Studiul Activitatii Antimicrobiene a Unor Nanoparticule pe Baza de Hidroxiapatita Si Zinc
Studiul activității antimicrobiene a unor nanoparticule
pe bază de hidroxiapatită și zinc
Introducere
Biomaterialele sunt reprezentate de substanțe sau combinații de substanțe, nevii, ce
pot fi utilizate pentru o perioadă de timp scurtă sau îndelungată, având rolul unor sisteme care tratează sau înlocuiesc orice țesut sau organ al corpului uman. În aceasta lucrare, vom prezenta proprietățile unor biomateriale cu potențiale aplicații in domeniul microbiologiei si medicină.
Un exemplu important de material cu proprietăți biologice este hidroxiapatita, constituent anorganic major al masei osoase, cu formula moleculară Ca10(PO4)6(OH)2). Hidroxiapatita este frecvent utilizată în medicină, devenind în ultimele două decenii un material de bază în constituția implanturilor medicale stomatologice sau ortopedice. Aceasta deține proprietăți remarcabile, precum biocompatibilitate sau osteoconductivitate și multe implanturi frecvent realizate în practica chirurgicală (înlocuiri de șold, implanturi dentare) sunt acoperite cu un strat de hidroxiapatită. De asemenea hidroxiapatita este folosită pentru umplerea spațiilor libere, restabilind fracturile osoase sau este utilizată în combinație cu diferite substanțe cu proprietăți antibacteriene. Materialele implantate în organism trebuie sa îndeplinească în contact cu țesuturile vii, aceeasi funcție biologică și fiziologică.
Constituenții primari ai țesuturilor osoase sunt mineralele de fosfat de calciu, ce reprezintă materiale de interes deosebit pentru implanturile de țesut dur în chirurgia orală, plastică și ortopedică. Mineralele de fosfat de calciu prezintă biocompatibilitate înaltă și o capacitate mare de a se integra la nivelul țesutului osos prin resorbție sau prin permiterea creșterii noului țesut osos în interiorul structurii lor poroase. Fosfatul de calciu, principalul component al osului este utilizat încă din anii 1890, în scopul stimulării regenerării osoase, însă rezultatele pozitive au fost descoperite abia după 1920, când cercetătorii au observat stimularea formării osoase de către fosfatul tricalcic (Yuan și De Groot, 2005).
Un domeniu care stă la baza evoluției actuale și viitoare, în aplicațiile tehnologice, industriale și medicale, îl reprezintă nanotehnologia. Literatura de specialitate abundă în informații legate de metodele de sinteză a materialelor biocompatibile și doparea acestora cu diferite substanțe pentru eficientizarea metodelor terapeutice și scăderea riscurilor de infecții postoperatorii. Intensificarea apariției organismelor multirezistente reprezintă o mare amenințare pentru sectorul de sănătate publică, deoarece medicamentele disponibile în prezent ar putea deveni ineficiente. Astfel că, pentru consolidarea terapiilor, studiile actuale se orientează spre potențiale alternative, cum ar fi utilizarea de " nanocompozite".
În cadrul studiului, ne-am concentrat asupra testării unor nanoparticule pe bază de
hidroxiapatită și zinc, pentru a determina dacă acestea prezintă o activitate antibacteriană cu spectru redus sau larg împotriva bacteriilor Gram-pozitive și respectiv, Gram-negative. Experimentul a debutat prin sintetizarea unor nanoparticule pe bază de hidroxiapatită, iar ulterior s-au stabilit diferite concentrații de zinc ce urmau a fi utilizate în prepararea pulberilor, atfel încât acestea să poată induce un mecanism de inhibare a creșterii bacteriene, dar în același timp să nu fie toxice pentru organism. În ceea ce privește alegerea metalelor încorporate la nivelul biomaterialelor, trebuie să se țină cont de proprietățile și de mecanismele de acțiune ale acestora.
Referitor la partea practică desfășurată în laborator, s-a urmărit formarea și proprietățile biofilmelor microbiene. Biofilmele formate pe diverse substraturi celulare sau inerte din punct de vedere nutrițional și pot avea consecințe nefavorabile într-o serie de procese. Aderența și dezvoltarea microorganismelor în biofilme reprezintă un caz particular al proceselor de adeziune celulară cu importanță fiziologică și patologică fundamentală în biologie și medicină.
Scopul lucrării este reprezentat de testarea activității antimicrobiene a unor materiale nanostructurate pe bază de hidroxiapatită și zinc, folosind metode calitative și cantitative.
CAPITOLUL I.
Studiul activității antimicrobiene al unor nanoparticule pe
bază de hidroxiapatită și zinc
Aplicațiile hidroxiapatitei în obținerea de biomateriale compatibile și rezistente la
colonizarea microbiană
Persoanele cu o vârstă mai înaintată suferă adesea de probleme ale articulațiilor, ce pot
conduce la deteriorarea prematură a cartilajului articular. De exemplu, în cazul artrozelor sau a poliartritei reumatoide, articulația degenerează sau se inflamează și devine dureroasă, îngreunând activitatea pacientului. O intervenție chirurgicală frecventă în aceste cazuri este reprezentată de artroplastia de șold sau de genunchi, care reprezintă înlocuirea articulației ireversibil deteriorate, cu piese artificiale. În urma implantării unei proteze, pacientul constată o îmbunătățire majoră a calității vieții, eliminarea durerii și abilitatea de a merge. Alte situații în care implantarea unei proteze este vitală, sunt reprezentate de fractura de col femural, coxartroza, necroza avasculară sau metastazele osoase. În general, fiziopatologia articulației coxo-femurale este cauzatoare de disconfort cronic si impotență funcțională și necesită o atenție deosebită din partea personalului medical. De asemenea, alegerea protezei trebuie să se bazeze pe cunoașterea aprofundată a implicațiilor biomecanice și de biocompatibilite pe care le ridică calitatea materialelor din care este efectuată proteza, cimentarea sau uzura.
Una dintre cele mai frecvente și importante probleme postoperatorii în zilele noastre este reprezentată de riscul crescut de infecții în cazul implanturilor. Infecțiile postoperatorii sunt foarte răspândite în rândul pacienților, chiar dacă eforturilor depuse de personalele spitalelor pentru a le evita sunt enorme. Pe durata spitalizării, pacienților li se administrează medicamente pentru combaterea durerii, prevenirea infecțiilor și a complicațiilor vasculare. În ciuda acestui fapt, concentrația antibioticelor care pătrunde în țesutul osos este foarte scăzută și de aceea, la acest nivel, infecțiile sunt foarte frecvente. Bolile osoase sunt asociate adesea cu infecții bacteriene, care pot deveni extrem de complicate și implică pe lângă intervenții chirurgicale și terapie cu antibiotice.
Speciile microbiene care sunt frecvent implicate în patologii și reprezintă un interes pentru clinicile medicale, sunt reprezentate atât de bacterii Gram-pozitive (exemplu. Bacillus sp., Staphylococcus sp.,), cât și de cele Gram-negative (E. coli). Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa se numără printre cei mai importanți agenți patogeni care cauzează infecții osoase și articulare și mai mult decât atât, prezintă rezistență la majoritatea medicamentelor antibacteriene disponibile.
Pentru intițierea procesului infecțios, agentul patogen pătrunde în organism pe o cale adecvată, iar corpul permite multiplicarea acestuia. Reactivitatea imunitară a organismului condiționează posibilitatea apariției procesului infecțios, intensitatea, extinderea și gravitatea acestuia. Din punct de vedere microbiologic, starea caracteristică a organismului infectat cu un agent infecțios, înainte de declanșarea simptomelor, este aceea de contaminare. După contaminare, agentul patogen înecepe colonizarea, se multiplică și este transportat prin sânge sau limfă la nivelul situsurilor specifice localizate la distanță. Colonizarea reprezintă multiplicarea bacteriilor și constituie principala condiție cantitativă pentru debutul procesului infecțios. Doza contaminantă necesară inițierii infecției este cu atât mai mică cu cât tulpina bacteriană este mai virulentă. Repercusiunea directă a colonizării agentului patogen este marcată de o reacție de apărare locală a organismului, cu mobilizarea leucocitelor și cel mai frecvent rezultatul imediat este formarea puroiului, proces numit supurație (Mihăescu și colab., 2008).
Extinderea infecției în organism poate determina o infecție regională sau una generalizată. Infestarea regională corespunde diseminării infecției pe teritorii întinse, cum ar fi sistemul limfatic sau vasele sanguine tributare unei zone. Dintr-o infecție regională, agenții patogeni răspândiți pe o cale adecvată pot dobândi localizări secundare, în orice țesut sau organ, unde vor iniția noi focare infecțioase care evoluează spre infecții generalizate. Acestea marchează incapacitatea mecanismelor de apărare a gazdei de a reacționa eficient în fața agentului patogen. În cazul în care bacteriile dintr-un focar de infecție, rezultat în urma unei intervenții chirurgicale sau pătrunderii acestora în organism pe diferite căi, sunt descărcate masiv în sânge apare infecția septicemică, stare care poate fi însoțită de toxemie (Mihăescu și colab., 2008).
Tratarea dificilă a infecțiilor are la bază creșterea bacteriilor ca biofilme aderente și dezvoltarea de rezistență la agenții antimicrobieni a acestora, motiv pentru care au fost dezvoltate diverse tehnologii multimodale, cum ar fi terapii bazate pe principiile energiei electrice sau ultrasunete. Procesul de aderență de suprafață și dezvoltarea biofilmelor este o strategie de supraviețuire angajată de aproape toate bacteriile de peste milioane de ani. Aderența reprezintă așadar, etapa inițială a formării biofilmului microbian și este favorizată de prezența glicoproteinelor preformate și a polizaharidelor extracelulare sau sintetizate de novo pe suprafața celulei aderate. Bacteriile încep astfel să se multiplice rapid și se formează de regulă, un strat continuu monocelular care acoperă toată suprafața expusă a substratului. Celulele legate formează între ele microcolonii și biofilme, iar în cazul în care biofimul devine suficient de gros, straturile profunde devin anoxice și conțin specii anaerobe (Chifiriuc și colab., 2011).
Tratamentul antimicrobian ineficient este agravat de dezvoltarea bacteriilor în
biofilme formate pe țesuturi și materiale utilizate în medicină și laboratoare, datorită toleranței, un nou comportament ce presupune capacitatea de a supraviețui în prezența factorilor bactericizi exprimând o rezistență fenotipică. În ceea ce privește metalele grele, termeni cum ar fi “rezistență” și “toleranță” sunt adesea folosite în literatură ca sinonime, dar putem sesiza o diferență între cele doua noțiuni. Toleranța este un termen care pare mai potrivit pentru a face referire la capacitatea unei tulpini bacteriene de a crește în prezența unor concentrații mari de metal, pe când rezistența este determinată de mutații ale genelor cromozomale sau este consecința dobândirii unei plasmide R. Rezistența plasmidială la antibiotice și la agenți chimioterapeutici este multiplă, având capacitatea de a se răspândi atât pe verticală, de la o generație la alta, cât și pe orizontală, prin mecanisme de transfer genetic, între specii patogene (Mihăescu și colab., 2008).
Bacteriile au un timp rapid de reproducere și formează populații mari, ceea ce la face să fie capabile de a-și dezvolta relativ rapid mecanismele de rezistența la antibiotice, atunci când populația supraviețuiește expunerii. În ultima perioadă, apariția continuă a rezistenței la antibiotice a microorganismelor determină oamenii de știința să se implice în mod constant în dezvoltarea de noi compuși bioactivi, cu proprietăți antibacteriene. Rezistența bacterienă și multirezistența la antibiotice reprezintă o problemă majoră de sănătate publică în România și în întreaga lume, aceasta fiind declarată de către ECDC (Centrul European pentru Prevenția și Controlul Bolilor), ca una dintre problemele majore de sănătate public. Din această categorie fac parte si alte boli, precum: infecția cu HIV sau tuberculoză.
Plasmidele sunt structuri genetice separate fizic de cromozomul bacterian, care conțin informație genetică neesențială pentru creșterea și diviziunea celulei și sunt capabile de replicare autonomă, independentă de cromozom, dar controlată de genele cromozomale. Plasmidele cu același tip de informație genetică nu pot coexista într-o celulă, deoarece ele au capacitatea de a exclude din celulă alte plasmide cu aceleași secvențe de baze sau cu secvențe foarte apropiate. Acestea sunt alcătuite din molecule de ADN dublu catenar, circulare, covalent închise și sunt prezente în special la speciile de bacterii Gram-negative. Denumirea și clasificarea lor se poate realiza în funcție de efectul acestora, astfel că se împart în doua categorii: conjugative și neconjugative (tabelul 1) (Mihăescu și colab., 2008).
