Studiu Comparativ la Pacientii cu Hepatopatie Cronica Versus Pacienti cu Encefalopatie Porto Sistematica

TEZĂ DE DOCTORAT

Stresul oxidativ

Studiu comparativ la pacientii cu hepatopatie cronica versus pacienti cu encefalopatie porto-sistematica

CUPRINS

Introducere

Capitolul I – STRESUL OXIDATIV – NOȚIUNI GENERALE

1.0.0. Stresul oxidativ (definiție, cadru general)

1.1.0. Speciile reactive de oxien

1.1.1. Radicalii liberi

1.1.2. Posibile surse de radicali liberi

1.1.3. Relația antioxidanți-radicali liberi

1.1.4. Enzime implicate în eliminarea ROS

1.1.5. Mecanisme nonenzimatice

1.2.0. Stresul oxidativ hepatic

1.2.1. Stresul oxidativ în patologia hepatitei C

1.2.2. Mecanismele moleculare ale patogeniei HCV

1.2.3. Stresul oxidativ celular în patogeneza HCV

1.3.0. Rolul antioxidanților în stresul oxidativ din HCV

1.4.0. Stresul oxidativ în hepatita virală B și C

1.5.0. Influența stresului oxidativ în ciroza hepatică de etiologie virală și etanolică

1.5.1. Efectele stresului oxidativ în ierarhizarea complicațiilor în

relație cu etiologia cirozei hepatice

1.6.0. Encefalopatia hepatică și stresul oxidativ

1.6.1. Conceptul stresului oxidativ în encefalopatia hepatică

1.7.0. Principalele substanțe neuroxocice acumulate în creier din insuficiența

hepatică cu encefalopatie

1.7.1. Amoniacul – mecanisme fiziopatologice și farmacologice de acțiune

1.7.1.1. Efectele toxice ale amoniacului asupra funcțiilor cerebrale

1.7.2. Manganul și relația cu encefalopatia hepatică

1.7.2. bis Inflamația

1.7.3. Amoniacul, manganul și manifestarea stresului oxidativ în

encefalopatia hepatică

1.7.4. Rolul metabolismului energetic cerebral și a influenței neuro-

Transmisiei în encefalopatia hepatică timpurie

1.7.5. Glutamatul, importanță clinică în encefalopatia hepatică

1.7.6. Serotonina și neurotransmisia în encefalopatia hepatică

1.7.7. Catecolaminele și encefalopatia hepatică – aspecte fiziopatologice

1.7.8. Neurotransmisia și acțiunile GABA în encefalopatia portosistemică

1.7.9. Encefalopatia hepatică și sistemul opioid

1.7.10. O implicare posibilă și a altor sisteme în fiziopatologia

encefalopatiei hepatice

1.7.11. Contribuția oxidului nitric în fiziopatologia encefalopatiei

hepatice

Capitolul II – STRESUL OXIDATIV ÎN HEPATITA CRONICĂ, CIROZA

HEPATICĂ ȘI ENCEFALOPATIA HEPATICĂ (STUDIU

EXPERIMENTAL)

Capitolul III – STRESUL OXIDATIV – STUDII CLINICE

Partea a II-a

Capitolul I – CONTRIBUȚIA PERSONALĂ

1.0.0. Scurtă rememorare asupra subiectului

Capitolul II – ORGANIZAREA STUDIULUI CLINIC

2.0.0. Alcătuirea loturilor de studiu

2.1.0. Examinările generale de start

2.1.1. Rezultatele examenului de start pentru pacienții lotului I

2.1.2. Rezultatele examenului de start pentru lotul II

2.1.3. Rezultatele examenului de start la lotul III

2.1.4. Rezultatele examenului de start la lotul IV

2.1.5. Rezultatele examenului de start la lotul de control

2.2.0. Evaluarea diagnostică după examenul de start la loturile de studiu

2.2.1. Lotul 1

2.2.2. Lotul 2

2.2.3. Lotul 3

2.2.4. Lotul 4

2.3.0. Evaluarea loturilor după 6 luni

Capitolul III

STUDIILE CLINICE

3.0.0. Criteriile de includere în tratamentul cu interferon pegylat și ribavirină

3.1.0. Studiul I (dezvoltat pe 3 grupuri de pacienți, din care 1 de control)

3.1.1. Grupul 1 – tratat cu Interferon pegylat și Ribavirină

3.1.2. Grupul 2 – fără tratament antiviral (martor)

3.1.3. Grupul 3 – voluntari sănătoși (de control)

3.1.4. Rezultatele examinărilor comparative start și final de studiu pe

cele trei grupuri

3.2.0. Studiul II

3.2.1. Aspecte fiziopatologice în encefalopatia hepatică

3.2.2. Structura grupului cu encefalopatie hepatică

3.2.3. Grupul 2 – hepatita cronică virală fără viremie dozabilă

3.2.4. Comentarii la studiul II

4.0.0. Discuții

5.0.0. Concluzii generale

BIBLIOGRAFIE

Introducere

Lucrarea de față reprezintă un studiu cu privire a Stresul Oxidativ și influența acestuia în hepatita cronică virală, versus encefalopatia hepatică porto-sistemică și reprezintă tema tezei mele de doctorat. Am urmărit și dezvoltat practic această temă prin 2 studii clinice în cadrul Spitalului Municipal Gavril Curteanu din Oradea și ambulatorul acestuia, cu sprijinul D-lui Conf. Dr. Ovidiu Burtă în perioada mai 2010-mai 2012.

Lucrarea este constituită din două părți: prima parte cuprinde date și concepte despre stresul oxidativ publicate în literatura de specialitate pe plan internațional, precum și date experimentale obținute din lucrări efectuate în instituții de mare prestigiu, cu privire la efectele stresului sub raport fiziopatologic la nivelul țesutului hepatic și a țesutului cerebral la subiecții cu patologie hepatică cronică și encefalopatie hepatică, examinate pe țesuturi recoltate imediat post-mortem și a căror funcționalitate a fost urmărită intravitam, în ultimele zile de viață.

Prezentăm în finalul părții întâi rezultatele unor studii clinice cu privire la implicarea stresului oxidativ în patologia hepato-biliară, interpretarea și soluționarea acestora.

Partea a II-a privește contribuția personală. După observația în timp a fenomenului stresului oxidativ am stabilit motivația și scopul lucrării, structura și dezvoltarea studiilor componente. Am inițiat două studii dintr-un lot lărgit de pacienți, cu hepatiă cronică virală (23 pacienți), ciroză hepatică consecutivă hepatitei virale (14 pacienți), hepatocarcinom (11 pacienți) și encefalopatie porto – sistemică secundară cirozei hepatice (8 pacienți).

În primul studiu pe un grup de 7 pacienți cu hepatită cronică virală C și B seropozitivi am urmărit relația dintre stresul oxidativ și reacția antioxidantă înainte și după tratamentul cu Interferon alfa-2a și Ribavirină.

Grupul 2 a urmărit relația dintre stresul oxidativ și apărarea antioxidantă endogenă la un grup de 7 pacienți cu hepatită cronică virală seropozitivi fără tratament cu interferon, ci numai cu antioxidanți și hepatoprotectoarele convenționale. Ambele grupuri au fost monitorizate 48 de săptămâni cât a durat tratamentul cu interferon și sub raportul dietetic cu adaptările necesare. Rezultatele celor două grupuri au fost raportate la cele ale unui al treiea grup de control format din 9 participanți sănătoși clinic și bioumoral.

Al doilea studiu a urmărit manifestările clinice simptomatice și neuro-psihiatrice la 8 pacienți cu encefalopatie porto –sistemică în relație cu valoarea stresului oxidativ exprimat prin expresia malondialdehidei, și dacă stresul oxidativ agravează în funcție de valoarea sa și evoluția simptomatică a encefalopatiei porto-sistemice.

Rezultatele celor două studii sunt analizate în text exprimate prin tabele și grafice. Comentarea rezultatelor față de rezultatele unor studii similare publicate în literatura de specialitate sunt prezentate în penultimul capitol al lucrării. Ultimul capitol cuprinde concluziile generale ale lucrării și rezultatele sale.

Recrutarea și selecția cazurilor pentru studiul de față a fost posibilă datorită activității și în ambulatorul de specialitate al spitalului, iar internarea și urmărirea bolnavilor, respectiv investigarea și diagnosticarea acestora s-a făcut în cadrul secției de Medicină Internă. Tratamentul a fost continuat la domiciliu, supravegheat prin medicul de familie și monitorizat de noi.

Pentru toate acestea mulțumesc Clinicii de Medicină Internă condusă de d –nul Conferențiar Dr. Ovidiu Burtă, care mi-a dat sfaturi prețioase și mi-a orientat căile spre soluționarea unor momente dificile din investigația bolnavilor.

Mulțumesc deopotrivă și pacienților cuprinși în studiu, care au acceptat să colaboreze cu noi, au răspuns la programul de investigare necesar în funcție de etapa studiului și de evoluția proprie.

Îmi exprim în finalul acestor gânduri recunoștința pentru colegii din unele laboratoare private care mi –

au acordat sprijinul calificat al profesiei lor, pentru unele investigații mai costisitoare, pentru care au găsit soluții salutare.

Toate eforturile celor menționați, alături de cele ale mele au condus la realizarea acestui studiu.

Capitolul I

STRESUL OXIDATIV – NOȚIUNI GENERALE

1.0.0. Stresul oxidativ (definiție, cadru general)

Stresul oxidativ este un proces fiziologic, dăunător organismului în cele mai multe cazuri, cauzat de un dezechilibru între diferiți reactanți, cum ar fi „speciile reactive de oxigen” (activitate oxidativă) și antioxidanți (2). Produșii de oxidare apar în corpul uman ca o consecință fiziologică a proceselor metabolice aerobe, dar cantitatea formată poate fi exagerat de mare în condiții anormale. Dezechilibrul dintre nivelul produșilor de oxidare și capacitatea antioxidantă a organismului, poartă numele de „stres oxidativ” și stă la originea unei patologii diverse, cu mare prevalență în medicina modernă. (22). Speciile reactive de oxigen (ROS) se formează în mod natural pe parcursul desfășurării proceselor metabolice generale din organism la nivel celular, iar simultan celulele dezvoltă mai multe mecanisme protectoare pentru prevenirea formării de ROS și în același timp detoxificării de ROS, utilizând un tip de molecule, numite antioxidanți. În anumite condiții, cum ar fi expunerea acută sau cronică la acțiunea unor efecte agresive, producția de ROS este disproporționat sporită, iar nivelul activității antioxidante este redus (comparativ). Starea rezultantă, care este caracterizată de o tulburare a echilibrului între producția de ROS pe de o parte și îndepărtarea ROS pe de altă parte împreună cu refacerea moleculelor complexe, deteriorate este numită „Stress Oxidativ”. (Halliwell). (18).

1.1.0. Speciile reactive de oxigen

„Molecula” esențială pentru viața aerobă este molecula de oxigen, ea stă la baza metabolismului energetic și a respirației, dar este implicată și în multe manifestări patologice. Formele de oxigen care intervin în diversele manifestări patologice sunt formele parțial reduse ale oxigenului, denumite și „specii reactive de oxigen”, care sunt molecule relativ mici, anorganice reprezentate de: oxigenului singlet, anionul superoxid, peroxidul de hidrogen, radicalul hidroxil, radicalii alcoxi și peroxi etc. Aceste molecule sunt reactive datorită electronilor lor nepereche și care în condiții fiziologice joacă roluri foarte importante în procesele metabolice normale.

Specii reactive, de oxigen se formează și în mediul ambiant, sub acțiunea radiațiilor ionizante. Stresul oxidativ își cumulează efectele cu stresul nitrozatin, datorat formării speciilor reactive de azot (nitrogen). „Speciile reactive de azot” reprezintă o familie de molecule antimicrobiene derivate din oxidul nitric (NO) și superoxid, produse prin activitatea enzimelor NOS2 și NADPH-oxidaza, rezultând peroxinitritul (22).

Reacțiile speciilor reactive cu substraturile organice sunt complexe. Natura leziunilor oxidative, care duce adesea la moartea celulelară nu este întotdeauna evidentă (16). Mecanismele prin care radicalii liberi lezează lipidele membranare sunt acceptate, însă se știe astăzi că sunt interesate și proteinele și acizii nucleici. (17).

Lezuinile determinate de stresul oxidativ se pot clasifica în:

leziuni ale ADN-ului celular,

oxidarea acizilor grași polinesaturați din lipide (peroxidarea lipidică);

oxidări ale aminoacizilor din proteine.

Față de atacul speciilor reactive, celulele se pot apăra prin numeroase mecanisme enzimatice antioxidante susținute de:

superoxid dismutazele (tipurile 1, 2, 3)

catalazele

lactoperoxidaza

glutation peroxidaza

perodinedoxinei

acestora li se adaugă un număr mare de molecule antioxidante, precum acidul ascorbic, tocoferolul, acidul uric, bilirubina, gltrivă și pacienților cuprinși în studiu, care au acceptat să colaboreze cu noi, au răspuns la programul de investigare necesar în funcție de etapa studiului și de evoluția proprie.

Îmi exprim în finalul acestor gânduri recunoștința pentru colegii din unele laboratoare private care mi –

au acordat sprijinul calificat al profesiei lor, pentru unele investigații mai costisitoare, pentru care au găsit soluții salutare.

Toate eforturile celor menționați, alături de cele ale mele au condus la realizarea acestui studiu.

Capitolul I

STRESUL OXIDATIV – NOȚIUNI GENERALE

1.0.0. Stresul oxidativ (definiție, cadru general)

Stresul oxidativ este un proces fiziologic, dăunător organismului în cele mai multe cazuri, cauzat de un dezechilibru între diferiți reactanți, cum ar fi „speciile reactive de oxigen” (activitate oxidativă) și antioxidanți (2). Produșii de oxidare apar în corpul uman ca o consecință fiziologică a proceselor metabolice aerobe, dar cantitatea formată poate fi exagerat de mare în condiții anormale. Dezechilibrul dintre nivelul produșilor de oxidare și capacitatea antioxidantă a organismului, poartă numele de „stres oxidativ” și stă la originea unei patologii diverse, cu mare prevalență în medicina modernă. (22). Speciile reactive de oxigen (ROS) se formează în mod natural pe parcursul desfășurării proceselor metabolice generale din organism la nivel celular, iar simultan celulele dezvoltă mai multe mecanisme protectoare pentru prevenirea formării de ROS și în același timp detoxificării de ROS, utilizând un tip de molecule, numite antioxidanți. În anumite condiții, cum ar fi expunerea acută sau cronică la acțiunea unor efecte agresive, producția de ROS este disproporționat sporită, iar nivelul activității antioxidante este redus (comparativ). Starea rezultantă, care este caracterizată de o tulburare a echilibrului între producția de ROS pe de o parte și îndepărtarea ROS pe de altă parte împreună cu refacerea moleculelor complexe, deteriorate este numită „Stress Oxidativ”. (Halliwell). (18).

1.1.0. Speciile reactive de oxigen

„Molecula” esențială pentru viața aerobă este molecula de oxigen, ea stă la baza metabolismului energetic și a respirației, dar este implicată și în multe manifestări patologice. Formele de oxigen care intervin în diversele manifestări patologice sunt formele parțial reduse ale oxigenului, denumite și „specii reactive de oxigen”, care sunt molecule relativ mici, anorganice reprezentate de: oxigenului singlet, anionul superoxid, peroxidul de hidrogen, radicalul hidroxil, radicalii alcoxi și peroxi etc. Aceste molecule sunt reactive datorită electronilor lor nepereche și care în condiții fiziologice joacă roluri foarte importante în procesele metabolice normale.

Specii reactive, de oxigen se formează și în mediul ambiant, sub acțiunea radiațiilor ionizante. Stresul oxidativ își cumulează efectele cu stresul nitrozatin, datorat formării speciilor reactive de azot (nitrogen). „Speciile reactive de azot” reprezintă o familie de molecule antimicrobiene derivate din oxidul nitric (NO) și superoxid, produse prin activitatea enzimelor NOS2 și NADPH-oxidaza, rezultând peroxinitritul (22).

Reacțiile speciilor reactive cu substraturile organice sunt complexe. Natura leziunilor oxidative, care duce adesea la moartea celulelară nu este întotdeauna evidentă (16). Mecanismele prin care radicalii liberi lezează lipidele membranare sunt acceptate, însă se știe astăzi că sunt interesate și proteinele și acizii nucleici. (17).

Lezuinile determinate de stresul oxidativ se pot clasifica în:

leziuni ale ADN-ului celular,

oxidarea acizilor grași polinesaturați din lipide (peroxidarea lipidică);

oxidări ale aminoacizilor din proteine.

Față de atacul speciilor reactive, celulele se pot apăra prin numeroase mecanisme enzimatice antioxidante susținute de:

superoxid dismutazele (tipurile 1, 2, 3)

catalazele

lactoperoxidaza

glutation peroxidaza

perodinedoxinei

acestora li se adaugă un număr mare de molecule antioxidante, precum acidul ascorbic, tocoferolul, acidul uric, bilirubina, glutationul. Când aceste rețele endogene eșuează, în restabilirea balanței redox cellare, nivelul glutationului scade, apare STRESUL OXIDATIV. (18).

1.1.1. Radicalii liberi

Radicalii liberi sunt substanțe înalt reactive produse în mod continuu, pe parcursul proceselor metabolice celulare și participă la evenimentele fiziologice comune, cum ar fi reacțiile imune, metabolismul acizilor grași nesaturați sau diverse reacții inflamatorii. (21)

Ca structură, radicalii liberi sunt molecule care conțin un singur electron nepereche pe orbita atomică sau moleculară și au un rol important în patogeneza deteriorării țesuturilor cum ar fi disfuncția hepatică, deteriorarea funcției renale inflamatorii, leziunile imune sau carcinogeneza. (16,17). Cei mai importanți radicali liberi includ anionul superoxid, radicalul hidroxil (OH) și acidul hipocloros (HOCl).

Acidul hipocloros este produs de reacția perioxidului de hidrogen (H2O2) cu ioni de clorură și joacă un rol important în cascada respiratorie leucocitică care este implicată în sistemul de apărare al gazdei. (16).

Anionul superoxid induce importante reacții de reducere în substanțele biologice prin intermediul unor reacții de tip Fenton care sunt catalizate de ionii metalici ai ciclului redox, incluzând cuprul, fierul, cromul și vanadiul. Acești ioni metalici au capacitatea de-a accepta și dona electroni singuri, ceea ce-i face catalizatori importanți ai reacțiilor rdicalilor liberi. Anionul superoxid reduce Fe3+ în metaloproteine cum ar fi feritina. Reducerea fierului legat de proteină este o reacție importantă în structurile biologice, deoarece în prezența unei cantități suficient de mari de peroxid de hidrogen (H2O2) disponibil se petrece o reacție între Fe2+ rezultat și H2O2 și care dă naștere OH, care este înalt reactiv, iar H2O2 traversează membranele biologice și atacă intracelular fosfolipidele, carbohidrații, metaloproteinele și ADN-ul, cauzând grave deteriorări pe calea reacției Fenton.

1.1.2. Posibile surse de radicali liberi

O însemnată cantitate de radicali liberi ar putea fi eliberați în ficat ca o consecință a detoxifierii hepatice de diferite medicamente, sau produși chimici, respectiv diferite produse toxice. Formarea de radicali liberi ai oxigenului ar putea fi fiziologică precum în fagocitoză (superoxidul și peroxidul de hidrogen (H2O2) sunt folosiți de celulele fagocitare pentru a distruge becteriile), un efect secundar al căilor metabolice, sau ar putea apărea în condiții patologice datorate agenților toxici, precum în cazul ischemiei, inflamației, datorită apărării antioxidante diminuată (15).

Mitocondriile sunt considerate o sursă majoră pentru producția de H2O2; aproximativ 2-3% din oxigenul consumat convertit în specii de oxigen reactiv, azot reactiv. Hepatocitele conțin o cantitate mare de mitocondrii și prin urmare, generează în exces ROS/RNS. (16).

În unele afecțiuni hepatice, infiltrația inflamatorie a țesutului interstițial este responsabilă pentru formarea de H2O2, +OH, HOCl, alături de monocloramina, care este deosebit de toxica. Anionul superoxid este cel care atrage neutrofilele suplimentar în zona de inflamație prin capacitatea chemotactică, determinând accentuarea leziunilor țesuturilor. În plus, macrofagele activate, celulele Kupffer și endoteliul vascular pot genera oxid de azot, care ar putea reacționa cu superoxidul, generând peroxinitritul, produs responsabil pentru inhibarea respirației mitocondriale și a sintezei de ADN. Deteriorarea ficatului datorată supraîncărcării cu fier (hemocromatoza) și cupru este considerată cel puțin parțial ca derivând din activitatea catalitică a acestor metale în reacția Fenton, ducând la generarea de ROS și sporirea peroxidării lipidice, având drept consecință funcția anormală mitocondrială. (14).

1.1.3. Relația antioxidanți – radicali liberi

La nivelul celulelor funcționează o varietate de mecanisme antioxidante, care joacă un rol central în protecția față de speciile de Oxigen reactiv (18). Sistemul antioxidant constă din enzime antioxidante (protectoare):

– superoxid dismutaza (SOD)

-catalaza și glutation peroxidaza (GSH-Px)

-glutationa,enzime auxiliare(glutation reductaza (GR),glutation S-tranferaza și glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G6PD).

-proteine care leagă metale (transferină, ceruloplasmina și albumina)

-vitamine (alfa-tocoferol, ascorbatul și beta-caroteni, flavonoizi și urați).

De observat este că reacțiile radicalilor liberi patologici nu cauzează în mod necesar deteriorarea celulară sau a țesutului, deoarece antioxidanții din celule și țesuturi sunt capabili să prevină leziunile datorate, radicalilor liberi (21).

Yu (1994) apreciază că așa cum ROS este un proces ce se petrece natural, diversitatea de mecanisme enzimatice și non-enzimatice s-au dezvoltat și evoluat adaptativ pentru a proteja celulele împotriva acțiunii ROS.

1.1.4. Enzime implicate în eliminarea ROS

a) Superoxid dismutaza (SOD), realizează îndepărtarea rapidă a radicalilor superoxizi. Există mai multe tipuri de SOD, care diferă în ceea ce privește localizarea lor în celule și ionii metalici de care au nevoie pentru a funcționa.

De exemplu, o superoxid dismutază cupru-zinc este prezentă în fluidul citosolic și în spațiul dintre cele două membrane care înconjoară mitocondriile. O altă formă de superoxid dismutază care conține mangan este prezentă în interiorul mitocondriilor (în matrice). Ambele forme sunt critice pentru preevnirea toxicității induse de ROS (23). Un alt tip de SOD – (EC-SOD) se găsește în afara celulelor. Efectele expunerii cronice la alcool asupra conținutului celular sau activității SOD, sunt controversate. Administrarea direct în stomacul animalelor de experiență a alcoolului a evidențiat scăderea activității SOD în ficat. (25).

b) Catalaza și sistemul glutation peroxidaza:

contribuie la îndepărtarea peroxidului de hidrogen. Catalaza este o enzimă care conține fier și se găsește în principal în interiorul unor mici componente celulare acoperite de o membrană, numite peroxizomi. Peroxizomii realizează detoxifierea celulei de peroxidul de hidrogen. Catalaza se exprimă în procesul de detoxifiere celulară prinn catalizarea unor reacții între două molecule de peroxid de hidrogen, ceea ce duce la formarea de apă și O2. Catalaza poate favoriza interacțiunea peroxidului de hidrogen cu compuși care pot servi ca donori de hidrogen, astfel că peroxidul de hidrogen poate fi convertit într-o moleculă de apă, iar donorul redus, devine oxidat. (proces denumit și activitate peroxidatică a catalazei).

c) Sistemul glutation-peroxidazei curpinde mai multe componente și include enzimele

– glutation peroxidaza

– glutation reductaza

alături de cofactorii glutationei (GSH) și nicotinamida adenin-dinucleotid fosfatul (NADPH) redus.

Glutation peroxidaza conține un aminoacid care este modificat de adăugarea unei molecule de seleniu, devenind critic pentru apărarea antioxidantă a corpului.

Glutationa (GSH) care constă din trei aminoacizi, este o componentă esențială a acestui sistem și servește de cofactor pentru o enzimă numită glutation transferaza, care contribuie la îndepărtarea anumitor medicamente și substanțe chimice precum și alte molecule reactive din celule. (26).

1.1.5. Mecanisme non-enzimatice

Prin multiplele sale funcții GSH pare a fi cel mai important antioxidant prezent în celulă, astfel încât enzimele care contribuie la generarea de GSH (Reduced glutatione) sunt critice pentru capacitatea corpului de a se proteja împotriva stresului oxidativ. (7).

Nivelele cele mai mari de GSH se găsesc în mitocondrii, unde activitatea metabolică este intensă și producția de ROS-crescută generată în cursul activității lanțului respirator. Mitocondriile însă nu pot sintetiza GSH, importându-l din citosolul celular folosind în acest scop o proteină purtătoare atașată membranei care înconjoară mitocondriile. Unele toxice între care și alcoolul interferează cu funcția acestei proteine purtătoare, ceea ce duce la scăderea GSH-lui mitocondrial. (27).

Nicotinamid-adenin-dinucleotid fosfatul (NADPH), un alt factor non enzimatic antioxidant este implicat într-o gamă mult mai diversă de reacții din celulă decât GSH. Datorită rolului jucat în sistemul glutation peroxidazei, NADPH sau enzimele care generează acest compus, sunt considerate uneori antioxidanți.

Alături de GSH și NADPH, numeroși alți antioxidanți nonenzimatici sunt prezenți în celule, între care:

vit. E (alfa tocoferol) se găsește în faza lipidică a membranelor, acționând ca un factor puternic al peroxidării lipidice, formând radicalul vitaminei E.

Vit. C (ascorbat)

Numeroase cercetări au constatat că administrarea de antioxidanți, agenți care reduc nivelul de fier liber din ficat sau agenți care refac nivelele GSH pot preveni sau ameliora acțiunile ROS sau a altor radicali liberi. (28)

1.2.0. Stresul oxidativ hepatic

Stresul oxidativ apare stunci când formele reactive ale oxigenului sunt produse mai rapid și mai mult decât pot fi neutralizate prin mecanismele de apărare sau în urma unei scăderi a apărării antioxidante, ceea ce ar putea duce la deteriorarea macromoleculelor biologice cu alterarea fiziologice a metabolismului normal. (29). Peroxidarea lipidică este implicată în patogeneza mai multor afecțiuni hepatice. Scăderea activității GSH-Px în degenerarea grasă severă a ficatului duce la sporirea H2O2, ceea ce poate iniția formarea de radicali liberi prin intermediul reacției Fenton. (15).

Mecanismul conducător al toxicității radicalilor liberi este peroxidarea fosfolipidelor membranare, care este inițiată de formarea de peroxizi sau hidroperoxizi lipizi, iar radicalii peroxi- sunt formați în prezența oxigenului care declanșează o reacție în lanț. În principal radicalul hidroxid și într-o mai mică măsură anionul superoxid duc la peroxidarea lipidelor membranei, cauzând în final producerea Malondialdehidei (MDA) și 4-hidroxialkenal (4HNE). Aceste substanțe induc direct deteriorarea hepatocitelor cu generarea de citokine proinflamatorii, activarea celulelor fusiforme (Spidle) și fibrinogeneza (30) și s-ar putea lega de diferite molecule afectând funcțiile lor și ducând, prin urmare la deteriorarea membranei, a proteinei și disfuncție enzimatică, cu deteriorarea ADN-ului sau a ARN-ului. Persistența stării de stres oxidativ cauzează efecte mutagene în ADN-ul celulei, sporește activitatea fibroblastică, ducând la ciroză și carcinomatoză. Multe studii au arătat că stresul oxidativ apare în patogeneza colestazei prin intermediul citokinelor și peroxidării lipide (31). S-a demonstrat că peroxidarea lipidică-mitocondrială are loc la diferite nivele de afectare a ficatului independent de etiologie și sporirea lipidelor, proteinelor, alături de peroxidarea acidului nucleic în specimenele de sânge și biopsie hepatică la pacienții cu hepatită cronică.

Bolile cronice ale ficatului încep adeseori cu starea anatomo-clinică a hepatitei cronice și pot evolua la ciroza ficatului sau hepatocarcionm (9). Diferiții factori etiologici au fost asociați cu hepatita cronică: virușii hepatitei B și C, alcoolul și uneori unele tulburări mtabolice, cum ar fi deficiențele de alfa-1 antitripsină sau ceruloplasmină.

Din rândul acestor factori cauzatori hepatita cronică datorată virusului hepatitei C este entitatea care evoluează cel mai des spre ciroza ficatului. Evoluția cirotică a hepatitei cronice este asociată cu fibrogeneza ficatului. Recunoașterea la timp a fibrogenezei ficatului poate îmbunătății opțiunile și rezultatul tratamentului. Procedura de referință pentru identificarea timpurie a evoluției cirotice a hepatitei cronice este histopatologia care încorporează scoruri semicantitative, iar mai modern, Fibroscanul.

Tehnicile imagistice și markerii biochimici ai fibrozei ficatului, cum ar fi fibronectina, N-acetil-beta-glucozaminidaza (beta NAG), 1 laminina și propeptida procolagen 3 (PIIIP) au fost propuse ca indicatori ai modificării și trecerii de la hepatită cronică la ciroză, dar PIIIP și laminina sunt crescute în plasma pacienților alcoolici indiferent de etapa bolii ficatului. (32).

1.2.1. Stresul oxidativ în patogeneza hepatitei C (mecanismele leziunilor hepatice virale)

Infecția hepatică cu virusul hepatitei C reprezintă un stres sistemic oxidativ major și este cauzat de o combinație între inflamația cronică interstițială hepatică, supraîncărcarea cu fier, deteriorarea progresivă a funcțiilor ficatului și asocierea de proteine codificate de virusul hepatitei C (VHC). Generarea sporită de specii reactive de oxigen și azot împreună cu scăderea apărării antioxidante favorizează dezvoltarea și progresia complicațiilor hepatice și extrahepatice ale infecției VHC.

Este știut că sunt aproximativ 170 de milioane de persoane în lume sunt infectate cronic cu acest virus. În SUA, 4 milioane de persoane au fost infectate cu VHC și se estimează că 35.000 de noi cazuri apar în fiecare an. Răspunsul terapeutic la această infecție nu este prea eficient, astfel că 80% dintre păcienții infectați devin purtători cronici care ar putea apoi progresa la boli grave; 10-20% din aceștia vor dezvolta ciroză hepatică, iar 1-5% vor dezvolta carcinom hepatocelular la 2-3 decenii de la infecție. (2).

Infecția ficatului cu virusul hepatitei C reprezintă o cauză majoră a transplantului hepatic. Genomul VHC a fost clonat, iar pe baza secvențelor nucleotide VHC au fost grupate în șase genotipuri majore și mai mult de 50 subtipuri. Genotipurile 1a și 1b ale VHC sunt cele mai rezistente la terapia curentă cu interferon alfa și ribavirină, și sunt responsabile de 70-75% din infecțiile cu VHC. (1,2).

Virusul (VHC) reprezintă o structură ARN cu catenă pozitivă cu o mărime a genomului de aproximativ 9,6 Kb. Acest genom codifică o poliproteină care este decodificată într-o manieră independentă de înveliș. Această decodificare necesită o zonă de intrare ribosomică internă (IRES) care cuprinde cea mai mare parte a regiunii necodificare (UTR) 5 și primii nouă codori ai secvenței de codificare a poliproteinei (20).

Poliproteina VHC este scindată de proteazele celulare și virale pentru a genera 10 produși ai genei virale, incluzând proteina centrală (CORE) care formeată capsida virală, NS3, și care are activitatea de helicază și protează, NS5A și polimeraza cu ARN viral NS3B. Suplimentar proteinelor derivate din secvența de codificare a poliproteinei ARN a VHC codificată pentru o altă proteină numită proteina F sau proteina cadrului de citire alternativ (AFRP) folosind un cadru de citire deschis care se suprapune cu secvența de codificare a proteinei CORE. (20).

1.2.2. Mecanismele moleculare ale patogenezei HCV

Stresul oxidativ a evidențiat un element cheie în dezvoltarea și progresia multor condiții patologice incluzând patogeneza ficatului indusă de VHC. Infecția VHC este caracterizată de sporirea markerilor stresului oxidativ, între care produșii peroxidării lipidice, care sunt crescuți în serul sanguin, celulele mononucleare în sângele periferic (PBMC), 4-hidroxinonenal (HNE) și 8-hidroxiguanozina, un marker al distrugerii oxidative a ADN-ului, sunt sporite. În același timp se constată o reducere semnificativă a nivelelor GSH hepatice, plasmatice și limfocitare la pacienții infectați cronic cu VHC, în special cu genotipul 1b. Nivelul crescut al acestui stres oxidativ în ficatul infectat cu virusul C ar putea fi explicat prin inflamația cronică, iar continua generare de specii reactive de oxigen (ROS) și de azot reactiv (RNS) ar putea fi explicate de NADPH (Nicotinamid adenin dinucleotid fosfatul), oxidaza (proteina Nox 2) celulelor Kupffer și a celulelor polimorfonucleare din ficat.

S-a descoperit că proteina NS3 a hepatitei virale C activează proteina Nox2 a fagocitelor și declanșează apoptoza și disfuncția celulelor T (celulele ucigașe naturale). Proteina Nox 2 este localizată în compartimentul fagozomal, pe membranele plasmatice, ducând la generarea sporită de ROS și alte specii reactive, care pot exercita stres oxidativ asupra celulelor din vecinătate. Ficatul este un exportator important de glutationă (GSH) și furnizează și altor țesuturi GSH. Întrucât GSH este un important antioxidant, prin deteriorarea ficatului ar putea favoriza stresul oxidativ sistemic, urmarea afectării exportului de GSH. (15, 37).

Este interesant că atât VHC cât și virusul hepatitei B (VHB) cauzează hepatită, dar VHC este mai puternic în a induce stresul oxidativ, ceea ce sugerează mecanisme care sunt unice pentru VHC. Este de subliniat că în ficatul acestora se găsesc depozite excesive de fier, ceea ce ar putea favoriza generarea de radicali liberi la acești pacienți. O seamă de studii recente au indicat că VHC poate induce direct stresul oxidativ intracelular în hepatocite. Expresia genei core-VHC a fost asociată cu sporirea ROS, în vreme ce GSH intracelular și intramitocondrial este scăzut față de nivelele crescute ale tioredoxinei oxidate și produși peroxidării lipidice.

Aceste rapoarte sugerează că expresia genei core-VHC favorizează mediul prooxidativ care induce apoi mecanismele apărării antioxidante. (3)

Mecanismele inducerii stresului oxidativ de către proteina core-VHC

Proteina „core” se atașează pe fața externă a membranei mitocondriale via regiunea sa terminală (COOH). Mai sus am arătat că generarea sporită de ROS apare odată ce proteina core-VHC este inhibată de difenil iodonin (DPI). Pe baza acestei descoperiri s-a sugerat că proteina core stimulează producția ROS de către lanțul de transport electroni al mitocondriei. Totuși difenil iodonina inhibă proteinele Nox dar nu este clar dacă ROS în aceste studii a derivat din lanțul de transport electroni mitocondriali sau din activarea proteinelor Nox. Studii mai recente au arătat dovezi suplimentare privind oxidarea sporită a GSH-ului mitocondrial și un conținut scăzut în mitocondriile celulei hepatice (experimental) al nicotinamidei adenin-dinucleotid fosfatului. S-a postulat astfel că localizarea proteinei CORE pe membrana exterioară duce la disfuncția mitocondrială prin facilitarea acumulării de Ca2+. Acesta, sporit, va inhiba apoi transportul de electroni și va favoriza producția de ROS. Mecanismele prin care proteina CORE afectează absorbția mitocondrială de calciu sau afectează direct lanțul de transport al electronilor rămâne neclar. (2, 3).

În afară de proteina CORE, și despre proteina NS5A a VHC s-a afirmat că perturbă statusul redox al organismului. Aceasta sporește semnificativ nivelele ROS așa cum este estimat de oxidarea crescută în celulele Huh 7. (3). Aceste celule Huh 7 exprimând NS5A în contextul replicanului ARN subgenomic al VHC a prezentat de asemenea o creștere semnificativă a stresului oxidativ. S-a arătat de asemenea că repliconul VHC sporește cantitatea de M4SOD, hemoxigeneza 1 (HO-1) și catalaza precum și conținutul GSH din celulele Huh 7, ceea ce sugerează inducerea unui răspuns adaptativ de către proteinele nonstructurale ale VHC. (H6).

S-a sugerat de asemenea că NS5A sporește generarea mitocondrială de ROS prin perturbarea indirectă a concentrației Ca2+ citosolic prin intermediul stresului reticulului endoplasmatic (ER). (2,33).

Se poate susține ipoteza conform căreia VHC produce stres oxidativ prin intermediul a multiple mecanisme care includ inflamația cronică, supraîncărcarea cu fier și lezarea ficatului. Este de observat că mediul redox celular este strâns legat de antioxidanți, precum și de enzimele antioxidante care îndepărtează direct oxidanții, fie inversează chimia lor. În cursul stresului oxidativ multe dintre aceste enzime antioxidante cresc ca adaptare la stres. Așadar, orice modificări susținute și semnificative ale nivelului de ROS și a raportului de GSH redus pot indica nu doar o producție necontrolată de oxidanți ci și o disfuncție semnificativă a apărării antioxidante. În această privință trebuie observat că proteina CORE spre deosebire de NS5A, tinde să scadă mai degrabă decât să crească conținutul GSH (2). Similar, în ciuda producției sporite de ROS în celulele, care exprimă proteina CORE, nu s-a observat nici o creștere compensatorie de HO-1 sau a catalazei. Pe de altă parte atât proteina NS5A cât și cea CORE au indus MnSOD. (2). Protinele care sunt afectate negativ în acest proces de către VHC ar putea cuprinde factorii transcripției AP-1, de unde rezultă că pentru determinarea efectelor combinate ale proteinei CORE, NS5A și a altor proteine VHC sunt necesare studii viitoare. (2, 33, 37).

1.2.3. Stresul oxidativ-celular în patogeneza VHC

S-a acreditat ideea că producția ridicată de specii reactive de către proteinele Nox ale fagocitelor au o proprietate microbicidă care este benefică pentru controlul infecțiilor microbiene. (16). În granulomatoza cronică, care este caracterizată de un defect al constituenților proteinici ai proteinei Nox-2, absența impulsului respirator duce la infecții recurente și formarea unor granuloame ale țesuturilor. Moleculele reactive au tendința să oxideze nespecific macromoleculele biologice esențiale care sunt în vecinătate și în conscință să ducă la distrugerea celulară sau să cauzeze deteriorarea graduală a funcțiilor importante ale celulei. Prin urmare, în timp ce O2 este esențial pentru metabolismul aerob, producția de ROS, o consecință a metabolismului aerob, a fost în general asociată cu efectele dăunătoare. (11).

S-a constatat că nivelele crescute ale ROS/RNS favorizează dezvoltarea carcinomului hepatocelular prin inducerea deteriorării ARN și mutațiile genelor celulare. (39). S-a sugerat de asemenea că stresul oxidativ indus de NS 5A activează NF Kappa B prin inducerea fosforilației 1 Kappa B alfa în tirozină-42 și tirozină-305. Această fosforilație a 1 Kappa B-alfa a implicat ZAP-70 ca o probabilă tirozin-kinază, iar degradarea 1 Kappa B-alfa pare să fie mediată de proteazele calpaina.

NF Kappa B modulează creșterea și apoptoza celulei, iar Stat 3 poate induce transformarea celulei. S-a sugerat că activarea NF Kappa B activează suplimentar ciclooxigenaza-2 (CoX2) care poate fi blocată de antioxidant chelatorului Ca2+ și inhibitorul calpainei, această activare Cox-2 va duce la o sinteză sporită a PG E2. (16, 37). Posibila activare a fosfolipazei A2 de către ROS în activarea post translatională a Cox-2 nu a fost probată.

PGE2 poate inhiba apoptoza celulelor tumorii, induce proliferarea lor, poate favoriza metastază și stimula angiogeneza. De asemenea, trebuie notat că sinteza de PG poate genera ROS. Aceste observații indică faptul că stresul oxidativ indus de VHC ar putea coopera cu alți factori pentru a favoriza oncogeneză.

Stresul oxidativ sistemic constatat la pacienții cu hepatită virală C, care este probabil următor stresului oxidativ hepatic, ar putea de asemenea explica o parte a manifestărilor extrahepatice ale infecției VHC, cum ar fi manifestările dermatologice. Infecția VHC a fost asociată cu diabetul, iar speciile reactive ar putea participa la dezvoltarea diabetului și a altor complicații asociate cu diabetul la pacienții cu hepatita C. (44). Urmare stresul oxidativ ar putea contribui la complicațiile atât hepatice cât și extrahepatice ale infecției VHC. (39, 42).

1.3.0. Rolul antioxidanților în stresul oxidativ din HVC

Reacțiile de oxidare sunt cele care adaugă oxigen unei molecule sau îndepărtează hidrogen sau electron dintr-o moleculă. Reacțiile inverse duc la îndepărtarea de oxigen sau adăugarea de hidrogen sau electroni. (oxidare/reducere).

Oxigenul molecular poate accepta un total de patru electroni, unul odată și numărul corespondent de protoni pentru a genera două molecule de apă. În cursul acestui proces diferiții radicali de oxigen sunt formați succesiv ca produși intermediari, incluzând superoxidul (O2– ) peroxidul (O2+) care există în mod normal în celule ca peroxidul de hidrogen (H2O2) și radicalul hidroxil (OH). Superoxidul, peroxidul și radicalul hidroxil sunt considerați ca principali ROS și au declanșat cercetări majore privind rolul radicalilor liberi în biologia medicală. Superoxidul poate reacționa cu el însuși pentru a produce H2O2. Efectele toxice ale oxigenului în sistemele biologice, cum ar fi oxidarea lipidelor, inactivarea enzimelor, introducerea de modificări în ADN și distrugerea membranelor celulare și în final a celulei, pot fi atribuite reducerii O2 în ROS (Toykuni 1999, de Groot, 1994, Nakawa et. al. 1996).

Antioxidanții joacă un rol protectiv al celulei hepatice, la pacienții cu VHC, dar și în alte forme de stres oxidativ, cum este cel din encefalopatia hepatică.

Într-un studiu clinic recent s-a observat normalizarea enzimelor hepatice la 44% dintre pacienții cu hepatită cronică cu VHC cu nivele ridicate înainte de tratament folosind o terapie antioxidantă combinată. (45). La fel și rezultatele histopatologice au fost favorabile la 36,1% din pacienți. Cu toate progresele făcute, nu este clar modul în care ROS/RNS crescute (sporite) afectează replicarea VHC. În studiile de culturi celulare bazate pe replicări s-a descoperit că stresul oxidativ suprimă replicarea ARN VHC.

Mecanismul este complex și constă din următoarea cascadă: (N-acetilcisteina a inhibat acest efect suprimator) – ROS a suprimat replicarea ARN-ului VHC, prin distrugerea formării complexului de replicare al ARN al VHC care s-a co-fracționat cu membranele Golgi. Procesul suprimării s-a realizat în 30 de minute fără însă a exista dovezi de toxicitate a celulei. În plus această suprimare oxidativă a replicării VHC ar putea fi mediată de calciu și PGE2. Rezultatele nu sunt însă destul de consecvente. De exemplu, într-un studiu recent, reducerea încărcării virale a fost observată la terapie antioxidantă de combinație la 25% dintre pacienți. Un alt studiu a descoperit că încărcarea virală s-a corelat pozitiv cu malondialdehida (MDA) eritrocitară (un produs al peroxidării lipide), dar nu și cu MDA plasmatică. (47). Este posibil ca antioxidanții să aibă alte efecte, cum ar fi asupra sistemului imunitar al gazdei, ceea ce ar duce la o reducere generală a încărcăturii virale VHC in vivo.

Desfășurarea cercetărilor în domeniu și multiplele studii efectuate arată că există relații complexe între stresul oxidativ, acțiunea diverselor antioxidante și dezvoltarea hepatitei cronice cu complicațiile sale (ciroza, encefalopatia și carcinomul hepatocelular) și patogeneza acestora.

Rezumând, efectele stresului oxidativ în patogeneza infecției virale a ficatului putem accepta că:

infecția cu virusul hepatitei C este asociată cu alterări severe ale statutului redox al gazdei;

nivelele sporite ale ROS/RNS ar putea juca un rol important în dezvoltarea bolilor de ficat asociate cu VHC;

în timp ce antioxidanții/reductorii ar putea fi utili la ameliorarea bolilor asociate VHC, se pune întrebarea dacă acești compuși suprimă, sporesc sau nu au nici un efect asupra VHC;

cu privire la terapia antioxidantă trebuie notat că acidul ascorbic (vitamina C) poate de fapt favoriza producția de radicali hidroxili în prezența fierului liber;

prin urmare, unii antioxidanți pot acționa ca pro-oxidanți, mai degrabă decât antioxidanți la pacienții cu hepatită C cu depunere excesivă de fier în ficat;

acest fapt impune o re-evaluare a obțiunii pentru antioxidanți și modul de folosire a acestora pentru tratamentul hepatitei virale C. (2, 4, 10).

1.4.0. Stresul oxidativ în hepatita virală B și C

Virusul hepatitei C este principalul agent cauzator al hepatitei virale cronice, iar virusul hepatitei B este observat pe scară largă în lume ca și cauzator al cronicizării hepatice.

Cu toată extensia celor două entități cronice și cu toate eforturile în cercetare, patogeneza hepatitei cronice nu este pe deplin înțeleasă. Deși ficatul este bine dotat cu antioxidanți enzimatici endogeni el are de asemenea sisteme active microsomale și mitocondriale, care generează specii de oxigen reactiv (ROS) în cursul proceselor metabolice normale. (56). Stresul oxidativ se dezvolră atunci când apare o tulburare a balanței dintre ROS produși în exces și factorii care previn efectele lor dăunătoare.

Pentru contracararea efectului dăunător al stresului oxidativ, organismul utilizează enzime ale apărării antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza (SOD) și catalaza (CAT). Oxigenul reactiv deteriorează acizii nucleici și proteinele celulei hepatice, declanșând în același timp procesul peroxidării lipidice. Peroxidarea lipidică este unul dintre cauzele majore de deteriorare a hepatocitelor, declanșând o creștere marcată a nivelului malondialhehidei (MDA), care reprezintă biomarkerul specific al stresului oxidativ. (57, 58). În ultimul timp au apărut un număr mare de studii despre stresul oxidativ la pacienții cu hepatită cronică B și C (62), între care De Maria et. al. (30) care subliniază că malondialdehida, produs al peroxidării acizilor grași nesaturați, își sporește nivelul în ficat și serul sanguin; la fel studiul efectuat de Paradis et. al. (57) a demonstrat imunohistochimic prezența aducților MDA proteinici în țesutul hepatic infectat viral. Boya et. al. (26) a arătat că celule mononucleare sanguine periferice de la pacienții cu hepatită C, aveau concentrații de malondialdehidă serice crescute și activitatea superoxid dismutazei sporită. Un alt studiu efectuat de Romero et. al. (58) a subliniat prezență sporită a malondialdehidei serice la pacienții cu hepatită C față de subiecții sănătoși, înaintea aplicării tratamentului cu interferon. Aceste studii au evaluat și subliniat importanța stresului oxidativ în hepatita cronică B și C prin expresia serică sporită a malondialdehidei ca marker specific al stresului oxidativ. Studiile cllinice au evidențiat că nivelele serice ale malondialdehidei la pacienții cu hepatita cronică B și C sunt constant diferite ca valoare titrată în laborator.

În hepatita cronică virală B, activitata catalazei și superoxid dismutazei ca și nivelul seric al malondialdehidei sunt semnificativ mai mari față de valorile normale. În hepatita cronică virală C nivelul seric al malondialdehidei este semnificativ mai mare față de intervalul normalului, iar activitatea catalazelor ș superoxid dismutazei este semnificaitv mai mică decât intervalul normal, dar și față de nivelul seric din hepatita B. De asemenea, se constată că activitatea catalazelor și a superoxid dismutazei este mai crescută în hepatită cronică virală B decât în hepatita virală C, în timp ce malondialdehida are nivelul seric mai crescut în hepatita C comparativ cu hepatita B, unde este mai scăzut.

O seamă de studii au raportat dovezi ale existenței unei bune corelări între tipul și severitatea bolii hepatice și nivelul antioxidanților din sânge. Activitatea catalazelor și a superoxid dismutazei sporite în hepatita cronică B arată că ar putea exista o reacție la stresul oxidativ, în cazul acestor bolnavi. Capacitatea mai mică a antioxidanților în hepatita cronică C poate evidenția gradul sporit de agresivitate a stresului oxidativ în infecția cu acest virus al hepatitei, dovadă gradul sporit de leziune a hepatocitelor din hepatita virală C. (63).

Atunci când activitatrea acestor enzime antioxidante este neadecvată, organismul nu este capabil să neutralizeze ROS excesiv și în consecință apar leziunile hepatice de grade variate. Demirdag et. al. (61) a raportat într-un studiu valori ale enzimelor antioxidante în cazul hepatitei cronice B și C, mai mici decât cele ale intervalului normal. Valori asemănătoare a raportat într-un alt studiu Irschad et. al. (63), indiferent de etiologia virală a hepatitei. În cazul deteriorării hepatice cauzată de etiologia virală s-a constatat că nivelul malondialdehidei sporește mult în ser și țesutul hepatic. Într-un studiu raportat de Nagoer (64) s-a arătat că nivelul malondialdehidei serice este cel mai crescut în hepatita cronică B și C în momentul de vârf al evoluției, diminuând pe parcursul regresiei evolutive și a convalescenței. Malondialdehida este produsul final al peroxidării lipidice și s-a constatat că perioxidarea lipidică este unul din factorii deteriorării hepatocitului. Toate manifestările enzimatice oxidative și antioxidative descrise reprezintă manifestări fiziopatologice determinate de stresul oxidativ în evoluția hepatitelor cronice virale B și C. Speciile reactive ale oxigenului, iau astfel parte la patogeneza hepatitei C cronice prin micșorarea activității enzimelor antioxidante.

1.5.0. Influența stresului oxidativ în ciroza hepatică de etiologie virală și etanolică

Stresul oxidativ are un rol major în evoluția hepatitelor virale și etanolice. Diferiți markeri ai stresului oxidativ au fost găsiți crescuți pe parcursul evoluției hepatitelor cronice virale și etanolice. Moleculele oxigenului reactiv au fost comparate în serul unor bolnavi cu cele ale unor loturi de control. Au fost evaluați markerii stresului oxidativ, 8-hidroxideoxiguanozina (8-OhdG), 4-hidroxi-2-nonenal, malondialdehida și tioredoxina în specimenele biopsiei ficatului de la pacienți cu infecție virală C avansată, cu fibroză în faze evolutive diferite – F1, F2, F3, F4 și a fost studiată concomitent apariția carcinomului hepatocelular în prezența markerilor stresului oxidativ. Nivelul moleculelor oxigenului reactiv la pacienții cu hepatită virală C a fost pozitiv, corelat cu stadiul de evoluție spre ciroză al hepatitei cronice. (66) comparativ cu subiecții de control.

În specimenele biopsiei ficatului, markerii stresului oxidativ au fost descoperiți în special în jurul zonelor de necroză celulară parțială sau în zonele periportale. Prezența markerilor stresului oxidativ pare să sporească odată cu faza fibrozei. Markerul 8-OhdG al deteriorării ADN-ului datorat stresului oxidativ a fost detectat în nucleul hepatocitelor din stadiu incipient al cirozei hepatice. Markerii stresului oxidativ au apărut atât în celulele hepatocarcinomatoase cât și în celulele non-carcinomatoase ale pacienților cu hepatocarcinom, urmare a complicației hepatitei cronice virale C. Markerii stresului oxidativ au fost găsiți atât în serul sanguin cât și în specimenele biopsiei hepatice ale bolii ficatului asociată cu VHC, cât și în țesuturile hepatocarcinomatoase. (65). Detectarea markerilor stresului oxidativ este importantă pentru monitorizarea progresiei hepatitei cronice spre ciroză, precum și pentru evaluarea stadiului de ciroză, dat fiind paralelismul pozitiv între nivelului seric și cel din specimenele de biopsie hepatică. (66).

Mecanismele fiziopatologice prin care stresul oxidativ acționează la nivel molecular și celular hepatic, prin care se marchează relația pozitivă a creșterii markerilor serici ai stresului oxidativ, pe măsura cronicizării și complicației bolii hepatice au fost descriși în paginile anterioare. În susținerea lor prezentăm două studii clinice ilustrative.

Infecția cronică cu viruși hepatotropi este principala cauză de boală cronică a ficatului și de ciroză în lume. Într-un studiu clinic pe un număr semnificativ de pacienți efectuat de L. Benvegnu și colaboratorii săi la o clinică de renume din Padova, în perioada 1986-1996 (312 pacienți, din care 43 pozitivi VHB, 254 pozitivi VHC și 15 co-infectați VHB+VHC) au fost observați la intervale de șase luni cu teste de laborator, prin care s-au urmărit complicațiile majore (ascita, hemoragia gastro-intestinală, encefalopatia porto-sistemică, carcinomul hepato-celular). Cea mai frecventă complicație a fost carcinomul hepatocelular cu 65 de cazuri (20,8%), ascita 61 de cazuri (19,5%), hemoragia gastro-intestinală 14 cazuri (4,5%) și encefalopatia porto-sistemică 6 cazuri (1,9%).

Aproximativ 10-20% dintre pacienții cu infecție VHB sau VHC cronică fac ciroză hepatică la prima prezentare clinică de la infecție, iar 20-30% dintre cei care nu au ciroză o vor dezvolta ulterior, însoțită de complicații, după unul sau mai multe decenii. (68).

În evaluarea evenimentelor au fost urmărite simptomele clinice ale bolii de ficat, parametrii de laborator incluzând: alaninaminotransferaza, aspartataminotransferaza, bilirubina, timpul de protrombină, albumina serică, numărul plachetelor și al leucocitelor, hemoglobina, alfa-fetoproteina, alături de examinarea eco-abdominală, CT și RMN, acolo unde a fost indicat. Complicațiile majore ale cirozei au fost urmărite astfel:

carcinomul hepatocelular a fost urmărit prin examen ecografic, tomografic computerizată și rezonanță magnetică nucleară, alături de biopsia hepatică;

ascita a fost identificată și urmărită ecografic;

hemoragia gastrointestinală, urmarea hipertensiunii portale a fost urmărită prin examenul endoscopic al varicelor esofagiene sau gastrice sau a gastropatiei hipertensive;

encefalopatia porto-sistemică a fost evaluată prin parametrii clinici, electroencefalogramă și teste psihometrice;

înrăutățirea evoluției hepatice a fost evaluată în conformitate cu trecerea de la ciroza de tip Child A la cea de tip Child B sau C. (69).

Câteva aspecte ale pacienților cirotici în relație cu etiologia cirozei – la start:

pacienții pozitivi AgHbs fără anti-VHC erau semnificativ mai tineri decât cei cu anticorpi VHC și era semnificativ mai probabil să fie bărbați.

Timpul mediu de protrombină a fost semnificativ mai mare în cazurile cu anti- VHC pozitivi comparativ cu cele doar cu AgHbs sau co-infetate cu VHC;

Abuzul de alcool a fost mai prevalent la cei cu AgHbs și la pacienții co-infectați VHB și VHC, dar diferența nu a fost semnificativă

1.5.1. Efectele stresului oxidativ în ierarhizarea complicațiilor în relație cu etiologia cirozei

Din analiza studiului (67), rezultă că cel puțin o complicație a cirozei a apărut la 78 pacienți din cei 254 (30,7%) cu anti- VHC pozitivi, 15 (34,8) din 43 a cazurilor cu AgHbs pozitiv și 8 (53,5%) din 15 cazuri coinfectate VHB și VHC. Carcinomul hepatocelular a fost cea mai frecventă și prima complicație la pacienții cu anti- VHC pozitivi și în cazurile co-infectate VHB -VHC, în timp ce ascita a predominat și a fost cea mai frecventă și prima complicație în rândul cazurilor pozitive doar pentru VHB.

Agravarea fazei cirozei hepatice și decesul datorat cauzelor legate de ficat au avut o frecvență similară la VHC și VHB, în timp ce incidența acestor evenimente a fost de două ori mai mare la pacienții cu co-infecție VHB și VHC.

Factorii stresului oxidativ au fost tot mai pronunțați și mai toxici, expresia lor fiind evaluată după 5 și 10 ani de monitorizare, iar incidența cumulată a arătat astfel:

carcinomul hepatocelular 7,8% la 5 ani și 28% la 10 ani la pacienții doar cu VHC, 10% și 18% la pacienții cu AgHbs și de 13% și 50% în cazurile co-infectate VHB + VHC.

