Propolisul. Noi Studii Referitoare la Produsele Destinate Cavitatii Bucale

INTRODUCERE

Deși este o substanță cunoscută din cele mai vechi timpuri, adevăratele virtuți ale propolisului au fost demonstrate științific abia în zilele noastre, devenind obiectul unor cuprinzătoare studii cu caracter farmacologic si chimic.

Numele de propolis este rezultatul îmbinării a doi termeni cu origine latină și greacă: pro – înainte și polis – cetate.

Propolisul este folosit de albine pe post de material de construcție și consolidare, lipind crăpăturile stupului și a ramelor ce susțin fagurii.

Propolisul, dar și alte produse apicole, au fost folosite încă din antichitate pe post de leacuri naturale. Astfel romanii, vechii egipteni și grecii îl foloseau pentru diferite afecțiuni, iar incașii foloseau propolisul împotriva inflamațiilor însoțite de temperatură. Mențiuni istorice de utilizare a propolisului mai apar și în 1807 ca agent de tratare a rănilor sau în 1899 în războiul burilor în intervențiile chirurgicale.

Studiile au demonstrat că albinele produc propolisul predominant intern – într-un organ foarte mic situat între gușă și intestinul mediu, unde are loc prima fază a digestiei polenului și se produce acest reziduu rășinos, dar și extern – recoltat de albinele culegătoare de pe mugurii arborilor. Este bine cunoscut faptul că stupii poziționați în păduri vor produce mai mult propolis decât cei poziționați la câmpie.

Fiind un produs natural produs de albine și provenind dintr-o multitudine de plante, propolisul prezintă variații complexe ale compoziției chimice. Importanța acestui produs, datorată activității sale biologice în medicină, a atras atenția cercetătorilor asupra studiului compoziției chimice și a identificării compușilor chimici responsabili.

S-a descoperit că efectele biostimulatoare și bioregulatoare a propolisului sun datorate prezenței în compoziție a unor elemente ce servesc drept catalizatori ai activității biologice a organismului precum auxinele, flavonoidele si vitaminele. [1,

Alți compuși ce trebuie menționați în lista de substanțe bioactive sunt și microelementele prezente în propolis, făcându-se referire la metale și metaloide. Aceștia sunt factori prezenți în hrana minerală a plantelor și a microorganismelor, indispensabili în procesul de dezvoltare. Microelementele au capacitatea de a forma compuși complecși organo-minerali cu activitate biologică de tip oligodinamic ridicată, fiind grupate în 3 categorii majore: esențiale – precum Zn, Fe, I, Cu, Co, Mn, Mo; secundare – substanțe ce pot influența anumite procese metabolice, precum Br, Ni, V, F, Cr, Sr, Al; neesențiale – precum Si, Ru, Li, Ag, B, Hg.

S-a observat ca propolisul are, de asemenea, efecte bactericide și bacteriostatice puternice, reușind chiar sa oprească putrezirea și să conserve cadavrele albinelor de la baza stupului daca sunt învelite în propolis.

Culoarea propolisului variază în nuanțe neomogene si neuniform distribuite de la verde,la galben, maroniu, uneori până aproape de negru. Are o densitate mai mare decât cea a cerii de albine, este solubil în eter și cloroform, insolubil în apă și parțial solubil în alcool, temperatura de topire a propolisului fiind de 60-69°C, iar cea de solidificare de 15°C.

CAPITOLUL 1. CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ A PROPOLISULUI

1.1 Caracterizarea propolisului brut din China

Propolisul brut este produs de albine din substanțele rășinoase al anumitor plante amestecate cu salivă și ceară de albine, folosit pentru a sigila găurile din faguri, pereții interiori, și de a proteja intrarea de intruși. Acesta a fost, de asemenea, utilizat în medicamente populare în multe regiuni din lume, datorită proprietăților sale biologice extinse (antioxidative, antibacterian, antiinflamatoare, anticancerigene și antidiabetice). Peste 200 de compuși : flavonoide, terpenoide, acizi aromatici, acizi grași, esteri, fenoli, aldehide, cetone, etc. au fost găsiți în propolis. Flavonoidele, terpenoidele, acizii aromatici și esterii lor sunt responsabili pentru activitățile biologice ale propolisului.

Compoziția chimică a propolisului brut de multe ori variază în mare parte din cauza materiei prime din substanțele rășinoase din care provine, în funcție de regiunea geografică, floră și anotimpuri. Componentele principale din propolisul brut chinezesc sunt, de asemenea complexe și diferite, pentru că apicultorii migrează întotdeauna din sudul Chinei catre nord, urmărind flora prtoprie regiunii. De aceea, a fost necesar să se elaboreze o metodă de analiză a compoziției chimice a propolisului brut.

Până în prezent, s-au dezvoltat mai multe metode care includ metode spectrografice și cromatografice pentru a analiza compoziția chimică a propolisului. Cromatografia în strat subțire (TLC) și cromatografie de lichide de înaltă performanță (HPLC) au fost folosite pentru a investiga amprentele digitale ale propolisului excluzând originile lui geografice. HPLC-MS-ul s-a utilizat pentru a cuantifica convenabil flavonoidele, acizii aromatici și esterii din propolis. Cromatografia gazoasă cuplata cu spectrometria de masă (GC/MS) reprezintă metoda cea mai eficientă pentru studiul componentelor volatile ale propolisului. De asemenea, a fost aplicată cromatografia gazoasă și spectrometria de masă la temperaturi ridicate (HTHRGC (/ MS)) pentru a analiza mai multe clase de compuși, inclusiv flavonoide și esteri ai acizilor grași din extract de propolis, și compușii polari, cum ar fi acizii aromatici, acizii grași și polizaharidele.

Probele de propolis brut au fost colectate de la stupi de albine din provinciile Shandong (proba Taian (TA) și Linyi (LY)), Zhejiang (proba Zhoushan (ZS), Quzhou (QZ)), și Hubei (proba HB) din septembrie 2011 până în februarie 2012. Albinele de la cele cinci stupine aparțin Apis mellifera ligustica.

În figura 1.1 se observă că proba de propolis brut a început să elibereze componente când temperatura a atins 100°C și s-a încheiat la aproximativ 550°C, împreună cu creșterea temperaturii pirolizorului de la 70°C la 700°C. Pe parcursul procesului, maximele A și B au fost observate la aproximativ 200°C și 450°C. Rezultatele au sugerat ca vârful A corespunde eliberării componentelor cu greutate moleculară mică și punct de fierbere scăzut, iar vârful B corespunde eliberararii componentelor cu greutate moleculară mare și punct de fierbere ridicat. Toate componentele din propolisul brut ar putea fi complet eliberat la aproximativ 550°C. De aceea, temperatura optimă de piroliză a fost stabilită la 550°C.

Fig. 1.1. Analiza evoluției curbei (EGA) a probei de propolis brut (TA).

Figura 1.2 prezintă pirograma ionilor unei probe de propolis (TA) obținută la temperatura optimă de piroliză de 550°C.

Șaptezeci și șapte de compuși au fost prezentați în tabelul 1, împreună cu timpul de retenție (tR), headspace-ul relativ (PA) și RSDS (n=3) din PA, formula moleculară și masele moleculare.

Așa cum este prezentat în figura 1.2, peak-urile timpului de retenție de la 1 la 7 min au fost identificate ca fiind compuși cu moleculă mică, cum ar fi dioxidul de carbon și hidrocarburi. Terpenoidele cu timpul de retenție de la 10 la 16 min au fost observate cu privire la conținut variind de la 0,1% la 0,4. Au fost identificați unsprezece tipuri de acizi cu timpul de retenție 8-21 min, inclusiv 6 acizi aromatici și 5 acizi grași. Acidul ferulic și acidul cinamic au fost componente tipice între acizii aromatici din propolisul chinezesc.

Opt tipuri de flavonoide au fost observate în pirogramă la timpul de retenție între 22 și 26 min cu diverse conținuturi de la 1,0% până la 13,5%, prezentate în figura 1, cu numerele maxime compatibile cu cele din figura 1.2 și tabelul 1.

Fig. 1.2. Curentul total de ioni (TIC) pirograma de propolis (proba TA) de Py-CG/MS.

▲: Flavonoidele; ♦: Terpenoizii; ●: Acizii aromatici; AA: Alcanii; AE: Alchenoxizii.

Tabelul 1.1. Compuși de piroliză cu timpul de retenție (tR), temperatura programată, indici de retenție liniari (LTPRI), grad de similaritate, headspace (PA)%, și RSDS% pentru PA în TA propolis brut.

Hidrocarburile au fost observate, de asemenea, cu un procent semnificativ în piroliza propolisului brut. O serie de alchene cu numărul atomilor de carbon cuprins între 5 și 20 au fost găsite la timpul de retenție 20 min.. Doisprezece tipuri de hidrocarburi macromoleculare cu numarul de carboni între 23 și 33 au fost identificați la timpul de retenție 21-30 min, inclusiv 5 tipuri de n-alcani și 7 tipuri de n-alchene. Este interesant faptul că omologii cu un număr impar de atomi de carbon între C23 și C33 sunt n-alcani.

Pe scurt, compoziția chimică a propolisului se împarte în 8 categorii chimice distincte, cum ar fi: flavonoide, terpenoide, acizi, esteri, hidrocarburi, fenoli, alcooli, aldehide, cetone și altele cu conținutul respectiv de 52,8%, 2,3%, 10,9%, 0,5%, 20,3%, 8,3%, 2,2%, și 2,7%, prezentate în tabelul 1.1.

În plus, deviațiile standard relative ale suprafețelor de maxim au fost cuprinse între 1,1% și 14,0% în trei măsurători consecutive de 76 componente prezentate în tabelul 1.1. Rezultatele au sugerat că metoda dezvoltată CG/MS cu bună repetabilitate este potrivită pentru analizarea compoziției chimice în propolisul brut.

Așa cum este prezentat în figura 1.3 și tabelul 1.2, probele de propolis TA și LY obținute din Taian și Linyi din provincia Shandong din China, au arătat aproximativ aceleași peak-uri datorită distribuției similare de compoziție chimică.

Fig. 1.3. Pirograma probelor de propolis din diferite regiuni ale Chinei (ZS TA, LY, HB, QZ,). Conținutul compoziției chimice în probe a fost calculat prin metoda de normalizare a ariei picului.

Tabelul 1.2. Rezumatul distribuțiilor compoziției din probele de propolis brut cu diferențe deosebite.

Flavonoidele sunt categoria predominantă de compuși în ambele probe de propolis TA și LY cu un conținut de 52,8% și 54,9%, urmate de hidrocarburi și acizi. Cu toate acestea, probele ZS, QZ, și HB obținute din Zhoushan, Quzhou din provincia Zhejiang și Shennongjia din provincia Hubei, au rezultat peak-uri diferite, datorită compoziției lor chimice complet diferite. Principalele patru categorii de compuși din probele de propolis QZ sunt esteri (în principal esteri ai acizilor aromatici), hidrocarburi, aldehide și cetone, fenoli și alcooli, cu un conținut similar. În ceea ce privește probele de propolis HB și ZS, hidrocarburile sunt categoria predominantă de compuși cu un conținut de 52,0% și 47,0%. Conținutul de 32,4% de esteri din proba de propolis HB (esteri ai acizilor grași, în principal așa cum se arată în tabelul 2) și conținutul de 21.63% de terpenoide din propolisul ZS sunt categoriile secundare din compoziție. În probele QZ și HB s-au găsit puține flavonoide, în schimb în probele ZS nu s-au găsit deloc. Este demn de menționat faptul că monoterpenoidele, diterpenoidele și triterpenoidele au fost găsite doar în proba de propolis ZS și esterii acizilor grași au fost găsiți doar in proba de propolis HB. De asemenea triterpenoidele au fost detectate în propolisul din Cuba, Brazilia și Egipt. Este pentru prima dată când s-au identificat triterpenoide abundente în propolisul chinezesc.

