Particularitatile Morfofiziologice ALE Bacteriilor
CAPITOLUL I
ELEMENTE DE TAXONOMIE ȘI PARTICULARITĂȚILE MORFOFIZIOLOGICE ALE BACTERIILOR DIN GENUL CLOSTRIDIUM
CHAPTER I
TAXONOMY ELEMENTS AND MORPHOPHYSIOLOGICAL FEATURES OF BACTERIA FROM CLOSTRIDIUM GENUS
Taxonomia
Clostridiile fac parte din grupul bacililor Gram pozitivi sporogeni, respectiv familia Bacillaceae, în care se încadrează speciile bacteriene sporogene. Ele se găsesc ca saprofite în sol și sunt rezistente față de factorii de mediu.
Familia cuprinde două genuri : Bacillus, din care fac parte speciile aerobe și Clostridium, cele anaerobe (Adams M.R., 2000).
Bacteriile din genul Clostridium sunt în totalitate anaerobe, în marea lor majoritate mobile, iar sporul lor depășește în diametru transversal pe cel al celulei vegetative. În funcție de poziția lui, o deformează imprimând bacililor sporulați diferite forme, cum sunt cele de lămâie sau suveică (sporul așezat central), sticlă de lampă de petrol (sporul subterminal) (Hook D., 1996).
Genul Clostridium include specii patogene și nepatogene. Speciile patogene, la rândul lor, pot fi clasificate în funcție de mecanismele patogenității în:
specii predominant sau exclusiv patogene;
specii toxigene și virulente (Noel I., 1986).
Germenii din ultima categorie, în care se include Clostridium perfringens, sunt cunoscuți sub numele de agenți ai gangrenei gazoase.
Welchia perfringens, identificată de Prèvot în 1938, prezintă următoarele sinonime:
Bacille d’ Achalme, 1891;
Bacillus aerogenos capsulatus (Welch și Nuttal, 1892);
Bacillus phlegmonis emphsematosae (Frankel, 1893);
Bacillus emphysematosus (Kruse, 1896);
Bacillus perfringens (Keillon și Zuber, 1898);
Bacterium welchii (Migula, 1900);
Clostridium welchii (Holand, 1920);
Clostridium perfringens (Veilon și Zuber, 1920);
Bacillus welchii (Wilsdon, 1931).
Această lungă enumerare de nume marcante le situează în nomenclatorul bacterian din cursul secolului XX și este datorată faptului că prima denumire specifică este legată de Weillon și Zuber, fiind de perfringens și că Preban în 1929 a recunoscut pentru prima dată un gen nou, Welchia.
În literatura de specialitate circulă mai multe determinatoare, cum ar fi cel a lui Krasilnikov din 1961, a lui Topley și Wilson din 1964, Prévot ed. a II-a din 1967, Bergey ed. a VIII-a din 1984 și, deoarece nu există o părere unanimă în ceea ce privește taxonomia genului Clostridium am considerat util să revenim asupra ei și să precizăm unele aspecte.
Prima clasificare a clostridiilor aparține lui Weinberg și Seguin din 1918, reluată apoi de Topley și Wilson în 1955. Această clasificare are în vedere și așezarea sporului, proprietățile proteolitice sau zaharolitice ale clostridiilor.
Ulterior, Prévot, în 1940, luând în considerare ideea lui Pribram din 1929, separă genul Welchia de genul Clostridium pe criterii de ordine morfologic și pe baza coeficientului Chargaff, care reprezintă raportul ADN / ARN care la genul Welchia este de 2,70, iar la genul Clostridium este de 2,08.
Prévot, în 1940, propune următoarea încadrare taxonomică: subîncrengătura Eubacteria, clasa Sporulales, ordinul Clostridialis, familia Clostridiaceae cu trei genuri:
genul Inflabilis
genul Welchia
genul Clostridium
Genul Inflabilis cuprinde clostridiacee imobile, neciliate, capsulate cu forma vegetativă nedeformată de spori.
Genul Welchia cuprinde Clostridiacaee imobile, neciliate, capsulate cu forma vegetativă nedeformată de spori.
Genul Clostridium cuprinde Clostridiacaee mobile, ciliate, sporulate, forma vegetativă deformată de spori.
Opus acesteia și, actualmente, de cea mai largă circulație este clasificarea din determinatorul lui Bergey.
Bergey, 1984, propune următoarea încadrare taxonomică: clasa Schizomicetes, ordinul Eubacteriale, familia Bacillaceae, genul Clostridium, cu mai multe specii patogene și nepatogene, așa cum se poate observa în tabelul 1.1.
Tabelul 1.1.
Clasificarea clostridiilor patogene (după Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1984)
Table 1.1.
Pathogenic Clostridium classification (după Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1984)
Nomenclatorul lui Bergey, utilizat în majoritatea țărilor reține aproximativ 95 specii de clostridii, dintre care mai bine caracterizate sunt 61 de specii. Între timp s-a descris enterita ulcerativă a prepelițelor produsă de Clostridium colinum și enterita ulcerativă a hamsterului cu Clostridium difficile, dar aceste specii nu sunt trecute în nomenclatorul lui Bergey ediția a 8-a, 1984, ca specii de sine stătătoare.
Nülo, în 1980, descrie varietățile antigenice la Clostridium perfringens la biotipul A, la biotipul B și biotipul C.
Morfologia
Bacilul se distinge morfologic de ceilalți anaerobi din genul Clostridium. În culturile tinere, ca și în țesuturile animale, formele bacilare sunt în general uniforme, bacilii sunt scurți, izolați sau grupați câte doi, capetele sunt tăiate drept ca la bacteria carbunoasă sau sunt ușor rotunjite. Lungimea bacteriei variază de la 0,8 la 6 microni, iar lațimea de la 0,8 la 2 microni. Unele forme de involuție se întâlnesc pe diverse medii și, în special, pe ser coagulant.
Forma vegetativă
Genul Clostridium grupează bacilii sporulați, ciliați sau neciliați, Gram pozitiv, anaerobi. Sporii pot fi situați central, subterminal sau terminal, diametrul lor transversal depășind pe cel al formei vegetative, cu excepția lui Clostridium perfringens și, din această cauză, constituirea sporului modifică celula bacteriană imprimându-i forma de Clostridium (clostridios = fus).
Capsula se formează în organismul animal, dar este greu evidențiabilă, necolorându-se prin metode uzuale aplicate în acest scop. Se pare că această structură poate fi colorabilă prin metoda Cosares Gill (metoda de colorare a cililor).
În frotiurile făcute din țesuturile infectate colorate prin metoda Gram sau cu albastru de metilen, capsula apare sub forma unor spații libere, complet necolorate în genul formelor vegetative, după cum se poate observa în figura 1.1.
Fig. 1.1. Clostridium perfringens – microscopic x 90, colorație Gram
Fig. 1.1. Clostridium perfringens – microscopic x 90, Gram staining
Forma sporulată
Fiind un germen sporulat, Clostridium perfringens are sporii ovali, cu poziție subterminală, frecvent prezenți în leziuni și rareori în culturi.
Dintre speciile patogene ale genului Clostridium, este singura imobilă, ceea ce ușurează foarte mult identificarea ei
Sporii sunt rar observați în culturile de Clostridium perfringens. Determinismul de sporulare la această bacterie anaerobă a rămas mult timp necunoscut și a făcut loc la numeroase ipoteze, care au fost infirmate de descoperirile recente (Fung D.Y.C., 2004).
Sporul matur cuprinde un centriol înconjurat de membrana sa, un cortex și un perete sporal (Smedley J.G., 2004), după cum se poate observa și în figura 1.2.
Fig. 1.2. Clostridium perfringens – spori
Fig. 1.2. Clostridium perfringens – spores
Sporii de Clostridium perfringens fotografiași prin microscopie electronică sunt netezi, fără rizuri, fără caneluri.
Presporul este subterminal, el se închistează în 4-5 ore, apoi sporangele se contractă progresiv în jurul lui, izolându-l. Sporul este compus dintr-un corp central împrejmuit de o zonă corticală, restul fiind înconjurat de peretele sporangelui. Acesta din urmă este refractar la colorare, dar poate fi observat la microscop în contrast de fază și poate fi impregnat argentic.
Sporii de Clostridium perfringens conțin un antigen sporal atoxic, care nu există în celulele vegetative, iar în afara acestui antigen specific, sporii conțin în egală măsură un antigen identic cu cel al celulelor vegetative.
Actualmente, în determinatorul lui Bergey, speciile din genul Clostridium, în număr de 61, sunt împărțite în cinci grupe, astfel:
Spori subterminali
nu hidrolizează gelatina: grupa I
hidrolizează gelatina: grupa II
Spori terminali:
nu hidrolizează gelatina: grupa III
hidrolizează gelatina: grupa IV
Cu exigențe nutritive deosebite: grupa V (nu se dezvoltă pe medii obișnuite)
Speciile din grupa a V nu prezintă interes pentru alimente.
Fiziologia
Metabolismul
Pe baza unor criterii metabolice și a modului lor de acțiune asupra diferitelor substraturi, speciile de clostridii sunt clasate în:
clostridii zaharolitice, agenți foarte activi ai fermentării glucidelor și care produc acid butiric, motiv pentru care se mai numesc și ,,clostridii butirice”. Ele acidifiază și coagulează laptele, nu lichefiază gelatina, nu produc hidrogen sulfurat și nu sunt gazoase. Aceste specii fac parte din grupa I și III: Clostridium butiricum, Clostridium beijerinkii, Clostridium pasteurianum, Clostridium tyrobutiricum și Clostridium termosaccharolyticum;
clostridii proteolitice sau de putrefacție, agenți foarte activi ai degradării proteinelor: lichefiază gelatina, digeră în general cazeina cu sau fără coagulare prealabilă și produc adesea hidrogen sulfurat. Au proprietăți fermentative reduse și puțin gazoase. Aparțin grupelor II și IV: Clostridium bifermentas, Clostridium sporogenes, Clostridium leutoputrescens, Clostridium putrefaciens, Clostridium botulinum, Clostridium nigrificans;
clostridii cu activitate intermediară care lichefiază gelatina, dar au și o activitate fermentativă intensă, produc în general hidrogen sulfurat, nu peptonează laptele după coagulare și sunt foarte gazogene. Din această categorie fac parte Clostridium perfringens, Clostridium septicum.
Clostridium perfringens și speciile apropiate sunt adesea incluse în grupa ,,clostridiilor sulfitoreducătoare” pentru că sunt capabile să reducă sulfitul.
Numeroase specii din celelalte grupe (I – IV) prezintă interes pentru microbiologia alimentelor și ele pot fi identificate pe baza criteriilor din tabelul 1.2.
Genul conține numeroase specii patogene și nepatogene. Speciile patogene au fost împărțite de Weinberg și colaboratorii, citați de Stamatin în două grupe și anume:
a) Specii toxigene;
b) Specii virulente și toxigene.
a) Speciile toxigene nu se multiplică de regulă, în țesuturile vii, activitatea lor patogenă se datorește în mod exclusiv principiilor toxice pe care îi pun în libertate (exotoxine). Din această grupă fac parte Clostridium tetani și Clostridium botulinum.
Tabelul 1.2.
Caractere diferențiale ale unor specii din genul Clostridium (după Bergey – citat de Bărzoi D, Apostu S.)
Table 1.2.
Differential characters of Clostridium genus species (după Bergey – citat de Bărzoi D, Apostu S.)
Tabelul 1.2. (continuare)
Caractere diferențiale ale unor specii din genul Clostridium (după Bergey – citat de Bărzoi D, Apostu S.)
Table 1.2.
Differential characters of Clostridium genus species (după Bergey – citat de Bărzoi D, Apostu S.)
2 Specia numită până nu demult Clostridium nigrificans, frecvent întâlnită la conservele și semiconservele în recipiente închise ermetic și care produce înegrirea acestora, în prezent este repartizată în genul Desulfatomaculum și deci numele ei corect este Desulfatomaculum nigrificans. Ea are proprietăți asemănătoare cu ale speciilor din grupa I a genului Clostridium, motiv pentru care a fost inclusă în acest tabel.
b) Speciile virulente și toxigene, spre deosebire de primele, se multiplică în țesuturile vii pe care le lizează. Din această grupă fac parte: Clostridium perfringens (Clostridium welchii), Clostridium chauvoei (bacilul cărbunelui emfizematos) și Clostridium histolyticum. Germenii din această grupă mai pot fi numiți agenții gangrenei gazoase, după numele infecției principale pe care le produc la om și la animale.
Speciile nepatogene de clostridii se împart și ele în două grupe:
a) Specii care produc procese de putrefacție (Clostridium bifermentas, Clostridium multifermentas, Clostridium putrifiens, Clostridium sporogenes etc.)
b) Specii care nu produc procese de putrefacție (Clostridium amylobacter, Clostridium sphenoides, Clostridium cochlearum, Clostridium tetanomorphus etc.)
Clostridium perfringens posedă antigene somatice și antigene specifice de biotip. Secretă o toxină foarte activă, constituită din 12 factori toxici. Pe baza acestor factori toxici, deosebiți antigenic, s-au identificat la această specie bacteriană 6 biotipuri: A, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5, D, E. Tipul F descris în unele lucrări mai vechi este încadrat acum în tipurile C4 și C5. Aceste biotipuri se deosebesc prin compoziția toxinei ce o elaborează și care se evidențiază prin reacția de seroneutralizare cu seruri antitoxice de biotip, prin specia de animal care o infectează și entitatea morbidă care o determină, astfel:
Tipul A produce gangrena gazoasă la om și la animale, în special la cabaline, infecții la taurine, suine și ovine, putrefacția profundă a cărnii, toxiinfecții alimentare la om;
Tipul B produce dizenterie anaerobă la miel și enterotoxiemie la oile adulte;
Tipul C produce enterotoxiemie la oaie, enterită la viței și miei și enterită necrotică la om;
Tipul D produce enterotoxiemie la miei, oi adulte, capre, bovine și toxiinfecții alimentare la om.
Clostridium perfringens posedă antigene somatice multiple, unele fiind comune, iar altele specifice pentru tulpinile care formează un anumit serotip. În cadrul biotipurilor pot exista mai multe tipuri antigenice. Astfel biotipul A cuprinde 8 tipuri antigenice. Serurile preparate față de antigene specifice stau la baza lucrărilor de determinare a serotipurilor cărora aparțin diferite tulpini de Clostridium perfringens.
Determinarea serotipului tulpinilor izolate este folosită uneori, pentru confirmarea implicării lor în producerea toxiinfecțiilor alimentare, completând studiile epidemiologice. Această determinare demonstrează:
dacă izolatele din probele de fecale recoltate de la diferite persoane aparțin aceluiași tip;
dacă izolatele din probele de alimente și cele din fecale de la persoanele bolnave aparțin aceluiași serotip;
care din mai multe alimente incriminate stă la originea îmbolnăvirilor;
dacă între diferite episoade sau cazuri de boală există legături.
