Notiuni Generale de Cromatografie

Capitolul II. NOȚIUNI GENERALE DE CROMATOGRAFIE

Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare și analiză a unor substanțe dintr-un amestec, care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat cu doua faze cromatografice: faza staționară și faza mobilă care se deplasează într-o direcție determinată. Ea este o tehnică de separare a amestecului în componente pentru a analiza (examinarea amestecului, componentelor sale și relațiile dintre acestea), identifica (determinarea unui amestec sau componente pe baza unor componente deja cunoscute), purifica (separarea componentelor pentru a izola unul dintre ele ce prezintă interes pentru studii ulterioare) și/sau cuantifica (determinarea cantității amestecului si/sau a componentelor prezente în probă).

Metoda se bazează pe migrarea variată a substanțelor din amestec, ca urmare a unor diferențe de adsorbție, repartiție, solubilitate, mărimea moleculei etc.

II.2. Clasificarea metodelor cromatografice

Clasificarea în funcție de mecanismul separării

Cromatografie de adsorbție

Cromatografie de repartiție

Cromatografie de schimb ionic

Cromatografie de excluziune

Cromatografie de afinitate

Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice

Cromatografie de gaze (GC)

Gaz-lichid (GLC)

Gaz-solid (GSC)

Cromatografie de lichide (LC)

Lichid-lichid (LLC)

Lichid-solid (LSC)

Cromatografie cu fluide supercritice (SFC)

Clasificarea în functie de configurația sistemului cromatografic

Cromatografie pe coloană (CC)

Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură)

Cromatografie pe coloane capilare

Cromatografie planară (CP)

Cromatografie în strat subțire (CSS)

Cromatografie pe hârtie (CH)

II.1.1. Cromatografia pe hârtie (CH)

Este o metodă cromatografică de separare a compușilor din amestec care folosește ca fază staționară hârtia cromatografică (tip Watman), tăiată în benzi de dimensiuni convenabile (8-10 cm / 40 cm).

Faza mobilă (developantul) este constituită din solvenți puri sau amestecuri de solvenți, în funcție de natura componentelor care urmează a fi separate.

Faza mobilă se introduce în vase cromatografice din sticlă (camere de developare), de formă cilindrică sau paralelipipedică, de dimensiuni corespunzătoare, cu posibilitatea de închidere etanșă. Developantul se introduce în vas cu 24 ore înaintea determinării cromatografice pentru saturarea atmosferei cu vaporii sistemului de solvenți.

Soluțiile de analizat (probă, etalon) se aplică cu ajutorul unor micropipete pe linia de start, în pete circulare sau benzi.

Separarea cromatografоcă se realizează prin migrarea fazei mobile într-o anumită direcție, pe cromatogramă. În funcție de direcția de migrare a developantului, se deosebesc următoarele tehnici de cromatografiere: ascendentă, descendentă, circulară, orizontală, bidimensională. Migrarea fazei mobile de-a lungul cromatogramei poartă numele de developare.

Când faza mobilă ajunge la distanța propusă (linia de front), hârtia cromatografică se scoate din vas și se usucă. Se notează timpul de migrare și distanța de migrare.

Se evidențiază petele, prin metode care diferă în funcție de proprietățile substanțelor separate (vizibil, fluorescentă în UV, pulverizare cu reactivi corespunzători etc).

Într-un sistem dat faza stationara-faza mobila, fiecărui component ii corespunde o anumita valoare Rf :

h

Rf = –- , în care:

H

h – distanța parcursă de substanță de la punctul de aplicare a soluției până la centrul spotului, cm; H – distanța parcursă de developant de la linia de start până la linia de front, cm (fig.4).

Fig. 4. Schema cromatogramei

Pentru identificarea substanțelor, se compară pe aceeași cromatogramă valoarea Rf și culoarea sau fluorescenta spoturilor obținute pentru soluția probă și respectiv pentru soluția etalon; cele 2 spoturi trebuie să aibă aceleași caracteristici.

II.1.2. Cromatografia pe strat subțire (CSS)

Cromatografia pe strat subțire (CSS), (Thin layer chromatographic – TLC) este o metodă de analiză oficinală atât în E.Ph.6 cât și în Farmacopeea Română Ediția a X-a (FRX). În E.Ph.6 este o metodă oficinală utilizată în analiza calitativă a majorității substanțelor medicamentoase oficinale. Este o tehnică care prezintă o serie de avantaje, fiind o metodă simplă, rapidă, economică și accesibilă, care utilizează cantități mici de substanță și are o bună putere de rezoluție.

Cromatografia pe strat subțire este o metodă de separare a componentelor din amestec asemănătoare cu cromatografia pe hârtie, cu deosebirea că faza staționară este reprezentată de o pulbere adsorbantă de puritate cromatografică ce se aplică în strat subțire pe placi cromatografice din sticlă sau alte materiale, de dimensiuni diferite (de obicei 20×20 cm).

Faza staționară este constituită din pulberi cu granulație fină și uniformă: silicagel, celuloză microcristalină, oxid de aluminiu, poliamidă etc., cu sau fără liant (amidon, gips, carboximetilceluloză).