În concluzie, metoda CG/MS a fost aplicată cu succes pentru analiza compoziției chimice în probele de propolis brut din China. 8 categorii de compuși chimici cuprinzând mai mult de 70 de compuși au fost caracterizați în propolisul brut, inclusiv flavonoide, terpenoide, acizi, esteri, hidrocarburi, fenoli și alcooli, aldehide și cetone, și altele. Mai mult decât atât, compoziția chimică a probelor de propolis a fost comparată cu diferite origini geografice. Conținutul de 8 ​​categorii de compuși din propolisul brut chinezesc a fost extrem de diferit în comparație cu categoriile predominante acestea fiind flavonoidele, esterii sau hidrocarburi. În plus, conținutul lor de compuși principali bioactivi precum flavonoidele și terpenoidele au variat în mare măsură cu 0-54.9% și respectiv 0.6-21.6%. Este dovedit faptul că Py-CG/MS este o metoda comodă, rapidă și extrem de sensibilă pentru analiza propolisului brut din China.

1.2 Extracția lichidă sub presiune a compușilor fenolici din propolisul din Anatolia și capacitățile lor de captare a radicalilor liberi

Propolisul nu poate fi utilizat ca materie primă și acesta trebuie să fie purificat prin extracție pentru a îndepărta materialul inert și să se păstreze fracția polifenolică.

Scopul major în studiul nostru a fost de a determina calitativ și cantitativ compușii fenolici selectați, activitatea antioxidanta și conținutul total compuși fenolici din propolisul din patru locații diferite din Anatolia.

Probele de propolis au fost colectate din patru localități diferite din Anatolia și anume: Bingol (BG), Rize (RZ), Tekirdag (TK) și Van (VN) (figura 5).

Fig. 5. Regiunea Anatolia

Extracția lichidă sub ​​presiune (ELP) a fost realizată de un sistem Dionex ASE 200 (Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA).

Analiza fenolilor s-a efectuat pe un Agilent seria 1100 de cromatografie lichidă, echipat cu un degazor în vid, o pompă cuaternară și un Agilent 1100, detector G 1315B DAD, conectat la un software HP ChemStation. Detectarea a fost realizată cu UV DAD scanând spectre de 210-360 nm.

Identificarea compușilor fenolici a fost realizată prin compararea timpilor de retenție și datelor spectrale cu cele ale standardelor autentice. Determinările cantitative au fost efectuate cu ajutorul curbelor de calibrare ale standardelor. Compușii probelor de propolis au fost enumerați în tabelul 1.3 ca mg/kg DPEE.

Tabelul 1.3. Compuși fenolici identificați și cuantificați

Conținutul fenolic total din probe a fost determinat utilizând metoda reactivului Folin & Ciocalteu.

În acest studiu, extracția lichidă sub ​​presiune a fost optimizată pentru extracția polifenolilor din probele de propolis solid în termen de amestec de solvenți, temperatură, timp de extracție și de presiune.

Natura solventului și temperatura sunt ce afectează randamentul extracției de ELP. S-a observat că temperatura de extracție este mai eficientă la 40°C, în timp ce, la 80°C cantitatea de polifenoli extrași a scăzut. Scăderea randamentului de extracție poate fi cauza unei posibile degradări a polifenolilor la temperaturi ridicate, cauzate de hidroliză.

Printre variabilele care afectează performanța procedurii ELP, presiunea statică este unul dintre cei mai importanți parametri și în general eficiența extracției crește odată cu presiunea.

Parametrii operaționali utilizați în extracție sunt prezentați în tabelul 1.4.

Tabelul 1.4. Parametri operaționali de extracție

Propolisul conține de obicei o varietate de compuși chimici inclusiv acizi fenolici, esteri, flavonoide, terpene, aminoacizi, aldehide aromatice și alcooli, acizi grași, stilbene și steroizi.

În acest studiu, eșantioanele de propolis din patru regiuni diferite ale Anatoliei au fost extrase prin metoda ELP și 13 fenoli au fost determinați prin sistem HPLC-DAD. Peak-urile relevante ale compușilor fenolici detectați și cuantificările lor au fost realizate folosind ecuațiile de calibrare prin rata de valori de normalizare a ariei (figura 1.4).

Fig. 1.4. Profilurile cromatografice în condițiile optime HPLC prezentate în experimentul înregistrat la 280nm a DPEE obținute din diferite locații ale Anatoliei și compușii standard: 1: Acid clorogenic (CHA), 2: Acidul cafeic (CA), 3: Procianidin-B2 (Procyn-B2), 4: Acid galic (GA), 5: Galocatechină (GCT), 6: Epigalocatechină (GECT), 7: Acid p-cumaric (p-CO), 8: Galat epicatechină (ECTG), 9: Epicatechină (ECT), 10: Miricetină (Myr), 11: Catechină (CT), 12: Floridzin (PHL), 13: Luteolină (Lut).

Rezultatele au arătat că GCT, CT, ECTG, CA și CHA au fost principalii constituenți fenolici din toate mostrele de propolis. Cu toate acestea, în proba din regiunea BG, nivelul CHA s-a dovedit a fi de 4,5, 3 și 23 ori mai mare decât cea a altor regiuni ale RZ, TK și respectiv VN. În regiunea RZ, CA, fenolii s-au dovedit a fi mai mult de 1,2, 1,4 și 2 ori mai mari în comparație cu regiunile BG, TK și VN. În plus față de aceste constatări, în regiunea VN, acidul p-cumaric este de patru ori mai mare decât în alte regiuni și valorile CT s-au dovedit a fi aproape identice cu regiunea BG și mai mare de 3,3 și 1,8 ori în regiunile TK și, respectiv, RZ (tabelul 1.3).

Variabilitatea constituenților din probele de propolis au arătat că acestea posedă compoziție chimică diferită, aceasta fiind dependentă de localizarea geografică; drept urmare, activitatea biologică a propolisului este strâns legată de funcția biogeografică (floră locală, climă și sezon).

Din punct de vedere cantitativ, comparat cu alte lucrări din literatura propolisului, cel anatolian este bogat din punct de vedere al compușilor fenolici.

Metodele de evaluare a capacităților de captare a radicalilor ale compușilor naturali și artificiali folosite au fost DPPH stabil și radicali ABTS, datorită simplității și timpului de comparație cu alte metode relativ scurt.

Când probele de propolis au fost investigate din punct de vedere al captării radicalilor, s-a constatat că în regiunea BG și RZ nivelul a fost mai mare cu valorile 497.8 ± 10,7 și 503,7 ± 1,6 mg TEAC g-1 DPEE. Cu toate acestea, TK a arătat rezultat statistic mai mic decât acele eșantioane cu 448.9 ± 4,8 mg TEAC g-1 DPEE și VN dovedind a avea cea mai mică capacitate de absorbție a radicalilor cu 409,6 ± 2,5 mg TEAC g-1 DPEE (p <0,05) (figura 7).

Fig. 1.5. Putera DPPH de absorbție a radicalilor echivalent Trolox de DPEE. Fiecare valoare este media de experimente triplicate cu bare de eroare care indică STDEV-uri (σ n-1).

Conform rezultatelor testului ABTS, similar cu DPPH, probele de propolis din BG și Rz au avut rezultate superioare exceptând o capacitate de absorbție puțin mai radicală a RZ comparativ cu BG (p <0,05) (figura 8).

Fig. 1.6. ABTS●+ putere de absorbție a radicalilor echivalent Trolox de DPEE. Fiecare valoare este media de experimente triplicate cu bare de eroare care indică STDEV-uri (σ n-1).

Capacitățile de captare a radicalilor ale probelor aparținând TK și VN măsurate sunt mai mici. Capacitatea de captare a radicalilor ABTS●+ din probele de propolis colectate din BG, RZ, TK și VN a fost de 279,7 ± 2,4, 285,3 ± 7,8, 267,9 ± 8,4 și 237,7 ± 1,8 mg TEAC respectiv propolis DPEE g-1.

Conform analizei, conținutul total fenolic BG și Rz au avut rezultate relativ mari și au fost evaluate prin analiză statistică (p <0,05). În paralel cu testele de capacitate antiradicalice, probele TK și VN au arătat rezultate mai slabe (figura 1.7).

Fig. 1.7. Conținutul total de acizi fenolici și acid galic echivalent de DPEE. Fiecare valoare este medie de experimente triplicat cu bare de eroare care indică STDEV-uri (σ n-1).

În concluzie, suma substanțelor fenolice individuale este direct proporțională cu conținutul total de fenoli și capacitatea de captare a radicalilor al probelor de propolis.

1.3 Analiza compușilor volatili din propolisul din diferite regiuni

Compoziția chimică a propolisului depinde de originea sa geografică, specii sau rase de albine și sezonul de colectare în regiunile în care poate fi colectat pe tot parcursul anului.

Acest studiu a fost axat pe proiecția peak-urilor compușilor volatili din propolis cu scopul de a-l diferenția în funcție de regiunea geografică de proveniență. A fost efectuată analiza comparativă a compoziției compușilor volatili din propolis colectat din diferite regiuni: America de Sud, Europa de Est și Asia. Probele au fost analizate cu ajutorul headspace-ului static, cu cromatografie gazoasă și spectrometrie de masă cu injecție directă, prin aplicarea unor tehnici statistice "data mining", care includ date pre-procesare, analiza componentelor principali și apoi clasificare.

Probele de propolis pentru acest studiu au fost obținute din: Brazilia, Estonia și China și trei probe din diferite locații din Uruguay.

Analiza a fost realizată folosind sistemul GC-MS (Shimadzu, Tokyo, Japonia), format din GC2010 cromatograf de gaze și QP2010 spectrometru de masa cuadripolar si autosampler CTC Combi-Pal.

Identificarea compușilor a fost realizată în conformitate cu spectrele lor de masă (NIST v1.7). Identificarea pozitivă a fost asumată atunci când au fost realizate potriviri (de 90% și peste) a spectrelor de masă.

Pentru repetabilitate metrologică a măsurătorilor fiecare probă de propolis a fost analizată de 6 ori, cu excepția probei cu numărul 3 din Uruguay, care a fost analizată de 5 ori. După aplicarea metodei GC-MS s-au găsit 24, 11, 30, 21, 33 și 53 de componente in probele de propolis brazilian, estonian, chinezesc și, respectiv, uruguayan 1, 2 și 3. Conform acestor rezultate, matricea de date a [35 x 104] a fost formată pentru analize suplimentare.

Tabelul 1.5. Compușii volatili predominanți identificați în propolis.

o datele nu sunt disponibile, de exemplu, autorii nu indică specia de albine precisă.

