Microbiotica Telurica Parametru Calitativ al Mediului

CUPRINS

PREAMBUL:

“Este îngrozitor sa constați ca din teritoriul național pleaca anual în medie peste 100 milioane tone de sol fertil, o bogație naturală pe care bunul Dumnezeu ne-a dat-o și pe care noi niciodată nu vom putea s-o mai recuperăm. Am pierdut-o pentru că n-am știut s-o gestionăm, pentru că am fost fie neștiutori, fie lacomi, fie amândouă deodată, oricum am fost foarte „RĂI” cu pamântul care ne-a iubit și ne-a hrănit milenii de-a rândul.”

INTRODUCERE

Prezenta lucrare, intitulată „MICROBIOTA TELURICĂ – PARAMETRU CALITATIV AL MEDIULUI” are la bază dorința personală de a constata și a-mi explica influența prezenței microorganismelor în cadrul solului ca habitat natural, această resursă naturală, de care trebuie să se bucure cât mai multe generații viitoare.

Solul este considerat interfața dintre scoarța terestră, atmosferă, hidrosferă, biosferă,

la nivelul său desfășurându-se un permanent schimb de substanță și energie care asigură perpetuarea vieții la nivel terestru.

Noțiunea de calitate a solului este relativ recent introdusă în terminologia ingineriei mediului și integrează fertilitatea și productivitatea acestuia alături de alte elemente care se

referă la starea de poluare a solului, starea sanitară a solului și disponibilitatea lui pentru anumite folosințe. Evaluarea calității solului implică măsurarea unor proprietăți sau însușiri ale solului care servesc ca indicatori sensibili la modificarea funcțiilor solului rezultate din utilizarea și managementul resurselor de sol.

Microorganismele sunt foarte răspândite în natură, fiind prezente în orice colț din natură. Răspândirea lor în natură variază în funcție de mai mulți factori, mai importanți fiind cei fizici, chimici, precum și interrelațiile ce se stabilesc între diferitele categorii de viețuitoare dintr-un ecosistem. Microorganismele sunt dependente de factori precum: substanțele nutritive disponibile sau sursa de astfel de substanțe, temperatură, reacția substratului etc.

Toate aceste condiții sunt reunite în sol, motiv pentru care solul conține o microfloră bogată, el reprezentând rezervorul principal pentru microflora din alte medii: aer, apă. Solul reprezintă mediul natural cel mai favorabil pentru dezvoltarea și multiplicarea microorganismelor.

Prezenta lucrare se bazează în special pe studierea fenomenelor microbiologice în care sunt implicate bacteriile cu impact asupra circuitului azotului în natură. Motivul alegerii acestei categorii de microorganisme din multitudinea claselor existente la nivelul solului este acela că azotul reprezintă elementul chimic esențial pentru asigurarea fertilității solului, parametru calitativ de o deosebită importanță pentru domeniul socio-economic.

Există un anumit raport între microfloră și fertilitatea solului în sensul unei proporționalități directe între fertilitatea unui sol, activitatea microflorei totale a solului și puterea nitrificatoare determinată de microflora specifică.

Rezultatul echilibrului dintre procesele biologice care au loc în sol sub acțiunea microorganismelor este fertilitatea solului.

În lipsa microorganismelor, substanțele organice din sol nu ar fi descompuse și deci nu ar putea condiționa cu nimic aceste particularități ale solului, care în ultimă instanță îi determină fertilitatea. Ținând seama de faptul că procesele microbiologice din sol pot influența fertilitatea solului, în prezenta lucrare ne-am propus să urmărim activitatea grupelor ecologice de microorganisme implicate în circuitul azotului. De activitatea acestor grupe de bacterii depinde bilanțul azotului în sol, cu importanță considerabilă în atribuirea stării de fertilitate a solului. Nu toate solurile au aceeași fertilitate și, din acest motiv, nu toate terenurile de pe Glob sunt cultivate. Din cele 1,5 mld. hectare cultivate, doar 920 000 hectare dau producție. Solul trebuie protejat, deoarece pentru refacerea unui strat de 3 cm este nevoie de 300 până la 1 000 de ani.

Tot mai mulți producători optează pentru practicarea unei agriculturi ecologice. Calitatea solului, prin atributele sale, determină, în largă măsură, marea complexitate și diversitate, în spațiu și timp, a mediului înonjurător, a echilibrului ecologic. De altfel, aceasta reflectă tocmai complexitatea și diversitatea rolului și funcției solului în multiplele lui ipostaze.

Solul: Un mediu complex și dinamic, caracterizat de o faună si o floră specifice, de un ansamblu de elemente minerale și organice și de o circulație proprie a aerului și apei care, toate, într-o strânsă interdependență și corelație cu climatul local, determină calitatea solului de care depind, de fapt, pretabilitatea terenurilor pentru multiple folosințe, favorabilitatea solurilor pentru diferite plante și funcția ecologică a acestora.

Pornind de la premisa unanim acceptată că solul ca resursă naturală nu este inepuizabil, tematica abordată prin prezenta lucrare este de strictă actualitate și de perspectivă, luând în studiu implicarea microorganismelor în atribuirea stării sanogene a solului, urmare a contribuției la realizarea circuitului biogeochimic al azotului.

Cunoașterea acestor procese și dirijarea lor rațională pot contribui la îmbunătățirea calităților solului și deci la ridicarea producției agricole. Acesta este și motivul pentru care ne-am propus să determinăm cantitativ numărul microorganismelor care intervin în circuitul azotului.

Viticultura ecologică, fiind cu totul nouă si cladită exclusiv pe cele mai bune descoperiri ale științei și tehnicii, poate înlătură toate neajunsurile provocate mediului de viticultura convențională, clasică și de către industriile acesteia.

Totuși, pentru a înțelege și aplica într-un mod corespunzător principiile unei viticulturi ecologice, trebuie revăzută politica de definire, de conservare, dar și de ameliorare a celei de-a treia dimensiuni a mediului înconjurător (după aer, apă) – respectiv SOLUL.

Scopul lucrării și obiectivele propuse

Pornind de la constatarea că deși literatura de specialitate oferă numeroase informații privind calitatea solului în plantațiile viticole, acestea sunt totuși fragmentate, în majoritatea cazurilor unilaterale. Astfel, în lucrarea de față tematica de cercetare abordată a vizat, ca scop principal prezentarea principalilor parametrii microbiologici ai solului viticol, respectiv dinamica încărcăturii microbiene răspunzatoare de starea de aprovizionare a solului viticol cu azot.

Determinările efectuate au vizat ca obiectiv: caracterizarea activității vitale a solului prin evidențierea principalelor categorii de microorganisme implicate în circuitul azotului în natură, prezente în soluri viticole diferite, respectiv plantație viticola Calafat, plantație viticolă Breasta – Dolj si fosta plantație viticolă Banu Măracine.

CAPITOLUL I

SOLUL – COMPONENT ESENȚIAL AL ECOSISTEMELOR TERESTRE

1.1 .Conceptul de calitate a solului – ca mediu natural regenerabil sau neregenerabil

Pedosfera (solul) – este partea superioară a litosferei cu grosimi de cca. 5m, se prezintă ca un strat afânat, care conține în proporții diferite elemente minerale, elemente organice, organisme vii. Însușirea specifică a solului este fertilitatea, adică capacitatea lui de a susține realizarea unei anumite biomase vegetale.

Solul face legătura dintre regnul mineral și regnul vegetal, situându-se în poziția de graniță dintre neviu și viu și este format din diverse tipuri de materii având la bază constituenți organici sau anorganici în diverse stadii de organizare. Reprezintă mediul de creștere, multiplicare și degradare a plantelor, asigurând din toate aceste puncte de vedere suportul fizic, chimic și biologic. Solul servește ca și rezervor de aer, apă și substanțe nutritive dar și ca suport fizic pentru ancorarea rădăcinilor plantelor asigurând totodată reciclarea materiei organice.

Procesele implicate în formarea solului sunt îndelungate, graduale, continue, fiind rezultatul efectelor factorilor ambientali asupra litosferei. V.V.Dokuceaev spune că sub denumirea de sol se regăsesc „orizonturile superioare ale rocilor, (independent de felul lor) modificate în mod natural de acțiunea simultană a apei, aerului și diverselor microorganisme vii și moarte.”. Prin această definiție se face net distincția între sol și piatra nefertilă, prin fertilitatea solului înțelegându-se comportamentul său față de apă, substanțe minerale, azot și fiind o caracteristică ce se dezvoltă treptat, ca urmare a unor procese de eroziune complexe.

În funcție de modul de acțiune al celorlalți factori de mediu (climatul zonei, vegetația, relieful, vârsta solului, natura rocii mamă) asupra rocilor-mamă, se pot forma diferite tipuri de sol cu însușiri și origini istorice diferite.

Solul este considerat interfața dintre scoarța terestră, atmosferă, hidrosferă, biosferă, la nivelul său desfășurându-se un permanent schimb de substanță și energie care asigură perpetuarea vieții la nivel terestru. Solul exrecită multiple roluri, precum:

rolul ecologic – este un component esențial al ecosistemelor naturale, fiind un habitat biologic, un tampon pentru schimbările climatice bruște, filtru de protecție și depurare împotriva patogenilor

rolul socio-economic – prin marea diversitate a materiilor prime furnizate și prin capacitatea de recirculare a unor elemente esențiale vieții

rolul tehnico-industrial – reprezintă substratul fizic de dezvoltare a activităților antropice, și nu în ultimul rând

rolul energetic – prin acumularea și transferul de energie și materii energetice.

Conceptul de calitate a solului este o noțiune relativ recent introdusă în terminologia specifică ingineriei mediului, definiția care se pliază cel mai bine pe principalele funcții ale solului fiind cea dată de Doran și Parkin (1994) și anume, “capacitatea de a funcționa în interiorul granițelor unui ecosistem pentru susținerea productivității biologice, menținerea calității mediului și asigurarea sănătății viețuitoarelor și habitatului”. Noțiunea este relativ ambiguă, având în vedere multiplele moduri de abordare a acesteia: agricultorii înțeleg prin calitatea solului productivitatea, fertilitatea, gradul de exploatare și profitul obținut, silvicultorii atribuie noțiunea altor indicatori precum suportul, biodiversitatea, rezistența, geografii suprapun semnificația noțiunii cu integrarea armonioasă în peisajul geografic, iar cei care se ocupă de problema de mediu sunt adepții definiției dată de Doran și Parkin.

Esența noțiunii de calitate a mediului constă în integrarea deopotrivă a însușirilor native și a însușirilor dobândite în urma intervențiilor antropice. Acestea din urmă apar ca urmare a utilizării în mod irațional și iresponsabil a măsurilor antropice, afectând nu numai calitatea mediului, ci și sănătatea acestuia.

Rezistența și reziliența sunt caracteristici care definesc calitatea unui sol, fiind noțiuni complet diferite. Dacă prin rezistență se înțelege capacitatea de a se opune acțiunilor care tind să îi modifice structura și funcțiile (de exemplu: capacitatea de tamponare a ploilor acide), reziliența presupune capacitatea de refacere și viteza de refacere a proprietăților solului după ce asupra sa au acționat o serie de factori perturbatori.

Așadar, noțiunea de CALITATE A SOLULUI integrează fertilitatea și productivitatea acestuia alături de alte elemente care se referă la starea de poluare a solului, starea sanitară a solului și disponibilitatea lui pentru anumite folosințe.

Evaluarea calității solului implică măsurarea unor proprietăți sau însușiri ale solului care servesc ca indicatori sensibili la modificarea funcțiilor solului rezultate din utilizarea și managementul resurselor de sol (Karlen și colab., 1997).

Toate aceste funcții pot fi îndeplinite în condițiile existenței unor însușiri fizice, chimice și biologice ale solului care pot fi supuse unor măsurători.

Noțiunea de fertilitate a solului are o semnificație deosebită, atât pentru practica agricolă, cât și pentru înțelesul științific al acestei însușiri a solului, cu atât mai mult cu cât aprecierea fertilității solului este discutabilă și astăzi.

Încercările de estimare a fertilității unui sol au parcurs un drum sinuos, începând cu You Kung (anul 2200 înainte de Hristos) sau Chow Li (1200 înainte de Hristos), care arătau că țăranii chinezi percepeau solul ca fiind fertil dacă acesta are o rezistență bună față de factorii nefavorabili și o largă adaptabilitate la unele practici agricole, ei fiind interesați de aspectul fizic al solului (En-feng Chen și colab., 1982).

În Europa, Thaer (1752-1828) a formulat Teoria nutriției plantelor cu humus, combătută apoi de către Liebig (1803-1873), prin Teoria nutriției minerale a plantelor, teorie ce deschide, de altfel, calea aplicării îngrășămintelor chimice, supranumită fertilizarea solului, răspunzătoarea de deterioarea unor însușiri esențiale ale solurilor agricole (conținut in humus, pH, structura agregatelor), concomitent cu creșterea productivității solului și plantelor cultivate. Prin urmare, fertilitatea solului era înteleasă ca o însușire de a produce mult și de a se reproduce. S-a creat astfel, analogia între fertilitate și productivitate sau capacitatea de producție a solului care a generalizat confuzia celor două noțiuni, cea de-a doua însușire realizându-se întotdeauna sub semnul eficienței tehnicii agricole și adesea în contradicție cu evoluția fertilității solului.

La sfârsitul secolului al XIX-lea și începutul secolului al XX-lea, descoperindu-se în scurt timp că solul are o micropopulație foarte heterogenă, care prin activitatea ei asigură circuitul continuu al materiei și energiei în sol, s-a facut trecerea spre cercetarea în domeniul microbiologiei solului (Winogradsky, 1925, Waksman, 1952).

Este înțeles faptul că fertilitatea solului a aparut și evoluează ca urmare a proceselor biotice, fizice și chimice, în interacțiune cu scoarța terestră, învelișul vegetal și condițiile climatice, acumulându-se un orizont humifer în zona superioară a profilului de sol. Vaillant (1901) aprecia: ”cu cât conținutul în humus e mai mare, cu atât solul este mai fertil și această fertilitate pare a fi datorată, în special, unui număr mare de organisme fixatoare de azot, care trăiesc aici".

În deceniul al II-lea al secolului XX, deja se formula prima definiție a fertilității solului, ca fiind: "capacitatea solului de a satisface într-o masură sau alta nevoia plantelor în factorii tereștrii ai vieții lor", ceea ce reduce conținutul noțiunii de fertilitate la limitele de aprovizionare a plantelor cu apă și săruri minerale și ale transformării acestora în recolte.

G. Ionescu-Sisești formula în 1947 o altă definiție, care înlătură confuzia dintre fertilitate și productivitatea solului, considerând că :"fertilitatea solului este o sinteză de însușiri favorabile ale solului, care se traduc prin productivitatea lui durabilă. Acești factori sunt de natură geografică: latitudine, expoziție; de natură chimică, fizică și biologică", definiție ce poate fi constituită într-un veritabil preambul în definitivarea conceptului de agricultură durabilă.

D. Davidescu (1963) readuce în actualitate definiția fertilității solului ca o însușire inseparabilă de nevoile optime ale plantelor. Este perioada în care identificarea fertilității solului cu productivitatea este evidentă. C. Chiriță (1974) a ajuns la concluzia că există o anumită fertilitate a solului în funcție de fiecare specie vegetală considerată, ceea ce duce la paradoxul că același sol are fertilitate dacă este cultivat cu anumite specii vegetale, care valorifică bine solul și are o fertilitate slabă dacă este cultivat cu specii neadecvate.

Teoria despre evoluția solului agricol și a fertilității sale a fost preluată și aplicată în practica agricolă de către Pfeiffer (1937), ca agricultură biodinamică.

Numai dupa 1970, încercările de analiză biologică pentru estimarea nivelului de fertilitate a solului, care să disocieze însușirea de fertilitate de cea de productivitate au început să câstige teren și în consecință să apară noi definiții, care să reflecte condițiile interne ale evoluției solului. În 1975, L. Ghinea a fost mai explicit, considerând că: "un sol va fi cu atât mai fertil, cu cât procesele de circulație a elementelor se vor desfășura în cadrul sau mai rapid, cu condiția menținerii echilibrului humificare-mineralizare, aceasta fiind condiția ideală a agriculturii".

În 1976, Gh. Stefanic și colab., analizând microbiologic, enzimatic si chimic 11 soluri din Oltenia, au elaborat urmatoarea definiție: "fertilitatea solului este capacitatea sa naturală pentru echilibrarea proceselor de acumulare a complexului organo-mineral cu cele ale mineralizării, care asigură plantele cu nutrienți. Când echilibrul este la un nivel scăzut, fertilitatea solului este scăzută. Omul poate administra conștient fertilitatea solului, conservând-o, chiar sporind-o, obținând concomitent recolte mari, prin introducerea materiei organice, compostată corect, având ca rezultat creșterea complexului organo-mineral". După numeroase alte cercetări și analize, Gh. Stefanic (1994) a definit mai cuprinzător fertilitatea solului, astfel: "fertilitatea este o însușire fundamentală a solului ce rezultă din activitatea vitală a micropopulației, a rădăcinilor plantelor, a enzimelor acumulate și a proceselor chimice generatoare de biomasă, humus, săruri minerale și substanțe biologic active, nivelul fertilității fiind legat de nivelul potențial al proceselor de bioacumulare și mineralizare, acesta depinzand de programul și condițiile evoluției subsistemului ecologic și de influențele antropice".

