4.1
Limite microbiologice propuse de ICMSF
4.4 ANALIZA RISCURILOR. PUNCTE CRITICE DE CONTROL (HACCP)
începând din 1959 este perfecționat si recomandat pentru aplicare în toate subramurile industriei alimentare sistemul HACCP (Hazard Analysis. Criticai Control Points) bazat pe identificarea, evaluarea și ținerea sub control a tuturor riscurilor chimice, fizice și biologice (microbiene și parazitologice) ce ar putea interveni în procesul de fabricare, păstrare, distribuție a produselor alimentare, în scopul asigurării inocuității acestora.
Pentru stabilirea unui plan HACCP este esențială cunoașterea următoarelor etape:
-Analiza riscurilor, etapă în care sunt identificate și evaluate riscurile ce pot fi date de materiile prime, aditivi, procesele tehnologice cheie, distribuția și recircularea produselor, factorul uman.
-Determinarea punctelor critice, respectiv a unor parametrii determinanți ai procesului tehnologic ce pot fi controlați. Este considerat punct critic de control orice punct unde controlul poate fi exercitat și riscul poate fi prevenit sau minimalizat. Punctul este considerat critic, dacă prin nerespectarea acestuia este posibil un risc potențial care să conducă la obținerea unor produse nesigure, insalubre (cu risc de alterare sau care pot cauza imbolnavirea consumatorului).
Stabilirea unui sistem de monitorizare a punctelor critice de control.
Pentru implementarea acestui sistem în primul rând trebuie întocmită schema de operații și cunoașterea întregului proces tehnologic atât la fabricare cât și la păstrare, distribuție, comercializare, în care să fie stabilite și localizate eventualele riscuri. Urmează identificarea punctelor critice de control, notarea pe diagrama centrală, urmată de o reevaluare a interacțiunilor ce pot avea loc între riscuri și punctele critice de control. Apoi este necesară enumerarea analizelor impuse pentru controlul calității, a procedurilor utilizate pentru a asigura eficiența și continuitatea controlului, monitorizarera rezultatelor și verificarea lor.
Principalele obiective al unui plan HACCP constă în aplicarea de măsuri pentru distrugerea, eliminarea sau reducerea riscurilor, prevenirea recontaminării, inhibarea dezvoltării microorganismelor și a producerii de toxine.
Pentru stabilirea unui sistem efectiv de inspecție și prevenire a riscurilor biologice se impune o bună cunoaștere a factorilor care determina incidența, creșterea, supraviețuirea, sau moartea microorganismelor în alimente. Acești factori pot fi grupați astfel:
Factori care se referă la aliment și procesare
-Contaminarea primară a materiilor prime
-Contaminarea în timpul manipulării și prin contact cu echipamentele
-Proprietățile fizice și chimice ale materiei prime: compoziția chimică, nutrienți și substanțe antimicrobiene, microeterogenitatea materialului, pH-ul și capacitatea de tamponare, echilibru gazos, potențial de oxidoreducere, aw, bariere mecanice.
-Condiții de preprocesare și depozitare: temperatura, mediul gazos ambiant, umiditate, timp
-Proceduri de proces și conservare; directe (temperatura, conservanți chimici adăugați, iradiere) și indirecte (modificări chimice și fizice produse în alimente).
-Condiții de ambalare și depozitare postprocesare: temperatura, condiții ambientale de gaz, umiditate, durată.
Factori dependenți de microorganisme:
-Caracteristici ale speciei sau tulpinii: rezistența la procese tehnologice, toleranța la factorii inhibitori.
-Necesități optime pentru creștere, viteză de reproducere.
-Efecte sinergice între microorganisme; schimbări în structura și proprietățile fizice ale alimentului.
-Suplimentarea cu nutrienți adiționali și factori de creștere, modificări ale pH-ului si mediul gazos ambiental.
– Efecte antagonice între microorganisme: competiția pentru nutrienți, modificări de pH și atmosferă, producerea de antibiotice ș.a.
