Rolul Echilibrului Acizilor Grasi Saturati Versus Nesaturati In Mecanisme Celulare Normale Si In Patologie
TEZA DE DOCTORAT
Rolul echilibrului acizilor grași saturați versus nesaturați în mecanisme celulare normale și în patologie
CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT
INTRODUCERE
CAPITOLUL 1. PARTEA GENERALĂ
1.1. Lipide membranare
1.1.1. Aspecte generale
1.1.2. Clasificarea lipidelor
1.2. Acizii grași din celulele animale
1.2.1. Acizii grași nesaturați
1.2.2 Acizii grași saturați
1.3. Rolul lipidelor membranare și al acizilor grași
1.3.1. Rolul acizilor grași polinesaturați (PUFA)
1.3.2. Efectul acizilor grași polinesaturați (PUFA) asupra biogenezei membranelor și traficului intracelular al lor
1.4. Stresul oxidativ indus de radiațiile UVA asupra lipidelor
1.4.1. Radiațiile ultraviolete (UV) – caracterizare generală
1.4.2. Peroxidarea lipidelor
1.4.3. Mecanisme de apărare împotriva peroxidării lipidice
CAPITOLUL 2. METODOLOGIA DE STUDIU
2.1. Culturi celulare
2.2. Gazcromatografie
2.2.1. Echipament – Gazcromatograf
2.2.2. Alcătuirea unui gaz cromatograf
2.2.3. Tipuri de detectori
2.2.4. Tipuri de coloane și utilitatea lor
2.2.5. Procedeul experiemntal – Metoda de cromatografiere
2.3. Separarea fracțiunilor celulare
2.4. Extragerea și analiza cantitativă a proteinelor
2.5. Electroforeză, transfer electroforetic și imunomarcare (Western blot)
2.6. Imunofluorescență
2.7. Testul MTS
2.8. Videomicroscopie în timp real
2.8.1. Modelul experimental de vindecare a rănilor („wound healing”) pentru celule tratate cu DHA și iradiate cu UVA
2.8.2. Investigarea aderării, etalării, traiectoriei și vitezei de migrare ale celulelor prin videomicroscopie în timp real pe celule tratate cu DHA
2.9. Investigarea efectului radiațiilor UVA și a administrării de DHA asupra aderării și etalării celulare prin monitorizări de impedanță
2.10. Extragerea lipidelor din organele de șoarece
2.11. Fracționarea lipidelor prin cromatografie în fază lichidă de înaltă performanță
CAPITOLUL 3. REZULTATE ȘI DISCUȚII
3.1. Studiul acizilor grași din lipidele unor diverse linii celulare
3.1.1. Studii asupra acizilor grași în diverse tipuri de celule în funcție de stadiul de confluență
3.1.2. Efectul tratamentului cu DHA asupra conținutului de acizi grași din lipidele celulare
3.1.3. Efectul tratamentului cu acizi grași nesaturați și expunerii la radiații ultraviolete A asupra celulelor tegumentare
3.2. Studiul acizilor grași din organe pe modele experimentale animale
3.2.1. Studiul acizilor grași din corduri de șoarece cu deficiență de exprimare a receptorului la SDF-1α
3.2.2. Studiul acizilor grași din organe de șoarece tratat cu fosfatidilserine
CONCLUZII
BIBLIOGRAFIE
Mulțumiri:
Doresc să aduc mulțumiri doamnei Doctor Ștefana PETRESCU, conducătorul științific al lucrării, pentru profesionalismul cu care m-a ghidat pe drumul către obținerea titlului de doctor în științe, pentru răbdarea și amabilitatea sa, pentru sprijinul real acordat pe întreaga perioadă de desfășurare a doctoratului.
De asemenea doresc să mulțumesc, în mod special, domnului Doctor Mircea LEABU care m-a ajutat, sprijinit și îndrumat în această perioadă și mi-a dat posibilitatea să fac parte pe parcursul elaborării tezei de doctorat din echipa de cercetare a Laboratorului de biologie celulară a Institutului Național Victor Babeș.
Mulțumesc colegilor și în mod deosebit domnișoarei Cristina Mariana NICULIȚE cu care am colaborat în unele studii prezentate în această teză.
Un loc aparte în elaborarea prezentei lucrări îl ocupă colaborarea cu doamna Doctor Elisa LIEHN de la „Institute of Molecular Cardiovascular Research”, din Aachen și doamna Conferențiar Doctor Mariana Tamara NECHIFOR, cu acest prilej aducandu-le sincere mulțumiri.
Nu în ultimul rând doresc să mulțumesc familiei mele pentru înțelegerea și sprijinul moral pe care mi le-au acordat în această perioadă.
INTRODUCERE
Lipidele, prin compoziția lor în diverse tipuri de acizi grași (inclusiv prin raportul acizi grași saturați/ acizi grași nesaturați), interacționează diferit cu domeniile transmembranare ale proteinelor membranare contribuind la aranjarea conformațională a acestora ceea ce atrage modulări la nivelul funcțiilor lor. Efectele induse de modificarea chimiei lipidelor se manifestă atât în funcționarea normală a celulelor, cât și în modificări patologice, inclusiv în cancer. De aceea, în ultima decadă, studiul efectelor compoziției lipidice a membranelor a cunoscut o relansare din perspectiva efectelor asupra funcțiilor proteinelor membranare în fiziologia și patologia celulară, inclusiv cea canceroasă. Mai mult, crește interesul pentru investigarea rolului terapeutic al modelării chimiei lipidelor membranare.
Pe plan internațional interesul pentru studiul lipidelor membranare, în contextul investigării organizării moleculare a membranelor, este în continuă expansiune. Primul articol care raportează studii asupra lipidelor membranare și modificărilor acestora în celulele canceroase, cu efecte asupra fluidității membranei, apare în anul 1974 [1]. Cât privește interesul pentru importanța terapeutică a lipidelor membranare în cancer primul articol pe care îl putem afla este din 1987 [2]. Terapia prin lipide membranare se referă atât la medicamente liposolubile, care să influențeze organizarea bistratului lipidic, deci a caracteristicilor fizico-chimice ale acestuia și mai departe a comportamentului acestul element ultrastructural de organizare a membranelor, cât și la modularea compoziției chimice a lipidelor biomembranelor cu efecte asemănătoare. Asemenea abordări se focalizează în momentul de față prin cercetări asupra:
corelațiilor structură-funcție la nivelul lipidelor membranare;
interacțiunilor lipide-proteine;
efectele structurii lipidelor și a interacțiunilor lipide-proteine asupra semnalizării și patofiziologiei celulare.
Studiile sunt la început, dar patologiile abordate sunt de o mare diversitate: patologii cardiovasculare, patologii neurodegenerative, obezitate, alte dezordini metabolice, inflamații, boli infecțioase și autoimune. Pentru cancer au fost raportate modificări la nivelul lipidelor cu alterări la nivelul structurii și funcției celulare, inclusiv asupra proliferării, sau inducând rezistență multiplă la medicamente.
Pornind de la informațiile găsite în literatură legate de diversitatea și rolul acizilor grași din lipidele celulare, scopul acestei lucrări este de a caracteriza unele tipuri celulare sub aspectul conținutului de acizi grași și al raportului de acizi grași saturați/acizi grași nesaturați și sunt grupate în două direcții principale:
studii pe linii celulare normale și tumorale;
studii pe modele experimentale animale.
Capitolul 1
PARTEA GENERALĂ
Lipidele membranare
Aspecte generale
Acizii grași sunt componente structurale ale tuturor lipidelor complexe. Lipidele sunt substanțe esențiale organizării și funcționării celulare atât pentru plante cât și pentru animale, așadar și pentru om. Ele ajung în organism fie din hrană (prin grăsimile animale sau vegetale), fie se sintetizează, în interiorul organismului din glucide sau aminoacizi.
Grăsimile ajunse în organism odată cu alimentele, nu suferă transformări datorate enzimelor salivei, trecând cu structura nemodificată în stomac.
Scindarea grăsimilor în glicerină și acizi grași liberi, are loc în duoden și în prima porțiune a jejunului, sub influența lipazelor, care sunt secretate în principal de pancreas.
Un rol important, în absorbția lipidelor îl joacă și lichidul biliar, care împreună cu calciul și cu unii aminoacizii, activează lipaza pancreatică și lipazele intestinale, ajutând astfel la descompunerea grăsimilor. Totodată, sărurile biliare emulsionează grăsimile (dispersând lipidele în picături foarte fine) și favorizează absorbția. Grăsimile digerate circulă spre intestinul subțire, unde sunt absorbite la nivelul apical al enterocitelor și sunt înglobate în chilomicroni, particule mari și sferice (din clasa lipoproteinelor) ce conțin trigliceride și esteri de colesterol. Chilomicronii sunt secretați la polul latero-bazal al enterocitelor, prin exocitoză și trec în vasele limfatice din vilozitățile intestinului subțire, de unde sunt eliberați în fluxul sanguin la ductul toracic ce se varsă în vena subclavie stângă. După trecerea în fluxul sanguin, are loc transportul la locurile de metabolizare a lipidelor. Chilomicronii circulă pe calea fluxului sanguin și duc lipidele nepolare la hepatocite, la celulele musculare scheletale și cardiace, sau la adipocite pentru stocare în principal cu scop energetic. Proteoglicanii, molecule atasate pe fața internă a capilarelor captează chilomicronii circulanți. Interacțiunile rezultate permit protein-lipazelor să acționeze asupra componentei lipidice transportate de chilomicroni, pe care o scindează, părțile rezultate fiind preluate de celule.
Complexitatea structurală a compușilor lipidici impune, pentru o mai ușoară înțelegere, clasificarea lor.
1.1.2. Clasificarea lipidelor
Există mai multe criterii de clasificare a lipidelor. Vom menționa aici câteva care sunt utile contextului în care le discutăm.
După criteriul biologic, care implică localizarea în celulă și rolul lor, lipidele se împart în:
de rezervă (care se acumulează la om permanent, în țesutul adipos și tranzitoriu, în celule active energetic, iar la plante în diferite organe, mai ales în unele semințe sau fructe);
de constituție (care participă la organizarea ultrastructurilor celulare prin formarea bistratului lipidic al membranelor);
circulante (care sunt vehiculate prin sânge sau prin limfă asigurând transportul unor substanțe importante – vitamine liposolubile, hormoni lipofili),
După criteriul biochimic, care implică structura lor chimică, lipidele se împart în:
• simple (conțin doar carbon, oxigen și hidrogen), reprezentate de:
gliceridele (esteri ai glicerolului cu acizii grași)
ceridele (esteri ai unor alcooli și acizi grași, cu glicerina)
steridele (esteri ai sterolilor cu acizii grași)
• complexe (conțin și alte elemente ca: fosfor, sulf, azot, etc.)
glicerofosfatidele (fosfatidele)
sfingolipidele
• conjugate (asociate cu alți compuși organici)
glicolipide (lipide conjugate cu glucide printr-o legatură eterică între un hidroxil lateral al glicerinei și hidroxilul glicozidic al primului zahar din partea glucidică)
lipoproteine (lipide conjugate cu proteine prin interacțiuni fizico-chimice)
Contextul în care abordăm aici lipidele este unul legat de organizarea și funcționarea celulelor. Structurile celulare, a căror organizare și funcție sunt semnificativ dependente de compuși lipidici, sunt membranele (atât membrana celulară, ultrastructura care separă, dar și unște celula cu mediul) cât și endomembranele (membranele din interiorul celulei care delimitează o serie de organite celulare).
Membranele biologice au o structură generală identică, de ,,mozaic fluid" lipido-proteic, cu o grosime de 6-10 nm. Conform modelului în mozaic fluid al organizării membranei celulare, lipidele sunt aranjate în membrane sub formă de bistrat, cu capetele hidrofile la exterior și cozile hidrofobe în interior, bistrat care prezintă proprietăți fluide, manifestate bidimensional. Între lipidele și proteinele membranare există mai ales legături necovalente. Bistratul lipidic este o componentă fundamentală de 5nm grosime, observabilă în microscopie electronică. Are structura fluidă, conferă membranelor proprietatea de a fi impermeabile pentru moleculele hidrosolubile și ioni. În bistrat, lipidele au o distribuție (dispunere) asimetrică și sunt de o mare eterogenitate. Asadar, membranele celulare sunt structurate pe un bistrat lipidic cu comportament de fluid bidimensional, asimetric și eterogen [3,4].
Lipidele membranelor celulare reprezintă ~50% din greutatea acestora, existând 500-1000 de tipuri diferite de lipide, bistratul lipidic conținând 5×106 molecule lipidice/μm2. Lipidele pot juca un rol important în medierea recrutării proteinelor la membrane sau afectarea directă a dinamicii membranei. Deși lipidele membranare sunt co asigurând transportul unor substanțe importante – vitamine liposolubile, hormoni lipofili),
După criteriul biochimic, care implică structura lor chimică, lipidele se împart în:
• simple (conțin doar carbon, oxigen și hidrogen), reprezentate de:
gliceridele (esteri ai glicerolului cu acizii grași)
ceridele (esteri ai unor alcooli și acizi grași, cu glicerina)
steridele (esteri ai sterolilor cu acizii grași)
• complexe (conțin și alte elemente ca: fosfor, sulf, azot, etc.)
glicerofosfatidele (fosfatidele)
sfingolipidele
• conjugate (asociate cu alți compuși organici)
glicolipide (lipide conjugate cu glucide printr-o legatură eterică între un hidroxil lateral al glicerinei și hidroxilul glicozidic al primului zahar din partea glucidică)
lipoproteine (lipide conjugate cu proteine prin interacțiuni fizico-chimice)
Contextul în care abordăm aici lipidele este unul legat de organizarea și funcționarea celulelor. Structurile celulare, a căror organizare și funcție sunt semnificativ dependente de compuși lipidici, sunt membranele (atât membrana celulară, ultrastructura care separă, dar și unște celula cu mediul) cât și endomembranele (membranele din interiorul celulei care delimitează o serie de organite celulare).
Membranele biologice au o structură generală identică, de ,,mozaic fluid" lipido-proteic, cu o grosime de 6-10 nm. Conform modelului în mozaic fluid al organizării membranei celulare, lipidele sunt aranjate în membrane sub formă de bistrat, cu capetele hidrofile la exterior și cozile hidrofobe în interior, bistrat care prezintă proprietăți fluide, manifestate bidimensional. Între lipidele și proteinele membranare există mai ales legături necovalente. Bistratul lipidic este o componentă fundamentală de 5nm grosime, observabilă în microscopie electronică. Are structura fluidă, conferă membranelor proprietatea de a fi impermeabile pentru moleculele hidrosolubile și ioni. În bistrat, lipidele au o distribuție (dispunere) asimetrică și sunt de o mare eterogenitate. Asadar, membranele celulare sunt structurate pe un bistrat lipidic cu comportament de fluid bidimensional, asimetric și eterogen [3,4].
Lipidele membranelor celulare reprezintă ~50% din greutatea acestora, existând 500-1000 de tipuri diferite de lipide, bistratul lipidic conținând 5×106 molecule lipidice/μm2. Lipidele pot juca un rol important în medierea recrutării proteinelor la membrane sau afectarea directă a dinamicii membranei. Deși lipidele membranare sunt considerate a fi organizate în microdomenii, studii recente au condus la formularea unor idei alternative cu privire la caracteristicile și bănuitele funcții ale microdomenilor lipidice și asocierii acestora cu proteine. Tradiționala teorie că proteinele membranare pot difuza liber într-o „mare de lipide” ar putea avea nevoie să fie revizuită. Astfel modificări ale proteinelor datorate lipidelor au rol deosebit în reglarea transportului celular a unei game largi de molecule [5,6].
În membranele celulare întâlnim numai trei clase de lipide pe care le putem clasifica, în funcție de structura lor chimică globală, în:
1. fosfolipide (au caracter amfipatic și sunt formate dintr-o moleculă de glicerol, esterificată cu 2 acizi grași și o grupare fosfat reprezentănd clasa principală de lipide în membranele celulare; ~70-75%);
2. colesterol (face parte din clasa sterolilor și conține o grupare polară hidroxil, respectiv o parte hidrofobă formată dintr-un inel steroidic rigid și un lanț hidrocarbonat flexibil; este singurul lipid steroidic din structura membranelor, reprezentând ~20-25%; molecula de colesterol se inserează între fosfolipidele membranare, orientându-se cu gruparea hidroxil în vecinatatea capului polar al fosfolipidelor; colesterolul modulează proprietațile bistratului lipidic, intensificând proprietatea de barieră impermeabilă față de moleculele mici solubile în apă, influențând fluiditatea membranei;
3. glicolipide (sunt conjugate lipidice prezente numai în foița externă a membranelor, cu resturi de zaharuri atașate înspre exteriorul celulei; glicolipidele umane și animale au în constituția lor ceramide și sunt glicosfingolipide, găsindu-se în proporție de 1- 10%).
De menționat că lipidele membranare sunt amfifile, caracteristică utilă aranjamentului în bistrat, unde capetele hidrofile sunt expuse pe suprafețele externă, respectiv internă, iar cozile hidrofobe în profunzimea structurii. În acest fel bistratul lipidic, care conferă rolul de barieră membranelor, este acomodat între cele două medii hidrofile separate: mediul intracelular (citosolul) și mediul extracelular.
Așadar, cele mai bine reprezentate lipide în membranele celulare, sub aspectul abundenței sunt fosfolopidele. Clasificarea fosfolipidelor se poate face în funcție de mai multe criterii ce implică structura lor chimică:
În funcție de poliolul din structură, fosfolipidele se împart în:
a. fosfoglideride (glicerofosfatide) – atunci când poliolul este glicerină, (în structura fosfogliceridelor, pe scheletul polialcoolului – glicerina – se află grefate pe de o parte, la hidroxilii din pozițiile 1 și 2, două lanțuri alifatice ce formează coada hidrofobă a lipidului membranar, iar, pe de altă parte, la hidroxilul din poziția 3, se leagă o moleculă atașată prin intermediul unei grupări fosfat, împreună formând partea esențială a capului hidrofil).
b. fosfosfingozide (sfingofosfatide) – atunci când poliolul este sfingozină, de fapt un aminodiol cu un lanț alifatic propriu (acesta înlocuiește unul dintre acizii grași din coada hidrofobă a fosfolipidelor rezultate, cel de-al doilea fiind inserat pintr-o legătură amidică la gruparea amino a sfingozinei).
În funcție de compusul variabil de la nivelul capului hidrofil fosfogliceridele se împart în:
• fosfatidilcoline (PC), atunci când gruparea din capul polar al fosfolipidului este colină;
Fosfatidilcolina este cunoscută sub denumirea de lecitină, aceasta fiind cel mai abundent fosfolipid din lipidele țesuturilor animale și din plante, ajungând până la 50% din total.
• fosfatidiletanolamine (PE), atunci când gruparea variabilă a capului polar al fosfolipidului este etanolamină;
Fosfatidiletanolamina este cunoscută sub denumirea de cefalină și este, de obicei, cel de-al doilea (ca abundență) fosfolipid din lipidele țesuturilor animale și din plante. Fosfatidiletanolamina este adesea principala componentă a lipidelor din membranele microbiene. Fosfatidiletanolaminele se găsesc în toate celulele vii, ajungând până la 25% din totalul fosfolipidelor. Fosfatidiletanolamina se găsește în special în țesutul nervos, cum ar fi materia alba a creierului, nervi, țesuturi neuronale, și în măduva spinării, ajungând până la 45% din totalul fosfolipidelor. La nivelul endomembranelor proporții mai mari de fosfatidiletanolamine se găsesc în mitocondrie în comparație cu alte organite.
• fosfatidilserine (PS), atunci când în capul polar al fosfolipidului este serină;
Fosfatidilserina este cunoscută sub denumirea chimică de 1,2–diacil-sn-glicero-(3)-L-fosfoserină. Pentru prima dată, fosfatidilserina a fost izolată din lipidele țesutului nervos cerebral. Fosfatidilserina este alcătuită dintr-un schelet glicerofosfatat, două molecule de acizi grași și aminoacidul L-serină.
• fosfatidilinozitoli (PI), atunci când compusul de la nivelul capului polar al fosfolipidului este inozitol;
Fosfatidilinozitolul este un lipid important, atât ca element al bistratului lipidic membranar cât și ca participant în procesele metabolice esențiale, în toate plantele și animalele, atât direct, cât și prin intermediul unui număr de metaboliți. De obicei fosfatidilinozitolul formează o componentă minoră în foița citosolică a bistratului lipidic al membranelor celulelor eucariote. Gruparea fosfat conferă moleculei o sarcină negativă, la pH fiziologic. Fosfatidilinozitolul este abundent în țesutul cerebral, unde poate ajunge la 10% între fosfolipide.
• acizi fosfatidici (PA), atunci când la fosfatul din capul polar al compusului nu se află nici un alt compus ci doar un hidrogen.
Acid fosfatidic este cunoscut sub denumirea chimică de 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfat. Acesta nu este un element constitutiv abundent în bistratul lipidic, dar este extrem de important ca intermediar în biosinteza de triacilgliceroli și fosfolipide, cât și ca moleculă de semnalizare. Este cel mai simplu diacil-glicerofosfolipid, molecula acestuia are caracter acid și poartă o sarcină negativă, adică este un lipid anionic, ca și PI, respectiv PS.
Echivalentul fosfatidilcolinelor pentru sfingofosfolipidele membranare sunt sfingomielinele (SM).
Este important să menționăm că lipidele sunt aranjate asimetric în bistratul lipidic. Experimental s-a dovedit că PC și SM sunt preponderant distribuite în foița externă a bistratului, în timp ce PE, PS și PI sunt, după datele existente până în prezent, exclusiv în foița internă. Distribuția asimetrică a moleculelor lipidice pe cele două fețe ale bistratului poate fi exemplificată prin structura membranei hematiilor care conține în foița externă predominant fosfatidilcolină și sfingomielină, iar în foița internă fosfatidiletanolamină și fosfatidilserină. Diferențele gradului de nesaturare ale lanțurilor hidrocarbonate ale lipidelor și natura diferită a grupărilor polare determină diferențe în fluiditatea celor două foițe ale bistratului, astfel apare de asemenea și o distribuție diferită a sarcinilor electrice. Importanța funcțională a asimetriei de distribuție a componentelor membranare poate fi exemplificată astfel: activitatea enzimatică a proteinelor asociate membranei este dependentă de sarcina electrică a fosfolipidelor, proteinkinazele necesitând prezența fosfatidilserinei cu sarcina electrică negativă. În timpul apoptozei, fosfatidilserina este translocată în foița externă a bistratului lipidic și expusă astfel pe suprafața celulară, semnalizează macrofagelor prezența unei celule moarte, acesta fiind semnalul pentru fagocitare. Translocarea fosfatidilserinei în foița externă se produce prin inactivarea translocazei care realizează translocări active din foița externă în cea internă și activarea scramblazei care transferă nespecific, fără consum energetic fosfolipide între cele două foițe.
Colesterolul este în general egal distribuit între ambele foițe ale bistratului. Colesterolul se orientează în biomembrane cu grupările hidroxil din structura inelară steroidă în vecinatatea capetelor polare ale fosfolipidelor interactionând cu lanțurile alifatice din cozile fosfolipidelor, pe care le imobilizează parțial, având ca efect scăderea fluiditații biomembranelor.
Glicolipidele se află numai în foița externă a bistratului lipidic.
Din cele prezentate până aici, sub aspectul structurii chimice a lipidelor membranare, se evidențiază faptul că acizii grași sunt o componentă ubicuitară. Doar colesterolul face excepție, acesta fiind un lipid simplu, singurul lipid simplu din alcătuirea bistratului lipidic al membranelor.
Acizii grași din celulele animale
Acizii grași care intră în structurile celulare și sunt utilizați în diversele procese biologice reprezintă doar o parte dintre cei întâlniți în natură și semnificativ mai puțini decât cei descriși chimic.
Acizii grași care intră în structura fosfolipidelor au un număr par de atomi de carbon, cuprins între 12 (această limită inferioară fiind controversată, 14 fiind un număr mult mai deplin agreat) și 24 (C12-C24). Primul este reprezentat de un acid gras saturat, iar ultimul este din categoria acizilor grași nesaturați, cu una sau mai multe legături duble de tip ,,cis". Diferențele de lungime a lanțului de atomi de carbon din acizii grași, ca și cele din gradul lor de nesaturare influențează asamblarea moleculelor lipidice în bistrat, ca și fluiditatea acestuia. Prezența dublelor legături de tip ,,cis" introduce un punct de inflexiune în catenele acidului gras nesaturat, sporind diametrul cilindrului pe care coada hidrofobă îl formează datorită rotației moleculei. În ceea ce privește poziționarea acizilor grași în structura glicerofosfatidelor putem face următoarele afirmații:
– în poziția 1 a glicerinei, de regulă, se află esterificat un acid gras saturat, ca de exemplu acidul miristic, acidul palmitic sau acidul stearic.
– în poziția 2 a glicerinei, de regulă, este esterificat un acid gras nesaturat, ca de exemplu acidul oleic, acidul linoleic sau acidul linolenic.
Acizii grași sunt substanțe organice care intră în constituția majorității lipidelor, atât cele membranare cât și cele din incluziuni. Toți acizii grași au un lanț lung de hidrocarbură și o grupare terminală carboxil. Lanțul de hidrocarbură poate fi saturat (în acest caz acizii grași fiind denumiți acizi grași saturați) sau poate avea una sau mai multe duble legături (aceștia fiind denumiți acizi grași nesaturați, sau polinesaturați).
Acizii grași nesaturați sunt compuși critici pentru om, deoarece nu toți pot fi sintetizați de organism. Astfel doi acizi grași nesaturați nu pot fi produși de celulele umane: acidul linoleic și acidul linolenic (cu doi izomeri α-linolenic, respectiv γ-linolenic), aceștia primind și denumirea de acizi grași esențiali. Alții (acizii eicosapentaenoic, docosapentaenoic și docosahexaenoic) sunt produși, dar cu randament mic din acidul linolenic. Pentru aceștia din urmă, suplimentarea alimentară este necesară, iar grăsimea de pește este o sursă bogată în asemenea acizi grași nesaturați.
Posibilitățile organismului de a sintetiza acizi grași, sunt foare diferite de la țesut la țesut și de la specie la specie. Comun pentru toate speciile și toate țesuturile este faptul că biosinteza acizilor grași pornește de la aceeași substanță, și anume acetil coenzima A, care poate proveni prin metabolizarea unor diverse surse (din glucide, din aminoacizi, din alcool etilic sau chiar din acizi grași). Prin carboxilarea acetil-CoA, în prezența enzimei acetil-CoA carboxilază, se sintetizează malonil-CoA, reacția fiind dependentă da ATP. Din punct de vedere structural, acetil-CoA carboxilaza este o enzimă complexă: au fost identificate 3 componente funcționale și anume biotin proteina transportoare de carboxil (BCCP), biotin carboxilaza și carboxil transferaza.