Această definiție menționează nu numai că fertilitatea este însușirea fundamentală a solului, dar că poate fi evaluată prin componentele materiale și procesele biologice si biochimice, fără a recurge la nivelul recoltelor, mai puțin dependent de fertilitatea solului și mai mult de tehnologia de cultivare.

În literatura de specialitate apar în continuare, încercări de definire a fertilității solului. Starea naturală de fertilitate a solului, ca reflectare a calității sale este definită în termenii durabili, astfel: "capacitatea unui sol de a primi, înmagazina și recicla apa, mineralele și energia, astfel încât producțiile agricole să fie maxime și degradarea mediului înconjurător minimă". În concordanță cu această definiție se stabilește că un sol de cea mai înaltă calitate trebuie:

să reducă nivelurile contaminanților în apele de suprafață și cele subterane;

să permită obținerea unor recolte sănătoase și nutriționale;

să manifeste principalele caracteristici ale maturitătii ecosistemului.

R. Chaussod (1986) apreciază că fertilitatea solului este o noțiune învechită, citând în sprijin aprecierea lui Sebillote, că ideea de fertilitate a solului aparține mai mult domeniului reprezentărilor sociale decât concepțiilor științifice, fiind o noțiune subiectivă. Pentru simplificare, Chaussod definește în locul noțiunii de fertilitate, noțiunea de CALITATE BIOLOGICĂ A SOLULUI, ca fiind "capacitatea solului de a îndeplini anumite funcții față de producție sau de mediu într-un ecosistem dat".

Dupa 1992, politica agrară a Comisiei Europene a fost îndreptată spre promovarea principiilor de agricultură biologică, elaborând doctrina agriculturii durabile.

În vederea promovării unor tehnologii agricole performante, cu impact negativ redus asupra mediului înconjurător, a devenit imperios necesară clarificarea teoretică a noțiunii de fertilitate a solului și revizuirea metodologiei de estimare cantitativă, în sistem integrator, complex a acesteia.

1.2 Parametri și indicatori de caracterizare a calității solurilor agricole

1.2.1.Parametrii fizici ai solului

Parametrii fizici ai solului depind de dimensiunea particulelor componente ale solului. De regulă, dimensiunea particulelor peste 2 mm încadrează respectivul tip de sol în categoria pietriș sau piatră, particule între 0,05 și 2mm sunt regăsite în nisipuri, între 0,002 și 0,05 în nămoluri, iar sub 0,002 se regăsesc în argilă sau lut. Aceste particule ocupă mai mult de jumătate din volumul solului, restul fiind reprezentat de apă și aer care se găsesc în spațiul poros. Densitatea masei solului este definită ca și măsură pentru volumul de sol uscat, reflectând totodată și volumul spațiului poros al solului respectiv. Solurile nisipoase au particule cu dimensiuni relativ omogene, în timp ce argilele sau solurile nămoloase prezintă particulele sub formă de agregate.

Stabilitatea agregatelor telurice depinde de componenta organică a solului și de natura produselor microbiene. Agregarea particulelor de sol reprezintă un factor vital pentru creșterea plantelor, având în vedere faptul că transportul aerului, apei și transferul de energie se realizează la nivelul porozităților solului.

Temperatura solului este un factor foarte variabil ( variază cu intensitatea luminii solare, lungimea zilei, variațiile sezoniere, cantitatea de precipitații, culoarea și textura solului) , dar care influențează deosebit de mult creșterea plantelor.

O altă caracteristică a solului este reprezentată de tendința de formare a crustelor prin desicare, cu efect dăunător asupra plantării și germinării semințelor de plante.

Alți factori fizici cu influență asupra creșterii plantelor sunt pH-ul și capacitatea de menținere a umidității.

Apa prezentă la nivelul solului se poate încadra în una din cele trei categorii: gravitațională, capilară sau higroscopică. După ploi sau irigații, apa gravitațională ajunge la nivelul solului. Din aceasta, excesul va fi drenat către profunzime, la nivelul porilor solului reținându-se apa capilară. Apa higroscopică este reprezentată de fracțiunea de apă absorbită de solul uscat în condițiile unei atmosfere cu un grad ridicat de umiditate. De reținut în ceea ce privește efectul apei asupra microorganismelor telurice este faptul că fungii sunt mai puțin sensibili la modificările în conținutul de apă decât bacteriile.

Retenția apei este dependentă de porozitatea solului și de acțiunea de capilaritate a particulelor de sol, iar pH-ul este influențat strict de compoziția chimică a solului, motiv pentru care va fi prezentat în detaliu la secțiunea de parametrii chimici ai solului. Solurile cu un pH acid sau alcalin nu sunt favorabile creșterii plantelor. Solurile acide au un conținut crescut de : aluminiu, fier, mangan, cupru și zinc cu efect toxic asupra plantelor. În solurile alcaline, elementele mai sus enumerate sunt deficitare, iar plantele prezintă tulburări de creștere datorate acestora. Solurile neutre sunt favorabile culturilor prin conținutul lor în microorganisme capabile să convertească formele organice de azot, fosfor și sulf în forme anorganice care pot fi absorbite de plante.

Capacitatea de menținere a umidității solului este dictată de porozitatea, deci de structura solului, dar cantitatea de apă ce este disponibilă pentru plante depinde și de tensiunea de aspirație a apei pe suprafața particulelor solului. Apa este disponibilă rădăcinilor plantelor la o tensiune de aspirație mai mare de 4-4,2. Se explică astfel de ce apa din solurile nămoloase nu este la fel de facil utilizată ca cea din solurile nisipoase, în ciuda saturării cu apă a solului. Mai mult decât atât, solurile nisipoase permit un transport mult mai facil al apei prin capilaritate decât restul solurilor.

Nivelul de aerare al solului este strâns legat de conținutul în apă al acestuia. Un sol este suficient aerat dacă porii cu conținut de aer reprezintă mai mult de 10 % din volum.

Modificările de temperatură produc modificări la nivelul reacțiilor fiziologice ale microorganismelor, modificând totodată caracteristicile solului ca mediu de viață. Prin scăderi ale temperaturii solului , prin denaturări termice ale proteinelor microorganismelor telurice sau prin alterări ale permeabilității membranei celulare a microorganismelor apare o depleție a numărului acestora la nivelul solului. Acest lucru nu este general valabil pentru toate microorganismele telurice, unele dintre acestea dobândind de-a lungul timpului adevărate mijloace de supraviețuire în condiții de mediu vitreg ( de exemplu: termostabilitatea mai mare a germenilor termofili față de cei mezofili, capacitatea unor germeni psihrofili de desfășurare a activității sub punctul de înghețare).

Ca indicatori fizici ai calității solului pot fi determinate:

Densitatea aparentă

Porozitatea capacitatea de reținere a aerului

Rezistența la penetrare

Măsurători de stabilitate a agregatelor

Capacitatea de reținere a apei

1.2.2 Parametrii chimici ai solului

Solul reprezintă mediul din care plantele își procură substanțele nutritive.

Aceste nutriente sunt reprezentate de substanțe anorganice de tipul: carbon, hidrogen, oxigen, azot, fosfor, sulf, potasiu, calciu, magneziu, fier, mangan, zinc, cupru, molibden, bor, clor. Din aceste 16 elemente chimice, fierul, cuprul, molibdenul, borul și clorul sunt considerate micronutrienți datorită necesarului scăzut din acestea pentru creșterea plantelor, iar celelalte sunt considerate macronutrienți datorită aportului mare necesar plantelor.

Principalele surse de materiale anorganice din sol sunt sursele organice, fracțiunea de argilă și derivații din rocile de la baza formării solului. Aceste componente vor fi mai întâi solubilizate în apă, apoi transferate în sistemul radicular al plantelor.

Materia organică supusă procesului de descompunere este sursă de azot, fosfor și sulf. Mineralele anorganice care provin din roca-mamă sunt transformate în forme accesibile plantelor prin procesul de descompunere minerală. Fracțiunea de argilă aduce suplimentar minerale secundare diferite de cele provenite din roca de bază și substanțe amorfe. Printre acestea se numără hidroxizii de fier și aluminiu, caolinul, montmorillonitul și illitul. Fracțiunea de argilă din sol acționează asemenea unui anion uriaș la nivelul căruia se absorb cationii, funcționând asemenea unui rezervor de ioni care pot fi supuși transferului. Transferul de cationi sau proprietatea solului de a realiza astfel de schimburi reprezintă baza fertilității solului și prin acesta, sursa de nutriție pentru plante. Ionii supuși schimburilor sunt: hidrogenul, calciul, magneziul, potasiul, sodiul, amoniul, manganul, zincul, cuprul și aluminiul.

La nivelul solului se întâlnesc deopotrivă anioni și cationi care sunt în permanență supuși transferului sol-plantă și plantă-sol care se produce la nivelul soluțiilor coloidale din sol. Se poate vorbi depre o particularitate a azotului, potasiului și fosforului în ceea ce privește schimburile de substanțe minerale de la nivelul solului. A fost aproximat că o importantă fracțiune a azotului de la nivelurile superficiale sau profunde ale solului nu sunt supuse schimburilor. Proprietatea solului de a reține ionii de amoniu poartă numele de fixare a amoniului, mecanismul fiind de o deosebită complexitate și având ca și scop substituirea altor cationi din sol, cum ar fi Ca, Mg, Na. Fixarea fosforului se produce printr-un mecanism similar, fiind acumulat sub forma unor compuși insolubili în asociere cu fierul , aluminiul, calciul, ca și fosfați sau ca apatită. Situația poate fi remediată prin adminstrare de fertilizatori cu fosfor, suplimentat cu materie organică. Prin descompunerea materiei organice se formează citrați, tartrați, acetați, oxalați, malați, malonați și alți anioni organici care eliberează fosforul.

Gazele predominante de la nivelul solului sunt azotul, oxigenul și dioxidul de carbon. Conținutul în dioxid de carbon al solului este de până la 10 ori mai mare decât cel al atmosferei (0,031 % din volum). Aceasta se datorează proceselor de respirație a microorganismelor telurice și se însoțeste de consumarea oxigenului, concentrația în oxigen a solului fiind mai mică decât cea atmosferică. În condiții de extremă anaeorobioză, în sol se pot acumula substanțe toxice precum: etan, metan, hidrogen sulfurat, cianați, acid butiric, acizi grași cu efect dăunător asupra plantelor (spre exemplu, culturile de orez se dezvoltă în general în condiții anoxice, fiind un excelent mediu pentru microorganismele metanogenice; metanul, pe lângă efectul de seră de care se face responsabil, participă alături de dioxidul de carbon și oxidul nitros la reacții chimice cu rol în degradarea stratului de ozon protectiv).

PH-ul solului este definit ca logaritm cu semn schimbat a concentrației de protoni din extractul apos sau în KCl al solului, reflectând aciditatea sau alcalinitatea acestuia. Capacitatea de tamponare a solului este dependentă de tipul de sol și determină totodată pH-ul solului. Acesta poate varia între 3 și 10 în funcție de tipul solului, dar cele cu cantități mari de substanțe organice sau anorganice au de regulă o capacitate de neutralizare ridicată datorită conținutului ridicat de cationi. De exemplu, solurile podzolice au un pH scăzut, în timp ce cele calcaroase și alcaline au valori ridicate datorită conținutului mare de baze de sodiu sau potasiu, acizi slabi sau bicarbonați. Ph-ul solului determină deopotrivă conținutul în minerale disponibile transferului și compoziția microbiană. Solurile alcaline prezintă o mare disponibilitate pentru potasiu, magneziu, calciu, mangan, cupru și aluminiu, în timp ce solurile cu pH acid favorizează solubilitatea carbonaților, fosfaților și sulfaților. În general, fungii trăiesc la un pH acid (sub 5,5), iar bacteriile fixatoare de azot preferă solurile cu un pH neutru. De asemenea, plantele prezintă în funcție de apartenența la o anumită specie soluri cu pH-uri diferite.

Ca indicatori chimici ai calității solului pot fi enumerați:

pH-ul (definește pragul de activitate chimică și biologică)

concentrația de N, P, K (definesc accesibilitatea nutrienților pentru plante)

materia organică (definește stabilitatea structurală și fertilitatea)

determinările contaminanților sau poluanților în cazul în care se pune problema unor poluări sau contaminări ale solului

1.2.3 Parametrii biologici ai solului

Solul reprezintă mediul de existență pentru foarte multe viețuitoare, variate ca formă, dimensiuni, apartenență sistematică sau activitate biochimică, între ele stabilindu-se relații deosebit de complexe.

Organismele de la nivelul solurilor exercită o influență fie directă, fie indirectă asupra tuturor proceselor desfășurate la nivelul solului: descompunerea resturilor materiale vegetale sau animale, transformarea sau fixarea nutrienților, capacitatea de reținere a apei, schimburile de gaze, formarea și stabilizarea solului, sinteza de noi compuși organici, degradarea substanțelor poluante sau contaminante.

Microorganismele din sol sunt reprezentate de bacterii (eubacterii, actinomicete, cianobacterii), microfungi, alge și protozoare. În 1925 și apoi în 1949, Winogradsky a propus o împărțire pe criterii ecologice a microorganismelor din sol în două categorii: autohtone și alohtone. Microorganismele autohtone repreZintă cea mai mare parte din microbiotă și sunt caracteristice unui anumit tip de sol. Aceste microorganisme desfășoară o activitate continuă dar lentă, fiind utilizatoare ale nutrienților existenți în mod natural în sol. Nu sunt dependente de alte surse nutritive exogene iar numărul lor nu fluctuează semnificativ. În rândul acestora se înscriu bacteriile, incluzând și actinomicetele, ascomicetele, basidiomicetele. Microorganismele alohtone au o activitate periodică, intermitentă. Sunt organisme care utilizează substraturi organice din exteriorul solului, deci ușor utilizabile.

Microorganismele din sol desfășoară o intensă activitate la procesele care au loc în sol, sub influența lor producându-se descompunerea diverselor substanțe organice rezultate din resturile vegetale și animale, dar și formarea de novo a unor substanțe organice.

Urmărind activitatea vitală a acestor microorganisme se ajunge la concluzia că regimul biochimic al solului este determinat aproape în totalitate de activitatea microbiologică.Ca generalitate, microorganismele din sol își desfășoară activitatea în două direcții, și anume: procese de degradare și procese de sinteză.

Prin procesele de descompunere de la nivelul solului se produc pe de o parte produși finali de tipul dioxidului de carbon, apă, amoniac, și pe de altă parte substanțe humice. La rândul lor, aceste substanțe, reintrând în circuitul materiei în natură, vor fi utilizate pentru sinteza de noi substanțe organice. Având în vedere că diferența dintre sol și rocă este reprezentată de fertilitate, aceasta devine proprietatea cea mai importantă, care depinde de cantitatea de substanțe organice din sol.

Pe de altă parte, procesele de sinteză (fixarea azotului molecular și humificarea), care creează în sol o rezervă de substanțe nutritive, mai ales sub formă organică, care influențează starea fizico-chimică și fertilitatea solului. Aceste procese devin esențiale pentru cunoașterea disponibilității unui anumit tip de sol, precum și pentru aprecierea calității solului.

Pentru cunoașterea activității microbiotei telurice se urmăresc anumite direcții și anume:

studierea frecvenței și activității microbiotei în ceea ce privește circuitul principalelor elemente sursă pentru materia organică

studierea echilibrului între grupele ecofiziologice de microorganisme și modificările acestuia sub influența factorilor legați de cultivare

studierea unor eventuale dezechilibre în ceea ce privește starea microbiotei și relația lor cu gradul de fertilitate al solului

Principalul factor care limitează dezvoltarea bacteriilor în sol este lipsa unei surse de energie convenabilă, excepție făcând doar puține bacterii și protozoare flagelate care conțin pigmenți asimilatori. Din punct de vedere al modului de producere a hranei, microorganismele sunt autotrofe (își sintetizează hrana singure, prin reducerea CO2) și heterotrofe (folosesc ca sursă de energie energia chimică înmagazinată în substanță organică). Dintre microorganismele autotrofe, cele care sunt capabile de fotosinteză sunt: bacteriile sulfuroase verzi, purpurii, nesulfuroase purpurii, sulfobacteriile, iar cele chimiotrofe sunt reprezentate de bacteriile nitrificatoare, fiind clasa cea mai importantă din punct de vedre agricol. Microorganismele heterotrofe sunt cele mai numeroase, utilizând ca sursă de enrgie glucide, grăsimi, acizi organici, pentru care au nevoie de o compoziție enzimatică specifică. De interes deosebit pentru studierea activității enzimatice a microbiotei solului sunt: metabolismul glucozei, al acizilor organici, al amidonului, al celulozelor și hemicelulozelor, al pectinelor și ligninelor. Metabolizarea glucozei presupune desfășurarea unui lanț lung de procese, energia produsă fiind reținută sub forma compușilor macroergici – AMP, ADP, ATP. Atunci când nevoile energetice o cer, are loc scindarea moleculelor de ATP, cu formare de ADP și AMP și eliberarea energiei corespunzătoare. Acizii organici din sol apar în urma acțiunii microorganismelor care degradează resturile vegetale și animale, acumulându-se de regulă cantități mari de acid formic și acetic. Aceștia sunt relativ rapid metabolizați, cu excepția acizilor grași cu lanț lung. Metabolismul amidonului este predominat de activitatea genului Clostridium, iar celuloza este degradată sub acțiunea Celvibrio, Cellulomonas, Cytophaga, Plyangium, Sporocytophaga, ciuperci – ascomicete, basidiomicete, actinomicete. Un rol important pentru calitatea nutrițională a solului îl are metabolismul ligninelor, realizată în general de basidiomicete și fungi, fiind a doua sursă de carbon în natură (25-30%).