În primul rând, trebuie menționat că diferența de culoare a tuturor probelor de propolis a fost evidentă: această proprietate a variat de la verde opac – proba braziliană, la maro închis lucios (aproape negru) – proba din China. Culoarea propolisului depinde de sursa sa botanică. Principala sursă botanică a propolisului din Europa, regiunile non-tropicale din Asia și America de Nord este Populus spp. (plop). Pe lângă principalele surse, albinele folosesc de asemenea pin, tei, salcie, cireș, măr și alți copaci. În regiunile tropicale nu sunt plopi, prin urmare, albinele folosesc alte surse vegetale de propolis. O sursă botanică de propolis brazilian verde este Baccaris dracunculifolia (asteraceae), o plantă braziliană nativă, numită "alecrim". Alte surse vegetale populare de propolis brazilian sunt araucaria angustifolia și citriodora eucalipt. Analiza gaz cromatografică aplicată a arătat diferențe semnificative ale compoziției de substanțe volatile din propolis, colectate în diferite regiuni (figura 1.8). Un total de 104 de compuși diferiți au fost găsiți în partea superioară a probelor.

Fig. 1.8. Cromatogramele GC-MS obținute din peak-urileale probelor de propolis testate.

Cantitatea și diversitatea cea mai mare de compuși volatili obținute au fost din peak-urile probelor din China și Uruguay, în timp ce cea mai mică cantitate obținută a fost de la proba de propolis estonian (tabelul 1.6).

Compușii identificați aparțin în principal claselor de alcooli, aldehide, monoterpene și politerpene. Monoterpenele, cum ar fi α- și β-pineni au predominat în toate probele, cu excepția propolisului chinezesc în care nu au fost descoperiți acești compuși. Metoda hidrodistilării a fost utilizată pentru a analiza și identifica α-pinenul ca și constituent major, care se găsește în patru din cele cinci eșantioane de propolis din Grecia a scăzut în intervalul 7.9-45.8%, în timp ce printre compușii volatili din propolisul tropical acest compus a fost raportat în sume mici (până la 1,6%). α-pinenul s-a aflat în mai mult de jumătate din toate substanțele volatile din propolisul brazilian și uruguayan nr. 1 (52.50 ± 2,91 și respectiv 53.41 ± 0,81%); cantități ușor mai mici au fost găsite în propolisul uruguayan nr. 2 (40.45 ± 2,38%) și aproape dublu mai mic în Uruguay nr. 3 (22,96 ± 2,80%) și din Estonia (20.57 ± 8.39%). Propolisul uruguayan 3 a fost proba cu cantitatea mai mare de β-pinen (27,44 ± 1,07%) decât α-pinen (22,96 ± 2,80%). Această probă sa remarcat, de asemenea o mare cantitate de limonen (15.58 ± 0,57%) și cis – β-ocimene (7,42 ± 0,41%), care a fost găsit numai în acest eșantion de propolis. Un conținut ridicat de limonen, (10,5% și 11,2%)a fost găsit în propolisul din Croația și Brazilia, din regiunea Jaguari. Eșantionul de propolis brazilian testat a conținut 1,13 ± 0,14% din limonen. Cantități mari de α- și β-pineni (57.0-62.0% și 12.5-29.2%) au fost raportate în propolisul din Brazilia. Conform rezultatelor de anchetă, în ciuda valorilor mari de α- și β-pineni analizate, propolisul brazilian se distinge printr-o mare cantitate de croton-aldehide β-metil, 10,1 ± 1,45%, ceea ce nu a fost determinat în probele testate din alte regiuni.

β-metil croton-aldehidele au fost de asemenea detectate în unele probe de propolis de origine chineză. Propolisul estonian s-a diferențiat prin cantități mari de eucaliptol (25,95 ± 10,64%), benzaldehidă (10,85 ± 0,92%) și compus neidentificat (12.20 ± 0,60%). Eucaliptolul nu a fost găsit în alte probe de propolis testate (vezi tabelul 1.6).

Proba de propolis din China a fost cu totul diferită de mostrele din Europa si America de Sud. 44 din 53 de compuși au fost găsiți doar în propolisul chinezesc. Această probă poate fi caracterizată prin cantități mari de alcooli 3-metil-3-buten-1-ol și 3-metil-2-buten-1-ol, (40.33 ± 0,44% și respectiv 11,57 ± 0,26%), ester-4-acetat-penten-1-il (9,04 ± 0,36%) și politerpene α-longipinene (9,41 ± 0,25%). Ultimul menționat a fost găsit doar în propolisul din China (Tabelul 1.6). Compușii volatili 3-metil-3-buten-1-ol, 3-metil-2-buten-1-ol și 4-penten-1-il acetat au fost identificați în unele probe de propolis chinezesc. Au fost testate 12 probe de propolis din patru regiuni din China și s-a găsit 3-metil-3-buten-1-ol și 3-metil-2-buten-1-ol în probele din toate regiunile, iar 4-penten-1 acetat era constitutiv doar unui eșantion.

Peak-ul propolisului chinezesc a fost cel mai bogat în compuși volatili, în timp ce probele estoniene au fost cele mai sărace. În funcție de peak-ul GC, probele de propolis testate sunt aliniate în următoarea ordine: chineză > uruguayană 3 > uruguayană 1 > braziliană > uruguayană 2 > estoniană (tabelul 1.6). Motivul pentru care cantitatea de compuși volatili din propolisul estonian este redusă poate fi ceara și alte materiale de balast, a căror prezență a fost vizibilă în eșantion.

Tabelul 1.6. Compoziția procentuală a compușilor volatili identificați în probele de propolis (valorile reprezintă standardul ± mediul abatererii de șase replici).

Tabelul 1.6. (continuare)

În cocluzie în cele șase probe de propolis din China, Estonia, Brazilia și trei regiuni din Uruguay au existat 104 compuși identificați în peak-urile probelor. S-au identificat monoterpenele α- și β-pineni din 50.4-77.6% din compușii volatili din propolisul colectat în zona temperată, adică Brazilia și Uruguay. Eucaliptolul și α-pinenul au fost principalii compuși în peak-urile din propolisul estonian (25,9 și, respectiv 20,6%). Propolisul chinezesc se distinge prin cantități mari de alcool 3-metil-3-buten-1-ol (40,3%) și absența α- și β-pinenilor. Cantitatea și diversitatea cea mai mare de compuși volatili a fost obținuță din peak-urile propolisului din China și o probă din Uruguay, în timp ce cea mai mică sumă a fost obținută din propolisul estonian.

1.4 Determinarea CG/SM a precursorilor botanici din propolisul eurasiatic

Concentrația polifenolilor din propolis depinde de compoziția chimică a precursorilor din plante. S-a constatat că în scopul de a face propolis, albinele adună exudate rășinoase din mugurii anumitor copaci. În emisfera nordica, acestea includ în cea mai mare parte diferite specii de plop (Populus sp.) și mesteacăn (Betula sp.).

Investigațiile experimentale extensive au arătat că principalul precursor al propolisului european este exudatul de plop negru (Populus nigra). Acest tip de propolis, cel mai frecvent investigat și găsit în mare parte în regiunile centrale și de sud ale Europei, este cel mai bine caracterizat atât din punct de vedere chimic cât și farmacologic.

Din acest motiv, s-a încercat analiza compoziției chimice nu numai a posibililor precursori botanici dar și a propolisului din regiunile de climă temperată și rece. Scopul acestui studiu a fost de a detecta precursorii botanici din propolis pe baza analizei CG-SM.

Piridina și bis (trimetilsilil) trifluoracetamida (BSTFA) conținând 1% trimetilclorosilan au fost achiziționate de la Sigma Aldrich (Poznan', Polonia). Extracțiile au fost efectuate în eter dietilic (POCH SA, Gliwice, Polonia).

Mugurii a două specii de mesteacăn (Betula pubesces Ehrh. și B. pendula Roth.) au fost colectați de pe loturile experimentale ale Institutului Forestier al Academiei de Științe din Rusia, în apropiere de Petrozavodsk, Rusia, și de la Arboretum aparținând Institutului de Dendrologie, Academia de Științe din Polonia. Mugurii de plop (Populus tremula), două soiuri de plop negru (P. nigra și P. nigra var. Piramidalis) și plop Sichuan (Populus szechuanica) au fost colectați tot de la Arboretum.

Probele de propolis brut au fost colectate și furnizate în vara anului 2011 de către apicultori individuali din diferite regiuni din Polonia, Rusia, Belarus, Ucraina, Republica Cehă, Bulgaria și Croația.

Atât probele de propolis cât și mugurii au fost extrași cu ajutorul eterului dietilic.

Analiza s-a făcut cu ajutorul unui gaz cromatograf HP 6890 cuplat cu un detector de masă MSD 5973 (Agilent Technologies, USA).

Metoda tradițională de extracție este macerarea, care durează până la câteva zile. Alegerea de extracție eterică a rezultat din faptul că în experimentele preliminare s-a devenit clar că acetatul de etil elimină considerabil cantități de apă din mugurii proaspeți, care provoacă complicații în etapele suplimentare de pregătire a probelor și anume în timpul sililării. Pentru a îndepărta apa, s-a folosit o etapă suplimentară de liofilizare a extractelor obținute după evaporarea EtAc. Mai mult, EtAc elimină, de asemenea, monozaharidele, cum ar fi glucoza și fructoza din muguri.

Cantități mai mari de zaharuri trec în soluție, după extracție cu etanol 70%. În extractele obținute în acest fel, s-au constatat mono și dizaharide, în sumă de până la 25% din curentul ionic total (TIC). Aceste date sunt conforme cu cele disponibile în literatură. Zaharurile nu sunt de interes în aceasta cercetare. Cu toate acestea, conținutul ridicat al acestor compuși împiedică determinarea substanțelor fenolice cu valori similare ale timpilor de retenție cromatografică. Deoarece zaharurile nu se dizolvă în eter și foarte puțin în apă, utilizarea sa pare a fi justificată.

Analiza exudatelor de muguri de arbori a fost efectuată în scopul de a găsi substanțe specifice (sau grupurile acestora) permițând astfel să se precizeze rolul acestor plante în formarea compoziției chimice a propolisului. În părțile nordice și centrale din Europa și Asia există trei reprezentanți ai familiei Populus: plop negru (P. nigra), varietatea piramidală (. P. nigra var piramidalis) numit uneori ”Italica” și Aspen (P. tremula). În afară de cei de mai sus, precursorii de plante probabile ale propolisului pot fi găsiți în două specii principale de mesteacăn, și anume mesteacăn argintiu (Betula pendula) și mesteacăn alb (Betula pubescens).

În cadrul studiului au fost identificați mai mult de 260 de compuși individuali din exudate de plop și mai mult de 300 de compuși, dintre care unele pentru prima dată, în exudatul din mesteacăn. Din cauza numărului lor mare, doar principalele grupuri și compuși selectați care le aparțin sunt prezentate în această secțiune.

În tabelul 7.1 sunt prezentate compozițiile exudatelor de muguri de plante și specii de plop și în tabelul 7.2 compoziția extractelor celor șase probe de propolis din cele cinci țări europene. Bazându-se pe datele culese cu privire la conținutul relativ a componentelor individuale și grupurile lor, pot fi făcute concluzii cu privire la precursorii botanici majori din propolis. Cu toate acestea, identificarea CG-SM a câtorva zeci de substanțe găsite într-o probă este foarte laborioasă și consumatoare de timp. Prin urmare, este de dorit să se dezvolte o metodă simplă și rapidă pentru a identifica originile botanice ale propolisului.

