Microbiologia Carnii Si Preparatelor din Carne Refrigerate

Microbiologia carnii si preparatelor din carne refrigerate

CUPRINS

Introducere

Distribuția germenilor psihrotrofi în mediul ambiant

Caracteristicile germenilor psihrotrofi

Efectul temperaturii scăzute asupra mecanismelor fiziologice ale bacteriilor

Natura rezistenței scăzute la căldură a germenilor psihrotrofi

Procesele de alterare a cărnii și preparatelor din carne

Microflora inițială a cărnii crude proaspete

Principalele genuri bacteriene psihrotrofe implicate

în procesele de alterare ale cărnii și preparatelor din carne

Bacterii de formă bacilară, Gram negative, nesporulate,

aerobe sau facultativ anaerobe Error! Bookmark not defined.

Genul Acinetobacter

Genul Alcaligenes

Genul Flavobacterium

Genul Moraxella

Genul Pseudomonas

Genul Psychrobacter

Genul Serratia

Genul Shewanella

Genul Yersinia

Bacterii de forma bacilară, Gram pozitive nesporulate,

aerobe, facultativ anaerobe

Genul Brochotrix

Bacterii acido-lactice

Listeria monocytogenes

Bacterii de formă bacilară, Gram pozitive, sporulate,

aerobe, facultativ anaerobe

Bacillus cereus

Bacterii Gram pozitive, de formă bacilară, sporulate, anaerobe

Clostridium perfringens

Clostridium botulinum

Alte specii de clostridii psihrotrofe implicate în procesele de alterare

ale cărnii și preparatelor din carne ambalate

Bacterii Gram negative, de formă alungită încurbată,

nesporulate, aerobe, facultativ anaerobe

Grupul Aeromonas hydrophila

Genul Campylobacter

BIBLIOGRAFIE

Introducere

În marea majoritate a țărilor, carnea și preparatele de carne reprezintă sursa de hrană cea mai solicitată. Prezența microorganismelor în acestea are o importanță deosebită pentru calitatea, salubritatea și starea lor de prospețime, deoarece sub influența germenilor calitatea de aliment a cărnii poate dispară. Această acțiune se poate realiza fie printr-o acțiune patogenă directă, fie printr-o degradare a produselor cu producerea unor metaboliți toxici (Bărzoi, 1987; Bărzoi și Apostu, 2002).

Progresele înregistrate în ultimele decenii privind tehnologia de procesare, conservare și manipulare a alimentelor, nu au înlăturat decât parțial posibilitățile de contaminare cu microorganisme a cărnii, în timp ce pretențiile consumatorilor față de salubritatea acesteia sunt tot mai crescute. Alimentele cele mai predispuse proceselor de alterare sunt acelea care au o valoare nutritivă ridicată, pH neutru sau ușor acid și un conținut ridicat de apă, asigurând astfel condiții favorabile pentru dezvoltarea microorganismelor. Datorită compoziției chimice, carnea este susceptibilă la contaminare bacteriană, mai ales în cazul în care nu se respectă cu strictețe normele de igienă de-a lungul întregului flux tehnologic, fiind astfel o sursă importantă în declanșarea toxiinfecțiilor alimentare (T.I.A.).

În majoritatea țărilor, carnea și preparatele de carne sunt păstrate prin refrigerare, la temperaturi cuprinse între 0°÷6° C, care nu permite dezvoltarea germenilor mezofili. Ca urmare, în aceste condiții, flora dominantă va fi reprezentată de către microflora bacteriană psihrotrofă. Carnea refrigerată poate conține o largă varietate de germeni, prezenți fie ca și componente ale microflorei normale a cărnii, fie datorită contaminării acesteia în timpul procesării ei. Utilizarea temperaturii scăzute pentru conservarea alimentelor, se bazează pe faptul că activitatea microorganismelor poate fi încetinită la temperaturi apropiate de punctul de îngheț al apei și stopată la temperaturi mai scăzute decât 0° C. Aceasta datorită faptului că toate reacțiile metabolice ale bacteriilor sunt catalizate de enzime și că rata de desfășurare a acestor reacții este dependentă de temperatură, odată cu creșterea acesteia având loc și o creștere a ratei de reacție metabolică. Coeficientul de temperatură Q10 (raportul dintre rata de reacție la o temperatură dată-R1 și rata de reacție la temperatura T-RT), pentru majoritatea sistemelor biologice are valori cuprinse între 1.5-2.5, având loc o dublare a ratei de reacție metabolică pentru fiecare creștere a temperaturii cu 10° și invers, conform ecuației:

Microbiologii au clasificat microorganismele în trei grupuri termice, în funcție de abilitatea acestora de a se dezvolta la temperaturi scăzute, medii și ridicate. Microorganismele capabile de a se dezvolta la temperaturi scăzute au fost denumite psihrofile, cele care se dezvoltă la temperaturi medii, mezofile iar cele care se dezvoltă la temperaturi ridicate, termofile (tab.1). Forster (cit. de Rod și Sutherland, 2000), în anul 1997, a demonstrat pentru prima data abilitatea microorganismelor de a crește la temperaturi scăzute. Ulterior, aceste microorganisme au fost izolate dintr-o gamă variată de produse alimentare conservate prin frig, precum și din diverse habitate naturale (Rod și Sutherland, 2000). Schmidt Nielsen (cit. de Jay, 1998), în anul 1902 a introdus termenul de psihrofil pentru microorganismele care se dezvoltă la 0°C. În prezent, acest termen este folosit pentru microorganismele care se dezvoltă în intervalul de temperatură –20° ÷ 20°C, cu un optim la 10° -15°C.

Tabe nr. 1

Clasificarea microorganismelor în funcție de temperatura

caracteristică pentru creștere

(Mossel D.A.A., Ganet E.L. Corry, C.B. Struijk, Rosamund M. Baird, A.C.Baird-Parker, 1999, Essentials of the Microbiology of Food, a Textbook for Advanced Studies)

În anul 1960, Mossel, Zwart și Eddy (cit. de Cousin și col., 1989), au propus termenul psihrotrof (psychros = rece, trephein = a se dezvolta), pentru microorganismele capabile de a se dezvolta la temperaturi de 5°C sau mai scăzute. În prezent, este larg acceptat printre microbiologi faptul că psihrotrofele pot crește la temperaturi cuprinse între 0° și 7°C, producând colonii vizibile sau turbiditate într-un interval de 7-10 zile, pe când microorganismele psihrofile, sunt acelea care se dezvoltă în produse provenite din apele oceanice foarte reci, sau din regiuni cu temperaturi foarte scăzute. Ca urmare, microorganismele implicate în procesele de alterare a alimentelor conservate prin refrigerare, sunt psihrotrofele (Jay, 1998; Mossel și col., 1999). Deoarece germenii psihrotrofi nu se dezvoltă uniform în intervalul de temperatură 0°÷7°C, au fost sugerați următorii termeni: eurypsihrotrof (eurys = larg) și stenopsihrotrof (stenos = îngust). Eurypsihrotrofele nu formează colonii vizibile decât după 7-10 zile, pe când stenopsihrotrofele formează astfel de colonii în aproximativ 5 zile.

În general, microflora saprofită de alterare se multiplică mai repede la temperaturi scăzute decât germenii patogeni, cu care sunt în competiție. Astfel, la majoritatea alimentelor menținute la temperaturi de refrigerare, semnele de alterare vor apărea înainte ca numărul germenilor să fie nociv pentru consumator, iar ca urmare produsele nu vor fi consumate. Există însă și excepții, deoarece lipsa modificărilor organoleptice nu este un criteriu sigur al lipsei de nocivitate al alimentului (Bărzoi, 1987).

Distribuția germenilor psihrotrofi în mediul ambiant

Abilitatea de a crește la temperaturi scăzute este o proprietate comună mai multor procariote și eucariote, inclusiv eubacterii, cyanobacterii, levuri, fungi filamentoși și alge. În cadrul eubacteriilor, principalii reprezentanți sunt germenii Gram negativi, aerobi, nesporulați, de formă bacilară.

Acești germeni au fost atribuiți în principal genurilor: Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Moraxella. Este însă evident, că și un număr variabil de germeni potențial patogeni sau patogeni se pot dezvolta în alimente, unii dintre ei producând toxine la temperaturi de 5°C sau mai scăzute, semnificativi pentru microbiologia alimentară fiind: Aeromomas spp., Bacillus cereus, Clostridium botulinum tip B, E non-proteolitic, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica și Campylobacter jejuni.

Caracteristicile germenilor psihrotrofi

O particularitate a acestor microorganisme este reprezentată de nivelul crescut de acizi grași nesaturați, comparativ cu germenii mezofili. Conținutul în lipide al majorității bacteriilor este cuprins între 2÷5 %, mai ales la nivelul membranei celulare. Lipidele bacteriene sunt esteri ai glicerolului, de două tipuri: lipide neutre, în care fie toate grupările, fie una sau două grupări –OH ale glicerolului sunt esterificate cu lanțuri lungi de acizi grași, și fosfolipide, în care, doar o grupare –OH este legată printr-un fosfodiester la colină, etanolamină, glicerol, inositol sau serină. Celelalte grupări hidroxilice sunt esterificate cu lanțuri lungi de acizi grași.

Mulți germeni psihrotrofi sintetizează lipide neutre și fosfolipide, care conțin un procent ridicat de acizi grași nesaturați când se dezvoltă la temperaturi scăzute, în comparație cu situația în care dezvoltarea are loc la temperaturi mai crescute. Astfel, s-a observat că în cazul în care speciile de Candida, mezofile și psihrotrofe, au fost cultivate la temperaturi de 10° C, conținutul de acizi grași nesaturați a crescut cu aproape 50%, comparativ cu situația în care au fost cultivate la 25° C. Nivelul de fosfolipide la această specie a rămas neschimbat.

Într-un studiu comparativ făcut asupra a patru specii de Vibrio, care se dezvoltă în intervalul –5°÷15°C, și patru specii de Pseudomonas, care se dezvoltă între 0°÷25°C, s-a observat creșterea nivelului de fosfolipide doar la speciile de Vibrio, în timp ce la speciile de Pseudomonas acesta a rămas același. Transformarea acizilor grași saturați în nesaturați la pseudomonadele psihrotrofe, nu este așteptat să se realizeze, când acestea se dezvoltă la temperaturi scăzute, deoarece acestea conțin între 57-71 % grăsimi nesaturate, ceea ce le face mult mai elastice decât alte multe microorganisme.

Spre deosebire de alte microorganisme psihrotrofe, Micrococcus psihrophilus suferă o scurtare a lanțurilor de acizi grași ca răspuns la scăderea temperaturii, care aparent scade punctul de topire al membranei lipidice.

Modificările frecvente induse de temperaturile scăzute în compoziția acizilor grași, sugerează că acestea sunt asociate cu mecanisme fiziologice ale celulei. Este cunoscut faptul că o creștere a gradului de nesaturare al acizilor grași duce la scăderea punctului de topire al acestora. Ca urmare, s-a sugerat că această intensificare a sintezei acizilor grași nesaturați la temperaturi scăzute, are scopul de a menține lipidele în stare lichidă și mobile, permițând astfel desfășurarea normală a activităților membranei. Acest concept, referitor la teoria solidificării lipidelor, a fost emis pentru prima oară de către Gaughn și Allen (cit. de Jay J.M., 1998), demonstrându-se că punctul de topire al acizilor grași este mult mai important decât structura lipidică. În sprijinul acestei teorii, a solidificării lipidelor, există evidențe amănunțite, cum este fenomenul de șoc termic prin frig, care duce la moartea multor celule bacteriene mezofile în momentul răcirii bruște a unei suspensii de bacterii mezofile viabile. În momentul declanșării șocului termic, are loc o eliberare masivă a unor constituienți celulari cu o greutate moleculară mică, probabil ca o consecință a unor modificări la nivelul membranei plasmatice. Pentru a susține aceasta ipoteză, Farrel și Rose (cit. de Jay, 1998), au cultivat o tulpină mezofilică de Pseudomonas aeruginosa la 30° C și au demonstrat că aceasta este susceptibilă la șoc termic, pe când aceeași tulpină cultivată la 10° C nu a prezentat această sensibilitate. Ca urmare, s-a stabilit că intervalul temperaturii de creștere a unui microorganism este dependent de abilitatea acestuia de a-și regla fluiditatea lipidelor în intervalul respectiv de temperatură.

O altă caracteristică importantă a bacteriilor psihrotrofe, când se dezvoltă la temperaturi scăzute, este sinteza crescută de polizaharide. Producerea dextranilor extracelulari de către Leuconostoc spp. și Pediococcus spp. este favorizată de temperaturile mai scăzute decât temperatura optimă de creștere pentru aceste sp a fost emis pentru prima oară de către Gaughn și Allen (cit. de Jay J.M., 1998), demonstrându-se că punctul de topire al acizilor grași este mult mai important decât structura lipidică. În sprijinul acestei teorii, a solidificării lipidelor, există evidențe amănunțite, cum este fenomenul de șoc termic prin frig, care duce la moartea multor celule bacteriene mezofile în momentul răcirii bruște a unei suspensii de bacterii mezofile viabile. În momentul declanșării șocului termic, are loc o eliberare masivă a unor constituienți celulari cu o greutate moleculară mică, probabil ca o consecință a unor modificări la nivelul membranei plasmatice. Pentru a susține aceasta ipoteză, Farrel și Rose (cit. de Jay, 1998), au cultivat o tulpină mezofilică de Pseudomonas aeruginosa la 30° C și au demonstrat că aceasta este susceptibilă la șoc termic, pe când aceeași tulpină cultivată la 10° C nu a prezentat această sensibilitate. Ca urmare, s-a stabilit că intervalul temperaturii de creștere a unui microorganism este dependent de abilitatea acestuia de a-și regla fluiditatea lipidelor în intervalul respectiv de temperatură.

O altă caracteristică importantă a bacteriilor psihrotrofe, când se dezvoltă la temperaturi scăzute, este sinteza crescută de polizaharide. Producerea dextranilor extracelulari de către Leuconostoc spp. și Pediococcus spp. este favorizată de temperaturile mai scăzute decât temperatura optimă de creștere pentru aceste specii. Această creștere a sintezei dextranilor la temperaturi scăzute este în legătură cu faptul că dextransucraza este rapid inactivată de temperaturile care depășesc 30° C. De asemenea, a fost demonstrată prezența dextransucrazei și la speciile de Lactobacillus. Această creștere a nivelului de polizaharide la temperaturi scăzute, este materializată prin apariția unui strat lipicios – mâzga – pe suprafața cărnurilor și preparatelor de carne, în special: crenwurști, carne de păsăre, carne tocată de porc, menținute la temperaturi de refrigerare.

Temperatura scăzută favorizează producerea de pigmenți în cazul speciilor care produc pigmenți fenazinici și carotenoizi. Cel mai elocvent exemplu îl reprezintă producerea pigmenților de către Seratia marcescens, care produce o enzimă sensibilă la căldură, care catalizează cuplarea precursorilor mono și bipirolului cu formare de prodigiozina. Creșterea sintezei pigmenților la temperaturi situate sub cea optimă a fost demonstrată și în cazul unui număr mare de germeni psihrotrofi și psihrofili marini.

Tot ca o adaptare la temperaturile scăzute, unele tulpini bacteriene prezintă o utilizare diferită a substratului nutritiv. Astfel, din fermentarea glucidelor la temperaturi mai mari de 30°C rezultă acid și gaze, pe când la temperaturi sub 30°C rezultă doar acid. Alți cercetători, au observat că germenii psihrotrofi care fermentează glucoza sau alte zaharuri la 20°C sau sub această temperatură, produc acizi și gaze, în timp ce la temperaturi mai ridicate produc doar acizi. Această utilizare diferențiată a fost atribuită unui sistem de hidrogenaze sintetizatoare termolabile.

Efectul temperaturii scăzute asupra mecanismelor fiziologice ale bacteriilor

Ca urmare a scăderii temperaturii, rata metabolică este încetinită în cazul tuturor germenilor bacterieni, cauzele precise ale acestui fenomen nu au fost pe deplin elucidate, însă încetinirea creșterii psihrotrofilor are loc mult mai încet comparativ cu cea a mezofililor. Coeficientul de temperatură Q10 pentru diferite substraturi ca acetat sau glucoză, a fost mai scăzut în cazul creșterii germenilor psihrotrofi decât pentru cei mezofili.

Odată cu scăderea temperaturii, rata de sinteză a proteinelor este încetinită, aceasta apărând în absența modificărilor privind cantitatea de ADN celular. Una dintre cauzele care duce la acest fenomen este reprezentată de creșterea numărului de legături de hidrogen intracelular, care apare la temperaturi scăzute, ducând la amplificarea plierii enzimelor urmată de scăderea activității lor catalitice. Pe de altă parte, scăderea sintezei proteice ar fi legată de o scădere a sintezei enzimelor individuale la temperaturi scăzute. Deși mecanismele precise care duc la această diminuare a sintezei proteice nu sunt pe deplin explicate, s-a sugerat că scăderea temperaturii afectează sinteza unei proteine represoare, care este termolabilă.

Unii cercetători au sugerat că scăderea temperaturii poate influența fidelitatea de translație a ARNm, în timpul sintezei proteice. Rata de sinteză proteică a fost de aproximativ 350 de ori mai scăzută la 0° C decât la 37° C, în cazul E. coli. Ca urmare, încetarea sintezei ARN, în general, poate fi considerat factorul determinant în stabilirea temperaturii minime de creștere. Lipsa formării polisomilor la E. coli când acesta este cultivată la temperaturi sub cea minimă de creștere a fost de asemenea demonstrată.

Deși activitatea metabolică a microorganismelor scade, când temperatura de creștere este scăzută, în cazul germenilor psihrotrofi s-a observat ca aceștia posedă o bună activitate enzimatică, motilitate, formare de endospori, germinarea lor având loc la 0° C. Pseudomonas fragi, printre alte microorganisme, produce lipaze în 2-4 zile la –7° C, în 7 zile la –18° C și în 3 săptămâni la –29° C. Ca urmare, temperatura minimă de creștere poate fi determinată pe baza structurii enzimelor și a membranei celulare, precum și pe baza sintezei enzimatice.

Absența sintezei enzimelor la temperaturi crescute de către germenii psihrotrofi, pare a fi datorată mai mult naturii inactive a reacțiilor enzimelor sintetizatoare, decât inactivării enzimatice, deși și aceasta este posibil de a se produce. Producerea enzimelor proteolitice endocelulare a fost mai crescută la Pseudomonas fluorescens incubată la 10°, decât la 20° sau 35° C. Alte studii au arătat că Pseudomonas fragi sintetizează preferențial lipaze la temperaturi scăzute, pe când la temperaturi de 30° C sau mai mari, acestă sinteză este scăzută sau chiar absentă. În schimb, Pseudomonas fluorescens produce aceeași cantitate de lipaze la 5° ca și la 20° C, însă la 35° C cantitatea este mai scăzută.

S-a sugerat că la nivelul celulei bacteriene sunt prezente anumite elemente termolabile, care influențează creșterea celulelor microbiene la o anumită temperatură. Ca urmare, microorganismele pot înceta să crească la o anumită temperatură scăzută, datorită unei excesive sensibilități a unuia sau mai multor mecanisme de control, efectori care nu pot fi furnizați în mediul de creștere.

La temperaturi scăzute, transportul nutrienților la nivelul membranei celulare a germenilor psihrotrofi este mult mai eficient. S-a demonstrat în câteva studii, că în cazul în care germenii mezofili erau cultivați la temperaturi specifice germenilor psihrotrofi, acumularea nutrienților în celulele bacteriene a fost mai scăzută. Studii efectuate de Baxter și Gibbons (cit. de Jay, 1998), au indicat că temperatura minimă de creștere a mezofililor este determinată de temperatura la care permeazele de transport sunt inactivate. Mecanismele de bază prin care scăderea temperaturii poate afecta acumularea nutrienților sunt:

inactivarea permeazelor la temperaturi scăzute, ca urmare a modificărilor induse de această scădere la nivelul anumitor proteine;

modificări în structura moleculară a membranei citoplasmatice, care împiedică acțiunea permeazelor;

penuria de energie, necesară pentru transportul activ al nutrienților

Deși acest mecanism de reducere al acumulării nutrienților nu este pe deplin elucidat, se pare că cel de-al 2-lea mecanism pare să fie cel mai probabil.

Studii efectuate asupra a patru specii psihrofile de Vibrio au relevat faptul că acumularea maximă de glucoză și lactoză s-a realizat la 0°C, aceasta scăzând la temperatura de 15°C, pe când în cazul a 4 specii psihrotrofe de Pseudomonas, acumularea maximă a nutrienților a avut loc în intervalul de 15°÷20°C, scăzând odată cu temperatura, fiind încetinit la 0°C.

Studiile efectuate asupra L. monocytogenes la 10° C, au arătat că metabolismul bacterian la temperaturi scăzute este rezultatul unui sistem enzimatic, rezistent la frig, de transport al glucidelor, care oferă o concentrație crescută a substatului intracelular. Acest sistem de transport rezistent la frig reprezintă o caracteristică specifică pentru germenii psihrotrofi, ca urmare a adaptării acestora la temperaturile scăzute.

Germenii psihrotrofi tind să aibă la nivelul membranei celulare un nivel crescut de lipide, care să asigure o anumită fluiditate și mobilitate membranei, facilitând astfel transportul nutrienților la nivelul acesteia la temperaturi scăzute. Mai mult, permeazele de transport sunt mai operative în aceste condiții decât cele ale germenilor mezofili. S-a arătat astfel, că psihrotrofele transportă glucosamina la 0° C, în timp ce la aceeași temperatură și chiar la 10° C, mezofilele au transportat doar o cantitate foarte scăzută.

Unele microorganisme psihrotrofe produc celule de dimensiuni mari. În condiții de creștere la temperaturi scăzute, bacteriile, levurile și mucegaiurile au capacitatea de a produce celule mai mari decât atunci când se dezvoltă la temperaturi crescute, specifice mezofilelor. În cazul lui Clostridium utilii, creșterea celulei a fost atribuită pe seama creșterii nivelului de ARN și a conținutului de proteină din celulă. Acest aspect nu a fost evidențiat la unele tulpini de Pseudomonas, când 92 celule bacteriene au fost cultivate la 2°, respectiv 32° C, pe aceleași medii de cultură. Pe de altă parte, germenii psihrotrofi, în general, sunt considerați ca au nivele crescute de ADN și proteine.

Sinteza flagelilor este mai eficientă în cazul creșterii la temperaturi scăzute, mai ales în cazul E. coli, Bacillus inconstant, Salmonella paratiphy și altor microorganisme, inclusiv câțiva psihrofili.

Psihrotrofii sunt afectați favorabil de către aerație. Efectul aerației asupra timpului de generație în cazul lui Pseudomonas fluorescens cultivat la temperaturi cuprinse între 4°÷32°C, folosind trei surse diferite de carbon, a fost mai favorabil la 4°, respectiv 10° C, pe când la 32° C culturile aerate au dus la creșterea timpului de generație. Într-un studiu efectuat asupra unui psihrotrof facultativ anaerob, cultivat în condiții anaerobe, s-a observat ca acesta a crescut mai lent, însă a supraviețuit o perioadă mai lungă de timp, iar producția de celule a fost mai scăzută în condiții anaerobe decât în condiții aerobe. Disponibilitatea oxigenului exercită, fără îndoială, o selecție asupra florei de alterare prezentă în alimentele refrigerate. Marea majoritate a germenilor psihrotrofi studiați este reprezentată de germeni aerobi sau facultativi anaerobi, care reprezintă de fapt principalii germeni implicați în procesele de alterare a alimentelor, depozitate în condiții de refrigerare. Studiile efectuate asupra florei microbiene psihrotrofe anaerobe au fost mai puțin numeroase în trecut, unul dintre primii germeni izolați fiind Clostridium putrefaciens. În ultimul timp, ponderea cercetărilor în cazul izolării și identificării psihrotrofilor anaerobi implicați în procesele de alterare a cărnii și preparatelor din carne a crescut (Broda și col, 1996, 1999, 2000a, 2000b; Moorhead și Bell, 1999).

O altă caracteristică a unor germenilor psihrotrofi, este aceea că unii dintre ei prezintă o necesitate crescută pentru anumiți nutrienți organici, observându-se că timpul de generație pentru anumite bacterii, izolate în medii slab nutritive, a fost de două sau trei ori mai lung, decât în cazul cultivării în medii bogate în nutrienți.

Natura rezistenței scăzute la căldură a germenilor psihrotrofi

Este cunoscut de mult timp că germenii psihrotrofi nu sunt în general capabili de a crește la temperaturi de 30°÷35° C. Edwards și Rettger (cit. de Jay, 1998), au fost printre primii cercetători care au sugerat cauzele care contribuie la această limitare a creșterii, concluzionând că temperatura maximă de creștere a bacteriilor poate conduce către o relație clară cu temperatura minimă de distrugere a enzimelor respiratorii. S-a demonstrat că multe enzime respiratorii sunt inactivate de temperatura maximă de creștere a unor germeni psihrotrofi. Astfel, termolabilitatea anumitor enzime implicate în procesele respiratorii a psihrotrofilor, reprezintă unul dintre factorii care limitează creșterea acestor microorganisme la temperaturi crescute.

Când anumiți germeni psihrotrofi sunt supuși unor temperaturi mai mari decât temperatura maximă de creștere, moartea celulară este precedată de eliberarea anumitor constituienți celulari, cum ar fi: ADN, ARN, aminoacizi liberi, fosfolipide pe la nivelul membranei citoplasmatice. Cauzele care duc la această scurgere a constituienților celulari nu sunt bine precizate, însă se pare că are loc o ruptură la nivelul membranei celulare. Acest fenomen se pare că are loc după inactivarea enzimelor.

Indiferent care este mecanismul real de producere a morții germenilor psihrotrofi, la temperaturi mai mari cu câteva grade peste temperatura maximă de creștere, distrugerea lor la aceste temperaturi relativ scăzute este caracteristică pentru acest grup de microorganisme, în special pentru acelea care au temperatura optimă de dezvoltare 20° C sau mai mică (Jay, 1998; Rod și Sutherland, 2000).

Microflora inițială a cărnii crude proaspete

Microflora bacteriană de la nivelul carcaselor este în mare măsură dependentă de condițiile în care animalele au fost crescute, sacrificate și de condițiile de prelucrare a carcaselor în unitățile de procesare. Factorii cei mai importanți care influențează calitatea microbiologică a cărnii sunt reprezentați de:

statusul fiziologic al animalelor în momentul sacrificării;

nivelul de contaminare în timpul sacrificării și al procesării;

temperatura din spațiile de prelucrare;

condițiile de depozitare și transport.

În carnea procesată în condiții optime de igienă, provenită de la animale sănătoase, numărul de germeni potențial patogeni proveniți în principal de la nivelul tegumentului este de obicei destul de scăzut, microflora bacteriană fiind constituită în principal din specii saprofite de poluare. Asociațiile microbiene dezvoltate în carnea și preparatele de carne sunt rezultatul interacțiunii dintre factorii determinanți prezentați anterior asupra creșterii microbilor prezenți inițial în carnea proaspătă sau introduși în timpul procesării acesteia. Ca urmare a faptului că procesele de apărare antimicrobiană sunt suprimate în momentul sacrificării animalelor, carnea rezultată este susceptibilă la o alterare microbiană rapidă.

Dacă supravegherea igienei de-a lungul întregului flux tehnologic de procesare a cărnii nu este eficientă, carnea obținută va fi contaminată excesiv, mai ales la nivelul suprafețelor de secțiune ale musculaturii, cu o gamă variată de germeni Gram pozitivi și Gram negativi (tab. nr. 2). Grau (cit. de Jackson și col., 1997), spunea despre carnea animalelor că aceasta poate fi privită ca o sursă importantă de țesuturi comestibile, care este situată între două regiuni contaminate masiv cu microorganisme: tegumentul, respectiv masa gastro-intestinală. Tegumentul, părul, ongloanele sunt contaminate cu un număr foarte mare de microorganisme, incluzând specii din genurile: Staphylococcus, Pseudomonas, Micrococcus, Lactobacillus, levuri și mucegaiuri, care fac parte din flora normală a pielii. Microflora de pe tegument provine din sol, apă, vegetație precum și de la nivelul animalului ca sursă de poluare: secreții, excreții, fecale. În cazul în care tegumentul este murdărit cu fecale, crește mult proporția germenilor de origine fecală. Este unanim acceptat faptul că aproximativ 50% din bacteriile prezente pe carcasele de taurine provin de la nivelul tegumentului. Inițial, țesutul conjunctiv subcutanat nu prezintă microorganisme, însă după jupuire, acesta poate fi contaminat cu bacterii prin intermediul activităților tehnologice, precum și cu germeni din spațiul de prelucrare. O primă contaminare se produce în momentul efectuării primei secțiuni, contaminările ulterioare realizându-se datorită aerosolilor și prafului generat în urma jupuirii, a contactului cu mâinile operatorilor sau prin atingerea tegumentului de țesutul conjunctiv subcutanat. În timpul procesării carcaselor, încărcătura microbiană crește prin contaminare cu germeni de la nivelul instrumentelor utilizate: cârlige, lanțuri, cuțite, fierăstraie, suprafețe de lucru etc.

Tabel nr. 2

Genuri bacteriene identificate în carne și preparate din carne

(Nychas G.J. E., E.H. Drosinos, Encyclopedia of Food Microbiology, 2000)

x = izolat uneori

xx = raportare frecventă

O altă fracțiune a microflorei este reprezentată de germenii psihrotrofi Gram negativi, în principal Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Aeromonas, Alteromonas. Există multe dezbateri cu privire la posibilitatea de obținere a unei cărni sterile, însă, în carnea obținută de la animale sănătoase și procesată cu respectarea strictă a normelor de igienă, încărcătura microbiană este foarte scăzută, sub 102 ufc/cm2, din care 1% sau uneori chiar 10% se pot dezvolta în condiții de refrigerare. În cazul cărnii provenite de la porcine, microflora inițială diferă de cea întâlnită la taurine, ca urmare a fluxului tehnologic diferit la această specie. În urma proceselor de opărire, depilare, pârlire, încărcătura microbiană scade foarte mult, sub 103 sau chiar 102 ufc/cm2, însă în urma proceselor de prelucrare ulterioară se produce o recontaminare cu o floră microbiană similară cu cea găsită în carnea de taurine (Brown, 1982). O sursă majoră de contaminare a suprafețelor secționate ale carcaselor este reprezentată de eviscerare. Nerespectarea normelor de igienă a acestei operații (aplicarea unei pungi de plastic la nivelul anusului, urmată de ligatura acesteia, ligaturarea și respingerea esofagului în cavitatea abdominală), secționarea accidentală a viscerelor, duce la contaminarea masivă a cărnii (Nesbakken, 2000).

Răcirea rapidă a carcaselor la temperaturi scăzute, viteza crescută a curenților de aer, poate duce la o reducere a populației bacteriene, în timp ce o răcire blândă, va permite creșterea și dezvoltarea germenilor psihrotrofi, astfel încât aceștia vor ajunge populația dominantă ducând la apariția proceselor de alterare ale cărnii (Lowry și Gill, 1985). Factorii care favorizează declanșarea rapidă a proceselor de alterare sunt: încărcărcătură mare de germeni psihrotrofi, temperatura crescută din spațiile de depozitare, valori mari ale factorului aw de la suprafața carcaselor apropiate de 1.0 (depinde de U.R. și viteza aerului din spațiile respective) (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1996). De asemenea, procesele de alterare ale cărnii depind de flora microbiană inițială, de nivelul contaminării, timpul și temperatura de depozitare. S-a demonstrat căm mirosul străin, persistent, apare la suprafața carcaselor, atunci când încărcătura microbiană ajunge la 107 ufc/cm2, iar mâzga se produce la o încărcatură de aproximativ 108 ufc/cm2. Apariția mirosului străin s-a pus în evidență la o încărcătură microbiană de 2×106 ufc/cm2 (J.C. Ayres, 1987, Dan și col, 2003, 2005). Pe lângă bacteriile de alterare, în carnea refrigerată se pot găsi o serie de bacterii potențial patogene și patogene, dintre care cele mai importante sunt: E. coli O157:H7, L. monocytogenes, Cl. botulinum tip B, E, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejunii, Aeromonas hydrophyla și Bacillus cereus, capabile să producă T.I.A. la consumatori. De asemenea, unele dintre aceste specii sunt capabile să producă toxine la temperaturi scăzute: Cl. botulinum, B. cereus, Y. enterolitica (Brown, 2000; Day, 2000; Kotula și kotula 2000).

În majoritatea țărilor, carnea și preparatele de carne sunt păstrate prin refrigerare, la temperaturi cuprinse între 0°÷6°C, care nu permite dezvoltarea germenilor mezofili. Ca urmare, în aceste condiții, flora dominantă va fi reprezentată de către microflora bacteriană psihrotrofă. Cărnurile refrigerate pot conține o largă varietate de germeni, prezenți fie ca și componente ale microflorei normale a cărnii, fie datorită contaminării acesteia în timpul procesării ei.

În ultimii ani, alimentele răcite (refrigerate) au devenit foarte apreciate de către consumatori, și ca urmare, procesatorii au venit în întâmpinarea cerinței consumatorilor, oferind mai mult spațiu de vânzare în magazinele de desfacere. Prin alimente răcite se înțelege: alimente perisabile, la care, pentru a se prelungi perioada în care ele rămân salubre, sunt păstrate în limite specifice de temperatură, cuprinse între –1°÷8° C, definiție emisă de Institutul de Știința și Tehnologia alimentelor din Anglia. Factorii care au contribuit la acest succes comercial al alimentelor răcite în magazinele moderne de prezentare sunt:

perceperea acestor produse ca proaspete și salubre de către consumatori, fiind cea mai apropiată alternativă pentru produsele obținute în sistem gospodăresc;

ambalarea acestor produse în folii transparente de polietilenă aderente, duce la perceperea de către consumatori a unor produse gata pentru consum, fără un prealabil tratament termic: șunca, pastrama, preparate uscate și afumate: salam tip Sibiu, Babic, Ghiudem etc.

confortul asigurat de aceste produse consumatorilor, prin faptul că unele dintre ele necesită înainte de consum doar o încălzire sumară, de exemplu în cuptorul cu microunde, spre deosebire de produsele congelate de același fel;

producătorii au ales această categorie de preparate, deoarece acestea le intensifică imaginea lor și le oferă oportunități în dezvoltarea unei largi varietăți de produse noi.

Ca urmare, respectarea cu strictețe a lanțului frigorific este vitală, deoarece acesta trebuie să asigure nu numai prelungirea perioadei de valabilitate, ci și faptul că aceste produse sunt sigure pentru consumator. Unele studii efectuate în S.U.A. și Anglia, cu scopul de a verifica dacă se respectă temperatura optimă în vitrinele frigorifice, a scos la iveală că în peste 20% din unitățile luate în studiu, temperaturile din spațiile respective au fost mai mari de 10°C. Deoarece toți germenii patogeni implicați în declanșarea T.I.A. pot supraviețui și unii se pot multiplica la temperatura de refrigerare (4°÷6°C), este esențial ca temperatura din aceste vitrine frigorifice să fie de maxim 1°÷2°C, pentru a se preveni dezvoltarea și multiplicarea acestora (Egan și Roberts, 1987; Nychas și Drosinos, 2000; Rod și Sutherland, 2000).

Principalele microorganisme psihrotrofe implicate

în procesele de alterare ale cărnii și preparatelor din carne

Bacterii de forma bacilară, Gram negative,

aerobe, facultativ anaerobe

Genul Acinetobacter

Bacteriile din acest gen sunt microorganisme ubicvitare, putând fi izolate din sol, apele de canalizare, de unde pot ajunge pe diverse alimente, în principal carne. Germenii fac parte din microflora tipică psihrotrofă de alterare a alimentelor.

Taxonomie și caracteristici

Denumirea actuală a fost propusă în anul 1954, și cuprindea o colecție heterogenă de germeni Gram negativi, saprofiți, unii oxidază pozitivi, alții oxidază negativi, care se puteau diferenția de alte microorganisme și datorită lipsei de pigmentare. În anul 1971, în urma unor studii, s-a demonstrat că tulpinile oxidază pozitive erau diferite de cele oxidază negative, și ca urmare, subcomisia de taxonomie a propus ca genul Acinetobacter să cuprindă doar speciile oxidază negative. În manualul de sistematică bacteriană Bergey’s din 1984, genul Acinetobacter era inclus în familia Neisseriaceae, cu două specii: A. calcoaceticus cu două varietăți –anitratus și lwoffii. În urma studiilor recente de filogenetică, s-a propus ca familia Moraxellaceae să cuprindă genurile Moraxella, Acinetobacter și Psychrobacter.

Genul Acinetobacter cuprinde bacterii Gram negative (uneori greu de observat), strict aerobe, imobile, oxidază negative și catalază pozitive, de formă coco-bacilară în faza logaritmică de creștere și cocoidă în faza staționară, de 1,0-1,5μm lățime și 1,5-2,5μm lungime. Sunt germeni care cresc ușor pe mediile de cultură, sunt non fermentativi, folosind diferite substraturi ca unică sursă de carbon. Pe agar formează colonii netede, uneori mucoide. În urma testelor de hibridare AND s-au pus în evidență 34 de specii, dintre cu importanță pentru procesele de alterare ale cărnii: A. calcoaceticus, A. baumanii, A. haemophylus, A. junii, A. johnsonii, A. lwoffii, A. radioresistens.

Incidența în alimente

Este considerat un germen care se localizează în mod normal pe tegumentul oamenilor, contribuind astfel la apariția unor procese infecțioase. Deși nivelul de patogenitate este scăzut în general, poate produce ocazional infecții oportuniste, inclusiv septicemii, pneumonii, mai ales în cazul persoanelor cu o imunitate deficitară. Separat de germenii din genul Pseudomonas sau alți Gram negativi non-fermentativi, germenii din acest gen sunt responsabili de alterări ale alimentelor, în special: bacon, carne de pasăre, carne de taurine păstrate în condiții de refrigerare, sau după tratamente de iradiere, ducând la pierderi economice importante. Contaminarea se poate produce fie prin intermediul tegumentului și părului animalelor în momentul jupuirii, fie prin intermediul cuțitelor sau al mâinilor operatorilor (piele), a apei de igienizare a carcaselor.

Dezvoltarea germenilor este favorizată în principal în carnea tocată, care are o suprafață mai mare de contact. În organe, ca: ficat, rinichi, inimi, limba de bovine, încărcătura microbiană a fost cuprinsă între 102÷105 ufc/cm2. Aceeași situație a fost evidențiată și în cazul cărnii proaspete de taurine, porcine și ovine. Acești germeni fac parte din flora bacteriană inițială de contaminare, deși micrococii, streptococii și corinebacteriile sunt speciile dominante. În carnea tocată de bovine sau în hamburger, procesele de alterare sunt produse exclusiv de germeni din genul Pseudomonas și Acinetobacter, deoarece la temperaturile de refrigerare acești germeni cresc foarte repede, ajungând ca la suprafața numărul de germeni să ajungă până la 108/cm2, la o valoare de pH 6.6.

Reprezentanții acestor grupuri de bacterii sunt caracterizați de o încărcătură enzimatică redusă, fiind astfel necompetitivi cu alți germeni de alterare (Nychas G.J.E. et al., 1988). Ei nu pot metaboliza hexozele dar utilizează aminoacizii și acizii organici ca și sursă de carbon și energie. Germenii din genul Acinetobacter utilizează de la început aminoacizii ca și sursă principală de carbon, după care metabolizează lactatul. S-a sugerat că germenii din genul Acinetobacter prezintă o oarecare activitate lipolitică, reprezentând populația dominantă în cazul produselor alimentare supuse iradierii. Deși degradează aminoacizii, produșii de metabolism rezultați nu produc modificări organoleptice neplăcute. Importanța acestor germeni rezidă din faptul că, în cazul unor încărcături microbiene crescute, au proprietatea de a restricționa utilizarea oxigenului de către pseudomonade și Shewanella putrefaciens, accentuând astfel potențialul de alterare al acestora, prin degradarea aminoacizilor de la început și producerea H2S și a altor produși metabolici urât mirositori (Kampfer, 2000).

Metode de izolare și identificare

Pentru identificarea tipului și a numărului de germeni din produsele alimentare sunt necesare în majoritatea cazurilor respectarea procedeelor de izolare și cultivare, deși metoda de determinare a NTG, nu va preciza cu exactitate numărul de microorganisme din produsele respective. Recent, au fost dezvoltate metode de detecție foarte precise a microorganismelor, care sunt independente de metodele clasice de cultivare: reacția de polimerizare în lanț (PCR), electroforeza în gel de agar a compușilor PCR (DGGE), etc. Izolarea bacteriilor din genul Acinetobacter, poate fi realizată utilizând o gamă variată de medii de cultură, incluzând agar nutritiv, agar cu soia și tripticază (TS), agar MacConkey, etc. În cazul agarului nutritiv se adaugă sânge de oaie sau om pentru identificarea tulpinilor hemolitice. După incubare peste noapte la 30° C, coloniile specifice, netede, gri-gălbui, sunt testate din punct de vedere biochimic prin testul oxidazei, fenilalanil dezaminazei, care sunt negative. Identificarea genului poate fi făcută pe baza următoarelor caracteristici: cocobacili Gram negativi, imobili în preparat în picătură, oxidază negativi, testul O-F negativ, nu fermentează D-glucoza, catalază pozitive, reducerea nitraților de obicei negativă, hidroliza Tween 20 în general pozitivă. Pentru o identificare rapidă a caracterelor biochimice se pot folosi chiturile API 20 NE, API LAB PLUS, etc. Pentru identificarea precisă a biotipurilor se recomandă efectuarea unor analize de genetică moleculare, cum ar fi: hibridarea ADN-ADN, analiza genelor ARNr 16S, PCR, secvențierea directă a PCR amplificat, 16 S ADN (Kamfer, 2000; Bărzoi și Apostu, 2002).

Genul Alcaligenes

Germenii din acest gen sunt încadraț în familia Alcaligenaceae. Sunt bacterii ubicvitare, Gram negative, de formă bacilară sau cocobacilară de 0,5-1,2μm lățime pănă la 2,6μm lungime, mobile, flagelate, având 1-4 flageli, strict aerobe, nezaharolitice și neproteolice, cu metabolism respirator, oxidazo-pozitive. Folosesc ca unică sursă de carbon citratul, iar ca unică sursă de azot săruri de amoniu sau de nitrat. Nu hidrolizează celuloza și chitina.