Ca și indicatori biologici în ceea ce privește calitatea solului de reținut sunt:

conținutul, compoziția și varietatea microbiotei

activitatea microbiană

activitatea enzimatică a microbiotei

1.2.4. Stadiul cercetărilor privind evaluarea fertilității solului

Primele evaluări ale nivelului fertilității solurilor s-au făcut prin: cuantificarea CO2 respirat de sol, în condiții de câmp, prin numărul de bacterii care trăiesc în sol; alți indicatori microbiologici au vizat: capacitatea de nitrificare, fixarea nesimbiotica a azotului molecular, evidențierea bacteriilor din genul Azotobacter, Pseudomons, bacteriile lactice. Numeroase alte asemenea încercări au vizat cuantificarea fertilității solului prin rezultate de analize chimice corelate cu recolta.

Atât în țară cât și pe plan mondial au fost efectuate o serie de cercetări agrochimice și biologice în vederea elaborării unor indicatori care să permită diferențierea fertilității solurilor în funcție de tipul de sol și de măsurile agrofitotehnice.

Indicatorii agrochimici au urmarit să reflecte, prin una sau mai multe însușiri chimice (uneori si fizice) nivelul de fertilitate al unui sol (natural sau influentat antropic) în concepția corelării cu nivelul producției vegetale. Astfel, printre indicatorii agrochimici folosiți pentru aprecierea nivelului de fertilitate a solurilor din România, menționăm:

Indicele de Azot-IN, după care solurile au fost împărțite în:

– soluri sărace in azot, cu IN < 2%;

– soluri asigurate mediu cu azot, cu IN = 2-4%;

– soluri asigurate cu azot, cu IN >4%.

Indicele C/N, după care solurile se clasifică in:

– cernoziomuri sudice, cu C/N = 9,5-11,5;

– podzoluri sudice, cu C/N = 8,0-10,5;

– soluri nisipoase, cu C/N = 8,0-10,0.

Indicele de fertilitate, care realizează clasificarea solurilor prin aplicarea unei formule de calcul.

Împortantă pentru aprecierea nivelului de fertilitate a solului s-a dovedit a fi cuantificarea efectului exercitat de diferite măsuri agrofitotehnice asupra humificării și mineralizării.

Fertilitatea solului, calitatea acestuia depinde însă de un număr mare de proprietăți fizice, chimice, biologice și biochimice ale solului, a căror apreciere necesită selectarea celor mai sensibile proprietăți la schimbarea practicilor manageriale (Elliot E.T., 1994).

Proprietățile biologice și biochimice ale solului îndeplinesc aceste condiții și sunt, de asemenea, sensibile la acțiunea factorilor de mediu, fiind, de aceea, considerate corespunzătoare pentru estimarea fertilității solului.

Evaluarea solului se poate realiza, de asemenea, prin cuantificarea efectelor secundare ale fungicidelor asupra microflorei solului. Astfel, s-a stabilit o listă de indicatori biologici și teste în ordine descrescătoare de sensibilitate (tabelul 1).

Tabelul 1

Sensibilitatea relativă a câtorva indicatori biologici utilizabili

pentru evaluarea efectelor secundare ale fungicidelor

(după Domsch K.H., 1985)

Proprietățile individuale ale solului, biologice și biochimice, nu reprezintă însă măsuri uzuale pentru starea de fertilitate a solului, acestea cunoscând o oscilație sezonieră si spațială. De aceea, este nevoie să se stabilească indicatorii bazați pe combinarea proprietăților solurilor ce reflectă mai bine efectele proceselor majore asupra calității solului.

Dupa 1950, enzimologia solului, ramură noua a biologiei solului, oferă informații prețioase referitoare la fertilitatea solului.

Până în prezent au fost stabiliți, în mod empiric, doar câțiva indicatori bazați pe proprietățile biologice ale solului: Gh. Ștefanic și colab. (1984, 1994) propune "Indicatorul activității biologice", bazat pe exprimarea combinată a activității dehidrogenazei și a catalazei din sol, precum și "Indicatorul activității vitale", bazat pe activitatea respiratorie și pe potențialul celulozolitic al solului. Beck (1984) stabilește "the enzyme number index", bazat pe activitatea a cinci enzime diferite (catalază, dehidrogenază, fosfatază, protează și amilază).

Perucci P. determină "coeficientul de hidrolizare" calculat ca și acetat de fluoresceina hidrolizat de către sol.Trasar-Cepeda C. și colab. (1998) stabilește un "index biochimic al calității solului" ce poate fi folositor pentru detectarea degradării solului, dar și pentru estimarea gradului de refacere a solurilor degradate (sub forma unei expresii simple polinomiale ce definește azotul total în forma biomasei microbiene a solului, a azotului mineralizat și a activității fosfomonoesterazei, ureazei si -glucozidazei din sol).

Cercetările efectuate în țara noastră privind urmarirea proceselor biotice și enzimatice, precum și a efectelor lor, în diferite soluri din România, au demonstrat că determinările parametrilor în aceste domenii, direct în sol sau în probe de sol analizate în cel mult 24 ore de la recoltare nu slujesc la caracterizarea potențialului de fertilitate al solului, ci numai la constatarea momentană a stării solului, a însușirilor din acel moment (Stefanic Gh., 1994).

Analizele biologice direcționate pentru diagnosticarea potențialului fertilității solului trebuie să surprindă nivelul potențial al fiecărei însușiri dinamice a solului, nivel care nu poate fi găsit fără condiționarea probei de sol, în așa fel încât aceasta să nu exprime influența vreunei cauze întâmplătoare, trecătoare, fără urmări importante pentru nivelul de fertilitate al solului.

Faptul că probele de sol se analizează fără condiționare prealabilă explică rezultatele contradictorii întâlnite în literatură, numărul cercetătorilor care afirmă că au reușit să stabilească indicatori ai fertilității solului fiind contrabalansat de numarul celor ce neagă această posibilitate.

Importanța microorganismelor solului în afectarea stării de fertilitate a solului este recunoscută de mult timp, în timp ce influența acestora asupra calității solului a fost demonstrată mai recent. În ultimele decenii au fost puse la punct numeroase metode de determinare a biomasei microbiene a solului și a activității acesteia.

Acestea pot servi la evaluarea solurilor supuse diferitelor practici manageriale în stabilirea potențialului lor de fertilitate, biomasa microbiană a solului fiind mai sensibilă decât determinările chimice ale carbonului organic total și/sau azotului.

Metodele microbiologice au fost comparate într-un număr important de studii, folosind soluri cu diferite proprietăți fizice și chimice. Analizele microbiologice, însă, pot fi utilizate eronat și greșit interpretate ca mijloace de cuantificare a fertilității solului, când rezultatele sunt corelate cu creșterea plantelor și nu cu procesele microbiene și enzimatice proprii solului.

Numărarea microorganismelor solului este una din cele mai vechi tentative de caracterizare a fertilității biologice a solurilor.

Numărarea germenilor totali a fost rapid completată cu numărarea grupelor funcționale, denumite "grupe fiziologice" corespunzătoare germenilor capabili să crească pe un substrat special sau care efectuează o transformare dorită (proteolitică, amilolitică, nitrificantă, fixatoare de azot etc.).

De fapt, se estimează că doar aproximativ 10% din microorganismele solului sunt cunoscute și descrise, existând și o carență privind metodologia de izolare și cultivare a majorității speciilor microbiene viabile din sol.

Luând în considerare cele precizate anterior, rând pe rând au fost creditate și apoi abandonate metode biologice și biochimice de analiză a solului (figura 1), cum ar fi: numărătorile directe și cultivarea microflorei, determinarea potențialelor fiziologice (fixarea azotului, amonificarea, nitrificarea, celuloliza etc.), absorbția de oxigen și degajarea de dioxid de carbon, determinările de biomasă și de activități enzimatice.

Un test de bază pentru diagnosticarea stării și nivelului de fertilitate ale solului rămâne măsurarea nivelului de respirație in vitro, în condiții standard, care nu reprezintă o cucerire modernă a biologiei solului.

Figura 1.1

SOL

MEDIU NEPERTURBAT

PROFIL DE SOL

P R O B E

OMOGENIZARE

PROB{ MEDIE

DILUARE SAU CONCENTRARE

EXAMINARE DIRECT{ CULTURI STUDIUL ACTIVIT{TII

(microscop fotonic sau (diluții în placi, METABOLICE

electronic) culturi selective) (enzime,viteza de utilizare

a nutrienților, producere de

CO2)

REZULTATE REZULTATE REZULTATE

Marimea și numărul Numărul și identitatea Activitatea metabolică

bacteriilor, algelor, microorganismelor care a probei.

protozoarelor; lungimea pot crește pe mediul utilizat

hifelor fungice și a și în condițiile respective.

algelor filamentoase.

APRECIEREA

CANTITATIVĂ ȘI CALITATIVĂ A MICROBIOTEI SOLULUI

1.3 Măsuri si politici de protecție a solului

Modificările cantitative și calitative ale caracteristicilor fizice, chimice și biologice ale solului, implicit ale indicatorilor de calitate ai solului enumerați mai sus sunt cunoscute sub denumirea generală de poluare a solului. Definiția acesteia cuprinde orice acțiune care are ca rezultat reducerea capacității bioproductive și alterarea funcționării normale a solului ca mediu de viață pentru plante.

Poluarea solului poate produce dezechilibre în ceea ce privește conținutul și activitatea microbiotei indiferent de tipul activității poluante (industrială, agricolă, urbană) și indiferent de nivelul la care acestea acționează: fizică, chimică, biologică, radioactivă.

Agricultura prin supraexploatarea sistemelor naturale reprezintă cauza apariției unor efecte nefavorabile solului cum ar fi: eroziunea și alunecarea solului (defrișări masive, pășunat excesiv, practici agricole inadecvate), salinizarea (datorată sistemelor de irigare inadecvată), acidifierea (utilizarea îngrășămintelor azotoase, ploi acide), băltirea (defrișări iraționale, lucrări agricole inadecvate), formarea crustei (ca urmare a incendierii resturilor vegetale), compactarea solului (lucrări agricole mecanizate), reducerea cantității de materie organică și minerale (utilizarea excesivă a îngrășămintelor cu azot, potasiu, ploi torențiale).

Industrializarea accelarată este răspunzătoare de alterarea calității solului prin lucrări de excavare ce modifică structura naturală a acestuia, cantitățile mari de deșeuri industriale rezultate și prin dezvoltarea amplă a municipalităților care aduc odată cu ele deșeuri urbane și un grad ridicat de impermeabilizare a solului.

Toate aceste acțiuni antropice prezentate mai sus au avut ca efect dereglarea unui complex echilibru ce ar trebui să se găsească între factorii biotici și abiotici ai solului. Actualmente, restabilirea acestui echilibru a devenit o preocupare majoră întrucât este esențială menținerea și chiar îmbunătățirea fertilității solului pentru asigurarea calității vieții la nivel mondial.

Măsurile de protecția mediului vizează două direcții, și anume:

îmbunătățirea funciară și

prevenirea, combaterea poluării solului.

Se insistă asupra dezvoltării unor tehnici și practici agricole în conformitate cu normele tehnice de protecție a calității solului.

Productivitatea solului poate fi eminamente crescută prin lucrări cum ar fi:

prevenirea eroziunii solurilor

prevenirea daunelor realizate de ape asupra solului (diguri, desecări, drenaje, regularizarea cursurilor de apă)

irigațiile eficientizate (captarea apei din surse nepoluate, transportul apei, distribuirea acesteia urmată de colectarea și evacuarea surplusului de apă)

ameliorarea unor parametri ai terenurilor nefertile (accidentate, sărăturate, acide)

utilizarea mașinilor multioperaționale în lucrările agricole

desfășurarea lucrărilor agricole în condiții de umiditate corespunzătoare

efectuarea studiilor agrochimice pentru fiecare unitate de producție și stabilirea științifică a tratamentelor și lucrărilor necesare de către instituțiile de specialitate autorizate în acest scop

ameliorarea acidității solurilor prin aplicare de amendamente calcice conform instrucțiunilor

folosirea îngrășămintelor, amendamentelor și pesticidelor aprobate, în doze recomandate

Calitatea solului și nivelele de poluare ale lui sunt precizate în Ord. 756/1997. Forma actualizată a acestui act normativ până la data de 28 iunie 2011 este realizată de către Departamentul juridic din cadrul S.C. "Centrul Teritorial de Calcul Electronic" S.A. Piatra-Neamț prin includerea tuturor modificărilor și completărilor aduse de către: ORDINUL nr. 592 din 25 iunie 2002; ORDINUL nr. 1.144 din 9 decembrie 2002, abrogat de HOTĂRÂREA nr. 140 din 6 februarie 2008; LEGEA nr. 104 din 15 iunie 2011.

(http://legislatie.just.ro/Public/DetaliiDocumentAfis/151788).

Se consideră 2 categorii de sol, în funcție de utilizare: soluri sensibile, prin care se îneleg terenurile cu folosință agricolă, și soluri mai puțin sensibile, care cuprinde terenurile pe care se găsesc construcții civile și industriale și pe care se desfășoară activități economice și tehnice. Ord. 756/97 stabilește pentru cele 2 categorii de folosință, față de valori normale, valorile de prag de alertă și valorile limită de intervenție. Pragul de alertă este valorea poluanților la care trebuie luate măsuri de eliminare a surselor de contaminare iar valoarea de intervenție este concentrația la care trebuiesc aplicate procedee de remediere, de refacere a calității solului.Contaminanții reglementați prin Ord. 756/97 sunt:

Metale (Ag,As,Ba,Be,B,Cd,Co,Cr,Cu,Hg,Mn,Mo,Ni,Pb,Sb,Sn,Tl,V,Zn)

Compuși toxici (Cianuri, Sulfocianuri)

Hidrocarburi aromate mononucleare (BTEX)

Hidrocarburi aromate hidroxilate (fenoli, etc.)

Hidrocarburri aromate polinucleare (HAP)

Hidrocarburi aromate clorurate (Clorbenzeni, Clorfenoli)

Bifenili policlorurați (PCB)

Dioxine, Furani

Pesticide organice clorurate

Pesticide triazinice

În Capitolul 3 sunt prezentate Reglementările privind poluarea solurilor:

Articolul 6. Pragurile de alertă și pragurile de intervenție pentru concentrațiile agenților poluanți în soluri sunt cuprinse în anexa la prezentele reglementări. Aceste valori vor înlocui toate celelalte norme utilizate anterior în România, referitoare la poluarea solurilor.

Articolul 7. Importanța poluării solurilor cu substanțe chimice și alți agenți poluanți care nu sunt incluși în anexă la prezentele reglementări va fi apreciată de către autoritățile competente pe baza unor studii efectuate de unități specializate.

Articolul 8. Prezentele reglementări privind poluarea solurilor se referă atât la folosința sensibilă, cât și la cea mai puțin sensibilă a terenurilor, identificate după cum urmează:

a) folosința sensibilă a terenurilor este reprezentată de utilizarea acestora pentru zone rezidențiale și de agrement, în scopuri agricole, ca arii protejate sau zone sanitare cu regim de restricții, precum și suprafețele de terenuri prevăzute pentru astfel de utilizări în viitor;

b) folosința mai puțin sensibilă a terenurilor include toate utilizările industriale și comerciale existente, precum și suprafețele de terenuri prevăzute pentru astfel de utilizări în viitor;

c) în cazul în care există incertitudini asupra încadrării unei folosințe de teren, se vor considera concentrațiile pragurilor de alertă și de intervenție pentru folosintele sensibile ale terenurilor.

Articolul 9. Relevanta pragurilor de alerta și de intervenție va determina următoarele măsuri:a) situațiile în care concentrațiile de poluanți în sol se situează sub valorile de alertă pentru folosința sensibilă a terenurilor, autoritățile competente nu vor stabili măsuri speciale;b) când concentrațiile unuia sau mai multor poluanți din soluri depășesc pragurile de alertă, dar se situează sub pragurile de intervenție pentru folosința corespunzătoare a terenului, se consideră că există impact potențial asupra solului. În aceste situații, autoritățile competente vor dispune de prevenire a poluarii în continuare a solului și de monitorizare suplimentară a surselor potențiale de poluare;c) când concentrațiile unuia sau mai multor poluanți din soluri depășesc pragurile de intervenție pentru folosința existenta a terenului, se considera ca exista impact asupra solului. d) pentru situația în care este necesar pentru o anumită utilizare ca un teren de folosința mai puțin sensibila sa treacă de categoria de folosința sensibila, trebuie satisfacute cerințe speciale. În astfel de situații, utilizarea terenurilor pentru folosințe sensibile este posibilă, numai dacă concentrațiile de poluanti din sol se încadrează sub nivelul de alertă al folosinței sensibile a terenurilor și dacă sunt satisfacute prevederile art. 10 și, după caz, ale art. 11; e) când pragurile de intervenție sunt depășite la unul sau mai mulți poluanti din sol pentru terenuri cu folosința sensibila sau mai puțin sensibila, autoritățile competente vor dispune executarea unui studiu de evaluare a riscului; f) atunci când sunt implicați mai mulți titulari de activități desfășurate pe un teren afectat de poluare, autoritățile competente vor solicita un singur studiu de evaluare a riscului pentru zona în cauză, iar costul acestuia va fi împărțit între titulari, corespunzător ariei geografice deținute în zona afectată.