Biotin-BCCP + HCO3- + H+ + ATP Carboxibiotin-BCCP + ADP + Pi (1)
Carboxibiotin-BCCP + Acetil-CoA Biotin-BCCP + Malonil-CoA (2)
Malonil-CoA, obținută din reacția acetil-CoA carboxilazei, este folosită în sinteza acizilor grași saturați cu catenă lungă printr-o serie de reacții care necesită NADPH și acetil-CoA, catalizate de complexul acid gras sintetază. Structura complexului enzimatic este diferită în funcție de sursa de proveniență, dar secvența reacțiilor este, în principiu, similară pentru toate organismele, respectând următorii pași:
1. Acetil transacilarea (reacția de inițiere)
Me COSCoA + HS-enzima MeCOS-enzima + CoASH (4)
2. Malonil transacilarea
HO2C-CH2COSCoA + HS-enzima HO2C-CH2COS-enzima + CoASH (5)
3. Condensarea cu β-cetoacil sintaza
HO2C-CH2COS-enzima + MeCOS-enzima HS-enzima + CO2
+ MeCOCH2S – enzima (6)
4. Reducerea β-cetoacilului
MeCOCH2S – enzima + NADPH MeCHOHCH2COS – enzima + NADP+ (7)
5. Deshidratarea β–hidroxi-acilului
MeCHOHCH2COS – enzima H2O + MeCH=CH-COS-enzima (8)
6. Reducerea 2,3-trans-enoilacilului
MeCH=CH-COS-enzima + NAD(P)H MeCH2CH2COS-enzima + NAD(P) (9)
Deoarece produsul final din ecuația (9) devine substrat în ecuația (6) unde reacționează cu o altă moleculă de malonil-S-enzimă, rezultatul concret al fiecărui ciclu de reacții este introducerea a doi atomi de carbon suplimentari în gruparea acetil inițială. Acești atomi de carbon suplimentari sunt ei înșiși obținuți din acetil-CoA substrat al acetil-CoA carboxilazei. După 7 repetări ale ciclului, este sintetizată palmitoil-CoA cu următoarea stoichiometrie:
MeCOSCoA + 7(HO2CCH2COSCoA) + 14NADPH + 14H+
Me(CH2)14COSCoA + 7CO2 + 8 CoASH + 14NADP+ 6H2O (10)
Natura produșilor finali din complex este determinată, într-o mare măsură, de specificitatea de substrat a β-cetoacil-sintazei. De exemplu, propionil-CoA poate înlocui acetil-CoA în reacția de inițiere, ceea ce are drept consecință sintetizarea acizilor grași cu număr impar de atomi de carbon.
Ca și în cazul biosintezei proteinelor, la care aminoacizii esențiali sunt foarte importanți, și în cazul producerii lipidelor contează asigurarea unui nivel optim de acizi grași esențiali din sursele de hrană. Dacă șobolanii imaturi sau sugarii sunt supuși unei diete lipsite de grăsimi, nu se dezvoltă bine, au o piele care se descuamează, au un păr care cade și, în cele din urmă, manifestând multe simptoame patologice, mor. Aceste fenomene nu mai apar dacă în dietă se adaugă acid linoleic. Acidul linoleic și acidul arahidonic au proprietatea de a preveni aceste simptoame, pe când acizii grași saturați și mononesaturați nu.
Astfel, s-a tras concluzia că mamiferele pot sintetiza acizi grasi saturați și mononesaturați din alți precursori, dar sunt incapabile să sintetizeze acid linoleic și linolenic.
Cel mai abundent acid gras esențial, la mamifere, este acidul linoleic, care reprezintă 10-20% din totalul de acizi grași din compoziția triacilglicerolilor și fosfogliceridelor. Mamiferele nu pot sintetiza acid linoleic și linolenic, dar aceștia pot fi obtinuți din plante, unde se află în cantitați foarte mari. Acidul linoleic este, în mamifere, un precursor necesar pentru biosinteza acidului arahidonic, acesta din urmă fiind foarte slab reprezentat în lumea vegetală.
Acizii grași se deosebesc între ei, în primul rând, prin lungimea lanțului și prin numărul și poziția legăturilor duble. Cei mai mulți acizi grași din plantele superioare și din animale au un număr par de atomi de carbon, cu lanțuri conținând între 14 și 22 atomi de carbon, predominând cei cu 16 sau 18. Cei mai răspândiți acizi grași saturați sunt acidul palmitic și acidul stearic, iar cel mai răspândit acid gras nesaturat este acidul oleic. Acizii grași nesaturați predomină față de de cei saturați îndeosebi în plantele superioare și în animalele care trăiesc la temperaturi mai scăzute. Acizii grași nesaturați au puncte de topire mai mici decât acizii grași saturați, cu același număr de atomi de carbon. În cei mai mulți acizi grași mononesaturați din organismele superioare, dublă legătură se află între atomii de carbon 9 și 10. În cei mai mulți acizi grași polinesaturați o dublă legătură se află între atomii de carbon 9 și 10, iar celelalte duble legături se află de obicei între dubla legătură 9-10 și capătul metil terminal al lanțului. În cele mai multe tipuri de acizi grași polinesaturați dublele legături sunt separate pintr-o grupare metilen (-CH=CH-CH2-CH=CH-), iar foarte rar, în unii acizi grași vegetali, găsim duble legături conjugate (-CH=CH-CH=CH-). În aproape toți acizii grași nesaturați din natură, dublele legături se află în configurația geometrică cis.
Formele cis ale acizilor grași nesaturati pot trece în forme trans prin încălzire, în prezența unor catalizatori. În acest fel, acidul oleic poate fi transformat în izomerul său trans, acidul elaidic, care are un punct de topire mult mai ridicat. Acidul elaidic nu apare în natură, dar se formează în cantități apreciabile prin hidrogenarea catalitică a uleiurilor vegetale lichide, în procesul obținerii grăsimilor comestibile semisolide și a margarinei. Acidul elaidic a fost găsit și în lipidele din țesuturile umane, probabil ca urmare a consumului produselor comerciale hidrogenate. Acizii grași nesaturați au în structura lor unul sau mai multe puncte rigide, datorită dublei sau a dublelor legături lipsite de libertate de rotație. Configurația cis a dublelor legături determină o înclinare de cca 30° a lanțului alifatic, în timp ce configurația trans se aseamănă cu forma extinsă a lanțului saturat.
1.2.1. Acizii grași nesaturați
Simbolul, în cazul acizilor grași nesaturați, se mai completează cu poziția atomilor de carbon care realizează dubla legătură. Numărătoarea primului atom de carbon implicat într-o dublă legătură C=C, se poate face în 2 feluri:
– dinspre gruparea carboxil spre gruparea metil (se notează cu c sau ∆).
– dinspre gruparea metil spre carboxil (se notează cu ω sau n),
În cazul acidului oleic, de oriunde se pornește, cifra va fi tot 9. Astfel avem (pentru gruparea carboxil aflată în dreapta):
← sens numerotare c
CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH (C18:1c9 sau C18:1ω9)
sens numerotare ω →
Acizii grași polinesaturați, prezintă 2 sau mai multe duble legături. Luând ca exemplu acidul linolenic, acid gras cu 3 duble legături, prezent mai ales în uleiul de in, acesta are formula CH3-(CH2-CH=CH)3-(CH2)7-COOH și simbolul (C18:3c9,12,15 sau C18:3ω3)
Numerotarea omega (ω), în cazul acizilor polinesaturați, nu se mai continuă după atomul de carbon prin intermediul căruia se realizează prima dublă legătură. Respectând unghiurile legăturilor chimice, grafic, molecula de acid linolenic (acid omega 3) se poate reprezenta astfel:
1.2.2 Acizii grași saturați
Acizii grași saturați au toți atomii de carbon din lanțul alifatic în hibridizarea sp3. De aceea simbolul lor poate prezenta, pe lângă numărul atomilor de carbon, cifra 0.
1.3. Rolul lipidelor membranare și al acizilor grași
Componenta structurală de bază a membranei celulare este bistratul lipidic, funcția structurală a lipidelor membranare organizate în bistrat fiind esențială. Bistratul lipidic conferă membranei celulare rolul de barieră, această menire a lipidelor membranare fiind enunțată încă de la dovedirea prezenței lor în structura membranei [5].
Departe de a avea numai un rol structural, lipidele membranare sunt implicate și în importante funcții ale ultrastructurii, funcții care permit celulei să comunice cu mediul înconjurător, schimbând informație și substanță.
Astfel, glicolipidele sunt implicate în fenomene de recunoaștere și semnalizare intercelulară.
La rândul lor, fosfolipidele pot fi modificate de enzime specifice numite fosfolipaze, implicăndu-se astfel în diferite fenomene care se petrec la nivelul membranelor. De regulă, aceste modificări se petrec ca urmare a unor procese de semnalizare, metaboliții rezultați acționând ca mesageri secunzi și susținând numeroase căi prin care celulele răspund semnalelor receptate. Există mai multe tipuri de fosfolipaze, care au proprietatea de a elibera diverse molecule din structura complexă a fosfolipidelor, astfel:
• fosfolipaza A1 are rolul de a elibera acidul gras din poziția 1 a glicerinei;
• fosfolipaza A2 elimină specific acidul gras din poziția 2 a glicerinei;
• fosfolipaza B prin funcția ei are menirea să scoată ambii acizi grași din structura fosfolipidelor, acționând asupra lizofosfolipidelor (de regulă după fosfolipaza A1);
• fosfolipaza C hidrolizează legatura dintre glicerină și fosfat;
• fosfolipaza D detașază compusul variabil din capătul hidrofil al fosfolipidelor,cu eliberarea acizilor fosfatidici.
Fosfatidilinozitolii sunt implicați în mecanisme de transmitere transmembranară și intracelulară a semnalelor. Când unele molecule semnal (liganzi) se leagă de receptorii specifici din membranele celulare, PI intră într-o secvență de reacții denumită cascada fosfoinozitidelor. Fosfatidilinozitolii sunt mai întâi fosforilați succesiv la hidroxilii din diversele poziții ale inozitolului la fosfoinozitolfosfați (PIP) și ulterior la fosfatidilinozitol-bis-fosfați (PIP2). Apoi, sub acțiunea fosfolipazei C (izomorfele și γ), specifică pentru fosfoinozitide, scindează fosfatidilinozitol-4,5- bisfosfații la inozitol-1,4,5-trisfosfat (IP3) și diacilglicerol (DAG).
Fosfolipaza A2 poate elibera acidul arahidonic, care este precursor pentru patru clase de substanțe cu diverse roluri: prostaglandine, tromboxani, prostacicline, leucotriene. Primele trei rezultă pe calea metabolică a ciclooxigenazelor (COX), cea de-a treia clasă pe calea lipooxigenazei.
Acidul arahidonic (AA) este unul dintre cei mai cunoscuți reprezentanți ai acizilor grași nesaturați. Acesta poate fi metabolizat intracelular și astfel dă naștere eicosanoizilor. In functie de enzimele implicate in producerea lor (lipooxigenaze si prostaglandin- endoperoxide sintetaze), eicosanoizii au fost clasificati in leucotriene si respectiv prostanoizi. Grupul prostanoizilor include prostaglandinele, tromboxanii si prostacicline. Primul pas în sinteza prostanoizilor este eliberarea acidului arahidonic de diacilglicerol sau de fosfolipide prin acțiunea fosfolipazelor (ca de exemplu: fosfolipaza citosolică A2 – cPLA-2). Ulterior, datorită acțiunii lor duale de ciclooxigenaze și peroxidaze, prostaglandin-endoperoxid sintetazele (PHGS) catabolizează acidul arahidonic până la nivelul unui endoperoxid. Două izoforme de PHGS au fost descrise si anume COX-1 și COX-2. Endoperoxizii obtinuți sub acțiunea acestor enzime sunt convertiți mai departe până la prostaglandine (PGD2, PGE2, PGF2 și PGI2, numită și prostaciclină) sub influența prostaglandin sintetazelor (PGDS, PGES, PGFS, PGIS). Receptorii acestor prostaglandine au fost denumiți DP, EP, IP. Efectele finale ale semnalizării celulare prin intermediul acestor eceptori se bazează pe modularea activitații adenil ciclazelor sau pe hidroliza IP3 și obilizarea Ca2+ din depozitele intracelulare [7,8].
Prostaglandinele produse prin intermediul COX-2 de la nivel nuclear, își pot exercita direct efectul asupra factorilor de transcriere cum ar fi receptorii activați de factorii de proliferare peroxizomalăi (peroxisome proliferator-activated receptors- PPAR). Se cunosc până în prezent trei astfel de receptori: PPAR α, β/δ și γ. Acești receptori se diferențiază prin natura liganzilor lor, prin nivelul de exprimare în diferite tipuri celulare și prin efectele finale ale activării lor. PPAR fac legătura între acizii grași și reglarea celulară la nivelul transcrierii genelor implicate în homeostazia lipidică și glucidică a organismului. Până în prezent, PGI2 (prostaciclina) este cunoscută ca singurul ligand specific pentru PPARβ/δ deși acest receptor interactionează cu afinitate mică și cu alți acizi nesaturați sau saturați. La nivelul membranei, prostaciclina are un alt receptor specific, notat abreviat cu IP. Căile de semnalizare celulară prin intermediul celor doi receptori specifici, PPARβ/δ, respectiv IP, sunt antagoniste [9,10].
Factorii de transcriere PPARs au o structură modulară. Cele mai importante module sunt: A/B – răspunzătoare de activarea independentă de ligand, C – zona de legare la ADN (DNA binding domain – DBD) și E/F – răspunzătoare de dimerizarea receptorilor și de activarea lor, ca urmare a legării ligandului specific. PPAR se leagă de ADN la nivelul acelor promotori ce conțin o secventă denumită PPRE (peroxisome proliferator responsive element).
O altă caracteristică importantă a acestor factori de transcriere este heterodimerizarea lor. PPAR se leagă de ADN numai sub formă de heterodimeri cu RXR (retinoid X receptor). Astfel, reglarea axei PPARβ/δ-PGI2-COX-2 se poate realiza la nivelul producerii de liganzi și de receptori. Producerea liganzilor poate fi modulată prin modificarea activitații COX-2 la nivel transcripțional și post-transcripțional. De asemenea, activitatea PPARβ/δ (receptorului) poate fi influențată atât la nivel transcripțional cât și la nivelul traducerii și post-traducerii [11].
Au fost descrise efecte multiple ale activării componenților acestei axe. Astfel, prezența prostaciclinei crește sinteza de ADN și proliferarea celulară în hepatocite. În celulele embrionare renale, prostaciclina promovează apoptoza. PPARβ/δ s-a dovedit a fi vital pentru dezvoltarea embrionară, din moment ce puțini șoareci PPARβ/δ knockout supravietuiesc. Spre deosebire de PPARγ care mobilizează lipidele numai la nivelul țesutului adipos, PPARβ/δ are un rol esențial în oxidarea lipidică la nivelul tuturor țesuturilor. S-a arătat că activarea PPARβ/δ induce oxidarea acizilor grași și disiparea de energie, ceea ce a făcut din PPARβ/δ o țintă interesantă pentru tratamentul obezitații. Rolul PPARβ/δ în alte procese ca proliferarea celulară, apoptoza si angiogeneza este controversat. Astfel, pe de o parte, stimularea PPARβ/δ de către PGI2 exogenă are efect anti-apoptotic pentru celulele epitheliale din colon, iar, pe de altă parte, producerea PGI2 promovează apoptoza. Activarea PPARβ/δ în celulele tumorale are ca rezultat creșterea nivelului de exprimare al Cdk2, VEGFα și receptorului acestuia (FLT-1), ceea ce sugerează că PPARβ/δ poate iniția o rețea autocrină implicată în proliferarea celulară și în angiogeneză, rețea importantă pentru inițierea și dezvoltarea tumorală [12,13].
S-a constatat că, organizate în strat dublu lipidic, fosfolipidele sunt mai stabile la acțiunea PLA2 [14]. Izoforma sPLA2 (fosfolipază A2 secretată, tip II, nepancreatică) manifestă preferință pentru fosfatidiletanolamină și fosfolipide anionice, cum ar fi fosfatidilserina și fosfatidilglicerolul. Enzima are activitate mică asupra fosfatidilcolinei. Fața externă a membranei plasmatice este bogată în fosfolipide cu colină (sfingomieline și fosfatidilcoline), substraturile pentru sPLA2 fiind localizate pe fața internă a membranelor. De aceea, sPLA2 are o acțiune redusă asupra membranelor celulare intacte. Pentru ca sPLA2 să acționeze asupra membranei, este necesară o perturbare a asimetriei sau o rearanjare a fosfolipidelor membranare.
Asimetria fosfolipidică este asigurată de o aminofosfolipid translocază sau flipază, care posedă caracteristicile unei ATP-aze membranare. În anumite condiții, se poate pierde asimetria, cum este cazul plachetelor tratate simultan cu trombină și colagen, celulelor endoteliale și plachetelor supuse acțiunii perforinelor (complexul de atac membranar al complementului) sau celulelor în apoptoză. S-a constatat că sPLA2 acționează preferential asupra microveziculelor secretate de celulele, care și-au pierdut asimetria fosfolipidică, ca urmare a fluxului rapid al fosfolipidelor de pe fața internă a membranei către fața externă, flux compensat, ulterior, printr-o echilibrare între cele două fețe.
Semnalele biochimice, care determină perturbarea membranei, nu sunt în totalitate cunoscute. S-a sugerat că pierderea asimetriei, din cauza mișcărilor de flip-flop ale fosfolipidelor, poate fi unul dintre aceste semnale. S-a demonstrat că acumularea de diacilglicerol sau ceramidă duce la perturbări la nivelul membranei plasmatice, favorizând acțiunea PLA2 [14].
Studii efectuate pe membrane artificiale, precum si pe membrane biologice, au dus la concluzia că modificarea structurii acestora, ca urmare a oxidării fosfolipidelor, le face susceptibile la acțiunea sPLA2. Peroxidarea lipidelor membranare, produsă de radicalii liberi ai oxigenului, conduce la formarea hidroperoxizilor ca primi produși. Hidroperoxizii generează forme reactive, care influențează activitatea unor proteine și modifică proprietațile fizice ale membranelor, prin schimbarea orientării fosfolipidelor și a dinamicii acestora.
Această alterare a structurii membranelor pare să fie suficientă pentru activarea fosfolipazelor extracelulare. Hidroliza fosfolipidelor se produce rapid, după tratamentul celulelor sau membranelor artificiale cu oxidanți [15,16].
Degradarea membranelor, ca urmare a oxidării fosfolipidelor, pare analogă acțiunii detergente a sărurilor biliare, care măresc activitatea hidrolitică, prin transformarea bistraturilor fosfolipidice în micelii. Formarea de fosfolipide oxidate printre fosfolipidele neoxidate ale unui bistrat lipidic determină agregarea acizilor grași și apariția unor domenii cu densitate mare de sarcină negativă la care aderă PLA2, urmată de modificarea conformatională și activarea centrului activ al enzimei. Suplimentar, produșii de peroxidare din membrane induc formarea de pori, comportarea ca ionofori sau scăderea activitații pompelor ionice, având ca rezultat influxul de calciu extracelular sau eliberarea calciului din depozite care activează PLA2 [17].
Recunoașterea imperfecțiunilor structurale membranare de către toate tipurile de PLA2 sugerează faptul că enzimele asociate celulei pot juca un rol în minimizarea formării domeniilor heterogene prin îndepartarea lipidelor degradate. Unele studii consideră plauzibil rolul PLA2 de antioxidant indirect, având în vedere capacitatea acesteia de a menține lipidele modificate oxidativ la un nivel care nu permite propagarea autocatalitică a reacțiilor de oxidare. Această relație ar putea să sublinieze un rol important pentru PLA2 în micșorarea peroxidării lipidice, prin limitarea cantității de peroxizi lipidici, care se pot acumula în membrane [17,18, 19].
Acizii grași joacă un rol foarte important în fiziologia celulară (transport membranar, semnalizare celulară) atât prin modularea fluidității membranare, cât și prin efectul pe care îl au asupra interacțiunilor cu porțiunile transmembranare ale proteinelor integrale, sau prin acțiunea mesagerilor secunzi care se pot obține după eliberarea lor din structura lipidului.
Numeroase funcții celulare, ca de exemplu localizarea și activitatea proteinelor membranare, pot fi modulate de raportul de acizi grași saturați/nesaturați. Dereglări în raportul de acizi grași saturați/nesaturați au fost descrise în multe patologii umane, în care nu se bănuia o asemenea influență. Acest lucru determină interesul actual pentru realizarea de terapii specifice la nivelul lipidelor membranare prin influențarea organizării lipidelor (funcții și structură) inducând concomitent modularea activității proteinelor membranare cît și a localizării acestora; acest tip de reglare poate induce în final schimbări la nivelul semnalizării celulare și expresiei genice ce pot servi, ipotetic, la reversibilizarea stării patologice [20,21].
Alterări ale structurii tridimensionale a lipidelor membranare prin modificarea compoziției lor în acizi grași duc la dezvoltarea a numeroase boli: boli cardiovasculare (hipertensiune, moarte subită, hipertrofie cardiacă, arteroscleroză, boli coranariene, tromboze), cancer (proliferare și rezistentă la medicamente), obezitate, boli neuronale (Alzheimer, schizofrenie), boli respiratorii, boli renale, inflamații, boli imunitare, boli infecțioase, coagulare, daune la nivel fetal datorate alcoolului [22-26].
Studii asupra lipidelor din celulele tumorale au arătat diferențe la nivelul fosfolipidelor și glicolipidelor, putându-se vorbi chiar de un fenotip metastazic. Astfel experimente realizate pe celule tumorale comparate cu celule sănătoase au arătat faptul că fosfolipidele din celulele tumorale conțin un nivel mai ridicat de acid oleic (C18:1) și un procent mai scăzut în acid arahidonic (C20:4) și de acizi polinesaturați C22 [27-31].
1.3.1. Rolul acizilor grași polinesaturați (PUFA)
Din clasa n-6 PUFA face parte acidul linoleic (LA; C18:2n-6), acid gras esențial deoarece nu poate fi sintetizat de către celulele din organismul uman. LA se găsește în uleiuri vegetale, semințe și fructe cu coajă lemnoasă. Un alt acid gras esențial este acidul linolenic (α- linolenic ALA și γ-linolenic GLA; C18:3n-3), acid gras ce face parte din clasa n-3 PUFA și trebuie obținut prin dietă. ALA se găsește în frunzele legumelor, nuci, boabe de soia, in, semințe și uleiuri vegetale. Atât LA cât și ALA pot fi metabolizați în organism, obținându-se PUFA cu lanț lung, prin mai multe etape (desaturări și elongări). LA este metabolizat în organism la acid arahidonic (AA; C20:4n-6), în timp ce ALA poate fi metabolizat la acid eicosapentaenoic (EPA; C20:5n-3) și în cele din urmă la acid docosahexaenoic (DHA; C22:6n-3). Alternativ AA poate fi obținut prin alimentație din grăsimi animale, iar EPA și DHA din pește oceanic. Transformarea endogenă a ALA în EPA și DHA se realizează cu un randament redus. Astfel unele studii sugerează că la adultul sănătos doar 5-10% din ALA este transformat în EPA, respectiv 2-5% în DHA [33], în timp ce alte studii sugerează faptul că procesul de conversie al ALA în EPA și DHA este de până la 5% [34]. Conform Societății Internaționale pentru Studiul Acizilor Grași și al Lipidelor (ISSFAL) conversia ALA în DHA este în jur de 1% la sugari și mai puțin la adulți [35]. DHA este un acid gras important, deoarece în diverse studii s-a demonstrat rolul benefic al acestuia asupra sănătății, având (de exemplu) rol în acuitatea vizuală [36-37] și în dezvoltarea creierului la mamifere [38-39]. Astfel, conversia scăzută a ALA în DHA este un motiv de îngrijorare mai ales pentru persoanele vegetariene sau care nu consumă pește gras. În anumite țări, unde dieta este săracă în surse de EPA și DHA (adică în unele țări europene [40] și India [41]), prevalența bolilor cardiovasculare [42], rezistenței la insulină [43] și a unor tipuri de cancer [44] este mai ridicată în comparație cu țările în care există un consum ridicat de pește gras (Japonia [45]).
Numeroase studii au arătat că PUFA au acțiune antitumorală selectivă, inducând apoptoza celulelor tumorale, în același timp neafectând celulele normale [46-55]. Astfel, într-un studiu în care s-au cultivat două tipuri de celule (fibroblaste normale umane din piele CCD-41-SK și celule umane din cancer de sân ZR-75-1) în același vas petri, GLA a eliminat celulele canceroase, neavând efect asupra celulelor normale [56]. PUFA induc apoptoza celulelor tumorale, sporind eliberarea citocromului c, activând caspaza 3, suprimând fosforilarea Akt (protein kinază B), modulând p38 MAPK (protein kinază activată de mitogeni) în fosforilarea p53 la Ser15, situs ce este asociat cu deteriorarea ADN [54-55]. Aceste modificări moleculare sunt asociate cu peroxidări lipidice ce au loc în acizii grași din celulele canceroase tratate cu PUFA [46-50, 54]. S-a dovedit că PUFA pot fi capabili de a suprima expresia oncogenelor ras și Bcl-2, de a spori activitatea p53, inducând astfel apoptoza celulelor tumorale [57].
O problemă importantă în tratamentul cancerului o constituie rezistența la medicamentele anticanceroase, a unor celule tumorale. Într-o serie de studii s-a arătat că PUFA măresc acțiunea citotoxică a unor medicamente antitumorale (vincristină, cisplatin, doxorubicină) [58-62].
În cancerul de prostată s-au făcut studii in vivo pe liniile celulare de cancer de prostată PC-3, DU 145 și LNCaP, pentru identificarea unei anumite doze de PUFA care să aibă ca rezultat inhibarea proliferării celulare [63] și represia PSA (antigen specific prostatic) [64]. Într-un alt studiu în care s-au tratat doar cu DHA sau cu DHA în combinație cu o doză mică de celecoxib – inhibitor farmacologic al COX-2 – culturi din linii celulare de cancer de prostată LNCaP, DU 145, PC-3 și celule murine din tumoră de prostată, s-a redus proliferarea celulară și s-a indus apoptoza celulelor tumorale [65-66].
În cancerul de sân, rezultatele demonstrează un efect protector al PUFA asupra șoarecilor. Suplimentarea dietei șoarecilor cu ulei de pește a dus la scăderea ritmului de creștere a tumorilor și a gradului de metastazare în BALB/cAnC [67-68]. Rezultate comparabile s-au obținut și după administrarea de DHA și EPA la șoareci imunodeficienți [69]. De asemenea, s-a arătat că administrarea uleiului de pește a dus la creșterea efectului citotoxic al doxorubicinei și mitomicinei C, la șoarecii imunodeficienți [70-71]. Pe culturi celulare, tratamentul cu PUFA are efect antiproliferativ, scăzănd sinteza de acizi grași și actionând asupra oncogenei HER-2 (receptorul 2 al factorului uman de creștere epidermală) [72-75].
Numeroase studii sugerează o asociere inversă între PUFA și rezistența la insulină. Au fost descrise efecte antidiabetice prin acțiunea PUFA asupra creșterii metabolismului bazal și al oxidării grăsimilor [76-77]. Experimente realizate pe rozătoare au demonstrat rolul benefic al EPA asupra rezistenței la insulină în mai multe modele de diabet și obezitate [78-80], precum și un răspuns îmbunătățit al testelor de glicemie la șoareci, după consumul de DHA și EPA [81].
PUFA au rol cardioprotector, acest lucru fiind confirmat de studii epidemiologice prin suplimentarea dietei cu ulei de pește [82-86]. Experimentele realizate au demonstrat efectele benefice ale PUFA, acționând asupra formării eicosanoizilor din AA, reducerii trigliceridelor plasmatice și a tensiunii arteriale, reglării fluxului de ioni în celulele cardiace și reglării expresiei genice prin sistemul de semnalizare pentru proliferarea peroxisomală implicând PPAR [87]. O analiză foarte amplă [88] arată faptul că n-3 PUFA modifică favorabil markerii serici specifici riscului de apariție a bolilor cardiovasculare prin reducerea trigliceridelor și creșterea HDL ca vehicul al colesterolului. Dovezi convingătoare ale efectelor terapeutice pentru bolile cardiovasculare au fost descrise prin stabilirea unor doze necesare de PUFA, ce pot fi administrate prin dietă și care conduc la scăderea trigliceridelor [82-84, 77].