Tipuri generale de risc microbiologic:
■Materia primă sau aditivii, pot fi privite ca o sursă potențială de patogeni, organisme toxicogene, organisme care dau alterarea sau formează substanțe toxice (de exemplu toxine preformate)
■Surse de contaminare în timpul producerii, procesării sau distribuției
■Pierderea controlului unor etape tehnologice în care se pot distruge microorganismele relevante (de exemplu tratamente termice incorect aplicate).
■Etape în timpul producerii, procesării, depozitării, distribuției etc. care oferă oportunitatea unor microorganisme de a supraviețui sau chiar să crească și să se multiplice. (Harrigan, WH, 1991).
ICMSF (1986) elaborează o clasificare a microorganismelor de risc în funcție de gravitatea îmbolnăvirilor pe care le pot cauza (tabel M.2) și subliniază faptul că analizele microbiologice trebuie să demonstreze atât riscul cât și probabilitatea unui potențial risc, precum și severitatea acestuia, încât se poate stabili ordinea și prioritatea în care acestea trebuiesc luate în considerație.
Tabel 4.2
Clasificarea microorganismelor in functie de gradul de risc
Industria alimentară din țara noastră se aliniază la cerințele unei producții moderne de alimente prin acreditarea sxistemului propriu de calitate cu adoptarea standardelor STAS ISO 9000, iar din 1995 Ministerul Sănătății recomandă introducerea și aplicarea sistemului HACCP în circuitul alimentelor.
4.5 Microbiologia previzionala
Tendința actuală în consum este orientată spre alimente proaspete, cu proprietăți nutriționale și senzoriale constante apropiate de aceea a produselor naturale. Această cerință a consumatorilor se reflectă prin preocuparea la nivel industrial de obținere a produselor cu procesare minimă, cu aplicarea unor tratamente termice reduse sau eliminarea acestora. In schimb aceste produse pot fi instabile din punct de vedere microbiologic, dar producătorul de bunuri alimentare are obligația de a garanta securitatea sanitară totală (absența microorganismelor patogene și a toxinelor). Pentru respectarea acestor cerințe este indispensabil de a cunoaște de la începutul fabricației care va fi evoluția cea mai probabilă a microbiotei materiilor prime și auxiliare (natura speciilor prezente, concentrația de celule). Acest lucru se impune și când sunt introduse noi tehnologii.
Metodele clasice de control microbiologic durează mult timp, de aceea microbiologia previzională sau predictivă aplică o metodologie alternativă, fiabilă, rapidă și reproductibilă pentru a previziona evoluția microbiotei și de a recomanda modificările din procedeul de fabricație care să asigure calitatea produsului finit.
Microbiologia predictivă poate fi considerată ca o aplicație a cercetărilor privind ecologia microbiană a alimentelor. Se bazează pe premiza că răspunsul populațiilor microbiene la factorii ambietali este reproductibil și că prin caracterizarea acestor factori care pot afecta creșterea și supravețuirea acestora este posibil să fie prezisă care va fi comportarea lor în alte condiții similare. Aceste cunoștințe dobândite în timp pot fi incluse în modele matematice ce pot fi folosite pentru a prezice din punct de vedere cantitativ comportarea populațiilor microbiene în alimente adică, creșterea, moartea, producere de toxine.
O aplicație a microbiologiei previzionale constă în stabilirea cineticii de creștere a unui microorganism de alterare cu trasarea precisă a curbei de creștere a acestuia în alimentul considerat, în diferite condiții de temperatură. pH, aw compoziție. Evoluția concentratiei de celule (X) in functie de timpul (t) sau durata de pastrare, in conditiile in care alimentul respectiv ar putea fi expus, pot fi descrise printr-un model matematic. Prin stabilirea parametrilor cinetici de crestere (fig.4.1) si anume concentratia initiala de celule Xo, (faza lag, de adaptare sau crestere zero) si μ, viteza specifica de crestere și cea maximă în cursul fazei exponențiale de creștere (Mmax) se poate calcula concentrația maximă tolerabilă X' sau timpul t' care reprezintă data limită de consum a produsului alimentar. (DLC). Acesta corespunde duratei în care în condițiile date, concentrația de microorganisme este încă compatibilă cu securitatea sanitară a alimentului respectiv consumatorului.