Articolul 10. Pentru stabilirea obiectivelor de remediere pe baza interpretării studiilor de evaluare a riscului, autoritățile competente trebuie să decidă dacă: a) pot fi dezvoltate în viitor obiective care implică utilizarea terenurilor pentru folosința sensibilă sau mai puțin sensibila a terenurilor; b) terenul poate rămâne în continuare în folosința curenta, dar folosința nu mai poate fi extinsă;c) trebuie luate măsuri de remediere.

Articolul 11.În situațiile când sunt necesare lucrări de remediere, autoritățile competente vor stabili obiectivele de remediere, luând în considerare următoarele:a) aceste obiective de remediere, reprezentând concentrațiile finale de poluanti din soluri după realizarea lucrărilor de depoluare, se vor situa fie sub pragurile de alerta fie sub pragurile de intervenție.

Articolul 12. Prelevarea și analizarea probelor de sol se va face în conformitate cu următoarele prevederi:a) prelevarea de probe de soluri în scopul estimării nivelului de poluare se va face în conformitate cu prevederile Ordinului ministerului apelor, pădurilor și protecției mediului nr. 184/1997 privind Procedura de realizare a bilanțurilor de mediu;b) laboratoarele care executa analize de poluanti din soluri vor utiliza probe de referința pentru a confirma acuratețea și precizia tehnicilor analitice folosite.

CAPITOLUL II. MICROBIOTA TELURICA – DEFINITORIE PENTRU REALIZAREA CIRCUITULUI AZOTULUI ÎN NATURĂ

2.1 Circuitul azotului în natură

În natură, organismele vii sunt implicate în permanență în sinteza de compuși celulari proprii pentru a obține energia necesară desfășurării funcțiilor vitale, pe baza elementelor preluate din sol, apă, atmosferă. Astfel, datorită acțiunii plantelor, animalelor și microorganismelor diferite elemente biogene sunt supuse transformării repetate din formă anorganică în formă organică și invers, într-un circuit în care microorganismele în funcție de condițiile biologice ale solului au un rol esențial. Transformările diferitelor elemente chimice nu se produce în mod izolat, ci realizează cicluri perfect articulate între ele.

Cea mai mare rezervă de azot din natură este reprezentată de azotul molecular atmosferic , un grup de microorganisme fiind specializate în integrarea acestuia în sinteze proteice, introducându-l în circuitul materiei în natură. Procesul are o deosebită importanță pentru fertilitatea solului.

Prima fază în circulația azotului în natură este fixarea biologică, proces prin care azotul molecular atmosferic este introdus sub formă organică în circuitul materiei în natură, sub acțiunea microorganismelor fixatoare de N (Azotobacter, Rhiyobium, Clostridium pasteurianum etc). Pe lângă această sursă de azot, în sol mai există azot proteic din degradarea resturilor vegetale sau animale, care supuse acțiunii microflorei proteolitice de putrefacție, apoi a microflorei amonificatoare (amonifierea reprezintă a doua etapă a ciclului), azotul este eliberat sub formă de amoniac. O parte din acest amoniac se degajă în atmosferă, de unde este readus la nivelul solului prin precipitații. Amoniacul din sol poate fi utilizat de microbiotă pentru sinteze organice proprii sau poate intra în cea de-a treia fază a ciclului azotat prin procesul de nitrificare. Astfel, amoniacul este transformat inițial în nitriți (sub acțiunea nitritbacteriilor), apoi în nitrați (sub acțiunea nitratbacteriilor). Nitriții și nitrații de la nivelul solului mai pot proveni din oxidarea azotului atmosferic sub acțiunea descărcărilor electrice și a razelor UV, fiind aduși de precipitații. Nitrații sunt folosiți de sistemul radicular al plantelor terestre sau de plantele acvatice dacă ajunge din nou în mediul acvatic. O parte din azotul nitric din sol poate fi pierdut sub formă de nitriți, amoniac sau chiar azot atmosferic prin acțiunea microorganismelor de denitrificare. Astfel, spre deosebire de fazele anterioare ale ciclului azotului, denitrificarea reprezintă un fenomen dăunător calității mediului, favorizând sărăcirea solului în substanțe azotate asimilabile de plante.

Așadar, principalele transformări ale azotului în natură sunt rezultatul microbiotei prin care se realizează fie trecerea azotului organic din resturile materiale în forma anorganică, fie prin trecerea azotului atmosferic în forma organică, asimilabilă.

Figura 2.1. Circuitul azotului în natură (după Wikipedia, encyclopedia liberă)

Imobilizarea biologică a azotului are loc în celula microorganismelor și trece prin stadiul formării aminoacizilor și apoi al formării proteinei microbiene.

Cercetările au arătat că imobilizarea biologică are loc în cursul a 45 de zile, perioadă în care azotul mineral introdus poate fi întâlnit în toate fracțiunile organice (azot aminic, amidic, hexozaminic). Totalitatea transformărilor pe care le suferă azotul în atmosferă, dintre care cele mai importante sunt de natură microbiană, constituie ciclul azotului. Circuitul azotului în natură cuprinde etapele:

Fixarea azotului atmosferic

Amonificarea

Nitrificarea

Denitrificarea

Figura 2.3. Circuitul azotului – reacțiile biologice

2.2 Fixarea biologică a azotului atmosferic

Aceasta reprezintă etapa esențială din ciclul azotului în natură întrucât în lipsa acesteia rezervele de N combinat din sol ar dispărea. Se află sub stricta coordonare a microorganismelor solului, acest aspect fiind demonstrat încă din 1888, când Berthelot a realizat un experiment cu două tipuri de sol, unul sterilizat și altul nesteril, de grădină, care a fost menținut în două recipiente câteva zile în condiții de temperatură și umiditate, fără să se dezvolte vreo plantă în recipiente. Rezultatul a constat în faptul că în solul steril nu s-a acumulat N, spre deosebire de cel steril și, mai mult decât atât, după amestecarea solului steril cu sol nesteril, acesta a devenit capabil să fixeze azot atmosferic. S-a ajuns astfel la concluzia că responsabile de fenomenul acumulării de N la nivelul solului sunt microorganismele telurice. Acest fenomen de captare și fixare a azotului atmosferic este întâlnit la o serie de microorganisme din sol, și anume:

bacterii libere aerobe: Azotobacter sp.,Beijerinckia sp.;

bacterii libere anaerobe: Clostridium pasteurianum;

bacterii simbiotice din nodozitățile leguminoaselor: Rhizobium leguminosarum;

bacterii fotosintetizante: Rhodospirilum rubrum;

bacterii oligonitrofile- trăiesc pe medii sărace în azot: Bacillus, Pseudomonas, Bacterium;

bacterii banale ca Aerobacter, B. Asterosporus;

alge din genul Nostoc.

Fixarea aerobă a azotului molecular

Fixarea aerobă a azotului atmosferic se face de către microorganisme aparținând genurilor Azotobacter și Beijerinckia. Genul Azotobacter este reprezentat din germeni gram negativi, fiind răspândiți la nivelul ecosistemelor acvatice, dar mai ales în solurile cultivate și bogate în humus. Deși caracterizate de rezistență, lipsesc în solurile acide, podzolice, mlăștinoase, turboase.

Genul cuprinde o mulțime de specii, reprezentativă fiind Azotobacter chroococcum, cu aspecte morfologice definitorii și un ciclu de diviziune specific. Pe mediile de cultură tulbură mediul, formează la suprafață un văl gros sau formează colonii lucitoare care cu timpul devin negre. Temperatura optimă de dezvoltare este de 280 C, la un pH de 7,6 fiind foarte sensibil la aciditate. Este un germen strict aerob, pentru fiecare gram de glucoză oxidată fixând aproximativ 20 mg azot. Așadar, pentru a se dezvolta și desfășura rolul de fixator de azot, acest gen are nevoie de oxigen și o sursă de carbon, ce poate fi glucoză, hexoze sau compuși organici de tipul alcoolilor sau acizilor.

Fixarea anaerobă azotului molecular

Este realizată de specia Clostridium Pasteurianum , foarte răspândită în sol, bacil gram pozitiv care se dezvoltă optim la 20-300C, pH între 8,9- 7,3. Poate fixa azot dacă este cultivată într-un mediu cu hidrocarbonați pe care îi va fermenta cu producere de acid butiric, iar cu energia produsă din fermentarea glucidelor va fixa azotul atmosferic. Fixează de regulă 3mg de azot atmosferic la 1 g glucoză fermentată. Astfel, dezvolatarea Clostridium pasteurianum este bine conturată în solurile cu resturi vegetale și animale care prin descompunere generează substanțe carbonate organice. Acest tip de fixare azotului are rol esențial în mediile anaerobe cum ar fi: soluri puțin aerate, invadate de ape, orezării, mlaștini, bazine de apă, unde C. pasteurianum este singurul fixator de azot.

Fixarea simbiotică a azotului molecular

Microorganismele simbiotice, aparținând genului Rhizobium, trăiesc în nodozitățile de pe rădăcinile leguminoaselor. Există diferite specii de Rhizobium, în funcție de planta leguminoasă cu care dezvoltă relație de simbioză: R. Leguminosarum, R. Trifolii, R. Japonicum, R.phaseoli, R.lupini, R. Meliloti. Activitatea acestora este diferită în funcție de infecțiozitatea microorganismului și de capacitatea de a fixa azot. Nodozitățile se formează în urma infectării rădăcinilor plantelor cu una din speciile de Rhizobium, pe baza unui fenomen de chemotactism, acestea putând fi eficiente (conțin un pigment roșu numit leghemoglobină și la nivelul lor se produce fixarea azotului) și ineficiente, cu o activitate de fixare mai redusă. Se pare că simbioza plante-bacterii are ca substrat schimbul de materie dintre acestea și anume: bacteria utilizează substanțele glucidice produse de plante pentru a-și procura energia necesară fixării azotului, iar bacteriile fixează azotul favorizând producerea de aminoacizi necesari sintezei proteice a leguminoaselor. Prin această relație de simbioză, leguminoasele devin independente de necesitatea de a se dezvolta numai pe soluri bogate în substanțe azotate. Fixarea biologică a azotului atmosferic de către microorganisme este un proces vital pentru toate viețuitoarele de pe Pământ întrucât deși azotul este în cantități foarte mari pe suprafața terestră, se află într-o formă inaccesibilă formelor de viață. Prin procesul de fixare biologică, azotul atmosferic este introdus în circuitul natural prin care se asigură în permanență necesarul de azot anorganic din sol care în lipsa acestui proces s-ar epuiza rapid.

Studiile arată că fără aport de îngrățăminte organice bacteriile fixatoare de azot dau 20-50 kg de azot la hectar în cursul unei perioade de vegetație, iar după introducerea îngrășpmintelor organice activitatea fixatoare se accentuează intens.

2.3 Amonificarea

Amonificarea poate fi definită ca procesul biologic prin care se eliberează în sol amoniac ca urmare a acțiunii microflorei solului asupra moleculelor aminate rezultate din descompunerea substanțelor proteice. Substanțele care conțin azot de la nivelul solului sunt reprezentate de rezervele humice, de compuși rezultați în urma fixării biologice a azotului molecular și de produși aminați proveniți din descompunerea resturilor organice. Procesul de amonificare presupune transformarea tuturor acestor compușu în forma minerală și mai apoi sub formă de amoniac. Pentru ca amonificarea să fie posibilă, este necesară inițial hidrolizarea sub acțiune bacteriană a substanțelor proteice. Astfel, proteinele trec prin fazele intermediare până la stadiul de aminoacizi, care vor fi apoi supuși la nivelul citoplasmei bacteriene procesului de dezaminare, cu formare de amoniac și acid organic corespunzător aminoacidului. Procesele de dezaminare sunt de diferite tipuri: hidrolitică, hidrolitică asociată cu decarboxilare, reducătoare, reducătoare asociată cu decarboxilare, oxidativă cu decarboxilare, cu desaturare. Pe lângă amoniac , așa cum am spus mai sus, se formează și acizi organici: acetic, formic, propionic, butiric, valerianic care, în funcție de condițiile de mediu și de microbiota responsabilă de tipul solului respectiv, pot fi complet metabolizați, acumulați, transformați în alcooli sau reduși.

Principalul rezultant din procesul de amonificare, amoniacul, poate urma mai multe căi de utilizare: poate fi refolosit ca atare de o serie de microorganisme, poate fi supus unor modificări suplimentare (nitrați, nitriți), se poate acumula ca atare în sol ( soluri acide) sau se poate evapora. Microorganismele capabile de reacția de amonificare sunt de mai multe tipuri:

Bacili sporulați: B. mycoides, B. mesentericus, B. megaterium, B.subtilis, B.sporogenes, B. perfringens;

Bacili nesporulați: Proteus vulgaris, B. fluorescens, B. prodigiosum, E. Coli;

Coci: Sarcina lutea ;

Actinomicete: până la acest nivel producerea de amoniac este intensă.

Mucegaiuri :la intrarea acestora în acțiune, cantitatea de amoniac începe să scadă probabil datorită faptului că mucegaiurile folosesc amoniac pentru sintezele proprii.

2.4 Nitrificarea

Nitrificarea constă în transformarea sărurilor de amoniac rezultate din faza anterioară în nitrați, aceștia fiind formele cele mai accesibile plantelor verzi. În același timp, sub această formă, azotul poate fi supus risipirii sale, nitrații fiind forme foarte solubile, care pot fi spălate de ploaie, pot fi reduse la amoniac sau chiar la azot molecular prin denitrificare. Procesul se desfășoară în două etape: faza de nitritare, finalizată cu formare de nitriți și fază de nitratare, finalizată cu formare de nitrați. Se pare că cele două populații de microorganisme implicate sunt în strânsă legătură, dat fiind faptul că în sol nu se poate surprinde stadiul de nitrit, spre deosebire de cercetările de laborator care descriu constant acest stadiu. Nitratbacteriile acționează rapid asupra nitrților formați, nepermițând acumularea lor pentru a împiedică efectul lor toxic asupra plantelor. Reacțiile de oxidare ce au loc sub acțiunea bacteriilor nitrificatoare sunt generatoare de energie care va fi utilizată de aceste microorganisme să își sintetizeze materia organică proprie pornind de la CO2 și apă. Așadar, ele sunt bacterii chimiosintetizante, obligatoriu aerobe, răspândite în toate tipurile de sol în care se găsesc amoniac sau nitriți și o sursă de carbon mineral din CO2 sau carbonați.

Nitritbacteriile : Nitrosomonas europaea, N.oligocarbogenes, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosocystis,Nitrosogloea sunt cele implicate în oxidarea sărurilor amoniacale în nitriți, trecând prin fazele intermediare de: hidroxilamină, dihidroxiamină, nitrit.

Nitratbacteriile : Nitrobacter vinogradskii, N.agilis, Nitrocystis, Bactoderma alba, B. rosea, Microderma minutissima, M.vacuolata realizează oxidarea nitriților la nitrați.

Per ansamblu, nitrificarea reprezintă procesul prin care substanțele azotate sunt transformate într-o fază asimilabilă plantelor, numărul agenților bacterieni nitrificatori fiind direct proporțional cu gradul de fertilitate a solului respectiv. Dat fiind faptul că aceste bacterii sunt strict aerobe, se înțelege de ce solurile lucrate, bine aerate au o mai mare fertilitate față de cele înțelenite. Tipuri diferite de sol vor prezenta grade diferite ale activității de nitrificare. De exemplu, podzolurile, cu excepția celor bogate în humus carbonatat, această activitate este foarte redusă, în timp ce solurile turboase, amendatate cu calcar prezintă o intensă activitate. O activitate superioară a bacteriilor nitrificatoare s-a observat în primii 20 de cm de la suprafața solului, precum și în solurile saturate cu baze. În zonele de pustiu și stepă, aerația și umiditatea reprezintă factori limitatori ai dezvoltării microbiotei nitrificatoare care necesită un anume grad de umiditate , respectiv mediu oxigenat corespunzător. Dintre efectele negative ale procesului de nitrificare, de reținut este solubilizarea excesivă a azotului sub formă de nitrați, putând fi spălați de apele fluviale în cantități importante.

2.5 Denitrificarea

Denitrificarea este ultima etapă a circuitului azotului în natură și presupune întoarcerea azotului molecular în atmosferă. Nitrații formați la nivelul solului sub acțiunea microorganismelor nitrificatoare pot urma diferite căi: utilizare de plante, asimilare de microorganismele telurice, spălare de apele fluviale sau reducere prin fenomenul de denitrificare prin acțiunea unor microorganisme, cu formare de azot molecular, amoniac sau stadii intermediare (nitriți, acid hiponitros). Este un proces care necesită condiții de anaerobioză, de aceea este mai intens în solurile saturate cu apă și profunde, unde sunt disponibile anumite microorganisme:

Bacterii denitrificatoare propriu-zise care au capacitatea de a transforma nitrații direct în azot molecular: Achromobacter severinii ( B.denitrificans), B.denitrificans agilis, B.nitroxus, B. Stutzerii etc.

Bacterii cu capacitatea de a transforma nitrații în nitriți, foarte răspândite în microflora banală a solului: B.megaterium, E. Coli, Ps.aeruginosa etc.

Bacterii sulfuroase: Thiobacillus denitrificans.