Germenii se dezvoltă la temperaturi cuprinse între 5°÷38° C, cu un optim la 20÷30° C. Sunt bacterii saprofite, izolându-se din sol, apă, precum și din intestinul oamenilor și animalelor, de unde pot contamina alimentele, provocând alterarea acestora în asociație cu alți germeni din genurile Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter. În anumite situații pot determina apariția unor infecții nosocomiale, mai ales la pacienții imunosupresați, la care pot produce septicemii, meningite, colite, apendicite, pneumonii, mai ales că unele tulpini sunt antibiorezistente. Deoarece nu se pot dezvolta în medii în care pH-ul este 4.5, se deosebesc de membrii genului Acinetobacter. Pentru identificarea și izolarea lor se poate folosi agarul MacConkey. Genul cuprinde 15 specii, cu 8 subspecii, dintre care: A. faecalis, subs. parafaecalis și subs. phenolicus, A. xylosidans, subsp. xylosidans și subsp. denitrificans, A. piechaudii (Răpuntean și Răpuntean, 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Scholl și col. 2001).

Genul Flavobacterium

Germenii de acest gen sunt recunoscuți ca și contaminanți ai alimentelor, numeroase lucrări științifice ilustrând importanța bacteriilor producătoare de pigment galben, Gram negative, denumite flavobacterii (Bărzoi și Apostu, 2002). Genul a fost descris pentru prima dată în 1923, incluzând bacterii care formează colonii pigmentate în galben sau portocaliu pe mediile de cultură. Datorită acestei definiții largi, în acest gen au fost incluse o mulțime de specii, de multe ori diferite din punct de vedere genetic.

În Manualul Sistematic de Bacteriologie Bergey’s sunt descrise în genul Flavobacterium bacteriile Gram negative, nesporulate, aerobe sau microarofile, pigmentate, imobile sau mobile prin alunecare. Pigmenții elaborați sunt de natura carotenoidă și/sau flexirubină. Temperatura de creștere pentru majoritatea speciilor este cuprinsă între 20°÷30°C, cu excepția F. psychophilum la care este între 15°÷18°C. Specia tip este F. aquatile. Genul Flavobacterium este apropiat de genurile Cytophaga și Flexibacter, toate fiind incluse în ordinul Cytophagales cu două familii diferite: Cytophagaceae și Flavobacteriaceae. Studii avansate, recente, bazate pe omologia acizilor nucleici au demonstrat că genul Flavobacterium aparține unuia din cele zece ramuri fitogenetice ale Eubacteriilor, denumit grupul Cytophaga-Flavobacterium-Bacterioides, care are două subdiviziuni: Bacterioides și Flavobacterium. Genul Flavobacterium cuprinde 141 de specii, dintre care : F. aquatile, F. branchiophilum, F. columnare, F. flevense, F. hydatii, F. johnosniae, F. pectivorum, F. psychrophilum, F. saccharophilum și F. succinicans.

Incidenta in alimente

Germenii genului Flavobacterium se găsesc în mod obisnuit în sol, apă proaspătă de unde pot să contamineze alimentele, inclusiv carnea și preparatele din carne. Deși numeroase studii publicate demonstrează prezența flavobacteriilor într-o varietate de alimente, datele privind rolul acestora în alterarea acestora sunt greu de obținut, datorită perioadei lungi de clasificare a acestora, a faptului că unele specii sunt reclasificate continuu, tulpinile identificate nefiind atribuite vreunei specii. Flavobacteriile fac parte din flora inițiala de poluare a cărnii și preparatelor din carne, însă incidența și nivelul de contaminare este mai scăzută decât în cazul peștelui și fructelor de mare. Dintre speciile genului 3 sunt patogene pentru pești, F. psychrophilum produce la salmonide și păstrăvul curcubeu bacteriemia de apă rece, F. columnare și F. psychrophilum produc afecțiuni ale branchhilor (Wakabayashi și col. 1989). Deși flavobacteriile fac parte parte din microflora inițială a carcaselor, rolul lor în procesele de alterare sunt limitate, datorită proceselor de competiție dintre microorganisme. Aceste bacterii au fost izolate mai frecvent de la carcasele de porc, în cazul depozitării la temperaturi de refrigerare, însă microflora dominantă este reprezentată de alte bacterii Gram negative.

Metode de detecție și izolare în alimente

Flavobacteriile nu se izolează greu și nu necesită etape de îmbogățire, fiind izolate din diverse alimente, utilizând medii cu triptonă, soia și agar (TSA), agar nutritiv, incubate fie la 30°÷48° C, fie la 7 °C 10 zile. Tot pentru izolare s-a propus următorul mediu: extract carne de bovine 1 %, peptonă 1%, NaCl 0.5%, agar 1.5 %, incubat la 20°÷25 °C 4 zile. Pentru a se observa mai ușor fenomenul de mobilitate prin alunecare sau roire, se necesită medii cu o concentrație scăzută a nutrienților. De asemenea, se pot identifica prin tehnica PCR, electroforeza în gel de agar a produșilor PCR. Pentru identificarea caracterelor fenotipice și diferențiere între speciile genului se pot folosi chituri comerciale, cum ar fi : API 20 NE, Vitek GNI, Biolog GN (Bărzoi și col., 2002; Garcia Lopez și Garcia, 2000).

Genul Moraxella

Bacteriile din genul Moraxella, încadrate acum în familia Moraxellaceae, au primit o atenție deosebită atât din partea taxonomiștilor, datorită clasificării și nomenclaturii anterioare cât și din partea microbiologilor alimentari, datorită asocierii acestor germeni în apariția proceselor de alterare a alimentelor, în special a produselor din carne proaspete, depozitate în condiții aerobe la temperaturi de refrigerare.

Taxonomie

Genul Moraxella cuprinde microorganisme Gram negative grupate în două subgenuri: Moraxella, de formă bacilară și Branhamella de formă cocoidă. Inițial genul a fost inclus în familia Neisseriaceae, dar în 1991 a fost creată familia Moraxellaceae, din care mai fac parte Acinetobacter și Psichrobacter. Diverse studii taxonomice efectuate asupra familiei Moraxellaceae, au demonstrat că aceasta cuprinde trei grupe diferite:

genul Moraxella:

specii clasice

specii cu caracter incert: Moraxella osloensis și Moraxella atlantae

genul Psichrobacter, inclusiv P. phenylpyruvicus, anterior Moraxella phenylpyruvica;

genul Acinetobacter.

Taxonomia genului Moraxella este complexă, cuprinzând două grupe distincte: un grup care include tulpini de Moraxella clasice, de formă bacilară (subgenul Moraxella) sau cocoidă (subgenul Branhamella), și un grup constituit din speciile M. osloensis și M. atlantae.

Bacteriile din acest grup sunt Gram negative, aerobe, neflagelate, imobile, unele posedă fimbrii asociate cu patogenitatea tulpinilor. Bacilii au dimensiuni de 1.0-2.5 μm, așezați în perechi sau lanțuri scurte. Sunt chemoorganotrofe, oxidază pozitive, nu produc acid din carbohidrați. Dintre caracteristicile fenotipice cele mai utilizate sunt: lichefierea gelatinei, proteoliza, hemoliza, reducerea nitratului și nitritului, hidroliza Tween 80, activitatea fosfatazei alcaline, activitatea esterazei. În unele culturi, forma celulelor este uniformă, în altele este pleomorfă, cu varietăți de mărime și aspect, pleomorfismul fiind favorizat de lipsa de oxigen și temperaturi crescute față de optim. Nu produc indol, hidrogen sulfurat. Sunt foarte sensibile la penicilină.

În prezent genul Moraxella cuprinde 22 specii: M. boevrei, M. bovis, M. caprae, M. lacunata, M. lincolnii, M. nonliquefaciens, M. catarrhalis, M. canis, M. caviae, M. cuniculi, M. ovis, M. atlantae și M. osloensis.

Metodele de detecție și izolare în alimente

Speciile genului Moraxella cresc la o temperatură optimă între 33°÷35° C pe medii de cultură standard: agar cu triptonă și soia, (TSA) sau (PCA) agar pentru numărul total de germeni. După o incubare prelungită, coloniile de 1-3mm, pot prezenta morfologie diferită, inclusiv tendințe de alunecare, cu sau fără zonă de hemoliză, asociat de obicei cu prezența fimbriilor. Pentru identificarea germenilor implicați în procesele de alterare a cărnii, inclusiv Moraxella, se poate folosi tehnica PCR și electroforeza în gel de agar. Pentru diferențiere între speciile genului se recurge la analizele fenotipice, bio-chimice și genotipice. Hibridizările ADN–ADN, ADN-ARNr, analiza ARNr 16S, electroforeza în gel de agar a proteinelor și studiul profilului acizilor grași se folosesc cu succes pentru diferențierea speciilor genului, acidul oleic (9 cis) C18 : 1 fiind unul dintre cei mai importanți acizi grași din compoziția germenilor genului Moraxella.

Incidența în alimente

Este larg acceptat faptul că reprezentanții genului Moraxella formează o importantă parte a florei aerobe, psihrotrofe de contaminare a produselor proaspete. Marea majoritate a studiilor cu privire la incidența, importanța și activitatea de alterare a germenilor Gram negativi, imobili, nepigmentați, aerobi, oxidază pozitivi, bacili sau cocobacili indică faptul că germenii izolați fac parte din grupul Moraxella–Acinetobacter, oxidază pozitiv Moraxella, Moraxella-like sau Moraxella spp. Germenii au fost izolați din carcasele de bovine, porcine si ovine, din carnea tranșată precum și din carnea tocată. Deși sunt bacterii strict aerobe, sunt capabile să se dezvolte și în produse proaspete, cărnuri conservate, ambalate în atmosferă gazoasă modificată. Deși se presupune că Moraxella spp. reprezintă o parte importantă a florei de alterare a cărnurilor depozitate în condiții aerobe, s-a demonstrat că importanța acestora este uneori exagerată, deoarece aceștia constituie o parte minoră a microflorei de spoliere, sub 1 %, având un potențial scăzut de alterare. Unele cercetări au arătat că speciile de Moraxella cresc pe carne, în particular pe suprafața grăsimii. Atașarea bacteriilor pe suprafața cărnurilor este considerată prima etapa în alterarea microbiană a cărnii. Unul dintre modificările organoleptice induse de acești germeni în carnea tocată de bovine a fost prezența unor mirosuri străine de alterare vegetală, aroma de fructe.În urma proceselor metabolice exercitate de către germenii oxidază pozitiv se produc compuși organici volatili: acetat de etil, metil isopropil sulfit, 2-propanetiol.

Susceptibilitatea la metodele de conservare

Așa cum s-a menționat anterior, tulpinile din genul Moraxella sunt psihotrofe, sensibile la factorul termic, capabile să supraviețuiască în produse congelate. Deși numărul speciilor luate în studiu a fost scăzut, se poate afirma că acestea par să fie susceptibile la condițiile ambalării produselor în atmosferă modificată, CO2 fiind pricipalul inhibitor, fiind rezistente la UV, la tratamente cu raze ionizante (10 kGy), presiuni înalte (200 Mpa), sensibile la NaCl, (deși au fost evidențiate în saramură), sorbat de potasiu 0.53 %, 200 ppm NaNO2, acizi organici, acid acetic și probabil la polifosfați. Pâna în prezent, nici una din speciile genului Moraxella nu au fost asociate cu apariția toxiinfecțiilor alimentare la om (Bărzoi și col. 2002; Santos și col. 2000).

Genul Pseudomonas

Genul Pseudomonas face parte din familia Pseudomonaceae, care include acum și genurile Frateuria, Xanthomonas și Zooglea. Speciile acestor genuri sunt Gram negative, obisnuit saprofite, întâlnindu-se în apele dulci, marine, sol, unele dintre ele fiind patogene pentru om și animale.

Speciile genului Pseudomonas sunt mobile, aerobe, având unul sau mai mulți flageli dispuși polar, de formă bacilară, drepți sau încurbați, de 1,5-5,0 μm lungime și 0,5-1,0 μm lățime. Sunt chemoorganotrofi și chemolitotrofi utilizând o varietate de compuși pentru necesitățile energetice: hidrogen, acizi, lipide, pectine, peptide, proteine, trigliceride, etc. Nu necesită factori organici de creștere, sunt catalază și ozidază-pozitivi. Nu tolerează mediul acid, rar crescând în intervalul de pH 5-6,0. Genul Pseudomonas are actual peste 100 de specii. În urma analizelor de genetică moleculară: analiza 16S a ARNr, hibridarea ADN-ADN, profilul acizilor grași și al lipidelor celulare, unele specii s-au transformat în genuri noi: Acidovorax, Burkholderia, Comamonas, Deleya, Flavimonas, Oceanospirillum și Ralstonia. Speciile genului sunt frecvent izolate din alimente proaspete, datorită contactului acestora cu apa, solul, vegetația, cele mai contaminate fiind: ouăle, carnea, laptele, fructele de mare, vegetalele.

Se dezvoltă în mod obișnuit la temperaturi cuprinse între 4÷45° C, cu un optim la 25°÷30° C, însă unele specii se pot dezvolta la temperaturi de –3°, -5° și chiar –9° C, durata de timp pe generație crescând pe măsură ce temperatura de cultivare scade. Astfel, P. fluorescens are o durată pe generație de 25.5 ore la –2.1°, de 12.8 ore la 2.2° și de 4.8 ° C ore la 8.7° C. La temperaturi mai mici decât cea minimă de dezvoltare, pseudomonadele sunt distruse, fiind mai sensibile la șocul termic decât celelalte bacterii asporogene (micrococi, stafilococi, sterptococi). De asemenea când temperatura maximă de dezvoltare este depășită, mor foarte repede.

Anumite specii produc pigmenți fluorescenți difuzabili, în special în mediile fără fier, altele produc pigmenți fenazinici, difuzabili sau insolubili, de diferite culori: albastră, verde, roșie, galbenă. Multe specii sunt psihrotrofe, având ca urmare un rol foarte important în procesele de alterare a produselor refrigerate. Deoarece nu necesită factori speciali de creștere, pseudomonadele vor scoate rapid din competiție germenii Gram pozitivi în produsele refrigerate. În tabelul 3 sunt prezentate caracteristicile biochimice ale unor specii de Pseudomonas asociate cu procesele de alterare ale alimentelor.

Tabel nr. 3

Proprietăți biochimice ale unor specii de Pseudomonas importante pentru alimente

(M.A. Cousin, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, 2000)

1. Redenumit Burkholderia

2. Redenumit Stenotrophomonas

Importanța pentru industria alimentară

Genul Pseudomonas reprezintă aproximativ 50-90 % din microflora de alterare a cărnii și preparatelor de carne, Pseudomonas fragi fiind considerată specia cea mai frecvent implicată în alterarea cărnii, cu o incidență de 56.7-79 %, urmată de Pseudomonas lundensis (Prieto și col., 1992). Au fost de asemenea identificate și tulpini ale Pseudomonas fluorescens, biovar I și III, cu o incidență cuprinsă între 5-13 %. Pseudomonas putida, izolată de pe suprafața cărnurilor roșii (sub 5%), pare să nu aibă importanță în procesele alterative ale cărnii. Pseudomonas cepacia și Pseudomonas stutzeri au fost asociate cu alterarea cărnii ambalate în atmosferă modificată în cazul utilizării de ambalaje permeabile pentru aer.

Speciile genului Pseudomonas utilizează glucoza reziduală, acidul lactic, aminoacizii liberi, nucleotidele ca și sursă de energie, degradarea fibrelor musculare intacte fiind realizată doar atunci când numărul de pseudomonade va fi crescut. Utilizarea ca și sursă de energie a aminoacizilor și acidului lactic se realizează doar când rezervele de glucoză sunt epuizate. Deși posedă lipaze, țesutul adipos din carne este insolubil pentru acestea, ca urmare grăsimea nu poate fi folosită pentru creșterea bacteriană. Procesele de alterare sunt evidente când populația bacteriană ajunge la 108 ufc/cm2, însă creșterea bacteriană continuă până la 109-10 ufc/cm2 (Cousin, 2000); (Piette și Idziak, 1992).

Principalele efecte pe care le exercită pseudomonadele asupra țesutului muscular sunt: degradarea proteinelor plasmatice, dislocarea proteinelor miofibrilare, actina și miozina, scăderea proteinelor stromale, în principal elastina. Mirosurile străine determinate de formarea unor produși de metabolism ca: acizi, amine biogene, amoniac, mercaptani, apar în carne la o încărcătură de 106-108 ufc/cm2, iar formarea de mâzgă, ca urmare a coalescenței celulelor bacteriene, apare la aproximativ 108 ufc/cm2. Pseudomonadele duc la formarea metaboliților cu sulf, a dimetil-sulfurilor, fără a produce însă H2S, caracteristică care-i diferențiază de germenii din familia Enterobacteriaceae.

Abilitatea pseudomonadelor de a se dezvolta în carnea refrigerată este pusă pe seama metabolizării glucozei în 2 oxo-gluconat sau gluconat pe calea metabolică Entner-Doudoroff (Nychas și col., 1988). Acești compuși nu sunt asimilați rapid de alte microorganisme, ca urmare, pseudomonadele își creează rezerve extracelulare de energie pentru utilizare atunci când rezervele de glucoză sunt epuizate. Ca urmare, 2 oxo-gluconatul și gluconatul au fost propuși recent ca și indicatori de alterare (Dainty, 1996). Drosinos și Board (1994) au descoperit diferențe metabolice între membrii genului Pseudomonas în carne. Asfel, ei au explicat că predominanța lui Pseudomonas fragi se datorează capacitătii acesteia de a metaboliza creatina și creatinina în condiții aerobe.

Procesele alterative determinate de pseudomanade, sunt însoțite de obicei de modificări organoleptice evidente, care duc la scoaterea produselor respective din consumul uman.

Metode de izolare și identificare

Pentru izolarea și identificarea pseudomonadelor se folosesc următoarele medii de cultură selective: agar cu glutamat-amidon fenol (GSP), cetrimid-furadoină-cefalosporina (CFC), Pseudomonas agar F și cetrimid agar, exclusiv pentru P. aeruginosa. Coloniile caracteristice sunt cercetate din punct de vedere biochimic, prin următoarele teste: producerea de pigment, gelatinaza, producere de acid din celobioză si maltoză, folosirea trehalozei, zaharozei, meso-inozitolului, benzilalaminei, etc. (Piettte și Idziak, 1992; Gram și col. 1999; Cousin, 2000; Bărzoi și Apostu, 2002; Dan și col., 2006).

Genul Psychrobacter

Genul cuprinde un grup de specii bacteriene psihrotrofe, care se dezvoltă cel mai bine la temperaturi scăzute. În prezent genul Psychrobacter este inclus în familia Moraxellaceae, cuprinzând 34 de specii: P. immobilis, P. urativorans, P. fragidicola, P. phenylpiruvicus, P. glacincola, P. alimentarius. Dintre acestea doar P. phenylpiruvicus și P. immobilis par să fie implicate în procesele de spoliere ale alimentelor, făcând parte din microflora de alterare a produselor din carne. Genul cuprinde bacterii Gram negative, aerobe, imobile, nepigmentate, oxidază pozitive, cocoide sau cocobacilare, uneori bacilare, halotolerante. Datorită caracterelor morfologice, fiziologice și biochimice se aseamănă cu tulpini din genul Moraxella și Acinetobacter. Tulpinile speciei P. immobilis sunt capabile să formeze acid din carbohidrați, dar nu pot utiliza multe componente ca și unică sursă de carbon. Nu au activitate hidrolitică asupra proteinelor, nu produc trimetilamina (TMA), indol și hidrogen sulfurat. Activitatea lecitinazică si lipolitică este scăzută. Din punct de vedere fenotipic, sunt oxidază și catalază-pozitive, majoritatea tulpinilor pot crește în intervalul de temperatură 4°÷10° C, cu un optim la 20° C. Sunt tolerante la 6% NaCl, sensibile la penicilină (1 U.I/ml), reduc nitrații, nu hidrolizează amidonul, gelatina și ADN-ul, nu decarboxilează aminoacizii, însă dezaminează fenilalanina și triptofanul.

Habitat

Germenii sunt considerați ubicuitari, fiind izolați din diferite medii acvatice și terestre, inclusiv alimente, sol, gheață, aer. Unele tulpini sunt considerate patogeni oportuniști, fiind implicați în cazuri clinice. Din produsele alimentare depozitate în spații de refrigerare au fost izolați frecvent. O parte din tulpinile izolate și descrise în literatura de specialitate sub denumirea de Moraxella-like sau “Achromobacter”, sunt de fapt Psychrobacter. P. phenylpiruvicus și P. immobilis au fost izolați din carne de pește, pasăre, ovine, precum și din preparate de de carne: cărnăciori de porc, carne tocată de vită, unele dintre ele supuse unor procese de iradiere.

În cazul cărnii, sursa de contaminare primară pare a fi solul și aerul, în timpul sacrificării și tranșării carcaselor. Capacitatea lor de a concura cu alte bacterii, ca de exemplu, Pseudomonas spp. este diminuată, numărul lor scăzând în timpul proceselor de depozitare, datorită modificărilor induse de factorii intrinseci, exemplu factorul aw. Sunt foarte rezistenți la procesele de iradiere, constituind microflora dominantă în preparatele de carne supuse acestui proces de sterilizare: cârnăciori vienezi, carne tocată, carne de pasăre, etc.

Incidența în carne și preparate de carne

Problemele apărute în taxonomia membrilor acestui gen, ca urmare a identificării greșite a germenilor izolați înainte de 1986 și puținele studii care atestă prezența lor în alimente, face dificilă stabilirea cu certitudine a faptului dacă aceste bacterii reprezintă o parte importantă din populația aerobă microbiană de alterare. În carnea de taurine și ovine, ponderea germenilor Psychrobacter este scăzută, fiind cuprinsă între 1-5 %, totuși, nivele mai ridicate s-au întâlnit pe suprafața unor depozite adipoase, uneori până la 50 %.

Metode de izolare

Germenii genului se dezvoltă bine pe medii standard, cum ar fi agarul cu triptonă și glucoză suplimentat cu 0,5 % NaCl (TGES), agar cu soia și tripticază (TSA), plate count agar (PCA). Pentru a-i diferenția de germeni din genul Acinetobacter s-au utilizat cu succes două medii, M și B. Mediul M conține agar nutritiv cu 1 μg/ml cristal violet și 0,1 % săruri biliare. Pe acest mediu, coloniile sunt opace, convexe, de culoare albastru deschis. Prin prelungirea perioadei de incubare la 5° C, culoarea coloniilor este mai evidentă. Pe medii neselective, coloniile sunt nepigmentate, mici, circulare, convexe, netede, opace. Pentru efectuarea diluțiilor zecimale se poate utiliza apa peptonată 0,1 % sau triptonă 0,1 % și NaCl 0,85 %. După inoculare pe suprafața mediilor, se incubează la 30°÷25° C timp de 3-4 zile, sau la 7° C timp de 10 zile (Garcia Lopez și Garcia, 2000).

Genul Shewanella

Este un gen care a fost definit recent, speciile genului având importanță în industria alimentară. Shewanella putrefaciens este cunoscută din 1930, deși sub altă denumire. Deși membrii genului sunt specifici pentru mediul marin, S. putrefaciens a fost izolată dintr-o varietate de alte medii, incluzând: apa din lacuri, sol, diferite produse alimentare, în principal carne și preparate din carne. Importanța acestei specii pentru industria alimentară rezidă datorită rolului acesteia în procesele de alterare ale produselor refrigerate, în care pH-ul are valori ridicate, peste 6.4: pește oceanic, carcase de pasăre, carne de bovine.

Taxonomie și caracteristici

Inițial, Sh. putrefaciens a fost inclusă în genul Achromobacter, care cuprindea specii Gram negative, non-fermentative, oxidază pozitive, de formă bacilară. În anul 1941 a fost transferat în genul Pseudomonas, însă datorită conținutului diferit al G+C al ADN-ului P. putrefeciens de 43-53 %, diferit de cel al genului, a fost transferată în genul Alteromonas. În anul 1985 s-a sugerat ca A. putrefaciens să fie denumită S. putrefaciens, în onoarea lui Shewan J. Până în momentul de față au fost identificate 64 de specii, dintre care: S. arctica, S. atlantica, S. indica, S. marina, S. benthica, S. hanedai, S. psychrophila. Pe baza studiilor genetice a ADNr 5S s-a sugerat ca genul Shewanella să fie inclus în familia Shewanelaceae. Din genul Shewanella face parte și S.alga, care însă se diferențiază de S. putrefaciens prin faptul că nu are caracter psihrotrof, crește la 42° C, la concentrații de NaCl de 10 %, conținutul în G+C al ADN-ului fiind de 52-56 %.

Sh. putrefaciens este bacil Gram negativ, oxidază pozitiv, flagelat, având un flagel polar când este cultivat în medii lichide, însă pe medii solide poate să aibă mai mulți flageli. Germenul este aerob, însă se poate dezvolta și în condiții de anerobioză, utilizând ciclul acizilor tricarboxilici în timpul respirației anaerobe. Germenul elaborează o gamă diversă de enzime de degradare, hidrolizând gelatina, cazeina, ADN-ul, ARN-ul, decarboxilează ornitina și unii esteri ai acizilor grași. S.putrefaciens produce o serie de compuși volatili: hidrogen sulfurat, trimetilamine (în carnea de pește). Tulpinile de alterare ale S.putrefaciens sunt psihrotrofe, dezvoltându-se la temperaturi de 4° C, unele chiar la 0°C. Rareori crește la 37°C, nu tolerază concentrații mari ale NaCl (10 %), însă se poate dezvolta la valori de până la 6 %. Fiind un microorganism nefermentativ, este sensibil la valori scăzute de pH, însă unele tulpini se pot dezvolta la pH de 5,5. În general tulpinile tolerante la concentrații crescute ale NaCl, sunt tolerante și la valori scăzute ale pH-ului. În produsele ambalate sub vid se poate dezvolta, însă este sensibil la valori crescute de CO2.

Importanța pentru industria alimentară. Dintre membrii genului, Shewanella putrefaciens este implicată în procesele alterative ale cărnii cu pH mai mare de 6, fiind considerată principală cauză care determină înverzirea lor. Aceasta utilizează aminoacizii ca cisteina și serina chiar dacă glucoza este disponibilă. În bulion, Shewanella putrefaciens utilizează aminoacizii doar după ce rezervele de glucoză au fost epuizate. Din metabolizarea aminoacizilor cu sulf (cisteină, cistină), rezultă H2S care interacționează cu mioglobina formând sulfmioglobina, fapt care se repercutează asupra culorii cărnii (Newton și Rigg, 1979). Deoarece S. putrefaciens este relativ sensibilă la valori scăzute de pH, în mod normal nu se va dezvolta în carnea aflată în rigiditate musculară, în care pH-ul atinge valori de 5.4-5.5, însă în carnea la care pH-ul are valori peste 6.0 germenul este adesea izolat ca și component al florei de alterare Gram negative, producând o serie de compuși pe bază de sulfuri volatile, care vor duce la apariția unor mirosuri neplăcute de: acetat, putrid, sulf, atunci când numărul de microorganisme este cuprins între 107-109 ufc/g (Gram și Vogel, 2000).

Metode de izolare și identificare

Pentru izolarea și identificarea Sh. putrefaciens nu există medii selective, însă izolarea se bazează pe capacitatea germenului de a produce hidrogen sulfurat și pigmentație caracteristică. Astfel, pe mediul agar cu peptonă și fier, bacteriile producătoare de hidrogen sulfurat, în urma degradării peptonelor vor forma în jurul coloniilor un precipatat negru de sulfură de fier. Pe agar cu fier, se produc aceleași aspecte. Temperatura de incubare este de 20°÷25° C, timp de 3-4 zile. Metodele rapide de identificare se bazează pe capacitatea germenului de a reduce oxidul de trimetilamină (OTMA) în trimetilamină (TMA). Se poate folosi tehnica Elisa, folosind anticorpi mono- sau policlonali specifici, însă este necesar ca încărcătura de bacterii să fie de 107 ufc/g.

Aplicarea metodelor de genetică moleculară, prin utilizarea analizei ARNr 16S, reacția de polimerizare în lant (PCR), a sondelor ARNr par să fie utilizabile, fiind aplicate în practicătot mai des. Deocamdată nu există standarde internaționale sau norme de referință privind nivelul acceptabil al Sh. putrefaciens în alimente, însă în Danemarca, de exemplu, Direcția Veterinară pentru Alimente, utilizează ca normă de referință o încărcătură de 107 microorganisme producătoare de hidrogen sulfurat/g pește (Gram și Vogel, 2000).

Bacterii de formă bacilară, Gram negative, facultativ anaerobe

Familia Enterobacteriaceae

Din totalul de 29 genuri incluse în această familie, în procesele de alterare ale cărnurilor sunt implicate următoarele genuri: Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Proteus, Providencia, Kluyvera și Serratia. Uneori au fost izolați și germeni din genurile Escherichia și Yersinia. Dintre acestea, Y. enterocolitica este considerat un patogen prin alimente, carnea de porc fiind mai frecvent implicată în declanșarea toxiinfecțiilor alimentare, datorită faptului că se poate multiplica la temperaturi apropiate de 0° C, și ca urmare în multe alimente refrigerate (Nesbakken T., 2000).

Tabel nr. 4

Principalele specii de Enterobacteriaceae izolate din carnea și

preparatele de carne alterate

(Garcia-Lopez M.L., M. Prieto, A. Otero, 1998,

Microbiology of meat and poultry)

In tabelul nr. 4 sunt prezentate principalele specii ale familiei Enterobacteriaceae implicate în procesele de alterare ale cărnii și preparatelor de carne. Deși importanța germenilor din familia Enterobacteriaceae rezidă din capacitatea patogenă a unora, anumiți membrii ai acestei familii constituie un grup important de germeni de alterare, în cazul în care sunt îndeplinite condiții de dezvoltare favorabile față de pseudomonade. Acest grup include Serratia liquefaciens, Hafnia alvei și Enterobacter agglomerans. Similar pseudomonadelor ei preferă să utilizeze glucoza, deși unii (Enterobacter), preferă produși intermediari de metabolism, cum ar fi glucoza 6-fosfat. Degradarea aminoacizilor are loc după epuizarea carbohidraților, cu eliberarea de amine, sulfuri organice și H2S. O caracteristică a anumitor enterobacteriacei este aceea de a forma H2S, fără a produce metil-sulfuri, fapt care-i diferențiază de pseudomonade (Gram L., et.al., 1999).

Deși Enterobacter spp. are o afinitate mai crescută pentru glucoză decât bacteriile acido-lactice, condițiile de pH și caracteristicile metabolice ale acestora (capacitatea bacteriilor lactice de a produce energie din utilizarea argininei), exclude ca germenii acestui gen să devină populația dominantă. De asemenea, Enterobacter spp. utilizează serina concomitent cu glucoza, după epuizarea căreia sunt metabolizate glucoza 6-fosfat, lizina, arginina și treonina.

Genul Serratia

Genul Serratia a fost denumit în onoarea lui Serafino Serrati, un microbiolog italian, fiind inclus în familia Enterobacteriaceae, tribul Klebsiellea. Până în prezent au fost identificate 16 specii, respectiv 4 subspecii: S. marcescens subsp. marcescens, S. marcescens subsp. sakuensis, S. liquefaciens, S. rubidaea, S. ficaria, S. fonticola, S.odorifera, S. plymuthica, S. grimesii și S. proteamaculus, subspecia quinovora (Skerman și col., 1980).

S. marcescens este specia tip a genului. Diferențierea între specii s-a făcut pe baza biotipizării, serotipizării, tipizării cu ajutorul fagilor, a bacteriocinelor, analiza ADN-ului. Unele specii ale genului Serratia fac parte din microflora de alterare a produselor păstrate la temperaturi de refrigerare. Membrii genului sunt bacterii Gram negative, de formă bacilară având capetele rotunjite, de 0,5-0,8μm lățime și 0,9-2μm lungime. Sunt germeni facultativi anaerobi, catalazo-pozitivi, mobili, având cili dispuși peritrih. Pe mediile solide formează colonii opace, albe, roz sau roșii în funcție de genotip și condițile culturale (aminoacizi, carbohidrați, pH, temperatura). Culoarea roșie este determinată de prodigiosina și pirimină. Prodigiosina este un pigment nedifuzibil, produs de biotipurile A1 și A2 ale S. marcescens și de majoritatea tulpinilor ale S.plymuthica și S.rubidaea. Acest pigment este produs la temperatura de 16°÷32° C, în condiții aerobe. Pirimina este un pigment solubil în apă, produs de anumite tulpini ale S. marcescens, biotipul A4. Unele tulpini ale S.liquefaciens, S.odorifera și S.ficaria pot să se dezvolte la temperatura de 4°-5° C, la valori de pH cuprinse între 5-9. De asemenea, unele specii sunt capabile să producă hemolizine, nucleaze, lipaze și proteaze. Serratia liquefaciens produce în carne acid acetic, modificări de culoare și apariția de mirosuri străine. produce în carne, modificări de culoare și apariția de mirosuri străine (Rafii F., 2000).

Metode de izolare

Față de celelalte genuri ale familiei Enterobacteriaceae, Serratia se izolează mult mai ușor, chiar în absența pigmentației. Pentru izolarea din alimente, după efectuarea diluțiilor succesive, se inoculează direct pe suprafața mediilor cu sânge sau a CT agar (caprilat talos cu săruri minerale), care conține: 0,01 % extract de drojdie, 0,1 % acid caprilic, 0,025 % sulfat talos pentru inhibarea altor microorganisme. Incubarea se face la 37° C timp de 24 ore sau la 30° C, timp de 48 ore. Pe agar cu sânge coloniile sunt de culoare roșie, iar pe agarul TC sunt mici, de culoare albă-albăstruie. Pe măsură ce coloniile cresc, culoarea acestora se intensifică. Pentru diferențiearea între speciile genului se folosesc următoarele teste biochimice: D-nase la 25° C, lipaza, gelatinaza, lizin decarboxilaza, ornitindecarboxilaza, fermentația L-arabinozei, D-sorbitolului, D-arabitolului, adonitolului, dulcitolului, D-manozei, etc. Se pot folosi pentru diferențiere biochimică și teste comerciale API 20 E și Vitek GN1 pentru Gram negativi (Bărzoi și Apostu, 2002; Hansen și col., 2000; Rafii, 2000).

Genul Yersinia

Genul Yersinia, propus în anul 1944 de către Vann Loghem, este inclus în familia Enterobacteriaceae și cuprinde 3 specii patogene: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis subs. pseudotuberculosis, și Y. enterocolitica subs. enterocolitica, Y. enterocolitica subs. palearctica, și 16 specii nepatogene, unele implicate în declanșarea proceselor alterative ale produselor alimentare, dintre care: Y. frederiksenii, Y. kristensenii, Y. intermedia, Y. ruckeri. Interesul medical pentru Y. enterocolitica a început în anul 1958, în urma evoluției unor epizootii la chinchila și iepurii de câmp, și după stabilirea unor relații cauzale cu limfadenitele purulente la om.

Y. enterocolitica este considerat unul dintre agenții principali cauzali ai gastroenteritei la om, în principal în țările cu climat temperat. Încercările de a izola germenul din alimentele incriminate în declanșarea toxiinfecțiilor alimentare la om au fost în multe cazuri nereușite. Însă, datorită evidențelor apariției multor focare de yersinioză în S.U.A., Canada, Japonia, a studiilor epidemiologice efectuate, Y. enterocolitica este considerat un patogen prin alimente, carnea de porc fiind mai frecvent implicată în declanșarea toxiinfecțiilor alimentare.Bacteriile sunt Gram negative, de forma unor bastonașe scurte sau cocoide, de 1-3 μm lungime și 0,5-0,8 μm lățime, asporogene, acapsulogene, oxidază pozitive, imobile la 37° C și mobile la 22°÷25° C. Nu fermentează lactoza, produc ornitindecarbozilază, nu folosesc citratul și malonatul ca unică sursă de carbon, nu decarboxilează lizina, nu dezaminează fenilalanina, nu hidrolizează gelatina. Fermenteaza fără producere de gaze fructoza, glucoza, glicerina, maltoza, manitolul, trehaloza și nu fermentează dulcina, glicogenul, eritritolul, inozitolul, rafinoza și melitoza. Temperatura optimă pentru dezvoltare și multiplicare este cuprinsă în intervalul 30°÷37° C, cu limite între –4°÷45° C. O caracteristică importantă a Y. enterocolitica este faptul că se poate multiplica la temperaturi apropiate de 0° C, și ca urmare în multe alimente refrigerate. Pe baza structurii antigenice, foarte complexă, alcătuită din antigene O și H, au fost descriși un număr variabil antigenici O, care delimitează numărul de grupe serologice. În prezent tulpinile patogene ale Y. enterocolitica aparțin serogrupurilor O:1, 2a, 3; O:2a,3; O:3; O:8; O:9; O:4,32; O:5,27; O:12,25; O:13a,13b; O:19; O:20; și O:21, însă cele care predomină în cazul îmbolnăvirile la oameni sunt O:3, O:8, O:9 și O:5, O:27.

Mecanism de patogenitate

Aderarea și penetrarea la nivelul celulor epiteliale ale intestinului, la nivelul celulelor M ale plăcilor Payer, reprezintă factori esențiali în patogeneza Y. enterocolitica. După penetrarea epiteliului, bacteriile traversează membrana bazală a foliculilor și invadează țesutul limfoid, în care se multiplică și determină limfangiectazii și microabcese. Difuzarea locală și generală a infecției se bazează pe capacitatea bacteriei de a rezista intrafagocitar. De asemenea, tulpinile patogene ale Y. enterocolitica posedă un plasmid de virulență, cu o greutate moleculară de 40-50 Mda. Multe tulpini produc o enterotoxină termostabilă (YEST), când bacteriile sunt cultivate la 20°÷30° C, asemănătoare cu enterotoxina ST a E.coli, în privința stabilitătii la pH, detectabilă pe șoareci sugari și pe ansă intestinală de iepure, care stimulează creșterea activității guanilat ciclazei, cu blocarea transportului de electroliți în celulă și apariția diareei. Toxina are o greutate moleculară de aproximativ 3kDa, nefiind inactivată la 121° C timp de 30 minute, iar la 4° C rezistă cel puțin 5 luni, fiind rezistentă și la acțiunea enzimelor.

Incidența în alimente

Deși la porcii sănătoși s-au identificat uneori tulpini patogene de Y.enterolitica, în special serotipul O:3/biovar 4 și serotipul O:9/biovar 2, mai ales de la nivelul amigdalelor, limbii și intestinului, la nivelul cărnii, tulpinile patogene au fost identificat foarte rar. Aceasta s-ar datora lipsei mediilor selective sau a unei metodologii adecvate de izolare a tulpinilor patogene, deoarece studii efectuate, atât asupra cărnii cât și asupra preparatelor din carne de porc, prin metode clasice și moderne au pus în evidență în proporție de 18-26 % prezența Y. enterocolitica în acestea. Cu câteva excepții, carnea de bovine și ovine în general nu este considerată a fi purtătoare de tulpini patogene ale Y. enterocolitica pentru om, însă există pericolul contaminării încrucișate cu carcasele de porcine în abatoare, unitățile de procesare și unitățile de desfacere.

Factori care influențează supraviețuirea și creșterea în alimente

Capacitatea germenului de a se multiplica la temperaturi scăzute, reprezintă o preocupare considerabilă atât pentru procesatorii de carne, cât și pentru medicii veterinari igieniști. În cazul în care produsele sunt depozitate la 5° C, la pH neutru, numărul de germeni poate ajunge de la 10/g la 2.8 x 107 ufc/g în 5 zile. Valoarea minimă de pH pentru creșterea Y. enterocolitica este de 4.2-4.4. Prezența acizilor organici reduce capacitatea acestor germeni de a se multiplica la temperaturi scăzute, acidul acetic fiind mai activ decât acidul lactic sau citric.

Deoarece Y. enterocolitica supraviețuiește și în produsele ambalate sub vid pentru perioade lungi de timp, precum și în produsele congelate, importanța acestuia pentru igiena alimentelor este considerabilă. Ambalarea alimentelor în atmosferă gazoasă modificată duce la limitarea creșterii microorganismului, concentrații de 100 % CO2 fiind inhibitorii.

Metode de izolare și identificare

Pentru izolarea și identificarea Y. enterocolitica din alimente trebuie să se țină cont de următoarele aspecte:

flora bacteriană de asociație foarte variată

numărul de yersinii din alimente este mult mai scăzut decât din probele patologice, fiind necesar, ca urmare, o etapă de îmbogățire

bacteriile pot suferi degradări subletale în urma tratamentelor termice: frig, căldură, substante chimice, fiind necesară o etapă de resuscitare

nu toate yersiniile din alimente sunt patogene, ca urmare, sunt necesare metode care să identifice tulpinile patogene

Etapa de îmbogățire se poate realiza prin una din cele 3 metode, expuse mai jos:

3 ore resuscitare la 20-25° C în soluție tampon salin fosfat, pH 7,6 cu 2 % sorbitol și 0,15 % săruri biliare (PSB);

8 zile preîmbogățire în săruri biliare la 4° C, urmat de îmbogățire selectivă în bulion Rapport modificat (MRB), 4 zile la 20°÷25° C;

3 săptămâni îmbogățire la rece, la 4° C în (PSB).

După fiecare etapă, cultura este trecută pe agar CIN (Nofsoludin Irgsan-Novobiocină). După incubare la 28° C, 18-20 ore, coloniile specifice au culoarea roșie închisă, cu margini transparente. Din coloniile caracteristice dezvoltate pe mediile selective se efectuează teste biochimice, pe medii multitest (TST, MILF), pentru identificare. După aceasta, se trece la tipizarea serologică, tipizarea prin metode moleculare: electroforeza în câmp pulsatil (PFGE), ribotipizare, PCR (Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Feng și Weagant, 1994; Nesbakken, 2000; Răpuntean și Răpuntean, 1999; Rotaru și Mihaiu, 2002).

Bacterii Gram negative, de formă alungită încurbată,

nesporulate, aerobe, facultativ anaerobe

Genul Aeromonas

Dintre bacteriile acestui gen, cu importanță pentru industria alimentară, având în vedere implicarea în declanșarea unor episoade de toxiifecții alimentare este Aeromosa hydrophila. Această bacterie a fost izolată și descrisă pentru prima dată la broaște, ca fiind agentul cauzal în septicemia broaștelor (boala piciorului roșu). Este un germen larg răspândit în mediul înconjurător, în special în mediul acvatic, de unde poate contamina diverse alimente proaspete sau procesate, rolul acesteia în producerea unor gastroenterite fiind încă discutat. Deoarece are capacitatea de a crește la temperatura de 5° C, multe tulpini având factori de virulență, prezența lui A. hydrophila în alimente trebuie să constituie o preocupare majoră pentru medicii veterinari igieniști, responsabili de siguranța alimentelor.