Incidențele cumulate ale ascitei la 5 și 10 ani au fost: 7% și 20% la pacienții doar cu VHC, 11% și 30% a pacienții doar cu AgHb și de 11% și 40% în cazurile de co-infecție VHB+ VHC.

Hemoragia gastrointestinală și encefalopatia au fost reprezentate în procent de 2,5% și 0% la 5 ani și de 5% și 2,5% la 10 ani la pacienții doar cu anti-HCV și de 0% și 0% respectiv 5% și 5% la pacienții doar cu AgHbs, în timp ce niciunul dintre pacienții co-infectați cu VHB+VHC nu au dezvoltat aceste complicații.

Pozitivitatea pentru ADN-ul VHB la pacienții cu AgHbs a fost asociată cu o incidență mai mare a ascitei (30,7% față de 11,7%), înrăutățirea fazei cirozei (30,7% față de 5,9%) și decesul sau transplantul de ficat (42,3% față de 11,7%) în cursul supravegherii de 10 ani.

Incidența și ierarhia complicațiilor în relația cu consumul abuziv de alcool arată pe primul loc ascita, în vreme ce dezvoltarea hepatocarcinomului, hemoragia gastrointestinală și apariția encefalopatiei au fost la valori apropiate, și fără complicații majore. Decesul datorat cauzelor legate de ficat s-a petrecut la 20,8% dintre cazurile netratate și la 11,3% din pacienții tratați. (69).

Cele mai multe studii pe pacienți în diferite faze ale cirozei au identificat de regulă hipertensiunea portală și principalele consecințe clinice: ascită și hemoragia esofagiamă ca fiind cele mai frecvente cauze de tranziție de la ciroza compensată la cea decompensată (72).

Un studiu de prestigiu efectuat de Tanaka R. și colaboratorii în Japonia, pe grupuri omogene de pacienți cirotici cu așa-zisă ciroză timpurie, inițial bine compensată de etiologie virală a constatat în mod clar că hepatocarcinomul este o altă complicație importantă, care la acești pacienți se poate dezvolta frecvent în faza compensată a cirozei.

În studiu, analizat pe larg de noi, se constată după o monitorizare de 10 ani că dezvoltarea hepatocarcinomului s-a petrecut la 20,5% dintre pacienții cu VHC și la 46,7% dintre cei cu VHC și VHB asociată fiind prima complicație a cirozei în 18,5% respectiv 40% din aceste cazuri (70, 71). Hepatocarcinomul a precedat adeseori apariția ascitei și a fost cauză de deces pentru 70,7% din pacienții studiului de mai sus (67). Impactul clinic major al hepatocarcinomului în primul deceniu de evoluție al cirozei legate de virus a fost în mod clar distras de rata decesului. Așa se face că studiile care au estimat ascita, ca fiind cea mai frecventă complicație a cirozei, au subestimat carcinoamele hepatocelulare mici care ar fi putut precede și precipita ascita. Studiile care au inclus pacienți cu forme de ciroză nevirale, în principal cele legat de alcool, unde stresul oxidativ implică în patogeneza și patofiziologia leziunilor hepatice diferite modificări hematodinamice, predomină faza de inflamație și proliferarea hepatocelulară anormală. (65, 67). Incidența crescută a hepatocarcinomului înregistrată la formele asociate de VHB și VHC în faza compensată a cirozei hepatice arată că această asociere este extrem de predispusă la transformare malignă, fapt ce impune o supraveghere atentă și reevaluarea acestor asocieri morbide.

Pacienții cirotici VHB au istoric natural diferit al bolii de ficat în relație cu ierarhia complicațiilor comparativ cu pacienții infectați VHC. Ascita este mai frecventă ca și complicație timpurie la pacienții cu AgHbs pozitiv, în timp ce acest aspect nu a fost observat în cazurile negative pentru ADN VHB. Incidența și ierarhia complicațiilor majore la pacienții cu VHC pozitivi a fost similară la cei cu genotipuri diferite, în special VHC-1 și VHC-2. (65)

Nivelul crescut al stresului oxidativ este implicat în dezvoltarea hipertensiunii portale la pacienții cu ciroză hepatică. Într-un studiu destul de recent (55) a fost urmărită relația dintre stresul oxidativ și parametrii hemodinamici la pacienții cu ciroză hepatică. În studiu au fost înrolați patruzeci și doi de pacienți cu ciroză hepatică de etiologie virală și 24 de subiecți normali, de control.

Scopul studiului a fost evidențierea efectului stresului oxidativ sporit implicat în dezvoltarea hipertensiunii portale din ciroza hepatică în corelare cu parametrii hemodinamici.

S-au efectuat măsurătorile nivelelor plasmatice ale malondialdehidei (MDA), nitrit/ nitraților (NOX), endotoxinei și activitatea superoxid dismutazei (SOD) la toți subiecții. La pacienții cirotici au fost efectuate măsurători hemodinamice sistemice și splenice.

Rezultatele:

Activitatea superoxid dismutazei (SOD) a fost semnificativ scăzută la pacienții cirotici comparativ cu subiecții lotului de control (normali)

Chiar mai mult, nivelele plasmatice ale malondialdehidei la pacienții cu ciroză hepatică au fost semnificativ asociate pozitiv cu gradientul presional al presiunii venoase hepatice la bifurcație. (WHVP) = r = 0,42; 8 = 0,007 și rezistența în vasele sinusoidale hepatice (HSR) r = 0,33, p = 0,33.

De asemenea nivelele plasmatice al malondialdehidei s-au corelat pozitiv cu endotoxina r = 0,71; p < 0,0001, NOX = r = 0,55; p < 0,001 la pacienții cirotici.

Analiza multiregresiei a arătat că cei mai puternici factori independenți care prezic gradientul presiunii venoase hepatice (HVPG), presiunea venoasă hepatică la bifurcație, (WHVP) și rezistența în vasele sinusoidale hepatice (HSR) sunt respectiv nivelele plasmatice ale MD, NOX și endotoxinei.

În concluzie, studiul sugerează o interacțiune strânsă între MDA, endotelină, NOX și faptul că aceste substanțe sunt asociate de asemenea cu tulburarea hemodinamică din ciroza hepatică.

1.6.0. Encefalopatia hepatică și stresul oxidativ (mecanisme fiziopatologice în encefalopatia porto-sistemică versus hepatita cronică)

Encefalopatia hepatică este o tulburare de natură neuropsihică care apare atât în insuficiența hepatică acută, cât și în cea cronică (53). Alți autori (77) definesc encefalopatia hepatică sau porto-sistemică ca fiind un sindrom reversibil al funcției cerebrale afectate ce survine la pacienți cu insuficiență hepatică în stadiu avansat. Totuși encefalopatia hepatică nu este o entitate clinică de sine stătătoare, ea ar putea reflecta fie o encefalopatie metabolică, fie o atrofie cerebrală, fie un edem cerebral, toate însă reversibile sau orice combinație a acestor condiții. Mecanismele care cauzează disfuncția cerebrală din insuficiența hepatică rămân încă insuficient cunoscute. În coma avansată efectele reversibile ale sistemului neuro-transmițător nu pot fi distinse, ba chiar mai mult aceste evenimente se suprapun, cel puțin în modelele de insuficiență hepatică acută. (77).

Encefalopatia hepatică (78) definește întreg tabloul clinic al simptomelor neuro-psihice ale bolii hepatice acute sau cronice cu tulburări de severitate variată ale funcțiilor psihosomotorii, intelectuale, cognitive, emoțional afective, comportamentale și motorii, cele de finețe și de precizie. S-a subliniat că encefalopatia hepatică din ciroza hepatică reflectă manifestările clinice ale edemului cerebral de grad mic folosind studii in vivo și utilizând spectroscopia cu rezonanță magnetică.

Deși mecanismele patologice exacte, responsabile pentru encefalopatia hepatică nu sunt complet înțelese pare să fie implicat un deficit de neurotransmisie mai degrabă decât un deficit primar al metabolismului energiei cerebrale. Cea mai vulnerabilă celulă neuronală la insuficiența hepatică este astrocitul, care în insuficiența hepatică suferă modificări caracteristice ce duc la creșterea presiunii intracraniene. Modificările suferite de acesta în insuficiența hepatică cronică sunt caracteristice și sunt cunoscute sub numele de astrocitoza Alzheimer de tip II. Encefalopatia porto-sistemică din insuficiența hepatică cronică este asociată cu alterarea funcției astrocitelor expresie marcată a disfuncției mai multor proteine și enzime cheie, incluzând monoaminoaxidaza B, glutamin-sintetaza și așa numiții receptori ai benzodiazepinei de tip periferic. De asemenea și unele proteine normale, cum ar fi monoaminooxidaza A și sintetaza oxidului nitric neuronal sunt modificate. În insuficiența hepatică acută este afectat transportul glutamatului spre astrocite – GLT-1, ceea ce determină creșterea concentrației extracelulare a acestuia. (85).

Unele din aceste modificări au fost atribuite efectului toxic al amoniacului sau manganului, două substanțe care normal sunt îndepărtate din corp pe cale hepato-biliară, și care în cazul insuficienței hepatice se acumulează în creier. Depunerea de mangan pe globus pallidus în cazul insuficienței hepatice cronice duce la o hiper-intensitate a semnalului de rezonanță magnetică ponderată T1 și ar putea fi responsabilă pentru simptomele extrapiramidale caracteristice encefalopatiei portosistemice. (83). Alte simptome neurotransmițătoare implicate în patogeneza encefalopatiei hepatice includ sistemul serotoninei în care este sugerat un deficit simpatic precum și sistemele catecolaminergic și opioid. (78, 81). Encefalopatia hepatică este o complicație neuropsihiatrică severă a insuficienței hepatice atât acute cât și cronice; ea evoluează în fucție de durata și gradul disfuncției hepatice și se poate prezenta fie sub forma encefalopatiei portosistemice, când însoțește șuntarea portosistemică a sângelui venos și care apare fie spontan, fie datorită hipertensiunii portale, fie chirurgical ca urmare a anastomozei porto-cave, sau a șunturilor porto-sistmice intrahepatice transjugulare cu scopul ușurării hipertensiunii portale.

Din punct de vedere neurologic encefalopatia portosistemică se dezvoltă lent, cu debut insidios, prin modificări de personalitate și somn tulburat, scăderea capacității de concentrare, necoordonare musculară și asterixis, progresând spre stupor și comă. Apare adesea ca manifestare clinică în urma unei sângerări gastrointestinale, constipației sau folosirea unor sedative. Neurologic se produc modificări astrocitice cunoscute sub numele de astrocitoza Alzheimer tip II în care astrocitele se prezintă umflate, cu un nucleu pal, mare cu nucleolul proeminent și cu evidențierea marginilor modelului cromatinei.

În encefalopatia portosistemică, astrocitele prezintă expresia alterată a unor proteine specifice astrocitelor cheie incluzând proteina acidică-fibrilară-ghială, enzime cum ar fi glutamin sintetaza și monoaminoxidaza (MAO/ și a receptorilor benzodiazepinei de tip periferic (mitrocondrial). (86). O seamă de studii bazate pe tomografia cu emisie de pozitroni privind patogeneza encefalopatiei portosistemice au relevat scăderi semnificative ale utilizării glucozei cerebrale în cortextul cerebral concomitent cu sporirea în talamus, nucleul caudat și în cerebelul pacienților cu encefalopatie portosistemică ușoară. Utilizarea glucozei cerebrale este micșorată, în special în girusul cingulat al acestor pacienți, o descoperire care este de un interes deosebit ținând cont de raportul conform căruia leziunile bilaterale ale acestei structuri ale creierului duc la confuzie, dezorientare și pierderea memoriei. (87). Aceste observații sugerează că hipometabolismul observat în aceste structuri cerebrale poate contribui la anomalii neuro-psihice timpurii observare frecvent la pacienți cirotici, mai cu seamă la cei vârstnici, ca urmare a procedurilor anastamozei porto-cave sau a celor portosistemice intrahepatice tranjugulare. (87)

1.6.1. Conceptul stresului oxidativ în encefalopatia hepatică

Speciile reactive de oxigen acționează și ca modulatori ai activității neuronale, inclusiv la nivelul transmiterii sinaptice. Când se acumulează în contități mari, speciile reactive de oxigen declanșează stresul oxidativ, reflectat prin tulburări ale transmisiei sinaptice. Astfel, inhibarea transmisiei sinaptice la nivelul hipocampului prin H2O2 este urmată de hiperexcitabilitate electrică odată cu îndepărtarea H2O2, ceea ce arată că expunerea neuronilor la H2O2 determină activarea receptorului NMDA, probabil prin inhibarea redox-senzitivă a captării glutamatului (80). Când se restabilește trasmisia sinaptică prin îndepărtarea H2O2 activarea probabilă a receptorului NMDA conduce în continuare la generarea speciilor reactive de oxigen și la înjurii oxidative consecutive. Aceste constatări atestă posibilitatea existenței unei resurse fiziopatologice care contribuie la disfuncțiile neurologice cu caracter degenerativ, care însoțesc stresul oxidativ în encefalopatia hepatică. (80). Activarea NMDA determină creșterea concentrației intracelulare de Ca2+, care inițiază mai multe procese calciu-dependente inclusiv formarea oxidului nitric, care este o moleculă generoasă foarte reactivă, foarte rapid difuzabilă și cu durată de viață foarte scurtă. Studii recente au evidențiat creșterea expresiei sintazei oxidului nitric (NOS) în neuroni și captarea sporită de L-arginină (un pecursor obligatoriu al oxidului nitric) atât în encefalopatia hepatică acută cât și în cea cronică. Hiperamoniemia asociată disfuncției hepatice severe determină și creșterea concentrației de NO, cu alterări consecutive ale memoriei și edem cerebral acut evidențiabil în encefalopatia hepatică acută (88). Astfel factori diferiți, cum ar fi amoniacul, benzodiazepinele, alterările neurotransmițătorilor, speciale reactive de oxigen și azot pot induce sau agrava edemul astrocitelor, fapt care induce activarea unei adevărate cascade de semnalizare osmotică, modificări proteice, alterări ale expresiei genice și ale neurotransmisiei.

Între cele mai importante modificări proteice se numărără nitrarea resturilor de tirozină din structura poteinelor gliale. Au fost astfel indetificate nitrări ale tirozinei din structura glutamin-sintazei și a receptorului periferic pentru benzodiazepine ca răspuns la hiperamoniemie, edem astrocitar, citokine proinflamatorii, etc. (77). Între substanțele neurotoxice ce apar și se dezvoltă pe parcursul evoluției insuficienței hepatice menționăm amoniacul, manganul, glutamatul, serotonina, catecolaminele, GABA, sistemul opioid și stresul oxidativ care contribuie pe parcursul dezvoltării fiziologice a insuficienței hepatice de diferite etiologii, la precipitarea și agravarea prognosticului acesteia.

1.7.0. Principalele substanțe neurotoxice, acumulate în creier în insuficiența hepatică cu encefalopatie.

Șuntarea porto-sistemică din insuficiența hepatică determină concentrații sanguine sporite ale unor substanțe care sunt potențial neurotoxice și ajung în circuitul cerebral. Între acestea amoniacul și manganul au fost cel mai mult studiate prin diverse cercetări pe animale, dar și în practica clinică.

1.7.1. Amoniacul – mecanisme fiziopatologice și farmacologice de acțiune

Relația dintre encefalopatia hepatică și efectele neurotoxice ale amoniacului în insuficiența hepatică cronică cu șuntare porto-sistemică sunt cunoscute de peste un secol, dar sunt legate în cercetare și în interpretarea clinică de numele lui Eck, care a descris efectele anastomozei porto-cave în experiențele sale pe câini (prin crearea unei fistule porto-cave). Concentrațiile sângelui arterial cu amoniac sunt sporite la orice bolnav cu insuficiență hepatică și în orice formă de encefalopatie. Susținerea unor dovezi consistente în acest sens au fost aduse de unele studii care au folosit tomografia cu emisie de pozitroni, care a demonstrat o creștere a ratei metabolice cerebrale pentru amoniac. O seamă de alte studii au dezvăluit că rata metabolică cerebrală pentru amoniac este sporită la pacienții cu encefalopatie porto-sistemică și a fost însoțită de o creștere a produsului ariei permeabilitate/suprafață, o măsură a permeabilității barierei sânge-creier, ceea ce sugerează că în insuficiența hepatică cronică bariera devine tot mai permeabilă la amoniac. (89). Ușurința cu care se deplsează amoniacul în creierul pacienților cu boală hepatică cronică și creșterea raportului concentrației creier/sânge, oferă o explicație pentru hipersensibilitatea pacienților cirotici la condiții amoniagene, cum ar fi ingerarea unei diete bogate în proteine sau o hemoragie gastrointestinală, precum și pentru corelația dintre gradul disfuncției neurologice și concentrațiile sanguine ale amoniacului la acești pacienți.

1.7.1.1. Efectele toxice ale amoniacului asupra funcțiilor cerebrale

Ca urmare a șuntării porto-cave, inhibarea post-sinaptică în cortexul cerebral dezvoltă o sensibilitate crescută a pacienților supuși anastamozei portocave chirurgicale sau șunturilor portosistemice intrahepatice transjugulare (TIPS) pentru tratamentul hipertensiunii portale la condiții amoniagene, cum ar fi încărcarea proteinică sau hemoragia gastro-intestinală. Concentrațiile milimolare de amoniac inhibă de asemenea neurotramisia excitatoare. (90).

O seamă de studii au sugerat că sporirea concentrațiilor de amoniac în creier ar putea fi legate cauzal de fenomenul edemului cerebral în insuficiența hepatică fulminantă. Sporirea apei în creier a fost descrisă experimental ca fiind o hiperamoniemie indusă de urează în urma infuziunii de acetat de amoniu. (91).

Tratarea feliilor cortical cerebrale izolate cu amoniac în concentrații echivalente cu cele raportate pentru creier în insuficiența hepatică fulminantă (experimental) a rezultat în umflarea semnificativă și în reducerea concomitentă a spațiului inulinei. (93). Edemul cerebral atât experimental cât și cel uman este de natură citotoxică mai degrabă decât vasogen, iar umflarea astrocitică este raportată consecvent. (94).

Umflarea astrocitelor corticale cerebrale a fost observată la primate după administrarea de amoniac. Umflarea celulei indusă de amoniac pare să fie mediată prin intermediul unui metabolit al amoniacului mai degrabă decât amoniacul în sine. Îndepărtarea din creier a amoniacului depinde de sinteza glutaminei enzimatice a astrocitei. Unele studii au sugerat că sporirea indusă de amoniac a conținutului de apă în creier este mediată de efectele osmotice ale glutaminei celulare (astrocitice) crescută la animalele de experiență. Tratamentul hiperamoniemiei cu sulfoximina metioninică, un inhibitor al sintezei glutaminei, privind sporirea în creier atât a glutaminei cât și a apei la nimalul de experiență. În condiții fiziologice normale transportul de glutamină participă la reglarea mișcării apei în creier. Studii post-mortem pe țesut cerebral de la pacienți decedați în insuficiența hepatică fulminantă au dezvăluit concentrații semnificativ crescute de glutamină, iar concentrațiile cerebrale de glutamină au fost mai mari de șase ori în insuficiența hepatic-ischemică experimentală (94) în paralel cu creșterea conținutului de apă în țesutul cerebral. Totuși conținutul de apă din creier nu a scăzut proporțional cu doza de sulfoximină metioninică, ceea ce indică faptul că edemul cerebral în hiperamoniemie s-ar putea să nu se datoreze doar sporirii acumulate de glutamină celulară. (95).

Prezent în concentații mari în circulația cerebrală amoniacul determină insuficiența energetică cerebrală. Adăugarea de concentrații milimolare de amoniac la prepararele mitocondriale cerebrale duce la inhibarea alfa-cetoglutarat dehidrăgenazei, o enzimă a ciclului acidului tricarboxilic, limitatoare a ratei. Insuficiența hepatică cronică duce la concentrații cerebrale sporite de lactați, iar concentrațiile de lactați sun crescute în corelație directă cu deterioarea funcției neurologice din encefalopatia porto-sistemică. Creșterea producției de lactați rezultă cel mai probabil ca urmare a scăderii cantității de piruvat în ciclul acidului tricarbocilic ca urmare a inhibării induse de amoniac a alfa-cetoglutarat dehidrogenazei.

Administrarea sărurilor de amoniu la animalul porto-șuntat duce în final la comă și conținut ATP-cerebral scăzut; acest deficit de energie este aparent doar în fazele finale (comă prelungită), pentru că la animalele cu encefalopatie hepatică severă nu manifestă reduceri semnificative ale conținutului ATP-ului cerebral înainte de faza de comă, ceea ce sugerează că în acest model animal, experimental de encefalopatie porto.-sistemică un deficit energetic cerebral este un fenomen de fază târzie. (91).

1.7.2. Manganul și relația cu encefalopatia hepatică

Manganul este secretat pe ruta hepato-biliară (102). Concentrațiile sanguine de mangan sunt crescute în cursul fazei active de hepatită acută ca și în ciroza posthepatitică și există o corelație semnificativă între manganul seric și activitatea enzimelor hepatice la pacienții cu hepatită sau ciroză hepatică. (102). Concentrațiile sanguine ale manganului sunt consecvent crescute la pacienții cirotici cu hiperintensități de semnal la rezonanța magnetică ponderat T1 pallidale. Hiperintensități de semnal MR pallidal au fost descrise la un pacient cu sindromul Alagille, o tulburare dominant autosomală caracterizată printr-o colestază intrahepatică, la care în faza finală s-a constatat sporirea nivelului seric de mangan. (101).

Imagistica cu rezonanță magnetică confirmă consecvent hiperintensitate de semnal în globus pallidus pe imaginile ponderate T1 la peste 80% dintre pacienții cirotici. (97). Rezonanța magnetică semnalează hiperintensitate în globus pallidus al unui pacient cirotic cu encefalopatie hepatică, chiar în stadiul subclinic, comparativ cu un subiect de control de aceeași vârstă. (98). Concentrațiile de mangan în globus pallidus obținute la autopsia a opt pacienți cirotici, care au murit în comă hepatică, au fost semnificativ crescute față de subiecții de control. Hiperintensitatea semnalului pallidal este corelată cu prezența simptomelor extrapiramidale, dar nu și cu gradul encefalopatiei postosistemice și nici cu scorurile testului neuropsihologic.

Evaluarea histopatologică a țesutului cerebral de la pacienții cirotici la care s-a manifestat hiperintensitate de semnal MRI ponderata T1 a fost dezvăluit astrocitoza Alzheimer de tipul II. (100). Un studiu angiografic a dezvăluit vase colaterale porto-sistemice mari cu originea din vena mezenterică superioară la toți cei nouă pacienți care au manifestat hipertensități de semnal MR pallidal, în timp ce doar 2 din 17 pacienți cu MRI (Imagistică cu Rezonanță Magnetică) normal au prezentat acest model angiografic, fapt ce este sugestiv, că hipertensitatea de semnal MR pallidal la pacienții cirotici este consecința șuntării porto-sistemice. (102). În studii recente s-a descoperit că expunerea la mangan micșorează absorbția de glutamat în astrocitele cultivate (99) și micșorează expresia enzimei glicolitice-gliceraldehida-3-fosfat-dehidrogenaza, ceea ce sugerează că acest metal ar putea influența atât sistemul glutamatergic cât și metabolismul energetic cerebral în encefalopatia hepatică. Capacitatea mare a astrocitelor de a acumula mangan sugerează că absorbția sa în aceste celule ar putea juca un rol în dezvoltarea astrocitelor din astrocitoza Alzheimer de tipul II, caracteristică neuropatologică a encefalopatiei hepatice.

1.7.2. bis. Inflamația

Dismetabolismul amoniacului nu poate explica de unul singur toate modificările neurologice care sunt observate la pacienții cu encefalopatie hepatică. Infecția este un factor precipitant binecunoscut pentru decompensarea bolii hepatice acută sau cronică. Unii autori (b.108) au studiat efectul hiperamoniemiei induse la un grup de pacienți cu ciroză care au fost internați cu sindrom de reacție inflamatorie sistemică (SIRS). Pacienților cu SIRS cărora li s-a administrat o soluție aminoacidă orală pentru inducerea hiperamoniemiei au obținut cele mai proaste rezultate la testul psihometral. Totuși, odată ce SIRS și infecția au fost tratate cu succes, iar nivelele markerilor inflamației: factorul necrozei tumorale (TNF), interleukina IL-1 și IL-6 au revenit la normal, rezultatele lor pentru țesutul psihometric nu s-a deteriorat după ce a fost indusă hiperamoniemia. (b.103, b.104). Rezultate similare au fost obținute atunci când o populație mare de pacienți cu ciroză a fost supusă testelor sanguine (pentru măsurarea nivelelor amoniacului și markerilor inflamatori) și evaluării psihometrice. Prezența și severitatea MHE (encefalopatia hepatică minimă) au fost independente atât de nivelele serice ale amoniacului cât și de severitatea bolii hepatice, totuși, nivelele serice ale markerilor inflamatori, cum ar fi proteina C-reactivă, numărul de leucocite, IL-6. au fost mult mai mari la pacienții cu MHE decât la pacienții fără MHE.

Sistemul imunitar periferic (b-106) comunică cu creierul ca răspuns la infecție și inflamație. Astrocitele și celulele microgliale eliberează citokine ca reacție la leziune sau inflamație (b-104). Observațiile din studiile pe animale arată că o creștere a nivelului sanguin a TNF, care apare în cursul inflamației, stimulează celulele gliale să secrete citokina IL-1 și IL-6; de asemenea TNF alterează bariera endotelială sânge-creier, iar IL-1 beta afectează integritatea părții gliale a barierei sânge-creier (b-104). Atât TNF cât și IL-6 cresc permeabilitatea fazei fluide a celulelor endoteliale cerebrale izolate în vivo, iar TNF sporește, de asemenea, difuzia amoniacului în astrocite (b-107).

1.7.3. Amoniacul, manganul și manifestarea stresului oxidativ în encefalopatia hepatică

Studiile pe culturi de celule și modelele animale indică un rol important pentru stresul oxidativ/nitrozativ în patogeneza toxicității cerebrale a amoniacului și manganului. Cu toate studiile în desfășurare, încă nu se știe dacă stresul oxidativ din creier este de asemeena caracteristic pentru encefalopatia hepatică la oameni. (103). Autorii acestui studiu au analizat post-mortem eșantionae de țesut cerebral cortical de la pacienți care au murit de ciroza hepatică cu sau fără encefalopatie, în comparație cu creierele de la pacienți fără afecțiuni hepatice.

Nivelele ridicate semnificativ ale proteinelor cu tirozina nitrat, proteinei 27 a șocului termic și 8-hidroxiguanozina ca marker al oxidării ARN-ului au fost descoperite în cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică, dar nu și la pacienții cu ciroză, dar fără encefalopatie hepatică. Activitatea glutamin sintetazei (GS) a fost semnificativ scăzută în timp ce expresia proteinei GS nu a fost afectată semnificativ. Expresia proteinică a cotransportorului glutamat-aspartat a crescut în encefalopatia hepatică, în timp ce expresia proteinică neuronală și indusă a sintazei oxidului de azot, superoxid dismutazei dependente de mangan și dependentă de cupru/zinc și transportorului 1 glial glutamat, nu a fost semnificativ sporite.

Aceste date indică faptul că encefalopatia hepatică la pacienții cu ciroză este asociată cu stresul oxidativ/nitrozatic, nitrarea tirozinei proteinice și oxidarea ARN-ului, ceea ce sugerează un rol pentru stresul oxidativ în patogeneza encefalopatiei hepatice la pacienții cu ciroză.

1.7.4. Rolul metabolismului energetic cerebral și a insuficienței neuro-transmisiei în encefalopatia hepatică timpurie

Metabolismul energetic cerebral compromis și insuficiența neuro-transmisiei reprezintă cauze ale encefalopatiei hepatice. Ratele metabolice cerebrale atât pentru oxigen cât și pentru glucoză sunt reduse în encefalopatia porto-sistemică. Aceste diminuări se potrivesc cu debutul simptomelor clinice și sunt direct proporționale cu deteriorarea statusului neurologic. Utilizarea scăzută a glucozei cerebrale în encefalopatia porto-sistemică timpurie, este cel mai probabil ca rezultat a scăderii cererii de energie, urmare a unei activități neuronale reduse în creier. Studiile făcute în acest sens au demonstrat că afecțiunea neurologică severă precede scăderea nivelelor cerebrale ale fosfaților înalt energetici, ceea ce sugerează că encefalopatia porto-sistemică este cel puțin până la fazele târzii, consecința activității neuronale reduse ca rezultat al insuficienței neurotransmisiei mai degrabă, decât a insuficienței energetice primare în creier. Acest fapt ar putea fi un factor contributar la dezvoltarea ulterioară a pierderii cunoștinței și debutul comei. Un efect similar asupra metaboliților energetici labili a fost observat la astrocitele cultivate expuse la amoniac în absența AMP-ului ciclic, dibutiril. (104). În comun cu alte tulburări metabolice și degenerative ale sistmului nervos central, encefalopatia hepatică este caracterizată de deficite în mai multe sisteme de neurotransmițători în creier.

Studii efectuate pe țesuturi cerebrale autopsiate de la pacienți cu hepatită acută sau cronică și care au murit în comă hepatică au demonstrat alterări semnificative ale mecanismelor glutamatergic și monoaminergic în creier. În plus, există noi dovezi indirecte care sugerează un rol pentru sistemul neurotransmițător opioid endogen în patogeneza encefalopatiei porto-sistemice. (105).

1.7.5. Glutamatul, importanța clinică în encefalopatia hepatică

Glutamatul este un metabolit al sistemului nervos central și principalul neurotrasmițător excitator din creier (105). Este eliberat din terminația nervilor presinaptici și este inactivat în cea mai mare măsură prin absorbția în astrocitele perineuronale unde este transformată rapid în glutamină prin intermediul acțiunii sintetazei glutaminei (GS). Glutamina formată este apoi fie reciclată în neuronul presinapric, fie difuzată în CSF. Concentrațiile glutaminei cerebrale și ale CSF sunt invariabil crescute în encefalopatia hepatică în concordanță cu expunerea creierului la concentrații sporite ale amoniacului purtat de sânge în insuficiența hepatică. (106). Expunerea astrocitelor la concentrații milimolare de amoniac, in vivo, rezultă în modificări importante funcționale și patologice, care includ expresia redusă a unor enzime cheie, cum ar fi sintetaza glutaminei și monoaminoxidaza (MAO-B) și capacitatea micșorată a transaspartatului glutamat astrocit GLT-1, un sistem esențial pentru inactivarea glutamatului în sinapsă. (107). Un grup de cercetători (85) au demonstrat o inhibare dependentă de doză în absorbția de mare afinitate a D-aspartatului pe feliile hipocampale de la animal, expuse la extracte sanguine provenite de la pacienți cu encefalopatie porto-sistemică. Această observație este de mare importanță pentru că potența relativă a inhibării absorbției D-aspartatului s-a corelat semnificativ cu concentrațiile amoniacului din extractele de sânge de la acești pacienți. Studii anterioare au demonstrat de asemenea alterări semnificative ale transportului glutamatului în creier în insuficiența hepatică. Eliberarea de glutamat dependentă de Ca2+ stimulată electric în feliile hipocampale superfuzate de la animalul șuntat porto-cav este semnificativ sporită, (106), iar eliberarea in vivo de glutamat din cortexul cerebral a fost sporită de asemenea, în urma șuntării porto-cave, mai cu seamă după folosirea microdializei cerebrale in vivo.(108). Aceste observații care au arătat o eliberare alterată neuronală precum și o absorbție astrocitară modificată, au dus la supoziția că encefalopatia porto-sistemică este o consecință a afectării traficului glutamatului neuron-astrocit. (107, 108, 109). Dată fiind capacitatea scăzută de absorbție a glutamatului de către astrocitele expuse la concentrații patofiziologice de amoniac, s-a sugerat că sporirea glutamatului extracelular în creier, în encefalopatia porto-sistemică, a fost consecința absorbției diminuate în astrocitele perineuronale mai degrabă, decât eliberarea crescută per se de glutamat din terminalul nervos presinaptic. O familie de transportori ai glutamatului non indentificată (G-LT-1) este exprimată de astrocite în întreg sistemul nervos. Mai recent, două studii noi au descris o pierdere a proteinei și expresiei genei GLT-1 în cortexul cerebral al modelului animal cu insuficiență hepatică fulminantă. Cercetările au identificat trei subtipuri majore ale receptorului glutamatului în sistemul nervos central care sunt definite în conformitate cu cuplarea lor la canalele ionice și afinitatea lor pentru agonistul receptorului glutamatului, N-metil-D-aspartat (NMDA):

-receptorul NMDA, un receptor inotrop cu înaltă afinitate pentru NMDA,

-receptorul non-NMDA /numit anterior subtipul AMPA (Kainat), de asemenea inotrop,

-receptorul glutamat metabotrop.

Deși în toate cazurile insuficiența hepatică a dus la pierderea de amplasamente ale receptorilor glutamatului (110), subclasa de receptori implicată a depins de tipul de insuficiență hepatică (acută sau cronică). Pe animale s-a descoperit că densitatea receptorilor non-NMDA a fost semnificativ redusă în cazul encefalopatiei porto-sistemice, fără a se putea localiza exact modificarea receptorilor non-NMDA în insuficiența hepatică acută sau cronică (110, 111).

1.7.6. Serotonina și neuro-transmisia în encefalopatia hepatică

O parte dintre simptomele neuropsihice din encefalopatia porto-sistemică, cum ar fi somnul alterat, au fost atribuite modificărilor neurotransmisiei serotoninei (5 HT).

Concentrațiile sporite ale metabolitului 5 HT, acidul 5-hidroxiindolacetic (5 HIAA), au fost consecvent raportate atât în țesutul cerebral cât și în CSF la pacienții cu encefalopatie severă, ca rezultat a insuficienței hepatice cronice.

Mai recent studii efectuate pe pacienți cirotici decedați prin comă hepatică au dezvăluit activități sporite ale enzimei care metabolizează 5 HT, monoaminoxidaza (MAO-A), ceea ce sugerează ca oxidarea sporită a 5 HT mai degrabă, decât ciclul sporit al 5 HT poate să fie explicația pentru descoperirea consecventă de concentrații cerebrale sporite de 5 HIAA în encefalopatia porto-sistemică. Aceste descoperiri ar sugera că boala hepatică cronică, duce la deficit sinaptic al 5 HT. (113). Studiile de microdializă cerebrală pe animalul cu insuficiență hepatică acută sau cronică nu au dezvăluit alterări semnificative ale 5 HT extracelular în creier.

Pe de altă parte coma precipitată de amoniac, la animalul cu anastomoză porto-cavă a dus la o creștere tranzitorie a 5 HT în spațiul extracelular cerebral. (113). Amplasamentele de legare 5 HT sunt sporite în hipocampusul pacienților cirotici care au murit în comă hepatică, ceea ce sugerează reglarea superioară a acestor amplasamente conform cu un deficit sinaptic 5 HT în această regiune a creierului.

Alterări ale legării receptorului 5HT1 au fost de asemenea raportate în creierul animalelor șuntate porto-cav. În plus, a fost observat un efect pozitiv al antagonistului receptorului 5 HT neselectiv, metilsergida, asupra activității motoare la animalul cu insuficiență hepatică acută indusă de tioacemidă (114), ceea ce sugerează că procesele serotoninergice ar putea juca un rol în unele dintre caracteristicele comportamentale ale encefalopatiei hepatice. Din punct de vedere clinic, tratamentul pacienților cu encefalopatie porto-sistemică subclinică cu un inhibitor al resorbției 5 HT, o acțiune ce va duce la concentrații sinaptice sporite de 5 HT, nu a înrăutățit simptomele neuropsihice, iar tratamentul cu antagonistul receptorului 5 HT postsinaptic, ketanserina, duce la precipitarea encefalopatiei la unii pacienți cirotici. Aceste rapoarte clinice sunt în concordanță cu aserțiunea că o hipoactivitate a sistemului 5 HT poate fi implicată în patogeneza anumitor manifestări clinice ale encefalopatiei porto-sistemice. (115).

1.7.7. Catecolaminele și encefalopatia hepatică. Aspecte fiziopatologice

Unele manifestări neuromusculare, incluzând simptomele extrapiramidale, respectiv tremorul și rigiditatea, fac parte din sindromul clinic al encefalopatiei porto-sistemice. Prin analogie cu manifestările extrapiramidale din boala Parkinson, care este o tulburare neurodegenerativă, caracterizată neurochimic de un deficit de dopamină în sistemul nigrostriatal, s-a sugerat că semnele și simptomele extrapiramidale din encefalopatia hepatică ar putea fi consecința unor tulburări de neurotransmisie a dopaminei. Studii efectuate în acest deceniu au arătat, pe țesutul cerebral provenit de la pacienți cirotici decedați în comă hepatică, concentrații cerebrale mari ale metabolitului dopaminei acidul homovanilic (HVA). Mai mult, concentrațiile HVA au fost sporite în creierele animalelor ca urmare a anastamozei porto-cave, ceea ce sugerează un ciclu sporit al dopaminei în creierul acestor animale. Dovezi în favoarea unor leziuni datorate dopaminei, în encefalopatia porto-sistemică, sunt furnizate de observațiile privind densitățile scăzute ale amplasamentelor de legare a dopaminei D2 post sinaptice în globus pallidus al pacienților cirotici care au decedat în comă hepatică. (118).

Sistemele noradrenergice centrale pot fi de asemenea implicate în patogeneza encefalopatiei hepatice, în special în insuficiența hepatică fulminantă. Hepatectomia, devascularizarea ficatului, precum și leziunile toxice ale ficatului induse de tioacetamidă la animale, rezultă toate în scăderea concentrațiilor cerebrale de norepinefrină (NA-nonadrenalină) (115, 120).

Hepatectomia duce la concentrații crescute de NA în perfuziile ventriculocisternale (126), iar studiile de microdializă cerebrală in vitro au dezvăluit creșteri semnificative ale concentrațiilor cerebrale extracelulare ale NA în fazele de precomă și comă ale encefalopatiei la animalul cu insuficiență hepatică acută fulminantă – experimental (122). Studii suplimentare au demonstrat o pierdere de amplasamente ale transportorului NA în structurile cerebrale corticale și subcorticale de la aceste animale. În faza de comă a encefalopatiei din insuficiența acută fulminantă a ficatului, experimental însoțit de o pierdere selectivă a subclaselor alfa-1 și beta-1 ale amplasamentelor receptorului noradrenergic (NA). Pe baza acestor observații s-a stipulat că alterările sistemului noradrenergic ar putea fi responsabile pentru multe dintre simptomele neuropsihice întâlnite în encefalopatia porto-sistmică. (122).

1.7.8. Neurotransmisia și acțiunile GABA în encefalopatia porto-sistemică

Acest concept sugerează că sporirea inhibării neurotransmisiei provocate de GABA joacă un rol în funcția motorie afectată și scăderea cunoștinței care sunt aspecte caracteristice ale encefalopatiei hepatice. O ipoteză majoră a considerat că GABA derivată din intestin, în virtutea eliminării sale diminuate de către ficat și a intrării sale în creier prin intermediul unei bariere defecte sânge-creier, poate contribui la inhibarea neuronală caracteristică encefalopatiei hepatice.

Multe dintre dovezile în favoarea acestei ipoteze au fost obținute folosind modelul animal cu insuficiență fulminantă hepatică cu hepatotoxicitate galactozaminică. Totuși studii pe encefalopatia porto-sistemică la om au produs rezultate negative, în sensul că nu a fost aparentă nici o alterare semnificativă a enzimelor sau receptorilor GABA sau legate de GABA, în creierul acestor pacienți (124). Pe de altă parte a atras atenția posibilitatea ca agoniștii componentei receptorului benzodiazepinici centrali al complexului receptorului A al GABA să poată potența efectele GABA acționând ca benzodiazepine endogene. Acest lucru a dus la izolarea și caracterizarea parțială de substanțe din extractele de creier de la oameni și animalele de experiență cu insuficiență hepatică, acută sau cronică. Pe baza acestor observații se așteaptă ca administrarea de antagoniști ai receptorului benzodiazepinici centrali să reducă tonusul GABA-ergic sporit, observat în encefalopatia hepatică, prin deplasarea unor asemenea agoniști endogeni din amplasamentele de legare ale receptorului. Într-un studiu clinic controlat ulterior pe antagonistul receptorului benzodiazepinic, flumazenil, la pacienții cu encefalopatie hepatică de gradul IV, s-a descoperit că un subgrup de pacienți au prezentat ameliorarea simptomelor neurologice. (124). Totuși, nu a existat o corelare clară, între răspunsul clinic la antagonistul benzodiazepinei și prezența liganzilor receptorului benzodiazepinei în sângele acestor pacienți (124), ceea ce sugerează că efectele benefice ale flumazenilului nu erau rezultatul inhibării acțiunii substanțelor purtate de sânge. (125).

În plus, efectul Flumazenilului a fost tranzitoriu și incomplet, ceea ce sugerează că alți factori ar putea de asemenea să contribuie la patogeneza encefalopatiei hepatice. Un asemenea factor ar putea să includă toxine, cum ar fi amoniacul și manganul, precum și modificări ale altor sisteme neurotransmițătoare. În prezent, mecanismul exact responsabil pentru efectul benefic al antagoniștilor benzodiazepinei la acest grup de pacienți cu encefalopatie porto-sistemică severă, rămâne neclar. (126).

1.7.9. Encefalopatia hepatică și sistemul opioid

Pacienții cirotici sunt hipersensibili la morfină, iar șuntarea provocată la animalul de experiență a dus la creșterea sensibilității la durere, un fenomen în care se știe că sistemul opioid este implicat. Sistemul opioid endogen al creierului ar putea de asemenea să fie implicat în medierea unora dintre efectele neuropsihice ale bolii cronice a ficatului asupra funcției sistemului nervos central. (127). Sub raport clinic, nivelele plasmatice sporite ale metionin-enkefalinei opioide endogene, au fost raportate la pacienții cu ciroză biliară primitivă (130), iar extractele cerebrale de la animalele de experiență cu insuficiență hepatică cronică conțineau concentrații modificate de beta-endorfină (127). Beta endorfina este o peptidă opioidă endogenă cu proprietăți analgezice puternice, sintetizată în principal în neuronii nucleului arcuat al hipotalamusului, cu axoni proiectați în părți variate ale creierului, incluzând nucleele implicate în modularea durerii și funcția memoriei, precum și regiunii implicate în medierea efectelor pozitive de consolidare ale mai multor substanțe de abuz, incluzând etanolul (128). Animalele șuntate porto-cav au consumat mai mult etanol într-un model specific cu liberă alegere, un comportament care a început în prima săptămână de la șuntare, iar studiile radiografice ale creierelor acestor animale au dezvăluit alterări selective regionale ale amplasamentelor receptorului opioid, nu și delta (127), ba chiar mai mult, s-a constatat că preferința pentru etanol, datorită șuntării porto-cave a fost semnificativ atenuată, ca urmare a tratamentului cu naloxonă, un antagonist opioid (129). Pe baza acestor observații s-a sugerat că preferința pentru etanol, ca urmare a șuntării porto-cave, a fost rezultatul modificărilor sistemului opioid endogen. Extraportarea acestor constatări la oameni, ar sugera posibilitatea, șocantă, că dezvoltarea unei boli hepatice semnificative la alcoolici ar putea să rezulte din exacerbarea băutului, ca rezultat al activării sistemului opioid cerebral.

1.7.10. O implicare posibilă și a altor sisteme în fiziopatologica encefalopatiei hepatice (Receptorul benzodiazepinei de tip periferic)

Receptorul benzodiazepinei de tip periferic este o proteină hetero-oligomerică, localizată pe membrana mitocondrială exterioară. La început s-a crezut că este limitată la țesuturile periferice, cum ar fi glandele suprarenale și rinichii, însă acum se știe cu siguranță că receptorul benzodiazepinei de tip periferic (PTBR) este localizat de asemenea în sistemul nervos central, dar spre deosebire de subtipul receptorului benzodiazepinei central, nu este cuplat alosteric la receptori GABA A; mai degrabă PTBR sunt concentrați pe membrana exterioară a astrocitelor. Densitatea receptorilor benzodiazepinei de tip periferic crește în țesutul cerebral, lucru constatat la autopsiile pacienților cirotici care au murit în comă hepatică și de asemenea în creierele și rinichii animalelor în urma anastomozei porto-cave, precum și în creierul și țesuturile periferice ale animalelor cu hiperamoniemie cronică.

Aceste constatări sugerează că PTBR sporiți în encefalopatia hepatică sunt consecința expunerii la concentrații sporite de amoniac. În concordanță cu această posibilitate s-a demonstrat ulterior că tratamentul asteocitelor cultivate cu concentrații milimolare de amoniac a dus la sporirea legării liganzilor PTBR. Mai recent, s-a arătat, de asemenea că expunerea astrocitelor cultivate la mangan a rezultat de asemenea în legarea sporită a liganzilor PTBR. Acestea sugerează că sporirea amplasamentelor de legare pentru liganzii PTBR raportate anterior în creier la encefalopatia porto-sistemică sunt consecința expunerii la amoniac și mangan. Acționarea receptorului benzodiazepinic de tipic periferic datorită amoniacului sau manganului duce la transport sporit de colesterol mitocondrial și la producerea de neurosteroizi, dintre care unii sunt modulatori alosterici poziti ai transmisiei GABA-ergici și ar putea, prin urmare, contribui la patogeneza encefalopatiei hepatice.

1.7.11. Contribuția oxidului nitric în fiziopatologia encefalopatiei hepatice

În urmă cu două decenii doi cercetători, Vallance și Moncada, au emis ipoteza conform căreia radicalul liber, oxidul nitric, este implicat în circulația hiperdinamică din ciroza hepatică.

Mai recent au apărut dovezi care susțin o implicare a oxidului nitric (NO) în encefalopatia hepatică. Creșterea generalizată a activității sintazei oxidului nitric (NOS), enzimă responsabilă pentru producția de NO, a fost demonstrată în creierul unor animale de experiență în urma anastomozei porto-cave. (132).

Sporirea MARN și a proteinei NOS neuronale au fost ulterior evidențiate în creierul animalelor de experiență în urma anastomozei porto-cave. (131). Creșterea nivelului de NO în creier poate fi responsabilă pentru stresul oxidativ, dar și pentru alterările perfuziei cerebrale raportate atât la om cât și la animalul de experiență cu insuficiență hepatică cronică. S-a arătat că hiperamoniemia duce la creșterea producției radicalilor liberi superoxid și la scăderea activității mai multor enzime antioxidante în creier. (135). Într-un raport preliminar s-a evidențiat că activitățile NOS erau de asemenea sporite atât la animalul cu hiperamoniemie, cât și la cel cu insuficiența hepatică acută produsă de tioacemidă. Mai mult, NO este capabil de sporirea eliberării de glutamat din fisura sinaptică, ceea ce ar putea avea un rol important pentru nivelele extracelulare sporite ale glutamatului, raportate în insuficiența hepatică fulminantă experimentală.

Disponibilitatea intracelulară și transportul L-argininei sunt de asemenea importante pentru reglarea activității NOS, iar studiile au arătat că absorbția de L-arginină de către preparatele sinaptosomale cerebrale de la animalele șuntate porto-cav a sporit în paralel cu sporirea activităților NOS. Absorbția de L-arginină a fost de asemenea stimulată în nervii sinaptosomali de la animalul cu encefalopatie hepatică indusă de tioacemidă (136) la animalele hiperamonemice și de expunerea acestor preparate la concentrații milimolare de amoniac in vitro. Expunerea astrocitelor cultivate la amoniac duce la creșterea absorbției de L-arginină și a expresiei NOS. Prepratele sinaptosomale de animal cu encefalopatie hepatică indusă de tioacemidă au prezentat, de asemenea, sporirea activităților enzimelor asociate cu șuntul arginină-glutamat, ceea ce sugerează că anginina ar putea acționa de asemenea ca un precursor pentru glutamat. (136). Se știe că L-anginina și glutamatul sunt scăzute în encefalopatia hepatică acută sau cronică.

Este posibil ca o creștere a absorbției de L-anginină în astrocite să indice existența unei căi similare în care glutamatul este reaprovizionat ca urmare a creșterilor induse de amoniac în producția de glutamină.

Capitolul II

STRESUL OXIDATIV ÎN HEPATITA CRONICĂ, CIROZA HEPATICĂ ȘI ENCEFALOPATIA HEPATICĂ.

(Studii experimentale)

Studiile pe culturi de celule și modelele animale joacă un rol important în dezvoltarea cunoștințelor despre stresul oxidativ în patogeneza toxicității cerebrale a amoniacului, manganului și a altor substanțe în hepatită cronică, ciroza hepatică și encefalopatia hepatică. Nivelele ridicate semnificativ ale proteinelor ca tirozin nitrat, a proteinei-27 a șocului termic și a 8-hidroxiguanozinei ca markeri ai oxidării ARN-ului, au fost descoperite în cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică, dar nu și la pacienții cu ciroză, dar fără encefalopatie hepatică. Activitatea glutamin sintetazei (GS) a fost semnificativ scăzută, în timp ce expresia proteinei GS nu a fost afectată semnificativ. Expresia proteinică a co-transportorului glutamat/aspartan, a fost crescută în encefalopatia hepatică, în timp ce expresia proteinei neuronale și induse a sintetazei oxidului de azot, superoxid dismutazei dependente de mangan și dependente de cupru/zinc și transportatorului-1 glial glutamat, nu au fost semnificativ crescute, ceea ce înseamnă că encefalopatia hepatică la pacienții cu ciroză este asociată cu stresul oxidativ/nitrozativ, nitrarea tirozinei proteinice și oxidarea ARN-ului, fapt ce sugerează un rol important pentru stresul oxidativ în patogeneza encefalopatiei hepatice la pacienții cu ciroză. (103).

Se susține tot mai mult că encefalopatia hepatică reflectă manifestările clinice ale edemului cerebral, de grad scăzut, fapt dovedit prin diverse metode imagistice (spectroscopia cu rezonanță magnetică) la pacienții cirotici. Amoniacul considerat toxicul cheie, în patogeneza encefalopatiei hepatice poate induce inflamația astrocitelor. Deoarece inflamația astrocitelor este de asemenea indusă și de citokinele inflamatorii, hiponatremie sau benzodiazepine, acțiunea factorilor precipitanți heterogeni s-ar putea însuma la nivelul inflamației astrocitelor. La animale, amoniacul, factorul alfa al necrozei tumorale, diazepamul și inflamația celulei hiposomatice, au produs o reacție de stres oxidativ prin intermediul activării nicotinamidei-adenin-dinucleotic-fosfat-oxidazei.

Aceste reacții au multiple efecte asupra funcției astrocitei, cum ar fi modularea transcripției genei, prin intermediul mobilizării Zn2+ și având drept consecință reglarea superioară a receptorului benzodiazepinei periferice.

Alte consecințe ale stresului oxidativ sunt: nitrarea tirozinei proteice (PTN) și oxidarea ARN.-ului prin intermediul formării de 8-hidroxiguanozinei.

Astrocitele localizate în apropierea barierei sânge-creier prezintă în special nivele foarte mari de PTN, cu consecințe potențiale pentru permeabilitatea barierei sânge-creier. Întrucât oxidarea ARN-ului în alte sisteme poate afecta eficiența și acuratețea translațională, asemenea efecte ar putea sta la baza multiplelor deranjamente neurogene ale sistemului neurotransmițător/receptor din encefalopatia hepatică și ale tulburărilor rețelelor oscilatorii din creierul pacienților cu encefalopatie hepatică, după cum au rezultat din studiile encefalografice-magnetice pe creier.

În studiul de față (103) au fost analizate eșantioane cerebrale umane, post-mortem, de la pacienți fără dovezi de boală anterioară a ficatului, comparativ cu țesut cerebral uman obținut post-mortem de la opt pacienți cu ciroză hepatică și encefalopatie hepatică. Pacienții cu encefalopatie hepatică au fost diagnosticați în clinica de gastroenterologie, hepatologie și boli infecțioase a Universității din Dusseldorf, Germania, precum și la Departamentul de Medicină Internă al Universității din Patras, Grecia. Au mai fost obținute și patru eșantioane cerebrale de la pacienți cu ciroză hepatică, dar fără encefalopatie hepatică. S-a efectuat analiza imunomarkerilor și a ARN-ului oxidat, după cum au fost descrise anterior (în text). Cuantificarea densitometrică s-a realizat prin chemiluminiscența petelor western și nonthwestern, colectată prin imagini digitale și analiză densitometrică. Nivelele expresiei proteinelor sunt date comparativ cu cea a gliceridaldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH). Activitatea GS (glutamin sintetaza) a fost determinată folosind reacția gamma-glutamil transferazei, așa cum s-a descris anterior, precum și imunoprecipitarea proteinelor nitrate.

Rezultate: markerii stresului oxidativ sunt sporiți în cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică. Expunerea la amoniac induce stres oxidativ și nitrozativ în culturile de astrocite. Intoxicația acută cu amoniac a animalelor de experiență, induce stres oxidativ în creier. Ca urmare a reacției de stres oxidativ apar PTN (nitrat tirozin proteina) și oxidarea ARN-ului, evidențiate prin sporirea formării de 8-hidroguanozina. PTN-ul proteinelor individuale cu masă moleculară în intervalul dintre 20 și 75 K Da a fost semnificativ sporit în eșantioanele cerebrale de la pacienții cu encefalopatie hepatică, comparativ cu subiecții de control. Mai mult, ARN-ul total extras din cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatia hepatică a prezentat o creștere de două ori a nivelelor ARN-ului oxidat comparativ cu subiecții de control.

Aceste date sugerează prezența stresului oxidativ în creierul pacienților cu ciroză și encefalopatie hepatică, iar pe de altă parte nivelele expresiei proteinice ale sintazei neuronale a oxidului de azot (nNOS) și a enzimelor antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza dependentă de cupru/zinc și cea dependentă de mangan, nu au fost semnificativ sporite în creierul pacienților cu encefalopatie hepatică atunci când s-au comparat cu grupul de control. Creșterea nivelului sintazei oxidului de azot inductibilă (INOS) a fost raportată la astrocitele tratate cu amoniac la animalul de experiență cu amostamoză porto-cavă; totuși, în toate eșantioanele cerebrale corticale de la subiecții de control proteina INOS nu a fost detectată. Nivelele expresiei proteinelor legate de stresul oxidativ din cortexul cerebral al subiecților de control și pacienților cu encefalopatie hepatică au fost analizate pentru nivelele expresiei nNOS, Hsp-27, superoxid dismutazei dependentă de cupru/zinc, superoxid dismutazei dependente de mangan (M4SOD) și INOS, prin analiza marcării Western, iar GAPDH a servit de control al încărcării.

GS astrocitică a fost identificată ca una dintre țintele PTN ca reacție la amoniac, iar studiile ulterioare au arătat că nitrarea rezidiilor tirozinei în buzunarul de adeziune adenozin trifosfat, similar cu mutațiile din această regiune a enzimei, sunt asociate cu o pierdere de activitate enzimatică a GS. Aceasta înseamnă că intoxicația cu amoniac micșorează activitatea GS din creier, fără să afecteze cantitatea de proteină GS, astfel că tot în cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică, activitatea GS, dar nu și nivelul proteinei GS a fost semnificativ micșorată. Acest fapt a fost însoțit de un PTN al GS semnificativ sporit. Expresia sintetazei glutaminei și a transportorului glutamat în cortexul cerebral al subiecților de control și al pacienților cu ciroză și encefalopatie hepatică, este dată comparativ cu expresia GAPDH. Activitatea GS a fost măsurată pe termen lung, experimental, pe animale cu șunt porto-cav și astfel s-a sugerat o reglare superioară cerebrală selectivă a transportatorilor glicali glutamați. Expresia proteinei GLAST a fost semnificativ superioară în cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică comparativ cu subiecții de control, în timp ce o ușoară creștere a expresiei GH-1 nu a atins semnificația.

Encefalopatia hepatică, dat nu și ciroza, declanșează stresul oxidativ în cortexul cerebral. Pentru a determina dacă stresul oxidativ sporit este o caracteristică a encefalopatiei hepatice sau a cirozei, au fost analizate eșantioane cerebrale de la patru pacienți cu ciroză fără encefalopatie hepatică, comparativ cu patru subiecți de control, fără ciroză. Nu a fost detectată nici o diferență semnificativă în ceea ce privește nitrarea tirozinică a proteinelor cerebrale, nivelele oxidării ARN-ului, expresia GRAST și Hsp 27 sau activtatea GS în eșantionele cerebrale de la pacienții cu ciroză fără encefopatie hepatică comparativ cu subiecții de control. Această constatare indică faptul că stresul oxidativ-nitrozativ este o caracteristică a encefalopatiei hepatice, dar nu și a cirozei în sine. Expresia markerilor stresului oxidativ transportatorilor glutamatujlui și GS în țesutul cerebral post-mortem a fost corelată cu datele de laborator in vivo, care au fost obținute în cursul perioadei de 24 de ore dinaintea decesului. Au fost obținute corelații puternic semnificative între concentrația bilirubinemiei și activitatea GS, concentrația sodiului seric și proporția oxidării ARN-ului, concentrația ureei serice și expresia GLAST. Nici amoniacul plasmatic, nici proteina reactivă C și nici numărul leucocitelor sanguine nu s-au corelat cu parametrii stresului oxidativ în cortexul cerebral post-mortem. (135-136).