Tabelul 1. Tipuri de plasmide și funcțiile acestora
Prezența plasmidelor conferă celulelor purtătoare proprietăți noi, cum ar fi: rezistența la una sau mai multe grupe de antibiotice și la sulfamide; rezistența la cationi ai metalelor grele sau combinațiile lor cu alți compuși, despre care s-a discutat în cadrul lucrării (Zn, Ag, Hg, Ni, Co, Pb, etc.); rezistența la anioni sau compuși de intercalare și la radiațiile UV. De asemenea, plasmidele conferă proprietăți noi de biosinteză, metabolice și conjugative. Încă de acum două decenii, este cunoscut faptul că bacteriile au mecanisme specifice genetice de rezistență la metale toxice și ca urmare, există o nevoie tot mai mare de a descoperi noi agenți cu proprietati antibacteriane și antifungice, cu activitate eficienta, dar și toxicitate mai mică. Silver și Ji, precizează într-un studiu realizat în 1994 faptul că „plasmidele bacteriene conțin gene specifice pentru rezistențe la ioni ai metalelor grele toxice, incluzând: Ag+, AsO2-, ASO4(3-), Cd2+, Co2+, CrO4(2-), Cu2+, Hg2+, Ni2+, Pb2+ și Zn2+.”
Într-o celulă bacteriană se gasește un număr diferit de copii plasmidiale, în funcție de tipul de control pe care îl exercită cromozomul asupra replicării plasmidei, de dimensiunile plasmidei și de starea fiziologică a celulei. Amplificarea numarului de copii per celulă este dată de tratamentele chimice sau de manipulările genetice ale celulei. Eliminarea plasmidelor dintr-o celulă se poate realiza spontan, prin tratare cu substanțe care interfera selectiv cu replicarea lor, fără sa modifice dinamica replicării cromozomului. Din punct de vedere practic, se folosesc agenți chimici cu acțiune selectivă, mai ales pentru eliminarea plasmidelor de rezistență la antibiotice (Mihăescu și colab., 2008).
Rezistența plasmidială la antibiotice este multiplă și are capacitatea de a se răspândi prin mecanisme de transfer genetic între diferite specii patogene. Nivelul rezistenței nu modifică rata de creștere și nici virulența tulpinilor bacteriene, iar eliminarea plasmidelor este urmată de redobândirea sensibilității la aceleași antibiotice.
Combaterea rezistenței plasmidiale devine posibilă, daca avem în vedere următoarele căi:
a) utilizarea echilibrată a antibioticelor;
b) efectuarea unei antibiograme cantitative, înainte de administrarea antibioticului;
c) eliminarea selectivă a unor plasmide R, prin întrebuințarea unor agenți care inhibă replicarea acestora;
d) utilizarea unor antibiotice de seminteză, noi, pentru care nu s-a format deja un mecanism de rezistență;
e) interzicerea folosirii antibioticelor, care sunt considerate ineficiente, cel puțin pentru o anumită perioadă.
Cercetătorii au încercat să elimine aceste incoveniente produse de colonizarea microbiană a dispozitivelor protetice, prin studiul diferitelor tipuri de particule si materiale cu proprietăți biologice. Bacteriile care se atașează la suprafețe agregă într-o matrice polimerică autosintetizată. Formarea acestor comunități și rezistența lor inerentă la agenții antimicrobieni reprezintă originea a numeroase infecții bacteriene persistente și cronice (Seil și Webster, 2012).
Complexitatea implanturilor și a materialelor folosite au o impresionantă evoluție, iar împreună cu nivelul crescut de competență al medicilor, riscurile care apar după operație pot scădea semnificativ. Materialele recunoscute pentru implanturi protetice chirurgicale sunt hidroxiapatita, titanul, alumina sau fosfatul tricalcic, toate având capacitatea de legare osoasă. Totuși, aceste materiale nu prezintă efecte din punct de vedere farmaceutic în privința intensificării sintezei osoase sau a regenerării țesuturilor.
Formarea biofilmelor reprezintă o problemă majoră a domeniului medical, nu numai în cazul implanturilor protetice, ce implică țesutul osos, ci și în cazul unor echipamente utilizate în practica medicală. De exemplu, infecțiile asociate biofilmelor dezvoltate pe cateterele venoase sau urinare reprezintă cea mai comună infecție datorată biomaterialelor utilizate în medicină. Biofilmele prezente pe cateterele venoase pot exista pe suprafața internă a cateterului sau se pot dezvolta din cauza microorganismelor colonizatoare ce provin de pe pielea pacientului de la locul inserției, mergând de-a lungul suprafeței cateterului și dezvoltând un biofilm în 3-10 zile. Cateterele urinare reprezintă dispozitive tubulare de latex sau silicon, iar microorganismele care aderă la nivelul acestora, pot dezvolta un biofilm ce determină creșterea locală a valorii pH, favorizând precipitarea mineralelor, cum ar fi fosfatul de calciu și fosfatul de magneziu amoniacal. Alte echipamente pe care se pot dezvolta frecvent biofilme, sunt lentilele de contact și acest lucru constituie un risc mare de contaminare pentru purtătorii lor (Lazăr, 2003).
Inserarea dispozitivelor protetice medicale pentru diferite scopuri de explorare sau terapeutice, în special în condiții patologice grave, reprezintă un factor de risc pentru apariția infecțiilor cronice, fiind caracterizate de debut lent, simptome de intensitate medie, evoluție cronică și rezistență la tratamentul cu antibiotice (Iconaru și colab., 2013).
Este de dorit ca materialul din care este constituit un implant chirurgical să posede și proprietăți antibacteriene, pentru a combate riscul de infecții postoperatorii. Pentru realizarea acestui lucru se pot utiliza ioni bivalenți, cum ar fi zincul, care este un element esențial, ce are efect stimulator asupra formării osoase și de asemenea, deține proprietăți antimicrobiene.
Aplicațiile biomedicale ale hidroxiapatitei si proprietățile antimicrobiene ale
acesteia
Cele mai importante materiale anorganice cu proprietăți biologice semnificative studiate pentru îmbunătățirea interacțiunilor biologice între material și organism sunt cele pe bază de fosfat de calciu, un compus ce abundă în țesutul osos al corpului uman. Fosfații de calciu au compoziții variate în țesutul dur și sunt: hidroxiapatita cu formula generală Ca10(PO4)6(OH)2., pirofosfatul de calciu (Ca2P2O7), fosfatul tricalcic (Ca3(PO4)2) și fosfatul tetracalcic (Ca4P2O9). Datorită bioactivității, cercetatorii utilizează intens în studiile lor compuși ce conțin hidoxiapatită și de asemenea, reprezentantul principal al acestei lucrari este hidroxiapatita (Costescu și colab., 2013; Webster și colab., 2004).
Fig 1. Structura hidroxiapatitei
(Sursă: http://www.info-farmacia.com/)
Este cunoscut faptul că biomaterialele de fosfați de calciu formează o legătură strânsă cu noul țesut osos, ghidând practic sinteza osoasă. Hidroxiapatita are o structură hexagonală construită din coloane de atomi de calciu și oxigen, paralele cu axele hexagonale, iar proprietățile chimice și biologice sunt puternic dependente de raportul Ca:P. Biomaterialele utilizate în scop medical pot primi diferite forme și anume: particule, granule sau blocuri dense sau poroase, tocmai pentru a face față cerințelor clinice.
Fig 2. Imagine de microscopie electronică de scanning a hidroxiapatitei
(Sursa: http://www.upc.edu/cmem/research)
Hidroxiapatita este o foma de fosfat de calciu mineral, care se gasește în corpul uman ca fiind principalul constituent anorganic în oase și dinți și de asemenea, intra în alcătuirea rocilor și colarilor. Scheletul de coral are o structura poroasă și poate fi transformat în hidroxiapatită, la temperaturi ridicate. Datorită proprietăților sale remarcabile, precum biocompatibilitate, osteoconductivitatea și bioactivitatea, nanoparticulele de hidroxiapatita au fost investigate și pentru evoluția tehnologiilor medicale, atât pentru implanturi stomatologice, cât și pentru proteze utilizate în ortopedie. Biodegrabilitatea hidroxiapatitei preparată comercial este limitată pe o durată de câțiva ani sau chiar absentă. Termenul de osteoconductivitate poate avea mai multe înțelesuri, în funcție de domeniul în care se folosește. În știința biomaterialelor, osteoconductivitatea semnifică formarea osoasă controlată dinspre osul gazda spre materialul implantat, iar absența altor țesuturi interpuse între cele două confirmă, practic, această proprietate. Condiția necesară pentru a permite sinteza osoasă este reprezentată de existența de pori deschiși interconectați, cu diametre mai mari de 100 μm, pentru a permite o vascularizație bună (Da Silva și colab, 2003).
Pe lângă hidroxiapatită, există diverse biomateriale care au proprietăți similare, de exemplu biosticla, ceramicile bifazice de fosfat de calciu (BCP) sau fosfat tricalcic (TCP) si cimenturile de fosfat de calciu. Orice material osteoconductiv formează in vivo un strat de apatită biologică pe suprafața lui, pe care se așază apoi celule osteogenice, sintetizând noua substanță osoasă. Biomaterialele osteoconductive sunt de asemenea, adecvate pentru grefe, deoarece asigură un rol structural si mecanic, acționând ca un șablon pentru regenerarea noilor țesuturi. Totuși, biomaterialele în sine, nu pot repara defecte osoase majore, iar formarea osoasă este limitată. O proprietate care poate fi menționată este osteoinducția, care se realizează în organism prin doua procese: inițial are loc diferențierea celulară de la celule non-osteogenetice la celule osteogenetice și ulterior are loc morfogeneza osoasă (Yuan și De Groot, 2005)
Cele mai utilizate ceramici de fosfat de calciu sunt cele de hidroxiapatită sau amestecuri ale acestora și deși compoziția și forma acestora variază, proprietățile ramân aceleași. Sunt biocompatibile, non-toxice, inactive din punct de vedere antigenic si cancerigen și se pot diferenția prin comportamentul la dizolvare și viteza de bioresorbție. Ceramicele de hidroxiapatită din coral sau cele fabricate din pulbere de apatită sintetică se dizolvă foarte încet, spre deosebire de ceramicile de fosfat tricalcic care se dizolvă rapid.
Fig 3. Cinetica de dizolvare ceramicilor de fosfat de calciu in vitro
(Sursa: Yuan și colab., 2005)
Așadar, un subiect preferat de catre cercetatori, la nivel global, este reprezentat de descoperirea unor compuși cu biocompatibilitate mare și proprietăți antimicrobiene crescute, cu scopul de a diminua rata de mortalitate și problemele cu care se confrunta atât medicii, cât și pacienții. Hidroxiapatita este un compus, care a demonstrat de-a lungul experimentelor, ca deține capacitatea de a-și menține structura și proprietățile originale în momentul înlocuirii ionilor de Ca2+ cu alți ioni de metale, cum ar fi: Cu2+, Zn2+ și Ag2+ (Iconaru și colab., 2013).
Aportul nanotehnologiei în dezvoltarea biomaterialelor cu proprietăți optimizate
Nanotehnologia reprezintă un domeniu care stă la baza evoluției actuale și viitoare, în aplicațiile tehnologice și industriale. În ultima perioada, datorită cercetărilor progresive realizate în acest domeniu, s-a înregistrat o spectaculoasă cunoaștere a materialelor la scară atomică și moleculară.
Cel mai frecvent, prin nanotehnologie se urmarește descoperirea de noi materiale sau dezvoltarea celor existente și folosirea lor în obținerea de produse medicale, cosmetice sau în alte procese biotehnologice. De asemenea, există studii importante care investigheaza pe larg proprietățile ecologice ale unor tipuri de nanoparticule (Lens, 2009).
Pentru realizarea pulberilor de metale se poate utiliza sintetizarea laser. Nanotehnologia utilizează materiale cu dimensiuni la nivel atomic sau molecular și a devenit tot mai întrebuințată pentru aplicații medicale, fiind de mare interes mai ales pentru reducerea activității numeroaselor microorganisme. Prin cercetările lor, oamenii de știință depun un efort semnificativ în studiul nanotehnologiei, mai ales în ceea ce privește obținerea de biomateriale noi sau îmbunătățirea materialelor cu proprietați biologice existente, destinate utilizării în aplicații clinice. Obiectivul acestui tip de cercetare este de a studia, de a facilita și de a îmbunătăți interacțiunile biologice între materialele folosite în practica medicală și organism (Moore, 2006).
Biomaterialele ar putea fi definite ca materiale funcționale în contact cu țesuturile vii. Încorporarea unor medicamente, de tipul antibioticelor sau antisepticelor, sub formă de nanoparticule, facilitează pătrunderea adâncă a acestora în țesuturi prin traversarea stratului epitelial și a capilarelor fine. Din acest punct de vedere, nanoparticulele sunt foarte avantajoase, iar acest lucru reprezintă principalul factor care favorizează aplicarea nanotehnologiei în domeniul medical. De asemenea, datorită dimensiunilor reduse și a concentrației optime, medicamentele sub această formă sunt eliberate controlat în sânge și cu o viteză predeterminată, pentru o perioadă suficient de lungă de timp pentru a ajunge la locul țintă. Spre deosebire de metodele de administrare enterale sau parenterale, introducerea de medicamente sub forma de pulbere exact la locul țintă, crește considerabil indicele terapeutic, eficacitatea tratamentului și scade efectele secundare nocive asupra organelor, care ar putea apărea din cauza unei concentrații serice ridicate (Venkatasubbu, 2011).