Taxonomie și caracteristici

În anul 1986 a fost propusă familia Aeromonadaceae, pe baza rezultatelor analizei ARNr 16 S, al secvenței nucleotidelor 5S ARN și al testelor de hibridare ADN-ARNr, efectuate la un număr mare de tulpini izolate. În urma acestor analize, germenii din genul Aeromonas se pot diferenția de cei din familia Vibrionaceae, în care au fost incluși inițial. Pe baza unor caracteristici fiziologice și de genetică moleculară, microorganismele din genul Aeromonas sunt clasificate în două grupuri: unul reprezentat de aeromonadele mobile ( A. Hydrophila), și un grup mai omogen, de aeromonade imobile, în care este încadrată A. salmonicida. Acesta se diferențiază de A. hydrophila prin faptul că nu crește la 37° C, temperatura optimă de creștere fiind cuprinsă între 10°÷15° C, producând furunculoza somonilor. Pe mediile de cultură care conțin tirozina sau fenilalanină produce un pigment maroniu caracteristic.

Aeromonadele mobile sunt facultativ anaerobe, Gram negative, de formă bacilară dreaptă sau încurbată, de 1,1 ÷4,4 μm lungime și 0,4÷1,0 μm lățime. Majoritatea tulpinilor prezintă flageli polari monotrih, unele prezintă flageli laterali mai scurți, puține dintre ele având flageli dispuși lofotrih. Nu produc pigmenți în mediile de cultură. Pe agar nutritiv, coloniile sunt translucide spre albicioase, circulare, netede. Sunt heterotrofe, fermentând carbohidrații cu producere de acid sau acid și gaz. Din punct de vedere biochimic sunt asemănătoare cu enterobacteriaceele, de care se deosebesc prin capacitatea lor de a produce oxidază. Sunt catalază pozitive, reduc nitrații în nitriți. Toți reprezentanții genului Aeromonas, în afară de A. salmonicida, sunt mezofili, crescând de la 4°÷5° C până la 42°÷43° C, având un optim la 26°÷28° C. În bulion se dezvoltă la valori de pH cuprinse între 4,5÷9 și o concentrație a NaCl de 0,1÷4 %.

Pe baza testelor de hibridare a ADN și a testelor biochimice, s-au pus în evidență 31 specii, cu 14 subspecii: A. hydrophila subs. anaerogenes, A. hydrophila subs. dhakensis, A. hydrophila subs. hydrophila, A. hydrophila subs. proteolytica, A. hydrophila subs. ranae, A. caviae, A. media, A. euarenophila, A. sobria, A. veronii, A. veronii biotip sobria, A. schubertii, A. trota, A. salmonicida subs. achromogenes, A. salmonicida subs. salmonicida, A. salmonicida subs. pectinolytica, A. salmonicida subs. masoucida, A. salmonicida subs. smithia A. piscicola.

Mecanism de patogenitate

A. hydrophila produce o gamă variată de factori asociați cu virulența, care cuprind componente structurale și extracelulare – exotoxine. Factorii strucurali includ: pilii, stratul S–factor major de virulență pentru A. salmonicida, lipopolizaharide și flagelii. Dintre exotoxine: hemolizine – aerolizina, enterotoxine, enterotoxina citotoxică, asemănătoare cu toxina holerică, proteaze și siderofori. Factorii celulari asocați cu virulența acestor bacterii sunt reprezentați de invazine și factori de aderență. Hemolizinele sunt de tip α și β, iar enterotoxina citotoxică este rezistentă la 56° C timp de 20 minute.

Incidența bacteriei în mediul înconjurător și alimente

A. hydrophila are două caracteristici care facilitează contaminarea alimentelor: supraviețuiește perioade lungi de timp în apă și cresc în prezența unor nivele scăzute de componenți organici. Au fost izolate din apa potabilă clorinată, ceea ce sugerează că sunt rezistente la niveluri reziuale ale clorului din apa potabilă, de unde poate contamina carcasele. Alte studii au arătat că aeromonadele sunt mai sensibile la acțiunea clorului decât bacteriile coliforme, și ca urmare nivelul de clor care inactivează coliformii ar trebui să inctiveze și aeromonadele.

Germenii din genul Aeromonas au fost izolați dintr-o gamă variată de produse alimentare: pește, produse lactate, carne de pasăre, carne tocată de bovine, porcine, ovine, încărcătura bacteriană fiind cuprinsă între 1.1×101÷105 ufc/g. Cele mai frecvente specii identificate au fost: A. hydrophila, A. sobria și A. caviae. În preparatele de carne: șuncă, cârnăciori afumați, delicatese din carne, burtă de bovine, nivelul contaminării a fost cuprins între 102÷107 ufc/g.

Factori care afectează supraviețuirea și creșterea

Temperatura. Multe tulpini de A. hydrophila testate pot să se dezvolte în intervalul de temperatură 4°÷42° C, limita minimă a temperaturii de creștere fiind 0° C, ca urmare se pot dezvolta în numeroase produse de origine animală, inclusiv carne și preparate din carne păstrate la temperatura de refrigerare. De asemenea, se pot dezvolta chiar în prezența unei microflore reziduale în produsele respective.

NaCl și activitatea apei-factorul aw. Nivelul maxim de NaCl la care A. hydrophila se poate dezvolta este dependent de temperatură și de pH. La 28° C, multe tulpini pot să crească la o concentrație de 4.5 % NaCl și pH de 7.3. Cu cât temperatura scade, va scădea și nivelul de NaCl la care germenii se pot dezvolta. Cantitatea de sare restricționează creșterea microorganismelor prin scăderea factorului aw. Valoarea minimă a acestui factor la care se pot dezvolta aeromonadele este dependent de temperatură și concentrația de NaCl, fiind în cazul lui A. hydrophila de 0,98 (Bell și col., 2001).

Valoarea de pH și acidulanții. Toleranța la mediul acid este în funcție de temperatură și valoarea pH-ului din mediul de cultură. La 28° C, unele tulpini se dezvoltă în trei zile la pH de 4.5 în mediu acidifiat cu HCl, în timp ce la 5° C tulpinile cresc în 13-14 zile la pH de 5.5 și nu cresc la pH de 4.5.Activitatea inhibitorie a acizilor organici și anorganici asupra creșterii aeromonadelor, în ordine crescătoare, este următoarea: HCl, H2SO4, acid tartric, acid citric, acid lactic, acid acetic.

Nitriții. Inhibarea creșterii aeromonadelor de către nitriți este dependentă de valoarea pH-ului, fiind minimă sau absentă la pH 6.0 sau peste, și maximă la valori de pH mai mici de 6.0. Acest efect inhibant este mai accentuat în condiții de cultivare anaerobă. Punerea în evidență a acestor germeni în preparatele de carne în care se folosec nitriți, în urma controalelor efectuate, relevă fără dubiu procese de recontaminare, decât dezvoltarea lor în produsele respective.

Atmosfera gazoasă modificată. Fiind un germen facultativ anaerob, A. hydrophila a fost izolat din diverse produse ambalate sub vid sau în atmosferă gazoasă modificată, cel mai frecvent din carne proaspătă refrigerată.

Substanțe conservante. O gamă variată de compuși chimici adăugați direct sau indirect alimentelor, pot inhiba dezvoltarea lui A. hydrophila, cum ar fi: lichidele de afumare, aditivii alimentari-polifosfați, unele condimente cum sunt: coriandrul, piperul, usturoiul. Polifosfații produc modificări minime asupra timpului de generație și a perioadei de lag, însă combinați cu NaCl 3,5 %, duc la scăderea numărului de aeromonade. Într-un studiu comparativ privind efectul inhibitor al metil-p-hidroxibenzoatului și sorbatului de potasiu asupra a patru germeni psihrotrofi, s-a observat că cel mai sensibil a fost A. hydrophila. Acesta este sensibil și la acțiunea hidroxianisolului, propil-hidroxi-parabenzoatului și a trifosfatului de sodiu. Deși multe dintre aceste substanțe chimice pot inhiba individual creșterea bacteriană, sunt mult mai eficiente în cazul combinării cu alți factori, cum ar fi: NaCl sau pH-ul.

Bacteriocinele. Unele de bacterii lactice au demonstrat că au activități inhibitorii pentru dezvoltarea lui A. hydrophila. Nisina și pediocina, 4.000 de unități/ml, acționând individual nu au avut efect inhibitor asupra creșterii, însă combinate cu o prealabilă tratare termică prin încălzire sau congelare, au dus la creșterea sensibilității bacteriene.

Metode de izolare și identificare

Deși aeromonadele sunt bacterii care nu necesită medii nutritive speciale, putând crește pe medii simple, izolarea și identificarea lor se face folosind medii selective de cultură, pe suprafața cărora se striază materialul de cercetat, incubarea făcându-se la 30°÷35° timp de 24-48 ore. Mediile selective care se folosesc frecvent sunt: agar nutritiv cu sânge de oaie și ampicilină (SBA), agar cu amidon și ampicilină (SAA), (10μg/ml ampicilină pentru inhibarea florei de asociație), agar MacConkey, agar selectiv Pseudomonas-Aeromonas (GSP). În cazul în care se bănuiește că numărul germenilor este scăzut, sau celulele bacteriene au fost supuse unor tratamente termice, se recomandă o etapă de îmbogățire, putându-se utiliza două tipuri de bulion de îmbogățire: apa peptonată alcalină (APW) și bulion triptic de soia cu ampicilină (TSBP). După etapa de îmbogățire se trece pe unul din mediile selective enumerate mai sus, iar din coloniile caracteristice pentru aeromonade, se însămânțează pe bulion nutritiv și agar nutritiv înclinat pentru confirmare biochimică. Există diferite scheme de identificare care se bazează pe 7, 9 sau 16 teste biochimice: hidroliza esculinei, formare de gaz din glucoză, acid din arabinoză, producere de indol, acid din sucroză, reacția Voges Proskauer, rezistența la cephalotină etc. Există de asemenea kituri comerciale de identificare biochimică: API 20E, API 20 NE, etc. (Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Palombo și col., 2000; Rotaru și Mihaiu, 2002).

Genul Campylobacter

Principala specie enteropatogenă a genului, incriminată în declanșarea unor episoade de toxiinfecții alimentare la om, este C. jejuni, deși transmiterea bolii prin alimente se poate realiza și prin intermediul celorlalte specii: C. coli, C. lari, respectiv C. upsaliensis. În anul 1957, E.O. King a fost prima cercetătoare care a sugerat că, gastroenteritele umane sunt determinate de ceea ce dânsa a denumit “like vibrio”, pe baza morfologiei acestora, asemănătoare cu vibrionii. Nișa ecologică primară pentru campilobacterii este reprezentată de tractusul intestinal al animalelor, de unde pot contamina alimentele, în principal carcasele. Principalele măsuri, în scopul reducerii poluării cu aceste microorganisme, sunt reducerea contaminării în timpul vieții animalelor precum și în timpul proceselor de sacrificare și prelucrare al carcaselor.

Taxonomie și caracteristici

Germenii din genul Campylobacter sunt Gram negativi, de 0,2-0,5 μm lățime și 1,5-5μm lungime, de forma unor bastonașe subțiri curbate, în spirală, nesporulați, mobili datorită unui singur flagel dispus polar, care produce mișcări caracteristice în vrilă (prin înșurubare). În culturile mai vechi, germenii au uneori formă cocoidă. Încă nu s-a stabilit cu certitudine dacă această schimbare a formei le conferă un avantaj pentru supraviețuire sau este o deteriorare care poate duce la moartea celulară. Speciile cele mai implicate în producerea gastroenteritelor campilobacteriene, în proporție de peste 90 %, sunt C.jejuni, C. coli și C. lari. Aceste specii cresc în intervalul de temperatură 5°÷43° C, cu un optim între 30°÷37° C. Germenii sunt oxidază pozitivi, majoritatea speciilor enteropatogene sunt catalazo-pozitive, reduc nitrații în nitriți, nu fermentează carbohidrații. Energia necesară metabolismului este rezultată în urma decarboxilării și dezaminării aminoacizilor. Campilobacteriile nu tolerează concentrația de oxigen normală din atmosferă, crescând în condiții optime în microaerofilie.

Mecanism de patogenitate

Mecanismul de patogenitate nu este pe deplin explicat, însă deoarece manifestările clinice din campilobacterioză sunt asemănătoare cu cele determinate de alți germeni enteropatogeni, se presupune că este implicat un mecanism patogen asemănător sau similar.

Factorii de patogenitate diferă în funcție de specie și de tulpină:

Producerea de toxine – enterotoxina, foarte asemănătoare cu cea holerică, are o greutate moleculară de 60-70 kDa, este termolabilă fiind inactivată în 60 minute la 56° C; citotoxina produce efecte citopatice în celulele renale de bovine, liniile celulare Hella și Vero, fiind sensibilă la tripsină; endotoxina este reprezentată de lipopolizaharidele peretelui bacterian (LPS), fiind un important factor de virulență.

Structura suprafeței celulare, formată din lipopolizaharide (LPS) și peptide majore (OMP), contribuie la patogenitatea germenilor, asigurând invazia și aderența germenilor în celulele gazde. Aderența este realizată de OMP, cu o greutate moleculară de 27 kDa, care se cuplează de membrana celulei gazdă,

Răspunsul fagocitar al macrofagelor față de campilobacterii reprezintă un alt factor implicat în patogeneza acestora. S-demonstrat că germenii supraviețuiesc 6-7 zile în monocitele din sângele periferic;

Utilizarea fierului este de asemenea un factor de virulență, producția de toxine de către C. jejuni fiind crescută în mediile cu exces de fier;

Flagelul se pare că are un rol în patogenază bacteriilor, fiind implicat în procesele de colonizare a celulelor, în timp ce mutantele neflagelate sunt incapabile de colonizare.

C. jejuni își manifestă capacitatea patogenă prin două mecanisme: colonizarea și procesul invaziv. Colonizarea constă în aderarea și multiplicarea bacteriei la suprafața mucoasei intestinale si elaborarea enterotoxinei, care determină apariția diareei apoase. Mucusul intestinal reprezină o barieră pentru pătrunderea majorității germenilor enteropatogeni, însă campilobacteriile fiind foarte mobile, penetrează această materie vâscoasă, ajungând la nivelul criptelor Lieberkuhn. Procesul de invazie este reprezentat de pătrunderea bacteriilor în peretele intestinului, cu multiplicare intracelulară și diseminarea campilobacteriilor în interiorul și afara membranei, cu apariția leziunilor specifice. În infecțiile umane cu Campylobacter, apar în serul sangvin titruri mari de anticorpi Ig G, Ig M și Ig A, care indică faptul că, constutuienții celulari bacterieni interacționează cu sistemul imun extraintestinal.

Incidența în carnea și preparatele de carne

Carcasele de porcine sunt mai frecvent contaminate cu campilobacterii decât cele de bovine și ovine, incidența fiind cuprinsă între 2,9-95 %, în funcție de zona geografică. Carnea de bovine nu este considerată ca o sursă importantă de contaminare și transmitere a bolii la oameni, deși și aceasta se poate contamina în timpul proceselor tehnologice de sacrificare. Prin analiza probelor de carne, recoltate din magazine de desfacere din S.U.A., incidența contaminării a fost de aproximativ 5 %. Tulpinile enteropatogene de Campylobacter sunt implicate în declanșarea episoadelor de toxiinfecții alimentare la om, manifestate clinic și morfopatologic ca enterită, entero-colită sau gastro-entero-colită acută. În multe țări, ca Olanda, Anglia, Franța, Suedia, S.U.A, Australia, campilobacteriile sunt cauza principală a diareilor acute, incidența bolii în U.S.A. în anul 1998, fiind estimată la 1.000 cazuri/1.000.000 locuitori.

Metode de detecție, izolare, identificare

O caracteristică principală a germenilor este faptul că sunt microaerofile, dezvoltându-se optim la concentrații de 5-10 % CO2 și 85 % azot. Microaerofilia se datorează incapacității de a sintetiza compuși care leagă Fe3+ la nivele suficiente care să permită bacteriei dezvoltarea în condiții aerobe (21 % O2). Totuși, studiile realizate cu privire la capacitatea C. jejuni de a se dezvolta în condiții aerobe la temperaturi cuprinse între 5°÷25° C au relevat faptul că tulpinile cultivate în condiții aerobe, au supraviețuit același timp ca și cele cultivate în condiții de microaerofilie (Egan și Roberts, 1987). În ultimii ani s-au perfecționat tehnici moderne, rapide pentru identificarea acestor bacterii, cu scurtarea timpului de lucru de la 4-5 zile, la 1-2 zile: ELISA, reacția de polimerizare în lanț (PCR), amplificarea ARN celular prin RT-PCR (reverse transcriptaze PCR), testul PCR cu imunocaptare, care permite detectarea directă a lui C. jejuni fără necesitatea fazei de îmbogătire, durata metodei fiind de aproximativ 8 ore (Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Chynoweth și col., 1998; Franco și Williams, 1994; Giesendorf și col., 1992; Rotaru și Mihaiu, 2002; Stern și Line, 2000).

Genul Vibrio

Atât Aeromonas spp. cât și Vibrio spp. sunt implicate în procesele de alterare ale cărnii și produselor din carne. Germenii din genul Vibrio sunt implicați în procesele de alterare a produselor din carne conservate (bacon, șuncă), fiind favorizați de concentrații crescute de cloruri. Deși dispun de un bagaj enzimatic considerabil, contribuția vibrionilor la procesele de alterare este redusă, atât prin apariția mirosului străin cât și a compușilor de metabolism formați. Au capacitatea de a reduce nitrații și nitriții iar V. costicola, subspecia liquefaciens, degradează cazeina și gelatina. Unele tulpini produc H2S și pot forma mâzgă, datorită producției de dextrani (Nychas și Drosinos, 2000) ; (Brian și Day, 2000); (Garcia-Lopez și col., 1998).

Bacterii de forma bacilară, Gram pozitive, nesporulate,

aerobe, facultativ anaerobe

Flora microbiană inițială Gram pozitivă este reprezentată în principal de germeni din genul Micrococcus, bacterii acido-lactice și Brochotrix thermosphacta. Pe lânga acestea au mai fost identificate și alte bacterii saprofite Gram pozitive: Kurthia spp., stafilococi netoxigeni, micrococi, care reprezintă însă o componentă minoră a florei Gram pozitive.

Germenii Gram pozitivi condiționat patogeni și/sau toxigeni pot proveni fie din masa gastro-intestinală a animalelor sau de la nivelul tegumentului, consecutiv contaminărilor din timpul procesului de sacrificare și prelucrare a carcaselor, fie de la animalele bolnave, fie ca urmare a contaminării carcaselor cu microorganisme de la nivelul mâinilor operatorilor, cum ar fi: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, streptococi din grupul A, Clostridium perfringens A, C, Clostridium botulinum tip b și E non-proteolitic. Datorită toleranței relativ crescute fată de factorii inhibitori de dezvoltare a germenilor Gram pozitivi (valori reduse ale factorului aw, temperatura de refrigerare, valoarea pH-ului scăzută), se ajunge la o rată de supraviețuire crescută și o rezistență mai îndelungată, comparativ cu majoritatea germenilor Gram negativi din carne și preparatele de carne. Printre speciile de microorganisme care alcătuiesc microflora de alterare a cărnii, unele bacterii Gram pozitive prezintă un avantaj crescut în competiția cu germenii Gram negativi, în cazul cărnurilor ambalate sub vid, atmosferă modificată și supuse conservării. Dintre acestea, bacterii acido-lactice reprezintă deseori flora specifică de alterare în produsele respective, cu precizarea faptului că în anumite prparate de carne fermentate (cârnăciori, salamuri), activitatea metabolică a acestora este chiar dorită.

Genul Brochotrix

Microorganismele din acest gen au fost incluse inițial în genul Micrococcus, însă nefiind termotolerante, având conținutul G+C a ADN-ului de 36 %, mai scăzut decât ceilalți membrii ai genului, care au 58-64 %, neavând acid tricarboxilic ciclic operațional (ATCc), au fost mutate și plasate temporar în familia Lactobacillaceae. Recent s-a demonstrat că aceste microorganisme sunt mult mai asemănatoare cu germenii genului Listeria, deoarece activitatea catalazei și citocromii sunt prezente în ambele genuri, iar în urma analizei ARNr 16 S au secvențe de nucleotide omoloage. În prezent, genurile Brochotrix și Listeria sunt incluse în familia Listeriacea. Genul Brochotrix cuprinde două specii, B. thermosphacta și B. campestris, foarte asemănătoare din punct de vedere biochimic. Ambele specii fost izolate din sol, iarbă, însă pentru microbiologia alimentară are importanță doar B. thermosphacta, acesta fiind frecvent izolat din carnea de porc, bovine, ovine, de la nivelul echipamentelor și instrumentarului din abatoare, precum și din fecalele animalelor. Deoarece B. therosphacta ara capacitatea de a se dezvolta în medii cu un nivel ridicat de NaCl , la valori scăzute ale temperaturii și factorului aw și la concentrații foarte scăzute ale oxigenului (>0.2 %), determină rapid alterarea cărnii si a preparatelor din carne ambalate sub vid sau în atmosferă gazoasă modificată, păstrate la temperaturi de refrigerare. Sunt germeni întâlniți frecvent în ecosistemul microflorei cărnii și preparatelor de carne. Se deosebesc de germenii din genul Kurthia datorită faptului că pentru dezvoltare necesită condiții strict aerobe, pe când germenii din genurile Brochotrix și Listeria au capacitatea de a se dezvolta în condiții facultative anaerobe sau de microaerofilie.

Caracteristici

B. thermosphacta este Gram pozitiv de formă bacilară, dispus în lanțuri scurte sau lungi filamentoase, măsurând 0,6-0,8μm lățime și 1-2μm lungime. În culturile vechi se prezintă și ca forme cocoide. Este nesporulat, necapsulat, imobil, facultativ anaerob, producând colonii nepigmentate. Activitatea catalazei și a citocromoxidazei este prezenă doar la temperaturi cuprinse între 20°÷25° C și pe medii selective: APT, tween. Cultivat la temperaturi mai mari și pe alte medii, germenii își pot pierde aceste proprietăți.

B. thermosphacta este une germen psihrotrof care se dezvoltă în intervalul de temperatură 0°÷30° C, fiind nehemolitic și nepatogen pentru om și animale. Este un germen termolabil, fiind inactivat la 63° C în 5 minute. Germenii genului Listeria catabolizează glucoza atât în condiții aerobe cât și anaerobe pe calea Embden-Meyernhof-Parnas, pe când Brochotrix thermosphacta deține enzime specifice pentru catabolizarea glucozei atât pe calea Embden-Meyernhof-Parnas (EMP) cât și pe calea hexoză-monofosfat (HMP) (Farber și Peterkin, 2000). În condiții anaerobe și concentrații scăzute de glucoză, L-lactatul și etanolul sunt produși în raport de 3:1. De asemenea, s-a observat că în anumite condiții Brochotrix thermosphacta poate utiliza în cursul dezvoltării în bulion de carne nu numai glucoza, ci și riboza și glicerolul (Egan și Roberts, 1987). Din fermentația glucozei formează în special acid lactic, dar în cantități mici și acid acetic și propionic. Cultivat în condiții de anaerobioză și cantități de glucoză scăzute, formează etanol. În mediu aerob din glucoză formează acetonă, diacetil, acid isobutiric, isovalerianic, alți acizi grași și alcooli. Sinteza acizilor grași este realizată din aminoacizi, și nu prin lipoliză. Deoarece, majoritatea acestor compuși rezultați sunt neplăcuți din punct de vedere senzorial, ducând la apariția acririi, acidifierii, a mirosului de malț, mucegai, se explică de ce B. thermosphacta contribuie la reducerea substanțială a perioadei de valabilitate a produselor alimentare. Nu produce însă indol și scatol. Testul Voges Proskauer și roșu metil sunt pozitive, nu reduce nitrații, din fermentarea carbohidraților formează acid, dar nu produce gaz. B. thermosphacta nu prezintă activitate proteolitică, exercitându-și activitatea la suprafața de secționare a cărnii. Este capabil să se dezvolte în intervalul de pH 5-9, cu un optim la 7, majoritatea tulpinilor crescând la concentrații de NaCl de 6,5 % și chiar 10 %. În condiții aerobe se dezvoltă la valori ale factorului aw cuprinse între 0,94÷0,96 la temperaturi de 20°÷25° C, însă în condiții anaerobe dezvoltarea este mult limitată de scăderea temperaturii, pH-ului și a factorului aw. Efectul nitriților asupra lui Brochotrix, prin comparație cu lactobacilii, este ușor crescut, aceștia dezvoltându-se la valori de 100 ppm nitrit, la un pH ≥5,5 și temperatura de 5° C, în mediu aerob și 2-4 % NaCl. În absența oxigenului sau la 200 ppm nitrit, dezvoltarea este inhibată. În atmosferă gazoasă modificată, creșterea nivelului de CO2 nu este inhibitorie pentru B. thermosphacta decât la concentrații mai mari de 50 %. Spre deosebire de B. thermosphacta, B. campestris nu se dezvoltă la concentrații ale NaCl de 8 % și produce o bacteriocină activă împotriva lui B. thermosphacta, asupra unor lactobacili, listerii și alți germeni Gram pozitivi.

Importanța pentru industria alimentară

Fiind un organism nepatogen pentru om, are importanță datorită faptului că produce alterarea rapidă a cărnii și a preparatelor din carne, ambalate sub vacuum sau atmosferă gazoasă modificată și păstrate în condiții de refrigerare. Aceste procese apar chiar dacă B. thermosphacta nu reprezintă populația microbiană majoritară în alimentele respective. La nivele de contaminare de 5 log10 ufc/g/cm2 modificările senzoriale sunt evidente și duc la confiscarea produselor respective. În carne nu produce decolorarea țesutului muscular.

B. thermosphacta ridică probleme mai ales pentru preparatele din carne, care au pH-ul cuprins între 6.2÷6.5 menținute la temperaturi mai mari de 9° C, decât pentru carnea proaspătă, care are pH-ul între 5.4-5.5. Pentru produsele ambalate, dacă se asigură ambalaje care să asigure o barieră eficientă pentru oxigen, de exemplu pe bază de clorură de poliviniliden (PVDC), B. thermosphacta nu va ridica probleme. Pentru produsele menținute la temperaturi de refrigerare, în condiții aerobe, sub vacuum sau atmosferă gazoasă modificată (excepție face situația în care concentrația de CO2 este de 100 % sau când se folosesc amestecuri de gaze pe bază de azot și CO2), acești germeni pot forma populația dominantă a microflorei. În prezența oxigenului la nivele peste 0,2 %, B. thermosphacta se poate dezvolta, nefiind afectat de competiția cu ceilalți germeni ai microflorei de asociere, formând pruduși metabolici urât mirositori. În cazul în care temperatura de depozitare a produselor este mai mare de 10° C, și concentația de oxigen este scăzută, sunt depășiți numeric de lactobacili. Se anticipează că importanța acestor microorganisme pentru stabilirea prospețimii și a perioadei de conservarea a alimentelor va crește în viitor, mai ales în cazul produselor ambalate în folii de polietilenă, sub vacuum sau atmosferă gazoasă modificată (mai ales carne feliată), mod de prezentare care capătă tot mai multă popularitate.

Deoarece B. therosphacta are capacitatea de a se dezvolta în medii cu un nivel ridicat de NaCl, la valori scăzute ale temperaturii și factorului aw și la concentrații foarte scăzute ale oxigenului (>0.2 %), determină rapid alterarea cărnii si a preparatelor din carne ambalate sub vid sau în atmosferă gazoasă modificată, păstrate la temperaturi de refrigerare. Din fermentația glucozei formează în special acid lactic, dar în cantități mici și acid acetic și propionic. Cultivat în condiții de anaerobioză și cantități de glucoză scăzute, formează etanol. În mediu aerob din glucoză formează acetonă, diacetil, acid isobutiric, isovalerianic, alți acizi grași și alcooli. Sinteza acizilor grași este realizată din aminoacizi, și nu prin lipoliză. Deoarece, majoritatea acestor compuși rezultați sunt neplăcuți din punct de vedere senzorial, ducând la apariția acririi, acidifierii, a mirosului de malț, mucegai, se explică de ce B. thermosphacta contribuie la reducerea substanțială a perioadei de valabilitate a produselor alimentare. Nu produce însă indol și scatol.

Metode de izolare și identificare

Germenul este izolat frecvent din carnea și preparatele de carne conservate prin refrigerare, în condiții anaerobe, fără a fi necesare etape de îmbogățire. După efectuarea diluțiilor zecimale, se trece pe medii solide, cum ar fi: agar nutritiv glicerolat, însă pe acest mediu vor crește și alte bacterii: pseudomonade, Kurtia spp., lactobacili, stafilococi, etc. Un mediu selectiv recomandat pentru identificarea B. thermosphacta este mediul STAA, care conține în plus față de agarul nutritiv glicerolat, streptomicină 500μg/ml, actidionă 50 μl/ml și acetat de thalus 50 μl/ml. După incubare la 20°-25° C timp de 23 zile se formează colonii de 1-4 mm. Deoarece pe acest mediu se pot dezvolta și pseudomonadele, trebuie efectuat testul oxidazei din coloniile respective, care va fi pozitiv, iar colonia va deveni albastră, în timp ce în cazul lui B. thermosphacta care sunt oxidază negative, colonia va rămâne incoloră. Selectivitatea acestui mediu se bazează pe activitatea antimicrobiană a sulfatului de streptomicină fată de corinebacterii și alți germeni Gram pozitivi sau negativi, care se aseamănă morfologic cu Brochotrix. Se pot folosi tehnici moderne de identificarea tulpinilor de B. thermosphacta bazate pe analiza ARNr 16S, PCR. Deși inițial metoda a avut succes, ulterior, rezultatele obținute nefiind la fel de bune ca și cele obținute prin metodele clasice, respectiv mediul STAA (Bărzoi și Apostu, 2002; Holley, 2000).

Bacterii acido-lactice

Bacteriile acido-lactice (LAB) reprezintă pricipala floră bacteriană a cărnii și preparatelor din carne ambalate în atmosferă gazoasă modificată sau sub vid. Din grupul bacteriilor lactice fac parte membrii genurilor Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus și Streptococcus. Dintre acestea, genurile Lactobacillus și Leuconostoc reprezintă principalele genuri implicate în procesele de alterare a acestor produse, L. sake, L. curvatus, L. carnosus fiind izolați frecvent, ultimul fiind asociat cu procesele de alterare în produsele ambalate in vid, în special în cazul șuncii feliate (Bjorkroth și col., 1998).

Caracteristici

Membrii grupului de bacterii lactice sunt Gram pozitivi, nesporulați, de formă bacilară, cocoidă sau cocobacilară, grupate în perechi, lanțuri, ocazional tetrade, majoritatea fiind catalază negative, cu toate că sunt și specii catalază pozitive, mai ales în cazul în care speciile atipice au crescut în medii cu un nivel scăzut de carbohidrați. Membrii grupului de bacterii lactice sunt împărțiți în specii homofermentative și heterofermentative, în funcție de modul de degradare al hexozelor. Tipurile homofermentative produc acid lactic din glucoză în 90 % din cazuri, în timp ce tulpinile heterofermentative produc cantități mai scăzute de acid lactic, producând în schimb cantități sporite de acid acetic, CO2 și compuși neutri.

Pe baza acestor caracteristici, membrii genurilor Pediococcus și Streptococcus sunt homofermentativi, cei ai genului Leuconostoc sunt heterofermentativi, în timp ce membrii genului Lactobacillus sunt fie heterofermentativi, fie homofermentativi. Majoritatea bacteriilor lactice sunt non–lipolitice, sau posedă un număr mic de lipaze pentru clivarea trigliceridelor. De asemenea, aceste bacterii prezintă o slabă activitate proteolitică, cu excepția câtorva specii din genul Streptococcus. Capacitatea bacteriilor de a se dezvolta la temperaturi scăzute ridică mari probleme procesatorilor de produse refrigerate, cazul cărnii, L. viridiscens fiind considerat unul dintre agenții responsabili de producerea putrfacției verde în preparatele conservate. Bacteriile lactice datorită propriețăților fermentative, a toleranței la valori scăzute de aciditate și NaCl, deseori inhibitorii pentru alte bacterii, beneficiază de mecanisme biologice pentru represarea creșterii altor specii bacteriene, devenind astfel populația dominantă.

În comparație cu alte bacterii de alterare, bacteriile lactice produc modificări organoleptice tipice, cum ar fi: acrire (acidifiere), producere de gaz, iar în faza staționară, formare de mâzgă. Deoarece produsele ambalate sub vid au o perioadă de valabilitate de 3-4 săptămâni, în cazul existenței unor tulpini da bacterii lactice de alterare, se pot declanșa procesele de alterare, care vor duce la confiscarea produselor respective. Într-un studiu efectuat cu privire la alterarea șuncii feliate ambalate sub vid, s-au izolat un număr foarte mare de bacterii lactice, observându-se că în multe cazuri, loturile de preparate prezentau modificări organoleptice înainte ca termenul de valabilitate să fie expirat.

Unele tulpini de bacterii lactice își exercită efectul inhibant datorită unor bacteriocine pe care le sintetizează, cum ar fi: lactocina 27, lactacina B, helveticina J, plantacina M, plantaricina A. În industria cărnii, unele bacterii lactice sunt larg utilizate ca și culturi starter în procesele de fermentare a salamurilor și cărnaților având rol în conservarea acestora, dar contribuind și la intensificarea aromei. Speciile de bacterii lactice cele mai des utilizate ca și culturi starter sunt: Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus și Lactobacillus plantarum ( Schillinger și Luke, 1989). Capacitatea de a produce acid lactic și ca urmare de scădere a pH-ului, a devenit în ultimii ani o metodă valoroasă de inhibare a microflorei potențial patogene sau patogene din multe alimente, bacteriile lactice furnizând mecanisme antagonice pentru represarea creșterii lui S. aureus, Salmonella spp., Listeria spp. și a altor specii de bacterii psihrotrofe, inclusiv asupra bacteriilor lactice de alterare (Bărzoi și Apostu, 2002; Stamer, 1980).

Bacterii de formă cocoidă, Gram pozitive, aerobe sau facultative anaerobe

Genurile Micrococcus și Staphylococcus

Spre deosebire de stafilococi, majoritatea micrococilor nu fermentează glucoza în condițiii anaerobe cu producere de acizi. Majoritatea micrococilor au fost asociați de numeroși cercetători cu preparatele de carne supuse proceselor de maturare. Unii dintre ei, Micococcus varians și Micrococcus kristinae sunt utilizați în industria preparatelor de carne ca și culturi starter, datorită modificarilor fizico-chimice pe care le produc în acestea (Fisher și Schleiter, 1980). Find germeni strict aerobi, majoritatea micrococilor utilizează sursele de carbon: glucoza, fructoza, glicerolul și lactatul cu producere de CO2 și apă. Metabolizarea glucozei se realizează pe calea metabolică fructoză 1,6-difosfat și hexozo-monofosfat. Excepție reprezintă Micococcus varians și Micrococcus kristinae, care se pot dezvolta și în condiții facultativ anaerobe cu producere de acid lactic din glucoză. Potențialul patogen al micrococilor este foarte rar întâlnit, cu toate că Micococcus luteus, Micrococcus kristinae, și Micrococcus sedentarius au fost implicați în anumite infecții la oameni.

Dintre cele 39 de specii de stafilococi, doar cei coagulază pozitivi sunt considerați a fi potențial patogeni: S. aureus, S. intermedius și S. hycus, tulpinile de S. aureus fiind producătoare a diferite tipuri de enterotoxine termostabile, germenul fiind implicat în declanșarea toxiinfecțiilor alimentare la om (Vasiu, 2001; (Răpuntean și Răpuntean, 2001; Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002).

Genul Listeria

Genul Listeria cuprinde 16 specii, cu 4 subspecii, dintre care doar L. monocytogenes este patogenă pentru om: L. ivanovii subs. ivanovii, L. murrayi, L. grayi, L. seeligeri, L. welshimeri, L. inocua.

Caracteristici

Germenii din acest gen sunt Gram pozitivi, catalazo-pozitivi, nesporulați, facultativi anaerobi, de formă bacilară, de 0,4-2 μm lungime și0,3-0,5 μm lățime, având capetele rotunjite. Sunt mobili datorită unor flageli dispuși peritrih. Mobilitatea este prezentă la 20°÷25° C și absentă la 37° C. L. monocytogenes este un germen psihrotrof, capabil de creștere la temperaturi de refrigerare, fiind implicat în procesele de alterare a produselor refrigerate. Temperatura minimă de creștere pentru L. monocytogenes este de –0.4° C, cu un optim de 25°÷30° C, crescând încet la temperaturi de refrigerare, timpul per generație fiind cuprins între 27÷62 ore. Capacitatea L. monocytogenes de a se dezvolta într-un interval larg de temperatură, în mediu acid, în absența sau prezența unei cantități scăzute de oxigen, îi oferă posibilitatea de a se multiplica în diverse medii. Este larg răspândit în natură, fiind izolat din apa potabilă, apele reziduale din abatoare, canalizare, silozuri, lapte și preparate din lapte, carne și preparate din carne, fecale umane și animale.

Factori de virulență și mecanism de patogenitate

Pe baza antigenelor somatice și flagelare ale L. monocytogenes s-au stabilit 13 serotipuri. Deși listerioza la om poate fi produsă de toate cele 13 serotipuri, majoritatea îmbolnăvirilor sunt cauzate de 3 serotipuri: 1/2a, 1/2b și 4b. În privința distribuției geografice a serotipurilor, s-a constatat că, în multe țări europene predomină serotipul 4b, 1/2a, 1/2b, în Canada și S.U.A. serotipul 4b, iar în Australia și Ungaria 1/2a și 1/2b (Farber și Petemkin, 2000). Patogenitea este determinată în primul rând de virulență și într-o măsură mai mică de toxicitate. În organismele gazdă listeriile se multiplică intracelular, provocând leziuni decelabile electronomicroscopic. Multiplicarea intracelulară se poate realiza în diferite tipuri de celule: celulele M din plăcile Payer, celulele epiteliale intestinale, eritrocite, etc. După pătrunderea în celulă, urmează internalizarea bacteriei prin intermediul internalinei A, cu o greutate moleculară de 88 kDa și internalinei B, cu o greutate de 65 kda, alcătuită din 630 aminoacizi. Urmează liza vacuolei, încapsularea în fibrele de actină, multiplicarea, reorganizarea actinei sub forma unei cozi care asigură mobilitatea bacteriei în citoplasmă, migrarea intracitoplasmatică și asocierea citoplasmatică cu membrana celulară sub forma unui pseudopod, solubilizarea celor două membrane și reluarea ciclului de multiplicare (Răpuntean și Răpuntea, 1999). În lizarea membranei vacuolei intervin două enzime: listeriolizina O (LLO), primul factor de virulență al listeriei și o fosfatidil-inozitol-fosfolipaza C (Pi-PLC).

Incidența în carne și preparate din carne

Contaminarea cărnii de către L. monocytogenes se poate realiza fie prin intermediul echipamentului, intrumentarului, a spațiilor abatorului (pereți, paviment, mese de tranșare), fie prin intermediul mâinilor operatorilor. La taurine și ovine sursa majoră de contaminare este reprezentată de tegument și firele de păr, fiind mai puțin reprezentată de contaminarea fecală, în timp ce la porcine, contaminarea fecală reprezintă cea mai importantă sursă de contaminare a carcaselor. L. monocytogenes a fost izolată atât din spațiile abatorului, cât și din spațiile de desfacere a cărnii și preparatelor din carne, fiind identificată dintr-o largă varietate de produse. Incidența raportată a contaminării variază în limite destul de largi, în principal datorită metodologiei diferite de izolare și identificare folosite. Majoritatea studiilor arată că, frecvent, contaminarea se realizează la suprafața cărnii și a preparatelor, însă au fost cazuri în care s-au depistat listerii și în profunzimea maselor musculare, în 5 din 110 probe de carne de bovine, ovine și porcine, serotipul I fiind cel mai frecvent izolat. Încărcătura cu germeni a fost destul de scăzută, sub 100 ufc/g, în fazele inițiale de contaminare. Datorită largii răspândiri a L. monocytogenes în jurul și în unitățile de procesare a cărnii, este puțin probabil că aceasta poate fi eliminată din unitățile respective. Însă, în cazul în care se respectă cu strictete normele de igienă în toate etapele fluxului tehnologic, cu dezinfecția riguroasă a echipamentelor și instalațiilor, carcasele obținute pot să fie libere de L. monocytogenes.

Factori care afectează creșterea în alimente

Creșterea L. monocytogenes în carne este dependentă în mare măsura de temperatură, pH, tipul de țesut, precum și de încărcătura microbiană inițială. Glass și Doyle (citat de Farber și Peterkin, 2000), au observat că listeriile cresc bine în carnea în care pH-ul este de 6.0 sau peste 6.0, în timp ce în carnea în care pH este 5.0 sau mai mică, creșterea este încetinită sau absentă.

În cazul mezelurilor, factorii inhibitori par să fie pH-ul, factorul aw și eventual lichidele de afumare utilizate. În carnea de bovine ambalată sub vid, L. monocytogenes crește la temperaturi de 0° C și pH de 6.5. Valori ridicate ale nitriților și scăzute ale factorului aw reduc creșterea L. monocytogenes în unele preparate din carne: șuncă, carne sărată de vită păstrată la 0°÷5° C, listeriile crescând mai repede în carnea sărată de vită la pH de 6.2, 5 ppm NO2 și aw de 0.97, decât în șuncă la pH de 6,6, factorul aw 0,97 și NO2 de 170 ppm. De asemenea, s-a observat că L. monocytogenes poate să crească pe șuncă, salam, carne sărată de bovine ambalate sub vid și păstrate la temperaturi de 0°, 2°, 5° și 10°C, însă când produsele au fost ambalate în atmosferă de 100 % CO2, germenii nu s-au dezvoltat la temperaturi sub 5° C. În cazul în care produsele au fost ambalate în atmosferă de CO2 de 50 %, listeriile au crescut la 4°-5° C, însă la valori mai mari de 75 % CO2, L. monocytogenes poate crește, însă aceasta este influențată de pH, temperatură și microflora de asociație. În privința eficacității acizilor folosiți pentru inhibarea dezvoltării L. monocytogenes, datele sunt controversate, unii autori arătând că eficacitatea este următoarea, în ordine crescătoare: acid acetic, lactic, citric, pe când alții au observat că cel mai eficient este acidul citric, urmat de acidul lactic, cel mai slab fiind acidul acetic.