Datele de laborator au evidențiat corelații semnificative statistic între bilirubina serică și activitatea GS în cortexul cerebral, concentrația serică a sodiului și proporția exidării ARN-ului în creier (imunoreactivitatea 8-hidroxiguanozinei, ureea serică și nivelul expresiei GLA-ST). (136).

Discuții

Cercetările celulare și experimentele pe animale efectuate în ultimele două decenii sugerează că inducerea stresului oxidativ și nitrozaminic în encefalopatia hepatatică este strâns legată de patogeneza toxicității cerebrale a amoniacului, datorită modificărilor clinice ale proteinelor și ARN-ului, precum și efectelor asupra microcirculației cerebrale, homeostaziei zincului și transcripției genei. Totuși, nu se știe dacă stresul oxidativ/nitroazativ și sechelele sale se găsesc de asemenea în creierul pacienților cu ciroză și encefalopatie hepatică. Mai multe tiruri de dovezi au indicat pentru prima oară un stres oxidativ/nitroazativ sporit în creierul pacienților cu encefalopatie hepatică. În primul rând, expresia Hsp-27 a fost de 4-5 ori mai mare în creierul pacienților cu encefalopatie Hsp-27, fapt cunoscut că oferă rezistență în fața stresului oxidativ și este frecvent folosit ca marker pentru expunerea țesutului la stresul oxidativ. În același context, creșterea nivelului de Hsp-27 apare în leziunile ischemice (reperfuzie), în regiunile perilezionale din scleroza multiplă. În mai multe eșantioane cerebrale de la pacienți cu encefalopatie hepatică s-au evidențiat nivele semnificativ crescute ale proteinelor nitrate tirozinic și ale ARN-ului oxidat, ambii parametrii fiind markeri surogat binecunoscuți pentru stresul oxidativ. Aceste modificări nu au fost identificate la pacienții cu ciroză hepatică, dar fără encefalopatie hepatică, ceea ce indică faptul că stresul oxidativ este o caracteristică a encefalopatiei hepatice, dar nu și a cirozei hepatice. (103).

Trebuie subliniat că sporirea nitrării tirozinei, a proteinei, și oxidarea ARN-ului în creierul pacienților cu encefalopatie hepatică a fost puternic discriminată între pacienții cu encefalopatie hepatică și subiecții de control. Cele mai multe creiere cu encefalopatie hepatică au prezentat oxidarea ARN-ului și nivele PTN care au fost peste cele mai mari valori găsite în grupul de control. (147). Experimente pe astrocitele de animal au sugerat că suprastimularea receptorilor acidului N-Metil-D aspartic joacă un rol important în declanșarea reacției la stresul oxidativ/nitroazativ. Inflamația astrocitelor și amoniacului declanșează eliberarea glutamatului astrocitic amplificând prin urmare activarea receptorului acidului N-metil-D-aspartic. Reabsorbția glutamatului este realizată de transportorii glutamatului astrocitic GLAST și GLT-1. O creștere semnificativă a GLAST a fost descoperită în creierul pacienților cu encefalopatie hepatică dar nu și la pacienții cu ciroză, dar fără encefalopatie hepatică. Creșterea nivelului GLAST a fost observată la animalele cu șunt porto-cav, pe termen lung, în vreme ce intoxicația cu amoniac de câteva zile, a determinat scăderea proteinei GLAST și ARN-ului mesager din astrocite. Acest fapt ar putea fi consecința oxidării ARN-ului mesager dată de GLAST.

Corelarea dintre datele de laborator in vitro și caracteristicile cerebrale post-mortem trebuie corelate cu atenție datorită eșantioanelor mici. A existat o corelație semnificativă între concentrația serică a sodiului și proporția oxidării ARN-ului cerebral, ceea ce indică faptul că hipo-osmolaritatea și oxidarea ARN-ului sunt conexe. În acest sens există dovezi conform cărora encefalopatia hepatică la pacienții cu ciroză reflectă manifestarea clinică a edemului cerebral de grad scăzut, care poate fi exacerbat ca reacție la hiponatremie. După alți cercetători se pare că hiponatremia (hipo-osmolaritatea) să nu fie cauza encefalopatiei, ci mai degrabă consecința sa, prin intermediul inflamației structurilor hipotalamice care favorizează secreția inadecvată a vasopresinei. Este de subliniat că nici amoniacul plasmatic și nici markerii infecției (leucocitele, proteina C-reactivă), nu au avut nici o relație cu modificarea cerebrală oxidativ-nitrozativă, fapt ce ar putea fi explicat de patogeneza multifactorială a edemului cerebral de grad scăzut și generarea în consecință a stresului oxidativ în encefalopatia hepatică, ceea ce dovedește că encefalopatia hepatică la pacienții cu ciroză hepatică nu este o simplă intoxicație cu amoniac sau o reacție pură la inflamația sistemică.

Studiul de mai sus (103) arată pentru prima oară implicarea stresului oxidativ/nitroazativ în patogeneza encefalopatiei hepatice la pacienții cu ciroză. Modificările oxidative ale proteinelor și ARN-ului cerebral sunt prezente în cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică, dar nu și al pacienților cu ciroză, dar fără encefalopatie hepatică.

Acest fapt ar putea arunca o lumină nouă asupra patogenezei encefalopatiei hepatice și oferă alte viziuni terapeutice. (103).

CAPITOLUL III

STRESUL OXIDATIV

Studii clinice

Stresul oxidativ joacă un rol important în patogeneza bolilor de ficat. Markerii stresului oxidativ măsurați în vena hepatică, venele periferice sau în țesutul hepatic, prin relația de fidelitate diagnostică pot facilita modalități de evaluare a funcției hepatice și a stadiului clinic în evoluție, cât și prognosticul bolii de ficat.

În studiul ce urmează (1) este investigată clinic această idee. Malondialdehida (MDA), un marker al stresului oxidativ, a fost măsurată în eșantioane din vena hepatică, vena periferică și urină de la 26 de pacienți care au fost supuși procedurilor hepatice transjugulare. La 19 pacienți supuși biopsiilor hepatice a fost măsurată MDA prin pătarea imunohistochimică de țesut hepatic cu parafină atașată.

Rezultate: nivelele MDA venoase periferice au prezentat o corelație semnificativă cu nivelele MDA venoase hepatice (r = 0,62, p = 0,02), dar nu s-au corelat cu conținutul MDA din țesutul hepatic (r = 0,22, p = 0,4). Nivelul MDA venoase hepatice nu s-a corelat cu conținutul MDA din țesutului hepatic (r = 0,01, p = 0,9).

Analiza subgrupului de pacienți fără hipertensiune portală a arătat o corelație pozitivă între nivelele MDA venoase hepatice și ale țesutului hepatic, dar acesta nu a fost semnificativ statistic (r = 0,45, p = 0,22). MDA urinară nu s-a corelat cu MDA din nici un alt tip de eșantioane.

Concluzia: stresul oxidativ măsurat în eșantioanele venoase periferice este slab reflectat de stresul oxidativ al țesutului hepatic. Eșantionul venos hepatic ar putea fi potrivit pentru evaluarea stresului oxidativ al țesutului hepatic la pacienții fără hipertensiune portală, dar este necesar un studiu pentru examinarea acestei posibilități.

Într-un alt studiu (4) au fost urmăriți parametrii legați de stresul oxidativ în ficatul pacienților cu ficat gras non-alcoolic. Stresul oxidativ este implicat în patogeneza bolii ficatului non-alcoolic (NAFLD). În studiul de față, au fost măsurați parametrii hepatici și plasmatici legați de stresul oxidativ, corelați cu constatările clinice și histologice la 31 de pacienți cu NAFLD, care prezentau un index al masei corporale crescut. Conținutul de carbonil al proteinei era crescut cu 40,3% la pacienții cu steatoză (n = 15) comparativ cu valorile de control (n = 12), în vreme ce conținutul de glutation, activitatea superoxid dismutazei (SOD) și capacitatea de reducere ferică a plasmei (FRAP) au fost reduse cu, respectiv 57%, 48% și 21% (p<0,05). Nu s-au observat modificări ale hidroxilării microsomale a p-nitrofenolului sau a conținutului total de citocrom P-450 (CYP sau CYP2E-1). Pacienții cu steatohepatită (n=16) au prezentat un conținut carbonil al proteinei comparabil cu cel al valorilor de control în timp ce conținutul de glutationă și activitatea superoxid dismutazei și ale catalazei erau scăzute cu respectiv 27%, 64% și 48% (p<0,05).

În plus valorile FRAP la pacienții cu steatohepatită erau reduse cu 33% și 15% (p < 0,05), atunci când se comparau cu valorile de control, respectiv la pacienții cu steatoză, în timp ce hidroxilarea p-nitrofenolului (52%) și conținutul CYP2E1 erau semnificativ crescute (p < 0,05) comparativ cu subiecții de control. S-a concluzionat că stresul oxidativ este dezvoltat în ficatul pacienților cu NAFLD cu steatoză și este exacerbat suplimentar la pacienții cu steatohepatită, care este asociată cu inducerea CYP2E1. Oxidarea substanțială a proteinei este urmată de proteoliza proteinelor modificate, ceea ce ar putea explica co-existența unei capacități antioxidante diminuate în ficatul pacienților cu steatohepatită.

Într-un alt studiu a fost evaluat stresul oxidativ așa cum este reflectat de statusul antioxidant și de nivelele produșilor peroxidării lipidice în plasmă și în eritrocite, la pacienții cu hepatită cronică virală C. Starea antioxidantă, markerii peroxidării lipidice și funcția ficatului au fost măsurate în eritrocitele și plasma a 29 de pacienți cu hepatită cronică virală C și la 26 de subiecți de control sănătoși. Nivelele MDA plasmatice și în eritrocite au fost statistic scăzute la pacienții cu hepatită cronică comparativ cu subiecții de control, în timp ce activitatea Cu-ZnSOD (superoxid dismutaza Cu-Zn) a fost statistic crescută la pacienții cu hepatită cronică virală C, comparativ cu subiecții de control. Nivelele MDA plasmatice s-au corelat pozitiv cu activitatea AST (aspartat-aminotransferaza), ALT (alanin-aminotransferaza), aldolazei și LDH-ului (lacto dehidrogenaza). Activitatea GPX (glutation peroxidaza) s-a corelat negativ cu nivelele MDA plasmatice și în eritrocit, iar activitatea Cu-ZnSOD s-a corelat negativ cu activitatea LDH, aldolazei și AST și cu nivelele MDA plasmatice. În concluzie, rezultatele statusului antioxidant la pacienții cu hepatită cronică virală C indică dezvoltarea stresului oxidativ și funcționarea eficientă a antioxidanților intracelulari.

În patologii asociate, stresul oxidativ sporește morbiditatea. Într-un studiu (149) privind infecția hepatică cronică la pacienții cu hemodializă au fost evaluați 73 pacienți, cu vârsta medie 49,3 ani, cu durata dializei între 48,8-81,7 luni. Indicatorii statusului stresului oxidativ plasmatic au fost monitorizați la începutul sesiunii de hemodializă stabilite clinic. Măsurătorile au fost efectuate în plasmă pentru superoxid dismutază (SOD), glutation peroxidaza (GPX) și malondialdehida (MDA) prin metode spectrofotometrice. Au fost înregistrate retrospectiv valorile de laborator lunare din anul anterior pentru alaninaminotransferaza (ALT), proteina C reactivă (CRP), albumină, lipide, hemocisteină, Lp (a), calciu, fosfor, hormon paratiroidian intact, creatinină, azot ureic sanguin (BUM), antedializa, precum și în constatătile clinice referitoare la indexul masei corporale, presiunea sanguină ante și post dializă. Au fost excluși pacienții cu inflamație cronică (valori CRP > 1 mg/dl) sau infecție hepatică virală de sub 12 luni de la debut. Durata dializei a fost similară între grupuri. Douăzeci și șase de pacienți aveau VHC și au prezentat nivele semnificativ mai mici ale malondialdehidei (MDA), albuminei, colesterolului total, trigliceridelor, creatininei antedializă și fosforului. Nivelele indicatorilor antioxidanți au fost de asemenea mai mari în grupul cu VHC, dar ele nu au fost semnificative statistic. În concluie, infecția cu VHC la pacienții cu dializă este asociată cu nivele micșorate ale încărcării oxidative plasmatice.

Hepatita cronică virală C poate progresa la ciroză, hepatocarcinoame sau encefalopatie hepatică. Terapia combinată cu interferon alfa-2b pegilat plus ribavirină a prescurtat unele rezultate încurajatoare.

Un colectiv de cercetători (49) au urmărit să evalueze stresul oxidativ și apărarea antioxidantă la pacienți cu hepatită cronică virală C înainte și după terapia antivirală.

Metode: 19 pacienți cu infecție cronică cu VHC și 28 de subiecți sănătoși de control au fost incluși în studiu. La ambele grupuri s-au măsurat nivelele serice ale alanin aminostransferazei (ALT) și aspartat aminotransferazei (AST), nivelele malondialdehidei (MDA) în eritrocite și activitățile în eritrocite ale superoxid dismutazei (SOD), Cu-Zn și glutation peroxidazei (GSH-Px).

După terapia combinată cu interferon alfa-2b pegilat plus ribavirină, timp de 48 de săptămâni, acești parametrii au fost măsurați din nou la grupul de pacienți sub tratament.

Rezultate: nivelele MDA serice erau semnificativ sporite la pacienții cu hepatită cronică virală C (n = 19) înainte de tratament comparativ cu subiecții sănătoși de control (n = 28): 9,28 ± 1,61 față de 4,2 ± 1,47 nmol/ml, p < 0,001. Concentrația MDA a scăzut semnificativ (p< 0,001) în eritrocite după tratament și de asemenea ALT și AST.

Enzimele antioxidante medii (superoxid dismutaza și glutation peroxidaza) au fost semnificativ mai scăzute în eritrocite la pacienții cu hepatită cronică virală C înainte de tratament comparativ cu grupul de control. Pacienții cu hepatită cronică virală C au prezentat după terapia cu interferon pegilat alfa-2b plus ribavirină valori ale SOD și GSH-Px semnificativ mai mari decât nivelele dinainte de tratament (ambele p < 0,001).

Concluzia a fost că pacienții cu infecție cronică virală C sub influența stresului oxidativ au asociat nivele mai scăzute ale enzimelor antioxidante. Aceste perturbări se inversează la nivelul subiecților de control sănătoși, după tratamentul antiviral. Deși interferonul și ribavirina nu sunt antioxidanți, capacitatea lor antivirală ar putea reduce povara virală și inflamația și astfel prin intermediul acestui mecanism să reducă stresul oxidativ din hepatita cronică virală C.

Metodele de laborator utilizate în cele mai multe din studiile consultate de noi în evaluarea factorilor stresului oxidativ dar și a enzimelor antioxidante de apărare ale organismului:

Eșantionaele sanguine au fost prelevate din vena antecubitală după post peste noapte, prin venopuncție, în tuburi care conțineau EDTA. Acestea au fost centrifugate timp de 10 minute la 4 000 G și 4 grade C. După separarea plasmei, sedimentul gălbui a fost îndepărtat, iar celulele aglomerate, au fost spălate de trei ori, cu două volume de soluție salină izotonică. Apoi un volum cunoscut de eritrocite a fost lizat cu apă distilată, rece (1:4), depozitat într-un frigider la 40C timp de 15 minute, iar rezidurile celulei au fost îndepărtate prin centrifugare la 2000 G la 4 grade C timp de 10 minute. Lizatele eritrocitelor au fost depozitate la – 700C până la testare.

Activitățile CuZn-SOD și GSH-Px au fost măsurate în lizatele eritrocitelr cu un spectrofotometru cu înregistrare UV-VIS (UV-2100 S de a Shimadza Co. din Japonia). Activitatea în eritrocite a CuZn-SOD a fost măsurată astfel: lizatele eritrocitelor au fost diluate de 400 de ori cu 10 mM de tarupen fosfat cu pH de 7,00, 25 microliții de alicote care au fost mixat cu 850 nmol/l de clorură 2+ (4 iodofenil) – 3 – (4 nitrofenol) – 5 – feniltetrazolin (INT) într-o soluție tampon conținând 50 nmol/l CAP (3-(ciclohexilamină) – 1 acid propanesulfonic) și 0,094 nmol/l EDTA (pH 10,2). Mixturii i s-a adăugat 125 microilitrii de xantin oxidază /80 U/l) iar creșterea absorbantă a fost urmărită la 505 nm timp de 3 minute. Activitatea CuZn-SOD este exprimată în U/ml.

Activitatea în eritrocite a GSH-Px a fost măsurată așa cum s-a descris de Aydin et. al. Pe scurt, a fost preparată o mixtură de reacție conținând 1 mmol/l Na2EDTA, 2 mmol/l glutationă redusă, 0,2 mmol/lNADPH, 4 mmol/l azida de sodiu și 1 000 U glutation reductoză în 50 mmol/l TRIS (pH 7,6). 20 microlitrii de lizate de eritrocit, 980 de microlitri de mixtură de reacție au fost amestecate și incubate timp de 5 minute la 370C. Reacția a fost inițiată prin adăugarea de 8,8 mmol/l de peroxid de hidrogen, iar scăderea absorbantă a fost înregistrată la 340 nm timp de 3 minute. Activitatea GSH-Px este exprimată în U/ml.

Peroxidaza lipidă a fost estimată prin măsurarea substanțelor reactive cu acidul tiobarbituric (TBARS) în lizatele eritrocitare prin metoda descrisă de Aydin et. al. După reacția MDA cu acidul tiobarbituric, produsul reacției a fost urmărit spectrofotometric la 532 nm folosind tetrametoxipropanul ca standard. Rezultatele sunt exprimate în nmol/ml.

Rezultate: rezultatele obținute arată că MDA serică este semnificativ sporită în grupul selectat de pacienți (n = 19) cu hepatită cronică virală C înainte de tratamentul antiviral, atunci când se compară cu subiecții sănătoși (n =28) (9,28 ± 1,61 față de 4,2 ± 1,47 nmol/ml, p < 0,001). Aceste rezultate arată că pacienții cu hepatită cronică virală C sunt sub influența stresului oxidativ crescut.

După 48 de săptămâni de tratament toți pacienții cu hepatită cronică virală C au eliminat ARN-ul VHC și și-au normalizat transaminazele serice. Concentrația MDA a scăzut semnificativ (p < 0,001) după tratamentul antiviral și la fel și activitatea ALT și AST în eritrocitele acestor pacienți. Tratamentul a dus de asemenea la scăderea concomitentă a conținutului MDA în eritrocite.

Am comparat nivelul mediu al superoxid dismutazei în eritrocitele pacienților cu hepatită cronică virală C înaintea tratamentului (2134,84 ± 71,61 U/ml) cu media activității SOD în grupul de control ( 285,78 ± 96,46 U/ml). Am demonstrat că activitatea SOD medie la pacienții cu hepatită cronică virală C este statistic semnificativ mai mică (p < 0,05) decât la grupul de control.

Activitatea medie a glutation peroxidazei în eritrocitele pacienților cu hepatită cronică virală C înainte de tratament a fost de 6,52 ± 1,86 U/ml. Valoarea a fost statistic semnificativ mai scăzută (p < 0,05) decît activitatea medie a GSH-Px în eritrocitele grupului de control (1,01 v 1,79 U/ml).

Discuții

Prima problemă ce se desprinde din acest studiu este că sunt dovezi clare care atestă o bună corelație între tipul și severitatea bolii și nivelele enzimelor antioxidante din sânge. (151). Deși s-a demonstrat rolul mecanismelor imunologice în patogeneza hepatitei virele B și C, cercetătorii s-au concentrat asupra influenței stresului oxidativ în patologia acestora. Stresul oxidativ se dezvoltă atunci când apar tulburări între formele de oxigen reactiv produse în exces și factorii care previn efectul lor nociv.

Apărarea antioxidantă enzimatică include: SOD, CAT (catalazele) și GSH-Px. Superoxid dismutaza protejează celula de efectul toxic al radicalilor superoxizi prin catalizarea racției de dismutație a radicalilor (26). Glutation peroxidaza descompune peroxidul de hidrogen care convertește peroxizii lipizi în molecule inofensive protejând celulele de consecințele peroxidării lipide. GSH-Px îndepărtează H2O2 prin oxidarea glutationei reduse. Glutationa oxidată (GSSG) este produsă și este redusă din nou de glutation reductaza și de NADPH (produs în ciclul pentazei (56). Stresul oxidativ a fost detectat în aproape toate condițiile clinice și experimentale ale bolilor cronice de ficat. (152). Între multele studii despre stresul oxidativ în hepatita cronică virală, De Maria et. al. (30), au arătat că MDA, un produs al peroxidării acidului gras polinesaturat, a fost sporit în ficat și sânge. În alt studiu (57) s-a demonstrat, de asemenea, imunohistochimic aducți ai proteinei MDA în țesutul hepatic infectat. Boya et. al. (26) a arătat că celulele mononucleare sanguine periferice de la pacienții cu hepatită cronică virală au concentrații de MDA sporite și activitate SOD crescută. Malondialdehida este reflexia peroxidării lipide, iar superoxid dismutaza este o importantă enzimă a apărării antioxidările care convertește superoxidul în peroxid de hidrogen. Activitatea SOD sporită pare să fie un răspuns adaptativ la generarea crescută de ioni superoxizi (26). Într-un studiu recent (58) au fost prezentate valori mari ale malondialdehidei serice la pacienții cu hepatită cronică virală C înaintea tratamentului antiviral față la subiecții sănătoși, aspect ce corespunde cu rezultatele din alte studii. Concluzia generală a studiului arată că nivelele scăzute pre-tratament ale antioxidanților și nivelul crescut al malondialdehidei ar putea fi un marker probabil al stresului oxidativ. Modificarea reversibilă a acestor nivele odată cu completarea tratamentului ar putea indica o corelație între stresul oxidativ și patogeneza infecțios-virală, iar suplimentarea antioxidantă ar putea fi adăugată la acești pacienți în cursul supravegherii lor clinice. (49).

Este important de observat și de evaluat dacă valorile MDA serice sunt corelate cu gravitatea clinică a hepatitei cronice și trecerea spre ciroză, care este momentul critic valoric al acesteia, precum și a enzimelor antioxidante.

Un studiu deosebit de concludent în acest sens a fost realizat de un grup de cercetători (153), care au urmărit funcția discriminantă multivariabilă bazată pe markerii biochimici din sânge, care ar putea prezice evoluția cirotică a hepatitei cronice. Autorii au studiat două șiruri de hepatită cronică (54 pacienți) și ciroză (49 pacienți) pentru a identifica o gamă de markeri biochimici care discriminează între cele două boli. A fost urmărită concentrația serică a șase markeri biochimici (fibronectina, protrombina, presudocolinesteraza, alaninaminotransferaza, mangan superoxid dismutaza și N-acetil-beta glucozaminidaza).

Aceleași examinări au fost urmărite și la al doilea șir de pacienți. Rezultatele au arătat că analiza discriminantă multivariabilă a clasificat corect 93,7% dintre pacienți (94,3% din pacienții cu hepatită cronică și 92,9% dintre pacienții cu ciroză) în primul șir, și 85% din pacienți (89,5% dintre pacienții cu hepatită cronică și 81% dintre pacienții cu ciroză) în al doilea șir. Deci analiza discriminantă a rezultatelor a șase markeri biochimici furnizează o valoare înalt predictivă pentru diferențierea între ciroza ficatului și hepatita cronică. Acești markeri biochimici alăturați într-o investigație furnizează informații care pot evalua evoluția naturală a hepatitei cronice. De la starea anatomo-clinică a hepatitei cronice se poate evolua spre ciroză sau hepatocarciom, encefalopatie hepatică sau deces. Diferiți factori etiologici au fost asociați cu hepatita cronică: virusul hepatitei B și C, alcoolul și mai rar unele tulburări metabolice, cum ar fi deficiențele de alfa-1 antitripsina sau ceruloplasmina și fibroza chistică (154).

Din rândul acestor factori cauzatori, hepatita cronică datorită virusului hepatitei C este entitatea care evoluează cel mai des spre ciroza ficatului. (155). Evoluția cirotică a ficatului este asociată cu fibrogeneza ficatului. Recunoașterea la timp a instalării fibrogenezei ficatului poate îmbunătăți rezultatul tratamentului și evoluția. (156).

Procedura de referință pentru identificarea timpurie a evoluției cirotice a hepatitei cronice este histopatologia care încorporează scoruri semnificative (157, 158, 159, 160).

Fiind o metodă invazivă și mai puțin la îndemâna clinicianului s-au evaluat mai mult tehnicile imagistice (158) și markerii biochimici ai fibrozei ficatului, cum ar fi și fibronectina sau N-acetil-beta-glucozaminidaza (beta NAG). Saminina și Propeptida Procolagen 3 (P III P) au fost propuse ca indicatori ai modificării de la hepatita cronică la ciroză. (156). Totuși concentrațiile P III P și lamininei sunt crescute în plasma pacienților alcoolici independent de stadiul bolii ficatului (162); în consecință markerii biochimici de mai sus disting limpede între hepatita cronică și ciroză. Autorii studiului de față au folosit analiza discriminantă multivariabilă malondialdehida (MDA) pentru a selecta analiți biochimici care contribuie la diferențierea din ciroza ficatului și hepatocarcinom (163), dintre hepatocarcinom și neoplazia ficatului (164) și dintre ascitele neoplazice și non-neoplazice (165). Pentru a identifica o gamă de markeri biochimici care diferențiază între hepatita cronică și ciroză, autorii au analizat markerii biochimici legați de funcția ficatului într-un șir temporar de pacienți cu hepatică cronică și pacienți cu ciroză, clasificați independent pe bază histologică.

Folosind MDA au selectat o funcție pe baza concentrațiilor a șase markeri biochimici care au diferențiat eficient între cele două grupuri de pacienți.

Materialul și metoda studiului: pacienții cu confirmarea clinică și de laborator pentru hepatita cronică sau ciroza ficatului clasă Child A au fost supuși biopsiei percutane a ficatului. Evaluarea histologică a fost efectuată de o comisie de patologi, care din primul șir termporal a constat că 35 de pacienți prezentau leziuni de hepatită activă cronică, etipizată în conformitate cu principiile Desmet (166), iar 28 erau afectați de ciroză hepatică. Clasificați în Child A, n =10 Child B, n = 8 și Child C, n = 10. În cel de-al doilea șir s-a constat că 19 pacienți erau afectați de hepatita activă cronică, iar 21 de pacienți erau cu ciroză hepatică. (Child A, n =10, Child B, n = 7 și Child C, n = 4). În toate cazurile etiologia hepatitei respectiv a cirozei hepatice a fost virală.

Metode de analiză: sângele obținut prin venopuncția a fost procesat pentru analiza fibronectinei, beta NAQG, P III P (RIA), glutation peroxidazei, a mangan superoxid dismutazei, feritinei, alfa-fetoproteina, alipoproteinei (Apo A1 și Apo B), activitatea protrombinei. Albumina, pseudocolinesteraza, fosfataza alcalină, gamma-glutamintransferaza, colesterolul, LDL-colesterolul și HDL-colesterolul, trigliceridele, bilirubina totală și directă, aspartat și alaninaminotransferaza, plachetele sanguine.

Primul șir de pacienți a fost folosit pentru selectarea combinației liniare de variabile, care a diferențiat cel mai bine hepatita cronică de ciroză. Rezultate: testul U Mam Whitney a arătat că distribuția a 18 din 24 markeri analizați a diferit semnificativ între pacienții cu hepatita cronică și cei cu ciroză hepatică la primul șir de pacienți. Totuși nici unul dintre acești analiți nu a diferențiat eficient între două populații datorată valorilor care s-au suprapus în mare măsură. Prin urmare, am folosit MALONDIALDEHIDA. Valorile medii ale markerilor biochimici serici au diferit semnificativ între hepatita cronică și ciroză în primul șir de pacienți. Următoarele variabile au deviat de la distribuția gaussiană: beta-NAG, PIIIP, MnSOD, feritina, Apo B, activitatea protrombinei, albumina, fosfataza alcalină, gamaglutamiltransferaza, colesterolul LDL și HDL, trigliceridele, bilirubina totală și directă, AST, ALT și alfa-fetoproteina. Transformarea logaritmică naturală a refăcut distribuția gaussiană. MDA a selectat următoarea ecuație:

scorul discriminant = PCHE (microkat/l)x 0,00011 + fibronecxtina (mg/l) x 0,039 + activitatea protrombinei (%) x 3,5 (în logaritmi naturali)

La pragul de 0,22 MDA a clasificat corect 59 din 63 (93,7%) din pacienți, adică 94,3% dintre pacienții cu hepatită cronică și 92,9% dintre cei cu ciroză. Metoda rabatării a confirmat procentajul de cazuri clasificat corect.

S-a aplicat funcția MDA celui de-al doilea șir de pacienți și s-a constatat că 85% dintre pacienți (adică 89,5% dintre pacienții cu hepatită cronică și 81% dintre cei cu ciroză) au fost clasificați corect.

Discuție: aceste date arată că biochimia clinică poate fi utilă pentru evaluarea progresiei fibrozei ficatului și mai specific pentru diagnosticul diferențiat dintre hepatită cronică și ciroza ficatului, două entități clinice care se suprapun frecvent atunci când sunt evoluate cu proceduri clinice sau instrumentale.

Analiții selectați prin analiza discriminantă multivariabilă MDA – au prezentat o eficiență satisfăcătoare. Ei nu sunt legați, ceea ce înseamnă că nu există redundanță și că ei explică diferite anomalii biochimice asociate cu cele două condiții clinice. Activitatea protrombinei și PCHE sunt markeri cunoscuți ai activității sintetice a proteinei ficatului care este afectată gradual în cursul evoluției cirotice a hepatitei cronice.

Fibrorectina și beta-NAG sunt markerii bine cunoscuți ai fibrozei. Sporirea activității beta-NAG serice la pacienții cirotici poate fi atribuită creșterii acumulării de colagen. Din contră, reducerea fibronectinei circulatorii la pacienții cirotici este legată de sinteza afectată a proteinei care apare în ficatul cirotic.

Mn-SOD (mangan-supersoxid dismutaza) este localizată în principal în matricea mitocondrială, o zonă de producerea a speciilor de oxigen reactiv și este implicată în calea antioxidantă a celulelor umane. Concentrațiile mARN-ului, MSOD în celulele mononucleare sanguine periferice și concentrațiile serice ale MnSOD sunt mai mari la pacienții cu infecții virale ale hepatitei C decât la subiecții de control sănătoși, iar stresul oxidativ implicat contribuie la aceste reacții influențând patogeneza hepatitei cronice.

Gradul de fibroză hepatică este de obicei evaluat prin biopsia ficatului, totuși aceasta este corelată cu un risc mare de morbiditate în special la pacienții cu tulburări de coagulare, cum sunt cele induse de bolile ficatului, în plus acuratețea biopsiei ficatului este pusă sub semnul întrebării datorată variabilității inter-observator.

Analiza markerilor biochimici serici este o metodă rapidă, de rutină, ușor reproductibilă, non-invazivă și care are o predictibilitate mare în progresiei procesului fibrotic și a evoluției nefavorabile.

În concluzie, concentrațiile sanguine ale fibronectinei și activității protrombinei, mangan-superoxid dismutazei, beta-NAG (N-acetil-beta-glucozaminidaza), alaninaminotransferaza (ALT) și PCHC, sunt ușor și rapid de analizat.

Astfel că acești șase markeri biochimici în metoda analitică MDA oferă un scor care calculat pentru fiecare pacient în parte determină diferența dintre hepatita cronică în evoluție și ciroza hepatică, stabilind gradul de predictibilitate de la hepatită la ciroză.

Stresul oxidativ acționează atât în cursul metabolismului normal cât și în cel al proceselor inflamatorii. Radicalii liberi celulari au ca țintă substraturi organice cheie, cum ar fi lipidele, ADN-ul și proteinele. Agenții protectori și mecanismele de apărare acționează pentru a minimiza deteriorarea oxidativă. Sistemul antioxidant constă din molecue mici, cum ar fi vitaminele C, E, glutationa, carotenul și coenzima Q, precum și antioxidanții enzimatici care detoxifică radicalii sau repară moleculele oxidate.

Superoxid dismutaza și catalazele sunt două din enzimele de cea mai mare imoprtanță în activitatea antioxidantă clululară prin detoxifierea radicalilor O2. Superoxid dismutazele care conțin metale, sunt localizate în mitocondrii, principala zonă celulară de producție a O2. Sulful din catena laterală a metioninei este în mod excepțional susceptibil oxidării, ceea ce ar putea duce la inactivarea și degradarea proteinei afectate. Metionin sulfoxid reductazele A și B reduc cei doi steroizomeri ai metioninei sulfoxidului (Met O), Met SO și respectiv MetRO într-o manieră dependentă de tioredoxină, prin urmare ele repară proteinele oxidate.

În mod practic cercetarea stresului oxidativ se poate efectua cu ajutorul unor enzime ca MSRA și MSRB obținute de la Jena Bioscience, care constituie modalități precise și ușor de manevrat.

La finele prezentării diferitelor cazuri clinice și modelelor experimentale de evaluare a stresului oxidativ în hepatită virală cronică, ciroza hepatică și encefalopatia hepatică, precum și de evaluare a predictibilității unor procese fiziopatologice legate de diferite complicații survenite în evoluția hepatitei cronice virale, mai adăugăm un studiu intersant care urmărește expresia moleculelor legate de stresul oxidativ în leucocitele circulante și urina pacienților cu hepatită virală cronică, a căror valoare cantitativă se corelează cu gradul și severitatea procesului hepatic. Într-un studiu (21) s-a urmărit evaluarea stresului oxidativ în patogeneza hepatitei cronice virale C. Au fost examinate: 4 hidroxi-2-nonenal (4 HNE), 4-hidroxi-2-hexenal (4 HNE), catalaza, superoxid dismutaza-1 (SOD-1), glutation peroxidaza-1, tioperopina (TRX) în leucocite și 8-hidroxi-2-deoxiguanozina (8-OhdG) urinară la 164 persoane, dintre care 130 pacienți cu hepatita cronică virală C și 34 de indivizi de control normali prin analiza pătării western și respectiv testul imunoabsorbant enzimatic. Expresia hepatică a acestor proteine a fost examinată imunohistochimic la 12 pacienți cu hepatită cronică virală comparativ cu trei persoane fără afectarea ficatului. Rezultatele au arătat că 4-HNE/beta-actina în hepatita virală cronică au fost semnificativ mai mari decât cele de la indivizii de control (p < 0,01) și erau semnificativ corelate cu aspartataminotransferaza (AST) și alaninaminotransferaza (ALT) (p < 0,01), în ambele cazuri.

Expresia hepatica a 4 HNE și 4 HNE, catalazei, SOD-1 și TRX în hepatita virală cronică a fost mai mare decât în cazurile fără deteriorarea ficatului. Excreția urinară a 8 OhdG nu s-a schimbat în hepatita virală cronică. În concluzie: rezultatele studiului (21) sugerează că expresia moleculelor legate de stresul oxidativ în leucocite este crescută în relație cu nivelele aminotransferazelor serice.

Conținutul întregului studiu din partea întâi a tezei tratează conceptul de stres oxidativ în patologia infecției virale hepatice B și C, influența stresului oxidativ în dezvoltarea evoluției de la hepatita cronică la ciroza hepatică precum și influența stresului oxidativ în fiziopatologia encefalopatiei hepatice. S-au căutat dovezi care indică predictibilitatea evolutivă sau prognostică prin expresia analizelor biochimice ale malondialdehide (MDA) și 4-hidroxinonenal (HNE), doi metaboliți secundari distrugerii oxidative a acizilor grași polinesaturați din membranele celulare deosebit de toxici, precum și diversele cazuri de antioxidante protectoare celulare, ca și glutationa, antioxidant natural și diverse enzime antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT) și glutation peroxidaza (GSH-Px).

S-au identificat elemente și valori ale diferitelor enzime, în procesul stresului oxidativ, care valorifică ideea că ele reprezintă expresia avansării stadiale în evoluția hepatitei virale cronice la ciroză, precum și de predicție a encefalopatiei hepatice și gradul de gravitate al acesteia pe de o parte, iar pe de altă parte de evaluare a posibilei virări de la hepatita cronică la hepatocarcinomul. S-au putut identifica valorile care diferențiază tipul stresului oxidativ în hepatita B față de hepatita C cronică și de cea metabolică etanolică, precum și evaluarea complicațiilor comune tuturor formelor de hepatită cronică menționate indiferent de etiologie ( ascita, hemoragia gastro-esofagiană, carcinomul hepatocelular, encefalopatia hepatică).

Prezența modelelor experimentale pe animale, pe țesuturi cerebrale sau hepatice după autopsiile pacienților cu hepatită cronică, ciroza hepatică sau țesut cerebral de la encefalopatia hepatică în studii de mare probabilitate științifică, cât și în studiile clinice, au avut intenția de a exprima cât mai complet viziunea despre subiectul studiului nostru.

Partea a II-a

CAPITOLUL I

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ

1.0.0. Scurtă rememorare asupra subiectului

Encefalopatia hepatică este o tulburare neuropsihică care apare în insuficiența hepatică acută sau cronică. Deși mecanismele fiziopatologice nu sunt pe deplin lămurite, se pare că sunt implicate mai degrabă deficite ale neurotransmițătorilor decât deficite primare ale metabolismului energetic cerebral. Nu se știe precis dacă stresul oxidativ din creier este de asemenea caracteristic pentru encefalopatia hepatică la oameni (103). Consecințele reacției la stresul oxidativ/nitrozativ induse de amoniac sunt modificările proteinei prin intermediul nitrării rezidurilor tirozinei și oxidării ARN-ului astrocitic și neuronal.

Mai multe ipoteze privind patogeneza encefalopatiei au apărut în ultimii ani și un număr de factori sunt raportați ca afectând direct sau indirect funcția cerebrală în această condiție. Între factorii neurotoxici implicați în apariția și dezvoltarea encefalopatiei hepatice se menționează cei alăturați:

Amoniacul și glutamina sunt neurotoxinele cele mai des implicate în acest sindrom, altele includ mediatorii inflamației, anumiți aminoacizi și manganul (165).

amoniacul este principalul produs secundar al metabolismului bacterian al proteineilor și compușilor azotului în colon și al metabolismului glutaminei în eritrocite (168). În mod normal, amoniacul absorbit în intestin este livrat via vena porta, în ficat, este metabolizat în cea mai mare parte și transformat în uree, iar o mică parte este metabolizat în mușchi, creier și rinichi. În ciroză și alte condiții asociate cu encefalopatia hepatică, o cantitate mai mică de amoniac este metabolizată în uree, iar o cantitate mai mare ajunge în astrocitele creierului. Creierul nu are ciclu ureic, dar metabolizează amoniacul în glutamină via sintaza glutaminei, o enzimă unică astrocitelor. Amoniacul determină edemul astrocitelor și edem cerebral via generarea de glutamină, o substanță activă osmotic.

glutamina: cauzează edem și stres oxidativ. Ea atrage apa în astrocite și induce modificări de astrocitoză de tip Alzheimer II caracterizată prin edem, creșterea în volum a nucleului, decolorarea și deplasarea cromatinei spre periferia celulei. Inhibarea sintazei glutaminei previne edemul astrocitar la animalele de experiență. Glutamina sporește activarea mai multor receptori incluzând N-metil-D-aspartatul (NMDA), receptorul acidului gama-aminobutiric (GABA) și receptorii benzodiazepinei de tip periferic de pe membrana mitocondrială (171). Apare o stare de stres oxidativ, iar aceasta afectează oxidarea proteinei și ARN-ului, sinteza neurotransmițătorului și neurotransmisia la joncțiunea neuronală. Azotul reactiv și radicații oxizi induc eliberarea de mediatori inflamatori, cum ar fi interleukinele 1 și 6, factorul necrozei tumorale (TNF-alfa), interferonul și neurosteroizii, care contribuie la apariția edemului și a neurotoxicității. (172). Neurosteroizii sunt produși secundari ai metabolismului mitocondrial și hormonilor steroizi în astrocite.

Manganul sporește sinteza neurosteroidă prin activarea proteinelor translocatar de pe membrana astrocitelor. A fost recunoscută pentru prima oară ca factor în encefalopatia hepatică atunci când la pacienții cirotici cu simptome extrapiramidale s-au găsit depozite de mangan în nucleul caudat și în globus pallidus pe imaginile imagistice de la rezonanța magnetică (MRI).(173, 174).

Astrocitele contribuie la permebilizarea selectivă a barierei sânge-creier. Aceste tulburări ale permeabilității stau la baza encefalopatiei hepatice cu difuzia slabă a moleculelor care ies din astrocite. De exemplu, zincul care joacă rol important în transcripția genelor și plasticitatea sinaptică se anulează în astrocite, cauzând o deficiență selectivă de zinc și afectând suplimentar sinteza neurotransmițătorilor și neurotransmisia la sinapsa normală. (179).

Hiponatremia, dată de o concentrație serică a Na+ mai mică de 130 mmol/l este tot mai mult recunoscută ca un predictor independent al encefalopatiei hepatice clinice și s-a raportat că sporește riscul de un factor 8. (175). Astrocitele fac parte integrantă din fiziologia funcțională neuronală și devine clar că atât neuronii, cât și astrocitele sunt afectate în encefalopatia hepatică. În plus, neuroinflamația și scăderea metabolismului energetic al creierului sunt prezente în cursul episoadelor de encefalopatie hepatică. (176).

De asemenea, dezechilibrul dintre aminoacizii aromatici (adică nivelele mari de tirozină și fenilalanină) față de aminoacizii derivați catenar (leucina, izoleucina și valina) a fost legat de encefalopatie la pacienții cu boala ficatului (177), dar nu este în totalitate clar dacă acest dezechilibru contribuie la encefalopatia hepatică sau este o consecință a sa.

Nici hiperamoniemia, nici creșterea unor acizi aminați aromatici nu caracterizează totalitatea encefalopatiilor hepatoportale. Chiar tabloul neurologic al comei nu poate exclude coma alcoolică, delirium tremens, hematomul subdural, sindromul Wernicke etc. (180).

Edemul cerebral este prezent în toate formele de encefalopatie hepatică, dar în ciroză este caracteristic de grad scăzut, însă mecanismul acestuia nu este limpede. Diversele cercetări care au studiat fenomenul acesta menționează că edemul astrociteor nu este global, ci implică anumite zone ale creierului și este asociat cu extruziunea compensatoare de mioinozitol intracelular. (181). Șuntarea portosistemică intrahepatică transjugulară terapeutică (pentru hipertensiune portală) duce la o incidență a encefalopatiei hepatice de 30-55% și este similară cu rata pacienților cirotici fără șuntare. La 5% – 8% dintre pacienți, encefalopatia hepatică este refractară și necesită ocluzia intenționată a șuntării. (182).

Într-un studiu (183) atunci când șuntarea portosistemică intrahepatică transjugulară a fost efectuată timpuriu în tratamentul pacienților cirotici cu hemoragie variceală acută, ratele eșecului tratamentului și decesul au fost semnificativ mai mici decât într-un grup de control căruia i s-a administrat terapie endoscopică și nu s-a observat nici o diferență semnificativă în ce privește rata encefalopatiei sau a efectelor adverse grave între cele două grupuri.

Totuși, dacă encefalopatia a fost precipitată de hemoragia variceală, plasarea șuntului va preveni sângerarea ulterioară și va face mai puțin probabilă o recurență a encefalopatiei; dacă encefalopatia este persistentă și necontrolabilă atunci plasarea șuntului este contraindicată. (184).

Modificările psihice sunt semne premonitorii în encefalopatia hepato-portală. Deși în mod curent noțiunile de encefalopatie și comă hepatică se substituie între ele, sferele lor nu sunt identice, prima fiind mult mai mare decât ultima. Din punct de vedere clinic problema are importană practică, și anume recunoașterea semnelor precoce ale encefalopatiei hepato-portale înainte de-a îmbrăca forma sa majoră, coma. (185).

Tabloul psihic al encefalopatiei hepatice este variabil ca intensitate și compoziție, tranzitoriu și reversibil, uneori dificil de remarcat, mai ales în cazurile în care hepatopatia generatoare nu a fost corect diagnosticată. Aproape două treimi dintre ciroticii cu anastamoză porto-sistemică chirurgicală prezintă semne neuropsihice. Semnele neurologice precoce sunt reprezentate de simptome extrapiramidale, diskinezii orale, mișcări coreice, flapping tremor, iar între semnele clinice precoce sunt steluțele vasculare, limba uscată, zmeurie, diminuarea rapidă a unei hepatomegalii preexistente, icter etc.

O altă sistematizare a encefalopatiei hepatice aparținând unor cercetători (Sherlock et. al. 1954), care prezintă o clasificare simplificată:

1) Encefalopatia hepatică acută cu insuficiență hepatică acută și caracterizată de edem cerebral și presiune intracraniană crescută.

2) Encefalopatia hepatică subacută sau subclinică, asociată cu ciroza hepatică și cu comportament anormal la testarea neuropsihică.

3) Encefalopatia hepatică cronică, asociată cu ciroza hepatică sub raportul manifestărilor clinice cea mai comună formă de prezentare este „encefalopatia indusă de precipitanți”, în care pacienții cirotici dezvoltă modificări progresive ale funcției mentale odată cu mai mulți factori precipitanți, cum sunt encefalopatia porto-sistemică datorită șuntării porto-sistemice extinse sau șuntului porto-cav chirurgical. O altă formă este degenerarea hepato-cerebrală în care pacienții se prezintă cu demență și tulburări extrapiramidale. Dacă la prezentarea bolnavului, acesta prezinta tulburări de dispoziție, de somn sau modificări de personalitate, iar dezvoltarea modificărilor cognitive survine ulterior și devine dominantă, se consideră că pacientul are demență datorită bolii de ficat sau șuntării porto-cave.

Cele patru etape ale encefalopatiei hepatice acute, sub raportul manifestărilor clinice sunt: letargia și confuzia, somnolența și dezorientarea, stupoarea și coma. Succesiunea dezvoltării acestor etape depinde de severitatea leziunilor hepatice și povara infecțioasă.

Implicarea stresului oxidativ în patogeneza hepatitelor virale și a celorlalte forme metabolice cu encefalopatie hepatică, deși este evidentă, este încă dificil de interpretat în toate reacțiile sale moleculare și tisulare. Generarea sporită de specii de azot și oxigen în contextul ficatului afectat viral, împreună cu scăderea apărării antioxidante favorizează dezvoltarea și progresia complicațiilor hepatice și extrahepatice ale infecției virale. Evaluarea gradului de implicare a stresului oxidativ se face prin măsurarea produșilor de agresiune oxidativă la nivel molecular și tisular, precum și prin măsurarea produșilor antioxidanți cu caracter de apărare împotriva agresiunii oxidative.

Cel mai comun, accesibil și ușor de identificat, marker al stresului oxidativ în hepatita virală cronică sau ciroza hepatică este malondialdehida.

Malondialdehida este întânită în multe produse biologice: serul sanguin, plasmă, urină, țesuturi sau chiar produse alimentare și a devenit unul din cei mai utilizați indicatori pentru a estima efectele stresului oxidativ asupra lipidelor celulare (186). Chimic este o aldehidă (alcătuită din 3 atomi de carbon) intens reactivă, formată în toate celulele mamiferelor, în urma procesului de peroxidare a acizilor grași polinesaturați și din metabolismul acidului arahidonic (biosinteza prostaglandinelor și tromboxomului). Se leagă covalent la grupările amino ale proteinelor, lipoproteinelor, fosfolipidelor sau ADN-ului.

Malondialdehida reacționează cu ADN-ul pentru a forma malondialdehida de oxiguanozine și deoxiadenozinei, însă compusul principal este o pirimidopurinonă numită M1G, care poate contribui semnificativ la apariția cancerului, determinat de stilul de viață și factorii dietetici. Peroxidarea lipidică este un mecanism major de apariție a leziunilor celulare și presupune oxidarea acizilor grași polinesaturați cu formarea unor specii reactive și produși toxici. Într-o celulă în care se acumulează radicali liberi, acizi grași, care în mod normal ar fi supuși B-oxidării în mitocondrii, vor urma calea peroxidării lipidice în urma căreia rezultă ca produs final malondialdehida (MDA). Spre deosebire de radicalii liberi, aldehidele sunt relativ stabile și prin urmare pot să difuzeze prin membrane și pot astfel acționa la distanță de locul de origine al radicalilor liberi. (187).

Proteinele modificate pot prezenta alterări structurale, ale antigenității și comportamentului fizico-chimic (disfuncție sau inactivare). Deși MDA poate fi inactivată de aldehid-dehidrogenaze, producția sa este accelerată de stresul oxidativ și atunci când concentrațiile ating nivele critice, dialdehida poate scăpa procesului de detoxifiere. MDA este un produs toxic implicat în procesul de mutageneză la persoanele vârstnice, carcinogeneza, nefropatie diabetică, leziuni determinate de radiați și o serie de alte procese patologice. (188)

Recomandarea esențială pentru determinarea malondialdehidei este în evaluarea stresului oxidativ.

Metodologia examenului și dozarea malonaldehidei

Se recoltează sânge a jeun, din vena cubitală, într-un vacutainer ce conține EDTA ca anticoagulant. Prelucrarea este necesară în maxim 30 minute de la recoltare prin separarea plasmei prin centrifugare timp de 15 minute la 1500 xg [g = (1118 + 10 – 8) x (raza în cm) x (rpm) 2]; pentru separarea plasmei se folosește o pipetă de plastic. Se lucrează imediat, dacă acest lucru nu este posibil, plasma recoltată se păstrează la – 200 C în recipient de plastic (polipropilen sau polistiren). Probele de plasmă recultate în afata laboratorului vor fi transportate în recipient destinat probelor congelate. Volumul probă = 1 ml plasmă.

Stabilitatea probei de plasmă este de maximum 1 lună la – 200C.

Cauze de respingere a probelor: specimene hemolizate sau decongelate.

Metoda de lucru: cromatografie de lichide sub înaltă presiune (HPLC) cu detecție prin fluorescență. Valori de referință = < 1 μmol/l.

Analiza evaluează stresul oxidativ, care înseamnă dezechilibrul dintre nivelul produșilor de oxidare și capacitatea antioxidantă a organismului. Stresul oxidativ stă la originea unei patologii diverse cu mare prevalență în medicina modernă.

Valorile normale ale Malondialdehidei serice 0,36 – 1,24 μmol/l.

Creșteri ale Malondialdehidei:

Malondialdehida are implicații în apariția și evoluția steatohepatitei nonalcoolice, în procesul de mutageneză a persoanele vârstnice, carcinogeneză, nefropatia diabetică, leziuni determinate de radiații și o serie de alte procese patogenice. Unele studii au raportat un nivel seric crescut de malondialdehină în bolile parazitare.

Superoxid dismutaza (SOD) este o familie de metaloenzime antioxidante implicate în sistemul de apărare împotriva speciilor reactive de oxigen (ROS). Ea convertește radicalii superoxid în apă și peroxid de hidrogen, care este apoi catalizat în O2 și H2O de glutationperoxidază și catalază.

Au fos identificate mai multe clase de SOD:

– intracelulară

– extracelulară

Cea intracelulară are o formă citosolică, cupru-zinc (SOD = Cu-Zn SOD/SOD1) și una mitocondrială, mangan-SOD (MnSOD/SOD2).

Extracelulară – Cu-Zn SOD (EC SOD/SOD3).

Izoforma SOD1 se găsește în toate celulele eucariote ca o enzimă homodimetrică cu masa moleculară de 32 Kda ce conține câte un ion de Cu și Zn pe fiecare subunitate în această locație și este responsabilă de eliminarea ROS generate de reticulul endoplasmatic celular sau din diferite reacții citosolice.

Izoforma MnSOD (SOD2) este o proteină tetramerică cu masă de aproximativ 88Kda, localizată în principal la nivelul matricei mitocondriale, și are rol de a elimina speciile reactive de O2 generate de lanțul transportor de electroni.

Forma extracelulară SOD3 este un tratament ce leagă heparina și se exprimă în plămâni, căile respiratorii și pereții vaselor. De asemenea, poate fi importantă în eliminarea speciilor agresive rezultate din reacțiile de oxidare a membranelor (189, 190). Mutații la nivelul genei care codifică izoforma SOD1 pot provoca scleroza laterală amiotrofică familială printr-un mecanism incomplet înțeles în prezent, dar care nu se datorează pierderii activității enzimatice sau instabilității conformaționale a SOD1. Excesul SOD1 a fost legat de tulburări neuronale observate în sindromul Down. Polimorfismul genetic, dar și activitatea modificată a enzimei sunt asociate cu deteriorarea oxidativă a ADN-ului, care ulterior crește riscul de apariție a neoplasmelor. Celelalte două izomorfe de SOD nu au fost legate de vreo afecțiune umană, dar cu toate acestea la animalul de experiență inactivarea SOD2 determină decesul perinatal, iar inactivarea SOD2 cauzează carcinom hepatocelular. (193)

SOD s-a dovedit a fi foarte eficientă în tratamentul inflamației colonului din colită indusă experimental la animalul de experiență. (192). Tratamentul cu SOD scade speciile reactive de oxigen generate de stresul oxidativ și astfel inhibă activarea celulelor endoteliale și interacțiunile leucocite, celule endoteliale. Prin urmare, acest antioxidant poate fi un tratament nou, important pentru bolile inflamatorii intestinale. (192, 194).

Recomandarea pentru evaluarea (dozarea) superoxid dismutazei este stresul oxidativ. Sângele venos se recoltează dimineața a jeun, într-un vacutainer ce conține EDTA ca anticoagulant, iar cantitatea de recoltat este cât permite vacumul. Prelucrarea este necesară imediat după recoltare; în caz contrar, proba de sânge integral se refrigerează imediat (195). Stabilitatea probei cu sângele integral este de 7 zile la 2-80 C (195), iar metoda de lucru este una fotometrică (enzimatică). (195)

Valorile de referință pentru superoxid dismutaza serică sunt 1200-1800 U/g Hb (hemoglobină). (195). Durata pentru efectuarea analizei este de 3-5 zile.

Analiza este utilă în evaluarea stresului oxidativ, proces ce reprezintă un dezechilibru între speciile reactive de oxigen și capacitatea antioxidantă a organismului. Tratamentul cu SOD scade speciile reactive de oxigen și astfel inhibă activitatea celulelor endoteliale și interacțiunile leucocitelor și ale celulelor endoteliale.

Valoarea normală este în intervalul 1200-1800 U/gHb (pe un gram de hemoglobină). Metoda folosită pentru determinarea SOD este una fotometrică (enzimatică).

Glutation peroxidaza (GPX) face parte dintr-o familie de enzime ce catalizează degradarea hidroperoxizilor organici rezultați din procesele metabolice normale și asigură protecția proteinelor, lipidelor și acizilor nucleici față de acțiunea moleculelor oxidante, utilizând un donator de electroni, glutationul, sau în anumite cazuri, tioredoxina sau glutaredoxina. Comparativ cu superoxid dismutaza și catalaza, care se găsește în celule în cantități relativ mari și constante, glutation peroxidaza este de asemenea prezentă în toate țesuturile, dar în cantități variabile, deoarece este indusă enzimatic.

Acest fapt a fost constatat în plămâni și în hematiile fumătorilor, deoarece, cunoscut fiind faptul că fumatul de țigară conține mari cantități de radicali liberi, oxizii de azot și hidroperoxizii acționează ca substrat al peroxidazei. Glutation peroxidaza (GPX) este o enzimă seleniu dependentă ce se găsește în citosol (70%), dar și în mitocondrii (30%). Este de neînlocuit în arsenalul antioxidant, în special în mitocondii, deoarece acestea nu conțin catalaza pentru metabolizarea peroxidului GPX; asigură de asemenea protecția față de hidroperoxizii organici (implicați în modificări ale lipidelor de la nivelul peretelui vascular care promovează ateroscleroza) și ajută la regenerarea formei reduse a vitaminei C.

Dezechilibrele în nivelul GPx au fost observate odată cu îmbătrânirea și într-o varietate de tulburări, cum ar fi cancerul, bolile cardiovasculare, stresul oxidativ indus de alcool etc. Până în prezent prin analiza selenoproteinelor cu rol enzimatic au fost identificate 8 izoforme ale glutation peroxidazei în corpul mamiferelor notate CGx1 – GPx8, care diferă prin structura lor primară și localizare, fiind codificate de gene diferite (196). Cu excepția fosfolipid-hidroperoxidului GPX4, care este un monomer, toate celelalte izoforme sunt tetrameri compuși din patru subunități identice. Glutation peroxidaza conține 4 subunități polipeptidice, enzime având o masă moleculară de cca 85 Kda. Atomii de seleniu de la nivelul situsului activ participă direct la reducerea peroxidului, fiind esențiali în sistemul de protecție împotriva antioxidanților. Un deficit de seleniu chiar neînsemnat, afectează activitata enzimei și determină peroxidarea membranelor și naștere permeabilitatea acestora.