Proprietățile antimicrobiene ale cationilor metalici divalenți (Zn, Hg, Ag, Cu, Fe)
Proprietățile antibacteriene ale cationilor metalici bivalenți sunt investigate de către cercetatori, în numeroase studii (Webster și colab., 2004), iar pentru a înțelege pe deplin proprietățile acestor nanostructuri, este important să se cunoască faptul că mecanismele de acțiune variază de la nanoparticule la nanoparticule. De exemplu: unele metale, precum: zinc, argint sau cupru, prezintă ele înșile activitate antibacteriană, pe când altele, cum ar fi: mercur sau fier, nu sunt antibacteriene ca atare, ci sub formă de compuși (oxizi sau săruri).
Particulele mici de zinc și de alți ioni bivalenți (argint, mercur sau cupru) sunt folosite adesea în studiile cercetătorilor, mai ales pentru evidențierea proprietăților bacteriostatice sau chiar bactericide. Se presupune că unul dintre mecanismele implicate în efectul inhibitor și bacteriostatic este atracția electrostatică dintre celulele bacteriene încărcate negativ și ionii bivalenți încarcați pozitiv.
Efectul antimicrobian al unor compuși chimici este dependent de sensibilitatea microorganismului și de faza sa de creștere; de natură, concentrația și durata acțiunii substanței bactericide; de compoziția chimică a mediului, temperatură și pH (Mihăescu și colab., 2008)
1.3.1. Zincul (Zn)
Sărurile de zinc (sulfatul, clorura și oxidul) sunt astringente, corozive și moderat antiseptice. Sunt utilizate frecvent sub formă de pulberi antifungice, unguente și loțiuni. Acțiunea substanțelor dezinfectante asupra organismelor se desfasoara treptat, printr-un proces în cursul căruia, numarul bacteriilor viabile scade progresiv.
A fost dovedit că ZnO reduce în mod natural activitatea unei game largi de tulpini de bacterii, în special bacterii Gram pozitive, fără utilizarea antibioticelor. Întelegerea proprietăților antibacteriene ale oxidului de zinc se îmbunătățeste în continuare prin aplicarea nanotehnologiei (Silver și Ji, 1994).
Există diferite studii în care s-a investigat efectul antibacterian al particulelor de ZnO. De exemplu, într-un experiment particulele de oxid de zinc au fost testate pe diferite suspensii lichide de celule, iar concluzia este că nanoparticulele au avut un mare efect asupra acestora. Particulele de ZnO, cu dimensiuni extrem de mici, au redus numărul de colonii de Bacillus subtilis cu 100%, Escherichia coli cu 75%, iar Pseudomonas fluorescens cu 50%. De asemenea, nanoparticulele de ZnO au redus viabilitatea tuturor speciilor de bacterii cu 100 % față de control. Viabilitatea redusă a speciilor de bacterii s-a observat o dată cu expunerea microorganismelor la nanoparticule de mărime descrescătoare. Pentru a reduce viabilitatea speciilor B. subtilis si E.coli, a fost necesară o concentrație de 5 mM din nanoparticulele cu cel mai mic diametru testat. Cele două specii bacteriene testate au fost afectate în mod aproximativ egal de prezența nanoparticulelor. ZnO a fost mai toxic pentru toate speciile de bacterii decât alte particule biochimice de mărime comparabilă, care au fost testate în același studiu (oxidul de aluminiu și dioxidul de siliciu) (Adams LK și colab., 2006).
Într-un alt studiu realizat pentru a elucida mecanismele efectului antibacterian al particulelor de ZnO, a fost determinată producerea de peroxid de hidrogen, o specie reactivă de oxigen, careia i se atribuie activitate bactericidă. ZnO a produs cea mai mare cantitate de peroxid de hidrogen și chiar se poate menționa ca producția de peroxid de hidrogen nu a fost detectată cu alte pulberi ceramice testate, cum ar fi oxidul de magneziu și oxidul de calciu. Astfel s-a concluzionat ca efectul antibacterian al pulberii de ZnO a fost atribuit acestui fenomen. (Yanping Xie și colab., 2011)
1.3.2. Mercurul (Hg)
Mercurul este utilizat sub formă de săruri anorganice, precum: HgCl2, oxicianura de
Hg sau sub formă anorganică: mertiolat, mercurocrom.
Sărurile de Hg pot forma mercapeptide, în reacție cu grupările SH ale proteinelor. Această reacție este reversibilă și conferă mercurului un efect microbiostatic. Prin adăugarea în exces a unor compuși ce conțin grupări –SH, de tipul: glutation sau tioglicolat, efectul sărurilor de Hg este neutralizat și de aceea, această reacție este scoasă din uz. În laboratoare, se folosește curent HgCl2, care la concentrații de 1/1000 până la 1/10000 are efect bactericid, iar în concentrație mai mică (1/20000) are efect bacteriostatic. (Gh. Mihaescu si colab., 2008).
1.3.3. Argintul (Ag)
Arigintul și compușii săi, în concentrație foarte mică au efect microbiostatic, iar în
concentrații mai mari, efect microbicid.
Se consideră că unele proteine au afinitate mare pentru ionii de Ag, fixându-i chiar în concentrații mici. Argintul este activ și asupra enzimelor, poate inhiba diviziunea celulara sau poate produce lezarea membranelor celulare. De exemplu, s-a demonstrat că argintul produce inhibiția creșterii la Cryptococcus neoformans sau lezarea membranei externe și anomalii structural ale componentelor celulare la Pseudomonas aeruginosa. (Mihăescu și colab., 2008)
Nanoparticulele de argint au fost folosite de secole pentru proprietățile lor bacteriostatice. Nano-argintul poate reduce infecțiile la pacienți, dependența utilizării de antibiotice și costurile asociate, considerându-se că aceste nanoparticule au un potențial imens pentru aplicații clinice. Totuși, efectul bactericid al nanoparticulelor de argint nu este pe deplin înțeles. A fost demonstrat că Ag+ se leagă de grupări funcționale de proteine, ceea ce duce la denaturarea acestora. Se presupune că unul din mecanismele implicate în efectul inhibitor și bacteriostatic se referă la atracția electrostatică între încărcarea negativă a celulelor bacteriene și nanoparticule de argint încărcate pozitiv. Unele studii au demonstrat ca efectul acestor nanoparticule depinde de morfologie și dimensiuni (Ciobanu și colab., 2013).
Cei mai importanți compuși cu acțiune antimicrobiană, proveniți de la argint sunt prezentați în tabelul 2:
Tabelul 2. Compuși pe bază de Ag cu activitate antimicrobiană
Într-un studiu conceput pentru a compara proprietațile antibacteriene ale nanostructurilor de argint de diferite forme s-a ajuns la concluzia că argintul în forme triunghiulare și nanosfere este mai eficient în reducerea viabilitații culturilor de E. coli, fața de ionii sau nanoparticulele de argint. Astfel, diferite volume din nanostructurile de argint au fost testate pe plăci de agar însamanțate cu suspensii de celule ale mai multor specii de bacterii. Formarea de colonii a fost aproape complet inhibată atunci când 1 pg de nanostructuri triunghiulare de argint, cu o lățime de aproximativ 50 nm a fost adăugată la placa de agar. În schimb , pentru a reduce comparabil activitatea bacteriilor cu nanoparticule sferice a fost nevoie de 12,5 micrograme. Inhibarea dependentă de doză a activității bacteriilor a fost observată pentru toate formele nanostructurilor de argint. După 24 h de creștere, populațiile de celulele de pe cele 10 plăci au fost cu 70% mai mici decât la plăcile de control, care nu conțin nanoparticule de argint. De altfel, s-a observat o inhibare a creșterii bacteriilor dependentă de concentrație, spre exemplu concentrații cu valoarea de peste 50 mg/ml au inhibat complet creșterea de E. coli (Da Silva și colab., 2012).
Procesul de producere a nanoplacilor de argint poate avea ca rezultat adăugarea de o sarcină pozitivă pe suprafața particulelor, care sporește interacțiunile electrostatice dintre particule și celule. În concluzie, acest efect, împreună cu forma particulei, explică activitatea antibacteriană superioară a particulelor triunghiulare. În rest, activitatea antibacteriană a tuturor nanostructurilor de argint a fost atribuită interferențelor dintre ionii de argint și integritatea membranei celulare, lanțul respirator sau replicarea ADN.
1.3.4. Fierul (Fe)
Fierul convențional nu este considerat antibacterian, dar cu toate acestea au fost efectuate câteva studii privind efectul unor compuși ai fierului (FeO, Fe2O3) asupra bacteriilor și s-a observat inhibarea activității microorganismelor. Se consideră că mecanismul antibacterian al nanoparticulelor de oxid de fier este legat de capacitatea nanoparticulelor de a pătrunde în celulă și de a genera noi specii de oxigen reactive. Astfel că, activitatea antibacteriană a fost din nou atribuită creșterii stresului oxidativ în celula și interferenței cu membrana bacteriilor.
Nanoparticulele de oxid de fier sunt din ce în ce mai dezvoltate pentru utilizarea în aplicații de cercetare și biomedicale, cum ar fi transportul la țintă de medicamente antimicrobiene. Nanoparticulele de oxid de fier pot fi utilizate in tratamentul infecțiilor generalizate și locale, deoarece, datorită dimensiunii lor mici, proprietățiilor supermagnetice și parametrilor controlabili, pot interacționa direct cu celulele microbiene, provocând perturbarea funcțiilor metabolice, cauzând în final distrugerea celulei. Așadar, oxizii de fier sunt de mare interes, nu numai datorită proprietăților lor antibacteriene, ci și datorită proprietăților lor superparamagnetice care ar putea permite unor astfel de particule să fie introduse în interiorul corpului cu un câmp magnetic, eventual după o acoperire cu un anumit tip de agent antimicrobian. (Masadeh MM și colab., 2014)
Titanul (Ti)
Pe lânga experimentele realizate pe substanțele menționate anterior, există cercetări care arată că nanoparticulele de titan cu diametre mici prezintă un efect antibacterian.
De exemplu, într-un studiu s-a folosit o varietate de nanoparticule de dioxid de titan, cu diametrul cuprins între 12 și 707 nm. Ca și condiții experimentale s-au utilizat potențiale zeta cu valori cuprinse între -50 și 44 mV, iar testarea s-a facut pe suspensii apoase de bacterii, de concentrație: 10, 100 și 500 pg/ml. Dintre toate particulele testate, cel mai mare efect s-a observat în cazul celor cu diametre foarte mici și în care potențialul zeta a fost mai pozitiv. Particulele de dioxid de titan cu diametre mari sau care au avut un potențial zeta negativ, au fost ineficiente pentru reducerea viabilității bacteriilor. Autorii menționeaza că a fost observată prezența tuturor varietăților de nanoparticule la suprafața membranelor celulare, dar în spațiul periplasmic au pătruns numai particulele cu un potențial zeta pozitiv. Acest lucru sugerează faptul că potențialul zeta joacă un rol semnificativ în capacitatea unei particule de a pătrundă în corpul celular și mai ales, de a-și exercita efectul antibacterian. (Chan CM și colab., 2013)
Titanul este un element chimic din grupa a IV-a a tabelului periodic, care se găsește în natură în special sub formă de bioxid de titan. Este un metal dur și casant, dar este mult mai ușor decât alte metale cu proprietăți mecanice și termice similare. Fiind un metal al grupelor tranziționale, titanul formează numeroși compuși chimici stabili sau instabili și de asemenea, se prelucrează ușor sub diferite forme, precum: pulberi, tije metalice sau foi de metal. Toate aceste proprietăți conduc la utilizarea titanului în diferite domenii științifice, inclusiv în medicină.
Mecanisme de acțiune antimicrobiană ale zincului și compușilor derivați
Zincul este un element esențial, ce se găsește în matricea osoasă, în anumite țesuturi și în plasmă. Conținutul de zinc în osul uman este de 0,0126-0,0217%. Zincul se poate lega de mai multe componente celulare, iar componentele interactioneaza cu membrana. Mecanismul exact al acțiunii antibacteriene al nanoparticulelor de zinc nu este pe deplin înțeles, dar putem remarca în literatura de specialitate, că exista o atracție electrostatica între celulele bacteriene încărcate negativ și ionii bivalenți încărcați pozitiv. (Hamouda și Baker, 2000)
Există studii care scot în evidență proprietățile antibacteriene ale hidroxiapatitei dopată cu zinc mai ales, prin încorporarea la nivelul acestor particule a unor antibiotice. Ca și exemplu, Justin T Seil și Thomas J Webster, au ca scop într-una dintre lucrările lor, publicate în anul 2012, dezvoltarea utilizării de hidroxiapatită dopată cu zinc și ciprofloxacină. Se pare că acest mix are o bună activitate antibacteriană împotriva unor bacterii, precum Pseudomonas aeruginosa si Staphylococcus aureus, fapt ce ne interesează în lucrarea de față. Ca și tehnică de lucru, particulele de hidroxiapatită dopată cu zinc s-au preparat și caracterizat prin difracție de raze X, microscopie electronica de transmisie și spectrometrie de emisie optică cu plasmă cuplată inductiv. Acestea au fost încărcate cu ciprofloxacină, folosind parametrii optimizați pentru evidențierea activitații antimicrobiene. In cadrul experimentului a fost analizată influența zincului cu privire la eliberarea controlată a ciprofloxacinei, iar rezultatele arată că prezența zincului crește procentul de eliberare a medicamentului într-un mod controlat.
