Tipuri de Microorganisme Prezente In Afectiunile Osteo Articulare Si Rezistenta Acestora la Antibiotice

Diverse2

Tipuri de Microorganisme Prezente In Afectiunile Osteo Articulare Si Rezistenta Acestora la Antibiotice

Byadmin ianuarie 1, 2024

Tipuri de microorganisme prezente in afecțiunile osteo-articulare și rezistența acestora la antibiotice

Cuprins

Introducere

Obiective

Capitolul 1. Tehnica examinarii produselor biologice recoltate in infectii osteo-articulare

1.1. Examinarea macroscopică

1.2. Examinarea microscopică

1.3. Examinarea prin cultură

1.3.1. Cultivarea și izolarea genului Staphyllococcus

1.3.2. Cultivarea, izolarea și identificarea enterobacteriilor

1.3.3. Cultivarea, izolarea și identificarea Mycobaterium tuberculosis

Capitolul 2. Rezultate obținute

2.1. Ponderea probelor pozitive

2.2. Distribuția pe specii a bacteriilor izolate din lichide articulare

2.3 Distribuția pe categorii de vârstă a pacientilor bolnavi

2.4. Distribuția pe categorii de sexe pacientilor bolnavi

2.5 . Analiza rezistenței bacteriilor la diferite clase de antibiotice

2.5.1. Staphylococcus aureus

2.5.2 Escherichia coli

2.5.3. Klebsiella sp.

2.5.4. Proteus sp.

2.5.5. Pseudomonas aeruginosa

Concluzii

Bibliografie

INTRODUCERE

Tuberculoza pulmonară a devenit o problema medicală și socio-economică, fiind în creștere alarmantă și cauzând o morbiditate și mortalitate înaltă. Aproximativ 1/3 din populația globului este infectată cu M.tuberculosis. Anual în lume se înregistrează 8.4 milioane de cazuri noi de tuberculoză și 3 milioane de decese.Tuberculoza cauzează mai multe decese decât oricare altă infecție și se situează în primele 10 cauze de mortalitate globală.

Creșterea numărului de cazuri de tuberculoză pulmonară a determinat și cresterea numărului de bolnavi de tuberculoză extra-pulmonară,care au ca punct de plecare,complexul primar toracic. Diseminarea din complexul primar pulmonar se face pe cale limfatică sau sangvină.

Localizarea extra-pulmonară, cea mai frecventă, (peste70%) este cea osteo- articulară. Depistată la timp și tratată corespunzator, tuberculoza osteo-articulară se vindecă în proporție de (90%). Din păcate bolnavii ajung în spitale specializate (mai există în prezent 2 spitale în țară care tratează tuberculoza osteo-articulara) în faze foarte avansate ale bolii, cu distrucții tisulare severe, ulcerații, abcese reci, fistule.

Formele infiltrativ-supurative sunt deseori complicate de suprainfecții cu alți germeni patogeni, care necesită tratament suplimentar cu antibiotice, suprapunându-se peste tratamentul cu tuberculostatice. De regulă aceste suprainfecții se produc cu germeni de spital (infecții nosocomiale), rezistenți la multe grupe de antibiotice. Pacienții sunt supuși unui „șoc” de antibiotice pe care mulți nu îl pot suporta și este nevoie să se intervină chirurgical (amputații).

Scopul lucrării este să atragă atenția asupra acestor afecțiuni tot mai frecvente și mai grave, care au și un impact socio-economic important, afectând în special persoane aflate în activitate.

Partea experimentală a acestei lucrări am efectuat-o în Laboratorul de analize medicale a ,,Spitalului de Ftiziologie Agigea” Constanța.

OBIECTIVE

Metodele de indentificare a germenilor patogeni prin tehnicile bacteriologice clasice sunt în general, laborioase, complexe, realizându-se în mai multe etape, care necesită mult timp și sunt destul de costisitoare. De foarte multe ori rezultatul venit de la laborator pentru medicul clinician este tardiv, starea pacientului se agravează, costurile de vindecare fiind mult mai ridicate, deasemenea și suferința pacientului.

Unul din obiectivele lucrarii mele este reducerea timpului de lucru în identificarea germenilor patogeni (enterobacterii), astfel încât clinicianul să dispună de un diagnostic orientativ care să-i permită inițierea unei scheme de tratament eficientă, în cel mult 24 de ore

Un alt obiectiv a fost impus de specificul spitalului de ftiziologie, unde pacienții sunt tratați cu un număr mare de antibiotice, (tuberculostatice) pe o perioadă foarte mare de timp. Din acest motiv ceilalți germeni implicați în patologia osteo – articulară, sunt în general rezistenți la multe categorii de antibiotice.

Prin observațiile mle am urmărit să scot în evidență aceste clase de antibiotice, la care tot mai mulți germeni sunt rezistenți, datorită utilizării prelungite, antibiotice care ulterior să fie înlocuite în farmacia spitalului.

CAPITOLUL 1

1.Tehnica examinarii produselor biologice recoltate in infectii osteo-articulare

Produsele biologice recoltate pentru examinare au fost reprezentate de:lichid de punctie(articular,sinovial),colectii purulente din abcese , fistule,plagi deschise si fragmente tisulare.

Prelucrarea acestor produse s-a realizat in urmatoarele etape:

1.1. Examinare macroscopica

1.2. Examinare microscopica

1.3. Examinare prin cultura

Examinare macroscopica

În laborator se notează în primul rând aspectul lichidului: seros, tulbure – purulent, lactescent, hemoragic, etc

Prima operație specială care se execută este evitarea coagularii, întrucât coagulul duce la diminuarea numarului de germeni din produs. Se realizează prin adăugarea unor cantități mici de heparină sau prin agitarea cu perle. ( 5 minute, până când fibrina formează un cheag omogen ). Lichidele clare sau ușor opalescente se însămânțează după o centrifugare sterilă ( 15 minute la 3000 t/minut ). Din supernatanți se fac analize biochimice ( Rivalta, glucoza, LDM ) iar din sediment, însămânțări și frotiuri pentru examenul microscopic. Lichidele evident purulente se însămânțează direct fără centrifugare.