În timp, s-au făcut mai multe scheme de serotipizare, preparându-se seturi de seruri față de numeroase tulpini izolate din diferite țări. Asemenea seturi erau formate din 17, 47 sau 68 seruri diferite. Prin încercările de serotipizare a mai multor sute de izolate de Clostridium perfringens, provenite din mai multe țări și de diferite origini, nu s-a reușit să se încadreze în unul din aceste serotipuri mai mult de 69 % din izolatele verificate. O mare parte din izolate s-au dovedit netipabile, ceea ce reduce considerabil valoarea serotipizării.
S-au folosit și alte metode de tipizare ca bacteriocinotipia și analiza gaz-lichid-cromatografică a polizaharidului capsular (Saito M., 1990).
Folosindu-se scheme de tipizare cu seturi de 10 sau 20 bacteriocine, s-a constatat că o proporție mult mai mare din tulpinile izolate din episoadele de toxiinfecție alimentară erau bacteriocinogene comparativ cu izolatele din diferitele infecții umane și animale, din alimente și mediul înconjurător. Până în prezent bacteriocinotipia nu este folosită în mod curent în investigațiile epidimiologice.
Analiza gaz cromatografică a polizaharidului capsular se bazează pe faptul că acesta este un antigen tipo-specific, capsula diferitelor tulpini conținând polizaharide cu structură diferită (heteropolizaharide). Acest polizaharid nu este bine fixat de suprafața celulei bacteriene și se poate solubiliza ușor. Pentru a obține ,,in vitro” celule bacteriene capsulate, bacteria se cultivă pe suprafața mediilor agarizate glucozate cu adaos de lichide organice. Culturile de pe mediile solide sunt reprezentate de colonii cu aspect rugos, formate din celule acapsulagene și deci, nepretabile la tipizarea prin această metodă.
1.3.1.Multiplicarea
Clostridium perfringens este o bacterie anaerobă, dar tolerează prezența unor cantități mici de oxigen. Crește la 390 C, dar și la 45 – 470 C, fiind ușor termofil (temperatura optimă este de 43 – 450 C).
Pentru izolarea acestei bacterii din alimente, în care de obicei se găsește în amestec cu altă microfloră, se folosesc medii speciale în care sunt incluse substanțe selective (polimixina B, cicloserina, neomicina) și revelatoare (sulfit, cistină-cisteină, o sare de fier). În urma dezvoltării, aceste microorganisme metabolizează substanțele care conțin sulf, pun în libertate hidrogen sulfurat, iar acesta intră în reacție cu ionii de fier din mediu, formează sulfura feroasă de culoare neagră.
Determinarea numărului de clostridii sulfito-reducătoare din apă se face prin metoda tuburilor multiple, o metodă aplicabilă tuturor categoriilor de ape și care furnizează date de evaluare a celui mai probabil număr de clostridii sulfito-reducătoare folosind un mediu lichid în condiții de anaerobioză.
Obținerea anaerobiozei este asigurată prin înlăturarea oxigenului dizolvat din mediu, procedeul fizic utilizat fiind regenerarea prin menținerea în apă în fierbere sau în vapori fluenți a flacoanelor sau tuburilor cu mediu. Ca urmare, vaporii formați în masa mediului antrenează și oxigenul dizolvat în acesta. După regenerare, flacoanele sau tuburile se răcesc lent în apă. Protecția anaerobiozei se realizează pe lângă raportul redus suprafață / volum prin:
– acoperirea suprafeței mediului cu un strat izolat de ulei de parafină steril și
– introducerea în momentul preparării a unei substanțe reducătoare direct în medii ca: glucoză 0,2 %, cistenia hidroclorică 0,05 %, eventual 0,5 1 g agar pentru un volum de un litru bulion, care limitează solvirea oxigenului în bulionul regenerat.
Mediul bulion pentru clostridii sulfito-reducătoare conține un indicator de culoare pentru a evidenția starea de oxidoreducere a mediului.: resazurina sau albastru de metilen. Atât timp cât culoarea mediului de la suprafață spre profunzime nu depășește ¼ din înălțimea coloanei de lichid, mediul poate fi folosit ca atare, în caz contrar, se folosește o prealabilă regenerare la 1000 C.
Pentru determinarea numărului de spori de Clostridium perfringens, probele de apă sunt inactivate, în prealabil introduse în baia de apă la temperatura de 600 C, temperatura este ridicată treptat și menținută timp de 15 minute la 800 C pentru a distruge toate formele vegetative ale bacteriilor din apă. Apoi probele de apă ca atare și după necesitate, diluțiile decimale ale acestora sunt însămânțate în balonașe și eprubete cu mediu regenerat la baia de apă la temperatura de 1000 C, răcit brusc, folosind pipete de capacitate mai mare decât volumul ce trebuie însămânțat ce vor fi introduse în profunzimea mediului, lăsând să cadă liber fără a sufla în ele volumul de apă însămânțat. Un strat de 0,5 – 1 cm ulei de parafină steril este adăugat la suprafața bulionului inoculat pentru a menține condiții de anaerobioză. Probele sunt apoi incubate la 370 C timp de 48 ore. Citirea se face la 24 ore și se completează și corelează cu citirea definitivă a testului după 48 ore. O reacție pozitivă este indicată de înnegrirea mediului.
Testele bacteriologice suplimentare, ca de exemplu, comportare față de cazeină și prezența lecitinazei, trebuie efectuate pentru configurarea speciei de Clostridium perfringens.
Laptele turnesolat în urma dezvoltării speciei de Clostridium perfringens capătă un aspect caracteristic: datorită fermentării lactozei se înroșește. Este coagulat în totalitate, fiind sfâșiat de gaze. Cheagul format este lipit de unul din pereții eprubetei, locul rămas liber este umplut cu un zer de culoare gălbuie care se clarifică pe măsură ce trece timpul și bacteriile se depun, proteina din lapte fiind lizată. Deasupra se găsește un cheag mai mic, buretos, cu aspect de dop spongios de culoare intens roșu. În cazul laptelui fără turnesol, aspectul caracteristic de cheag allveolar este identic, dar fără colorația specifică.
Prezența lecitinazei se determină folosind plăci cu mediu Nagler sau Willis-Hobbs ce se însămânțează în suprafață folosind metoda pentagonului. La marginea plăcii se depun 3-4 picături de bulion pentru clostridii sulfito reducătoare pozitiv din care se trag cu ansa flambată striuri paralele, alte striuri din capătul acestora și apoi altele, până se realizează un pentagon încadrat în cercul plăcii Petri. Pentru realizarea condițiilor de anaerobioză se folosește metoda pirogalolului alcalin, ce constă în utilizarea unor pliculețe cu amestec pentru realizarea anaerobiozei lipite de capătul plăcii Petri conținând pirogalol, una din substanțele cu mari puteri de absorbție a oxigenului, urmată de parafinarea plăcii pentru a o etanșa. Reacția lecitinazei constă din opacifierea care se observă în jurul coloniilor pe mediile Nagler sau Willis – Hobbs, conținând gălbenuș de ou și se datorează producerii unor enzime specifice, letinazei, care difuzează în jurul coloniilor și atacă lecitina din gălbenușul de ou. Această reacție este produsă de câteva specii de Clostridium și în primul rând este produsă în mod specific de Clostridium perfringens, a cărei exotoxină principală, alfa-toxina este o lecitinază.
Plăcile cu mediul Willis – Hobbs pe care se observă activitatea lecitinazei se deschid permițând contactul cu aerul. În cazul speciei Clostridium perfringens, după 1-2 ore coloniile se vor colora în roz-roșiatic, datorită fermentării lactozei, prin aceasta Clostridium perfringens putând să se diferențieze de alte specii lecitino-pozitive dar lactozo-negative, ca de exemplu Clostridium bifermentas.
Ca urmare folosirea laptelui fără turnesol se recomandă când în paralel se utilizează mediul Willis-Hobbs care conține lactoză și permite evidențierea fermentării acesteia, datorită prezenței roșului neutru în compoziția sa, iar a laptelui cu turnesol în paralel cu mediul Nagler.
Controlul culturilor de pe mediul Nagler și Willis-Hobbs se face prin repicarea unui număr de 5-10 colonii pe plăci cu geloză 2 % în aerobioză, având ca rezultat lipsa creșterii după incubare timp de 24 ore la 370 C.
Asocierea proprietății de a produce cheag alveolar în lapte, cu cea a opacifierii mediului cu gălbenuș de ou prin producerea lecitinazei, este strict specifică pentru Clostridium perfringens, deoarece nici o altă specie de genul Clostridium (sau din alte genuri) nu produce simultan cele două reacții. În cadrul unei ape reziduale încărcate, în care clostridiile sulfito-reducătoare sunt prezente până la diluții mari (104) și confirmarea speciei Clostridium perfringens prin testul cheagului alveolar, se realizează de asemenea, până la diluții mari, se recomandă să se facă trecere pe mediu cu gălbenuș de ou (Nagler sau Willis-Hobbs modificat), având încorporat antibioticul din ultimele două diluții ale mediului de îmbogățire. Examenul microscopic, prezintă la colorația Gram aspectul caracteristic de bacili de lungime variabilă (4-8 ) și groși (0,8 – 1,2 ), drepți cu capete rotunjite, Gram pozitive.
Se pot folosi mai multe medii selective pentru numărarea celulelor vegetative viabile și a sporilor de Clostridium perfringens conținând unul sau mai multe antibiotice adăugate în anumite concentrații la mediul de bază pentru inhibarea florei de asociație:
mediul sulfit polimixină B sulfat – sulfadiazină agar (SPS) după Angelotti;
mediul sulfit – polimixină B sulfat – neomicină agar (SPN) după Marshall;
mediul Shaide – Ferguson perfringens agar (SFP) conținând polimixină B sulfat, kanamicină sulfat și gălbenuș de ou;
mediul triptonă – sulfit – cicloserină – agar (TSC) constând din același mediu de bază ca și agarul Shaidi – Ferguson, dar cu adaos de 40 mcg D – cicloserină, pe capacitatea ei de a produce lecitinază și de a reduce sulfitul permițând astfel izolarea celor mai multe tulpini de Clostridium perfringens și inhibând practic toți anaerobii facultativi.
A fost evaluată o tehnică a membranei filtrante pentru determinarea cantitativă a speciei de Clostridium perfringens din apă, utilizând un mediu de bază (MCP) pe care creșterea speciei Clostridium perfringens a fost îmbunătățită prin adăugarea de fier, recuperarea maximă atingându-se când mediul de bază a fost suplimentat cu 9 mg clorură ferică pentru 100 ml mediu. Inhibarea florei de asociație cu izolare maximă a speciei de Clostridium perfringens s-a realizat cu ajutorul a două antibiotice: D – cicloserina 40mg/ml și polimixină B sulfat 2,5 mg/100 ml mediu.
Procentele cele mai mari de izolări s-au obținut la temperatura de 450 C, optimă pentru dezvoltarea speciei și aleasă pentru că temperaturile de 44 până la 450 C sunt utilizate pentru cercetarea altor indicatori. Perioada de incubare optimă este 18-24 ore, depășirea acesteia neîmbunătățind procentele de izolare.
Printre testele diferențiale incluse în mediu se numără fermentarea sucrozei, producerea de acid fosfatază și absența activității B-D-glucozidazei (Clostridium perfringens este Suc + Phos+, Celo-). Pentru a evidenția hidroliza gelatinei care este o caracteristică majoră de diferențiere a Clostridium perfringens de alte clostridii, fără a fi necesară subcultivarea coloniilor se transferă membrana cu o pensă sterilă de pe mediul pentru Clostridium perfringens pe o placă cu mediu cu gelatină, se incubează 1-2 ore la 370 C, se îndepărtează membrana și se inundă cu 1-2 ml reactiv Frazier. Coloniile de pe membrană corespund hidrolizei sunt socotite gelatinoza – pozitive.
1.3.2.Germinarea-sporularea
Sporulează greu și numai în anumite medii de cultură (mediul Poppe). Sporii care nu apar în mediile de cultură unde bacteriile produc aciditate sunt ovali și măsoară 0,4 – 0,6 micrometri, plasați subterminal.
S-a studiat influența pH – ului în mediul fără zahăr, cu pH constant, zona favorabilă sporulării fiind cea cu pH 6,8 – 8,4, cu un optim între 7,4 și 8 (Craven S.E., 1990).
Diminuarea cantității de glucoză crește sporularea (Guguianu E., 2002). Pentru Clostridium perfringens, dispariția glucozei determină creșterea numărului de spori de la 5000 la 9000 pe cm ³ (Brett., 1998).
Vechimea culturii în acest mediu este un factor de creștere a fazei de sporulare. Adăugarea de substanțe reducătoare, în particular vitamina C, crește nivelul de sporulare (Craven S.E., 2003).
În 1945 Regvier, Prèvot și Lartigant au constatat că ionul de potasiu favorizează puțin sporularea prin mărirea permeabilității peretelui celular.
După Wynne, Mehl și Sechmieding, 1945 sporii de Clostridium perfringens germinează când sunt introduși într-o soluție de glucoză tamponată cu fosfat. Aceasta germinație este sensibilă la pH-uri acide și la Eh-uri defavorabile.
Pe baza răspunsului la germinarea sporilor, cele zece tulpini de Clostridium perfringens studiate au fost împartițe în două tipuri: tipul K, care cuprinde tulpini termorezistente, ai căror spori germinează în mediul ce conține clorură de potasiu, după activare termică și tipul A care cuprinde tulpini termosensibile ai căror spori germinează în mediul cu L-alanină, inozină și clorură de calciu, în prezența CO2, fără activare termică prealabilă.
Pentru o germinare optimă sporii au nevoie de o tratare termică ușoară, proces ce este cunoscut ca activare prin caldură sau șoc termic.
Stimularea germinării sporilor se face prin tratarea lor cu concentrații mici de etanol (10,8 moli), ceea ce reduce nivelul tratamentului termic de activare de la 700C la 400C (Manfreda G., 2006).
Prin practicarea de frotiuri s-au observat modificările stadiale ale celulelor bacteriene în timpul sporulării. După colorarea cu KMnO4 0,2%, timp de 5 minute, se colorează cu saprinină 1% timp de 3 minute (Carp Cărare M., 1987).
La început se observă forme vegetative bazofile, omogene. În a doua oră se observă o îngroșare proeminentă care se produce o dată cu scăderea bazofiliei din citoplasmă. În a treia oră se observă presporularea. De la a patra la a cincea oră umflătura sporului se închistează. În a sasea oră noii spori rezistă la colorare, apoi sporangele își pierde forma elipsoidală și continuă să se micșoreze. În a zecea oră apar sporii maturi.