Proprietățile antimicrobiene ale zincului și compușilor săi, împreună cu biocompatibilitatea nanoparticulelor de hidroxiapatita sprijină posibila utilizare a lor pentru diverse aplicații medicale, cum ar fi: pansamente textile și ortopedice sau proteze dentare și implanturi cu rezistență îmbunătățită la colonizare microbiană.
1.4.1 Compuși ai zincului cu proprietăți antimicrobiene: ZnO
Efectele antibacteriene observate pe nanoparticulele de ZnO nu sunt elucidate în întregime dar, se pare că acestea reduc în principal viabilitatea bacteriile Gram-pozitive și mai puțin a bacteriile Gram-negative.
Unul dintre mecanismele de acțiune ale oxidului de zinc este acela că produce specii de oxigen reactive, în special în prezența luminii ultraviolete, care interfera cu funcțiile celulelor. Tot aceeași situație se regasește și în cazul ionilor de argint, care pot perturba replicarea ADN-ului și a diviziunii celulare. Ambele tipuri de particule chimice par să compromită integritatea membranei bacteriei datorită interacțiunilor fizice. Producția de specii reactive de oxigen și tulburarea membranelor celulare cauzate de actiunea nanoparticulelor de ZnO poate reprezenta un mecanism bactericid. Cu toate acestea, se constată că prezența de specii de oxigen reactive este dependentă de doza de nanoparticule de ZnO (Yanping Xie și colab., 2011).
Este cunoscut faptul că ionii de zinc inhibă activități multiple în celulele bacteriene, cum ar fi: glicoliza, translocarea transmembranară de protoni și toleranța. Spre deosebire de nanoparticulele de ZnO, care au posibilitatea de ucidere a bacteriilor (efect bactericid), prezența ionilor de zinc poate doar inhibă proliferarea bacteriilor, având efecte bacteriostatice. Proprietățile bactericide ale ZnO depind de diferite mecanisme antibacteriene, de exemplu, pentru bacterii cultivate în suspensie in vitro, literatura sugerează că particulele cu diametru mai mic sunt mai eficiente în reducerea activității bacteriilor decât particulele mai mari, chiar dacă acestea au structuri chimice identice.
La celulele eucariote, potențialul de utilizare ca agent antibacterian a diverselor particule este dependent de citotoxicitate. Astfel concentrațiile de nanoparticule necesare pentru a ucide bacteriile nu pot depăși concentrațiile care ar compromite semnificativ funcțiile celulelor eucariote. Experimental, a fost investigata citotoxicitatea oxidului de zinc pe o celulă neuronală de șoarece. Nanoparticule de ZnO, cu un diametru mediu de 70 nm au fost adăugate la mediul de cultură, în concentrații de 10, 25, 50 și 100 pg/ml. După 12 ore de expunere la nanoparticule, s-a cuantificat numărul de celule prezente printr-un test de viabilitate. Concentrațiile de 10, 25, 50 și 100 pg/ml a redus viabilitatea celulară cu 90%, 80%, 55% și respectiv, 10% față de control.
Studii similare s-au realizat și pe celule umane. În continuare sunt prezentate câteva exemple în acest sens. Potențiala toxicitate a nanoparticule de ZnO a fost investigată pe celule epiteliale pulmonare, cultivate in vitro. Ca și condiții experimentale s-au folosit 40 pg/ml și 80 pg/ml de nanoparticule de ZnO, cu diametrul mediu de 71 nm și un potențial zeta de 26,9 mV. După 18 ore, celulele au fost clătite, tripsinizate, colorate cu albastru de tripan și numărate utilizând un hemocitometru. Viabilitatea celulară a fost redusă cu 75% pentru concentrația de 40 pg/ml și 62 % pentru concentrația de 80 pg/ml. Comparativ cu grupurile de control pentru fiecare concentrație de nanoparticule, prezența de specii de oxigen reactive nu a fost semnificativ crescută. Rezultatele arată și faptul că s-au produs deteriorarea ADN-ului sau leziuni oxidative la nivelul acestuia. Citotoxicitatea și daunele asupra ADN-ulului au fost atribuite în mare parte prezenței de zinc ionic. (Seil și Webster, 2012)
Un potențial zeta puternic promovează interacțiuni între nanoparticule și membranele celulare bacteriene, ceea ce conduce la dezintegrarea membranei și o reducere a viabilității. Potențialul zeta, împreună cu dimensiunea particulelor reprezintă parametri foarte importanți în controlul efectelor antimicrobiene. Având în vedere studiile anterioare, se poate specula că nanoparticulele de argint sau ZnO, care prezintă un diametru foarte mic (<30 nm) și care au fost pregatite pentru a fi expuse la o sarcină pozitivă reprezintă cea mai eficientă metoda de a reduce viabilitatea bacteriilor.
Colectiv, aceste studii au în vedere concentrațiile de nanoparticule necesare pentru a inhiba activitatea bacteriilor, dar fară a avea efecte citotoxice locale. Concentrațiile de nanoparticule necesare pentru tratamentul unei infecții trebuie să se limiteze la volumul de bacterii pentru care se aplică tratamentul. Dozele relativ mari de nanoparticule introduse la locul infecției pot deveni mai puțin concentrate, deoarece disipa în tot corpul și de aceea, ar fi ideal, dezvoltarea unor tehnici ce pot limita acțiunea nanoparticule doar la locul infecției (Sevinç și Hanley, 2010).
În literatura de specialitate, cercetătorii evidențiază faptul că și alți ioni metalici, încorporați la nivelul unor nanomaterial sau pulberi, au un efect antibacterian. De exemplu, într-un studiu realizat pe tulpini de Escherichia coli, a fost testată citotoxicitatea nanoparticulelor pe bază de diferiți oxizi ai metalelor, precum ZnO, CuO, Co3O4 și TiO2. Se pare că, interacțiunile dinamice ale mai multor mecanisme conduc la efectul antimicrobian al oxizilor metalelor. Mecanismul de toxicitate s-a determinat prin măsurători ale stresului oxidativ, iar clasamentul general a fost în ordinea ZnO < CuO < Co3O4 < TiO2, în condiții de întuneric și ZnO < CuO < TiO2 < Co3O4 la lumină. Dintre nanoparticulele testate, ZnO a fost cel mai toxic pentru specia bacteriană testată, dar și ceilalți ionii metalici eliberați au avut un efect antitoxic parțial la E. coli (Da Silva, 2003).
1.4.2. Mecanismele moleculare ale activității antimicrobiene ale nanoparticulelor pe bază de Zn
Pentru toate tipurile de nanoparticule, mecanismul antibacterian nu este pe deplin înțeles. În timp ce unele mecanisme propuse, sunt legate de structura fizică a nanoparticulelor (de exemplu, deteriorarea membranei din cauza abrazivitatii nanoparticulelor sau penetrarea peretelui celular), altele se referă la cantitatea crescută de ioni metalici de pe suprafețele de nanoparticulelor. Suprafața specifică a unei doze de nanoparticule crește pe măsură ce scade dimensiunea particulelor, care permite o interacțiune mai mare de material cu mediul înconjurător. Astfel, pentru unele materiale cu proprietati antibacteriene, cum ar fi zincul și argintul, daca crestem raportul suprafață-volum se amplifică și efectul antibacterian (Pal și colab., 2007).
Raportându-ne la studiile realizate până acum, se poate concluziona că nanoparticule mici (cu diametru ≤ 30 nm) par a fi mai capabile să pătrundă în celula bacteriană. Deși interferența cu membranele celulare și pierderea ulterioară a viabilității celulare este atribuită aproape tuturor tipurilor de nanoparticule, unele studii arată că în special particulele cu un diametru mic și potențial zeta pozitiv acționează mai eficient. Penetrarea membranei este posibilă datorită interacțiunii electrostatice dintre nanoparticule cu potențial zeta pozitiv și suprafețele bacteriilor, care sunt încărcate negativ din cauza conținutului de polizaharide (Seil și Webster, 2012).
Un alt mecanism, aproape universal pentru descrierea activității antibacteriene a unor
nanoparticule este reprezentat de generarea de specii de oxigen reactive, care pot reduce viabilitatea celulelor bacteriene. Dar efectele toxice ale metalelor grele asupra microorganismelor sunt influențate de o multitudine de factori, cum ar fi: pH-ul, concentrația de agenți de chelatizare și materie organic, iar prezența acestor elemente în mediul de lucru poate duce la un impact asupra comunitaților microbiene. Speciile reactive de oxigen (SRO) sunt reprezentate de radicali de oxigen (superoxid, peroxid , hidroxil,) precum și de derivați non-radicalici ai oxigenului (peroxid de hydrogen sau oxigen singlet). SRO se formează sub influența radiațiilor ionizante (raze X sau gamma) și în timpul unor procese fiziologic normale precum respirația celulară. Formele active ale oxigenului, reprezintă stări chimice caracterizate prin prezența unui electron neîmperecheat în orbitalii atomici sau moleculari. Datorită dubletului electronic incomplet, sunt molecule extrem de instabile din punct de vedere chimic, care manifestă tendința de a extrage un electron din cadrul altei molecule, ce implicit va fi oxidată.
Dacă SRO nu se acumulează în exces în organism, acestea au doar efecte pozitive, fiind implicate în diverse mecanisme celulare. În ceea ce privește raspunsul imun, la nivelul macrofagelor și neutrofilelor, prin internalizarea structurilor antigenice de tip bacterian se activează NADPH oxidaza care catalizează reacția de formare de anion superoxid, ce va produce peroxidul de hidrogen care constituie finalizarea procesului, inducând liza bacteriei, cu scopul de a apăra organismul. Pe de altă parte, excesul de specii reactive de oxigen poate determina disfuncții la nivelul membranelor celulare, deoarece acestea au un conținut bogat in acizi grași polinesaturați, care prezintă un grad ridicat de susceptibilitate la acțiunea SRO, suferind modificări de permeabilitate. Pe de altă parte, excesul conduce la modificări conformaționale ale proteinelor, iar la nivelul ADN favorizează apariția mutațiilor sau alterarea exprimării corecte a genelor prin modificarea tipului de baze azotate (Mohora, 2008).
Ionii unor metale grele sunt toxici pentru microorganisme, deoarece prezintă capacitatea de a fi activi la concentrații foarte mici, datorită afinității lor pentru grupările SH. În concentrații supraoptimale, ionii metalelor grele acționeaza prin precipitarea enzimelor sau a unor proteine importante din structura celulei, prin interferenta cu grupările lor active. Ionii metalici pot fi așezați într-o serie descrescătoare a activității antimicrobiene, după cum urmeaza: Hg> Ag> Zn> Cu (Mihăescu și colab., 2008).
Metalele grele sunt un grup de metale cu densitate mai mare de 5 g/cm3, care se găsesc în natură în proporții relativ ridicate. Unele metale grele, precum: nichel, fier, cupru și zinc sunt esențiale pentru reacțiile metabolice și sunt necesare pentru buna funcționare a organismului. Altele, cum ar fi mercur, argint și cadmiu nu au nici un rol biologic și sunt nocive pentru organism, chiar și la concentrații foarte scăzute.
Argintul este considerat un metal natural antibacterian, care are probabil mecanisme multiple de activitate antibacteriană. Progresia utilizarii argintului ca agent antibacterian se datoreste diferitelor studii, mai ales celor care au la baza nanotehnologia. S-a dovedit că nanoparticule de argint cu un diametru mediu de 21 nm și concentrații ≥ 75 pg/ml, inhibă dezvoltarea speciilor de bacterii Gram-negative (E. coli, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, P. aeruginosa). Într -un alt studiu care compară caracteristicile morfologice ale bacteriilor Gram pozitive (de exemplu S. aureus) și Gram negative (E. coli) expuse la aceeași concentrație de ioni de argint (10 pg/ml de nitrat de argint pentru 4-12 ore), la ambele specii de bacterii testate au fost observate condensare ADN-ului, separarea membranei celulare de peretele celular sau daune ale peretelui celular. Mai mult, ionii de argint au fost detectati în citoplasma fiecarui tip de bacteria, fapt ce a clarificat rolul argintului ca și ion metalic divalent în mecanismul antibacterian (de Silva și colab., 2012).
Autorii atribuie efectul bactericid al nanoparticulelor de argint la o serie de mecanisme. În primul rând, prezența unui număr mare de nanoparticule în interiorul bacteriilor sugerează că permeabilitatea membranei reprezintă un factor important în mecanismele antibacteriene. Interacțiunea dintre particulele de argint și membrana bacteriilor conduce la reacții chimice ce afectează diviziunea celulară și provoacă moartea celulelor. Acest lucru se datorează faptului că proteinele membranei conțin în special sulf, iar ADN care conține fosfor. După expunerea la argint ionic, ADN-ul bacterian încearcă să își formeze mecanisme de aparare pentru a se proteja de un mediu înconjurător toxic și prin urmare, este compromisa capacitatea de replicare a bacteriilor. Astfel, răspunsurile la argint ionic și la nanoparticule de argint sunt diferite, dar ambele sunt esențiale pentru o înțelegere completă a activității antibacteriene (de Silva și colab., 2012).