Există multiple puncte de vedere în ceea ce privește efectul benefic sau dăunător al acestui ultim pas al circuitului azotului în natură. Transformarea nitraților în azot molecular care poate fi supus evaporării este considerată realmente o pierdere de substanțe minerale din solul respectiv. Pe de altă parte, azotul gazos poate fi preluat de fixatorii anaerobi de azot din genul Clostridium. Formarea de amoniac este favorabilă pentru unele microorganisme care îl folosesc ca atare pentru sintezele proprii, iar formele intermediare ca nitriții sunt preluate de bacteriile nitratformatoare și oxidate la nitrați. Condițiile principale care stau la baza pierderii de azot sunt: slaba ventilație a solului, umiditatea în exces, prezența în sol a unor substanțe organice lipsite de azot. La solurile cultivate, întrunirea concomitentă a acestor condiții este dificil de realizat. De exemplu, cernoziomurile, deși au condiții de pH, temperatură, umiditate, substrat microbiotic care să favorizeze denitrificarea, datorită lipsei de substanță organică neazotată, procesul de denitrificare nu este foarte accelerat.

2.6. Bilanțul general al circuitului azotului

În cadrul bilanțului general al circuitului azotat trebuiesc luate în considerație, pe de o parte câștigurile, iar pe de altă parte pierderile de azot.

Câștigurile de azot se realizează prin :

– fixarea biologică (simbiotică și nesimbiotică) a azotului molecular ;

– aportul de azot adus de apele de precipitații și pulberile atmosferice. Apa de ploaie conține azot amoniacal, nitric și nitros, provenit din sol sau apele oceanice, rezultat în urma descărcărilor electrice sau din fumul industrial ;

– absorbția amoniacului din atmosferă de coloizii organici ai solului;

– aportul adus de îngrașăminte ;

Pierderile de azot se pot produce prin :

– denitrificarea biologică (singura pierdere reală din punct de vedere agricol deoarece reducerea la nitrați sau amoniac este un fenomen reversibil) ;

– volatizarea amoniacului gazos în cazul solurilor fertilizate cu îngrașăminte minerale, în speță cele cu azot, sau organice, pierderile de amoniac în solurile nefertilizate sunt reduse datorită tendinței puternice de fixare a NH4+ în sol și datorită nitrificării rapide a acestuia ;

– descompunerea chimică a nitraților ;

– reacția Van Slyke care constă în cuplarea unor acizi aminici cu nitriții și eliminarea azotului molecular; descompunerea nitraților

– levigarea, ce afectează atât azotul mineral din îngrășământ cât și azotul propriu solului rezultat în urma proceselor de mineralizare a substanței organice, situație produsă atunci când în soluri există un dezechilibru între aceste două procese de demineralizare.

– eroziunile sunt în funcție de climat, tipul de sol, covorul vegetal etc.

În general între pierderile și câștigurile de azot există un echilibru dinamic care asigură menținerea și perpetuarea vieții pe pământ.

2.7. Ecologia bacteriilor ce realizează circuitul azotului

Deoarece dintre organismele care realizează circuitul azotului în natură bacteriile dețin ponderea cea mai mare, sunt necesare cateva referiri la ecologia și sistematica acestora.

Speciile de Azotobacter sunt prezente aproape în toate solurile, deosebit de mare este însă frecvența în solurile cultivate, fertile. Rizosfera restrânsă a plantelor superioare este în special preferată de aceste bacterii. Pot fi izolate chiar și din fluvii și ape sărate.

Speciile de Azotobacter trăiesc în soluri neutre sau alcaline în limite de pH cuprinse între 5,8 și 8,5. Au fost izolate însă și tulpini care rezistă la un pH mai mic (4,6).

Optimul de temperatură pentru Azotobacter este de 28ºC. În ceea ce privește cerințele față de oxigen se știe că Azotobacter este un aerob strict, dar rezistă și la concentrații mici de oxigen apropiate de anaerobioză. În asemenea condiții, fixarea azotului se desfășoară cu un randament mic. Fiind un microorganism heterotrof, Azotobacter are nevoie de substanțe organice ca surse de carbon, energie și rol plastic. Dintre substanțele existente în sol, Azotobacter nu utilizează nici celuloza, nici hemiceluloza, nici substanțele humice deși în privința substanțelor organice simple, microcelulare, este foarte polivalent utilizând hexoze, pentoze, dextrine, amidon, alcooli, polialcooli, săruri ale acizilor organici etc. Randamentul fixării azotului molecular de către Azotobacter este foarte variabil în funcție de tulpină, de sursa de carbon, de prezența anumitor elemente minerale. În general, randamentul fixării azotului molecular de către Azotobacter este de 1% față de carbonul utilizat. Acest fapt se datorează utilizării energiei carbonului în cea mai mare parte la desfășurarea metabolismului intercelular și sinteza macromoleculelor proteice și numai în mică măsură la fixarea propriu-zisă a azotului. Dacă în sol există azot nitric, acesta influențează fixarea de către Azotobacter în funcție de concentrație. Speciile de Azotobacter resimt foarte puternic influența și lipsa elementelor minerale din sol sau din mediul de cultură, de unde s-a ajuns la ideea utilizării lor ca test biologic pentru constatarea diferitelor carențe.

Cerințele Azotobacterului pentru fosfor sunt destul de ridicate. În aceste condiții pentru fixarea de 5 mg de azot, Azotobacter metabolizează 1 mg fosfor. Calciul este necesar în cantități mai mici de 0,001 milimoli și se presupune că participă în însuși fenomenul de fixare a azotului. Fierul este necesar în doze de 0,0001 milimoli atât în medii cu azot cât și în medii lipsite de azot combinat. Cantitatea de magneziu necesară pentru dezvoltarea normală a Azotobacterului este aproximativ egală cu cea de calciu. S-a constatat că se consumă cam 0,36 mg magneziu pentru 1g de azot fixat. Molibdenul este necesar numai în lipsa sărurilor amonicale, iar în lipsa nitraților cerințele sunt foarte mici. Se pare că molibdenul intră în compoziția unei enzime care reduce nitriții la amoniac și care participă activ la procesul de fixare a azotului combinat. Azotobacterul nu fixează azotul molecular combinat. De asemenea mai sunt necesare următoarele microelemente : Cu, Mn, Al, Zn, Ba, Si, As. Foarte des se întâlnește în sol conviețuirea dintre speciile de Azotobacter și bacteriile celulozolitice. Speciile de Azotobacter furnizează bacteriilor celulozolitice produși de autoliză, bogați în proteine și obțin în schimb, produși de degradare ai celulozei ca : celobioză, glucoză, acidul acetic, acidul propionic etc., pe care le folosesc ca sursă de energie. Există de asemenea, o simbioză cu algele din sol. În această simbioză, speciile de Azotobacter primesc din partea algelor hidrații de carbon și dau în schimb diferiți compuși proteici. În funcție de condițiile fizico-chimice, biologice și climatice diferă și răspândirea fixatorilor de azot. Cei mai importanți factori pedologici care influențează răspândirea Azotobacterului sunt: umiditatea, aciditatea, precum și cantitatea substanței organice din sol. Fiind o bacterie aerobă, Azotobacterul este răspândit mai ales în terenurile prelucrate. În solurile grele, argiloase, în care condițiile sunt apropiate de anaerobioză, Azotobacter poate să lipsească. În schimb, în solurile prelucrate de grădină, precum și în solurile de pădure, Azotobacter se găsește până la o adâncime de 2 m. De asemenea, Azotobacter este puțin răspândit în solurile ce conțin prea puțin carbonat de calciu și au o reacție puternic acidă așa cum se întâmplă, de exemplu, în solurile tropicale. Umiditatea solurilor influențează distribuția fixatorilor azot în sensul că Azotobacter predomină în solurile bine aerisite și neinundabile. În solurile lipsite de fosfor, Azotobacter se poate găsi în stare latentă. În această situație administrarea de îngrășăminte fosfatice stimulează dezvoltarea intensă a Azotobacterului și prin aceasta se îmbogățește bilanțul azotului combinat din sol.

Speciile genului Clostridium sunt răspândite și în solurile afânate, aerisite, numai că în acest caz ele intră în relație de metabioză cu diferite specii aerobe, care consumă oxigenul din sol. Această metabioză este avantajoasă deoarece bacteriile aerobe, consumând oxigenul din imediata apropiere a Clostridiilor nu consumă și azotul molecular care este strict necesar vieții acesteia. Clostridium, fixând azotul atmosferic îl redă parțial în formă combinată în mediul ambiant, ceea ce îmbunătățește condițiile de existență a bacteriilor aerobe. Pe baza acestor metabioze se constituie o biocenoză care poate exista și în condițiile unei lipse aproape totale de azot combinat în mediu.Toleranța față de oxigen și metabioza cu bacteriile aerobe fac din Clostridium un fixator de azot mai răspândit decât Azotobacter.

Activitatea bacteriilor din nodozități este dependentă de anumite condiții. Bacteriile din nodozități necesită pentru activitatea lor, compuși ai carbonului. La întuneric, bacteriile din nodozități încetează treptat activitatea de fixare a azotului. De asemenea, valorificarea oxigenului și producerea de acizi sunt în legătură cu nutriția hidraților de carbon. Dintre compușii cu azot se folosesc de preferință peptone și aminoacizii. Bacteriile din nodozități sunt aerobe. Chiar dacă își desfășoară cea mai mare parte a activității la un conținut normal de oxigen al aerului din sol, totuși ele posedă o mare putere de adaptabilitate pentru limite mici ale conținutului de oxigen în sol. Limita inferioară la care speciile de Rhizobium sistează fixarea azotului este la un conținut de 5% O2.

Speciile de Rhizobium nu sunt răspândite în toate solurile în care trăiesc și plantele gazdă din flora spontană sau cultivată. În solurile care nu au fost cultivate cu leguminoase, deloc sau scurt timp, iar condițiile locale nu permit înmulțirea speciilor de Rhizobium, introducerea unei leguminoase necesită înocularea solului sau a semințelor. Speciile de Rhizobium se dezvoltă bine în special în rizosfera intimă a leguminoaselor, dar și în cea a majorității plantelor. Bacteriile din nodozități pot trăi în sol mai mulți ani și fără simbioza cu plantele leguminoase, putându-și păstra capacitatea de infectare. Aprovizionarea cu substanță organică acționează extrem de favorabil asupra menținerii densității și capacitatea de infiltrare. Cu cât se resimte lipsa culturilor de leguminoase, cu atât se reduce mai mult capacitatea lor de înmulțire în sol. Formarea nodozităților este optimă la pH = 7, sub pH = 5 scade repede, iar la pH = 4 încetează. Temperatura solului influențează și asupra activității speciilor de Rhizobium. Ele sunt foarte sensibile la temperaturi scăzute. Activitatea lor se oprește la temperaturi cuprinse între 10 – 12 °C, în timp ce asimilația plantelor continuă.

Reacția solului exercită o influență deosebită asupra fenomenelor de amonificare. Acest proces de amonificare decurge cel mai intens în condiții neutre dar spre deosebire de nitrificare este numai slab inhibată de reacția slab acidă până la acidă. Cu cât se realizează mai favorabil condițiile pentru nitrificare (odată cu creșterea valorii pH), cu atât devin mai nefavorabile condițiile pentru amonificare. Un factor foarte important pentru amonificare este aerisirea solului. Într-un sol rău aerisit, proteoliza este incompletă. Se formează numeroși produși intermediari care nu pot fi folosiți de plante și care influențează mai degrabă în mod nefavorabil reacția și proprietățile chimice ale solului. Microorganismele amonificatoare sunt mai puțin sensibile decât cele nitrificatoare la aceste condiții. Aerisirea este strâns legată de textura și structura solului. O structură glomerulară stabilă la apă oferă în general cele mai favorabile premise pentru o proteoliză nestânjenită. Există o dependență față de temperatura solului în sensul că la 20 – 25°C se poate observa intensitatea cea mai mare a procesului de descompunere. Cu cât este mai mare devierea de la acest optim, cu atât proteoliza este mai inhibată. Procesul de nitrificare depinde de variațiile factorilor locali.

Temperatura optimă pentru bacteriile nitrificatoare este cuprinsă între limitele de 25-30 °C, o temperatură mai mare de 50 °C începe să frâneze activitatea acestora. Aerisirea solului este în strânsă corelație cu umiditatea. Un conținut prea ridicat de apă reduce aprovizionarea cu oxigen a bacteriilor nitrificatoare. Dacă umiditatea solului crește peste 80 % din capacitatea sa pentru apă, atunci nitrificarea este serios inhibată. Bacteriile nitrificatoare sunt sensibile la reacția acidă a solului. Totuși sfera lor optimă de răspândire este destul de mare, fiind cuprinsă în general între valori de pH = 6 – 9. Sub pH = 5 formarea nitratului este puternic inhibată, iar la pH = 4 încetează în întregime. Un rol important în desfășurarea nestânjenită a nitrificării îl au microelementele: Ca, Mg, Fe, Cu. Procesele de amonificare și nitrificare sunt supuse unei dinamici sezoniere. Resturile vegetale ce se acumulează în sol la sfârșitul perioadei de vegetație sunt numai parțial descompuse din cauza temperaturii scăzute a solului iarna. De abia la începutul perioadei de vegetație se poate observa o creștere a amonificării și nitrificării; ambele procese culminează în lunile de vară, fiind întrerupte numai în cursul unei perioade de maximă uscăciune. Importanța substanțelor organice din sol ca sursă de energie pentru bacteriile denitrificatoare a fost multă vreme necunoscută. Temperatura optimă pentru denitrificare oscilează în general între 27 si 30ºC. Reacția solului influențează de asemenea, procesul de denitrificare. La pH = 6 denitrificarea aproape că nu variază. Influenței umidității solului i s-au atribuit totdeauna o mare importanță în procesul denitrificării. Se consideră că denitrificarea are loc numai într-un sol saturat cu apă. În lipsa oxigenului creșterea umidității solului nu intensifică denitrificarea. Umiditatea influențează denitrificarea numai în funcție de presiunea oxigenului din sol. În general, capacitatea de denitrificare variază în același sens cu fertilitatea solului.

Microflora denitrificatoare nu trebuie privită deci ca patologică. Ea este mai mult o componentă a microflorei obișnuite a solului.

2.8. Sistematica bacteriilor ce realizează circuitul azotului

După Bergey’s Manual of Determinative Bacteorology, ediția 1984, bacteriile fac parte din :

Regnul Procariotae

Secțiunea 4. Coci și bacilli aerobi Gram negativi.

Familia Rhizobiaceae

Genul Rhizobium cu speciile :

– Rhizobium leguminosarum

– Rhizobium trifolii

– Rhizobium phaseoli

– Rhizobium meliloti

– Rhizobium lupini

– Rhizobium japonicum

Genul Agrobacterium cu specia Agrobacterium tumefociens

Familia Azotobacteriaceae

Genul Azotobocter cu speciile :

– Azotobacter chorococcum

– Azotobacter vinelandii

– Azotobacter agilis

– Azotobacter insignis

– Azotobacter macroocytogen

Familia Pseudomonadaceae

Genul Pseudomonas : Pseudomonas putida

Alte genuri cu speciile fixatoare de azot care aparțin secțiunii 4 (nu sunt încadrate în familii) :

Genul Beijerinckia cu speciile :

– Beijerinckia indica

– Beijerinckia mobilis

– Beijerinckia lacticogenis

– Beijerinckia fluminensis

Genul Derxia cu speciile : – Derxia gumosa, Derxia indica

Secțiunea 13. Coci și bacile Gram pozitivi sporulați

Genul Bacillus cu speciile :

– Bacillus mycoides

– Bacillus mesentericus

– Bacillus megatherium

– Bacillus subtilis

– Bacillus putrifiens

– Bacillus circus

– Bacillus probates

Genul Clostridium cu speciile :

– Clostridium pasteurianum

– Clostridium sporogenes

– Clostridium putrificum

– Clostridium perifrigens

– Clostridium butyricum

– Clostridium acetobutyricum

Secțiunea 5. Bacili Gram negativi facultative anaerobi

Familia Enterobacteriaceae

Genul Proteus cu specia Proteus vulgaris

Genul Escherichis cu Escherichia coli.

Secțiunea 12. Coci Grami pozitivi

Familia Micrococcoceae

Genul Micrococcus cu specia Micrococcus ureae.

Secțiunea 15. Bacili Gram pozitivi neregulați, nesporulați

Genul Arthrobacter cu specia Arthrobacter agropyri

Secțiunea 12.

Genul Nocardia cu specia Nocardia braziliensis

Secțiunea 11. Bacterii Gram negative, vibrioide, helicale, aerobe, microaerofile

Genul Spirillum cu specia Spirillum volutans.