1.4. Rezistența la factorii de mediu
1.4.1. Temperatura
Cunoașterea temperaturii de dezvoltare a bacteriei are o deosebită semnificație pentru salubritatea alimentelor. Odată cunoscută, ea poate fi folosită pentru prevenirea dezvoltării bacteriei.
Formele vegetative nu prezintă o rezistență particulară față de diverși factori fizici și chimici, acestea fiind distruse în 15 minute la 63-650C. Sporii, în schimb, rezistă la temperaturi mult mai ridicate. Rezistența lor variază în raport cu tulpina și cu mediul de cultură .
Clostridium perfringens se poate dezvolta la 15 – 500C, cu un optim de 43-450C.
Cunoașterea temperaturii minime de dezvoltare a determinat tehnologii să folosească metode rapide sau ultrarapide de refrigerare a carcaselor rezultate din tăierea animalelor de măcelarie, pentru a preveni putrefacția profundă a cărnii. Aceasta ar însemna că în 6-7 ore de la obținere, straturile profunde ale maselor musculare ar ajunge la temperaturi de 15-200C. La acest interval de temperatură, bacteria nu se multiplică cu o rată semnificativă, numărul celulelor bacteriene pe toată perioada de valabilitate neatingând valori la care apare alterarea cărnii.
Temperatura de 600C distruge repede formele vegetative aflate în mediul de cultură. În alimente, datorită conținutului în grăsimi, bacteriile sunt mai rezistente.
Efectul temperaturii a fost studiat în Canada de Strong și Scott în 1963, pentru viabilitatea a trei tulpini de Clostridium perfringens de origine alimentară și fecală. Au fost testate următoarele limite de temperatură: -170C și 70C, 170C și -10C, 800C și 1000C, primele două temperaturi timp de 48 de ore, ultimele două timp de 10 minute. Rezultatele au fost următoarele:
1% din celulele vegetative rezistă la – 170C – +70C
5% din celulele vegetative rezistă la 70C și – 10C;
3% – 10% din celulele vegetative rezistă la 800C;
0% din celulele vegetative rezistă la 1000C.
Există tulpini psihrofile de Clostridium perfringens care cresc bine la 60C. Se consideră a fi o bacterie mezotermofilă. Această proprietate a bacteriei se folosește în unele metode de izolare din materialele în care există microfloră competitivă, temperatura de incubare a mediilor inoculate fiind, în acest caz, un factor selectiv.
Sporii de Clostridium perfringens nu sunt prea rezistenți la caldură, fiind distruși prin fierbere în 2-3 minute.
Rezistența la căldură a sporilor are o importanță deosebită pentru tehnologia și igiena produselor alimentare.
Termorezistența sporilor de Clostridium perfringens este mult mai mică decât a sporilor altor specii de clostridii, în special al celor de Clostridium botulinum.
Compoziția mediului, pH-ul, originea tulpinilor joacă cu siguranță un rol în aceste variații ale termorezistenței, binecunoscute în industria conservelor.
Prèvot, Raymond și Tatuki, în 1951, au observat un fenomen ce explică variațiile termorezistenței pentru aceeași tulpină. Tratată la temperatura de 1000 C, aceasta nu rezistă decât 3 minute.
Pusă în contact cu o altă cultură a unei bacterii anaerobe termorezistente (de exemplu varietatea stavangerensis de Clostridium sporogenes), care rezistă 8 ore la 1000C, termorezistența primei tulpini este marită de zece ori, aceasta rezistând 30 de minute la 1000C.
Ei au numit acest fenomen ,,antrenare la termorezistență“. La terminarea contactului termorezistența dispare, deoarece substanța responsabilă de acest fenomen se găsește în corpul microbian și difuzează în mediu.
Fenomenul este neregulat, iar această neregularitate este datorată faptului că nu toate tulpinile sunt receptive la substanță antrenantă.
Sporii existenți în mediile uscate, sunt foarte rezistenți comparativ cu cei din atmosferă umedă. Ei rezistă 15 minute la 1300C și 5 minute la 1400C (după C. Constantinescu 1984), iar în aer pot rezista până la 10 luni.
Sunt foarte sensibili la formol, o cultură sporulată formolizată (4 ‰) fiind complet sterilă după 2-3 zile la 370C.
Hall și Angelotti au completat aceste cercetări în 1965. Pe 265 de eșantioane de produse alimentare, 161 fiind de origine animală, în stare crudă și 101 alimente preparate, Clostridium perfringens a fost izolat în proporție de 43,1 %. Două tulpini au fost termorezistente și au crescut între 5 și 1500C (creștere rapidă la 450C), iar restul au fost inactivate între 45 și 600C.
Dacă la numeroase specii bacteriene sporogeneza reprezintă numai un proces de formare a sporului, fără alte consecințe asupra patogenității sau a altor caractere taxonomice, în cazul speciei Clostridium perfringens sporularea are un rol suplimentar, în sensul că ea este legată, în cazul multor tulpini, de producerea enterotoxinei, factorul principal al producerii toxiinfecțiilor alimentare determinate de această bacterie (Bârzoi D., 1985).
1.4.2. Capacitatea de reținere a apei ( aw)
Valoarea aw influențează capacitatea de înmulțire a bacteriei. În soluția în care aw este ajustat cu ajutorul zaharozei, glucozei și a clorurii de sodiu, valoarea cea mai mică la care se poate multiplica Clostridium perfringens este de 0,97- 0,95. La o valoare aw de 0,95, Ph – ul de 7 și temperatura de 450C se obține numărul maxim de bacterii pe unitatea de volum și timpul de ,,log” cel mai scurt.
1.4.3. Ph-ul
Clostridium perfringens se dezvoltă foarte bine la Ph 6,5 – 7,5 și este distrusă la Ph < 5 sau > de 8,5. Din cauza sensibilității mari la Ph scazut, această bacterie moare foarte repede după dezvoltarea în medii glucozate. Dacă mediile conțin carne sau ficat, Ph – ul nu scade prea mult în urma dezvoltării acesteia, deoarece proteinele din aceste substraturi au capacitatea de a tampona mediul.
Ca și în cazul Ph – ului și temperaturii, valoarea aw la care poate avea loc sporularea oxcilează între limite foarte strânse.
1.4.4. Potențialul oxido- reducător
Eh-ul influențează dezvoltarea speciei Clostridium perfringens în substraturile în care se află. Bacteria se poate multiplica la valori Eh foarte diferite, de la -125 la + 350 Mv, în funcție de tulpină, mărimea inoculului, natura mediului de creștere, starea metabolică a celulelor.
Dacă Eh – ul este favorabil începerii multiplicării, bacteria are capacitatea să susțină multiplicarea prin stabilirea unor condiții reducătoare intense în timpul fazei de multiplicare logaritmică, aceasta probabil datorită existenței unor substanțe cu Eh scăzut, așa cum este ferodoxinul.
Carnea, imediat după sacrificarea animalului, are un Eh > 250 Mv, deci nefavorabil dezvoltării bacteriei Clostridium perfringens. Treptat, această valoare scade, ajungând după 9 ore la valori de -50 Mv, carnea deveninhd asfel un mediu propice multiplicării bacteriei.
1.4.5. Sărurile de conservare
Acestea influențează în mod nefavorabil supraviețuirea și multiplicarea speciei Clostridium perfringens în alimente.
O concentrație de 5-6 % NaCl inhibă dezvoltarea majorității tulpinilor, iar cantitatea de nitrit necesară inhibării depinde de tulpină, Ph, mărimea inoculului, iar condiția este ca nitritul să fie adăugat înainte de autoclavare.
Mărirea efectului de inhibare a nitritului de sodium sub influența căldurii, când acesta este adăugat în carne, este cunoscut sub denumirea de efectul PERIGO (PTF). Acesta este un produs antibacterian ce se formează în timpul tratării termice severe, a cărnii care conține nitrit, cum este cazul conservelor și semiconservelor stabile.
Acest factor joacă un rol important în prevenirea germinării și multiplicării sporilor de Clostridium perfringens rămași în cărnurile conservate, după tratarea lor termică.
Pentru realizarea acestui efect este necesar de 20-60 de ori mai puțin nitrit într-un mediu la care el se adauga înainte de autoclavare, decât dacă el se adaugă la un mediu deja sterilizat.
Amestecul de sare și nitriți sporește efectul inhibitor pentru fiecare în parte.
Pentru cărnurile conservate, pentru același efect inhibitor este nevoie de adăugarea unor cantități mai mici din fiecare substanță, când se adaugă împreună. De exemplu, la concentrația de 3-6 % NaCl, cantitatea de nitrit se reduce de la 300 ppm la 25 ppm.
1.4.6. Refrigerarea și congelarea
Acestea au un efect nefavorabil asupra formelor vegetative de Clostridium perfringens și aceasta sta la baza prevenirii multiplicării lor în alimente.
Formele vegetative nu se pot multiplica la temperaturi mai mici de 150C și mor în timp relativ scurt. Celulele aflate în faza logaritmică de dezvoltare sunt mai sensibile decât cele în faza staționară, primele fiind distruse în proporție de 80 -90 % în interval de 6 minute la 40C. De asemenea, ele sunt sensibile la temperatura de congelare, proporția lor de supraviețuire la – 170C după 30 de zile fiind de 6,5% sau mai mică, în funcție de substratul în care se găsesc, iar la -29 0C, rata de supraviețuire este de 0,5% după 28 de zile.
Sporii nu sunt distruși la temperaturi joase decît într-o proporție neînsemnată.
Având în vedere sensibilitatea formelor vegetative la temperaturi joase, se impune ca probele de alimente, care trebuie examinate în pentru detectarea prezenței speciei Clostridium perfringens, să se introducă în lucru imediat sau să se păstreze refrigerate un timp cât mai scurt, dar nu congelate.
1.5. Rezistența la acțiunea substanțelor antimicrobiene și dezinfectante
Antibioticele cele mai active sunt penicilina, eritromicina, cloramfenicolul, etc., dar și sulfamidele au un efect antibacterian.
Clostridium perfringens poate căpăta rezistență transferabilă față de unele antibiotice. Rezistența față de antibiotice a tulpinilor izolate din carne este asemănătoare cu cea a tulpinilor izolate din materialele clinice. Acest efect apare mai des în efectivele în care antibioticele se administrează în mod obișnuit, mai ales în scop de biostimulatori. Acest fel de rezistență s-a observat față de tetraciclină, ea datorându-se unor plasmide.
Radiațiile
Rezistența la radiații a sporilor de Clostridium perfringens este variabilă, tulpinile izolate din cazurile de toxiinfecții alimentare fiind în general mai rezistente.
Între radiorezistență și termorezistență există o relație directă. O iradiere anterioară sensibilizează sporii la tratamentul termic.
1.6. Patogenitatea
1.6.1. Factorii de patogenitate
Clostridium perfringens se multiplică în țesuturile vii și secretă principii toxice atât ,,in vivo“ cât și ,,in vitro“. Este deci un germene patogen prin toxicitate și virulență. Procesul patologic e dominat însă, ca și la alți anaerobi din acest grup, de capacitatea toxică a bacteriei.
Elaborarea toxinei ,,in vitro“ este condiționată de tulpină, de mediul de cultură și de temperatura de incubare, al cărei nivel optim este de 37 – 400C.
Bacteria produce 12 exotoxine, de natură proteică, cu activitate biologică diferită. Acestea sunt notate cu literele alfabetului grecesc și sunt diferite din punct de vedere antigenic. Opt dintre acestea reprezintă toxine propriu –zise (α – i), iar patru (k – γ) sunt enzime. Unele din aceste exotoxine au un grad apreciabil de termorezistență, însușire cu o mare semnificație pentru igiena alimentară. Astfel, toxina rămâne activă după o tratare termică de 6 – 18 minute la 850C, fiind în același timp suspendată într-o soluție de fracțiuni proteice cu greutatea moleculară de 50.000 Da. În alimente, se presupune că acestă termorezistență este mai mare.
Capacitatea de a sintetiza una sau mai multe toxine majore, constituie criteriul de clasificare al tulpinilor de Clostridium perfringens in cinci tulpini sau biotipuri: A, B, C, D și E (tabelul 1.3.).
1.6.1.1.Toxine
Toxina α este o fosfolipază C care hidrolizează lecitina în fosforilcolină și digliceridă. Ea este produsă de toate cele 5 tipuri de Clostridium perfringens și își manifestă efectele ei letale prin liza membranelor celulare, probabil ca o consecință a hidrolizei lecitinei din membrana celulară. Este singura toxină care produce necroza țesutului muscular în cazul gangrenei gazoase la om și animale. De asemenea, poate determina hemoliză intravasculară. Intervine în enterotoxiemia mieilor și a altor specii de animale, iar la porci produce o hipersensibilitate care determină apariția artritelor deformante, a paracheratozei și a glomerulonefritei proliferative. La om, în afară de necroză și hemoliză, tulpinile de tip A provoacă toxiinfecții alimentare ca urmare a producerii de enterotoxină.
Tabelul 1.3.
Clasificarea tulpinilor de Clostridium perfringens pe baza tipurilor majore de toxine produse
Tipul F, descris țn unele lucrări mai vechi este considerat acum ca tip C.
Table 1.3.
Classification of Clostridium perfringens strains based on the produced major types of toxins
(după Bărzoi S. Meica și M. Negut , 1999 )
Toxina β este produsă de tulpinile B și C și este sensibilă la tripsină. Este formată dintr-un singur lant de polipeptide cu greutatea moleculară de 30.000 daltoni, producerea ei fiind mediată de o plasmidă. Acțiunea sa toxică pare a fi exercitată prin creșterea permeabilității capilare. Injectată pe cale intravenoasă determină eliberarea de catecolamine endogene.
Procesul patologic determinat de toxină interesează tubul digestiv. La om determină o enterită necrotică, de regulă prin consumul de carne de porc. Nu se cunoaște dacă toxina este preformată în alimente sau este produsă in intestine după ingestia bacteriei. Activitatea acestei toxine este favorizată de ingerarea unor cantități mari de cartofi cruzi, care conțin inhibitori ai tripsinei, ca și de înfometarea prelungită care determină producerea unor nivele scăzute de tripsină.
Toxina ε este elaborată de tipul B și D sub formă de protoxină, virtual netoxică, care este ulterior convertită de unele enzime proteolitice, așa cum este tripsina, într-o toxină termolabilă. Această toxină pare a crește permeabilitatea vasculară, probabil prin activarea adenilciclazei, care, în ultimă instanță, duce la necroza țesuturilor.
Expunerea intestinului la toxina ε conduce la o permeabilitate mai mare a vaselor față de proteine, inclusiv față de toxina ε, aceasta putând fi un factor important de patogeneză, deoarece administrarea aceleeași doze totale în mai multe reprize, dar în cantități mici, poate fi letală.