Există studii care analizează prezența toleranței la unele metale, cum ar fi: crom, argint și mercur, în bacteriile de la canalizare și unele efecte ale metalelor grele asupra microorganismelor, care sunt capabile să supraviețuiască și să crească în prezența lor. Experimentele se bazează pe reacții enzimatice asupra activității bacteriene, cum ar fi acțiunea catalazei, hidroliza gelatinei și reducerea nitratului, încercându-se analizarea posibilelor interțiuni dintre aceste elemente toxice și bacteriile tolerante. În concluzie, se poate menționa că s-au produs modificări fiziologice și metabolice la nivelul culturilor microbiene, lucru ce poate fi important , de exemplu, în situații precum utilizarea microorganismelor tolerante metalice pentru bioremediere a mediilor contaminate (de Silva și colab., 2012).
Partea practică
CAPITOLUL II.
Testarea activității antimicrobiene a unor nanoparticule ce conțin
hidroxiapatită și zinc
Acest capitol constituie partea practică desfășurată în laboratorul de Microbiologie al Facultații de Biologie și este structurat sub formă de: introducere, materiale și metode, rezultate, discuții și concluzii.
Partea experimentală a acestei lucrări are ca și finalitate, bioevaluarea unor tehnologii care să crească eficiența metodelor terapeutice și scăderea numărului de intervenții postoperatorii, conducând la eficientizarea serviciilor de sănatate. Hidroxiapatita este unul dintre materialele, care prezintă principalele proprietăți necesare pentru utilizare în confecționarea protezelor și anume: biocompatibilitate, osteoconductivitate, rezistența la coroziune, la frecare și la presiune și de asemenea, importantă activitate antimicrobiană, în cazul combinării cu pulberi de titan sau ioni bivalenți. Se găsește, în mod natural în corpul uman și are capacitatea de a substitui ionii de Ca2+ cu alți ioni de metale, cum ar fi Cu2+, Zn2+, Ag 2+, fără a-și modifica structura sa inițială și proprietățile.
Una dintre problemele majore cu care se confruntă medicina modernă este de a găsi noi materiale care pot fi integrate în corpul uman, fără a fi respins de țesutul gazdă. Pentru a putea fi integrate cu succes în corpul uman, materialele nanostratificate trebuie să aibă proprietăți specifice, cum ar fi o bună biocompatibilitate și biodegrabilitate. Componentele unei proteze tapetate cu ajutorul unei ceramici pe bază de fosfat de calciu, permit integrarea la nivelul osului. Hidroxiapatita este un bun candidat pentru diverse aplicații biomedicale. Datorită asemănării sale cu mineralele din țesutul osos uman, aceasta este utilizată pe scară largă în intervenții chirurgicale ortopedice ca material de acoperire a protezelor sau pentru reconstrucții osoase. De asemenea, hidroxiapatita este utilizată în stomatologie, ca umplutură în protezele dentare. În ciuda proprietăților sale remarcabile, totuși, unele studii arată că pacienții cu implanturi acoperite cu hidroxiapatită pură au șanse mai mari de a dezvolta biofilme asociate infecțiilor microbiene (Venkatasubbu, 2011).
Așadar, una dintre soluțiile propuse pentru această problem a fost încorporarea unor nanoparticule de zinc în structura hidroxiapatitei. Este bine cunoscut faptul că zincul prezintă activitate antimicrobiană ridicată împotriva unor tulpini bacteriene și fungice, prin atașarea la membrana celulară bacteriană cauzând modificarea permeabilității sale și perturbarea funcției respiratorii. Astfel, datorită hidroxiapatitei dopată cu zinc, rezecțiile osoase sunt minime și mai mult decât atât, riscul decementării și al infecțiilor scade considerabil.
O provocare majoră în terapia infecțiilor asociate biofilmelor este dată de caracteristicile microroganismelor aderate, cum ar fi apariția rezistenței fenotipice sau comprtamentale la antibiotice. Medicamentele antimicrobiene convenționale au o gamă restransă de ținte celulare și sunt în principal active împotriva agenților patogeni care se dezvoltă rapid. Pentru rezultate bune, tratamentul antimicrobian convențional trebuie sa fie completat cu alte metode, precum: curent electic, ultrasunete, sisteme de transport de medicamente sau modificări de suprafață. Evoluția tehnicilor de imagistică și de analiză de suprafață permit investigarea cantitativă a interacțiunilor celulă/suprafață la o scară submicronică și furnizează informații cu privire la capacitatea de aderență a celulelor microbiene la un substrat solid, și la proprietățile macromoleculelor implicate ce pot contribui în mod semnificativ la îmbunătățitrea rezultatelor clinice.
2.1. Scopul și obiectivele lucrării
Scopul acestei lucrări este reprezentat de testarea activității antimicrobiene a unor nanoparticule ce conțin hidroxiapatita și zinc, folosind metode calitative și cantitative.
Obiectivele lucrării au fost:
-testarea calitativă a activității antimicrobiene a unor materiale pe bază de hidroxiapatită dopată cu diferite concentrații de Zn;
-determinarea concentrației minime inhibitorii a acestor materiale față de diferite tulpini microbiene;
-studiul influenței acestor materiale asupra capacitații de aderența microbiană la substrat inert.
Materiale si metode
Nanoparticulele de hidroxiapatită dopate cu diferite concentrații de zinc ce au fost utilizate în cadrul experimentului ce constituie proba practică a acestei lucrări, au fost furnizate de cercetători de la Institutul Național pentru Fizica Materialelor, Măgurele.
Prepararea particulelor de hidroxiapatită, care au format o structură cristalină, s-a realizat la temperaturi scazute, folosind metoda de coprecipitare.
Reactivii necesari prepararii nanoparticulelor de hidroxiapatită sunt descrisi în tabelul 6: (Iconaru si colab., 2013).
Tabelul 6. Reactivii utilizați pentru prepararea nanoparticulelor de hidroxiapatită
Pentru sinteza nanoparticulelor ce ne-au fost furnizate s-au folosit diferite concentrații de ioni de zinc și respectiv, argint. În aceasta lucrare, este descris doar experimentul realizat pe baza pulberilor de hidroxiapatită și zinc.
Sinteza (Ca10-x Znx)(PO4)6(OH)2 a fost realizată folosind zinc în următoarele concentrații: Zn1% ; Zn 3%, Zn 5%, Zn 7%, Zn 10%).
Valoarea pH a soluției a fost ajustată constant cu hidroxid de amoniu, pe parcursul reacțiilor ce au avut loc între compuși. Unele studii au sugerat reacții de schimb ionic între metalele grele și particulele de hidroxiapatită (Iconaru si colab., 2013).
Proprietățile antimicrobiene ale compușilor de tipul (Ca10-x Znx)(PO4)6 (OH)2
au fost evaluate pe diferite tipuri de culturi microbiene, precum:
→ tulpini Gram – pozitive (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis), → tulpini Gram-negative (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) și drojdii (Candida albicans).
Alte materiale utilizate:
Medii de cultură:
→PCA (Plate Count Agar) – Triptonă: 5 g/l; Extract de drojdie: 2, 5 g/l; Glucoză: 1 g/l; Agar: 9 g/l; pH: 7,0 ± 0,2.
→TSB (tryptone soy broth) – Extract pancreatic de cazeină: 17 g/l; Extract papaic de faină de soia: 3g/l; Clorură de sodiu: 5 g/l; Fosfat de dipotasiu: 2,5 g/l; Dextroză: 2,5 g/l; pH: 7,3 ± 0,2.
→Sabouraud Broth (mediu utilizat pentru izolarea și cultivarea fungilor) -Dextroză: 2g /100 ml; Peptonă: 1g /100 ml; pH: 5,6 ± 0,2
DMSO (dimetil sulfoxid) => solvent
A.F.S. (apă fiziologică sterilă)
soluție alcalină de cristal violet 1%
soluție de acid acetic 33%
metanol
Consumabile: micropipete automate, vârfuri sterile mari și mici, plăci Petri cu
diametrul de 10 cm, plăci Multiwell cu 96 de godeuri, cititor de microplaci Apollo, balanță analitică, ansă, riglă, eprubete, baloane cotate, cilindru gradat.
Echipamente: termostat la 37 °C, hotă Vertical 700 laminar flow.
Metode de analiză
Screening-ul calitativ al sensibilității diferitelor tulpini bacteriene față
de nanoparticule cu potențială acțiune antimicrobiană s-a realizat printr-o metodă adaptată celei difuzimetrice: repartizarea compusului în spot pe mediul însămânțat cu cultura microbiană.
Ințial s-au cântărit la balanța analitica aproximativ câte 10 mg din fiecare compus solubilizat în 1ml DMSO, rezultând în final concentrația de 10mg/ml.
Pe plăcile Petri cu mediu PCA (plate count agar), însămânțate „în pânză” cu inocul bacterian de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa de densitate corespunzatoare standardului MacFarland 0,5, au fost repartizati în spot câte 10 µl din fiecare compus de testat.
Plăcile au fost lăsate în repaus la temperatura camerei pentru adsorbția picăturii de soluție în mediu, după care au fost incubate la termostat (37oC) cu capacul în jos, timp de 24 de ore.
Citirea rezultatelor s-a efectuat prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție generate de prezența substanțelor în mediu, cu ajutorul unei rigle gradate. Efectul bactericid al compusului (inhibarea creșterii bacteriene) a fost cuantificat prin apariția unei zone de inhibiție a creșterii microbiene în jurul spotului.
2.3.2. Analiza cantitativă a activității antimicrobiene în vederea determinării unor parametri cantitativi ai acțiunii antimicrobiene pe tulpini bacteriene izolate din clinica și tulpini microbinene de referință (concentratia minima inhibitorie -CMI)
Activitatea antimicrobiană împotriva tulpinilor microbiene a fost efectuată prin metoda microdiluțiilor seriale în mediu lichid (bulion TSB), folosindu-se plăci sterile cu 96 de godeuri. Aceasta este o metodă de analiză cantitativă comparativă, cu ajutorul căreia se determină CMI, cantitatea minimă de compus chimic capabilă să inhibe creșterea celulelor microbiene.
Pentru analizele cantitative, au fost testați doar compușii activi pe tulpinile care s-au dovedit a fi sensibile la testele calitative. În continuare, este prezentat modul de lucru al metodei.
Într-un volum de 100μl de mediu s-au realizat diluții seriale binare ale soluției stoc de compus realizată în DMSO (10 mg/ml). Ȋn primul godeu s-au pipetat 180 μl mediu și 20 μl compus. Din primul godeu s-au transferat 100 μl în al doilea, din al doilea godeu s-au transferat 100 μl în al treilea și asa mai departe până la ultimul godeu, din care s-au aruncat 100 μl.
Ulterior godeurile au fost însămânțate cu câte 20 l suspensie microbiană cu densitate MacFarland 0,5. Suspensiile microbiene au fost realizate ȋn apă fiziologică sterilă din culturi de 24 de ore obținute pe geloză simplă. La fiecare testare s-a utilizar un martor de cultură microbiană (un șir de godeuri conținând exclusiv mediu de cultură inoculat cu suspensie microbiană) și un martor de sterilitate a mediului. După incubarea plăcilor la 37oC timp de 24 de ore, au fost analizate rezultatele obținute prin observare macroscopică si citirea absorbantei la 620nm cu ajutorul unui spctrofotometru.
Concentrația de compus chimic corespunzătoare ultimului godeu în care nu s-a mai observat dezvoltarea culturii a reprezentat valorea CMI (µg/ml) pentru compusul respectiv. În godeurile următoare, inclusiv godeul martor de creștere, mediul a prezentat turbiditate crescută ca urmare a creșterii microbiene. Godeul martor de sterilitate nu a prezentat creștere bacteriană conținutul lichidului rămânând clar, transparent.
Tabelul 8. Dispunerea compușilor în plăcile cu 96 de godeuri.
Concentrația (ug/ml) : 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.62 7.81 3.9 1.95 – +
Fig 4. Modelul exeprimental de determinare a valorii CMI prin metoda microdiluțiilor
„-” =control negativ ; „+” =control pozitiv
Valoarea C.M.I. (µg/ml) reprezintă concentrația de compus corespunzătoare tubului cu cea mai mică concentrație, care inhibă creșterea vizibilă a culturii microbiene.
2.3.3 Studiul influenței compușilor testați asupra dezvoltării de biofilme microbiene pe substrat inert
Pentru a analiza influența compușilor pe bază de hidroxiapatită și zinc asupra dezvoltării de biofilme microbiene pe substrat inert, s-au parcurs următoarele etape:
Celulele microbiene au fost cultivate în plăci cu 96 de godeuri cu bulion nutritiv și în prezența compușilor testați (similar metodei microdiluțiilor pentru stabilirea valorii CMI) și incubate la 37 ˚C timp de 24 ore. Plăcile au fost golite și spălate de două ori cu A.F.S;
Fixarea celulelor aderate s-a realizat cu 150 μL metanol 80%, timp de 5 minute.