CAPITOLUL III. PRINCIPIILE DE BAZĂ PRIVIND PRELEVAREA PROBELOR DE SOL SI EFECTUAREA ANALIZELOR MICROBIOLOGICE

3.1. Recoltarea probelor de sol pentru analize biologice

Probele de sol se recoltează cu ajutorul unui burghiu pentru a se preleva cantități egale de sol pentru fiecare probă. Adâncimea de la care se face recoltarea depinde de parametrul urmărit în determinările biochimice, dar și de condițiile meteoro-climatice care pot determina migrarea diferiților compuși chimici. Astfel, azotul se dizolvă complet în apă și migrează în straturile de la suprafața solului, iar sărurile de amoniu în urma ploilor abundente, prin solubilizare migrează la o adâncime de 45-60 cm sau chiar mai mult. Spre deosebire de compușii azotați, fosforul și potasiul sunt greu solubili în apă, deci nu migrează ca urmare a modificării cantității de precipitații și se vor găsi la adâncimea de recoltare standard de 0-20 cm. Pentru măsurarea conținutului de azotat din sol, probele de sol se recomandă a se preleva la temperaturi sub 10 C pentru că la această temperatură procesul de mineralizare este minim. Probele de sol pentru analiza oricărui alt element pot fi prelevate în orice perioadă a anului. Pentru obținerea unei probe reprezentative de sol este necesară recoltarea de sub-probe. Acestea se recoltează în formă de tablă de șah, într-un număr de minim 20 de sub-probe pe câmp. Se sfătuiește să fie evitate porțiunile neunifrome (gropi, depresiuni, margini, brazde moarte, suprafețe diferite ca textură sau culoare față de majoritatea câmpurilor) ale suprafeței sau cele prelucrate cu ierbicide sau îngrășăminte.

În general, probele de sol se recoltează de la 15 cm adâncime, fiind transferate în recipiente sterile. Pentru fiecare probă se prelevează 3-5 mostre care se omogenizează. Din materialul omogenizat se rețin 10-25 g de sol pentru proba reprezentativă. Pentru prelevare de probe de la alte adâncimi se utilizează un burghiu corespunzător.

Important pentru procesul recoltării solului este sterilizarea recipientelor de recoltare care asigură dezvoltarea unei culturi în condiții aseptice. Sterilizarea se poate realiza pe baza căldurii uscate, căldurii umede ( vapori de apă sub presiune din autoclav), prin substanțe chimice sau prin radiații. Recipientele se sterilizează prin păstrarea lor timp de 15 minute la temperatura de 121 C în autoclav, iar sterilizarea mediilor de cultură se realizează prin menținerea lor timp de 20 de minute în aceleași condiții. Sterilizarea la rece constă în utilizarea unor filtre din celulozo-acetat, celulozo-nitrat sau policarbonat cu pori de dimensiuni foarte mici (0,4-0,2 microni) care pot reține microorganismele nedorite. Alături de aceste metode de sterilizare, ca și modalități adjuvante pentru asigurarea asepsiei în cercetarea microorganismelor se mai utilizează hotele cu flux laminar, dezinfectanți, radiații UV. Pentru recoltarea corespunzătoare este necesară o trusă pedologică de teren:

Acid clorhidric-pentru identificarea carbonaților

Clorură de bariu-pentru identificarea sulfaților

Azotat de argint pentru identificarea carbonatului da Na

Fenolftaleina 1% pentru identificarea carbonatului de Na

Fericianură de K 5% pentru identificarea Fe bivalent

Salicilat de Na 5% pentru determinarea pH –ului

pH-metru

Eprubete, pâlnie, hârtie de filtru, cuțit, șpaclu, ruletă, pungi, cilindri, bidoane, etichete

Lopată, sondă pedologică, ciocan, altimetru, clinometru.

3.2. Prelucrarea probelor de sol

Păstrarea și prelucrarea probelor de sol sunt etape care pot influența profund rezultatele analizelor microbiologice. O păstrare îndelungată a probelor de sol nu este indicată pentru asigurarea unui răspuns veridic al analizelor bacteriologice. Toate sub-probele vor fi omogenizate într-un recipient de plastic steril. Din întreaga cantitate se rețin maxim 500g care se supun uscării în aer liber sau se mențin la frigider timp de maxim 24 de h. La frigider pot fi menținute probele care vor fi analizate în ceea ce privește unii indicatori care se modifica în timp cum ar fi: azotul, amoniacul, nitrații, nitriții, umiditatea. Uscarea la aer poate fi aplicată probelor care se analizează pentru poluanții anorganici sau de altă natură, mai persistenți în mediu. Uscarea în aer liber presupune presărarea solului într-un strat de maxim 1cm grosime pe o suprafață de polietilenă sau aluminiu și menținerea lui astfel o anumită perioadă. Nu este indicată folosirea cuptoarelor cu microunde sau a altor cuptoare. Esența acestei etape constă în stoparea activității bacteriologice și formarea sărurilor de amoniu anterior analizelor microbiologice. În timpul transportului, probele de sol trebuie să fie ferite de razele solare și să fie însoțite de o fișă de recoltare care cuprinde: data de recoltare, numele și calitatea celui care a recoltat proba, localizarea regiunii din care s-a făcut recoltarea, scopul analizei, precipitațiile atmosferice de la data și locul recoltării, felul poluării la care se suspectează că ar fi fost expus solul.

3.3. Efectuarea suspensiilor – diluții de sol

În studierea plăcilor Petri, este determinat numărul unităților formatoare de colonii. Tehnica diluțiilor seriate constă în diluarea progresivă a unui extract inițial, în vederea obținerii unui număr din ce în ce mai mic de colonii pe plăcile Petri. După incubarea plăcilor care au fost însămânțate cu diluțiile seriate, se începe numărătoarea de colonii. Plăcile cu colonii între 25 și 250 sunt potrivite pentru realizarea numerotării. Astfel, populația microbiană din proba originală de sol poate fi apreciată numeric. De exemplu, dacă pe placa în care a fost inoculată diluția 1: 1000 000, în cantitate de 0,01 ml, calculul de microorganisme totale este: Bacteria( unități formatoare de colonii)=232 colonii/(0,001 ml X 10-6 )= 2,32 X 10 6. Ca materiale necesare realizării diluțiilor enumerăm: 99ml apă sterilă într-o sticlă, pipetă sau picărător calibrat, plăci Petri cu mediu agar solid steril, tijă de omogenizare și răspândire (ansă) , alcool, sursă de foc. Pentru prepararea unei diluții 1:100, peste 1 g din proba de sol finală se adaugă 99 ml de apă sterilă. Se amestecă foarte bine cele două componente. Se asigură etanșeizarea completă a recipientelor în timpul manevrelor pentru a preveni contaminarea externă. Pentru obținerea unei diluții 1:10 000, se pipetează 1 mL din diluția 1:100 într-un alt recipient cu 99 ml apă sterilă. Amestecarea riguroasă a componentelor se poate face prin pipetarea și eliberarea repetată a conținutului recipientului. Pentru prepararea unei diluții 1:1000 000 se repetă acțiunea: 1 ml din diluția anterioară se pune în 99 ml apă sterilă dintr-un recipient steril, se omogenizează.

Figura 3.1. Realizarea diluțiilor seriate (Sursa: www.sigmaaldrich.com)

Utilizând o pipetă supusă anterior sterilizării, se iau din fiecare diluție câte 0,5 ml și se pun pe suprafața mediului agar din 3 cutii Petri diferite. Ansa metalică cu care se va face însămânțarea propriu-zisă se sterilizează, fiind trecută inițial prin alcool, apoi flambată până ce alcoolul se evaporă în totalitate. Ansa este lăsată să se racească. După răcire, ansa este folosită pentru răspândirea picăturii din diluție pipetată pe suprafața mediului. Plăcile astfel însămânțate sunt supuse incubării în condiții de temperatură și umiditatea favorabile, timp de 24-48 h. după incubare, sunt selectate plăcile cu număr corespunzător ( între 25 și 250 ), se numără coloniile formate și numărul de bacterii dintr-un gram de sol. 

Metodele de diluție a solului și a numărătoarea pe placă sunt cele mai utilizate metode în ceea ce privește izolarea și cuantificarea microorganismelor solului. Diluții corespunzătoare din sol sunt introduse pe un mediu solid caracteristic. Pentru a împiedica creșterea bacteriilor sau a fungilor pe mediile respenctive sunt încorporate în mediul de agar solid fie streptomicină, fie roz-bengal. Bacteriile termofilice, deci cele capabile de a tolera temperaturi înalte, sunt izolate prin incubarea plăcilor cu diluții cultivate la temperaturi de 55-60° C.

Însămânțarea culturilor bacteriene se poate face și după metoda de epuizare a încărcăturii ansei, în care un fir din metal inoxidabil, platină sau nichel-crom de forma unei anse este utilizat pentru a recolta din diluția respectivă un inocul. Inițial ansa este sterilizată, se recoltează cu aceasta inoculul. Acesta va fi însămânțat ( prin mișcări de dute-vino ale ansei încărcate) , inițial în primele două cadrane (I și II) ale plăcii Petri împărțită în prealabil în patru cadrane. După însămânțarea celor două, printr-o mișcare de rotație cu 90° , placa Petri se întoarce cu următoarele două cadrane (II și III) în partea de sus; se repetă aceeași mișcare de dute-vino cu ansa încărcată cu inoculul inițial. Se repetă mișcarea până se ajunge cu ansa la ultimul cadran. Scopul acestei manevre este de a creea diluții seriate din inoculul inițial. Placa Petri se pune apoi la incubat într-o cameră sterilă. Metoda este favorabilă pentru obținerea unor colonii ce provin dintr-o singură bacterie, deși inoculul inițial reprezintă o mixtură de diferiți germeni. Dezavantajul metodei este acela că unele microorganisme, în timpul producerii suspensiei de sol, rămân aderente de suprafața particulelor de sol, în ciuda mișcărilor energice de agitare a solului. Pentru a preveni acest dezavantaj, o cantitate mică de sol (0,005-0,01 g de sol ) este poziționată direct într-o cutie Petri sterilă, este mărunțită fin cu ajutorul unui ac, iar peste aceasta este turnată o cantitate de agar topit și răcit.

Winogradsky și Beijerinck au descoperit metoda îmbogățirii mediului de cultură pentru a obține rezultate mai bune în culturile microorganismelor telurice, având la bază criteriul selecției naturale. S-a descoperit că la inocularea unei soluții heterogene din punct de vedere al compoziției microbiene, microorganismele care sunt adaptate condițiilor oferite de mediul de inoculare vor începe să prolifereze, inhibând restul tipurilor de microorganisme. Astfel, se pot obține culturi microbiene țintite, doar prin manipularea conținutului mediului de cultură. Metodele de determinare a numărului de microorganisme de la nivelul solului sunt multiple:

Metoda numărului cel mai probabil-este metoda mai sus prezentată, realizată pe baza diluțiilor seriate;

Directa observare la microscop-folosește camerele de numărare. Se numără microorganismele prezente într-o cantitate de inocul cunoscută, apoi se raportează la 1 gram de sol. Pot fi utilizate colorații vitale pentru a diferenția microorganismele viabile de cele nonviabile sau de artefacte. Microscopia electronică permite numărătoarea automată de microorganisme;

Turbiditatea (densitatea optică)- turbiditatea unui mediu lichid creată de multiplicarea bacteriană poate fi măsurată de un spectrofotometru. Absorbanța probei este dependentă de numărul celulelor, forma și mărimea, fiind măsura utilizată pentru cuantificarea ratei de multiplicare bacteriene;

Activitatea metabolică- este o modalitate indirectă de a cuantifica rata de multiplicare bacteriană, și anume, prin determinarea concentrației de metabolit al unei populații bacteriei care este direct proporțională cu numărul de bacterii prezente în mediu. Exemple de metaboliți: CO2, acizi organici.

3.4. Evaluarea grupelor ecologice de microorganisme implicate în circuitul azotului în natură

3.4.1. Determinarea microflorei fixatoare de azot

Așa cum am prezentat și mai sus, interacțiunile dintre plante și microorganismele rizosferei sunt multiple, compușii pe bază de carbon eliberați de rădăcinile plantelor stând la baza dezvoltării a numeroase specii de microorgnisme. Cele mai multe plante interacționează cu microorganismele în vederea obținerii unor elemente minerale de tipul azot sau fosfor. Simbioza cu bacteriile fixatoare de azot este bine cunoscută, constând în interacțiunea bacteriilor cu rădăcinile leguminoaselor în vederea formării de noduli fixatori de azot. Reducerea azotului atmosferic la amoniac în nodulul simbiotic de la nivelul rădăcinii este realizat de complexul de enzime nitrogenaze. Cele mai importante astfel de simbioze sunt descrise între rădăcinile de leguminoase și speciile de microorganisme Rhizobium spp. și Bradyrhizobium spp. Aceste două specii sunt cele mai studiate la nivel mondial datorită ușurinței de obținere a culturilor microbiologice.

Bacteriile fixatoare de azot pot fi izolate direct din nodulii de la nivelul rădăcinilor plantei gazdă sau din sol, folosind mediu de cultură selectiv cu extract din drojdii obținut cu manitol (YEM). Albastrul de bromtimol este utilizat ca indicator pentru detectarea multiplicării bacteriilor fixatoare de azot. Indicatorul producerii de acid este considerată formarea unui halou galbel în jurul coloniilor bacteriene colorate în albastru.

Alberton a fost printre primii care a determinat caracteristicile morfo-fiziologice ale microorganismelor din specia Rhizobium. Speciile au fost crescute pe extract de drojdie-manitol agar, iar caracterizarea morfologică s-a realizat pe baza unor colorații Gram. Alte metode de studiu al acestor microorganisme țin de domeniul ingineriei genetice și biologiei moleculare și constau în: studierea informației genetice codificată de ADN-ul ribozomal și a proteinelor codificate de această informație genetică ( prin PCR- RFLP).

Pentru determinarea bacteriilor fixatoare de azot, se recomandă ca probele de sol să fie prelevate din zone care au avut cultivate în antecedente pe suprafața lor plante leguminoase, de la o adâncime de 10-15 cm. Se realizează inițial culturi din inoculul obținut din proba de sol, apoi, prin selectarea coloniilor cu aspecte sugestive pentru Rhizobium se obțin culturi pure dintr-o singură specie bacteriană. Izolarea Rhizobium s-a realizat pe mediu YMA (10 g manitol, 0,2 g MgSO4·7H2O, 0,1 g NaCl, 0,5 g K2HPO4, 0,2 g CaCl2·2H2O, 0,01 g FeCl2·6H2O, 1 g extract d drojdie, 20 g agar, 1 L apă distilată, 25 μg/ml albastru de bromtimol, pH = 6,7 – 7). Mediile însămânțate au fost menținute 7 zile la 28 C.

3.4.2. Determinarea microflorei amonificatoare

Flora amonificatoare realizează mineralizarea aminoacizilor, peptidelor și a altor substanțe organice prin formare de NH3, CO2, H2O. Formarea de amoniac la nivelul culturilor este monitorizată cu ajutorul reactivului Nessler.

Se realizează diluții seriate din extractul de sol obținut inițial, acestea se însămânțează într-un mediu în care asparaginaza reprezintă unica sursă de carbon și azot, se incubează 7 zile la 28 C. Se monitorizează apoi cantitatea de amoniac produsă în mediu în funcție de intensitatea reacției cu reactivul Nessler. Procesul de amonificare este puternic influențat de factori precum: pH, oxigen, temperatură, umiditate, concentrație de substanțe, prezența anumitor ioni. În testul pentru determinarea cantității de amoniac produs, reactivul Nessler (tetraiodomarcurat potasic) reacționează cu amoniacul prezent în probă ( în condiții de pH alcalin) și formează un compus de culoare galbenă. Având în vedere că modificarea colorimetrică este direct proporțională cu concentrația de amoniac, modificările se pot măsura spectrofotometric.

2K2HgI4 +NH3 + 3KOH Hg2OINH2+ 7KI +2H2O

Lecturarea rezultatelor s-a făcut la cinci zile de la însămânțarea probelor. Se prelevează steril, cu o pipetă câte l ml din fiecare tub, începând cu diluția cea mai mare și prelevatele se pun în eprubeta de hemoliză. Se adaugă câte 2 picături de reactiv Nessler. Tuburile pozitive au o tulbureală galben-oranj. Tuburile negative, la fel ca și tuburile martor, rămân incolore.

3.4.3. Determinarea microflorei nitrificatoare

Prezența bacteriilor producătoare de nitrat sau nitriți nu este net separată. Pentru determinarea celor două categorii de bacterii se utilizează două medii elective lichide, câte un mililitru pentru fiecare tub, în fiecare tub fiind însămânțată câte unu din diluțiile obținute.

Pentru cercetarea nitrat bacteriilor, mediul va fi suplimentat cu sulfat de amoniu ((NH4)2SO4), iar pentru studierea nitritbacteriilor se va adăuga NO2Na. Se incubează 3 săptămâni la 280C. Prezența nitriților este testată cu ajutorul unui reactiv sulfuric de difenilamină, iar cea a nitraților prin monitorizarea conținutului de uree în mediu sulfuric. Sărurile de amoniu care rezultă din l- procesul de amonificare disociază în ioni de amoniu ai acizilor respectivi (C-, HCO-3 , SO4 -2, HPO4-2), care sunt supuși ulterior proceselor de oxidare și schimburi cu ionii atașați de coloid. Procesele la care sunt supuși ionii de amoniu și amoniacul formează fenomenul de denitrificare. Organismele care oxidează ionii de amoniu la acid nitric poartă numele de nitrit bacterii, iar microorganismele care oxidează azotiții în azotați poartă numele de nitratbacterii. Bacteriile nitrificatoare pot fi autotrofe sau heterotrofe. Factorii care influențează nitrificarea sunt: umiditatea, temperatura și în special substratul de amoniac și ioni de amoniu. Concentrația de bacterii nitrificatoare dintr-o cultură de microorganisme este revelată în funcție de intensitatea reacției nitriților și nitraților cu reactivul difenilamină sulfurică, iar în cazul bacteriilor producătoare de nitrați de prezența ureei în mediul sulfuric. Nitrații oxidează difenilamina într-un compus chinolic de culoare albastră. S-a notat separat prezența bacteriilor nitroase și nitricee. Două medii selective au fost însămânțate cu suspensii-diluții de sol, câte 10,5 ml pentru fiecare tub folosindu-se câte trei tuburi pentru, fiecare diluție. Lecturarea rezultatelor:

– bacteriile mitroase – prezența nitraților sau nitriților se determină astfel: se golesc tuburile, aproape complet, încât să conțină doar 1-2 picături de mediu, se adaugă în fiecare tub câte 10 picături de acid sulfuric și 10 picături de difenilamină sulfurică. Tuburile pozitive prezintă o tentă albastră, mai intensă la concentrații mari. Citirea se face deasemenea față de un martor neînsămânțat.