Glutation peroxidaza 1 (GPx1) este izoforma cea mai abundentă, localizată în citoplasma tuturor celulelor animale, implicată în detoxifierea peroxidului de hidrogen și lipid peroxidului, acționând ca o pernitrit reductază. În lipsa acestei enzime antioxidante rezultă acumularea de specii reactive de oxigen care determină deteriorarea ADN-ului, proteinelor și lipidelor. Dovezi clinice sugerează un potențial rol al GPx1 în aterogeneză, asociată cu diabetul zaharat.

Mai multe studii sugerează un rol protector al GPx1 în procesul de aterogeneză, astfel prin reducerea activității GPx12 în eritrocite a fost asociată cu un risc crescut de evenimente cardiovasculare și apariția de plăci aterosclerotice, ceea ce explică rolul cheie de protecția vaselor împotriva stresului oxidativ și ateroscleroză. (196, 198).

GPx2 este cunsocută și sub numele de GPx gastrointestinală. Ea este o enzimă intracelulară exprimată la nivelul epiteliului gastro-intestinal. Este mai abundentă la nivelul criptelor și scade treptat spre suprafața luminală, indicând un rol în proliferarea celulelor. Este crescută în adenoamele colo-rectale, carcinoame pulmonare și de sân, etc. Dar expresia sa nu este specifică pentru tractul gastro-intestinal. Rolul protector al GPx2 poate fi demonstrat prin faptul că exprimarea sa este reglată de factorul de transcriere Norf 2, care este considerat citoprotector și previne tumorigeneza GPx2, capabilă să inhibe ciclooxigenaza 2 (Cox2) și duce la scăderea producției de prostaglandine E2 (PGE2). Toate formele de GPx au proprietatea de a inhiba activitatea COX prin eliminarea hidroxizilor. Activitatea COX necesită hidroperoxid și nu mai poate produce PGE2 în cazul în care acesta este în cantitate redusă (201). Flutatin-peroxidaza intervine de asemenea și în reacția de conversie a acidului arahidonic în leucotriene sub acțiunea lipooxigenazei. (199).

Glutation peroxidaza aflată în plasmă poartă denumirea de GPX3. Deoarece controlul redox a fost implicat în apariția disfuncțiilor metabolice, măsurarea GPX3 în ser poate aduce unele beneficii în diagnosticul acestor afecțiuni (rinichi, plămâni, ficat, inimă etc.) (201)

Glutationperoxidaza 4 (GPX4) este o enzimă antioxidantă, care protejează celulele împotriva peroxidării lipidelor membranare, fiind exprimată în aproape toate tipurile de celule, dar la nivel mai scăzut. Gena Gpx4 codifcă trei izoforme:

o formă lungă lGpx4

o formă scurtă sGpx4

o formă nucleată, cu rol important în condensarea cromatinei la nivelul spermatozoizilor.

Aceste izoforme se disting prin prezența sau absența unei peptide semnal la capătul N-terminal.

Glutation peroxidaza 5 (GPX5) cunoscută și sub denumirea de glutation peroxidaza expididimală secretorie, este specific exprimată în tractul genital masculin (epiteliu) și joacă un rol important în protejarea membranelor spermatozoizilor de efectele nocive ale peroxidării lipidice sau previne reacția acrozomală prematură. (200).

Glutation peroxidaza 6 (GPX6) este exprimată la nivelul epiteliului olfactiv. GPX5 și GPX6 sunt înrudite cu GPX3, dar GPX5 nu conține seleniu la nivelul situsului activ. GPX6 este o enzimă dependentă de seleniu.

Familia acestor enzime este destul de mare, astfel că a fost identificată mai nou o altă izoformă fostelipid hidroperoxid glutation peroxidaza (PHGPx) care conține cisteină la nivelul domeniului catalitic și a fost descrisă la mamifere. Ea joacă un rol esențial în cancerul de sân, reducând în celulele tumorale stresul oxidativ generat de metabolismul acizilor grași polinesaturați. (202).

Recomandările pentru determinarea glutation-peroxidazei se referă la evaluarea stresului oxidativ. (196).

Recoltarea pentru examen se face a jeun, din sângele venos, în vacutainer ce conține heparinat de litiu ca anticoagulant, după care produsul nu se centrifughează și se menține refrigerat. Proba se menține stabilă 1 lună la 2-40C. Metoda de lucru este una fotometrică, prin care se analizează activitatea enzimatică în eritrocite.

Valorile de referință = 4171-10881 U/L

Scăderea concentrațiilor de glutation peroxidază se întâlnește în deficitul de seleniu, boli coronare, diabet și dializă. (203).

Glutation peroxidaza este o enzimă antioxidantă care protejează celulele împotriva peroxidării lipidelor membranare și este utilă determinarea ei, în evaluarea stresului oxidativ.

Implicarea patogenetică a stresului oxidativ în evoluția hepatitei, indiferent că este ea acută sau cronică, îi imprimă acesteia o notă particulară de agravare, prin distrucțiile ce le provoacă în mediul intracelular, mitocondrrial și de-o potrivă extracelular la nivel membranar, în plan osmolar și în cel al conducției neuronale, respectiv al pompei ionice și echilibrului hidroelectrolitic. Din punctul de vedere al obiectivului nostru, în studiul encefalopatiei hepatice, stresul oxidativ vizează în mod deosebit metabolismul energetic cerebral în toată complexitatea lui, ținând cont de specificul distribuțiilor metabolice specifice legate de insuficiența hepatică. Cea mai vulnerabilă celulă neuronală la insuficiența hepatică și stresul oxidativ este astrocitul. El ocupă locul central ca patologie în encefalopatia hepatică:

în insuficiența hepatică acută (encefalopatia) astrocitele suferă modificări caracteristice care duc la creșterea presiunii intracraniene.

în insuficiența hepatică cronică, astrocitele suferă modificări caracteristice cunoscute ca astrocitoza Alzheimer tip II.

în encefalopatia porto-sistemică rezultată în urma insuficienței hepatice cronice, astrocitele prezintă expresia alterată a mai multor proteine și enzime cheie, incluzând monoaminoxidaza B, glutaminsintetaza și așa numiții receptori ai benzodiazepinei de tip periferic. (169, 179).

Expresia clinică a gradului de afectare hepatică, în funcție de încărcarea, respectiv povara infecțioasă și inflamatorie care marchează ritmul și direcția dezvoltării complicațiilor (hepatocarcinomul, ciroza hepatică, encefalopatia hepatică) este evaluată prin markeri specifici ai viremiei, gradului de distrucție celulară (hepatocitică), distrucția enzimatică specifică metabolismului hepatic, alterarea țesutului interstițial și fibros, puncția hepatică, tulburările hemodinamice cu apariția barajelor vasculare, a varicelor gastro-esofagiene, apariția ascitei și hemoragiilor gastro-esofagiene, iar la acestea, asocierea expresiei enzimatice a stresului oxidativ (malondialdehida, superoxid dismutaza, glutamin peroxidazei) din a căror evoluție valorică putem interpreta evoluția favorabilă sau defavorabilă a procesului hepatic și a complicațiilor sale. În acest spirit se desfășoară studiul de față.

Cuantificarea și prelucrarea statistică a datelor

În cazul analizei statistice rezultatele sunt exprimate sub formă de medie ± semnificația

mediei. Datele sunt prezentate după medii procentuale, iar acolo unde a fost nevoie s-a realizat analiza statistică pe baza testului Studen (testul t)

Valorile a căror prag de semnificație a fost p<0,05 au fost considerate statistic semnificative(*) , distins semnificative pentru un p<0,01 (**) și foarte semnificative acolo unde p<0,001(***). Testul T (Student) este folosit pentru a examina efectele unei variabile independente asupra uneia sau a mai multe variabile dependente, iar folosirea sa este rezervată comparării a două condiții sau grupe (două niveluri ale variabilei independente). Este cel mai des utilizat test pentru evaluarea diferențelor între mediile unei variabile în două grupuri.

Nivelul „p” reprezintă pragul de semnificație statistică a unui rezultat și este o estimare a gradului în care respectivul rezultat (obținut pe un eșantion) poate fi generalizat la nivelul întregii populații. Cu cât nivelul p este mai mare cu atât mai puțin "credibilă" este generalizarea rezultatului de la nivelul eșantionului studiat la nivelul întregii populații studiate. Un nivel al „p”-ului de 0.05 indică că există o probabilitate de 5% ca rezultatul obținut pentru eșantionul studiat să nu fie adevărat pentru întreaga populație din care s-a „desprins” respectivul eșantion. Nivelul de 5% este un nivel general acceptat în literatura de specialitate și în calculele statistice.

Capitolul II

ORGANIZAREA STUDIULUI CLINIC

Am pornit de la ipoteza că nivelul valoric seric al malondialdehidei la un pacient cu hepatită cronică se asociază pozitiv cu evoluția defavorabilă sau complicațiile ce apar, ca expresie a stresului oxidativ intensificat, iar nivelul seric sporit al antioxidanților se asociază pozitiv cu evoluția favorabilă sau ameliorarea procesului hepatitic.

În același spirit, am urmărit relația valorilor acelorași enzime cu evoluția encefalopatiei hepatice exprimată prin parametrii specifici.

2.0.0. Alcătuirea loturilor de studiu

Au fost alcătuite patru loturi de studiu și un lot martor din subiecți sănătoși, după cum urmează:

Condițiile de neeligibilitate au fost:

infarctul miocardic acut în ultimele trei luni înaintea debutului studiului

tratament cu Interferon și Ribavirină aplicat înaintea includerii în studiu.

tulburări acute de ritm ventricular repetitive.

epilepsie

Structura pe sexe, grupe de vârstă și locație a pacienților

LOTUL 1 = 23 pacienți cu hepatită cronică din care 14 (60,86%) bărbați și 9 (39,13%) femei, vârsta cuprinsă între 18-67 ani, cu media de vârstă 40,5 ani

după rezidență – 16 (69,56%) din mediu urban și 7 (30,43%) din mediu rural

după gradul de instrucție – 11 (47,82%) cu pregătire gimnazială, 7 (30,43%) aveau studii liceale și 5 (21,73%) aveau studii universitare.

după vechimea afecțiunii de la debut la cuprinderea în studiul nostru:

3-5 ani = 9 (39,13%) pacienți

5-7 ani = 8 (34,78%) pacienți

> 7 ani = 6 (26,08%) pacienți

după etiologie: – infecție cu virus hepatitic B = 4 (17,39%) pacienți

– infecție cu virus hepatitic C = 12 (52,17%) pacienți

– hepatită etanolică = 7 (30,43%) pacienți

după numărul de spitalizări,de la debutul bolii până la data cuprinderii în lotul nostru.

-0 internări = 7 (30,43%) pacienți din care: 5 (21,73%) cu infecție cu virus hepatitic C

2 (8,69%) cu hepatită etanolică

1 (4,34%) infecție cu virus hepatitic B

-1 internare = 6 (26,08%) pacienți din care: 3 (13,04%) cu infecție cu virus hepatitic B

2 (8,69%) cu hepatită etanolică

1 (4,34%) cu infecție cu virus hepatitic C

-1-3 internări = 5 (21,73%) pacienți din care: 3 (13,04%) cu hepatită etanolică

2 (8,69%) cu infecție cu virus hepatitic C

> 3 internări = 4 (17,39%) pacienți cu infecție cu virus hepatitic C.

LOTUL 2 = 14 pacienți cu ciroză hepatică din care 9 (64,28%) bărbați și 5 (35,71%) femei, cu vârsta cuprinsă între 31-77 ani, cu o media de vârstă de 54 ani

după rezidență – 8 (57,14%) din mediu urban și 6 (42,85%) din mediu rural

după gradul de instrucție – 4 (28,57%) aveau studii gimnaziale, 7 (50%) aveau studii liceale sau echivalente și 3 (21,42%) aveau studii universitare sau echivalente.

după vechimea afecțiunii de la diagnostic la cuprinderea în lotul nostru de studiul:

1-2 ani = 3 (21,42%) pacienți

2-4 ani = 9 (64,28%) pacienți

> 4 ani = 2 (14,28%) pacienți

după etiologie: – 6 (42,85%) pacienți cu infecție cu virus hepatitic C

– 3 (21,42%) pacienți cu hepatită etanolică

– 5 (35,71%) pacienți cu infecție cu virus hepatitic B

după numărul de spitalizări înaintea încorporării în studiul nostru:

1 internare = 5 (35,71%) pacienți

1-3 internări = 6 (42,85%) pacienți

> 3 internări = 3 (21,42%) pacienți

după tipul complicațiilor clinice:

4 (28,57%) prefigurarea unui nivel mic de ascită decelabilă ecografic

3 (21,42%) varice esofagiene în jumătatea inferioară a esofagului

2 (14,28%) encefalopatie hepatică stadiul I

3 (21,42%) dintre pacienți s-au complicat cu hepatocarcinom

LOTUL 3 = 11 pacienți cu hepatocarcinom din care 6 (55,84%) femei și 5 (45,45%) bărbați, cu vârsta cuprinsă între 42-70 ani, cu o medie de 56 ani

după rezidență – 5 (45,45%) din mediu urban și 6 (55,84%) din mediu rural

după gradul de instrucție – 5 (45,45%) aveau studii gimnaziale, 4 (36,36%) aveau studii liceale sau echivalente și 2 (18,18%) aveau studii universitare sau echivalente.

după vechimea afecțiunii de la diagnostic la cuprinderea în lotul nostru de studiul:

< 1 an = 4 (36,36%) pacienți

1-2 ani = 7 (63,63%) pacienți

după etiologie: – 3 (27,27%) cazuri pe fond de infecție cu virus hepatitic B

– 6 (54,54%) cazuri pe fond de infecție cu virus hepatitic C

– 2 18,18%) cazuri pe fond de consum cronic de etanol

după numărul de spitalizări înaintea încorporării în studiul nostru:

1 internare = 4 (36,36%) pacienți

1-3 internări = 3 (27,27%) pacienți

> 3 internări = 4 (36,36%) pacienți

LOTUL 4 = 8 pacienți cu encefalopatie hepatică, din care 5 (62,5%) bărbați și 3 (37,5%) femei, cu vârsta cuprinsă între 43-67 ani, cu o medie de 55 ani

după rezidență – 4 (50%) din mediu urban și 4 (50%) din mediu rural

după gradul de instrucție – 3 (37,5%) aveau studii gimnaziale, 5 (62,5%) aveau studii liceale

după vechimea afecțiunii de la diagnostic la includerea în studiu:

< 1 an = 3 (37,5%) pacienți

1-2 ani = 5 (62,5%) pacienți

după etiologie: – 5 (62,5%) pacienți cu infecție cronică cu virus hepatitic C

– 2 (25%) pacienți cu infecție cronică cu virus hepatitic B

– 1 (12,5%) pacienți cu consum cronic de etanol

după numărul de spitalizări înaintea încorporării în studiul nostru a fost:

1 internare = 1 (12,5%) pacient

1-3 internări = 4 (50%) pacienți

> 3 internări = 3 (37,5%) pacienți

După unii autori (204) complexitatea tulburărilor metabolice, cu posibilă importanță patogenetică în encefalopatia porto-sistemică include:

– reducerea afinității hemoglobinei pentru oxigen,

– reducerea utilizării cerebrale de glucoză, dar cu păstrarea echilibrul între producția și consumul de energie,

– creșterea amoniacului în sânge, mușchi, creier și lichidul cefalo-rahidian,

– creșterea glutaminei și α-cetoglutamatului în mușchi, creier și lichidul cefalo rahidian,

– creșterea de piruvat, lactat, citrat, α-cetoglutamat, fumarat, malat și oxalacetat în creier,

– scăderea producției de corpi cetonici,

– creșterea concentrației acizilor grași în sânge

– modificarea modulului aminoacid în sânge, creier, lichidul cefalo-rahidian și urină,

– reducerea conținutului de neurotransmițători în creier și mușchi,

– creșterea de metaboliți ai neurotransmițătorilor în creier și lichidul cefalo-rahidian,

– creșterea de falși neurotransmițători în sânge, creier, mușchi și urină,

– creșterea de mercaptani în sânge, creier, aer expirat și urină.

Aceste manifestări dismetabolice sunt întâlnite în evoluția cronică a tuturor hepatitelor virale și metabolice (etanolice) cu evoluție către ciroză, dar encefalopatia hepatică începe ca manifestare secundară odată cu suferința hepatocitului, ca semn de insuficiență hepatică.

LOTUL 5 format din 15 subiecți sănătoși clinic, cu vârstă și distribuție pe sexe, instrucție și rezidența apropiate de loturile de studiu.

Toți pacienții cuprinși în studiu au avut cel puțin o internare în servicii clinice de specialitate, având deci și diagnosticul compentent precizat, precum și stadiul clinic.

Studiul nostru s-a desfășurat în cadrul Spitalului Clinic Municipal „Dr. Gavril Curteanu” din Oradea, secția clinică de Medicină Internă, Conf.Univ.Dr. Ovidiu Burtă, în perioada mai 2010-mai 2012.

Înglobarea pacienților în loturile de studiu s-a realizat succesiv în anul pregătitor 2009 – iunie, 2010 – mai, pe măsura identificării lor la examinările de specialitate din ambulatoriu și din cei trimiși spre internare în serviciul nostru.

Toți bolnavii distribuiți în cele 4 loturi de studiu ca și cei din lotul martor au fost supuși deopotrivă la un examen de START, ce a constat în: examen clinic, bioumoral, imagistic (EKG, EEG, ECO, CT sau RMN) precum și în dozarea enzimelor stresului oxidativ (malondialdehida, superoxidul dismutaza, glutation peroxidaza), alături de cele specifice afecțiunii hepatice în diversele ei stadii (hepatită cronică, ciroză hepatică sau encefalopatie hepatică).

Toate rezultatele obținute pe parcursul dezvoltării studiului s-au raportat pe de o parte celor din start, iar pe de altă parte, lotului de referință, dar și față de alte studii similare din literatura de specialitate.

Au fost înregistrate fișe individuale pentru fiecare pacient, cu datele de identificare civilă, adresa și numărul de telefon pentru a se putea colabora pe perioada celor doi ani de monitorizare (mai 2010-mai 2012). S-au înregistrat datele antecedentelor personale și istoria naturală a afecțiunii de bază, cu examinările specifice în evoluție și cu o scurtă epicriză, la final.

Pentru colaborarea în teritoriu cu acești pacienți s-a făcut un protocol de înțelegere cu medicii de familie de care aparțineau acești bolnavi, prin care ni s-a permis a colabora profesional cu pacienții în cauză.

Cea mai delicată problemă a examenului de start s-a referit la elementele diagnostice mai subtile ale encefalopatiei hepatice și afirmarea naturii lor hepato-portale. Recunoașterea encefalopatiei se bazează pe înmănuncherea prin observații repetate și investigații a manifestărilor neuropsihice, care variază de la mici modificări comportamentale ca: astenia psihică și fizică, scăderea capacității de concentrare, până la semne neurologice ce apar ceva mai târziu ca asterixisul, faetorul hepatic, agitația psihomotorie, elemente elocvente pentru debutul encefalopatiei hepatice. Față de examenul de start, comun celorlalte loturi, în cazul encefalopatiei hepatice s-a efectuat examenul electro-encefalografic, psihologic și psihiatric, neurologic și psihometric.

Măsurătorile și rezultatele acestora la examinările imagistice, EKG, EEG, ECO, CT sau RMN, sunt exprimate în concordanță cu metoda de lucru, raportată la valorile convenționale. TA valori normale < 140/90 mmHg și > 90/60 mmHg. Valoarea intervalului normal pentru enzimele stresului oxidativ: (MDA) – Malondialdehida = 0,36-1,24 μmol/L

(SOD) – Superoxid dismutaza = 1 200-1 800 U/gHg

(GPx) – Glutation peroxidaza = 4 171-10 881 U/L

2.1.0. Examinările generale de start

2.1.1. Rezultatele examinărilor de start pentru pacienții din lotul 1

Tabelul 1. Repartizarea pe sexe și grupe de vârstă: total 23 pacienți

Raportul după sexe = 60,86% bărbați

= 39,13% femei

prevalența după grupa de vârstă, decada 28-37 ani = 44,44% cu hepatită cronică la femei și 42,85% pentru grupa de vârstă de la 38-47 ani pentru bărbați.

Tabelul 2. Distribuția pacienților lotului 1 în funcție de valorile TA (tensiunii arteriale)

Valorile cuprinse în interiorul normalului au fost înregistrate la 13 pacienți (56,56%) din lot și în mod egal câte 5 pacienți (21,73%) au prezentat valori hipotensive și respectiv hipertensive, numărul mai mare a fost în ambele cazuri la bărbați.

Tabelul 3. Rezultatul electrocardiografice

Traseul electrocardiografic al pacienților din lotul 1 a fost relativ normal, cu extrasistole ventriculare LOWN 1 la 2 pacienți (8,69%), bloc de ramură stângă a alți 2 pacienți (8,69%), ischemie portero-inferioară la 3 pacienți (13,04%). Cel mai important aspect a fost însă ischemoleziunea antero-apicală la 2 (8,69%) din pacienți, dar fără simptomatologie clinică anginoasă.

Tabelul 4. Rezultatele examenului ecografic hepatic la pacienții lotului 1

Tabelul 4a. Endoscopia digestivă superioară la pacienții lotului 1

După examenul de start 20 din bolnavii lotului 1 au prezentat creșteri în volum ale ficatului, de diferite grade (hepatomegalie).

Creșterea peste limita superioară a intervalului normal al calibrului venei porte s-a înregistrat la 13,04% din pacienți, motiv pentru care la examinarea endoscopică s-au și evidențiat varice esofagiene grad I. Probabil că acești pacienți se aflau în tranziție morfologică și funcțională spre ciroză hepatică.

Lichid de ascită încantitate moderată, s-a detectat ecografic doar la un bărbat cu hepatită cronică etanolică.

Tabelul 5. Radioscopia (Radiografia) pulmonară la pacienții lotului 1

Tabelul 6. Rezultatele examinărilor bioumorale de start la lotul 1

A rezultat din examinările de mai sus că valoarea malondialdehidei la 6 (26,08%) pacienți cu hepatită cronică virală C a fost mai mare, iar nivelul antioxidanților enzimatici SOD și GPx4 au fost mai crescut la 4 (17,39%) pacienți cu hepatită cronică virală B. Malondialdehida a fost mai mare la cazurile mai severe de hepatită C, cu unele modificări spre ciroză și activitate citolitică sporită.

Totuși, activitatea MDA a fost sporită în ambele forme de hepatită cronică virală, dar activitatea enzimelor antioxidante a fost mai scăzută la grupul cu hepatită cronică virală C în aceeași măsură în care activitatea malondialdehidei a fost mai sporită ca efect al activității mai intense a stresului oxidativ. Această diferențiere s-ar putea datora unei deteriorări oxidative, în sensul că atunci când activitatea acestor enzime antioxidante este neadecvată organismului, ea nu este capabilă să neutralizeze speciile reactive de oxigen sintetizate în exces, iar în consecință apare o lezare a hepatocitelor exprimată prin valori crescute ale GOT și GPT. În cazul nostru activitatea SOD a fost scăzută la 11 (47,82%) pacienți, iar cea a GPx4 la 7 (30,43%) pacienți, posibil urmarea agresivității oxidative în contextul stresului oxidativ.

Celelalte rezultate hematologice și biochimice au diferențiat hepatita cronică virală B de hepatita cronică virală C, precum și de cea etanolică, evaluându-le astfel etiologic.

S-a putut evidenția o asociere pozitivă între nivelul mai crescut al malondialdehidei în asociere cu creșterea gradului de anemie, sporirea nivelului seric al proteinei C-reactive alături de creșterea nivelului enzimelor hepatocitolitice și de alterarea stării clinice.

Tabelul 7. Nivelul enzimelor hepatocitolitice la pacienții lotului 1

Pentru o evaluare cât mai fidelă a rezultatelor, acestea au fost grupate în câte două trepte, luând în calcul valoarea cea mai mică deasupra intervalului normal și valoarea cea mai mare înregistrată, ca rezultat, de laborator. Astfel la ALT cea mai mică valoare înregistrată a fost de 67 U/L, iar cea mai mare 198 U/L la AST, valoarea cea mai mică a fost de 58 U/L și cea mai mare 139 U/L la femei și 55 U/L respectiv 178 U/L la bărbați. Aceste valori le-am împărțit în două trepte în mod arbitrar, după cum sunt înregistrate mai sus.

Raportul De Rittis: ALT/AST > 1 este în favoarea afecțiunilor virale (21/19 = 1,1), iar ALT/AST < 1 este în favoarea afecțiunilor hepatocelulare alcoolice, tumorale, toxice etc.

Etiologia celor 23 de cazuri de hepatită cronică a fost confirmată ca fiind de origine virală la 16 pacienți, din care la 4 infecția virală B, 12 cu infecție virală C, iar 7 având etiologie etanolică susținută prin rezultatele bioumorale de mai sus, alături de imagistică și comemorative etilice.

2.1.2. Rezultatele examinărilor de start – lotul 2 (ciroză hepatică)

Tabelul 8. Distribuția lotului 2 pe grupe de vârstă

Grupele de vârstă prevalente în lotul cu ciroză hepatică au fost 41-50 ani și 61-70 de ani cu 35,7% din pacienți, respectiv 21,42%. Predominanța pe sexe a fost de 64,26% bărbați și 35,7%.

Tabelul 9. Distribuția în funcție de valorile TA (tensiunii arteriale)

Valorile tensionale au fost în intervalul normal la 57,12% pacienți, sub valoarea normală a fost înregistrată la 21,42%, aceeași valoare find înregistrată și la hipertensiune arterială.

Tabelul 10. Rezultatul EKG la pacienții lotului 2

Tabelul 11. Rezultatele examenului ecografic hepatic la pacienții lotului 2

Tabelul 11a. Endoscopia digestivă superioară la pacienții lotului 2

În 78,54% din cazurile de ciroză hepatică s-a constatat prezența hepatomegaliei, cu contur neregulat al feței inferioare, cu ecostructură profund inomogenă la 49,98% din bolnavi.

Calibrul crescut al venei porte (de peste 13 mm) a fost detectat la 57,12% dintre pacienți, iar prezența lichidului de ascită în cantitate minimă s-a identificat la 5 (35,7%) din cei examinați.

Tabelul 12. Examinările bioumorale de start la lotul 2

AgHBs a fost pozitiv la 35,7%, iar anti-VHC a fost pozitiv la 42,84%. Din analiza sumară a rezultatelor imagistice și bioumorale corelate cu istoria naturală rezultă că 3 pacienți au ajuns în stadiul de ciroză hepatică din faza de hepatită cronică etanolică, în favoarea etiologiei pledând recunoașterea consumului cronic de etanol, aspectul clinic al pacienților, aspectul ecografic al ficatului, atrofic, cu margine inferioară ascuțiță, profund inomogen, încărcat gras; biologic s-a constatat un proces de citoliză cu predominanța GOT, cu raport De Rittis de 1,27, GGT crescut, bilirubinemia totală crescută, pe fondul celei directe, hiposideremie, colinesterază serică scăzută, IgA > 250 UI/ml.

La cei cu etiologie virală a cirozei descendența s-a făcut din hepatiă cronică, iar ceea ce a fost caracteristic față de cazurile de ciroză hepatică de cauzî etanolica, a fost un rapost de Rittis supraunitar, deci cu predominanța GPT și IgG > 350 UI/ml.În rest diferențele clinice, ecografice și bioumorale au fost nesemnificative.

Cât privește descendenta din hepatita virală B sau C, raportul este în favorea cirozei hepatice de etiologie VHC, deoarece Ag HBs s-a identificat doar la 5 pacienți, iar 6 bolnavi prezentau în ser Ac anti-HCV.

Cât privește implicarea stresului oxidativ în patogeneza cirozei hepatice și a evoluției acesteia, s-a putut constata prezența malondialdehidei în serul unor bolnavi din acest lot, precum și reacția unor enzime antioxidante.

Malondialdehida fost identificată la 6 (42,84%) pacienți în cantități variabile. La 4 (28,56%) pacienți valorile au fost puțin mai mari decât limita superioară a intervalului normal și a fost asociată cu nivele serice ale proteinei C-reactive de peste 3 mg/dl, iar la 2 (14,28%) pacienți valorile au crescut de peste 4 mg/dl, ceea ce s-a corelat pozitiv cu evoluția mai severă a două cazuri de ciroză hepatică de etiologie VHC. Răspunsul enzimelor antioxidante a fost concordant cu nivelul valoric al enzimelor oxidante.

2.1.3. Rezultatele examinărilor de start – lotul 3 (hepatocarcinom)

Tabelul 13. Distribuția pe grupe de vârstă și sex a lotului 3

Grupa de vârstă cea mai afectată a fost cea de 61-70 de ani, urmată de grupa de vârstă de 42-50 cu 45,45%, respectiv 36,36% din pacienți. Femeile au prevalat la grupa de vârstă 42-50 de ani, iar bărbații la grupa de vârstă 61-70 de ani. Incidența mare a prezenței a cel puțin unui marker al infecției virale B la bolnavii cu hepatocarcinom și a antecedentelor de 60-80% de hepatită cronică virală B sugerează susceptibilitatea mai crescută a bolnavilor cu hepatită cronică virală B de a face hepatocarcinom. (206)

Asociarea hepatocarcinomului în 15-25% la bolnavii cirotici, care provin în proporție de peste 65% din hepatita cronică virală C duce la relația acesteia cu hepatocarciomul. (207)

Cum aproximativ 1/3 din cazurile de hepatită cronică etanolică virează spre ciroză hepatică, iar ciroza prezintă o disponibilitate crescută atât spre hepatocarcinom cât și spre encefalopatie, raportul fiind însă greu de estimat.

În contrast cu cele mai multe statistici privind raportul dintre sexe cu privire la determinările carcinomatoase hepatice, în cazul studiului de față, femeile reprezintă un procent mai mare respectiv de 54,54% față de bărbați.

În mod tradițional bărbații fiind mai frecvent consumatori cronici de alcool, în cazul nostru rezerva în lot a acestora, implicit a complicației hepatice cronice etilice ca ciroza sau hepatocarcinomul, a fost mai mică.

Tabelul 14. Distribuția pacienților în funcție de valorile TA (tensiunii arteriale)

Valori normale ale tensiunii arteriale am înregistrat la 63,63% din pacienți și doar la 18,18% dintre aceștia am depistat valori moderat crescute, peste limita convențională a normalului. Nu am constatat vreo relație între stadiul clinic al heparocarcinomului și nivelul valorilor tensionale.

Tabelul 15. Rezultatul EKG la pacienții lotului 3

Traseu electric normal am înregistrat la 63,63% din pacienți, la care de altfel nici simptome clinice sugestive (anginoase) nu am decelat.

S-a înregistrat totuși imagine de T negativ și segment S-T subdenivelat la 18,18% din pacienți, fără însă a avea corespondent clinic, precum și un caz de infarct miocardic sechelar, spitalizat în urmă cu patru ani, dar actualmente fără modificări biochimice, enzimatice sau acuze anginoase.

Tabelul 16. Rezultatele examenului ecografic hepatic la pacienții lotului 3

Prevalența cea mai mare a fost a cazurilor la care ecografic s-au decelat multiple formațiuni hiperecogene, de dimensiuni variabile, diseminate în ambii lobi hepatici (4 din 11 bolnavi). La toți acești 4 pacienți s-au identificat Ac anti –VHC. La trei pacienți am identificat determinări carcinomatoase multiple doar în lobul drept hepatic, iar la alți trei pacienți am identificat doar o imagine solitară în lobul drept hepatic.

Tabelul 16a. Endoscopia digestivă superioară la pacienții lotului 3

Tabelul 17. Examinările bioumorale de start la lotul 3

Examenul clinic, ecografic, bioumoral, în special bazat pe valoarea crescută a alfafetoproteinei, a VSH-ului, cu colestază marcată au ajutat la stabilirea diagnosticul de hepatocarcinom.

2.1.4. Rezultatele examinărilor de start – lotul 4 (encefalopatia hepatică)

Tabelul 18 Distribuția pe grupe de vârstă și sex a lotului 4

Raportul pacienților afectați de encefalopatie hepatică a fost în favoarea bărbaților cu 62,5% față de 37,5% pentru femei. Grupa de vârstă prevalentă este 51-60 ani, cu un procent de 50%.

Tabelul 19. Distribuția pacienților în funcție de valorile TA (tensiunii arteriale)

Jumătate din pacienții cu encefalopatie hepatică au prezentat valori tensionale sub limita superioară a normalului

Tabelul 20. Rezultatul EKG la pacienții lotului 4

Ischemia miocardică a avut și corespondent clinic anginos la doi din pacienți: angină pectorală de efort, cu răspuns favorabil la administrarea sublinguală de nitroglicerină. Dependență de nitroglicerină și valoarea mică a efortului la care apărea durerea, alături de o stare de anxietate, care asociată tabloului neuropsihic dezvoltat pe fondul intoxicației metabolice, în contextul bolii de bază, a complicat imaginea tabloului clinic la aceștia.

O seamă de studii (103) publicate recent în Hepatology, 2010, au dovedit pe eșantioane cerebrale recoltate post mortem de la pacienții cu ciroză hepatică și encefalopatie hepatică, asocierea acestora cu stresul oxidativ și rolul lor în patogeneza encefalopatiei hepatice. Ei au subliniat că encefalopatia hepatică în ciroză reflectă manifestările clinice ale edemujlui cerebral de grad scăzut. Amoniacul, care este toxina majoră în patogeneza encefalopatiei hepatice, induce inflamația astrocitelor alături de citokinele inflamatorii, hiponatremie și benzodiazepine, factori precipitanți, ce se pot însuma ca efect în inflamația astrocitelor.

Experimental s-a dovedit că amoniacul, factorul alfa al necrozei tumorii, diazepamul și inflamația celulei hipoosmotice au determinat o reacție de stres oxidativ/nitrozativ, prin intermediul activării unei enzime numite nicotinamid-adenin-dinucleotid-fosfat-oxidaza.

Reacția la stresul oxidativ/nitrozativ indusă de amoniac, factorul alfa al necrozei tumorale și inflamație are multiple efecte asupra funcției astrocitare, cum ar fi modularea transcripției genei prin intermediul mobilizării ionilor de Zn++ , ceea ca va regla superior receptorii benzodiazepinici periferici, acțiune deosebit de importantă. În plus, apar și alte reacții cum sunt: nitrarea tiroizinei proteinice și oxidarea ARN-ului prin intermediul formării de 8-hidroxiguanidină. Astrocitele localizate în apropierea barierei sânge-creier prezintă nivele foarte mari de PTN (nitrarea proteinei tirozinice) care joacă rol important în procesul de permeabilizarea a acesteia. Oxidarea ARN-ului în neuroni implică specii ARN conținute în granulele ARN-pozitive NOVA-2 de-a lungul dendritelor și în regiunile post-sinaptice. Aceste constatări sugerează că stresul oxidativ asociat cu encefalopatia hepatică modifică speciile ARN, implicate în sinteza proteinei sinaptice locale și prin urmare, ar putea afecta plasticitatea sinaptică și formarea memoriei.

Analiza finală a arătat că PTN și oxidarea ARN-ului sunt semnificativ sporite în encefalopatia hepatică, ceea ce dovedește că stresul oxidativ/nitrozativ este o caracteristică a encefalopatiei hepatice la pacienții cu ciroză.

Din examenul ecografic abdominal nu am decelat imagini specifice.

Tabelul 21.Rezultatele examenului ecografic hepatic la pacienții lotului 4

Tabelul 22. Examenul eletroencefalografic (EEG) la pacienții lotului 4

Modificările traseului EEG normal însoțesc majoritatea cazurilor de encefalopatie hepatică în sinergism cu tulburările psihice, care trădează suferința sistemului nervos înaintea apariției semnelor neurologice caracteristice.

Modificările bioumorale sunt de mare valoare asociate celor de mai sus în evaluarea diagnosticului. Encefalopatia porto-sistemică este însoțită de o formulă caracteristică a aminoacidemiei.

Valoarea raportului concentrațiilor molare plasmatice pentru

leucină+valină+izoleucină în condiții fiziologice = 3-3,5 ng/ml, în hepatopatiile cronice scade

fenilalanină + tirozină

la 1,5-2 ng/ml, iar în comă = 0,8 ng/ml (208). La lotul nostru acest raport a fost de 2,74 ng/ml

Evaluarea psihometrică a celor opt pacienți i-a încadrat astfel:

4 (50%) pacienți în stadiul II al encefalopatiei porto-sistemice

2 (25%) pacienți în stadiul III al encefalopatiei porto-sistemice

Doi dintre pacienții lotului 4 s-au situat între stadiul I și II de encefalopatie porto-sistemică, prezentând tulburări coportamentale, emotive, iar alteori apatie și depresie, fără însă a prezenta semne neurologice.

Tabelul 23. Examinările bioumorale de start la lotul 4

Acumularea și creșterea nivelului aldehidei în encefalopatia hepatică este considerată ca un aspect patognomonic al bolii hepatice asociate cu stresul oxidativ. (52)

Aldehidele sunt produșii finali, majori ai peroxidării lipidice. Ele sunt puternic electrofilice și reacționează cu biomolecule, cum ar fi proteinele și acizii nucleici, generând diverși aducți. Nivelele înalte de aducte aldehide au fost detectate în lipoproteinele oxidate urmarea stresului oxidativ din unele organe, ca manifestări aterosclerotice, boală aterială coronariană, dar și creierele pacienților cu Alzheimer. Pe plan fiziopatologic, adițional efectului patogen asociat stresului oxidativ, nivelele înalte de aldehide interacționează cu sistemele de semnalizare și reglează superior expresia genei pentru a contracara provocarea stresorilor și pentru a reface homeostazia.

Incidența encefalopatiei hepatice este în general mică ca și complicație a cirozei hepatice de etiologie virală B sau C. Într-un studiu (67) pe 385 de cazuri de ciroză hepatică compensate, supravegheați cel puțin 24 de luni, cu dovezi ale infecției virale B și C (254 prezentau în ser Ac anti-VHC, iar 131 aveau AgHBs), au fost biopsiați hepatic și urmăriți pe o perioadă de 10 ani, la interval de 5 și 10 ani. Incidența complicațiilor cirozei a fost următoarea:

– 78 de pacienți (30,7%) din cei 254 cu Ac anti-VHC au prezentat din complicații

– 43 (34,8%) de pacienți din cei 131 cu AgHBs au prezentat din complicații

Incidența cumulată la 5 și 10 ani de monitorizare a fost pentru:

Atât ordinea ierarhică a incidenței, cât și numărul celor afectați, arată că encefalopatia hepatică este o complicație minoră sub acest aspect, dar sub aspectul complexității fiziopatologice a manifestărilor clinice și consecințelor prognostice, ea trebuie tratată cu multă responsabilitate. Într-un alt studiu (212), în care au fost incluși doar pacienți cu ciroză hepatică compensată, determinată de infecția cu VHC, incidența totală a evenimentelor petrecute ca primă complicație a fost de 8% pentru hepatocarcinom, 8% pentru ascită, 3,6% pentru hemoragia variceală și 1,3% pentru encefalopatie.

Dacă ar fi să judecăm după rezultatele procentuale ale encefalopatiei hepatice legate de tipul infecției, atunci la 10 ani (în studiul 67), 5% din cei cu AgHbs au prezentat encefalopatie hepatică, în vreme ce doar 2,5% din pacienții descinși din ciroza hepatică virală C au prezentat encefalopatie hepatică..

Și în cazul studiului nostru, pacienții au fost calificați în funcție de prezentarea lor la consultațiile de specialitate și diagnosticați clinic și morfologic prin puncție biopsie hepatică alături de valorile bioumorale și ecografice, astfel raportul între etiologia cirozei, pozitivă pentru VHC a fost de 5 (62,5%) față de ciroza secundară infecției cu AgHBs, de 3 (37,5%). Acest lucru corespunde cu etiologia encefalopatiei hepatice a lotului 4 – raport apropiat de alte studii similare din literatura medicală de specialitate.

Cu toate acestea encefalopatia hepatică devine tot mai comună pe măsură ce prevalența cirozei crește (207). Patogeneza encefalopatiei hepatice însă nu este clar definită, de aici relația sa cu ciroza hepatică, care în mod practic generează pașii bio-umorali și morfologici spre deteriorarea metabolică generală, cu apariția de derivați neurotoxine. Consensul general este la ora actuală că nivelele ridicate ale amoniacului și o reacție inflamatorie acționează sinergic pentru a produce balonizarea astrocitelor și acumularea fluidului în creier (edemul cerebral), ceea ce se crede că ar explica simptomele encefalopatiei hepatice. (208).

Insuficiența hepatică din ciroză furnizează ca produs secundar al metabolismului azotat, amoniacul, care sporește pe măsura deteriorării funcției metabolice a hepatocitelor, devenind tot mai toxic, motiv pentru care el trebuie îndepărtat din corp. Acest proces se realizează prin formarea ureei în ficat, din care o parte se metabolizează în creier și mușchi. Expunerea subită a astrocitelor la concentrații mari de amoniac în cursul insuficienței hepatice acute (echivalentul tipului A de encefalopatie hepatică) rezultă în eliberarea de glutamat, care contribuie la creșterea activității neuronale. Deoarece glutamatul este un neurotransmițător excitator, se crede că este responsabil pentru modificările clinice observate în encefalopatia hepatică, în fazele inițiale, incluzând agitația, confuzia, iar mai târziu în evoluție, convulsiile și coma. (214)

Markerii stresului oxidativ sunt sporiți în cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică. Experimental s-a arătat că expunerea la amoniac induce stres oxidativ în culturile de astrocite la animalul de experiență. Insuficiența hepatică acută cu creșterea de amoniac a indus stres oxidativ în creier. (215).

Ca urmare a reacției de stres oxidativ/nitrozativ apare PTN și oxidarea ARN-ului cu sporirea formării de 8-hidroxignanozina (216). Acești markeri ai stresului oxidativ au fost analizați în țesutul cerebral uman postmortem, iar rezultatele sunt deosebit de ilustrative. Astfel PTN proteinelor individuale cu masă moleculară în intervalul dintre 20 și 75 Kda a fost semnificativ sporit în eșantioanele cerebrale de la pacienți cu encefalopatie hepatică comparativ cu subiecții de control; mai mult, ARN-ul total extras din cortexul cerebral al pacienților cu encefalopatie hepatică a prezentat o creștere de două ori mai mare a nivelelor de ARN oxidat față de subiecții de control. Aceste date sugerează prezența stresului oxidativ în creierul pacieților cu ciroză hepatică și encefalopatie hepatică (215, 216). În concordanță cu aceste rezultate a fost evidențiată expresia proteinică a micii proteine – 27 a șocului termic (Hsp – 27), un marker binecunoscut și frecvent întâlnit în stresul oxidativ, de patru ori mai crescut în cortexul cerebral al pacienților cirotici, cu encefalopatie hepatică, față de subiecții de control (215).

Pe de altă parte nivelul proteinic al sintazei neuronale a oxidului de azot și a enzimelor antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza dependentă de cupru/zinc și cea dependentă de mangan, nu au fost semnificativ sporite, în creierul pacienților cu encefalopatie hepatică atunci când s-au comparat cu grupul de control.

Expresia markerilor stresului oxidativ co-transportatorilor glutamat aspartat (GLAST) și glutaminsintetaza (GS) în țesutul cerebral post-mortem a fost corelată cu datele de laborator în vivo, care au fost obținute în cursul perioadei de 24 ore dinaintea decesului, disponibile la 6 pacienți din studiu. (103). Au fost găsite corelații semnificative statistic între: blirubinemia serică și activitatea glutamin sintetazei (GS) în cortexul cerebral, concentrația sodiului seric și proporția oxidării ARN-ului în creier, imunoreactivitatea 8-hidroxiguanozinei (8-OHG), ureea serică și nivelul expresiei GLAST (103).

Expresia stresului oxidativ în creierul celor cu encefalopatie hepatică este întărită semnificativ de nivelul sporit, de 4-5 ori mai mult, față de subiecții de control a Hsp-27, care apare în regiunile cerebrale ischemice perilezionale. Eșantioanele cerebrale de la pacienții cu encefalopatie hepatică au prezentat nivele semnificativ crescute ale proteinelor tirozinice nitrate (PTN) și ale ARN-ului oxidat, ambii parametrii fiind markeri surogat binecunoscuți pentru stresul oxidativ. Aceste modificări nu au fost găsite în eșantioanele cerebrale de la pacienții cu ciroză hepatică, dar fără encefalopatie hepatică, ceea ce indică faptul că stresul oxidativ/nitrozativ este o caracteristică a encefalopatiei hepatice, dar nu și a cirozei (217,218).

Proporția oxidării ARN-ului cerebral se corelează pozitiv cu hipoosmolaritatea sodiului, care induce oxidarea ARN-ului din astrocite. Este posibil ca hiponatremia (hipo-osmolaritatea) să nu fie cauza encefalopatiei hepatice, ci mai degrabă consecința sa, prin intermediul inflamației structurilor hipotalamo-hipofizare, care favorizează secreția inadecvată de vasopresină, în sensul scăderii acesteia, cu scăderea reabsorbției apei la nivel renal. Este o corelație pozitivă între gradul hiponatremiei și severitatea encefalopatiei hepatice în contextul sporirii acțiunii stresului oxidativ prin acțiunea hiperamoniemiei progresive legată de degradarea severă a hepatocitelor și scăderea lor numerică (219). Este o interdependență corelată pozitiv între gradul encefalopatiei hepatice și intensitatea proceselor oxidative generate de stresul oxidativ (219), manifestate la nivelul astrocitelor cerebrale.

Lotul nostru de studiu (nr.4) a fost format din 8 pacienți cu ciroză hepatică și encefalopatie hepatică calificați etiologic astfel: 5 (62,5%) cu Ac anti-VHC, 2 (25%) cu AgHBs și un pacient a avut etiologie etanolică (12,5%).

Efectele stresului oxidativ asupra encefalopatiei hepatice corelat cu etiologia cirozei va fi prelucrat în continuarea studiului.

2.1.5. Examinările lotului de control (5) – 15 pacienți

Fără excepție, atât rezultatele valorilor tensiunii arteriale, EKG, imagistice și bioumorale s-au înscris în limitele intervalului normal, motiv pentru care nu am desfășurat grafice sau tabele spre a le ilustra. Conform metodologiei de desfășurare a studiului, toți pacienții au beneficiat de un număr de patru examinări clinice, imagistice și bioumorale. Examinarea de start este cea mai complexă. După obținerea rezultatelor de start s-a făcut o evaluare diagnostică și clinică cât mai completă, acesta fiind și examenul de referință față de care ne-am raportat și cu care am comparat rezultatele din cursul monitorizării și în final.

Pacienții au fost din nou examinați la șase luni, un an și doi ani. La aceste sesiuni s-a insistat pe urmărirea valorilor patologice identificate la start și dezvoltarea lor, a identificării unor alte manifestări specifice diagnosticului inițial. La nevoie, tabloul investigațiilor s-a extins CT, RMN, biopsii etc..

Toate examinările clinice care au necesitat intervenția unor alte specialități în scop diagnostic s-au efectuat la momentul oportun. Tratamentele necesare au fost efectuate, urmărite și evaluate de noi. La externare, pacienții incluși în studiu au fost însoțiți de scrisori metodologice pentru medicul de familie, iar intervenția noastră a fost promptă la orice solicitare a acestora după externare, astfel că monitorizarea a avut un caracter continuu, timp de 24 de luni.

2.2.0. EVALUAREA DIAGNOSTICĂ DUPĂ EXAMENUL DE START PE LOTURILE DE STUDIU

2.2.1. Lotul 1 – total pacienți: 23

Diagnostic: hepatită cronică

-etiologie: 12 pacienți cu hepatită cronică virală C

4 pacienți cu hepatită cronică virală

7 pacienți cu hepatită cronică etanolică

– examenul TA: 5 pacienți cu TA < 110/70 mmHg

13 pacienți cu TA în limita convențională a normalului 140/90

5 pacienți cu TA > 140/90 mmHg

– examenul EKG: 14 pacienți cu traseu EKG normal

2 pacienți cu extrasistole ventriculare

2 pacienți cu bloc de ramură stângă

3 pacienți cu ischemie subendocardică (3 derivații)

2 pacienți cu ischemoleziuni în 4 derivații fără corespondent clinic

– examenul ecografic al ficatului:

– 20 pacienți cu hepatomegalie:

– la 6 pacienți o ecostructură omogenă

– la 4 pacienți o ecostructură difuz inomogenă

– la 8 pacienți îngroșarea pereților vezicii biliare;

– la 2 pacienți steatoză hepatică ușoară

– la 5 pacienți steatoză hepatică moderată

– la 3 pacienți steatoză hepatică severă

Puncția hepatică (motivație) – deși metodele moderne au capactitatea de diagnostic noninvaziv, în cele mai multe stadii ale evoluției proceselor hepatice, în procesele difuze hepatice, investigația „in vivo” este de mare valoare prin facilitarea unei examinări histologice, histochimice, enzimatice, imunologice și biochimice a fragmentului de țesut hepatic obținut în urma unei manevre țintit dirijate.

Tehnica și manevra Manghini, care utilizează o trusă specială garantează actul intervențional, care pregătit cu grijă și în deplină cooperare cu pacientul aduce mari beneficii diagnostice.

Pentru eliminarea posibilelor incidente se utilizează un trocar cu diametru de 1,2-1,6 mm, de regulă de 1,6 mm, lung de 7-10 cm, al cărui vârf este oblic spiral, cu mandren obturator foarte mobil în lumenul acului și un stilet pentru incizarea peretelui toracic sau abdominal.

– anestezia cu xilină 1% a tegumentelor, țesutului subcutanat, peritoneului și capsulei hepatice

– puncția rapidă a ficatului cu acul conectat la seringă și aspirarea de țesut hepatic

– expulzarea fragmentului extras, într-un lichid fixator.

Indicația majoră este recunoașterea sau infirmarea caracterului activ al hepatitelor cronice și cirozelor hepatice, pentru stabilirea atitudinii terapeutice. Rezultatele analizelor de la examinarea fragmentelor de țesut hepatic extras prin puncție bioptică stabilesc o anumită ierarhizare în evoluția hepatitei sub raport morfopatologic, după cum urmează:

Stadiul I – distrugerea canalelor biliare interlobulare, granuloame

II – proliferare canaliculară

III – fibroză

IV – ciroză (233)

Puncția hepatică (rezultat) – hiperplazie de țesut conjunctiv, inter și intralobular, distrofii hepatocelulare, asociate cu procese regenerative. Țesutul conjunctiv are celularitate fibroblastică, fibrocitară, bogat în vase de neoformație. Reacție mezenchimală cu prezența de infiltrate inflamatorii limfo-plasmocitare la nivelul spațiilor portale și de-a lungul septurilor fibroase ce reprezintă o continuare a activității procesului cirogen. Pe alocuri apar alterări infrastructurale în hepatocite, tumefierea mitocondriilor, reticul endoplasmatic granular și benzi de colagen cu caracter infiltrativ disecant interhepatocitar.

puncția hepatică a fost efectuată la doi dintre pacienții cu infecție cronică virală C, depistați cu Ac anti-VHC în urmă cu 7 ani, cu repetate internări în serviciul nostru

Rezultatul puncției hepatice: destructurare progresivă a țesutului hepatic sub raport histologic și histochimic după agresiune mezenchimală activă. Numeroase limfocite și plasmocite. Multiple necroze hepatocitare. Multiple imunoglobuline IgG în zona perinecrotică. Rare zone cu depunere de fibrină.

– examenul bioumoral:

anemie normocromă 7 femei

11 bărbați

trombocitopenie și leucopenie = 5 pacienți

markerii virali pozitiv : Ac anti VHC = 12 pacienți

AgHBs = 4 pacienți

glicemia < 70 mg/dl = 8 pacienți

albumina serică < 3,5/dl = 9 pacienți

GGT > 38 U/l = 12 pacienți

PT = > 12,5 sec = 4 pacienți

< 11 sec = 9 pacienți

Proteina C-reactivă > 1 mg/dl = 10 pacienți

Alfafetoproteina > 40 ng/ml = 6 pacienți

Feritina > 300 ng/l = 7 pacienți

Sideremia > 180 μg/dl = 11 pacienți

Creatinemia serică > 0,7 mg/dl = 7 pacienți

GOT-GPT 40-76 U/L = 6 pacienți

Fosfataza alcalină >120 U/L = 9 pacienți

Colesterolul total < 200 mg/dl = 12 pacienți

LDL > 180 mg/dl = 6 pacienți

Bilirubinemia totală > 1 mg/dl = 7 pacienți

directă > 0,3 = 14 pacienți

Malondialdehida = 1,24-4,9 μmol/l = 11 pacienți

5 – 11,4 μmol/l = 6 pacienți

Superoxid dismutaza > 1800 U/gHg = 12 pacienți

Glutation peroxidaza < 4 171 = 7 pacienți

> 10 881 = 9 pacienți

La șapte pacienți cu hepatită cronică activă cu comemorative etanolice de peste 7 ani, susținute prin hepatomegalie și cu steatoză importantă, endoscopic s-au decelat varice esofagiene grad I. Tot la aceștia, pancreasul avea un aspect hiperecogen, inomogen, redus de volum, cu duct Wirsung dilatat (peste 3 mm).

Bioumoral, anemie marcată, un GGT mult crescută, un sindrom de hepatocitoliză marcată , pe seama GOT-ului, cu raport de Rittis subunitar. Toate acestea comfirmă diagnosticul de hepatită cronică etanolică la acești 7 pacienți. Impactul stresului oxidativ este mai puțin vizibil față de hepatita cronică virală C. Numai la 5 pacienți MDA a fost prezentă în valoare mai mare de 1,8 μmol/l.

Stresul oxidativ s-a dovedit pozitiv asociat la 6 pacienți cu hepatită cronică virală C și la 2 pacienți cu hepatită cronică virală B, respectiv la 3 cazuri de hepatită cronică etanolică, la care nivelul procesului de citoliză hepatică (GOT – GPT) a fost mai mare de 7 ori față de normal. Asocierea reacțiilor inflamatorii cu proteina C-reactivă mai mare de 6 mg/dl și leucocitoză, însoțite de un grad semnificativ de anemie și trombocitopenie, bilirubinemie totală și directă crescute contribuie sinergic la stresul oxidativ.

Corelația pozitivă între intensitatea stresului oxidativ susținută de nivelul seric înalt al Malondialdehidei la șase pacienți cu hepatită cronică virală C, la 2 bolnavi cu hepatită cronică virală B, și la 3 cazuri de hepatită cronică etanolică, precum și nivelul crescut al GOT, GPT, BT și BD explică progresia acestor cazuri spre ciroza hepatică și accentuarea unor procese hiperactive histochimic, care au pregătit posibil terenul pentru hepatocarcinom pentru că la sfârșitul perioadei de monitorizare aceste cazuri s-au situat ca manifestare clinică, citologică, ecografică, endoscopică, între o hepatită cronică ultimul stadiu și un început de ciroză hepatică pe de o parte, respectiv carcinom hepato-celular pe de altă parte sub raportul imaginii ecografice a ficatului.