Colorarea celulelor aderate s-a făcut cu soluție alcalină de cristal violet 1% (150 μl/godeu), timp de 15 minute. Soluția de colorare s-a ȋndepărtat apoi prin spălare sub jet de apă de la robinet;
Biofilmele microbiene formate pe plăcile de plastic au fost resuspendate în acid acetic 33% (omogenizata prin barbotare), iar intensitatea suspensiei colorate a fost evaluată prin măsurarea absorbanței la 492 nm;
Fig 18. Materialul biologic resuspendat în acid acetic 33%
Concentrația de compus chimic corespunzătoare ultimului godeu în care nu s-a mai observat dezvoltarea biofilmului a reprezentat valoarea CMEB (concentrația minimă de eradicare a biofilmului).
Rezultate și discuții
Analiza calitativă a sensibilității diferitelor tulpini bacteriene față de
nanoparticulele pe bază de hidroxiapatitț și zinc
Analiza calitativă a activitatii antimicrobiene a nanoparticulelor utilizate a arătat că acestea prezintă un spectru diferit de activitate antimicrobiană.
In urma screening-ului calitativ am putut observa că nanoparticulele au manifestat o acțiune inhibitorie, bacteriostatică/bacteriocidă asupra tulpinilor testate. Luând în considerare zonele de inhibiție a creșterii, rezultatele pozitive obținute la testele microbiologice sunt prezentate în figurile 5, 6 și 7.
Dintre bacterile Gram pozitive, cea mai sensibilă tulpină la activitatea compușilor testați este Bacillus subtilis, indiferent de concentrația zincului din nanoparticule. Astfel că, s-a observat pe plăcile însămânțate cu tulpini de Bacillus subtilis o activitate antimicrobiană evidentă în spoturile compușilor 1 (Hap-Zn 7%), 2 (Hap-Zn 5%), 3 (Hap-Zn 10%), 4 (Hap-Zn 3%), 5 (Hap-Zn 1%) și DMSO.
Deasemenea și în cazul tulpinii de Candida albicans s-a putut observa zone de inhibiție bine delimitate, insa cu colonii prezente și în interiorul zonei de inhibiție, compușii având totuși o activitate bacteriostatică.
Fig 5. Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene a nanoparticulelor
testate fata de fata de Bacillus subtilis. La nivelul spoturilor însămânțate
cu Hap-Zn și inclusiv în spotul ce conține solvent DMSO se
observă inhibarea creșterii microbiene.
Bacillus subtilis este o bacterie Gram-pozitivă ce poate produce infecții cu caracter nosocomial, adică se supraadaugă unei boli pe care pacientul o manifestă, producând bacteriemii sau toxiinfecții alimentare. Bacilii apar izolați, în perechi sau în lanțuri scurte sau lungi, sub formă de bastonașe, cu capete drept retezate. Sunt imobili și au capacitatea de a forma endospori de protecție, ce îi ajută să se adapteze condițiilor de mediu. Sporii sunt situați central și se observă pe culturi mai vechi, de 2-3 zile.
Activitatea antimicrobiana cea mai evidentă pe placa însămânțată
cu Bacillus subtilis, se observă în spoturile 1 (HAP-Zn 7%), 4 (Hap-Zn 3%)
și 5 (Hap-Zn 1%).
Fig 6. Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene a nanoparticulelor testate față de Bacillus subtilis
Prezența ionilor de zinc în structura hidroxiapatitei face ca nanoparticulele testate să prezinte activitate antimicrobiană și pe unele drojdii. În ceea ce privește placa însămânțată cu tulpina de Candida albicans se observa activitate pozitiva numai la nanoparticulele dopate cu cea mai mare concentrație de zinc, respectiv în spoturile compușilor: 1 (Hap-Zn 7%)-foarte puțin, 3 (Hap-Zn 10%) și în spotul în care se regasește solventul, DMSO. Spoturile ce conțin compușii Hap-Zn (1%, 3%, 5%) nu au prezentat niciun efect inhibitor asupra creșterii microbiene. (fig. 7)
Candida albicans este o specie care se prezintă pe preparate sub formă de filamente cilindrice simple sau ramificate de 3-5 microni grosime și 50-600 µm lungime, alcătuite din celule așezate cap la cap și are distribuție ubiquitară, colonizare timpurie și cuprinde circa 150 de specii de levuri. Candida albicans este agentul patogen din grupul fungilor imperfecți întâlnit în infecțiile severe ale mucoaselor, pielii și unghiilor, de exemplu produce infecția numită candidoză, întâlnită la persoanele imunocompromise și prezintă rezistență la antibioticele antifungice (Chifiriuc și colab., 2011).
Fig 7. Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene a nanoparticulelor
testate față de tulpina de Candida albicans, însămânțată pe mediu Sabouroud
Nici unul dintre compușii testați nu a fost activ împotriva speciilor de Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa. Așadar, placile însămânțate cu aceste culturi microbiene care nu au prezentat activitate antimicrobiană, nu au mai fost utilizate pe parcursul lucrării (fig 8-11).
Fig 8. Screening-ul calitativ al activității Fig 9. Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene a nanoparticulelor testate față de antimicrobiene a nanoparticulelor testate față
Staphylococcus aureus de Pseudomonas aeruginosa.
Fig 10. Screening-ul calitativ al activității Fig 11. Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene a nanoparticulelor testate față de antimicrobiene a nanoparticulelor testate față
Escherichia coli Enterococcus faecalis
Tabel 9. Rezultatele screening-ului calitativ al activitatii antimicrobiene
„+” In spot s-a observat inhibarea creștererii microbiene
„-” Nu s-a observat activitate
Se consideră că efectul antimicrobian al nanoparticulelor de hidroxiapatită dopată cu ioni bivalenți, este dependent de structura peretelui celular microbian, probabil ca urmare a diferențelor structurale ale acestuia. Interacțiunea celulă-nanoparticule este reprezentată de atașarea la suprafața peretelui celular a unor medicamente, pentru realizarea activității dorite. Unele studii au demonstrat că marimea nanoparticulelor asigura o suprafață mare de contact cu suprafața celulelor microbiene și, prin urmare, se produce o mai bună interacțiune cu ținta microbiană. De exemplu, Pal și colab., în anul 2007, arată că nanoparticulele de forma sferica necesita un conținut de argint mai mare fața de nanoparticulele sub formă de bară, iar câțiva ani mai târziu, în 2010, Bai și colab., au concluzionat că eficacitatea antibacteriană depinde de forma de nanoparticule utilizate.
Studiul nostru demonstrează că activitatea antibacteriană a compușilor constituiți din particule de hidroxiapatită și zinc, depinde de concentrația de zinc folosită.
2.4.2 Analiza cantitativă a activității antimicrobiene în vederea determinării unor parametri cantitativi ai acțiunii antimicrobiene (CMI).
Interpretarea macroscopică a rezultatelor
Pe plăcile cu 96 de godeuri, s-a determinat ultima concentrație la care nu s-a observat
apariția creșterii microbiene, respectiv apariția turbidității mediului;
În coloanele 1 și 2, ce conțin concentrații mari de compus (coloana 1= 1000µg/ml, coloana 2= 500µg/ml), creșterea culturii este puțin vizibilă, microorganismele fiind omorâte sau inhibate în prezența acestuia. În tuburile următoare, mediul se tulbură ca urmare a creșterii microbiene. În tubul martor de sterilitate, mediul trebuie să ramână steril (limpede), dar în plăcile noastre a apărut o ușoară turbiditate (fig 12).
Fig 12. Interpretarea macroscopică a valorii CMI pe placă cu 96 de godeuri
Determinarea densitaților optice prin citire la spectrofotometru a fost utilă pentru
realizarea unui grafic, în care se poate observa influența creșterii microbiene. Nanoparticulele testate au prezentat activitate antimicrobiană cu spectru și intensitate diferite. Astfel, tulpinile cele mai sensibile au fost reprezentate de Bacillus subtilis și Candida albicans.
În graficele urmatoare, sunt reprezentate valorile CMI pentru fiecare dintre compușii testați. În prima coloană, unde concentrația de compus este cea mai mare, de 1000µg/ml, se observă cel mai bine cum a fost inhibată creșterea microbiană. De altfel, se poate observa o sensibilitate mai pronunțata la Hap-Zn a tulpinii de B. subtilis, față de C. albicans (Fig. 14, 15)
Fig 14. Reprezentarea grafică a valorilor CMI ale nanoparticulelor de hidroxiapatită și zinc față
de tulpinile de B. Subtilis
Fig 15. Reprezentarea grafică a valorilor CMI ale nanoparticulelor de hidroxiapatită și zinc față
de tulpinile de C. albicans
2.4.3 Studiul rezistenței biofilmelor microbiene dezvoltate pe substrat inert la compușii testați.
În vederea obținerii unor rezultate cât mai eficiente, este necesară testarea compușilor asupra biofilmelor microbiene a caror rezistența la substanțe antimicrobiene este în general mai mare decat a celulelor în suspensie.
În continuare, pentru determinarea influenței asupra capacității de aderență la substrat inert, am efectuat protocolul analizei cantitative a efectului antibiofilm prin metoda microtitrării, evaluându-se biomasa.
În prima parte, plăcile cu 96 de godeuri au fost spălate cu apă distilată, după care a urmat fixarea, cu etanol și colorarea, cu cristal violet (fig. 16) pentru evidențierea aderenței bacteriilor la substrat inert.
Fig 16. Evidentierea aderenței bacteriene la substrat inert prin colorare cu cristal violet
Fig 17. Evidențierea biofilmului bacterian aderat la substratul inert
Cea mai evidentă aderență la substrat se observă în godeurile corespunzătoare tulpinii de Candida albicans.
În final, materialul biologic a fost resuspendat în 150µl acid acetic de concentrație 33% (fig. 18).
Formarea biofilmelor microbiene implică aderența bacteriilor la un substrat. Biofilmul reprezintă o comunitate microbiană sesilă care este alcătuită din celule atașate ireversibil la un substrat, ele fiind încorporate într-o matrice de substanțe polimerice extracelulare produse. Dezvoltarea biofilmului implică atașarea bacteriilor pe o suprafață, acest proces realizându-se prin următoarele mecanisme:
Sedimentarea nutrienților și formarea unui film macromolecular pe o suprafața pe care se concentrează nutrienții, acest proces fiind mai întâi reversibil și apoi ireversibil;
Etapa de colonizare și invazia substratului, care presupune multiplicarea celulelor ferm
aderate formând microcolonii care vor conflua, formând un biofim, unistratificat la început și apoi multistratificat. Colonizarea este randomică și presupune existența unor procese fizico-chimice, urmate de procese biologice. Factorii care influențează colonizarea și formarea biofimelor sunt reprezentați de:
*factori genetici;
*factori fizico-chimici, reprezentați de calitățile interfeței;
*factorilor biotici și abiotici;
*fenomene cu rol determinant, precum relațiile interspecifice dintre organisme, condițiile de curgere laminară sau turbulentă, abrazivitate, procese mecanice (de adiție și îndepărtare a componentelor biotice și abiotice).
c) Etapa de maturare a biofimului, în care celulele biofimului sunt înglobate într-o matrice extensivă de polizaharide;
Dincolo de aceste etape, are loc detașarea de celule solitare sau agregate celulare din biofimul matur, ciclul relunâdu-se. Aderența bacteriilor la un substrat implica deplasarea microorganismelor din mediu la suprafața substratului, mecanism ce se realizează prin:
→Difuziune: reprezintă consecința mișcării browniene a celulelor bacteriene, asigurând totodată deplasarea lentă într-un mediu staționar, ca și în cursul procesului de sedimentare, reprezentând astfel singurul mod de contact al microorganismelor cu diferite substraturi.
→Curenți de convenție: sunt asociați cu circulația lichidului în care sunt suspendate și asigură astfel transportul cu câteva ordine de mărime mai rapid decât difuziunea.
→Mișcare activă: poate duce la contacte orientate chimiotactic în cazul unei existențe ale unui gradient chimic în regiunea interfacială. Este cel mai rapid mecanism de formare ale unui biofilm (Chifiriuc și colab., 2011).
Biofilmele bacteriene sunt foarte heterogene în spațiu și timp iar din punct de vedere funcțional sunt dinamice și răspund la acțiunea condițiilor de mediu, schimbându-se constant datorită acțiunii unor factori interni și externi. Cel mai important aspect este reprezentat de faptul că, agregatele celulare păstrează sensibilitate scăzută față de substanțele antimicrobiene.
Așadar, prima etapă a colonizării unui țesut este aderența celulelor bacteriene la celulele gazdă. Aderența microbiană la celulele gazdei poate fi directă și indirectă. Aderența directă se produce prin intermediul adezinelor specifice: pili, hemaglutinine, în timp ce aderența indirectă se produce prin intermediul glicocalixului sau al moleculelor de matrice extracelulară: fibronectină, opsonine. Bacteriile produc o varietate de factori, care le ușurează capacitatea de a invada celulele gazdă și de a se răspândi în țesuturi. Aderența este condiționată de complementaritatea sarcinilor electrice ale celor două suprafețe implicate și asigură colonizarea anumitor situsuri din organism, multiplicarea bacteriilor, sinteza toxinelor sau desfășurarea reacțiilor inflamatorii de apărare. Adeziunea bacteriană se referă la capacitatea unor specii bacteriene de a adera la diferite tipuri de suprafete prezente în mediul înconjurator, conducând la formarea de biofilme. Adezinele sunt structuri de suprafață ale bacteriilor care au proprietați de aderare la receptorii prezenți pe celule. Acestea sunt proteine bacteriene, care variază ca morfologie (pili, fimbrii, glicocalix) și compoziție chimică (proteine, polizaharide) (Chifiriuc și colab., 2011).