Pe lângă rolul avut în bolile cardiovasculare, cancer, diabet, obezitate, n-3 PUFA au efecte benefice asupra altor numeroase boli cum ar fi artrita reumatoidă, astmul, colita, boli neurodegenerative [89-91]. Stabilirea valorilor normale, respectiv a celor ce însoțesc diverse patologii pentru raportul acizi grași saturați/acizi grași nesaturați din lipidele celulare și membranare, ca și identificarea proceselor celulare afectate de modificările acestui raport vor permite identificarea unor ținte terapeutice la nivel molecular, cu posibilitatea găsirii unor căi în modularea lor prin tratamente.
1.3.2. Efectul acizilor grași polinesaturați (PUFA) asupra biogenezei membranelor și traficului intracelular al lor
Activitatea celulară este influențată semnificativ de comportamentul membranei. Funcționarea membranei poate fi modulată de proprietățile bistratului lipidic, acestea fiind dependente și de tipurile de acizi grași din compoziția lipidelor.
Studii cu privire la suplimentarea mediului de cultură pe diverse linii celulare cu acizi grași polinesaturați (PUFA) descriu schimbări majore la nivelul compoziției acizilor grași atât din membrana plasmatică, cât și la nivelul plutelor lipidice [92]. De asemenea, într-un număr tot mai mare de articole s-a arătat efectul PUFA (cu precădere DHA – acidul docosahexaenoic și EPA – acidul eicosapentaenoic) asupra propietăților fizice ale membranei. Aceste studii descriu modificări asupra permeabilității membranare [93], elasticității membranare [94-96], modulând astfel procese de fuziune membranară [97], de formare a veziculelor [98] și mecanismele mișcării flip-flop [99]. PUFA sunt încorporați în celule fiind esterificați în poziția sn-2 în fosfolipidele membranare și anume în fosfatidilcoline și fosfatidiletanolamine, iar în țesutul neuronal în fosfatidilserine [100]. Încorporarea celulară a PUFA liberi, cât și inserarea lor în fosfolipidele membranare modulează proprietățiile fizice ale membranei. Aceștia sunt capabili să schimbe proprietățiile de acomodare reciprocă a fosfolipidelor membranare la nivelul foițelor bistratului prin reducerea interacțiunilor Van der Waals [101], gradul de dezorganizare produs asupra membranei fiind diferit în funcție de acidul gras folosit (acid stearic < acid oleic < EPA < DHA). PUFA au efect asupra fluidității membranare influențând permeabilitatea membranei pentru ioni prin afectarea conformației proteinelor care îi transportă [102], modulează activitatea canalelor ionice [103-109] și afectează comportamentul plutelor lipidice și al caveolelor. Plutele lipidice sunt microdomenii din membrana plasmatică bogate în sfingolipide, colesterol și anumite proteine membranare aduse laolaltă pentru îndeplinirea unor anumite funcții. În foița internă de la nivelul plutelor, lipidele conțin preferențial acizi grași saturați, ceea ce ar putea realiza necesarul de rigiditate corespunzător foiței externe, unde sfingolipidele sunt bogat reprezentate. Aceste microdomenii au atât importanță structurală, cât și metabolică ținând laolaltă, în complexe supramoleculare, molecule și macromolecule destinate a funcționa împreună. Datorită incompatibilității sterice dintre sfingolipide și colesterol pe de-o parte și DHA și (într-o măsură mai mică) EPA pe de altă parte, aceștia din urmă alterează comportamentul plutelor lipidice și funcțiile proteinelor [110-112]. În compoziția plutelor lipidice și a caveolelor întâlnim proteine citosolice, recrutate la nivelul membranei după acilare (de exemplu, modificarea covalentă cu acid palmitic, C16:0). Asemenea recrutări de proteine sunt critice pentru funcționarea unor microdomenii de membrană [113]. PUFA înlocuiesc selectiv resturile acil din proteinele de semnalizare aflate în plutele lipidice și caveole, influențând astfel procesul de semnalizare în aval [114-117]. Pentru a funcționa în mod corespunzător este necesar ca multe proteine de semnalizare să se lege de membrană. Astfel proteinele citosolice, care sunt sintetizate inițial ca proteine solubile, sunt modificate post-traducere cu ancore lipidice specifice, sau prin expunerea unor anumite domenii cu afinitate mare pentru membrane [113]. Deoarece localizarea membranară a acestor proteine solubile este mediată de interacțiuni între ancorele lipidice ale proteinelor și membrana celulară, localizarea membranară a acestora este sensibilă la schimbări induse de PUFA în mediul lipidic celular.
PUFA modulează selectiv localizarea subcelulară a proteinelor de semnalizare modificate prin resturi de natură lipidică, controlând calea de transport intracelular al acestora. Mecanismul prin care DHA modulează direcționarea intracelulară a proteinelor rămâne evaziv, deși au fost elaborate unele ipoteze [113].
În ultimii ani, interesul pentru studiul efectelor benefice ale consumului de PUFA asupra sănătății a crescut continuu. Studii clinice au arătat că o dietă bogată în acizi grași de tip omega 3 este benefică pentru prevenirea apariției cancerului, sau pentru stoparea avansării lui.
Deși există studii ale efectelor tratamentelor cu acizi grași nesaturați asupra celulelor tumorale cu abordări diverse [118-119] sunt foarte puține raportări asupra transformărilor epigenetice induse de asemenea abordări. PUFA n3 induc apoptoza celulară și inhibarea proliferării celulelor tumorale de cancer de sân, însă mecanismul prin care aceștia intervin nu este pe deplin cunoscut. Au fost realizate studii prin care au fost analizate modificări ce au loc la resturile de lizină ale histonelor H3 și H4 și, de asemenea, a fos evidențiată o legătură directă între metilarea ADN la promotorii unor gene cu rol de represori tumorali și apariția cancerului [120-121].
1.4. Stresul oxidativ indus de radiațiile UVA asupra lipidelor
Dintre radiațiile UV care ating suprafața Pământului, peste 90% sunt reprezentate de UVA. Stresul oxidativ indus de radiațiile UVA ar putea afecta plasticitatea membranară. Deși inițial au fost considerate mult mai puțin nocive față de radiațiile UVB, studiile efectuate în ultimii 15 ani au demonstrat că expunerea la UVA generează indirect leziuni, prin inducerea formării ROS și activarea unor căi de semnalizare ce controlează proliferarea, diferențierea, senescența și moartea celulară.
1.4.1. Radiațiile ultraviolete (UV) – caracterizare generală
Lumina ultravioletă (UV) este o radiație electromagnetică ce are lungimea de undă mai mică decât a luminii vizibile, însă mai mare decât a razelor X, acoperind domeniul 10-400 nm, iar energia ei este cuprinsă între 3 și 124 eV.
Spectrul electromagnetic al luminii ultraviolete poate fi împărțit în mai multe categorii. Conform standardelor ISO [122], pentru determinarea radiațiilor solare, s-au descris o serie de domenii (Tabelul 1). Dintre radiațiile solare care ating suprafața Pământului, 90-99% sunt reprezentate de UVA și 1-10% de UVB. Stratul de ozon absoarbe mare parte din radiațiile UVB și pe cele UVC la toate lungimile de undă [123].
În momentul în care radiațiile UV și vizibile ajung la nivelul tegumentului, o parte sunt reflectate, restul fiind absorbite în variatele straturi ale acestuia. Lungimile de undă din domeniul UVB sunt în principal absorbite de componente ale celulelor din epiderm (ex, proteine sau ADN), în timp ce radiațiile UVA penetrează tegumentul la nivel profund, ajungând în stratul bazal al epidermului și chiar la fibroblastele din derm [124].
Tabelul 1 – Tipuri de radiații UV și caracteristicile lor
Este cunoscut faptul că radiațiile UV exercită efecte variate, dăunătoare asupra sănătății umane, inclusiv generarea cancerului de piele [125], inducerea îmbătrânirii premature a tegumentului (fotoîmbătrânire) [126], supresarea sistemului imunitar cu consecințe negative atât asupra bolilor maligne, cât și a celor infecțioase (fotoimunosupresie) [127] și agravarea/declanșarea fotodermatozelor, inclusiv a maladiilor autoimune (ex. lupus eritematos) [128]. De asemenea, se știe că toate aceste efecte pot fi cauzate atât de UVB, cât și de UVA. Fracțiunile UVA și mai ales UVB sunt principalele componente carcinogene responsabile de dezvoltarea cancerului de piele la om.
Majoritatea studiilor timpurii ale căilor de semnalizare induse de UV foloseau lămpi de mercur de presiune joasă care emit radiații UVC (254 nm). De fapt, UVC este cel mai bine studiat component al radiațiilor UV, deși este cel mai puțin relevant pentru sănătatea umană. În afară de disponibilitatea relativ largă, un alt motiv pentru utilizarea UVC a pornit de la falsa presupunere că toate lungimile de undă ale UV vor avea efecte biologice similare. Totuși, informațiile acumulate au contribuit la înțelegerea căilor de semnalizare declanșate de UV și a procesului de carcinogeneză. În prezent, se știe că variatele componente ale radiațiilor UV diferă în ceea ce privește efectele biologice, în principal din cauza cromoforilor diferiți la nivelul cărora acționează. În primul rând, cu cât lungimea de undă crește, efectul biologic ce rezultă din absorbția directă a radiației de către moleculele țintă descrește, în timp ce leziunile indirect provocate de generarea de specii reactive de oxigen (ROS – Reactive Oxygen Species) cresc [129]. În al doilea rând, deoarece nivelul de penetrare în tegument crește odată cu lungimea de undă, vor fi afectate ținte variate și vor apărea răspunsuri diferite pentru lungimile de undă mai scurte sau mai lungi [129].
Până de curând, leziunile la nivelul ADN au fost considerate drept mediatorul principal al semnalizării induse de UV la nivel celular, deoarece ADN genomic reprezintă principalul cromofor celular cu maximul de absorbție în domeniul UV (200-290 nm) și, deci, o țintă directă pentru radiațiile UVB și UVC. Într-adevăr, radiațiile UV induc modificări directe și indirecte la nivelul ADN, în funcție de lungimea de undă. În timp ce UVA produce leziuni mediate de stresul oxidativ, UVB și UVC sunt direct absorbite de ADN și induc, în special, formarea dimerilor de pirimidină. Aceste defecte sunt de obicei eliminate prin intermediul unui mecanism de excizie-reparare, iar erorile din cursul acestui proces cresc riscul mutațiilor și al transformărilor maligne ulterioare [130]. Tendința biologică naturală de a menține integritatea genomului presupune că leziunile la nivelul ADN vor induce răspunsuri celulare ale căror consecințe vor fi oprirea ciclului celular și repararea ADN sau moartea celulară. Studiile mai recente au arătat că radiațiile UV influențează și o serie de structuri citosolice și membranare, precum protein kinaze, factori de transcripție și receptori membranari. Apoptoza indusă de UV la nivel celular depinde de contribuția a 3 procese: lezarea ADN, activarea receptorilor implicați în moartea celulară și formarea ROS [131-132].
1.4.2. Peroxidarea lipidelor
Stresul oxidativ provoacă leziuni la nivelul (macro)moleculelor celulare: acizii nucleici, proteinele și lipidele. Dintre acestea, peroxidarea lipidelor este mai dăunătoare, deoarece produșii rezultați facilitează propagarea reacțiilor în care sunt implicați radicalii liberi. Extragerea unui atom de hidrogen din porțiunea fosfolipidelor membranare ce conține resturi de acizi grași polinesaturați inițiază peroxidarea lipidică. Radicalul alchil rezultat se poate rearanja într-o dienă conjugată mai stabilă, ce va intra în cascada autocatalitică de peroxidare. Hidroperoxizii fosfolipidelor (PL-OOH) și ai acizilor grași (FA-OOH) reprezintă produșii principali ai cascadei. Lanțul hidrocarbonat al acidului gras poate fi, de asemenea, clivat (β-scindare) în cursul peroxidării, formând o serie de compuși foarte reactivi, precum radicali ai pentanului și etanului și aldehide α,β-nesaturate, în special 4-hidroxinonenalul, ce rezultă din degradarea PUFA n-3 și n-6. Derivatul 4-hidroxinonenal este prezent în cantități mari în membranele biologice în condiții de stres oxidativ [133].
1.4.3. Mecanisme de apărare împotriva peroxidării lipidice
În celulele mamiferelor, există 2 categorii de mecanisme antioxidante. Prima categorie cuprinde compuși cu masa moleculară mică, ce acționează în special asupra radicalilor peroxil și opresc reacțiile autocatalitice în lanț: α-tocoferolul, acidul ascorbic, glutationul (GSH), acidul uric, carotenoizii, ubiquinonele, polifenolii [134]. A doua categorie de mecanisme de apărare cuprinde enzimele antioxidante. O parte dintre acestea au rol preventiv, cum ar fi în cazul superoxid dismutazei (SOD), catalazei (CAT) și glutation peroxidazei (GPx). Ele descompun ROS și previn inițierea peroxidării lipidice și formarea leziunilor celulare. În cazul în care procesul a fost deja inițiat, alte enzime acționează pentru eliminarea peroxizilor lipidici (LOOH), astfel încât să stopeze lanțul de reacții autocatalitice. Aceste enzime sunt reprezentate de GPx și glutation S-transferaze (GST) care catalizează reducerea peroxizilor cu ajutorul GSH. Până în prezent, au fost descrise la mamifere 4 izoenzime GPx [135-138]. Dintre acestea, GPx-1, GPx-2 și GPx-3 sunt implicate în special în reducerea H2O2 și a FA-OOH, iar GPx-4 reduce PL-OOH și hidroperoxizii colesterolului [139].
La ora actuală, este cunoscut faptul că radiațiile UVA provoacă leziuni la nivelul pielii indirect, prin specii reactive de oxigen și activarea unor căi de semnalizare ce controlează proliferarea, diferențierea, senescența și moartea celulară. Majoritatea studiilor din ultimii 20 ani s-au concentrat pe investigarea căilor de semnalizare activate de UVA potențial implicate în apariția cancerului. În schimb, sunt relativ puține studiile referitoare la efectul acestor radiații asupra adeziunii, motilității celulare și a refacerii epidermului. Pornind de la ipoteza că stresul oxidativ are consecințe nefavorabile asupra refacerii epidermului, în partea experimentală a aceastei lucrări se vor prezenta rezultate cu privire la efectul exercitat de radiațiile UVA și tratamentul cu acizi grași polinesaturați asupra conținutului în acizi grași al lipidelor celulare, migrării și adeziunii celulare a keratinocitelor displazice și normale în cultură.
Capitolul 2
METODOLOGIA DE STUDIU
În funcție de tipurile și numărul lipidelor membranare (raportul de acizi grași saturați/nesaturați) se controlează numeroase funcții celulare ca de exemplu localizarea și activitatea proteinelor membranare. Dereglări în raportul de acizi grași saturați/nesaturați au fost descrise în multe patologii umane, urmarindu-se realizarea de terapii specifice la nivelul lipidelor membranare prin influențarea organizării lipidelor (funcții si structură), inducând concomitent modularea activitații proteinelor membranare cît și a localizării acestora. Acest tip de reglare poate induce în final schimbări la nivelul semnalizării celulare și expresiei genice ce pot servi la reversia stării patologice.
Studiile prezentate în această lucrare permit caracterizarea unor tipuri celulare sub aspectul conținutului de acizi grași și al raportului de acizi grași saturați/acizi grași nesaturați și sunt grupate în două direcții principale:
analiza acizilor grași din lipidele unor linii celulare (normale și tumorale)
În prima parte s-a urmărit identificarea schimbărilor în comportamentul celular ca urmare a modelării raportului acizi grași saturați/acizi grași nesaturați prin suplimentarea mediului de cultură cu acizi grași polinesaturați.
În a doua parte s-a urmărit efectul tratamentului cu acizi grași polinesaturați și expunerii la radiații ultraviolete A asupra celulelor tegumentare.
analiza acizilor grași din organe pe modele experimentale animale
S-a urmărit investigarea tipurilor de lipide și acizi grași din organele șoarecilor în fenomene ischemice pentru identificarea unor modalități de asigurare a protecției miocardului.
Culturile celulare
Reactivii pentru culturi celulare utilizați în decursul desfășurării experimentelor care stau la baza prezentei teze au fost procurați de la următoarele firme: Sigma-Aldrich, Lonza, Gibco, HyClone.
Tipurile celulare utilizate au fost reprezentate de: HUVEC (celule endoteliale din venă ombilicală umană), DOK (keratinocite orale displazice umane – ECACC nr. 94122104), HaCaT (keratinocite epidermale umane normale), și o serie de celule tumorale: HeLa (carcinom cervical – ECACC nr. 93021013), DU145 (cancer de prostată – ATCC nr. HTB-81) și MCF-7 (adenocarcinom mamar – ECACC nr. 86012803). Celulele au fost crescute în plăci de 75cm2, folosind de regulă Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) + HamF12 (supliment nutritiv), cu 10% ser fetal de vițel (SF) și 1% soluție antibiotic-antimicotic, la 37°C și 5% CO2. În cazul celulelor MCF-7, mediul de cultură folosit a fost Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM).
Celulele au fost pasate după ce au ajuns la o confluență de 60-80%, fiind desprinse fie cu EDTA 2mM în tampon fosfat salin (abreviere internațională PBS, de la sintagma englezească „Phosphate Buffered Saline”), fără Ca2+ și Mg2+, pentru majoritatea tipurilor celulare investigate, fie cu tripsină-EDTA (0.25% tripsină, 0.02% EDTA) în PBS, fără Ca2+ și Mg2+ (în cazul keratinocitelor).
Gaz-cromatografie
Analiza compoziției de acizi grași din lipidele celulare se poate face prin gaz-cromatografie. Această metodă este prima variantă de alegere în analiza conținutului de acizi grași din probele de lipide, deoarece este rapidă, și are o rezoluție, respectiv o sensibilitate înalte.
Cromatografia este metodă fizico-chimică de separare bazată pe repartiția diferențiată a componentelor unui amestec de separat între două faze în contact și situându-se într-un raport de mișcare relativă una față de cealaltă (generic definite prin termenii de fază staționară respectiv fază mobilă).
În cazul cromatografiei de gaze faza mobilă este un gaz (gaz purtător, de regulă gaz inert – azot, heliu, hidrogen – în care componenții probei de analizat difuzează repede) iar faza staționară poate fi un solid (cu proprietăți absorbante ) sau un lichid (vâscos, repartizat sau imobilizat chimic, în mod uniform pe o suprafață inertă). Faza staționară se află într-o coloană cromatografică lungă, sau foarte lungă, capilară (diametre de ordinul μm). Faza mobilă se deplasează continuu prin coloană, iar la ieșire, gazul purtător trece prin detector, antrenând cu el compușii separați în cursul procesului cromatografic. Dinamica proceselor estre următoarea: gazul purtător se deplasează cu o viteză constantă prin camera de evaporare, preia proba de analizat și o introduce în coloana cromatografică, unde se realizează separarea componentelor. La ieșirea din coloana cromatografică gazul purtător trece împreună cu componentele dispersate prin detector, care emite un semnal electric proporțional cu concentrația componentei din faza gazoasă. Detectorul este conectat la sistemul de înregistrare. Rezultatele se prezintă sub forma unui grafic semnal – timp (gazcromatograme) .
2.2.1. Echipamentul
Aparatele destinate cromatografiei în fază gazoasă sunt complexe și trebuie să conțină câteva componente caracteristice, alături de altele genreal valabile și altor tipuri de procese cromatografice.
2.2.2. Alcătuirea unui gaz-cromatograf:
– sursă de gaz
– dispozitiv de reglare a debitului de gaz purtător
– dispozitiv de introducere a probei (injector)
– termostat
– coloană cromatografică
– detector
– sistem de înregistrare a cromatogramei
În cele ce urmează detaliem câteva aspecte legate de detectori și coloane.
2.2.3. Tipuri de detectori:
Există mai multe tipuri de detectori utilizați în cromatografia în fază gazoasă:
• Detector cu ionizare în flacără (FID) – este dependent de debitul masic, neselectiv, larg aplicabil la analiza compușilor organici și anorganici;
• Detector selectiv de masă (MS) – este parte componentă a sistemului GC/MS care combină tehnica separării cromatografice cu detecția pintr-un spectofotometru de masă.
• Detector cu captură de electroni (ECD) – este dependent de concentrație, selectiv pentru compușii halogenați.
• Detector flam-fotometric (FPD) – este dependent de debitul masic, selectiv pentru compușii care conțin fosfor și sulf.
• Detector termoionic (TID) – este dependent de debitul masic, selectiv pentru compușii care conțin fosfor și azot.
• Detector cu conductivitate electrolitică (ELCD) – este dependent de debitul masic, selectiv pentru compușii care conțin azot și sulf.
• Detector cu fotoionizare (PID) – este dependent de concentrație, selectiv în funcție de energia lămpii, cu largi aplicații la compuși organici și anorganici.
• Detector cu conductibilitate termică (TCD) – este dependent de concentrație, cu aplicații la analiza gazelor organice și anorganice.
Sistemul de cromatografie utilizat în studiile care fac obiectul acestei lucrări este dotat cu un detector cu ionizare în flacără. Componentele eluate ajung la detectoru FID unde sunt arse de o flacără intensă și rupte în fragmente ionizate ce pot fi cantitativ detectate.
2.2.4. Tipuri de coloane și utilitatea lor
Există două tipuri de coloane utilizate:
2.2.4.1. Coloane deschise (coloane capilare): conțin faza staționară uniform distribuită pe suprafața peretelui interior al tubului. Faza mobilă va circula în spațiul rămas liber în zona axei longitudinale a coloanei. Pentru ca repartiția cromatografică să aibă loc în condiții optime, este necesar ca filmele de fază staționară și de fază mobilă aflate în contact să fie extrem de înguste. Utilizarea coloanelor deschise în cromatografia de gaze este astăzi preponderentă.
Tipuri: WCOT (wall coated open tubular), BP(bonded phase-fază legată), SCOT (suport coated open tubular), PLOT (porous layer open tubular)
2.2.4.2. Coloane umplute (packed columns): conțin faza staționară cât mai uniform distribuită în tot volumul interior al tubului cilindric.
2.2.5. Procedeul experiemntal – Metoda de cromatografiere
Aparat: Gaz-cromatograf CP 3800 Varian cu detector de ioizare în flacără FID. Coloană: Coloamă capilară TR FAME (caracteristică pentru determinarea esterilor metilici ai aciziilor grași) cu caracteristicile 120m x 0.25 mm i.d. x 0.25 μm.
Temperatura injectorului: 250ºC
Temperatura detectorului: 300ºC
Tip detector: FID
Temperatura pe coloană: Analiza pornește de la o temperatură pe coloană de 50ºC. Această temperatură se menține constantă timp de 2 minute, după care temperatura crește constant, cu 2ºC/minut (rată de creștere), până la 250ºC, unde staționează timp de 20 de minute.
Mod de injectare: Splitare
Rata de splitare: 1:100
Volum de injecție: 1 ml
Gaz purtător: Heliu
Debitul gazului purtător: 0,7 ml/min., debit constant
Pregătirea probelor
Pentru analiza prin gaz-cromatografie a aciziilor grași din lipidele celulare, probele trebuie derivatizate (acizii grași sunt transformați în substanțe ușor volatile – esteri metilici ai acizilor grași – pentru a putea fi determinați prin gaz-cromatografie). Eterii metilici ai acizilor grași din lipidele celulare au fost obținuți prin metoda transesterificării, folosind o modificare a unei procedurii descrise în literatură [140]. La 100 mg probă (sediment celular) se adaugă 2 ml hexan. Se dispersează proba pentru facilitarea extragerii lipidelor și se adaugă 100 μl soluție metanolică de hidroxid de potasiu 2M (13,1 g de hidroxid de potasiu se dizolvă încălzind ușor în 100 ml metanol absolut). Se agită viguros pentru realizarea reacției de transesterificare. Se adaugă sulfat de sodiu anhidru pentru îndepărtarea urmelor de apă și fosfat acid de sodiu monohidrat pentru neutralizarea hidroxidului de potasiu. Amestecul de reacție se agită puternic, iar după depunerea prin microfugare a sedimentului săruri-proteine, soluția ce conține esterii metilici este concentrată sub azot pentru a nu se oxida dublele legături din esterii metilici ai acizilor grași nesaturați sau polinesaturați (Concentrator Techne Sample DB-2A și Generator de azot N2-Bora). După concentrare, soluția hexanică de esteri metilici obținută se supune analizei gaz-cromatografice în aceeași zi. Pentru identificarea tipurilor de acizi grași din probe a fost cromatografiat în aceleași condiții experimentale (temperatură pe coloană, debit de gaz purtător, etc.) amestec etalon (Supelco 37 Component FAME Mix) care conține esteri metilici ai 37 tipuri de acizi grași. Acizii grași din probele investigate au fost identificați conform timpului de retenție specific, determinat prin analiza amestecului etaloan. Cantitatea procentuală pentru fiecare acid gras din proba respectivă este calculată de programul dedicat al calculatorului conectat gaz-cromatografului, pe baza integrării automate a picurilor.
2.3. Separarea fracțiunilor celulare
Funcția diferitelor membrane din celule este dependentă semnificativ de caracteristicile lipidelor acestora, deci și de conținutul lor în acizi grași. Aceste fenomene sunt valabile atât în condiții fiziologice, cât și în patologie. În aceast studiu s-a urmărit efectul modulării conținutului de acizi grași din lipidele celulare la nivelul membranelor diferitelor fracțiuni celulare, pe celule MCF-7, în urma tratamentului cu acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic (DHA). Pentru o mai detaliată cunoaștere a efectelor tratamentului cu DHA asupra compoziției în acizi grași a lipidelor membranare observate pentru celulele MCF-7, s-a investigat modularea acestora la nivelul membranelor diferitelor fracțiuni celulare.
Celulele probă (tratate cu 100 M DHA și 10 M 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methylphenol (BHT) ca antioxidant) cât și control (al căror mediu de cultură a fost suplimentat numai cu 10 M BHT) au fost supuse omogenizării și fracționării, pentru obținerea a trei fracțiuni: fracțiunea nucleară (FN), fracțiunea plasmalemală (FP) și fracțiunea citoplasmatică (reprezentând conținutul celular, adică citosol și organite). După spălare și desprindere de pe suprafața de cultură, folosindu-se un tampon A (0,25 M sucroză, 1 mM EDTA și 20 mM tricină, pH =7,8), celulele au fost centrifugate 5 minute, la 1400g. Sedimentul celular a fost resuspendat în tampon A (1 ml), iar celulele au fost supuse omogenizării prin fricțiune în omogenizator Dounce. După centrifugare timp de 10 min, la 1000g, supernatantul a fost folosit pentru obținerea membranei plasmatice, iar sedimentul ce conținea fracțiunea nucleară a fost supus ultracentrifugării în soluție 1,38M sucroză, timp de 80 minute, la 40000g [141]. Fracțiunea plasmalemală a fost obținută prin ultracentrifugare în gradient (folosing 30% percoll, în tampon A) timp de 30 min, la 28000 rpm (rotor SW41Ti, centrifugă Optima XPN, Beckman) [142]. Îndepărtarea percollului s-a realizat prin diluare cu PBS și depunere prin ultracentrifugare 2h, la 30000 rpm (rotor SW60Ti, centrifugă Optima XPN, Beckman).
2.4. Extragerea și analiza cantitativă a proteinelor
Celulele ajunse la confluență au fost spălate cu PBS, desprinse, numărate și apoi resuspendate în tampon de liză cu compoziția: 50mM Tris-HCl, pH 7,4, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% deoxicolat de Na, 0,1% SDS (dodecilsulfat de Na), 2mM EDTA, 1mM PMSF (fluorură de fenilmetilsulfonil), 10µg/ml aprotinin, 10µg/ml leupeptin. Liza celulară și solubilizarea proteinelor s-a realizat la 4°C, pe baie de gheață. Supernatantul s-a separat prin centrifugare la 6000 rpm, timp de 10 minute, la 4°C, reprezentând extractul proteic.