Tabelul 7.1 Exudatele de muguri de plante și specii de plop din cinci țări europene

Tabelul 7.2 Compoziția extractelor celor șase probe de propolis din cinci țări europene

O trăsătură comună a tuturor exudatelor investigate este conținutul ridicat de fenilpropenoide, acizi hydroxicinamici și derivații lor. În același timp, prezența caracteristicilor reprezentative a acestui grup pot fi observate în secrețiile mugurilor de la diferite specii de copaci. De exemplu, exudatele mugurilor de trei specii de plop conțin cantități mari de alcool alifatic nesaturat C5H10O, precum și alcool aromatic 2-feniletanol. Exudatele mugurilor de aspen sunt lipsiți de aceste substanțe. Pe de altă parte, ele posedă un conținut foarte ridicat (peste 50% din TIC) din glicerinele fenilpropenoidice. Fenilpropenoidele din mesteacănul alb sunt reprezentate de esterii p-cumaric și ferulic ai hidroxicariofilenelor C15H24O.

Trebuie remarcat aici faptul că intervalele indicilor de retenție cromatografică a reprezentanților fiecăreia dintre cele trei grupuri de fenilpropenoide pe coloana cu fază staționară nepolară nu se suprapun. Pentru prima dintre ele (esteri ai acidului cafeic), gama de IT este 2150-2800 UI, pentru politerpenolii fenilpropenoidelor 3080 – 3350 UI și pentru derivații glicerinei 3800-4260 UI. În plus, indiferent de diferențele în compoziția chimică, ionul cu m/z = 219 este prezent în spectrele de masă a tuturor fenilpropenoidelor. Aceste caracteristici ne dau posibilitatea unei detecții rapide a contribuției principalilor precursori botanici din extractele de propolis.

În figura 1.9, fragmentele de cromatograme de ioni (m/z 219) a extractelor exudate din muguri sunt prezentate în coloana din stânga, iar cel din dreapta prezintă analog EIC a extractelor de propolis, a cărui compoziție este prezentată în tabelul 7.2.

Fig. 1.9. Mugurii: A – P. nigra; B – P. nigra var. piramidalis; C – P. tremula; D – B. pubescens; E – B. pendula; F – P. czechuanica (de la 40 la 320 LC LC la rata de 3 LC/min). Propolises: P-1 – Croatia (plop + plop de munte); -P 2 – Ucraina, Crimeea (plop pur); -P 3 – Belarus (plop-aspen); -P 4 – Rusia, Ferapontovo (mesteacan cu plop amestec); -P 5 – Polonia (plop-mesteacan-plop); -P 6 – Rusia, regiunea Far-Est (Sichuan plop). Compuși: 1 – 3-metil-3-butenil- (E) -cafeat; 2 – 3 a-metil-2-butenyl- (E) -caffeate; 3 – feniletil- (E) -caffeate; 4 – 1,3-di-p-coumaroylglycerol; 5 – 2-acetil-1,3-di-p-coumaroylglycerol; 6 – 2-acetil-1-caffeoyl-3-p-coumaroylglycerol; 7-6-hidroxi-b -caryophyllene-p-coumarate; 8-14-hidroxi b -caryophyllene-p-coumarate.

Prima probă (P-1), luată din zona de munte a Croației, în plus față de picurile caracteristice pentru exudatele de plop negru, conține ioni care au fost creați ca rezultat al fragmentării glicerinei fenilpropenoide. Proba de propolis din Crimeea (P-2) poate fi numită ''plop pur''. În propolisul colectat din Belarus (P-3) nu sunt doar semnale de plop si aspen, dar este prezent și un semnal slab de mesteacăn alb. Propolisul din regiunea de nord-est a Rusiei (P-4) a fost dovedit a fi aproape ''mesteacăn pur''. În proba de propolis polonez (P-5) semnalul probei de mesteacăn este mai pronunțat (comparație cu P-3). Unele limitări ale abordărilor sugerate pot fi asociate cu compoziția specifică a vegetației în diferite regiuni din Eurasia. Un exemplu în acest sens poate fi EIC de P-6 de propolis în figura 12. Prezența fenilpropenoidele ale alcoolilor C5H10O și ale glicerinei poate fi interpretată ca având un conținut semnificativ de exudate de muguri de plop negru și aspen în acest propolis. Cu toate acestea, proba P-6 provine din zona climatică aproape subtropicală (Parcul Național ''Kedrovaya Pad'' 42°44° N, 131°4.2° E), situată dincolo de apariția naturală atât a plopului cât și a plopului negru. Cel mai probabil precursor botanic al acestui propolis, găsit acolo, este plop Sichuan, un alt reprezentant al Populusgenus, cu fenilpropenoid-glicerină prezentă în exudatele sale amice. Poate fi de așteptat ca aceste tipuri de particularități în componența propolisului să fie de asemenea înregistrate în regiunile apariției mesteacănului Litvinov (Betula litwinowii). În exudatele de muguri de la acest copac, tipice pentru Caucaz și regiunile muntoase ale Turciei, au fost găsite nu doar (tipice pentru Litvinov mesteacan) hidoxicariofilene C15H26O (14-hidroxi-4,5-dihidro-isocariofilen și 14-hidroxi-4,5-dihidrocariofilen) dar și fenilpropenoide ale acestor politerpene.

În concluzie acest studiu a permis pentru prima dată caracterizarea originii botanice a propolisului eurasiatic. Mai întâi de toate, în majoritatea cazurilor analizate, propolisul este de origine mixtă. Pot fi detectate frecvent semne de exudate din mai multe plante în compoziția lui. În al doilea rând, ponderea exudatelor de plop negru în probele de propolis se mărește din regiunile situate în partea de nord spre cele situate în partea de sud. Cea de-a treia concluzie se referă la comportamentul selectiv al albinelor în timpul colectării de exudate din plante. Aceasta se referă în principal la două specii principale de mesteacan eurasiatic. Datele obținute au arătat că doar un singur exudat provenind din mesteacănul alb, poate fi găsit în componența propolisului nordic. Nici unul dintre triterpenoide, dipterocarpol, damaradien-3-onă, caracteristice mesteacănului, nu au fost detectați în niciuna din cele 50 de probe de propolis analizate. Este posibil ca comportamentul selectiv al albinelor să fie conectat cu conținutul foarte scăzut de fenoli din exudatele de muguri de mesteacan argintiu ( tabelul 7 ), adică substanțele principal responsabile pentru proprietățile antibacteriene ale propolisului, datorită căruia sunt menținute condițiile sterile în stup.

1.5 Identificarea originii geografice a propolisului cu ajutorul GC-MS și nasul electronic combinat cu analiza componentelor principale

Componentele volatile ale propolisului diferă în funcție de originile sale geografice și botanice, în principal din cauză ca albinele aduna rășini și exudate vegetale din sursele vegetale disponibile, care variază de la regiune la regiune în funcție de diferite condiții climatice, teren, disponibilitatea apei și a altor factori de mediu. Cele mai importante surse botanice ale propolisului sunt plopi, mesteceni, sălcii, ulmi, pini, stejari și alții.

S-a demonstrat chimic și acceptat la scală generală că principalele surse de propolis din China sunt exudatele de muguri de specii de plop și hibrizii acestora.

În prezent, certificarea originii geografice a propolisului a stârnit un interes în creștere. Consistența compușilor volatili din propolis depinde foarte mult de regiunea geografică din care este colectat. Fracțiunea volatilă este una dintre cele mai importante atribute de calitate care definește caracterul organoleptic al propolisului și are o mare influență asupra aprecierii acesteia de către consumatori. Compoziția propolisului este foarte complexă, deoarece diferite clase de compuși volatili (aldehide, cetone, alcooli, esteri, terpene, acizi, etc.) sunt prezente în profilul chimic al propolisului.

Recent, mai multe metode de analiză bazate pe tehnici cromatografice, tehnici de spectrometrie de masă, cum ar fi HPLC, TLC și spectrometria de masă cu ionizare prin pulverizare sonică în atmosferă ambientală (EASI-MS), au fost cel mai frecvent folosite până acum pentru a determina originea geografică a propolisului.

Astfel, în această lucrare, identificarea originii geografice a propolisului a fost efectuată de către DHS – GC/MS și nasul electronic. S-au studiat componentele volatile a doisprezece probe de propolis din patru regiuni geografice diferite ale Chinei, cu ajutorul extracției dinamice a spațiului superior (DHS), urmată de analiza GC-MS-O. Datele cromatografice au fost apoi prezentate analizei statistice, cum ar fi analiza componentelor principale (APC), în scopul de a detecta compușii volatili care pot diferenția probele de propolis din diferite regiuni ale Chinei.

Doisprezece probe de propolis brut au fost furnizate de apicultori din 4 regiuni geografice diferite din China și au fost colectate în perioada octombrie 2011 și decembrie 2011. Detalii specifice pe origine, culoare, textură a probelor de propolis sunt enumerate în tabelul 8.

Tabelul 1.8. Detalii specifice pe origine, culoare, textură a probelor de propolis

Pentru determinarea substanțelor volatile din propolis a fost utilizat un dispozitiv cu sistem headspace dinamic combinat cu o unitate de desorbție termică (UDT) conectată la un sistem CG-SM.

Analiza cromatogrfică s-a făcut cu ajutorul unui gaz cromatograf 7890N (Agilent Technologies), cu un detector spectrometru de masă selectiv Agilent 5975 (MSD) și echipat cu o coloană capilară DB-5 (30m×0,25mm, grosime film 0,25μm, Agilent Technologies).

Cromatografia gazoasă-olfacometrică s-a realizat cu un port Sniffer 9000, (Brechbühler, Elveția) cuplat la un instrument GC-MS (7890A-5875C, Agilent Technologies, Inc.).

Patru jurați instruiți au participat la analiza frecvenței de detectare folosind analiza GC-O. Juriul a constat într-un ansamblu mixt de ambele sexe, cu vârste cuprinse între 20 și 35 de ani. Participanții au fost instruiți înainte de analiza senzorială, în scopul de a se familiariza cu o descriere a mirosului folosind soluții de odorizante artificiale și diferite probe de propolis. În total, opt GC-O au fost efectuate (câte două pentru fiecare evaluator). Mirosul compușilor activi percepuți de către jurati a fost înregistrat ca timpul de debut și sfârșit în timp ce miroseau efluentul din masca de mirosire. Juratul a notat de asemenea caracteristica mirosului perceput și cât și intensitatea acestuia. La portul de mirosire orice odorizant care a avut frecvențe de detectare totale ≥2 a fost considerat arbitrar că are potențial de activitate aromatică.

Un nas electronic GC Flash (Alpha MOS Heracle, Franța) a fost utilizat pentru a discrimina șabloanele de miros ale diferitelor modele aromatice. Condiția este după cum urmează: 0,5 g de probe de propolis ras se prepară separat într-un flacon cu capac filetant cu barieră antiseptică și echilibrat timp de 200s la 50°C. Ulterior, headspace-ul aromei de deasupra probei a fost introdus în nasul electronic, la o viteză de 270μ l/s. Programul temperaturii coloanei a fost de 40°C (1 min) – 2°C/min – 200°C (3 min). Temperatura injectorului și a detectorului a fost stabilită la 180°C și respectiv 220°C. Fiecare analiză a fost repetată de cinci ori, iar toate aceste date de răspuns analizate au fost listate de un soft (Alpha version3.0.0 Soft, Toulouse, Franța) din nasul electronic. În fiecare test, fiecare probă a fost reprodusă de cel puțin 5 ori.

Compușii volatili identificați în aceste probe de propolis au fost prezentate în tabelul 1.9.

Tabelul 1. 9. Compușii volatili din propolis

RT: Timp de retenție (minute).