Examinare microscopica

Frotiurile se efectuează prin depunerea pe lamă a produsului cu ajutorul ansei și în cazul când este foarte purulent, se omogenizează cu o picatură de ser fiziologic pus pe lamă. Frotiurile s-au colorat: Gram, cu albastru de metil si Ziehl-Neelsen.

Rezutatul examenului bacterioscopic are o valoare diagnostică deosebită. Poate fi uneori suficient pentru un diagnostic prezumtiv de infecție stafilococică, cu bacil G sau microbacterii dacă este susținut și de examenul citologic se poate institui un tratament adecvat.

Tehnica efectuării frotiurilor

Materiale necesare: lame de microscop curate, degresate și uscate, pipete, anse, bec Bunsen, ser fiziologic steril, coloranți (albastru de metilen, fucsină fenicată), decoloranți (acid, alcool). Etapele efectuării unui frotiu:

– întinderea frotiului;

– uscarea;

– fixarea;

– colorarea.

Întinderea frotiului: dacă produsul patologic este lichid (Ziehl-Neelsen) cu pipete sterile (de unică folosință), se ia o picatura si se depune pe lama de microscop. Dacă produsul patologic este solid sau cultura bacteriană este pe un mediu solid, pe lama de microscop se depune o picătură de ser fiziologic steril, apoi ansa sterilă se încarcă cu produs sau 2-3 colonii microbiene și se emulsionează în picatura de ser fiziologic urmarind să se obțină o suspensie omogenă și nu prea densă. Apoi, cu ansa, prin mișcări concentrice se întinde picătura în strat subțire ( astfel încât prin frotiul obținut să se poată vedea literele unui text tiparit ).

Uscarea frotiului se face la temperatura camerei. Uscarea bruscă, la temperaturi ridicate, produce fierberea apei din frotiu, cu distrugerea morfologiei și structurii celulelor.

Fixarea se face la cald, prin trecerea lamei, cu frotiul în sus peste flacăra becului Bunsen de 3-4 ori. Fixarea realizează aderarea frotiului de lama, astfel încât nu se va desprinde cu ocazia procedurilor de spălare din timpul colorări, asigură omorârea microorganismelor și crește susceptibilitatea acestora la coloranți.

Colorarea este o etapă esențială în executarea unui frotiu. Colorațiile efectuate au fost: colorații simple cu albastru de metilen, colorații duble- colorația Gram, colorații speciale- Ziehl-Neelsen.

Coloratia cu albastru de metil .

Fig. 1. Preparat microscopic colorat cu albastru de metil

Este o colorație simplă, rapidă, neaagresivă asupra bacteriilor prin lipsa unor timpi de decolorare, recolorare și care permite o orientare rapidă asupra prezenței și morfologiei bacteriilor. De asemenea permite vizualizarea capsulei bacteriene sub forma unui halou clar în jurul acestora.

Tehnica coloratiei:

frotiul bine uscat și fixat se acoperă cu o soluție albastru de metil 1% timp de 2-3 minute

– se scurge colorantul și se spală cu apă

– se usucă în stativ la temperatura camerei

În examenul microscopic bacteriile si levurile apar colorate în albastru închis, iar celulele eucariote în albastru foarte deschis

Coloratia Gram – este cea mai utilizată în bacteriologie. Permite vizualizarea marii majorități a bacteriilor, cu încadrarea în categoriile morfologice: coci,bacilli, etc și diferențierea lor în două mari clase : bacterii Gram-pozitive șibacterii Gram-negative.

Tehnica colorației:

Frotiul uscat și fixat se acoperă cu Violet de gențiană 1-3 minute apoi se scurge colorantul și se spală cu apă, după care, se acoperă cu soluție Lugol 1 minut. La trecerea acestui minut, se scurge soluția Lugol și se spală iar cu apă apoi se decolorează cu alcool-acetonă (25 secunde strict).

Se spală cu apă, după decolorare, se acoperă frotiul cu soluție fuxină 10% diluată extemporaneu 1 minut, se scurge colorantul, se spală cu apă și se usucă pe stativ la temperatura camerei.

La examenul microscopic unele bacterii apar colorate în violet- Gram pozitivi, altele în roz- gram negative. Diferența de colorabilitate se datorează structurii diferite a peretelui celular. Unele au perete format din mai multe straturi de peptidoglican, impenetrabil pentru alcool-acetonă, astfel încât violetul nu este extras din celulă.

Altele au peretele format din puține straturi de peptidoglican și bogate în lipide, care se solubilizează în alcool-acetonă, permițând decolorarea violetului și colorarea cu fuxină.

Coloratia Ziehl-Neelsen

Mecanismul colorației constă în pătrunderea fuxinei fenicate în micobacterii la cald și legarea acesteia de acizi micolici din peretele celular. La temperatura camerei , peretele celular al acestor bacterii este impenetrabil atât la amestecul de decolorant cât și la colorarea cu albastru de metil.

Fig. 2 . Executarea frotiurilor prin tehnica coloratiei Ziehl-Neelsen (imagine originală)

Reactivi necesari:

– Fuxina fenicată 3 %

– Soluție alcool-acid (alcool etilic 96 % și acid clorhidric 37 %)

– Albastru de metilen 0.3 %.

Colorarea:

– Frotiul uscat și fixat se acoperă cu fuxina fenicată și se încălzește dosul lamei (cu flacăra de alcool) până la emisia de vapori, de 3 ori la interval de 5 minute. Nu se aduce la temperatura de fierbere a colorantului.

– Se varsă colorantul și se spală cu apă.

Decolorarea:

– Se decolorează cu acid-alcool timp de 2-3 minute.

– Se repetă decolorarea dacă frotiul rămâne roșu.

După decolorare frotiul trebuie să rămână roz pal până la alb.

– Se spală frotiul din nou cu apă distilată sau apă de robinet, după care se scurge de excesul de apă.