Toxina ε produce o creștere a permeabilității vasculare în mai multe organe, în special în creier. Din această cauză, la animalele afectate, edemul și necroza țesutului cerebral este cauza cea mai probabilă a morții. Toxina este și citotoxică pentru macrofagele peritoneale de iepure și cobai.
Toxina ί (iota) este produsă numai de tipul E ca protoxină, fiind activată de enzimele proteolitice. Toxina crește permeabilitatea vasculară, determinând necroze după inocularea i.d. și efect letal după inocularea i.v.
Pentru tipizarea tulpinilor de Clostridium perfringens se folosește reacția de seroneutralizare cu seruri antitoxice specifice biotipului. Neutralizarea toxinei se verifică prin inocularea i.v. a șoarecilor, cu amestecul de toxină și antitoxină, menținut 30 de minute la 35 – 370C. În cazul în care toxina este neutralizată, șoarecii supraviețuiesc, în timp ce șorecii inoculați cu amestec de toxină și ser fiziologic mor în 3 – 4 ore. Tipizarea se poate face și prin inocularea i.d. la cobai a amestecului de toxină și antitoxină.
Distribuția factorilor toxici la diferite tipuri de Clostridium perfringens și stările morbide pe care le produc sunt prezentate în tabelul 1.4. (după D. Barzoi , 1999).
Tabelul 1.4.
Factorii toxici produși de Clostridium perfringens (după D. Barzoi , 1999).
Table 1.4.
Toxic factorsproduced by Clostridium perfringens (după D. Barzoi , 1999).
Continuarea tabelului 1.4.
Legenda : +++ = produsă de majoritatea tulpinilor
++ = produsă de unele tulpini
– = nu e produsă
0 = netestată
1.6.1.2.Enterotoxina
Enterotoxina produsă de Clostridium perfringens este o proteină cu greutate moleculară de 35000 daltoni, nedializabilă, inactivată de pronază, eliberată în mediu prin liza celulelor microbiene sporulate. Mecanismul său de acțiune este mediat de activarea sistemului adenil – ciclază – AMP ciclic, efectele citotoxice directe ale toxinei fiind demonstrate pe culturi de celule Hela (Taylor, citat de Dragomirescu, 1980).
Enterotoxina se leagă de gangliozidul GM1 din plasmalema enterocitului, provocând activarea ireversibilă a adenilciclazei. Aceasta, în continuare, catalizează formarea unei cantități mari de AMP ciclic din ATP care activează transportul de Na+ prin mucoasă. Ionii de Na+ atrag după ei transportul apei și, ca atare, se produce diareea (Benga,1985). La această acțiune de inversare a fluxului intestinal se adaugă ca acțiune specifică și inhibiția absorbției de glucoză.
Activarea termică a sporilor de Clostridium perfringens necesară germinării acestora, atunci când se aplică formelor vegetative, desigur la valori mai mici, mărește capacitatea lor de a sporula și de a produce enterotoxina.
Enterotoxina se poate sintetiza și în alimentele contaminate. Pentru a se produce în cantități mari capabile să determine îmbolnavirea, este nevoie ca numărul bacteriilor să atingă valori foarte mari (>10 % /gram), situație în care apar modificări organoleptice evidente ale alimentului și acesta devine neconsumabil.
CAPITOLUL II
DATE PRIVIND EPIDEMIOLOGIA INFECȚIILOR PRODUSE DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
CHAPTER II
DATAS REGARDING THE EPIDEMIOLOGY OF INFECTIONS PRODUCED BY CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
2.1. Sursele de infecție
2.1.1. Rezervoarele de Clostridium perfringens
În diferite faze și tehnologii de conservare se încearcă obținerea unor cifre cât mai mici de microorganisme în produse. Aceasta duce la mărirea duratei de consumare a produsului, împiedicând dezvoltarea florei proprii, ca și contaminarea accidentală care să ducă la alterare. Din aceasta decurge faptul că, N.T.G.M.A. (numărul total de germeni mezofili aerobi) nu prezintă importanță decât pentru produsele din carne (mixte sau simple), gata pregătite, care se consumă reci – piftii, aspicuri, pateuri din carne și organe, salate etc., mâncăruri gătite, mâncăruri congelate. Toate celelalte au ca cerință microbiologică imperioasă numai prezența germenilor patogeni și aceștia se cercetează prin indicatori sanitari care pot arăta posibilitatea infectării produsului și prin metode directe pentru unii dintre ei.
Clostridium perfringens este cel mai răspândit dintre toate microorganismele care pot provoca infecții la om, are o răspândire universală, se găsește în orice mediu, sol, apă, aer, pe orice suprafață, în orice aliment care nu a fost sterilizat. La om și animale se găsește pe piele, mucoase și 100 % în conținutul intestinal. De aici rezultă importanța decelării sale și a determinării numărului probabil în laptele crud sau pasteurizat, ca și în produsele sale de orice fel.
Clostridium perfringens a fost descris de diverși autori, în multe alimente cu diferite grade de prospețime și în alimentele alterate sub forma sa vegetativă sau ca spor.
În ceea ce privește valoarea ca indicator sanitar a germenului Clostridium perfringens, în comparație cu bacteriile din grupul coliformi, cu enterococii și cu bacteriile din genul Proteus, Clostridium perfringens își dovedește valoarea sa ca indicator sanitar microbiologic de contaminare a alimentelor datorită existenței sale în materiile fecale ale omului și animalelor. Fiind însă o bacterie sporulată care supraviețuiește foarte mult timp în condiții diferite de mediu, unii autori au rezerve când o găsesc ca singura prezență dintre bacteriile indicatoare. În asemenea cazuri este vorba de o contaminare care a avut loc mai demult, așa că în momentul cercetării este posibil ca orice microorganism patogen care ar fi existat să fi dispărut și deci, apa sau produsul alimentar să nu prezinte vreun pericol pentru consumator. Din această cauză, la analiza unui produs alimentar, ca și la analiza apei trebuie să se caute în prealabil două sau mai multe bacterii indicatori.
Dintre bacterii, ca indicatori sanitari microbiologici, Clostridium perfringens este cel care poate demonstra cea mai veche contaminare, în contrast cu Proteus, indicator al unei contaminări foarte recente sau al unui început de alterare.
Rezistența mare a sporilor de Clostridium perfringens, timp de 10 luni, chiar în condiții de aerobioză, demonstrată de Weinberg și colab. (1934), explică și mai bine de ce această bacterie poate indica cea mai veche contaminare.
Sporii de Clostridium perfringens sunt rezistenți la temperaturi ridicate. După diverși autori, ei rezistă 10 – 90 minute la fierbere în funcție de pH-ul alimentului. Duncan C.L., 1972 într-un studiu pe tulpini de Clostridium perfringens tip A care au provocat toxiinfecții alimentare în Anglia, găsește că sporii acestor tulpini rezistă la fierbere 1-3 ore.
Prezența Clostridium perfringens în alimente poate arăta o contaminare fecală veche, anterioară prelucrării termice de tipul pasteurizărilor.
Conținutul de clostridii sulfito-reducătoare și, în special, Clostridium perfringens, se modifică mult mai puțin decât titrul coli prin termotratamentul laptelui, Clostridium perfringens constituind un indicator al contaminării inițiale a laptelui pasteurizat.
Clostridiile sulfito-reducătoare au valoare ecologică interpretabilă, limitată de faptul că proveniența lor în alimente nu este numai din contaminare fecală, ci uneori au origine telurică și întrucât ele se pot înmulți în aliment, iar numărul lor devine semnificativ numai dacă depășește 102 celule /g, când pot apare modificări de alterare, precum și eventual riscurile pentru consumator (toxiinfecția alimentară).
Clostridium perfringens poate fi găsit în multe alimente, dar pentru a provoca toxiinfecție alimentară, este necesar un număr mare de asemenea microorganisme (cca 106 / g aliment).
Cele mai bune condiții de multiplicare le găsește în produsele bogate în proteine și lipide (mâncăruri cu carne, pasăre, pește, fasole etc.) și care, după tratamentul termic, sunt răcite lent și se păstrează la temperaturi ridicate (40-500C) sau se reîncălzesc. Sporii de Clostridium perfringens, fiind termorezistenți, suportă uneori ,,șocul termic”, iar germinarea lor poate fi stimulată prin lipsa competițională a microorganismelor aerobe și păstrarea alimentului la temperatură ridicată.
În produsele alimentare perisabile ca: laptele praf, brânzeturi, mezeluri, păsări fripte, pește afumat etc., clostridiile sulfito reducătoare nu trebuie să depășească 102 / g de produs.
La fabricarea conservelor se iau toate măsurile pentru reducerea titrului de spori din materia primă și se aplică un barem de autoclavare care să distrugă sporii.
La analiza unui produs alimentar trebuie să se caute în paralel două sau mai multe bacterii indicatoare de contaminare fecală. Prezența a două asemenea bacterii în aliment în raport cu cantitatea lor, confirmă mai bine contaminarea cu materii fecale a unui produs alimentar. Unii indicatori sanitari au și semnificație epidemiologică deosebită, ne pot informa despre originea umană sau animală a contaminării, despre vechimea contaminării, precum și despre originea sigur intestinală sau eventual originea telurică a contaminării.
Microbiologia apei destinate consumului uman este o componentă importantă a complexului de aspecte legate de sănătatea publică, datorită, în primul rând, faptului că apa contaminată cu unele microorganisme poate sta în mod direct la originea multor episoade de îmbolnăvire în masă a unor comunități de oameni. În al doilea rând, fiind folosită la obținerea și prelucrarea alimentelor, apa le poate contamina cu unii germeni patogeni. Din această cauză, nu se poate vorbi de microbiologia alimentelor fără a trata microbiologia apei potabile.
Clostridium perfringens reprezintă un indicator complementar util al poluării fecale a apei, deoarece este consecvent prezent în apa fecaloid-menajeră în concentrații de 103 până la 104 / 100 cm3 și pentru că rezistența sa la clorurare și factorii de mediu este asemănătoare cu cea a enterovirusurilor.
În Directiva CE nr. 98/83, modificată cu Regulamentul CE nr. 1882/2003, se arată că, sporii acestei clostridii sulfito reducătoare pot supraviețui mai mult timp în apă comparativ cu grupul coliformilor și rezistă la dezinfecții când concentrația, pH-ul sau durata contactului nu sunt satisfăcătoare. Persistența lor în apele dezinfectate indică prezența deficiențelor în procesele de tratare a apei.
Poluarea microbiană a alimentelor de origine animală se produce inevitabil în momentul recoltării acestora (lapte, ouă, miere), în timpul producerii sau prelucrării (carne, preparate din carne, semiconserve, conserve, produse lactate etc.), în timpul conservării, depozitării, manipulării, transportului și desfacerii.
Gradul poluării alimentelor este strict dependentă de condițiile în care se produce. Această poluare se realizează cu microfloră și micofloră saprofită, dar, uneori, poate participa și microflora patogenă pentru om.
Microflora și micoflora saprofită din alimente au ca surse primare solul și apa, ca nișe ecologice esențiale și aerul, ca vector. Din sol și apă aceste microorganisme ajung pe pielea animalelor și în conținutul intestinal. Deci, animalul însuși, reprezintă o sursă principală de contaminare a produselor, îndeosebi când igiena corporală a animalului este deficitară.
Clostridium perfringens se găsește frecvent în dejecțiile omului, animalelor și insectelor. Sporii bacterieni pot rezista foarte mult timp în sol, praf și sunt frecvenți în adăposturile animalelor și în lăptării.
Aproximativ 16 – 18% din probele de lapte pasteurizat sunt contaminate cu Clostridium perfringens. În anumite condiții el se poate înmulți în laptele contaminat și provoacă gastroenterite. Cazurile de diaree și vomismente observate la copii au fost atribuite laptelui contaminat a cărui tratare termică este insuficientă și care s-a păstrat la 250 C. Pentru a evita înmulțirea acestui germen în laptele contaminat este nevoie ca acesta să se păstreze la temperaturi de 150C. În produsele lactate acide și brânzeturi nu rezistă.
2.1.2. Purtători de Clostridium perfringens
Infecțiile produse de Clostridium perfringens, denumite și Welchioze, sunt larg răspândite la animale, germenul găsindu-se aproape constant în tubul digestiv al acestora, precum și în sol. Clostridium perfringens este agentul etiologic al enterotoxiemiilor la animale (oi, purcei, viței, mânji, etc.), entități care se traduc prin tulburări gastrointestinale și modificări a unor organe splahnice. O eliminare de 103 germeni pe gramul de materii fecale este considerată normală (Dragomorescu, 1980).
Tulburările digestive sunt provocate de toxina preformată în furaje incorect prelucrate, fiind consecința intervenției unor factori mai puțin cunoscuți (regim alimentar hiperproteic, consumul unor furaje mucegăite sau înghețate, tahifagie, etc.). Acestea duc la diminuarea peristaltismului intestinal și la crearea unor condiții propice de pH, la nivelul tubului intestinal, pentru multiplicarea germenilor din această specie, care vor produce cantități mari de enterotoxină și care este răspunzătoare de simptomatologia din aceste afecțiuni.
Pacheco, în 1954, a considerat că, în ansamblu, semnele gangrenei gazoase, semnele nervoase centrale, ca și în botulism și în tetanos, au o importanță primordială și, din aceste considerente, include clasa infecțiilor gangrenoase printre infecțiile neurotoxice. Alături de Cardoso și Costa, el a descris leziunile sistemului nervos central la animalele intoxicate prin toxine. În intoxicația acută, leziunile severe apar după 20 – 30 minute în celulele măduvei spinării, în particular în celulele motrice ale măduvei posterioare și bulbului: cromatoliză, picnoză, atunci când teaca de mielină rămâne intactă.
În intoxicația lentă, ca urmare a administrării de doze mici, repetate, s-a observat hiperemie, hemoragii perivasculare ale substanței albe și cenușii, edem, creșterea volumului nucleului hipercromatic al celulelor gliale, fragmentarea tecii de mielină și degenerescență cu gomflare și lichefiere. Se înregistrează, de asemenea, aglutinarea corpusculilor Nissl, deformația sinuoasă a terminațiilor dendritice și neuronofagie.
Tabloul în ansamblu este descris prin edem acut și lichefierea celulelor ganglionare, retracția celulelor izolate, reacții gliale și neuronofagie, demielinizare, edem, hiperemie, hemoragii punctiforme și apoplexie.
Pentru aprecierea tulburărilor fiziologice corespondente Pacheco a întrebuințat metoda măduvei izolate.
Reflexele medulare sunt încetinite, activitatea dehidrogenazică a creierului de șoarece intoxicat fiind diminuată. În stadiul final s-a observat paralizie însoțită de pierderea propagării influxului nervos. Acesta este un fenomen de origine neurotoxică centrală care explică moartea rapidă a animalelor și justifică teoria gangrenei gazoase.