Grafic 1. Numărul pacienților pe grupe de vârstă și sexe

Grafic 2 Diagnosticul etiologic al hepatitei cronice

Grafic 3. Forme clinico-evolutive ale hepatitei cronice, în funcție de:

-persistența sindromului astenic,

-persistența AgHBs sau a Ac anti-HVC,

– creșterea gamaglobulinelor, mai ales a Ig G

Grafic 4. Dispersia pe număr de bolnavi la examenul de start a valorilor de citoliză, inflamației și stres oxidativ la pacienții cu hepatită cronică

Sindromul citolitic: GOT 55-100 U/L = 3 pacienți; 100-178 U/L = 7 pacienți

GPT 67-100 U/L = 9 pacienți; 100-198 U/L = 12 pacienți

Sindromul inflamator: proteina C-reactivă: 1-3 mg/dl =6 pacienți; 5-14 mg/dl =7 pacienți

Stresul oxidativ: Malondialdehida (MDA): 1,66-5 μmol/l = 11 pacienți

6-17 μmol/l = 7 pacienți

> 17 μmol/l = 5 pacienți

Grafic 5. Valoarea enzimelor antioxidante la start

Superoxid dismutaza: < 1200 U/gHg = 5 pacienți; 1 200-1 800 U/gHg = 12 pacienți;

1 800-2 300 U/gHg = 6 pacienți

Glutation peroxidaza: < 10 881 U/L = 6 pacienți; 10 881-12 300 = 5 pacienți;

> 12 300 U/L = 3 pacienți

Lotul II

2.2.2.Evaluarea diagnostică după examenul de start a lotului 2:

Diagnostic: ciroză hepatică

Total pacienți în studiu 14: femei 5, bărbați 9

-etiologie: 6 pacienți cu ciroză hepatică virală C

5 pacienți cu ciroză hepatică virală B

3 pacienți cu ciroză hepatică etanolică

– examenul TA: 3 pacienți cu TA < 110/70 mmHg

8 pacienți cu TA în limita convențională a normalului 140/90

3 pacienți cu TA > 140/90 mmHg

– examenul EKG: 8 pacienți cu traseu EKG normal

2 pacienți cu extrasistole ventriculare LOWN 1

4 pacienți cu ischemo-leziune subendocardică fără corespondent clinic anginos

– examenul ecografic al ficatului:

– 11 pacienți cu hepatomegalie:

– la 11 pacienți contur neregulat al feței inferioare

– la 7 pacienți o ecostructură profund inomogenă

– la 5 pacienți o ecostructură ușor inomogenă

– la 8 pacienți venă portă de calibru crescut ( peste 13 mm)

– la 7 pacienți steatoză hepatică severă

– la 3 pacienți steatoză hepatică moderată

– la 4 pacienți steatoză hepatică ușoară

– la 5 pacienți cantitate mică de lichid de ascită

– endoscopia digestivă superioară:

– la 6 pacienți endoscopic nu s-a evidențiat prezența varicelor esofagiene

– la 3 pacienți s-au evidențiat varice esofagiene grad I

– la 3 pacienți s-au evidențiat varice esofagiene grad II

– la 3 pacienți s-au evidențiat varice esofagiene grad III

Puncția hepatică a fost efectuată la doar 3 pacienți cu evoluție subferilă prelungită și elemente de encefalopatie hepatică, la care s-a suspicionat debutul unui hepatocarcinom, însă fără elemente ecografice sugestive; s-a extras un eșantion cu țesut fibros și depozite de țesut conjunctiv și necrotic, țesut fibroblastic cu prezența de fibre subțiri, ce indicau o fibroză progresivă.

Examenul bioumoral:

Ig A > 350,40 mg/dl = 4 pacienți

Ig M > 105,50 mg/dl = 2 pacienți

Ig G > 2100 mg/dl = 6 pacienți

LDH > 190 U/L = 9 pacienți

GOT > 50 mg/dl =7 pacienți

GPT > 70 mg/dl =7 pacienți

GGT > 70 U/L = 8 pacienți

Fosfataza alcalină > 390 U/L = 9 pacienți

Proteine totale < 6 g/dl =9 pacienți

Albumina serică < 3,5 g/l = 7 pacienți

CRP > 3 mg/dl = 6 pacienți

Bilirubina totală > 1,22 mg% = 7 pacienți

directă > 0,85 mg% = 8 pacienți

Hgb < 10 g/dl = 7 pacienți

Ht < 35% = 9 pacienți

Trombociți < 135 000 = 11 pacienți

Leucocite < 5 000/mmc = 10 pacienți

Colesterolul total < 150 ng/dl = 7 pacienți

Glicemia < 90 mg/dl = 7 pacienți

Colinesteraza serică > 8 U/l = 6 pacienți

Creatinemia > 1,4 mg/dl = 4 pacienți

Potasiu > 5 mEq = 6 pacienți

Sodiu < 130 mEq/l = 8 pacienți

PT (sec) < 11 = 7 pacienți

Feritina 10-300 μg/L = 4 pacienți

> 300 μg/L = 7 pacienți

VSH > 30/h

Malondiladehida > 2,60 μmol/l la 7 pacienți

Este dificil de stabilit histo-biochimic și enzimatic dacă acesta este un stadiu al evoluției cirozei hepatice sau o complicație a acesteia.

Deteriorarea metabolică generată progresiv în cadrul insuficienței hepatice agravate, cu invazia unor metaboliți toxici ce depășesc ușor bariera hemato-encefalică în cadrul hipertensiunii portale duce la afectarea neuronală și a astrocitelor, cu dezvoltarea encefalopatiei hepatice (hiperamoniemie, hiponatremie, hipoglicemie, etc.)

Apariția unor simptome psihiatrice discrete, dar persistente, și unele tulburări comportamentale dar și neurologice la 2 din pacienții noștri, din faza inactivă, arată o dezvoltare a manifestărilor de encefalopatie hepatică de tip porto-sistemic.

Puncția biopsie efectuată la acești 2 pacienți a evidențiat depunerea crescută de fier în hepatocite, alături de o fibroză marcată.

Consecința fiziopatologică a acestor manifestări anatomo-histopatologice este:

apariția icterului (la patru pacienți);

deficit hepatocelular în sinteza factorilor coagulării (fibrinogen, protrombină, factorul V și VII);

hipoalbuminemia;

insuficiența detoxifierii și apariția unor dereglări hormonale cu tulburări neuro-endocrine

hiposerinemie < 2,5 g%, trombocitopenie

Hipertensiunea portală, urmarea obstacolului porto-sinusoidal, realizat și de nodulii regenerativi și de procesul de fibroză, antrenează circulația colaterală abdominală și periombilicală. Se dezvoltă progresiv splenomegalia ca urmare a hipertrofiei reticulului splenic, ceea ce antrenează apariția și dezvoltarea ascitei.

Tulburările electrolitice, ca hiponatremia și hipopotasemia, sunt legate de deficitul de volum sanguin circulant și de disfuncția aldosteronului și a antagonoșitilor săi, dar mai semnificativ este rolul vasopresinei, datorită căreia se pierde capacitatea de diluție a urinii. (223).

Complicația majoră în ciroza hepatică: hemoragia digestivă și encefalopatia hepatică.

Reprezentarea grafică a rezultatelor examinărilor de start la lotul 2 (ciroza hepatică)

Grafic 6. Structura pe sexe și grupe de vârstă.

Grafic 7. Distribuția pacienților în funcție de etiologia cirozei hepatice

6 pacienți cu ciroză hepatică virală C

5 pacienți cu ciroză hepatică virală B

3 pacienți cu ciroză hepatică de etiologie etanolică

Grafic 8. Forme clinice în raport cu evoluția cirozei

forma de ciroză activă (infiltrat inflamator agresiv)

forma de ciroză inactivă (proces cirotic septal cu hepatomegalie fără proces inflamator)

forma de adenocarcinoză (zone de țesut neoplazic proeminând pe suprafața ficatului cirotic)

Grafic 9. Complicații ale cirozei hepatice

Grafic 10. Distribuția unor valori bioumorale la start în cazul lotului 2

GOT = 35-150 U/L = 5 pacienți; 150-504 U/L = 9 pacienți

GPT = 35-100 U/L = 3 pacienți; 105-250 U/L = 11 pacienți

PCR 3-15 mg/dl = 7 pacienți

Grafic 11. Fosfataza alcalină, alfafetoproteină și malondialdehida

Grafic 12.Enzimele antioxidante și Feritina

Elementele bioumorale care însoțesc dezvoltarea unor complicații în evoluția cirozei și care se asociază pozitiv ca elemente predictorii ținând cont de intricarea procesului degenerativ, fibrotic, colagenos, cu cel inflamator și regenerativ sunt: fosfataza alcalină, Proteina C-reactivă, alfa-fetoproteina, alanilaminotransferaza și malondialdehida ca expresie a stresului oxidativ. Toate aceste enzime sau proteine se pot doza din serul sanguin pe parcursul evoluției procesului cirotic, oferindu-ne prin nivelul lor tendința, ritmul și intensitatea progresiei bolii.

Lotul III

2.2.3. Evaluarea diagnostică după examenul de start a lotului 3

Diagnostic: hepatocarcinom

Total pacienți în studiu: 11 pacienți din care 6 femei și 5 bărbați

etiologie: 6 pacienți cu infecție cronică virală C

3 pacienți cu infecție cronică virală B

2 pacienți cu etiologie etanolică

– examenul TA: 2 pacienți cu TA < 110/70 mmHg

7 pacienți cu TA în limita convențională a normalului 140/90

2 pacienți cu TA > 140/90 mmHg

– examenul EKG: 7 pacienți cu traseu EKG normal

1 pacienți cu extrasistole ventriculare LOWN 1

3 pacienți cu ischemo-leziune subendocardică fără corespondent clinic anginos

– examenul ecografic al ficatului:

– 3 pacienți cu ficat de aspect cirotic, cu o singură imagine hiperecogenă solitară în lobul drept

– 3 pacienți cu ficat de aspect cirotic, cu multiple imagini hiperecogene în lobul drept

– 4 pacienți cu ficat de aspect cirotic, cu multiple imagini hiperecogene, de dimensiuni variabile, diseminate în ambii lobi hepatici

– l pacient cu o imagine solitară hiperecogenică în lobul stâng hepatic

– 5 pacienți prezentau lichid de ascită

– endoscopia esofagiană: 1 pacient cu varice esofagiene grad I

3 pacienți cu varice esofagiene grad II

7 pacienți cu varice esofagiene grad III

puncția biopsie hepatică (efectuată înainte de internarea în spitalul nostru) – a evidențiat zone cu reacție abundentă a stromei și neoformații vasculare, în centru cu septuri conjunctive, cu zone cu necroză și hemoragii printre plajele de țesut fibros abundent.

examenul bio-umoral în hepatocarcinom:

fosfataza alcalină > 215 U/L = 9 pacienți

proteina C-reactivă > 5 mg/dl = 8 pacienți

alfa fetoproteina > 300 ng/dl = 9 pacienți

alanilaminotransferaza > 60 mg/dl = 11 pacienți

malondialdehida 2,6-4 μmol/l = 7 pacienți

4,2-6,6 μmol/l = 4 pacienți

natremia < 130 mEq/dl = 9 pacienți

bilirubina totală > 1,8 ng/dl =5 pacienți

directă > 1,14 mg/dl = 7 pacienți

feritina serică > 300 mg/dl = 7 pacienți

glicemia 70-95 mg/dl = 4 pacienți

GGT > la 11 pacienți

AgHBs pozitiv = 3 pacienți

Ac anti –VHC pozitivi = 6 pacienți

În procesul de carcinogeneză hepatică, un rol major îl are stresul oxidativ. Dacă ținem cont de multiplele leziuni hepatice instalate în contextul complex al agresiunii virale, și concomitent a altor toxice, asocierea agresivă a stresului oxidativ marchează defavorabil și chiar hotărâtor dezvoltarea proceselor specifice hepatocitare. Pornind de la peroxidarea lipidică, mecanism major de determinare a leziunilor celulare, continuând cu oxidarea acizilor grași polinesaturați și formarea unor specii reactive de oxigen și produși toxici, până la acumularea de radicali liberi, acizi grași, care în mod normal ar fi supuși β oxidării în mitocondiile celulare, va rezulta ca produs final malondialdehida (MDA). Malondialdehida este alcătuită din trei atomi de carbon, este intens reactivă și apare în toate celulele mamiferelor în urma proceselor de peroxidare a acizilor grași polinesaturați ca și din metabolizarea acidului arahidonic (biosinteza prostaglandinelor și a tromboxanului).

Malondialdehida se leagă covalent la grupurile „amino” ale proteinelor, lipoproteinelor sau ADN-ului și reacționează cu acesta din urmă (ADN) pentru a forma malondialdehid deoxiguanozine și deoxiadenozine, însă compusul principal este pirimidopurinona numită „M1G” care poate contribui semnificativ la apariția cancerului, cu ajutorul determinant al unor factori dietetici (alimentari). Spre deosebire de radicalii liberi, aldehidele sunt relativ stabile și pot difuza prin membrane, acționând la distanță de locul originar al radicalilor liberi. Astfel proteinele modificate pot prezenta alterări structurale ale antigenității și comportamentului fizico-chimic. Deși malondialdehida poate fi inactivată de aldehid-dehidrogenaze, producerea ei este foarte dinamică, determinată de stresul oxidativ, iar când ajunge la nivele critice ea scapă de sub controlul detoxifierii. Prin efectele ei este toxică, fiind implicată în procesele de mutageneză la persoanele vârstnice și are un caracter puternic carcinogenetic. Fiind întâlnită în multe probe biologice (ser, plasmă, urină, țesuturi) sau chiar alimente, este unul dintre cei mai folosiți indicatori (markeri) pentru a estima efectele stresului oxidativ asupra lipidelor.

Nivelul stresului oxidativ exprimat prin valoarea serică a malondialdehidei la cei 11 pacienți din studiul nostru cu hepatocarcinom este pozitiv asociată cu alfa fetoproteina, fosfataza alcalină, proteina C-reactivă și inconstant în stadiile de început cu alanilaminotransferaza și factorul alfa al necrozei tumorii (TNF-alfa).

Diferite mecanisme incluzând deteriorarea hepatică imunologică, citotoxicitatea directă mediată de diferiți produși virali și inducerea stresului oxidativ, au un rol în procesul carcinogenetic din hepatocitul infectat viral. Mai multe tipuri de dovezi susțin aceste aserțiuni:

existența ciclului glutationei activate,

prezența nivelelor crescute ale produșilor peroxidării lipidice,

depozitele sporite de fier din ficat,

valorile scăzute ale glutationei din eritrocite și celulele mononucleare sanguine periferice.

Ba chiar mai mult, s-a arătat că pacienții cu hepatită cronică virală C prezintă o producție crescută a factorului alfa al necrozei tumorale (TNF-alfa), o citokină care poate produce stres oxidativ prin stimularea generării de specii reactive de oxigen (ROS), cum ar fi ionul de superoxid (O2) și peroxidul de hidrogen (H2O2). Speciile reactive de oxigen pot deteriora celula hepatică prin inducerea peroxidării lipidice, distrugerii oxidative a ADN-ului, a proteinelor și prin scăderea depozitelor de ATP. În prezența metalelor (cum ar fi F3+), O2 poate reacționa cu H2O2, generează radicalul hidroxil și devine chiar mai reactiv și mai citotoxic decât O2 sau H2O2.

Cele mai multe studii care au investigat peroxidarea lipidelor au lucrat cu extracte de sânge și țesut prin metode indirecte, cantitative; testul acidului tiobarbituric a fost cel mai comun aplicat în acest scop. Folosind această procedură a fost observată o creștere a malondialdehidei în ser și în ficatul pacienților cu hepatită cronică virală C. Recent au fost identificați anticorpi specifici împotriva malondialdehidei (MDA) și 4-hidroxinonenalului (HNE).

Celulele sunt protejate împotriva lezării oxidative de către produșii antioxidanți naturali, în special glutationa, și de diverse enzime antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT) și glutation peroxidaza (GSH-Px). Deși mecanismele imunologice au dominat patogeneza hepatitelor virale și a complicațiilor lor cirogene și carcinogenetice, în ultimele decenii stresul oxidativ domină cercetarea clinică și de grup în acest domeniu, cu explicații deosebit de pertinente din punct de vedere științific.

Într-un studiu (54) au fost evaluați imunohistochimic markerii stresului oxidativ în hepatită cronică virală B și C, precum și complicațiile acestora. Acest studiu a detectat prezența stresului oxidativ în specimenele serice și bioptice hepatice de la pacienți cu hepatită cronică virală B și C. Moleculele oxigenului reactiv au fost comparate în serul a 54 de pacienți cu cele provenind de la și de subiecți de control. Au fost măsurați markerii stresului oxidativ (8-Ohd-G) – 8 hidroxideoxiguanoazina, 4-hidroxi-2-nonenal, malondialdehida și tioredoxina cu specimenele biopsiei hepatice de la 18 pacienți cu hepatită cronică virală C. Au fost de asemenea evaluate apariția carcinomului hepatocelular în prezența markerilor stresului oxidativ. În specimenele bioptice hepatice, markerii stresului oxidativ au fost descoperiți, în special, în jurul zonei de necroză parțială sau a zonei periportale. Markerul 8-Ohd-G al deteriorării ADN-ului, datorate stresului oxidativ a fost detectat în nucleul hepatocitelor. Prezența markerilor stresului oxidativ pare să sporească odată cu faza de fibroză. În cursul unei supravegheri de patru ani, 4 pacienți cu dezvoltat hepatocarcinom care nu a răspuns la terapia cu interferon într-un grup de 13 pacienți supuși acestei terapii.

Markerii stresului oxidativ au fost găsiți în ser, fragmentele bioptice, în țesuturile carcinomatoase, etc. Acești markeri servesc la monitorizarea progresiei bolii, iar terapia asociată antioxidantă și antivirală ar putea ajuta la prevenirea ulterioară a hepatocarcinomatozei.

În studiul nostru valoarea markerilor stresului oxidativ a sporit, în paralel cu deteriorarea funcțiilor metabolice ale ficatului și dezvoltarea procesului inflamator, anemiei și conflictului imunitar deficitar pe un teren cu hipoproteinemie și hipoalbuminemie.

Față de această situație de start, lotului 3, cu hepatocarcinom, a urmat monitorizarea la interval de 6,12 și 24 de luni, când s-a făcut și evaluarea finală.

Grafic 13. Reprezentarea grafică a unor rezultate ale examenului de start al lotului 3

Grafic 14. Distribuția în funcție de etiologie a cazurilor de hepatocarcinom

Grafic 15. Rezultatul examenului EKG de start la lotul 3

Grafic 16. Examenul endoscopic esofagian al lotului 3

A = varice esofagiane grad I

B = varice esofagiane grad II

C = varice esofagiane grad III

Grafic 17. Expresia grafică a unor markeri bio-umorali, p=0.034 *

Grafic 18. Expresia grafică a unor markeri bio-umorali, p=0,000125 ***

Grafic 19. Reprezentarea relației oxidare – antioxidare pe număr de pacienți la start, p=0,033 *

Grafic 20. Procesul de citoliză și retenție biliară

Lotul IV

2.2.4. Rezultatele examinărilor de start la lotul 4 (encefalopatia hepatică): 8 pacienți

Encefalopatia hepatică este definită ca o tulburare metabolică reversibilă ce apare la pacienții cu boală acută, subacută sau cronică a ficatului (225).

Clasificarea sistemului encefalopatiei hepatice a fost concepută la Congresul de Gastroenterologie de la Viena, din 1998 (231) și se prezintă după cum urmează:

Tipul A: Encefalopatia hepatică asociată cu insuficiența hepatică acută;

B: Encefalopatia hepatică la pacienți cu by – pass porto-sistemic (fără boală hepatocelulară intrinsecă)

C: Encefalopatie hepatică asociată cu ciroza hepatică, hipertensiunea portală sau șunt porto-sistemică.

Aceasta din urmă se divide în trei tipuri:

C1 = encefalopatia episodică, spontană sau precipitată,

C2 = encefalopatia hepatică persistentă, dependentă de tratament,

C3 = forma minimală de encefalopatie hepatică

Manifestările neuropsihice ce se dezvoltă în cadrul encefalopatiei hepatice au fost sistematizate în patru grade clinice:

Gradul I: bolnav letargic și confuz

II: bolnav somnolent și dezorientat

III: bolnav aflat în stare stuporoasă, vorbind nearticulat

IV: bolnav comatos, uneori cu semne extrapiramidale

Cât privește encefalopatia hepatică minimă, aceasta este o manifestare ușoară a encefalopatiei hepatice și se estimată că afectează până la 60% dintre pacienții cu ciroză hepatică (Riordan și Williams, 2010).

Asocierea dintre boala hepatică și tulburările mentale întâlnite în encefalopatia hepatică a fost recunoscută încă din timpul lui Hipocrat, iar primul care a descris simptomele neurologice și psihiatrice în encefalopatia hepatică a fost GALEN. În unul din marile muzee de artă din München (Germania) există un tablou al celebrului pictor flamand Rubens P. intitulat „Turmentatul Silen”, în care sunt prezentate deosebit de sugestiv simptomele caracteristice ale insuficienței hepatice. (230).

Toate aceste preocupări arată interesul mare față de manifestarea complexă, dramatică din unele stadii, ale encefalopatiei hepatice.

Cel puțin patru factori majori patogenetici colaborează în grade diferite pe parcursul evoluției la apariția și dezvoltarea encefalopatiei hepatice; aceștia sunt:

infecția virală specifică a hepatocitului.

inflamația locală și sistemică cu manifestările imunologice, generale

disfuncția metabolică hepatică specifică, cu apariția derivaților toxici în circulația generală și cerebrală;

stresul oxidativ, care favorizează dezvoltarea infecției, inflamației și disfuncției hepatocitare, cu dezvoltarea hipertensiunii portale și apariția în circulația cerebrală de metaboliți toxici determinanți ai manifestărilor neuro-psihiatrice (231, 232)

Cauzele encefalopatiei hepatice sunt evident multiple, dar noi în studiul de față ne ocupăm doar de encefalopatia dezvoltată pe terenul ficatului cirotic urmare a infecției, cu virusul B și C, alături de forma metabolic-toxică determinată de etilism.

La examenul de start am avut: 8 pacienți cu ciroză hepatică complicată cu encefalopatie hepatică, dintre care 5 bărbați și 3 femei.

etiologie: 5 pacienți cu infecție cronică virală C

2 pacienți cu infecție cronică virală B

1 pacienți cu etiologie etanolică

După clasificarea de la Viena (1998): 7 pacienți se califică în tipul C2, adică 87,5% și 1 caz (12,5%) se califică în tipul C1, iar după gradul de afectare a sistemului nervos central pacienții se califică astfel: – 3 pacienți (37,5%) se încadrează în gradul I

– 4 pacienți (50%) se încadrează în gradul II

– 1 pacient (12,5%) se încadrează în gradul III

– examenul TA: 4 pacienți cu TA < 110/70 mmHg

4 pacienți cu TA în limita convențională a normalului 140/90

– examenul EKG: 2 pacienți cu traseu EKG normal

2 pacienți cu extrasistole ventriculare LOWN 1

2 pacient cu ischemie întinsă anterioară

1 pacient cu sechelă infarct miocardic inferior

1 pacient cu sechelă infarct miocardic postero – inferior

– examenul ecografic al ficatului:

– 6 pacienți cu ficat redus în dimensiuni (atrofic)

– 7 pacienți cu ficat cu contur neregulat al feței inferioare

– 8 pacienți cu calibru mărit al venei porte (peste 13 mm)

– 5 pacient cu ficat cu ecostructură profund inomogenă

– 6 pacienți cu steatoză hepatică

– 8 pacienți cu splenomegalie

– 8 pacienți cu lichid de ascită

– endoscopia esofagiană: 3 pacienți cu varice esofagiene grad II

7 pacienți cu varice esofagiene grad III

– electroencefalografia:

S-a înregistrat scăderea ritmului de bază la 5 pacienți (62,5%), la care au apărut disparatat activității pseudoparoxistice. Ritmul alfa a fost total dezorganizat la 6 pacienți (75%), undele teta au crescut progresiv ca număr și apoi a apărut un ritm delta trifazic la 6 dintre bolnavi (75%). S-au evidențiat ritmuri lente (sub 8 cicli/sec) față de normal (8-13 cicli/sec) și perioade cu creșterea voltajului în majoritatea conducerilor înregistrate la 7 (87,5%) dintre pacienți.

examinările bioumorale la start;

anemie microcitară = 3 (37,5%) pacienți

anemie macrocitară = 4 (50%) din pacienți

natremia < 130 mmol/l = 6 (75%) pacienți

albuminele < 35 g/l = 7 (78,5%) pacienți

AgHBs pozitiv = 2 (25%) pacienți

Ac anti – VHC pozitivi = 5 (62,5%) pacienți

GTP > 66 U/l = 5 (62,5%) pacienți

GOT > 94 U/l = 8 (100%) pacienți

Fosfataza alcalină 500-700 U/l la 3 pacienți (37,5%)

700-860 U/l = 5 pacienți (62,5%)

Proteina C-reactivă 1-3 mg/dl = 3 (37,5%) pacienți

3-7 mg/dl = 5 (62,5%) pacienți

– Alfa fetaproteina 96-180 μg/l = 5 (62,5%) pacienți

180-260 μg/l = 3 pacienți (37,5%)

Malondialdehida 7,9-40 μmol/l = 3 (37,5%) pacienți

> 40 μmol/l = 5 (62,5%) pacienți

SOD = 820-1119 U/gHgb = 6 pacienți (75%)

> 1800 U/gHgh = 2 (25%) pacienți

Glutation peroxidaza 4425-9940 U/l = 5 pacienți

> 10 900 U/L = 3 pacienți

Reprezentarea grafică pentru lotul 4 (Encefalopatia hepatică) : 8 pacienți

Grafic 21. Distribuția pe sexe la lotul 4

Grafic 22. Distribuția după etiologie a encefalopatiei hepatice

Grafic 23. Distribuția pacienților după clasificarea encefalopatiei hepatice Viena 1998

Grafic 24. Distribuția lotului după gradul de afectare a sistemului nervos central

Ilustrarea grafică a unor rezultate bio-umorale la start

Rezultatele bioumorale ale examenului de start de la lotul 4 (encefalopatia porto -sistemică) pune în evidență un număr crescut al markerilor inflamației (proteina C reactivă, VSH, imunoglobulinele, etc.) care alături de expresia citolizei (GOT, GPT) mult sporite și de prezența AgHBS sau a Ac anti – VHC subliniază relația dintre infecție, inflamație și stresul oxidativ în encefalopatia hepatică pe terenul cirozei hepatice, fie ea virală, fie etanolică.

Sunt o seamă de studii (227) care urmăresc dacă clinica encefalopatiei hepatice este influențată de severitatea bolii hepatice, de nivelul hepatocitolizei, de cel al inflamației locale și sistemice, alături de valoarea stresului oxidativ măsurată prin markerul său malondialdehida și dacă acești factori contribuie la deteriorarea neuropsihică din encefalopatia hepatică.

Concluzia este că, inflamația secundară infecției este un important factor determinant al prezenței și severității encefalopatiei hepatice la cirotici, iar alterarea funcției neuropsihice la pacienții cu sindrom citolitic sever este mai pronunțată la persoanele cu inflamație mai severă (227).

Un alt studiu (228) efectuat pe 100 pacienți cu ciroză hepatică internați pe parcursul a 8 ani într-un serviciu clinic de specialitate, la care cauza principală a internării a fost encefalopatia hepatică, datele hematologice și biologice la internare au arătat că 56% din pacienți au avut culturi pozitive (recoltate în 48 ore de la internare), iar 22% au avut culturi negative, dar prezentau dovezi ale inflamației sistemice.

Concluzia studiului arată o asociere pozitivă între encefalopatia hepatică, infecție, inflamația sistemică și exacerbarea simptomelor neuropsihiatrice.

Într-un studiu clinic (229) pe 10 pacienți cu ciroză hepatică, internați cu dovezi biologice ale unei inflamații sistemice asociate și cu prezențe serice a unor citokine proinflamatorii pozitive, au primit tratamentul cuvenit pentru infecția suprapusă cirozei hepatice, respectiv pentru encefalopatia hepatică. Odată cu rezolvarea infecției, respectiv a inflamației, scorul testului neuropsihic, care la internare a fost alarmant, s-a ameliorat radical.

Trei dintre pacienții lotului nostru, cu encefalopatie hepatică, au prezentat la internare febră moderată cu hepato-splenomegalie, motiv pentru care s-au recoltat hemoculturi, al căror rezultat încă nu este cunoscut la ora examinării celorlalte rezultate de start.

După constituirea grupurilor de studiu și evaluarea lor bioumorală și imagistică, odată cu investigarea motivației internării s-a efectuat și evaluarea terapiei în funcție de starea actuală, de terapia efectuată ambulator și de potențialul evolutiv al afecțiunii. Cum toate cele patru afecțiuni (4 loturi) au ca numitor comun patogenetic, tulburarea metabolismului (afecțiuni dismetabolice), planul terapeutic imediat și de perspectivă a cuprins măsuri terapeutice, cu caracter general, nefarmacologic (igieno-dietetic) și măsuri farmacologice, acestea din urmă cu adresă punctuală etiologică și patogenetică (antiinfecțioasă, antiinflamatorie, imunologică, enzimatică, antioxidantă, hepatoprotectoare și tonic generală).

Hepatita cronică

La acest prim lot am aplicat măsuri terpaeutice cu caracter general, care s-au adresat regimului fizic de activitate al pacienților cu hepatită cronică și hepatocitoliză, chiar moderată, motiv pentru care am recomandat repausul la pat. Din 23 de pacienți cuprinși în acest lot, toți au avut valoarea GOT și GPT peste limita superioară a intervalului de referință.

S-a asociat o alimentație complexă, echilibrată, ținând cont și de patologia asociată.

Terapia farmacologică a vizat în primul rând componenta antivirală. Un grup de 12 pacienți cu vârsta cuprinsă între 33 – 49 ani au prezentat Ac anti – VHC pozitivi, dar cu viremie detectabila (ARN VHC ) doar la 7 pacienți. Aceștia au fost supuși unor investigații suplimentare, din care numai 7 au beneficiat de tratament cu interferon pegilat alfa 2b 1,5 microg/kg (greutate corporală) administrat subcutanat, asociat cu ribavirină în capsule de 200 mg. Ribavirina s-a administrat astfel: 2 – 0 – 3 capsule/zi la cei cu greutatea corporală mai mică de 75 kg, respectiv 3 – 0 – 3 capsule la cei peste 75 kg, timp de 48 de săptămâni. Acești pacienți au prezentat valori serice ale malondialdehidei la start mai mari de 9 μmol/L, iar glutation peroxidaza mai mică 4 000 U/L, respectiv superoxid dismutaza mai mică de 1 200 U/gHg.

Componenta antiinflamatorie a fost combătută cu imunostimulante, deosebit de utile pe un teren afectat sub raportul apărării proprii de invazia virală. La fel am utilizat antioxidante la patru pacienți, respectiv interleukina -12 la un pacient (proprie).

Pe lângă aceste medicamente am administrat hepatoprotectoare clasice (acid orotic, acid aspartic, vitamine din grupa B, aspatofort, purinor, hepabionta etc.). De eficiența satisfăcătoare au fost unele stabilizatoare de membrană (Silimarină), cu efect benefic în sindromul hepatocitolitic, precum și unele antioxidante. Colestaza a fost combătută cu S-adenozil-metionina și acidul ursodeoxicolic care au efecte citoprotectoare, dar sunt și bune imunomodulatoare. În mod variabil, aceste grupe de medicamente au fost administrate la toți cei 23 de pacienți.

În cazul celor 7 pacienți cu hepatită cronică etanolică, o luptă amăgitoare s-a dus cu prelungirea sevrajului sau abandonarea totală a consumului de alcool. S-au identificat factorii precipianți ai recăderilor de natură infecționasă la 5 pacienți, malnutriția la 2 pacienți. S-a corectat dieta cu proteine vegetale și lactate, alături de perfuzii cu mixturi de aminoacizi, vitamina B, K pentru 2 pacienți. Manifestările ascitice au fost irelevante, iar cele de encefalopatie hepatică (în două cazuri) constând într-un discret deficit neuro-psihic, au rămas sub monitorizare. Întregul lot a rămas sub monitorizare, iar la 6 luni de la start, au fost reevaluați bio-umoral, ecografic, etc.

Ciroza hepatică a fost reprezentată de pacienți internați cu manifestări dispeptice datorate hipertensiunii portale incipiente, au constituit un lot de 14 pacienți stadializați după Baveno IV în: stadiul I (fără varice, fără ascită) 6 pacienți, stadiul II (cu varice, fără ascită) 3 pacienți, stadiul III (cu ascită incipientă fără varice) 5 pacienți, stadiul IV, (cu hemoragie variceală, cu au fără ascită) zero pacienți, altfel spus, 9 din pacienți se încadrează la ciroza compensată, iar 5 la ciroza decompensată, în sensul că prezența ascitei chiar incipientă face diferențierea, orientând tratamentul. Clasificarea Child-Pugh orientează mult mai fiziologic aplicarea tratamentului, introducând în clasificare trei parametri esențiali de evaluarea bioumorală a bolnavului cirotic, astfel că scorul obținut după evaluarea unui suferind de ciroză hepatică așează adresabilitatea drogului la nivelul modulului fiziopatologic afectat.

În urma examinărilor de start ale acestui lotul, conform modelului Child-Pugh, bolnavii au fost astfel clasificați:

8 pacienți cu scor = 6,2 = clasa A

6 pacienți cu scor = 9,42 = clasa B

Tabel 23. Distribuția pacienților lotului 2 în funcție de clasificarea Child-Pugh

Clasa A = 5-6 puncte (6,2 la noi), B = 7-9 puncte (9,42 la noi).

Doi din pacienții cu ciroză compensată clasa Child – Pugh A s-au calificat după vârstă, valoarea malondialdehidei și a celorlalte examinări bioumorale, imagistice și endoscopice, pentru tratamentul cu interferon și ribavirină.

Asistența intrainstituțională a pacienților cu ciroză după internare și asigurarea terapiei imediate internării, s-au desfășurat în funcție de încadrarealor în clasa Child-Pugh:

cu privire la măsurile generale de nutriție

terapia antifibrotică

terapia în raport cu etiologia bolii

profilaxia complicațiilor

Cu privire la terapia nutrițională au fost identificați subiecții malnutriți și supuși unui regim de reevaluare a valorii calorice a alimentației și componentelor produselor care asigură nevoia suportului proteinic, respectiv raportul între originea vegetală și animală a proteinelor, cu sporirea în funcție de toleranță a proteinelor animale în mod individual. Am încercat să ne raportăm cât mai mult posibil la recomandările Grupului de Consens al Societății Europene pentru Nutriție Parenterală și Enterală (ESPEN) 1997, cu privire la conținutul și aportul adecvat de calorii, proteine, vitamine și minerale necesare pentru o balanță pozitivă și corecția deficitelor astfel:

la pacienții cu ciroză hepatică compensată se apreciază ca necesar 25-30 kcal non-protidice pe kg corp plus 1,0-1,2 g proteine/Kg corp, iar la pacienții malnutriți sau cu ciroză hepatică decompensată se recomandă 35-40 Kcal non-protidică pe Kg corp plus 1,5 g proteine/Kg corp.

De mare valoare practică, cu urmări esențiale asupra nivelului sanguin al produșilor resorbiți din intestin și supuși fluxului metabolic la diverse nivele, ca și invaziei unor derivați toxică scăpați de bariera hemato-encefalică, este administrarea a 6-7 mese în cursul zilei, care cuprind doze aproximativ egale ale conținutului în azot a alimentelor și o gustare constituită din hidrocarbonate complexe, administrată seara târziu, astfel încât să fie evitate perioadele de post alimentar mai mari de 6 ore. S-a reconsiderat administrarea în ciroza compensată a unor produși alimentari în cantități controlate de unt, ouă, cafea, ciocolată, ciuperci sau produși vegetali, precum și fasole, linte, mazăre etc. În ciroza hepatică decompensată, restricția acestor produși se face selectiv, cu răspuns punctual la starea de edeme, ascită, hemoragie digestivă, encefalopatie hepatică, care însoțesc și complică evoluția cirozei hepatice.

Este important de sesizat că marea majoritate a celor cu encefalopatie hepatică în stadiu subclinic necesită o anume intervenție nutrițională, iar din cei cu manifestări clinice, o atenție deosebită față de varicele mari eso-gastrice care ar putea ceda, iar alimentația proteică administrată vizează în mod special lactatele și derivatele de lapte, iar vegetalele trebuie să beneficieze de un mod de prelucrare astfel încât ingestia și prelucrarea gastrică să nu angajeze impacte fizice cu șanse de lezare a mucoasei eso-gastrice sau să suprasolicite mecanic pereții stomacului.

Dat fiind caracterul hipercatabolic al cirozei hepatice am evitat restricțiile nutriționale în proteine, mergând până la 1,5 gr proteine/Kg corp/24 h, cu predominența celor provenite din lactate în funcție de toleranță. La pacienții cu intoleranță la proteine, respectiv cu encefalopatie hepatică s-a recurs la diminuarea unor cantității de proteine la 0,5 g/Kg corp/24 h, temporar, revenind în funcție de tolerață și nevoi, la valori de până la 1,5 gr/Kg corp pe zi.

La ciroticii cu retenție de fluide (edeme, ascită) am diminuat aportul alimentar de sodiu și lichide, încurajând alimentația vegetariană și fructele, alături de lactate și derivate.

Deși 3 din totalul pacienților cu ciroză aveau etiologie etanolică nu am fost nevoiți să apelăm la impunerea unor măsuri severe de sevraj, bolnavii fiind cooperanți și conștienți de efectul toxic al alcoolului.

Bolnavii supraponderali au acceptat programul dietei hipocalorice cu diminuarea valorii kilocaloriilor pe kg/corp prin reducerea aportului de grăsimi sub 30% din aportul caloric zilnic, respectiv 500-1000 Kcal (zi cu menținerea aportului proteinic la 15% din valoarea calorică zilnică). S-a recomandat un consum de fibre alimentare de 20-30 g/zi, provenind din fructe, legume, cereale alături de cantități corespunzătoare de minerale și vitamine, după un calcul dietetic făcut pe bolnav, și pe zi, în timpul spitalizării, dar și un program pentru externare.

Terapia farmacologică s-a adresat mecanismelor fibrogenetice, care acompaniază afecțiunile cronice hepatice. Fibroza în dezvoltarea sa are un impact major asupra funcțiilor hepatice, deoarece modifică compoziția matricei extracelulare și astfel determină schimbări biochimice și metabolice importante la nivelul hepatocitului.

Fibroza hepatică din ciroză se asociază cu formarea de noduli de regenerare, modificări ale structurii pereților vasculari intrahepatici, ce contribuie la apariția progresivă a hipertensiunii portale și la complicațiile acesteia. Combaterea fibrozei printr-o terapie specifică nu este la ora actuală eficientă (disponibilă). În mod indirect însă, acționaând asupra cauzei ce determină injuria hepatică, respectiv infecția virală și inflamația, se poate limita extensia fibrozei hepatice. Acest aspect esențial și eficient se poate face prin terapie antivirală.

Din cei 14 pacienți cu ciroză hepatică, s-au încadrat în limitele protocolului terapeutic publicat în Monitorul Oficial al României partea I, nr.386 bis/10 VI 2010 anexa 9, cu privire la criteriile de includere în tratament doar patru.

Agenți antiinflamatori, de tipul corticosteroizilor, pot contribui la procesul de reparare cicatricială tisulară post inflamatorie din hepatita cronică sau ciroza hepatică etanolică. O strategie ce reduce nivelul citokinelor proinflamatorii, ca TNF-α, prin administrarea de pentoxifilină sau anticorpi monoclonali anti TNF-α (infliximab) se poate folosi în terapia hepatitei cronice etanolice. Unele citokine anti-inflamatorii ca IL-10 sau inhibitorii lipo- și ciclooxigenazei sunt alternative de control ale inflamației și fibrozei hepatice.

Responsabil de fibroză hepatică este miofibroblastul sau celula stelată, care activată de factorii virali infecțioși și inflamatori duce la fibrogeneza hepatică. O serie de agenți care interferează cu fenomenul activării miofibroblaștilor, cum este rapomicina sau unii inhibitori ai tirozin -kinazelor au efect antifibrotic semnificativ. Cliotoxina are efecte antifibrotice prin reducerea numărului de miofibroblaști activați ca urmare a efectului citokinelor pro-inflamatorii.

Stresul oxidativ, proces ce însoțește orice eveniment metabolic, cu atât mai semnificativ în ciroza hepatică unde au loc anarhice și dense procese metabolice, favorizează și intensifică evoluția și diversele complicații ale cirozei hepatice.

Acțiunea stresului oxidativ la nivel tisular și celular, intensifică progresia fibrozei hepatice, fapt susținut de asocierea pozitivă a nivelelor crescute de malondialdehidă, fibronectină, proteină C reactivă, precum și a valorilor crecute ale enzimelor de hepatocitoliză, alături de nivele crescute ale bilirubinei, scăderea albuminei serice și creșterea timpului de protrombină. Fibronectina cu valori mai mari de 75 ng/l în ascită, confirmă un proces malign, iar valori sub 75 ng/l sugerează ciroză hepatică.

Dintre antioxidanții pe care-i utilizăm curent, și care confirmă în parte așteptările, se numără silimarina și tocoferolul. Printre substanțele eficiente, care contractează activitatea miofibroblaștilor și implicit procesul de fibrogeneză, se numără colchicina, utilizată mai cu seamă în ciroza hepatică de etiologie etanolică.

Profilaxia complicațiilor în ciroză este de mare importanță, dacă ținem cont de dramatismul lor, cum ar fi hemoragiile digestive superioare secundare efracțiilor variceale, ascita, malignizarea și encefalopatia hepatică. Varicele esofagiene în ciroza hepatică compensată se întâlnesc la 30-40% din pacienți și la 60% din cei cu ciroză hepatică decompensată.

Evaluarea endoscopică a varicelor se face în funcție de mărimea lor și este cel mai important factor de risc, asociat cu hemoragia variceală. În funcție de aceasta se clasifică astfel:

pacienți cu varice esofagiene mari

pacienți cu varice esofagiene mici și semne roșii variceale( red cherry- spots)

varice esofagiene mici și insuficiență hepatică severă (clasa Child C)

Între principiile utilizate curent în clinică sunt beta- blocantele neselective (propranolol sau nadolol), care reduc riscul de sângerare la 15-24% din cazuri și acționează prin două mecanisme: reduc debitul cardiac prin blocarea receptorilor β 1 și 2 și prin vasocontricție splahnică, reducând fluxul în colateralele porte prin blocarea receptorilor β2, modificând gradientul de presiune hepatică la sub 12 mmHg sau mai mult 20 mmHg față de valoarea inițială, scăderea frecvenței cardiace cu peste 25% față de valoarea inițială.

Ligatura endoscopică profilactică a dus uneori la rezultate satisfăcătoare, deși metoda în sine este destul de controversată, însă ea rămâne de folos pentru pacienții care nu tolerază atitudinea farmacologică.

„Consensul Beveno IV” recomandă ca terapie de primă linie pentru profilaxia primară a hemoragiei variceale beta-blocantele non selective (BBNS)

Ghidul AASLD (2007) recomandă pentru pacienții din clasa Child C, cu varice medii și mari, și risc de sângerare, terapie BBNS sau ligatură endoscopică ca terapie de primă linie. Eficiența BBNS în profilaxia secundară a demonstrat în studii controlate că reduce semnificativ rata de resângerare (de la 63% la 42%) și mortalitatea de la 27% la 20%.

Șuntul porto-sistemic transjugular (TIPS) este apreciat, în urma unor studii mai recente, că este superior terapiei endoscopice în prevenirea resângerării variceale, la fel și față de terapia combinată propranolol/nadolol plus isosorbid – 5 mononitrat. Limitarea metodei este dată de riscul encefalopatiei hepatice, mortalitate și costuri mari.

Hepatocarcinomul a fost prins în studiul nostru din două motive: primul rezultă dintr-o deviere citopatologică a ficatului cirotic, așa cum rezultă și alte complicații evolutive ca hipertensiunea portală, ascita, hemoragia eso-gastrică sau encefalopatia hepatică, doar că potențialul mitotic și mecanismele cancerigene ce stau la baza genezei hepatocarcinomului au alte legi decât complicațiile cirozei menționate mai sus. Al doilea motiv a fost acela de a identifica relația dintre mecanismele evoluției mitotice și stresul oxidativ, care se dezvoltă pe ficatul cirotic în evoluția hepatocarcinomului.

Cât privește etiopatogeneza hepatocarcinomului, acesta este legată de etiologia cirozei respectiv infecția cronică virală C la 6 pacienți, infecția cronică virală B la 3 pacienți și consumul cronic de etanol la 2 pacienți. Formele clinice descrise la examenul ecografic au fost: imagine unică, hiperecogenă, în lobul drept hepatic 3 pacienți, multiple imagini hiperecogne în lobul drept hepatic la 3 pacienți, multiple imagini hiperecogene diseminate în ambii lobi hepatici la 4 pacienți, imagine hiperecogenă, solitară în lobul stâng hepatic la un pacient.

Alfafetoproteina s-a situat la toți cei 11 pacienți deasupra limitei superioare a intervalului convențional, respectiv între 40-1 236 ng/ml. Între alfa fetoproteină și nivelul seric al malondialdehidei s-a observat, la examenul de start, o corelare pozitivă, la care sinergizează și proteina C reactivă.

Fondul cirotic, descrierea ecografică, prezența valorilor crescute ale alfafetoproteinei, la care se alătură stresul oxidativ și componenta inflamatorie au susținut diagnosticul. Prezența AgHBs, a Ac anti -VHC pozitivi alături de comemorativele etanolice au asigurat diagnosticul etiologic. La 2 pacienți a fost necesară apelarea la CT, respectiv RMN, pentru elucidarea dignostică.

Pentru aplicarea unui tratament adecvat formei și studiului clinic în baza criteriilor diagnostice am aplicat clasificările BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer) și clasificarea OKUDA, față de bolnavii care au fost așezați, fiecare în funcție de criteriile cerute de clasificre într-o anume poziție, din care a rezultat atitudinea terapeutică de moment și de perspectivă.

Tabel 24.Clasificarea BCLC:

Pentru: – stadiul A și B trebuiesc îndeplinite toate criteriile,

stadiul C cel puțin 1 criteriu, status de performanță 1-2 sau invazie vasculară extrahepatică,

stadiul D cel puțin 1 criteriu, status de performanță 3-4 sau OKUDA III/Child- Pugh C

Tabel 25. Clasificarea OKUDA

În baza acestor clasificări cei 11 pacienți s-au situat astfel:

7 pacienți cu ciroză hepatică și ascită moderată, din care 5 cu tumori mai mari de 3 cm, 6 cu albumină serică mai mică de 3 g/dl și 3 cu bilirubină totală mai mare de 3 mg/dl, și care ar putea beneficia de transplant de ficat, după criteriile BCLC și OKUDA.

4 pacienți cu ciroză hepatică din care 2 cu formațiune tumorală solitară mare, cu semne de hipertensiune portală, cu bilirubina totală ușor crescută peste normal, fără ascită, care se pretează la chimioembolizare tumorii, respectiv ceilalți 2 cu formațiuni tumorale polimorfe, albuminemia scăzută (sub 3 g/dl), bilirubină totală crescută peste 3 mg/dl se poate iniția tratament antiviral, chimioterapie sistemică cu evaluarea la 6 luni.

Terapia simptomatică și de susținere a funcțiilor hepatice s-a practicat la toți pacienții acestui lot. Monitorizarea bioumorală și imagistică s-a făcut ca și pentru ceilalți bolnavi cuprinși în studiu, cu reevaluări la 6, 12 și 24 de luni odată cu examenul de sfârșit de studiu.

Encefalopatia hepatică, ca o complicație a cirozei hepatice pornește fiziopatologic de la complexele tulburări metabolice ce apar progresiv ca urmare a afectării infecțioase și inflamatorii a hepatocitului, de unde se ajunge la apariția edemului cerebral de grad scăzut, care este exacerbat de reacția amoniacului și a altor factori precipitanți.

Acest edem cerebral de grad scăzut este însoțit de o producție crescută de specii reactive de oxigen și oxid de azot care declanează multiple modificări ale proteinelor și acidului ribonucleic, afectând prin urmare funcția cerebrală. Acțiunea amoniacului, citokinelor inflama-torii, benzodiazepinelor și hiponatremiei se însumează cu nivelul inflamării astrocitului și a stresului oxidativ. Acest fenomen explică de ce condiții clinice heterogene pot precipita episoade de encefalopatie hepatică (234). Strategiile terapeutice curente au ca scop eliminarea factorilor precipitanți. În conformitate cu criteriile West Haven, encefalopatia hepatică este clasificată în patru grade, de la I-IV, pe baza semnelor clinice și simptomelor specifice, ca și a severității lor. (235). Spectrul severității simptomelor neuropsihologice și neuropsihice evidențiază deficite care au efect asupra capacității intelectuale și a calității vieții individului (236), chiar și la pacienți care par normali la o primă examinare clinică. Aceste deficiențe pot fi puse în evidență în urma testării neuropsihologice sau neurofiziologice, a acestor pacienți. Această condiție a fost denumită encefalopatie hepatică minimă (mHE). (235).

Dificultățile identificării în practica clinică curentă a unor simptome ce prefigurează encefalopatia hepatică și pentru evitarea erorilor generate în ambiguitatea interpretării acestora, a dus la propunerea recentă a unei noi evaluări pentru clasificarea encefalopatiei hepatice la pacienții cu ciroză, care distinge doar encefalopatia hepatică de grad scăzut și de grad înalt.

Forma de grad înalt a encefalopatiei hepatice descrie pacienți cu un nivel scăzut al cunștienței și o capacitate de a coopera la fel de mică, ceea ce corespunde gradelor III și IV și necesită internarea, în vreme ce encefalopatia hepatică de grad scăzut cuprinde pacienții cu forme ușoare (mEH și EHgr I-II) și nu necesită internarea.

Recent s-a introdus în practică analiza frecvenței scintilației critice (CFF) pentru a identifica cele mai precoce manifestări psiho-neurologice din encefalopatia hepatică, cu scopul dea putea interveni cât mai precoce și mai bine țintit în combaterea și corectarea dereglărilor metabolice, însă acest lucru nu a adus satisfacție în supravegherea pacienților în cursul tratamentului și al studiilor clinice.

Sintetizarea și gruparea cu atenție a simptomelor și a rezultatelor bioumorale în encefalopatia hepatică, în mod practic, în clinică, permite ierarhizarea măsurilor terapeutice cu adresă la:

identificarea și eliminarea factorilor precipitanți ai encefalopatiei hepatice,

modificarea dietei,

reducerea compușilor de amoniu și eliminarea compușilor azotați din intestin,

corectarea neurotransmisiei cerebrale.

Cât privește identificarea factorilor precipitanți, cei mai frecvenți se referă la tulburările hidroelectrolitice în special NA+, K+, Ca2+, elemente ce joacă un rol important atât în mecanismul retenției hidrice, a edemului cerebral, a alterării barierei sânge-creier, dar și a neurotransmisiei.

În studiul nostru 3 din cei 8 pacienți cu encefalopatie hepatică, au prezentat la examenul de start valori mai mici de 130 mmol/l ale Na+-ului, alături de hipocalcemie, hipomagnezemie, hipoalbuminemie cu hiperglicemie bazală, coagulograma modificată, sindrom de retenție azotată, anemie și leucocitoză, sindrom de hepatocitoliză, cu alfa fetoproteină crescută și sindrom inflamator asociat cu hiperbilirubinemie. Sindromul neuropsihic a calificat în stadiul I – 2 pacienți, stadiul II – 5 pacienți, iar în stadiul III – 1 pacient.

În acest context, tratamentul nostru s-a adresat direct procesului infecțios inflamator intestinal pe trei căi: combaterea colostazei, antibioterapie și corectarea dietetică a conținutului proteinic al dietei, cu scăderea aportului de proteine animale, creșterea celor vegetale bogate în fibre, cu scăderea reabsorbției de la nivelul colonului a produșilor de digestie și diminuarea aportului de toxine în circulația generală, inclusv cerebrală, prin combaterea constipației. Astfel, timp de câteva zile, în funcție de evoluția clinică, s-au administrat câte 20 ml lactuloză, de 2-3 ori/zi.

Trei dintre pacienți au prezentat subfebrilități prelungite, sensibilitate palpatorică în flancul stâng, contipație, inapetență și meteorism. S-au efectuat clisme evacuatorii cu latuloză (200 ml în 800 ml apă). S-a asociat Rifaximină în doză de 1 200 mg/zi – 4 zile consecutiv, apoi 800 mg/zi, încă 5 zile. Pentru reducerea nivelului seric al amoniacului am administrat Ornitin-aspartat și compuși cu Zn, 2×300 mg/zi.

Combaterea retenției hidrice și a ascitei s-a făcut prin administrarea asociată a diureticelor cu acțiune la nivelul tubului contort distal, cu cea a diureticelor de ansă, respectiv Spironolactonă cu Furosemid în raport de 100 mg la 40 mg, însoțite de o alimentație restrictivă în sare. Răspunsul a fost satisfăcător.

Alcătuirea loturilor de studiu, a lotului de control, examenul clinic gneral, bio-umoral și imagistic de stabilirea diagnosticului, formularea tratamentului medicamentos și igieno-dietetic, urmărirea evoluției clinice pe timpul spitalizării, formularea protocolului terapeutic la externare și a planului complex de monitorizare ambulatorie, au constituit prima etapă a studiului.

După șase luni s-a efectuat prima evaluare a datelor clinice, bioumorale și imagistice cu raportare la cele obținute la start.

2.3.0. Evaluarea studiului după șase luni pe cele patru loturi inițiale

Evaluările loturilor de studiu efectuate la 6 luni, 1 an și doi ani a urmărit comparativ cu valorile de start următorii parametrii și tendința lor evolutivă:

Impactul stresului oxidativ asupra evoluției clinice exprimate prin câțiva markeri:

malondialdehida serică, GPT și GOT, GGT, fosfataza alcalină, bilirubina serică, proteina C-reactivă, alfa fetoproteina, albumina serică, bilirubina serică, timpul de protrombină, superoxid dismutaza, glutation peroxidaza

Tendințe imagistice privitor la:

mărimea și structura ficatului

relația cu sistemul vascular hepatic și perihepatic

hipertensiunea portală: – șunturile portosistemice

– varicele esogastrice

– ascita

– encefalopatia hepatică

dezvoltarea formațiunilor hepatice carcinomatoase

Progresia stadiului morfologic și clinic și dezvoltarea complicațiilor dinspre:

hepatită cronică → ciroză

ciroză compensată → decompensată, complicată cu: – encefalopatie hepatică

– hipertensiune portală

– varice esofagiene, hemoragie

digestivă variceală

– ascită

– malignizare

Tabel 26.Datele comparative ale unor examinări selective la 6 luni față de start, raportate la numărul de pacienți afectați

Tabel 27.

Tabel 28.Tendințele imagistice ale ficatului și sistemului venos portal la șase luni de la examenul de start pentru cele patru entități

Examenul de evaluare la șase luni a avut menirea pe de o parte să ne arate tendința evolutivă a afecțiunilor celor patru loturi față de start, iar pe de altă parte ne-a oferit posibilitatea de a ne organiza studiul propriu-zis, bazat pe aceste date.

Din analiza unor markeri biologici a rezultat că infecția virală hepatică alături de procesul inflamator hepatic și stresul oxidativ se mențin la valori crescute în cele patru loturi, după cum rezultă:

1) Malondialdehida:

3-9 μmol/L la 17,39% pacienți cu hepatită cronică, iar la valori > 9

Hepatita cronică μmol/L la fel 17,39% din pacienți

Total 34,78% din pacienții cu hepatită cronică sunt sub influența marcată a

stresului oxidativ

Ciroza hepatică 14,28% din cei cu ciroză au valori cuprinse între 3-11 μmol/L ale

malondialdehidele, iar 21,42% au valori mai mari de 11/μmol/L

Hepatocarcinomul are valori de 1,24 – 7 μmol/L – 72% din pacienți

Encefalopatia toate cazurile au înregistrat la 6 luni valori ale malondialdehidei 1,24-3

hepatică μmol/L respectiv 3-7 μmol/l în proporție de 50, respectiv 50 pacienți

În concluzie, 55,35% din pacienții celor patru loturi au valori patologice ale malondialdehidei la 6 luni, din care 12,5% valorile depășesc 11 μmol/L, aceștia înregistrându-se în rândul hepatitei cronice și cirozei.

Tabel 29

Prezența stresului oxidativ în unele afecțiuni cronice hepatice, exprimat prin malondialdehidă, comparativ cu reacția anioxidantă exprimată prin superoxid dismutaza și glutamil peroxidază.

Valori la startul studiului și după 6 luni sub tratamentul convențional, menționat în textul lucrării.

Nivelul malondialdehidei în μmol /L

Nivelul valorilor serice ale antioxidanților endogeni.

Superoxid dismutaza la start și la 6 luni pentru cele patru entități studiate

Glutation peroxidaza la start și la 6 luni pentru cele patru entități în studiu

Capitolul III

STUDII CLINICE

Rezultatele obținute după examinarea bioumorală de la 6 luni de monitorizare ne arată că un procent mare de peste 35% din pacienții celor 4 loturi au infecție cu virusul hepatitei B și C și că terapia cu Interferon s-ar impune , dar criteriile de includere ne-au selectat doar 1 pacient cu infecție cu VHB, 4 pacienți cu infecție cu VHC aflați în stadiul de hepatită cronică, la care s-au adăugat 2 pacienți cu ciroză hepatică compensată de etiologie VHC.

Asocierea stresului oxidativ infecției virale B și C augmentează efectele clinice ale acestor pacienți. Aplicarea tratamentului antiviral (antiinfecțios) și antiinflamator în același timp scad impactul și efectele stresului oxidativ, cu ameliorarea clinică sau chiar vindecare, fapte confirmate în studii clinice internaționale și publicate în literatura de specialitate (49).