Concentrația proteică din extract a fost determinată prin metoda Lowry [143], utilizând kitul DCTM Protein Assay de la Bio-Rad. Curba etalon a fost trasată prin folosirea BSA (albumină serică bovină) ca standard.
Reactivii pentru extragerea proteinelor, electroforeză și Western Blot au fost procurați de la următoarele firme (în cazul în care nu este specificat altfel): Bio-Rad, Sigma-Aldrich, Riedel de Haen.
2.5. Electroforeză, transfer electroforetic și imunomarcare (Western blot)
Separarea proteinelor s-a realizat prin electroforeză în gel de poliacrilamidă, în prezență de dodecilsulfat de sodiu (SDS-PAGE) după metoda lui Laemmli [144], folosindu-se un gel de separare de 12% acrilamidă. Proteinele au fost transferate timp de 75 minute pe membrană de polidifluorură de viniliden (PVDF).
După transfer, membranele au fost mai întâi blocate în BSA 5%, peste noapte, la 4°C. Anticorpul primar utilizat a fost anti-SCD1 (Abcam), monoclonal de șoarece, la o diluție de 1:1000 (incubare peste noapte, la 4°C). Pentru controlul încărcării proteice a probelor, a fost folosit anticorpul pentru β-actină (Santa Cruz Biotechnology), monoclonal de șoarece, la o diluție de 1:200 (incubare 2 ore, la temperatura camerei). Deasemenea s-au făcut incubări și cu anticorpii primari anti-TATA monoclonal crescut în șoarece (Abcam), diluție 1:2000, pentru fracțiunea nucleară, respectiv anti-caveolină 1, policlonal crescut în iepure (Santa Cruz Biotechnology), diluție de 1:200, pentru fracțiunea plasmalemală. Acestea au fost realizate la temperatura camerei, timp de 2 ore. Anticorpii secundari conjugați cu HRP (Santa Cruz Biotechnology), la o diluție de 1:10000 au fost aplicați timp de 1h, la temperatura camerei. Detectarea semnalului dat de anticorpi a fost realizată prin metoda chemiluminiscenței amplificate, folosind kitul SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific).
2.6. Imunofluorescență
Celulele probelor sau controlului, cultivate pe lamele de sticlă, au fost mai întâi fixate cu 3,7% formaldehidă, timp de 10 minute, spălate în PBS și incubate timp de 30 minute în 2% albumină serică bovină, iar apoi spălate cu glicină 20 mM (toate substanțele provin de la Sigma- Aldrich). Incubarea cu anticorpul primar anti-SCD1, policlonal ridicat în iepure (Novus Biologicals), diluție de 1:50, s-a realizat la temperatura de 4°C, peste noapte. Detecția anticorpului primar a fost făcută cu un anticorp secundar anti-iepure, ridicat în capră, conjugat cu Alexa Fluor 594 (Invitrogen), la o diluție de 1:400, timp de două ore, la temperatura camerei.
Pentru vizualizarea depozitelor de lipide formate în citoplasmă s-a realizat colorarea cu solutie de Oil Red O (Sigma- Aldrich), timp de 15 minute la temperatura camerei. Nucleii au fost contracolorați cu 3μg/ml dihidroclorură de 2'-fenilindol 4',6-diamidin, DAPI (Sigma-Aldrich).
Controlul negativ a fost obținut urmănd același protocol, dar fără aplicarea anticorpului primar.
Probele au fost analizate la microscopul de fluorescență Nikon Eclipse TI.
2.7. Testul MTS
Pentru determinarea gradului de proliferare celulară s-a realizat testul MTS. După desprindere și numărare celulele probă (tratate cu 100 M DHA și 10 M BHT) cât și control (al căror mediu de cultură a fost suplimentat numai cu 10 M BHT) au fost cultivate în plăci cu 96 godeuri.
Celulele au fost resuspendate în mediu la care s-au adăugat 100μM DHA și 10μM BHT pentru cele tratate, respectiv 10μM BHT pentru celulele control, punându-se în fiecare godeu 100μl ce conțineau 7000 de celule. Placa a fost lăsată timp de 24 ore în incubator pentru echilibrate, după care s-a adăugat în fiecare godeu 20μl CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent. Citirea absorbanței s-a realizat (dupa ce placa a fost ținută trei ore la incubator) la 490 nm pe aparatul Multiskan Microplate Photometer reader.
2.8. Videomicroscopie în timp real
Instrumentul destinat experimentelor de videomicroscopie este BioStation IM (Nikon Corp. Kawasaki, Japonia) și reprezintă un mini-incubator cu sistem optic și cameră video încorporate. Echipamentul permite urmărirea celulelor un timp îndelungat (ore, zile), în diferite modele experimentale menite a aduce informații despre comportamentul celular (adeziune, etalare, motilitate în modele tip vindecarea rănilor, răspunsuri la stimulări sau inhibări).
Modelul experimental de vindecare a rănilor („wound healing”) pentru celule tratate cu DHA și iradiate cu UVA
Pentru aceste experimente, au fost utilizate plăci Petri de 35 mm, cu fundul de sticlă (WillCo Wells B.V., Amsterdam, Olanda). Celulele au fost desprinse din flaconul de cultură, resuspendate în mediu DMEM – HamF12 cu DHA 50 µM și BHT 5 µM pentru celulele tratate, respectiv BHT 5 µM pentru control și apoi plasate în placa de cultură (1 ml suspensie conținând 7.5×105 celule). Aceasta a fost lăsată în incubator 2.5 ore pentru aderarea și etalarea celulelor și pentru obținerea unui strat celular confluent.
După acest interval de timp, celulele au fost expuse la UVA 30 minute, în PBS, la temperatura camerei (pentru control, celulele s-au prelucrat similar, fiind ținute la temperatura camerei, fără UVA). După iradiere, stratul celular a fost zgâriat pentru pregătirea experimentală tip vindecarea rănilor („wound healing”). PBS utilizat ca soluție necesară iradierii a fost înlocuit cu mediu DMEM – HamF12 suplimentat cu BHT și DHA (pentru probă), respectiv BHT (pentru control) și placa a fost plasată imediat în Biostation. Comportamentul keratinocitelor a fost urmărit, în puncte multiple de-a lungul zgârieturii, până la refacerea stratului celular la nivelul fantei denudate.
Analiza imaginilor obținute prin videomicroscopie a fost realizată cu ajutorul aplicației NIS-Elements (Nikon Instruments Europe B.V., Badhoevedorp, Olanda). Pentru fiecare experiment, au fost înregistrate și analizate imagini din 9-10 câmpuri.
În toate experimentele, celulele au fost tratate cu DHA timp de 3 zile înainte de recoltare. Pentru martor au fost utilizate celule netratate.
Investigarea aderării, etalării, traiectoriei și vitezei de migrare ale celulelor prin videomicroscopie în timp real pe celule tratate cu DHA
Pentru aceste experimente, au fost utilizate plăci Petri de 35 mm, cu fundul de sticlă (WillCo Wells B.V., Amsterdam, Olanda). Suprafața plăcii a fost acoperită cu proteina de matrice (colagen) la concentrația 5μg/ml (diluție în 0,1M NaHCO3), peste noapte, la 4°C. Celulele au fost desprinse din vasul de cultură, resuspendate în mediu DMEM-F12 (Dulbecco Modified Eagle’s Medium) cu 5% BSA și 1% antibiotic și plasate în placa de cultură (1 ml suspensie conținând 1×105 celule). Comportamentul celulelor control și probă (după tratament cu DHA) a fost urmărit imediat după punerea acestora pe placă. Au fost selectate pentru monitorizare 10 câmpuri diferite, iar experimentul a durat 24h, colectându-se imagini la interval de 5 minute.
Analiza imaginilor obținute prin videomicroscopie a fost realizată cu ajutorul aplicației NIS Elements (Nikon Instruments Europe B.V., Badhoevedorp, Olanda). Pentru fiecare experiment, au fost înregistrate și analizate imagini pentru minim 20 de celule, monitorizate în cele 10 câmpuri diferite.
Investigarea efectului radiațiilor UVA și a administrării de DHA asupra aderării și etalării celulare prin monitorizări de impedanță
Sistemul xCELLigence (Roche Diagnostics, Mannheim) măsoară în timp real impedanța electrică a stratului celular de-a lungul unor microelectrozi plasați la baza godeurilor plăcilor de cultură special realizate pentru aparat. Echipamentul este astfel construit încât poate fi plasat în interiorul unui incubator și este conectat la un computer portabil ce are instalată aplicația software RTCA („Real Time Cell Analyzer”) Software, care achiziționează datele. Sistemul oferă posibilitatea rulării simultane a unor experimente în trei plăci diferite, fiecare dispunând de câte 16 godeuri. Fiecare placă poate fi urmărită independent, având propriul program setat de către utilizator. De aceea nu este necesar să fie pornite toate experimentele în același timp, astfel încât una sau două pot fi introduse în sistem ulterior. Mai mult fiecare placă poate reprezenta un alt model experimental.
Pentru experimentele noastre de urmărire a etalării și aderării celulare, au fost utilizate plăcile cu 16 godeuri, E-Plate 16. Semnalul de bază al impedanței a fost înregistrat inițial, înainte de plasarea celulelor în godeuri, prin scanarea plăcilor având în godeuri mediu DMEM – HamF12, cu BHT, 5µM și DHA, 50µM în cazul celulelor tratate (probă), respectiv numai BHT, 5µM, în cazul celor netratate. Celulele au fost adăugate, câte 15000 celule/godeu (DOK), respectiv 7500 celule/godeu (HaCaT). După ce semnalul înregistrat a ajuns la platou, mediul a fost înlocuit cu tampon fosfat salin cu Ca2+ și Mg2+ (PBS) în vederea expunerii celulelor la UVA pentru intervale de timp diferite: 15, 30, respectiv 60 minute. Pentru iradierea celulelor cu UVA, s-a utilizat o lampă ce emite radiații la lungimea de undă de 365 nm – VL-340.BLB (Vilber Lourmat, Franța); plăcile (stratul celular) au fost plasate la o distanță de 10 cm față de lampă. După expunere, PBS a fost înlocuit cu mediu DMEM – HamF12, cu DHA și BHT (probă), respectiv BHT (martor), iar plăcile au fost plasate în analizorul RTCA pentru măsurarea impedanței. În toate experimentele, celulele au fost tratate cu DHA timp de 3 zile înainte de recoltare, iar pentru martor au fost utilizate celule netratate.
Extragerea lipidelor din organele de șoarece
Organele șoarecilor au fost spălate cu tampon fosfat salin și înghețate în azot lichid până la extragerea lipidelor. La 150mg țesut (bine mărunțit) au fost adaugți 0,5ml amestec cloroform:metanol (1:2), agitând ușor timp de 15min. În final au fost adăugați câte 0,2ml cloroform, respectiv 0,2ml apă. După centrifugare, 7min. la 3000rpm (centrifugă Sigma 2-16K prevăzută cu rotor 369/F) pentru separarea fazelor, a fost colectată partea organică și concentrată la sec sub atmosferă de azot.
2.11. Fracționarea lipidelor prin cromatografie în fază lichidă de înaltă performanță
Tehnica de cormatografie în fază lichidă de înaltă performanță (HPLC) este reprezentată de o categoirie de metode fizico-chimice de separare a compușilor dintr-un amestec în care faza mobilă este un lichid, iar faza staționară, împachetată într-o coloană, este constituită dintr-un solid poros cu granulație fină și dispersie mică (atât a dimensiunii pariculelor cât și a porozității acestora) care pot sau nu avea atașate diferite grupări funcționale ceea ce duce la varietatea de metode.
Extractele fosfolipidice din organele șoarecilor au fost separate prin HPLC. Filmele de lipide (obținute fie prin liofilizare, fie prin evapoarare sub azot) au fost solubilizate într-un solvent A (hexan-izopropanol, 6:8, v/v) și analizate printr-o metodă prin faze normale pe un aparat Accela Thermo Fisher HPLC (ThermoFischer Scientific), prevăzut cu o coloană Hypersil Gold Silica Column, 250x4mm (ThermoFischer Scientific). Eluția a fost făcută cu un gradient liniar 0-100% între solventul A și un salvent B (hexan – isopropanol – apă, 6:8:1.4 v/v/v), realizat în 45 minute, cu un flux de 1ml/min. Detecția a fost făcută în UV, la 206 nm. Pentru identificarea tipurilor de fosfolipide din probe au fost cromatografiate în aceleași condiții experiemntale standarde de fosfolipide (Sigma-Aldrich). Fracțiunile au fost colectate și concentrate sub atmosferă de azot (Concentrator Techne Sample DB-2A și Generator de azot N2-Bora) pentru a fi ulterior analizate prin gaz cromatografie, astfel analizându-se acizii grași din fosfolipidele separate prin HPLC.
Capitolul 3
Rezultate Și discuȚii
3.1. Studiul acizilor grași din lipidele unor diverse linii celulare
3.1.1. Studii asupra acizilor grași în diverse tipuri de celule în funcție de stadiul de confluență
Activitatea celulară este influențată semnificativ de comportamentul membranei. Funcționarea membranei poate fi modulată de proprietățile bistratului lipidic. Comportamentul bistratului lipidic este dependent de proprietățile fizico-chimice ale lipidelor membranare și, prin urmare, și de tipurile de acizi grași din compoziția acestora. În multe patologii, au fost descrise dereglări ale rapoartelor dintre tipurile de acizi grași saturați, respectiv nesaturați. Acest lucru a determinat interesul actual pentru investigarea compoziției în acizi grași a lipidelor membranare ca posibilă țintă terapeutică. Prin urmare, la începutul studiului am urmărit să identificăm acizii grași din lipidele mai multor tipuri de celule canceroase cât și normale, cu scopul confirmării că raportul de acizi grași saturați/acizi grași nesaturați din lipide este diferit. Primele experimente au constat în studii ale aciziilor grași din probe de celule HeLa (celule epiteliale de carcinom ovarian) și celule HUVEC (celule endoteliale ale venei ombilicale umane) care au fost luate în lucru în diverse stadii ale culturii celulare și anume la 24 ore, 48 ore, 72 ore și respectiv 96 ore, aceaste momente reprezentând implicit și diferite stadii ale confluenței stratului celular. Analiza compoziției de acizi grași din lipidele membranare a fost realizată prin gaz-cromatografie.
Rezultatele acestor investigații au arătat că diversele celule au proporții diferite de acizi grași în lipidele lor.
În celulele HeLa au fost identificați următorii acizi grași: C16:0, C18:1n9cis, C18:0, C18:2cis, C20:4n6, C22:6n3, C18:1n11cis, C24:1, C22:1n9, C22:2, C16:1. Alături de acizii grași menționați în cromatograme apar două componente pe care nu le-am putut identifica (desemnați ca neidentificat 1 și neidentificat 2 în Tabelul 3.1.1).
În HUVEC s-au identificat următorii acizi grași: C16:0, C20:4n6, C18:1n9cis, C18:0, C18:1n11cis, C18:2cis, C22:6n3, C24:1, C14:0. Pentru aceste celule în cromatogramele noastre a fost înregistrat numai o componentă ce a rămas neidentificată, cu timp de retenție specific celui de-al doilea component neidentificat la HeLa (neidentificat 2 în Tabelul 3.1.2). Indiferent de timpul de cultivare după pasaj, în celulele HeLa procentul de acizi grași saturați este mai mic cu aproximativ 10% față de procentul de acizi grași saturați din HUVEC. Astfel, ipotetic, ne putem gândi că celulele canceroase prezintă o fluiditate membranară mai mare (asigurată de o cantitate mai mare de acizi grași nesaturați) ce le poate facilita motilitatea crescută. Există în literatură corelații directe între capacitatea de metastazare a celulelor tumorale și cantitatea de acizi grași nesaturați din lipidele celulare [27].
În celulele HeLa conținutul în principalele tipuri de acizi grași din lipide este următorul (în ordine descrescătoare): C18:1n9cis, C16:0, C18:0, C18:2cis și C20:4n6. În celulele HUVEC conținutul în aceeași ordine descrescătoare este: C16:0, C18:1n9cis, C18:0, și C20:4n6. Este de menționat că acidul oleic (C18:1n9cis) este în cantitate mai mare în celulele HeLa decât în HUVEC, pe când acidul arahidonic (C20:4n6) este în cantitate dublă în HUVEC față de conținutul lui în celulele HeLa. Cantitatea mai mare de acid oleic și cantitatea mai mică de acid arahidonic sunt specifice celulei canceroase și o diferențiază de celula normală [27]. Totusi, având în vedere că motilitatea celulară este un proces complex, reglat de o multitudine de factori celulari, aspectele legate de fluiditatea membranei necesită o aboradre experimenatală mai amplă.
Atât în celulele HeLa cât și în HUVEC a fost observată o scădere a procentului de acizi grași nesaturați odată cu creșterea numărului de ore de menținere în cultură, după pasarea celulelor. Această modificare ar putea fi explicată prin faptul că pe măsură ce suprafața de cultură se acoperă cu celule, acestea au nevoie de mobilitate mai redusă și de o fluiditate membranară mai scăzută.
În HUVEC a fost observată atât o creștere a acidului oleic (C18:1n9cis), odată cu creștere timpului de cultivare a celulelor după pasaj, cât și o scădere a două tipuri de acizi grași polinesaturați: acidul arahidonic (C20:4n6) și acidul docosahexaenoic DHA (C22:6n3). Nu putem explica în acest stadiu scăderea abundenței în acid arahidonic al celulelor endoteliale, cu atât mai mult cu cât procesele de semnalizare care folosesc drept mesageri metoboliții acestui acid gras polinesaturat sunt intens folosite la nivelul endoteliului.
Tabel 3.1.1. Acizi grași identificați în celule HeLa la timpi diferiți de cultivare, după pasaj (24h, 48h, 72h și 96h).
Tabel 3.1.1. (continuare)
Tabel 3.1.2: Acizi grași identificați în celule HUVEC la timpi diferiți de cultivare, după pasaj (24h, 48h, 72h și 96h).
Tabelul 3.1.2. (continuare)
Cromatograme reprezentative obținute pentru diversele condiții experimentale abordate sunt prezentate în figurile de mai jos.
Fig. 3.1.1. Rezolvarea cromatografică a amestecului etalon FAME MIX 37 (Supelco). Analiza acestora a permis stabilirea timpilor de retenție pentru fiecare tip de acid gras identificat în probele supuse investigației.
Fig. 3.1.2. Cromatogramă relevantă pentru acizii grași din celule HeLa după 24 ore de cultivare.
Fig. 3.1.3. Cromatogramă reprezentând conținutul de acizi grași din celule HeLa la 48 ore de cultivare, după pasare.
Fig. 3.1.4. Conținutul în acizi grași din lipidele celulelor HeLa la 72 ore de cultură.
Fig. 3.1.5. Cromatogramă pentru acizii grași din celulele HeLa la 96 de ore de cultură.
Fig. 3.1.6. Acizii grași din HUVEC la 24 ore de cultivare, rezolvați prin cromatografie gazoasă.
Fig. 3.1.7. Tipurile de acizi grași din HUVEC la 48 ore de cultivare a celulelor, după pasare.
Fig. 3.1.8. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din HUVEC, 72 de ore după pasarea culturii.
Fig. 3.1.9. Cromatograma acizilor grași la 96 de ore de cultivare a HUVEC.
3.1.2. Efectul tratamentului cu DHA asupra conținutului de acizi grași din lipidele celulare
Ca urmare a acestor investigații, au fost identificate, prin analiză gaz-cromatografică, modificări ale raportului acizi grași saturați/acizi grași nesaturați în lipidele celulare, ca urmare a suplimentării mediului de cultură a celulelor canceroase cu acizi grași polinesaturați. Este de așteptat ca asemenea modificări, când apar, să ducă la comportament celular diferit față de cel al celulelor crescute în mediu standard. Pentru verificarea ipotezelor au fost alease linile celulare MCF7, HeLa și DU145, care au fost tratate cu acid cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic (DHA), 100 M și 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methylphenol (BHT), 10 M ca antioxidant. Controlul s-a realizat pe celule al căror mediu de cultură a fost suplimentat numai cu 10 M BHT.
Din Tabelul 3.1.3 se poate observa că în celulele MCF-7 și HeLa efectul DHA este asemănător, în timp ce pentru celulele DU145 rezultatele sugerează efecte semnificativ diferite. Astfel, în celulele HeLa și MCF-7 tratate cu DHA, procentul de acizi grași saturați crește față de control. La celulele DU145 tratate, se înregistrează o inversare a efectului: în celulele tratate procentul de acizi grași saturați scade. Se mai poate observa faptul că la toate cele trei tipuri celulare investigate, tratamentul cu DHA duce la scăderea procentului de acizi grași mononesaturați. În celulele HeLa și MCF7, pentru scăderea procentului de acizi grași mononesaturați contribuția principală revine acidului oleic. În celulele HeLa și DU145 tratate, procentul acizilor grași polinesaturați crește în timp ce pentru celulele MCF-7 procentul acizilor grași polinesaturați rămâne apoape neschimbat. Se mai poate remarca faptul că, în urma tratamentului, celulele acumulează procente relativ similare de DHA; astfel celulele HeLa și DU145 acumulează 7.9% respectiv 8.3%, iar în celulele MCF-7 creșterea este cu 6.3% (existând un procent de 3.5% DHA la celulele netratate).
În figurile de mai jos sunt prezentate cromatogramele unor experiemnte reprezentative.
Tabelul 3.1.3. Efectul tratamentului cu DHA asupra acizilor grași identificați în celule MCF-7, HeLa și DU145. Valorile reprezintă procente relative la conținutul total de acizi grași.
Fig. 3.1.11. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din celulele MCF-7 tratate cu DHA100 M timp de 6 zile.
Fig. 3.1.12. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din celulele MCF-7 control.
Fig. 3.1.13. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din celulele HeLa tratate cu DHA 100 M timp de 6 zile.
Fig. 3.1.14. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din celulele HeLa control.
Fig. 3.1.15. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din celulele DU 145 tratate cu DHA 100 M timp de 6 zile.
Fig. 3.1.16. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din celulele DU 145 control.
În urma tratamentului cu DHA s-a observat că la concentrația 100 M rata de supraviețuire a celulelor MCF-7 a fost cea mai mare, în comparație cu alte linii celulare tumorale investigate. Linia celulară MCF-7 utilizată nu sintetizează caspaza 3, astfel încât supraviețuirea celulelor în număr semnificativ mai mare după tratament poate fi explicată prin faptul că apoptoza nu a fost indusă. Având în vedere aceste rezultate a fost aleasă linia MCF-7 pentru studierea consecințelor tratamentului cu DHA dincolo de efectul citotoxic.
Efectul tratamentului cu DHA asupra acizilor grași identificați în celule MCF-7 tratate 5 zile cu DHA + BHT, comparativ cu MCF-7 tratate 5 zile doar cu BHT, în 6 experimente realizate în zile diferite este prezentat în Tabelul 3.1.4. Modificările evidențiate nu sunt semnificativ diferite pentru prelungirea tratamentului la 12, respectiv 19 de zile. Se observă că în celulele MCF-7 tratate cu DHA procentul de acizi grași saturați crește față de control. Creșterea are semnificație statistică foarte înaltă (p<0,0005). Din datele referitoare la proporțiile tipurilor de acizi grași, se poate vedea că această creștere este în mare parte datorată acidului palmitic care crește semnificativ statistic (p<0,005) în probă față în control. Se mai poate observa faptul că în celulele MCF-7 tratate cu DHA procentul de acizi grași mononesaturați este mai mic decât în control. Scăderea este înalt semnificativă din punct de vedere statistic (p<0,0001) și se datorează în principal acidului oleic care prezintă o creștere înalt semnificativă în control, față de probă (p<0,005). Cantitatea de acizii grași polinesturați este apoximativ egală. Se mai poate remarca faptul că, în urma tratamentului, procentul de DHA crește de la 3,5% (în control) la 9,8% (în probă). Odată cu această creștere (care ar fi de așteptat, datorită administrării de DHA) observăm o scădere semnificativă a acidului arahidonic în probă, față de martor (p<0,05) (Fig. 3.1.17).
Tabel 3.1.4. Efectul tratamentului cu DHA asupra conținutului de acizi grași din lipidele celulelor MCF-7.
Fig. 3.1.17. Efectul tratamentului cu DHA 100 M asupra tipurilor de acizi grași din lipidele celulelor MCF-7. PROBA – celule tratate 8 zile; CONTROL – celule netratate.
Pentru o mai detaliată cunoaștere a efectelor tratamentului cu DHA asupra compoziției în acizi grași a lipidelor membranare observate pentru celulele MCF-7, ne-am propus să investigăm dacă modificările totale observate sunt diferențiate la nivelul membranelor diferitelor fracțiuni celulare obținute după omogenizarea celulelor și ultracentrifugarea componentelor omogenatului.
Puritatea fracțiunilor celulare obținute a fost investigată prin electroforeză, transfer electroforetic și imunodetecție (Western Blot), folosind anticorpi anti-TATA (pentu fracțiunea nucleară) sau anti-caveolină 1 (pentru fracțiunea plasmalemală). Fracțiunile obținute prezintă un grad înalt de puritate (Fig. 3.1.18) întrucât TATA este identificat numai în fracțiunea nucleară și în lizatul celular total, în timp ce ceveolina 1 este prezentă numai în fracțiunea plasmalemală și la un nivel scâzut în lizatul celular total, deoarece proteinele membranare reprezintă un procent foarte scăzut în preparat.
Efectul tratamentului cu DHA asupra acizilor grași identificați în lipidele celulelor MCF-7 tratate 7 zile cu DHA + BHT, comparativ cu MCF-7 tratate 7 zile doar cu BHT, din diferitele fracțiuni celulare, cât și pentru totalitatea lipidelor celulelor MCF-7 este prezentat în Tabelul 3.1.5. Rezultatele dovedesc că în celulele MCF-7 tratate cu DHA procentul de acizi grași saturați crește față de control, atât în lizat total cât și în fracțiunile celulare, creșterile fiind însă diferențiate.
1 2 3 4 5 6
TATA
Cav-1
Fig. 3.1.18. Verificarea, prin electroforeză, transfer electroforetic și imunodetecție, a purității fractiunilor celulare, obținute din celule MCF-7. 1. fracțiune nucleară – probă; 2. fracțiune nucleară – control; 3. plasmalemă – probă; 4. plasmalemă – control; 5. lizat total – probă; 6. lizat total – control.
Tabelul 3.1.5. DHA adăugat în mediul de cultură al celulelor MCF7 afectează în mod diferit raportul acizi grași saturați/acizi grași nesaturați din sedimentul celular total și din fracțiunile celulare. FN – fracțiune nucleară, FP – fracțiune plasmalemală, FC – fracțiune citoplasmatică.