Pregătirea plăcilor cromatografice. Pulberea adsorbantă se suspendă în apă (în proporție – 1:2 m/V), se agită puternic și se aplică pe plăcile în prealabil bine degresate, fie manual, fie cu ajutorul unor dispozitive speciale, într-un strat uniform, de ~ 0,25 mm grosime. Plăcile se usucă la temperatură ambiantă, apoi se mențin în etuvă la 105-110°C timp de 1 oră, pentru activare. Plăcile astfel pregătite se păstrează în exsicator. Dacă nu se folosesc în 3 zile de la activare, este necesară reactivarea în etuvă.

Faza mobilă poate fi constituită dintr-un singur solvent sau mai frecvent, dintr-un amestec de solvenți (metanol, cloroform, butanol, eter etilic, toluen, acetat de etil).

Separarea componentelor din amestec se bazează pe distribuția diferită a substanțelor între cele două faze: staționară și mobilă. Viteza de migrare a substanțelor depinde de natura lor chimică. Cu cât o substanță este mai bine adsorbită de faza staționară, viteza sa de migrare este mai mare, deci și valoarea Rf a spotului va fi mai mare și invers.

Pentru evidențierea spoturilor se examinează cromatograma în lumina zilei și în lumină UV (254, 366 nm), ca atare sau după ce se tratează cu reactivi corespunzători (fig.5).

Fig. 5. CSS extractelor alcoolice din părți aeriene la 4 specii de Hypericum (faza mobilă: acid formic anhidric: acetat de etil: apă (6:9:90). A – La lumina zilei; B – La lumina UV 366 nm: 1 – extract din H. perforatum L.; 2 – extract din H. elegans L.; 3 – extract din H. tetrapterum Fries; 4 – extract din H. hirsutum L.; 5 – hipericină; 6 – cvercetol; 7 – hiperozidă; 8 – rutozidă; 9 – acid clorogenic.

II.1.3. Cromatografia pe coloană (CC)

Faza staționară pentru cromatografia pe coloană este constituită dintr-un material adsorbant de granulație corespunzătoare (silicagel oxid de aluminiu, sephadex, celuloză etc), care se introduce într-un tub de sticlă, prevăzut în partea inferioara, cu un robinet (coloană cromatografică). Peste adsorbant se adaugă soluția extractivă concentrată, apoi developantul, în cantități mici. La trecerea solventului prin coloană se realizează separarea componentelor în zone de adsorbție diferite. Fiecare fracțiune se colectează în recipiente (eprubete) diferite; se evaporă solventul și substanțele separate se pot identifica prin alte metode (CSS, UV, IR etc).

II.1.4. Cromatografia în fază gazoasă (CG)

Gazcromatografia (GC), (Gas chromatography – GC) este o metodă fizico-chimică de separare care poate fi utilizată atât pentru analiza calitativă cât și pentru analiza cantitativă a substanțelor medicamentoase.

Cromatografia în fază gazoasă este o metodă fizico-chimică de separare a compușilor volatili din amestec, în care faza mobilă este un gaz (gaz purtător), iar faza staționară este un solid sau un lichid repartizat uniform pe pereții unei coloane capilare.

Probele analizate sunt aduse în stare de vapori, în camera de vaporare, la o temperatură suficient de ridicată pentru a asigura o evaporare rapidă, fără a produce o degradare termică a probelor.

Faza mobilă se deplasează continuu prin coloana cromatografică, cu viteză constantă, iar la ieșire, gazul purtător trece prin detector, care emite un semnal electric proporțional cu concentrația componentei din faza gazoasă. Detectorul este conectat la sistemul de înregistrare, iar rezultatele se prezintă sub forma unui grafic semnal-timp (gaz-cromatograma), picurile corespunzătoare fiecărei componente separate caracterizându-se printr-un anumit timp de retenție (timpul scurs de la injectare până la ieșirea din coloană). Gaz-cromatograful poate fi cuplat la un spectrometru de masă care înregistrează spectrele de masă ale substanțelor separate, care pot fi identificate cu ajutorul standardelor.

II.1.5. Cromatografia de lichide de înaltă performantă (CLIP)

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (CLIP), (High performance liquid chromatography – HPLC) este fără discuție cea mai utilizată metodă cromatografică. Avantajele metodei CLIP față de GC sunt legate de creșterea eficacității cromatografice și reducerea timpului de analiză.

Cromatografia de lichide de înaltă performanță este o metodă de separare a substanțelor dintr-un amestec în care faza mobilă este un lichid, iar faza staționară, conținută într-o coloană, este constituită dintr-un solid cu granulație fină, un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care sunt grefate grupări organice.

Faza mobilă circulă prin coloana cromatografică cu un debit constant, sub efectul unei presiuni și apoi trece prin detector. Compoziția fazei mobile poate să rămână constantă pe toată durata determinării (eluție izocratică) sau să varieze după un anumit program (gradient de eluție).

Sistemul de detectare folosit trebuie să permită determinarea cantităților de componente prezente în faza mobilă și se bazează pe spectrofotometrie de absorbție, refractometrie diferențială, fluorimetrie etc. Se înregistrează o cromatogramă care cuprinde picurile corespunzătoare componentelor separate, caracterizate printr-un anumit timp de retenție. Măsurarea ariilor de sub picuri poate da indicii cu privire la proporția componentelor din amestec.