Protocolul terapeutic în hepatita cronică și ciroza hepatică cu VHB (LBO1B) și VHC, publicat în Monitorul Oficial al României, partea I nr. 384 bis/10VI, 2010 cuprinde:

3.0.0. Criteriile de includere în tratamentul cu Interferon:

Hepatita cronică cu VHC:

Biochimic: ALT normal sau în creștere

Virusologic: ARN-VHC detectabil

Histologic: puncție biopsie hepatică, Fibromax cu A ≥ 1, F ≥ 1 și/sau S ≥ 1, sau Fibroscan F > 1

Vârsta ≤ 65 ani

> 65 ani se va evalua riscul terapeutic în funcție de comorbidități (se exclud: bolile neorologice, bolile psihice, demența etc), diabetul zaharat, bolile autoimune, boala ischemică coronariană sau insuficiență cardiacă severă, necontrolată, afecțiuni respiratorii severe, necontrolabile, Hb < 11 gdl, numărul de leucocite < 5 000 pe mm3, numărul PMN < 1 500 pe mm3.

Schema de tratament:

durata tratamentului este de 24 de săptămâni și presupune administrarea de Interferon pegylat α 2 a 180 µg/săptămână + Ribavirină 1 000 sau 1 200 mg/zi în funcție de greutatea corporală

Tipuri de răspuns:

RVR (răspunsul viral rapid) = ARN-VHC negativ după 4 săptămâni de terapie

EVR (răspunsul viral precoce) = negativarea sau scăderea ≥ 2 log10 a ARN-VHC după 12 săptămâni de terapie

Non Response (lipsa răspunsului) = scăderea ARN-VHC cu < 2 log10 la 12 săptămâni de tratament

Slow Response (lipsa de răspuns) = ARN-VHC negativ după 24 săptămâni de terapie

– EOT (Răspuns viral la sfârșitul tratamentului) = ARN-VHC nedetectabil la sfârșitul tratamentului

SVR (răspuns viral susținut) = ARN-VHC nedetectabil la 24 de săptămâni după terminarea terapiei

Breaktrough = ARN-VHC detectabil în cursul tratamentului, după obținerea EVR

Relapse (recădere) = pozitivarea ARN-VHC după obținerea răspunsului viral la sfârșitul tratamentului

Răspunsul inițial la terapie se apreciază:

biochimic: ALT = normal

virusologic: scăderea ARN-VHC cu ≥ 2 log sau sub limite de la 4,12 sau 24 săptămâni.

ARN se determină:

la începutul terapiei

la 4 săptămâni de terapie

la 12 săptămâni de terapie dacă ARN-VHC a fost detectabil la 4 săptămâni

la 24 săptămâni de terapie dacă nu s-a obținut negativarea, dar s-a obținut scăderea ≥ 2 log10 a ARN-VHC după 12 săptămâni de terapie

la terminarea terapiei (48 de săptămâni de terapie din momentul negativării ARN-VHC)

la 24 săptămâni de la terminarea terapiei.

Durata tratamentului:

24 de săptămâni pentru genotipul 2-3 ( + ribavirină 800 mg/zi)

24, 48 sau 72 de săptămâni pentru genotipul 1-4 după cum urmează

Dacă ARN, VHC inițial este < 600 000 UI/ml și se obțin RVR (ARN-VHC nedetectabil la 4 săptămâni) se efectuează 24 de săptămâni de tratament.

Dacă la 12 săptămâni de la începerea terapiei ARN-VHC este nedetectabil se continuă tratamentul până la 48 de săptămâni. Dacă la 12 săptămâni de la începerea terapiei ARN-VHC este detectabil sau a scăzut cu ≥ 2 log față de nivelul preterapeutic se continuă terapia până la 24 săptămâni, când se face o nouă determinare de ARN-VHC.

Dacă ARN-VHC este pozitiv la 24 săptămâni terapia se oprește.

Dacă ARN-VHC este negativ la 24 de săptămâni, se continuă tratamentul până la 72 de săptămâni. Ciroza hepatică cu VHC se tratează conform schemei terapeutice din hepatita cronică cu VHC. Valoarea tratamentului cu Interferon asupra infecției virale și a stresului oxidativ am prezentat-o într-un studiu comparativ pe 2 grupuri de hepatită virală, unul tratat cu Interferon și al doilea netratat; acesta a fost studiul numărul 1.

Baza fiziopatologică de acțiune a stresului oxidativ în hepatita cronică și ciroză la cele două grupuri a fost asemănătoare, peroxidarea lipidică sporită din hepatită este cauzată de inflamația determinată de infecția virală, iar nivelele scăzute ale antioxidanților reprezintă rezultanta dată de severitatea stresului oxidativ și ar putea fi un marker timpuriu al acestuia. Peroxizii lipizi formați, pot fi chemotactici pentru neutrofile, determinând sporirea inflamației, ceea ce va stimula și mai mult lezarea celulei hepatice mediate de stresul oxidativ. În dezvoltarea sa, infecția virală hepatică deteriorează limfocitele periferice, iar acestea la rândul lor produc interferon pentru a stimula celulele sănătoase împotriva virusurilor (reacție de apărare). În același timp hepatita cronică produce o cantitate sporită de TNF-alfa, o citokină care ea însăși poate produce stres oxidativ prin stimularea generării de specii reactive de oxigen, cum ar fi ionul superoxid (O2) și peroxidul de hidrogen (H2O2). Așadar peroxidarea lipidică este determinată de radicalii liberi și duce la distrugerea oxidativă a acizilor grași polinesaturați din membranele celulare, iar în urma acestei distrugeri apar metaboliți ai aldehidei, toxici și reactivi cum este malondialdehida (MDA) și 4-hidroxinonenalul(HNE).

Acești metaboliți sunt deosebit de toxici și pot migra de la locul de producere pentru a forma legături covalente cu diferite molecule. Deci acești doi metaboliți oxidanți au trei însușiri foarte agresive: toxicitate mare, mobilitate crescută și putere de penetrare în țesuturi la distanță, invadând astfel întreg organismul. A treia însușire, de luat în seamă, a celor doi metaboliți (MDA și HNE) este nespecificitatea, în sensul că interacționează la orice nivel și în orice țesuturi punându-și amprenta în mecanismele fiziopatologice locale. Astfel că recunoașterea peroxidării lipide prezintă interes la fel de mare precum efectele nocive tardive ale acestui proces, incluzând fibrogeneza hepatică. Testul cel mai eficient în modul de identificare a malondialdehidei și HNE este testul acidului tiobarbituric. Recent au fost identificați anticorpi specifici împotriva MDA și HNE.

Între produșii naturali de protecție celulară împotriva lezării oxidative a stresului sunt enzimele superoxid dismutaza, catalaza și glutation peroxidaza (SOD, Cat, GSH-Px)

S-au stabilit o seamă de markeri serologic sau celulari care să ajute în urmărirea îngrijirii clinice și în evaluarea tratamentului pentru acești pacienți cu hepatită cronică și ciroză, între care:

– încărcarea virală (ARN – VHC)

– IgM anti VHC plasmatici

Cu toate că, până recent, se practicau biopsii hepatice, repetate, pentru evaluarea progresiei bolii, la ora actuală evaluarea fibrozei hepatice se face cu Fibroscanul, care utilizează principiul elastografiei tranzitorii unidimensionale pentru măsurarea rigidității hepatice. Activarea vibrației la nivelul transductorului este transmisă prin tegumente și celelalte țesuturi până la ficat. În paralel cu activarea vibrației, transductorul realizează o serie de achiziții de ultrasunete cu o frecvență de repetiție de 4 KHz. Din compararea semnalelor ultrasonore succesive obținute în acest fel, se pot configura rapoartele de deformare ale țesuturilor determinate de propagarea undei elastice. Se măsoară timpul necesar trenului de unde pentru a se propaga de-a lungul zonei de interes, precum și viteza de propagare. În acest fel se poate măsura rigiditatea ficatului după formula F = 3 pV2 (E = modulul de elasticitate, p = densitatea constantă de material, V = viteza de propagare a undei elastice în parechiul hepatic). Cu cât este mai rapid mediul (structura ficatului), cu atât viteza de propagare va fi mai mare.

Rezultatele sunt exprimate în „Kilo Pascali (Kpa), corespund valorii medii a 10 măsurători valide, iar valorile pe care le poate determina echipamentul sunt cuprinse între 2,5 și 75 Kpa.

Utilizarea practică a metodei se bazează pe stabilirea unor valori prag cu rigidități hepatice pentru fiecare stadiu de fibroză. Diagnosticul stadiului F ≥ 2, F ≥ 3 și respectiv F = 4 de fibroză (luând în considerare sistemul Metavir) se face pe doza valorilor rigidității hepatice de 7,1-8,8 Kpa, 9,5-9,6 Kpa și respectiv 2,5-14,6 Kpa.

În general valoarea rigidității hepatice sub 7 Kpa infirmă fibroza sau aceasta este minimală.

Pentru ciroza hepatică rigiditatea ficatului variază între 12,5/14,5 și 75,5 Kpa, dar valoare optimă pentru predicția cirozei este 12,5-14,5 Kpa, dar poate varia între 9 KPa și 17,3 KPa. (239)

Monitorizarea progresiei bolii hepatice subliniază că rigiditatea ficatului crește pe măsură ce afecțiunea progresează. Semnificația prognostică a valorilor rigidității hepatice este în curs de evaluare: 27,5 Kpa = varice esofagiene gradul 2/3, 37,5 Kpa = ciroză hepatică stadiu Child- Pugh B – C, 49,1 Kpa pentru ascită, 53,7 Kpa= hepatocarcinom, 62,7 Kpa = sângerarea varice esofagiane. În practică, riscul de ciroză decompensată < 27 Kpa, se exclude.

Importanța fibroscanului este de-a dreptul revoluționară în aprecierea progresiei bolii hepatice cronice prin modul acurat de evaluare a procesului de fibrozare și relația cu diversele posibilități de evoluție și complicație a ficatului cirotic. Procesul de fibrozare, în esența sa fiziopatologică, este profund influențat de stresul oxidativ, în corelare pozitivă cu nivelele serice și eritrocitare ale malondialdehidei și cu gradul de fibrozare hepatică. El oferă o evaluare a gradului de progresie a bolii hepatice, implicit cel al posibilelor complicații din ciroza hepatică. Encefalopatia hepatică, complicație a citozei hepatice și a gradului de fibrozare cu progresie spre hipertensiunea portală. Severitatea encefalopatiei hepatice este în funcție de prezența și severitatea simptomelor și semnelor clinice specifice din ciroză: hipertensiunea portală, ascită, varice esofagiene și ruptura acestorta cu rezorbție de derivați azotați din extravazatul vascular cu sporirea amoniacului etc. Între factorii care contribuie la agravarea complicaților cirozei hepatice în encefalopatia hepatică este stresul oxidativ care amprentează dezvoltarea clinică a encefalopatiei hepatice.

Astfel speciile ARN oxidate, care sunt formate ca reacție la stresul oxidariv participă de asemenea la sinteza proteinică post-sinaptică locală din neuroni, care este necesară pentru formarea memoriei. În context, acțiunea amoniacului, a citokinelor inflamatorii, benzodiazepinelor și hiponatriemiei se însumează la nivelul astrocitelor inflamate sub efectul stresului oxidativ amplificând tabloul neuro-psihiatric din encefalopatie.

Pe baza rezultatelor examinărilor din start și a celor după 6 luni am selectat bolnavii și am început studiul după cum urmează:

3.1.0. STUDIUL I – dezvoltat pe 3 grupuri de pacienți, din care unul de control

Motivația studiului:

Tot mai multe cercetări din literatura de specialitate susțin rolul stresului oxidativ în patogeneza infecției virale din hepatit virală a cronică B și C, și influențarea apariției diverselor complicații (ciroza, hepatocarcinomul, ascita, hemoragiile digestive secundare efracției variceale, encefalopatia hepatică).

Scopul studiului: să determine starea de stres oxidativ la pacienții cu hepatită cronică virală B și C, și efectul terapiei combinate cu Interferon pegylat alfa 2a și eventual Ribavirină asupra stresului oxidativ comparativ cu un lot martor de pacienți, tot cu hepatită cronică virală B, C și ciroză hepatică seropozitiv, care nu au beneficiat de terapie antivirală. Exceptând terapia antivirală, în rest tratamentul medicamentos a fost egal pentru toți componenții grupului.

3.1.1. Grupul 1 (tratat cu Interferon)

Tabel 30. Structura grupului 1:

Grupul de studiu selectat pentru tratametul cu Interferon și Ribavirină a prezentat infecție cronică cu VHC, iar cei tratați doar cu Interferon au fost cei cu AgHBs pozitiv. Diagnosticul s-a bazat pe creșterea transaminazelor serice, pozitivitatea pentru Ac anti-VHC și prezența ARN-ului HCV în ser, care au definit hepatita cronică C, respectiv AgHBs pozitiv, Ag Hbe pozitiv și ADN-VHB > 20 000 UI/ml în cazul celor cu hepatită cronică virală B. Ecografia a descris un ficat de aspect cirotic, cu contur neregulat al marginii inferioare, cu ecostructură difuz inomogenă, dar cu VP de calibru normal.

Grupul martor a prezentat aceleași caracteristici imunologice, citolitice și ecografice, doar că vârsta acestora, precum și nivelul viremiilor nu au permis tratamentul etiopatogenic.

Tabel 31.Rezultatele bioumorale

Aplicarea tratamentului

Un pacient avea hepatită cronică virală B, cu Ag HBs și respectiv Ag HBe pozitiv, cu ADN – VHB 72 143 UI/ml, motiv pentru care s-a administrat Interferon pegylat α 2 a 180 μg/săptămână. Tratamentul a început la 9 ianuarie 2011 și s-a finalizat la 6 ianuarie 2012. Evaluările au fost făcute la intervale de 6 luni, iar scăderea ADN-VHB cu peste 2 log10 a permis continuare tratmentului până la final (48 săptămâni).

Patru pacienți cu hepatită cronică virală C au primit ca tratament Interferon pegylat α 2-a 180 μg/săptămână plus ribavirină 1 000 mg/zi. Controlul efectuat la 4, 12 și 24 de săptămâni de tratament, a arătat o evoluție virusologică favorabilă cu scăderea și respectiv negativarea ARN-VHC. La terminarea terapiei, după 48 de săptămâni, ARN-VHC s-a negativat complet, iar celelalte rezultate bio-umorale, în peste 80% din cazuri, s-au normalizat.

La 20% din pacienții tratați cu interferon s-a instalat un grad marcat de anemie normocromă normocitară și splenomegalie.

Doi pacienți au ciroză hepatică compensată, de etiologie virală C au primit tratament cu Interferon și Ribavirină la fel ca și cei cu hepatită cronică virală C. Aceștia au avut un răspuns clinic favorabil, însă bioumoral s-a menținut un sindrom de colestază crescut. Proteina C reactivă și alfa fetoproteina au prezentat valori ce depășeau limita superioară a normalului, la fel leucocitele > 12 000/mm3. Malondialdehida a rămas deasupra intervalului normal, respectiv 1,79 μmol/L.

Rezultatele bio-umorale au fost aduse la limita intervalului normal în cazul malondialdehidei, mult crescută față de grupul martor, înaintea tratamentului. Enzimele antioxidante, atât superoxid dismutaza, cât și glutation peroxidaza, care înainte de tratament au fost situate sub nivelul grupului de control, au crescut ușor, deasupra limitei superioare a intervalului normal la 70% din pacienții tratați cu Interferon și Ribavirină, iar la 30% reacția a crescut semnificativ, de mai bine de 2 ori față de valoarea normalului.

Markerii inflamației (proteina C-reactivă, leucocitele) au fost semnificativ crescute alături de malondialdehida, respectiv de enzimele hepatocitolitice înainte de tratament. Expresia stresului oxidativ ca urmare a terapiei combinate antivirale a fost semnificativ influențată, iar sub raport clinic, toți pacienții (100%), au obținut o stare de confort satisfăcătoare.

3.1.2. Grupul 2 fără tratament antiviral (martor):

Tabel 32

Tratamentul etiologic al afecțiunii hepatice privește eliminarea factorilor cauzali injuriei hepatocitare astfel reușind a se opri, implicit, extensia fibrozei hepatice, fapt confirmat prin tratamentul antiviral al hepatitei cronice virale din studiul 1. Pacienții lotului martor nu au putut beneficia de tratament antiviral din cauza valorilor mici ale viremiilor, din cauza faptului că depășiseră vârsta de 65 ani, pentru că 3 dintre ei aveau o trombocitopenie de < 80000/mm3 și pentru că asociau boală coronariană ischemică.

Pacienții lotului martor au fost monitorizați pe parcursul a 12 luni de tratament standard, constând în:

restricție în activitaeta fizică la cei cu forme active de manifestare citolitică (GOT, GPT) și chiar repaus prelungit la pat pentru 2 dintre aceștia

alimentație completă, echilibrată, adaptată de la caz la caz, cu privire la aportul proteic și la raportul între proteinele de origine animală și vegetală

s-a aplicat terapia convențională, în primul rând de citoprotecție și limitare a injuriei hepatocitare și implicit a fibrozei hepatice, prin administrarea de acid ursodeoxicolic capsule de 250 mg, 15 mg/kg corp/zi, timp de 12 luni

agenți antiinflamatori de reducere a nivelului citokinelor proinflamatorii prin administrarea de pentoxifilină, care prin vasodilatație pe de o parte și creșterea flexibilității eritrocitelor pe de altă parte, diminuă vârscozitatea sângelui, combate staza locală, favorizează circulația și contribuie la reducerea nivelului citokinelor proinflamatorii ca TNF-α

pentru combaterea sindromului hepatocitolitic, ca stabilizator de membrană, cu efecte antioxidante, am utilizat Silimarină în doză de 3×150 mg à la longue

in categoria largă a hepatoprotectoarelor am utilizat substanțe stimulatoare ale funcției antitoxice a ficatului LIV 52, în doză de 3×1 cpr/ zi

am administrat, de asemenea, substanțe care participă la sinteza proteinelor și în același timp la legarea amoniacului în exces, sub forma unor cure lunare a câte 10 zile de Arginină, 1 fiolă buvabilă/zi

fosfolipidele cu rol structural membranar și în activarea sistemelor enzimatice de la acest nivel, au fost administrate sub formă de Essențiale Forte N 3 x1 cps/zi.

În ciuda tratamentului mai sus menționat, în hepatita cronică virală C sau B, cu ARN și respectiv ADN pozitiv, efectul stresului oxidativ cu tulburările metabolice celulare antrenate, evoluează lent spre fibroză hepatică, dovadă fiind rezultatele bioumorale de la sfârșitul celor 12 luni de tratament monitorizat (GOT, GPT, MDA, SOD, și GPx, leucocitele, proteina C-reactivă, bilirubina și albumina serică etc.).

Combaterea infecției cu ajutorul Interferonului pegylat, asociat sau nu cu Ribavirină, și scăderea efectului stresului oxidativ, stimularea și creșterea apărării antioxidante (SOD, GPx) scăderea bazei inflamatorii nespecifice generale de la nivelul țesuturilor duc la scăderea citolizei, stimularea capacității antitoxice a hepatocitului, cu restabilirea echilibrului membranar, negativarea ARN-VHC, respectiv ADN-VHB.

3.1.3. Grupul 3 (de control – voluntari sănătoși)

Grupul de control a fost alcătuit din 7 voluntari sănătoși, cu vârste și sex similare cu cle ale primelor două loturi.

Tabel 33.Rezultate bioumorale

Stresul oxidativ a fost detectat în toate stadiile clinice ale bolii cronice hepatice. Rapoarte ale mai multor studii au adus dovezi conform cărora există o bună corelație între tipul și severitatea bolii și nivelul antioxidant din sânge (151). Apărarea antioxidantă enzimatică din sânge, include superoxid dismutaza (SOD), catalaza și glutation peroxidaza (GPx).

Superoxid dismutaza protejează celula de efectul toxic al radicalilor superoxizi, prin catalizarea reacției de dismutație a radicalilor (26), glutation peroxidaza descompune peroxidul de hidrogen, dar și convertește peroxizii lipizi în molecule inofensive protejând celula de consecințele peroxidării lipidice, iar glutation peroxidaza îndepărtează H2O2 prin oxidarea glutationei reduse (56).

Tratamentul întregului lot 1, care cuprinde hepatita cronică a fost astfel sistematizat prin:

monitorizarea alimentației și repaosului individualizat, conform programului (vezi pag. 91)

terapia antivirală pentru 7 pacienți seropozitivi eligibili;

terapie convențională de citoprotecție și limitarea injuriei pentru întreg lotul 1, inclusiv cei din grupul 2 seropozitiv, neeligibili, care au fost monitorizați timp de 12 luni cât a durat și tratamentul antiviral cu Interferon pegylat și Ribavirină pentru grupul 1;

principiile terapeutice aplicate:

citoprotecție și limitarea injuriei celulare cu prevenirea fibrozei hepatice.

Acidul ursodeoxicolic

Agenți antiinflamatori, de reducere a nivelului citokinlor proinflamatorii, administrând substanțe care realizează vasodilatație periferică cu combaterea stazei locale, prin flexibilizarea eritrocitelor și diminuarea vâscozității sângelui și reducerea nivelului citokinelor proinflamatoare, ca spre exemplu, TNF-α (mai cu seamă în hepatita etanolică). Expresia acestor efecte este Pentoxifilina.

Combaterea sindromului hepatocitolitic și ca stabilizator de membrană am utilizat Silimarina în doză zilnică de 450-600 mg.

Din grupa medicamentelor antitoxice am utilizat Leciva 3-5 drajee pe zi.

Terapia de susținerea sintezei proteinelor și legarea amoniacului în exces – Aspatofortul.

Terapie de protecție membranară celulară urmare a stresului oxidativ, administrând Endonal.

O combinație de trei antioxidanți puternici (acidul alfa-lipoic, Silimarina și seleniu) de mare eficiență care a indus o accentuată îmbunătățire clinică și de laborator pe termen scurt.

3.1.4. Rezultatele examinărilor comparative, start și final de studiu, pe cele trei grupuri

Am urmărit în continuarea tratamentului după 12 luni și efectele bioumorale pe grupul 1 cu tratament convențional plus antiviral cu Interferon pegylat și ribavirin, grupul 2 cu tratament convențional și grupul 3 fără tratament, sau grupul de control.

Grupul 1. Tratament convențional plus antiviral cu Interferon pegylat și Ribavirină

Malondialdehida serică, semnificatic crescută înaintea terapiei cu Interferon pegylat și ribavirim (valoarea medie de 9,27 μmol/L a scăzut după 12 luni de tratament la 1,31 μmol/L față de grupul e control unde valoarea medie a fost de 1,09 μmol/L

Superoxid dismutaza a fost înainte de tratament mai scăzută cu valoarea medie de 1443,60 U/gHg, iar după tratament a sporti la 2527,50 U/gHg.

Glutation peroxidaza, valoarea medie înainte de tratament a fost de 3966 U/L pentru tot grupul 1, iar după tratament are o valoare medie de de 10 300 U/L

Enzimele citolitice au înainte de tratament: GPT în valoare medie de 89,16 UI/L, iar la sfârșitul tratamentului a scăzut la valoarea medie de 22,91 UI/L, iar GOT de la valoarea medie de 118,04 UI/L înainte de tratament a scăzut după tratament la valoarea medie de 21,08 UI/L.

ARN-HCV-pozitiv înainte de tratament s-a negativat după tratament cu Intgerferon pegylat și Ribavirină, anticorpii anti HCV au rămas poztiv doar la 2 paceienți, iar în cazul ADN-VHB din pozitiv a devenit negativ după tratamentul antiviral cu Interferon pegylat

Proteina C reactivă a scăzut de la o demie de 8,27 mg/dl înainte de tratament la 2,16 mg/dl după tratament.

Leucocitele cu media de 11,660/mmc înainte de tratament au scăzut după tratament la o medie 774 mmc

Fosfataza alcalină de la o medie de 283,16 U/L înainte de tratament a ajuns la o medie de 123,18 U/L după tratament.

Colinesteraza serică de la o medie de 8,39 U/L a ajuns la 18,14 U/L la sfârșitul tratamentului.

Alfafetoproteina

Grupul 2 de pacienți seropozitivi sub tratament convențional.

Malondialdehida, valoarea medie la începutul tratamentului convențional a fost de 10,33 μmol/L, iar la sfârșitul tratamentului media valorii malondialdehidei a fost de 6,14 μmol/L

Superoxid dismutaza,la începutul tratamentului a prezentat o medei de 1166,76 U/gHg, iar la fârșitul tratamentului de ujn an, supravegheat, SOD medie a fost de 1986,14 U/Ghg.

GPx la începutul tratamentului a prezentat o medie de 3778,24 U/L, iar după 12 luni la tratament convenținal supravegheat s-a prezentat o medie de 4416,2 U/L

Anti anti HCV au fost pozitiv atât la debutul studiului cât și la sfârșitul său, ARN-HCV pozitiv 100% a grupului, iar la sfârșitul tratamentului a rămas pozitiv 71,42% din grup ADN-HBV, au fost pozitivi 2 paciebnți și au rămas pozitivi la finalul monitorizării. La fel AgHBs a rămas pozitiv și după 12 luni de terapie convențională supravegheată.

Proteina C-reactivă , valoarea medie la începutul tratamentului a fost de 10,94 mg/dl, iar la sfârșitul tratamentului a fost de 8,68 mg/dl.

Leucocitele, valoarea medie la începutul tratamentului a fost de 13,400/mmc, iar la sfârșitul tratamentului a fost de 9118/mmc, valoarea medie.

Fosfataza alcalină, o medie de 261,14 UI/L la începutul tratamentului și 199,16 U/L la sfârșitul tratamentului.

Colinesteroza serică 6,78 U/L la 2 pacienți și a urcat la 15,12 U/L lasfârșitul tratamentului.

GPT valoare medie 93,4 UI/L, GOT =115,66 UI/L, Alfafetoproteina – 44 ng/dl.

Grupul 3 (de control voluntari sănătoși)

Toți parametrii bio-umorali evaluați față de start se mențin la valori normale, apți pentru a fi baza de referință a rezultatelor celorlalte două studii.

Evaluarea studiului înainte de tratament cu Interferon

Rezultatele analiților celor două grupuri și a celui de control înaintea tratamentului cu Interferon pegylat și Ribavirină a grupului 1.(Toți pacienții grupurilor 1+2 au început tratamentul convențional egal)

Tabel 34

Evaluarea studiului grupului 1 după tratament cu Interferon

Rezultatele analiților celor două grupuri de studiu și a grupului de control după 48 de săptămâni de tratament

Tabel 35

Rezultatele obținute arată că stresul oxidativ este prezent în patogeneza hepatieti cronice virale B și C expresie fiind valoarea serică crescută a malondialdehidei în cele două grupuri 1 și 2 seropozitive raportate la grupul 3 (de control), înainte de tratamentul convențional supravegheat 9,27 μmol/L (gr. 1), 10,33 μmol/L (gr.2) respectiv 1,31 μmol/L (gr. 3).

În același timp răspunsul slab a organismului sub influența afectării virale cu reacția de apărare antioxidantă, chiar sub nivelul valorilor normale după cum rezultă din valorile medii comparative a celor trei grupuri înainte de tratament.

Superoxid dismutaza: 1443,60 U/gHg (gr. 1), 1166,76 U/gHg (gr. 2) și 2016,19 U/gHg (gr. 3)

Glutation peroxidaza: 3966 U/L (gr. 1), 3778,24 U/L (gr. 2), 11206,44 U/L (gr. 3).

Se constată valorile malondialdehidei mult mărite față de cele ale grupulu (3) de control, în același timp reacția antioxidantă fațăd e agresiunea stresului este exprimată chiar sub nivelul valorilor intervalului normal (gr. 3).

Continuarea tratamentului convențional complex al hepatitei cronice supravegheat a ameliorat acești parametri în comparație cu grupul de control la toate cazurile seropozitivie de hepatită respectiv la final față de start.

Aplicarea tratamentului cu Interferon pegylat și ribavirină la grupul 1 alături de terapia convențională față de grupul 2 fără terapie antivirală cu Interferon arată adevărata valoare a influenței stresului oxidativ în patogeneza hepatică cronice virale.

Astfel: sub tratamentul complex al hepatitei seropozitive (gr.1 ) plus Interferon pegylat și ribavirină aplicate atât ca doză cât și ca timp corespunzător metedologiei Ministerului Sănătății toate elementele (biochimice Malondialdehida), virusologice, (ARN-HCV și ADN-HBV, plus imunologic ant.antiHCV, AgHBs) s-au normalizat. Enzimele citolitice, GOT și GPT precum și Fosfataza alcalină s-au normalizat. Elementele expresiei inflamației Proteina C reactivă și leucocitele au revenit la valori normale. Starea clinică și reactivitatea acestor pacienți a revenit aproape integral la normal.

La grupul 2, fără tratament cu Interferon și ribavirină, tratamentul convențional complex, supravegheat 12 luni a produs o anume ameliorare biochimică și a caracterului virusologic și citolitic, dar incomparabil mai slab decât la grupul 1. Caracterul agresiv al stresului oxidativ nu a putut fi stăvilit și capacitatea antioxidativă specifică a enzimelor proprii nu a fost revitalizată, dovadă că statutul antioxidant în hepatitele virale este puternic compromis, iar cele mai multe mecanisme de apărare antioxidante sunt semnificativ scăzute. Iată rezultatele comparative ale componentelor stresului oxidativ la sfârșitul tratamntului de un an între cele două grupuri (1+2).

Tabel 36

Caratcerul inflamator care însoțește stresul oxidativ exprimat prin valoarea proteinei C-reactive și a leucocitelor arată relația dintre fondul infecțios viral, fondul inflamator general prezent și modificările biochimice determinate de stresul oxidativ, reflectate și de procesul hepatocitolitic concordant în ambele sensuri, după 12 luni

Tabel 37

Prezența ușor crescută (2,16 mg/dl) a proteinei C reactive la sfârșitul tratamentului cu Interferon poate reprezenta caracterul inflamator în restructurare a parenchinului hepatic care se desfășoară în timp, dar valoarea este aproape de normal ca și a leucocitelor, în comparație cu valoare de 6,14 mg/dl a Proteinei C-reactive și 9118 leucocite în cazul grupei 2 fără tratament cu Interferon. Componenta virală și imunologică ca reacție la eliminarea stresului oxidativ prin tratamentul antiviral cu Interferon pegylat și Ribivarină este exprimată tot prin rezultatele finale, între grupul 1 – 2 și 3.

Tabel 38

În grupul 1, după tratamentul final anticorpii antivirali HCV au putut fi indetificate la 2 persoane, doar ca expresie calitativă, în vreme ce la grupul 2 fără terapie antivirală ARN-HCV a fost pozitiv la 4 pacienți, iar ADN-HBV a fost pozitiv la 2 pacienți. Abia un pacient din cei cu HBV a fost negativ, după 12 luni de tratament.

Sindromul hepatocitolitic, cu nivele crescute ale pigmenților biliari și GPT, GOT, alături de fosfatahza alcalină sub tratamentul cu Interferon s-au normalizat față de valorile grupului de control, dar la grupul 2 aceste valori rămân încă crescute în sânge.

Tabel 39

Corelația pozitivă între valorile înalte ale malondialdehidei, valorile crescute ale enzime-lor de hepatocitoliză, proteina C-reactivă și fosfatazei alcaline și corelarea negativă cu Superoxid dismutaza și glutation peroxidaza caracterizează stresul oxidativ în hepatitele cronice virale.

Răspunsul favorabil la terapia antivirală combinată: Interferon pegylat și Ribavirină arată rolul determinant al infecției care la rândul ei cauzează dezvoltarea reacției inflamatorii cu toate etapele moleculare și de țesut, care împreună se constituie în stresul oxidativ, iar ca răspuns la tratament, expresia stresului oxidativ malondialdehida se normalizează, iar componentele enzimatice (SOD și GPx) din negative decin progresiv tot mai vizibile serologic în procesul reparator.

Concomitent scad enzimele hepatocitolitice se restabilește balanța metabolică hepatică aproape de parametrii normali.

Reprezentarea grafică pentru studiul 1

Rezultate bioumorale la grupul 1 de studiu sub tratament cu Interferon pegylat + Ribavirină – Nr. pacienți 7

Rezultatele bioumorale la grupul 2 de studiu, fără tratament cu Interferon

Enzimele hepatocitolitice înainte și după tratament pe grupul 2 cu terapie convențională, monitorizat

Grupul de control

3.2.0. STUDIUL 2

„Caracteristicile stresului oxidativ din encefalopatia hepatică portosistemică versus cele din hepatita cronică”

Cadru:

Terenul morfofuncținal pe care se dezvoltă și evoluează encefalopatia hepatică este ciroza hepatică și hepatocarcinoza.

Modelul anatomopatologic pornește de la dezvoltarea fibroasă inclusiv periportală a ficatului cirotic și dezvoltarea progresivă a hipertensiunii portale cu apariția circulației colaterale, ascitei, varicelor esofagiene, hemoragiei esogastrice, tulburări metabolice complexe cu alterarea barierei sânge-creier și crarea condiției de agresiune a creierului și funcțiilor cu degradarea persoanlității cognitive până la comă. Implicarea stresului oxidativ în patogeneza cirozei hepatice, a progresiei acesteia și a complicațiilor ei, între care encefalopatia hepatică (porto-sistemică) sunt intens studiate.

Caracteristicile stresului oxidativ din encefalopatia hepatică pot influența dezvoltarea stării comatoase și exitusul sau pot fi anihilate după identificarea cauzei ce-a declanșat encefalopatia și corectarea acesteia (infecție, hemoragie digestivă, substanțe neurotoxice etc.). Procesul este reversibil.

3.2.1. Aspecte fiziopatologice în encefalopatia hepatică

Sub raport fiziopatologic encefalopatia hepatică din ciroză se dezvoltă pe un edem cerebral de grad scăzut exacerbat ca reacție a hiperamoniemiei și a altor factori precipitanți. În 1994, studii efectuate prin spectroscopie cu rezonanță magnetică protonică in vivo pe creierul uman, au fost furnizat primele dovezi ale prezenței unui edem cerebral de grad scăzut la pacienții cu ciroză (240). Acest edem cerebral de grad scăzut este asociat cu o producție crescută de specii reactive de oxigen și oxid de azot, care vor declanța modificări ale proteinelor și ARN-ului, afectând astfel funcția cerebrală. O seamă de factori în prezența hiperamoniemiei, cum ar fi citokinele inflamatorii, benzodiazepnele, hiponatremia, alături de inflamația astrocitelor și a stresului oxidativ contribuie la dezvoltarea encefalopatiei hepatice. Urmarea efectului stresului oxidativ, specii ARN oxidate participă la sinteza proteinică post sinaptică locală din neuroni, care este necesară pentru formarea memoriei, oferind explicații biochimice pentru multiple alterări ale sistemului receptor neurotramsițător de la nivelul sinapselor. Modelele patogene ale encefalopatiei hepatice în ciroza hepatică trebuie să explice cinetica rapidă a severității simptomelor, reversibilitatea lor și faptul că episoadele sunt exacerbate de factori precipitați, eterogeni, precum și multiplele alterări ale sistemului neurotramsițător din creierul pacienților cu encefalopatie hepatică, alterări selective ale permeabiltății barierei sânge-creier.

Există la ora actuală un consens că astrocitele joacă un rol imoprtant în patogeneza encefalopatiei hepatice, cu consecințe pentru funcția neuronală. Sub raport neurofiziologic, deficiențele motorii observate în encefalopatia hepatică sunt cauza unei cuplări oscilatorii alterate patologic în zonele cerebrale cognitive superioare (241). Cele mai multe studii privind mecanismele edemului cerebral de grad scăzut s-au concentrat pe astrocite. Acumularea intraastrocitică de glutamină activă în ciroza ficatului și hiperamoniemia contribuie la dezvoltarea edemului cerebral. Diferite neurotoxine repetat implicate în patogeneza encefalopatiei hepatice ar putea promova inflamația astrocitelor, ceea ce ar putea explica că la pacienții cu ciroză factori heterogeni precum sângerarea, infecțiile virale, diureticele sau tulburări electrolitice pot precipita declanșarea encefalopatiei hepatice.

Stresul oxidativ determină atacul celulei cu specii reactive de oxigen și oxid de azot, care rezultă dintr-o producție sporită fie dintr-o indepărtare diminuată din țesuturi, ca urmare a pierderii capactiății antioxidante a acestora.

Speciile oxigenului reactiv includ anionul superoxid (O2, N7), care reacționează cu peroxidul de hidrogen pentru producerea de readicali hidroxil (OH). Speciile oxidului de azot reactiv includ oxidul nitric (NO) radicalul dioxid de azot (NO2N) și peroxinitritul (ONOO7).

Consecințele moleculare ale stresului oxidativ includ oxidarea proteinelor și acizilor nucleici, S-nitrosilarea proteinelor, nitrarea tirosinei proteinice și eliberarea de zinc din metalotioneină. Stresul oxidativ susținut declanșază leziuni celulare și apoptoză.

Există o relație strânsă între inflamația astrocitelor și stresul oxidativ, pe de o parte inflamația astrocitelor induce stres oxidativ prin intermediul receptorului NMDA (N-metic-D-aspartat) și a mecanismelor dependente de Ca2+, iar pe de altă parte activarea receptorului NMDA și stresul oxidativ declanșează inflamația astrocitelor. Consecințele funcționale ale inflamației astrocitelor și stresulu oxidativ/nitrozativ se regăsesc în evenimentele majore din fiziopatologia encefalopatiei hepatice. Astfel, în aproape fiecare tip de celulă, modificările în hidratarea celulei astrocitice reprezintă un regulator independent al transportului membranar, expresie a genei și am metabolismului prin intermediul activării căilor sensibilității osmotice și a semnalizării osmotice.

De exemplu: inflamația astrocitară hipo-osmotică declanșează activarea Kinazelor. MAP de tip ErK și p 38 sporește concentrația intracelulară a Ca2+ și stimulează sinteza glicogenului cu depunere astroglială în encefalopatia hepatică cronică.

Date recente arată că astrocitele posedă mecanisme puternice pentru vasoreglarea locală cu moderarea hiperemiei locale funcționale, proces declanșat de Ca+2 intraastrocitar într-o manieră dependentă de ciclooxigenaza 1, de unde s-a acreditat ideea posibilității ca semnalele Ca2+, astrocitele care sunt induse de inflamația celulei ar putea afecta microcirculația cerebrală. Inflamația astrocitelor ar putea dispune la disfuncția neuronală datorită tulburării funcțiilor lor homeostatice protectoare.

Inflamația moderată a astrocitelor în creier ar putea micșora volumul fluidelor extracelular din creier, care este încapsulat. Această contracție a spotrului extracelular ar putea micșora difuziunea moleculelor și spori acumularea de ioni, transmiători excitotoxici și metaboliți neurotoxici, contribuind la leziunile neurologice (242).

Inflamația astrocitară determină scăderea marcată a taurinei, care acționează nu doar ca un oasmolit și antioxidant organic, ci are și proprietăți neuro-modulatoare. Taurina este implicată în osmoreglarea secreției vasopresinei. Deficiența de taurină cerebrală duce la apariția unei legături interesante între encefalopatia hepatică și secreția vasoepreinei hipotalamice. Hiponatremia declanșează inflamația astrocitelor, dar în cindiții de nivele scăzute ale taurinei nu mai inhibă secreția vasopresiei hipotalamice. (249) Prin urmare, sarcina taurinei ca reacție la inflamația astrocitelor joacă un rol în toxicitatea cerebrală a amoniacului și implicit în patofiziologia encefalopatiei hepatice.

Dacă astrocitele sunt relativ rezistente la stresul oxidativ nitrozativ, radicalii derivați astrogliali pot afecta lanțul respirator al neuronilor înconjurători și pot contribui la compromiterea metabolismului energetic cerebral și a transmisiei neuronale în encefalopatia hepatică. Amoniacul TNF-alfa, benzodiazepinele și inflamația astrocitică osmotică declanșează o mobilizare dependentă de oxidul nitric a zincului din metalotioneină și alte proteine cu complex Zn2+ prin intermediul tiolilor cisteinei. Activitatea mai multor enzime și factori ai transcripției sunt reglate dependent de Zn2+ (243). O consecință fiziopatologică a mobilizării zincului ca reacție la stresul nitrozativ este o translocație dependentă de kinaza C proteinică a SPI în nucleu. SPI participă la reglarea expresiei receptorulu bezodiagpinei. Această proteină crescută în encefalopatia hepatică joacă rol atât în tranziția permeabilității mitocondriale și mediază reacția la stresul oxidativ față de benzodiazepenie, dar este implicată și în sinteza neurotransmițătorilor, cum ar fi alopregnanolana și corticosteron-alotetrahidrodeoxi. Această constatare ar putea furniza o explicație pentru tonusul GABA-ergic crescut la pacienții cu encefalopatie hepatică. (245)

Formarea de specii de oxigen reactiv sau RNOS care este indusă de inflamația astrocitelor duce la nitrația tirozinică a proteinelor, ceea ce indică faptul că sinergia dintre hiperamoniemie și inflamație în precipitarea simptomelor encefalopatiei hepatice este reflectată chiar la nivelul nitrației tirozinice. Peroxinitritul este implicat în nitrația tirazinei indusă de amoniac, citokine și inflamație, în timp ce nitrația tirozinei indusă de benzodiazepine este independentă de peroxinitrit și implică activarea PBR (receptorul periferic a benzediazepinei). (244). Astrocitele localizate în apropierea barierei sânge-creier, prezintă în mod special nivele înalte de tirozină cu consecințe potențiale pentru permeabilitatea barierei sânge-creier. Deci nitrația tirozinei proteice poate afecta transportul transastrocitic, ceea ce corespunde alterărilor selective cunoscute din encefalopatia hepatică. (246)

Implicațiile oxidării Arn-ului pentru neurotoxicitatea amoniacului și encefalopatia hepatică sunt insuficient cunsocute. Oxidarea ARN-ului neuronal a fost aspcoată cu o tulburare cognitivă ușoară ca etapă timpurie a bolii Alzheimer (250).

Oricum, oxidarea ARN-ului ca reacție la stresul oxidativ indus de neurotoxinele relevante din encefalopatia hepatică poate furniza o legătură între inflamația celulei și stresul oxidativ pe de o parte și alterările plasticității sinaptice, cu manifestările neurologice pe de altă parte.

Tulburarea cognitivă fără degenerare neuronală este o caracteristică a encefalopatiei hepatice și ar putea implica tulburarea potențării pe termen lung de fază târzie (L-LTP) dependentă de sinteza proteinică, învățării și consolidării memoriei datorită oxxidării speciilor mARN decodificarea post sinaptic. Magnetoencefalografic permite estimarea noninvazivă a informației procesate în creierul uman cu rezoluție mare spațială și temporală. Această tehnică a fost folostă împreună cu electromiografia la pacienții cu ciroză și encefalopatie hepatică pentru a obține informații dspre baza neurofiziologică a mini-asterixisului, adică un tremor postular de frecvență variată (6-12 Hz) care este observat la pacienții cu encefalopatie hepatică de grad scăzut. Măsurarea acestor modificări se corelează cu severitatea encefalopatiei hepatice și sunt aparent declanșate de cuplarea oscilatorie talamocorticală alterată. (251).Prin umare structurile talamice sensibile la neurotoxine și hidratare crescută (edem) ar putea acționa ca stimulatori pentru o cuplare anormală talamocorticală și cortico-musculară rigidă și de frecvență scăzută și ar putea explica unele deficiențe motorii la pacienții cu encefalopatie hepatică. Acest fapt se petrece fără o creștere vizibilă clinic a presiun ii intracranieie, dar sporirea hidratării este suficientă pentru declanșarea multiplelor alterări ale funcției astrocitice și expresiei genei în parte prin modificările dependente de stresul oxidativ ale proteinelor și ARN-ului. Amplificarea inflamației astrogliale și alături de stresul oxidativ creează o buclă de semnalizare cu auto-amplificare, iar acțiunea variaților factori precipitanți ai encefalopatiei hepatice se însumează cel puțin în parte la acest nivel. Stresul oxidativ afectează de asemenea comunicarea gliconeurală și induce oxidarea ARN-ului în neuroni cu impact asurpa plasticității sinaptice. Ca rezultat se petrec tulburări ale rețelelor cerebrale oscilatorii, care sunt responsabile de simptomele encefalopatiei hepatice.

Motivația studiului a fost sugerată de interesul tot mai crescut pe care-l ocupă stresul oxidativ în literatura de specialitate cu privire la implicarea acestuia în patogeneza unui lung șir de afecțiuni.

Scopul studiului este de a urmări relația dintgre stresul oxidativ la pacienți cu encefalo-patie porto-sistemică prin evaluarea nivelului seric a malondialdehidei (produsul final al peroxi-dării lipidice din mitocondrii, versus pacienți cu hepatită cronică și reacția de apărare antioxi-dantă a organismului prin enzimele sale specifice (superoxid dismutaza și glutation peroxidaza).

Material și metodă. Am luat în studiu un număr de 8 pacienți cu encefalopatie hepatică pe ciroza hepatică virală tip C internați în clinica noastră, în intervalul martie 2009, ianuarie 2010 și un grup de 9 pacienți cu hepatică virală cronică (B (3) + C (6)) cu viremie nedozabilă la care am urmărit manifestările statutului serologic al stresului oxidativ 18 luni.

3.2.2. Structura grupului 1 cu encefalopatie hepatică

Distribuția după sex: femei 3 (37,5%)

bărbați 5 (62,5%)

după vârstă: limite 61-76 ani cu media de 68,5 ani

după etiologie: – virală B = 2 pacienți

-virală C = 5 pacienți

-etanolică = 1 pacient

Am luat în calcul stadiul clinic al celor 8 pacienți pentru a corela simptomatologia clinică și nivelul bio-umoral al expresiei stresului oxidativ, alături de modificările bio-umorale legate de boala de fond, ciroza hepatică, a cărei complicație este encefalopatia hepatică.

Tabloul clinic într-o clasificare a manifestărilor neuropsihice din encefalopatia hepatică este cel mai bine reprezentată în adaptarea sistemului de clasificare West Haven acceptată și utilizată des de către „The American College of Gastroenterology”:

Distribuția celor 8 pacienți, în această clasificare este asociată cu motivația reactivării clinice de internare și a fost dată la:

2 pacienți cu infecție virală intercurentă

2 pacienți cu erori alimentare cu manifestare diareică prelungită,

4 pacienți cu abandonarea tratamentului de întreținere

Tabel 40 Examinările bioumorale la start și la finalul monitorizării alături de stadiul

neuropsihic West Haven

Toate cele 8 cazuri de encefalopatie hepatică au evoluat pe teren de ciroză hepatică cu sunt porto-sistemic și hipertensiune portală.

Diagnosticul a fost elaborat pe baza examenului clinic, eco-abdominal, cu decelarea fibrozei hepatice extinse, noduli fibroși, hipertensiune portală cu circulația colaterală, edeme și ascită. Ficatul mare cu margini ascuțite, ferme, neregulat, inomogenitatea parenchinului. Vena portă, mezenterică superioară și splenica mărită în volum. Splenomegalie.

Endoscopic varice esofagiene mari. Clasificarea Child Pugh a cirozei = A – 3 cazuri, B – 5 cazuri.

Conform clasificării West Haven, cei 8 pacienți au prezentat umrătoarele simptome, fiind clasificați astfel:

2 pacienți în stadiul I și prezentau: – astenie psihică marcată cu apatie

– tulburări de somn

– disartrie și hiperreflexie osteo-tendinoasă

5 pacienți în stadiul II: – modificări ale personalității

– hipertonie, disartrie

– flapping-tremor

– agitație alternantă cu somnolență crescută

1 pacient în stadiul III: – stare de confuzie și dezorientare temporo-spațială,

– ataxie

– rigiditate spastică

– discret foetor hepatic

Bolnavii sunt cunoscuți clinicii noastre prin internări repetate anterioare și ținuți în tratament cronic ambulator, supravegheați prin medicii de familie.

Cauzele care au precipitat manifestările neuro-psihice actuale, identificate la internare sunt: – infecție virală- intercurentă prlungită și rezistență la terapia aplicată, subfebrilități cu instalarea manifestărilor neuropsihice compatibile cu stadiul I-II al clasificării Bockus la 2 pacienți.

-erori alimentare practicate de mai multă vreme, însoțite de manifestări diareice, care au dus la instalarea inițială a asteniei fizice, apoi neuropsihice, cu agitație alternantă cu stări de somnolență, modificări de persoanlitate, flopping-tremor la 2 pacienți compatibili cu stadiul West Haven II.

-abandonarea tratamentului de întreținere, cu însușirea unui stil liber de viață și alimentație, care a condus la degradarea neuro-psihcă la 4 pacienți compatibili cu manifestare neuro-psihică cu stadiul II al clasificării West Haven pentru trei pacienți și stadiul III pentru 1 pacient.

În funcție de datele de mai sus s-a conceput și inițiat tratamentul dietetic farmacologic, adoptând atât complexitatea alimentației pentru fiecare pacient în parte, cât și diversele formule farmacologice.

Din examinările bio-umorale efectuate la start rezultă prezența seropozitivității: la 7 (87,5%) din cei 8 participanți la studiu (Ag HBS la un pacient (12,5%)

Sindromul hepatocitolitic cu valoari medii ale transaminazelor de 54 U/L pentru 50% din pacienți și de 112 U/L pentru 37,5% din pacienți pentru GPT, respectiv 52,5 UL pentru 37,5% din pacienți, 105 U/L pentru 62,5% din pacienți și 220 U/L pentru 12,5% pacienți, ceea ce arată pe lângă procesul de fibroză hepatică dovedit ecografic și prezența citolizei, necrozei și procesul inflamator probat prin Leucocitoza > 8 000/mmc la 65,5% din pacienți la start și 50% la finalul studiului.

Cel mai important marker al inflamației de joasă intensitate, specific evenimentelor hepatitice, este Proteina C-reactivă cu valori cuprinse între 1-3 mg/dl, respectiv între 3-10 mg/dl, și care arată caracterul inflamator general, asociat unor evenimente mai complexe filiate stresului oxidativ. Infecția, inflamația de joasă intensitate, asociate stersului oxidativ cu tulburări metabolice generale, severe determinate în celula hepatică în suferință, funcțională, întreținută și de staza intrahepatică, dar și de ischemia provocată de invazia țesutului fibros și de creșterea permeabilității pereților vasculari cu penetrarea toxinelor în circulația cerebrală, implicit prin penetrarea barieirei sânge-creier, arată cât de complex este contextul în care se generează și se dezvoltă encefalopatia hepatică.

Alături de procesul citotoxic, citolitic, infecțios și inflamator stresul oxidativ accentuează și agravează activitatea neuropsihică inițiată pe terenul hepatitei cronice virale și a cirozei.

Malondialdehida ca expresie a prezenței și activității stresului oxidativ în encefalopatia hepatică o găsim în valori de 2,12 μmol/L la 62,5% din pacienții cu encefalopatie hepatică în aceeași proporție la pacenții cu simptome neuro-psihice, calificați în stadiul II West Haven, respectiv cu modificări de persoanlitate, agitație alternantă cu somnolență, flapping și tremor, iar după un an de monitorizare sub tratamentul convențional complex, supravegheat, valoarea stresului oxidativ la unii pacienți sporește prin expresia malondialdehidei, care crește nivelul sanguin de la 2,12 >μmol/l la 7 μmol/l pentru 37,5% din pacienți, în vreme ce apărarea antioxidantă a organismului scade în expresia enzimelor superoxid dismutaza, sub limita inferioară a intervalului normal, respectiv de la 37,5% pacienți la 62,25% pacienți, iar Glutation peroxidaza, numărul pacienților cu valori sub normale crește de la 25% pacienți la 37,5% pacienți , fapt ce arată cât de mult stresului oxidativ depășește capacitatea organismului de-a combate fenomenele locale și generale patologice asociate bolii de bază cu care se asociază. Așa se explică și creșterea de la 12,5% la 37,5% a numărului de pacienți a căror simptmatologie neuro-psihică s-a complicat, sporind de ls stadiul II la III, concomitent cu creșterea nivelului seric al proteinei C-reactive, dar și a fosfatazei alcaline > 180 U/L de la 12,5% la 25% a pacienților.

Faptul că apărarea antioxidantă proprie este puțin reactivă, iar aportul antioxidantelor administrate în terapia curentă este puțin viguros, pune în valoare agresivitatea stresului activ, exprimată prin numărul de pacienți cu valori mai mari de 7 mg/dl ale proteinei C-reactive la sfârșitul monitorizării (37,5%) față de 12,5% la start. Acolo unde reacția antioxidantă exprimată prin enzimele proprii active este crescută, stresul oxidativ este anulat, iar valoarea funcțiilor normale celulare și de țesut restabilesc normalul, ceea ce arată că encefalopatia porto-sistemică este un eveniment reversibil.

Reprezentarea grafică studiul II, grupul 1 (Encefalpatia porto-sistemică)

Creșterea valorilor serice a malondialdehidelor spre finalul monitorizării concomitnt cu stadiul degradării neuro-psihice axprimată prin creșterea numărului pacienților afectați.

Pe măsura agravării evoluției, cu creșterea serică a malondialdehidei, a scăzut superoxid dismutaza și a crescut gradul afectării neuro-psihice.

Fiind teren de ciroză hepatică, la sfârșitul monitorizării numărul cazurilor cu agravare biologică a crescut, inclusiv hepatocitoliza.

3.2.3. Grupul 2 cu hepatită cronică virală, fără viremie dozabilă (9 pacienți)

Motivația studiului

Așa cum se știe, infecția ficatului cu virusul C duce frecvent la boli grave ale acestuia, între care ciroza, hepatocarcinomatoza și o seamă de complicații severe, precum hipertensiunea portală, hemoragia digestivă superioară sau encefalopatia hepatică. În ultimul timp stresul oxidativ a ieșit în evidență în dezvoltarea și progresia multor condiții patologice din patogeneza indusă de infecția virusului hepatitei C. Stresul oxidativ crescut în hepatita virală C ar putea fi explicat de inflamația cronică cu continuă generare de specii de oxigen reactiv, care ar putea fi explicată de NAD (P)H (niacin-adenin-dinucleotidul), oxidaza (proteina Nox 2) a celulelor Kupffer și celulelor polimorfonucleare din ficat. Ficatul normal este un exportator de glutationă (GSH antioxidant fabricat de ficat) și-l furnizează și altor țesuturi. Deci GSH este un important antioxidant, reducător endogen, ori hepatita virală C prin deteriorarea ficatului, acesta ar putea favoriza stresul oxidativ sistemic, cel puțin în parte prin afectarea exportului de GSH. Sunt observații care arată că la pacienții cu hepatita virală C se găsesc depozite excesive de fier în ficat, cea ce ar putea favoriza generarea de radicali liberi la acești indivizi. Se crede în ipoteza conform căreia hepatita C-virală produce stres oxidativ prin intermediul a multiple mecanisme care includ:

inflamația cronică

supraîncărcarea cu fier

lezarea ficatului și limitarea generării de antioxidanți (GSH) (26,30, 56, 58, 151).

Mediul redox celular este strâns legat de antioxidanți/reductori precum și de enzimee antioxidante care fie îndepărtează direct oxidanții, fie inversează chimia lor. Efectele stresului oxidativ/nitrozativ în patogeneza HCV implică cel mai probabil efecte dăunătoare ale specilor reactive de oxigen sau azot, precum și efectele lor mai subtile asupra semnalizării și construcției celulare. De exemplu, stresul oxidativ poate induce proliferarea celulelor hepatice stelate, sinteza TCF-beta și colagenului (226). Acest fapt joacă probabil un rol important în dezvoltarea fibrozei ficatului asociată cu infecția HCV. Supraîncărcarea cu fier prezentă la unii pacienți cu hepatită C este implicată în lezarea hepatocitului. Stresul oxidativ a fost propus ca mijloc de prognostic și în monitorizarea progresiei bolii. Chiar mai mult, stresul oxidativ ar putea participa la dezvoltarea steatozei hepatice și la progresia sa spre fibroză și ciroză la pacienții cu hepatită cronică C. (253)

Stresul oxidativ se dezoltă puternic în boala ficatului, așadar prin diminuarea „fabricării” de GSH, ca antioxidant puternic determinată de scăderea numărului de hepatocite valide, iar pe de altă parte depozitarea fierului în ficat generază formarea de radicali liberi favorabili acțiunii stresului oxidativ.

Obiectivul studiului: este acela de a identifica prezența stresului oxidativ la un grup de 9 pacieți cu hepatită cronică virală C (viremia-nedetectabilă, dar cu prezența anticorpilor virali C) și influența acestuia asupra evoluției hepatitei virale C.

Material și metodă

Din bolnavii internați în secția noastră pe parcursul anilor 2009-2010, am selecționat 9 pacienți care au fost diagnosticați în ultimii 10 ani cu hepatită virală C, stabilizați și tratați ambulator. La internarea în secția noastră după selecție, nu s-a putut indentifica prezența viremiei, aceasta fiind nedetectabilă. Includerea în studii a vizat absența altor afecțiuni ale ficatului, cardio-vasculare, neurologice sau neoplazice.

-vechimea bolii: mai mare de 4 ani

-repartizarea pe sexe: femei 3, bărbați 6

-media de vârstă: 51 ani, limite de vârstă 33-69 ani.