Pentru demararea microbiologici previzionale se parcurg 5 etape:
1.Prima etapă constă în definirea microorganismului cel mai relevant și care este reținut pentru studiu. Alegerea acestuia este condiționată de rezultatul analizei microbiologice a alimentului și de considerațiile sanitare ce permit evaluarea riscului și a pericolului prin consumul alimentului contaminat. In continuare se deduce concentrația inițială de celule normală în aliment a microorganismului reținut pentru studiu si concentrația X' care nu trebuie să fie depășită în momentul consumului. Se analizează factorii de risc care permit evoluția microorganismului în aliment, se stabilește influența temperaturii ca cel mai important factor în creșterea microorganismului (temperatura minimă și temperatura maximă de creștere).
2.Se organizează o serie de experimentări de evaluare a creșterii microorganismului în aliment (considerat drept mediu de cultură), se vor trasa curbe de creștere pentru unele temperaturi menținute constante pe parcursul experienței și se stabilește valoarea vitezei maxime de creștere (μmax).
3.Cu ajutorul rezultatelor și a modelelor matematice se determină matematic valori ale parametrilor modelului.
4.Se realizează validarea modelului prin compararea valorilor ce pot fi obținute prin calcul cu cele obținute experimental.
5.Se utilizează modelul validat pentru a prevedea care va fi concentrația de celule X' la timpul t' care corespunde duratei de conservare sau se determină condițiile în care concentrația de celule microbiene nu trebuie să fie superioară lui X', fixând "a priori" timpul t' al datei limite de consum (Bourgeois, 1996).
Marty S. et al., (1998) prezinta modalitati de determinare a unei date limite de consum (fig. 4.2), prin utilizarea de modele matematice ce tin cont de principalii factori cu semnificație biologică asupra creșterii microbiene și dă exemple de aplicare a microbiologici previzionale prin determinarea DLC pentru lapte pasteurizat și carne de vită ambalată în film permeabil la oxigen.
Aplicarea microbiologici previzionale în industria alimentară.
Prezintă numeroase avantaje economice și sociale. Astfel modelele stabilite în condiții constante, pot, de asemenea, fi utilizate pentru a face predicții, în condiții vari¬ate. Aceasta permite de a reprezenta cinetica de creștere a unui microorganism de alterare într-un aliment dat, în condițiile variabile al mediului ambiant, prin determianarea DLC-ului în aceste condiții.
Microbiologia previzională permite să se detecteze punctele critice și să se evalueze riscul microbiologic în perioada în care alimentul ar trebui să fie consumat, încât este un ajutor util pentru demararea programului HACCP. Aplicarea în producție permite reducerea numărului de analize în cadrul controlului microbiologic și deci reducerea costului lor.
Principala problemă de actualitate a microbiologici previzionale este aceea de a constitui o bază de date despre microorganismele de alterare a alimentelor care să cuprindă informațiile bibliografice și rezultatele experimentărilor pentru diferite tulpini test pentru a fi pusă la dispoziția industriei. O atenție deosebită este dată diverselor fenomene legate de interacțiunile între microorganisme aflate în același biotop (an¬tagonism și sinergism), de fenomenele de stres bacterian, ca urmare a unor tratamente chimice și termice subletale, care pot mări perioada de latență și antrena erori în aplicarea principiilor microbiologici previzionale (Marty S., 1998).
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Procese Metabolice ALE Microorganismelor Si Aplicatii In Industria Alimentara (ID: 131188)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.