Apariție: 1, compușii identificați în probele DS (DS1, DS2, DS3); 2, compușii identificați în probele YT (YT1, YT2, YT3,); 3, compușii identificați în probele SS (SS1, SS2, SS3); 4, compușii identificați în probele DZ (DZ1, DZ2, DZ3).

Valorile medii (media ± deviația standard) ale concentrațiilor celor 32 de compuși volatili determinate în triplicat pentru cele patru grupe ale probelor de propolis sunt prezentate în tabelul 1.10.

Tabelul 1.10. Valorile medii ale concentrațiilor

Din cei 99 de compuși volatili identificați în probele de propolis investigate, 78 compuși aparțin unor clase chimice diferite: A-acizi (6); B-esteri (8); C-alcooli (10); D-terpene (31); E-olefine (3) și F-aromatice (20). Codul clasei compușilor a fost dat la fiecare specie chimică pentru etichetare.

Componentele volatile cu concentrații ridicate nu au jucat întotdeauna un rol important în contribuția mirosului, deoarece nivelul de miros a fost legat de pragul acestora. GC-O se bazează pe principiul că teoretic oamenii pot detecta cel puțin 10 – 19 moli din aroma unei substanțe și GC-O poate diferenția cu ușurință care compuși nu au nimic de-a face cu mirosul și care sunt componentele aromatice active.

Așa cum se arată în tabelul 1.11, un total de 28 de substanțele volatile sunt determinate să aibă impact aromatic folosind metoda de frecvență de detectare (detectare frecvență ≥ 2).

Tabelul 1.11. Componentele principale arom-active determinate de DHS și CG – O a probelor de propolis din diferite regiuni ale Chinei, utilizând DFA.

Dintre acești compuși, 22 s-au calificat pe baza spectrelor de masă, RI și descriptori de miros, în timp ce șase compuși (cum ar fi 3-carenă, octanal, furfurol, vanilină, guaiol, acidul octanoic), menționati de către toți jurații, nu erau detectați prin GC-MS, cauza fiind concentrația acestuia aflată sub ​​limita de detecție a metodei folosite. Treisprezece componente, și anume, A1, A2, A5, C2, C4, C5, C7, C9, F4, G8, G12, vanilină și guaiol au fost detectate de către toți evaluatorii, indicând contribuția mai activă la profilul aromatic al propolisului.

În probele de propolis DS au fost identificați un total de 20 de compuși de aromă activi. După cum se poate vedea din tabelele 1.11 și 1.12, nouă compuși s-au dovedit a fi cei mai importanți compuși aromatici activi printre cele 20 de probe depropolis DS, și anume A1, C2, C5, C7, C9, G8, G12, furfurol și vanilină. Conform evaluării mirosului și descrierea mirosului de jurat, se poate concluziona că aroma de acru în propolisul DS ar putea fi cauzat de A1și A2; mirosul de plante și ierboase poate fi datorată prezenței C5, D5 și G12; mirosul floral și fructat ar putea fi cauzat de C7, C9, D2, octanal și vanilină. În plus, 3-carene (rășină), octanal (săpun, fructe) și furfurol (murat, prăjit) au fost găsite doar în probele de propolis DS.

Tabelul 1.12. Principalii compuși volatili în diferite probe de propolis.

După cum se poate vedea din tabelele 1.11 și 1.12, opt compuși (A2, B6, C2, C7, C9, D3, F4 și guaiol) s-au dovedit a fi cei mai importanți compuși de aromă activi în cei 21 de compuși de aromă activi identificați în probele YT de propolis. Conform evaluării mirosului și descrierea rapoartelor de miros, se poate concluziona că mirosul vaporilor s-ar putea datora prezenței B6; Aroma înțepătoare în propolisul YT ar putea fi cauzată de C2, G12; aroma florală și fructată ar putea fi datorată de B7, C7, C9, D2 și G6; mirosul lemnos s-ar putea datora prezenței guaiolului; aroma de brânză ar putea fi dată de acidul octanoic.

În probele de propolis SS au fost identificați un total de 22 de compuși de aromă activi. După cum se poate vedea în tabelele 1.11 și 1.12, s-au găsit șase cei mai importanți compuși de aromă activi printre cei 22 de compuși din propolisul SS, care erau A1, C2, C5, F4, G8, G12 și acid octanoic. Conform evaluării mirosului și descrierea raportate de miros, se poate concluziona că aroma înțepătoare din propolisul SS ar putea fi cauzat de A1, A2; aroma de cauciuc ar putea fi datorată de C2, F2, F4 și G12; aroma de brânză ar putea fi datorată de acidul octanoic; mirosul de plante și ierburi se poate datora prezenței C5, D5; aroma de migdale ar putea fi datorată de G8. În plus, D23 (lemn, dulce) si D30 (lemn, balsamic) au fost găsite doar în probele de propolis SS. Acești compuși volatili au contribuit foarte mult la mirosul propolisului SS.

După cum se poate vedea din tabelele 1.11 și 1.12, șapte compuși (A1, A5, B7, C5, C7, C9 și vanilină) s-au dovedit a fi cei mai importanți compuși de aromă activi în rândul a 19 compuși de aromă activi identificați în probele de propolis DZ. Conform rapoartelor evaluării mirosului și descrierea mirosului, se poate concluziona că aroma înțepătoare în propolisul DZ poate fi cauzată de A1 și A2; aroma de rânced ar putea fi cauzată de A5; aroma florală și fructată ar putea fi cauzată de B7, C7 și C9; mirosul de vanilie s-ar putea datora prezenței de vanilină. În plus, C3 (vin, ceapă) au fost găsite doar in probele de propolis DZ.

Analizele de nas electronic cuplate cu analiza compușilor principali au fost efectuate cu aceleași probe de propolis utilizate de GC-MS. Pentru o mai bună vizualizare de date, analiza compușilor principali a fost efectuată pentru a identifica modele de corelație cu variabile de compoziție individuale implicate în separarea între diferite probe de propolis, care a fost realizată prin utilizarea de semnale corespunzătoare a 5 expuneri repetate de fiecare probă (figura 1.10). Datele au fost transformate în bidimensional (2D) sau tridimensional (3D) pentru a coordona cu vectorii de proiecție necorelați care păstrează cele mai importante informații din datele originale. Probele cu origine botanică similară sunt situate aproape una de alta. În plus, diferențele dintre grupuri au fost vizualizate mai clar de graficul 3D al analizei compușilor principali (figura 13).

Așa cum se arată în figura 1.10 fiecare grup a fost în mod clar distins de alte grupuri, cu ajutorul analizei compușilor principali și nu a existat o diferență evidentă între probele de propolis. Există o separare principală între diferite probe de propolis, toate probele de propolis fiind împărțite în patru grupe (DS, YT, SS și DZ). Graficul scorului pentru primele două componente principale (PC1 versus PC2) este prezentat în figura 1.10. Acesta arată că separarea de-a lungul PC1 reprezentând 82.81% din variația din setul de probă, în timp ce separarea pe PC2 a reprezentat 15,79%.

Fig. 1.10. Reprezentarea grafică tridimensională (3D) a propolisului din diferite origini a nasului electronic.

Rezultatele au indicat că probele de propolis din diferite origini botanice pot fi distinse în funcție de diferite mirosuri cu ajutorul nasului electronic și metoda APC. De aceea, în funcție de rezultatele obținute, nasul electronic poate fi folosit ca un instrument pentru analiză rapidă, care poate ajuta să distingă propolisul din diferite regiuni, luând în considerare concentrația de compuși volatili. Constatările din analizele efectuate pe probele de propolis au prezentat un acord bun cu rezultatele obținute prin intermediul DHS-GC/MS, ambele au separat probele de propolis în patru grupuri diferite și au sugerat utilitatea nasului electronic ca instrument de identificare pentru propolis.

În concluzie, în acest studiu, s-au clasificat probele de propolis în patru grupuri pe baza originilor geografice diferite, cu ajutorul GC – MS și nasului electronic. Rezultatele preliminare confirmă utilitatea GC- MS și a nasului electronic pentru clasificarea și controlul calității propolisului.

1.6 Aspecte terapeutice și utilizări ale propolisului

Propolisul este bogat în constituenți biochimici și mai mult de 300 de compusi au fost identificati în el (polifenoli, flavonoide, acizi fenolici, esterii lor, aldehide și cetone fenolici, terpene, steroli, vitamine, aminoacizi și alții). [10 ]

Deși compoziția chimică a propolisului este complexă și este semnificativ variabilă în funcție de zonele geografice, timpul de colectare și sursa botanică, activitățile farmaceutice ale propolisului sunt asociate în principal cu fracțiunile de polifenoli biologic activi, inclusiv flavonoide și acizi fenolici, ar fi cafeici, ferulici, p-cumarici și cinamici. [8, 20, ]

Flavonoidele sunt metaboliți omniprezenți în plante, care nu sunt indispensabile pentru supraviețuirea plantelor, dar sunt bioactive și prezintă diverse propietăți terapeutice, de exemplu, antioxidative, antiproliferative, antitumorale, antiinflamatorii. [18 ]

Studiile arata ca flavonoidele au fost folosite pentru a preveni și trata multe boli, inclusiv acnee,infecții respiratorii, boli gastro-intestinale si infectii ale tractului urinar, și se așteaptă să fie dezvoltat pentru a fi o clasă de noi agenți anti-infecție. Un Aport mai mare de flavonoide pot reduce semnificativ riscul de a suferi de boala Parkinson. Cu cât cantitatea de fenoli este mai mare cu atât crește și activitatea antioxdinată . [11, 16, ]

1.6.1. Activitatea antimicrobiană

Metoda de difuzie în agar (folosind clești, cilindri de oțel sau discuri de hârtie) este adesea folosită pentru probe de screening împotriva unor serii de microorganisme iar parametrul de activitate este diametrul zonei de inhibiție.

Agarul s-a utilizat pentru a determina activitatea extractelor de propolis provenit de la mai multe specii de albine împotriva Staphylococcus aureus, Escherichia coli și Candida albicans. Deși majoritatea au fost active împotriva S. aureus, activitatea lor împotriva celorlalte două microorganisme a fost slabă sau nesemnificativă. Compușii izolați din propolis roșu au fost testați împotriva S. aureus si E. coli. Pentru a evalua activitatea fungicidă de Propolis brazilian verde și roșu împotriva C. albicans, Sporothrix schenckii și Paracoccicoides brasiliensis, o zonă de inhibare mai mică de 15 mm a fost considerată fără activitate și toate extractele au prezentat activitate similară.

S-a comparat activitatea unui extract uleios de propolis împotriva bacteriilor gram pozitive și negative. Extractele au fost active împotriva S. aureus și Monocitogenes monocytogenes dar nu a avut nici un efect asupra E. coli, Salmonella tiphimurium și Pseudomonas aeruginosa .

Extractul etanolic de propolis din sudul Braziliei a fost testat împotriva agenților patogeni endodontici (Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces israelian, Clostridium perfringens) și împotriva Enterococcus faecalis. P. nigrescens a fost cel mai sensibil, F. nucleatum și C. perfringens avut rezultate intermediare și A. israelian și E. faecalis au fost cele mai rezistente.