Toți pacienții au fost supuși investigațiilor bio-umorale și imagistice egale la start și la sfârșitul perioadei de monitorizare de 12 luni.

Tabel 41 Rezultatele investigațiilor bio-umorale:

Reprezentarea grafică a studiului II, grupul 2 de studiu (9 pacienți)

3.2.4. Comentarii la studiul II

4 pacienți (44,44%) din totalul grupului au prezentat constant valori crescute ale malondialdehidei între 1,24-3 μmol/L, un pacient și între 3-5 μmol/L, 3 pacienți care au avut și enzimele antioxidante sub limita normală a intervalului serologic, respectiv 3 pacienți 33,33% și abia 3 (22%) au dezvoltat o cantitate de enzime de apărare mai semnificative după ce hepatita cronică s-a stabilizat.

În corelație pozitivă cu prezența malondialdehidei, expresie a prezenței stresului oxidativ au fost elemente de inflamație prezente, Proteina C-reactivă la valori crescute moderat (1-3 mg/dl) 3 pacienți și 4-5 mg/dl, 2 pacienți, iar leucocitele la aceștia au fost constatate la peste 8000 pe mmc. Un grad moderat de anemie cu Hg < 12 și hematocritul < 37%, dar și trombociții < 150 000/mmc, LDH > 240 UI/L. ferul ionic între 160-196 μg/dl, iar Feritina 300-440 μg/L la 3 pacienți. Toate aceste elemente identificate la același grup de 3 pacienți, respectiv parțial la încă unul, arată că la acești pacienți stresul oxidativ este prezent și contribuie la un proces de evoluție hepatitică cu hepatocitoliză (GOT și GPT, mai mari de dublul normalului pentru 3 pacienți, bilirubinemia totală și directă în limite patologice, colinesterza scăzută, iar enzimele antioxidante sub limita inferioară a normalului la 3 pacienți ca semn al scăderii capacității ficatului de-a genera aceste enzime (GSH) fie prin prezența unor factori de agrsiune asupra hepatocitului, fie prin excesul radicalilor liberi proliferați în prezența unor factori ca inflamația și excesul de fier din ficat.

În concluzia studiului se constată că între 55-66% din pacienți au o evoluție clinică și bio-umorală favorabilă în contextul diagnosticul de hepatită cronică virală C și B, sub un tratament cronic de întreținerea 33-44% din pacienții grupului sunt afectați de prezența unei activități inflamatorii de grad scăzut cu Proteina C-reactivă ușor crescută, leucocitoză, anemie moderată, sindrom de hepatocitoliză, trombopenie, ușoară retenție biliară, nivele sporite ale fierului seric, dar și nivele modificate ale stresului oxidativ, cu Malondialdehida crescută moderat și superoxid dismutaza, respectiv Glutation perioxidaza scăzute față de nivelul inferior al intervalului normal.

Aspectul ecografic al ficatului la acest grup de studiu ne arată că la 3, respectiv 4 pacienți, care corespund cu modificările bioumorale marcate de stresul oxidativ prezintă și modificări structurale ecografice cu zone de țesut fibrotic și inflamator incipiente și micronoduli dispersați în lobul caudal pe fața superioară. Splina este reacționată de volum. Calibru venei splenice și mezenterice sperioară reacționat.

Aceste modificări sugerează progresia hepatitei cronice virale spre ciroza ficatului.

4.0.0. Discuții

Stresul oxidativ și implicațiile sale în patogeneza bolii hepatice virale B și C este tot mai mult dezbătut în literatura de specialitate, atât ca aspecte ale cercetării, cât și ca aplicații în practica clinică.

Infecția virală hepatică cronică este marcată de stresul oxidativ sistemic care este cel mai probabil cauzat de o combinație dintre inflamația cronică, supraîncărcarea cu fier și deteriorarea consecutivă a celulei hepatice. Stresu oxidativ favorizează dezvoltarea infecției virale, a inflamației și a disfuncției hepatice consecutive și în perspectivă a fibrozării hepatice, hipertensiunii portale, tulburării ciruclatorii și metabolice cu apariția în circulația cerebrală de metaboliți toxici, determinanți ai manifestărilor neuro-psihice din encefalopatia porto-sistemică. Stresul oxidativ a fost identificat în toate condițiile clinice ale bolilor de ficat prin dovezi clare conform cărora există o bună corelație între tipul și severitatea bolii pe de o parte și nivelul antioxidant din sânge. (151).

Efectul oxidativ al stresului este evaluat prin nivelul seric sporit al malondialdehidei. În cercetările sale De Maria (30) o găsește mult sporită în sângele și ficatul bolnavilor cu hepatită cronică virală. În același timp a putut fi pusă în evidență apărarea endogenă antioxidantă, enzimatică prin superoxid dismutază, catalaze și glutation peroxidază (56). Relația dintre acțiunea și efectele stresului oxidativ asupra pacienților cu diferite afecțiuni hepatice virale și răspunsul antioxidant-enzimatic al organismului este și obiectivul lucrării noastre. Analiza rezultatelor examinărilor din startul studiului efectuată pentru pacienții recrutați a permis identificarea a patru loturi: lotul unu format din 23 de pacienți cu hepatită cronică virală B, C și etanolică, lotul doi format din 14 pacienți cu ciroză hepatică Child A și A spre B, lotul trei format din 11 pacienți cu hepatocarcinom și lotul patru cu encefalopatie hepatică (porto-sistemică).

În studiul 1 al hepatitei cronice virale am alcătuit două grupuri de studiu: grupul 1 format din 7 pacienți cu hepatită virală cronică C și B, care s-au încadrat în Protocolul terapeutic în hepatita virală publicat în monitorul Oficial al României, Partea I nr. 386 bis/10 III.2010 de tratament cu Interferon pegylat alfa 2 b și Ribavirin. Cura a durat 48 de săptămâni au fost efectuate controalele de eficiență și răspuns la tratament la intervalele recomandate. S-a urmărit relația stresului oxidativ (MDA) și efectele sale asupra biologiei din hepatita cronică virală, prcum și răspunsul antioxidant (SOD, CSH-Px), reacția citolitică și inflamatorie (GOT, GPT-PCR etc.)

Aceleași elemente bioumorale au fost urmărite și pe grupul 2 din studiul 1 format tot din 7 pacienți, care nu au beneficiat de criteriile de includere în tratamentul cu Interferon pegylat și Ribavirină. Aceștia au fost deopotrivă monitorizați ca și grupul 1 și au primit tratament cu antioxidant asociate, hepatoprotectoare (acid orotic, aspartic, vitmaine din grupul B, aspatofort, purinor, hepatobionta și antitoxice (stabilizatori de membrană), silimarina, acidul ursodeoxicolic etc. Pentru ambele grupuri tratamentul monitorizat a durat 48 de săptămâni.

Rezultate constatate la sfârșitul tratamentului:

Grupul 1: Malondialdehida cu valori medii serice de 9, 27 μmol înainte de tratament a ajuns la valori în intervalul normal (1,31 μmol/L) după tratamentul cu Interferon pegylat și Ribavirină. SOD și GSH-Px scăzute sub nivelul normalului de la grupul de control, 1443,60 U/gHg valoare normală au sporit la sfârșitul tratamentului la 2527,50 U/gHg valoare medie. Transaminazele serice de la valori semnificativ crescute la 89,16 respectiv 118,04 valori medii înainte de tratament, au scăzut la sfârșitul acestuia la 22,91, respectiv 21,08 U/L valor medii Proteina C-reactivă, leucocitele s-au normalizat, dar și ARN-VHC a devenit nedetectabil la grupul cu tratamentul asociat Interferon pegylat plus Ribavirină.

Și în studiul nostru ca și în alte studii similare (30, 58) se arată că Malonaldehida serică este semnificativ sporită la pacienții cu hepatită virală înaintea tratamentului cu Interferon pegylat și Ribavirin, atunci când se compară cu subiecții grupului de control sănătoși. Rezultatele confirmă implicarea stresului oxidativ ca parte a fiziopatologiei în hepatita cronică cu atât mai mult cu cât, înaintea tratamentului enzimele endogene de apărare (antioxidante) au avut un nivel seric scăzut, comparativ cu grupul de control la pacienți sănătoși, iar la sfârșitul tratamentului, pe măsură ce ARN-ul HCV a fost nedetectabil, SOD și GSH au prezentat tendințe de creștere în serul sanguin, concomitent cu normalizarea nivelului seric al GPT și GOT.

Rezultate asemănătoare au fost raportate și de alți autori (Suarez et al, Kramer et. al.).

Scăderea reacției enzimatice antioxodante atenționează asupra gradului de leziune hepatică și a incapcității ficatului de-a neutraliza radicalii liberi ai oxigenului (56).

Demirdag et. al. (61), într-un studiu pe pacienți cu hepatită cronică virală B și C remarcă nivelele serice scăzute ale enzimelor antioxidante, față de intervalele normale. În alt studiu Irschad (63) a raportat aceleași valori scăzute indiferent de tipul de virus hepatic.

Relația pozitivă dintre infecția hepatică virală Malondialdehida a fost raportată de Nagoer (64), care a arătat că nivelul seric maxim al Malondialdehidei este în perioada de vârf a evoluției hepatitei virale acute și scade pe măsura regresiei și intrarea în convalescență, ceea ce trimite la relația stresului oxidativ cu patofiziologia hepatică virală. Toate manifestările enzimatice oxidative și antioxidative reprezintă manifestări fizio-patologice ale stresului oxidativ în evoluția hepatitei cronice virale Bși C și iau parte la patogeneza hepatitei virale. Este constatat că în hepatita cronică virală C capacitatea antioxidantă este mai scăzută (151). Reducerea cantității de SOD și GSH-Px reflectă atât o scădere a capacității de sintetizare a ficatului bolnav, cât și a puterii de apărare antioxidantă generală a pacienților cu hepatită cronică virală C cauzate de inflamația de nivel scăzut indusă de infecția virală. Peroxizii rezultați urmarea stesului oxidativ sunt chemotactici pentru neutrofile, determinând sporirea inflamației, astfel sunt stimulate în plus leziunile mediate oxidativ din ficat și evoluția defavorabilă a acestuia. Așa se explică nivelele crescut înainte de tratament a Proteinei C-reactive, leucocitelor și VSH, a transaminazelor serice, fosfataza alcalină și bilirubina totală și directă. Trtatqamentul cu Interferon pegylat și Ribavirină aplicat grupului 1 de studiu a indus diminuarea progresivă a infecției virale, a replicării acesteia consecutiv, căreia inflamația a scăzut și s-a remis, mecanism prin care sa eliminat stresul oxidativ. După 48 de săptămâni, refacerea bio-umorală și clinică s-a încadrat în intevalul normalului în procent de peste 86% a membrilor grupului 1 de studiu comparativ cu grupul de control.

În paralel relațiile despre grupul 2 din același de studiu, rezultatele au fost cu totul diferit. În literatură sunt publicate o seamă de lucrări clinice care au obținut efecte benefice în terapia cu antioxidante la pacienți cu infecție virală cronică a ficatului. De la terapia intravenoasă cu Glicirizină, care a dus la scăderea citolizei hepatice, cu refacerea histologică parițială a hepatocitului, până la combinații de trei antioxidanți puternici, toți au încercat vindecarea.

Milhem și colaboratorii au sugerat o combinație de mai mulți antioxidanți la pacienți cu HCV cronică pentru ameliorarea reacției inflamatorii echivalată prin enzimele hepatice și scorul inflamator al biopsiei hepatice. Herbay a observat efectele benefice ale vitaminei E asupra aminotranferazei la pacienții cu HCV, astfel că o mulțime de aspecte ale efortului de tratare a hepatitei virale s-au dezvoltat peste tot, dar cu rezultate inconsecvente.

În grupul doi al cercetării noastre pe 7 pacienți cu HCV cronică sub tratament cu antioxidante, hepatoprotectoare, dietă și monitorizare, rezultatele exprimate prin markerii oxidanți (malondialdehida) și antioxidanți (SOD și GSH), precum și enzimele hepatocitolizei GPT și GOT, markerii inflamației proteinei C-reactivă și leucocitele au evidențiat o ameliorare duopă 48 de săptămâni, der rezultatele față de grupul 1 cu tratament antiviral cu Interefron Pegylat și Ribavirină sunt mult indferioare. În același spirit sunt și rezultatele obținute de Look ez. Al, care arată că terapia adjuvantă cu N-acetilcisteină și Seleniu la terapia cu In terferon alfa aplicată pacienților cu hepatită virală C nu a sporit răspunsul antiviral.

Stresul oxidativ are un rol important la progresia hepatitei cronice spre ciroză. Diferiți markeri ai stresului oxidativ au fost găsiți crescuți pe parcursul evoluției și complicațiilor hepatitei cronice virale.

În studiul nostru nivelul malondialdehidei serice la pacienți cu hepatită cronică virală a fost pozitiv asociată cu progresia spre ciroză comparativ cu a grupului de control, astfel la 5 (21,73%) din 23 de pacienți cu hepatită c ronică virală, nivelul malondialdehidei a sporit alături de proteina C-reactivă spre sfâșitul monitorizării, iar imaginea eco a ficatului a evidențiat sporirea procesului de fibroză, mai ales în zona peiportală, semn al trecrii spre ciroză.

Pacienți cu ciroză secundară HBV au istoria naturală diferită de cei HCV, în relația cu ierarhia complicațiilor. Astfel ascita este mai frecventă ca și complicație timpurie la cei pozitivi HbsAg, în timp acest aspect nu l-am observat la cei negativi pentru ADN-HBV.

Am constatat de asemenea că nivelul crescut al stresului oxidativ este asociat cu dezvoltarea hipertensiunii portale. Cei cu ascită au valori ale malondialdehidei sporite față de cei fără ascită.

În cadrul encefalopatiei porto-sistemice nivelul sporit al stresului oxidativ este pozitiv asociat la 5 (62,5%) din 8 (100%) cu gradul de afectare neuro-psihică, astfel că aceștia au fost încadrați în stadiul I-II West Haven la debutul studiului, și la stadiul II-III West Haven la sfârșitul studiului față de restul de trei (37,5%) al căror nivel seric al malondialdehidei a rămas mai scăzut și încadrarea simptomatică neuro-psihiatrică a rămas la std. I West Haven după monitorizarea de un an.

Stresul oxidativ influențează dezvoltarea și agravarea simptomelor clinice, bio-umorale și imagistice ale hepatitei virale cronice spre ciroză, și ale cirozei spre complicațiile sale specifice, din care noi am urmărit encefalopatia porto-sistemică (encefalopatia hepatică), în care se evidențiază că există un paralelism între complexitatea și intensitatea simptomelor neuro-psihiatrice și valoarea serică mai crescută a malondialdehidei, dar și scăderea enzimelor endogene antioxidante spre sfârșitul monitorizării la 37,5% din pacienți ca semn al reversibilității encefalopatiei portosistemice..

Combaterea stresului oxidativ repoziționează valorile oxidante și antioxidante în aria intervalului normal al organismului.

5.0.0. Concluzii

Scopul studiului nostru a fost să indetifice și urmărească efectele stresului oxidativ asupra unor afecțiuni hepatice, precum și impactul asupra evoluției acestora. După monitorizarea unor grupuri de studiu am observat că:

Stresul oxidativ reprezintă o manifestare biochimică activă, cu implicarea directă în patogeneza unor boli ale ficatului (hepatită cronică virală, ciroza hepatică consecutivă, hepatocarcinomatoză, precum și în unele complicații ale acestora, recte encefalopatia hepatică).

Celulele sunt protejate împotriva proceselor oxidative de către produsele antioxidante naturale, cu precădere glutationului, și prin diverse enzime antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT) și glutation peroxidaza (GSH-Px) [2]. Stresul oxidativ se dezvoltă atunci când apare o perturbare în echilibru între formele reactive de oxigen produse în exces și între factorii de prevenire a apariției a efectului lor nociv.

Stresul oxidativ favorizează prin destabilizarea unor echilibre celulare scăderea apărării proprii și dezvoltarea infecției virale, a inflamației țesutului hepatic, implicit procesul de hepatocitoliză.

În hepatita cronică virală stresul oxidativ favorizează evoluția spre fibroză și ciroză, respectiv spre dezvoltarea carcinomatoasă a hepatitei.

Inflamația legată de infecția virală sporește stresul oxidativ, exprimată prin nivelele serice sporite ale malondialdehidei și nivelele scăzute ale antioxidanților endogeni, proces ce se poate constitui într-un marker al prezenței stresului oxidativ în hepatita cronică.

În hepatita cronică virală seropozitivă tratamentul cu Interferon pegylat și ribavirină la cazurile bine selectate poate produce vindecare.

Virusul hepatitei C (HCV) este unul dintre principalii agenții responsabili de hepatitele cronice virale. Hepatita cronică C poate progresa spre ciroza și în cele din urmă la carcinom hepatocelular pe o perioadă de 20 până la 30 de ani. Mecanismele prin care HCV provoaca deteriorarea celulelor nu sunt bine înțelese. Mecanisme diferite, inclusiv leziuni hepatice imunologice, citotoxicitatea directă mediată de diferite produse virale și inducții de stres oxidativ au fost sugerate că joacă un rol patogen în această infecție [1].

HCV poate cauza stres oxidativ în celule infectate. Câteva linii de susținere ca dovadă a acestei afirmații, inclusiv existența la nivelul activat turnover-ului glutationului, prezenta unor niveluri crescute de produse de peroxidare lipidelor precum și mai numerose stocurilor de de fier din ficat, precum și constatarea la nivelul valori diminuate ale glutationului redus în celule mononucleare sanguine periferice și în eritrocite. Mai mult decât atât, s-a arătat că pacienții cu hepatită cronică C prezintă o producție crescută la nivelul factor de necroză tumorală-alfa (TNF-α), o citokină care poate produce stress oxidativ prin simularea generării la nivelul specii reactive de oxigen (ROS), cum ar fi ionul superoxid (O2. -) precum și peroxidul de hidrogen (H2O2). ROS pot deteriora celulele provocând peroxidarea lipidelor, precum și prin daunele oxidative la nivelul ADN-ului și al proteinelor​​, precum și prin epuizarea stocurilor de ATP. În prezența metalelor (de exemplu Fe3 +), O2 -. poate reacționa cu H2O2 pentru a genera un radical hidroxil devene chiar mai reactiv precum și mai citotoxic decât O2 -. sau de H2O2 [2].

În studiul nostru nr. 1, pe un grup de 7 pacienți, care au respectat criteriile de includere după 48 de săptămâni, am obținut revenirea la limite normale ale malondialdehidei și proteinei C-reactive, normalizarea enzimelor de citoliză hepatică, reacționarea și chiar creșterea enzimelor endogene (SOD și GSPx) antioxidante.

La un grup similar cu primul, monitorizat în același condiții, cu markerii bioumorali grupați cu cei din grupul 1, dar care nu au primit tratament cu Interferon pegylat și Ribavirină, a primit în schimb tratament hepatoprotector complex, antioxidante asociate, dietă și repaus. Markerii stresului oxidativ și inflamației au fost parțial îmbunătățiți , valorile lor la sfârșitul celor 48 de săptămâni de monitorizare s-au menținut crescute fgață de grupul de control. Enzimele citolitice de asemenea s-au menținut deasupra limitei superioare a convenționalului, dar semnificativ scăzute față e valoarea dinaintea începerii tratamentului antioxidant la acest grup.

Dacă rezultatele de la grupul I s-au datorat eliminării infecției și respectiv a infamației ca urmare a acțiunii Interferonului pegylat și Ribavirinei, în grupul II de studiu de tratament cu antioxidanți asociați rezultatele chiar dacă nu sunt egale cu cele din grupul I sunt mult îmbunătățite față de tratamentele nemonitorizate. Așa cum subliniază în studiul său Melhem și colaboratorii tratamentul cu antioxidanți combinați la pacienții cu infecție HCV cronică ar putea ameliora reacția inflamației dovedită și măsurată prin valoarea enzimelor citolitice și markerii inflamatori.

În cazul grupului II cu adevărat atât markerii citolizei (GOT, GPT), cât și a inflamației (Proteina C-reactivă, leucocitele, neutrofilele și limfocitele) au fost găsite la sfârșitul studiului aproape de intervalul normalului la 4 din 7 pacienți (57,14%). La 42,85 % din pacienții acestui grup nivelul Malondialdehidei a crescut sub tratament alături de Proteina C-reactivă, GOT și GPT. În 3 (42,85%) cazuri s-a constatat o progresie ecografică a procesului de fibroză hepatică însoțită de creșterea bilirubinemiei totale și directă, scăderea albuminei serice și a plachetelor sanguine, fosfatazei alcaline și alfafetoproteinei.

Evoluția defavorabilă a hepatitei cronice virale se accentuează, odată cu creșterea nivelului seric a proteinei C-reactive și Malondialdehidei, concomitent cu diminuarea Glutamil peroxidazei endogene. În statisticile publicate în diverse lucrări se arată că 10-20% din pacienții cu infecție HBV sau HCV cronice fa ciroză hepatică în prima decadă a evalujării clinice.

Studiul II (grupul I) generat de prezența cirozei hepatice Child A, 5 din 8 pacienți (62,5%) și Child A spre B, 3 pacienți (37,5%), care cuprinde manifestări clinice de encefalopatie hepatică, nivelul seric al Malondialdehidei la pacienții cu Child-Pugh B a fost aproape dublu față de cei din Child A și s-a menținut până la controlul de 6 luni de la demararea studiului. Cu ocazia acesti evaluri bioumorale și ecografice din grupul cu Child A au progresat spre Child B încă 3 pacienți, astfel că numărul total al celor din Child B a sporit la 6 (75%). Simptomatologia neuro-psihiatrică de stadiul I (West Haven) a progrest spre stadiul II (West Haven).

Valorile Malnonilaldehidei (MDA) serice au crescut semnificativ la pacienții CHC [carcinom hepato celular/hepatocarcinom (n: 19)], înainte de tratament în comparație cu subiecții sănătoși (n: 28) 9.28 ± 1.61, 4.20 ± 1.47 nmol / ml, p <0,001. Concentrația MDA a scăzut semnificativ (p <0,001), după tratament, precum activitatea ALAT, ASAT, la acești pacienți. Enzimele medii antioxidante (superoxid dismutaza și glutation peroxidaza) au fost semnificativ mai scăzute la pacienții cu CHC înainte de tratament, comparativ cu grupul de control (ambele, p <0,001). Pacienții cu hepatita C, forma cronică, după intervenția de tratament cu interferon alfa-2b si ribavirina au prezentat valori ale SOD, GSH-Px semnificativ mai mari decât nivelurile de pretratare (ambele, p <0.001).

Monitorizarea acestui grup [Studiul II (grupul I)] arată o corelare pozitivă între nivelul seric sporit al Malondialdehidei, Proteinei C-reactive, scăderea sub limita intervalului normal al glutamol peroxidaza și superoxid dismutazei. Concomitent a scăzut albumina serică sub 3,5 g/L, a crescut TP peste 14 sec., gradul de anemie a crescut, plachetele sanguine au scăzut. Starea clinică s-a alterat, hipertensiunea portală a sporit și concomitent nivelul lichidului ascitic.Faptul că după adaptarea tratamentului la stadiul clinic nou cu antioxidante asociate hepatoprotectoare și diuretice asociate s-a amendat starea clinică, s-au ameliorat unii markeri bio-umorali, inclusiv malondialdehida și Proteina C-reactivă, precum și ameliorarea simptomelor neuro-psihice de la stadiul II la I, arată că stresul oxidativ sporește cu alterarea stării clinice și progresia de la un stadiu inferior la unul superior și regresează odată cu ameliorarea factorilor patogenetici., ceea ce subliniază implicarea sa patogenetică.

Am comparat nivelul mediu al nivelului superoxid dismutazei la pacienți cu CHC înainte de tratament (213.84 ± 71.61 U / ml) cu activitatea SOD medie în grupul de control (285.78 ± 96.46 U / ml) (p <0,001). Am demonstrat că activitatea medie SOD la pacienții cu CHC este semnificativ statistic mai mică (p <0,05) comparativ cu grupul de control sănătoși.

Rezultatele noastre au aratat ca SOD a fost scăzută în mod semnificativ la pacienții CHC înainte de tratament, comparativ cu subiecții sănătoși (p <0.001). Acest rezultat poate indica o scădere a capacității antioxidante la pacienții cu hepatita cronică C. Reducerea cantității de SOD, precum și GSH-Px reflectă atât o scădere a capacității de sintetizare de la nivelul hepatic, precum și a competenței de apărare antioxidantă a pacienților cu CHC. Se poate argumenta că a crescut peroxidarea lipidică care este cauzată de procesul inflamator conex infecțiilor virale și scăderii nivelurilor de antioxidanți care ar putea fi un marker precoce al stresului oxidativ instalat sau pe cale de instalare. Peroxizii lipidici constituiți pot fi chemotactici pentru neutrofile provocând o inflamație crescută, ceea ce conduce în continuare la un prejudiciu oxidanți-mediat în ficat [14].

Nivelul seric al MDA (malondialdehida), NO (oxidul nitric), GSH (glutationul redus) , GSH-Px (glutation peroxidaza), GR precum și SOD (superoxid dismutaza) au fost determinate prin metode spectrofotometrice. Nivelurile serice (medie ± deviație standard) nivelul MDA (6,7 ± 1,6 vs 2,8 ± 1,7 nmol / ml, p 0,0001), NO (135 ± 28 vs 113 ± 35 mmol / L, p 0,04), GSH (919 ± 137 vs 770 ± 128 mmol / L, p = 0,003) au fost crescute la pacienții investigați vs. loturile de control. Nivelurile serice nivelul ale GSH-Px (1063 ± 152 vs 1000 ± 94 U / L) precum și GR (47 ± 22 vs 40 ± 21 U / L) nu au fost semnificativ diferite la pacienții investigați vs. control. Cu toate acestea, nivelul seric al SOD (1,24 ± 0,32 vs 1,51 ± 0,37 U / ml, p: 0,04) a fost în mod semnificativ scăzut în ansamblu.

Corectarea sindromului hepatocitolitic nu a fost eficientă decât numai după scăderea nivelului seric a factorilor oxidanți (malondialdehida) și inflamatori (proteina C-reactivă, leucocitele, fosfataza alcalină). Deși mecanismele moleculare ale patogenezi HCV rămân neclare, stresul oxidativ se evidențiază ca un pas cheie și un inițiator major al dezvoltării și progresiei deteriorării ficatului, iar evaluarea stresului oxidativ ar putea fi utilă pentru o mai bună înțelegere a patogenezei hepatitei C-virale. (5)

Niveluri mai scăzute de pretratare ale antioxidanților și nivelul MDA mai ridicat ar putea fi semnul cel mai probabil al (începerii) stresului oxidativ. Schimbarea prin inversare la nivelul acestor parametrii, cu finalizarea tratamentului poate indica o corelație între stresul oxidativ precum și patogeneza virală. Suplimentele antioxidante pot fi adăugate la acești pacienți în timpul tratamentului lor clinic.

Malondialdehida care este un compus foarte reactiv, nu este de obicei observată în formă pură. Speciile reactive de oxigen degradează lipidele polinesaturate, formând astfel malondialdehidă. Acest compus, care este o aldehidă reactivă precum și una dintre cele mai electrofil specii reactive care provoacă stress toxic în celule și formează produse finale avansate de glicozilare. Producția acestei aldehide este folosită ca un biomarker pentru a măsura nivelul stress-ului oxidativ într-un organism (Moore, et.al;1998, Del Rio, et.al, 2005).

Stresul oxidativ este foarte bine evidențiat a fi un element cheie în patogeneza nivelul leziunilor hepatice etanol asociate. Substanțele toxice generate în timpul metabolismului alcoolului la nivelul ficatului pot contribui la dezvoltarea de boli hepatice alcoolice (Nordmann R, et.al, 1992, Situnayake RD, et.al;1990). Infecția cu virus hepatitic B cronică produce, de asemenea, daune hepatocelulare prin creșterea stresului oxidativ, care sunt considerate a fi cei mai importanți factori de risc pentru dezvoltarea unui nivel de ciroza (Carmela, et.al, 2003). Conform studiului nostru există o mare diferență în valorile medii ale GSH antioxidanți si a catalazei la pacienții examinați față de cei din liotul control si de control. GPX și MDA au fost foarte crescute la pacienții ciroză hepatică. Scăderea antioxidanților GSH și a catalazei indică în mod clar că există un rol bine definit al nivelului stresului oxidativ în fiziopatologia bolilor de ficat.

Se recomandă tot timpul, în cadrul management-ului acestei patologii, investigații suplimentare pentru a evidenția și controla precoce toate aceste probleme și situații de repercusiune clinică/biologică/imunologică care pot surveni cu o exprimare acută, subacută sau chiar cronică prin omisiune a simptomatologiei sau a elementelor de tratament.

BIBLIOGRAFIE

Vuppalanchi, Traj MD et. al. – Oxidative stress in chronic Siver Disease: Relationship Between Peripheral and Hepatic measurements. American Jaournal the Medical Sciences, october 2011, vol. 432-Tassue 4, pp 314-317.

Jinah Choi and J.H. James Om – Mechanism of Liver Injury. Oxidative stress in the pathogenesis of hepatitis C virus. Hepatology 2011 HMR-401 Los Angeles, CA 90033

Natalie Strobel et. al. – Quantifying Oxidative stress and its Role in Mitochondrial Biogenesis. Medical and Health Sciences, 2009-11 The University of Queensland

Luis A Videla et. al. – Oxidative stress related parametres in the liver of non-alcoholic fatty liver disease patientsi. Clinical Science (2004) 106, (261-268) (Printed in Great Britain)

Gonzalez-Gallego J. et. al. – C-Virus, Stress and Steatosis: Current Status and Perspectives. Curent Molecular Medicine. Volume 11 nr. 5 July 2011, pp. 373-390. (18)

Trotti R. Et. al. – Oxidative stress and a thrombophilic condition in alcoholics without sever liver disease. J. Exp. Biol. May 15, 2011 – february- 1 88: 650-659.

Dryden, Gerald W. et. al. – Clinical implication of oxidative stress and antiooxidant therapy, Neurology October 22, 2002, Arch Dis. Child Ed. March

Mahmood S. et. al. – Ummunohistochemical evaluarion of oxidative stress mar-kers in cronic hepatitis C, 6: 19-24, 2004, Web of Science

Moriya K, et. al. – Oxidative stress in the abcese of inflammation in hepatitis C virus associated heaptocorcinogenesis, Cancer Res 61: 4365-4370.

Poli G. – Pathogenesis of liver fibrosis rol of oxidative stress, Castroenterology 122: 366-377, 2002.

Sumida Y, et. al. – Serum thioredoxin levels as an indicator of osidative stress in patients with hepatitis C virus infection, J. Hepatol 33: 616-622, 2000

Xiao-Peng Fan, et. al. – Oxidative stress, Copyright (C) 2009 by The Japanese Society of Internal Medicine

Mahmoud Rushdi, Abd Eliah – The Role of Liver Biopsy in Detection of Hepatic Oxidative Stress, Veterinary Medicine International, volume 2011, 10.4061/2011/613602.

Mc Carol, J.M. – Iron, free radicals, and oxidative stress, J. Hematology, 1998, 30:403-411

Rosen G.M. et. al. – Free radicals and phagocytic cells. Faseb Jaournal 9:200-209, 1995

Toykuni, S. – Reactive oxygen species induced molecular damage and its aplication in pathology. Pathology international 49:91-102, 1999

de Groot, H – Reactive oxygen species in tissue injury. Hepato-Gastroenterology, 41:328-332, 1994

Halliwell B. – Antioxidant defense mecanism: From the beginning to the end. Free Radical Research 31: 261-272, 1999.

Bailey, S.M. et. al. – Contribution of mitochondria to oxidative stress associatd with alcoholic liver disease. Free Radical Biology et. Medicine. 32:11-16, 2002.

Choi J., et. al. – Structure and functions of Hepatitis C. Virus care. Recent Res. Devek Virol 3: 105-120, 2001

Sies H – Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology 82:291-295, 1997.

Bannerize W.P. – Oxidative stress. J. Cell. Mol. Med. 2002, Jul-Sep: 6 (3) 399-406.

Fridovich, I. – Superoxide anion radical, superoxide dismutases, and related matters, 1997 Journal of Biological Chemistry 272: 18515-18517

Polavarapu, R., et. al. – Increased lipid perocidation and impoired antioxidat injuri in experiemental alcoholic liver disease in rats fed diets high in carn oil and fish oil, Hepatology 27: 1317-1323, 1998

Knecht, K.T. et. al. – Free radical adducts in the bile of rats treated chronically with intragastric alcohol, 1995, Molecular Pharmacology, 47:1028-1034

Boya P., et. al. – Antioxidant status and glutathione metabolism in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis C. J. Hepatol 1999, 31: 808-814.

Fernandez-Checa J.C. et. al. – Oxidative stress and alocholic liver disease, Alcohol Health et Research World, 21: 321-324, 1997

Sadrzadeh, S.M. et. al. – The oral iron chelator, 1,2 dijmethyl-3-hydroxypyrid-4-one reduces hepatic free iron, lipid peroxidation and fat accumulation in cheonically ethanol fed rats. Journal of Pharmacology and Exerimental Therapeutics 246:946-949, 1988.

Nakazawa J. et. al. – Psihological aspects of active oxygens(free radicals. Japanese Jaournal of Physiology, 46:15-32-1996.

De Maria N, et. al. – Association between reactive oxygen species and disease activity in chronic hepatits C Free Radic. Biol, Med. 1996, 21:291-295.

Comporti M. – Lipid peroxidation and cellular damage in toxic liver injury. Laboratory investigation, vol. 53, nr. 6, p. 599-623-1985.

Wixzkowski A et. al. – Oxidative stress evaluarion in chronic hepatits C pato-genesis. PMID, 16463698, Pub. Med indexed for Medline.

Choi J., et. al. – Structure and functions of Hepatitis C Virus care protein. Frecent Res. Evel Virol 3: 105-120, 2001

Loguercioc, etl. al. – Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis. Free Radic Biol. Med. 2003.

Matés J. M. et. al. – Antioxidant enzymes and human disease Clin Bioch. (Pub Med)

Jaeschke H., et. al. – Neutrophie and Kupffer cell induced oxidant stress an ischemia-reperfusion. Physiol 1991:2601:G 355-G: 362.

Takami Y. et. al. – Of a novel biomarker for axidative stress induced by hydrogen peroxide in primary human hepatocytes: nitro-benzensulfenyl chloride isotope labeling method. Hepatol Res, 2010: 40: 438-445.

Sumida J., et. al. – Serum thioredoxin levels as an indicator of oxidative stress in patients with hepatitis C virus.2000;33:616-622(Pub Med)

Choi J. et. al. – Reactive oxigen species suppress hepatitis C-virus RNA replication in humman hepatoma cells. Hepatology 39:81-89, 2004

Sumida Z. et. al. – Serum thioredoxin levels as a predictod of statohepatitis in patients with nonalcoholic fatty liver disease; 2003; 38:32-38 (Pub Med)

Uchida K. et. al. – Activation of stress signaling pathways by the end product of lipid peroxidation, 4-hydroxy-2-nonenal is a patential inducer of intracellular-peroxide production. J. Biol Chem, 1999; 274:2234-2242.

Ohta S. et. al. – Mitocondrial ALDH2 deficiency as an oxidative stress Ann N4 Acad. Sci 2004; 1011:36-44.

Yang Y. et. al. – Lipid peroxidation and cell cycla signaling: 4-hydroxyno-nenal, a Key molecule in stress mediate signaling. Acta Biochim Pol, 2003; 50: 319-336.

Aydin A., et. al. – Oxidative stress and nitric oxide related parametres in type II, diabetes mellitus: effects of glycemic control. Clin Biochem 2004; 34:65-70 (Pub Med)

Melhem A. et. al. – Treatmet of cronic hepatitis C virus infection via antio-xidants results of a phase I – clinical trial. J. Clin Gastroenterol. 39:737-742, 2005

Li K, et. al. – Celular response to conditional expression of hepatitis C virus care rotein in Huh 7 cultured human hepatoma cells. Hepatology 35:1237-1246-2002 (Cross Ref)

Sies H. – Strategies of antiocidant defences. Eur J. Biochem 1993:215:213-219. (Cross Ref)

Chrabot A.M. et. al. – Antioxidant defence in children with cronic vival hepatitis B and C, Med Sci.Movit 2000, 6:713-718.

Görenek Levent et. al. – Oxidative stress and antioxidant defense in patients with chronic hepatitis C patients before and after pegylated interferon alfa-2 b plus ribavirin therapy. Jaournal of Translatation Medicine 2006-4:25-doi: 10.1186/1479-5876-4-25

Ingrid Emerit et. al. – Clastogenic Factors as Biomarkers of Oxidative stress in chronic Hepatitis C. Digestion 2000; 62:200-207:10 1159/7814.

Michael W. King et. al. – Hyppoxic ischemic encephalopaty general principles. Hepatology, 2011.

Jin Endo et. al. – Metabolic Remodeling induced by Mitochondri Aldehydy Stress Stimulates Tolerance to oxida stress in the Heart

Alan S. Hazele, Roger F. Butterweth – Encefalopatie hepatică: o actualizare a mecanismelor fiziopatologice. Unitate de cercetare Universitatea din Montreal Quebec Canada.

Pinar Ciragil et. al. –Oxidative Stress in Patients with Chronic Hepatitis Band C

Kuei-Chuan Lee, et. al. – Increased Plasma Malondialdehide in Patients with Viral Crrhosis and its Relationships to Plasma Nitric Oxide, Endotoxin and Portale Pressure. Digestive Disease and Sciences 2009, volume 54-Number 6, pages 1178-1183.

Chrobat A.M. et. al. – Antioxidant defence in children with chrronic viral hepatitis A and C. Med. Sci Monit, 2000; 6:713-718.

Paridis V. et. al. – In situ detection of lipid peroxidation in chronic hepatitis C.correlation with pathological features. J. Clin Pathol, 1997;50-401-6

Romero M.J. et. al. – Serum Malondialdehide: Possible use for the clinical management of chronic hepatitis C patients. Fere Radiol Biol. Med 1998:25:993-7.

Fridovich I. – Superoxide radical: an endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxical, 1983;23:239-57

Beutler E. – Red:Cell metabolism. Grune and Strattom Company. New York 1975; 261-5.

Demirdag K. et. al. – Lefvels of plasma malondialdehyde and erytrocyte antioxidant enzime activities in patients with chronic hepatitis B. Hepatogastroeterology 2003; 50:766-70.

Broide E. et. al. – Superoxide dismutase activity in children with chronic liver disease. J. Hepathol 2000; 32:188-92.

Jrshad M. et. al. – Superoyide dismutase and total antioxidant levels in various forms of liver disease. Hepatology Research 2002; 23: 178-84.

Nagoev B. S. et. al. – LPO ant Free nadical oxidation parametres in patients with acute viral hepatitis. Bull Exp. Biol Med 2002; 134:557-8.

Takano S., et. al. – Incidence of hepato-celluar carcinoma in cronic hepatitis B and C: a pros-pective study of 251 patients Hepatology, 1995; 21:650-5.

Tabaka R. Et. al. – Follow-up study of 582 liver cirrhosis patients for 26 years in Japan. Liver 1987; 7:316-24.

Benvegnu L. et. al. – Naturalhistory of compensated viral cirrhosis: a prospective study on the incidence and hierarchy of major complications. Italy, University of Padova, 2-35128-November 2003.

Global Surveillance – Control of hepatitis C Report of a WHO consultation organized in colaboration with the viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium.

Liaw YF, et. al. – The development of cirrhosis in patients with chronic type B-hepatitis, a prospective study. Hepatology, 1988; 8: 493-6.

Pachliaro L. et. al. – Portal Hypertension in cirrhosis: natural history. Cambridge, M.A. Blackwell Scientific, 1994: 72-92.

Gines P. et. al. – Compesated cirrhosis: natural history and prognostic factors. Hepatology, 1987; 7: 122-8.

D’Amico G. et. al. – Survival and prognostic indicators in compesated and decompensated cirrhosis. Dig. Dis. Sci, 1986; 31:468-475.

Kyrsten D. Fairbanks – Alcoholic liver Disease. Alcohol Clin Exp. Res. 1993, 17 (5), 1112-1117.

Haussinger, Dieter; Görg, Boris – Interaction of oxidative stress astrocyte swelling and cere-bral amenonia Foxicity,2010 Lippincott William set Wilkins

Loguercio C. et. al. – Oxidative stress in viral and alcholic hepatitis, Free Radic Biol Med. 2003.

Rafael Mateo et. al. – Relationyship Between Oxidative Stress and Behavioral Sings of Lead Poisoing in Mallards. Eur Neural, 1994; 34:209-12.

Haussinger D. – Pathogenesis of hepatic encephalopathy. J. Gastroeneral Hepatol, 2002.

Jones E.A. – Animonia, the GABA neurotransmitter system and hepatic encephalopathy. Metas Brain. Dis. 17 (4): 275-81, 2002.

Rama Rao K.V. – Anemonia neurotoxicity. Metab. Brain Dis. 18 (2), 113-27, 2003.

Avashalumov M. V. et. al. – NMDAR activation mediates hydrogen peroxide, induced pathophysiology in rat hippocampal glices. (2002). J. Neurophysical: 87 (6), 2896-903.

Butterwoth R.F., et. al. – Manganese toxicity, dopaminergic dysfunction and hepatic encephalopathy. Metab. Brain. Res. 10: 259-267, 1995.

Papavasilion P.S. et. al. – Role of liver in regulating distribution and excretion of manganese. Am. J. Physiol 211:211-216-1966.

Layrargues G.P. et. al. – Increased manganese concentrations in palidum of cirrhotic patients. Lancet 345:735, 1995.

Lavoie J. et. al. – Activities of neuronal and astrocytic marker enzimes in antropsied brain tissue form patients with hepatic encephalopathy.Metabol Brain Dis 2: 283-290, 1987

Schmidt W. et. al. – Hepatic encephalopatzhy influences high affinity uptake of transmitter dutamate and aspartate into the hippocampal formation. Metab. Brain Dis 5:19-22, 1990

Lavoie J. et. al. – Increased densities of peripheral-type benzodiazepine rceptors in brain autopy, from cirrhotic patients with hepatic encepholopathy. Hepatology 11:874-878,199.

Cruz N.F. et. al. – Locol cerebral glucose metabolism in rats with chrronic portocaval scheunts. J. Cereb Blood Flow Metab 3:311-320, 1983.

Rao V.L. – Nitric oxide in hepatic encephalpathy and hyperammo-niemia Neurochem int: 41 (2-3) 161- 7, 2002.

Taylor-Robinson S.D. et. al. – Cerebral 31 P. magnetic resonance spectroscopy in patients with chronic hepatitis encepholopazhy. Hepatology 20; 1173-1178, 1994.

Butterworth R.F. et. al. – Rathophysiology of hepatic enxephalopathy: The ammonia hypothesis revisited. CRC. Press 00. 9-24, 1991.

Lockwoot A.H. et. al. – Cerebral amonia metabolism in patients with sever liver disease and minimal hepatic enhcephalopathy. J. Cereb Blood Flow Metab 11; 337-341, 1991.

Szerb J.C. et. al. – Effect of ammonium ions on synaptic transimmissio in the mammalion central neurous system. Prog. Neurobiol 39: 125-153, 1992.

Levin L.H. et. al. – Elevatect brain water during urease, induce hyperammo-niemia in drogs. Berlin, Springer Verlag pp 1032, 1034, 1989.

Narenberg M.D. et. al. – Ammonia induce astrociyrw swelling in primary culture. Neurochem Res, 16; 833-836, 1993.

van Galder N.M. – Metabolic intgeracions between neurons and astroglia. Clutamine syntetaze carbonic anhytrase and wate a balance. Basic Mechahisms of Neuronal Hyperexcitability. New York Alan R Liss pp. 5-29, 1983.

Versieck J. et. al. – Manganese, Copper an zinc concentrations in serum and placked blood cells during acute hepatitis, chronic hepatitis and posthepatic cirrhosis. Clin Chem, 20: 1141-1145, 1974.

96.b. Hauser R.A. et. al. – Manganese intoxication an chronic liver failure. Ann

Neuronal 36: 871-875, 1994.

Nelson K. et. al. – Manganese encephalopthy: Utility of early magnetic resonance imaging. Br. J. Ind. Med, 50: 510-513, 1993.

Layrargues G.P. et. al. – Increased manganese concentrations in pallidum of cirrhotic patients. Lancet 346: 270-274, 1997.

Hazell A.S. et. al. – Manganese decreases glutamate uptake in cultured astroctes. Nemochem Res 22: 1443-1447, 1997.

Mc Candless D.W. et. al. – Effect of acute ammonia intoxication on energy stores in the cerebral reticular-activating system. Exp. Brain Res 44: 325-330, 1981.-

Devenyi A.G. et. al. – Dystonia, hyperintense basal ganglia, and high whole blood manganese levels in Alagile’s syndrome. Gastroenterology 106: 1068-1071, 1994.

Rose C., et. al. – Manganese de position in basal ganglia structures results from both portal-systemic shunting and impaired hepatobiliary elimination. Hepatology 26: 182A, 1997.

Boris Görg – Oxidative stress markers in the brain of patients with cirhosis and hepatic encephalopathy, 2010, Hepatolog vol. 52 issue-1 pag. 256-265.

103.b. de Vries H.E. et. al. – The influence of cytokines on the integrity of the blood-

brain, barrier in vitro. J. Neuroimmunol 64, 37-43, 1996.

Norenberg MD. et. al. – The glial glutamate transporter in hyperamoniemia and hepatic encephalopathy. Relation to Energy metabolism and glutamatergic neurotransmission. Glia 21: 124-133, 1997.

104.b. Didier N. et. al. – Secretion of interleukin-β by astrocytes mediates

endothelin-1and human necrotisis factor-α effects on human brain micrfovascular endothelial cell pernseability. J. Neurochem 86; 246-254 (2003).

Khachaturian H. et. al – Anatomi of the CNS opioid systems. Trends Neuroal Sci, 10; 111-119, 1985.

105.b. Duchini A. – Effects of tumor necrosis factor-α and intraleukin-6 on

fenid-phase permeability and ammonia diffusion in CNS derived endothelial cells. J. Investig Med 44; 474-482, 1996.

Girard G. et.al. – Protocaval anastomosis results in region selective loss of glutamine syntetase in brain. Metab Brain Dis 8: 207-215, 1993.

106.b. Cagnin A., et. al. – In vivo imaging of cerebral „periphoral benzodiazepine

binfing sites” in patients with hepatic C encephalopathy. Gut 55, 547.553 (2006).

Kmecht K. et. al. – Decreased glutamate transporters (GLT-1) expression in frontal cortex of rats with acujte liver failure. Neurosci Lett, 299: 201-203, 1997.

107. b. Ahboucha S., et. al. – The neurosteroid system implication in the pathophysio-

logy of hepatic encephalopathy.

Rothstein J. D. et. al. – Localization of neuronal and glial glutamaet transporters. Neuron 13: 713-772, 1994.

108.b. Showcross D. et. al. – The pathophysiologic basis of hepatic encephalopathy

central role for ammonia and inflammation. Cell Mol Life Sci, 62; 2295-2304 (2005).

Ferenci P. et. al. – Changes in clutamate receptors on Synaptic membranes associated with hepatic encephalpathy on hyperammonia in the rabbit.. Hepatology 4 25-29 1984.

Michalak A. et. al. – Selective loss of binding sites for the glutomate receptor ligends (3H) kainate and (S)-(3H) 5 fluorowillardine in the brains of rats with acute liber failure. Hepatology: 25: 631-635, 1997.

Raghavendra Ra O.V.L. et. al. – Increased activities of MAOA and MAOB in autopsied brain tisseie from cirhotic patients with hepatic encephalopathy. Braian Res 621: 345-352, 1993.

Bergeron M. et. al. – Effect of amonia on brain seratonin metabolism in rlation to function in the portocaval-shunted rat. J. Neurochem 55: 222-229, 1990.

Apelqvist G. et. al. – Regional brain serotonin receptor changes in portocav-shunted rats. Acta Physiol Scond 162:509-516, 1998.

Yurdaydin C. et. al. – Modulation of hrpatic encephalipathy in rath with thioacetamide indeced acute liver failure by serotonin antegonists. Eur J. Gastroenterol Hepatol, 8: 667-671, 1996.

Yurdaydin C et. al. – Incraosed serotoninergic and noradrenergic activity in hepatic encepholopathy rats with thioacetamide induced acute liver failure. Hepalology 12; 695-700, 1990.

Michalok A. et. al. – Evidence for altered central noradrenergic funcion, in experimental acute liver failure in the rat.. Hepatology 27: 362-368, 1998.

Berg qvist P. et. al. – Brain extracellular quinolinic acid in Chronic experimental hepatic encephalopathy as assessed by in vivo microdyalisis. Acute effects of L-tryptophan. Neuropsydrophormacology 15: 381-389, 1996.

Mousseau D.D. et. al. – Selective loss of pallidal dopamine D2 receptor density in hepatic encephalopathy. Neurosci Lett 162: 192-196, 1993.

Hadesman R. et. al. – Concentrations of 3, 4 dihydroxyphenylolanine and catecholamines and catecholamines and metabolites in an anhepatic model of hepatic encephalopathy. J. Heurocherm 65: 1166-1175, 1995.

Yurdaydin C. et. al. – Increased serotoninergic and nooradrenergic activity in hepatic encepholopthy in rats with thioacetamide induced acute liver failure. Hepatology 12; 695-700-1990.

Mc Kinzie S.L. et. al. – Release of norepinephrine and dopamine in ventriculo-cisternal perfuzions in hepatictomized rats.. Neurochem 66: 509-578, 1996.

Bergeron M. et. al. – Increased metabocortical dopaminergic function following ammonia administration to rats with portocaval anastomosis. Neurochem Res 10: 79-86, 1995.

123. Ray S. et. al. – Hepatic encephalopathy in cirrohotic and portocaval-shunted dogs: Lack of changes in brain GABA uptake, brain GABA level and brain glutamic acid decarboxylase activity and poptsynaptic GAB receptor. Hepatology 8: 845-849, 1988

Basile A.S. et. al. – GABA receptor Complex in an experimental model of encephalopathy: Evidence for elevated levels of an endogenosis benzodiazepine receptor ligend. J. Neurochem 53: 1057-1063, 1989.

Puia G. et. al. – Difference in the negative allosteric modulation of GABA receptors elicides by 4-chlorodiazepam and by a β carbo-line-3-carboxylate ester. A study with natural and reconsti-tuted receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 86:7275-7279, 1889.

Majewska M.D. et. al. – Neurosteroid pregnenolone sulfate antagonizes electrophysiological responses to GABA in neurons. Neurosci Lett 90: 270-284, 1988.

Zeneroli M.L. et. al. – Endorphin-and opiate receptor change in acute and chronic models of hepatic encephalopathy. N.J. Humana Press Inc. Pp 455-466, 1988.

De Wacle J. et. al. – Portocaval anastemosis results in region-selective changes of β-endorphin content and of μ and δ opiod receptor densities in rat brain. Hepatology 24: 895-901, 1996.

Martin J. R. et. al. – Incrased ethanol consumtion and blood ethanol levels in rats with portocaval shunts. Am J. Physil 248: G. 287-G.292, 1985.

Thorton J.R. et. al. – Plasma methionine enkephalin concentrationand prognosis in primari biliary cirrhosis. Br. Med J. 297: 1241-1242, 1988.

Rao V.L. et. al. – Increased nitric oxide synthase activities and L-3 (3H) arginine utake in brain following portocaval anastemosis. J. Neurochem 65: 677-681, 1995.

Rao V.L., et. al. – Increased neuronal nitric oxide synthase expression in brain following portocoval anastomosis. Brain Res 765: 169-172, 1977

Noremberg M.D. et. al. – Acute liver failure and hyperammonemia incrase nitric oxide synthase in mouse brain. Soc Neurosci Abst 21-869, 1995.

Kosenko E. et. al. – Nitroarginine an inhibitor of nitric oxide synthetase atemattes ammonia toxicity and ammonia incluced alterations in brain metabolism. Neurochem Res 20:451-456, 1995.

Kosenko E. et. al. – Nitroarginie an inhibitor of nitric oxide synthase prevents changes in superoxide radical and antioxidant enzimes induced by ammonia intoxication. Metab, Brain Dis. 13: 29-41, 1998.

Katchman A.N. et. al. – Nitric oxide modulates synaptic glutamate releas during anoxia. Neurosci Sett 228:50-54, 1990.

Bajaj. J.S. et. al. – Inhibitory control test for the diagnosis of minimal hepatic encephalopathy. Gastroenterology 2008; 135: 1591-60.

Mandini H. et. al. – Computerized psychometric testind in minimal hepatic encephalopathy and modulation by nitrogen challenge and liver transplant. Gastroenterology 2008; 135; 1582-90

Sherlock S. et. al. – Sontal-systemic encepholopathy neurologic Complications of liver disease. Lancet, 1954, 454-7.

Schafer D.F. et. al. – Hepatic encepholopathy and the gamma aminobutyric-acid neurotransmitter system Lancet 1982 (1), 18-20.

Haussinger D. et. al. – Hepatic encepholopathy in cronic liver disease a clinical manifestation of astrocyte swelling and low grade cerebral edema. J. Hepatol 2000, 32:1035-8.

Haussinger D. et. al. – Proton magnetic resonance spectioseapy studies on human brain myo-inasital in hypo-osmolarity and hepatic encepholopathy. Gastroenterology, 1994; 107: 1475-80.

Tanigami H. et. al. – Effect of glutamine synthetase inhibition on astrocyte swelling and altered astroglical protein expression duringhyperammoniemia in rats.. Neuroscience, 2005; 134: 437-49.

Shawcross D.L. et. al. – Lowmyo-inositol and high glutamine levels in brain are associated with neuropsychological deterioration after induced haperammonemia. Am J. Pshysiol 2004; 287: G. 503-9

Schliess F. et. al. – Clacium dependent activation of Erk-1 and Erk-2 following hyoposomatic cell swelling. Biochem J. 1996; 320;167-71.

Bender A. S. et. al. – Effect of benzodiazepines and neurosteroids on anmonia induced swelling in cultured astrocytes. J. Neurosci Res, 18998: 54: 673-80.

Lavoie J. et. al. – Increased sensivities of peripheral type benzodiazepine receptors in brain autopsy sample from cirrhotic petients with hepatic encephalopaty. Hepatology, 1990; 11: 874-8.

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between osmotic and oxidative stress the hepatic encephalopathy paradign. Biol Chem 2006; 387: 1363-70.

Sezer S. et. al. – Hepatitis C infection in Hemodialysis Patients: Protective Against Oxidative stress. Biochemisty 06490 Ancara Turkey

Larrea E. et. al. – Superoxide dismutase in patients with cronic hepatitis C virus infectionI. Free Radic Biol Med. 1998, 24; 1235-1241.

Irshad M et. al. – Superoxide dismutase and total antioxidant levels in varios forms of liver disease. Hepatol Res, 2002, 23: 178-184.

Parola M et. al. – Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis. J. Hepatol, 2001, 35: 297-306.

Giuliai Fortunato – Multivatiate Discriminant function based on Six Biochemical Markers in blood can predict the cirrhotic evolution of chronic hepatitis, 2001. The American Association for Clinical Chemistry.

Colombo M. – Hepatacellular carcinoma. J. Hepatol, 1992; 15: 225-236.

Sollie R. et. al. – Viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterol Clin North Am, 1994; 23: 576-579.

Shuppan D. et. al. – Serumk assays for liver fibrosis. J. Hepatol 1995,22:82-88.

Ishak K.G. – Pathologie features of Chronic hepatits. A review and update. A, J. Clin Pat, 2000; 113: 40-55.

Pilette C. et. al. – Histopathological evaluation of liver fibriosis quantitative image analysis vs semi-quantitative scores. Comparison Whith serum markers. J. Hepatol, 1998, 28: 439-446.

Brunt E. M. – Grading and staging the histopathological lesions of chronic hepatitis: the Knodell histology activity index and beyondI. Hepatology 2000, 31: 241-246.

Szakcs J.G. et. al. – Progress in diagnosis of hepatitis and the cirrhotic liver. Am clin Sci, 1999; 23: 87-103.

The Metevir – Inter and intra obserwer variation in the assesment of liver biopsy of chronic hepatitis C.. Hepatology 1994; 20-15-20

Teare J. P. et. al. – Concentrations of serum procollagen III peptide concentrations and PGA index for assessment of hepatic fibrosis. Lancet, 1993, 342: 895.898.

Castedo G. et. al. – Differential diagnosis between hepatocellura carcinoma and cirrhosis through a discriminant function based on biochemical serrum analytes. Clin Chen 1996; 42: 1263-1269

Castaldo G. et. al. – Discriminant function based on serum analytes differentiates hepatocarcinoma from secondary liver neoplasma. Clin Chem 1995; 41: 439-443.