Recolorarea:

– Se acoperă frotiul cu albastru de metilen 0.3 %, timp de 30 de secunde, maxim un minut. Prelungind timpul de contact cu colorantul, fondul frotiului va fi prea închis la culoare făcând dificilă vizualizarea BAAR.

– Se spală frotiul cu apă de robinet.

– Se usucă frotiul în poziție înclinată (pentru ca excesul de apă să se scurgă), în suportul de lame, la temperatura camerei.

Examinarea frotiului colorat Ziehl-Neelsen se face la microscopul optic folosind obiectivul cu imersie și ocularul de 10X sau 12X. Bacilii acid-alcoolo-rezistenți apar colorați în roșu, iar celelalte bacterii, precum și celulele eucariote din frotiurile executate din produsele patologice, apar colorate în albastru. Pentru a obține rezultate bune prin microscopie, citirea frotiurilor trebuie să fie realizată în mod sistematic și standardizat, astfel încât să ofere garanția examinării unei părți reprezentative din frotiu. Frotiul se examinează dintr-un capăt în celălalt , câmp microscopic după câmp microscopic, de la centru spre periferie.

Nu se imprimă lamei o mișcare continuă în timpul examinarii. Se examinează minim 100 de cămpuri înainte c vizualizarea BAAR.

– Se spală frotiul cu apă de robinet.

– Se usucă frotiul în poziție înclinată (pentru ca excesul de apă să se scurgă), în suportul de lame, la temperatura camerei.

Examinarea frotiului colorat Ziehl-Neelsen se face la microscopul optic folosind obiectivul cu imersie și ocularul de 10X sau 12X. Bacilii acid-alcoolo-rezistenți apar colorați în roșu, iar celelalte bacterii, precum și celulele eucariote din frotiurile executate din produsele patologice, apar colorate în albastru. Pentru a obține rezultate bune prin microscopie, citirea frotiurilor trebuie să fie realizată în mod sistematic și standardizat, astfel încât să ofere garanția examinării unei părți reprezentative din frotiu. Frotiul se examinează dintr-un capăt în celălalt , câmp microscopic după câmp microscopic, de la centru spre periferie.

Nu se imprimă lamei o mișcare continuă în timpul examinarii. Se examinează minim 100 de cămpuri înainte ca frotiul să fie declarat negativ. În cazul unui frotiu care are lungimea de 2 cm, parcurgerea unei lungimi înseamnă aproximativ 100 de câmpuri. Dacă frotiul este intens pozitiv pot fi examinate doar până la 25 de câmpuri. La sfarșitul examinării, se verifică încă o dată numărul frotiului și se înregistrează imediat rezultatul. Lamele se păstrează până la confirmarea prin cultură (2 luni) și pentru controlul intern și extern de calitate.

Exprimarea semnificativa a rezultatelor examenului microscopic:

Tabel I – Rezultatul coloratiei Ziehl-Neelsen

Rezultatul pozitiv 1-3 BAAR/100 câmpuri trebuie interpretat cu prudență, fiind necesară examinarea unui alt eșantion de produs.

Tab.1. Rezultatul coloratiei Ziehl-Neelsen

Examinare prin cultura

Cultivarea microorganismelor constituie etapa principală în stabilirea diagnosticului etiologic; ea include:

– însămânțarea prelevatelor

– examinarea coloniilor

– repicarea lor în vederea identificării.

-realizarea antibiogramei

Inocularea propriu-zisă a prelevatelor trebuie executată în așa fel încât să se obțina o cultură reprezentativă și colonii izolate. Înainte de inoculare, mediile se preîncălzesc și se usucă prin evaporarea condensului de pe suprafața mediului. Inocularea se face cu ansa, tamponul sau pipeta Pasteur. Se depune inoculul pe suprafața mediului și se dispersează pe aproximativ 1/3 din suprafața plăcii; se fac apoi striuri perpendiculare pe primele, pornind de la acestea. Se epuizează astfel ansa în patru cadrane .

Fig. 3. Însămânțare pe mediu geloză-sânge (imagine originală)

Incubarea mediilor se face la 37 °C timp de 24 de ore, pentru microorganismele uzuale, și 60 de zile pentru micobacterii.

Examinarea culturilor și coloniilor are ca scop identificarea prezumtivă a agentului cauzal. Pentru caracaterizarea creșterii, trebuie urmarite colonii izolate din cultura tânără, de 24 de ore, care au toate elementele caracteristice. În culturile vechi aspectul caracteristic se modifică.

În examinarea coloniilor se urmăresc aspectele:

– Dimensiunea estimată în mm: colonii mici (sub 1 mm); colonii mijlocii (1 mm); colonii mari (peste 2 mm)

– Forma: punctiforme, circulare, neregulate, filamentoase, lenticulare

– Relieful: plane, aplatizate, convexe, bombate, acuminate

– Marginile: întregi, ondulate, lobate, zimțate, filamentoase

– Suprafața coloniilor: netedă, umedă, lucioasă – forma de culura S (smooth-neted), sau mată, uscată, rugoasă – forma de cultură R (rough-rugos), mucoase cu tendința de confluare, plate, transparente cu aspectul unor picături de apă (G-glossy)

-Transparența și culoarea: – Coloniile pot fi transparente, semitransparente sau opace. Culoarea este dată de pigmenții intracelulari: coloniile pot fi incolore sau pigmentate (alb, galben, gri, oranj).

Alte caractere:

– Producerea de pigmenți extracelulari difuzibili în mediu

– Miros specific

– Migrarea pe suprafața mediului

– Virarea mediilor diferențiale.

1.3.1. Cultivarea și izolarea genului Staphylococcus

Stafilococii sunt bacterii nepretențioase care cresc și pe geloza simplă nutritivă, dar se prefeăr geloza-sânge pentru observarea hemolizei. Se folosește geloza cu sânge defrinat de berbec 7%. După o incubare de 18-24 ore la 37 °C se obtine o cultură abundentă caracteristică:

Fig. 4. Stafilococ hemolitic însămânîat pe mediu geloză sânge (imagine originală)

Coloniile de 1-3 mm de tip “S”, bombate, lucioase, opace cu consistență cremoasă. Pigmentul auriu, caracteristic speciei, apare după 24-48 ore (plăcile se lasă în nișa bacteriologică încă o zi pentru evidențierea pigmentului).