1.6.2 Activitatea antiparazitară

Trypanozoma cruzi este un parazit endemic în unele regiuni din Brazilia. Sângele de trypomastigotes a fost tratat cu probe de propolis brazilian verde din statul São Paulo, extrase cu diverse concentrații de etanol. Concentrația extractului care a lizat 50% din paraziți (ED50) a fost calculată prin numărarea paraziților cu 96 godeuri. Cel mai bun rezultat a fost obținut cu o probă extrasă prin Soxhlet folosind 100% etanol. Aceeași analiză a fost utilizată pentru compararea propolisului brazilian roșu și verde. O corelație pozitivă a fost găsită între activitatea tripanocidală și concentrația de acid 3,5-diprenil-4-hidroxicinamic în probe.

1.6.3 Activitatea analgezică și antiinflamatorie

Propolisul verde de la sud-vest de Brazilia a fost testat in vivo folosind șoareci pentru teste de durere și inflamație, precum și culturi de celule in vitro. Proba a arătat efecte analgezice semnificative și antiinflamatorii. Experimentele in vitro au demonstrat că eșantionul a inhibat producția de NO și factorii nucleari inhibați implicați în procesul inflamator. Întrucât experimentele in vivo indică prezența activității antiinflamatorii, testele in vitro au fost capabile să indice mecanismul de acțiune. Una dintre componentele principale ale propolisului brazilian verde, acidul 3,5-diprenyl-4-hidroxicinamic, a fost testat împotriva modelelor similare in vivo și in vitro de inflamații indicând că acest compus este cel puțin parțial responsabil pentru aceste activități. Mai mult, acest compus a avut o bună absorbție orală, așa că poate fi luat pe cale orală pentru durere și inflamație.

1.6.4 Efectele imunomodulatoare

O nouă linie de cercetare de propolis implică aplicarea sa ca un posibil adjuvant de vaccinare, deși cele mai multe vaccinuri comerciale folosesc sărurile de aluminiu în acest scop. O probă de propolis brazilian verde a fost testat, împreună cu alți compuși adjuvanți, pentru a imuniza șoarecii împotriva virusului herpetic porcin inactivat (SuHV-1). Atunci când este administrat împreună cu hidroxid de aluminiu, extractul de propolis a crescut răspunsurile atât celulare cât și umorale. O combinație de vaccin uleios inactivat împotriva virusului herpetic bovin tip 5 și extract de propolis a crescut, de asemenea, răspunsul imun umoral la bovine. Fracțiunile de propolis verde au fost testate împotriva SuHV-1. Fracțiunea J, conținând o cantitate de expresiv cafeic și derivați ai acidului cinamic, s-a dovedit a fi cea mai eficientă, crescând răspunsurile umorale și celulare. Într-un studiu anterior, când extractul de propolis a fost testat singur, nu a fost la fel de eficace, posibil datorită prezenței imunostimulatoarelor și substanțelor imunosupresive.

O altă aplicație a activității imunomodulatoare de propolis a fost demonstrat intr-un studiu folosind Paracoccidioides brasiliensis, o micoza sistemică răspândită în America latină. Pentru că macrofagele au un rol important în mecanismul de apărare împotriva acestei ciuperci, activarea lor de propolis a crescut activitatea lor fungicidă.

1.6.5 Alte activități farmacologice

Unii compuși din propolis pot afecta enzimele care controlează reacțiile cailor respiratorii. Prin urmare, a fost evaluat efectul propolisului verde și a compușilor izolați din propolis verde pe traheea cobaiului. Atât extractul de propolis, precum și compușii individuali, au demonstrat o activitate de relaxare.

Cinci eșantioane de propolis brazilian din sudul și sud-vestul Braziliei au prezentat efecte hepatoprotectoare pe hepatocite de șoarece în prima cultură, dar doar un eșantion a prezentat un efect hepatotoxic.

În plus, testele de inducere de ulcere cu indometacin la șobolani au arătat efectul protector puternic al propolisului asupra mucoasei gastrice la șoarecii din statul Paraná. Acest efect poate fi asociat cu activitatea antioxidantă, eliminarea speciilor de radicali liberi generați în mod indirect prin indometacin. Același tip de propolis a arătat de asemenea un efect protector împotriva leziunilor hepatice induse de CCI4 la șoareci, care poate fi, de asemenea, corelată cu activitatea antioxidantă.

CAPITOLUL 2. NOI STUDII REFERITOARE LA PRODUSELE DESTINATE CAVITĂȚII BUCALE

Pasta de dinți este o necesitate pentru viața cotidiană, iar funcția sa principală este de a curăța dinții, precum și pentru decontaminarea și tratamentul inflamațiilor. Diferitele tipuri și mărci de pastă de dinți prezintă, în general diferite proprietăți și funcții. Prin urmare, estimarea calității fiecărui brend de pastă de dinți este destul de importantă pentru a controla calitatea produselor în perioada de garanție.

Unele lucrări au dezvăluit o instabilitate caracteristică a pastei de dinți adesea legată de valoarea pH-ului din pasta de dinți.

În materia primă folosită la fabricarea pastei de dinți, inclusiv în faza solidă cât și în faza lichidă, materialul de legătură este component principal. Caracteristicile materialului de legătură implică o anumită rată de disociere, iar rata de disociere excesivă va duce la o reacție acido-bazică, ce provoacă flatulență și așadar modificarea pH-ului.

Prin urmare, detectarea valorii pH-ului a produselor de pastă de dinți este partea vitală în monitorizarea calității. Modificarea valorii pH-ului poate influența calitatea pastei de dinți. Companiile naționale și internaționale de pastă de dinți dau o mare atenție acestui fapt, și consideră valoarea pH-ului ca fiind un indicator chimic important.

2.1 Determinarea pH-ului pe diferite mărci de pastă de dinți prin spectroscopia în infraroșu apropiat cu ajutorul chemometriei

Metoda standard pentru a determina pH-ul pastei de dinți este utilizarea unui pH metru. Conform standardului, proba de pasta de dinți trebuie să fie cântărită exact și amestecată complet.

Prin urmare, procedura este consumatoare de timp, dacă există o mulțime de mostre ce urmează a fi testate și pot apărea erori aleatorii. Spectroscopia cu infraroșu apropiat (NIR) permite o monitorizare "on-line" a procedurii de analiză, care să permită o intervenție rapidă atunci când se observă unele abateri. NIR a fost folosită pentru a prezice valoarea ph-ului probelor de pastă de dinți cu ajutorul metodei celor mai mici pătrate cu ajutorul chemometriei.

Chemometria poate fi în general descrisă ca o aplicare a metodelor statistice în chimie în scopul de a îmbunătăți procesul de măsurare și de a extrage informații cât mai utile și mai complete din datele brute ale măsurătorilor fizico-chimice (de regulă instrumentale). Chemometria reprezintă o abordare a determinărilor chimice care se bazează pe ideea măsurătorilor indirecte. Astfel, măsurătorile legate de compoziția chimică a unui set de probe sunt puse în legătură cu o probă necunoscută prin efectuarea unor determinări mai puțin laborioase decât cele efectuate inițial asupra setului de probe bine cunoscute.

Șaizeci și nouă de probe de pastă de dinți de patru branduri diferite au fost colectate, inclusiv pasta de dinți pentru adulți – A (20), marca B (19) și C (20), și un set de probă de pastă de dinți pentru copii – D(10).

Toate probele au fost uscate la 100°C timp de 48 h, iar apoi s-au măcinat timp de 2 min.

Probele au fost trecute printr-o sită (0.45 mm) și au fost diluate într-un recipient din sticlă, apoi s-au efectuat măsurătorile NIR. Fiecare probă a fost scanată cu ajutorul unui Spectrofotometru (Hitachi 4100) iar apoi s-a efectuat mediu spectrelor.

Măsurătorile valorii pH-ului s-au realizat astfel: 5.00g probă de pastă de dinți a fost cântărită și transferată într-un pahar de 50ml, s-au adaugat 20ml apă distilată și s-a amestecat complet. Apoi pH-ul probei a fost măsurat cu un pH-metru, la 20°C.

Pentru a testa impactul pretratării pentru calibrare s-au folosit patru tipuri de metode pre-procesare pentru a minimiza influența efectelor fizice și a corecta efectele multiplicative în analiza NIR.

Aceste metode includ :

– eliminarea fondului și creșterea capacității de rezoluție;

– corecții multiplicative (MSC)

Spectrele celor 69 de probe sunt prezentate în figura 14a și poate fi constatat că acestea sunt destul de asemănătoare. Aceste spectre au o absorbție relativ scăzută în regiunea selectată. Acest lucru este posibil deoarece pasta de dinți conține multe substanțe anorganice. Există schimbări în spectre din cauza distribuțiilor de împrăștiere și dimensiunea particulelor de lumină. Spectrele pretratate obținute prin cele patru metode descrise mai sus sunt prezentate în figura 14b-d.

Fig. 2.1. Spectrele originale (a) și spectrele de corecție (b)

Spectrele de corecție (figura 2.1b) arată o diferență mică în comparație cu originalul său (figura 2.1a), liniile de bază ale tuturor spectrelor au fost mutate aproape de zero, în timp ce formele sunt asemănătoare cu cele originale. Se pare că numai corecția poate elimina influența erorilor de instrument, mediul de testare și variația de lumină.

Tehnicile derivate sunt utilizate pe scară largă pentru a elimina trecerea de bază, și ar putea elimina în mod eficient erorile și a îmbunătăți capacitatea de sensibilitate și rezoluția.

Pentru alegerea celei mai bune metode de pre-tratament, spectrele complete PLS au fost dezvoltate cu diferite pre-tratamente.

Rezultatele calculate cu utilizarea a patru metode de pretratare diferite sunt prezentate în tabelul 2.1.

Tabelul 2.1. Rezultatele metodelor de pretratare

Cel mai bun model a fost evaluat în funcție de cea mai mică rădăcină medie pătrată a erorii de calibrare (RMSEC), rădăcina medie pătrată eroare de predicție (RMSEP) și coeficientul de corelație (r) între valorile previzionate și măsurate. Prin urmare, în conformitate cu standardul de evaluare, cea mai bună performanță pentru determinarea pH-ului a fost obținută cu MSC pentru spectrele pre-tratament. Este posibil ca distribuțiile de împrăștiere și dimensiunea particulelor de lumina să fi fost eliminate în mod eficient în această situație.

Spectroscopia NIR combinată cu PLS a fost aplicată la determinarea ph-ului probelor de pastă de dinți (Figura 2.2).

Fig. 2.2. Valorile ph-ului

Pre-tratarea prin diferite metode de pre-procesare a fost aplicată datelor NIR pentru evaluarea modelului optim pentru estimarea valorii pH-ului din probele de pastă de dinți, care reflectă calitatea pastei de dinți. Rezultatele au indicat că NIR combinat cu chemometria ar putea fi folosite pentru a determina valoarea pH-ului pastei de dinți.

2.2 Metoda de determinare a fluorului în pasta de dinți prin absorbție moleculară a aluminiului mono fluorură folosind HR-CS-FAAS

Fluorul a fost determinat prin intermediul liniei de rotație de absorbție moleculară a aluminiului mono fluorură (ALF) generat în flacără în C₂H₂/N₂O la 227,4613nm folosind ca sursă continuă un spectrofotometru de absorbție atomică de înaltă rezoluție în flacără (HR-CS-FAAS). Efectele lungimilor de undă ale AIF, rata de combustibil (C₂H₂/N₂O) și cantitatea de Al pe exactitate, precizie și sensibilitate au fost investigate și optimizate. Banda de absorbție Al-F la 227,4613nm s-a dovedit a fi linia analitică cea mai potrivită în ceea ce privește sensibilitatea și interferențele spectrale. O bună sensibilitate și liniaritate s-a obținut în flacăra protoxid de azot/acetilenă, la un debit de 210L/h și o înălțime a arzătorului de 8nm folosind 3000mg/L de Al pentru 10-10000mg/L de F.