Costaldo G. et. al. – Total discrimination of peritoneal ascites from cirrhosis and hepatocarcinoma associaetd ascites by assays of ascitic cholesterol and lactate dehydrogenase. Clin Chem 1994; 40: 478-483.

Desmet V.J. et. al. – Clasification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. Hepatology 1994; 19: 1514-1519.

Jamilé Wakim-Fleming et. al. – Hepatic encehalopathy: Suspect it early in patients with cirrhosis. European Jaournal of internal Medicine volum 20 Issue 7 pages 703-708, 2009

Romero Gomez M, et. al. – Intestinal glutaminase activity in increased in liver cirrhosis and corelates with minimal hepatic encephalopathy. J. Hepatol 2004; 41: 49-54.

Nourenberg M.D. et. al. – New concepts in the mechanism of ammonia-induced astrocyte swelling. Metab Brain Dis 2007; 22: 219-232.

Tanigaimi H. et. al. – Effect of glutamine synthetase inhibition an swelling and altered astroglial protein expression during hypermmania in rats. Neuroscince 2005, 131: 437-449.

Liansala M. et. al. – NMDA recedptors in hyperammoniemia and hepatic encefalpathy. Metab. Brain Dis. 2007; 22; 321-335

Montaliu C., et. al. – IL 6-and IL-8 in blood may discriminate cirrhotic patient with and withont minmal hepatic encephalopathy. J. Clin. Gastrenteril. 2009; 45; 272-279

Krieger D. et. al. – Manganese and chronic hepatic encephalopathy. Lauced 1995; 346: 270-274.

Pomier Laxrargues et. al. – Increased manganese concetration in pallidum of cirrhotic patients. Laucet. 1995; 345-735

Guevara M et. al. – Hiponatiemia is a risk factor of hepatic encephalopathy in patients with cirrhosis a prospective study with time dependent analysis. Am J. Gastroenterol. 2009; 104: 1382-1389

Hertz L. et. al. – Energy metabolism in brain cells: effects of elevated ammonia concentration. Metab. Brain. Dis 2007; 22: 199-218

Marchesini G. et. al. – Prevalence of subclinical hepatic encephalopaty in cirrhosis and relationship to plasma amino acid inbalance. Dig Dis Sci 1980; 25: 763-768.

Morgan M.Y. et. al. – Plasma ratio of valine, leucine, and isolencine to phenylaline and tyrosine in liver disease. Gut, 1978; 19: 1068-1073.

Haussinger D. et. al. – Interaction of oxidative stress, astrocyte swilling and cerebral ammonia toxicity. Curr.Opin.Clin. Nutr. Metab. Care 2010:13: 87-92.

Bianchi L. – Leberinsuffizienz und Leberkama. Leber Magen Darm. 1977; 7; 221-226.

Poveda M. J. – Brain edema dinamics in patients with overt hepatic encephalopa-thy. A magnetic resonance imaging study. Neuroimage 2010; 52: 481-487.

Masson S et. al. – Hepatic encephalopathy after transjugular intrahepatic portosys-temic shunt insertion: a decade of experience. O.J.M, 2008; 101: 493-501.

Garcia Pagan J.C.et.al.– Early use of TIPS in patients with cirrhosis and variceal bleeding. N. Engl. J. Med. 2010; 362: 2370-2379

Boyer T.D. et. al. – The rol of transjugular intrahepatic pertosystemic shunt (TIPS) in the management of portal hypertension update 2009. Hepatology 2010; 51:306.

Bockus H.L. – Gastroenterology, vol III W.B. Saunders Company Ltd. Philadel-phia London.

Genova Diagnostics – Test Catalog, Oxidative stress Analysis Ref. Type Internet Commu-nication

Abeam – Test Catalog Malondialdehyde (MDA), Ref. Type: Internet Communication

Laborator Synevo – Referințe specifice tehnologice de lucru utilizate 2011. Ref. Type Catalog.

Abcam, Test Catalog –Superoxide Dismutase 3-antibody Ref Type Internet Communication

Genova Diagnostics – Test Catalog Oxidative Stress Analysis Ref Type Internet Communication

Hx Deng et. al. – Amyotrophic lateral sclerosis and structural defects in Cu, Zn, superoxide dismutas. In Science 261 (5124): 1047-1051, 1993.

Segui J. et. al. – Superoxid dismutase ameliorates TNBS induced calitis by reducing oxidative stress adhesion molecule expresion and leukocyte recruiment into the inflamed intestine. In J. Leukoc Biol. 76 (3): 537-44, 2004

Ying Zhang et. al. – Overexpresion of Copper Zing Superoxid Dismutase Supp Human Clioma Cell Crowth. In Cancer Res: 62: 1205-1212, 2002.

Y. Graner et. al. – Cell damage by excess Cu Zn SOD and down’s syndrome. Biomedicine et. Parmacotherapy volume 48 (5-6), 231-237, 1994.

Laborator Synevo – Referințe specifice tehnologiei de lucru utilizate în 2011. Ref. Type Catalog.

Guoyao W. et. al. – Turner guetatione Metabolism and is implications for Health. In J, Nutr. 134: 489-492, 2004.

Hangy Liang et. al. – The district in vivo roles of the long-form and short-form of glutathione peroxidase 4: the short-form is essential for somatic cell functions and the long-form in important for male fertility. In the FASEB Jaournal, 2009.

Paul Lewis et. al. – Cooper and Judy B de Haan Lack of the Antioxidant Enzime Glutathione Peroxidase Accelerates Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotin E-Deficient Mice. In Circulation; 115: 2178-2187.

Paula Dobrescu – Importanța antioxidanților în sănătate. Fac. De Educa Sportivă Universit Al I. Cuza, Iași.

Talmud P.J. et. al. – Gene-centric association signals for lipids and apolipoproteins identified via the Human CND Bead Chip. In Am. J, Hum, Genet 85 (5): 628-42, 2009.

Antije Banning, et. al. – Guatatione Peroxidase inhibits Cyelooxygenase 2-Mediated Migration and invasion of HT-29 adenocarcinoma cells but supports their Gronth as Tumors in Nude Mice. In Cancer Res. 68:9746-9753, 2008.

Rogerio Margis et. al. – Glutatione peroxidase family an evolutionary overview. In FEBS Journal: 275: 3959-3970, 2008.

Laborator Synevo – Referințe specifice tehnologice de lucru utilizate în 2011, Ref. Type: Catalog.

Zieve L. – Hepatia encephalopazhy in Popper H, Schaffner Progress in liver disease vol VI, Grune and Stratton, New Zork, 1979; 327-341.

Ramona Bănică, – Analize de laborator și alte explorări diagnostice, Copyright, 2007,

M. Samoilă, L. Anghel Medic Art.

Dumitrașcu D. – Tratat de Medicină internă sub redacția Radu Păun: Bolile aparatului digestiv; Ficatul, căile biliare și pancreasul, pg. 476-482. Ed. Medicală, București, 1986.

Harison, – Principii de medicină internă, Ediția a XIII-a, pg. 496-498. Editura

K.J.Issalbacher et.al. Orizonturi, București, 1997.

Mc Cullough A.J.et.al.– The nature prognostic significance of serial serum aminoacid abnormalitis in severe chronic active liver disease. Gastroenterology, 1979, 77,5, A 26.

Randolph C. et. al. – Neuropsychological assement of hepatic encefalopathy. Ishen Practice guidelines. Liver Int. 29 (5), 629-35, 2009

Ryan J.M. et. al. – Hepatic encephalopathy. Medicine (10): 617-620, 2011

Summerskill W.H.et.al.– The neuropsychiatric syndrome associated with hepatic cirrhosis and an extensive portal collaterla circulation. Q. J. Med. 25 (98): 245-66.

Fattovich G. et. al. – Morbidity and mortality in compensated cirrhosis C: retospective follow-up study of 384 patients. Castrology 1997; 112: 463-72.

Shawcross D.,Jalan R. – The pathophysiologic basis of hepatic encephalopathy. Control role for ammonia and inflammation.Cell Med. Life Sci 62, 2295-2304, (2005).

Norenberg M.D.et.al. – New concepts in the mechanism of amonia induced astrocyte swelling. Metab. Brain Dis (2007).

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between osmotic and oxidative stress: the hepatic encephalopathy paradign. Biol Chem 387, 1363-1370 (2006)

Cooper A.J. et. al. – Biochemistry and physiology of brain ammonia. Physiol Rev. 67, 440-519 (1987).

Thomas J.M. et. al. – Change in glutamate cycle enzime MRNA levels in a rate model of hepatic encephalopathy. Metab. Brain Dis. 3, 81-90 (1988)

Rose C. et. al. – Acute insult of ammonia leads to calcium dependent glutamate release from cultured astrocytes an effect of pH. J. Biol Chem: 280, 20937-20944, (2005)

Reinehr R. et. al. – Hypoosmotic swelling and ammonia increase oxidative stress by NADPH oxidanse in cultured astrocytes and vital slices. Glia 55, 758-771 (2007).

Ion Dina – Breviar clinic de ecografie abdominală, pg. 9-26, Editura Didactică și Pedagogică, 2009, București.

Oliviu Pascu – Îndrumător practic de Endoscopie digestivă superioară, pag. 45, 57. Editura Dacia Cluj-Napoca, 1982.

Götz W. – Diagnostik von Lebererkrankungen G.I.T. Verlag Ernst Giebeler. Darmstadt 1980.

Mailard I.N. et. al. – Indications et modalites de la derivation porto-cave chez le cirrhotique. Gastroenterology Clin. Biol, 1977: 1, 8-9, 613-619.

Jain M.D. – Hepatic encephalopazhy (is a potentially reversible metabolic disturbance of the brain in liver disease) MedLink Neurology July 20, 2011)

Cihan Yurdaydin et.al.– Hepatic Encephalopathy. European Gastroenterology et hepatology Review, 2012; 7(4) 268-71.

rafael Mateo et. al. – Relationship Between Oxidative Stress, Pathology and Behavioral Sings of Lead Poisoning in Mallards.

Shawcross D.L.et.al. – Pole of ammonia inflammation in minimal hepatic encefalophathy. Metab. Brain Dis, 2007; Man: 22 (1) 125-38.

Shawcross D.L. et. al. – Infectiond and systemic inflammation, not ammonai are asociated with Grade ¾ hepatic encephalopathy, but not mortality in cirrhosis. Hepatol 2011, apr. 54 (4), 640-9.

Shawcross D.L. et. al. – Systemic inflammatory response exacerbates the neuropsychologi-cal effects of induced hyperammonia in cirrhosis. J.

Marsha Y. Morgen et. al. – Hepatia Encephalopathy in Patoents with Cirrhosis. Neurobiology of Disease 21699073 (2009)

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between asmatic and oxidative stress: the hepatia encephalopathy paradign. Biol Chem 2006, oct-Nov; 387 (10-11) 1363-70

Amit S.Segan et. ak. – Changing face of hepatic encephalopathy: Role of inflammation and oxidative stress. Warld J. Gastroenterol 2010 July 21.

Bloch P. et. al. – Dilatation kystique congenitale des voies biliares intra et extra hepatiques. J. Rad. Electrol. 1977, 58, 12, 839.

Haussinger D. et. al. – Hepatic encephalopata, in Rodes J., et. al. eds. The Oxford textbook of hepatology Oxford: Blackwell, 2007: 728-6.

ferenci P. et. al. – Hepatic encephalopathy definition, nomenclature, diagnosis and quantification: final raport of the working party at the 11 th Word Congresses of Gastrolenterology, Vienna 1998. Hepatology, 2002, 35:716-21

Wein C. et. al. – Minimal hepatic encephalopathy impairs fitness to derive. Hepatology 2004; 39: 739-45.

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between osmotic and oxidative stress: the hepatic encephalopatha paradigm. Biol Chem 2006; 387: 1363-1370.

Schliess F., et. al. – Osmotic and oxidative stress in hepatic encephalopathy In Haussinger D., Kircheis G. eds. Hepatic Encephalopathy and nitroegn metabolism. Dordrecht: Springer 2006:20-42.

Lupșor M. et. al. – Elastografia trantitorie unidimensională. Gastroenterologie Hepatilogie Bazele Practicii clinice. Ed. Med. Universitară, Iuliu Hațieganu, Cluj-Napoca, 2010.

Bajaj J.S. et. al. – Minimal hepatic encephalopathy is associated with motor vechicle crashes: the reality beyond the driving test.. Hepatology 50, 1175-1183 (2009)

Bajaj J.S. et. al. – The effect of fatigue in driving skills in patients with hepatic encephalopathy. Am. J. Gastroenterol, 104, 898-905 (2009)

Jennett B., et. al. – Predicting outcome in individual patients after severe head injury. Laucet 15, 1031-1034 (1976).

Manchesini G. et. al. – Zinc supplementation and amino acid-nitrogen metabolism in patients with advanced cirrosis. Hepatology 23, 1084-1092. (1996)

Schawcross D., et. al. – The pathophysiologic basis oh hepatic encephalopatha, central role for amonia and inflamation. Cell Mol Life Sci, 62, 2295-2304 (2005)

Sergeeva O.A. et. al. – GABAA receptor modification in taurine transporter Knockout nice causes steatol disinhibition. J. Physiol 2007; 585; 539-548.

Stewart V.C. et. al. – Astrocyte-derived oxide causes both reversible and ireversible damage to the neuronal mitrochondrial respitatory chain. J. Heurochem, 2000; 57: 694-700

Spahl D.U. et. al. – Regulation of zinc homeostayiy ba inducible No synthase derived No: nuclear metallothionein translocation and intranuclear Zn2+ release. Proc Natl. Acad Sci USA, 2003, 100: 13952-7.

Negru T., et. al. – Oxidative injury and other metabolic disorders in hepatic encephalopathy. Rom J. Physiol 1999, 36: 29-36.

Huang, D.Z, et. al. – Impaired ability to increase water excretion in mice lacking the taurine transporter gene TAUT. Plugers Arch 2006; 451: 668-77.

Kiebler M.A. et. al. – Neuronal RNA granules: movers and Markers. Neuron 2006, 50: 685-90.

Timmermann L. et. al. – Mini-asterixis in hepatic encephalopathy induced by pathologic thalamo-martor cortical coupling.

Haussinger D., et. al. – Pathogenetic mechynisms of hepatic encephalopathy „Experimente de Hepatologie” Dusseldarf the Deutshe 575.

Vuppalanchi Raj M.D. et. al. – Oxidative stress in chronic Liver Disease: Relationship Between Peripheral and Hepatic Measurements, 2001. Gastroenterology 120; 1241-1250.

BIBLIOGRAFIE

Vuppalanchi, Traj MD et. al. – Oxidative stress in chronic Siver Disease: Relationship Between Peripheral and Hepatic measurements. American Jaournal the Medical Sciences, october 2011, vol. 432-Tassue 4, pp 314-317.

Jinah Choi and J.H. James Om – Mechanism of Liver Injury. Oxidative stress in the pathogenesis of hepatitis C virus. Hepatology 2011 HMR-401 Los Angeles, CA 90033

Natalie Strobel et. al. – Quantifying Oxidative stress and its Role in Mitochondrial Biogenesis. Medical and Health Sciences, 2009-11 The University of Queensland

Luis A Videla et. al. – Oxidative stress related parametres in the liver of non-alcoholic fatty liver disease patientsi. Clinical Science (2004) 106, (261-268) (Printed in Great Britain)

Gonzalez-Gallego J. et. al. – C-Virus, Stress and Steatosis: Current Status and Perspectives. Curent Molecular Medicine. Volume 11 nr. 5 July 2011, pp. 373-390. (18)

Trotti R. Et. al. – Oxidative stress and a thrombophilic condition in alcoholics without sever liver disease. J. Exp. Biol. May 15, 2011 – february- 1 88: 650-659.

Dryden, Gerald W. et. al. – Clinical implication of oxidative stress and antiooxidant therapy, Neurology October 22, 2002, Arch Dis. Child Ed. March

Mahmood S. et. al. – Ummunohistochemical evaluarion of oxidative stress mar-kers in cronic hepatitis C, 6: 19-24, 2004, Web of Science

Moriya K, et. al. – Oxidative stress in the abcese of inflammation in hepatitis C virus associated heaptocorcinogenesis, Cancer Res 61: 4365-4370.

Poli G. – Pathogenesis of liver fibrosis rol of oxidative stress, Castroenterology 122: 366-377, 2002.

Sumida Y, et. al. – Serum thioredoxin levels as an indicator of osidative stress in patients with hepatitis C virus infection, J. Hepatol 33: 616-622, 2000

Xiao-Peng Fan, et. al. – Oxidative stress, Copyright (C) 2009 by The Japanese Society of Internal Medicine

Mahmoud Rushdi, Abd Eliah – The Role of Liver Biopsy in Detection of Hepatic Oxidative Stress, Veterinary Medicine International, volume 2011, 10.4061/2011/613602.

Mc Carol, J.M. – Iron, free radicals, and oxidative stress, J. Hematology, 1998, 30:403-411

Rosen G.M. et. al. – Free radicals and phagocytic cells. Faseb Jaournal 9:200-209, 1995

Toykuni, S. – Reactive oxygen species induced molecular damage and its aplication in pathology. Pathology international 49:91-102, 1999

de Groot, H – Reactive oxygen species in tissue injury. Hepato-Gastroenterology, 41:328-332, 1994

Halliwell B. – Antioxidant defense mecanism: From the beginning to the end. Free Radical Research 31: 261-272, 1999.

Bailey, S.M. et. al. – Contribution of mitochondria to oxidative stress associatd with alcoholic liver disease. Free Radical Biology et. Medicine. 32:11-16, 2002.

Choi J., et. al. – Structure and functions of Hepatitis C. Virus care. Recent Res. Devek Virol 3: 105-120, 2001

Sies H – Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology 82:291-295, 1997.

Bannerize W.P. – Oxidative stress. J. Cell. Mol. Med. 2002, Jul-Sep: 6 (3) 399-406.

Fridovich, I. – Superoxide anion radical, superoxide dismutases, and related matters, 1997 Journal of Biological Chemistry 272: 18515-18517

Polavarapu, R., et. al. – Increased lipid perocidation and impoired antioxidat injuri in experiemental alcoholic liver disease in rats fed diets high in carn oil and fish oil, Hepatology 27: 1317-1323, 1998

Knecht, K.T. et. al. – Free radical adducts in the bile of rats treated chronically with intragastric alcohol, 1995, Molecular Pharmacology, 47:1028-1034

Boya P., et. al. – Antioxidant status and glutathione metabolism in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis C. J. Hepatol 1999, 31: 808-814.

Fernandez-Checa J.C. et. al. – Oxidative stress and alocholic liver disease, Alcohol Health et Research World, 21: 321-324, 1997

Sadrzadeh, S.M. et. al. – The oral iron chelator, 1,2 dijmethyl-3-hydroxypyrid-4-one reduces hepatic free iron, lipid peroxidation and fat accumulation in cheonically ethanol fed rats. Journal of Pharmacology and Exerimental Therapeutics 246:946-949, 1988.

Nakazawa J. et. al. – Psihological aspects of active oxygens(free radicals. Japanese Jaournal of Physiology, 46:15-32-1996.

De Maria N, et. al. – Association between reactive oxygen species and disease activity in chronic hepatits C Free Radic. Biol, Med. 1996, 21:291-295.

Comporti M. – Lipid peroxidation and cellular damage in toxic liver injury. Laboratory investigation, vol. 53, nr. 6, p. 599-623-1985.

Wixzkowski A et. al. – Oxidative stress evaluarion in chronic hepatits C pato-genesis. PMID, 16463698, Pub. Med indexed for Medline.

Choi J., et. al. – Structure and functions of Hepatitis C Virus care protein. Frecent Res. Evel Virol 3: 105-120, 2001

Loguercioc, etl. al. – Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis. Free Radic Biol. Med. 2003.

Matés J. M. et. al. – Antioxidant enzymes and human disease Clin Bioch. (Pub Med)

Jaeschke H., et. al. – Neutrophie and Kupffer cell induced oxidant stress an ischemia-reperfusion. Physiol 1991:2601:G 355-G: 362.

Takami Y. et. al. – Of a novel biomarker for axidative stress induced by hydrogen peroxide in primary human hepatocytes: nitro-benzensulfenyl chloride isotope labeling method. Hepatol Res, 2010: 40: 438-445.

Sumida J., et. al. – Serum thioredoxin levels as an indicator of oxidative stress in patients with hepatitis C virus.2000;33:616-622(Pub Med)

Choi J. et. al. – Reactive oxigen species suppress hepatitis C-virus RNA replication in humman hepatoma cells. Hepatology 39:81-89, 2004

Sumida Z. et. al. – Serum thioredoxin levels as a predictod of statohepatitis in patients with nonalcoholic fatty liver disease; 2003; 38:32-38 (Pub Med)

Uchida K. et. al. – Activation of stress signaling pathways by the end product of lipid peroxidation, 4-hydroxy-2-nonenal is a patential inducer of intracellular-peroxide production. J. Biol Chem, 1999; 274:2234-2242.

Ohta S. et. al. – Mitocondrial ALDH2 deficiency as an oxidative stress Ann N4 Acad. Sci 2004; 1011:36-44.

Yang Y. et. al. – Lipid peroxidation and cell cycla signaling: 4-hydroxyno-nenal, a Key molecule in stress mediate signaling. Acta Biochim Pol, 2003; 50: 319-336.

Aydin A., et. al. – Oxidative stress and nitric oxide related parametres in type II, diabetes mellitus: effects of glycemic control. Clin Biochem 2004; 34:65-70 (Pub Med)

Melhem A. et. al. – Treatmet of cronic hepatitis C virus infection via antio-xidants results of a phase I – clinical trial. J. Clin Gastroenterol. 39:737-742, 2005

Li K, et. al. – Celular response to conditional expression of hepatitis C virus care rotein in Huh 7 cultured human hepatoma cells. Hepatology 35:1237-1246-2002 (Cross Ref)

Sies H. – Strategies of antiocidant defences. Eur J. Biochem 1993:215:213-219. (Cross Ref)

Chrabot A.M. et. al. – Antioxidant defence in children with cronic vival hepatitis B and C, Med Sci.Movit 2000, 6:713-718.

Görenek Levent et. al. – Oxidative stress and antioxidant defense in patients with chronic hepatitis C patients before and after pegylated interferon alfa-2 b plus ribavirin therapy. Jaournal of Translatation Medicine 2006-4:25-doi: 10.1186/1479-5876-4-25

Ingrid Emerit et. al. – Clastogenic Factors as Biomarkers of Oxidative stress in chronic Hepatitis C. Digestion 2000; 62:200-207:10 1159/7814.

Michael W. King et. al. – Hyppoxic ischemic encephalopaty general principles. Hepatology, 2011.

Jin Endo et. al. – Metabolic Remodeling induced by Mitochondri Aldehydy Stress Stimulates Tolerance to oxida stress in the Heart

Alan S. Hazele, Roger F. Butterweth – Encefalopatie hepatică: o actualizare a mecanismelor fiziopatologice. Unitate de cercetare Universitatea din Montreal Quebec Canada.

Pinar Ciragil et. al. –Oxidative Stress in Patients with Chronic Hepatitis Band C

Kuei-Chuan Lee, et. al. – Increased Plasma Malondialdehide in Patients with Viral Crrhosis and its Relationships to Plasma Nitric Oxide, Endotoxin and Portale Pressure. Digestive Disease and Sciences 2009, volume 54-Number 6, pages 1178-1183.

Chrobat A.M. et. al. – Antioxidant defence in children with chrronic viral hepatitis A and C. Med. Sci Monit, 2000; 6:713-718.

Paridis V. et. al. – In situ detection of lipid peroxidation in chronic hepatitis C.correlation with pathological features. J. Clin Pathol, 1997;50-401-6

Romero M.J. et. al. – Serum Malondialdehide: Possible use for the clinical management of chronic hepatitis C patients. Fere Radiol Biol. Med 1998:25:993-7.

Fridovich I. – Superoxide radical: an endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxical, 1983;23:239-57

Beutler E. – Red:Cell metabolism. Grune and Strattom Company. New York 1975; 261-5.

Demirdag K. et. al. – Lefvels of plasma malondialdehyde and erytrocyte antioxidant enzime activities in patients with chronic hepatitis B. Hepatogastroeterology 2003; 50:766-70.

Broide E. et. al. – Superoxide dismutase activity in children with chronic liver disease. J. Hepathol 2000; 32:188-92.

Jrshad M. et. al. – Superoyide dismutase and total antioxidant levels in various forms of liver disease. Hepatology Research 2002; 23: 178-84.

Nagoev B. S. et. al. – LPO ant Free nadical oxidation parametres in patients with acute viral hepatitis. Bull Exp. Biol Med 2002; 134:557-8.

Takano S., et. al. – Incidence of hepato-celluar carcinoma in cronic hepatitis B and C: a pros-pective study of 251 patients Hepatology, 1995; 21:650-5.

Tabaka R. Et. al. – Follow-up study of 582 liver cirrhosis patients for 26 years in Japan. Liver 1987; 7:316-24.

Benvegnu L. et. al. – Naturalhistory of compensated viral cirrhosis: a prospective study on the incidence and hierarchy of major complications. Italy, University of Padova, 2-35128-November 2003.

Global Surveillance – Control of hepatitis C Report of a WHO consultation organized in colaboration with the viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium.

Liaw YF, et. al. – The development of cirrhosis in patients with chronic type B-hepatitis, a prospective study. Hepatology, 1988; 8: 493-6.

Pachliaro L. et. al. – Portal Hypertension in cirrhosis: natural history. Cambridge, M.A. Blackwell Scientific, 1994: 72-92.

Gines P. et. al. – Compesated cirrhosis: natural history and prognostic factors. Hepatology, 1987; 7: 122-8.

D’Amico G. et. al. – Survival and prognostic indicators in compesated and decompensated cirrhosis. Dig. Dis. Sci, 1986; 31:468-475.

Kyrsten D. Fairbanks – Alcoholic liver Disease. Alcohol Clin Exp. Res. 1993, 17 (5), 1112-1117.

Haussinger, Dieter; Görg, Boris – Interaction of oxidative stress astrocyte swelling and cere-bral amenonia Foxicity,2010 Lippincott William set Wilkins

Loguercio C. et. al. – Oxidative stress in viral and alcholic hepatitis, Free Radic Biol Med. 2003.

Rafael Mateo et. al. – Relationyship Between Oxidative Stress and Behavioral Sings of Lead Poisoing in Mallards. Eur Neural, 1994; 34:209-12.

Haussinger D. – Pathogenesis of hepatic encephalopathy. J. Gastroeneral Hepatol, 2002.

Jones E.A. – Animonia, the GABA neurotransmitter system and hepatic encephalopathy. Metas Brain. Dis. 17 (4): 275-81, 2002.

Rama Rao K.V. – Anemonia neurotoxicity. Metab. Brain Dis. 18 (2), 113-27, 2003.

Avashalumov M. V. et. al. – NMDAR activation mediates hydrogen peroxide, induced pathophysiology in rat hippocampal glices. (2002). J. Neurophysical: 87 (6), 2896-903.

Butterwoth R.F., et. al. – Manganese toxicity, dopaminergic dysfunction and hepatic encephalopathy. Metab. Brain. Res. 10: 259-267, 1995.

Papavasilion P.S. et. al. – Role of liver in regulating distribution and excretion of manganese. Am. J. Physiol 211:211-216-1966.

Layrargues G.P. et. al. – Increased manganese concentrations in palidum of cirrhotic patients. Lancet 345:735, 1995.

Lavoie J. et. al. – Activities of neuronal and astrocytic marker enzimes in antropsied brain tissue form patients with hepatic encephalopathy.Metabol Brain Dis 2: 283-290, 1987

Schmidt W. et. al. – Hepatic encephalopatzhy influences high affinity uptake of transmitter dutamate and aspartate into the hippocampal formation. Metab. Brain Dis 5:19-22, 1990

Lavoie J. et. al. – Increased densities of peripheral-type benzodiazepine rceptors in brain autopy, from cirrhotic patients with hepatic encepholopathy. Hepatology 11:874-878,199.

Cruz N.F. et. al. – Locol cerebral glucose metabolism in rats with chrronic portocaval scheunts. J. Cereb Blood Flow Metab 3:311-320, 1983.

Rao V.L. – Nitric oxide in hepatic encephalpathy and hyperammo-niemia Neurochem int: 41 (2-3) 161- 7, 2002.

Taylor-Robinson S.D. et. al. – Cerebral 31 P. magnetic resonance spectroscopy in patients with chronic hepatitis encepholopazhy. Hepatology 20; 1173-1178, 1994.

Butterworth R.F. et. al. – Rathophysiology of hepatic enxephalopathy: The ammonia hypothesis revisited. CRC. Press 00. 9-24, 1991.

Lockwoot A.H. et. al. – Cerebral amonia metabolism in patients with sever liver disease and minimal hepatic enhcephalopathy. J. Cereb Blood Flow Metab 11; 337-341, 1991.

Szerb J.C. et. al. – Effect of ammonium ions on synaptic transimmissio in the mammalion central neurous system. Prog. Neurobiol 39: 125-153, 1992.

Levin L.H. et. al. – Elevatect brain water during urease, induce hyperammo-niemia in drogs. Berlin, Springer Verlag pp 1032, 1034, 1989.

Narenberg M.D. et. al. – Ammonia induce astrociyrw swelling in primary culture. Neurochem Res, 16; 833-836, 1993.

van Galder N.M. – Metabolic intgeracions between neurons and astroglia. Clutamine syntetaze carbonic anhytrase and wate a balance. Basic Mechahisms of Neuronal Hyperexcitability. New York Alan R Liss pp. 5-29, 1983.

Versieck J. et. al. – Manganese, Copper an zinc concentrations in serum and placked blood cells during acute hepatitis, chronic hepatitis and posthepatic cirrhosis. Clin Chem, 20: 1141-1145, 1974.

96.b. Hauser R.A. et. al. – Manganese intoxication an chronic liver failure. Ann

Neuronal 36: 871-875, 1994.

Nelson K. et. al. – Manganese encephalopthy: Utility of early magnetic resonance imaging. Br. J. Ind. Med, 50: 510-513, 1993.

Layrargues G.P. et. al. – Increased manganese concentrations in pallidum of cirrhotic patients. Lancet 346: 270-274, 1997.

Hazell A.S. et. al. – Manganese decreases glutamate uptake in cultured astroctes. Nemochem Res 22: 1443-1447, 1997.

Mc Candless D.W. et. al. – Effect of acute ammonia intoxication on energy stores in the cerebral reticular-activating system. Exp. Brain Res 44: 325-330, 1981.-

Devenyi A.G. et. al. – Dystonia, hyperintense basal ganglia, and high whole blood manganese levels in Alagile’s syndrome. Gastroenterology 106: 1068-1071, 1994.

Rose C., et. al. – Manganese de position in basal ganglia structures results from both portal-systemic shunting and impaired hepatobiliary elimination. Hepatology 26: 182A, 1997.

Boris Görg – Oxidative stress markers in the brain of patients with cirhosis and hepatic encephalopathy, 2010, Hepatolog vol. 52 issue-1 pag. 256-265.

103.b. de Vries H.E. et. al. – The influence of cytokines on the integrity of the blood-

brain, barrier in vitro. J. Neuroimmunol 64, 37-43, 1996.

Norenberg MD. et. al. – The glial glutamate transporter in hyperamoniemia and hepatic encephalopathy. Relation to Energy metabolism and glutamatergic neurotransmission. Glia 21: 124-133, 1997.

104.b. Didier N. et. al. – Secretion of interleukin-β by astrocytes mediates

endothelin-1and human necrotisis factor-α effects on human brain micrfovascular endothelial cell pernseability. J. Neurochem 86; 246-254 (2003).

Khachaturian H. et. al – Anatomi of the CNS opioid systems. Trends Neuroal Sci, 10; 111-119, 1985.

105.b. Duchini A. – Effects of tumor necrosis factor-α and intraleukin-6 on

fenid-phase permeability and ammonia diffusion in CNS derived endothelial cells. J. Investig Med 44; 474-482, 1996.

Girard G. et.al. – Protocaval anastomosis results in region selective loss of glutamine syntetase in brain. Metab Brain Dis 8: 207-215, 1993.

106.b. Cagnin A., et. al. – In vivo imaging of cerebral „periphoral benzodiazepine

binfing sites” in patients with hepatic C encephalopathy. Gut 55, 547.553 (2006).

Kmecht K. et. al. – Decreased glutamate transporters (GLT-1) expression in frontal cortex of rats with acujte liver failure. Neurosci Lett, 299: 201-203, 1997.

107. b. Ahboucha S., et. al. – The neurosteroid system implication in the pathophysio-

logy of hepatic encephalopathy.

Rothstein J. D. et. al. – Localization of neuronal and glial glutamaet transporters. Neuron 13: 713-772, 1994.

108.b. Showcross D. et. al. – The pathophysiologic basis of hepatic encephalopathy

central role for ammonia and inflammation. Cell Mol Life Sci, 62; 2295-2304 (2005).

Ferenci P. et. al. – Changes in clutamate receptors on Synaptic membranes associated with hepatic encephalpathy on hyperammonia in the rabbit.. Hepatology 4 25-29 1984.

Michalak A. et. al. – Selective loss of binding sites for the glutomate receptor ligends (3H) kainate and (S)-(3H) 5 fluorowillardine in the brains of rats with acute liber failure. Hepatology: 25: 631-635, 1997.

Raghavendra Ra O.V.L. et. al. – Increased activities of MAOA and MAOB in autopsied brain tisseie from cirhotic patients with hepatic encephalopathy. Braian Res 621: 345-352, 1993.

Bergeron M. et. al. – Effect of amonia on brain seratonin metabolism in rlation to function in the portocaval-shunted rat. J. Neurochem 55: 222-229, 1990.

Apelqvist G. et. al. – Regional brain serotonin receptor changes in portocav-shunted rats. Acta Physiol Scond 162:509-516, 1998.

Yurdaydin C. et. al. – Modulation of hrpatic encephalipathy in rath with thioacetamide indeced acute liver failure by serotonin antegonists. Eur J. Gastroenterol Hepatol, 8: 667-671, 1996.

Yurdaydin C et. al. – Incraosed serotoninergic and noradrenergic activity in hepatic encepholopathy rats with thioacetamide induced acute liver failure. Hepalology 12; 695-700, 1990.

Michalok A. et. al. – Evidence for altered central noradrenergic funcion, in experimental acute liver failure in the rat.. Hepatology 27: 362-368, 1998.

Berg qvist P. et. al. – Brain extracellular quinolinic acid in Chronic experimental hepatic encephalopathy as assessed by in vivo microdyalisis. Acute effects of L-tryptophan. Neuropsydrophormacology 15: 381-389, 1996.

Mousseau D.D. et. al. – Selective loss of pallidal dopamine D2 receptor density in hepatic encephalopathy. Neurosci Lett 162: 192-196, 1993.

Hadesman R. et. al. – Concentrations of 3, 4 dihydroxyphenylolanine and catecholamines and catecholamines and metabolites in an anhepatic model of hepatic encephalopathy. J. Heurocherm 65: 1166-1175, 1995.

Yurdaydin C. et. al. – Increased serotoninergic and nooradrenergic activity in hepatic encepholopthy in rats with thioacetamide induced acute liver failure. Hepatology 12; 695-700-1990.

Mc Kinzie S.L. et. al. – Release of norepinephrine and dopamine in ventriculo-cisternal perfuzions in hepatictomized rats.. Neurochem 66: 509-578, 1996.

Bergeron M. et. al. – Increased metabocortical dopaminergic function following ammonia administration to rats with portocaval anastomosis. Neurochem Res 10: 79-86, 1995.

123. Ray S. et. al. – Hepatic encephalopathy in cirrohotic and portocaval-shunted dogs: Lack of changes in brain GABA uptake, brain GABA level and brain glutamic acid decarboxylase activity and poptsynaptic GAB receptor. Hepatology 8: 845-849, 1988

Basile A.S. et. al. – GABA receptor Complex in an experimental model of encephalopathy: Evidence for elevated levels of an endogenosis benzodiazepine receptor ligend. J. Neurochem 53: 1057-1063, 1989.

Puia G. et. al. – Difference in the negative allosteric modulation of GABA receptors elicides by 4-chlorodiazepam and by a β carbo-line-3-carboxylate ester. A study with natural and reconsti-tuted receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 86:7275-7279, 1889.

Majewska M.D. et. al. – Neurosteroid pregnenolone sulfate antagonizes electrophysiological responses to GABA in neurons. Neurosci Lett 90: 270-284, 1988.

Zeneroli M.L. et. al. – Endorphin-and opiate receptor change in acute and chronic models of hepatic encephalopathy. N.J. Humana Press Inc. Pp 455-466, 1988.

De Wacle J. et. al. – Portocaval anastemosis results in region-selective changes of β-endorphin content and of μ and δ opiod receptor densities in rat brain. Hepatology 24: 895-901, 1996.

Martin J. R. et. al. – Incrased ethanol consumtion and blood ethanol levels in rats with portocaval shunts. Am J. Physil 248: G. 287-G.292, 1985.

Thorton J.R. et. al. – Plasma methionine enkephalin concentrationand prognosis in primari biliary cirrhosis. Br. Med J. 297: 1241-1242, 1988.

Rao V.L. et. al. – Increased nitric oxide synthase activities and L-3 (3H) arginine utake in brain following portocaval anastemosis. J. Neurochem 65: 677-681, 1995.

Rao V.L., et. al. – Increased neuronal nitric oxide synthase expression in brain following portocoval anastomosis. Brain Res 765: 169-172, 1977

Noremberg M.D. et. al. – Acute liver failure and hyperammonemia incrase nitric oxide synthase in mouse brain. Soc Neurosci Abst 21-869, 1995.

Kosenko E. et. al. – Nitroarginine an inhibitor of nitric oxide synthetase atemattes ammonia toxicity and ammonia incluced alterations in brain metabolism. Neurochem Res 20:451-456, 1995.

Kosenko E. et. al. – Nitroarginie an inhibitor of nitric oxide synthase prevents changes in superoxide radical and antioxidant enzimes induced by ammonia intoxication. Metab, Brain Dis. 13: 29-41, 1998.

Katchman A.N. et. al. – Nitric oxide modulates synaptic glutamate releas during anoxia. Neurosci Sett 228:50-54, 1990.

Bajaj. J.S. et. al. – Inhibitory control test for the diagnosis of minimal hepatic encephalopathy. Gastroenterology 2008; 135: 1591-60.

Mandini H. et. al. – Computerized psychometric testind in minimal hepatic encephalopathy and modulation by nitrogen challenge and liver transplant. Gastroenterology 2008; 135; 1582-90

Sherlock S. et. al. – Sontal-systemic encepholopathy neurologic Complications of liver disease. Lancet, 1954, 454-7.

Schafer D.F. et. al. – Hepatic encepholopathy and the gamma aminobutyric-acid neurotransmitter system Lancet 1982 (1), 18-20.

Haussinger D. et. al. – Hepatic encepholopathy in cronic liver disease a clinical manifestation of astrocyte swelling and low grade cerebral edema. J. Hepatol 2000, 32:1035-8.

Haussinger D. et. al. – Proton magnetic resonance spectioseapy studies on human brain myo-inasital in hypo-osmolarity and hepatic encepholopathy. Gastroenterology, 1994; 107: 1475-80.

Tanigami H. et. al. – Effect of glutamine synthetase inhibition on astrocyte swelling and altered astroglical protein expression duringhyperammoniemia in rats.. Neuroscience, 2005; 134: 437-49.

Shawcross D.L. et. al. – Lowmyo-inositol and high glutamine levels in brain are associated with neuropsychological deterioration after induced haperammonemia. Am J. Pshysiol 2004; 287: G. 503-9

Schliess F. et. al. – Clacium dependent activation of Erk-1 and Erk-2 following hyoposomatic cell swelling. Biochem J. 1996; 320;167-71.

Bender A. S. et. al. – Effect of benzodiazepines and neurosteroids on anmonia induced swelling in cultured astrocytes. J. Neurosci Res, 18998: 54: 673-80.

Lavoie J. et. al. – Increased sensivities of peripheral type benzodiazepine receptors in brain autopsy sample from cirrhotic petients with hepatic encephalopaty. Hepatology, 1990; 11: 874-8.

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between osmotic and oxidative stress the hepatic encephalopathy paradign. Biol Chem 2006; 387: 1363-70.

Sezer S. et. al. – Hepatitis C infection in Hemodialysis Patients: Protective Against Oxidative stress. Biochemisty 06490 Ancara Turkey

Larrea E. et. al. – Superoxide dismutase in patients with cronic hepatitis C virus infectionI. Free Radic Biol Med. 1998, 24; 1235-1241.

Irshad M et. al. – Superoxide dismutase and total antioxidant levels in varios forms of liver disease. Hepatol Res, 2002, 23: 178-184.

Parola M et. al. – Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis. J. Hepatol, 2001, 35: 297-306.

Giuliai Fortunato – Multivatiate Discriminant function based on Six Biochemical Markers in blood can predict the cirrhotic evolution of chronic hepatitis, 2001. The American Association for Clinical Chemistry.

Colombo M. – Hepatacellular carcinoma. J. Hepatol, 1992; 15: 225-236.

Sollie R. et. al. – Viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterol Clin North Am, 1994; 23: 576-579.

Shuppan D. et. al. – Serumk assays for liver fibrosis. J. Hepatol 1995,22:82-88.

Ishak K.G. – Pathologie features of Chronic hepatits. A review and update. A, J. Clin Pat, 2000; 113: 40-55.

Pilette C. et. al. – Histopathological evaluation of liver fibriosis quantitative image analysis vs semi-quantitative scores. Comparison Whith serum markers. J. Hepatol, 1998, 28: 439-446.

Brunt E. M. – Grading and staging the histopathological lesions of chronic hepatitis: the Knodell histology activity index and beyondI. Hepatology 2000, 31: 241-246.

Szakcs J.G. et. al. – Progress in diagnosis of hepatitis and the cirrhotic liver. Am clin Sci, 1999; 23: 87-103.

The Metevir – Inter and intra obserwer variation in the assesment of liver biopsy of chronic hepatitis C.. Hepatology 1994; 20-15-20

Teare J. P. et. al. – Concentrations of serum procollagen III peptide concentrations and PGA index for assessment of hepatic fibrosis. Lancet, 1993, 342: 895.898.

Castedo G. et. al. – Differential diagnosis between hepatocellura carcinoma and cirrhosis through a discriminant function based on biochemical serrum analytes. Clin Chen 1996; 42: 1263-1269

Castaldo G. et. al. – Discriminant function based on serum analytes differentiates hepatocarcinoma from secondary liver neoplasma. Clin Chem 1995; 41: 439-443.

Costaldo G. et. al. – Total discrimination of peritoneal ascites from cirrhosis and hepatocarcinoma associaetd ascites by assays of ascitic cholesterol and lactate dehydrogenase. Clin Chem 1994; 40: 478-483.

Desmet V.J. et. al. – Clasification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. Hepatology 1994; 19: 1514-1519.

Jamilé Wakim-Fleming et. al. – Hepatic encehalopathy: Suspect it early in patients with cirrhosis. European Jaournal of internal Medicine volum 20 Issue 7 pages 703-708, 2009

Romero Gomez M, et. al. – Intestinal glutaminase activity in increased in liver cirrhosis and corelates with minimal hepatic encephalopathy. J. Hepatol 2004; 41: 49-54.

Nourenberg M.D. et. al. – New concepts in the mechanism of ammonia-induced astrocyte swelling. Metab Brain Dis 2007; 22: 219-232.

Tanigaimi H. et. al. – Effect of glutamine synthetase inhibition an swelling and altered astroglial protein expression during hypermmania in rats. Neuroscince 2005, 131: 437-449.

Liansala M. et. al. – NMDA recedptors in hyperammoniemia and hepatic encefalpathy. Metab. Brain Dis. 2007; 22; 321-335

Montaliu C., et. al. – IL 6-and IL-8 in blood may discriminate cirrhotic patient with and withont minmal hepatic encephalopathy. J. Clin. Gastrenteril. 2009; 45; 272-279

Krieger D. et. al. – Manganese and chronic hepatic encephalopathy. Lauced 1995; 346: 270-274.

Pomier Laxrargues et. al. – Increased manganese concetration in pallidum of cirrhotic patients. Laucet. 1995; 345-735

Guevara M et. al. – Hiponatiemia is a risk factor of hepatic encephalopathy in patients with cirrhosis a prospective study with time dependent analysis. Am J. Gastroenterol. 2009; 104: 1382-1389

Hertz L. et. al. – Energy metabolism in brain cells: effects of elevated ammonia concentration. Metab. Brain. Dis 2007; 22: 199-218

Marchesini G. et. al. – Prevalence of subclinical hepatic encephalopaty in cirrhosis and relationship to plasma amino acid inbalance. Dig Dis Sci 1980; 25: 763-768.

Morgan M.Y. et. al. – Plasma ratio of valine, leucine, and isolencine to phenylaline and tyrosine in liver disease. Gut, 1978; 19: 1068-1073.

Haussinger D. et. al. – Interaction of oxidative stress, astrocyte swilling and cerebral ammonia toxicity. Curr.Opin.Clin. Nutr. Metab. Care 2010:13: 87-92.

Bianchi L. – Leberinsuffizienz und Leberkama. Leber Magen Darm. 1977; 7; 221-226.

Poveda M. J. – Brain edema dinamics in patients with overt hepatic encephalopa-thy. A magnetic resonance imaging study. Neuroimage 2010; 52: 481-487.

Masson S et. al. – Hepatic encephalopathy after transjugular intrahepatic portosys-temic shunt insertion: a decade of experience. O.J.M, 2008; 101: 493-501.

Garcia Pagan J.C.et.al.– Early use of TIPS in patients with cirrhosis and variceal bleeding. N. Engl. J. Med. 2010; 362: 2370-2379

Boyer T.D. et. al. – The rol of transjugular intrahepatic pertosystemic shunt (TIPS) in the management of portal hypertension update 2009. Hepatology 2010; 51:306.

Bockus H.L. – Gastroenterology, vol III W.B. Saunders Company Ltd. Philadel-phia London.

Genova Diagnostics – Test Catalog, Oxidative stress Analysis Ref. Type Internet Commu-nication

Abeam – Test Catalog Malondialdehyde (MDA), Ref. Type: Internet Communication

Laborator Synevo – Referințe specifice tehnologice de lucru utilizate 2011. Ref. Type Catalog.

Abcam, Test Catalog –Superoxide Dismutase 3-antibody Ref Type Internet Communication

Genova Diagnostics – Test Catalog Oxidative Stress Analysis Ref Type Internet Communication

Hx Deng et. al. – Amyotrophic lateral sclerosis and structural defects in Cu, Zn, superoxide dismutas. In Science 261 (5124): 1047-1051, 1993.

Segui J. et. al. – Superoxid dismutase ameliorates TNBS induced calitis by reducing oxidative stress adhesion molecule expresion and leukocyte recruiment into the inflamed intestine. In J. Leukoc Biol. 76 (3): 537-44, 2004

Ying Zhang et. al. – Overexpresion of Copper Zing Superoxid Dismutase Supp Human Clioma Cell Crowth. In Cancer Res: 62: 1205-1212, 2002.

Y. Graner et. al. – Cell damage by excess Cu Zn SOD and down’s syndrome. Biomedicine et. Parmacotherapy volume 48 (5-6), 231-237, 1994.

Laborator Synevo – Referințe specifice tehnologiei de lucru utilizate în 2011. Ref. Type Catalog.

Guoyao W. et. al. – Turner guetatione Metabolism and is implications for Health. In J, Nutr. 134: 489-492, 2004.

Hangy Liang et. al. – The district in vivo roles of the long-form and short-form of glutathione peroxidase 4: the short-form is essential for somatic cell functions and the long-form in important for male fertility. In the FASEB Jaournal, 2009.

Paul Lewis et. al. – Cooper and Judy B de Haan Lack of the Antioxidant Enzime Glutathione Peroxidase Accelerates Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotin E-Deficient Mice. In Circulation; 115: 2178-2187.

Paula Dobrescu – Importanța antioxidanților în sănătate. Fac. De Educa Sportivă Universit Al I. Cuza, Iași.

Talmud P.J. et. al. – Gene-centric association signals for lipids and apolipoproteins identified via the Human CND Bead Chip. In Am. J, Hum, Genet 85 (5): 628-42, 2009.

Antije Banning, et. al. – Guatatione Peroxidase inhibits Cyelooxygenase 2-Mediated Migration and invasion of HT-29 adenocarcinoma cells but supports their Gronth as Tumors in Nude Mice. In Cancer Res. 68:9746-9753, 2008.

Rogerio Margis et. al. – Glutatione peroxidase family an evolutionary overview. In FEBS Journal: 275: 3959-3970, 2008.

Laborator Synevo – Referințe specifice tehnologice de lucru utilizate în 2011, Ref. Type: Catalog.

Zieve L. – Hepatia encephalopazhy in Popper H, Schaffner Progress in liver disease vol VI, Grune and Stratton, New Zork, 1979; 327-341.

Ramona Bănică, – Analize de laborator și alte explorări diagnostice, Copyright, 2007,

M. Samoilă, L. Anghel Medic Art.

Dumitrașcu D. – Tratat de Medicină internă sub redacția Radu Păun: Bolile aparatului digestiv; Ficatul, căile biliare și pancreasul, pg. 476-482. Ed. Medicală, București, 1986.

Harison, – Principii de medicină internă, Ediția a XIII-a, pg. 496-498. Editura

K.J.Issalbacher et.al. Orizonturi, București, 1997.

Mc Cullough A.J.et.al.– The nature prognostic significance of serial serum aminoacid abnormalitis in severe chronic active liver disease. Gastroenterology, 1979, 77,5, A 26.

Randolph C. et. al. – Neuropsychological assement of hepatic encefalopathy. Ishen Practice guidelines. Liver Int. 29 (5), 629-35, 2009

Ryan J.M. et. al. – Hepatic encephalopathy. Medicine (10): 617-620, 2011

Summerskill W.H.et.al.– The neuropsychiatric syndrome associated with hepatic cirrhosis and an extensive portal collaterla circulation. Q. J. Med. 25 (98): 245-66.

Fattovich G. et. al. – Morbidity and mortality in compensated cirrhosis C: retospective follow-up study of 384 patients. Castrology 1997; 112: 463-72.

Shawcross D.,Jalan R. – The pathophysiologic basis of hepatic encephalopathy. Control role for ammonia and inflammation.Cell Med. Life Sci 62, 2295-2304, (2005).

Norenberg M.D.et.al. – New concepts in the mechanism of amonia induced astrocyte swelling. Metab. Brain Dis (2007).

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between osmotic and oxidative stress: the hepatic encephalopathy paradign. Biol Chem 387, 1363-1370 (2006)

Cooper A.J. et. al. – Biochemistry and physiology of brain ammonia. Physiol Rev. 67, 440-519 (1987).

Thomas J.M. et. al. – Change in glutamate cycle enzime MRNA levels in a rate model of hepatic encephalopathy. Metab. Brain Dis. 3, 81-90 (1988)

Rose C. et. al. – Acute insult of ammonia leads to calcium dependent glutamate release from cultured astrocytes an effect of pH. J. Biol Chem: 280, 20937-20944, (2005)

Reinehr R. et. al. – Hypoosmotic swelling and ammonia increase oxidative stress by NADPH oxidanse in cultured astrocytes and vital slices. Glia 55, 758-771 (2007).

Ion Dina – Breviar clinic de ecografie abdominală, pg. 9-26, Editura Didactică și Pedagogică, 2009, București.

Oliviu Pascu – Îndrumător practic de Endoscopie digestivă superioară, pag. 45, 57. Editura Dacia Cluj-Napoca, 1982.

Götz W. – Diagnostik von Lebererkrankungen G.I.T. Verlag Ernst Giebeler. Darmstadt 1980.

Mailard I.N. et. al. – Indications et modalites de la derivation porto-cave chez le cirrhotique. Gastroenterology Clin. Biol, 1977: 1, 8-9, 613-619.

Jain M.D. – Hepatic encephalopazhy (is a potentially reversible metabolic disturbance of the brain in liver disease) MedLink Neurology July 20, 2011)

Cihan Yurdaydin et.al.– Hepatic Encephalopathy. European Gastroenterology et hepatology Review, 2012; 7(4) 268-71.

rafael Mateo et. al. – Relationship Between Oxidative Stress, Pathology and Behavioral Sings of Lead Poisoning in Mallards.

Shawcross D.L.et.al. – Pole of ammonia inflammation in minimal hepatic encefalophathy. Metab. Brain Dis, 2007; Man: 22 (1) 125-38.

Shawcross D.L. et. al. – Infectiond and systemic inflammation, not ammonai are asociated with Grade ¾ hepatic encephalopathy, but not mortality in cirrhosis. Hepatol 2011, apr. 54 (4), 640-9.

Shawcross D.L. et. al. – Systemic inflammatory response exacerbates the neuropsychologi-cal effects of induced hyperammonia in cirrhosis. J.

Marsha Y. Morgen et. al. – Hepatia Encephalopathy in Patoents with Cirrhosis. Neurobiology of Disease 21699073 (2009)

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between asmatic and oxidative stress: the hepatia encephalopathy paradign. Biol Chem 2006, oct-Nov; 387 (10-11) 1363-70

Amit S.Segan et. ak. – Changing face of hepatic encephalopathy: Role of inflammation and oxidative stress. Warld J. Gastroenterol 2010 July 21.

Bloch P. et. al. – Dilatation kystique congenitale des voies biliares intra et extra hepatiques. J. Rad. Electrol. 1977, 58, 12, 839.

Haussinger D. et. al. – Hepatic encephalopata, in Rodes J., et. al. eds. The Oxford textbook of hepatology Oxford: Blackwell, 2007: 728-6.

ferenci P. et. al. – Hepatic encephalopathy definition, nomenclature, diagnosis and quantification: final raport of the working party at the 11 th Word Congresses of Gastrolenterology, Vienna 1998. Hepatology, 2002, 35:716-21

Wein C. et. al. – Minimal hepatic encephalopathy impairs fitness to derive. Hepatology 2004; 39: 739-45.

Schliess F. et. al. – Pathogenetic interplay between osmotic and oxidative stress: the hepatic encephalopatha paradigm. Biol Chem 2006; 387: 1363-1370.

Schliess F., et. al. – Osmotic and oxidative stress in hepatic encephalopathy In Haussinger D., Kircheis G. eds. Hepatic Encephalopathy and nitroegn metabolism. Dordrecht: Springer 2006:20-42.

Lupșor M. et. al. – Elastografia trantitorie unidimensională. Gastroenterologie Hepatilogie Bazele Practicii clinice. Ed. Med. Universitară, Iuliu Hațieganu, Cluj-Napoca, 2010.

Bajaj J.S. et. al. – Minimal hepatic encephalopathy is associated with motor vechicle crashes: the reality beyond the driving test.. Hepatology 50, 1175-1183 (2009)

Bajaj J.S. et. al. – The effect of fatigue in driving skills in patients with hepatic encephalopathy. Am. J. Gastroenterol, 104, 898-905 (2009)

Jennett B., et. al. – Predicting outcome in individual patients after severe head injury. Laucet 15, 1031-1034 (1976).

Manchesini G. et. al. – Zinc supplementation and amino acid-nitrogen metabolism in patients with advanced cirrosis. Hepatology 23, 1084-1092. (1996)

Schawcross D., et. al. – The pathophysiologic basis oh hepatic encephalopatha, central role for amonia and inflamation. Cell Mol Life Sci, 62, 2295-2304 (2005)

Sergeeva O.A. et. al. – GABAA receptor modification in taurine transporter Knockout nice causes steatol disinhibition. J. Physiol 2007; 585; 539-548.

Stewart V.C. et. al. – Astrocyte-derived oxide causes both reversible and ireversible damage to the neuronal mitrochondrial respitatory chain. J. Heurochem, 2000; 57: 694-700

Spahl D.U. et. al. – Regulation of zinc homeostayiy ba inducible No synthase derived No: nuclear metallothionein translocation and intranuclear Zn2+ release. Proc Natl. Acad Sci USA, 2003, 100: 13952-7.

Negru T., et. al. – Oxidative injury and other metabolic disorders in hepatic encephalopathy. Rom J. Physiol 1999, 36: 29-36.

Huang, D.Z, et. al. – Impaired ability to increase water excretion in mice lacking the taurine transporter gene TAUT. Plugers Arch 2006; 451: 668-77.

Kiebler M.A. et. al. – Neuronal RNA granules: movers and Markers. Neuron 2006, 50: 685-90.

Timmermann L. et. al. – Mini-asterixis in hepatic encephalopathy induced by pathologic thalamo-martor cortical coupling.

Haussinger D., et. al. – Pathogenetic mechynisms of hepatic encephalopathy „Experimente de Hepatologie” Dusseldarf the Deutshe 575.

Vuppalanchi Raj M.D. et. al. – Oxidative stress in chronic Liver Disease: Relationship Between Peripheral and Hepatic Measurements, 2001. Gastroenterology 120; 1241-1250.