Enterotoxiemia anaerobă a mieilor este o boală toxiinfecțioasă a mieilor în primele zile după fătare, determinată de Clostridium perfringens, biotipul A, B, C și D, caracterizată prin tulburări digestive și, uneori, nervoase, iar anatomopatologic prin enterită hemoragico – necrotică în funcție de vârstă, toxotip, condițiile de alimentație și întreținere.
Boala a fost semnalată pentru prima dată în Anglia, în secolul al XIX- lea, iar mai târziu pe toate continentele. În țara noastră a fost semnalată în mai multe zone geografice (Hanganu, 1949; Stamatin și colab., 1954; Băieș și colab., 1964; Carp și colab., 1966) etc. Din 134 tulpini izolate din focarele cu dizenterie anaerobă, 56% au aparținut tipului B, 43% tipului A, 5% tipului C, 14% tipului D, iar 16% au fost netipabile (Secașiu, 1922).
Enterotoxiemia anaerobă cu tipul A a fost semnalată în 1936 de Rose, în Australia, în 1961 de Prévot, în Franța, iar în 1977 de Secașiu, în România. Boala este însoțită de excitabilitate crescută, icter, hemoglobinurie, edem pulmonar, enterită cataral hemoragică.
Din punct de vedere morfopatologic, boala se caracterizează printr-o stare icterică a cadavrului, ficat mărit, distrofic de culoare galben – verzui, necroze centro – lobulare, dar fără excese de hemosiderină. Macroscopic, splina este normală, dar histopatologic prezintă congestie. Rinichii sunt măriți de culoare brună, iar vezica urinară este dilatată, cu un conținut roșu – negricios. Examenul histopatologic relevă o gravă hialinoză intracelulară a tubilor uriniferi pe fondul unei accentuate infiltrații hemoragice, precum și o gravă encefaloză, mieii prezentând o simptomalogie nervoasă caracteristică (Paul I., 1982).
Enterotoxiemia anaerobă cu biotipul B (dizenteria mieilor) a fost descrisă pentru prima dată în Anglia (1920 – 1923) de Gaiger și Daling. În prezent este cunoscută pe tot globul. După Polâkovski (1952), citat de Volintir în 1975, incidența bolii putând înregistra valori de până la 40 – 50%, deși s-au înregistrat enzotii cu pierderi doar de 5-12 % în efectivele de miei.
Din punct de vedere morfopatologic se constată, în majoritatea cazurilor, o enterită difteroidă destul de caracteristică. Pe toată lungimea intestinului subțire, mai ales pe ileon, din loc în loc pot fi observate focare cenușii – gălbui de aproximativ 1cm diametru, înconjurate de un inel hemoragic și bule de gaze. Prin desprinderea peliculei fibrino – necrotice de la suprafață, rămân ulcerații mai mult sau mai puțin profunde (Paul, 1982). În cazuri rare, Roberts 1959 citat de Paul în 1982, Jubb și Kennedy 1985, menționează și posibilitatea perforării intestinului la nivelul focarelor, cu instalarea unei peritonite fibrinoase localizate. În cavități se constată colecții serofibrinoase sau serohemoragice. Limfonodulii sunt edemațiați și puternic congestionați. Leziunile prezente în celelalte organe sunt cele date de toxiemie severă. Ficatul este friabil, palid sau congestionat. Splina poate fi normală sau puțin mărită, rinichii măriți, edemațiați, palizi și moi datorită degenerării toxice. Sacul pericardic conține un lichid gelatinos, clar, iar miocardul este degenerat, hemoragiile subseroase fiind constante.
Enterotoxiemia cu biotipul C sau enterocolita hemoragică
Enterotoxiemia cu biotipul C sau enterocolita hemoragică este cunoscută pe tot globul. La noi în țară a fost descrisă de Ungureanu și Grecianu (1958), cei mai receptivi fiind mieii de 1- 3 zile (Jensen, 1974 citat de Paul în 1982).
Se caracterizează din punct de vedere morfopatologic printr-o enterită de intensități variabile, de la forma catarală până la forma hemoragică difuză. Examenul necropsic relevă prezența unei cantități considerabile de lapte mai mult sau mai puțin coagulat în lumenul cheagului, congestii și hemoragii ale pliurilor mucoasei acestui organ și o accentuată inflamație hemoragică a intestinului.
Jejunul, ileonul și cecumul apar de culoare roșie – negricioasă (aspect de volvulus), iar la deschidere se poate observa conținutul intestinal cu aspect hemoragic. Leziunile din celelalte organe sunt cele date de enterotoxiemie severă. Histologic se observă necroze intense ale vilozităților intestinale, ca și prezența germenilor, atât în lumenul intestinal, cât mai ales la suprafața mucoasei.
Enterotoxiemia cu biotipul D
Enterotoxiemia cu biotipul D se întâlnește la miei de 2-12 luni, cu o evoluție extrem de rapidă. Infecția, întâlnită în literatură și sub denumirea de „boala rinichiului moale”, este un sindrom determinat de fracțiunea toxică epsilon a biotipului D și care se întâlnește mai frecvent la vârsta de 3-8 săptămâni, cu o rată a mortalității de 100 % și morbiditate 30 %.
Furajarea bogată în hidrocarbonate, cereale, substituenți de lapte, ca și pășunea foarte bogată constituie principalii factori favorizanți.
Morfopatologic, atenția este reținută de instalarea foarte precoce a putrefacției rinichilor. Histopatologic se evidențiază aproape constant leziuni ale sistemului nervos central manifestate prin edem și hemoragii perivasculare, focare de encefalomalacie.
Buxton și colaboratorii, în 1978, examinând histologic sistemul nervos provenit de la 18 miei cu boala rinichiului moale, relevă existența unui edem perivascular la 16 cazuri, la nivelul meningelor la 13 cazuri, hemoragii perivasculare la 17 cazuri și la 12 cazuri focare de encefalomalacie situate în special în corpii striați, creierul median și substanța albă cerebeloasă.
Sursele de infecție sunt reprezentate de solul contaminat cu spori de Clostridium perfringens eliminați odată cu fecalele de animalele purtătoare (miei, oi). Germenii, prezenți sub formă sporulată, se găsesc în mod curent pe glanda mamară murdărită cu fecale, de unde mieii îi pot ingera prin supt (Stamatin 1956, citat de Volintir 1975).
Enterotoxiemia oilor adulte este o boală cu evoluție rapidă și sfârșit letal, care apare datorită multiplicării uneia din variantele toxigene de Clostridium perfringens în tractusul digestiv și intoxicației, consecutiv resorbției toxinei elaborate în urma multiplicării germenului.
Pentru prima dată descris în 1909 de Gilreeth în Australia ca o congestie acută renală (rinichi moale), boala apare la mieii în vârstă de 4 –8 săptămâni, caracterizată clinic prin evoluție rapidă, iar anatomopatologic prin ramolisment renal. Deși cunoscută de mai mult timp, etiologia a fost descoperită în 1930 de Mc. Ewen în Anglia prin izolarea din cazurile bolii denumite „struck” a unui bacil pe care îl denumește Bacterium paludis, întrucât boala apare la oi în regiunile mlăștinoase.
Dintre cele 5 serotipuri de Clostridium perfringens, în producerea enterotoxiemiei oilor intervin tipurile B, C, D și A (tabelul 2.1)
În 1932, Bennets, în Australia, descrie o boală pe care o denumește „enterotoxiemie infecțioasă”, boală întru totul asemănătoare „bolii rinichiului moale” (Pulpi kidney disease), descris în 1909 de Gilbruth tot în Australia și din care izolează o variantă a Welchiei agni, numite de el Bacterium ovitoxicus (Clostridium perfringens tip D).
Tabelul 2.1.
Tipurile de Clostridium perfringens și bolile determinate (după Perianu, 1996)
Table 2.1.
The types of Clostridium perfringens and diseases they cause (după Perianu, 1996)
Același germen este izolat în 1954 de către Gréner și Jonson, iar ulterior de alți cercetători de la mieii cu enterită hemoragică (tabelul 2.2.).
Astfel, Ozsoy și Tekin (1963) semnalează apariția bolii în Turcia, produsă de Clostridium perfringens tip A, C și D. Durand și Foret (1965) semnalează boala în Tunisia, Wananinghe descrie o enterotoxiemie cu tipul D în Ceylon.
În țara noastră, boala (de tipul strukh) a fost semnalată în 1936 de Derlogea, apoi de Buceag și Taga în 1949, iar mai târziu de Ungureanu și colaboratorii în 1965, Popescu în 1965; Roșca în 1966, Sâmpetru în 1968, Darie în 1977 care au semnalat atât enterotoxiemia oilor adulte cu biotipul B cât și a tineretului ovin de peste o lună cu biotipul D.
Ulterior, a fost descrisă și enterotoxiemia produsă de Clostridium perfringens biotipul A, caracterizată prin icter, hemoglobinurie cu evoluție lentă la oile adulte și fulgerătoare la miei (Yalcin, 1970 citat de Volintir, 1975).
Tabelul 2.2.
Toxotipurile de Clostridium perfringens (după Paul I. 1994)
Table 2.2.
Toxotip of Clostridium perfringens (după Paul I. 1994)
Această enterotoxiemie a fost semnalată și la noi de Secașiu și colab., în 1977. Boala evoluează sporadic sau enzootic, producând uneori pierderi foarte mari.
Sursa de infecție o constituie solul, furajele și, probabil, laptele oilor, însă de cele mai multe ori boala apare ca o autoinfecție întrucât bacteria este purtată de animalele sănătoase în intestinul gros. În apariția bolii, pe lângă virulența și toxicitatea germenului, mai intervin și o serie de factori complexi cum ar fi: starea fiziologică a tubului digestiv, alimentația animalelor, factori climatologici (umiditate și frigul), etc.
Enterotoxiemia anaerobă a purceilor, cunoscută și sub denumirea de enterită necrozantă infecțioasă, este o boală toxiinfecțioasă ce afectează purceii în primele zile de viață, caracterizată prin enterită hemoragico – necrotică
Infecțiile cu Clostridium perfringens (Clostridium welchii), numite de Prévot și „welchioze”, au fost mai puțin studiate la porcine comparativ cu ovinele.
De la prima semnalare a enterotoxiemiei purceilor în 1925, de Rohonyi și Detne (citați de Hogh), boala a fost descrisă în 1949 în Irlanda, iar după 1945 în diferite țări din Europa, America de Nord, Africa și Asia, având ca agent etiologic Clostridium perfringens biotipurile A, B și C.
Boala a fost descrisă de Scemikov în 1946 în U.R.S.S., Field și Gibson (1955) în Anglia Szent și Szabo (1956) în Ungaria. La noi în țară boala a fost semnalată pentru prima dată în 1952 de Volintir și Leluțiu la purceii nou – născuți. Autorii au izolat și identificat germenul ca fiind Clostridium perfringens biotipul B. Ulterior enterotoxiemia purceilor a fost semnalată în Transilvania, fiind produsă de biotipul A și C, iar în Banat și Moldova de biotipul C (Secașiu, 1982).
Boala apare la purcei în primele 10 – 12 zile de viață, mai frecventă la cei de 2 – 5 zile și mai rar peste vârsta de 14 zile.
Germenul este prezent în fecalele a numeroase scroafe, în așternutul din adăpost și în sol. Purceii se infectează obișnuit în timpul suptului, de la mamele purtătoare și eliminatoare de bacili, al căror mameloane sunt murdărite cu fecale, praf și pământ, ce conțin, de regulă, spori. În tubul digestiv sporii se transformă în forme vegetative care se multiplică intens și elaborează enterotoxine, care sunt răspunzătoare de leziunea de tip hemoragico – necrotic.
Acestei acțiuni necrozante ale bacteriei Clostridium perfringens, în evoluțiile mai lente, i se adaugă cea produsă de Fusobacterium necrophorum, subspecia necrophorum care intensifică modificările distructive, necroza ajungând până la musculoasă sau uneori până la seroasă (Carp Cărare, 1987).
Prin infecții experimentale, Köhler și colab. (1979), evidențiază faptul că infecția intestinală se desfășoară în două faze. În prima fază germenii aderă la epiteliul vilozităților intestinale și pătrund în straturile superficiale ale mucoasei, iar în a doua fază are loc distrugerea mucoasei sub acțiunea toxinelor letale, hemolitice și necrozante elaborate de germeni.
Boala evoluează cu caracter sporadic sau enzotic, cu caracter limitat în unitățile în care se înregistrează deficiențe alimentare și de zooigienă.
La porcinele adulte a fost descrisă o enterotoxiemie anaerobă în etiologia căreia este incriminat Clostridium perfringens tip C, cu un tablou anatomopatologic asemănător celui de la oile adulte. Din această formă de boală se izolează frecvent și un colibacil beta – hemolitic responsabil de leziunile de tip infiltrativ (edeme) cu localizări similare cu cele din boala edemelor.
Este o boală acută, obișnuit letală, care apare consecutiv lezării mucoasei stomacale sau unor plăgi externe care interesează musculatura.
Din etiologia bolii face parte și Clostridium perfringens în asociere cu Clostridium septicum și Clostridium chauvoei (Bercea și colab., 1981).
Infecția apare la animalele care au suferit traumatisme: porcine, ovine, cabaline, vulpi argintii și mai rar la nurci, zebeline și nutrii.
Perioada de incubație este scurtă, evoluția bolii putând varia de la 12 ore până la 5 zile. Animalele prezintă hipertermie, stare de depresie și inapetență. La locul traumei apare un edem local care apoi se extinde și poate cuprinde porțiuni mai mari sau chiar regiuni întregi. Edemul la început este cald, dureros, și crepitant, apoi devine rece și insensibil, iar culoarea pielii devine roșie – violacee.
Enterotoxiemia vițeilor denumită și „enterotoxiemia hemoragică” sau „dizenteria vițeilor” este o clostridioză gravă, caracterizată prin enterită hemoragică cu evoluție acută, urmată în majoritatea cazurilor prin moarte.
Este determinată de biotipurile A, B, C, D, E. Boala a fost semnalată pentru prima dată de Griner și Brocken în 1953, fiind produsă de Clostridium perfringens tip C. Shofeld (1955) izolează de la un caz tipul A, Frank (1956) tipul B și C, iar Lenikov șu colab în 1956 descriu mai multe enzotii atipice cu Clostridium perfringens, considerându-le variante ale tipului A.
Nülo și colab., în 1975, semnalează pentru prima dată în Canada enterotoxiemia neonatală hemoragică a vițeilor. Din conținutul intestinal s-a izolat Clostridium perfringens tip C, la care s-a mai pus în evidență și hemolizina produsă.
Seifert în 1975, făcând un studiu etiologic asupra anaerobiozelor la bovine și ovine în Peru, împarte infecțiile clostridiene în trei grupe: edemul gazotipic, complexul enterotoxiemic și complexul toxiemic. De la animale cu simptome de enterotoxiemie a fost izolat Clostridium perfringens tipul A.