Bacteriile în general aderă între ele prin fenomene de recunoaștere celulară, aceste interacțiuni putând fi de tip: coagregare (recunoașterea și atașarea celulelor sesile genetic, distincte, cu formare de coagregate) și coadeziune (celulele sesile recunosc și se atașează la celulele deja aderate la o suprafață ca parte a unui biofilm). Structurile bacteriene de aderență, anatomice sau moleculare sunt de cele mai multe ori, adaptative și chiar dispar prin cultivarea succesivă in vitro. De aceea, tulpinile bacteriene de laborator sunt mai puțin aderente de suport, comparativ cu tulpinile bacteriene izolate recent. Adezinele bacteriene conferă specificitate tisulară, spre exemplu: Helicobacter pylori, este implicat în infecții asociate mucoasei gastrice, Escherichia coli mucoasei tractului urinar, iar Streptococcus pneumoniae aderă la celulele nazofaringelui (Chifiriuc și colab., 2011).
Bacteriile aderă preferențial la epiteliile mucoaselor, epiteliile keratinizate, la țesutul osos sau smalțul dentar, astfel că, puntem concluziona că aderența constituie un avantaj ecologic major pentru bacteriile patogene, deoarece prin acest proces ele își asigură nutrienții necesari, protecția față de anticorpi, lizozim, etc. În practică, mecanismele aderenței bacteriene in vivo, au fost studiate mai ales pentru bacteriile generatoare de carii dentare.
Legarea bacteriilor patogene de celule sensibile este etapa inițială a procesului infecțios, deoarece aderența bacteriană împiedică îndepărtarea microorganismelor prin fluxul secrețiilor, prin mobilitatea cililor, prin tuse sau peristaltism. Astfel, celule alcătuiesc colonii mai puternice și devin mai dificil de distrus, ceea ce creează un inconvenient în practica medicală. Mai mult, dacă utilizăm nanoparticule cu scopul de a adminitra controlat și cu o viteză predeterminată, medicamentele în organism, este posibil ca această metodă să nu dea cele mai eficiente rezultate, tocmai din cauza stabilității bacteriene.
Biofilmele constituie cele mai semnificative exemple referitoare la modul în care adaptarea fiziologică are rol în conferirea rezistenței intrinsece (Mihaescu si colab., 2008).
Sensibilitatea redusă pe care o prezintă bacteriile într-un biofilm se datorează mai multor factori, precum:
-accesul scăzut al substațelor antimicrobiene (dezinfectant, antibiotic) la celulele din biofilm;
-producerea de enzime cu scop degradativ sau care neutralizeaza sunstanțele chimice;
-interacțiunile din punct de vedere chimic dintre biofilm și dezinfectanți;
-schimbul genetic, care poate avea loc între biofilm și celule.
Intensitatea suspensiilor colorate a fost evaluată cu ajutorul spectrofotometrului, prin măsurarea absorbanței la 492 nm.
În graficele următoare este reprezentată influența nanoparticulelor de hidroxiapatită și
zinc asupra capacității de aderare la substrat inert (fig. 21 și 22).
Fig 21. Influența nanoparticulelor de hidroxiapatită și zinc asupra capacității de aderenta la substrat inert, în cazul tulpinii de B. Subtilis
Fig 22. Influența nanoparticulelor de hidroxiapatită și zinc asupra capacității de aderare la substrat inert, în cazul tulpinii de C. albicans
Se observă că celulele de Bacillus subtilis au aderat mult mai puțin la pereții godeurilor, decât cele de Candida albicans. Rezultatele determinării activității nanoparticulelor asupra dezvoltării de biofilme microbiene pe substrat inert au arătat că acestea prezintă un efect inhibitor al aderenței microbiene.
Scopul principal al obținerii nanoparticulelor cu proprietăți antibacteriene este de a preveni aderența bacteriilor și formarea biofilmelor, care ar reprezenta semnul distinctiv al infecțiilor ulterioare. Colonizarea unui biomaterial cu diferite specii de bacterii constituie o mare amenințare pentru eficacitatea dispozitivului medical. Biofilmele microbiene dezvoltate pe diferite suprafețe sunt implicate intr-o gama largă de infecții cu diferite etiologii, dificil de diagnosticat și de tratat, ce prezintă rezistență fenotipică și comportamentală, numită de către cercetători toleranță la mecanismele de apărare ale gazdei, mediată de diferite procese incomplet elucidate. Biofilmele nu sunt niște asociații simple care se dezvoltă pe suprafețe, ci acestea reprezintă sisteme biologice în care bacteriile formează comunități funcționale, coordonate și care au un grad înalt de organizare, fiind considerate o formă primitivă de citodiferențiere, a cărei existență este bazată pe interdependența celulară.
Una dintre strategiile promițătoare de reducere a aderenței microbiene este utilizarea unor dispozitive cu suprafețe modificate, învelite cu materiale nanostructurate și functionalizate cu diferite substanțe cu efect antibiofilm. În acest context, unul dintre obiectivele tezei a fost studiul activității antibiofilm a nanoparticulelor pe bază de hidroxiapatită și zinc.
Zincul este un element important în toate țesuturile biologice, participând la activitatea a mai mult de 300 de tipuri de enzime. Proprietățile biochimice ale zincului sunt variate, acest metal având efect direct asupra efectului proliferativ al celulelor osteoblaste și efect inhibitor asupra resorbției osteoclastice osoase. Pe lângă acestea, zincul intervine în metabolismul acizilor nucleici, în întreținerea structurii membranei și a funcției sale, influențează activitatea hormonală, biomineralizarea și calcifierea patologică. De asemenea, acesta acționează ca un antioxidant și intervine în metabolismul glucidic și proteic. Zincul are și un rol microbiologic însemnat, datorită proprietăților antibacteriene. În studiul de față, se dorește să se obțină compuși pe bază de hidroxiapatită și zinc, pentru a spori în special activitatea microbiologică.
Rezultatele obținute in acest studiu pot constitui o alternativă pentru tratamentul cu antibiotice, dacă nanoparticulele pe bază de hidroxiapatită și zinc sunt încorporate intr-un mod eficient. Totuși, toxicitatea particulelor folosite este un aspect important în aplicațiile practice datorită compoziției in metale grele, care în concentrații ridicate devin nocive pentru organism.
Rezultatele prezentate în capitolul de activitate de laborator au fost obținute în laboratorul de microbiologie de la Grădina Botanică a Facultății de Biologie, Universitatea București. Mulțumesc doamnei coordonator stiințific, Prof. univ. dr. Carmen Chifiriuc și doamnei îndrumător, lector dr. Luminița Măruțescu, precum și doamnelor asistent, doctorand și tehniciene din cadrul laboratorului de Microbiologie care mi-au oferit ajutor și suport de materiale pentru desfășurarea activității practice.
Concluzii
Analiza calitativă a activitații antimicrobiene a nanoparticulelor pe bază de hidroxiapatită și zinc a arătat că acestea prezintă un spectru diferit de activitate antimicrobiană.
În urma screening-ului calitativ, cea mai intensă activitate antimicrobiană a fost observată față de Bacillus subtilis (cea mai sensibilă tulpină la activitatea tuturor combinațiilor testate, indiferent de concentrația de zinc din nanoparticule) și de Candida albicans.
Aanaliza cantitativă a activității antimicrobiene a combinațiilor testate a relevat concentrații minime inhibitorii ridicate, cuprinse între 500µg/ml și 1000µg/ml.
În ceea ce privește acțiunea nanomaterialelor asupra biofilmelor microbiene, cea mai eficientă activitate s-a observat în cazul biofilmului format de Bacillus subtilis, în timp ce godeurile corespunzătoare tulpinii de Candida albicans au prezentat aderența la substrat.
Având în vedere rezultatele obținute, dar și studiile din literatura de specialitate, nanoparticulele pe bază de hidroxiapatită și zinc ar putea servi drept un bun candidat pentru aplicații biomedicale, având proprietăți antimicrobiene dar și o buna biocompatibilitate, reprezentând o abordare eficientă pentru combaterea infecțiilor asociate biofilmelor prin obținerea de materiale și suprafețe bioactive rezistente la colonizarea microbiană.
Bibliografie
Carți:
[1] Grigore Mihăescu, Carmen Chifiriuc, Lia-Mara Dițu, 2008, Microbiologie generală, Editura Universității din București
[2] Carmen Chifiriuc, Grigore Mihăescu, Veronica Lazăr, 2011, Microbiologie și virologie medicală, Editura Universității din București
[3] Veronica Lazăr, 2003, Aderența microbiană, Editura Academiei Române, București.
Articole:
[1] C.S. Ciobanu, E. Andronescu, A.M. Prodan, L. Pall, A. Costescu, P. Le Coustumer, F. Huneau, L. Marutescu, N.I. Ene, R. Trusca, E. S. Barna, S. L. Iconaru. 2013. Physico-chemical and antibacterial studies on silver doped nano-hydroxyapatite. Journal of optoelectronics and advanced materials. 15 (7-8), 918 – 922
[2] A. Costescu, C. S. Ciobanu, S. L. Iconaru, R. V. Ghita, C. M. Chifiriuc, L. G. Marutescu, D. Predoi. 2013. Fabrication, Characterization and Antimicrobial Activity. Evaluation of Low Silver Concentrations in Silver-Doped Hydroxyapatite Nanoparticles. Journal of Nanomaterials, Article ID 194854
[3] S. L. Iconaru, C. S. Ciobanu, C. M. Chifiriuc, A. Costescu, P. Le Coustumer, D. Predoi. 2013. Synthesis and Antimicrobial Activity of Silver-Doped Hydroxyapatite Nanoparticles. BioMed Research International. 280, 359-360
[4] V. Lazăr, C. M. Chifiriuc. 2010. Medical significance and new therapeuticalstrategies for biofilm associated infections. Roumanian Archives of Microbiology and Immunology, vol. 69, 125–138
[5] V. Běhal. 2000. Bioactive products from Streptomyces. Adv Appl Microbiol. 47, 113-156.
[6] V. Běhal, I. S. Hunter, L. C. Vining, C. Stuttard. 1995. Genetics and Biochemistry of Antibiotics Production. Butterworth-Heinemann, Boston. 359-384
[7] C. S. Ciobanu, S. L. Iconaru, F. Massuyeau, L. V. Constantin, A. Costescu, D. Predoi. 2012. Synthesis, Structure, and Luminescent Properties of Europium-Doped Hydroxyapatite Nanocrystalline Powders. Journal of Nanomaterials. Article ID 916218
[8] M. Jarcho. 1992. Retrospective analysis of hydroxyapatite development for oral implant applications. Dental Clinics of North America, vol. 36(1), 19–26
[9] T. J. Webster, C. Ergun, R. H. Doremus, R. Bizios. 2002. Hydroxylapatite with substituted magnesium, zinc, cadmium and yttrium—II. Mechanisms of osteoblast adhesion. Journal of Biomedical Materials Research, vol. 59(2), 312–317
[10] T. J. Webster, E. A. Massa-Schlueter, J. L. Smith, and E. B.Slamovich. 2004. Osteoblast response to hydroxyapatite doped with divalent and trivalent cations. Biomaterials, vol. 25(11), 2111–2121
[11] Q. Y. Ma, S. J. Tralna, T. J. Logan, and J. A. Ryan. Effects of aqueous AI, Cd, Cu, 1994. Fe(II), Ni, and Zn on Pb immobilization by hydroxyapatite. Environmental Science and Technology, vol.28(7), 1219–1228
[12] X. Bai, K. More, C. M. Rouleau, and A. Rabiei. 2010. Functionally graded hydroxyapatite coatings doped with antibacterial components. Acta Biomaterialia, vol. 6(6), 2264–2273
[13] S. Pal, Y. K. Tak, and J. M. Song. 2007. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the gram-negative bacterium Escherichia coli. AppliedandEnvironmentalMicrobiology, vol. 73,no. 6, 1712–1720
[14] M. Lens. 2011. Use of fullerenes in cosmetics. Recent Patents on Biotechnology, vol. 3(2), 118–123
[15] M. N. Moore, 2006. Do nanoparticles present ecotoxicological risks for the health of the aquatic environment?. Environment International, vol. 32(8), 967–976
[16] T. Hamouda and J. R. Baker. 2000. Antimicrobial mechanism of action of surfactant lipid preparations in enteric gram-negative bacilli. Journal of Applied Microbiology, vol. 89(3), 397–403
[17] A.L. de Silva, M. R. de Carvalho, S. A. L. de Souza, P. M. Teixeira Dias, R. G. da Silva, C. S. de Meirelles Saramago, C.A. de Melo Bento, E. Hofer. 2012. Heavy metal tolerance (Cr, Ag AND Hg) in bacteria isolated from sewage. Braz J Microbiol, vol 43(4), 1620–1631
[18] S. Silver and G. Ji. 1994. Newer systems for bacterial resistances to toxic heavy metals. Environ Health Perspect, vol 102, 107–113
[19] G. D. Venkatasubbu, S. Ramasamy,V. Ramakrishnan, J. Kumar. 2011. Nanocrystalline hydroxyapatite and zinc-doped hydroxyapatite as carrier material for controlled delivery of ciprofloxacin. Biotech, vol 1(3), 173–186
[20] J. T. Seil, T. J. Webster. 2012. Antimicrobial applications of nanotechnology: methods and literature. Int J Nanomedicine, vol. 7, 2767–2781
[21] K. S. Katti. 2004. Biomaterials in total joit replacement. Colloid and surfaces B, vol. 39
[22] Y. Xie, Y. He, P. L. Irwin, T. Jin, X. Shi. 2011. Antibacterial Activity and Mechanism of Action of Zinc Oxide Nanoparticles against Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol, vol 77(7), 2325–2331
[23] B. A. Sevinç, L. Hanley. 2010. Antibacterial Activity of Dental Composites Containing Zinc Oxide Nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 94(1): 22–31.