Acuratețea și precizia metodei au fost testate prin analiza eșantioanelor ținte și materialului de referință a apelor uzate certificate. Rezultatele au fost în concordanță cu sumele certificate, precum și precizia de câteva zile în timpul acestui studiu a fost satisfăcătoare ( RSD < 10 % ). Limita de detecție și concentrația caracteristică a metodei au fost de 5,5mg/ L si, respectiv, 72,8mg/L. În cele din urmă, s-au determinat concentrațiile de fluor din mai multe probe de pastă de dinți. Rezultatele constatate și datele producătorilor nu au fost semnificativ diferite. Metoda a fost simplă, rapidă și sensibilă.

Fluorul este un element natural care se găsește din abundență în scoarța terestră. Ca elemente diverse, fluorul este de asemenea necesar în organism, dar în cantități mici. Este esențial pentru organismul uman într-un interval foarte mic de concentrație critică și multe efecte nocive apar în caz de exces sau lipsa lui. Fluorul este util pentru sănătatea dentară în doză redusă și se adaugă la multe produse stomatologice cum ar fi pasta de dinți (apa de gură, geluri și lacuri) ca ingredient activ. Cu toate acestea, expunerea cronică la fluor în cantități mari interferează cu formarea osoasă și poate provoca fluoroza scheletului, deci cantitatea de admisie a fluorului este foarte importantă.

Există numeroase metode pentru determinarea fluorului și a formelor florine în pasta de dinți, cum ar fi metodele de analiză, electrozi ion-selectivi, determinarea potențiometrică, cromatografie ionică, metode spectrofotometrice și electroforeza capilară în timp ce fiecare dintre ele au propriile lor dezavantaje. Există unele studii despre determinarea fluorului în pasta de dinți cu spectrometrie de absorbție atomică.

Pe tot parcursul lucrării s-a fost folosit un spectrofotometru de absorbție Analytik Jena CountrAA 700 de înaltă rezoluție Continuum Source Atomic, echipat cu o lampă cu arc scurt 300W xenon cu o sursă de radiații continuă. Toate măsurătorile s-au efectuat de trei ori.

Apă cu puritate mare s-a obținut de la o osmoza inversă TKA conectată cu un deionizator. Șase probe diferite de mărci de pastă de dinți conținând fluorura de sodiu și monoflorofosfat de sodiu au fost achiziționate din piața din Istanbul, Turcia.

În această metodă molecula diatomică se formează în flacără între analit și un alt element (molecula de formare a elementului). Elementul este ales astfel încât molecula diatomică care conține analitul să fie suficient de stabilă pentru a rămâne în flacără în timpul măsurării, în timp sensibilitatea sa este suficientă pentru detectarea concentrațiilor analitului (concentrația moleculei diatomice formată din analit). Se presupune că speciile diatomice cu energii disociate mai mari de 500kj/mol sunt adecvate pentru acest scop. Energia de disociere a AlF este 653kj/mol. Prin urmare, Al este un element adecvat pentru determinarea F. În plus este ușor, disponibil și ieftin. AlF poate fi format prin descompunerea AlF3(AlF3(g) → ALF(g) – F(g)) și/sau recombinarea atomilor de Al și F în faza gazoasă (Al(g) + F(g) → AlF(g)).

Soluția stoc de fluor a fost preparată din fluorură de sodiu de înaltă puritate și HF. Optimizarea a fost făcută cu doi reactivi diferiți de fluor și nici o diferență semnificativă nu a fost găsită între sensibilitățile celor două standarde. Deoarece HF este riscant pentru sănătate, ca etalon a fost folosit NaF.

Linearitatea curbei de calibrare pentru determinarea halogenilor prin MAS a moleculelor diatomice are nevoie de precauție și efort suplimentar deoarece depinde nu numai de concentrația de analit ci de asemenea de reactivul de formare a moleculei.

Fig. 2.3. Modificarea absorbției moleculare Alf cu concentrația Al la concentrații constant F(a) 100mg/L și (b) 500mg/L. Barele de eroare reprezintă deviația standard (N : 3)

Prin urmare, modificarea absorbției cu concentrația F a fost investigată la diferite cantități de Al simultan. În prezența unei cantități fixe de Al selectată pentru cuantificarea F în probele studiate, absorbanța trebuie să se schimbe liniar cu concentrația F într-o gamă largă. Astfel, în funcție de concentrația F în eșantion, recalibrarea ar fi fost necesară la diferite cantități de Al. Așa cum se arată în figura 2.4 sensibilitatea maximă pentru AlF a fost obținută cu concentrații de Al diferite în funcție de concentrația F.

Fig. 1.14. Spectrul de absorbție al unei probe de pastă de dinți în vecinătatea liniilor moleculare pentru AlF la 227,4613nm (Al: 3000mg L-l ).

Când concentrația de fluor a fost fixată la 100mg/l, concentrația optimă de Al a fost de 3000mg/l, în timp ce pentru 500mg/l F concentrația cea mai potrivită Al a fost găsită ca 5000mg/l.

Deoarece se așteaptă ca suspensiile de probe de pastă de dinți să conțină circa 20-30 mg/l de F care corespunde la aproximativ 1000-1500µg/g F în pasta de dinți, 3000mg/l Al ar putea fi utilizat în siguranță ca și cantitate optimă în toate cuantificările. După ce a fost constatată concentrația optimă de Al, în prezența a 3000mg/l Al o curbă de calibrare liniară a fost obținută de până la 1000mg/l de F care a fost mult mai mare decât concentrațiile F din soluțiile de eșantion pregătite pentru analiză (figura 2.4). Cu alte cuvinte, 3000mg/l de Al poate fi utilizat pentru determinarea F în probe de pastă de dinți fără nici o problema. Preciziile măsurătorilor în figura 2.4 au fost destul de satisfăcătoare.

Unul dintre parametrii critici optimizați în metodă este tipul de flacără. Așa cum se arată în figura 1.15 gradul de utilizare a diferitelor tipuri de flacără pentru determinarea MAS prin AlF a fost investigat și se constată că metoda este mai stabilă și are RSD mai mică atunci când este utilizat în flacără protoxid de azot/acetilenă.

Fig. 2.5. Curba de calibrare liniară (♦) și curba standard etalon (■). Proba: apă reziduală SPS-NUTR WW2; Al 3000µg/ml. Barele de eroare reprezintă deviația standard.

Așa cum se arată în figura 2.6, absorbanța moleculară maximă de Alf a fost obținută la o rată de combustibil de 210 l/h și o înălțime de 8mm deasupra arzătorului. Sensibilitatea în flacăra protoxid de azot/acetilena la 227,4613nm a fost semnificativ mai bună decât cea în flacără aer/acetilena și după optimizarea parametrilor experimentali și instrumentali, prima metodă este utilizată în mod eficient.

Fig. 2.6. Compararea absorbanțelor cu diferite tipuri de flacară; ♦: flacără protoxid de azot/acetilenă; ■: flacără aer/acetilenă.

Fig 2.7. Optimizarea parametrilor de flacăra cu 3000mg/l Al și 500mg/l F.

Limita de detecție pentru determinarea F a fost de 5,5mg/l bazat pe 3 timpi de la abaterile standard obținute de la 10 măsurători repetate ale soluției martor (3000mg/l Al), aspirate în flacără.

Curba de calibrare a fost liniară până la 1000mg/l de F. Performanțele analitice ale metodei și metodele anterioare au fost rezumate în tabelul 2.2. Trebuie precizat că, concentrația de F din probele de pastă de dinți a fost în jurul valorii de 30-40mg/l înainte de aspirație și pasta de dinți este una dintre cele mai bogate probe în F. Nu există nici un folos de extindere a curbei de calibrare liniară la concentrații foarte mari de F. Prin urmare, domeniul liniar cu AlF este suficient pentru aproape toate probele pentru determinare a F.

Tabelul 2.2. Compararea indicatorilor de eficacitate pentru determinarea florului prin AAS flacără folosind diferite molecule.

Cu toate acestea, nivelul LOD obținut este suficient pentru a detecta concentrațiile de F în probele de pastă de dinți. De asemenea, caracteristicile curbei de calibrare, precum și parametrii analitici prezentați în tabelul 2.2 nu sunt stricte, deoarece valorile lor pot varia la alt set de experimente de la o zi la alta. După optimizarea parametrilor experimentali, validitatea metodei a fost testată prin analiza unui material de referință certificat (tabelul 2.3).

Tabelul 2.3. Determinarea concentrațiilor de fluor în apă reziduală.

Concentrația certificată de F în CRM poate fi determinată în limitele de incertitudine, precum și concentrațiile adăugate pot fi recuperate satisfăcător (tabelul 2.3), care arată că interferența de la matricea apei reziduale nu este semnificativă în prezența a 3000mg/l de concentrații Al și F. Cu toate acestea, acest lucru nu înseamnă că F poate fi întotdeauna determinat prin utilizarea tehnicii de calibrare liniară în toate probele.

În cele din urmă, conținutul de F din diferite probe de pastă de dinți a fost determinat aplicând adiție standard și tehnici de calibrare liniare. Deoarece probele au fost introduse direct ca suspensii (sau diluat reziduuri), rezultatele reflectă conținutul total de fluor. După cum se arată în tabelul 2.4.

Tabelul 2.4. Determinarea fluorului în diferite probe de pastă de dinți

Rezultatele găsite de cele două tehnici nu au fost în concordanță (nivel de încredere cel puțin 95%). Cu toate acestea, în cazul în care nu avem nici o diferență semnificativă, rezultatele constatate de tehnica adiției standard ar trebui să fie fiabile din cauza interferențelor non-spectrale provenite din reacții încrucișate de Al și F cu matricea simultană. Ar trebui precizat că valorile date de către producători de pe pachetele de paste de dinți sunt doar informative și nu pot fi folosite ca referință. Prin urmare, deși nu este singurul criteriu pentru exactitatea experimentelor, se observă că rezultatele s-au găsit destul de aproape de valorile date de producători.

Florul ionic și legăturile covalente de fluor provenite din dizolvarea mostrelor de pastă de dinți conținând NaF și monoflorofosfat de sodiu poat fi determinate în jurul valorii date de producători. Trebuie subliniat faptul că fluorura din monoflorofosfat nu poate fi determinată cu IC sau ICE pentru ca fluorura este ușor eliberată. În concluzie, după optimizarea condițiilor experimentale, concentrațiile de fluor pot fi determinate cu succes prin MAS de Alf de HR-CS-FAAS.

În concluzie lucrarea demonstrează că HR-CS-FAAS poate fi folosit pentru determinarea fluorului în probele de pastă dinți prin măsurarea liniei adecvate de absorbție moleculară de AlF generate în flacără de protoxid de azot/acetilenă. Aceasta este de încredere, rapidă și simplă. Prin urmare, după validarea metodei, flacăra protoxid de azot/acetilenă a devenit importantă pentru determinarea F prin AlF de HR-CS-AAS. Avantajele cele mai remarcabile ale metodei:

-Al este ieftin și este o moleculă ușor accesibilă de formare a unui element în flacără și folosit ca un atomizor în acest studiu,

-este un atomizor mai ieftin decât un cuptor de grafit, folosit pe scară largă în studiile anterioare.

Totusi, aceasta este o metodă indirectă și la fel ca în studiile similare, există și alți parametri ce pot fi optimizați, cum ar fi concentrația potrivită a moleculei reactivului de formare.