Este de menționat că pentru fracțiunea citoplasmatică a fost înregistrată cea mai mică creștere (de numai 2%), în timp ce pe fracțiunile nucleară și plasmalemală creșterea conținutului de acizi grași saturați este de 7,1%, respectiv 7,4%. Din datele referitoare la proporțiile tipurilor de acizi grași, se poate vedea că această creștere a conținutului în acizi grași saturați este datorată în principal acidului palmitic, care sporește după tratamentul cu DHA atât în lizatul total, cât și în toate fracțiunile, în timp ce acidul stearic preznită o creștere evidentă numai pentru fracțiunea plasmalemală. Un alt fapt care se poate remarca este legat de scăderea conținutului de acizi grași nesaturați în celulele MCF-7 tratate cu DHA, atât pentru lizatul total (7,3%) cât și în două dintre fracțiunile celulare analizate (7,1% pentru fracțiunea nucleară, respectiv 2% pentru fracțiunea citoplasmatică). Excepție a făcut fracțiunea plasmalemală, unde a fost observată o tendință de creștere (2,6%). Aceste efecte se datorează cu precădere modulării în conținutul de acizi grași mononesaturați. Scăderea acizilor grași mononesaturați se datorează în principal modificărilor în conținutul de acid oleic, dar și a acidului palmitoleic în fracțiunea plasmalemală, singura fracțiune celulară unde apare acidul palmitoleic. Conținutul de acizii grași polinesturați nu pare afectat de tratamentul cu DHA în fracțiunile citoplasmatică și plasmalemală. În lizatul total conținutul de acizi grași polinesaturați este mai crescut în urma tratamentului, iar, în fracțiunea nucleară se înregistrează o scădere a acestuia. Cum este și firesc, în urma tratamentului, procentul de DHA crește în probă, însă odată cu această creștere se înregistrează o scădere pentru acizii linoleic și arahidonic. Aceste observații sunt sugestiv evidențiate în Fig. 3.1.19.
Rezultatele obținute încearcă să completeze și să nuanțeze datele existente [145-151] referitoare la modulările induse de tratamentele cu DHA în conținutul de acizi grași la nivelul lipidelor celulare, prin investigări adresate diferitelor fracțiuni celulare obținute după omogenizare și centrifugare secvențială și în gradient.
Fig. 3.1.19. Efectul tratamentului cu DHA asupra conținutului în acizi grași al lipidelor din celule MCF-7 tratate cu DHA (Probă), sau numai cu antioxidantul BHT (Control), în diversele fracțiuni celulare separate și investigate.
Scăderea proporției de acid oleic, ca urmare a tratamentului celulelor cu acizi polinesaturați (DHA), ar putea fi datorată efectului asupra activității stearoil-CoA desaturazei (SCD) [152-154], enzimă responsabilă pentru biosinteza de acizi grași mononesaturați pornind de la acizi grași saturați, această modulare a activității enzimei putând explica și proporția mai mare de acid palmitic evidențiată la celulele tratate.
SCD se află localizată în reticulul endoplasmatic și catalizează introducerea unei duble legături între atomii de carbon 9 și 10. SCD acționează asupra palmitoil-CoA și stearoil-CoA, care sunt transformate în palmitoleoil-CoA (16:1) și respectiv oleoil-CoA (18:1). Au fost identificate patru izoforme (SCD-1, SCD-2, SCD-3, și SCD-4) la șoarece, iar la șobolan două izoforme. La om sunt exprimate două izoforme SCD-1 și SCD-5, SCD-1 fiind exprimată aproape ubicuitar, iar SCD-5 fiind prezentă doar în creier si pancreas [154].
Totuși, rezultatele studiilor noastre asupra nivelelor de exprimare a SCD1 au dovedit (atât prin western blot (Fig. 3.1.20.), cât și prin imunofluorescență (Fig. 3.1.21.) că nu apar modificări semnificative, ceea ce indică faptul că reducerea nivelului de acid oleic, după tratamentul cu DHA, are la bază alte mecanisme decât cele de reducere a nivelului celular pentru enzima de dehidrogenare a acidului stearic.
Rezultate similare au fost obținute și pentru investigarea expresiei SCD1 prin imunofluorescență (Fig. 3.1.21.). Distribuția și intensitatea semnalului dat de anticorpul anti-SCD1 în citoplasmă nu sunt semnificativ diferite la celulele tratate cu DHA, comparativ cu cele netratate. Așadar, mecanismul prin care nivelul de acid oleic este mai redus în celulele tumorale după tratare cu DHA nu implică subexprimarea enzimei implicate în biosinteza sa.
1 2
SCD1
actină
Fig. 3.1.20. Exprimarea SCD1 în celulele MCF-7, evidențiată prin Western Blot. 1 – celule după 8 zile de tratament cu DHA; 2 – celule netratate (control). Pentru controlul încărcării a fost realizată detectarea actinei.
(A)
(B)
Fig. 3.1.21. Efectul tratamentului cu DHA 100 M asupra nivelului de exprimare a SCD1 în celulele MCF-7, determinat prin imunofluorescență. A – celule control (netratate), B – celule după 7 zile de tratament. În roșu distribuția SCD1; în albastru nucleii contra-colorați cu DAPI.
Celulele MCF-7 acumulează depozite de lipide foarte repede după începerea tratamentului cu DHA. Numărul și dimensiunea depozitelor de lipide în citoplasmă crește semnificativ odată cu timpul de tratament la care sunt supuse celulele. Acumularea acestor depozite de lipide în citoplasmă se poate pune în evidență prin colorarea cu Oil Red O (Fig. 3.1.22.).
Monitorizarea în timp real prin videomicroscopie pe aparatul BioStation IM evidențiază (Fig. 3.1.23.) deasemenea efecte ale administrării DHA asupra morfologiei celulare prin formarea de incluziuni lipidice al căror număr și dimensiuni sporesc pe măsură ce timpul de administrare crește.
A B
C D
E F
Fig. 3.1.22. Dinamica acumulării depozitelor lipidice în celulele MCF-7, ca urmare a tratamentului cu DHA 100 M. A – celule netratate (control), B – celule tratate o oră, C – celule tratate 6 ore, D – celule tratate 12 zile, E – celule tratate o zi și F – celule tratate 8 zile.
A B
C D
E F
Fig. 3.1.23. Dinamica acumulării depozitelor lipidice în urma tratamentului cu DHA 100 M, pe celulele MCF-7. A – celule după 2 ore tratament, B – celule după 5 ore tratament, C – celule după 12 ore tratament, D – celule tratate o zi, E – celule tratate 2 zile și F – celule tratate 5 zile.
Efectul tratamentului cu 100 µM DHA, aspra capacității proliferative a MCF7, după un tratament de 5 zile, a fost investigat folosind testul MTS. Experimentele realizate pentru studiul efectelor tratamentului asupra proliferării celulare atată că aceasta scade cu aproximativ 20% față de control (Fig. 3.1.24). Scăderea este înalt semnificativă din punct de vedere statistic (p<0,0001).
Fig. 3.1.24. Variația ratei de proliferare a celulelor MCF-7 în urma tratamentului cu DHA 100 µM timp de 5 zile.
Comportamentul celulelor MCF7 (evidențiat prin monitorizare în timp real) este influențat de DHA. Etalarea celulelor tratate cu DHA timp de 5, 12, respectiv 19 zile este mai rapidă inițial, suprafața acestora fiind mai mare în comparație cu aceea a celulelor netratate, la începutul experimentului (Fig. 3.1.25). Această diferență inițială a dinamicii etalării nu a fost surprinsă deoarece stabilirea setărilor experimentale și alegerea punctelor de monitorizare durează aproximativ 15 minute. În cazul celulelor netratate, suprafața de etalare înregistrează o creștere constantă, în timp ce la celulele tratate suprafața de etalare oscilează în jurul valorii inițiale. Monitorizarea prin videomicroscopie în timp real a celulelor MCF7 a permis și studii privind efectul DHA asupra motilității celulare în condiții bazale. În ceea ce privește viteza de migrare în condiții bazale a celulelor aceasta este mai mică după 5 zile de tratament, dar revine către cea a celulelor netratate pentru 12, respectiv 19 zile de administrare a DHA (Fig. 3.1.26). Singura deosebire ar consta în aceea că celulele netratate au o variabilitate mult mai mare a vitezei de migrare, iar tratamentul cu DHA determină un comportament mai unitar. Nu au fost observate efecte ale DHA asupra direcționalității mișcării celulelor MCF7 în condiții bazale (Fig. 3.1.27).
Fig. 3.1.25. Efectul DHA 100 M asupra etalării celulelor MCF7.
Fig. 3.1.26. Efectul DHA 100 M asupra motilității celulelor MCF7, exprimată ca viteză de migrare.
Fig. 3.1.27. Efectul DHA 100 M asupra direcționalității de migrare a celulelor MCF7.
A – celule netratate (control), B – celule tratate 5 zile, C – celule tratate 12 zile și D – celule tratate 19 zile.
3.1.3. Efectul tratamentului cu acizi grași nesaturați și expunerii la radiații ultraviolete A asupra celulelor tegumentare
Pornind de la ipoteza că stresul oxidativ are consecințe nefavorabile asupra refacerii epidermului, a fost investigat efectul concertat al administrării de DHA 50 M în mediul de cultură și iradierii cu UVA, asupra comportamentului celulelor din linii de keratinocite displazice și keratinocite normale. Mai întâi, a fost analizat, la nivel biochimic, efectul tratamentului cu DHA și expunerii la UVA asupra modificărilor în conținutul de acizi grași al lipidelor celulare, prin cromatografie în fază gazoasă. Apoi, au fost investigate, în timp real, prin măsurători de impedanță a stratului celular, efectele DHA+UVA asupra aderării/etalării și proliferării celulare. De asemenea, a fost investigată capacitatea keratinocitelor de a reface suprafața denudată, într-un model experimental de vindecare a rănilor („wound healing”). Rezultatele prezentate în această lucrare vizează studii comparative asupra comportamentului keratinocitelor displazice DOK și keratinocitelor normale HaCaT, completând rezultatele publicate anterior [155].
Efectul DHA și UVA asupra conținutului în acizi grași al lipidelor celulare
S-au realizat experimente pe celule al căror mediu de cultură a fost suplimentat cu 50 M DHA și 5 M BHT ca antioxidant și celule al căror mediu de cultură a fost suplimentat numai cu 5 M BHT. Pentru a se investiga efectul exercitat de radiațiile UVA, celulele au fost iradiate timp de 30 de minute, în PBS. În vederea urmăririi dinamicii modificărilor induse de UVA în timp, experimentele au fost realizate la intervale de timp diferite: imediat după iradiere, respectiv la 6, 12 și 24 ore post-iradiere (pentru fiecare condiție experimentală a existat o probă control).
Analiza gaz-cromatografică a proporției acizi grași nesaturați/saturați calculată ca raport probe iradiate/probe neiradiate a arătat o scădere a proporției de acizi grași nesaturați din lipidele membranare la celulele iradiate în comparație cu cele neiradiate, mai ales pentru celulele tratate cu DHA, atât în cazul keratinocitelor displazice cât și a celor normale (Fig. 3.1.34). Doar în cazul celulelor HaCaT tratate cu DHA 50 M, la 24 ore post-iradiere, nivelul de acizi grași nesaturați a crescut.
Fig. 3.1.34. Efectul iradierii cu UVA (30 minute de expunere) asupra proporției de acizi grași nesaturați/saturați în keratinocitele normale, respective displazice tratate sau nu cu DHA (50M).
Procentul de acizi grași mononesaturați (acid oleic) este mai scăzut pentru celulele tratate cu DHA la ambele tipuri celulare (efect mai pronunțat în cazul celulelor HaCaT), atât post-iradiere cât și la celulele neiradiate (Fig. 3.1.35). Această scădere este datorată acțiunii acidului docosahexaenoic (așa cum s-a arătat și pe alte linii celulare în rezultatele prezentate anterior – secțiunea 3.1.2.), nefiind influențată de radiațiile UVA. Raportul probă iradiată/probă neiradiată pentru acidul oleic, atât în cazul celulele Dok cât și HaCaT netratate și tratate cu DHA, nu se modifică semnificativ (Fig. 3.1.36).
Fig. 3.1.35. Efectul DHA (50µM) asupra proporției de acid oleic pentru celulele DOK și HaCaT iradiate (30 minute) și neiradiate.
Fig. 3.1.36. Efectul DHA (50µM) asupra raportului probă iradiată/probă neiradiată pentru acidul oleic în cazul celulelor DOK și HaCaT iradiate (30 minute) și neiradiate.
Cantitatea de acizii grași polinesturați este influențată atât de expunerea celulelor la radiații UVA cât și de tratamentul acestora cu acid docosahexaenoic. În cazul celulelor DOK tratate cu DHA procentul de acizi grași polinesaturați este mai ridicat pentru celulele iradiate comparativ cu cele neiradiate. Aceeași tendință se observă și la celulele HaCaT, mai puțin la 24 de ore post iradiere. Cea mai accentuată diferență între celulele iradiate și cele neiradiate fiind la probele luate în lucru la 12 ore post-iradiere. În cazul celulelor netratate cu DHA, pentru HaCaT, se observă o variație mai mică a acizilor grași polinesaturați în urma expunerii la UVA timp de 30 de minute (Fig. 3.1.37, Fig. 3.1.38).
Fig. 3.1.37. Efectul iradierii cu UVA (30 minute de expunere) asupra porporției de acizi grași polinesaturați în keratinocitele normale, respective displazice tratate sau nu cu DHA (50M).
Fig. 3.1.38. Efectul iradierii cu UVA (30 minute de expunere) asupra raportului de acizi grași polinesaturați, pentru celulele DOK și HaCaT netratate și tratate cu DHA 50µM.
Efectul DHA și UVA asupra aderării și etalării celulare
Alături de multe alte fenomene celulare, aderarea și etalarea sunt procese ce depind de o multitudine de factori, inclusiv de comportamentul membranei la nivel fizico-chimic. De aceea, modificările care apar în raportul dintre tipurile de acizi grași din lipidele membranare pot influența capacitatea de aderare și etalare a celulelor. În studiile destinate acestei lucrări, am investigat dinamica aderării și etalării keratinocitelor prin măsurători de impedanță a stratului celular.
Rezultatele obținute au arătat că înainte de iradiere, impedanța stratului celular crește, pe măsură ce celulele din suspensie aderă și se etalează specific pe suprafața de cultură (Fig. 3.1.39A; Fig. 3.1.40A). Keratinocitele normale (HaCaT) se etalează mai mult decât cele displazice (DOK), din această cauză numărul de celule care au fost însămânțate în fiecare godeu a fost dublu în cazul DOK față de HaCaT. În aceste condiții, nivelul indicelui celular înregistrat înainte de iradiere a fost similar.
După iradiere, a fost observată scăderea impedanței, ceea ce înseamnă că suprafața de contact cu substratul, adică etalarea s-a micșorat (Fig. 3.1.39B,C; Fig. 3.1.40B,C). Semnalul înregistrat imediat după iradiere este scăzut și în cazul controlului, pentru că celulele martor au fost menținute în PBS, la temperatura camerei, pe durata iradierii celulelor din probe pentru coerența condițiilor experimentale. Comportamentul celulelor DOK și HaCaT este diferit după iradiere. În cazul celulelor DOK netratate cu DHA, o iradiere mai scurtă (de 15 și mai ales 30 minute) pare să aibă un efect stimulator, nivelele mai ridicate ale impedanței stratului celular sugerând intrarea lor în proliferare. În experimentele desfășurate cu ajutorul xCELLigence în primele ore semnalul cuantifică tăria interacțiunilor cu substratul și suprafața ocupată de celulele însămânțate la o anumită densitate. Ulterior, în condițiile monitorizării pe termen lung, creșterea/scăderea indicelui celular va reflecta în principal modificări în numărul de celule, datorate fie proliferării, fie morții celulare.
Celulele iradiate timp de 60 minute s-au comportat similar cu cele neiradiate (control). Iradierea cu UVA nu a indus modificări majore în comportamentul celulelor tratate cu DHA, dar semnalul înregistrat în cazul acestora a fost aproximativ jumătate din cel obținut la celulele netratate.
Tratamentul cu DHA a determinat scăderea proliferării celulare și în cazul celulelor HaCaT (Fig. 3.1.40B,C). Iradierea cu UVA timp de 15 sau 30 minute stimulează proliferarea celulară, în schimb iradierea pe o perioadă mai îndelungată duce la scăderea impedanței (Fig. 3.1.40B). Celulele HaCaT tratate cu DHA sunt afectate de radiațiile UVA proporțional cu timpul de iradiere, indicele celular cel mai scăzut fiind obținut la 60 minute de iradiere (Fig. 3.1.40C).
Efectul DHA și UVA asupra motilității celulare
Prin investigații în timp real de videomicroscopie au fost studiate efectele tratamentului cu DHA și expunerii la UVA asupra capacității motile a keratinocitelor normale, respectiv displazice. Analiza imaginilor obținute a evidențiat faptul că expunerea la UVA afectează capacitatea keratinocitelor de a reface stratul celular după zgâriere, în modelul experimental de vindecare a rănilor. Acest efect este evident în cazul keratinocitelor normale (Fig. 3.1.41b). Tratamentul cu DHA pare să aibă un efect benefic asupra keratinocitelor displazice iradiate, în urma expunerii la UVA timp de 30 minute, celulele tratate dovedind capacitatea de acoperire a suprafeței denudate mai rapid decât cele netratate (control) (Fig. 3.1.42a).
În schimb, în cazul keratinocitelor displazice neiradiate tratamentul nu a schimbat semnificativ motilitatea celulară. Celulele HaCaT tratate și iradiate reușesc să acopere suprafața denudată într-un interval de timp de aproximativ 3 ori mai mare față de cele tratate și neiradiate (16 ore, respectiv 5 ore). Dinamica de acoperire a zonei zgâriate este diferită pentru celulele HaCaT iradiate tratate, în comparație cu cele netratate, deși intervalul de timp necesar acoperirii suprafeței denudate în proporție de 100% este aproape identic. Astfel, există o diferență care variază între 20 și 40% între suprafața acoperită de celulele netratate și cele tratate pe durata experimentului, această diferență atenuându-se după aproximativ 12 ore. De exemplu după 6 ore de monitorizare în timp real se observă că celulele netratate au acoperit aproximativ 40% din suprafața denudată inițială, față de 10% în cazul celor tratate (Fig. 3.1.41b).
Au fost analizate traiectoriile individuale ale keratinocitelor din frontul de migrare, aducându-se informații suplimentare legate de efectele asupra motilității celulare induse atât de tratamentul cu DHA, cât și de iradierea cu UVA, respectiv legate de efectele combinării factorilor. S-a observat pierderea direcționalității în migrare în cazul celulelor DOK tratate (Fig. 3.1.42c,d), în comparație cu cea prezentată de celulele netratate (Fig. 3.1.42a,b). Celulele DOK tratate (Fig. 3.1.42c,d) au avut o migrare relativ mai bine coordonată, iar în cazul celor iradiate cu UVA, traiectoriile descrise de majoritatea celulelor au fost relativ paralele între ele. Pierderea direcționalității de migrare a fost evidențiată și în cazul HaCaT, după tratament și iradiere (Fig. 3.1.43d). După aproximativ 6 ore, celulele din frontul de migrare au început să se deplaseze cu viteză mai mare în direcția acoperirii suprafeței denudate, însă mișcarea acestora nu a fost la fel de coordonată ca a celulelor HaCaT neiradiate (Fig. 3.1.43a,c).
3.2. Studiul acizilor grași din organe pe modele experimentale animale
3.2.1. Studiul acizilor grași din corduri de șoarece cu deficiență de exprimare a receptorului la SDF-1α
Studierea efectelor ischemiei și reperfuziei asupra miocardului își pătrează actualitatea în privința impactului asupra cunoașterii patologiilor cardiovasculare. Descifrarea la nivel celular și molecular a fenomenelor induse de evenimentele ischemice perimte să se identifice căi de protejare și regenerare a miocardului. Axa Cxcr4/SDF-1α mediază recrutarea de celule progenitoare în aria ischemică și promovează regenerarea miocardului.
Celulele progenitoare endoteliale (CPE) se mobilizează din măduva osoasă sub acțiunea unor fenomene precum ischemia și infarctul miocardic pentru a contribui la procesele reparatorii. Orice lezare a endoteliului are același efect asupra CPE. Modelele animale experimentale au elucidat multe din aspectele legate de mobilizarea și recrutarea CPE. În timpul mobilizării, celulele progenitoare de la nivelul măduvei hematogene sunt mobilizate și trec prin nișa stromală, în capilarele sinusoide. Unul din cei mai importanți factori care determină mobilizarea celulelor stem progenitoare este o chemokina stromală (CXC), denumită SDF-1alfa (factorul 1 alfa- derivat din celule stromale, cu SDF de la Stromal cell-Derived Factor) sau CXCL12 (ligandul 12 al chemokinei), care se leagă de receptorul ei specific reprezentat de CXCR4. SDF-1 este exprimat pe suprafața celulelor stromale ale măduvei osoase, dar și de celulele endoteliale, celulele musculare netede lezate și trombocitele activate [156].
În mod normal, datorită expresiei ridicate a SDF-1 la nivelul celulelor stromale ale măduvei, se crează un gradient de concentrație a acestui factor între măduva hematogenă și țesuturile periferice, care însă se inversează în cusul ischemiei, hipoxiei și inflamației [157]. Trombocitele activate exprimă SDF-1 și sunt responsabile de recrutarea celulelor progenitoare circulante la locul injuriei vasculare asociate, cu formarea de trombuși albi plachetari.
În timpul ischemiei sau fenomenelor inflamatorii, mai mulți factori, printre care VEGF, eritropoetina și factorul de stimulare al coloniilor granulocitare (G-CSF), își exercită acțiunea mobilizatoare asupra celulelor stem hematopoetice prin intermediul SDF-1 [158-160]. Oxidul nitric a fost identificat drept factor important și specific pentru mobilizarea CPE, acționând tot prin intermediul SDF-1. De asemenea, SDF-1 induce eliberarea de NO la nivelul celulelor endoteliale, creând un „feedback” pozitiv, util pentru regenerarea vasculară [161-162]. Mobilizarea CPE la locul injuriei vasculare a fost redusă semnificativ în cazul studiilor cu șoareci „knock-out” pentru eNOS (nitric oxid sintază endotelială).
Clinic, SDF- 1, adică CXCL12 a fost descris ca o chemokină homeostatică și antiinflamatoare. Scăderea nivelului ei plasmatic se corelează cu prezența bolii coronariene instabile [163]. Expresia genei CXCL12 este în principal reglată de un factor de transcriptie-factorul 1 indus de hipoxie (HIF-1alfa). Pe lângă CXCL12/CXCR4, CPE exprimă și receptorul 2 al chemokinei (CXCR2) dar și liganzii (CXCL1, CXCL7) pentru acești receptori, eliberați în timpul inflamației dar și după injuria arterială și care pot ameliora repararea endotelială.
Având în vedere că interacțiunea SDF-1/CXCR4 este exploatată din ce în ce mai mult în vederea terapiei cu celule stem după infarct miocardic, într-o colaborare cu colectivul coordonat de Dr. Elisa Liehn de la „Institute of Molecular Cardiovascular Research”, din Achen, unde pe un model experimental de șoarece transgenic (CXCR4+/-) au fost observate acumulari lipidice în cardiomiocite cu aspecte morfologice diterite de cele din șoarecii control (Fig. 3.2.1), am propus investigarea tipurilor de acizi grași din extractul lipidic de miocard. Din extractul lipidic au fost separate prin HPLC diferitele tipuri de lipide (Fig. 3.2.2), care au fost analizate în laboratorul nostru pentru tipurile de acizi grași.
Analiza efectuată pentru conținutul de acizi grași în fracțiunea trigliceridică a avut ca scop explicarea aspectului mai electronoopac al incluziunilor lipidice în cardiomiocitele șoarecilor transgenici (Fig. 3.2.1). Cordurile animalelor heterozigote au prezentat o mai accentuată acumulare de picături lipidice în cardiomiocite așa cum se evidențiază prin microscopie electronică (Fig. 3.2.1). Mai mult, osmiofilia acestor incluziuni lipidice este semnificativ mai accentuată față de cea prezentată de incluziunile din cardiomiocitele animalelor normale. În miocardul șoarecilor heterozigoți, picăturile lipidice prezintă un conținut mai ridicat de acizi grași nesaturați (cu ~10%), dar și o diversitate semnificativ mai mare de tipuri de acizi grași nesaturați (șase tipuri care nu apar în miocardul șoarecilor normali: C16:1, C18:3n6, C20:1, C20:3n6, C22:1n9 și C22:2) (Fig. 3.2.3).
(A) (B)
Fig. 3.2.1. Aspectul în microscopie electronică al miocardului de șoarece. (A) miocardul de șoarece normal. (B) miocardul de șoarece CxcR4+/-. Numărul de incluziuni (cap de săgeată magenta) este evident crescut în miocardul de șoarece transgenic. În inserturi aspectul incluziunilor lipidice în cardiomiocitele corespunzătoare. (Imagini prezentate cu acordul Dr. Elisa Liehn.)
Fig. 3.2.2. Separarea prin HPLC a tipurilor de lipide din extractele miocardice. (A) cromatograma probelor obținute din șoareci normali. (B) cromatograma probelor obținute din șoareci CxcR4+/- Sunt rezolvate trigliceridele, fosfatidiletanolaminele, fosfatidilserinele și fosfatidilcolinele. (Rezultate prezentate cu acordul Dr. Elisa Liehn.)
În concluzie, deficiența în exprimarea receptorului la SDF-1α induce o acumulare sporită de acizi grași nesaturați în incluziunile lipidice din cardiomiocite față de miocardul normal. Această acumulare sporită de acizi grași nesaturați explică osmiofilia mai accentuată a picăturilor lipidice la șoarecii heterozigoți în comparație cu cele din miocardul normal [164].
Fig. 3.2.3. Identificarea prin GC a tipurilor de acizi grași în fracțiunea trigliceridică a lipidelor extrase din miocadrul de șoarece. (A) Acizii grași din trigliceridele miocardului de șoarece normal. (B) Acizii grași din trigliceridele șoarecilor heterozigoți. Analiza cantitativă a indicat o creștere a acizilor grași nesaturați cu ~10% la șoarecii heterozigoți față de normali (76,77 ± 4,86 vs. 66,05±14,75).
3.2.2. Studiul acizilor grași din organe de șoarece tratat cu fosfatidilserine
Bolile cardiovasculare reprezintă principala cauză a mortalității din întreaga lume, iar una dintre manifestările clinice cele mai importante ale acestora o reprezintă boala cardiacă ischemică. Această condiție patologică a inimii este caracterizată prin reducerea fluxului coronarian într-o anumită regiune a inimii, ceea ce are ca rezultat apariția infarctului miocardic, reprezentat de necroza datorată ischemiei cardiace. Prezervarea viabilității miocardului ischemic a devenit astăzi o țintă terapeutică majoră. Precondiționarea ischemică, care oferă unul din mecanismele de protecție a miocardului ischemic, a fost dovedită în ultimele două decenii, în numeroase studii experimentale și clinice, ca având un efect protector. Ea constă în faptul că episoade scurte de ischemie miocardică protejează miocardul de efectele nedorite ale episoadelor ischemice ulterioare, chiar dacă sunt de mai lungă durată. Efectul protector al precondiționării ischemice constă în diminuarea consecințelor ischemiei de tipul tulburărilor metabolice, necrozei, tulburărilor electrofiziologice, scăderii performanței cardiace, durerii, tulburărilor de ritm, disfuncției endoteliale, efectelor adverse ale reperfuziei. Efectele protectoare ale precondiționării se manifestă doar în cazul ocluziilor coronariene urmate de reperfuzie, sau a ischemiilor coronariene tranzitorii [165]. Precondiționarea ischemică crește rezistența miocardului la ischemie, permițând un timp mai lung pentru intervențiile terapeutice antiischemice. În ocluziile coronariene definitive sau în ischemia permanentă severă, precondiționarea ischemică este ineficientă și nu asigură protecția miocardului ischemic [166]. De aceea există o preocupare pentru identificarea unor alte modalități de asigurare a protecției și, eventual, rezistenței miocardului la fenomene ischemice mai grave.