Pe mediu geloză-sânge, coloniile de S.aureus pot fi înconjurate de o zonă clară de hemoliză completă.

Identificarea Staphylococcus aureus

Cu ajutorul trusei Pastorex Staph Plus, prin metoda latex aglutinarii se poate determina simultan:

a) Coagulaza legată sau “ Clumping factor”

b) Proteina A, cu afinitate pentru fragmentul “cristalizabil” (Fc) al imunoglobuluinelor de clasa 1gG.

c) Polizaharidele capsulate ale lui S.aureus .

Reactivul latex conține particule de latex sensibilizate cu anticorpi monoclonali specifici anticapsulari, fibrinogen și IgG.

Metoda:

-1-3 colonii de stafilococ (de pe geloza simplă sau geloza sânge) se emulsionează într-o picătură de reactiv latex, într-un cerc de pe cardul de aglutinare. Se omogenizează prin mișcări ușoare de rotație timp de 30 de secunde.

Citirea si interpretarea:

– Prezența aglutinării =>reacție pozitivă

– Absența aglutinării => recație negativă.

Reacția se produce întotdeauna cu martori pozitiv și negativi pentru a se putea valida rezultatul, sensibilitatea testului de 99%.

Pentru izolarea stafilococului auriu s-a mai folosit si mediu cromogen”HiCrome Agar”

pe care coloniile apar de culoare maronie.

Fig. 5. Colonii maronii de Staphylococcus aureus pe mediu cromogen (imagine originală)

1.3.2. Cultivarea, izolarea si identificarea enterobacteriilor

În produsele prelucrate , enterobacteriile cu reprezentare semnificativă ca pondere au fost: Escherichia coli, Klebsiella sp. si Proteus sp. (alte specii precum Serratia sp. și Enterobacter sp având o reprezentare mult mai mică).

În practica medicală volumul cel mai mare de lucru al unui laborator de bacteriologie clinică este alocat izolării și identificării bacililor Gram negativi.

Diversitatea mare de microorganisme componente determină necesitatea utilizării unui număr mare de medii de cultură: uzuale, diferențiale, selective, pentru izolare și punere în evidență a caracteristicilor biochimice distinctive.

Schemele clasice de cultivare pentru izolare și identificare a Enterobacteriilor presupun următoarele etape:

Prelevat (lichid, puroi) prin puncții aseptice

cultivare pe mediu diferențial (AABTL;ADCL;etc) => colonii izolate (lactozo-pozitive sau lactozo-negative)

identificare preliminară prin sisteme multitest (medii multitest: TSI/MIU/MILF)

Identificare de certitudini :

– biochimică- teste convenționale (chituri microtest)

– serologică pe lamă sau tub

– tipizare

Sistemele microtest sunt baterii de teste biochimice, în truse variabile ca extindere si în consecință diferite și ca performanțe. Interpretarea lor permite o încadrare taxonomica cu mai multe nivele de probabilitate.

Utilizarea acestor teste la un nivel de complexitate care să asigure o identificare corectă, este destul de dificilă în practica medicală, atât din considerente economice (puține unități sanitare dispun de resurse financiare să le procure), cât și din punct de vedere al promptitudinii emiterii rezultatului (uneori până la 7 zile de la recoltare până la emiterea ABG)

Din aceste considerente, am folosit o metodă mai eficientă și mai sigură pentru izolarea și identificarea celor mai frecvente enterobacterii din produse de puncție si anume folosirea mediilor cromogene.

Aceste medii solide permit identificarea până la nivel de specie a microorganismelor, folosind proprietăți chimice definitorii ale acestora, dand reacții de culoare specifice.

S-a folosit „HiCrome Agar”a carui compozitie chimica a fost stabilita de Pezzlo M,WilkieM.E

FriedmanM.P in1997.

Acest mediu este recomandat pentru detecția și izolarea mai multor specii gram negative dar și gram pozitive. Identificarea se face prin culorile diferite pe care le au coloniile apartinând

unor specii diferite. Culoarea apare în urma reacției dintre o enzimă specifică unui germen și

componente ale substratului cromogen.

Astfel E.coli produce colonii purpurii datorită reacției dintre enzima beta-galactozidaza și un component al mediului cromogen.

Fig. 6.Colonii purpurii de E. Coli, pe mediu cromogen (imagine originală)

La genul Proteus prezența triptofan-deaminazei a fost evidențiată prin apariția unor colonii de culoare maronie.

Coloniile de Klebsiella apar mucoase de culoare albastru –verzui.

Fig. 7. Colonii albastre-verzui de Klebsiella pe mediu cromogen (imagine originală)

Mediul se prezinta sub formă de pulbere gălbuie și s-a turnat in plăci sterile după dizolvarea în apă distilată și sterilizare prin autoclavare la 121˚C si 1,2 atm., timp de 15minute.

Fig. 8. Turnarea mediului în plăci sterile (imagine originală)

Folosind acest mediu, emiterea rezultatului este mai rapidă (maxim 48 de ore), clinicianul putând instaura regimul terapeutic mult mai rapid, evident cu prognostic mai bun al evoluției bolii.

1.3.3. Cultivarea, izolarea si identificarea Mycobacterium tuberculosis

Micobacteriile tuberculozei sunt relativ pretențioase, necesitând medii speciale (nutriționale) complexe, dezvoltarea făcându-se lent. Mediile de dezvoltare a micobacteriilor trebuie să conțină o sursă de carbon, o sursă de azot, ioni esențiali (fier și magneziu). Micobacteriile necesită obligatoriu oxigen pentru dezvoltarea și producerea unor enzime și pigmenți. Tipul uman este strict aerob (în timp ce tipul bovin se dezvoltă la o concentrație de oxigen redusă).