La noi în țară boala a fost semnalată pentru prima dată de Volintir și colab., în 1968, în județul Timiș, la viței de 1 – 12 zile. Tulpina izolată nu a putut fi încadrată prin seroprecipitare cu ser B, C, D, ceea ce înseamnă că a fost tipul A sau E.
Enterotoxiemia vițeilor este considerată mai mult o tehnopatie de nutriție, fiind favorizată de consumul unor cantități mari de lapte praf, prost omogenizat, alimente reci, lipsă de apă, hiperazotemie, etc. (Renault și colab., 1977, citat de Paul, 1982).
Deoarece Clostridium perfringens trăiește ca epifit în intestinul gros al vițeilor, factorii sus amintiți crează o serie de condiții care favorizează multiplicarea acestuia și producerea unei cantități mari de toxine, care depășesc limitele suportate de organism.
Boala afectează vițeii bine dezvoltați, viguroși și lacomi, cu vârstă ce poate varia de la câteva zile, până la 12 – 18 luni. Infecția are caracter sporadic cu mortalitate cuprinsă între 3 și 23%.
Enterotoxiemiile anaerobe ale iepurilor de casă sunt produse de Clostridium perfringens toxotipurile A și E (Kunstyr, 1975, citat de Paul, 1982), caracterizate clinic prin tulburări generale grave, diaree, acumulare de gaze în stomac și intestin urmate de moarte rapidă. Lesbouyres și Berthe – Lon 1936, citați de Vlaicu în 1984, consideră că agentul etiologic este Clostridium perfringens, a cărei acțiune este favorizată de dispepsia gastrointestinală provocată de alimentația cu cartofi sau sfeclă, asociată cu lipsa de adăpare, leziuni renale provocate de boli cronice (sechele de coccidioză prin tratamente repetate cu sulfamide) sau supraalimentația cu fân de leguminoase.
Clostridium perfringens intervine când factorii menționați au declanșat enterita de nutriție manifestată prin stază intestinală și alcaloză digestivă. Din acest moment se declanșează acțiunea enterotoxică prin hiperazotemie (exces de uree în sânge), insuficiență renală și moartea animalului.
Boala este mai frecventă la femelele gestante sau în lactație și la iepurași cu vârsta de până la 3 luni.
2.1.3. Alimentele – sursă de infecție pentru om
2.1.3.1. Alimente implicate în producerea toxiinfecțiilor alimentare
Prezența lui Clostridium perfringens la suprafața și în profunzimea maselor musculare este, de asemenea, aproape o regulă, ceea ce explică faptul că, în multe țări, cele mai multe toxiinfecții alimentare prin consumul de carne sunt provocate de această bacterie.
Clostridiile ajung pe sau în carne, de pe suprafața animalelor (blană, piele, murdăria de pe ongloane), din fecale și din mediul înconjurător neigienizat corespunzător, în care se taie animalele, se depozitează și se manipulează carnea. Când carnea, după tăiere, se păstrează la temperaturi mai mari de 200C, clostridiile se multiplică în scurt timp și provoacă putrefacția profundă a cărnii, făcând-o insalubră.
În cazul animalelor sacrificate în stare de oboseală pronunțată sau stresate, a cărnii provenite de la animale eviscerate târziu după sângerare, clostridiile împreună cu alte bacterii prezente în conținutul tubului digestiv, pot pătrunde în organe și masele musculare profunde. În mod frecvent Clostridium perfringens se găsește în țesutul muscular imediat după tăiere în proporție de 1 celulă la 100 g, iar la animalele sacrificate în stare de oboseală 1 celulă sau mai multe la 10 g. În ficat numărul de celule de Clostridium perfringens este mai mare. O parte din celulele de Clostridium perfringens ce contaminează carnea se află în stare vegetativă, fapt de care trebuie să se țină seama când alegem metoda prin care urmărim punerea în evidență a acestei bacterii din carne. Deci, pentru stabilirea numărului real de celule, va trebui să nu se aplice metoda distrugerii formelor vegetative (încălzirea inoculului 10-15 minute la 75-800). Smart și colab., în 1979, folosind metoda de îmbogățire a inoculului recoltat de pe suprafața carcaselor, au găsit următoarele procente de contaminare: la bovine 29, la miei 85, iar la porci 69. Jumătate din numărul celulelor contaminante se prezintă sub formă vegetativă.
La carnea transportată, manipulată și ajunsă în rețeaua de desfacere, numărul de celule de Clostridium perfringens este mai mare, ca urmare a contaminării ulterioare. Semnele putrefacției profunde apar când densitatea Clostridium perfringens atinge valori de 107/g. Ținând seama de faptul că densitatea inițială a bacteriilor în masele musculare este de aproximativ 10-2/g, înseamnă că, pentru a ajunge la 107, este nevoie de un factor de multiplicare egal cu 109 sau, altfel spus, de 30 diviziuni succesive: 230 = 109. Pentru multiplicare Clostridium perfringens are nevoie de temperatură 200 C (se multiplică foarte repede la 40-500 C, fiind un germene mezofil), de condiții de anaerobioză (Eh sub – 50 mV) și un pH în jur de 7. Cu cât aceste condiții principale vor fi mai apropiate de optimum, cu atât viteza lui de multiplicare în carne va fi mai mare și putrefacția profundă va apărea în timp mai scurt.
Rosset prezintă posibilitățile de multiplicare a Clostridium perfringens în carne, din momentul sacrificării animalului, până la apariția putrefacției profunde, insistând asupra rolului refrigerării asupra prevenirii acestui tip de alterare (tabelul 2.3.)
La temperatura inițială a carcaselor (390C) Clostridium perfringens se divide de 4,5 ori pe oră, în timp ce la 200C multiplicarea sa este foarte încetinită, motiv pentru care carcasele, după obținere, trebuie semirăcite (răcite până când centrul maselor musculare ajunge la 200C) într-un timp scurt.
Tabelul 2.3.
Viteza de diviziune a Clostridium perfringens în funcție de temperatură la pH și
Eh convenabil (-50 mV) (după Rosset 1974)
Table 2.3.
Clostridium perfringens division rate according to the temperature and a convenient pH and
Eh (-50 mV) (după Rosset 1974)
În refrigerarea lentă demararea multiplicării este posibilă, de asemenea, după a 9-a oră de răcire, când carnea atinge în straturile profunde temperatura de 340C. În următoarele 26 de ore, până ce carnea atinge temperatura de 200C, pot avea loc 28 de diviziuni, ceea ce corespunde unui număr de germeni apropiat celui care produce putrefacția profundă.
În refrigerarea rapidă, demararea multiplicării este posibilă, după a 9-a oră de răcire, când carnea atinge în straturile profunde temperatura de 27-280C. În următoarele 6 – 7 de ore, necesare atingerii temperaturii de 200C, pot avea loc cinci diviziuni. Numărul germenilor va fi foarte mic (25 = 32/g), fără semnificație pentru caracterele cărnii. Deci, refrigerarea rapidă previne apariția putrefacției profunde.
Formele de Clostridium perfringens mor după o depozitare prelungită la refrigerare și nu se multiplică la temperaturi mai mici de 120C. Practic la temperaturi mai mici de 200C (temperatura de semirăcire a carcaselor), înmulțirea acestei bacterii este nesemnificativă motiv pentru care straturile profunde ale cărnii obținută în abatoare trebuie aduse cât mai repede la temperaturi mai mici de 200C.
Temperatura de congelare distruge rapid formele vegetative de Clostridium perfringens. Cu toată această distrugere, carnea congelată și decongelată conține un număr destul de mare de microorganisme, ceea ce poate determina alterarea ei rapidă. Aceasta depinde de condițiile ei de decongelare dintre care temperatura și timpul joacă un rol important.
Metodele rapide de decongelare sunt improprii ele favorizând multiplicarea florei de alterare și mai ales a germenilor patogeni, mărind enorm riscul pentru sănătatea publică. Decongelarea trebuie să se facă, fie la temperaturi mai mici de 100C, fie în aer. James și colab. au determinat numărul de bacterii pe gram carne recoltată de la suprafața sferturilor posterioare de bovine supuse decongelării în aer la temperaturi diferite (50C, 100C, 200C, 300C) și au observat creșterea numărului de bacterii pe carnea decongelată față de numărul stabilit pe carnea congelată, este cu atât mai mare, deși timpul necesar decongelării este mai mic. Astfel la temperatura de 50C, decongelarea are loc în 105 ore, timp în care numărul bacteriilor aerobe crește cu 0,12 log, iar al celor psihotrofe cu 0,63 – 1,03 log. La temperaturi de 300C decongelarea are loc în numai 25 ore, dar numărul de bacterii mezofile crește cu 2 log, iar al celor psihotrofe cu cca. 3 log, atingând valori apropiate celor la care încep să apară semnele organoleptice de alterare. Germenii patogeni din carnea congelată sunt aceeași cu cei existenți pe carne înainte de congelare. În timpul congelării, nu se produce distrugerea acestora, ci doar o reducere numerică. Atunci când decongelarea are loc la temperaturi prea ridicate (25-300 C) alterarea cărnii constă în putrefacția profundă produsă de clostridii, cu riscuri mari și pentru salubritate.
Majoritatea alimentelor conțin numeroși oxido-reducători, cum sunt aminoacizii și peptidele care conțin gruparea tiolică (-HS), zaharuri reducătoare și acid ascorbic.
Relația dintre presiunea parțială a oxigenului și potențialul redox (Eh) din aliment nu este stabilă. Pe măsură ce timpul de depozitare se prelungește, presiunea parțială a oxigenului scade. Exemplul concludent este carnea în primele ore de la tăierea animalului. Oxigenul din interiorul maselor musculare scade treptat, datorită încetării aportului prin respirație (circulație), pe de altă parte datorită fixării lui în alți compuși. Pe măsură ce cantitatea de oxigen scade, potențialul redox crește, creându-se condiții pentru dezvoltarea anaerobilor. Aceasta explică faptul că multiplicarea speciei Clostridium perfringens, agentul putrefacției profunde a cărnii, este posibilă numai după 10-12 ore după tăiere, când are loc depleția oxigenului tisular și se creează condiții de anaerobioză.
Înmulțirea microorganismelor în alimente în cele mai multe cazuri, este un rezultat al influențelor combinate ale mai multor factori intrinseci de prelucrare și extrinseci. Când doi sau mai mulți dintre acești factori sunt optimi pentru înmulțirea unei specii, aceasta poate avea loc în condiții bune, chiar dacă alți factori se află în limite extreme de toleranță.
Apariția rară a toxiinfecțiilor alimentare produse de Clostridium perfringens prin comparație cu frecvența lor mare din alimente, ar putea fi explicată prin inhibarea lor de către flora saprofită, în special Pseudomonas spp. și streptococii din grupa D. Dezvoltarea saprofiților în alimente produce modificări organoleptice și deci respingerea lor de la consum. Prin mijloacele tehnice de care dispune industria, se obțin, de obicei, alimente lipsite de organisme saprofite și în general cu un conținut total de microorganisme redus. Așa este cazul alimentelor tratate termic. În asemenea alimente deseori supraviețuiesc specii de Clostridium, care puse în condiții favorabile, în special de temperatură, se vor dezvolta în scurt timp, microflora concurentă fiind absentă.
Lipsa din alimente a bacteriile saprofite, care pot fi considerate ,,avertizori”, poate duce la aprecieri greșite privind riscul acestor alimente pentru sănătatea consumatorilor.
În carnea tocată încărcătura inițială depinde de încărcătura cărnii din care a fost preparată și de condițiile în care se realizează. Dezosarea mecanică a cărnii ce urmează a fi tocată contribuie la obținerea unei cărni cu o încărcătură mai mică decât una provenită din carnea dezosată manual. Carnea tocată obținută în condiții igienice dintr-o carcasă cu contaminare redusă, conține de regulă, cca. 104 bacterii / g, de 10-100 ori mai mult decât carnea în carcasă. Carnea tocată din comerț are obișnuit o încărcătură mai mare, de 106 bacterii / g. Ținând seama că, la o încărcătură de 108 bacterii / g apar semnele organoleptice de alterare, înseamnă că o carne tocată trebuie prelucrată sau gătită în timpul cel mai scurt de la preparare sau păstrată în condiții de temperatură care să oprească multiplicarea microbiană: 0-40C pentru maxim 24 ore sau –18 ÷ – 200C pentru perioadele mai lungi de timp (2 – 3 luni). În afară de Staphylococcus aureus, prezent în mod obișnuit în carnea tocată și de salmonelele prezente frecvent, carnea tocată conține deseori și Clostridium perfringens, uneori în procente mai mari de 50 %.
Contaminarea cărnii și a produselor din carne deshidratată poate proveni din materia primă, deci de la animalul de la care provine carnea, când este vorba de produsele uscate prin metode tradiționale, care nu suferă tratamente termice înainte de uscare. Produsele realizate prin tehnologii moderne se pot contamina secundar, în cursul prelucrării, depozitării, manipulării necorespunzătoare. Clostridium perfringens este bacteria care se poate găsi în aceste produse.
Multiplicarea bacteriilor patogene nu are loc în produsele uscate, de aceea ele sunt admise în număr mic. Pericolul constă în multiplicarea lor în timpul reconstituirii produselor, mai ales când pentru aceasta se folosește apă caldă. Pentru a se evita multiplicarea speciei Clostridium perfringens, perioada de preînmuiere (reconstituire) nu trebuie să depășească 4 ore.
Clostridium perfringens nu găsește condiții de multiplicare în carnea refrigerată și nici în multe din produsele din carne, deși este prezentă frecvent. Ea se cercetează atât în carne cât și la preparate, fiind unul dintre agenții frecvenți ai toxiinfecțiilor alimentare.
La preparatele din carne fierte se vor căuta întotdeauna germenii patogeni ca Salmonela, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Escherichia coli enteropatogenă, Listeria monocytogenes și bacili coliformi, ca indicator igienic. Bacteria Clostridium perfringens este frecventă în aceste produse tratate termic la un nivel de pasteurizare. Ea poate fi introdusă în produs odată cu ingredientele adăugate. Important pentru destinația produsului, rămâne numărul în care se găsește această bacterie.
Prospăturile (parizer, crenwurști, lebăr) și produsele cu mult aspic (toba), care au un conținut de apă mai mare de 65%, au o durată de conservare de 48 – 72 ore, cu condiția păstrării lor neîntrerupte la temperatura frigiderului. Astfel, sporii de Clostridium spp., mezofili, pot germina și se multiplică, producând alterarea, care are, de regulă, caracter proteolitic. De cele mai multe ori dezvoltarea clostridiilor este însoțită de balonarea accentuată a batoanelor și de miros specific descompunerii proteice. Alteori, aceste produse ținute mai mult timp, chiar la temperatura frigiderului, se alterează datorită înmulțirii unor tulpini psihrotrofe de micrococi, streptococi și lactobacili. Alterarea, în acest caz are caracter fermentativ și este, de regulă, însoțită de modificări de culoare a compoziției batoanelor: cenușie, cenușie – verzuie.