Fosfatidilserina este un fosfolipid ce se găsește, în condiții normale, în foița internă a bistratului membranei celulare. Translocarea fosfatidilserinelor în foița externă a bistratului membranar reprezintă primele semne ale intrării celulei în procese apoptotice sau necrotice [167-168]. Externalizarea fosfatidilserinelor este un fenomen întâlnit în ischemia și reperfuzia miocardică [169-170]. Rezultate prezentate în această secțiune sunt realizate în urma unui studiu ce este în desfășurare și se realizează în colaborare cu același colectiv coordonat de Dr. Elisa Liehn de la „Institute of Molecular Cardiovascular Research”, din Aachen. Experimentele își propun să urmărească efectul administrării orale de fosfatidilserine asupra miocardului de șoarece în ischemie. Totodată, a fost investigat efectul administrării de fosfatidilserine asupra lipidelor celulare din diferite organe cu scopul evidențiierii eventualelor modificări metabolice la nivelul acestora care ar putea conduce la efecte adverse. Soarecii tratați cu fosfatidilserine 5 g/g, timp de 4 zile și șoarecii control (trei control și trei tratați), au fost sacrificați, recoltându-se cordurile și rinichii acestora. Lipidele extrase din organe au fost separate prin HPLC (Fig. 3.2.4, Fig. 3.2.5).
Fig. 3.2.4. Separarea prin HPLC a tipurilor de lipide din extractele miocardice: cromatograma probelor obținute din șoareci normali (sus) și cromatograma probelor obținute din șoareci tratați cu fosfatidilserinele. Sunt rezolvate trigliceridele, fosfatidiletanolaminele, fosfatidil inozitolii, acizii fosfatidici, cardiolipinele, fosfatidilserinele, fosfatidilcolinele și lisofosfatidilcolinele.
Fig. 3.2.5. Separarea prin HPLC a tipurilor de lipide extrase din rinichi: cromatograma probelor obținute din șoareci normali (sus) și cromatograma probelor obținute din șoareci tratați cu fosfatidilserinele. Sunt rezolvate trigliceridele, fosfatidiletanolaminele, fosfatidilcolinele și lisofosfatidilcolinele.
Din experimentele realizate până în momentul de față nu au fost observate diferențe majore în tipurile de fosfolipide separate din cordurile șoarecilor tratați cu fosfatidilserine față de cei netratați (Fig. 3.2.6), sau a lipidelor separate din rinichii șoarecilor cărora le-a fost administrate fosfatidilserine față de cei control (Fig. 3.2.7).
Fig. 3.2.6. Variația tipurilor de fosfolipide din lipidele extractelor miocardice de șoareci tratați cu fosfatidilserine (PS+) și din cei netratați (PS-).
Fig. 3.2.7. Variația tipurilor de fosfolipide din lipidele extrase din rinichii șoarecilor tratați cu fosfatidilserine (PS+) și celor netratați (PS-).
Fracțiunile lipidice obținute prin HPLC au fost investigate prin gaz-cromatografie pentru identificarea tipurilor de acizi grași din lipidele extrase din miocard (Fig. 3.2.8, Fig. 3.2.9), respectiv din rinichi (Fig. 3.2.10, Fig. 3.2.11).
Din cromatogramele obținute pentru deterninerea tipurilor de acizi grași din fosfolipidele separate nu s-au observat diferențe semnificative ale acizilor grași din cordurile și rinichii șoarecilor tratați cu fosfatidilserine față de cei control.
În urma experimentelor realizate nu se evidențiază eventuale modificări metabolice la nivelul lipidelor extrase din organele șoarecilor tratați cu fosfatidilserine, deoarece nu se observă modificări semnificative, atât în cazul tipurilor de fosfolipide, cât și în cazul acizilor grași din lipidele extrase din cordurile și rinichii șoarecilor tratați.
Fig. 3.2.8. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din fracțiunea de fosfatidiletanolamine a lipidelor extrase din miocadrul de șoareci normali.
Fig. 3.2.9. Conținutul în acizi grași din fracțiunea de fosfatidiletanolamine a lipidelor extrase din miocadrul de șoareci tratați cu fosfatidilserine.
Fig. 3.2.10. Aspectul cromatogramei pentru acizii grași din fracțiunea de fosfatidiletanolamine a lipidelor extrase din rinichii de șoareci normali.
Fig. 3.2.11. Cromatogramei reprezentând conținutul în acizi grași din fracțiunea de fosfatidiletanolamine a lipidelor extrase din rinichii de șoareci tratați cu fosfatidilserine.
Concluzii:
Activitatea celulară este influențată semnificativ de comportamentul membranei. Funcționarea membranei poate fi modulată de proprietățile bistratului lipidic, acestea fiind dependente și de tipurile de acizi grași din compoziția lipidelor. Au fost descrise în multe patologii dereglări în raportul dintre tipurile de acizi grași (saturați/nesaturați). Acest lucru a determinat interesul actual pentru investigarea compoziției în acizi grași a lipidelor membranare ca posibilă țintă terapeutică. Studiile prezentate în această lucrare se referă la analiza acizilor grași din lipidele celulare, permițând caracterizarea unor tipuri celulare sub astectul conținutului de acizi grași și al raportului de acizi grași saturați/acizi grași nesaturați. Pentru sporirea cunoașterii în acest domeniu am realizat experimente, atât pe diverse tipuri de celule (normale și tumorale) cât și pe organe de șoareci.
În cadrul tezei s-a dezvoltat o metoda eficace si reproductibilă de identificare a acizilor grași din lipidele celulelor în cultură prin gaz cromatografie, această metodă fiind aleasă deoarece este rapidă, având o rezoluție și o sensibilitate înalte. Acizii grași identificați, cât și cantitatea procentuală din fiecare acid gras conținut diferă în funcție de tipul de celule analizate, compoziția în acizi grași a lipidelor celulare modificându-se în timpul dezvoltării culturii celulare.
Tratamentul celulelor tumorale cu DHA a determinat modificări la nivelul acizilor grași din lipidele celulare. La celulele HeLa și MCF-7 tratamentul induce o creștere a procentului de acizi grași saturați, pe când la celulele DU145 induce o scădere a acestora. La toate cele trei tipuri celulare investigate, procentul de acizi grași mononesaturați scade. Procentul de acizi grași polinesaturați crește la celulele HeLa și DU145, ca urmare a tratamentului cu DHA, în timp ce pentru celulele MCF-7 nu se constată modificări.
Tratamentul celulelor MCF7 cu DHA 100 M a determinat modificări la nivel comportamental, morfologic și biochimic. Linia celulară MCF-7 utilizată reprezintă un fenotip care nu sintetizează caspaza 3, astfel încât apoptoza nu poate fi indusă în acest caz. Prin urmare, a fost aleasă linia MCF-7 pentru studierea consecințelor tratamentului cu DHA la concentrația 100 M.
Au fost evidențiate modificări la nivelul raportului acizi grași saturați/acizi grași nesaturați induse de tratamentul celulelor MCF7 cu DHA. DHA determină, în celulele MCF7, o reducere a conținutului de acid oleic (acid gras mononesaturat crescut în celulele canceroase), concomitent cu o creștere a acidului palmitic, acid gras saturat.
Reducerea nivelului de acid oleic după tratarea celulelor MCF7 cu DHA nu se datorează unor eventuale modificări de exprimare a SCD1.
Tratamentul celulelor MCF-7 cu DHA afectează conținutul în acizi grași al lipidelor celulare pe lizat total și diferențiat pe fracțiunile celulare investigate. Acidul stearic prezintă creștere numai în fracțiunea plasmalemală. Acidul palmitoleic este detectat numai în fracțiunea plasmalemală, unde scade ca urmare a tratamentului cu DHA.
Celulele MCF-7 încep să acumuleze depozite de lipide foarte repede după inceperea tratamentului cu DHA. Numărul și dimensiunea depozitelor de lipide în citoplasmă crește semnificativ odată cu timpul de tratament la care sunt supuse celulele.
DHA a indus scăderea semnificativă a capacității proliferative a celulelor MCF7.
Monitorizarea prin videomicroscopie în timp real a permis evidențierea faptului că tratamentul cu DHA determină o aderare și etalare pe colagen mai rapidă a celulelor MCF7. Efecte mai mici au fost înregistrate în ceea ce privește motilitatea celulară examinată atât sub aspectul vitezei de migrare, cât și al direcționalității de mișcare. Tratamentul cu DHA a dovedit că poate afecta și capacitatea invazivă a celulelor MCF7.
Tratamentul cu DHA, respectiv expunerea la UVA în model experimental separat afectează reversibil conținutul în acizi grași al lipidelor celulare la keratinoceiele displazice (DOK), respectiv normale (HaCaT).Tratamentul concertat DHA+UVA păstrează efectele induse de DHA asupra compoziției lipidelor celulare în acizi grași.
Experimentele destinate investigării efectelor concertate ale DHA și UVA păstrează modificările induse de DHA asupra compoziției lipidelor celulare în acizi grași.
Efectele induse de UVA asupra proliferării și motilității celulare sunt reversate de DHA, în condițiile noastre experimentale, așa cum se dovedește prin tratamentul și expunere concertate.
Rezultatele obținute prin modelul nostru experimental sugerează un efect protector indus de DHA, împotriva iradierii cu UVA pe keratinocite.
Deficiența în exprimarea receptorului la SDF-1α induce o acumulare sporită de acizi grași nesaturați în incluziunile lipidice din cardiomiocite față de miocardul normal. Această acumulare sporită de acizi grași nesaturați explică osmiofilia mai accentuată a picăturilor lipidice la șoarecii heterozigoți în comparație cu cele din miocardul normal.
Pornind de la ipoteza că modularea compoziției în acizi grași a lipidelor celulare afecteză metabolismul celular, în prezenta lucrare de doctorat am arătat că suplimentarea mediului de creștere al celulelor cu acizi grași polinesaturați a adus schimbări la nivel comportamental, morfologic și biochimic. Tratamentul cu DHA, în cazul celulelor tumorale MCF7, a indus revenirea lor către comportamentul celulelor normale ale celulelor epiteliale secretorii din sân. Deasemenea, tratamentul cu DHA a avut un efect protector împotriva iradierii cu UVA pe keratinocite. O direcție interesantă de investigat în continuare ar fi dacă modificările morfologice observate sunt datorate unei reale diferențieri a celulelor canceroase către celulele normale, sau tratamentul cu DHA doar conferă unele caracteristici similare cu celulele normale fără a corecta comportamentul tumoral.
Bibliografie generală
Leabu M, Nechifor MT. Biomembranele, unitate în diversitate, vol. I Editura Medicală Amaltea, 2014.
Alberts, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. Molecular biology of the cell, Garland Publishing Inc, & , 2002 (ed. a IV-a).
Lehninger AL. Biochimie, Editura Tehnică București, 1987.
Voiculeț N, Puiu L. Biologia moleculară a celulei, Edit. ALL, București, 1997.
Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Molecular cell biology ,W.H. Freeman and Company, New York,2000 (ediția a IVa).
RK, Granner DK, Mazers PA, Rodwell VW. Harper´s Biochemistry, Appleton & Lange, 1993.
Medvedovici A, Tache F. Noțiuni fundamentale și mărimi caracteristice în cromatografie, Edit. Universității din București, 1997.
The Structure of Biological Membranes, CRC Press, 2005.
Christie WW. Gas Chromatography and Lipids , Oily Press, Bridgwater, 1989.
Bibliografie specifică
1. Barnett RE, Furcht LT, Scott RE. Differences in membrane fluidity and structure in contact-inhibited and transformed cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1974, 71: 1992-4.
2. Spector AA, Burns CP. Biological and therapeutic potential of membrane lipid modification in tumors. Cancer Res. 1987, 47: 4529-37.
3. Singer SJ, Nicolson GL. The fluid mosaic model of cell membranes, Science, 1972, 175: 720-731.
4. Yang L, et al. New phases of phospholipids and inplications to the membrane fusion problem, Biochemistry, 2003, 42: 6631-6635.
5. Haucke V, Di Paolo G. Lipids and lipid modifications in the regulation of membrane traffic, Ceel Biology, 2007, 19:426-435.
6. Van Meer G, Sprong H. Membrane lipids and vesicular traffic, Cuur. Opin. Ceel. Biol., 2004, 8:241-246.
7. Fourcade O, Simon MF. Phospholipases A2 et pathologie inflammatoire: consensus et nouveaux concepts, Synthese, 1995, 12: 323-332.
8. Nigam S, Schewe T. Phospholipase A2 and lipid peroxidation, Molecular and Cell Biology of Lipids, 2000, 1488: 167-181.
9. Fauti T.et al. Induction of PPAR band prostacyclin (PGI2) synthesis by Raf signaling: failure of PGI2 to activate PPARb. FEBS J., 2005, 273, 170–179.
10. YuK, Bayona W, Kallen CB, Harding HP, Ravera CP, McMahon G, Brown M& Lazar MA, Differential activation of peroxisome proliferator-activated receptors by eicosanoids. J Biol Chem, 1995, 270, 23975–23983.
11. Kim DJ, , Billin AN, Willson TM, Gonzalez FJ & Peters JM, PPARbeta/delta selectively induces differentiation and inhibits cell proliferation. Cell Death Differ, 2005, doi:10.1038/sj.cdd.4401713.
12. Gupta RA, Tan J, Krause WF, Geraci MW, Willson TM, Dey SK & DuBois RN, Prostacyclinmediated activation of peroxisome proliferator-activated receptor delta in colorectal cancer. Proc Natl 97, 13275–13280.
13. Kim DJ, , Burns AM, Gonzalez FJ, Perdew GH & Peters JM, Peroxisome proliferator-activated receptor-beta ⁄ delta inhibits epidermal cell proliferation by down-regulation of kinase activity. J Biol Chem, 2005, 280, 9519–9527.
14. Fourcade O, Simon MF. Secretory phospholipase A2 generates de novel lipid mediator lysophosphatidic acid in membrane microvesicles shed from activated cells, Cell.,1995, 80: 919-27.
15. Elliott SJ, Meszaros G, Schilling WP. Effect of oxidant stress on calcium signaling in vascular endothelial cells, Free Rad Biol Med, 1992, 13, 635-650.
16. Leslie CC. Properties and regulation of cytosolic phospholipase A2, J Biol Chem, 1997, 272, 16709-16712.
17. Gopalakrishna R, Anderson B. Ca2+-and phospholipid independent activation of protein kinase C by selective oxidative modification of the regulatory domain, Proc Natl Acad Sci USA,1989, 86: 6758-6762.
18. Guy GR, J, Ng S, Tan YH. Inactivation of a redox-sensitive protein phosphatase during the early events of tumor necrosis factor/interleukin-1 signal transduction, J Biol Chem, 1993, 268: 2141-2148.
19. Prades J, Et al. Effect of unsaturated fatty acids and tricylglycerols on phosphatidylethanolamine membrane structure, J. Lipid Res., 2003.
20. Escriba PV. Membrane – lipid therapy: a new approch in molecular medicine, Trends in Molecular Medicine, 2006, vol. 12, nr.1.
21. Spector AA, Yorek MA. Membrane lipid composition and cellular function, Journal of Lipid Research Volume 26, 1985, 26:1015-1035.
22. Yerram NR, Moore SA, Spector AA. Eicosapentaenoic acid metabolism in brain microvessel endothelium: effect on prostaglandin form at ion, Journal of Lipid Research Volume 30, 1989, 30: 1747-1757.
23. Robins SJ. Cardiovascular diseasse with diabetes or the metabolic syndrome: should statins or fibrates be first line lipid theraphy?, Curr. Opin. Lipidol., 2003.
24. Mikirova N, Et al. Erythrocyte membrane fatty acid composition in cancer patients, R.P. Health Sci. J., 2004, 23:2270-2273.
25. Crook T, Et al. Effects of phosphatidylserine in Alzheimer´s diseasse, Psychopharmacol. Bull., 1992, 28: 61-66.
26. Simopoulos AP. Omega-3 faty acids in inflammation and autoimmune disseases, J.Am. Coll. Nutr., 2002, 21: 495-505.
27. Ruggieri S, Mugnai G, Mannini A, Calorini L, Fallani A, Barletta E, Mannori G, Cecconi O. Lipid characteristics in metastatic cells, Clinical & Experimental Metastasis, 1999, 17: 271-279.
28. Montaudon D, Louis JC, Robert J. Phospholipid acyl group composition in normal and tumoral nerve cells in culture, Lipids, 1981, 16: 293-7.
29. Hakomori S. Glycosphyngolipids in cellular interaction, differentiation, and oncogenesis, Annu Rev Biochem, 1981, 417: 56-89.
30. Sandermann H. Regulation of membrane enzymes by lipids, Biochim Biophys Acta, 1978, 515: 209-37.
31. Shinitzky M. Membrane fluidity in malignancy. Adversative and recuperative, Biochim Biophys Acta, 1984, 738(4): 251-61.
32. Castagnet PI, Golovko MY, Barcelo-Coblijn GC, Nussbaum RL, Murphy EJ. Fatty acid incorporation is decreased in astrocytes cultured from α-synuclein geneablated mice., J. Neurochem, 2005, 94: 839-849.
33. Wijendran V, Hayes KC. Dietary n-6 and n-3 fatty acid balance and cardiovascular health. Annu Rev Nutr 2004, 24:597-615.
34. Brenna JT. Efficiency of conversion of alpha-linolenic acid to long chain n-3 fatty acids in man. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2002, 5(2):127-132.
35. Brenna JT, Salem N Jr, Sinclair AJ, Cunnane SC. alpha-Linolenic acid supplementation and conversion to n-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in humans. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2009, 80(2–3):85-91.
36. SanGiovanni JP, Chew EY. The role of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog Retin Eye Res 2005, 24(1):87-138.
37. Litman BJ, Niu SL, Polozova A, Mitchell DC. The role of docosahexaenoic acid containing phospholipids in modulating G protein-coupled signaling pathways: visual transduction. J Mol Neurosci 2001, 16(2–3):237-242.
38. Birch EE, S, Hoffman DR, Uauy R, Birch DG. A randomized controlled trial of early dietary supply of long-chain polyunsaturated fatty acids and mental development in term infants. Dev Med Child Neurol 2000, 42(3):174-181.
39. Salem N Jr, Litman B, Kim HY, Gawrisch K. Mechanisms of action of docosahexaenoic acid in the nervous system. Lipids 2001, 36(9):945-959.
40. Welch AA, Lund E, Amiano P, Dorronsoro M. Variability in fish consumption in 10 European countries. IARC Sci Publ 2002, 156:221-222.
41. Muthayya S, Dwarkanath P, Thomas T, Ramprakash S, Mehra R, Mhaskar A, Mhaskar R, Thomas A, Bhat S, et al. The effect of fish and omega-3 LCPUFA intake on low birth weight in Indian pregnant women. Eur J Clin Nutr 2009, 63(3):340-346.
42. Menotti A, Kromhout D, Blackburn H, Fidanza F, Buzina R, Nissinen A. Food intake patterns and 25-year mortality from coronary heart disease: cross-cultural correlations in the Seven Countries Study. The Seven Countries Study Research Group. Eur J Epidemiol 1999, 15(6):507-515.
43. Misra A, Khurana L, Isharwal S, Bhardwaj S. South Asian diets and insulin resistance. Br J Nutr 2009, 101(4):465-473.
44. Caygill CP, Charlett A, Hill MJ. Fat, fish, fish oil and cancer. Br J Cancer 1996, 74(1):159-164.
45. Kuriki K, Hirose K, Wakai K, Matsuo K, Ito H, Suzuki T, Hiraki A, Saito T, Iwata H, et al. Breast cancer risk and erythrocyte compositions of n-3 highly unsaturated fatty acids in Japanese. Int J Cancer 2007, 121(2):377-385.
46. Das UN. Tumoricidal action of cis-unsaturated fatty acids and their relationship to free radicals and lipid peroxidation. Cancer Lett 1991, 56:235-243.
47. Sangeetha P, Das UN. Cytotoxic action of cis-unsaturated fatty acids on human cervical carcinoma (HeLa) cells in vitro. Prostaglandins Leukot Essen Fatty Acids 1995, 53:287-299.
48. Begin ME, Ell G, Das UN, Horrobin DF. Differential killing of human carcinoma cells supplemented with n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. J Natl Cancer Inst 1986, 77:1053-1062.
49. Sagar PS, Das UN, Koratkar R, Ramesh G, Padma M, Kumar GS. Cytotoxic action of cis-unsaturated fatty acids on human cervical carcinoma (HeLa) cells: Relationship to free radicals, and lipid peroxidation and its modulation by calmodulin antagonists. Cancer Lett 1992, 63:189-198.
50. Kumar SG, Das UN. Free radical dependent suppression of mouse myeloma cells by alpha-linolenic and eicosapentaenoic acids in vitro. Cancer Lett 1995, 92:27-38.
51. Solomon LZ, AM, Hayes MC, Bass PS, Birch BR, Cooper AJ. Is gamma-linolenic acid an effective intravesical agent for superficial bladder cancer? In vitro cytotoxicity and in vivo tolerance studies. Urol Res 1998, 26:11-15.
52. Menéndez JA, Ropero S, del Barbacid MM, Montero S, Solanas M, Escrich E, Cortés-Funes H, Colomer R. Synergistic interaction between vinorelbine and gamma-linolenic acid in breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2002, 72:203-219.
53. Kafrawy O, Zerouga M, Stillwell W, Jenski LJ. Docosahexaenoic acid in phosphatidylcholine mediates cytotoxicity more effectively than other omega-3 and omega-6 fatty acids. Cancer Lett 1998, 132:23-29.
54. Ge H, Kong X, Shi L, Hou L, Liu Z, Li P. Gamma-linolenic acid induces apoptosis and lipid peroxidation in human chronic myelogenous leukemia K562 cells. Cell Biol Int 2009, 33:402-410.
55. Toit-Kohn JL, Louw L, Engelbrecht AM. Docosahexaenoic acid induces apoptosis in colorectal carcinoma cells by modulating the PI3 kinase and p38 MAPK pathways. J Nutr Biochem 2009, 20:106-114.
56. Begin ME, Das UN, Ells G. Cytotoxic effects of essential fatty acids (EFA) in mixed cultures of normal and malignant human cells. Prog Lipid Res 1986, 25:573-576.
57. 12. Das UN. Essential fatty acids, lipid peroxidation and apoptosis. Prostaglandins Leukot Essen Fatty Acids 1999, 61:157-163.
58. Das UN, Madhavi N. Effect of polyunsaturated fatty acids on drugsensitive and resistant tumor cells in vitro. Lipids in Health and Disease 2011, 10:159,
59. Sangeetha P, Das UN. Gamma-linolenic acid and eicosapentaenoic acid potentiate the cytotoxicity of anti-cancer drugs on human cervical carcinoma (HeLa) cells in vitro. Med Sci Res 1993, 21:457-459.
60. Menendez JA, Ropero S, del Barbacid MM, et al. Synergistic interaction between vinorelbine and gamma-linolenic acid in breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2002, 72:203-219.
61. Hernandez M, Bayon Y, Sanchez Crespo M, Nieto ML. Signaling mechanisms involved in the activation of arachidonic acid metabolism in human astrocytoma cells by tumor necrosis factor-alpha: phosphorylation of cytosolic phospholipase A2 and transactivation of cyclo-oxygenase-2. J Neurochem 1999, 73:1641-1649.
, Krokan HE. Cell-specific enhancement of doxorubicin toxicity in human tumour cells by docosahexaenoic acid. Anticancer Res 2001, 21:29-38.
63. Rose DP, Connolly JM. Effects of fatty acids and eicosanoid synthesis inhibitors on the growth of two human prostate cancer cell lines. Prostate 1991, 18(3):243-254.
64. Chung BH, Mitchell SH, Zhang JS, Young CY. Effects of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid on androgen-mediated cell growth and gene expression in LNCaP prostate cancer cells. Carcinogenesis 2001, 22(8):1201-1206.
65. Narayanan NK, Narayanan BA, Reddy BS. A combination of docosahexaenoic acid and celecoxib prevents prostate cancer cell growth in vitro and is associated with modulation of nuclear factor-kappaB, and steroid hormone receptors. Int J Oncol 2005, 26(3):785-792.
66. Narayanan NK, Narayanan BA, Bosland M, Condon MS, Nargi D. Docosahexaenoic acid in combination with celecoxib modulates HSP70 and p53 proteins in prostate cancer cells. Int J Cancer 2006, 119(7):1586-1598.
67. , Lim D, Erickson KL. Alteration of murine mammary tumorigenesis by dietary enrichment with n-3 fatty acids in fish oil. Cancer Lett 1998, 124(1):1-7.
68. Rose DP, Connolly JM. Effects of dietary omega-3 fatty acids on human breast cancer growth and metastases in nude mice. J Natl Cancer Inst 1993, 85(21):1743-1747.
69. Rose DP, Connolly JM, Rayburn J, Coleman M. Influence of diets containing eicosapentaenoic or docosahexaenoic acid on growth and metastasis of breast cancer cells in nude mice. J Natl Cancer Inst 1995, 87(8):587-592.
70. Hardman WE, Avula CP, Fernandes G, Cameron IL. Three percent dietary fish oil concentrate increased efficacy of doxorubicin against MDA-MB 231 breast cancer xenografts. Clin Cancer Res 2001, 7(7):2041-2049.
71. Shao Y, Pardini L, Pardini RS. Dietary menhaden oil enhances mitomycin C antitumor activity toward human mammary carcinoma MX-1. Lipids 1995, 30(11):1035-1045.
72. Chamras H, Ardashian A, Heber D, Glaspy JA. Fatty acid modulation of MCF-7 human breast cancer cell proliferation, apoptosis and differentiation. J Nutr Biochem 2002, 13(12):711-716.
73. Menendez JA, Mehmi I, Verma VA, Teng PK, Lupu R. Pharmacological inhibition of fatty acid synthase (FAS): a novel therapeutic approach for breast cancer chemoprevention through its ability to suppress Her-2/neu (erbB-2) oncogene-induced malignant transformation. Mol Carcinog 2004, 41(3):164-178.
74. Hunt DA, Lane HM, Zygmont ME, Dervan PA, Hennigar RA. MRNA stability and overexpression of fatty acid synthase in human breast cancer cell lines. Anticancer Res 2007, 27(1A):27-34.
75. Menendez JA, Vazquez-Martin A, Ropero S, Colomer R, Lupu R. HER2 (erbB-2)-targeted effects of the omega-3 polyunsaturated fatty acid, alpha-linolenic acid (ALA; 18:3n-3), in breast cancer cells: the "fat features" of the "Mediterranean diet" as an "anti-HER2 cocktail". Clin Transl Oncol 2006, 8(11):812-820.
76. Couet C, Delarue J, Ritz P, Antoine JM, Lamisse F. Effect of dietary fish oil on body fat mass and basal fat oxidation in healthy adults. Int J Obes Relat Metab Disord 1997, 21(8):637-643.
77. Jones PJ, Schoeller DA. Polyunsaturated:saturated ratio of diet fat influences energy substrate utilization in the human. Metabolism 1988, 37(2):145-151.
78. Mori Y, Murakawa Y, Katoh S, Hata S, Yokoyama J, Tajima N, Ikeda Y, Nobukata H, Ishikawa T, Shibutani Y. Influence of highly purified eicosapentaenoic acid ethyl ester on insulin resistance in the Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rat, a model of spontaneous non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism 1997, 46(12):1458-1464.
79. Mori Y, Murakawa Y, Yokoyama J, Tajima N, Ikeda Y, Nobukata H, Ishikawa T, Shibutani Y. Effect of highly purified eicosapentaenoic acid ethyl ester on insulin resistance and hypertension in Dahl salt-sensitive rats. Metabolism 1999, 48(9):1089-1095.
80. Nobukata H, Ishikawa T, Obata M, Shibutani Y. Long-term administration of highly purified eicosapentaenoic acid ethyl ester prevents diabetes and abnormalities of blood coagulation in male WBN/Kob rats. Metabolism 2000, 49(7):912-919.