– bacteriile nitrice – prezența nitraților se evidențiază ca și în cazul bacteriilor nitroase cu acid sulfuric și difenilamina câte 10 picături după ce în prealabil s-au adăugat în fiecare tub câte 10 mg uree pentru eliminarea nitriților restanți.Prezența nitraților se traduce prin aceeași colorație albastră.

3.4.4. Determinarea microflorei denitrificatoare

Denitrificarea este ultima verigă din lanțul ce formează circuitul azotului în natură. Este un proces ce constă în reducerea nitraților la nitriți și poate fi cuantificat de-a lungul timpului prin monitorizarea nivelurilor de nitrți și nitriți din cadrul unei probe biologice. Numărul microorganismelor implicate în denitrificare este cuantificat prin dispariția nitraților de-a lungul timpului, cu ajutorul reactivului pe bază de difenilamină în mediu sulfuric. Proba de examinat este reprezentată de diluțiile seriate obținute din proba de sol realizate într-un mediu de sol în care azotul se găsește sub formă de nitrați (NO3K). Sunt incubate la 300 C și sunt menținute timp de 3 săptămâni. Rezultatele sunt obținute prin compararea cu probele de control care nu au fost însămânțate cu diluții din sol. Rezultatele se interpretează în funcție de grupul de microorganisme studiat. De exemplu, microflora totală a unei probe de sol se evaluează în zilele de incubație 3, 5 și 7. Microorganismele amonificatoare și denitrificatoare sunt studiate după zilele 3,5 ,7 ,10 ,12 ,15 de incubație, iar nitrit și nitrat bacteriile devin disponibile studiului după 20 de zile de incubație. În ceea ce privește microflora de denitrificare, cu cât diluția din proba de sol realizată în mediul cu sursă de azotați este mai mare, cu atât așteptarea ca reacția de determinare a nitraților să fie mai intensă. Se numără la fiecare lectură numărul tuburilor pozitive pentru fiecare diluție și se determină numărul de germeni. Rezultatele determinărilor cantitative s-au exprimat în numărul de microorganisme/g sol uscat, după tabelele lui Mc Crady și apoi în Log2 microorganisme/ grame sol uscat. În cazul acestor interpretări precizia este cu atât mai mare cât numărul repetițiilor este crescut. De aceea noi am utilizat câte trei tuburi pentru fiecare diluție. Pe baza acestor rezultate s-a reprezentat grafic activitatea biologică a microorganismelor studiate.

CAPITOLUL IV. REZULTATE PRIVIND DINAMICA GRUPELOR FIZIOLOGICE DE BACTERII FIXATOARE DE AZOT DIN SOLURILE VITICOLE

În lucrarea de față tematica de cercetare abordată a avut ca scop principal prezentarea dinamicii principalilor parametrii microbiologici ai solului viticol, respectiv încărcatură microbiană răspunzătoare de starea de aprovizionare a solului viticol cu azot. Analizele efectuate au vizat ca obiectiv: caracterizarea activității vitale a solului prin evidențierea principalelor categorii de microorganisme prezente în solul viticol, implicate în circuitul azotului în natură.

Pentru evidențierea principalelor grupe ecofiziologice de microorganisme implicate în circuitul biogeochimic al azotului, în lucrarea de față s-au efectuat analize de laborator de izolare și identificare grupe de bacterii fixatoare aerobe, bacterii amonificatoare, bacterii nitrificatoare (nitritbacterii si nitratbacterii) și bacterii denitrificatoare – aplicate pe probe de sol prelevate din zone viticole diferite, respectiv:

• P1 – Plantație viticolă Breasta – Dolj –amplasată în S-V Olteniei, sol cernoziom brun-roscat.

• P2 – Plantație viticolă Calafat – Dolj – cu o vechime de peste 20 de ani, cu soiuri hibride – predomina hibridul Gama,întreținută clasic pe toată suprafața, prin executarea manuală a lucrărilor de mobilizare a solului.

• P3 – Plantația viticolă Banu Maracine (fosta) – amplasată în extremitatea sudică a Podișului Getic, la o distanță de cca. 6 km de municipiul Craiova.

Locațiile de unde s-au prelevat probe de sol

Tabel 4.1.

Pentru o mai bună înțelegere a fenomenelor de la fața locului, consider necesare prezentarea unor succinte decrieri a condițiilor geo-pedologice ale zonelor luate în studiu. Plantația viticolă Breasta – Dolj

Așezată în S-V Olteniei, cu sol de tip cernoziom brun-roșcat, în zonă de relief de câmpie colinară de acumulare lacustră, format din prundișuri, nisipuri și cuverturi groase de luturi, iar în lungul văilor apar soluri aluvionare și soluri brune. Prin terasarea pantelor, fostele pasuni neproductive au fost înlocuite cu suprafete viticole întinse. Din punct de vedere climatic, este o zonă cu climat temperat-continental, cu medie anuală de cca.10'C, o temperatură maximă absolută de 40'C și o minimă de -30' C.Primul îngheț apare după 25 octombrie, iar ultimul in prima decada a lunii aprilie, intervalul de timp fara inghet fiind astfel de 200 de zile pe an. Se înregistrează o medie de precipitatii de 600 mm|an. Vânturile dominante au direcția E-V, schimbările generale ale atmosferei de la un anotimp la altul sunt clar reflectate de modificările frecvenței vânturilori. Vanturile predominante sunt cele din sud-vest (Cosava, Austrul, Crivatul). Reteaua hidrografică este relativ săracă. In afara râului Jiu, care numai margineste teritoriul spre est, este reprezentată de râul Raznic, care adună apele din zona limitrofă a județelor Mehedinți și Dolj. (http://obiective-turistice.romania-tourist.info/breasta-dolj–detalii#sthash.Uw1ySYQD.dpuf).

Plantația viticolă Calafat – Dolj

Dispusă la o altitudine cuprinsă între 30 și 300 m față de nivelul mării, regiunea este considerată o zonă de câmpie, fiind una dintre zonele dunărene ale țării, dispusă în cadrul Câmpiei Române, la extremitatea sud-vestică. Din punct de vedere al climei, regiunea pe care se află plantația de viță de vie al cărei sol l-am analizat, aparține zonei climatice temperate, dar cu ușoare influențe mediteraneene. Media anuală în această regiune este de aproximativ 10-110C. Verile sunt foarte calde, precipitații reduse sub formă de averse, iar iernile sunt relativ blânde, cu fenomene de încălzire datorate influențelor mediteraneene. Dintre lunile de vară, cea mai călduroasă este luna iulie, cu o medie a maximelor de aproximativ 230C, iar temperatura maximă absolută înregistrată în ultimul secol este de 41,50C Anual, în această regiune îngheață aproximativ 83 zile. Valoarea medie anuală a precipitațiilor regiunii este destul de ridicată, aproximativ 580mm/an, iar stratul de zăpadă durează în medie cca 35 zile pe an.Schimbările climatice au atins cu o oarecare gravitate și această regiune a țării, în mare parte fiind datorate activităților antropice desfășurate local și național. Ploile acide, efectul de seră, creșterea concentrației de ozon troposferic, acumularea de precursori ai ozonului, alternanța dintre perioadele de secetă și inundații, perioadele prelungite de secetă sunt fenomene care au intrat în normalitatea aspectelor climatice ale zonei.Din punct de vedere geologic, zona este caracterizată de un sol fertil, propice pentru lucrările agricole. Deși fragmentat de luncă, dune de nisip și terase, solul predominant în zonă este reprezentat de cernoziom, la care se adaugă mici suprafețe de teren nisipos, cu o fertilitate mai redusă din punct de vedere agricol. În ciuda calității suficient de bune pentru dezvoltarea agriculturii, zona a devenit în ultimul sfert de secol ținta acțiunilor nefaste rezultate din antropizarea activităților, dar și a tendinței de deșertificare, tendință care de altfel a afectat întregul județ Dolj.

Plantația viticolă Banu Maracine (fosta)

Amplasată în extremitatea sudică a Podișului Getic, la o distanță de cca. 6 km de municipiul Craiova; face parte din Podgoria Dealurile Craiovei; solurile de fond sunt solurile brun-roșcate, normale sau slab-moderat erodate pe versanți, urmate de soluri brune sau/și soluri slab podzolite, moderat-puternic erodate pe pante și soluri aluviale pe terasele de luncã. Solul reprezintă o componentă principală a biotopului, care prin intermediul factorilor ecologici specifici (temperatura solului, umiditatea solului ș.a.) și al determinanților pedologici (conținut în humus, textură, porozitate, reacția solului) exercită o influență pregnantă asupra creșterii și rodirii viței de vie, fidel reflectată în tipicitatea produselor viti-vinicole obținute. Mărturii arheologice care atestă prezența culturii viței de vie și a producerii vinului pe teritoriul actual al centrului viticol Banu Mărăcine datează din vremuri foarte îndepărtate.

Oportunitatea temei – Multă vreme, în viticultură au fost neglijate problemele legate de identificarea microorganismelor solului, a proceselor vitale și enzimatice care se desfașoară în sol, precum și a interacțiunii dintre ele. Insuficienta de cunoaștere a acestor procese și legi a condus la numeroase intervenții antropice, soldate cu degradarea solului (Gh.Ștefanic,1994). Ca urmare, în ultimele decenii am asistat la un ritm accelerat de mineralizare a materiei organice din solurile viticole în condițiile luarii în cultură a unor soluri sărace în humus, a unei fertilizări unilaterale, fără încorporarea îngrășămintelor organice sau a resturilor vegetale, cu efectuarea unor lucrări ale solului la adâncimi prea mari.

Studiile și cercetările efectuate în domeniul biologiei solului, dublate de cele de agrochimie, au recurs la metode de laborator utilizate în microbiologia clasică, în corelație cu stabilirea unor metode moderne, rapide, care să permită cuantificarea fenomenelor și relațiilor dintre acestea, stabilirea unor indicatori de exprimare directă, indirectă sau sintetică a stării de calitate a solului.

Luând în considerare cele amintite, rezultatele mai puțin satisfacătoare, uneori descurajante, obținute prin metodele de investigare microbiologică a solului au la origine:

neglijarea modului de recoltare a probelor de sol, a condiționării lor, superficialitatea în alegerea metodelor și a variantelor experimentale;

greșeli legate de necunoașterea profundă a vieții solului, a proceselor vitale și enzimatice, a condițiilor ecologice de desfășurare a metabolismului microbian;

prezentarea unor rezultate din cercetari întâmplătoare, neaprofundate, necorelate cu alte fenomene paralele.

Considerând drept un preambul aceste aprecieri pertinente asupra oportunității sau inoportunității efectuării analizelor microbiologice ale solului, în continuare este prezentată evoluția sezonieră a reprezentanților grupelor ecofiziologice de bacterii fixatoare de azot, ca parametrii calitativi de calitate microbiologică ai solului viticol.

S-a pus accent pe surprinderea modificărilor cantitative ale microorganismelor implicare în realizarea ciclului biogeochimic al azotului.

Compoziția calitativă și abundență microflorei solului determină specificul activității biologice din sol, aceasta depinzând de o multitudine de factori: tipul de sol, vegetația, umiditatea, temperatura, pH-ul, anotimpul, zona geografică, caracteristicile de lucrare a solului. În strânsă corelație cu prezența materiei organice în sol și a elementelor minerale a evoluat și microflora solului, a cărei abundență și compoziție determină specificul activității biologice din sol.

Prezența bacteriilor fixatoare de azot libere, în diferite medii naturale, a fost remarcată încă din primele lucrări ale lui Beijernik. Punerea în evidență a acestor bacterii în sol este uneori dificilă , pentru că se știe că microorganismele din sol au necesități de creștere extrem de diferite și uneori extrem de specializate. De aceea în cadrul prezentului studiu, pentru punerea in evidență a acestui grup ecologic de microorganisme s-au folosit medii selective, care prin compoziția lor crează condiții de dezvoltare și multiplicare numai pentru anumite microorganisme din materialul studiat. Am folosit medii lipsite de substanțe azotate, care au permis numai dezvoltarea microorganismelor capabile să fixeze azotul atmosferic.

Analiza microbiologică privind numărul fixatorilor de azot liberi, aerobi și anaerobi, numărul de microorganisme amonificatoare, nitrificatoare și denitrificatoare în cele trei probe de sol recoltate în perioada august 2014 – martie 2015 au condus la o serie de rezultate care sunt consemnate în tabele și grafice. Rezultatele au fost calculate după tabelele statistice ale lui Mc Crady și raportate la grame sol uscat. S-a estimat astfel numărul cel mai probabil de germeni viabili și capabili să se multiplice în mediile însămânțate. Determinarea numărului de germeni a fost dedusă din numărul de tuburi găsite pozitive pentru câteva diluții consecutive și semnificative.

4.1. Dinamica fixatorilor aerobi în solurile viticole

Analiza rezultatelor obținute în urma însămânțării celor trei probe de sol recoltate în

luna martie 2015 arată că numărul fixatorilor aerobi, liberi se mențim la același ordin de mărime (zeci și sute bacterii/g sol uscat) în toate probele analizate dar la valori mai scăzute față de luna noiembrie 2014.

Astfel, numărul lor variază între 18,4 – 34,7 bacterii / g sol uscat (la 7 zile) și 308 – 347 bacterii/g de sol uscat (la 15 zile). Această creștere numerică a bacteriilor se datorează creșterii temperaturii solului și aerului din perioada primăverii, variație consemnată și în literatura de specialitate ( Zarnea, 1994 ) ca fiind hotărâtoare pentru microflora solului.

Din datele obținute rezultă că în luna noiembrie numărul fixatorilor de azot aerobi este de ordinul zecilor și sutelor de bacterii pe grame sol uscat, cu variație de la o probă de sol la alta (tabel 2). Cea mai intensă fixare de azot molecular atmosferic are loc în solul I (sol cu pH neutru unde numărul de bacterii variază între 11,7 (la șapte zile) și 195 bacterii pe grame sol uscat (la 15 zile), respectiv 3,548 și 7, 607 log2 din numărul de microorganisme.

Numărul cel mai mic de bacterii fixatoare de azot libere, aerobe este întâlnit în solul III (sol cu pH slab acid) la care numărul de bacterii variază între 0-4,6 bacterii/grame sol uscat.

Diferența dintre numărul fixatorilor aerobi la cele trei probe de sol este explicabilă deoarece este bine cunoscut faptul că numărul acestor bacterii variază mult în funcție de tipul de sol care oferă condiții diferite de dezvoltare pentru aceste bacterii (pH, umiditate, prezența unor factori toxici, conținutul în calciu și fosfor, etc.).

S-a constatat că pH-ul solului poate influența diferit dezvoltarea diferitelor specii și tulpini. Reacția solului prezintă o mare importanță pentru dezvoltarea speciilor genului Azotobacter. Scăderea pH-ului sub 6 influențează considerabil densitatea Azotobacterului din sol.

În cazul probelor analizate se poate aprecia că solurile cu o reacție aproape de neutralitate (sol I) sunt optime dezvoltării Azotobacterului, fapt concretizat în numărul mult mai mare de fixatori găsiți în urma analizelor efectuate.

În luna august 2014 se înregistrează o creștere a numărului de fixatori anaerobi în toate cele 3 probe de sol analizate (la 15 zile). În schimb la șapte zile nu au fost puse în evidență la niciuna din probe.

Dinamica germenilor fixatori de azot aerobi în probele de sol viticol

Tabel 4.2.

Figura 4.1. Dinamica germenilor fixatori de azot aerobi după 7 zile

Figura 4.2. Dinamica germenilor fixatori de azot aerobi după 15 zile

4. 2. Dinamica fixatorilor anaerobi în solurile viticole

Datele obținute indică diferențe foarte mari în numărul fixatorilor anaerobi (Clostridium pasteurianum)/g sol uscat în cele trei perioade în care s-a făcut prelevarea (tabel 4.3). Astfel, în luna martie se înregistrează o scădere a numărului de fixatori anaerobi mai ales în solurile II și III.

În luna noiembrie în cele trei probe de sol examinate numărul anaerobilor variază între 305 și 180.000 bacterii/ g sol uscat. Numărul cel mai mare de fixatori liberi anaerobi s-a obținut în solul III. Se remarcă faptul că în luna noiembrie fixarea azotului atmosferic în sol se realizează mai mult pe seama fixatorilor anaerobi. Numărul acestora este mult mai mare în comparație cu numărul fixatorilor aerobi si dintre toate probele analizate în aceeași perioada a anului. Fixarea anaerobă a azotului atmosferic vine să completeze deficitul în activitatea aerobilor care se găsesc într-un număr mai mic.