Metode de izolare și identificare

Izolarea L. monocytogenes din alimente care conțin flora de asociație este dificilă și necesită etape de îmbogățire selective a probelor, înainte de striere pe agaruri selective de izolare. Cele mai utilizate medii folosite actual pentru izolarea și identificarea L. monocytogenes din alimente sunt:

Medii de îmbogățire selectivă: bulion de îmbogățire pentru Listeria 1, LEB 1; bulion de îmbogățire pentru Listeria 2, LEB 2; bulion Fraser;

Medii agarizate de izolare selective: agar LPM (Listeria phenylethanol moxalactam), agar Palcam, agar Oxford, agar ALOA.

Coloniile caracteristice se supun următoarelor teste pentru confirmare și identificare: catalaza, colorația Gram, mobilitate, hemoliza, fermentația D-glucozei, D-xilozei, D-manozei, L-ramnozei, testul CAMP (Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Donnelly și Catherine, 1994; Farber și Peterkin, 2000; Răpuntean și Răpuntean, 1999; Membre și col., 1999; Rotaru și Mihaiu, 2002; Vasiu, 2001).

Bacterii de formă bacilară, Gram pozitive, sporulate,

aerobe, facultativ anaerobe

Genul Bacillus

Dintre germenii acestui gen, cu importanță pentru industria alimentară este B. cereus. Este un germen Gram pozitiv, mobil, aerob, dar crește și în condiții de anaerobioză, necapsulat, sporulat, sporul fiind situat central sau subterminal, de formă eliptică sau cilindrică, nedeformând celula. În mediile de cultură sporularea se produce în aproximativ 2-3 zile, germenul pierzându-și mobilitatea în timpul fazelor inițiale ale sporulării. B. cereus este larg răspândit în natură, fiind izolat din sol și plante, de unde poate contamina în special alimentele de origine vegetală, însă poate ajunge și în alte produse, cum ar fi: lapte și preparate din lapte, carne și preparate din lapte. În bulion nutritiv produce turbiditate intensă necaracteristică, iar pe agar formează, în funcție de mediul folosit, colonii mari, opace de tip R, cu aspect caracteristic. Când este cultivat pe agar cu sânge de cal, după 48 ore la 35°÷37° C, formează colonii mari de 4-7 mm, opace, plate, de culoare verzuie, înconjurate de o zonă de hemoliză α sau β, în funcție de tulpină. Unele studii au arătat că temperatura minimă de creștere este în jurul valorii de 10°÷12° C, însă tulpinile psihrotrofe pot crește la temperaturi de 4°÷6° C (Chynoweth și col., 1998; Cousin, 2000). B. cereus este implicat în producerea a două sindroame diferite de toxiinfecții alimentare: sindromul diareic și sindromul emetic. Forma diareigenă este determinată de enterotoxina produsă în timpul creșterii vegetative a lui B. cereus la nivelul intestinului subțire, pe când forma emetizantă este determinată de multiplicarea celulelor bacteriene în alimente. Examenul serologic al tulpinilor de B. cereus a demonstrat că în sindromul diareic sunt implicate serotipurile H1, H2, H6, H8, H10, H12 și H19, iar în producerea sindromului emetic sunt implicate serotipurile H1, H5, H8, H11, și H19. Preponderența serotipului H1, față de celelalte serotipuri, demonstrază că sporii tulpinilor H1 sunt mai rezistenți la tratamentul termic al alimentelor, inclusiv al cărnii preparate prin fierbere.

Multe tulpini de B. cereus au capacitatea de a produce ambele tipuri de toxine. Recent au fost declarate două cazuri de T.I.A. în Norvegia, care au apărut în urma consumului de ostropel. Doza infectantă a fost estimată la o încărcătură de 104÷105 ufc/g. Din 17 persoane care s-au îmbolnăvit, 3 au fost spitalizate, din care una timp de trei săptămâni. În cel de-al doilea caz, au fost implicate 152 persoane, cele mai severe simptome fiind manifestate de către tinerii de 16-19 ani. Simptomele au debutat la aproximativ 24 ore de la consumului ostropelului, durata bolii fiind de 2-7 zile.

Factorii de virulență și mecanismele de patogenitate

Patogeneza în cazul B.cereus are la bază o serie de metaboliți extracelulari, elaborați mai ales în timpul fazei de multiplicare logaritmică și a fazei staționare. Unii dintre acești metaboliți sunt veritabile toxine sau factori de virulență, identificați pe baza comportării in vivo. Principalele toxine elaborate de B. cereus sunt enterotoxina diareigenă, toxina emetică, hemolizinele, fosfolipazele și citotoxinele. Enterotoxina diareigenă (ED), este o proteină antigenică, termolabilă, cu o masă moleculară de 38 kDa, alcătuită din 344 aminoacizi, fiind compusă din mai multe subunități sensibile la acțiunea enzinelor proteolitice. Este dermonecrotică, letală, produce distensia intestinului la iepure, având rol în producerea toxiinfecțiilor alimentare. Toxina emetică, denumită cereulida, are o structură inelară, peptidică, fiind alcătuită din 4 aminoacizi, care se repetă de trei ori. Greutatea moleculară este de aproximativ 10 kDa, nu este antigenică și citototoxică, nu produce distensia intestinului la iepure și șoarece. În schimb este termostabilă, rezistând la 128° C 90 minute, rezistentă la acțiunea proteazelor fiind activă și la valori de pH extreme, 2-11. Producerea toxinei are loc la temperaturi cuprinse între 25°÷32° C, însă unele studii au demonstrat că elaborarea toxinei emetice se realizează și la temperaturi de 12° C. Din 7 tulpini de B. cereus supuse cercetării, 6 au crescut la 12° C, începând cu a două zi de incubare. Deasemenea, sporularea la toate cele 6 tulpini a avut loc la 12° C, iar cinci dintre tulpini au elaborat toxina la 12° C, începând cu ziua 4-a de incubare (Cousin, 2000).

Metode de izolare și identificare

B. cereus se dezvoltă ușor pe medii de cultură uzuale, însă pentru identificare sunt necesare medii de îmbogățire și izolare: bulion îmbogățit cu triptonă și sulfat de polimixină B (TSPB), agar cu piruvat, gălbenuș de ou, manitol, albastru de bromtimol și polimixina B (PEMBA). Confirmarea microscopică constă în efectuarea examenelor bacterioscopice din coloniile caracteristice pentru B. cereus și colorarea cu verde de malachit, negru de sudan B și safranină. Apariția unor bacili așezați în lanțuri scurte, cu globule de grăsime intracelulare negre, iar sporii colorați în verde așezați central sau subterminal, reprezintă elemente caracteristice pentru B. cereus. Confirmarea biochimică constă în efectuarea testelor de fermentare a glucozei, reducerea nitraților, reacția Voges-Proskauer, care sunt pozitive pentru B. cereus. Pentru detectarea toxinelor se poate recurge la: administrarea orală a alimentelor contaminate sau a preparatelor purificate la om, câine, pisică, maimuță; inocularea ansei ileale de iepure ligaturată; administrarea i.d. a filtratului de cultură la cobai și iepure; teste imunoenzimatice. În cazul toxinei vomitigene, administrarea orală prin intubație gastrică la maimuță a culturilor de B. cereus și apariția vomitării la scurt timp de la administrare, este considerată pozitivă. Asupra culturilor celulare HE 52 provoacă vacuolizarea celulară (Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Finlay și col., 2000; Granum, 1997; Răpuntean și Răpuntean, 1999; Rotaru și Mihaiu, 2002; Schultz și Smith, 1994; Microorganisms in Foods, vol. 6, 1998).

Bacterii de formă bacilară, Gram pozitive, sporulate, anaerobe

Genul Clostridium

Principalele microrganisme responsabile de declanșarea toxiinfecțiilor alimentare sunt reprezentate de Cl. perfringens și Cl. botulinum.

Clostridium perfringens

Acești germeni au fost asociați pentru prima dată cu toxiinfecțiile alimentare în urmă cu aproximativ 50 ani, în 1953, pe baza unor studii efectuate de Hobbs și col. (cit. de Labbe R.G., 2000). Agentul cauzal al T.I.A. este reprezentat de tipul A de Cl. perfringens, producător de enterotoxină. Cl. perfringens este un bacil Gram pozitiv, sporulat, cu spor de formă ovală, situat subterminal, imobil, de 3-9μm lungime și 0,9-1,3 μm lățime. În condiții de creștere rapide, pe medii îmbogățite cu glucoză, celulele sunt mai scurte decât în condiții de creștere înceată. Sporularea are loc în medii alcaline, la pH mai mic de 6,6 nu sporuleză. Deși este un germen anaerob, totuși tolerează cantităti scăzute de oxigen. Conținutul în G+C al ADN-ului este de aproximativ 24-27 %.

Factori de patogenitate

Cele mai multe tulpini de Cl. perfringens produc enterotoxina, atât in vitro cât și in vivo, în timpul sporulării, aceasta fiind constituită din 12 factori toxici, notați de la α la υ. Majoritatea tulpinilor produc α toxina, care este lecitinazică, fosfolipază C, letală, necrotică și hemolitică. Pe baza acestor factori toxici, deosebiți antigenic, s-au evidențiat 5 serotipuri (A, B, C D, E), cu următoarele biotipuri: A1, B1, B2, C2, C3, C4, D, E (Thomas și col., 1989). Enterotoxina are o greutate moleculară de 33,317 kDa, fiind formată dintr-o singură polipeptidă cu 309 aminoacizi, inactivată de pronază și subtilisină, rezistentă la acțiunea tripsinei, chimotripsinei, a lipazelor, α amilazei și neuraminidazei. Expunerea la chimotripsină și tripsină crește activitatea biologică a toxinei, sugerând o posibilă activare la nivelul intestinului subțire în timpul evoluției T.I.A. Enterotoxina este termolabilă, pierzându-și activitatea biologică după o încălzire timp de 5 ore la 60° C, 7 zile la 35° C, 28 zile la –20° C, însă la 4° C activitatea biologică nu este afectată timp de câteva săptămâni. Pentru inducerea simptomelor intoxicației este necesară o cantitate de 8-10 mg de enteroxină purificată. Prin liza celulelor bacteriene, enterotoxina este eliberată și se cuplează de celulele epiteliale intestinale. Locul primar de acțiune al toxinei este marginea în perie a vilozităților intestinale, ducând la descuamarea stratului epitelial, fenomen care apare în 15 minute de la contactul cu enterotoxina.

Incidența în produsele alimentare

Numeroase studii au arătat că, Cl. perfringens tip A, a fost identificat dintr-o gamă variată de alimente, în principal produse proaspete de origine animală. Aproape 50 % din totalitatea probelor recolate de carne tocată de bovine au fost pozitive pentru acest germen. De asemenea a fost identificat în proporție de 29,66 respectiv 35 % din carcasele de bovine, porcine și ovine. O mare atenție trebuie acordată condimentelor, din care Cl. perfringens a fost izolat în proporție de 80%, din 54 de sortimente diferite. Prezența germenilor, mai ales în stare sporulată, reprezintă un risc crescut de contaminare a preparatelor din carne, în care sunt folosite aceste ingrediente, sporii rezinstând proceselor termice la care sunt supuse preparatele respective iar procesele de răcire înceată, ducând la creșterea unui număr mare de celule vegetative.

Factori care influențează dezvoltarea în alimente

Cl. perfringens poate să se dezvolte la temperaturi cuprinse între 15°÷50° C, la 15° C coloniile aparând după câteva zile. Unele studii au demonstrat că, Cl. perfringens poate să crească și la 12,8° C, în carnea friptă de bovine, când este prezent și Pseudomonas fragi, probabil ca urmare a consumului de oxigen de către ultimul. Temperatura optimă de creștere este 43°÷46° C, în funcție de tulpină.

În scopul reducerii riscurilor microbiologice, unele țări au stabilit măsuri specifice pentru răcirea alimentelor. Astfel, în S.U.A., răcirea produselor alimentare de la 60° la 5° C trebuie făcută în cel mult 6 ore. Valoarea cea mai scăzută a factorului aw la care se poate dezvolta Cl. perfringens este 0,93, în prezența glucozei și 0.,95 prin utilizarea NaCl. Pentru a preveni creșterea clostriidiilor concentrația de NaCl trebuie să fie de 7-8 %, iar a nitriților între 60-2560 ppm, în funcție de tulpină. Prin combinarea acestor factori, nivelul inhibitor al nitritului scade de la 300 ppm la 25μg/g, când NaCl crește de la 3 la 6 %.

Metode de izolare și identificare

Pentru izolare din alimente se folosesc medii de cultură selective, care conțin polimixina B, sulfit, cistină-cisteină, punând în evidență capacitatea germenului de a produce hidrogen sulfurat, manifestat prin apariția coloniilor negre. În prezent, cele mai utilizate medii de cultură sunt: agar TCS (triptonă-sulfit-cicloserină), cu sau fără adaos de gălbenuș de ou; agar SFP, care are aproximativ aceeași compoziție ca a agarului TSC, însă în locul cicloserinei are 3 mg polimixină B și 12 mg kanamicină sulfat/l. În medii lichide produce turbiditate intensă și mari cantități de gaze, degajând miros de rânced. Pe medii solide, în condiții anaerobe formează colonii rotunde de 2-5 mm, convexe, cenușiu-gălbui, opace. Pe suprafața agarului cu sânge produce în jurul coloniilor zone de hemoliză β. În lapte turnesolat, determină o fermentare tumultuoasă, cu acidifiere și coagulare, coagulul având aspect alveolar. Pentru confirmarea biochimică, cinci colonii caracteristice se vor supune testelor de mobilitate, reducerea nitratului pe agar semisolid și pe medii cu gelatină și lactoză pentru testarea gelatinolizei și fermentării galactozei. Pentru Cl. perfringens sunt caracteristice următoarele aspecte: fermentează cu producere de acizi și gaze glucoza, lactoza, zaharoza, fructoza, manoza, hidrolizează amidonul, lichefiază gelatina, produce hidrogen sulfurat, reduce albastru de metil, roșu metil pozitiv, indol și AMC negative (Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Blankenship și col., 1998; Labbe, 2000; Răpuntean și Răpuntean, 1999; Rotaru și Mihaiu, 2002).

Clostridium botulinum

Pe baza caracteristicilor fiziologice și ale producerii de neurotoxine, Cl. botulinum este diferențiat în patru grupe. Studiile de genetică bacteriană, hibridarea ADN-ADN, analiza 16 S ARNr, au arătat că în timp ce tulpinile cuprinse în același grup fenotipic sunt foarte apropiate în privința tipului de toxină produs, cele patru grupuri fenotipice corespund la patru grupuri distincte filogenetic. Tulpinile din grupurile I și II sunt puțin asemănătoare, deși produc același tip de toxine, pe când între tipul I și IV, există o diferență suficient de mare pentru a se crea patru specii. În privința denumirii tulpinilor de Cl. botulinum, trebuie făcută precizarea cu privire la tipul de toxină pe care îl produce și grupul din care face parte, deoarece ambele grupuri, I și II, produc același tip de toxină, B sau F (tab. 5).

Taxonomie și caracteristici

Sunt bacterii anaerobe, mobile, sporulate, cu spor situat subterminal, de 0.5-2μm lățime și 1.6-20μm lungime. Botulismul la om este determinat de tulpini din grupele I și II. Microorganismele grupului I au o activitate proteolitică intensă, digerând și degradând rapid proteinele native, pe când cele din grupul II nu au aceste proprietăți, însă lichefiază gelatina. Din degradarea aminoacizilor: valină, izoleucină, leucină și fenilalanina se produc acid isobutiric, izovalerianic și fenilpropionic, doar de către tulpinile grupului I.

Temperatura minimă de creștere a acestor bacterii reprezintă criteriu important de diferențiere între tulpinile celor două grupuri. Astfel, tulpinile grupului I nu sunt capabile de multiplicare sub temperatura de 10° C, pe cele ale grupului II se pot multiplica la temperaturi de 3°÷3.3° C.

Incidența în carne și produse din carne

În S.U.A. incidența Cl. botulinum în carnea și preparatele de carne este cuprinsă între 0,04÷5,5 %, fiind identificate tipurile A și C de neurotoxine. În Anglia, incidența este cuprinsă între 2÷14 %, depistându-se până la 5 spori/kg produs. Cea mai crescută incidență în Anglia, de 77 %, a fost raportată în anul 1977 în probele de bacon ambalate sub vid, fiind detectate în principal tipurile A, B de neurotoxină. Însă, tehnicile utilizate pentru izolarea și detecția tulpinilor au favorizat în principal pe cele ale grupului I, mediul de îmbogățire fiind incubat la 35° C, în prezența tripsinei, care favorizează elaborarea neurotoxinei. Factorii care afectează creșterea și supraviețuirea tulpinilor din grupurile I și II de Cl. botulinum, sunt prezentate în tabelul 6.

Sporii tulpinilor de Cl. botulinum din grupul I sunt mult mai rezistenți la căldură decât cei produși de tulpinile grupului II, neproteolitice. Aceasta are importanță pentru alimentele care sunt conservate doar prin aplicarea unui tratament termic moderat și apoi sunt refrigerate.

Tabel nr. 5

Grupele de Clostridium botulinum

(Barbara M.Lund, M.W. Peck, The microbiological Safety and Quality of Food, Vol II, 2000)

Temperatura minimă pentru dezvoltarea și producerea de toxine în cazul tulpinilor grupului I este de 10°÷12° C, toxina fiind elaborată în 3-4 săptămâni. Pentru tulpinile din grupul II, temperatura minimă de creștere și de producere a toxinei este de 3° C, toxina fiind elaborată în 7 săptămâni. La temperaturi sub 3° C nu a fost detectată creșterea și elaborarea de toxină. Însă, odată cu creșterea temperaturii, perioada de elaborare a toxinei s-a scurtat, astfel că la 5°, 10° și 20° C ambele toxine, B și F au fost produse în 42.7 ore, 7,2 ore respectiv 1.9 ore.

În condiții optime, tulpinile grupului I se pot dezvolta la valori minime de pH cuprinse între 4.4-4.8, pe când cele din grupul II nu se pot dezvolta sub pH de 5. Creșterea tulpinilor proteolitice de Cl. botulinum este prevenită de o concentrație de 10 % NaCl și o valoare a factorului aw de 0.93, pe când tulpinile neproteolitice nu se dezvoltă la valori ale NaCl mai mari de 5%. Efectul nitriților asupra creșterii germenilor este în funcție de pH. În prezența a 2.5 % NaCl și a 200 mg NaNO2/kg, efectul tratamentului termic este mai eficient, nu atât în privința distrugerii sporilor, cât în inhibarea creșterii formelor vegetative.

Tabel nr. 6

Factorii care afectează creșterea și supraviețuirea tulpinilor

din grupurile I și II de Cl. botulinum

(Barbara M.Lund, M.W. Peck, The microbiological Safety and Quality of Food, Vol II, 2000)

Prevenirea creșterii și formării neurotoxinelor de către Cl. botulinum se poate face prin combinarea diverșilor factori fizici, chimici și biologici, cum ar fi: aciditatea și scăderea pH-ului, ca urmare a acțiunii creșterii germenilor din culturile starter, combinate cu o scădere a factorului aw din produsul final. În cazul în care creșterea germenilor este inhibată doar prin intermediul refrigerării, cazul cărnii proaspete ambalate în folii de polietilenă, cu o permeabilitate scăzută a filmului de plastic pentru gaze și la temperatura de 0° C, are loc o creștere a concentrației de CO2 ca urmare a metabolismului țesutului muscular. Clostridiile nu sunt prezente în mod normal în profunzimea cărnii, dar pot apărea la suprafața țesutului, însă în acest caz vor trebui să competiționeze cu miroflora de alterare, și abia apoi să producă toxinele. Cu toate acestea, au fost câteva raportări de alterări ale cărnii crude ambalate sub vacuum și păstrate la temperaturi sub 3°C, produse de Clostridium spp. Riscul de apariție a botulismului la om este mai mare în cazul consumului peștelui refrigerat, ambalat în aceeași condiții, deoarece au fost raportate cazuri de intoxicații în urma consumului acestor categorii de produse care au fost contaminate cu spori ale tulpinilor non-proteolitice de Cl. botulinum în special tip E. Aceasta, deoarece toxinele pot fi elaborate înainte ca produsul să fie modificat în privința aspectului organoleptic (Lund și Peck, 2000).

Izolarea Cl. botulinum din alimentele incriminate în apariția TIA este dificilă, deoarece după multiplicare și elaborarea toxinelor, germenii se autolizează, dacă nu exista condiții optime de sporulare. Ca medii de îmbogățire se folosesc bulionul cu ficat, carne, glucoză, extract de drojdii, peptonă, tripsină (TPGYT). Pentru a îndepărta inhibitori potențiali se recomandă centrifugarea, după care se inoculează în 2 eprubete cu mediul de îmbogațire. Inoculul unei eprubete se inactivează prin încălzire la 75°÷80 °C timp de 15 minute, iar apoi ambele se incubează.

Culturile dezvoltate se striază pe suprafața unor medii de izolare solide:

geloză cu sânge, cu bulion Wenberg, când după 5-7 zile la 35°÷37 °C apar colonii mari, verzi-cenușii, cu hemoliză în jur.

agar nutritiv cu galbenuș de ou și glucoză. Tulpinile lipază pozitive: A, B, C, D, E formează colonii cu zone de precipitare.

Coloniile caracteristice se pasează pe bulion Vf, verificându-se în privința caracterelor morfologice, culturale, biochimice, iar o parte din cultura obținută în tubul cu bulion Vf se centrifughează, filtrează, iar filtratul se supune identificării toxinei botulinice prin metode in vitro și in vivo (Bărzoi și col., 1999; Bărzoi și Apostu, 2002; Răpuntean și Răpuntean, 1999; Rotaru și Mihaiu, 2002; Vasiu, 2001).

Alte specii de clostridii psihrotrofe implicate în procesele de alterare

ale cărnii și preparatelor din carne ambalate

În urma studiilor efectuate de către Broda D. M. și colaboratorii asupra germenilor din genul Clostridium s-au pus în evidență câteva specii noi de clostridii psihrotrofe, implicate în procesele de alterare ale preparatelor din carne ambalate sub vid sau atmosferă gazoasă modificată (Broda și col., 1996; Broda și col., 2000; Broda și col., 2000; Broda și col., 2000; Moorhead și Bell, 1999).

În urma dezvoltării procedeelor de depozitare a cărnii și a preparatelor din carne în condiții de refrigerare și a metodelor de ambalare moderne, sub vid sau atmosferă gazoasă modificată, pe lângă creșterea perioadei de valabilitate a acestor produse, s-a creat o nișă ecologică specifică pentru bacteriile psihrotrofe, capabile să se dezvolte în conditii anaerobe. Majoritatea bacteriilor asociate cu alterarea cărnii feliate, ambalate în vid, provin fie din mediul înconjurător: sol, suprafețele abatorului, sau din materiile fecale ale animalului, ca urmare a contaminării în timpul jupuirii, eviscerării, tranșării carcaselor. În anul 1989, Dainty, E. și Hibbard (cit. de Bell R.G. și col. 2001), a stabilit pentru prima dată legătura cauzală dintre clostridiile psihrotrofe și alterarea cărnii ambalată în folii de polietilenă sub vid, respectiv, prin distensia ambalajului, “blown– pack”. Astfel, în cazul cărnii ambalate în vid, după 4–6 săptămâni de depozitare la temperatura de 1.5°÷2° C, s-a produs distensia ambalajului, cauzată de acumularea masivă de gaze și apariția de mirosuri dezagreabile. Agenții cauzali ai acestui tip de spoliere, “blow–pack”, au fost câteva specii de clostridii psihrotrofe: Cl. esterthicum și Cl. laramiense, descoperite în 1992 și trei specii noi, Cl. frigicarnis, Cl. gasigenes, Cl. aligidixylanolyticum. Cl. gasigenes este Gram pozitiv, mobil, de formă bacilară, de 4.5–9.4 μm lungime și 1.3–1.6 μm lățime, dispus izolat sau în perechi. Crește în intervalul de temperatură 3.8°÷40.5° C. Compoziția ADN-ului în G+C este între 27.3 – 28.4 %. Bacteriile fermenteaza o gamă lărgă de carbohidrați, hidrolizează gelatina, au activitate lecitinazică cu producere de acetat, etanol, lactat, butirat, butanol hidrogen și CO2. Coloniile pe agar cu sânge de oaie sunt de 0.7 – 3 mm, rotunde, cu margini regulate, gri-albicioase, convexe, înconjurate de o zonă de β hemolică (Broda și col., 1999).

Cl. frigicarnis formează pe agar cu sânge de oaie colonii de 2,7-7,2 mm, circulare sau neregulate, lobate, gri cremoase, opace sau semi-opace, β hemolitice. Germenul este Gram pozitiv, mobil, sporulat, cu spor eliptic dispus subterminal, psihrotrof, dezvoltându-se între –1.5°÷26° C. Fermentează celobioza, fructoza, manoza, inozitolul, trehaloza, hidrolizează gelatina, amidonul și esculina. Conținutul de G+C al ADN-ului este 28.3÷29.4 % (Broda și col., 2000).

Cl. algidixylanolyticum este Gram pozitiv, de formă bacilară, de 1.8–2.8 μm lungime și 0.5–0.8 μm lățime, sporulat, mobil. Pe agar cu sânge de oaie formează colonii circulare de 0.8–2.5 mm diametru, gri–albicioase, translucide, β hemolitice. Temperatura de creștere este cuprinsă între 2.5°÷32.2° C, iar pH-ul între 4.7–9.1. Fermentează arabinoza, celobioza, fructoza, galactoza, glucoza, inulina, maltoza, manoza, rafinoza, sucroza și xyloza, hidrolizeaza amidonul și degradează xylanul. În urma fermentatiei produce în bulion PYGS acetat, format, lactat, etanol, butirat, hidrogen și oxigen. Conținutul în G+G a ADN este de 38.4 % (Broda și col., 1996; Broda și col., 2000; Broda și col., 2000; Moorhead și Bell, 1999). De asemenea, unele specii de clostridii psihrotrofe se pare că sunt implicate în procesul de fermentație acidă (încingere) a carcaselor la porcine, ovine, bovine care sunt supuse unui proces de răcire lent. Încingerea se produce mai ales în regiunile profunde ale carcaselor, aproape de os, în special la nivelul sfertului posterior, însă pentru stabilirea cu certitudine a acestui fapt sunt necesare studii ulterioare. (De Lacy și col., 1998; Rotaru și Mihaiu, 2001).

Activitatea metabolică a germenilor Gram pozitivi în ecosistemul cărnii

Supraviețuirea și dezvoltarea microorganismelor în carnea și preparatele de carne sunt rezultatul uneui complex de interacțiuni care au loc între speciile de germeni care alcătuiesc ecosistemul cărnii și factorii intrinseci și extrinseci specifici pentru fiecare categorie de produs alimentar în parte. Microorganismele cele mai bine adaptate la acești factori determinanți, intrinseci și extrinseci, cu cea mai ridicată rată de multiplicare, vor reprezenta populația dominantă, cu efecte asupra salubritătii cărnii, ca urmare a declanșării activitătilor metabolice microbiene. În general, nivelurile de încărcătură bacteriană mai mari de 106 ufc/cm2 sunt considerate suficiente pentru declanșarea modificărilor senzoriale ale produselor (apariția mirosului și gustului străin, producerea de mâzgă). Pe lângă declanșarea proceselor alterative (proteoliză/putrefacție, acrire, gust și miros străin, etc.), ca urmarea interacțiunii dintre microorganisme, datorită producerii unor produși toxici de metabolism (amine biogene), sau a unor exotoxine, unii germeni Gram pozitivi (Clostridium spp., Staphylococcus spp.) pot fi considerați potențial patogeni sau chiar patogeni pentru consumatori.

Pe de altă parte, unele dintre activitătile metabolice ale germenilor Gram pozitivi sunt benefice: producerea de acid lactic, reducerea nitriților și nitraților în timpul proceselor fermentative și de maturare ale preparatelor de carne. Prezența bacteriilor acido-lactice în carnea ambalată în vid poate fi chiar benefică, deoarece aceasta duce la un control “natural” al germenilor potențial patogeni și de alterare putrifică, datorită acidului lactic și a altor compuși cu activitate antimicrobiană, inhibantă.

Producerea anumitor metaboliți antimicrobieni poate să facă parte din mecanismul complex al interrelațiilor microbiene, prin care unele microorganisme devin dominante în contextual prezenței altor germeni competitori. Prin înțelegerea acestor mecanisme, se oferă soluții valoroase pentru înțelegerea complexității interrelațiilor microbiene din ecosistemul cărnii și prin urmare baza abordării “biologice” a conservării alimentelor. Trebuie menționat că unii dintre acești metaboliți pot avea fie un efect negativ asupra salubrității produselor, fie unul benefic, prin modificările fizico-chimice survenite în produsele supuse fermentării și maturării (acidul lactic). Din metabolizarea carbohidraților, în principal glucoză, glicogen, glucoza-6-fosfat și în măsură mai mică riboză, în carnea și preparatele de carne se produc acizi organici prin glicoliză, fie pe calea metabolică EMP sau HMP. Catabolizarea carbohidraților este utilizată de majoritatea bacteriilor Gram positive pentru obținerea energiei iar în cazul bacteriilor acido-lactice aceasta implică și fosforilarea. În tabelul nr. 7 sunt prezentați câțiva metaboliți cu proprietăți antimicrobiene și microorganismele asupra cărora au efect inhibant.

Acidul lactic este principalul produs final de metabolism al bacteriilor acido-lactice precum și a unor germeni din genurile: Staphylococcus, Brochotrix și Listeria. Bacteriile lactice, în principal, sunt capabile să reducă pH-ul la valori la care germenii de putrefacție (pseudomonadele, clostridiile), cei patogeni (S. aureus, B. cereus, Cl. botulinum) sunt fie inhibați fie distruși. Mai mult, datorită faptului că acidul lactic este solubil pentru grăsimile din peretele bacterian, va pătrunde în celula bacteriană determinând scăderea pH-ului intracelular, încetinind astfel activitatea metabolică. În cazul enterobacteriaceilor (E. coli), dezvoltarea microbiană este inhibată la valori de pH de 5.1. Scăderea rapidă a pH-ului la valori de 5.2 – 5.1, în cazul produselor fermentate este suficientă pentru a inhiba dezvoltarea salmonelelor și a lui S. aureus.

Tabel nr. 7

Compușii metabolici ai bacteriilor acido-lactice cu proprietăți antimicrobiene

În cazul germenilor din genurile Listeria și Brochotrix, potențialul redox și disponibilitatea oxigenului va influența diferit cantitatea și proporția produșilor finali de metabolism rezultați din catabolizarea glucozei. L. monocytogenes produce în condiții aerobe acetoină (26 %), lactat (28 %) și acetat (23 %) iar în condiții anaerobe lactatul este produs în proporție de 79 %, acetatul 2 %, formatul 5.4 %, etanolul 7.8 % și dioxidulul de carbon 2.3 % (Romick și col, 1996).

Acidul acetic este produs de către speciile de bacterii lactice heterofermentative (Leuconostoc spp.), însă în cantități reduse, ca o consecință a metabolismului acestor microrganisme. Acest metabolit poate constitui un factor vital pentru stabilirea populației microbiene dominante inițial din timpul fermentațiilor spontane. În condițiile în care hexozele și disponibilitatea oxigenului sunt foarte scăzute, bacteriile acido-lactice homofermentative (pediococi, lactococi, mai ales Lactobacillus spp.), descompun acidul lactic în acid acetic, acid formic și dioxid de carbon (Kandler O., 1983).

Apa oxigenată este formată de unele specii da bacterii acido-lactice în prezența oxigenului molecular în timpul producerii lactatului, piruvatului și NADH de către enzimele flavinice. Oxidarea lactatului poate fi realizată de o flavină ce conține L(+) lactat-oxidaza, fie în prezența oxigenului (Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake), fie în prezența albastrului de metilen ca și acceptor de electroni (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei). Majoritatea pseudomonadelor și Staphylococcus aureus sunt aproximativ de 10 ori mai sensibile la acțiunea apei oxigenare decât bacteriile acido-lactice. Concentrația apei oxigenate necesară pentru realizarea efectului bacteriostatic este de 6 μg pentru stafilococi și 23-25 μg în cazul pseudomonadelor.

Apa oxigenată poate fi produsă ca urmare a reducerii oxigenului în timpul proceselor fermentative din produsele de carne sau ca rezultat al contaminării cu bacterii lactice a acestor produse, ducând la modificări de tip oxidative al produselo. Unul dintre tipurile de înverzire ale produselor alimentare este cauzată de acumularea de apă oxigenată, produsă de anumite tulpini de bacterii acidolactice, în condițiile unui Eh scăzut. În urma reacției dintre H2O2 cu nitrozo-hemocromul se formează o porfirină oxidată verzuie.

Metaboliți cu masă moleculară scăzută. Diacetilul este produs în carne de anumite specii ale genului Pediococcus, ca urmare a degradării acidului citric. Datorită aromei lui intense, chiar în concentrații scăzute, poate contribui la apariția gustului și mirosului străin. Ca și agent antimicrobian, are însă un rol minor.

Dioxidul de carbon, produs de către bacteriile acido-lactice heterofermentative, din descompunerea hexozelor, contribuie la scăderea Eh-ului, fiind inhibitor pentru unele bacterii aerobe de putrefacție, inclusive Brochotrix thermosphacta. Aceste însușiri pot fi observate concomitent cu producerea de acizi , în produsele de carne ambalate în vid.

Reuterina (3-hidroxi-propionaldehida), este produsă din glicerină în prezența coenzimei B12 de către Lactobacillus reuteri. Spectrul larg antimicrobian al acesteia poate fi datorat de inhibarea reductazei ribonucleotidelor microbiene. Datorită acestei proprietăți, Lactobacillus reuteri, poate fi utilizat în bioconservarea cărnurilor, prin introducerea acestuia în culturile starter (Davies A., 1998).

Bacteriocinele. Aceste peptide cu potențial antimicrobian crescut sunt produse de diferite bacterii, inclusive bacterii acido-lactice, fiind în general active față de microorganismele înrudite cu cele producătoare. Sunt inactivate de proteaze la nivelul tubului digestive.

Tabel nr. 8

Clasificarea bacteriocinelor produse de către bacteriile acido-lactice

(Schillinger și col., 1995)

Majoritatea bacteriocinelor produse de către bacteriile lactice sunt termostabile (la 100˚C rezistă 10 min.), hidrofobe, prezentând o tendință în direcția formării multimerilor. Spectrul lor de activitate pare să fie determinat de prezența receptorilor la nivelul peretelui celular, de ex. acidul lipoteicoic pentru pediocina AcH (Davies A., 1998). Majoritatea bacteriocinelor au în general un efect antimicrobian bactericid, puține având efect bacteriostatic. Datorită efectului antimicrobian, acești metaboliți au fost intens studiați în ultimii ani, în scopul precizării posibilității folosirii lor și a potențialului acestora pentru bioconservare. Bacteriocinele produse de către bacteriile acido-lactice sunt clasificate în prezent în 3 categorii, după cum urmează (tab. nr. 8):

grupa antibioticelor (nisina) și a compușilor non-lantionine, ce conțin peptide de membrană active cu masă moleculară scăzută;

grupa proteinelor cu masă moleculară mare, termolabile;

grupa complexului de bacteriocine, glicoproteine.

Proteoliza. În afara germenilor din genul Clostridium și unele specii de Bacillus, majoritatea bacteriilor Gram positive întâlnite în carne, prezintă o activitate proteolitică redusă sau chiar absentă. Despre potențialul bacteriilor acido-lactice de degradare enzimatică a proteinelor cărnii se cunosc relativ puține aspecte. Studiii asupra sistemului proteinazelor extracelulare al lactobacililor au fost efectuate de către Hammes W.P. și col. (1992), rezultatele obținute arătând că, în general, activitatea proteolitică a lactobacililor este destul de redusă. În cazul tulpinilor de Pediococcus pentosaceus și Staphylococcus xylosis izolați din șunca afumată, nu a fost depistată nici un tip de activitate endopeptidazică. S-a sugerat ipoteza că procesele de alterare ale cărnii exprimate prin apariția mirosului străin sau producerea aromei și gustului plăcut, în procesele fermentative din cârnăciorii și salamurile maturate, pot să fie cauzate de descompunerea aminoacizilor liberi în urma activității proteolitice exercitate de către bacteriile acido-lactice. Deși micrococii și stafilococii sunt capabili să producă proteinaze extracelulare, rolul acestora în proteoliza preparatelor din carne fermentate nu este elucidat pe deplin (Nychas și Arkoudelos, 1990). Despre potențialul proteolitic al germenilor din genul Brochotrix și Kurthia se cunosc destul de puține date, unele specii din genul Kurthia produc însă cantități reduse de H2S.

Lipoliza. Despre activitatea lipolitică a bacteriilor acido-lactice în ecosistemul cărnii sunt cunoscute relativ puține aspecte, însă se pare că aceasta este scăzută. Activitatea enzimatică lipolitică a micrococilor (în condiții aerobe) și stafilococilor (în condiții aerobe spre anaerobe), pare să contribuie parțial la producerea aromei și gustului plăcut în preparatele de carne supuse fermentației. Conform studiilor lui Hammes W.P. (1995), unele tulpini de Staphylococcus piscifermentans și Staphylococcus carnosus își exacerbează potențialul lipolitic pe agar tributirin.

Activitatea catalazică. Efectele oxidative negative consecutive producerii apei oxigenate în carne prin diferite mecanisme, pot fi contracarate de către catalază sau alte peroxidaze. Catalaza poate inhiba sau reduce procesele de râncezire (Nychas și Arkoudelos, 1990). Acestă proprietate poate să fie avantajoasă din punct de vedere al utilizării culturilor starter în obținerea preparatelor din carne maturate, în care acumularea apei oxigenete poate fi prevenită de către catalază. În practica curentă, tulpinile de micrococi și stafilococi utilizate în culturile starter sunt selectate pe baza unei activități crescute ale catalazei. Deși biosinteza catalazei este blocată în condiții anaerobe în absența hemului, sinteza acesteia a fost posibilă prin adăugarea de hematină (Hammes, 1995). Aceasta demonstrează că tulpinile de Staphylococcus carnosus utilizate ca și culturi starter au capacitatea de a produce catalază în timpul proceselor fermentative din preparatele de carne crude maturate. Culturile starter de Lactobacillus sake producătoare de catalază, s-au demonstrat a fi superioare calitativ față de cele reprezentate de Lactobacillus curvatus datorită îmbunătățirii culorii cărnăciorilor cruzi uscați (Davies, 1998).

Reducerea nitraților și nitriților. Deși nu este o proprietate comună bacteriilor acido-lactice, câteva tulpini de Lactobacillus și Weissella întâlnite în carne produc atât reductaze pentru nitriți cât și pentru nitrați. (Lactobacillus pentosum și Lactobacillus plantarum) sau produc reductaze doar pentru nitriți (Lactobacillus brevis, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus sake), (Wolf și Hammes, 1995). Reducerea nitraților în nitriți este realizat în procesul tradițional de maturare lentă a cârnăciorilor cruzi de anumite specii de micrococi și stafilococi. Tulpinile de Staphylococcus carnosus și Staphylococcus piscifermentans, microorganisme specifice pentru obținerea cârnăciorilor fermentați, prezintă în general o activitate crescută de reducere a nitratului și mai scăzută de reducere a nitritului (Hammes, 1995). Concentrația de nitriți în timpul proceselor fermentative poate fi redusă fie datorită oxidării nitriților fie reducerii acestora, ceea ce scoate în evidență rolul foarte important al activității nitrit-reductazelor al acestor microorganisme pentru procesarea preparatelor de carne, cunoscându-se efectul nociv al nitriților asupra consumatorilor.

Aminele biogene. Acestea sunt produse în principal în alimentele cu conținut crescut de proteine, fie prin decarboxilarea aminoacizilor, ca urmare a activității microbiene sau prin aminarea și transaminarea aldehidelor și cetonelor (Davies A., 1998). În cazul în care concentrația aminelor biogene este crescută, aceastea exercită un efect toxic asupra consumatorilor, mai ales în cazul în care acestea se cuplează cu nitriții, rezultând nitrozaminele, cu potențial cancerigen cunoscut. Datorită mirosurilor și gusturilor străine neplăcute, de putrid, aminele biogene contribuie în mare măsură la degradarea produselor alimentare.

Decarboxilarea aminoacizilor este întâlnită frecvent la enterobacteriacee, însă este rar prezentă la majoritatea bacteriilor Gram pozitive (excepție Bacillus și Clostridium). Dintre aminele biogene produse de către germenii Gram pozitivi, în carne s-a identificat tiramina, prezența ei putând fi pusă pe seama activității metabolice a tulpinilor de Carnobacterium și a câtorva tulpini de Lactobacillus curvatus și Lactobacillus plantarum (Masson și col., 1996). Germenii din genul Micrococcus și Lactobacillus sake nu prezintă această proprietate.

Mecanismele de alterare a cărnii și preparatelor de carne sub influența microorganismelor

Alimentele sunt supuse în timpul depozitării unor procese de degradare variabile, care includ modificări senzoriale, ale valorii nutritive și ale calității igienice. Procesele de degradare pot să fie de natură fizică, chimică sau microbiologică. Factorii care pot determina apariția acestor procese sunt: temperatura, lumina, radiațiile, oxigenul, umiditatea, enzimele endogene țesutului muscular, contaminanții industriali, macro și microorganismele. Această gamă de factori potențiali degradanți și marea diversitate a alimentelor explică de ce multe variante a proceselor de conservare clasice își găsesc aplicația în industria agro-alimentară modernă.

Unul dintre cele mai importante aspecte ale siguranței alimentelor este reprezentat de înțelegerea și controlul mecanismelor de acțiune ale factorilor implicați în procesele de degradare a alimentelor, în scopul prevenirii apariției fenomenelor alterative și a prelungirii perioadei de valabilitate (limita optimă de consum) a acestora. Termenul de valabilitate al produselor alimentare este definită după unii autori ca perioada de timp necesară unui aliment, în care, calitatea nutritivă și igienică a acestuia să ajungă la un nivel neacceptabil. Acest nivel neacceptabil este variabil da la un consumator la altul. Astfel, unii consideră ca neacceptabil prezența mirosului slab perceptibil al cărnii, în timp ce alții preferă carnea în care mirosul este intens modificat. În multe situații, termenul de valabilitate reprezintă durata de timp în care produsul este vandabil, fiind reprezentat de un echilibru care trebuie realizat între procesator și distribuitor, în care procesatorul trebuie să definească pentru fiecare produs calitatea minimă acceptabilă. Termenul de valabilitate depinde de următorii factori: tehnologia de procesare și ambalare, condițiile de transport și depozitare.