[24] M. Karasneh, A. Akhras, B. A. lbiss, K.M. Aljarah, S. I. Al-Azzam, K. H. Alzoubi. 2014. Cerium oxide and iron oxide nanoparticles abolish the antibacterial activity of ciprofloxacin against gram positive and gram negative biofilm bacteria. Cytotechnology. Online ISSN 1573-0778
[25] C. M. Chan, M. Y. Guo, Y. H. Leung, A. B. Djurišić, X. Hu, W. K. Chan, F. C. Leung, S. Y. Tong. 2013. Antibacterial and photocatalytic activity of TiO2 and ZnO nanomaterials in phosphate buffer and saline solution. Appl Microbiol Biotechnol. 97(12),
65-73
[26] L. K. Adams, D. Y. Lyon, A. McIntosh, P. J. Alvarez. 2006. Comparative toxicity of nano-scale TiO2, SiO2 and ZnO water suspensions. Water Sci Technol, vol 54(11-12), 327-340
[27] I.Matai, A.Sachdev, P. Dubey, S. U. Kumar, B. Bhushan, P. Gopinath. 2014. Antibacterial activity and mechanism of Ag-ZnO nanocomposite on S. aureus and GFP-expressing antibiotic resistant E. coli. Biointerfaces, vol. 1, 115-359
[28] T. P. Dasari, K. Pathakoti, H. M. Hwang. 2013. Determination of the mechanism of photoinduced toxicity of selected metal oxide nanoparticles (ZnO, CuO, Co3O4 and TiO2) to E. coli bacteria. J Environ Sci (China), vol. 1;25(5), 882-8
[29] O. Gunduz, C. Gode, Z. Ahmad, H. Gökçe, M. Yetmez, C. Kalkandelen, Y. M. Sahin, F. N. Oktar. 2014. Preparation and evaluation of cerium oxide-bovine hydroxyapatite composites for biomedical engineeringapplications. J Mech Behav Biomed Mater, vol 35, 70-6
[30] M. H. P. Da Silva, A. F. Lemos, J. M, da Fonte Fereira, J. D. Santos. 2003. Citotoxicity of metal oxides to E. Coli. Mat. Research, vol. 6(3), 321-325
[31] M. F. Ulum, A. Arafat, D. Noviana, A. H. Yusop, A. K. Nasution, M. R. Abdul Kadir, H. Hermawan. 2014. In vitro and in vivo degradation evaluation of novel iron-bioceramic composites for bone implant applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, vol. 1(36), 336-344
[32] L. Melin Svanborg, L. Meirelles,V. Franke Stenport, P. Kjellin, F. Currie, M. Andersson, A. Wennerberg. 2014. Evaluation of bone healing on sandblasted and Acid etched implants coated with nanocrystalline hydroxyapatite: an in vivo study in rabbit femur. Int J Dent. Article ID 197581.
[33] H. Yuan, K. De Groot. 2005. NATO Science Series II: Mathematics, Physics and Chemistry. Springer Netherlands, vol.171, 37-57
[34] D. Gopi, E. Shinyjoy, L. Kavitha. 2014. Synthesis and spectral characterization of silver/magnesium co-substituted hydroxyapatite for biomedical applications. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, vol. 5(127), 286-291
Web:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.info-farmacia.com/
http://www.upc.edu/cmem/research
Bibliografie
Carți:
[1] Grigore Mihăescu, Carmen Chifiriuc, Lia-Mara Dițu, 2008, Microbiologie generală, Editura Universității din București
[2] Carmen Chifiriuc, Grigore Mihăescu, Veronica Lazăr, 2011, Microbiologie și virologie medicală, Editura Universității din București
[3] Veronica Lazăr, 2003, Aderența microbiană, Editura Academiei Române, București.
Articole:
[1] C.S. Ciobanu, E. Andronescu, A.M. Prodan, L. Pall, A. Costescu, P. Le Coustumer, F. Huneau, L. Marutescu, N.I. Ene, R. Trusca, E. S. Barna, S. L. Iconaru. 2013. Physico-chemical and antibacterial studies on silver doped nano-hydroxyapatite. Journal of optoelectronics and advanced materials. 15 (7-8), 918 – 922
[2] A. Costescu, C. S. Ciobanu, S. L. Iconaru, R. V. Ghita, C. M. Chifiriuc, L. G. Marutescu, D. Predoi. 2013. Fabrication, Characterization and Antimicrobial Activity. Evaluation of Low Silver Concentrations in Silver-Doped Hydroxyapatite Nanoparticles. Journal of Nanomaterials, Article ID 194854
[3] S. L. Iconaru, C. S. Ciobanu, C. M. Chifiriuc, A. Costescu, P. Le Coustumer, D. Predoi. 2013. Synthesis and Antimicrobial Activity of Silver-Doped Hydroxyapatite Nanoparticles. BioMed Research International. 280, 359-360
[4] V. Lazăr, C. M. Chifiriuc. 2010. Medical significance and new therapeuticalstrategies for biofilm associated infections. Roumanian Archives of Microbiology and Immunology, vol. 69, 125–138
[5] V. Běhal. 2000. Bioactive products from Streptomyces. Adv Appl Microbiol. 47, 113-156.
[6] V. Běhal, I. S. Hunter, L. C. Vining, C. Stuttard. 1995. Genetics and Biochemistry of Antibiotics Production. Butterworth-Heinemann, Boston. 359-384
[7] C. S. Ciobanu, S. L. Iconaru, F. Massuyeau, L. V. Constantin, A. Costescu, D. Predoi. 2012. Synthesis, Structure, and Luminescent Properties of Europium-Doped Hydroxyapatite Nanocrystalline Powders. Journal of Nanomaterials. Article ID 916218
[8] M. Jarcho. 1992. Retrospective analysis of hydroxyapatite development for oral implant applications. Dental Clinics of North America, vol. 36(1), 19–26
[9] T. J. Webster, C. Ergun, R. H. Doremus, R. Bizios. 2002. Hydroxylapatite with substituted magnesium, zinc, cadmium and yttrium—II. Mechanisms of osteoblast adhesion. Journal of Biomedical Materials Research, vol. 59(2), 312–317
[10] T. J. Webster, E. A. Massa-Schlueter, J. L. Smith, and E. B.Slamovich. 2004. Osteoblast response to hydroxyapatite doped with divalent and trivalent cations. Biomaterials, vol. 25(11), 2111–2121
[11] Q. Y. Ma, S. J. Tralna, T. J. Logan, and J. A. Ryan. Effects of aqueous AI, Cd, Cu, 1994. Fe(II), Ni, and Zn on Pb immobilization by hydroxyapatite. Environmental Science and Technology, vol.28(7), 1219–1228
[12] X. Bai, K. More, C. M. Rouleau, and A. Rabiei. 2010. Functionally graded hydroxyapatite coatings doped with antibacterial components. Acta Biomaterialia, vol. 6(6), 2264–2273
[13] S. Pal, Y. K. Tak, and J. M. Song. 2007. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the gram-negative bacterium Escherichia coli. AppliedandEnvironmentalMicrobiology, vol. 73,no. 6, 1712–1720
[14] M. Lens. 2011. Use of fullerenes in cosmetics. Recent Patents on Biotechnology, vol. 3(2), 118–123
[15] M. N. Moore, 2006. Do nanoparticles present ecotoxicological risks for the health of the aquatic environment?. Environment International, vol. 32(8), 967–976
[16] T. Hamouda and J. R. Baker. 2000. Antimicrobial mechanism of action of surfactant lipid preparations in enteric gram-negative bacilli. Journal of Applied Microbiology, vol. 89(3), 397–403
[17] A.L. de Silva, M. R. de Carvalho, S. A. L. de Souza, P. M. Teixeira Dias, R. G. da Silva, C. S. de Meirelles Saramago, C.A. de Melo Bento, E. Hofer. 2012. Heavy metal tolerance (Cr, Ag AND Hg) in bacteria isolated from sewage. Braz J Microbiol, vol 43(4), 1620–1631
[18] S. Silver and G. Ji. 1994. Newer systems for bacterial resistances to toxic heavy metals. Environ Health Perspect, vol 102, 107–113
[19] G. D. Venkatasubbu, S. Ramasamy,V. Ramakrishnan, J. Kumar. 2011. Nanocrystalline hydroxyapatite and zinc-doped hydroxyapatite as carrier material for controlled delivery of ciprofloxacin. Biotech, vol 1(3), 173–186
[20] J. T. Seil, T. J. Webster. 2012. Antimicrobial applications of nanotechnology: methods and literature. Int J Nanomedicine, vol. 7, 2767–2781
[21] K. S. Katti. 2004. Biomaterials in total joit replacement. Colloid and surfaces B, vol. 39
[22] Y. Xie, Y. He, P. L. Irwin, T. Jin, X. Shi. 2011. Antibacterial Activity and Mechanism of Action of Zinc Oxide Nanoparticles against Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol, vol 77(7), 2325–2331
[23] B. A. Sevinç, L. Hanley. 2010. Antibacterial Activity of Dental Composites Containing Zinc Oxide Nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 94(1): 22–31.
[24] M. Karasneh, A. Akhras, B. A. lbiss, K.M. Aljarah, S. I. Al-Azzam, K. H. Alzoubi. 2014. Cerium oxide and iron oxide nanoparticles abolish the antibacterial activity of ciprofloxacin against gram positive and gram negative biofilm bacteria. Cytotechnology. Online ISSN 1573-0778
[25] C. M. Chan, M. Y. Guo, Y. H. Leung, A. B. Djurišić, X. Hu, W. K. Chan, F. C. Leung, S. Y. Tong. 2013. Antibacterial and photocatalytic activity of TiO2 and ZnO nanomaterials in phosphate buffer and saline solution. Appl Microbiol Biotechnol. 97(12),
65-73
[26] L. K. Adams, D. Y. Lyon, A. McIntosh, P. J. Alvarez. 2006. Comparative toxicity of nano-scale TiO2, SiO2 and ZnO water suspensions. Water Sci Technol, vol 54(11-12), 327-340
[27] I.Matai, A.Sachdev, P. Dubey, S. U. Kumar, B. Bhushan, P. Gopinath. 2014. Antibacterial activity and mechanism of Ag-ZnO nanocomposite on S. aureus and GFP-expressing antibiotic resistant E. coli. Biointerfaces, vol. 1, 115-359
[28] T. P. Dasari, K. Pathakoti, H. M. Hwang. 2013. Determination of the mechanism of photoinduced toxicity of selected metal oxide nanoparticles (ZnO, CuO, Co3O4 and TiO2) to E. coli bacteria. J Environ Sci (China), vol. 1;25(5), 882-8
[29] O. Gunduz, C. Gode, Z. Ahmad, H. Gökçe, M. Yetmez, C. Kalkandelen, Y. M. Sahin, F. N. Oktar. 2014. Preparation and evaluation of cerium oxide-bovine hydroxyapatite composites for biomedical engineeringapplications. J Mech Behav Biomed Mater, vol 35, 70-6
[30] M. H. P. Da Silva, A. F. Lemos, J. M, da Fonte Fereira, J. D. Santos. 2003. Citotoxicity of metal oxides to E. Coli. Mat. Research, vol. 6(3), 321-325
[31] M. F. Ulum, A. Arafat, D. Noviana, A. H. Yusop, A. K. Nasution, M. R. Abdul Kadir, H. Hermawan. 2014. In vitro and in vivo degradation evaluation of novel iron-bioceramic composites for bone implant applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, vol. 1(36), 336-344
[32] L. Melin Svanborg, L. Meirelles,V. Franke Stenport, P. Kjellin, F. Currie, M. Andersson, A. Wennerberg. 2014. Evaluation of bone healing on sandblasted and Acid etched implants coated with nanocrystalline hydroxyapatite: an in vivo study in rabbit femur. Int J Dent. Article ID 197581.
[33] H. Yuan, K. De Groot. 2005. NATO Science Series II: Mathematics, Physics and Chemistry. Springer Netherlands, vol.171, 37-57
[34] D. Gopi, E. Shinyjoy, L. Kavitha. 2014. Synthesis and spectral characterization of silver/magnesium co-substituted hydroxyapatite for biomedical applications. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, vol. 5(127), 286-291
Web:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.info-farmacia.com/
http://www.upc.edu/cmem/research
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Studiul Activitatii Antimicrobiene a Unor Nanoparticule pe Baza de Hidroxiapatita Si Zinc (ID: 124282)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.