Bioxidul de carbon stimulează creșterea bacililor acido-alcoolo-rezistenți. Temperatura optimă de dezvoltare este în jur de 37oC. Alți factori ce influențează dezvoltarea micobacteriilor: vitaminele (piruvat de sodiu), gradul de umiditate, pH optim (6,5 – 7). În concluzie, mediul ideal necesar dezvoltării trebuie:

– să fie suficient de bogat în substanțe nutritive pentru a favoriza dezvoltarea coloniilor de dimensiuni cât mai mari (vizibile cu ochiul liber).

– să permită diferențierea morfologică a coloniilor pentru a le identifica.

– să împiedice dezvoltarea florei asociate care poate invada coloniile de mycobacterii.

Mediul folosit si care indeplineste aceste conditii a fost Lowenstein-Jensen un mediu pe bază de ou. Acesta mai conține zaharuri (glicerol), aminoacizi (acid glutamic), săruri minerale (magneziu, fosfați, citrați) și verde de malachit (acțiune bactericidă și de colorare a mediului făcand mai vizibile coloniile de micobacterii).

Fig. 9. Colonii de Mycobacterium tuberculosis însămânțat pe mediu Lowenstein Jensen (imagine originală)

În diagnosticul bacteriolologic al tuberculozei cultivarea reprezintă metoda de bază. Prin cultură se poate stabili viabilitatea microorganismelor. Cultivarea permite atât izolarea, cât și identificarea bacteriei tuberculoase, confirmând etiologia și activitatea bolii.

De asemenea, obținerea coloniilor izolate permite testarea chimiosensibilității germenilor. Este o metodă foarte sensibilă, cu o limită de 10-100 bacterii/ml produs (față de 5.000-10.000 în cazul frotiului direct), dar în același timp o metodă laborioasă și complexă care nu poate fi corect și eficient aplicată decât în laboratoarele specializate.

Cultura pozitivă crește numărul de cazuri confirmate bacteriologic cu 30-50% prin detectarea cazurilor cu microscopie negativă, dar trebuie să avem în vedere că rezultatul este obținut tardiv (circa 3-8 săptămani)

Produsele patologice se împart în două categorii, în funcție de condiția lor microbiologică:

Prima categorie o reprezintă produsele considerate normal sterile, care nu necesită decontaminare înaintea cultivarii:

Ex : fragmentele de țesut dacă se consideră ca nu sunt contaminate cu flora

banală se prelucrează astfel:

– se omogenizează prin triturare cu 0.5-1 ml soluție salină fiziologic steril

– se inoculează ca atare pe mediu Lowenstein Jensen.

Preventiv o parte din omogenat se prelucrează și prin decontaminare.

A doua categorie o constituie prelevate sigur contaminate cu flora uzuală.

Ex : – lichidul articular purulent se prelucrează prin decontaminare

Prelucrarea acestor produse implică urmatoarele etape:

1. Omogenizare/decontaminare

2. Concentrare prin centrifugare

3. Însămânțare pe mediu de cultură, incubarea la termostat și controlul creșterii

4. Notarea și interpretarea rezultatelor.

Se folosesc agenți chimici (NaOH 4%), care omogenizează produsul patologic prin descompunerea structurilor sale organice (mucus, fibrina, detritus) și concomitent este distrusă flora microbiană asociată din produs.

Efectul bactericid al substanțelor decontaminate nu este strict selectiv, o bună parte dintre micobacterii fiind distruse. Acest efect variază în funcție de agentul chimic folosit, durata contactului cu germenii și condițiile centrifugării. Se apreciază că hidroxidul de sodium 4% ținut 15 minute în contact cu microorganismele, nu distrug în procent semnificativ micobacteriile.

Produsul se centrifugheaza apoi 15 minute la 5000 turatii/minut și se însămânțează sedimentul.

Fiecare produs prelevat se însămânțează pe trei tuburi cu mediu Lowenstein-Jensen.

Verificarea tuburilor cu mediu de cultură

– culoarea mediului Lowenstein Jensen este verde luminos, ocazional poate avea particule punctiforme datorate prezenței lipidelor din ouă. Pot apărea mici bule produse spontan în timpul coagulării, dar acestea nu afectează calitatea mediului;

– suprafața mediului trebuie să fie netedă, lucioasă;

– să aibă lichid de condensare pe fundul eprubetei;

– eprubetele cu mediu nu trebuie expuse la lumină în exces, deoarece mediul va căpăta o culoare albastră și își va modifica proprietățile nutritive devenind inutilizabil;

Pregătirea eprubetelor cu mediu

– mediul de cultură se scoate din frigider cu cel puțin 30 de minute înainte de a se folosi;

– se numerotează tuburile cu mediul asfel: numărul din registrul de laborator cu indicativul produsului patologic și data insămanțării pe fiecare tub (se pregătesc câte trei tuburi pentru fiecare produs patologic prelucrat).

Tehnica însămânțării

– se însămânțează 3 tuburi cu mediul Lowenstein Jensen pentru fiecare produs;

– se însămânțează câte 4 picături (0,2 ml) din sedimentul eșantionului de produs prelucrat în fiec- – se înclină fiecare tub pentru ca inoculul să inunde toată suprafața mediului; are tub cu mediu de cultură, folosind o pipetă Pasteur;

Fig. 10 . Tehnica însămânțării pe mediu Lowenstein Jensen (imagine originală)

– tuburile însămânțate se pun în poziție înclinată (unghi de 25-30°) pe tăvițe speciale, astfel încât lichidul însămânțat să scalde suprafața mediului, dar să nu ajungă la capac;

– capacul nu se închide complet, rămâne semiînchis;

– se incubează, în funcție de indicațiile producătorului, 2-5 zile în poziție înclinată, la 37 °C la termostat, pentru ca excesul de lichid să se evapore;

– se închide capacul (anumiți producători specifică faptul că pe întreaga perioadă de incubare capacul trebuie să rămână semiînchis);

– se așează în poziție verticală (cutii cu locașuri din materiale ce pot fi dezinfectate alumini;

– cu această ocazie se face prima verificare a culturilor, eliminând tuburile contaminate;

– se consemnează în registrul de laborator contaminarea și se anunță solicitantul.