Procesele de alterare ale cărnii reprezintă un fenomen complex în care sunt implicate microorganismele prezente în țesutul muscular, atât la suprafață cât și în profunzime, consecutiv unei contaminări secundare din timpul procesării, fiind dependente în mare măsură de nivelul inițial de contaminare microbiană, precum și de de temperatura și umiditatea mediului din spațiile tehnologice (Napravnikova și col., 2002). Alterarea cărnii este definită ca un fenomen ecologic care cuprinde totalitatea modificărilor ecosistemului cărnii, de-a lungul dezvoltării asocierilor microbiene. Stabilirea unei asociații microbiene particulare în carne depinde de factorii ecologici care persistă în timpul procesării, depozitării, transportului și desfacerii acesteia. În carne, cinci categorii de determinanți ecologici influențează dezvoltarea asocierilor microbiene inițiale, tranzitorii, și determină stabilirea populației dominante. Acestea sunt:

factorii intrinseci, asociați cu proprietățile fizico-chimice și structurale ale cărnii: pH-ul, activitatea apei (factorul aw reprezintă procentul de apă “liberă” conținut de aliment, fiind raportul dintre proporția vaporilor de apă din aliment–p, față de cea a apei pure–p0, aw =p/p0), prezența componenților antimicrobieni naturali sau adăugați, Eh-ul (potențialul oxidoreducător), precum și compoziția cărnii: conținutul de carbohidrați, în special concentrația de glucoză;

parametrii intrinseci biotici – factori impliciți, care au un rol important în geneza asocierilor de alterare;

parametrii extrinseci, care exercită o influență selectivă: temperatura, U.R. %, compoziția atmosferei gazoase în cazul produselor ambalate în acest mod, în timpul depozitării;

factorii de procesare: jupuire, eviscerare, tranșare, tratare termică, depozitare;

efectele combinate, care rezultă în urma interacțiunii factorilor pentru a produce efecte mai mari decât ar fi de așteptat, în urma acțiunii lor singulare.

Ca urmare, în practică, specialiștii în procesarea cărnii încearcă să modeleze unii sau toți acești parametri, cu scopul de a extinde perioada de valabilitate a cărnii și a preparatelor din carne, sau de a obține noi produse (Brown, 2000); (Nychas și Drosinos, 2000).

Depozitarea cărnii în condiții de refrigerare este asociată cu modificări ale calității acesteia, ca urmare a activității microbiene, modificării pH-ului, apariției unor produși intermediari de degradare toxici. Răcirea rapidă a carcaselor la temperaturi scăzute, viteza crescută a curenților de aer, poate duce la o reducere a populației bacteriene, în timp ce o răcire blândă, va permite creșterea și dezvoltarea germenilor psihrotrofi, astfel încât aceștia vor ajunge populația dominantă ducând la apariția proceselor de alterare ale cărnii (Jackson și col., 1997); (Lawry și Gill. 1997); (Day, 2000). Factorii care favorizează declanșarea rapidă a proceselor de alterare sunt: încărcărcătură mare de germeni psihrotrofi, temperatura crescută din spațiile de depozitare, valori mari ale factorului aw de la suprafața carcaselor apropiate de 1.0 (depinde de U.R%. și viteza aerului din spațiile respective).

Baur G. (1995), cit. de Nychas, (2000), a demonstrat că enzimele proprii țesutului muscular și cele de origine microbiană sunt implicate în apariția modificărilor fizico-chimice: modificări de culoare și consistență, producere de mâzgă (strat lipicios la suprafața cărnii și preparatelor de carne), oxidarea lipidelor, producerea de amine biogene, ce apar în timpul perioadei de depozitare. Principalii factori implicați în declanșarea proceselor de degradare ale alimentelor sunt: creșterea și dezvoltarea microorganismelor (bacterii, drojdii și mucegaiuri), acțiunea enzimelor de origine alimentară și a unor reacții chimice în interiorul produselor, temperatura de păstrare și umiditatea necorespunzătoare, oxigenul, lumina și durata de păstrare. De regulă, acești factori nu acționează independent, ci simultan în declanșarea proceselor alterative.

Există două tipuri principale de alterare a alimentelor în funcție de factorii implicați: alterarea microbiană cauzată de către microorganisme și produșii de metabolism ai acestora, și alterarea non-microbiană, care poate să fie cauzată de diverse substanțe străine care pot ajunge în alimente și de enzimele care există in mod natural în acestea. Cei mai importanți factori care influențează dezvoltarea și creșterea microorganismelor în carnea crudă păstrată în condiții de refrigerare, sunt reprezentați de încărcătura inițială de germeni psihrotrofi și de dinamica creșterii microbiene la temperaturi scăzute. Configurația și încărcătura microflorei responsabile de declanșarea proceselor alterative ale cărnii depind de valoarea pH-ului, temperatura de depozitare, activitatea apei (factorul aw), atmosfera spațiului de depozitare și relațiile dintre speciile bacteriene care alcătuiesc ecosistemul cărnii (Napravnikova și col. 2002).

Microorganismele de alterare pot cauza modificări organoleptice inacceptabile produselor alimentare, pe când dezvoltarea germenilor patogeni poate face produsul periculos pentru consumatori, ca urmare a producerii toxiinfecțiilor alimentare (T.I.A.). Unele microorganisme patogene sunt responsabile de declanșarea T.I.A. de tip infecțios, cum sunt: Salmonella spp, Yersinia enterocolitica, L. monocytogenes, Aeromonas hydrophyla, E. coli O157 :H7, Campylobacter spp., sau de tip toxic, Clostridium botulinum tip E, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus.

Produsele alimentare refrigerate pot părea bune pentru consum, în pofida prezenței unor germeni patogeni sau a toxinelor acestora. De aceea, lipsa vizibilă a proceselor de alterare nu poate fii utilizată ca indicator de securitate alimentară pentru aprecierea salubrității cărnii și preparatelor de carne (Brian și Day, 2000). Ca urmare, în industria agroalimentară securitatea alimentară trebuie să aibă prioritate față de aspectele privitoare la celelalte atribute ale calității: compoziție chimică, aspect organoleptic.

Utilizarea temperaturii scăzute pentru conservarea alimentelor se bazează pe faptul că activitatea microorganismelor poate fi încetinită la temperaturi apropiate de punctul de îngheț al apei și stopată la temperaturi mai scăzute de 0° C. Aceasta se datorează faptului că toate reacțiile metabolice ale bacteriilor sunt catalizate de către enzime, iar rata de desfășurare a acestor reacții este dependentă de temperatură, odată cu creșterea acesteia având loc și o creștere a ratei de reacție metabolică, acesta dublându-se odată cu creșterea temperaturii cu 10°C și invers. Efectul temperaturii scăzute asupra microorganismelor este fie de inhibare totală a creșterii, fie de prelungire a fazei lag, cu reducerea ulterioară a dezvoltării microbiene. In momentul în care temperatura minimă de dezvoltare a microorganismelor este atinsă, acestea devin mai susceptibile la efectul altor mecanisme de conservare, cum ar fi: aciditatea, activitatea apei (aw). Trebuie precizat faptul că, deși microorganismele nu se dezvoltă la temperaturi mai scăzute decât temperatura minimă de creștere, acestea pot supraviețui și chiar se pot dezvolta în cazul creșterii ulterioare a temperaturii. Ca urmare, este absolut necesar menținerea temperaturii de refrigerare pe toată durata perioadei de valabilitate a produselor alimentare. Alterarea microbiologică a produselor refrigerate depinde, așa cum am menționat anterior, de tipurile de microorganisme prezente, de natura substratului alimentar și de temperatura ambiantă. Diferitele microorganisme de alterare vor utiliza diverse substraturi alimentare și chiar diferite căi de metabolizare, care pot fi schimbate deseori, în funcție de condițiile și nutrienții disponibili. Alterarea evidentă a alimentelor se produce când caracteristicile senzoriale ale produselor cum sunt: aspectul, structura, mirosul, gustul devin inacceptabile pentru consumator. Compușii care duc la apariția mirosului și gustului străin sunt în marea lor majoritate volatili, fiind produși deseori ca urmare a metabolizării proteinelor de către microorganisme.

Tabel nr. 9.

Exemple de alterare microbiană asociate produselelor refrigerate

(Brian P.F., Chilled storage of foods, Encyclopedia of Food Microbiology, vol. I, 2000)

Acidifierea, un alt tip de alterare frecvent întâlnit, este cauzat de microorganismele producătoare de acid, ca urmare a metabolizării carbohidraților. Aspectele vizuale ale alterării de origine microbiană sunt diverse, fiind reprezentate în principal de: modificări de culoare, producere de pigmenți, de gaze, turbiditate și mâzgă. În tabelul nr. 9 sunt reprezentate câteva dintre efectele alterării microbiene asociate cu produsele refrigerate (Brian și Day, 2000).

Contribuția microorganismelor și enzimelor

acestora la alterarea cărnii și preparatelor de carne

Contribuția microflorei este esențială pentru alterarea cărnii, activitatea metabolică a microorganismelor selectate în ecosistemul cărnii ducând la apariția modificărilor cauzate de procesele alterative. Aceste modificări sunt dependente de nivelul contaminării microbiene și de substratul alimentar din carne (tab. nr. 7). In condiții de anaerobioză, vacuum sau atmosferă modificată gazoasă, microorganismele catabolizează glucoza pentru dezvoltarea lor. La sfârșitul acestei faze, modificările și alterarea evidentă ulterioară sunt cauzate de catabolismul compușilor azotați și aminoacizilor, precum și de reacțiile metabolice secundare. Contribuția enzimelor endogene țesutului muscular este nesemnificativă în declanșarea proceselor alterative comparativ cu enzimele bacteriene, ele având rol în procesul de maturare al cărnii.

Mecanismele chimice ale alterării

Modificările fizico-chimice care se produc în timpul proceselor de alterare se desfășoară în faza apoasă a cărnii, care conține: glucoză, acid lactic, anumiți aminoacizi, nucleotide, uree, proteine hidrosolubile, care sunt utilizate de majoritatea bacteriilor ce alcătuiesc microflora cărnii. Concentrația în care se găsesc acești compuși moleculari este suficientă pentru asigurarea dezvoltării microbiene. Dintre acești compuși, glucoza reprezintă principalul compus care este catabolizat inițial în timpul proceselor alterative. Acest substrat este utilizat de majoritatea bacteriilor de alterare atât în condiții aerobe cât și anaerobe. Până când alterarea nu este evidentă din punct de vedere senzorial, principalul efect decelabil al creșterii bacteriene este reprezentat de reducerea concentrației de glucoză, care însă nu modifică proprietățile organoleptice ale cărnii.

Doar când glucoza sau produșii săi de oxidare ajung la nivele foarte scăzute, va fi catabolizat acidul lactic. Trebuie precizat faptul că în momentul în care cea de-a două mare sursă de carbon și de energie este epuizată, microorganismele care alcătuiesc ecosistemul cărnii se găsesc în faza maximă de dezvoltare (faza logaritmică) (Nychas și Drosinos, 2000) ; (Brian și Day, 2000) ; (Kotula și Kotula, 2001). In tabelul nr. 10 sunt prezentate diferitele substraturi alimentare și ordinea de utilizare a acestora de microflora bacteriană de alterare, atât în condiții aerobe cât și anaerobe.

Tabel nr. 10

Substratul alimentar utilizat pentru creștere de principalele

specii bacteriene de alterare a cărnii

(Nychas G.E., E.H. Drosinos R.G. Board, The microbiology of meat and poultry, 1998)

1-4 = ordinea de utilizare a substratului la valori normale de pH

În condiții de aerobioză

Potențialul relativ de alterare al bacteriilor depinde în funcție de speciile microbiene dominante și de abilitatea acestora de a forma compuși urât mirositori, cum sunt: H2S, amine volatile, esteri și cetone. Germenii din genul Pseudomonas au importanță în declanșarea proceselor alterative datorită dominanței acestora în asocierile microbiene aerobe din produsele refrigerate.

Modificările biochimice asociate cu însușirile metabolice ale pseudomonadelor au fost studiate intens atât în bulion nutritiv cât și în suc de carne (tab. 11).

Tabel nr. 11

Activitatea metabolică a pseudomonadelor în sucul de carne la 0 – 4°C

(Nychas G.E., E.H. Drosinos, Spoilage of meat, Encyclopedia of Food Microbiology, vol. II, 2001)

c = catabolizat

f = format

nd = nedeterminat

Dintre acestea, caracteristicile metabolice majore sunt reprezentate de catabolizarea D-glucozei și D-acidului lactic, cu utilizarea cu precădere a D-glucozei față de lactat și oxidarea glucozei și glucozei 6-fosfat pe calea extracelulară cauzând o acumulare tranzitorie de D-gluconat și o creștere a concentrației de 6-fosfogluconat. Creșterea concentrației de D-gluconat a determinat echipa de cercetători să propună o metodă pentru controlul activității microbiene din carne prin determinarea acestui metabolit (Nychas și Drosinos, 2000).

Acumularea tranzitorie de gluconat și imposibilitatea catabolizării acestuia de către toți membrii asociației microbiene poate constitui un determinant selectiv al ecosistemului cărnii. O altă caracteristică importantă a lui Pseudomanas fragi este reprezentată de catabolizarea creatinei și creatininei în condiții aerobe, formarea amoniacului și creșterea pH-ului fiind legate incontestabil de catabolizarea acestor substraturi. Producerea de amoniac, care reprezintă a cauză a creșterii pH-ului poate fi realizată de numeroase bacterii, inclusiv de pseudomonade, în cursul metabolizării aminoacizilor.

Speciile de pesudomonade care se dezvoltă la suprafața cărnii consumă preferențial glucoza, până când rata de difuzie a acesteia din țesuturile profunde devine inadecvată pentru a susține cerințele de creștere ale acestora. În momentul în care încărcătura cu pseudomonade de la suprafața cărnii atinge valori de aproximativ 108 UFC/cm2 și concentrația de glucoză din straturile superficiale ale cărnii scade, pseudomondele declanșează procesele de proteoliză și utilizaeză compușii azotați și aminoacizii ca și substrat de creștere cu producere de sulfuri și esteri urât mirositori (tab. 12).

Tab. 12

Produșii finali de metabolism ai bacteriilor Gram negative în carnea alterată

(Nychas G.E., E.H. Drosinos, Spoilage of meat, Encyclopedia of Food Microbiology, vol. II, 2001)

Germenii din genul Enterobacteriaceae pot avea un rol important în procesele de alterare ale cărnii, dacă ecosistemul acesteia favorizează dezvoltarea lor. Aceștia utilizează în principal glucoza și glucoza 6-fosfat ca și sursă principală de carbon, după epuizarea acestora trecând la degradarea aminoacizilor, cu producere de către unii membrii ai genului de: amoniac, sulfuri volatile (H2S, amine biogene), din metabolizarea aminoacizilor.

Germenii din genul Acinetobacter și Moraxella, deși reprezintă o componentă majoră a florei microbiene de alterare, au un potențial scăzut de alterare. Aceștia utilizează aminoacizii ca și substrat de creștere, dar nu formează produși urât mirositori din degradarea lor. Ei mai degrabă amplifică activitatea alterativă a pseudomonadelor și a lui Shewanella putrefaciens, prin limitarea disponibilității oxigenului către aceste microorganisme. În momentul în care concentrația de oxigen scade, pseudomonadele degradează aminoacizii, chiar în cazul prezenței glucozei, cu producerea substanțelor urât mirositoare. În condiții anaerobe, Shewanella putrefaciens produce H2S, rezultând înverzirea cărnii, ca urmare a formării sulfmioglobinei.

În condiții de anaerobioză sau atmosferă gazoasă modificată

În aceste condiții are loc o modificare a configurației microbiene inițiale, de la o microfloră dominată de germeni Gram negativi, aerobi, la o microfloră dominată de germeni Gram pozitivi, facultativi anaerobi sau microaerofili, reprezentați în principal de bacterii acidolactice și Brochotrix thermosphacta, care, în general, apar în carne în timpul depozitării în condiții de ambalare în atmosferă gazoasă modificată. Caracteristicile metabolice ale bacteriilor acidolactice și ale lui Brochotrix thermosphacta au fost intens studiate. Factorii determinanți ambianți, cum sunt: tensiunea oxigenului, concentrația de glucoză și pH-ul inițial al cărnii au o influență majoră asupra fiziologiei acestor microorganisme, și ca urmare asupra produșilor finali de metabolism.

Tabel nr. 13

Produșii finali de metabolism ai bacteriilor acido-lactice

(homo și heterofermentativi) și Brochotrix thermosphacta în carnea alterată

(Nychas G.E., E.H. Drosinos, Spoilage of meat, Encyclopedia of Food Microbiology, 2001)

HO – bacterii acido-lactice homofermentative

HT – bacterii acido-lactice hetero-fermentative

BT – Brochotrix thermosphacta

Brochotrix thermosphacta, spre deosebire de bacteriile acidolactice, are un potențial de alterare mult mai crescut, având rol în alterarea cărnii atât în condiții aerobe cât și anaerobe. Acesta utilizează glucoza și glutamatul fără a utiliza alți aminoacizi în timpul dezvoltării aerobe, producând o serie de produși finali de metabolism, cum sunt: acetoină, acid acetic, iso-butiric și iso-valerianic, 2-3 butandiol, diacetil, 3 metil-butanal, 2 metil-propanol și 3 metil-propanol. Proporția dintre acești compuși este influențată de concentrația de glucoză, pH și temperatură.

Germenii genului Lactobacillus reprezintă doar o mică parte a populației bacteriene inițiale de alterare a cărnii, însă în cazul în care concentrația de oxigen scade, ca și în cazul cărnii ambalate în vacuum, microflora bacteriană este de regulă dominată de lactobacili. Aceste microorganisme fermentative se dezvoltă mai repede decât alți germeni competitori, deoarece nu sunt afectați de scăderea pH-ului și de produșii antimicrobieni ca și acidul lactic, H2O2 și anumite antibiotice. Aceste microorganisme utilizează glucoza pentru dezvoltare, cu producere de acid lactic. Când carbohidrații sunt epuizați, ei utilizează aminoacizii cu producere de acizi grași volatili, care imprimă cărnii ambalate în vacuum un miros brânzos sau de produse lactate acide.

În cazul cărnii ambalate în atmosferă gazoasă modificată, creșterea concentrației de CO2 duce la inhibarea creșterii microflorei aerobe și ca urmare a asimilării de glucoză de către pseudomonade, mirosul brânzos fiind depistat numai în cazul probelor de carne ambalate în mixturi de gaze în care concentrația de CO2 este crescută, fiind produs de bacteriile acido lactice și Brochotrix thermosphacta. Pe lângă acesta, germenii mai produc acetoină, diacetil și alcooli din metabolizarea glucozei în condiții anaerobe. Alcoolii sunt prezenți în cantități foarte scăzute în prima parte a perioadei de păstrare, însă concentrația lor crește semnificativ înainte de declanșarea proceselor alterative, făcâdu-i posibili indicatori de alterare, aspecte redate în tab. 13 (Nychas și Drosinos, 2000 ; Brian, 2000) ; Kotula și Kotula, 2001).

Efectul bacteriilor psihrotrofe Gram negative

asupra proceselor de alterare a cărnii și preparatelor din carne

Bacteriile psihrotrofe Gram negative reprezintă microflora cu cel mai ridicat potențial de alterare pentru carnea și preparatele de carne refrigerate. În cazul în care carnea este menținută la temperaturi de 0˚ – 4˚C, în condiții aerobe, membrii genurilor Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter și Psychrobacter au cea mai mare rată de creștere, de unde rezultă și potanțialul crescut de alterare al acestora. Speciile din genul Shewanella și unii membrii ai familiei Entorobacteriaceae, necesită condiții de creștere mai speciale, decât microorganismele menționate anterior, în scopul dezvoltării și producerii metaboliților de alterare. Dependent de anumite condiții, perioada de valabilitate a cărnii proaspete este reprezentată de perioada, în zile, anterior apariției semnelor evidente de alterare: modificări de aspect, miros și gust străin, mâzga. Prelungirea acestei perioade poate fi realizată prin inhibarea creșterii germenilor Gram negativi, cu dezvoltarea germenilor Gram pozitivi (micrococi și bacterii acido-lactice), prin selectarea anumitor condiții legate de mediu și produse: atmosfera din interiorul ambalajului, factorul aw, concentația de cloruri și nitriți, temperatura de păstrare.

Încărcătura cu microorganisme din carnea obținută de la animalele sănătoase este cuprinsă între 102–105 ufc/cm2/g, dependent de respectarea condițiile de igienă pe întreg fluxul tehnologic, din care doar 1 – 10 % se pot dezvolta în condiții de refrigerare (Nychas și col, 2000). În momentul în care încărcătura cu germeni atinge valori de 107 UFC/cm2, sunt depistate primele semne de alterare, respectiv apariția mirosului străin. Mâzga este evidentă când încărcătura microbiană atinge 108 UFC/cm2 (Ayres, 1987; Gill, 1982).

La începutul perioadei de refrigerare, compoziția chimică a cărnii are o contribuție mai curând selectivă decât restrictivă asupra microflorei bacteriene. Deși în țesutul muscular există din abundență nutrienți pentru dezvoltarea microbiană, germenii psihrotrofi preferă utilizarea compușilor cu o greutate moleculară scăzută, în pofida complexelor proteice și lipidice (Gill, 1982).

Carne proaspătă

Alterarea cărnii depozitate în condiții aerobe este precedată de un interval de timp variabil în care bacteriile utilizează carbohidrații, în principal glucoza și glucoza 6-fosfatul ca și sursă de carbon și energie. Concentrația de glucoză în carnea de bovine este cuprinsă între 0.1 – 0.5 %, fiind rapid utilizată de către microorganismele de la suprafața cărnii (Gill, 1986). La epuizarea acesteia, are loc o difuzare a glucozei din straturile profunde musculare. Aceasta asigură menținerea unei concentrații adecvate a glucozei la suprafață cărnii, și prin urmare asigură bacteriilor metabolizarea în continuare a carbohidraților, întârziând astfel utilizarea altor compuși. Doar în cazul în care încărcătura microbiană este foarte mare, peste 107 ufc/cm2, necesarul de glucoză fiind insuficient, microorganismele vor degrada aminoacizii cu producere de amoniac și creșterea pH-ului. Germenii Gram negativi, deoarece au abilitatea de a utiliza compușii cu masa moleculară joasă la temperaturi de refrigerare, în carnea cu pH normal, de 5.5 –5.8, prezintă rata de creștere mai crescută decât a competitorilor pe care îi depășesc numeric la suprafața cărnii.

Valori scăzute ale glucozei în carne se pot întâlni la animalele supuse anterior sacrificării stresului, foamei, fricii, oboselii. În aceste circumstanțe are loc o scădere a concentrație de glicogen în musculatura animalelor vii. O astfel de situație se întâlnește și în cazul cărnii DFD (dark, firm, dry), care se întâlnește în cazul animalelor stresate. Ca urmare a scăderii concentrației de glicogen, acidul lactic este produs în cantitate scăzută iar concentrația glucozei fiind mai scăzută decât valorile normale, carnea este mai rapid supusă proceselor alterative deoareec nivelul glucozei insuficient conduce la utilizarea mai timpurie a aminoacizilor. Adăugarea glucozei în cazul cărnii DFD întârzie declanșarea proceselor alterative, deoarece bacteriile pot ajunge la maxima densitate/cm2 fără degradarea aminoacizilor (Lambropoulou și col., 1996).

In prima fază a creșterii microbiene, metabolizarea glucozei de către pseudomonade și alte bacterii Gram negative nu duce la apariție mirosurilor străine neplăcute, creșterea lor fiind bazată pe utilizarea carbohidraților, din metabolizarea cărora rezultă un complex de substanțe ce cuprinde: acizi cu catenă scurtă, cetone și alcooli, care exprimă o varietate de mirosuri dulci și de fructe (Dainty R.H., 1996). A doua fază de dezvoltare microbiană începe în momentul în care rezervele de glucoză sunt epuizate, iar microorganismele încep să utilizeze aminoacizii pentru energie și sursă de carbon. Această fază debutează când încărcătura microbiană atinge valori de 107 UFC/cm2. Aminoacizii cu sulf (cisteină, cistină, metionină), sunt precursori pentru H2S, metil-sulfuri și dimetil-sulfuri, compuși generați de pseudomonade și unele specii ale familiei Enterobactariaceae, cu apariția mirosului de putrid și sulf. Prin dezaminarea acestor aminoacizi se formează piruvat, amoniac, H2S, metil-sulfuri și dimetil-sulfuri. Este interesant aspectul că pseudomonadele degradează amonoacizii prin dezaminare, în timp ce enterobacteriaceele au capacitatea de decarboxilare (McMeekin, 1982).

Metilamina, dimetilamina și trimetilamina au fost de asemenea puse în evidență, fiind de obicei asociate cu creșterea lui Pseudomonas fluorescens, precum și a altor pseudomonade non-fluorescente. Dintre membrii genului, Pseudomonas fragi este considerată a fi principalul responsabil pentru producerea de etil-esteri, ce au un miros dulce de fructe. În fazele mai avansate ale alterării cauzate de pseudomonade, au fost depistați și alți compuși sulfurați, sursa acestora fiind aminoacizii, însă producerea lor apare la încărcături microbiene mai mari de 107 UFC/cm2. În urma decarboxilării aminoacizilor au fost identificați doi produși finali de metabolism principali: cadaverina rezultată din lizină și putresceina provenită din ornitină sau arginină. Dainty și Mackey (1992), au stabilit o corelație pozitivă între producția de putresceină și pseudomonade și cadaverină și enterobacteriacei. Apariția acestor compuși finali de metabolism se realizează la încărcături microbine mai mari de 107 ufc/cm2. Alte amine importante, dar mai puțin studiate sunt reprezentate de spermidină, spermină, histamină și tiramină (tabel nr. 14). Putresceina, cadaverina, histamina, tiramina și spermidina au fost identificate în carnea tocata de porc, bovine și pasăre, păstrată în condiții de refrigerare. Cadaverina este principala amină biogenă pusa în evidență în carnea de pasăre păstrată în condiții aerobe sau vacuum. Schmitt și Schmidt-Lorenz (1992), au raportat că putresceina și cadaverina, care sunt dedectabile la încărcături microbiene peste 105 ufc/cm2, pot indica debutarea proceselor alterative în carnea de pasăre.

Pentru a pune în evidență caracterul proteolitic intens al tulpinilor de Pseudomonas și Proteus, au fost efectuate experimente în culturi pure, care au demonstrat o activitate proteică crescută față de proteinele miofibrilare și sarcoplasmatice (Dainty și col., 1983). Acestea utilizează proteinele ca și sursă de carbon și energie, cu eliberarea enzimelor extracelulare, doar în cazul în care nu sunt disponibili compușii cu masa moleculară joasă, ușor de asimilat. Deși unele specii ale genurilor Pseudomonas, Alteromonas, și Aeromonas au demonstrat activitate proteolitică și lipolitică în condiții de laborator, există suficiente dovezi că aceste proprietăți nu contribuie la procesele de alterare, deoarece alți factori sunt puși în evidență înainte.

Se pare că eliberarea exoproteazelor bacteriene se produce în faza staționară a creșterii, când celulele bacteriene au atins densitatea maximă pe unitatea de suprafață și aminoacizii au fost epuizați. Analiza proteinelor miofibrilare și sarcoplasmatice nu au arătat modificări decât la încărcături de peste 1010 UFC/cm2, la mult timp de la apariția mirosului străin și de mâzgă (McMeekin T.A., 1982).

Tabel nr. 14

Producerea aminelor biogene de către microflora cărnii

(Maijala și. col, 1994 ; Rawles și col., 1996)

Chiar dacă multe bacterii psihrotrofe produc lipaze, rolul acestor bacterii în modificările lipolitice și oxidative ale cărnii sunt în general neglijate. Unele experimente au arătat totuși abilitatea lui Pseudomonas fragi de a crește nivelul acizilor grași atât în carne cât și în mediile de cultură. Pe suprafața grăsimilor, pseudomonadele și psihrobacteriile utilizează aceeași compuși ca și în cazul cărnii degresate (macră), producând aceeași metaboliți. Deoarece rata de difuzie a compușilor cu greutate moleculară scăzută este încetinită iar valoarea factorului aw este scăzută, creșterea microbiană este redusă pe suprafața cărnurilor grase comparativ cu cea a cărnii degresate, procesele de alterare fiind inițial puse în evidență în părțile degresate ale carcasei.

Carne ambalată în vacuum

Perioda de păstrare cu menținerea caracterelor organoleptice corespunzătoare a cărnii poate fi prelungită prin modficarea atmosferei care înconjoară carnea. Ambalarea cărnii și preparatelor de carne în vacuum și atmosferă gazoasă modificată sunt două metode utilizate curent în vânzarea en gros și en detail. Metoda de ambalare în vacuum este preferată pentru depozitarea și distribuirea componentelor voluminoase ale sferturilor de carcasă refrigerate. In cazul ambalării în vacuum, oxigenul rezidual (sub 1 %), este rapid consumat de respirația microbiană și a țesutului muscular iar CO2 atinge concentrații de aproximativ 20%.

Condiții perfect anaerobe sunt foarte rar realizate, deoarece majoritatea ambalajelor folosite în utilizarea comercială prezintă o anumită permeabilitate față de oxigen. In cazul ambalarii sub vid, flora microbiană Gram negativă este înlocuită treptat de bacteriile Gram pozitive, reprezentate cel mai frecvent de bacteriile acidolactice și Brochotrix thermosphacta, datorită faptului că acestea sunt mai tolerante față de concentația crescută de CO2 și temperatura scăzută. Aceste bacterii metabolizează glucoza pentru a produce acid lactic, isobutanoic și isopentanoic, ce conferă produselor miros și gust acrișor (brânzos, acid). Acumularea acestor acizi are loc, în principal, în faza staționară de dezvoltare bacteriană, fapt care duce la retragerea cărnii de la consum public. Celelalte procese de alterare, cum ar fi lipoliza sau proteoliza sunt limitate sau inexistente, deoarece bacteriile Gram pozitive au o activitate proteolitică destul de scăzută. Datorită unor cauze variate: contaminare inițială crescută a produselor, ambalaje permeabile, temperatura de păstrare necorespunzătoare, bacteriile Gram negative (pseudomonadele și chiar enterobacteriaceii), se pot dezvolta în carnea de bovine ambalată în vacuum cu pH normal. În carnea de porc ambalată sub vid, germenii din familia Enterobacteriaceae se pot dezvolta la temperaturi cuprinse între –1,5° ÷3°C (Gill și Harrison, 1989). Acestea și Shewanella putrefaciens au fost evidențiate în tegumentul și grăsimea cărnii de porc ambalată în vid. De asemenea, dezvoltarea germenilor din familia Enterobacteriaceae a fost pusă în evidență și în carnea de ovine ambalată în vid (Gill și Penney, 1985). În cazul în care pH-ul are valori mai mari de 6, devoltarea lui Shewanella putrefaciens, Alcaligenes spp., Aeromonas spp. și anumite specii de enterobacteriacei pot declanșa procese alterative ale cărnii (Bjorkroth și col., 1998).

Carne ambalată în atmosferă gazoasă modificată ( MAP)

Ambalarea cărnii și preparatelor de carne refrigerate în atmosferă gazoasă modificată extinde perioada de valabilitate a acestora, datorită faptului că CO2 utilizat are o acțiune inhibitorie asupra dezvoltării și metabolismului germenilor de alterare. De regulă, CO2 este utilizat în diferite concentrații alături de N2 și/sau O2. Deoarece CO2 este solubil atât în apă cât și în grăsime, el se poate dizolva în produsele respective. N2 este un gaz inert cu o solubilitate scăzută în apă, fiind de regulă utilizat ca și gaz de adaos, concentrațiile crescute, peste 20 %, fiind în general utilizate pentru a se evita ruperea ambalajelor care conțin concentrații crescute de CO2.

Tabel nr. 15

Compușii volatili prezenți în carnea de bovine, porc și pasăre ambalate

(Dainty R.H. și Mackey B.M., 1992); (Nychas G.J.E. et al.1994): (Lasta J.A. et al., 1995)

+ prezenți la sfârșitul perioadei de păstrare

absenți la sfârșitul perioadei de păstrare

În cazul cărnii roșie proaspete, ambalată în atmosferă gazoasă modificată au loc două tipuri de deteriorare: decolorarea țesutului muscular din roșu aprins în cafeniu-cenușiu și alterarea microbiană. Culoarea țesutului muscular este determinată de starea de oxidare a mioglobinei. Forma neoxigenată este de culoare roșie închisă, pe când forma oxigenată, oximioglobina este de culoare roșie aprinsă. Modificarea culorii cărnii este determinată de oxidarea lentă a mioglobinei în metmioglobină, care are o culoare cafenie închisă, fiind mult mai susceptibilă la oxidare decât oximioglobina (O’Connor-Shaw și Reyes, 2000). Procesele de alterare ale cărnii ambalate în atmosferă îmbogățite în dioxid de carbon, cu un conținut scăzut de oxigen, sunt datorate acțiunii bacteriilor acidolactice și/sau Brochotrix thermosphacta, deoarece bacteriile Gram negative, și în principal pseudomonadele sunt inhibate. Prezența compușilor sulfurați ca: propil-esteri, 3 metil-butanol, etc. (tab. 15), ridică problema cauzei care determină inhibarea dezvoltării pseudomonadelor: atmosfera îmbogățită în dioxid de carbon sau limitarea concentrației de oxigen ?

Este bine cunoscut faptul că pseudomonadele sunt foarte sensibile la acțiunea dioxidului de carbon, în condiții de refrigerare, deoarece solubilitatea acestui gaz este crescută la temperaturi scăzute. Deoarece pseudomonadele au o afinitate foarte crescută pentru oxigen, acestea se pot dezvolta la concentrații scăzute de oxigen, având loc o creștere a activității metabolice a acestora (Drosinos și Board, 1994) ; (Molin, 1985). În cazul în care O2 este prezent în concentrații crescute, flora principală de alterare va fi reprezentată de pseudomonade, cu producerea mirosurilor neplăcute și a produșilor de putrefacție rezultați din degradarea aminoacizilor. pH-ul țesutului muscular după sacrificare scade la 5.5 – 5.8, ca urmare a descompunerii glicogenului în acid lactic. În cazul în care concentrația de O2 este scăzută, iar pH-ul cărnii are valori mai mici de 5.8, flora dominantă va fi reprezentată de către lactobacili. Dacă nivelul oxigenului inhibă dezvoltarea bacteriile Gram negative iar pH-ul cărnii are valori mai mari de 5.8, microflora bacteriană va fi reprezentată de Brochotrix thermosphacta, enterobacteriacei și Shewanella putrefaciens, care vor produce diferiți metaboliți ce vor determina apariția mirosurilor neplăcute (tab. 16).

În ambalajele cu atmosferă gazoasă modificată în care concentrația de O2 este crescută, respectiv raportul CO2:O2:N2 este de 25:60:15 %, oxigenul va menține pigmenții musculari în starea dorită de oximioglobină, menținând culoarea roșie aprinsă a cărnii, pe când concentrațiile scăzute de oxigen, de 20 %, duc la înjumătățirea ratei de creștere microbiană. Dacă raportul CO2:O2:N2 este de 50÷90:1÷10:10÷40 %, concentrația crescută de CO2 și cea scăzută de oxigen va duce la inhibarea dezvoltării microflorei Gram negative de alterare. În cazul în care concentrația CO2 este de 100 % iar depozitarea se realizează la 0°C, are loc inhibarea totală a tuturor germenilor de alterare. În carnea depozitată în atmosferă gazoasă modificată au fost identificate și unele amine biogene, ca tiramina, putresceina și cadaverina.(Dainty R.H. et al., 1986); (Smith R.E. et al., 1992). O preocupare majoră a tehnologilor legată de utilizarea ambalajelor în atmosferă gazoasă modificata este reprezentată de faptul că, scăderea concentrației de oxigen duce pe de o parte la inhibarea germenilor aerobi, dar permite dezvoltarea bacteriilor anaerobe nepatogene de alterare, care pot atinge valori crescute în timpul păstrării produselor (Broda, 2001).

Tabel nr. 16

Substratul alimentar utilizat și compușii volatili produși de microorganisme în carnea ambalată în vacuum și atmosferă gazoasă modificată

1-3 = ordinea de utilizare a substratului la valori normale de pH

a-b = utilizare numai în cazul pH crescut

w = creștere slabă

** = cu excepția serinei, care poate fi utilizată cu glucoza și glucoza 6-fosfat, ceilalți aminoacizi sunt utilizați numai după epuizarea compușilor cu masa moleculară scăzută

În urma dezvoltării procedeelor de depozitare a cărnii și a preparatelor din carne în condiții de refrigerare și a metodelor de ambalare moderne, sub vid sau atmosferă gazoasă modificată, pe lângă creșterea perioadei de valabilitate a acestor produse, s-a creat o nișă ecologică specifică pentru bacteriile psihrotrofe, capabile să se dezvolte în conditii anaerobe (Broda și col., 1996); (Broda și col., 2000 a); (Broda și col., 2000 b); (Broda și col., 2000 c); (Moorhead și Bell, 1999). De asemenea, se pot dezvolta și germeni psihrotrofi patogeni, cum ar fi: Cl. botulinum neproteolitic tip E, B și L. monocytogenes ( Bjorkroth și col., 1998); (Broda și col., 1996).

Preparate din carne

Cărnea tocată (carnea tocată proaspătă, anumite sortimente de cârnăciori proaspeți) au o periaodă de valabiliate scăzută, pe de o parte datorită calității materiei prime utilizate (de multe ori cu încărcătură microbiană ridicată) iar pe de altă parte a procesului de mărunțire a cărnii care favorizează contaminarea microbiană mai rapidă. Flora microbiană de alterare este reprezentată de germeni din genul Pseudomonas și într-o măsură mai mică de germeni din familia Enterobacteriaceae (Lambropoulous K.A. et al., 1996). Diferitele tratamente aplicate acestor categorii de preparate (sărare, afumare, adăugare de nitriți, ambalare în vacuum sau atmosferă gazoasă modificată), duce la selectarea unei microflore bacteriene reprezentate de bacterii acido-lactice, Brochotrix thermosphacta și drojdii.

S-a constatat că există asemănare între microflora cârnăciorilor proaspeți cu cea din carnea tocată, deși aditivii alimentari utilizați și condițiile de păstrare vor influența tipul dominant de microorganism. În cazul în care preparatele din carne sunt păstrate în condiții aerobe, la temperaturi de refrigerare, neambalate sau ambalate în ambalaje permeabile pentru aer, microflora de alterare va fi dominată de pseudomonade iar dacă temperatura de păstrare este cea a camerei, populația microbiană va fi reprezentată de enterobacteriacei. În produsele ambalate în vacuum sau atmosferă gazoasă modificată și păstrate la temperatura de 10-12°C, germenii din familia Enterobacteriaceae reprezintă o componentă majoră a microflorei de alterare (Penney și col., 1993). In cazul produselor din carne crude, uscate și/sau afumate, temperatura de păstrare, factorul aw, concentrația clorurilor și nitriților, pe lângă modificarea proprietăților organoleptice, vor selecta și microflora de alterare, reprezentată în principal de micrococi, bacterii acido-lactice (Carnobacterium spp., Leuconostoc spp.), germeni din genul Psychrobacter, Vibrio și unii enterobacteriacei. Alterarea produselor de carne crude, uscate și/sau afumate, cu apariția mirosului și gustului de acru, este cauzată în principal de bacteriile acido-lactice. Producerea de H2S poate fi realizată atât de germeni din genul Vibrio cât și de enterobacteriacei, în cazul în care temperatura de păstrare este crescută (peste 18°C).

Providencia (Proteus inconstans) este responsabilă de apariția mirosului de varză, datorat producției de metantiol din metionionă. Acest tip de alterare este asociat cu baconul, în care pH-ul este crescut, concentrația de cloruri este scăzută, iar păstrarea se face la temperatura camerei (Gardner G.A., 1982,1983). Microflora preparatelor din carne de durată ambalate în atmosferă gazoasă modificată pare a fi similară cu cea a preparatelor din carne ambalate în vid.

Pentru preparatele de carne supuse tratamentelor termice : șuncă, cârnăciori, etc., formele vegatative ale bacteriilor sunt inactivate în urma tratamentului de pasteurizare, însă uneori are loc o contaminare post-procesare, consecință a manoperelor de feliere, porționare, etc. Deși o gamă variată de germeni Gram negativi au fost izolați uneori din aceste produse, în cazul ambalării în vacuum sau atmosferă modificată și păstrare la temperatura de refrigerare, aceștia sunt incapabili de a concura cu bacteriile lactice (Borch și col., 1996).

Modificări biochimice în carne și preparatele de carne

Modificările biochimice care apar în timpul proceselor de alterare se desfășoară în faza apoasă a cărnii (Nychas și col., 1994). Aceasta conține glucoză, acid lactic, anumiți aminoacizi, nucleotide, uree și proteine solubile în apă, care sunt catabolizate de majoritatea germenilor ce alcătuiesc microflora cărnii (Drosinos, 1994). Datorită acestui fapt, carnea este considerată a fi un mediu foarte bogat în substante nutritive, fiind optim pentru dezvoltarea microorganismelor (tab. 17). Deși concentrația compușilor cu masă moleculara scăzută, în principal carbohidrați (glicogen, glucoză, glucoză 6-fosfat, lactat), este scăzută în comparație cu cea a proteinelor și lipidelor, aceasta este suficientă pentru a susține dezvoltarea masivă a microorganismelor din ecosistemul cărnii.

În funcție de speciile bacteriene implicate în procesele de alterare ale cărnii și preparatelor de carne, substratul nutritive este utilizat de către microorganisme într-o anumită ordine, atât în condiții aerobe cât și anerobe, aspecte redate în tabelul nr. 16. În timpul dezvoltării populației microbiene, s-a demonstrat că interacțiunile dintre microrganisme au loc doar când s-a atins densitatea maximă celulară raporată la unitatea de suprafață. Predominanța pseudomonadelor față de celelalte microorganisme de alterare, în cazul cărnii păstrate în condiții aerobe refrigerate, se datorează ratei de creștere rapidă a acestora și a afinitătii crescute pentru oxigen, având ca urmare un catabolism accentuat al glucozei (Gill și Mollin, 1991).