81. Ikemoto S, Takahashi M, Tsunoda N, Maruyama K, Itakura H, Ezaki O. High-fat diet-induced hyperglycemia and obesity in mice: differential effects of dietary oils. Metabolism 1996, 45(12):1539-1546.
82. Brady LM, Lovegrove SS, Lesauvage SV, Gower BA, Minihane AM, Williams CM, Lovegrove JA. Increased n-6 polyunsaturated fatty acids do not attenuate the effects of long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids on insulin sensitivity or triacylglycerol reduction in Indian Asians. Am J Clin Nutr 2004, 79(6):983-991.
83. Lovegrove JA, Lovegrove SS, Lesauvage SV, Brady LM, Saini N, Minihane AM, Williams CM. Moderate fish-oil supplementation reverses low-platelet, long-chain n-3 polyunsaturated fatty acid status and reduces plasma triacylglycerol concentrations in British Indo-Asians. Am J Clin Nutr 2004, 79(6):974-982.
84. Minihane AM, Khan S, Leigh-Firbank EC, Talmud P, Wright JW, Murphy MC, Griffin BA, Williams CM. ApoE polymorphism and fish oil supplementation in subjects with an atherogenic lipoprotein phenotype. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000, 20(8):1990-1997.
85. Psota TL, Gebauer SK, Kris-Etherton P. Dietary omega-3 fatty acid intake and cardiovascular risk. Am J Cardiol 2006, 98(4A):3i-18i.
86. Roche HM, Gibney MJ. Effect of long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids on fasting and postprandial triacylglycerol metabolism. Am J Clin Nutr 2000, 71(1 Suppl):232S-237S.
87. Sinclair AJ, ttar-Bashi NM, Li D. What is the role of alpha-linolenic acid for mammals? Lipids 2002, 37(12):1113-1123.
88. 192. Balk EM, Lichtenstein AH, Chung M, Kupelnick B, Chew P, Lau J. Effects of omega-3 fatty acids on serum markers of cardiovascular disease risk: a systematic review. Atherosclerosis 2006, 189(1):19-30.
89. Calder PC. Polyunsaturated fatty acids and inflammation. Biochem Soc Trans 2005, 33, 423–427.
90. Calder PC. Polyunsaturated fatty acids, inflammatory processes and inflammatory bowel diseases. Mol Nutr Food Res 2008, 52, 885–897.
91. Calon F, Cole G. Neuroprotective action of omega-3 polyunsaturated fatty acids against neurodegenerative diseases: evidence from animal studies. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2007, 77, 287–293.
92. Schumann J, Leichtle A, Thiery J, Fuhrmann H. Fatty Acid and Peptide Profiles in Plasma Membrane and Membrane Rafts of PUFA Supplemented RAW264.7 Macrophages, 2011, PLoS ONE 6(8): e24066.
93. Huster D, Jin AJ, Arnold K, Gawrisch K. Water permeability of polyunsaturated lipid membranes measured by O-17 NMR. Biophysical Journal, 1997, 73: 855–864.
94. Koenig BW, Strey HH, Gawrisch K. Membrane lateral compressibility determined by NMR and x-ray diffraction: effect of acyl chain polyunsaturation. Biophys J, 1997, 73: 1954–1966.
95. Smaby JM, Momsen MM, Brockman HL, Brown RE. Phosphatidylcholine acyl unsaturation modulates the decrease in interfacial elasticity induced by cholesterol. Biophys J, 1997, 73: 1492–1505.
96. Lipid polymorphism and protein-lipid interactions. Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1376: 353–368.
97. Williams EE, Jenski LJ, Stillwell W. Docosahexaenoic acid (DHA) alters the structure and composition of membranous vesicles exfoliated from the surface of a murine leukemia cell line. Biochim.Biophys.Acta, 1998, 1371: 351–362.
98. Stillwell W, Wassall SR. Docosahexaenoic acid: membrane properties of a unique fatty acid. Chem.Phys.Lipids, 2003, 126: 1–27.
99. Armstrong VT, Brzustowicz MR, Wassall SR, Jenski LJ, Stillwell W. Rapid flip-flop in polyunsaturated (docosahexaenoate) phospholipid membranes. Arch Biochem. Biophys, 2003, 414: 74–82.
100. Stubbs CD, Smith AD. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim Biophys Acta 1984; 779:89 –137.
101. Onuki Y, Morishita M, Chiba Y, Tokiwa S, Takayama K. Docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid induce changes in the physical properties of a lipid bilayer model membrane. Chem Pharm Bull (), 2006, 54(1), 68−71.
102. Ehringer W, Belcher D, Wassall SR, Stillwell W. A comparison of the effects of linolenic (18:3 omega 3) and docosahexaenoic (22:6 omega 3) acids on phospholipid bilayers. Chem Phys Lipids, 1990, 54(2), 79−88.
103. Vreugdenhil M, Bruehl C, Voskuyl RA, Kang JX, Leaf A, Wadman W. J. Polyunsaturated fatty acids modulate sodium and calcium currents in CA1 neurons. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(22), 12559−12563.
104. Xiao Y, Huang Y, Chen ZY. Distribution, depletion and recovery of docosahexaenoic acid are region-specific in rat brain. Br J Nutr, 2005, 94(4), 544−550.
105. Xiao YF, Gomez AM, Morgan JP, Lederer WJ, Leaf A. Suppression of voltage-gated L-type Ca2+ currents by polyunsaturated fatty acids in adult and neonatal rat ventricular myocytes. Proc Natl Acad Sci , 1997, 94(8), 4182−4187.
106. Xiao YF, Kang JX, Morgan JP, Leaf A. Blocking effects of polyunsaturated fatty acids on Na+channels of neonatal rat ventricularmyocytes. Proc Natl Acad Sci , 1995, 92(24), 11000−11004.
107. Xiao YF, Ke Q, Wang SY, Auktor K, Yang Y, Wang GK, et al. Single point mutations affect fatty acid block of human myocardial sodium channel alpha subunit Na+ channels. Proc Natl Acad Sci , 2001, 98(6), 3606−3611.
108. Xiao YF, Wright SN, Wang GK, Morgan JP, Leaf A. Fatty acids suppress voltage-gated Na+currents in HEK293t cells transfected with the alpha-subunit of the human cardiac Na+ channel. Proc Natl Acad Sci , 1998, 95(5), 2680−2685.
109. Xiao YF, Wright SN, Wang GK, Morgan JP, Leaf A. Coexpression with beta(1)-subunit modifies the kinetics and fatty acid block of hH1(alpha) Na(+) channels. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 279(1), H35−46.
110. Stulnig TM. Immunomodulation by polyunsaturated fatty acids: mechanisms and effects. Int. Arch. Allergy Immunol 2003;132:310–321.
111. Shaikh SR, Dumaual AC, Castillo A, et al. Oleic and docosahexaenoic acid differentially phase separate from lipid raft molecules: A comparative NMR, DSC, AFM, and detergent extraction study. Biophys. J 2004, 87:1752–1766.
112. Chen W, Jump DB, Esselman WJ, Busik JV. Inhibition of cytokine signaling in human retinal endothelial cells through modification of caveolae/lipid rafts by docosahexaenoic acid. Invest. Opthalmol. Vis. Sci 2007, 48:18–26.
113. Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, Lupton JR. Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fatty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem Phys Lipids. 2008, May ; 153(1):14–23.
114. Stulnig TM, Berger M, Sigmund T, Raederstorff D, Stockinger H, Waldhausl W. Polyunsaturated fatty acids inhibit T cell signal transduction by modification of detergent-insoluble membrane domains. J. Cell Biol 1998;143:637–644.
115. Stulnig TM, Huber J, Leitinger N, Imre EM, Angelisova P, Nowotny P, Waldhausl W. Polyunsaturated eicosapentaenoic acid displaces proteins from membrane rafts by altering raft lipid composition. J. Biol. Chem, 2001, 276:37335–37340.
116. Webb Y, Hermida-Matsumoto L, Resh MD. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. J. Biol. Chem, 2000, 275:261– 270.
117. Liang X, Nazarian A, Erdjument-Bromage H, Bornmann W, Tempst P, Resh MD. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. J. Biol. Chem, 2001, 276:30987–30994.
118. Escribá PV, González-Ros JM, Goñi FM, , Vigh L, Sánchez-Magraner L, Fernández AM, Busquets X, Horváth I, Barceló-Coblijn G Membranes: a meeting point for lipids, proteins and therapies. J Cell Mol Med. 2008, 12:829-875.
119. Barry M Zee, Rebecca S Levin, Peter A DiMaggio, Benjamin A Garcia1. Global turnover of histone post-translational modifications and variants in human cells, Epigenetics & Chromatin 2010, 3:22
120. Feinberg AP & Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 1983, 301, 89–92.
121. Jeppesen P, Turner BM. The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression. Cell 1993, 74:281-289.
122. ISO 21348 – Process for Determining Solar Irradiances
123. Matsui MS, – Longwave ultraviolet radiation and promotion of skin cancer. Cancer Cells 1991;3:8–12.
124. Marrot L, Meunier JR. Skin DNA photodamage and its biological consequences. J Am Acad Dermatol 2008, 58:S139-48
125. Krutmann, J., Ho¨ nigsmann, H., , Bergstresser, P.R. Dermatological Phototherapy and Photodiagnosis. Springer, 2001, .
126. Gilchrest, B.A., Krutmann, J. Photoaging. Springer, 2006, .
127. Krutmann, J., , Photoimmunology. Blackwell Science Ltd., 1995, .
128. Tyrrell RM, – Ultraviolet radiation and free radical damage to skin, Biochem. Soc. Symp. 61, 1995, 47– 53.
129. Tornaletti S, Pfeifer GP, – UV damage and repair mechanisms in mammalian cells, BioEssays 18, 1996, 221– 228.
130. Kulms D, Poppelmann B, Yarosh D, Luger TA, Krutmann J, Schwarz T, – Nuclear and cell membrane effects contribute independently to the induction of apoptosis in human cells exposed to UVB radiation, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1999, 7974–7979.
131. Kulms D, Schwarz T, Independent contribution of three different pathways to ultraviolet-B-induced apoptosis, Biochem. Pharmacol. 64, 2002, 837–841.
132. Kulms D, Zeise E, Poppelmann B, Schwarz T, DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way, Oncogene 21, 2002, 5844– 5851.
133. Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med.1991, 11:81–128.
134. Acworth IN, , Maher TJ. The analysis of free radicals, their reaction products, and antioxidants. In Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals. Baskin SI, Salem H, eds,1997, pp 23–77. Taylor & Francis, .
135. Awasthi YC, Beutler E, Srivastava SK. Purification and properties of human erythrocyte glutathione peroxidase. J Biol Chem.1975, 250: 5144–9.
136. FF, Doroshow JH, Esworthy RS. Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutathione peroxidase, GSHPx-GI. J Biol Chem.1993, 268: 2571–6.
137. Takahashi K, Avissar N, Whitin J, Cohen H. Purification and characterization of human plasma glutathione peroxidase: a selenoglycoprotein distinct from the known cellular enzyme. Arch Biochem Biophys.1987, 256: 677–86.
138. Ursini F, Maiorino M, Gregolin C. The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochim Biophys Acta.1985, 839: 62–70.
139. Thomas JP, Maiorino M, Ursini F, Girotti AW. Protective action of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase against membrane-damaging lipid peroxidation. In situ reduction of phospholipid and cholesterol hydroperoxides. J Biol Chem. 1990, 265: 454–61.
140. Animal and vegetable fats and oils – Preparation of methyl esters of fatty acids (SR EN ISO 5509:2002).
141. Hoffmann K, Blaudszun J, Brunken C, Höpker WW, Tauber R, Steinhart H. Distribution of polyunsaturated fatty acids including conjugated linoleic acids in total and subcellular fractions from healthy and cancerous parts of human kidneys. Lipids. 2005, 40(3): 309-315.
142. Sokolowska I, Dorobantu C, Woods AG, Macovei A, Branza-Nichita N, Darie CC. Proteomic analysis of plasma membranes isolated from undifferentiated and differentiated HepaRG cells. Proteome Sci. 2012, 10(1):47. doi: 10.1186/1477-5956-10-47.
143. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, and Randall RJ. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagen. J. Biol. Chem. 1951, 193, 265–275.
144. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227 (5259): 680–685.
145. Escriba PV, Ferrer-Montiel AV, Ferragut JA, Gonzalez-Ros JM. Role of membrane lipids in the interaction of daunomycin with plasma membranes from tumor cells: implications in drug-resistance phenomena. Biochemistry. 1990, 29: 7275-7282.
146. Sagar PS, Das UN. Cytotoxic action of cis-unsaturated fatty acids on human cervical carcinoma (HeLa) cells in vitro. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 1995, 53(4): 287-299.
147. Morre J, Morré DM, Brightmore R. Omega-3 but not omega-6 unsaturated fatty acids inhibit the cancer-specific ENOX2 of the HeLa cell surface with no effect on the constitutive ENOX1. J Diet Suppl. 2010, 7(2): 154-158.
148. Chapkin RS, Wang N, Fan YY, Lupton JR, Prior IA. Docosahexaenoic acid alters the size and distribution of cell surface microdomains. Biochim Biophys Acta. 2008, 1778(2): 466-471.
149. Corsetto PA, Cremona A, Montorfano G, Jovenitti IE, Orsini F, Arosio P, Rizzo AM. Chemical-physical changes in cell membrane microdomains of breast cancer cells after omega-3 PUFA incorporation. Cell Biochem Biophys. 2012, 64(1):45-59.
150. Chapkin RS, McMurray DN, Davidson LA, Patil BS, Fan YY, Lupton JR. Bioactive dietary long-chain fatty acids: emerging mechanisms of action. Br J Nutr. 2008, 100(6): 1152-1157.
151. Schley PD, Brindley DN, Field CJ. (n-3) PUFA alter raft lipid composition and decrease epidermal growth factor receptor levels in lipid rafts of human breast cancer cells. J Nutr. 2007, 137(3): 548-553.
152. Ntambi JM. Regulation of stearoyl-CoA desaturase by polyunsaturated fatty acids and cholesterol. J Lipid Res. 1999, 40: 1549-1558.
153. McNamara RK, Liu Y, Jandacek R, Rider T, Tso P. The aging human orbitofrontal cortex: Decreasing polyunsaturated fatty acid composition and associated increases in lipogenic gene expression and stearoyl-CoA desaturase activity, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2008, 78: 293-304.
154. Paton CM, Ntambi JM. Biochemical and physiological function of stearoyl-CoA desaturase. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009, 297(1):E28-37.
155. Urs AO, Nechifor MT, Niculițe CM, Regalia T, Mocanu M, Popescu A, Manda G, Dinu D, Leabu M. UVA Irradiation of Dysplastic Keratinocytes: Oxidative Damage versus Antioxidant Defense. Int J Mol Sci. 2012, 13(12): 16718-16736.
156. Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, Adler K, Urbich C, Martin H. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res, 2001, 89: E1-E7.
157. Petit I, Jin D, Rafii S. The SDF-1-CXCR4 signaling pathway: a molecular hub modulating neo-angiogenesis. Trends Immunol, 2007, 28: 299-307.
158. Abbott JD, Huang Y, Liu D, Hickey R, Krause DS, Giordano FJ. Stromal cell-derived factor-1 alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not suffi – cient to induce homing in the absence of injury. Circulation, 2004, 110: 3300-5.
159. Dentelli P, Rosso A, Balsamo A, et al. C-kit, by interacting with the membrane-bound ligand, recruits endothelail progenitor cells to infl amed endothelium. Blood, 2007, 109:4264-71.
160. Ceradini DJ, Kulkarni AR, Callaghan MJ, et al. Progenitor cell traffi cking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induc- tion of SDF-1. Nat Med, 2004, 10: 858-64.
161. Gallagher KA, Liu ZJ, Xiao M, et al. Diabetic impairments in NO- mediated endothelial progenitor cell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF-1 alpha. J Clin Invest, 2007, 117: 1249-59.
162. Zhang CC, Lodish HF. Cytokins regulating hematopoietic stem cell function. Curr Opin Hematol, 2008, 15: 307-11.
163. Wojakowski W, Kucia M, Kazmierski M, Ratajczak M, Tendera M. Circulating progenitor cells in stable coronary heart disease and acute coronary syndromes: relevant reparatory mechanisms? Heart, 2008, 94: 27-33.
164. Liehn EA, Tuchscheerer N, Kanzler I, Drechsler M, Fraemohs L, Schuh A, Koenen RR, Zander S, Soehnlein O, Hristov M, Grigorescu G, Urs AO, Leabu M, Bucur I, Merx MW, Zernecke A, Ehling J, Gremse F, Lammers T, Kiessling F, Bernhagen J, Weber ASC. Double-Edged Role of the CXCL12/CXCR4 Axis in in Experimental Myocardial Infarction. JACC, 2011, Vol. 58, No. 23, 2011:2415–23.
165. Bolli R. The late phase of preconditioning. Circ Res. 2000, 87:972-983
166. Gonz P, Gonz W. Coronary blood flow and myocardial ischemia in Braunwald E, Ziper DP, Libby P.Heart Disease, WB Saunders, Philadelphia 2004:1087-1114
167. Krysko O, De RL, Cornelissen M. Phosphatidylserine exposure during early primary necrosis (oncosis) in JB6 cells as evidenced by immunogold labeling technique. Apoptosis 2004, 9:495–500.
168. Fadok VA, , Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 1992, 148:2207–2216.
169. Kenis H, Zandbergen HR, Hofstra L, Petrov AD, Dumont EA, Blankenberg FD, Haider N, Bitsch N, Gijbels M, Verjans JW, Narula N, Narula J, Reutelingsperger CP. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med 2010, 51:259–267.
170. Wouters CW, Meijer P, Janssen CI, Frederix GW, Oyen WJ, Boerman OC, Smits P, Rongen GA. Atorvastatin does not affect ischaemia-induced phosphatidylserine exposition in humans in-vivo. J Atheroscler Thromb. 2012, 19:285–291. doi: 10.5551/jat.10983.
Lucrări publicate
Liehn EA, Tuchscheerer N, Kanzler I, Drechsler M, Fraemohs L, Schuh A, Koenen RR, Zander S, Soehnlein O, Hristov M, Grigorescu G, Urs AO, Leabu M, Bucur I, Merx MW, Zernecke A, Ehling J, Gremse F, Lammers T, Kiessling F, Bernhagen J, Weber ASC. Double-Edged Role of the CXCL12/CXCR4 Axis in in Experimental Myocardial Infarction. JACC, 2011, Vol. 58, No. 23, 2011:2415–23.
Nechifor MT, Niculițe CM, Urs AO, Regalia T, Mocanu M, Popescu A, Manda G, Dinu D, Leabu M. UVA Irradiation of Dysplastic Keratinocytes: Oxidative Damage versus Antioxidant Defense. Int J Mol Sci, 2012, 13(12): 16718-16736.
contribuție egală a autorilor
Bibliografie generală
Leabu M, Nechifor MT. Biomembranele, unitate în diversitate, vol. I Editura Medicală Amaltea, 2014.
Alberts, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. Molecular biology of the cell, Garland Publishing Inc, & , 2002 (ed. a IV-a).
Lehninger AL. Biochimie, Editura Tehnică București, 1987.
Voiculeț N, Puiu L. Biologia moleculară a celulei, Edit. ALL, București, 1997.
Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Molecular cell biology ,W.H. Freeman and Company, New York,2000 (ediția a IVa).
RK, Granner DK, Mazers PA, Rodwell VW. Harper´s Biochemistry, Appleton & Lange, 1993.
Medvedovici A, Tache F. Noțiuni fundamentale și mărimi caracteristice în cromatografie, Edit. Universității din București, 1997.
The Structure of Biological Membranes, CRC Press, 2005.
Christie WW. Gas Chromatography and Lipids , Oily Press, Bridgwater, 1989.
Bibliografie specifică
1. Barnett RE, Furcht LT, Scott RE. Differences in membrane fluidity and structure in contact-inhibited and transformed cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1974, 71: 1992-4.
2. Spector AA, Burns CP. Biological and therapeutic potential of membrane lipid modification in tumors. Cancer Res. 1987, 47: 4529-37.
3. Singer SJ, Nicolson GL. The fluid mosaic model of cell membranes, Science, 1972, 175: 720-731.
4. Yang L, et al. New phases of phospholipids and inplications to the membrane fusion problem, Biochemistry, 2003, 42: 6631-6635.
5. Haucke V, Di Paolo G. Lipids and lipid modifications in the regulation of membrane traffic, Ceel Biology, 2007, 19:426-435.
6. Van Meer G, Sprong H. Membrane lipids and vesicular traffic, Cuur. Opin. Ceel. Biol., 2004, 8:241-246.
7. Fourcade O, Simon MF. Phospholipases A2 et pathologie inflammatoire: consensus et nouveaux concepts, Synthese, 1995, 12: 323-332.
8. Nigam S, Schewe T. Phospholipase A2 and lipid peroxidation, Molecular and Cell Biology of Lipids, 2000, 1488: 167-181.
9. Fauti T.et al. Induction of PPAR band prostacyclin (PGI2) synthesis by Raf signaling: failure of PGI2 to activate PPARb. FEBS J., 2005, 273, 170–179.
10. YuK, Bayona W, Kallen CB, Harding HP, Ravera CP, McMahon G, Brown M& Lazar MA, Differential activation of peroxisome proliferator-activated receptors by eicosanoids. J Biol Chem, 1995, 270, 23975–23983.
11. Kim DJ, , Billin AN, Willson TM, Gonzalez FJ & Peters JM, PPARbeta/delta selectively induces differentiation and inhibits cell proliferation. Cell Death Differ, 2005, doi:10.1038/sj.cdd.4401713.
12. Gupta RA, Tan J, Krause WF, Geraci MW, Willson TM, Dey SK & DuBois RN, Prostacyclinmediated activation of peroxisome proliferator-activated receptor delta in colorectal cancer. Proc Natl 97, 13275–13280.
13. Kim DJ, , Burns AM, Gonzalez FJ, Perdew GH & Peters JM, Peroxisome proliferator-activated receptor-beta ⁄ delta inhibits epidermal cell proliferation by down-regulation of kinase activity. J Biol Chem, 2005, 280, 9519–9527.
14. Fourcade O, Simon MF. Secretory phospholipase A2 generates de novel lipid mediator lysophosphatidic acid in membrane microvesicles shed from activated cells, Cell.,1995, 80: 919-27.
15. Elliott SJ, Meszaros G, Schilling WP. Effect of oxidant stress on calcium signaling in vascular endothelial cells, Free Rad Biol Med, 1992, 13, 635-650.
16. Leslie CC. Properties and regulation of cytosolic phospholipase A2, J Biol Chem, 1997, 272, 16709-16712.
17. Gopalakrishna R, Anderson B. Ca2+-and phospholipid independent activation of protein kinase C by selective oxidative modification of the regulatory domain, Proc Natl Acad Sci USA,1989, 86: 6758-6762.
18. Guy GR, J, Ng S, Tan YH. Inactivation of a redox-sensitive protein phosphatase during the early events of tumor necrosis factor/interleukin-1 signal transduction, J Biol Chem, 1993, 268: 2141-2148.
19. Prades J, Et al. Effect of unsaturated fatty acids and tricylglycerols on phosphatidylethanolamine membrane structure, J. Lipid Res., 2003.
20. Escriba PV. Membrane – lipid therapy: a new approch in molecular medicine, Trends in Molecular Medicine, 2006, vol. 12, nr.1.
21. Spector AA, Yorek MA. Membrane lipid composition and cellular function, Journal of Lipid Research Volume 26, 1985, 26:1015-1035.
22. Yerram NR, Moore SA, Spector AA. Eicosapentaenoic acid metabolism in brain microvessel endothelium: effect on prostaglandin form at ion, Journal of Lipid Research Volume 30, 1989, 30: 1747-1757.
23. Robins SJ. Cardiovascular diseasse with diabetes or the metabolic syndrome: should statins or fibrates be first line lipid theraphy?, Curr. Opin. Lipidol., 2003.
24. Mikirova N, Et al. Erythrocyte membrane fatty acid composition in cancer patients, R.P. Health Sci. J., 2004, 23:2270-2273.
25. Crook T, Et al. Effects of phosphatidylserine in Alzheimer´s diseasse, Psychopharmacol. Bull., 1992, 28: 61-66.
26. Simopoulos AP. Omega-3 faty acids in inflammation and autoimmune disseases, J.Am. Coll. Nutr., 2002, 21: 495-505.
27. Ruggieri S, Mugnai G, Mannini A, Calorini L, Fallani A, Barletta E, Mannori G, Cecconi O. Lipid characteristics in metastatic cells, Clinical & Experimental Metastasis, 1999, 17: 271-279.
28. Montaudon D, Louis JC, Robert J. Phospholipid acyl group composition in normal and tumoral nerve cells in culture, Lipids, 1981, 16: 293-7.
29. Hakomori S. Glycosphyngolipids in cellular interaction, differentiation, and oncogenesis, Annu Rev Biochem, 1981, 417: 56-89.
30. Sandermann H. Regulation of membrane enzymes by lipids, Biochim Biophys Acta, 1978, 515: 209-37.
31. Shinitzky M. Membrane fluidity in malignancy. Adversative and recuperative, Biochim Biophys Acta, 1984, 738(4): 251-61.
32. Castagnet PI, Golovko MY, Barcelo-Coblijn GC, Nussbaum RL, Murphy EJ. Fatty acid incorporation is decreased in astrocytes cultured from α-synuclein geneablated mice., J. Neurochem, 2005, 94: 839-849.
33. Wijendran V, Hayes KC. Dietary n-6 and n-3 fatty acid balance and cardiovascular health. Annu Rev Nutr 2004, 24:597-615.
34. Brenna JT. Efficiency of conversion of alpha-linolenic acid to long chain n-3 fatty acids in man. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2002, 5(2):127-132.
35. Brenna JT, Salem N Jr, Sinclair AJ, Cunnane SC. alpha-Linolenic acid supplementation and conversion to n-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in humans. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2009, 80(2–3):85-91.
36. SanGiovanni JP, Chew EY. The role of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog Retin Eye Res 2005, 24(1):87-138.
37. Litman BJ, Niu SL, Polozova A, Mitchell DC. The role of docosahexaenoic acid containing phospholipids in modulating G protein-coupled signaling pathways: visual transduction. J Mol Neurosci 2001, 16(2–3):237-242.
38. Birch EE, S, Hoffman DR, Uauy R, Birch DG. A randomized controlled trial of early dietary supply of long-chain polyunsaturated fatty acids and mental development in term infants. Dev Med Child Neurol 2000, 42(3):174-181.
39. Salem N Jr, Litman B, Kim HY, Gawrisch K. Mechanisms of action of docosahexaenoic acid in the nervous system. Lipids 2001, 36(9):945-959.
40. Welch AA, Lund E, Amiano P, Dorronsoro M. Variability in fish consumption in 10 European countries. IARC Sci Publ 2002, 156:221-222.
41. Muthayya S, Dwarkanath P, Thomas T, Ramprakash S, Mehra R, Mhaskar A, Mhaskar R, Thomas A, Bhat S, et al. The effect of fish and omega-3 LCPUFA intake on low birth weight in Indian pregnant women. Eur J Clin Nutr 2009, 63(3):340-346.
42. Menotti A, Kromhout D, Blackburn H, Fidanza F, Buzina R, Nissinen A. Food intake patterns and 25-year mortality from coronary heart disease: cross-cultural correlations in the Seven Countries Study. The Seven Countries Study Research Group. Eur J Epidemiol 1999, 15(6):507-515.
43. Misra A, Khurana L, Isharwal S, Bhardwaj S. South Asian diets and insulin resistance. Br J Nutr 2009, 101(4):465-473.