Adițional, interferențele cauzate de reacțiile competitive a constituenților complicați ai matricei cu analiți și a elementului ce formează molecule sunt surse potențiale de erori ce nu pot fi prevenite. Prin urmare, în caz de diferențe între rezultatele găsite prin calibrare liniară și tehnici adiționale standard, acestea din urmă sunt mai fiabile datorită motivelor menționate mai sus.

CAPITOLUL 3. PARTEA EXPERIMENTALĂ

În acest studiu s-au analizat cinci probe diferite de pastă de dinți cu și fără propolis în vederea determinării substanțelor insolubile în apă, apei și substanțelor volatile, pH-ul, indicelui de iod, indicelui de aciditate și a clorurilor.

S-au luat în lucru un număr de cinci probe diferite de pastă de dinți: pastă de dinți cu propolis din comerț (Colgate), pastă de dinți fără propolis (Dentica) și trei probe de pastă de dinți (Dentica) în care s-a adăugat propolis brut de concentrații diferite: proba 1 (P1) – 2g/100g, proba 2 (P2) – 4g/100g, proba 3 (P3) – 6g/100g.

3.1 Determinarea substanțelor insolubile în apă

Principiul metodei

Prezenta metodă se referă la determinarea substanțelor insolubile în apă, conținute de pasta de dinți. Aceste substanțe pot fi: substanțe abrazive (ex. carbonați de claciu), substanțe mucilaginoase, grăsimi nesaponificabile, etc.

Modul de lucru

Într-un vas Erlenmeyer de 300ml se cântăresc 10g probă de analizat. Se adaugă 150-200ml de apă distilată, de 60oC și se agită pentru dizolvarea pastei de dinți și se filtrează pe o hârtie de filtru de porozitate medie așezată într-o pâlnie sau sub vid, pe un creuzet cu placă filtrantă, montat în prealabil la un vas cu trompă. Reziduul de pe hârtia de filtru sau din creuzet se spală cu apă distilată de 60o C. Filtratul împreună cu apele de spălare se trec într-un pahar Berzelius și se păstrează pentru determinarea acizilor naftenici sau pentru determinarea silicatului de sodiu. Hârtia de filtru cu reziduu se introduce în fiola în care a fost în prealabil cântărită și se usucă în etuvă la 100-105oC, timp de 3 ore. În cazul în care s-a folosit creuzetul filtrant, aceasta se introduce direct în etuvă pentru uscare. După răcire în exsicator, se cântăresc cu precizie de 0,0002g.

Calcul

% substanțe insolubile în apă =

în care, – masa probei luate pentru determinare, în grame

– masa reziduului uscat (pe hârtia de filtru), în grame

% substanțe insolubile în apă =

Rezultatele obținute sunt exprimate în figura 3.1

Fig. 3.1 Substanțele insolubile în apă din cele 5 probe de pastă de dinți

În urma reprezentării grafice a rezultatelor se poate observa foarte ușor că pasta de dinți colgate conține o cantitate foarte mare de substanțe insolubile în apă, comparabil cu celelalte probe.

3.2 Determinarea apei și substanțelor volatile

Principiul metodei

Apa și substanțele volatile sunt eliminate din pasta de dinți prin uscare în etuvă la 100-105oC.

Modul de lucru

O fiolă de cântărire, în care s-a introdus o baghetă de sticlă cu capătul aplatizat, se usucă timp de o oră in etuvă la 100-105oC. Apoi se lasă să se răcească în exsicator și se cântărește. În cazul în care se analizează o probă de pastă de dinți moale sau lichefiabilă, înainte de uscare se introduce în fiolă și circa 10g de nisip. Circa 10g de probă de analizat se introduce în fiolă și se amestecă, eventual cu nisipul, cu ajutorul baghetei de sticlă. Se usucă în etuvă la 100-105oC, timp de o oră, se răcește la exsicator și se cântărește. Apoi se frământă fin bulgărașii de pastă de dinți cu bagheta, așezând fiola pe o foaie de hârtie lucioasă pentru a reintroduce în fiolă eventualele pierderi. După aceea fiola cu proba se introduce în etuvă și se usucă la 100-105oC, timp de o oră, apoi se răcește și se cântărește. Se repetă uscarea, răcirea și cântărirea până când diferența între două cântăriri succesive nu depășește 0,005g.

Calcul

% apă și substanțe volatile =

în care, – masa probei luate pentru determinare, în grame

– masa probei uscate, în grame

1,34 g

% substanțe insolubile în apă =

Rezultatele obținute sunt exprimate în figura 3.2

Fig. 3.2 Apa și substanțele volatile din cele 5 probe de pastă de dinți

În urma reprezentării grafice a rezultatelor putem observa că pasta de dinți cu propolis (P1) conține cantitatea ce mai mare de apă și substanțe volatile, comparabil cu celelalte probe.

3.3 Determinarea pH-ului

Aparatură: hârtie de pH.

Reactivi: apă distilată.

Pregătirea extractului apos: se introduce circa 1g probă într-un pahar de laborator, se adaugă 99ml de apă, se fierbe timp de 5 minute și se filtrează prin hârtie de filtru cu porozitate medie.

Determinarea pH-ului se face pe extractul apos obținut, cu hârtie indicator de pH.

Rezultatele obținute sunt exprimate în figura 3.3

Fig. 3.3 pH-ul probelor de pastă de dinți

pH-ul pastelor de dinți pe bază de săpun este cuprins între 9,5 și 10,5 [], în timp ce valoarea medie a pH-ului propolisului este 6,20 ± 0,15. [13]

Reprezentarea grafică a rezultatelor arată că pasta de dinți colgate are pH-ul cel mai ridicat în comparație cu celelalte probe, în timp ce probele cu propolis brut (P1, P2, P3) au același pH, deci putem spune că propolisul a contribuit la schimbarea pH-ului pastei de dinți.

3.4 Determinarea indicelui de iod

Prin indice de iod se înțelege numărul de grame de iod fixat în 100g probă de analizat.

Mod de lucru

Se cântărește 1g de probă, se dizolvă în 4ml cloroform și se adaugă 5ml soluție alcoolică de iod 0,1N într-un flacon cu dop rodat de 300ml. Flaconul se închide și se ține la întuneric timp de 30 de minute, agitând din când în când. Se adaugă 3ml KI, 2ml apă și se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N până la colorația galben deschis. Se adaugă 0,4ml amidon și se continuă titrarea. Agitând puternic până la decolorare.

În paralel se efectuează determinarea cu o probă martor.

Calcul

în care,

– indicele de iod

– volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei luate martor, în mililitri

– volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei luate în lucru, în mililitri

– masa probei luate în lucru, în grame

0,01269 – numărul de grame de iod corespunzător la 1ml tiosulfat de sodiu 0,1N

Rezultatele obținute sunt exprimate în figura 3.4

Fig. 3.4 Indicele de iod din cele 5 probe de pastă de dinți

Potrivit reprezentării grafice, valoarea indicelui de iod din pasta de dinți cu propolis P2 este cea mai mare, acest lucru semnifică faptul că gradul de nesaturare al acizilor nesaturați din această probă a fost cel mai ridicat.

3.5 Determinarea indicelui de aciditate

Prin indicele de aciditate se înțelege numărul de mg de KOH necesar pentru neutralizarea acizilor grași liberi conținuți în 1g de probă de analizat.

Mod de lucru

Se cântăresc la balanță 1g probă de analizat. Se dizolvă în 10ml amestec format din volume egale de alcool și eter, neutralizat în prealabil cu fenolftaleină și se titrează cu KOH 0,1N în apă până la colorație roz.

Calcul

în care,

– indice de aciditate

– volumul de KOH 0,1N în apă folosit la titrare, în mililitri

– masa probei luate în lucru, în grame

5,61 – numărul de mg de KOH corespunzătoare la 1ml KOH 0,1N în apă

Rezultatele obținute sunt exprimate în figura 3.5

Fig. 3.5 Indicele de aciditate al celor 5 probe de pastă de dinți

În figura 3.4 se observă că valoarea cea mai ridicată a indicelui de aciditate este cea probei de pastă de dinți cu propolis P3, ceea ce ne indică faptul că o cantitate prea mare de proplis adăugat în pasta de dinți poate dăuna, devenind toxic.

3.6 Determinarea clorurilor

Principiul metodei

Ionul de clor se precipită cu soluție de azotat de argint, excesul de azotat de argint se titrează cu sulfocianură de amoniu în prezența sulfatului de fier și amoniu.

Modul de lucru

Într-un vas Erlenmeyer de 300 mL se cântăresc 5g probă de analizat. Se adaugă 100 mL apă distilată și se încălzește pe baie de apă până la dizolvarea săpunului. Soluția se trece cantitativ într-un balon cotat de 200 mL, spălând cu apă distilată. Se adaugă 5mL acid azotic și imediat 25 mL de soluție de azotat de argint. Balonul cu soluție se încălzește pe baie de apă până când acizii se separă bine și clorura de argint precipită. Se răcește la temperatura camerei ș se completează volumul soluției din balonul cotat, cu apă distilată, până la semn. Se agită pentru omogenizare și apoi se filtrează. Se aruncă primii 10mL de filtrate într-un vas Erlenmeyer. Se adaugă 2-3mL soluție de alaun de fier și amoniu și se titrează cu soluție de sulfocianură de amoniu până la o colorație roșiatică persistentă.

Calcul

în care,

0,00585 – cantitatea de clorură de sodiu, în g, corespunzătoare la 1mL soluție de sulfocianură de amoniu (NH4SCN) 0,1n

V – volumul soluției de sulfocianură de amoniu 0,1n folosit la titrare în mL.

Rezultatele obținute sunt exprimate în figura 3.6

Fig. 3.6 Procentul de cloruri din cele 5 probe de pastă de dinți

Din reprezentarea grafică (figura 3.6) observam ca pasta de dinți Colgate are un conținut de cloruri remarcbail mai scăzut decât pasta de dinți Dentica, iar pe măsură ce conținutul de propolis crește și cantitatea de cloruri crește.

CONCLUZII GENERALE

Propolisul este un produs apicol din ce în ce mai utilizat datorită proprietăților sale biologice extinse (antioxidative, antibacteriene, antiinflamatoare, anticancerigene și antidiabetice).

În propolis au fost găsiți peste 200 de compuși precum flavonoide, terpenoide, acizi aromatici, acizi grași, esteri, fenoli, aldehide, cetone, etc. Componentele principale responsabile pentru activitățile sale biologice sunt flavonoidele, terpenoidele, acizii aromatici și esterii lor .

Compoziția chimică a propolisului brut variază în mare parte din cauza materiei prime din substanțele rășinoase din care provine, în funcție de regiunea geografică, floristică și anotimpuri.

Datorită interesului crescând asupra propolisului, s-au dezvoltat multe metode spectrografice și cromatografice pentru a analiza compoziția chimică a propolisului.

Pasta de dinți este un produs necesar vieții cotidiene, având rolul de a curăța și păstra sănătatea dinților. Din acest motiv s-au efectuat numeroase studii în ceea ce privește controlul calității acesteia.

Contribuția personală în această lucrare a fost de a expune influența propolisului asupra proprietăților pastei de dinți. În urma rezultatelor obținute, am constatat că o cantitate medie de propolis poate avea o influență bună, în timp ce o cantitate mai mare de propolis poate avea o influență negativă.

BIBLIOGRAFIE