Rolul esențial al glucozei în procesele de alterare a cărnii și preparatelor de carne atât în condiii aerobe cât și anaerobe a fost intens studiat (Nychas. și col., 1988), deși sunt unele studii care arată că uneori rolul glucozei este prea exagerat (Molin, 1985). Nychas și col. (1992), și Drosinos (1994), au corelat calitatea microbiologică bună, respectiv o încărcătură microbiană scăzută, a cărnii de bovine și miel păstrate în condiții de refrigerare, cu concentrația glucozei. Cu cât nivelul glucozei este mai ridicat, cu atât procesele de alterare sunt declanșate mai tardiv. Boers și col. (1991), au observat că există o corelație directă între reducerea concentrației de glucoză din carnea de vânat si declanșarea proceselor alterative în cazul cărnii ambalate în vacuum. Ei au obsrevat că nivelul glucozei a devenit foarte scăzut odată cu apariția primelor semen de alterare. S-a stabilit, de asemenea, că limitarea concentrației de glucoză duce la schimbarea metabolismului carbohidraților cu cel al aminoacizilor, în cazul unor microorganisme, nivelul glucozei fiind astfel un factor intrinsic foarte important pentru descrierea și prevederea gradului de alterare a cărnii (Borch, 1991) ; (Seymour și col., 1994). Pe baza acestor descoperiri, compușii cu masă moleculară scăzută, în principal glucoza, au fost propuși ca și factori potențiali pentru asigurarea și menținerea calității cărnii, ce pot fi utilizați pentru prelungirea termenului de valabilitate a acesteia.

Lactatul este un alt compus cu masă moleculară scazută, care este utilizat de microorganismele de alterare ale cărnii pentru dezvoltare atât în condiții aerobe cât și anaerobe. (Drosinos, 1994). Molin (1985), a observat că lactatul este utilizat de Pseudomonas fragi, în bulion, în prezența glucozei atât în condiții de incubare aerobe cât și anaerobe.

Rezultate similare au fost obținute de Nychas și col. (1994) în carnea contaminată natural sau inoculată cu diferite specii de Lactobacillus și menținute în condiții aerobe, cu limitarea nivelului oxigenului, sau în condiții anaerobe. S-a observat că rata de utilizare a glucozei și lactatului în cazul cărnii ambalate în vacuum sau atmosferă modificată este mai scăzută, decât în cazul cărnii păstrate în condiții aerobe, aspecte redate în tabelele 18 și 19.

Tabel nr. 17

Compoziția chimică a musculaturii animalelor adulte după sacrificare

(Lawrie, 1985, Gill C.O., 1986)

Concluzii similare pot fi deduse și în cazul aminoacizilor. Mulți cercetători au încercat să folosească modificările induse de procesele alterative în profilul aminoacizilor din carne, în scopul determinării cu exactitate a momentului în care a debutat degradarea proteinelor. Unii cercetători au presupus că nivelul aminoacizilor din carne ar rămâne constant o perioadă scurtă de timp înainte de declanșarea proceselor alterative (cauzată de epuizarea glucozei), sau în cazul în care încărcatura microbiană atinge valori de 107 – 108 ufc/cm2/g, fiind urmată probabil de o scădere ușoară a lor, după care are loc o creștere bruscă cauzată de declanșarea proteolizei (Dainty, 1996). Aceste presupuneri diferă de rezultatele publicate de Schmitt și Schmidt-Lorenz (1992) și Nychas și Tassou (1997), pentru carnea de bovine, porcine și pasăre, conform cărora în condiții aerobe cantitatea de aminoacizi liberi și a proteinelor solubile crește în timpul refrigerării, corespunzător cu numărul microorganismelor. Mai mult, rata de creștere a aminoacizilor liberi a fost mult mai mare decât în cazul cărnii ambalate în vid sau atmosferă modificată. Aceste constatări pot avea o mare importanță comercială, deoarece procesele alterative declanșate de pseudomonade sunt asociate cel mai adesea doar cu degradarea aminoacizilor, după cea a glucozei (Gill, 1986).

Tabel nr. 18

Modificarea conținutului de glucoză (mg/100 g) în carnea de bovine păstrată la 3˚C în condiții aerobe și atmosferă modificată

(Kakouri A. și Nychas G.J.E., 1994)

Tabel nr. 19

Modificarea conținutului de glucoză (mg/100 g) în carnea de porcine păstrată la 3˚C în condiții aerobe și atmosferă modificată

(Kakouri A. și Nychas G.J.E., 1994)

Conform rezultatelor obținute de Gill (1976), atâta timp cât substanțele cu masă moleculară scăzută, mai ales glucoză, sunt disponibile, procesele de proteoliză nu debutează. Aceste aspecte nu sunt pe depline susținute de studiile recente ale lui Schmitt și Schmidt-Lorenz (1992) și Nychas și Tassou (1997), care au arătat că deși concentrația glucozei și lactatului erau crescute, au fost puse în evidență procese proteolitice, pe baza analizei compușilor azotați cu masă moleculară mai mare de 3.000 da și a analizei HPLC a proteinelor solubile. Astfel, cantitatea acestor produși a crescut progresiv, în majoritatea probelor de carne păstrate atât în condiții aerobe, cât și în vacuum sau atmosferă gazoasă modificată (tab. 20). În afara de acestea s-au înregistrat modificări semnificative în ceea ce privește profilul proteinelor solubile identificate prin HPLC, observându-se apariția progresivă sau la finalul perioadei de păstrare a unor peak-uri de noi produși hidrofili sau hidrofobi, în toate probele de carne analizate. Mai mult, concentrația finală a peak-urilor înregistrate la începutul perioadei de păstrare diferă semnificativ față de probele analizate la sfârșitul termenului de valabilitate. Aceste modificări au fost evidente chiar în fazele timpurii de păstrare, indiferent de încărcătura microbiană, putând fi cauzate nu numai de enzimele proprii țesutului muscular (autoliza), ci și de activitatea enzimatică proteolitică microbiană (Schmitt. și Schmidt-Lorenz, 1992).

Tabel nr . 20

Modificarea concentrației de glucoză (mg/100 g), L-lactat si a proteinelor solubile în carnea de pasăre inoculată cu P. fragi și păstrată la 3˚C

Dacă în timpul perioadei de păstrare a cărnii ar fi implicate numai procesele de autoliză, s-ar fi observat în urma analizei HPLC o configurație similară a proteinelor în toate probele de carne, indiferent de modalitățile de păstrare sau contribuția diverselor microorganisme de alterare. S-a observat că producerea enzimelor proteolitice bacteriene este declanșată în momentul în care densitatea bacteriilor este maximă (faza logaritmică), chiar dacă condițiile necesare elaborării acestora par să fie favorabile în fazele timpurii ale dezvoltării microbiene (Venugopal, 1990).

Conținutul de aminoacizi va crește sau va descrește în cele din urmă în funcție de configurația microflorei bacteriene. Efectul individual asupra proteinelor musculare al germenilor de alterare a fost studiat de mulți cercetători, prin compararea nivelului aminoacizilor liberi sau a proteinelor din probele de carne necontaminate sau tratate cu antibiotice, cu cele contaminate în mod natural. S-a observat că în cazul în care germenii acționează individual, aceștia au fie un efect proteolitic scăzut asupra proteinelor, fie cantitatea de aminoacizi liberi scade în fazele timpurii de păstrare. Doar speciile înzestrate cu un echipament enzimatic proteolitic bogat au determinat o creștere considerabilă a cantității de amininoacizi liberi și aceasta numai în faza finală a procesului alterativ. Speciile bacteriene neproteolitice au determinat o scădere a conținutului de aminoacizi liberi.

Proteinele solubile sarcoplasmatice reprezintă probabil substratul inițial în declanșarea proteolizei. Bacteriile par să modifice solubilitatea proteinelor, însă degradarea proteinelor de către bacterii nu poate fi demonstrată de către creșterea fracțiunilor azotului neproteic, decât după o păstrare îndelungată. Proporția proteinelor sarcoplasmatice (solubile în apă) scade în timp ce proteinele miofibrilare (solubile în cloruri) și stromale (insolubile) tind să crescă inițial, probabil datorită modificărilor de solubilitate a anumitor proteine musculare. Deoarece bacteriile acido-lactice au o activitate proteolitică scăzută în comparatie cu bacteriile Gram negative de alterare (pseudomonade), nu pot penetra țesutul muscular. În schimb, bacteriile proteolitice pot avea, datorită posibilitătii de penetrare a țesutului muscular, un avantaj major în ecosistemul cărnii, deoarece au acces la un mediu nou, bogat în substanțe nutritive, care nu sunt accesibile pentru microorganismele neproteolitice.

În concluzie, nu există dubii că multe bacterii sintetizează enzime: proteaze, endoproteaze, proteinaze, aminopeptidaze, carboxipeptidaze, etc., care pot degrada proteinele sarcoplasmatice și miofibrilare, declanșând procesele de alterare ale cărnii și preparatelor de carne.

Evaluarea proceselor de alterare ale cărnii și preparatelor de carne

Metode chimice

Deoarece timpul necesar pentru efectuarea examenelor microbiologice, pentru stabilirea salubății cărnii și preparatelor de carne, este de multe ori prea îndelungat, nu puține fiind cazurile în care produsele erau deja consumate pâna la primirea rezultatelor, evaluarea proceselor alterative datorate dezvoltarii microorganismeleor se poate realiza prin examene chimice. Deși mai mult de 40 teste rapide de laborator, prin metode fizice, chimice și microbiologice, au fost propuse pentru depistarea și aprecierea alterării bacteriene în carne, puține dintre acestea se folosesc în practica curentă pentru stabilirea calității igienice a acesteia (Sheridan, 1995). Lipsa acordului unanim asupra primelor semne de alterare a cărnii și modernizarea tehnologiilor de conservare (ambalare în vacuum, atmosferă modificată, etc.), face ca sarcina de identificare a indicatorilor de alterare să fie și mai dificilă.

Pentru a putea fi utilizați la evaluarea proceselor alterative, indicatorii de alterare sau metaboliții microbieni trebuie sa îndeplinească, următoarele condiții:

compușii trebuie să fie absenți sau, cel mult, să fie prezenți în cantități foarte mici în carne;

nivelul acestora trebuie să crească odată cu perioada de păstrare;

trebuie să fie produși de microflora dominantă și să se coreleze cu modificările organoleptice apărute (Jay, 1986).

În ultimele două decenii au fost făcute numeroase propuneri pentru potențiali indicatori de alterare a cărnii, pe baza asocierii compușilor metabolici produși cu procesele alterative cauzate de bacterii (tabel nr. 21). Aceste propuneri s-au bazat pe raționamentul că, în urma dezvoltării microorganismelor în carne, acestea utilizează anumiți nutrienți cu producerea anumitor produși metabolici. Prin determinarea cantitativă a acestor metaboliți se pot face aprecieri cu privire la gradul de alterare a produselor.

Tabel nr. 21

Compuși metabolici care pot fi importanți pentru stabilirea perioadei de valabilitate a cărnii crude ambalată în diferite condiții

(Nychas G.J.E. et al., 1992; Boers R.H. et. al., 1994; Seymour I.J. et al., 1994;

Drosinos E.H., 1994; Dainty R.H., 1996)

Punerea în evidență a metabolitului ideal, care să fie utilizat pentru evaluarea proceselor alterative, s-a dovedit a fi o încercare foarte dificilă, datorită următoarelor aspecte:

majoritatea metaboliților sunt specifici pentru anumite microorganisme (glutamatul pentru pseudomonade, etc), și germenii fie nu sunt prezenți în carne, fie sunt inhibați de anumiți factori naturali sau artificiali de mediu (ecosistemul cărnii, tehnologia de conservare), furnizând astfel informații eronate cu privire la procesele alterative;

metaboliții sunt rezultați în urma catabolismului unor substraturi specifice, însă absența substratului respectiv sau prezența lui în cantițăti scăzute, nu exclude alterarea;

rata metabolică de producere a acestor metaboliți și căile metabolice utilizate de aceste microorganisme sunt afectate de condițiile de mediu impuse (temperatură, pH, nivelul oxigenului, etc);

acuratețea depistării și determinării acestor metaboliți necesită tehnici laborioase, personal calificat și echipamente performante;

Potențiala utilizare a indicatorilor prezentati în tabelul 21 este incă subiectul cercetărilor, deoarece, deși majoritatea acestora prezintă corelații pozitive cu încărcătura de microorganisme, există unele necorelații cu privire la caracterele organoleptice ale cărnii. Acest obiectiv rămâne de realizat prin studii ulterioare.

Metode microbiologice de evaluare a încărcăturii și configurației germenilor psihrotrofi din carne și preparatele de carne

Determinarea încărcăturii totale de germeni psihrotrofi

Materiale

Aparatură și sticlărie

Baloane Erlenmeyer sterile (100 cm3, 200 cm3, 1000 cm3)

Eprubete de 16/160 mm sterile;

Pipete gradate de 1 și 2 ml sterile cu scurgere totală ;

Pipetor automat ;

Omogenizator tip Stomacher ;

Agitator Vortex;

Bisturie, foarfeci,spatule, pense sterile;

Cutii Petri de 90/15 mm sterile;

Hotă cu flux laminar Biohazard;

Termostat reglabil;

Autoclav;

pH-metru electronic, cu precizie 0,1 unități;

Aparat de numărarea coloniilor, cu sistem de iluminare.

Medii și reactivi

Soluție fiziologică peptonată:

la 1000 ml apă distilată se adaugă 8,5 g clorură de sodiu și 1 g peptonă, după care se agită. După dizolvarea ingredientelor, se ajustează pH-ul la 7,0 iar soluția se repartizează în eprubete și vase Erlenmayer de sticlă și se sterilizează la 120˚C timp de 15 minute.

Mediu PCA (Plate-Count-Agar)

Compoziție (g/l): Peptona din cazeină 5 g, extract de drojdie 2.5 g, glucoză D(+) 1.0 g și agar-agar 14.0 g.

Preparare: Se suspendă 22.5 g într-un litru de apă distilată, se dizolvă pe baia de apă; se ajustează pH-ul (la 25˚C) la valoarea de 7.0±0.2, după care se autoclavează la 121˚C, timp de 15 minute.

Prelucrarea probelor

În cazul probelor provenite de la suprafața carcaselor are loc mărunțirea acestora (400 cm2) cu foarfecele, amestecarea cu 400 ml diluant (apă peptonată sterilă) și omogenizarea 2 minute cu omogenizatorul tip Stomacher Se obține diluția de bază, în care 1 ml de lichid reprezintă 1 cm2 suprafață controlată. Pentru probele provenite din profunzime se mărunțesc 10 g carne, care se amestecă cu 90 ml diluant (apă peptonată tamponată sterilă), urmând omogenizarea timp de 2 minute cu omogenizatorul. Se obține în felul acesta diluția de bază (10-1), din care se fac apoi diluții zecimale succesive: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Din fiecare diluție se însămânțează câte 0.1 ml în câte 2 plăci Petri, în care a fost turnat în prealabil mediul de cultură. Însămânțarea s-a efectuat prin inundare, omogenizându-se inoculul cu o pipetă Drigalski, care s-a sterilizat prin flambare după fiecare diluție. Pentru a se realiza o bună omogenizare, respectiv o absorbție corespunzătoare a inoculului în mediul de cultură, plăcile Petri cu mediile de cultură selective s-au menținut anterior acestei manopere la termostat, la 37˚C, 24 ore, realizând-se cu această ocazie și eliminarea plăcilor în care s-au dezvoltat colonii ca urmare a unor deficiențe de însămânțăre.

Deoarece determinarea clasică a numărului total de germeni psihrotrofi se realizează prin incubarea plăcilor la 4-7ºC, timp de 7 zile, perioadă care corespunde de regulă duratei limită de consum a cărnii, am ales ca plăcile inoculate să fie păstrate la temparatura de 20ºC timp de 48 ore, pentru a obține rezulatele într-un timp mult mai scurt. Studii efectuate de Mossel și col., (1970), Greer (1981, 1982), Nottingham (1982), au relevat faptul că la această temperatură (optimă pentru dezvoltarea germenilor psihrotrofi), se obțin rezultate similare cu cele obținute în cazul incubării plăcilor la temperaturi de refrigerare, însă mai rapid. Ca urmare, plăcile însămânțate au fost plasate la termostat (20˚C) 24-48 ore cu capacul în jos, pentru a evita ca picăturile de condens să cadă pe suprafața mediului și să producă deplasarea celulelor și coalescența coloniilor. Pentru numărarea coloniilor, s-au ales plăcile în care numărul acestora a fost cuprins între 15–150. Deoarece volumul de inocul a fost de 0,1 ml, pentru exprimarea rezultatului/cm2, valoarea obținută pe baza formulei s-a înmulțit cu 10.

Calculul numărului total de germeni (NTG) s-a efectuat cu ajutorul formulei următoare:

N = ,

în care: = suma tuturor coloniilor pe plăcile numărate;

= numărul de plăci la prima diluție numărată;

= numărul de plăci la a doua diluție numărată;

d = diluția din care s-a obținut prima placă numărată (Rotaru și col,. 2006)

Exprimarea valorii încărcăturii microbiene s-a efectuat în log10 ufc/cm2, respectiv log10 ufc/g, utilizându-se programul Excel în vederea acestei transformări. Pentru aprecierea caracterelor morfologice ale coloniilor dezvoltate pe suprafața mediilor solide, s-a efectuat examinarea acestora la stereo-lupă iar pentru aprecierea morfologiei caracteristică a microorganismelor, din coloniile specifice s-au efectuat frotiuri colorate prin metoda Gram, fiind ulterior examinate la microscopul cu imersie în vederea aprecierii caracterelor morfologice și tinctoriale ale acestora. Deoarece unele microorganisme sunt Gram labile, pentru diferențierea bacteriilor Gram pozitive de cele Gram negative este necesară efectuarea testului cu KOH 3 %.

Metoda orizontală pentru enumerarea germenilor din familia Enterobacteriaceae (SR ISO 21528-2/2007)

Materiale

Aparatură și sticlărie

Baloane Erlenmeyer sterile (100 cm3, 200 cm3, 1000 cm3)

Eprubete de 16/160 mm sterile;

Pipete gradate de 1 și 2 ml sterile cu scurgere totală ;

Pipetor automat ;

Omogenizator tip Stomacher ;

Agitator Vortex;

Bisturie, foarfeci,spatule, pense sterile;

Cutii Petri de 90/15 mm sterile;

Hotă cu flux laminar Biohazard;

Termostat reglabil;

Autoclav;

pH-metru electronic, cu precizie 0,1 unități;

Aparat de numărarea coloniilor, cu sistem de iluminare.

Medii de cultură

Agar cu bilă, cristal violet și glucoză (VRBG)

Compoziție:

Digerat enzimatic din țesuturi animale 7.0g

Extract de drojdie 3.0 g

Săruri biliare nr. 3 1,5 g

NaCl 5.0 g

Roșu neutru 0.03 g

Cristal violet 0.002 g

Glucoză 10.0 g

Agar-agar 12.0 g

Apă 1000 ml

Modul de preparare :

Se dizolvă 38.5 g mediu VRBG deshidratat în 1 l apă apă distilată, încălzind dacă este nevoie. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,4 0,2 la 25°C. Se repartizează mediul baloane Erlenmayer de 500 ml, se sterilizează prin autoclavare 15 minute la 121°C. Înainte de utilizare se răcește pe baia de apă reglată la 45°C. Mediul neînsămânțat are o culoare roz-violet, omogen, translucid, iar coloniile de Enterobacteriaceae sunt mai mari de 0.5 mm, cu marginile neregulate, de culoare roz-violet, înconjurate de regulă de un halou de aceaași culoare, ca urmare a precipitării sărurilor biliare.

Lichide de diluție sterile (în funcție de produs) :

Soluție fiziologică peptonată, sterilă: 8,5 g clorură de sodiu și 1 g peptonă, cântărite cu precizie de 0,1 g, se introduc într-un balon de stilcă, se adaugă 1000 ml apă și se agită. După dizolvarea ingredientelor, soluția se repartizează în vase Erlenmeyer sterile și se sterilizează în autoclav la temperatura de +1200 C, timp de 15 minute.

Soluție tampon fosfat pH = 7: se prepară prin amestecul a două soluții, A și B.

Soluția A (soluție fosfat de sodiu secundar):

Fosfat de sodiu secundar (Na2HPO4 . 12H2O) 11,876 g

Apă 1000 ml

Soluția B (soluție de fosfat de potasiu primar):

Fosfat de potasiu primar (KH2PO4) 9,078 g

Apă 1000 ml

Cele două soluții, A și B, se sterilizează separat la temperatura de +1200 C timp de 15 minute. Se păstrează separat. In momentul folosirii se amestecă:

Soluția A 7 vol.

Soluția B 3 vol.

Pregătirea probei de analizat – eșantionarea și obținerea diluțiilor successive

Probele de analizat se pregătesc în vederea obținerii diluțiilor succesive în conformitate cu tehnica descrisă anterior.

Inoculare și incubare

Din fiecare diluție stabilită pentru însămânțare se introduc câte 1 ml în centrul a 2 plăci Petri cu o pipetă sterilă. Pentru fiecare diluție se utilizează pipete sterile. După aceasta se toarnă aproximativ 15 ml mediu de cultură VRBG topit și răcit la 45°±1ºC, astfel încât să se obțină o suprafață continuă de aproximativ 3 mm grosime. Se omogenizează cu grijă inoculul cu mediul de cultură prin efectuarea unor mișcări de rotație în plan orizontal prin câte 5 mișcări circulare în sensul acelor de ceasornic și 5 în sens invers și prin alte 5 mișcări înainte și înapoi iar apoi se lasă să se solidifice pe o suprafață rece și orizontală. Se recomandă ca timpul care se scurge de la obținerea diluției inițiale (101) și până la adăugarea mediului de cultură în plăcile Petri să nu depășească 15 minute. După solidificarea completă, se adaugă un strat superficial de aproximativ 15 ml agar cu bilă, cristal violet și glucoză, topit in prealabil si mentinut la 44ºC-47ºC intr-o baie de apa, pentru a preveni creșterea invazivă și pentru a crea condiții de semi-anaerobioză și se lasă să se solidifice, așezând cutiile Petri pe o suprafață orizontală, rece, punând capacul pe cutie după solidificare.După solidificarea completă a mediului, cutiile Petri se introduc la termostat la 37°C cu capacul în jos, pentru a se evita formarea condensului, timp de 24±2 ore.

Selectarea coloniilor pentru confirmare biochimică

După 18-24 ore de incubare se efectuează numărarea coloniilor cu ajutorului aparatului de numărare, luându-se în considerere plăcile în care s-au dezvoltat maxim 150 colonii tipice de Enterobacteriaceae. Determinarea se consideră anulată dacă jumatate sau mai mult de jumătate din suprafața plăcii este invadată. Daca mai puțtin de jumătate din suprafața placii este invadată se numără coloniile de pe partea clară și se extrapolează astfel incât numărul să corespundă la suprafața totală a plăcii. Anumite Enterobacteriaceae pot cauza decolorarea coloniilor sau a mediului. De aceea, când nu sunt prezente coloniile caracteristice, se aleg 5 colonii albicioase pentru confirmare. Se aleg randomizat 5 colonii caracteristice din care se vor efectua subculturi pe agar nutritiv pentru confirmare biochimică. Se însămânțează prin striere în cutii cu agar nutritiv fiecare din coloniile selecționate în vederea confirmării. Se incubează plăcile la 37ºC, 24 ±2 ore. Pentru confirmare biochimică se selectează o colonie bine izolată din fiecare cutie incubată.

Confirmare biochimică

Testul oxidazei

Cu ansa sau cu acul de însămânțare cu fir de platină/iridiu se ia câte o porțiune din fiecare colonie izolată și se însămânțează prin striere hârtia de filtru umectată cu reactiv sau pe un disc aflat în comerț. Nu se utilizează ansa sau fir din nichel/crom. Testul se consideră negativ dacă culoarea hârtiei îmbibate cu reactiv nu a virat in negru în 10 sec. Pentru discurile gata preparate se respectă indicațiile fabricantului.

Testul fermentării

Se repică aceleași colonii selecționate cu un ac de însămânțare în eprubete care conțin mediu glucozat. Se incubează tuburile la 37ºC, 24 ±2 ore. Reacția se consideră pozitivă dacă totalitatea conținutului eprubetei se colorează în galben. Majoritatea tulpinilor de Enterobacteriaceae produc gaz.

Interpretarea testelor biochimice

Coloniile oxidază-negative și glucozo-pozitive sunt confirmate ca și Enterobacteriaceae.

Exprimarea rezultatelor

Numărul de microorganisme pe mililitru sau gram de produs – N, se calculează, ca medie ponderată, cu ajutorul următoarei formule :

N – număr total de microorganisme mezofile aerobe

C – suma coloniilor numarate în toate cutiile Petri reținute

n1 – numărul de cutii reținute la prima diluție

n2 – numărul de cutii reținute la a doua diluție

d – factorul de diluție corespunzător primei diluții

Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative. Pentru evaluarea bacteriologică a suprafeței carcaselor de bovine, ovine, caprine, porcine și cabaline, in unitatile de tăiere, pentru controlul dezinfecției și curățeniei in abatoare și unități de tranșare, calculul și exprimarea rezultatelor se face în ufc/cm2, iar media zilnică a valorii logaritmice se calculează prin aflarea logaritmului in baza 10 a fiecarui rezultat obtinut individual și apoi se calculează media aritmetică a valorilor logaritmice.

Determinarea încărcăturii totale de germeni din genurile Pseudomonas – Aeromonas

Materiale

Aparatură și sticlărie

Baloane Erlenmeyer sterile (100 cm3, 200 cm3, 1000 cm3)

Eprubete de 16/160 mm sterile;

Pipete gradate de 1 și 2 ml sterile cu scurgere totală ;

Pipetor automat ;

Omogenizator tip Stomacher ;

Agitator Vortex;

Bisturie, foarfeci,spatule, pense sterile;

Cutii Petri de 90/15 mm sterile;

Hotă cu flux laminar Biohazard;

Termostat reglabil;

Autoclav;

pH-metru electronic, cu precizie 0,1 unități;

Aparat de numărarea coloniilor, cu sistem de iluminare.

Medii și reactivi

Soluție fiziologică peptonată:

la 1000 ml apă distilată se adaugă 8,5 g clorură de sodiu și 1 g peptonă, după care se agită. După dizolvarea ingredientelor, se ajustează pH-ul la 7,0 iar soluția se repartizează în eprubete și vase Erlenmayer de sticlă și se sterilizează la 120˚C timp de 15 minute.

Mediul GSP agar (glutamat starch phenolred, Merck) – agar selectiv pentru Pseudomonas – Aeromonas

Compoziție g/l:

glutamat de sodiu 10 g

amidon solubil 20 g

sulfat de magneziu 0,5 g

roșu fenol 0,36 g

fosfat de potasiu 2 g

agar – agar 12 g

Preparare:

se suspendă 45g într-un litru apă distilată, se dizolvă pe baia de apă; pH-ul la 25˚C este 7,2±0,2, sterilizare prin autoclavare 15 minute la 121˚C. La 40º–45˚C se adaugă 100.000 U.I penicilină G.

Utilizare:

mediul permite dezvoltarea și diferențierea foarte bună a coloniilor de Pseudomonas, de culoare roșie și a coloniilor de Aeromonas, de culoare galbenă. Se incubează timp de 48 de ore la 22˚C, coloniile putând fi apreciate după 24 – 48 ore.

Pregătirea probei de analizat – eșantionarea și obținerea diluțiilor successive

Probele de analizat se pregătesc în vederea obținerii diluțiilor succesive în conformitate cu tehnica descrisă anterior.

Inoculare și incubare

Din fiecare diluție stabilită pentru însămânțare se introduc câte 0.1 ml, în centrul a 2 plăci Petri în care s-a turnat în prealabil mediul GSP, cu o pipetă sterilă. Pentru fiecare diluție se utilizează pipete sterile. Se omogenizează cu grijă inoculul cu ajutorul unei anse de însămânțare Drigalski, cu mediul de cultură prin efectuarea unor mișcări de rotație în plan orizontal prin câte 5 mișcări circulare în sensul acelor de ceasornic și 5 în sens invers și prin alte 5 mișcări înainte și înapoi. După omgenizare, cutiile Petri se introduc la termostat la 20°C cu capacul în jos, pentru a se evita formarea condensului, timp de 48±2 ore.

Selectarea coloniilor pentru confirmare

După 48 ore de incubare se efectuează numărarea coloniilor cu ajutorului aparatului de numărare, luându-se în considerere plăcile în care s-au dezvoltat maxim 150 colonii tipice de Pseudomonas – Aeromonas. Se aleg randomizat 5 colonii caracteristice din care se vor efectua testele pentru confirmare biochimică.

Confirmare biochimică

În vederea stabilirii configurației microflorei psihrotrofe de la nivelul cărnii, din fiecare placă Petri se vor testa câte cinci colonii considerate caracteristice pe baza caracterelor culturale, morfologice și biochimice pentru specia respectivă.

Testul cu KOH 3%

Se bazează pe principiul lizării peretelui bacterian de către KOH 3% și eliberarea filamentelor de AND.

Mod de lucru: pe o lamă se pune o picătură KOH 3%, după care se transferă cu ansa de însămânțare o colonie bine crescută și se omogenizează prin mișcări circulare. În caz pozitiv se observă apariția unei vâscozități în 15-30 secunde. AND eliberat se pune în evidență prin ridicare ansei și apariția unor filamente. Testul este pozitiv doar pentru bacteriile Gram negative.

Bactident aminopeptidază (Merck)

Conține 50 bandelete indicatoare care se utilizează pentru identificarea L–alanil-aminopeptidazei din microorganisme, o enzimă localizată în peretele celular al bacteriilor, care au o activitate exclusivă pentru microorganismele Gram negative.

Mod de lucru: se prelevează cu ansa de însămânțare o colonie individuală de pe mediul selectiv, care se suspendă în 0,2 ml apă distilată într-o eprubetă. Se introduce bandeleta test în eprubetă astfel încât zona de reacție să fie complet imersată în suspensia bacteriană. Se incubează eprubeta timp de 10 – 30 minute la 37˚C.

Rezultat: apariția unei culori galbene a suspensiei bacteriene în 10 minute este considerată pozitivă pentru toate microorganismele Gram negative, cu excepția speciilor Bacteroides vulgatus, B. fragilis, Campylobacter spp. și Veillonela parvula iar reacție negativă (suspensia bacteriană rămâne incoloră), pentru toate microorganismele Gram pozitive.

Bactident oxidază (Merck)

Conține 50 bandelete test pentru testarea activității citocrom oxidazei la microorganisme.

Mod de lucru: cu ansa de însămânțare se ia o colonie bine crescută de pe mediul de cultură selectiv și se aplică pe bandeleta test la nivelul zonei de reacție, iar după 20–60 secunde se compară cu scara etalon. În cazul germenilor citocrom oxidază pozitivi, zona de reacție este colorată în albastru–albastru violet.

Bactident catalază (Merck)

Pe o lamă se depune o picătură din reactiv (apă oxigenată 3%), în care se face o suspensie abundentă din germenii de examinat. Reacția pozitivă este marcată de producerea unei efervescențe accentuate.

API 20 NE (Biomerieux)

Este un sistem standardizat pentru identificarea bacililor Gram negativi nepretențioși non-enterobacterii (de ex. Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas etc.), care utilizează 8 teste convenționale, 12 teste de asimilație miniaturizate precum și o bază de date. Organismele pretențioase, care necesită condiții speciale de creștere și testare (de ex. Brucella si Francisella) nu sunt cuprinse în baza de date API 20 NE. Pentru excluderea sau confirmarea prezenței lor sunt necesare metode alternative.

Principiu

Galeria API 20 NE este constituită din 20 microtuburi care conțin diverse substrate sub formă deshidratată. Testele convenționale se inoculează cu o suspensie salină bacteriană, realizată din colonia studiată, pentru reconstituirea mediului. Reacțiile produse în timpul perioadei de incubare se traduc prin viraje de culoare spontane sau obținute prin adăugarea de reactivi suplimentari. Testele de asimilație se inoculează cu un mediu minimal iar bacteriile cresc dacă sunt capabile să utilizeze substratul respectiv.

Citirea acestor reacții se realizează cu ajutorul tabelului de citire iar identificarea este obținută cu ajutorul programului soft APILAB PLUS.

Echipament de laborator necesare:

incubator (35–37ºC);

frigider;

bec Bunsen;

creioane marker.

Pregătirea galeriilor :

într-o cutie de incubare se repartizează aprox. 5 ml apă distilată sau demineralizată în godeurile tăviței pentru crearea unei atmosfere umede (se poate folosi orice fel de apă fără aditivi chimici care pot duce la elibererea de gaze, cum ar fi Cl2, CO2 etc.) ;

se desface ambalajul galeriei ;

se pune galeria în taviță.

Prepararea inoculului :

se deschide o fiolă de mediu NaCl 0.85% (5 ml) sau o fiolă de mediu de suspensie (5 ml sau se utilizează un tub ce conține 5 ml apă peptonată sterilă sau apă distilată sterilă fără aditiv) ;

se prelevează cu o pipetă Pasteur o colonie bine individualizată izolată de pe mediul gelozat. Se recomandă folosirea unei culturi tinere (18-24 ore);

se realizează o suspensie bacteriană omogenizând bine bacteriile în mediu. Această suspensie trebuie folosită imediat după preparare.

Inocularea galeriei:

Se umplu tuburile (nu și cupulele) testelor NO3, până la PNPG din galerie cu suspensia bacteriană utilizând psipeta pentru prelevare. Pentru evitarea formării bulelor de aer la baza tuburilor, se ține vârful pipetei în partea superioară a cupulei înclinând ușor spre înainte cutia de incubare.

Se deschid fiolele cu mediu API AUX și se transferă în el cu o psipeta aprox. 200l (6-8 picături) din suspensia salina rămasă, după care se omogenizează cu psipeta evitând formarea bulelor de aer. Se umple tuburile și cupulele testelor GLU până la PAC cu suspensie în așa fel încât să se obțină o suprafață orizontală sau ușor convexă, dar niciodată concavă. Cupulele incomplet umplute sau foarte pline pot conduce la rezultate incorecte. Se creează condiții de anaerobioză în testele GLU, ADH, URE, umplând cupulele respective cu ulei de parafină până se formează un menisc convex. Se închide cutia de incubare și se încubează la 29+2°C timp de 24 ore (+2 ore).

Interpretarea:

Identificarea se poate realiza plecănd de la profilul numeric:

Determinarea profilului numeric:

Pe fișa de rezultate testele sunt separate în grupe de trei și o valoare 1, 2 sau 4 este indicat pentru fiecare test. Adunând în interiorul fiecărei grupe de câte 3 teste numerele corespunzătoare reacțiilor pozitive, se obțin 7 cifre pentru cele 20 de teste ale galeriei API 20 E. Reacția oxidazei, care constituie al 21-lea test, are valoarea 4 când este pozitivă.

Identificarea:

cu ajutorul softului de identificare APILAB Plus, prin introducerea manuală a codului numeric (alcătuit din 7 cifre) rezultat la citire.

În unele cazuri profilul de 7 cifre este insuficient de discriminativ și trebuie realizate teste suplimentare:

reducerea nitraților la nitriți (NO2) și N2 gaz: Se adaugă o picătură de reactiv NIT 1 și NIT 2 în tubul GLU. O colorație roșie care apare în 2-5 minute indică o reacție pozitivă. O reacție negativă (colorație galbenă) se poate datora producției de azot (eventual semnalată prin prezența de microbule); se adaugă 2-3 mg de reactiv Zn în godeul GLU. După 5 min., dacă tubul rămâne galben indică o reacție pozitivă. Dacă cupula devine portocaliu-roșu, reacția este negativă, nitrații încă prezenți în tub au fost reduși la nitriți de către zinc. Aceasta reacție este interesantă pentru bacilii Gram negativi oxidazo-pozitivi;

mobilitatea (MOB): se însmântează o fiolă cu mediu API M;

creșterea pe agar Mac Conkey (McC): se inoculează o placă cu agar Mac Conkey;

oxidarea glucozei (OF-O): se inoculează o fiolă cu mediu API OF;

fermentarea glucozei (OF-F): se inoculează o fiolă cu mediu API OF. Aceste teste suplimentare menționate în Catalogul de interpretare, pot fi utilizate pentru constituirea unui profil de 9 cifre, identificabil cu ajutorul softului APILAB Plus.

API 20 E (Biomerieux)

Este un sistem standardizat pentru identificarea germenilor din familia Enterobacteriaceae și a altor bacili Gram negativi nepretențioși, care utilizează 21 teste biochimice miniaturizate și o bază de date.

Principiu:

Galeria API 20 E este constituită din 20 microtuburi care conțin diverse substrate sub forma deshidratată. Testele sunt inoculate cu o suspensie bacteriană din colonia studiată, pentru reconstituirea mediului. Reacțiile produse în timpul incubării se traduc prin viraje de culoare spontane sau la adăugarea de reactivi suplimentari. Citirea acestor reacții se face cu ajutorul tabelului de citire iar identificarea este obtinuta cu ajutorul programului soft APILAB PLUS.

Conținutul kit-ului (pentru 25 identificari):

25 galerii API 20 E;

25 cutii de incubare;

25 fișe pentru rezultate ;

1 baretă pentru închiderea pungii cu galerii;

1 notiță tehnică;

mediu de suspensie 5 ml sau mediu NaCl 0.85%;

trusa de reactivi API 20 E sau reactivii individuali TDA, JAMES, VP1 + VP2, NIT1 + NIT2;

reactiv Zn;

oxidaza;

ulei de parafină;

catalog de interpretare API 20 E sau soft de identificare APILAB PLUS;

pipete Pasteur sau Psipete;

stativ pentru fiole.

sau suplimentar:

mediu API OF: Test pentru determinarea metabolismului fermentativ sau oxidative;

mediu API M: Test pentru determinarea motilității bacteriilor facultativ anaerobe.

Echipament de laborator necesar:

incubator (35 – 37ºC);

frigider;

bec Bunsen;

creioane marker.

Pregătirea galeriilor:

într-o cutie de incubare se repartizează aprox. 5 ml apa distilată sau demineralizată în godeurile tăviței pentru crearea unei atmosfere umede (se poate folosi orice fel de apă fără aditivi chimici care pot duce la elibererea de gaze, cum ar fi Cl2, CO2, etc.);

se desface ambalajul galeriei;

se pune galeria în taviță.

Prepararea inoculului :

se deschide o fiolă de mediu NaCl 0.85% (5 ml) sau o fiolă de mediu de suspensie (5 ml sau se utilizează un tub ce conține 5 ml apă peptonată sterilă sau apă distilată sterilă fără aditiv;

se prelevează cu o pipetă sau o psipetă o singură colonie bine individualizată izolată de pe mediul Levine. Se recomandă folosirea unei culturi tinere (18-24 ore);

se realizează o suspensie bacteriană omogenizând bine bacteriile în mediu. Aceasta suspensie trebuie folosită imediat după preparare.

Inocularea galeriei:

se umplu tuburile și cupulele testelor CIT, VP, GEL din galerie cu suspensia bacteriană utilizând psipeta pentru prelevare;

se umple doar tuburile (nu și cupulele) celorlalte teste;

se crează anaerobioză în testele ADH, LDC, ODC, URE, H2S, umplând cupulele respective cu ulei de parafină;

se închide cutia de incubare și se incubează la 36+2°C timp de 18-24 ore;

Citire si interpretare :

Citirea galeriei :

după incubare, se citește galeriei cu ajutorul tabelului de citire;

dacă 3 teste sau mai multe sunt pozitive (testul GLU + sau -), se notează pe fișa pentru rezultate toate reacțiile spontane și se efectuează testele care necesită adaugarea de reactivi:

test TDA: Se adaugă o picatură de reactiv TDA. Culoarea maro roșcat indică o reacție pozitivă care va fi notată pe fișa pentru rezultate;

test IND: Se adaugă o picatură de reactiv JAMES. Culoarea roz difuzată în tot godeul indică o reacție pozitivă;

test VP: Se adaugă o picatură de reactivi VP 1 și VP 2. Apariția culorii roz sau roșu după cel puțin 10 minute indică o reacție pozitivă care va fi notată pe fișa pentru rezultate. Colorația roz slab apărută după 10 minute indică o reacție negativă.

Notă: testul de producere a indolului trebuie să fie realizat ultimul, deoarece această reacție eliberează gaz care riscă să altereze interpretarea celorlalte teste din galerie. Dacă numărul de teste pozitive este mai mic de 3 (inclusiv testul GLU) înainte de adăugarea reactivilor:

se reincubează galeria pentru 24+2 ore fără a se adauga vreun reactiv;

se efectuează testele care necesită adaugarea de reactivi (vezi mai sus);

pentru completarea identificării este necesar să se realizeze teste suplimentare : testul O-F și testul M.

Interpretarea:

Identificarea se poate realiza plecănd de la profilul numeric:

Determinarea profilului numeric:

Pe fișa de rezultate testele sunt separate în grupe de trei și o valoare 1, 2 sau 4 este indicat pentru fiecare test. Adunând în interiorul fiecărei grupe de câte 3 teste numerele corespunzătoare reacțiilor pozitive, se obțin 7 cifre pentru cele 20 de teste ale galeriei API 20E. Reacția oxidazei, care constituie al 21-lea test, are valoarea 4 când este pozitivă.

Identificarea:

cu ajutorul softului de identificare APILAB Plus, prin introducerea manuală a codului numeric (alcătuit din 7 cifre) rezultat la citire.

În unele cazuri profilul de 7 cifre este insuficient de discriminativ și trebuie realizate teste suplimentare:

reducerea nitraților la nitriți (NO2) și N2 gaz: Se adaugă o picătură de reactiv NIT 1 și NIT 2 în tubul GLU. O colorație roșie care apare în 2-5 minute indică o reacție pozitivă. O reacție negativă (colorație galbenă) se poate datora producției de azot (eventual semnalată prin prezența de microbule); se adaugă 2-3 mg de reactiv Zn în godeul GLU. După 5 min., dacă tubul rămâne galben indică o reacție pozitivă. Dacă cupula devine portocaliu-roșu, reacția este negativă, nitrații încă prezenți în tub au fost reduși la nitriți de către zinc. Aceasta reacție este interesantă pentru bacilii Gram negativi oxidazo-pozitivi;

mobilitatea (MOB): se inoculează o fiolă cu mediu API M;

creșterea pe agar Mac Conkey (McC): inoculați o placă cu agar Mac Conkey;

oxidarea glucozei (OF-O): se inoculează o fiolă cu mediu API OF;

fermentarea glucozei (OF-F): se inoculează o fiolă cu mediu API OF;

aceste teste suplimentare menționate în catalogul de interpretare, pot fi utilizate pentru constituirea unui profil de 9 cifre, identificabil cu ajutorul softului APILAB Plus.