Fig. 11. Tuburi însămânțate puse în poziție înclinată (imagine originală)

Incubarea culturilor și controlul creșterii bacteriilor

Se incubează culturile până la 2 luni de la însămânțare în termostat, la 36,5 – 37°C;

– primul control se efectuează la ridicarea tuburilor în poziție verticală și permite identificarea mediilor rapid și integral contaminate (toate cele 3 tuburi). Rezultatul se comunică imediat medicilor care au solicitat examenul;

– în continuare, culturile vor fi controlate săptămânal până la împlinirea a 8 săptămani de incubare (60 de zile).

Interpretarea și notarea rezultatelor

Tuburile cu mediu solid se examinează la intervale de timp fixe. Rezultatele se exprimă semicantitativ.

Notarea rezultatelor

Pentru fiecare din tuburile examinate rezultatul culturii se consemnează în registrul de laborator. Deoarece din fiecare produs patologic se însămânțează 3 tuburi, rezultatul culturii se notează astfel:

– dacă numărul de colonii dezvoltate este sub 30 se scrie suma coloniilor numărate pe toate tuburile și numărul de tuburi pe care s-au dezvoltat;

– dacă numărul de colonii dezvoltate este mai mare de 30, rezultatul final al unei culturi va fi reprezentat de tubul cu creșterea cea mai intensă;

– dacă sunt 2 tuburi cu microbi de contaminare și colonii de micobacterii pe al treilea tub, rezultatul culturii va fi dat de creșterea pe acel tub, cu mențiunea ,,/1 tub";

– mediile contaminate total (3 tuburi); rezultat de cultură contaminată la data de …

– mediile contaminate parțial (1-2 tuburi); Se menționează data contaminării (C. și data pentru fiecare tub);

– mediile pe care s-au dezvoltat colonii, rezultat pozitiv, cu interpretarea lui.

Fig. 12. Registrul de evidență al pacienților infectați cu Mycobacterium tuberculosis (imagine originală)

Diagnosticul modern al infecției tuberculoase

Diagnosticul și tratarea infecțiilor tuberculoase latente este o măsură importantă în lupta împotriva acestei afectiuni. Testul cutanat la tuberculina (IDR-PPD) a fost până nu demult singura metodă practicată pentru detectarea tuberculozei latente, însă această metodă dă reacții fals pozitive la infecțiile cu micobacterii netuberculoase, dar și în urma vaccinarii BCG.

Două teste sanguine: Quantiferon TB Gold si T-SPOT-TB măsoară răspunsul de hipersensibilitate tardivă la contractul cu M. tuberculosis. Aceste teste utilizează antigene specifice M. tuberculosis: ESAT6 si CFP10. Antigenele ESAT6 și CFP10 sunt ținte majore ale răspunsului imun, cu stimularea limfocitelor T și sinteza de IFN-gama. QuantiFeron TB Gold se realizează pe proba de sânge total și măsoară IFN-gama eliberat în plasma de limfocite T, ca răspuns la stimularea cu ESAT6 si CFP10. T-SPOT. TB constă în stimularea celulelor mononucleate din sângele periferic cu ESAT6 și CFP10 și numărarea limfocitelor T care secretă IFN-gama.

Avantajele covârșitoare ale testelor sanguine față de IDR, vor conduce în viitor la utilizarea cât mai importantă a acestora în diagnosticul infecției tuberculoase, înlocuind PPD.

Antibiograma

Ultima etapă în diagnosticul de laborator al infecțiilor osteoarticulare este efectuarea antibiogramei sau testarea sensibilității „in vitro”, unei tulpini bacteriene la substanțele antimicrobiene. Am folosit metoda difuzimetrică Kirbz – Bauer, cel mai frecvent utilizată deoarece dacă se respectă cu strictețe condițiile de lucru poate asigura o reproductibilitate de cca 90 %.

Principiul metodei

Prin depunerea discurilor (microcomprimatelor), cu antibiotice pe suprafața unui mediu solid însămânțat cu o cultură bacteriană, substanța antimicrobiană activă va difuza în mediu prezentând o scădere constantă a gradientului de concentrație, de la marginea discului spre periferie.

După un anumit timp de incubație se vor contura zone distincte; una în care creșterea bacteriană este inhibată de concentrația de substanță antimicrobiană și o zonă de creștere, în care concentrația de antibiotic este prea mică pentru a inhiba creșterea.

Cu cât diametrul zonei de inhibiție este mai mare cu atât germenul este mai sensibil, deci cantitatea de antibiotic necesară inhibiției germenului (concentrația minimă inhibantă , CMI), este mai mică. Există deci o relație de proporționalitate inversă între diametrul zonei de inhibiție și CMI.

Mediul de cultură utilizat pentru realizarea antibiogramelor este Muller – Hinton, mediu nutritiv, fără substanțe inhibitoare, cu pH de 7,2 – 7,4. Mediul se toarnă în plăci Petrii în strat de 4 mm grosime.

Inoculul bacterian este reprezentat de o suspensie bacteriană cu densitatea de 0,5 McFarland (aproximativ 108 microorg/ml) efectuat din cultură pură a tulpinii ce urmează a fi testată. Această densitate se realizează cu aproximativ 2-3 colonii la 2 ml bulion, dar obligatoriu se verifică cu densiometru.