Clostridium perfringens se găsește obișnuit în fecale, sol, apă și se introduce în abatoare o dată cu pasărea vie. Tehnicile moderne de tăiere nu previn contaminarea cu această bacterie a cărnii, chiar când se respectă condițiile de igienă. Clostridium perfringens nu se multiplică în carne decât dacă temperatura de depozitare este total inadecvată (peste 200C) și devine un risc pentru sănătatea consumatorilor numai dacă, după gătire, carnea este păstrată mai mult timp (peste 6 – 10 ore) la temperaturi mai mari de 200C.
Dintre speciile de clostridii întâlnite în semiconservele de carne în cutii, semnificația cea mai mare pentru alterarea lor o prezintă Clostridium sporogenes și Clostridium perfringens. Ele produc bombajul biologic al cutiilor și alterarea putrifică a conținutului, când produsul nu este depozitat la temperatură de refrigerare. În practica curentă, clostridiile, deși prezente, nu alterează semiconservele de carne în cutii decât foarte rar. Aceasta se datorează în primul rând păstrării lor la temperaturi joase și substanțelor cu rol stabilizator adăugate la produs: clorura de sodiu, nitrit, polifosfat. În același timp, prezența unor streptococi din grupa D, în special, Streptococcus faecium, Streptococcus faecalis, inhibă dezvoltarea clostridiilor. Deci, enterococii, oaspeți nedoriți ai produselor alimentare, sunt utili în acest caz.
Clostridium perfringens poate fi prezent pe carnea animalelor acvatice, fiind considerat contaminant străin, nespecific acestei cărni, provenind de pe obiecte, suprafețe cu care vine în contact, mâinile manipulatorilor sau din apele contaminate în care asemenea animale trăiesc. Incidența este mai mare la moluște.
Clostridium perfringens, pentru a produce toxiinfecții alimentare la om trebuie să fie în număr foarte mare ( 106 / g), număr însoțit de modificări organoleptice pronunțate, putrefactive și fermentative ale conținutului și de bombajul cutiei, așa încât, asemenea conserve nu se consumă. Aceasta explică raritatea toxiinfecțiilor alimentare produse prin consumul de conserve, deși, în număr mic, sporii de Clostridium perfringens sunt prezenți în materia primă din care se fac conservele. Ei sunt mai puțin rezistenți la căldură, motiv pentru care Clostridium perfringens este implicat mai rar în alterarea conservelor. Prin apa de răcire Clostridium perfringens poate pătrunde în interiorul conservelor.
Clostridium perfringens este unul dintre microorganismele patogene care se cercetează în cazul de suspiciuni în carnea de pește, crustacee și moluște. De regulă, nu se admit în consum cărnurile contaminate cu microorganisme patogene, mai ales dacă ele se consumă ca atare. Cele contaminate slab, fără toxine și fără modificări organoleptice, pot fi admise pentru prelucrarea industrială imediat, în produse care se supun sterilizării sub control sanitar veterinar.
Condimentele sunt plante sau părți din plante aromatice sau picante care se folosesc pentru aromarea alimentelor sau pentru a le oferi un gust plăcut. Se folosesc de obicei în amestec cu alte ingrediente cum sunt zahărul și sarea, care, deși nu sunt condimente adevărate, pot determina ameliorarea aromei sau savorii sau măresc durata de conservare a alimentelor la care se adaugă.
Condimentele pot conține uneori agenți ai toxiinfecțiilor alimentare, în special Clostridium perfringens și B. cereus. Aceștia se află în condimente în număr relativ mic, sub formă de spori și pentru a produce toxiinfecții alimentare, trebuie să se multiplice în alimentul în care s-a adăugat până la nivelul de 105 – 106 /g.
Clostridium perfringens poate contamina mai des piperul negru, chimenul, coriandrul, frunzele de dafin și nucșoară și, rar, scorțișoara și usturoiul. Numărul de spori ai acestei bacterii în condimente nu depășește în general 500-1000 / g. Ținând cont că proporția de condimente ce se adaugă diferitelor alimente nu depășește 1%, înseamnă că bacteria prezentă în condimente în mod obișnuit și, ajunsă în alimente, nu atinge praguri periculoase pentru om.
Alimentele al căror consum stă la originea acestor toxiinfecții alimentare produse de Clostridium perfringens sunt reprezentate de carne și produsele din carne, mâncărurile pe bază de carne, care, după prelucrare sau gătire, nu se consumă, sau nu se răcesc imediat la temperaturi mai mici de 100C și sunt ținute la temperatură ambiantă până la servire mai mult de 8 – 10 ore sau chiar până a doua zi. Menținerea în stare caldă a mâncărurilor trebuie să se facă la temperaturi de 600C sau mai mult, până la servire, deoarece la temperaturi de 40 – 500C sporii prezenți în asemenea produse germinează și se multiplică cu o rată foarte mare (1, 19, 17, 40).
Clostridium perfringens este prezent pe toate plantele contaminate prin sol, în timpul recoltării, în laptele proaspăt, în carnea proaspătă și chiar în unele produse care au fost prelucrate, cum sunt laptele condensat, diverse brânzeturi, conserve și semiconserve. Incidența Clostridium perfringens este mare (aproximativ 50%) în carnea animalelor de măcelărie și în cea a păsărilor, deoarece sunt aproape în totalitate purtătoare intestinale.
În perioada stresului de abator sau când timpul între tăiere și eviscerare se prelungește, o parte din bacteriile intestinale, printre care și Clostridium perfringens, evadează din intestin și, prin circulația limfatică și sanguină, ajung în tot organismul inclusiv în straturile musculare profunde, unde după un timp de 7 – 9 ore de la tăiere, chiar bacteriile anaerobe vor găsi condiții de multiplicare. Clostridium perfringens poate ajunge în carnea animalelor și prin cuțitul de înjunghiere, nespălat, nesterilizat și contaminat cu bacterii de la suprafața pielii.
Datorită termorezistenței sporii ajung vii în unele produse prelucrate, cum sunt mezelurile (25-42 %) ceea ce duce deseori la producerea de toxiinfecții alimentare.
2.1.4. Alte surse de infecție
Clostridium perfringens este un agent foarte frecvent ale unor infecții manifestate din punct de vedere clinic foarte variat, în funcție de poarta de intrare a acestuia în organism, atât la om cât și la animale. Se pot distinge:
miozite ce îmbracă aspectul unui flegmon gazos, acompaniat frecvent de icter, datorită lizei hematiilor și transformării hemoglobinei eliberate în derivați bruni;
viscerite, veritabile infecții, toxiinfecții alimentare, cu aspect enterotoxiemic acompaniate de semne mai mult sau mai puțin marcate de hepatonefrită;
septicemii primare și secundare având un punct de plecare cel mai adesea natura traumatică și în particular postabortigen.
Miozitele umane sunt complicații infecțioase, cel mai frecvent ale plăgilor: răni de război, răni datorate accidentelor de muncă, rutiere, etc.
În plagă pot pătrunde resturi vestimentare sau pământ în care sporii de Welchia perfringens, acompaniați de alte bacterii aerobe sau anaerobe, se dezvoltă foarte rapid în serozitățile și anfractuozitățile acesteia. Se produc numeroase toxine și enzime patogene care afectează profund starea generală și sistemul nervos central.
Flegmonul gazos se constituie în câteva ore în mușchii afectați, cu prezența locală de edem, necroză, hemoliză intensă, lipidoliză, serozitate hemoragică și acumulare de gaze. Semnele generale sunt foarte intense înregistrându-se febră, paralizie și moartea bolnavului în una sau mai multe zile prin asfixie (lipsa de globule roșii intacte) și prin intoxicație generală.
Miozitele medicamentoase produse de numeroase medicamente ischemiante injectate subcutan sau intramuscular pot fixa celulele de Welchia perfringens la locul infecției, în mod particular în momentul bacteriemiei fiziologice din timpul digestiei. Acestea se pot dezvolta local și pot provoca flegmon gazos mortal.
Borghini, în 1932, a studiat bine aceste gangrene survenite după injecterea hipodermică: 8 cazuri după administrare de cafeină, 4 cazuri după administrarea adrenalinei, dar semnalează și cazuri după administrarea sparteinei, novocainei, scopolaminei, uleiului camforat, tincturii de mosc, asmolizinei, morfinei, arsenicului. El a observat un caz mortal în 39 de ore după administrarea adrenalinei, explicându-l prin mecanismul de splenocontracție.
Cazzanica semnalează prezența gangrenelor după injectarea adrenalinei și acțiunea favorabilă a serumului antiperfringens. Leonardi în 1934 a studiat mecanismul pe cobai: după injectarea subcutană de adrenalină se înregistrează vasoconstricție locală și diminuarea puterii fagocitare a leucocitelor.
Kissler, în 1958, a raportat și un caz de gangrenă gazoasă edematoasă după injectarea intravenoasă a unor medicamente.
Visceritele, altele decât toxiinfecțiile alimentare
Printre bacteriile anaerobe din supurațiile bronhopulmonare și pleurale, Gernez – Rieux și Beerenț, în 1948, au semnalat și Welchia perfringens. Numeroși autori au găsit Welchia perfringens în abcese pulmonare, gangrene pulmonare, pleurezii purulente, otite, mastoidite, meningite.
Hutchinson, în 1946, a observat un caz de colecistită gangrenoasă după litiază biliară la un om de 56 ani. Bacteria izolată a fost Welchia perfringens, dar ablația chirurgicală, seroterapia și chimioterapia au fost urmate de vindecare totală.
Mc. Donald, în 1964, a observat o peritonită determinată de Welchia perfringens la un om supus unei gastrectomii parțiale și care a fost sterilizată prin penicilină și ser specific.
Numeroși autori au recunoscut importanța rolului Welchia perfringens în apendicita acută. În 1928, Weinberg, Prévot și colab. au publicat un studiu efectuat pe un număr de peste 200 cazuri în care această bacterie anaerobă a fost găsită în 33 % din cazuri. Tulpinile erau foarte patogene pentru cobai și au fost responsabile la om de caracterul acut sau subacut al apendicitei aproape totdeauna acompaniată de perforație și peritonită gazoasă, ansamblul comportând o mortalitate crescută când apendicitoectomia nu a fost practicată la timp.
Meningitele
Colwell și Sullivan, Schuman și Cohen în 1960 au observat un băiat care, 18 ore după un traumatism cranian prezenta un sindrom meningial. Cultura din lichidul cefalorahidian în anaerobioză a evidențiat o tulpină pură de Welchia perfringens. Yarkowski și Wolf în 1962 a u observat două cazuri de infecție gravă cu această bacterie, reprezentată de o enterită necrotică survenită în perioada terminală a unei leucemii limfatice și în care diagnosticul a fost pus prin hemocultură, alt caz fiind o septicemie consecutivă unei colecistite cu obstrucție biliară.
Ehring și Jutte în 1963 au observat o oftalmie purulentă după plaga perforantă a ochiului stâng, prin fragment metalic și care a necesitat enucleerea. S-a izolat Welchia perfringens în cultură pură, patogen pentru cobai și prin injecții subcutanate și intraoculare. Boala s-a vindecat după antibioterapie.
Septicemiile postabortigene
Avortul provocat antrenează un număr considerabil de septicemii mortale, aproape toate determinate de Welchia perfringens.
Numeroși autori au depus eforturi de a găsi mecanismul acestor complicații, aproape întotdeauna mortale, și tratamentul lor. Terapeutica modernă a schimbat prognosticul fatal al acestei infecții, iar cazurile de vindecare sunt din ce în ce mai numeroase.
Harvier, Merklen și Antonelli în 1934 au observat o septicemie postabortum determinată de Welchia perfringens și care, deși ameliorată prin seroterapie specifică, a evoluat către uremie ce a condus la moarte în a 11-a zi. La autopsie, ei au constatat obstrucția mecanică a tubulilor prin reziduri de hemoliză și leziuni accentuate de nefrită tubulo-interstițială.
Baker a publicat în 1939 cazul unui secundipare de 24 ani, care după o sarcină gemelară anormal întreruptă în luna a șasea, prezenta o septicemie determinată de Welchia perfringens cu peritonită gazoasă. S-a aplicat tratamentul cu seroterapia specifică intravenoasă (20 000 U.I.) de ser antiperfringens purificat, diluat și cu sulfamidoterapie (693 M.B.). După laparatomie evacuatoare, febra a scăzut și boala s-a vindecat.
În 20 de cazuri de infecții grave cu Welchia perfringens după avort, frotiurile din secreția colului uterin au evidențiat numeroși bacili, imobili, incapsulați, Gram pozitivi și leucocite alterate. Se poate face, prin urmare, un diagnostic rapid al acestor infecții printr-un simplu frotiu colorat Gram (Butler, 1942).
Septicemiile nepuerperale cu Welchia perfringens nu sunt întotdeauna de origine puerperală. Astfel Levi – Valensi și Molina în 1953 au observat un caz de boală care, după o angină acută prezintă o septicemie urmată de infarct pulmonar. Reacția Nagler a fost pozitivă cu serul bolnavului, iar hemocultura anaerobă a permis izolarea unei tulpini de Welchia perfringens.
Elliot, Smith și Ellis în 1957 au observat la 24 ore după o operație normală de colecistectomie la un om tânăr, apariția unei septicemii cu Welchia perfringens. Seroterapia specifică și antibioterapia instituită precoce au jugulat rapid infecția.
Mac Koy, Caldwell, Hindawi în 1963 au observat o septicemie fulminantă cu Welchia perfringens după o explorație chirurgicală a unei anastomoze biliare după stenoză. Ficatul a fost masiv infectat iar pulmonul a fost sediul unei embolii gazoase
CAPITOLUL III
IMPLICAȚIILE SPECIEI CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ÎN TOXIINFECȚIILE ALIMENTARE
CHAPTER III
IMPLICATIONS OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS IN FOOD TOXIINFECTIONS
3.1. Toxiinfecțiile alimentare
Toxiinfecțiile alimentare produse de Clostridium perfringens sunt afecțiuni de tip toxic la originea cărora stă ingerarea alimentelor contaminate cu această bacterie și care, din punct de vedere anatomoclinic, în funcție de biotipul agentului cauzal, se manifestă prin enterite ușoare, medii sau ca enterite necrozante grave.
Welch și Nuthal în 1892 izolează pentru prima dată Clostridium perfringens din organele unui cadavru de om. Un an mai târziu această bacterie a fost pusă în evidență de Fraenkel într-o leziune de gangrenă umană. Abia în 1949, Zeissler și Raszfeld – Sternberg și separat Oakley au izolat și identificat Clostridium perfringens tipul F, actual C, agentul cauzal al enteritei necrozante la om.