Pentru aprecierea configurației microbiene psihrotrofe de la nivelul carcaselor de bovine am utilizat medii de cultură selective deshidratate pentru identificarea bacteriilor din genurile Aeromonas, Pseudomonas, Yersinia, a germenilor psihrotrofi din Familia Enterobacteriaceae și bacteriile acido-lactice urmat de identificarea germenilor prin examenul morfologic al acestora utilizând colorația Gram și testele de confirmare biochimică. Deoarece unele specii bateriene psihrotrofe nu necesită condiții speciale de dezvoltare, identificarea lor s-a realizat utilizându-se mediul nutritiv PCA (Merck), urmat de efectuarea testelor de confirmare morfologică și biochimică, conform protocolului din fig. 1.

Fig. 1 Schema generală de identificare a bacteriilor psihrotrofe

Determinarea încărcăturii totale de bacterii acido-lactice

Materiale

Aparatură și sticlărie

Baloane Erlenmeyer sterile (100 cm3, 200 cm3, 1000 cm3)

Eprubete de 16/160 mm sterile;

Pipete gradate de 1 și 2 ml sterile cu scurgere totală ;

Pipetor automat ;

Omogenizator tip Stomacher ;

Agitator Vortex;

Bisturie, foarfeci,spatule, pense sterile;

Cutii Petri de 90/15 mm sterile;

Hotă cu flux laminar Biohazard;

Termostat reglabil;

Autoclav;

pH-metru electronic, cu precizie 0,1 unități;

Aparat de numărarea coloniilor, cu sistem de iluminare.

Medii și reactivi

Soluție fiziologică peptonată:

la 1000 ml apă distilată se adaugă 8,5 g clorură de sodiu și 1 g peptonă, după care se agită. După dizolvarea ingredientelor, se ajustează pH-ul la 7,0 iar soluția se repartizează în eprubete și vase Erlenmayer de sticlă și se sterilizează la 120˚C timp de 15 minute.

Mediul MRS – Lactobacillus agar ( De man, Rogosa, Sharpe, Merck) – agar selectiv pentru izolarea bacteriilor lactice.

Compoziție:

peptonă din cazeină 10 g

extract de carne 8 g

extract de drojdie 4 g

D-glucoză 20 g

dihidrogen fosfat de potasiu 2g

dihidrogen citrat de amoniu 2g

tween 80 1 g

acetat de sodiu 5 g

sulfat de magneziu 0,2 g

sulfat de mangan 0,04 g

agar – agar 14 g

Preparare:

se suspendă 66,2g într-un litru de apă distilată sterilă, se dizolvă pe baia de apă; pH-ul la 25˚C 5,7±0,2. Se sterilizează prin autoclavare 15 minute la 121˚C.

Utilizare:

mediul permite dezvoltarea coloniilor de Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, Bifidum bacterium, L. casei. Se incubează 48-72 ore, în condiții aerobe sau microaerofilie, în funcție de specia de bacterie lactică.

Pregătirea probei de analizat – eșantionarea și obținerea diluțiilor successive

Probele de analizat se pregătesc în vederea obținerii diluțiilor succesive în conformitate cu tehnica descrisă anterior.

Inoculare și incubare

Din fiecare diluție stabilită pentru însămânțare se introduc câte 0.1 ml, în centrul a 2 plăci Petri în care s-a turnat în prealabil mediul MRS, cu o pipetă sterilă. Pentru fiecare diluție se utilizează pipete sterile. Se omogenizează cu grijă inoculul cu ajutorul unei anse de însământare Drigalski, prin efectuarea unor mișcări de rotație în plan orizontal prin câte 5 mișcări circulare în sensul acelor de ceasornic și 5 în sens invers și prin alte 5 mișcări înainte. Se recomandă ca timpul care se scurge de la obținerea diluției inițiale (101) și până la adăugarea mediului de cultură în plăcile Petri să nu depășească 15 minute. După omogenizarea inoculului, cutiile Petri se introduc la termostat la 30°C cu capacul în jos, pentru a se evita formarea condensului, timp de 48±2 ore.

Selectarea coloniilor pentru confirmare biochimică

După 48 ore de incubare se efectuează examen microscopic din 5 colonii caracteristice dezvoltate în plăcile cu mediul MRS, luându-se în considerare doar coloniile din care s-au identificat germeni Gram pozitivi (bacili și/sau coci).

Confirmare biochimică

Testul oxidazei

Cu ansa sau cu acul de însămânțare cu fir de platină/iridiu se ia câte o porțiune din fiecare colonie izolată și se însămânțează prin striere hârtia de filtru umectată cu reactiv sau pe un disc aflat în comerț. Nu se utilizează ansa sau fir din nichel/crom. Testul se consideră negativ dacă culoarea hârtiei îmbibate cu reactiv nu a virat in negru în 10 sec. Pentru discurile gata preparate se respectă indicațiile fabricantului. Bacteriile acido-lactice sunt oxidazo-negative.

Testul catalazei

Se aplică pe suprafața unei lame microscopice 1-2 picături de apă oxigenată, în care se omogenizeaă una sau două colonii specifice pentru bacteriile acido-lactice. Apariția unei reacții efrvescente denotă un rezultat pozitiv. Bacteriile acido-lactice sunt catalazo-negative.

Pentru identificarea speciilor de bacterii acido-lactice coloniile catalazo-negative și oxidază-negative sunt luate în vedere pentru efectuarea testelor API 50 CH.

Exprimarea rezultatelor

Numărarea coloniilor cu ajutorului aparatului de numărare, luându-se în considerere plăcile în care s-au dezvoltat maxim 150 colonii tipice de bacterii acido-lactice. Numărul de microorganisme pe mililitru sau gram de produs – N, se calculează, ca medie ponderată, cu ajutorul următoarei formule :

N – număr total de microorganisme mezofile aerobe

C – suma coloniilor numarate în toate cutiile Petri reținute

n1 – numărul de cutii reținute la prima diluție

n2 – numărul de cutii reținute la a doua diluție

d – factorul de diluție corespunzător primei diluții

Metoda orizontală pentru detecția Yersinia enterocolitica prezumtivă

(SR EN ISO 10273/2003)

Materiale

Aparatură și sticlărie

Termostat la 25°C, 32oC, 37°C

Mixer rotativ si separator

Autoclav

Balanța tehnică

Stomacher

Etuva

Microscop

Hotă cu flux laminar

Baie de apă termoreglabilă

Pipetor

baloane Erlenmeyer de diferite volume, sterile (100 cm3, 200 cm3, 300 cm3, 1000 cm3)

eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm, 18/180mm, 10/100mm)i

pipete gradate sterile, cu capacitatăți diferite (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml), cu gradații de 0,1 ml

cutii Petri sterile, cu diametre diferite (100 mm, 140mm)

perle din sticlă sterile

anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom și/sau ace de însămânțare și baghete sterile

stative pentru eprubete

pense/spatule

cilindrii gradați sterili, cu capacități diferite (25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml).

Medii de cultură și reactivi

Agar Salmonella Shigella cu deoxicolat de sodium și clorură de calciu (SSDC)

Compoziție:

Digestiv peptidic din țesuturi animale 10.0 g

Extract de drojdie 5.0 g

Lactoză 10.0 g

Amestec de săruri biliare 8.5 g

Deoxicolat de sodiu 10.0 g

Clorură de calciu 1.0 g

Citrat de sodiu 10.0 g

Tiosulfat de sodiu anhidru 5.42 g

Citrate feric (III) de amoniu 1.0 g

Verde malachit 0.0003 g

Roșu tilol 0.025 g

Agar 15.0 g.

Preparare: se suspendă 75.94 g într-un litru de apă distilată, după care se dizolvă pe baia de apă la 50˚C, pH-ul la 25˚C se ajustează la 7.3 ± 0.2. Se omogenizează prin încălzire aproape de temperature de fierbere și se toarnă fierbinte în plăci Petri sterile (nu se autoclavează).

Aspect: mediul neînsământat are culoare roșie portocalie, translucid spre opalescent, iar coloniile specifice de Yersinia sunt netede, transparente, de 1 mm diametru,cu centru ușor granular.

Agar CIN (cefsulodin, irgasanTM și novobiocina)

Compoziție:

Peptonă din cazeină 10 g

Peptonă din carne 10 g

Extract de drojdie 2 g

D-manitol 20 g

Piruvat de sodiu 2 g

NaCl 1 g

Sulfat de magneziu 0.01 g

Mixtură de săruri biliare 1 g

Roșu neutru 0.03 g

Cristal violet 0.001 g

Agar 12.5 g

Preparare: se suspendă 58.5 g într-un litru de apă demineralizată, după care se dizolvă pe baia de apă, pH-ul la 25˚C se ajustează la 7.4 ± 0.2; se sterilizează, prin autoclavare, timp de 15 minute la 121˚C, se răcește la 45º–50˚C, după care se adaugă două flacoane de supliment selectiv pentru Yersinia spp., care conține: cefsoludin 7.5 g, irgasan 2 mg, novobiocin 1.25 mg. Conținutul unui flacon se dizolvă prin într-un ml de apă distilată sterilă și 1 ml etanol.

Aspect: mediul neînsământat are culoare roz deschis, transparent, iar coloniile specifice de Yersinia sunt netede, de 1 -2 mm, cu centrul roz și maginea gri-cenușie, opacă (fig. 37).

Bulion PSB (peptonă, sorbitol și săruri biliare)

Bulion TSB (triptonă și soia)

Bulion BOS (oxalat de sodiu și săruri biliare)

Bulion ITC (irgasan, ticarcilin și clorat de potasiu)

Galerii API 20 E

Reactivi:

0.25% KOH in 0.5% NaCl soluție apoasă

Cristal violet

Ulei mineral steril

Sulfat feros de amoniu 1% (proaspăt preparat)

Reactiv Kovacs

reactivi Voges-Proskauer

Oxidază

Glicerol

Soluție HCl 1 N

Pregătirea probei de analizat – eșantionarea și obținerea diluțiilor successive

25 g din proba de analiză se omogenizează cu 225 ml bulion ITC (irgasan, ticarcilin și clorat de potasiu) și se omogenizează in Stomacher timp de 2 min, urmată de incubare la 25°C timp de 2-3 zile. De asemenea, 25 g din proba de analiză se omogenizează cu 225 ml bulion PSB (peptonă, sorbitol și săruri biliare) sau bulion TSB (triptonă și soia) și se omogenizează in Stomacher timp de 2 min, urmată de incubare la 22-25°C timp de 1 zi.

Îmbogățire selectivă

Din suspensia microbiană dezvoltată în bulionul PSB/TSB se însămânțează 0.1 ml în 9.9 sau 1 ml în 99 ml bulion BOS (oxalat de sodiu și săruri biliare) și se incubează 2-3 zile la 22-25°C.

Izolare pe medii selective

Din culturile microbiene obținute în mediile lichide se vor dispersa câte 0.1 ml la suprafața a două medii solide selective:

agar cu CIN (cefsulodin, irgasanTM și novobiocina), urmată de incubare la 32°C timp de 18 h;

agar Salmonella Shigella cu deoxicolat de sodium și clorură de calciu (SSDC), urmată de incubare la 30°C timp de 24 h;

din culturile dezvoltate în mediile lichide TSB/PSB, se iau 0.5 ml care se omogenizează la vortex 3-4 sec. în 4.5 ml KOH 0.5%, respectiv 4.5 mlNaCl 0.5 %, urmată de inocularea prin striere cu ansa la suprafața mediului CIN, care se va incuba la 32°C timp de 18 h.

După incubare se vor urmări dezvoltarea coloniilor caracteristice de Y. enterocolitica.

Confirmarea identității

5 colonii tipice dezvoltate la suprafața mediilor selective solide se însământează prin striere la suprafața unui agar neselectiv, care se incubează la 25°C timp de 2-3 zile, urmată de confirmare biochimică, biotipizare, teste de patogenitate și teste serologice.

Metoda orizontală pentru izolarea și identificarea Campylobacter spp. (SR EN ISO 10272/2/2007)

Materiale

Aparatură și sticlărie

Termostat la 37oC, 41.5°C

Mixer rotativ si separator

Autoclav

Balanța tehnică

Stomacher

Etuva

Microscop

Hotă cu flux laminar

Baie de apă termoreglabilă

Pipetor

Pipetă mecanică de la 20-200 µl

Pipetă mecanică de la 100-1000 µl

baloane Erlenmeyer de diferite volume, sterile (100 cm3, 200 cm3, 300 cm3, 1000 cm3)

eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm, 18/180mm, 10/100mm)i

pipete gradate sterile, cu capacitatăți diferite (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml), cu gradații de 0,1 ml

cutii Petri sterile, cu diametre diferite (100 mm, 140mm)

perle din sticlă sterile

anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom și/sau ace de însămânțare și baghete sterile

stative pentru eprubete

pense/spatule

cilindrii gradați sterili, cu capacități diferite (25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml).

Eprubete tip Eppendorf de material plastic de unică folosință

plicuri de Campygen

Medii de cultură și reactivi

Agar modificat cu cărbune, cefoperazonă, deoxicolat mCCD (Charcoal Cefoperazone Deoxycholate)

Compozitie:

Extract de carne 10.0 g

Digest enzimatic de țesuturi animale 10.0 g

Clorură de sodiu 5.0 g

Cărbune 4.0 g

Digest enzimatic de cazeină 3.0 g

Deoxicolat de sodiu 1.0 g

Sulfat feros 0.25 g

Piruvat de sodiu 0.25 g

Agar 8-10.0 g

Preparare: Se suspendă 24.2 g în 500 ml apă distilată, după care se dizolvă pe baia de apă. Se ajustează pH-ul dacă este necesar, astfel ca după sterilizare să fie 7.4 ± 0.2 la 25˚C și se sterilizează prin autoclavare timp de 15 min. la temperatura de 121˚C.

Soluția de antibiotice:

Cefoperazonă 0.032 g

Amfotericină B 0.01 g

Apă 5 ml

Compoziție mediu complet:

Mediu de bază (mCCD) 1000 ml

Soluție de antibiotic 5 ml

Preparare: Se adaugă soluția de antibiotic la mediul de bază topit și răcit la 47°±2°C, apoi se omogenizează prin mișcări circulare cu atenție. Se toarnă circa 15 ml mediu complet în cutii Petri sterileși se lasă să se solidifice. Chiar înainte de folosire, se usucă cu atenție plăcile de agar, de preferat fără capace și cu suprafața agarului orientat în jos, într-o etuvă de uscare timp de 30 min. sau până când suprafața agarului este lipsită de umiditate vizibilă. Dacă au fost preparate înainte, plăcile de agar neuscate nu se păstrează maimult de 4 h la temperatura ambiantă, sau la întuneric la 5°C±3°C mai mult de 7 zile.

Aspect: mediul neînsămânțat are culoare neagră, omogen, aspect opalescent, iar coloniile tipice sunt netede, cu marginile clare, de culoare cenușie sau negru-cenușiu.

Agar cu sânge Columbia

Compoziție mediu de bază:

Digest enzimatic de țesuturi animaliere 23,0 g

Amidon 1,0 g

Clorură de sodiu 5,0 g

Agar 8.0-10.0 g

Apă 1000 ml

Preparare: Se dizolvă componentele de bază sau mediul de bază complet, deshidratat, înapă, prin aducere la fierbere.Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, așa încât după sterilizare să fie 7,3±0,2la 25°C. Se repartizează mediul de bază în flacoane de capacitate corespunzătoare. Se sterilizează în autoclavă fixată la 121°C timp de 15 min.

Compoziție mediu complet:

Mediu de bază agar Columbia 1000 ml

Sânge de oaie defibrinat steril  5 ml

Preparare: se adaugă aseptic sângele la mediul de bază, răcit la 47°C±2°C, apoi seomogenizează cu atenție. Se toarnă circa 15 ml mediu complet în cutii Petri sterile. Se lasă să se solidifice. Chiar înainte de folosire, se usucă cu atenție plăcile de agar, de preferat fără capace și cu suprafața agarului orientat în jos, într-o etuvă de uscare timpde 30 min sau până când suprafața agarului este lipsită de umiditate vizibilă. Dacă aufost preparate înainte, plăcile de agar neuscate nu se păstrează mai mult de 4 h la temperatura ambiantă, sau la întuneric la 5°C±3°C mai mult de 7 zile la 5°C±3°C.

Aspect: mediul neînsămânțat are culoare roșie, cu aspect opalescent, omogen iar coloniile tipice sunt netede, cu marginile clare, de culoare cenușie-maronie.

Bulion Bolton

Compozitie:

Cefoperazonă 10.0 g

Vancomicină 10.0 g,

Lactat de trimetoprim 10.0 g

Polimixină B 5.0 g

Preparare: Se suspendă 13.9 g în 500 ml apă distilată, după care se dizolvă pe baia de apă. Se sterilizează la autoclav timp de 15 min la temperatura de 121˚C, apoi se păstrează la o temperatură de 44-47˚C. Se realizează o reconstituire a conținutului prin adăugarea de 5 ml etanol 50% și 25 ml de agar cu sânge. Se omogenizează bine, iar pe urmă se distribuie în tuburi.

Bulion Brucella

Compoziție:

Digest enzymatic de cazeină 10.0 g

Digest de țesutiri animale 10.0 g

Glucoză 1.0 g

Extract de drojdie 2.0 g

Clorură de sodiu 5.0g

Disulfit de sodiu 0.1 g

Apă 1000 ml

Preparare: Se dizolvă componentele de bază sau mediul de bază complet, deshidratat, înapă, prin încălzire dacă este necesar.Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, așa încât după sterilizare să fie 7,0±0,2 la 25°C. se repartizează mediul în eprubete de10 ml și se sterilizează în autoclav la 121°C timp de 15 min.

Reactivi pentru teste biochimice:

Oxidază

Hidroliza hipuratului

Discuri cu Indoxyl acetat

Soluție Ninhydrin 3.5 %

Pregătirea probei de analizat – eșantionarea și obținerea suspensiei inițiale

În cazul probelor cu consistență solidă se prelevează fragmente din diverse zone, astfel că în cantitatea prelevată pentru analiză produsul să fie corect reprezentată. Produsele congelate se lasă în recipientul de recoltare la frigider până la decongelare totală sau până când se poate preleva cantitatea necesară pentru analiză. Se cântărește proba de analizat, în mod aseptic. După cântărire, omogenizarea probei cu consistență solidă se face cu ajutorul omogenizatorului electric Stomacher. Alimentele în bucăți mari (carne, preparate din carne) se vor mărunți anterior operației de omogenizare propriu-zisăi în acest scop se utilizează foarfeci, bisturie, pense sterile.

În cazul carcaselor de pasăre se prelevează 25 g din pielea gâtului, se adaugă 225 ml bulion Bolton, și se omogenizează in Stomacher timp de 1 min (fig. 2).

Îmbogățire selectivă

Suspensia initială se introduce în anaerojar cu plicuri de Campygen și se incubează în termostat la 37° timp de 4-6 ore, după care se păstrează la 41.5°C timp de 44 ore.

Izolare pe medii selective

Din cultura obținută în bulionul Bolton după incubare, se însămânțează cu o pipetă sterilă 0,1 ml din bulionul Bolton la suprafața a două plăci Petri cu mediu agar mCCD . Se omogenizează inoculul, cu atenție, fără a se atinge marginile plăcii. Plăcile se incubează în anaerojar cu plicuri de Campygen la 41,5°C timp de 44±4 h.

Confirmarea identității

Se rețin plăcile cu colonii caracteristice (colonii cu luciu metalic sub formă alungită) sau suspecte de Campylobacter spp. Pe agar mCCD tulpinile de Campylobacter jejuni produc colonii cenușii, plate și umede, adesea de nuanță verzuie și luciu metalic, cu o tendință de împrăștiere. tulpinile de Campylobacter coli produc colonii gri-crem, cu aspect umed, iar cele de Campylobacter lari formează ambele tipuri de colonii. Se selectează plăcile care conțin mai puțin de 150 colonii tipice sau suspecte și se numără aceste colonii. Deoarece tulpinile de Campylobacter sunt foarte sensibile în condiții de aerobioză, examenele de confirmare pentru trebuie realizate foarte repede (tab. 22).

Tabel 22

Criteriide diferențiere între diferitele specii de Campylobacter

Testul oxidazei

Din coloniile tipice de Campylobacter se ia o colonie izolată și se descarcă pe o hârtie de filtru îmbibată cu reactiv pentru oxidază. Apariția în timp de 10 secunde a unei culori mov, violet sau albastru închis, indică o reacție pozitivă. Pentru confirmarea rezultatelor pozitive se utilizează tulpini martor.

Dezvoltarea în condiții de microaerofilie

Din aceste colonii dezvoltate pe mediul mCCD se striază pe 2 plăci cu agar Columbia cu sânge. Se incubează în condiții de microaerofilie în anaerojar cu plicuri de Campygen la 41.5°C timp de 22±2 ore.

Examen morfologic și mobilitate

Din coloniile obținute pe agar Columbia cu sânge, după incubare la 41,50C se inoculează 1ml bulion Brucella pentru examinarea morfologică și mobilitate, la microscop cu contrast de fază. Se realizează un preparat între lamă și lamelă din bulionul Brucella. în cazul Campylobacter se vor evidenția bacili Gram negativi, curbați sauspiralați, foarte mobili, ceprezintă o mișcare în spirală, de tirbușon.

Testul catalazei

Colonii de pe agar Columbia cu sânge se omogenizează, pe o lamă de microscop, într-o picătură de soluție de peroxid de hidrogen. Apariția bulelor de gaz în 30 secunde indică reacția pozitivă.

Detectarea hidrolizei hipuratului

Se iau cu o ansă câteva colonii tipice dezvoltate pe agarul Columbia cu sânge și se introduc într-un tub de hemoliză cu 0.4 ml soluție de hipurat de sodiu. Se introduce tubul și se incubează într-o baie de apă la 370C timp de 2 ore. Se adaugă 0.2 ml soluție de ninhidrină la suprafața soluției de hipurat de sodiu. Se incubează în baia de apă la 370C timp de 10 minute. Apariția culorii violet închis indică reacția pozitivă. Culoarea violet deschis sau lipsa modificării culorii indică o reacție negativă.

Detectarea hidrolizei acetatului de indoxil

De pe agar Columbia cu sânge se ia o colonie și se pune pe un disc acetat indoxil peste care se adaugă o picătură de apă distilată sterilă. Apariția culorii albastru închis în 5-10 minute indică o reacție pozitivă. Lipsa modificării culorii indică reacția negative. Germenii din genul Campylobacter prezintă următoarele caracteristici:

morfologie – bacili mici Gram negativ, curbați;

mobilitate – caracteristică;

creștere aerobă la 41.5°C – negativă;

creștere microaerofilă la 41.5°C – negativă;

catalază – pozitivă

oxidază – pozitivă.

De asemenea se pot folosi chituri de identificare pentru examinarea biochimică a germenilor din genul Campylobacter, disponibile în comerț (kitul API Campy).

Fig. 2. Diagrama modului de izolare și identificare a germenilor din genul

Campylobacter din alimente

Exprimarea rezultatelor

Rezultatul se exprimă ca prezent sau absent în cantitatea de probă luată în lucru, 25 grame (25 ml), din proba de analizat.

Metoda orizontală pentru detectarea și numărarea Listeria monocytogenes (SR EN 11290/1/2/2005)

Materiale

Aparatură și sticlărie

Baloane Erlenmeyer sterile (100 cm3, 200 cm3, 1000 cm3)

Eprubete de 16/160 mm sterile;

Pipete gradate de 1 și 2 ml sterile cu scurgere totală ;

Pipetor automat ;

Omogenizator tip Stomacher ;

Agitator Vortex;

Bisturie, foarfeci,spatule, pense sterile;

Cutii Petri de 90/15 mm sterile;

Anse Drigalski de sticlă ;

Hotă cu flux laminar Biohazard;

Termostate reglabile la 37°C și 42°C;

Autoclav;

pH-metru electronic, cu precizie 0,1 unități;

Baie de apă termoreglabilă pentru menținerea mediilor solide în stare topită la temperatura de 40-45oC.

Aparat de numărarea coloniilor, cu sistem de iluminare.

Medii de cultură și reactivi:

Bulion Semi-Fraser

Bulion Fraser

Agar Oxford

Agar Palcam

Agar cu extract de drojdii, soia, triptonă (TSYEA)

Bulion cu extract de drojdii, soia, triptonă (TSYEA)

Agar cu sânge de oaie

Bulion pentru utilizarea hidraților de carbon

Agar pentru mobilitate

Soluție de peroxid de hidrogen

Soluție salină tamponată cu polifosfați

Mediu și tulpini pentru testul Camp

tulpina Staphylococcus aureus;

tulpina Rhodococcus equi;

tulpina Listeria monocytogenes.

Suplimente pentru mediile de îmbogățire și selective:

Supliment ALOA

supliment demi Fraser

supliment Fraser

supliment Palcam

supliment Oxford

Mediu selectiv de îmbogățire primară: bulion semi-Fraser

Compoziție mediu de bază:

Peptonă de carne 5,0 g

Triptonă (cazeină digerată peptic) 5,0 g

Extract de drojdie 5,0 g

Extract de carne 5,0 g

Fosfat disodic dihidrat 12,0 g

Fosfat monopotasic 1,35 g

Clorură de sodiu 20,0 g

Esculină 1,0 g

Apă 1000 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind dacă este necesar. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,2 0,2 la 25°C. Se repartizează în flacoane Erlenmayer de 300 ml, în volume corespunzătoare cantității de probă care se introduce în testare. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Soluție de clorură de litiu

Clorură de litiu 3, 0 g

Apă 10 ml

Preparare

Se adaugă clorura de litiu în apă și se sterilizează prin filtrare.

Compoziție soluția de sare de sodiu a acidului nalidixic

Sare de sodiu a acidului nalidixic 0,1 g

Hidroxid de sodiu 10 ml

Preparare

Se dizolvă sarea de sodiu a acidului nalidixic în soluția de hidroxid de sodiu și se sterilizează prin filtrare.

Soluție de acriflavină hidroclorică 0,25 g

Apă 100 ml

Preparare

Se dizolvă acriflavina hidroclorică în apă și se sterilizează prin filtrare.

Soluție de citrat de fier (III) și amoniu

Citrat de fier (III) și amoniu 5,0 g

Apă 100 ml

Preparare

Se dizolvă soluția de citrat de fier și amoniu în apă și se sterilizează prin filtrare.

Mediu complet

Mediu de bază 100,0 ml

Soluția de clorură de litiu 1,0 ml

Soluția de sarea de sodiu a acidului nalidixic 0,1 ml

Soluția de acriflavina hidroclorică 0,5 ml

Soluție de citrat de fier și amoniu 1,0 ml

Preparare

Imediat înainte de folosire se adaugă cele 4 soluții la fiecare 100 ml mediu de bază.

Mediu selectiv de îmbogățire secundară: bulion Fraser

Compoziție mediu de bază:

Peptonă de carne 5,0 g

Triptonă (cazeină digerată peptic) 5,0 g

Extract de drojdie 5,0 g

Extract de carne 5,0 g

Fosfat disodic dihidrat 12,0 g

Fosfat monopotasic 1,35 g

Clorură de sodiu 20,0 g

Esculină 1,0 g

Clorură de litiu 3,0 g

Sarea de sodiu a acidului nalidixic 0,02 g

Apă 1000 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind dacă este necesar. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,2 0,2 la 25°C. Se repartizează în flacoane Erlenmayer de 300 ml, în volume corespunzătoare cantității de probă care se introduce în testare. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Soluție de acriflavină hidroclorică

Soluție de citrat de fier (III) și amoniu

Mediu complet

Imediat înainte de folosire, la fiecare eprubetă cu 10 ml mediu de bază, se adaugă câte 0,1 ml din soluția de acriflavină hidroclorică și cea de citrat de fier (III) și amoniu. Se amestecă prin mișcări ușoare.

Mediu selectiv ALOA – agar Listeria Ottaviani & Agosti

Peptone din carne 18.00 g

Triptonă 6.00 g

Extract drojdie 10.00 g

Piruvat de sodiu 2.00 g

Glucoză 2.00 g

Glicerofosfat de magneziu 1.00 g

Sulfat de magneziu 0.50 g

Clorură de sodiu 5.0 g

Clorură de litiu 10.0 g

Fosfat anhidru disodiu de hidrogen 2.5 g

5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranosidă 0.05 g

Agar 13.5g

Supliment Selectiv ALOA (fiole pentru 500 ml de mediu)

Acid nalidixic 10 mg

Ceftazidime 10 mg

Cycloheximidă 25 mg

Polymyxină B 38350 UI

Supliment de îmbogățire ALOA (fiole pentru 500 ml de mediu)

L-α-fosphatidylinositol 1.0 g

Compoziție mediu complet Agar Listeria Ottaviani & Agosti (ALOA)

Agar ALOA 1000 ml

Supliment Selectiv ALOA 10 ml

Supliment de îmbogățire ALOA 40 ml

Preparare:

Se dizolvă 35.3g agar ALOA în 500 ml apă distilată, încălzind până la fierbere. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,2 ± 0,2 la 25°C. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. După răcire la 45-48°C se adaugă o fiolă de supliment de îmbogățire ALOA încălzită la 47°C și una de supliment selectiv ALOA, care s-a diluat în prealabil cu 5 ml amestec alcool etilic asolut/apă distilată 1:1. Se repartizează în flacoane Erlenmayer de 500 ml, în volume și una de corespunzătoare cantității de probă care se introduce în testare. Se omogenizează prin mișcări de rotație și se toarnă în plăci.

Aspect: mediul neînsămânțat este de culoare bej deschis, omogen, opalescent. Dupa 24 de ore Listeria monocytogenes formeaza colonii de culoare verde albăstrui, înconjurate de un halou opac, cu diametrul de 1,5-2mm, în timp ce alte specii de Listeria formeaza colonii de culoare verde albăstrui, fără a fi înconjurate de un halou opac.

Mediul selectiv de izolare: agar Oxford

Compoziție agar de bază

Agar Columbia1 39,0 g

Esculină 1,0 g

Citrat de fier (III) și amoniu 0,5 g

Clorură de litiu 15,0 g

Apă 1000 ml

1Protează peptonă 23,0 g

Amidon 1,0 g

Clorură de sodiu 5,0 g

Agar 9…18 g

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind dacă este necesar. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,0 0,2 la 25°C. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Compoziție supliment pentru 1000 ml mediu

Cicloheximidină 400,0 mg

Sulfat de colistină 20,0 mg

Acriflavină hidroclorică 5,0 mg

Cefotetean 2,0 mg

Fosfomicină 10,0 mg

Etanol 5,0 ml

Apă 5,0 ml

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în amestecul etanol-apă. Se sterilizează prin filtrare.

Preparare mediu complet

Se răcește mediul de bază la 47°C și se adaugă, în mod aseptic, suplimentul Oxford. Se omogenizează, apoi se repartizează în plăci Petri sterile, căte 15 ml, și se lasă să se solidifice. Mediul se păstrează ferit de lumină.

Aspect: mediul neînsămănțat are culoare gălbuie verzuie deschisă, transparent. Coloniile tipice de Listeria spp. dezvoltate dupa o incubare de 24 h sunt mici (1 mm), gri, înconjurate cu un halou negru, iar mediu devine maro. Dupa 48 h coloniile devin mai inchise la culoare, cu o posibilă tentă verzuie, cu diametrul de 2 mm, cu halou negru și centrul concav (fig. 30).

Mediul selectiv de izolare: agar Palcam

Compoziție mediu de bază:

Peptonă 23,0 g

Amidon 1,0 g

Extract de drojdie 3,0 g

D-glucoză 0,5 g

D-manitol 10,0 g

Citrat de fier (III) și amoniu 0,5 g

Clorură de sodiu 5,0 g

Esculină 0,8 g

Clorură de litiu 15,0 g

Sarea de sodiu a acidului nalidixic 0,02 g

Roșu de fenol 0,08 g

Apă 960 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind dacă este necesar. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,2 0,2 la 25°C. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Compoziție sulfat de polimixină B

Sulfat de polimixină B (100.000) 0,1 g

Apă 100 ml

Preparare

Se dizolvă soluția polimixină în apă și se sterilizează prin filtrare.

Compoziție soluție de acriflavină hidroclorică

Soluție de acriflavină hidroclorică 0,05 g

Apă 100 ml

Preparare

Se dizolvă acriflavina hidroclorică în apă și se sterilizează prin filtrare.

Compoziție soluție de ceftazidimă de sodiu pentahidrat

Ceftazidimă de sodiu pentahidrat 0,116 g

Apă 100 ml

Preparare

Se dizolvă soluția de ceftazimidă de sodiu pentahidrat în apă și se sterilizează prin filtrare.

Compoziție mediu complet

Mediu de bază 960 ml

Soluție de sulfat de polimixină 10 ml

Soluție de acriflavină hidroclorică 10 ml

Soluție de ceftazimidă de sodiu pentahidrat 20 ml

Preparere

Se răcește mediul de bază la 47°C și se adaugă, în mod aseptic solutiile menționate mai sus, agitând ușor după fiecare adăugare. Se omogenizează, apoi se repartizează în plăci Petri sterile, căte 15 ml, și se lasă să se solidifice.

Aspect: mediul neînsămânțat este roșu-bordo, translucid. Dupa 24 de ore Listeria spp. formeaza colonii de culoare verde oliv sau gri verzui, mici, cu diametrul de 1,5.. 2mm, uneori cu centrul negru, dar totdeauna cu halou negru. Dupa 48 h, coloniile de Listeria spp. cu diametrul de 1,5-2 mm sunt de culoare verzuie, concave în centru și inconjurate de un halou negru.

Mediu de cultură solid: agar cu triptonă, soia și extract de drojdii (TSYEA)

Bulion cu triptonă și soia 30,0 g

Extract de drojdii 6,0 g

Agar 9…18 g

Apă 1000 ml

Triptonă 7,0 g

Peptonă de soia 3,0 g

Clorură de sodiu 5,0 g

Fosfat dipotasic 2,5 g

Glucoză 2,5 g

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind prin fierbere. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,3 ± 0,2 la 25°C. Se repartizează în eprubete, în volume corespunzătoare. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Se lasă să se solidifice în poziție verticală. Se toarnă în plăci Petri căte 15 ml, și se lasă să se solidifice.

Mediu de cultură lichid: bulion cu triptonă, soia și extract de drojdii (TSYEB)

Bulion cu triptonă și soia1 30,0 g

Extract de drojdii 6,0 g

Apă 1000 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind prin fierbere. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,3 ± 0,2 la 25°C. Se repartizează în eprubete sau flacoane, în volume corespunzătoare. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Agar cu sânge de oaie

Compoziție mediu de bază

Peptonă de carne 15,0 g

Digerat hepatic 2,5 g

Extract de drojdie 5,0 g

Clorură de sodiu 5,0 g

Agar 9…18 g

Apă 960 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind la fierbere. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,2 ± 0,2 la 25°C. Se repartizează în flacoane, în volume corespunzătoare Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Sânge de oaie defibrinat

Compoziție mediu complet

Mediu de bază 100 ml

Sânge de oaie defibrinat 5-7 ml

Preparare:

Se adaugă sângele la mediu de bază, răcit în prealabil la 47°C. Se amestecă bine, după care se repartizează în plăci Petri sterile și se lasă să se solidifice.

Bulion pentru utilizarea hidraților de carbon

Compoziție mediu de bază

Proteazo-peptonă 10,0 g

Extract de carne 1,0 g

Clorură de sodiu 5,0 g

Purpur de bromcrezol 0,02 g

Apă 1000 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind dacă este nevoie. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 6,8 ± 0,2 la 25°C. Se repartizează în epubete, în volume corespunzătoare Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Compoziție soluții de hidrat de carbon

Hidrat de carbon (L-ramnoză sau L-xiloză) 5,0 g

Apă 100 ml

Preparare:

Se dizolvă separat fiecare hidrat de carbon în 100 ml apă. Se sterilizează prin filtrare.

Compoziție agar pentru mobilitate

Peptonă de cazeină 20,0 g

Peptonă de carne 6,1 g

Agar 9…18 g

Apă 1000 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele sau mediul complet deshidratat în apă, încălzind la fierbere. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,3 ± 0,2 la 25°C. Se repartizează căte 5 ml în eprubete. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Mediu și tulpini pentru testul Camp-Christie, Atkins, Munch-Petersen

Pentru acest test se pot folosi Plăcile cu agar cu sânge de oaie defibrinat, dar este preferabil să se folosească plăci cu agar în două straturi, cu un strat foarte subțire de agar cu sânge.

Compoziție

Mediu de bază agar cu sânge de oaie

Mediu cu sânge de oaie

Preparare

Se separtizează câte 10 ml mediu de bază în plăci Petri sterile și se lasă pentru solidificare. Se toarnă după aceea un strat subțire de mediu cu sânge de oaie, folosind cantități de cel mult 3 ml per placă. Dacă mediul cu sânge se adaugă în plăci care conțin mediu de bază preparat anterior, poate fi necesară încălzirea plăcilor, timp de 20 minute în termostat, la 37°C.

Tulpini pentru testul CAMP

Se utilizează o tulpină de Staphylococcus aureus β-hemolitică (NCTC 1803 sau ATCC 25923) și o tulpină de Rhodococcus equi (NCTC 1621 sau ATCC 6939). Nu toate tulpinile de Staphylococcus aureus sunt adecvate pentru testul CAMP.

Culturile de Staphylococcus aureus, Rhodococcus equi, Listeria monocytogenes, Listeria innocua și Listeria ivanovii se mențin prin însămânțarea lor pe agarul TSYEA, înclinat, apoi incubare la 35°-37°C, timp de 24-48 ore, apoi se mențin la frigider, la 3°-5°C. Se pasează cel puțin o dată pe lună.

Compoziție soluție salină tamponată de polifosfați (PBS)

Fosfat disodic dihidrat 8,98 g

Fosfat monosodic 2,71 g

Clorură de sodiu 8,5 g

Apă 1000 ml

Preparare:

Se dizolvă componentele în apă. Se ajustează pH-ul, cu o soluție de NaOH 0,1 N astfel încât, după sterilizare să fie de 7,2 0,2 la 25°C. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.

Metoda de detecție

Detectarea Listeriei monocytogenes necesită patru faze succesive de lucru, așa după cum se poate observa în diagrama din fig. 3.

Eșantionare și obținerea suspensiei inițiale

Eșantionul de analiză se pregătește conform standardului internațional specific care privește produsul respectiv. Se cântăresc 25 grame din proba recoltată, peste care se adaugă un volum de 9 ori mai mare lichid de diluție, respectiv 225 ml bulion semi-Fraser.

Îmbogățirea primară

Suspensia inițială se incubează la 30°C, timp de 24±2 h.

Îmbogățirea secundară

Din suspensia inițială, după incubare la 37°C timp de 24 h ±2 h, se transferă 0,1 ml într–o eprubetă cu 10 ml mediu de îmbogățire secundară: bulion Fraser, care se incubează la 35° sau 37°C, timp de 48 h.

Striere și identificare

Din cultura obținută prin îmbogățire primară și incubată timp de 24 h 2 h la 30C , se ia cultură cu o ansă bacteriologică sau cu o baghetă de sticlă și se însămânțează prin striere suprafața primului mediu selectiv de izolare (Agar Listeria în acord cu Ottaviani și Agosti(ALOA) în așa fel încât să se obțină colonii izolate. Se procedează la fel cu al doilea mediu selectiv de izolare (agar Palcam sau Oxford). Din mediu de îmbogățire secundară incubat 48 h la  2h la 35 C sau la 37 C se repetă procedeul descris mai sus cu cele două medii selective de izolare. Cutiile Petri cu mediile solide însămânțate se întorc cu capacul în jos și se introduc în termostat la 37 C (plăcile cu agar ALOA) și la 35 C sau la 37 C. (plăcile cu agar Oxford și Palcam). După incubare, se examinează coloniile dezvoltate la suprafața celor două medii de cultură.

Confirmarea pentru genul Listeria

Din fiecare placă cu mediu selectiv se aleg câte 5 colonii presupuse a fi Listeria spp. care vor fi supuse testelor de confirmare. Dacă nu există 5 colonii specifice, se iau toate coloniile dezvoltate. Cu ansa de inoculare se striază din fiecare colonie reținută prin striere pe suprafața cu extract de drojdie, soia și triptonă – TSYEA și apoi se incubează la etuvă la 35°-37°C, timp de 18–24 h.

Fig. 3. Diagrama modului de lucru de identificare a Lsteria monocytogenes

Coloniile tipice au diametrul de 1-2mm, sunt convexe, incolore și opace, cu marginile regulate. Dacă nu există colonii izolate, se ia o colonie tipică pentru Listeria spp. și se trece pe o altă placă TSYEAColoniile dezvoltate pe pediul TSYEA vor fi supuse următoarelor teste de confirmare:

Cutiile cu agar ALOA se incubează la 37°C, 24-48 ore

Cutiile cu agar Oxford și Palcam se incubează la 35° sau 37°C, 24-48 ore

Testul mobilității

Se insămânțează o cantitate mică dintr-o colonie izolată de pe mediul TSYEA, într-o eprubetă cu bulion cu extract de drojdie, soia și triptonă – TSYEB. Se incubează la termostat la 25°C, timp de 8-24 h, pănă când mediul devine ușor tulbure. Se ia o picătură din cultura obținută și se pune pe o lamă microscopică, aopi se acoperă picătura cu o lamelă și se exameniază la microscopul cu contrast de fază, cu obiectivul 40x. Listeria spp. prezintă mișcări de rostogolire caracteristice. Culturile dezvoltate la temperaturi mai mari de 25°C, pot fi lipsite de mobilitate. Totdeauna acestea se compară cu o cultură de referință. Ca un test alternativ pentru mobilitate, se poate însămânța cu un ac de însămânțare, prin înțepare, o cultură dintr-o colonie izolată de pe mediul TSYEA, coloana dreapta a unui agar semi-solid. Se incubează la 25°C, timp de 48 h, după care se examinează coloana, pentru a constata dezvolatrea Listeriei spp. în jurul înțepăturii. Speciile de Listeria spp. sunt mobile, dezvoltându-se sub forma unei umbrele tipice. Dacă nu s-a constatat dezvoltarea, incubarea se poate prelungi până la 5 zile.

Confirmarea Listeria monocytogenes

Testul hemolizei

Se suspendă coloniile caracteristice în 150 µl TSYEB, se incubează la 37°C timp de 2h. Se adaugă 150 µl suspensie de globule roșii de oaie. Se incubează la 37°C timp de 15 până la 60 minute, apoi se răcește la 3°C ± 2°C timp de 2h. Se examinează pentru prezența sau absența hemolizei. Dacă reacția nu a apărut se mai menține încă 24±3 h la 3°C ± 2°C.