Discurile cu antibiotice conțin cantități standardizate din fiecare antibiotic. Vor fi folosite 2-3 antibiotice din fiecare clasă și câteva antibiotice de rezervă. Au fost alese în funcție de tulpina bacteriană testată

Setul de antibiotice pentru testarea stafilococilor:

Setul de antibiotice pentru testarea Enterobacteriilor:

Lista antibioticelor testate

Aminopenicline Aminoglicozide Macrolide Quinolone

Ampicilina Amikacina Azitromicină Norfloxacin

Amoxicilina Gentamicina Claritromicina Ofloxacin

Amoxiklav Kanamicina Eritromicină Ciprofloxacin

Tobramicina Moxifloxacin

Netilmicina

Cefalosporine Carabapeneme Altele

Cefalotină Imipenem Cloramfenicol

Cefaclor Trimetoprim

Cefuroxim Vancomicină

Cefotaxim Lincomicină

Cefoperazone

Ceftriaxonă

Ceftazidim

Tehnica de lucru

Suspenisa bacteriană este însămânțată uniform pe toată suprafața mediului cu un tampon steril (plăcile cu mediu sunt scoase de la frigider înainte cu o oră și se lasă la temperatura camerei, apoi 15 – 20 de minute la termostat, pentru uscare, nu pot fi utilizate plăci cu lichid de condens pe suprafața mediului sau pe capac)

Se lasă mediul însămânțat câteva minute să se usuce, apoi se aplică comprimatele cu antibiotice, fie manual cu o pensă, fie cu diskdisencer (aplicator mecanic), la distanța de 3 cm între discuri și 2,5 cm de marginea plăcii.

Citire și interpretare

Cu ajutorul unei rigle gradate se măsoară în mm diametrul zonei de inhibiție, a fiecărui antibiotic. Prin compararea cu datele din tabelele furnizate de producătorii discurilor, se face evaluarea rezultatelor pentru fiecare antibiotic, fiind apreciată tulpina ca: sensibil (S), intermediar (I), rezistent (R). Prezența de colonii în interiorul zonei de inhibiție semnifică dezvoltarea rezistenței secundare interpretarea fiind „R”, indiferent de mărimea zonei de inhibiție.

CAPITOLUL 2

REZULTATE OBȚINUTE

Studiul a fost făcut în perioada 2013 – 2014, pe un lot de 355 de pacienți cu suspiciune de artropatii infecțioase. Dintre aceștia 107 pacienți au fost testați pentru diagnostic de tuberculoză osteo – articulară. Probele au fost prelevate de la pacienții internați în secția de ortopedie a spitalului de Ftiziologie Agigea.

2.1. Ponderea probelor pozitive

În lotul studiat pentru infecții cu flora banală, ponderea probelor pozitive a fost de 46%, iar în lotul studiat pentru tuberculoză de 17 %.

Fig.13. Ponderea probelor pozitive în infecții cu flora banală

Fig. 14. Ponderea probelor pozitive în infecții cu micobacterii

2.2. Distribuția pe specii a bacteriilor izolate din lichide articulare.

În artritele spetice și osteomielite sunt implicați frecvent stafiloccoci și bacili Gram negativi. Datorită faptului că pacienții testați în acest spital sunt în general cu spitalizare îndelungată, imunodepresați, cu intervenții chirurgicale repetate, datorită sechelelor tuberculoase, germenii selectați sunt din categoria celor care dau infecții nosocomiale, polirezistenți la antibiotice, așa cum am ilustrat în tabelul nr. 1 si fig. 15.

Tabel I – Distribuția pe specii a bacteriilor izolate din lichide de puncție

Fig. 15. Distribuția pe specii a bacteriilor izolate din lichide articulare.

2.3 Distribuția pe categorii de vârstă a pacientilor bolnavi

Tabel II – Distribuția și procentul pacienților pe categorii de vârstă

Fig . 16. Distribuția și procentul pacienților pe categorii de vârstă

Tabel III – Distribuția pe categorii de vârstă în artropatii tuberculoase

Fig. 17. Distribuția pe categorii de vârstă în artropatii tuberculoase

2.4. Distribuția pe categorii de sexe pacientilor bolnavi

Tabel IV – Distribuția pe sexe în artropatii infecțioase

Fig. 18. Distribuția pe sexe în artropatii infecțioase

Tabel V – Distribuția pe sexe in artropatii tuberculoase.

Fig. 19. Distribuția pe sexe în artropatii tuberculoase

Distribuția pacienților pe vârste și sex relevă câteva aspecte și anume:

categoria cu risc major, pentru aceaste afectiuni este reprezentată de bărbații cu vârsta cuprinsă între 40 – 59 de ani, deci persoane aflate în cei mai productivi ani ai vieții, ceea ce

determină consecințe sociale importante atât în plan individual cât și în colectivitate.

sunt mai mulți factori care pot determina această distribuție. Bărbații din această categorie de vârstă sunt expuși prin activitatea fizică unor condiții grele de muncă, (frig, umiditate, suprasolicitare)

majoritatea lor sunt fumători, bolnavi cronici (diabet, hepatite, ciroze, etc.) adică persoane cu imunitatea scăzută.

non – complianța la tratament a acestei categorii, determină o rată mare a eșecului în tratamente și a recidivelor

Tabel VI – Distribuția după domiciliu în artropatii infecțioase.

Fig. 20. Distribuția după domiciliu în artropatii infecțioase

Tabel VII – Distribuția după domiciliu în artropatii tuberculoase

Fig.21. Distribuția după domiciliu în artropatii tuberculoase

Artropatiile infecțioase afectează în procente apropiate populația din mediu rural cât și cea din mediu urban, însă observăm că artropatiile tuberculoase au incidența mai mare în mediu rural legat in special de accesul mai dificil la asistenta medicala specializata.

2.5 . Analiza rezistenței bacteriilor la diferite clase de antibiotice

2.5.1. Staphylococcus aureus

Tabel VIII – Numărului de tulpini și rezistența lor la diferite clase de antibiotice

Fig. 22. Reprezentarea grafică a rezistenței la antibiotice a tulpinilor stafilococice

2.5.2 Escherichia coli

Tabel IX – Reprezentare tulpini de E. coli și rezistența lor

Fig. 23. Reprezentare grafică a rezistenței la antibiotice a tulpinilor de E.coli

2.5.3. Klebsiella sp.

Tabel X – Reprezentare a rezistenței la antibiotice a tulpinilor de Klebsiella sp. studiate

Fig. 24. Reprezentare grafică a rezistenței la antibiotice a tulpinilor studiate de Klebsiella sp.