44. Caygill CP, Charlett A, Hill MJ. Fat, fish, fish oil and cancer. Br J Cancer 1996, 74(1):159-164.
45. Kuriki K, Hirose K, Wakai K, Matsuo K, Ito H, Suzuki T, Hiraki A, Saito T, Iwata H, et al. Breast cancer risk and erythrocyte compositions of n-3 highly unsaturated fatty acids in Japanese. Int J Cancer 2007, 121(2):377-385.
46. Das UN. Tumoricidal action of cis-unsaturated fatty acids and their relationship to free radicals and lipid peroxidation. Cancer Lett 1991, 56:235-243.
47. Sangeetha P, Das UN. Cytotoxic action of cis-unsaturated fatty acids on human cervical carcinoma (HeLa) cells in vitro. Prostaglandins Leukot Essen Fatty Acids 1995, 53:287-299.
48. Begin ME, Ell G, Das UN, Horrobin DF. Differential killing of human carcinoma cells supplemented with n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. J Natl Cancer Inst 1986, 77:1053-1062.
49. Sagar PS, Das UN, Koratkar R, Ramesh G, Padma M, Kumar GS. Cytotoxic action of cis-unsaturated fatty acids on human cervical carcinoma (HeLa) cells: Relationship to free radicals, and lipid peroxidation and its modulation by calmodulin antagonists. Cancer Lett 1992, 63:189-198.
50. Kumar SG, Das UN. Free radical dependent suppression of mouse myeloma cells by alpha-linolenic and eicosapentaenoic acids in vitro. Cancer Lett 1995, 92:27-38.
51. Solomon LZ, AM, Hayes MC, Bass PS, Birch BR, Cooper AJ. Is gamma-linolenic acid an effective intravesical agent for superficial bladder cancer? In vitro cytotoxicity and in vivo tolerance studies. Urol Res 1998, 26:11-15.
52. Menéndez JA, Ropero S, del Barbacid MM, Montero S, Solanas M, Escrich E, Cortés-Funes H, Colomer R. Synergistic interaction between vinorelbine and gamma-linolenic acid in breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2002, 72:203-219.
53. Kafrawy O, Zerouga M, Stillwell W, Jenski LJ. Docosahexaenoic acid in phosphatidylcholine mediates cytotoxicity more effectively than other omega-3 and omega-6 fatty acids. Cancer Lett 1998, 132:23-29.
54. Ge H, Kong X, Shi L, Hou L, Liu Z, Li P. Gamma-linolenic acid induces apoptosis and lipid peroxidation in human chronic myelogenous leukemia K562 cells. Cell Biol Int 2009, 33:402-410.
55. Toit-Kohn JL, Louw L, Engelbrecht AM. Docosahexaenoic acid induces apoptosis in colorectal carcinoma cells by modulating the PI3 kinase and p38 MAPK pathways. J Nutr Biochem 2009, 20:106-114.
56. Begin ME, Das UN, Ells G. Cytotoxic effects of essential fatty acids (EFA) in mixed cultures of normal and malignant human cells. Prog Lipid Res 1986, 25:573-576.
57. 12. Das UN. Essential fatty acids, lipid peroxidation and apoptosis. Prostaglandins Leukot Essen Fatty Acids 1999, 61:157-163.
58. Das UN, Madhavi N. Effect of polyunsaturated fatty acids on drugsensitive and resistant tumor cells in vitro. Lipids in Health and Disease 2011, 10:159,
59. Sangeetha P, Das UN. Gamma-linolenic acid and eicosapentaenoic acid potentiate the cytotoxicity of anti-cancer drugs on human cervical carcinoma (HeLa) cells in vitro. Med Sci Res 1993, 21:457-459.
60. Menendez JA, Ropero S, del Barbacid MM, et al. Synergistic interaction between vinorelbine and gamma-linolenic acid in breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2002, 72:203-219.
61. Hernandez M, Bayon Y, Sanchez Crespo M, Nieto ML. Signaling mechanisms involved in the activation of arachidonic acid metabolism in human astrocytoma cells by tumor necrosis factor-alpha: phosphorylation of cytosolic phospholipase A2 and transactivation of cyclo-oxygenase-2. J Neurochem 1999, 73:1641-1649.
, Krokan HE. Cell-specific enhancement of doxorubicin toxicity in human tumour cells by docosahexaenoic acid. Anticancer Res 2001, 21:29-38.
63. Rose DP, Connolly JM. Effects of fatty acids and eicosanoid synthesis inhibitors on the growth of two human prostate cancer cell lines. Prostate 1991, 18(3):243-254.
64. Chung BH, Mitchell SH, Zhang JS, Young CY. Effects of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid on androgen-mediated cell growth and gene expression in LNCaP prostate cancer cells. Carcinogenesis 2001, 22(8):1201-1206.
65. Narayanan NK, Narayanan BA, Reddy BS. A combination of docosahexaenoic acid and celecoxib prevents prostate cancer cell growth in vitro and is associated with modulation of nuclear factor-kappaB, and steroid hormone receptors. Int J Oncol 2005, 26(3):785-792.
66. Narayanan NK, Narayanan BA, Bosland M, Condon MS, Nargi D. Docosahexaenoic acid in combination with celecoxib modulates HSP70 and p53 proteins in prostate cancer cells. Int J Cancer 2006, 119(7):1586-1598.
67. , Lim D, Erickson KL. Alteration of murine mammary tumorigenesis by dietary enrichment with n-3 fatty acids in fish oil. Cancer Lett 1998, 124(1):1-7.
68. Rose DP, Connolly JM. Effects of dietary omega-3 fatty acids on human breast cancer growth and metastases in nude mice. J Natl Cancer Inst 1993, 85(21):1743-1747.
69. Rose DP, Connolly JM, Rayburn J, Coleman M. Influence of diets containing eicosapentaenoic or docosahexaenoic acid on growth and metastasis of breast cancer cells in nude mice. J Natl Cancer Inst 1995, 87(8):587-592.
70. Hardman WE, Avula CP, Fernandes G, Cameron IL. Three percent dietary fish oil concentrate increased efficacy of doxorubicin against MDA-MB 231 breast cancer xenografts. Clin Cancer Res 2001, 7(7):2041-2049.
71. Shao Y, Pardini L, Pardini RS. Dietary menhaden oil enhances mitomycin C antitumor activity toward human mammary carcinoma MX-1. Lipids 1995, 30(11):1035-1045.
72. Chamras H, Ardashian A, Heber D, Glaspy JA. Fatty acid modulation of MCF-7 human breast cancer cell proliferation, apoptosis and differentiation. J Nutr Biochem 2002, 13(12):711-716.
73. Menendez JA, Mehmi I, Verma VA, Teng PK, Lupu R. Pharmacological inhibition of fatty acid synthase (FAS): a novel therapeutic approach for breast cancer chemoprevention through its ability to suppress Her-2/neu (erbB-2) oncogene-induced malignant transformation. Mol Carcinog 2004, 41(3):164-178.
74. Hunt DA, Lane HM, Zygmont ME, Dervan PA, Hennigar RA. MRNA stability and overexpression of fatty acid synthase in human breast cancer cell lines. Anticancer Res 2007, 27(1A):27-34.
75. Menendez JA, Vazquez-Martin A, Ropero S, Colomer R, Lupu R. HER2 (erbB-2)-targeted effects of the omega-3 polyunsaturated fatty acid, alpha-linolenic acid (ALA; 18:3n-3), in breast cancer cells: the "fat features" of the "Mediterranean diet" as an "anti-HER2 cocktail". Clin Transl Oncol 2006, 8(11):812-820.
76. Couet C, Delarue J, Ritz P, Antoine JM, Lamisse F. Effect of dietary fish oil on body fat mass and basal fat oxidation in healthy adults. Int J Obes Relat Metab Disord 1997, 21(8):637-643.
77. Jones PJ, Schoeller DA. Polyunsaturated:saturated ratio of diet fat influences energy substrate utilization in the human. Metabolism 1988, 37(2):145-151.
78. Mori Y, Murakawa Y, Katoh S, Hata S, Yokoyama J, Tajima N, Ikeda Y, Nobukata H, Ishikawa T, Shibutani Y. Influence of highly purified eicosapentaenoic acid ethyl ester on insulin resistance in the Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rat, a model of spontaneous non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism 1997, 46(12):1458-1464.
79. Mori Y, Murakawa Y, Yokoyama J, Tajima N, Ikeda Y, Nobukata H, Ishikawa T, Shibutani Y. Effect of highly purified eicosapentaenoic acid ethyl ester on insulin resistance and hypertension in Dahl salt-sensitive rats. Metabolism 1999, 48(9):1089-1095.
80. Nobukata H, Ishikawa T, Obata M, Shibutani Y. Long-term administration of highly purified eicosapentaenoic acid ethyl ester prevents diabetes and abnormalities of blood coagulation in male WBN/Kob rats. Metabolism 2000, 49(7):912-919.
81. Ikemoto S, Takahashi M, Tsunoda N, Maruyama K, Itakura H, Ezaki O. High-fat diet-induced hyperglycemia and obesity in mice: differential effects of dietary oils. Metabolism 1996, 45(12):1539-1546.
82. Brady LM, Lovegrove SS, Lesauvage SV, Gower BA, Minihane AM, Williams CM, Lovegrove JA. Increased n-6 polyunsaturated fatty acids do not attenuate the effects of long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids on insulin sensitivity or triacylglycerol reduction in Indian Asians. Am J Clin Nutr 2004, 79(6):983-991.
83. Lovegrove JA, Lovegrove SS, Lesauvage SV, Brady LM, Saini N, Minihane AM, Williams CM. Moderate fish-oil supplementation reverses low-platelet, long-chain n-3 polyunsaturated fatty acid status and reduces plasma triacylglycerol concentrations in British Indo-Asians. Am J Clin Nutr 2004, 79(6):974-982.
84. Minihane AM, Khan S, Leigh-Firbank EC, Talmud P, Wright JW, Murphy MC, Griffin BA, Williams CM. ApoE polymorphism and fish oil supplementation in subjects with an atherogenic lipoprotein phenotype. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000, 20(8):1990-1997.
85. Psota TL, Gebauer SK, Kris-Etherton P. Dietary omega-3 fatty acid intake and cardiovascular risk. Am J Cardiol 2006, 98(4A):3i-18i.
86. Roche HM, Gibney MJ. Effect of long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids on fasting and postprandial triacylglycerol metabolism. Am J Clin Nutr 2000, 71(1 Suppl):232S-237S.
87. Sinclair AJ, ttar-Bashi NM, Li D. What is the role of alpha-linolenic acid for mammals? Lipids 2002, 37(12):1113-1123.
88. 192. Balk EM, Lichtenstein AH, Chung M, Kupelnick B, Chew P, Lau J. Effects of omega-3 fatty acids on serum markers of cardiovascular disease risk: a systematic review. Atherosclerosis 2006, 189(1):19-30.
89. Calder PC. Polyunsaturated fatty acids and inflammation. Biochem Soc Trans 2005, 33, 423–427.
90. Calder PC. Polyunsaturated fatty acids, inflammatory processes and inflammatory bowel diseases. Mol Nutr Food Res 2008, 52, 885–897.
91. Calon F, Cole G. Neuroprotective action of omega-3 polyunsaturated fatty acids against neurodegenerative diseases: evidence from animal studies. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2007, 77, 287–293.
92. Schumann J, Leichtle A, Thiery J, Fuhrmann H. Fatty Acid and Peptide Profiles in Plasma Membrane and Membrane Rafts of PUFA Supplemented RAW264.7 Macrophages, 2011, PLoS ONE 6(8): e24066.
93. Huster D, Jin AJ, Arnold K, Gawrisch K. Water permeability of polyunsaturated lipid membranes measured by O-17 NMR. Biophysical Journal, 1997, 73: 855–864.
94. Koenig BW, Strey HH, Gawrisch K. Membrane lateral compressibility determined by NMR and x-ray diffraction: effect of acyl chain polyunsaturation. Biophys J, 1997, 73: 1954–1966.
95. Smaby JM, Momsen MM, Brockman HL, Brown RE. Phosphatidylcholine acyl unsaturation modulates the decrease in interfacial elasticity induced by cholesterol. Biophys J, 1997, 73: 1492–1505.
96. Lipid polymorphism and protein-lipid interactions. Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1376: 353–368.
97. Williams EE, Jenski LJ, Stillwell W. Docosahexaenoic acid (DHA) alters the structure and composition of membranous vesicles exfoliated from the surface of a murine leukemia cell line. Biochim.Biophys.Acta, 1998, 1371: 351–362.
98. Stillwell W, Wassall SR. Docosahexaenoic acid: membrane properties of a unique fatty acid. Chem.Phys.Lipids, 2003, 126: 1–27.
99. Armstrong VT, Brzustowicz MR, Wassall SR, Jenski LJ, Stillwell W. Rapid flip-flop in polyunsaturated (docosahexaenoate) phospholipid membranes. Arch Biochem. Biophys, 2003, 414: 74–82.
100. Stubbs CD, Smith AD. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim Biophys Acta 1984; 779:89 –137.
101. Onuki Y, Morishita M, Chiba Y, Tokiwa S, Takayama K. Docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid induce changes in the physical properties of a lipid bilayer model membrane. Chem Pharm Bull (), 2006, 54(1), 68−71.
102. Ehringer W, Belcher D, Wassall SR, Stillwell W. A comparison of the effects of linolenic (18:3 omega 3) and docosahexaenoic (22:6 omega 3) acids on phospholipid bilayers. Chem Phys Lipids, 1990, 54(2), 79−88.
103. Vreugdenhil M, Bruehl C, Voskuyl RA, Kang JX, Leaf A, Wadman W. J. Polyunsaturated fatty acids modulate sodium and calcium currents in CA1 neurons. Proc Natl Acad Sci , 1996, 93(22), 12559−12563.
104. Xiao Y, Huang Y, Chen ZY. Distribution, depletion and recovery of docosahexaenoic acid are region-specific in rat brain. Br J Nutr, 2005, 94(4), 544−550.
105. Xiao YF, Gomez AM, Morgan JP, Lederer WJ, Leaf A. Suppression of voltage-gated L-type Ca2+ currents by polyunsaturated fatty acids in adult and neonatal rat ventricular myocytes. Proc Natl Acad Sci , 1997, 94(8), 4182−4187.
106. Xiao YF, Kang JX, Morgan JP, Leaf A. Blocking effects of polyunsaturated fatty acids on Na+channels of neonatal rat ventricularmyocytes. Proc Natl Acad Sci , 1995, 92(24), 11000−11004.
107. Xiao YF, Ke Q, Wang SY, Auktor K, Yang Y, Wang GK, et al. Single point mutations affect fatty acid block of human myocardial sodium channel alpha subunit Na+ channels. Proc Natl Acad Sci , 2001, 98(6), 3606−3611.
108. Xiao YF, Wright SN, Wang GK, Morgan JP, Leaf A. Fatty acids suppress voltage-gated Na+currents in HEK293t cells transfected with the alpha-subunit of the human cardiac Na+ channel. Proc Natl Acad Sci , 1998, 95(5), 2680−2685.
109. Xiao YF, Wright SN, Wang GK, Morgan JP, Leaf A. Coexpression with beta(1)-subunit modifies the kinetics and fatty acid block of hH1(alpha) Na(+) channels. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 279(1), H35−46.
110. Stulnig TM. Immunomodulation by polyunsaturated fatty acids: mechanisms and effects. Int. Arch. Allergy Immunol 2003;132:310–321.
111. Shaikh SR, Dumaual AC, Castillo A, et al. Oleic and docosahexaenoic acid differentially phase separate from lipid raft molecules: A comparative NMR, DSC, AFM, and detergent extraction study. Biophys. J 2004, 87:1752–1766.
112. Chen W, Jump DB, Esselman WJ, Busik JV. Inhibition of cytokine signaling in human retinal endothelial cells through modification of caveolae/lipid rafts by docosahexaenoic acid. Invest. Opthalmol. Vis. Sci 2007, 48:18–26.
113. Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, Lupton JR. Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fatty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem Phys Lipids. 2008, May ; 153(1):14–23.
114. Stulnig TM, Berger M, Sigmund T, Raederstorff D, Stockinger H, Waldhausl W. Polyunsaturated fatty acids inhibit T cell signal transduction by modification of detergent-insoluble membrane domains. J. Cell Biol 1998;143:637–644.
115. Stulnig TM, Huber J, Leitinger N, Imre EM, Angelisova P, Nowotny P, Waldhausl W. Polyunsaturated eicosapentaenoic acid displaces proteins from membrane rafts by altering raft lipid composition. J. Biol. Chem, 2001, 276:37335–37340.
116. Webb Y, Hermida-Matsumoto L, Resh MD. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. J. Biol. Chem, 2000, 275:261– 270.
117. Liang X, Nazarian A, Erdjument-Bromage H, Bornmann W, Tempst P, Resh MD. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. J. Biol. Chem, 2001, 276:30987–30994.
118. Escribá PV, González-Ros JM, Goñi FM, , Vigh L, Sánchez-Magraner L, Fernández AM, Busquets X, Horváth I, Barceló-Coblijn G Membranes: a meeting point for lipids, proteins and therapies. J Cell Mol Med. 2008, 12:829-875.
119. Barry M Zee, Rebecca S Levin, Peter A DiMaggio, Benjamin A Garcia1. Global turnover of histone post-translational modifications and variants in human cells, Epigenetics & Chromatin 2010, 3:22
120. Feinberg AP & Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 1983, 301, 89–92.
121. Jeppesen P, Turner BM. The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression. Cell 1993, 74:281-289.
122. ISO 21348 – Process for Determining Solar Irradiances
123. Matsui MS, – Longwave ultraviolet radiation and promotion of skin cancer. Cancer Cells 1991;3:8–12.
124. Marrot L, Meunier JR. Skin DNA photodamage and its biological consequences. J Am Acad Dermatol 2008, 58:S139-48
125. Krutmann, J., Ho¨ nigsmann, H., , Bergstresser, P.R. Dermatological Phototherapy and Photodiagnosis. Springer, 2001, .
126. Gilchrest, B.A., Krutmann, J. Photoaging. Springer, 2006, .
127. Krutmann, J., , Photoimmunology. Blackwell Science Ltd., 1995, .
128. Tyrrell RM, – Ultraviolet radiation and free radical damage to skin, Biochem. Soc. Symp. 61, 1995, 47– 53.
129. Tornaletti S, Pfeifer GP, – UV damage and repair mechanisms in mammalian cells, BioEssays 18, 1996, 221– 228.
130. Kulms D, Poppelmann B, Yarosh D, Luger TA, Krutmann J, Schwarz T, – Nuclear and cell membrane effects contribute independently to the induction of apoptosis in human cells exposed to UVB radiation, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1999, 7974–7979.
131. Kulms D, Schwarz T, Independent contribution of three different pathways to ultraviolet-B-induced apoptosis, Biochem. Pharmacol. 64, 2002, 837–841.
132. Kulms D, Zeise E, Poppelmann B, Schwarz T, DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way, Oncogene 21, 2002, 5844– 5851.
133. Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med.1991, 11:81–128.
134. Acworth IN, , Maher TJ. The analysis of free radicals, their reaction products, and antioxidants. In Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals. Baskin SI, Salem H, eds,1997, pp 23–77. Taylor & Francis, .
135. Awasthi YC, Beutler E, Srivastava SK. Purification and properties of human erythrocyte glutathione peroxidase. J Biol Chem.1975, 250: 5144–9.
136. FF, Doroshow JH, Esworthy RS. Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutathione peroxidase, GSHPx-GI. J Biol Chem.1993, 268: 2571–6.
137. Takahashi K, Avissar N, Whitin J, Cohen H. Purification and characterization of human plasma glutathione peroxidase: a selenoglycoprotein distinct from the known cellular enzyme. Arch Biochem Biophys.1987, 256: 677–86.
138. Ursini F, Maiorino M, Gregolin C. The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochim Biophys Acta.1985, 839: 62–70.
139. Thomas JP, Maiorino M, Ursini F, Girotti AW. Protective action of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase against membrane-damaging lipid peroxidation. In situ reduction of phospholipid and cholesterol hydroperoxides. J Biol Chem. 1990, 265: 454–61.
140. Animal and vegetable fats and oils – Preparation of methyl esters of fatty acids (SR EN ISO 5509:2002).
141. Hoffmann K, Blaudszun J, Brunken C, Höpker WW, Tauber R, Steinhart H. Distribution of polyunsaturated fatty acids including conjugated linoleic acids in total and subcellular fractions from healthy and cancerous parts of human kidneys. Lipids. 2005, 40(3): 309-315.
142. Sokolowska I, Dorobantu C, Woods AG, Macovei A, Branza-Nichita N, Darie CC. Proteomic analysis of plasma membranes isolated from undifferentiated and differentiated HepaRG cells. Proteome Sci. 2012, 10(1):47. doi: 10.1186/1477-5956-10-47.
143. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, and Randall RJ. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagen. J. Biol. Chem. 1951, 193, 265–275.
144. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227 (5259): 680–685.
145. Escriba PV, Ferrer-Montiel AV, Ferragut JA, Gonzalez-Ros JM. Role of membrane lipids in the interaction of daunomycin with plasma membranes from tumor cells: implications in drug-resistance phenomena. Biochemistry. 1990, 29: 7275-7282.
146. Sagar PS, Das UN. Cytotoxic action of cis-unsaturated fatty acids on human cervical carcinoma (HeLa) cells in vitro. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 1995, 53(4): 287-299.
147. Morre J, Morré DM, Brightmore R. Omega-3 but not omega-6 unsaturated fatty acids inhibit the cancer-specific ENOX2 of the HeLa cell surface with no effect on the constitutive ENOX1. J Diet Suppl. 2010, 7(2): 154-158.
148. Chapkin RS, Wang N, Fan YY, Lupton JR, Prior IA. Docosahexaenoic acid alters the size and distribution of cell surface microdomains. Biochim Biophys Acta. 2008, 1778(2): 466-471.
149. Corsetto PA, Cremona A, Montorfano G, Jovenitti IE, Orsini F, Arosio P, Rizzo AM. Chemical-physical changes in cell membrane microdomains of breast cancer cells after omega-3 PUFA incorporation. Cell Biochem Biophys. 2012, 64(1):45-59.
150. Chapkin RS, McMurray DN, Davidson LA, Patil BS, Fan YY, Lupton JR. Bioactive dietary long-chain fatty acids: emerging mechanisms of action. Br J Nutr. 2008, 100(6): 1152-1157.
151. Schley PD, Brindley DN, Field CJ. (n-3) PUFA alter raft lipid composition and decrease epidermal growth factor receptor levels in lipid rafts of human breast cancer cells. J Nutr. 2007, 137(3): 548-553.
152. Ntambi JM. Regulation of stearoyl-CoA desaturase by polyunsaturated fatty acids and cholesterol. J Lipid Res. 1999, 40: 1549-1558.
153. McNamara RK, Liu Y, Jandacek R, Rider T, Tso P. The aging human orbitofrontal cortex: Decreasing polyunsaturated fatty acid composition and associated increases in lipogenic gene expression and stearoyl-CoA desaturase activity, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2008, 78: 293-304.
154. Paton CM, Ntambi JM. Biochemical and physiological function of stearoyl-CoA desaturase. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009, 297(1):E28-37.
155. Urs AO, Nechifor MT, Niculițe CM, Regalia T, Mocanu M, Popescu A, Manda G, Dinu D, Leabu M. UVA Irradiation of Dysplastic Keratinocytes: Oxidative Damage versus Antioxidant Defense. Int J Mol Sci. 2012, 13(12): 16718-16736.
156. Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, Adler K, Urbich C, Martin H. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res, 2001, 89: E1-E7.
157. Petit I, Jin D, Rafii S. The SDF-1-CXCR4 signaling pathway: a molecular hub modulating neo-angiogenesis. Trends Immunol, 2007, 28: 299-307.
158. Abbott JD, Huang Y, Liu D, Hickey R, Krause DS, Giordano FJ. Stromal cell-derived factor-1 alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not suffi – cient to induce homing in the absence of injury. Circulation, 2004, 110: 3300-5.
159. Dentelli P, Rosso A, Balsamo A, et al. C-kit, by interacting with the membrane-bound ligand, recruits endothelail progenitor cells to infl amed endothelium. Blood, 2007, 109:4264-71.
160. Ceradini DJ, Kulkarni AR, Callaghan MJ, et al. Progenitor cell traffi cking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induc- tion of SDF-1. Nat Med, 2004, 10: 858-64.
161. Gallagher KA, Liu ZJ, Xiao M, et al. Diabetic impairments in NO- mediated endothelial progenitor cell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF-1 alpha. J Clin Invest, 2007, 117: 1249-59.
162. Zhang CC, Lodish HF. Cytokins regulating hematopoietic stem cell function. Curr Opin Hematol, 2008, 15: 307-11.
163. Wojakowski W, Kucia M, Kazmierski M, Ratajczak M, Tendera M. Circulating progenitor cells in stable coronary heart disease and acute coronary syndromes: relevant reparatory mechanisms? Heart, 2008, 94: 27-33.
164. Liehn EA, Tuchscheerer N, Kanzler I, Drechsler M, Fraemohs L, Schuh A, Koenen RR, Zander S, Soehnlein O, Hristov M, Grigorescu G, Urs AO, Leabu M, Bucur I, Merx MW, Zernecke A, Ehling J, Gremse F, Lammers T, Kiessling F, Bernhagen J, Weber ASC. Double-Edged Role of the CXCL12/CXCR4 Axis in in Experimental Myocardial Infarction. JACC, 2011, Vol. 58, No. 23, 2011:2415–23.
165. Bolli R. The late phase of preconditioning. Circ Res. 2000, 87:972-983
166. Gonz P, Gonz W. Coronary blood flow and myocardial ischemia in Braunwald E, Ziper DP, Libby P.Heart Disease, WB Saunders, Philadelphia 2004:1087-1114
167. Krysko O, De RL, Cornelissen M. Phosphatidylserine exposure during early primary necrosis (oncosis) in JB6 cells as evidenced by immunogold labeling technique. Apoptosis 2004, 9:495–500.
168. Fadok VA, , Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 1992, 148:2207–2216.
169. Kenis H, Zandbergen HR, Hofstra L, Petrov AD, Dumont EA, Blankenberg FD, Haider N, Bitsch N, Gijbels M, Verjans JW, Narula N, Narula J, Reutelingsperger CP. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med 2010, 51:259–267.
170. Wouters CW, Meijer P, Janssen CI, Frederix GW, Oyen WJ, Boerman OC, Smits P, Rongen GA. Atorvastatin does not affect ischaemia-induced phosphatidylserine exposition in humans in-vivo. J Atheroscler Thromb. 2012, 19:285–291. doi: 10.5551/jat.10983.
Lucrări publicate
Liehn EA, Tuchscheerer N, Kanzler I, Drechsler M, Fraemohs L, Schuh A, Koenen RR, Zander S, Soehnlein O, Hristov M, Grigorescu G, Urs AO, Leabu M, Bucur I, Merx MW, Zernecke A, Ehling J, Gremse F, Lammers T, Kiessling F, Bernhagen J, Weber ASC. Double-Edged Role of the CXCL12/CXCR4 Axis in in Experimental Myocardial Infarction. JACC, 2011, Vol. 58, No. 23, 2011:2415–23.
Nechifor MT, Niculițe CM, Urs AO, Regalia T, Mocanu M, Popescu A, Manda G, Dinu D, Leabu M. UVA Irradiation of Dysplastic Keratinocytes: Oxidative Damage versus Antioxidant Defense. Int J Mol Sci, 2012, 13(12): 16718-16736.
contribuție egală a autorilor
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Rolul Echilibrului Acizilor Grasi Saturati Versus Nesaturati In Mecanisme Celulare Normale Si In Patologie (ID: 123668)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.