Scăderea însă cea mai accentuată a numărului de bacterii se observă în luna august, când la 7 zile nu au putut fi puse în evidență în nici una din probe, iar la 15 zile numărul lor scade aproape la jumătate față de luna martie. Atribuim această scădere secetei care s-a manifestat în luna august, care a creat condiții nefavorabile dezvoltării microorganismelor în general și celor fixatoare de azot în special.

Speciile genului Clostridium sunt răspândite și în solurile viticole afânate, aerisite, soluri în acest care ele intervin în metabioza cu diferite specii aerobe care consumă oxigenul din sol. Această metabioză este avantajoasă, deoarece bacteriile aerobe consumând oxigenul din imediata apropiere a Clostridiilor nu consumă și hidrogenul molecular, care este strict necesar vieții acestuia. Clostridium, fixând azotul atmosferic îl redă parțial în formă combinată în mediul ambiant, ceea ce îmbunătățește condițiile de existență a bacteriilor aerobe. Toleranțe față de oxigen și metabioza cu bacteriile aerobe fac din Clostridium un fixator de azot mai răspândit decât Azotobacter.

Azotobacter chroococcum fixează azotul liber din atmosferă pe baza resurselor energetice existente în sol, contracarează microorganismele patogene din sol, mobilizează fosfații, asimilează și valorifică exudatele radiculare și sintetizează fitohormoni. Asadar, efectul stimulator nu este doar o consecință a fixării de azot atmosferic, ci și a sintezei de compuși antibacterieni, antifungici, stimulatori de creștere (auxine, gibereline, citochinine, siderofori și fitohormoni ).

Tabel 4.3. Dinamica germenilor fixatori de azot anaerobi în probele de sol viticol

Figura 4.3. Dinamica germenilor fixatori de azot anaerobi după 7 zile

FiFigura 4.4. Dinamica germenilor fixatori de azot anaerobi după 15 zile

4.3. Dinamica microorganismelor amonificatoare în solurile viticole

Amonificarea este procesul prin care substanțele organice cu azot sunt descompuse de către microorganisme până la amoniac. Acest proces este realizat de către microorganismele heterotrofe, dar în primul rând de către bacteriile amonificatoare și apoi de către alte grupe sistematice.

Din rezultatele consemnate în tabelul 4.4. reiese că dintre grupele ecologice de microorganisme care participă la realizarea circuitului azotului în sol, cel al amonificatorilor este cel mai bine reprezentat.

Luând, de asemenea în considerare faptul că microflora amonificatoare reflectă în realitate microflora totală, rezultatele prezentate se referă de fapt la încărcarea microbiană heterotrofă totală a probelor de sol recoltate.

Numărul microorganismelor amonificatoare în cele trei probe de sol variază între 254×108 – 265×108 bacterii/g sol uscat în martie, între 282×108 – 295×108 bacterii în noiembrie și 265×106 – 292×106 în august. Nu sunt diferențe semnificative în numărul de amonificatori între perioadele toamnă + primăvară (noiembrie și martie); pe timpul verii scăderea ușoară a numărului acestor microorganisme se poate atribui în primul rând variației sezoniere, vara numărul de microorganisme scade întotdeauna și în al doilea rând secetei din perioada respectivă și poate unor eventuale dezechilibre ecologice.

Literatura de specialitate consemnează suficiente date cu privire la scăderea numărului de microorganisme sub influența pesticidelor. Există deci o variație sezonieră a acestei microflore amonificatoare, variație consemnată în toată literatura de specialitate pentru microflora solului în general, care menționează o creștere semnificativă a microorganismelor din sol toamna și primăvara.

În cazul probelor analizate de sol viticol, creșterea numerică a amonificatorilor în luna noiembrie se datorează acumulării unei cantități mai mari de materie organică, iar în martie, lună de primăvară creșterea se datorează creșterii temperaturii solului și aerului.

Tabel 4.4. Dinamica germenilor amonificatori in probele de sol viticol

Figura 4.5. Dinamica germenilor amonificatori

Amonificarea reprezintă, așadar, prima faza în derularea circuitului azotului, ca proces de degradare a substanțelor proteice vegetale și animale de către organismele proteolitice:

– specii bacteriene aerobe: Bacillus subtilis, B.cereus, B.mesentericus, B.megaterium, B.anthracis, Pseudomonas fluorescens, Sarcina lutea;

– specii bacteriene anaerobe: Clostridium putrificum, Cl.sporogenes, Cl.tetani, Cl.perfringens;

– specii bacteriene facultativ anaerobe: Proteus vulgaris;

– ciuperci amonificatoare din genurile: Thricoderma, Oidium, Monilia, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Botrytis.

Amonificatori deosebit de activi sunt Proteus vulgaris, Bacillus mycoides, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida si Clostridium putrificum.

Procesul de amonificare s-a dovedit mai intens în special în perioada cu temperaturi optime pentru metabolismul bacteriilor amonificatoare, de 25-30oC, când și încorporările repetate de material organic în sol par să favorizeze efectul de activare a bacteriilor – priming effect. Cu cât este mai mare devierea de la acest optim, cu atât proteoliza este mai inhibată.

Un factor foarte important pentru amonificare este aerisirea solului. Într-un sol rău aerisit, proteoliza este incompletă. Se formează numeroși produși intermediari care nu pot fi folosiți de vița de vie și care influențează mai degrabă în mod nefavorabil reacția și proprietățile chimice ale solului.

Microorganismele amonificatoare sunt mai puțin sensibile decât cele nitrificatoare la aceste condiții. Aerisirea este strâns legată de textura și structura solului. O structură glomerulară stabilă la apă oferă în general cele mai favorabile premise pentru o proteoliză nestânjenită.

4.4. Dinamica microorganismelor nitrificatoare în solurile viticole

Nitrificarea este un proces microbiologic direct corelat cu productivitatea solului, un indiciu important în aprecierea fertilității lui și mult influențat de factorii de mediu: umiditate, temperatură, pH, aerare, etc.

Amoniacul produs prin procesul de amonificare se acumulează doar în solurile acide sau slab aerate. În general, amoniacul suferă în continuare procesele de oxidare la azot nitric, prin procesul de nitrificare, sub incidența bacteriilor nitrificatoare strict aerobe, reunite în familia Nitrobacteriaceae. L.Pasteur menționa pentru prima dată în anul 1864 că azotații se formează prin acțiunea bacteriilor din sol. Procesul nitrificării se desfășoară etapizat, de către doua grupe de bacterii ce acționează metabolic, grupa nitrit- (genurile Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosospira,șautotrofe si aerobe) si grupa nitrat-bacteriilor (genul Nitrobacter), cu precadere în straturile superficiale de sol, bine aerisite, până la 20 cm adâncime. Din determinările microbiologice obținute pe probele de sol viticol se constată că intensitatea nitrificării, cu formare de azotați accesibili viței de vie este maximă primăvara și toamna. Astfel, probele prelevate în luna noiembrie indică pentru bacteriile nitroase, respectiv cele care oxidează amoniacul la azotit valori ale acestora care oscilează între 265 – 449 bacterii/g sol uscat, iar pentru bacteriile nitrice, cele care oxidează mai departe azotitul la azotat, valori între 35 – 1840 bacterii/g sol uscat.

Ca și procesul de amonificare, cel de nitrificare este supus unor condiții ecologice locale (pH, umiditate, aerare etc.). Analizele efectuate în luna martie evidențiază faptul că valorile microflorei nitrificatoare sunt ușor crescute față de luna noiembrie. Valoric aceasta variază între 254 – 480 bacterii g/sol uscat în cazul bacteriilor nitroase și între 265 – 150.000 bacterii/g sol uscat în cazul bacteriilor nitrice.

În schimb, în luna august se observă o scădere a numărului bacteriilor nitrificatoare. Astfel, numărul de bacterii nitroase este între 236 – 294 bacterii g/sol uscat, iar al bacteriilor nitrice între 65 – 246 bacterii g/sol uscat. Aceasta scădere se poate pune pe seama condițiilor climaterice (temperaturi ridicate, de 35° C, umiditate) din luna august, dar mai ales pe seama stării de întreținere diferită a plantațiilor viticole luate în studiu.

Oxidarea microbiologica a amoniacului este strâns dependentă, de asemenea, de reacția solului (pH optim = 6,7 – 7,8, la pH < 5 se oprește), de umiditate (optim de 40 – 70%) și de temperatură (25 – 35oC). Scăderea temperaturii sub 5 – 100C determină, de asemenea, blocarea procesului de transformare a amoniacului în nitrați.

Tabel 4.5. Dinamica germenilor nitrificatori în probele de sol viticol

Figura 4.6. Dinamica germenilor nitrificatori – nitribacterii – NO2- după 20 de zile

Figura 4.7. Dinamica germenilor nitrificatori – nitratbacterii – NO3- după 20 de zile

4.5. Dinamica microorganismelor denitrificatoare în solurile viticole

Utilizarea nitraților care se formează în sol este multiplă. Partea cea mai mare este consumată de plantele superioare. O parte este levigată, iar altă parte este transformată de microorganismele din sol.

Denitrificarea este un alt proces important din circuitul azotului în sol, ca proces de respirație realizat pe calea unei reduceri dezasimilatorii, prin care speciile bacteriene facultative (Aerobacter aerogenes) si obligate (Micrococcus denitrificans, Bacterium denitrificans, Vibrio denitrificans etc) utilizează nitrații sau alți compusi oxigenati ai azotului mineral ca acceptori finali de hidrogen. Procesul de denitrificare determinat de microflora specifică în probele de sol prelevate în lunile august, noiembrie și martie este consemnat în tabelul 4.6. Din analiza datelor înscrise în tabel, cât și pe baza graficelor de activitate biologică trasate, se desprind următoarele aspecte:

în luna noiembrie citirea finală de la 21 de zile după însămânțarea probelor evidențiază faptul ca microflora denitrificatoare în toate cele trei probe de sol este bine reprezentată și oscilează între 165 · 105 – 194 · 105 bacterii/g sol uscat.

în luna martie, microflora denitrificatoare este prezentă la valori destul de apropiate de cele consemnate în noiembrie, fiind cuprinsă între 157 · 105 – 171 · 105.

în luna august, microflora este prezentă în toate probele de sol cercetate, dar la valori mai mici, numărul de germeni denitrificatori este cuprins între 1.830.000 – 1.950.000 bacterii/g sol uscat.

Procesul de denitrificare este, așadar, favorizat de umiditate, prin efectul antagonist al apei față de aer, dar chiar la un continut egal de oxigen, denitrificarea crescând atunci când solul este umed, prin împiedicarea liberei circulații a aerului in sol.

Tabel 4.6. Dinamica germenilor denitritificatori în probele de sol viticol

Figura 4.8. Dinamica germenilor denitrificatori după 21 de zile

CONCLUZII

O gestionare biologică poate constitui cea mai indicată strategie de utilizare a solurilor pe termen lung. Alături de parametrii fizici și chimici, parametrii biologici sunt definitorii pentru caracterizarea unui tip de sol, având în vedere faptul că solul reprezintă mediul de existență pentru foarte multe viețuitoare, variate ca formă, dimensiuni, apartenență sistematică sau activitate biochimică, între ele stabilindu-se relații deosebit de complexe.

Determinările microbiologice efectuate în cele trei probe de sol, în trei perioade diferite a anului (vară, toamnă, primăvară) indică faptul că toate grupele ecologice de microorganisme care realizează circuitul azotului sunt bine reprezentate, cu variații determinate de tipul de sol, sezon și condiții climaterice.

Numărul fixatorilor aerobi liberi variază în cele trei probe de sol cercetate, pH-ul conferind condiții diferite de dezvoltare acestor bacterii.

Numărul de fixatori liberi anaerobi este mai mare decât al fixatorilor aerobi în special în luna noiembrie. În această perioadă fixarea azotului atmosferic în sol se realizează mai mult pe seama fixatorilor anaerobi, care completează deficitul în activitatea aerobilor.

Microflora amonificatoare este cea mai bine reprezentată. Există o variație sezonieră a acestei microflore care se înscrie în variația microflorei generale a solului în perioada de vară, toamnă și primăvară.

Reacția solului exercită o influență deosebită asupra fenomenelor de amonificare. Acest proces de amonificare decurge cel mai intens în condiții neutre, dar spre deosebire de nitrificare este numai slab inhibată de reacția slab acidă până la acidă. Cu cât se realizează mai favorabil condițiile pentru nitrificare (odată cu creșterea valorii pH), cu atât devin mai nefavorabile condițiile pentru amonificare.

Nitrificarea, proces microbiologic direct corelat cu fertilitatea solului este diferită în cele cinci probe de sol analizate; rezultă, așadar, faptul că procesul de nitrificare depinde de variațiile factorilor locali.

Procesul de denitrificare în toate probele de sol este bine reprezentat, cu variații în funcție de perioada în care s-au făcut determinările microbiologice.

Ca o concluzie de ordin practic se poate aprecia necesitatea stimulării procesului de fixare simbiotică a azotului din sol, prin măsuri agrotehnice corespunzătoare, care mențin fertilitatea solului, condiție esențială a dezvoltării acestui grup de bacterii.

BIBLIOGRAFIE

BAUMAN, M. SNOZZI, A.J. ZEHNDER AND J.R. VAN DER MEER, 1996 – „Dynamics of denitrification activity of Paracoccus denitrications in continous culture during aerobic-anaerobic changes”, J. Bacteriol, 178:4367-4374;

Chirita C., 1974 – Ecopedologie, Ed. Ceres, Bucuresti.

Chaussod R., Nicolardot B,Catroux B, Chretien J., 1986 – Relation entre les caracteristiques physico-chimiques et microbiologiques de quelques sols cultives, Science du sol. 2.

Domsch K.H., 1985 – Interactions wich microflora. In: Fungicides for crop protection. Colloque comémoratif du centenaire on soil microorganismes, Residue Reviews, 86

Doran J.W., Parkin T.B., 1994 – Defining and assesing soil quality. In: Doran J.W., Coleman D.C., Bezdicek D.F, Steward B.A.,. Defining soil quality for a sustainable envirinment, SSSA, Spec. Pub., nr. 35, Madison

Elliot E.T., 1994- The potential use of soil biotic activity as au indicator of productivity, sustainability and pollution. In: Soil biota: management in sustainable farming system CSIRO, Melbourne.

En-feng Chen, Li-Kai Zhou, Feng-Qiong Qui, Chang-Sheng Yan, Zi-Quin Gao,1982 – An approach to the essence of soil fertility. Zeitschrift für Pflanzenernährung, Düng. Bodenk. 145. 2 (pp. 207-220)

EVANS R.D., BELNAP J., 1999 – „Long term consequences of disturbance on nitrogen dynamics in an arid ecosystem”, Ecology, January, 16 – 32;

FOCHT D., VERSTRACTE W., 1977 – „Biochemical Ecology of Nitrification and Denitrification”, Rev. Advances in Microbial Ecology, pag. 1, 135 – 214;

Ghinea L., 1975 – Marile circuite naturale ca sisteme autoreglate. Cibernetica si mediul. Casa Jud. A Corpului Didactic, Deva.

JORDAN J. 2002 – „Denitrifation as a Model Chemical Process”, Journal of chem Education, February, Vol.79, nr.2, 179-186;

HERA C., ELIADE GH., GHINEA L., POPESCU A., 1984 – „Asigurarea azotului necesar culturilor agricole”, Ed. Ceres, București, pag. 5- 7, 32 – 54;

HOUSE G.J., STINNER B.R., CROSBY D.A., ODUM E.P., 1984 – „Nitrogen cycling in Conventional and Notilloage Agro – Ecosystems”, Analysis of Pathways and Processes, Journal oj Aplied Ecology, pag. 21, 991 – 101

Karlen D.L., M. J. Mausbach, J. W. Doran, R. G. Cline, R. F. Harris and G. E. Schuman – Soil Quality: A Concept, Definition, and Framework for Evaluation, SSSAJ Vol. 61 No. 1, p. 4-10, 1997

Pfeiffer E., 1937 – La fécondité de la terre, Ed. Triade, Paris, tranl. In French, 1966.

POPA A., POPA DANIELA, DRAGOMIR FELICIA, Miracolul vieții microorganismelor, Editura Universitaria Craiova, ISBN 973-742-112-4; 2005

POPA DANIELA – SOLUL VITICOL – Tezaur pentru o dezvoltare durabilă, Editura Universitaria Craiova, 2005

POPA DANIELA, COYNE MARK (S.U.A.) – Soil Microbiology: The Life Beneath Your Feet, publicat in Statele Unite ale Americii, Instant Publisher.com, U.S.A. ISBN 987-1-59872-9, 2007.

STEFANIC GH., 1994 – Cuantificarea fertilității solului prin indici biologici. Lucrări Stiințifice – Conferința Națională Stiința Solului, Tulcea.

STEFANIC GH., 1994 – Biological definition, quantifying method and agricultural interpretation of soil fertility. Roumain Agricultural Research.

Trasar-Cepada C., Leirós C., Gill-Sotres F.,Seoane S,.1998 – Towards a biochemical quality index for soil:du expression relating several biological and biochemical properties, Biol.Fertil.Soil,26.

VAILLANT V. 1901 – Petite chimie de l'agriculteur , Edit. F.Alcan.

ZARNEA GH., 1994 – „Tratat de microbiologie”, vol. 5, Ed. Academiei Române

Waksman S.A, 1952 – Soil microbiology, J Wiley and Sons, Inc. New York.

Winogradsky S.,1925 – Sur une méthode pour apprecier le pouvoir fixateur dans les terres ( in Winogradski Microbiologie Du sol, 1949), Ed. Mason et Cie, Paris.