Zeuner în 1939 a studiat un episod la 60 persoane, după ingestia de cârnați și care prezentau tulburări intestinale. A fost izolată o tulpină de Welchia perfringens patogenă pentru animale de laborator, dar netoxică în cultură.
Steiner și Tracy au descoperit la autopsia unui băiat de 13 ani, prezența unei enterite acute, a unei necroze pancreatice și a unei peritonite, determinate de Welchia perfringens. Tot în 1939, Tabakov a descris alte îmbolnăviri apărute după consumul de cârnați cu semne incipiente de alterare (Nestorescu 1959). În Anglia primul episod a fost descris în 1943 de Knox și Mac Donald iar în S.U.A. în 1945 de Mc. Chung. Acesta a descris o toxiinfecție alimentară produsă prin consumul unor pui fierți, preparați cu o zi înainte.
Lievre în 1946 a semnalat un caz de toxiinfecție alimentară determinată de Welchia perfringens la o fetiță, după ingestia unei conserve de pește infectată. Infecția a determinat o fază septicemică gravă și a impus asocierea seroterapiei cu antibioterapia cu penicilină, sulfadiazină pentru vindecarea definitivă după numeroase recăderi foarte grave.
Defilippo în 1948 a observat un caz mortal de enterocolită gazoasă complicată cu septicemie și determinată de două bacterii anaerobe: Welchia perfringens și Clostridium oedematiens. Caracteristica tulpinilor de Welchia perfringens izolate este termorezistența crescută și apartenența acestora la biotipul A. Semnele clinice sunt reprezentate de colică și diaree, după o perioadă de incubație de 8-20 ore. Reproducerea bolii a fost făcută pe voluntari prin ingerarea de culturi cu tulpinile izolate din alimentele incriminate.
În Germania, în 1949 Hain a comunicat îmbolnăviri cu caracter de toxiinfecții alimentare la trei persoane. Toți bolnavii au decedat prezentând enterită necrozantă, iar produsul care a stat la originea îmbolnăvirii era o conservă de carne de iepure, preparată în casă. Din conservă și din fecalele bolnavilor s-a izolat Clostridium perfringens tip C. În același an, cazuri asemănătoare au raportat Zeissler și Raszfeld-Sternberg.
După cel de-al doilea război mondial, în Germania, au apărut mai multe sute de cazuri grave de enterită necrotică după consumul conservelor de carne în cutii. Agentul etiologic era Clostridium perfringens tip C, iar boala denumită ,,Darmbrand” era foarte gravă.
În 1956 Lizenmeir a descris in episod cu 300 cazuri produse în urma consumului cărnii de porc gătită cu 1-2 zile înainte. Din carnea crudă și din fecalele bolnavilor s-a izolat Clostridium perfringens tip A.
După 1960 numărul de toxiinfecții cu Clostridium perfringens a crescut datorită cunoașterii exactă a bolii.
Clostridium perfringens tip A este responsabil de gangrena gazoasă la om, putrefacția profundă a cărnii și toxiinfecției alimentare. Tipul C produce enterita necrotică la om iar tipul D este implicat în producerea de toxiinfecții alimentare la om.
Secașiu (1982) subliniază rolul solului în contaminarea plantelor, a acestora în contaminarea directă a animalelor și indirectă a oamenilor.
Prezența bacteriei Clostridium perfringens este posibilă în toate alimentele crude și în multe din cele gătite. Se poate spune că această bacterie este prezentă pe toate plantele contaminate prin sol, în laptele proaspăt, carnea proaspătă și în chiar unele produse care au fost prelucrate cum sunt: laptele condensat, diverse brânzeturi, semiconserve și unele conserve. Dintre toate carnea este cel mai des implicată în producerea toxiinfecțiilor alimentare. Incidența este mare (aproximativ 50 %) a speciei Clostridium perfringens în carnea animalelor de măcelărie și în aceea a păsărilor. Aceste animale sunt aproape în totalitate purtătoare intestinale.
Datorită termorezistenței sporii ajung vii în unele produse prelucrate cum sunt mezelurile (25-42 %). Aceasta explică de ce consumul de carne și preparate din carne stă deseori la originea toxiinfecției alimentare produsă de această bacterie. Deși bacteria este frecventă în laptele crud, brânzeturile nu reprezintă o sursă de îmbolnăvire pentru om, în ele neexistând condiții favorabile dezvoltării speciei Clostridium perfringens.
Clostridium perfringens se găsește frecvent în intestinul omului și animalelor, unii cercetători considerând-o ca o bacterie care face parte din microflora intestinală normală.
Pentru producerea toxiifecției alimentare, elementul essențial de patogenitate îl constituie enterotoxina elaborată în intestinul subțire al omului, la scurt timp de la ingerarea alimentelor cu număr foarte mare de celule vegetative.
Până nu demult, elaborarea toxinei Clostridium perfringens era strict legată de procesul sporulării, dar, în ultimul timp, s-au adus dovezi certe că aceasta este elaborată și în absența sporulării, fiind un produs al citoplasmei celulelor vegetative și nu al învelișului sporal (Mânzat M., 2001). Faptul că la majoritatea tulpinilor studiate producerea enterotoxinei are loc în pralel cu sporularea, s-ar datora unor factori comuni care stimulează în același timp gena care determină producerea enterotoxinei și gena responsabilă de sporulare.
Patogenitatea enterotoxinei are la bază principalele activități biologice pe care le desfășoară, respectiv: formarea sporului în membrană citoplasmei celulelor intestinale, alterarea permeabilității acestor membrane, pierderea apei și ionilor din celulele afectate, inhibarea sintezei macromoleculare a proteinelor, dezvoltarea citoscheletică Ca++ dependentă și liza celulelor.
Acțiunea citotoxică a enterotoxinei produse de Clostridium perfringens presupune patru fenomene legate de interacțiunea ei cu membrane celulelor epiteliului intestinal și anume :
1 – legarea enterotoxinei de un receptor proteic de pe membrană celulelor mamiferelor Acest receptor proteic reprezintă o polipeptidă de 50.000 daltoni, care, împreună cu enterotoxina, formează un complex proteic de 90.000 daltoni;
2 – modificarea structurii fizice a acestui mic complex proteic, apărut după legarea celor două polipeptide;
3 – formarea unui complex polipeptidic mare de 160.000 daltoni, care rezultă din interacțiunea dintre complexul proteic modificat fizic și o proteină membranară de 70.000 daltoni.
4 – dezvoltarea alterărilor extinse ale permeabilității membranei citoplasmatice prin care pot ieși moleculele mai mici de 200.000 daltoni, în special apa și ionii, ceea ce determină efecte secundare grave, precum vătămările morfologice ale celulei, inhibarea sintezei macromoleculare și, in final, moartea celulei.
Pentru verificarea patogenității speciei Clostridium perfringens și a capacității de a produce gastroenterita, s-au făcut și experiențe pe voluntari umani. S-a stabilit cu această ocazie că doza necesară pentru a produce îmbolnavirea omului este de 4 – 6 × 109 celule vegetative.
Până în prezent nu s-a adus nici o dovadă că prezența în circulația sangvină a anticorpilor față de enterotoxină ar conferi imunitate la expunerile ulterioare. Din cauză că anticorpii față de enterotoxină pot exista adesea la personae clinic sănătoase, fără să fi manifestat vreodată gastroenterită cu Clostridium perfringens, prezența lor în sânge nu are nici o semnificație clinică sau epidemiologică.
3.1.1. Frecvența toxiinfecțiilor alimentare cu Clostridium perfringens
Incidența reală a acestor toxiinfecții nu se cunoaște din cauză că ea este obligatoriu declarabilă numai în anumite țări, în celelalte fiind facultativ declarabilă.
Țările în care s-au raportat episoade și cazuri numeroase sunt Anglia și Țara Galilor, unde boala se declară în mod obligatoriu, se înregistrează anual 46-87 episoade cu 918-2924 cazuri, după cum arată și datele ilustrate în tabelul 3.1.
Tabelul 3.1.
Principalele toxiinfecții alimentare înregistrate în Anglia și Țara Galilor
în perioada 1986 – 1988, după Lund B.M. 1990
Table 3.1.
The main food poisoning registered in England and Wales during 1986 to 1988,
after Lund B.M. 1990
Dacă excludem toxiinfecțiile produse de alți germeni, în special de cele stafilococice, se poate concluziona că în Anglia și Țara Galilor, toxiinfecțiile alimentare produse de Clostridium perfringens ocupă locul trei, dar la distanță mare de cele produse de Campylobacter și Salmonella.
În S.U.A. 10 % din episoadele de toxiinfecție alimentară cu etiologie cunoscută sunt produse de Clostridium perfringens (Lund B.M. 1990).
În Finlanda, cu o populație puțin numeroasă, se înregistrează 9-22 episoade cu 187-593 cazuri în fiecare an. Față de alte țări, în Japonia episoadele se caracterizează printr-un număr foarte mare de cazuri: o medie de peste 200 cazuri pe episod în perioada 1980 – 1989 când s-au raportat un total de 84 episoade cu 16831 cazuri. În majoritatea celorlalte țări numărul de cazuri pe episod este mai mic, media situându-se în jurul a 30-60, totuși, mult mai mare decât în cazul altor toxiinfecții alimentare (Labbé, 1989). Aceasta demonstrează că toxiinfecția alimentară cu Clostridium perfringens se produce, de regulă, în urma servirii meselor în unitățile de alimentație publică, spitale, grădinițe, case de bătrâni unde servesc în același timp și din același aliment un număr mare de persoane.
Regan și colab. în 1995 au descris în Regatul Unit, un episod apărut întru-un spital în care 38,6% dintre pacienții care consumaseră friptură de porc se îmbolnăviseră, iar specia de Clostridium perfringens izolat aparținea tipului A.
În țara noastră toxiinfecția alimentară produsă de Clostridium perfringens a fost descrisă de Tudor și colab. în 1979. Ea a interesat 23 din 41 de persoane care au servit masa la aceiași cantină. Alimentul care a vehiculat germenele și enterotoxina sa nu s-au putut identifica.
3.1.2. Caracteristicile clinice ale toxiinfecțiilor alimentare cu Clostridium perfringens
Toxiinfecțiile alimentare produse de Clostridium perfringens se manifestă sub două forme: forma benignă produsă de tipul A și forma malignă denumită și enterita necrotică produsă de tipul C.
Semnele clinice în toxiinfecția produsă de tipul A apar după 8 – 24 ore de la ingerarea alimentelor care conțin un număr foarte mare de celule vegetative (mai mare de 105 / g.). Lund B. M. în 1990 semnalează cazuri de îmbolnăviri apărute la două ore după ingerarea alimentului contaminat, acesta conținând enterotoxina preformată.
Simptomele obișnuite sunt diareea și durerile abdominale severe, grețurile apărând mai rar, iar febra și vomitările lipsesc. Scaunele diareice prezintă un miros putrid, pronunțat și sunt însoțite de evacuări masive de gaze, care produc un balonament abdominal accentuat.
Moartea, în această formă, este foarte rară și apare de regulă la bătrâni și persoane debilitate. La autopsia acestor persoane s –au găsit, uneori, necroze ale intestinului subțire.
Frecvența toxiinfecțiilor cu tipul A a scăzut după apariția antibioticelor, deși sunt observații care arată că tratamentul de lungă durată cu anumite antibiotice, care distrug microflora concurentă, ar favoriza toxiinfecția cu Clostridium perfringens.
Toxiinfecția alimentară produsă de Clostridium perfringens tip C sau enterită necrozantă, reprezintă o formă malignă, dar este foarte rară.
Ernst, citat de Nestorescu, a studiat epidemiologic 400 cazuri apărute în Germania în perioada 1946 – 1949, stabilind că incidența maximă se înregistrează în luna august și că persoanele bătrâne au contractat forme mai grave, deseori mortale. Principala manifestare anatomoclinică a acestei forme de îmbolnăvire este jejunita hemoragică, necrozantă. Din probele de fecale ale bolnavilor se izolează cu regularitate Clostridium perfringens tip C.
Diagnosticul se bazează pe perioada scurtă de incubație, pe apariția durerilor abdominale severe și a diareei, caracterizată prin scaune frecvente, putride, însoțite de evacuări masive de gaze, absența vărsăturilor și evoluția benignă.
Diagnosticul se confirmă prin examen de laborator care consta în izolarea și identificarea lui Clostridium perfringens din alimente și fecale, detectarea enterotoxinei prin teste biologice, imunologice și teste pe culturi celulare.
Clostridium perfringens este sensibil la mai multe antibiotice, dar mai ales la penicilina G, care este preferabilă în tratamentul gangrenei gazoase. Pentru tratarea toxiinfecțiilor alimentare produse la om de Clostridium perfringens nu s-au folosit antibiotice, ele mărind aspectul evident de infecție. În formele de evoluție prelungită tratamentele simtomatice sunt favorabile. Labbe, în 1989, citează câteva încercări reușite de tratare a diareei cu antibiotice sau cu metronidazol. În enterita necrozantă tratamentul cu antibiotice este motivat, deoarece este vorba de o multiplicare a bacteriei la nivelul intestinului subțire.
Combaterea se face prin măsuri de prevenire nespecifice. Principala măsură de prevenire constă în realizarea de alimente necontaminate cu Clostridium perfringens sau cele contaminate să fie păstrate în condiții nefavorabile multiplicării acestei bacterii. Pentru evitarea contaminării cărnii se va respecta tehnologia de tăiere și condițiile de igienă. Odată obținute, carcasele animalelor trebuie semirăcite în maxim 7 – 9 ore.
Sporii din carne și din condimentele adăugate diferitelor mâncăruri pot supravețui procesului de gătire. În plus, acești spori supraviețuitori, activați de procesul termic, vor germina și se vor multiplica cu o rată ridicată, când aceste mâncăruri ajung la temperaturi de 200C – 570C. Aceasta cu atât mai mult cu cât gătirea reduce semnificativ valoarea Eh – ului (potențialul oxidoreducător), creând condiții anaerobe. De aceea, în timpul păstrării sau răcirii mâncărurilor, aceste temperaturi vor fi parcurse în timpul cel mai scurt.
Mâncarea gătită se va păstra la temperaturi mai mari de 600C. Dacă mâncarea este gătită în cantitate mare, pentru a fi servită și în zilele următoare, trebuie răcită în scurt timp să atingă temperaturi ≤ 100C. Măncarea răcită nu se va servi decât după o încălzire de minimum 20 minute la 750C.
Rolul de purtător clinic sănătos cu implicație în transmiterea bolii este minim față de ceilalți factori favorizanți.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Particularitatile Morfofiziologice ALE Bacteriilor (ID: 122796)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.