2.5.4. Proteus sp.

Tabel XI – Prezentare a rezistenței tulpinilor de Proteus sp.

Fig. 25. Reprezentare grafică a rezistenței la antibiotice a tulpinilor de Proteus sp.

2.5.5. Pseudomonas aeruginosa

Tabel XII – Prezentare a rezistenței la antibiotice a tulpinilor studiate de Pseudomonas aeruginosa

Fig. 26. Reprezentare grafică a rezistenței la antibiotice a tulpinilor studiate de Pseudomonas

Se constată că un număr important din tulpinile testate sunt rezistente la aminoglicozide și fluoroquinolone. Astfel, toate enterobacteriile analizate au o rezistență mare la fluoroquinolone, clasă de antibiotice la care în mod normal au o sensibilitate crescută.

Se observă faptul că 66 % din tulpinile de E. Coli testate sunt rezistente la FQ, 71 % sunt rezistente la AG, iar la ambele clase sunt rezistente peste 50 % din tulpinile testate. Aceeași observație se menține și la ceilalți germeni analizați. Stafilococcul auriu, cel mai frecvent germen izolat din infecțiile osteo – articulare are același comportament față de antibioticele testate, 56 % din tulpini fiind rezistente la AG și FQ

O observație generală ce reiese din studierea graficelor este că toate tulpinile manifestă rezistență crescută la majoritatea claselor de antibiotice, datorită spitalizării prelungite a pacienților și contaminării lor în general cu germeni din spital.

Acest comportament particular limitează selecția antibioticelor de către medici și ei se orientează spre alte clase cum ar fi – aminopeniciline, cefalosporine etc. Rezistența crescută la aceste clase de antibiotice se explicăl prin faptul că majoritatea bolnavilor au fost sau încă mai sunt tratați cu medicamente antituberculoase din care fac parte Amikacina, Ciprofloxacin, Kanamicina, (AG și FQ), iar in suprainfecții cu alți germeni sunt selectate bacterii rezistente la aceste clase de antibiotice.

Tot din studierea comportamentului bacteriilor la antibiotice s-a mai observat că la o serie de antibiotice tot mai puțin folosite, datorită toxicității lor, cum ar fi de exemplu Cloramfenicol, sau a accesibilității reduse cum ar fi de exemplu imipenem, vancomicina Lincomicina, sensibilitatea germenilor s-a menținut sau a crescut.

CONCLUZII

Din analiza probelor din perioada menționata s-au tras următoarele concluzii :

din totalul bolnavilor internati aproape jumatate (46%)au fost diagnosticati pozitiv cu infectii bacteriene osteo-articulare

categoria cu risc major, pentru aceaste afectiuni este reprezentanța de bărbații cu vârsta cuprinsă între 40 – 59ani,deoarece aceasta categorie este expusa unor conditii care favorizeaza aceste boli(munca fizica grea,boli cronice,non-complianta la tratamente)

in ceea ce priveste comportamentul la antibiotice a germenilor analizati reiese din studierea graficelor că tulpinile studiate manifestă rezistență crescută la majoritatea claselor de antibiotice, datorită spitalizării prelungite a pacienților și contaminării lor în general cu germeni din spital.

De semnalat in mod special rezistenta majoritatii tulpinilor la aminoglicozide si floroquinolone chiar si a enterobacteriilor care in mod normal sunt sensibile la aceste clase.

Rezistența crescută la aceste clase de antibiotice se explicăl prin faptul că majoritatea bolnavilor au fost sau încă mai sunt tratați cu medicamente antituberculoase din care fac parte Amikacina, Ciprofloxacin, Kanamicina, (AG și FQ), iar in suprainfecții cu alți germeni sunt selectate bacterii rezistente la aceste clase de antibiotice.

Acest comportament particular limitează selecția antibioticelor de către medici care trebuie sa se orientează spre alte clase cum ar fi – aminopeniciline, cefalosporine, etc..

Tot din studierea comportamentului bacteriilor la antibiotice s-a mai observat că la o serie de antibiotice tot mai puțin folosite, datorită toxicității lor, cum ar fi de exemplu Cloramfenicol, sau a accesibilității reduse cum ar fi de exemplu imipenem, vancomicina Lincomicina, sensibilitatea germenilor s-a menținut sau a crescut.

BIBLIOGRAFIE

BRUN, Y, I.M. BOEUFGRAS (1990): International collaborative evaluation of the ATB 32Staph galery for identification of Staphylococcus species. ZentralblBakteriol. 273:319-326.

DUMITRU BUIUC ȘI MARIAN NEGUȚ 2009: Tratat de microbiologie clinică, ediția a III-a. Editura Medicală, pag. 199-1200.

GOODFELOW, M. 1998: The Actynomicetes: Micrococcus and Related genera. InA. Balows, B.I. Duerden (eds). Topley and Wilson's Microbilogy Infectious, 9th, vol. 2, Arnold, London, pp 491-506.

KLOOS, W.E., TORNABENE, G, SCHLEIFER, K.H.: Isolation and characteriyation of micrococci from human skin, two new species: Micrococcus Iylae and Micrococcus kristinae. Int. 1. Sist. Bacteriol.

MANDELL G.L, DOUGLAS R.G., BENNETT J.E.- Principles and practice of infectious diseases, Second edition. Ed. John Wiley and Sons, N.Y., 1985.

PEACOCK,S.J.2005: Staphylococcus. In Borello,S.P., MUIT3Y,P.R., Funke,G(eds). Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 10'h, vol. 2, Hodder Arnold, London, pp. 771-772.

STRONG M., LEJMAN T., MICHNO P.- Septic arthritis of the wrist in infancy, J. Pediatric Orthoped., 1995, pag 152-156.

TUREK S.L.- Orthopaedics vol I, Fourth edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1984.