În același timp se însămânțează și o cultură martor pozitiv (Listeria monocytogenes) și una martor negativ (Listeria innocua). După incubare la 35° -37°C, timp de 24 h, se examinează culturile de testat și culturile martor. Listeria monocytogenes prezintă zone clare, înguste de β-hemoliză, Listeria ivanovii prezintă zone delimitate clar, mari de β-hemoliză. Plăcile se examinează la o lumină puternică, pentru a putea compara culturile de testat cu cele martor.

Utilizarea hidraților de carbon

Se însămânțează, cu ansa de inoculare, fiecare din bulioanele cu substantele hidrocarbonate, cu o cultură din bulionul TSYEB, apoi se incubează la 35°-37°C, până la 5 zile. Apariția culorii galbene (formare de acid), denotă o reacție pozitivă (de regulă la 24-48 h).

Testul Camp

Se striază fiecare din culturile de Staphylococcus aureus și Rhodococcus equi pe suprafața agarului cu sânge de oaie, în câte o linie față în față, astfel încât cele două culturi să fie paralele și diametral opuse (se recomandă ca între cele două linii să fie o distanță de 3 –4 cm), după cum se poate observa în figura 4. Este necesar un inocul subțire, uniform. În mod asemănător, se striază în unghi drept, pe aceste culturi, tulpina de testat, astfel încât cultura de testat să nu se atingă de culturile de Staphylococcus aureus și Rhodococcus equi, la o distanță de 1-2 mm de acestea. Pe aceeași cutie pot fi striate mai multe tulpini de testat.

Fig. 4. Însămânțarea și interpretarea plăcilor în testul CAMP

* Aria delimitată de linia punctată arată influența culturii de Staphylococcus aureus.

Simultan, se testează culturile martor de Listeria monocytogenes, L. innocua și Listeria ivanovii. Dacă se folosește agarul cu sânge, plăcile se incubează la 35° -37°C, timp de 18-24 h, iar dacă se folosesc plăcile cu strat dublu de agar, se incubează la 35 -37°C , timp de 12-18 h. O zonă intensă de β-hemoliză, la intersecția tulpinii de testat cu fiecare din culturile de Staphylococcus aureus și Rhodococcus equi, este considerată ca o reacție pozitivă.

Reacția pozitivă cu Rhodococcus equi apare ca un „cap de săgeată” lat de 5-10 mm, de hemoliză. Reacția este considerată negativă, dacă o zonă mică de hemoliză slabă, se extinde numai cu aproximativ 1 mm la intersecția tulpinii de testat cu zona difuză a culturii de Rhodococcus equi

O reacția pozitivă cu Staphylococcus aureus apare ca o zonă mică de hemoliză intensă, care se extinde numai cu aproximativ 2 mm de la tulpina de testat și în interiorul zonei de hemoliză slabă dată de cultura de Staphylococcus aureus. Nu se produc zone largi de hemoliză în aria de Staphylococcus aureus și Listeria monocytogenes.

Interpretarea proprietățior morfologice, fiziologice și biochimice a germenilor din genul Listeria

Toate speciile de Listeria au forma de bastonașe subțiri și scurte, Gram pozitive, sunt mobile și catalazo-pozitive. Listeria monocytogenes se deosebește de celelalte specii ale genului prin următoarele caracteristice (tab. 23).

Tabel 23

Caractere biochimice ale genului Listeria

V: reacție variabilă

(+): reacție pozitivă slabă

– : nici o reacție

+ : peste 90% cu reatii pozitive

Confirmarea definitivă

Tulpinile considerate pozitive pentru Listeria monocytogenes pot fi trimise la un laborator de referință pentru Listeria, pentru tipizare serologică sau, dacă este posibil, și lisogenică.

Culturi martor

În scopul verificării capacității mediilor de îmbogățire, izolare și identificare de a asigura dezvoltarea selectivă a Listeria monocytogenes, o diluție de cultură de referință dintr-o tulpină recent izolată de Listeria monocytogenes și o tulpină dintr-o specie bacteriană martor negativ (ex: bacilii, Streptococcus) se introduc introduc într-un recipient cu mediu de îmbogățire primară selectiv. Martorii se lucrează la fel ca probele de testat pentru a se demonstra că procedeul de lucru este capabil să detecteze martorul pozitiv.

Metoda de numărare

Eșantionare și obținerea suspensiei inițiale

Eșantionul de analiză se pregătește conform standardului internațional specific care privește produsul respectiv. Se cântăresc 25 grame din proba recoltată, peste care se adaugă un volum de 9 ori mai mare lichid de diluție, respectiv 225 ml bulion semi-Fraser.

Resuscitare

Se resuscitează suspensia inițială se incubează la 20°C, timp de 1 h.

Inoculare pe suprafața agarului ALOA

Din cultura obținută prin resuscitare timp de 1 h la 20°C, se ia cultură cu o ansă bacteriologică sau cu o baghetă de sticlă și se însămânțează prin striere suprafața mediului selectiv de izolare ALOA în așa fel încât să se obțină colonii izolate. Cutiile Petri cu mediul solid însămânțat se întorc cu capacul în jos și se introduc în termostat la 37° C timp de 24-48 h.

După incubare timp de 24-48 h, se examinează cutiile Petri însămânțate pentru prezența coloniilor presupuse a fi Listeria spp. Pe agar ALOA coloniile tipice de Listeria spp. dezvoltate sunt de culoare albastru-verzui

Confirmarea pentru genul Listeria, respectiv Listeria monocytogenes

Se realizează ca și în cazul metodei de detecție.

Exprimarea rezultatelor

Conform interpretării rezultatelor, se raportează prezența sau absența Listeria monocytogenes, în proba testată, specificând masa, în grame sau mililitri, al probei testate.

Încărcătura și configurația microflorei psihrotrofe la nivelul carcaselor de bovine

Carcasele de bovine pot fi contaminate în timpul procesului tehnologic cu o largă varietate de microorganisme de alterare sau condiționat patogene, care pot proveni din diferite surse (sol, apă, utilaje, cuțite, materii fecale, operatori), însă numai câteva dintre acestea vor fi capabile să se dezvolte în noile condiții de ecosistem, și din aceștia doar o mică parte vor putea, eventual, să declanșeze procesele de alterare (Gill și Bryant, 1997; Gill et al., 1998). Bacteriile Gram negative au cea mai mare capacitate de alterare a cărnii și preparatelor din carne. În cazul în care acestea sunt păstrate în condiți aerobe, membrii genurilor Pseudomonas, Acinetobater, Psychrobacter și Moraxella, datorită ratei de creștere ridicate, vor alcătui microflora dominantă (Molin și Ternstrom, 1982, 1986; Shaw și Latty, 1982, 1984, 1988; Prieto et al., 1992 a, 1992 b; Drosinos și Board, 1995 a; Davis, 1998).

Încărcătura și configurația microbiologică la

suprafața carcaselor de bovine obținute imediat după sacrificare (carne caldă)

Din prelucrarea statistică a datelor înregistrate s-a constatat că la unitatea A, media trimestrială a încărcăturii microbiene de la suprafața carcaselor calde a prezentat valori diferite, fiind cuprinsă între 3.80±0.60 log ufc/cm2 în trim. I și 5.01±0.30 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 2.63±0.44 log ufc/cm2 în luna ianuarie, și maximă de 5.22±0.26 log ufc/cm2 în luna septembrie. De asemenea, am constatat că în cazul tuturor probelor recoltate, nu s-au constatat depășiri ale limitei maxim recomandate, de 6.0 log ufc/cm2 (Sutherland et al., 1975; Hanna et al.,1977; Ayres et al., 1980; Cousin, 2000). Media trimestrială a încărcăturii totale de germeni psihrotrofi obținute în cadrul unității B, s-a încadrat între 4.63± 0.47 log ufc/cm2 în trim. I și 5.77±0.20 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 4.24±0.46 log ufc/cm2 aferentă lunii februarie și maximă de 6.06±0.22 log ufc/cm2 în luna iulie, constatându-se depășirea limitei maxim recomandate (6.0 log ufc/cm2) doar în cazul a trei probe, recoltate în lunile iulie și august, respectiv 8.33%.

Comparând valorile obținute pe intreaga perioadă a studiului, în unitatea B putem constata o creștere a mediei valorilor încărcăturii totale de germeni psihrotrofi în trim. II și III, comparativ cu trim. I și IV, probabil corelate și cu temperaturile mai crescute din perioada mai caldă a anului. În urma prelucrării statistice a rezultatelor încărcăturii microbiene medii psihrotrofe la suprafața carcaselor calde de bovine prin testul ANOVA, din cele două unități luate în studiu, putem aprecia că s-au obținut diferențe distict semnificative statistic (p≤ 0.01), nivelul contaminării fiind mai crescut în unitatea B.

Prin însămânțare pe mediul selectiv GSP agar (Merck), incubat la temperatura de 20ºC timp de 24–48 ore, s-a observat dezvoltarea unor colonii de culoare roz-violet, bombate cu margini regulate, opace, lucioase, de aproximativ 1–3 mm diametru, pentru toate probele luate în lucru. La nouă dintre probe s-a observat și apariția unor colonii de culoare galbenă, bombate, opace, lucioase, cu margini regulate, netede, de aproximativ 1–2 mm diametru, considerate specifice pentru Aeromonas spp.

Încărcătura microbienă a germenilor din genul Pseudomonas în unitatea A a fost cuprinsă între 2.58±0.48 log ufc/cm2 în trim. II și 3.46±0.73 log ufc/cm2 în trim. I, cu un minim de 2.23±0.15 log ufc/cm2 și un maxim de 4.76±0.66 log ufc/cm2, ambele valori fiind înregistrate în luna ianuarie. De asemenea s-a constatat că aceste microorganisme au fost identificate la toate probele (100%). Și în cazul unității B germenii din genul Pseudomonas au fost identificați în toate cele 36 probe prelucrate, constatându-se o încărcătură microbiană medie cuprinsă între 3.16±0.19 log ufc/cm2 în trim. I și 4.15±0.53 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 2.96±0.50 log ufc/cm2 în luna ianuarie și maximă de 5,06±0.30 log ufc/cm2 în luna septembrie.

Ca și în cazul încărcăturii totale de germeni, nivelul de contaminare cu pseudomonade a fost mai crescut în unitatea B. Germenii din genul Aeromonas au fost identificați doar în 9 probe în cazul unității A (25%), încărcătura microbiană medie fiind cuprinsă între 2.66±0.37 log ufc/cm2 în trim. III și 4.0±0.47 log ufc/cm2 în trim. I, cu o valoare minimă de 2.4 log ufc/cm2 în luna august și una maximă de 4.7 log ufc/cm2 în luna martie (fig. 6). La nici una din probele examinate nu s-au constatat depășiri ale valorilor considerate corespunzătoare de literatura de specialitate (6.0 log ufc/cm2) (Sutherland et al., 1975; Hanna et al., 1977; J.C. Ayres et al., 1980; Cousin, 2000).

Din totalul probelor examinate din unitatea B, germenii genului Aeromonas au fost identificați din 18 probe, respectiv 50%, încărcătura medie microbiană fiind cuprinsă între 2.46±0.30 log ufc/cm2 în trim. IV și 3.73±0.63 log ufc/cm2 în trim. II, cu un minim de 2.2 log ufc/cm2 în luna decembrie și maxim de 4.33±0.41 log ufc/cm2 în luna mai. Deși media încărcăturii cu germeni din genul Aeromonas este mai crescută în unitatea B, prin efectuarea testului ANOVA, nu s-au obținut diferențe semnnificative în ceea ce privește nivelul contaminării în cele două unități.

Pentru izolarea și identificarea germenilor din genul Yersinia s-au făcut însămânțări pe mediul selectiv pentru Yersinia (CIN-Merck), observându-se, după 24 ore de incubare la temperatura de 20ºC, doar în cazul a șase probe (16.66%) prelevate din unitatea A apariția unor colonii circulare, cu centrul violet și inel de culoare cenușiu-albicios, bombate, lucioase de 2–3 mm diametru. Încărcătura microbiană medie a germenilor din genul Yersinia în cazul probelor recoltate de la suprafața carcaselor din unitatea A a prezentat valori relativ scăzute, fiind cuprinsă între 2.80±0.23 log ufc/cm2 în trim. I și 3.47±0.3 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 2.5 log ufc/cm2 corespunzătoare lunii iulie, și maximă de 3.7 log ufc/cm2 în luna februarie.

În ceea ce privește unitatea B, germenii din genul Yersinia au fost identificați în 9 probe (25%), încărcătura microbiană medie cu germeni fiind cuprinsă între 2.83±0.30 log ufc/cm2 în trim. II și 3.96±.077 log ufc/cm2 în trim. III, înregistrându-se o valoare minimă de 2.5 log ufc/cm2 în luna aprilie și maximă de 4.6 log ufc/cm2 în luna iulie (fig. 8). În urma prelucrării statistice a rezultatelor încărcăturii cu germeni din genul Yersinia de la suprafața carcaselor calde de bovine, în cele două unități luate în studiu nu s-au obținut diferențe semnificative (p≥0.05), deși în unitatea B, nivelul de contaminare este mai crescut.

Grupa bacteriilor acido-lactice a fost pusă în evidență prin însămânțare pe mediul selectiv MRS (Merck), în condiții de microaerofilie, observându-se dezvoltarea coloniilor caracteristice de culoare alb-gălbuie, opace, lucioase, bombate, cu margini regulate de 1–2 mm diametru, doar în cazul a trei probe prelevate din unitatea B în cursul trim. II (8.33%), media încărcăturii de bacterii acido-lactice fiind de 2.21±0.25 log ufc/cm2.

Încărcătura microbiană a germenilor din familia Enterobacteriacee a fost stabilită prin utilizarea mediului selectiv VRBD agar (Merck). După incubarea plăcilor la 30ºC, 24 ore, s-a stabilit că media încărcăturii de Enterobacteriaceae a fost cuprinsă în cazul probelor prelevate din unitatea A între 1.97±0.06 log ufc/cm2 în trim. I și 3.48±0.25 log ufc/cm2 în trim. III, cu un minim de 1.63±0.15 log ufc/cm2 în luna mai și maxim de 3.73±0.50 log ufc/cm2 în luna august. S-a constatat că limita maxim admisă de legislația în vigoare, de 2.5 log ufc/cm2, a fost depășită în cazul a 11 probe prelevate în cursul trim. II și III, respectiv la 30.55% din totalul probelor. În cazul probelor prelevate din unitatea B, media încărcăturii de germeni din familia Enterobacteriacee a fost mai crescută comparativ cu cea stabilită în unitatea A, iar prin efectuarea testului ANOVA s-a stabilit că între cele două unități există diferențe semnificative statistic (p≤0.05).

Nivelul mediu al încărcăturii cu Enterobacteriaceae s-a situat între 2.21±0.21 log ufc/cm2 în trim. II și 3.82±0.48 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 1.96±0.15 log ufc/cm2, aferentă lunii aprilie și maximă de 4.30±0.26 log ufc/cm2 în luna august. În cazul probelor recoltate din unitatea B depășirea limitei maxim admise s-a constat în cazul a 69.44% din totalul probelor.

Aceste valori crescute ale enterobacteriilor denotă nerespectarea normelor în ceea ce privește codul de bune practici de lucru (GMP), precum și a normelor de bune practici de igienă (GHP), în ambele unităti luate în studiu. Menționăm că în momentul efectuării acestor examene bacteriologice în ambele unități nu era implementat sistemul de asigurare a calității din industria alimentară, respectiv programul HACCP.

Din analiza rezultatelor prezentate mai sus, se poate afirma că în cazul în care prelucrarea carcaselor a fost efectuată cu respectarea strictă a normele de igienă de-a lungul întregului flux tehnologic, încărcătura microbiană inițială la suprafața carcaselor a prezentat valori relativ scăzute, comparabile cu cele prezente în literatura de specialitate (Sutherland et al., 1975; Hanna et al., 1977; J.C. Ayres et al., 1980; Cousin, 2000).

Confirmare biochimică

Configurația microflorei bacteriene a fost determinată prin efectarea testelor de confirmare biochimică a coloniilor izolate pe mediul PCA și a mediilor selective GSP, CIN, MRS. Pentru acest scop s-au utilizat kiturile comerciale API 20 E, respectiv 20 NE, pe baza cărora se pot identifica microorganismele Gram negative (Biomerieux) (fig. 4).

După incubarea galeriilor API la termostat, diferențiat în funcție de tipul de test utilizat, rezultatele au fost interpretate cu ajutorului softului de identificare API LABPLUS. Au fost luate în considerare doar acele rezultate, la care identificarea speciilor bacteriene a fost mai mare de 85% probabilitate. Pentru restul rezultatelor s-au efectuat teste suplimentare, diferite în funcție rezultatul furnizat de programul de calculator. Când nici cu ajutorul testelor respective nu am putut identifica microorganismele, rezultatul a fost încadrat la categoria specii bacteriene neidentificate.

Fig. 4 Kituri biochimice Api 20NE, utilizate pentru identificarea speciilor bacteriene

Din analiza rezultatelor am constatat că microflora inițială de la suprafața carcaselor de bovine din unitățile A și B luate în studiu a fost reprezentată de germeni din genurile Staphylococcus, Micrococcus, Lactobacillus, Neisseria, Aeromonas, Acinetobacter, Moraxella, Pseudomonas, Yersinia, Serratia, Hafnia, Proteus și Escherichia, incidența speciilor bacteriene fiind redată în graficele din fig. 4 și 5.

Din analiza graficului din fig. 4 se poata constata că microflora inițială de la suprafața carcaselor de bovine din unitatea A este dominată de germenii Gram pozitivi (56.51%). Diferențierea între germenii Gram pozitivi de formă cocoidă s-a efectuat pe baza examenului bacterioscopic și a testelor catalază, oxidază și KOH 3% (pentru bacteriile Gram labile).

Dintre bacteriile Gram negative non-enterobacteriaceae, s-a constatat că predomină bacteriile psihrotrofe, din care: genul Pseudomonas (17.38%), genul Aeromonas (4.34%), cu specia Aeromonas hydrophila și genul Acinetobacter (4.34%). Prezența A. hydrophila, specie cunoscută ca agent etiologic implicat în declanșarea unor episoade de toxiinfecții alimentare la consumator, pe suprafața carcaselor de bovine ridică problema dacă cei care au consumat din carnea respectivă au prezentat astfel de manifestări. Datorită faptului că legislația sanitar veterinară din țara noastră nu prevede obligativitatea identificării acestui germen, poate apărea posibilă situația ca unii consumatori să fi prezentat semne clinice specifice acestei toxiinfecții alimentare. Una din cauzele care pot determina apariția unor astfel de manifestări clinice este reprezentată de faptul că, chiar în situația în care examenul bacteriologic s-ar fi efectuat, rezultatele sunt furnizate unității de sacrificare după câteva zile, timp în care, de multe ori, carnea nu se mai găsește în magazinele de prezentare spre vânzare.

Dintre reprezentanții familiei Enterobacteriaceae, au fost identificați, pe baza testelor API 20E, următoarele specii: E. coli (1.44%), Proteus vulgaris (2.89%), Hafnia alvei (4.83%), Serratia lignefaciens (3.84%), Yersinia frederikseni (2.89%). Dintre acestea, ultimele trei specii fac parte din categoria germenilor psihrotrofi ai familiei Enterobacteriaceae, implicați frecvent în declanșarea proceselor alterative a cărnii, la încărcături cuprinse între 106–107 ufc/cm2 (Gram et al., 1999). Dintre aceste microorganisme, probleme de sănătate pot fi determinate de către E. coli, care au tulpini patogene pentru om. În ceea ce privește germenii din genul Yersinia, din rezultatele obținute, nu s-au identificat germeni patogeni ci doar specii nepatogene pentru om, implicate însă în declanșarea proceselor alterative ale cărnii, cum sunt Y. frederikseni, respectiv Y. kristersenii (Feng, 1994; Nesbakken, 2000).

În ceea ce privește configurația microbiană la suprafața carcaselor calde din unitatea B, s-a constatat că microflora Gram pozitivă reprezintă 56.15%, fiind alcătuită din stafilococi, micrococi, lactobacili și bacterii neidentificate de formă bacilară. Și în această unitate s-a constatat că dintre bacteriile Gram negative predomină cele psihrotrofe (41.22%), configurația și incidența microbiană fiind prezentată în graficul din fig. 5.

În privința încărcăturii microbiene din profunzimea carcaselor, din cele 36 probe analizate din unitatea A, la 12 probe nu s-au pus în evidență germeni psihrotrofi, iar pentru restul probelor, media încărcăturii microbiene a prezentat valori cuprinse între 1.92±0.22 log ufc/g în trim. II și 2.71±0.49 log ufc/g în trim. IV, cu valori minime de 1.66±0.41 log ufc/g în luna aprilie și 3.06±0.05 log ufc/g în luna noiembrie. Limita admisă în ceea ce privește încărcătura microbiană totală din profunzimea carcaselor, de 2.20 log ufc/g, a fost depășită în cazul a 11 probe, respectiv 30.55% (fig. 10). Media încărcăturii microbiene totale din unitatea B a fost cuprinsă între 2.26±0.23 log ufc/g în cursul trim. I și 2.82±0.72 log ufc/g în trim. III, cu o valoare minimă de 2.0 log ufc/g în luna ianuarie și maximă 3.6±0.20 log ufc/g în luna sepembrie. Analizând rezultatele obținute în unitatea B s-a constatat că din totalul probelor examinate, 15 au fost negative, iar pentru 14 s-au întâlnit depășiri ale valorilor maxime admise (38.88%). Comparând media valorilor încărcăturii cu germeni psihrotrofi de la suprafața carcaselor de bovine calde cu cea obținută din profunzime, s-a constatat că cele mai ridicate valori s-au obținut în trimestrele II și III, atât pentru unitatea A cât și pentru unitatea B, între cele două unități neexistând diferențe semnificative statistic (p≥0.05).

Germenii din genul Pseudomonas au fost identificați doar în 8 probe prelevate din profunzimea carcaselor, în cazul unității A, respectiv 22.22%, cu media valorilor fiind cuprinse între 1.4±0.32 log ufc/g în trim. II și 2.0±0.43 log ufc/g în trim. IV, nefiind constatate depășiri ale valorii maxim recomandate (2.2 log ufc/g). Media încărcăturii cu pseudomonade pentru probele prelevate din unitatea B a fost cuprinsă între 1.8±0.23 log ufc/g în trim. I și 2.2±0.56 log ufc/g în cursul trim. III, nivelul maxim al încărcăturii fiind depășit doar în cazul a 2 probe (5.55%). Germenii din genul Aeromonas, Yersinia, grupul bacteriilor acido-lactice si reprezentanții familiei Enterobacteriaceae nu au fost identificați, atât din probele recoltate din unitatea A, cât și din unitatea B.

Aprecierea încărcăturii microbiene și configurația microbiologică

la suprafața carcaselor de bovine refrigerate

După cum s-a precizat anterior, în intervalul luat în studiu, au fost examinate un număr de 72 de probe carne de bovine, câte 36 atât de la suprafața cât și din profunzimea carcaselor refrigerate (48 ore), din spațiile de refrigerare ale abatorului.

În urma prelucrării datelor, s-a constatat că media încărcăturii psihrotrofe de la suprafața carcaselor refrigerate din unitatea A a prezentat valori diferite, cuprinse între 3.70±0.20 log ufc/cm2 în trim. I și 6.90±0.43 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 3.2±0.1 log ufc/cm2 în luna ianuarie și maximă de 7.33±0.20 log ufc/cm2 în luna septembrie (fig. 23). Cele mai ridicate valori ale încărcăturii microbiene s-au constatat în cursul trimestrelor II și III, când s-a observat depășirea limitei maxime recomandate (6.0 log ufc/cm2) în cazul a 13 probe (36.11%) (Sutherland et al., 1975; Hanna et al., 1977; Ayres et al., 1980; Cousin, 2000).

Media încărcăturii de germeni psihrotrofi în cazul probelor recoltate din unitatea B, a fost cuprinsă între 5.46±0.14 log ufc/cm2 în trim. I și 6.04±0.51 log ufc/cm2 în trim. III, cu valori minime de 5.30±0.20 log ufc/cm2 în luna ianuarie și maximă de 7.16±0.05 log ufc/cm2, aferentă lunii mai, constatându-se depășirea limitei maxim recomandate în cazul a 17 probe, respectiv 47.22%, din totalul probelor. De asemenea, am constatat că valori mai crescute ale încărcăturii microbiene au fost obținute în cazul probelor recoltate în perioada în care temperatura mediului ambiant a fost mai crescută (trimestrele II și III). Ca urmare a acestui fapt, temperatura din spațiile de refrigerare ale unității de sacrificare nu s-au încadrat la valori de 4-6ºC, deoarece instalația de refrigerare nu funcționa în condiții optime. Analiza statistică prin testul ANOVA nu a relevat diferențe semnificativ statistic între cele două unități luate în studiu în cazul încărcăturii de germeni psihrotrofi de la suprafața carcaselor refrigerate de bovine (p≥0.05).

Studii efectuate de alți cercetători au pus în evidență nivele ale încărcăturii cu germeni psihrotrofi relativ diferite, datorită diferențelor existente între unitățile de sacrificare, specificul acestora, gradul de tehnologizare, instruirea și calificarea operatorilor, etc. Rezultatele obținute de Brown (2000), au pus în evidență pentru carnea de bovine refrigerată valori ale încărcăturii bacteriene cuprinse între 5.54 log ufc/cm2 și 8.0 log ufc/cm2. La aceste valori crescute ale încărcăturii microbiene pot apare îmbolnăviri la consumatori. Roberts (1980, 1997), Moreno et al. (2004), în studii cu privire la încărcătura cu bacterii psihrotrofe la suprafața carcaselor de bovine refrigerate a evidențiat valori cuprinse între 4.50 log ufc/cm2 și 7.0 log ufc/cm2, rezultate asemănătoare cu cele obținute de către noi în studiul nostru.

Pe mediul selectiv GSP agar (Pseudomonas-Aeromonas), în urma însămânțării și incubării la temperatura de 20ºC, timp 48 ore, s-a observat dezvoltarea unor colonii caracteristice germenilor din genul Pseudomonas, pentru toate probele analizate. S-a constatat că media încărcăturii cu pseudomonade în unitatea A a fost cuprinsă între 4.98±0.45 log ufc/cm2 în trim. III și 6.07±0.33 log ufc/cm2 în trim. II, cu o valoare minimă de 4.53±.040 log ufc/cm2 în luna august și maximă de 6.4±0.26 log ufc/cm2 în luna mai. Din cele 36 probe examinate, 10 au depăsit limita maximă recomandată (6.0 log ufc/cm2), respectiv 27.77%. În privința unității B, rezultatele obținute relevă o medie a încărcăturii cu germeni din acest gen mai crescută, cuprinsă între 4.62±0.34 log ufc/cm2 în trim. I și 6.27±0.18 log ufc/cm2 în trim. III, cu un minim de 4.33±0.41 log ufc/cm2 în luna februarie și maxim de 7.13±0.15 log ufc/cm2 în luna august, constatându-se depășiri ale limitei maxime în cazul a 20 probe, respectiv 55.55%. În ceea ce privește media încărcăturii cu germeni din genul Pseudomonas, s-a constatat că nivelul de contaminare este variabil, fiind mai crescut în cursul trimestrelor II și III, dependent de condițiile de microclimat din abator, precum și de respectarea normelor de igienă.

Media încărcăturii cu germeni din genul Aeromonas în unitatea A a fost cuprinsă între 4.41±0.57 log ufc/cm2 în trim. III și 5.81±0.39 log ufc/cm2 în trim. IV, cu o valoare minimă de 3.8±0.2 log ufc/cm2 în luna august și maximă de 6.27±0.11 log ufc/cm2 în luna decembrie. Din totalul probelor examinate, 15 au fost negative (41.66%), iar 3 au depășit limita maximă (8.33%). Comparativ, în unitatea B, nivelul mediu al încărcăturii cu aeromonade a fost mai crescut, fiind cuprins între 4.23±0.33 log ufc/cm2 în trim. I și 5.74 ±0.47 log ufc/cm2 în trim. III, înregistrându-se rezultate negative în cazul a 3 probe (8.33%).

Din prelucrarea statistică a rezultatelor, s-a constat că în cazul probelor prelevate din unitatea A, media încărcăturii cu germeni din genul Yersinia a fost cuprinsă între 4.20±0.26 log ufc/cm2, în trim. I și 5.78±0.44 log ufc/cm2 în trim. III. Din totalul probelor prelucrate, 18 au fost negative și în cazul a două dintre ele s-a constatat depășirea limitei maxim recomandate (5.55%). În cazul probelor prelevate din unitatea B, încărcătura medie cu yersinii a fost cuprinsă în intervalul 4.5±0.4 log ufc/cm2 în trim. IV și 6.13±0.63 în trim. III, cu o minimă a valorii de 4.066±0.30 log ufc/cm2 în luna mai și maximă de 6.8±0.30 log ufc/cm2 în cursul lunii septembrie. În acest caz, depășirea limitei maxime s-a constatat la 11.11% din totalul probelor examinate.

Grupa bacteriilor acido-lactice s-a evidențiat prin însămânțare pe mediul selectiv (MRS), observându-se dezvoltarea coloniilor caracteristice doar în cazul a 4 probe în cazul unității A (11.11%) și 6 probe pentru unitatea B (16.66%), în cursul trimestrelor II și III. Media încărcăturii de bacterii acido-lactice a fost cuprinsă între 1.6±0.26 log ufc/cm2 și 4,1 log ufc/cm2.

Germenii din familia Enterobacteriaceae au fost identificați prin însămânțarea pe mediul selectiv VRBD agar. După incubare timp de 24 ore, s-au identificat colonile caracteristice, la toate probele prelevate din unitatea B și în 33 recoltate din unitatea A (91.66%), observându-se că media încărcăturii cu germeni din familia Enterobacteriaceae din unitatea A este cuprinsă între 2.0±0.03 log ufc/cm2 în trim. IV și 5.65±0.21 log ufc/cm2 în trim. IV, cu o valoare minimă in luna ianuarie de 1.96±0.40 log ufc/cm2 și maximă de 5.86±0.11 log ufc/cm2 în luna august. Din prelucrarea rezultatelor s-a constatat că din totalul probelor examinate, 25 au depăsit limita maxim admisă de 2.5 log ufc/cm2 (69.44%), cele mai scăzute valori fiind înregistrate în trim. IV. În privința rezultatelor obținute din prelucrarea probelor din unitatea B, se poate constata că nivelul mediu al numărului de Enterobacteriaceae a fost mai mare decât cel din unitatea A, fiind cuprins între 3.77±0.17 log ufc/cm2 în trim. IV și 6.07±0.24 log ufc/cm2 în trim. III, la toate probele depășindu-se limita maxim admisă.

Aceste valori crescute ale încărcăturii cu Enterobacteriaceae denotă condiții precare de prelucrare a carcaselor pe întreg fluxul tehnologic și nerespectarea bunelor practici de lucru (GMP), respectiv a bunelor practici de igienă (GHP) cu precădere la eviscerarea organelor din cavitatea abdominală și pelvină. Astfel, pe baza observațiilor efectuate în unitățile luate în studiu s-a constatat că în ambele unități de sacrificare nu s-au efectuat ligaturi duble la nivelul esofagului, pilorului și nu s-au aplicat pungi de polietilenă la nivelul anusului, urmat de legarea acesteia, în vederea prevenirii contaminării cu germeni a carcaselor de la nivelul tubului digestiv.

O altă sursă majoră de contaminarea a suprafețelor carcaselor a fost reprezentată de tegumentul bovinelor, în condițiile în care jupuirea s-a efectuat manual, având loc astfel o contaminare a țesutului conjunctiv subcutanat cu germeni de la nivelul cuțitului și mâinilor, mai ales că operațiunile de igienizare a mâinilor operatorilor și de sterlizare a cuțitelor nu erau efectuate corespunzător. Ca urmare a acestor aspecte, pot fi explicate rezultatele obținute în ceea ce privește contaminarea microbiană cu germeni din familia Enterobacteriaceae la suprafața carcaselor refrigerate.

Interpretarea statistică a rezultatelor obținute prin prelucrarea probelor prelevate de la suprafața carcaselor refrigerate din unitățile A și B prin analiza varianței unifactoriale (ANOVA) a pus în evidență diferențe semnificative statistic doar în cazul germenilor din genul Aeromonas (p<0.05), pentru celelalte categorii de microorganisme (Pseudomonas, Yersinia, Enterobacteriaceae, bacterii acido-lactice, număr total de germeni psihrotrofi) diferențele nefiind semnificative.

Comparând rezultatele obținute în privința încărcăturii de germeni de la suprafața carcaselor calde de bovine cu cele prelevate de la suprafața carcaselor refrigerate de bovine din unitatea A s-a constatat că s-au obținut diferențe distinct semnificativ statistic în ceea ce privește încărcătura de germeni psihrotrofi și a germenilor din familia Enterobacteriaceae (p≤0.01). Diferențe foarte semnificativ statistic (p≤0.001) s-au obținut doar în cazul germenilor din genul Pseudomonas, iar diferențe semnificative statistic s-au constatat pentru germenii din genurile Yersinia și Aeromonas (p<0.05). Pentru bacteriile acido-lactice nu s-au efectuat calculele statistice deoarce în cazul probelor provenite de la carcase calde nu s-au pus în evidență aceste microorganisme.

În privința comparării rezultatelor încărcăturii medii cu germeni psihrotrofi din probele de carne calde și refrigerate, prelevate din unitatea B, s-au obținut diferențe foarte semnificative în cazul germenilor din genurile Pseudomonas, Aeromonas și din familia Enterobacteriaceae (p≤0.001), diferențe distinct semnificative în cazul yersiniilor (p≤0.01), și semnificative statistic pentru încărcătura totală de germeni (p<0.05). În cazul bacteriile acido-lactice nu s-au evidențiat diferențe semnificative statistic.

Pe baza acestor rezultate se poate constata că în cazul păstrării carcaselor la temperaturi de refrigerare, germenii psihrotrofi de alterare și/sau condiționat patogeni au capacitatea de a se multiplica foarte repede, comparativ cu microflora mezofilă, devenind astfel microorganismele dominante din ecosistemul cărnii (Jackson, 1997; Gill, 1986; Day, 2000). a urmare a acestui aspect, germenii psihrotrofi vor declanșa procesele alterative ale cărnii cu atât mai repede cu cât numărul acestora va ajunge mai rapid la valori de 106–107 ufc/cm2 (Ayres, 1987; Gill, 1986).

Rezultatele privind nivelul de contaminare cu germeni psihrotrofi în profunzimea carcaselor de bovine refrigerate a relevat că media încărcăturii totale de germeni în cazul probelor prelevate din unitatea A este cuprins între 2.58±0.18 log ufc/g în trim. I și 3.97±0.69 log ufc/g în trim. III, cu o valoare minimă de 2.43±0.32 log ufc/g în luna martie și 4.76±0.45 log ufc/g în luna august. Din totalul probelor examinate, 3 au fost negative, iar restul (91.66%) au depășit limita maximă recomandată (2.2 log ufc/g) (Gill și Penny, 1979; Shank et al., 1962).

Pe baza analizelor statistice (ANOVA), s-a stabilit că diferența în ceea ce privește încărcătura totală de germeni psihrotrofi între cele două unități este distinct semnificativă (p≤0.01), în unitatea B nivelul de contaminare fiind mai crescut, cuprins între 3.85±0.45 log ufc/g în trim. I și 4.66±0.2 log ufc/g în trim. II, toate probele depășind limita maximă recomandată.

Încărcătura medie trimestrială cu germeni din genul Pseudomonas, în cazul probelor prelevate din unitatea A, a fost cuprinsă între 2.26±0.32 log ufc/g în trim. IV și 4.1±0.1 log ufc/g în trim. II, cele mai ridicate valori fiind înregistrate în cursul trim. II. Din totalul probelor examinate, 12 au fost negative iar 16 (50%) au depășit limita maximă recomandată de 2.2 log ufc/g.

În ceea ce privește rezultatele obținute pentru unitatea B, s-a constatat că din totalul probelor 9 au fost negative (25%), iar 20 au prezentat valori peste limita maximă recomandată (55.55%), media încărcăturii cu pseudomonade fiind cuprinsă între 2.18±0.16 log ufc/g în trim. IV și 3.4±0.9 log ufc/g în trim. II. Valorile crescute ale deviației standard în cazul trimestrelor II și III, de 0.98 log respectiv 1.05 log, se datorează diferențelor mari între mediile probelor lunare (1.9 log), ceea ce denotă condiții deferite de prelucrare a carcaselor, respectiv de respectarea normelor de igienă. Comparând mediile lunare ale încărcăturii cu germeni din genul Pseudomonas, din unitățile luate în studiu, prin intermediul testului ANOVA, nu s-au obținut diferențe semnificative statistic, (p=0.54).

Germenii din genul Aeromonas au fost identificați în 18 probe (50%), atât pentru probele recoltate din unitatea A cât și din unitatea B. Deși nivelul încărcăturii a fost mai crescut în unitatea B, mai ales în trimestrele II și IV, prin efectuarea analizei statistice nu s-au pus în evidență diferențe semnificative (p=0.97). În cazul unității A, din cele 36 probe examinate, doar în 5 cazuri s-a constatat depășirea limitei de 2.2 log ufc/g, respectiv 13.88%, încărcătura medie fiind cuprinsă între 1.6±020 log ufc/g în trim. III și 2.5±0.14 log ufc/g în trim. IV. Media încărcăturii cu aeromonade a fost cuprinsă în cazul unității B între 2.23±0.15 log ufc/g în trim. I și 3.23±0.15 log ufc/g în trim. IV, cu o valoare minimă de 2.1 log ufc/g în cursul lunii aprilie și maximă de 3.4±0.20 log ufc în luna decembrie, constatându-se depășirea limitei maxime recomandate la 11 probe, respectiv la 30.55% din totalul probelor examinate (fig. 31) (Gill și Penny, 1979; Shank et al., 1962)..

Încărcătura medie a germenilor din genul Yersinia pentru probele prelevate din unitatea A a fost relativ scăzută, fiind cuprinsă între 1.58±0.20 log ufc/g în trim. I, și 1.93±0.29 log ufc/g în trim. II, cu o valoare minimă de 1.4±0.16 log ufc/g în luna martie și maximă de 2.16±0.20 log ufc/g în luna iunie, 50% din totalul probelor examinate fiind negative. În unitatea B, media încărcăturii cu yersinii s-a situat între 1.84±0.41 log ufc/g în trim. I și 2.41±0.30 log ufc/g în trim. III, cu un minim de 1.36±0.15 log ufc/g în luna ianuarie și maxim de 2.63±0.32 log ufc/g în luna august, 21 probe fiind negative iar 4 prezentând depășiri ale limitei maxime recomandate (11.11%).

S-a observat că încărcătura cu germeni din familia Enterobacteriaceae a fost scăzută în cazul probelor prelevate din unitatea A, doar 9 fiind pozitive (25%), în cursul trimestrului II, cu o medie a valorii de 1.60±0.12 log ufc/g. Spre deosebire, în unitatea B, din totalul probelor examinate 21 au fost pozitive (58.33%), media încărcăturii fiind cuprinsă între 1.76±0.35 log ufc/g în trim. IV și 2.41±0.25 log ufc/g în trim. III. Prin intermediul testului ANOVA s-a stabilit că între mediile lunare a încărcăturii cu Enterobacteriaceae a celor două unități de sacrificare, există diferențe semnificativ statistic (p=0.03). Deși încărcătura cu germeni din familia Enterobacteriaceae este relativ scăzută, contaminarea în profunzimea carcaselor trebuie să fie mult mai redusă (sau chiar absentă), în cazul în care de-a lungul etapelor de prelucrare al carcaselor s-ar respecta bunele practice de lucru și bunele practice de igienă.

Germenii din grupa bacteriilor acido-lactice nu au fost puși în evidență la nici o probă prelevată din unitățile A și B.

Prin analiza statistică a rezultatelor obținute în cazul încărcăturii totale de germeni psihrotrofi din profunzimea carcaselor calde și refrigerate de bovine s-a consatat că există diferențe foarte semnificative, atât pentru unitatea A (p=0.004), cât și pentru unitatea B (p=0.001). Ca și în cazul încărcăturii psihrotrofe de la suprafața carcaselor refrigerate de bovine, se poate constata că și în profunzimea carcaselor, în condiții de refrigerare, numărul bacteriilor psihrotrofe crește foarte mult, de multe ori depășind limitele maxim recomandate, ducând astfel la declanșarea proceselor alterative, cu scurtarea drastică (în unele cazuri), a duratei limită de consum a cărnii, respectiv cu pierderi economice semnificatve pentru unitățile de sacrificare, respectiv de procesare a cărnii. Diferențele în ceea ce privește nivelul încărcăturii cu germeni între probe nu denotă altceva decât diferențe între modul de manipulare și procesare ale carcaselor, atât între operatorii care-și desfășoară activitatea în unitățile luate în lucru, cât și între aceeași operatori, dar în diferite perioade ale zilei sau săptămânii de lucru. Ca urmare, putem aprecia că în cazul în care în unitățile luate în studiu s-ar fi respectat de fiecare dată atât normele de igienă (spații de lucru, echipament, instrumentar), cele de prelucrare a carcaselor și microclimat (bune practice de lucru, temperatură, umiditate), nivelul încărcăturii cu germeni de la suprafața și din profunzimea carcaselor ar fi prezentat valori mult mai scăzute, care s-ar fi încadrat în normele maxim admise de legislația în vigoare, respectiv de cele recomandate de literatura de specialitate (Gill și Penny, 1979; Shank et al., 1962; Sutherland et al., 1975; Hanna et al., 1977; Ayres et al., 1980; Dainty et al., 1992; Cousin, 2000).

Teste de confirmare biochimice

Configurația microflorei psihrotrofe a fost stabilită prin efectuarea testelor de confirmare biochimică a coloniilor izolate de pe mediul SI și a mediilor selective pentru Pseudomonas, Aeromonas, Yersinia și grupa bacteriilor acido-lactice. În vederea identificării speciilor bacteriene psihrotrofe, din fiecare colonie dezvoltată pe mediile de cultură (SI-agar, GSP-agar, CIN-agar, VRBD-agar), s-au efectuat teste de confirmare biochimică API 20NE, respectiv API 20E (Biomerieux)..

Incidența speciile bacteriene identificate în cazul carcaselor de bovine refrigerate din unitatea A este redată în graficul din fig. 6. Din prelucrarea rezultatelor prezentate în graficul din figura 6, s-a observat că speciile bacteriene predominante sunt cele Gram negative, respectiv 73.98%, în timp ce bacteriile Gram pozitive reprezintă 26.02%. Dintre bacteriile Gram pozitive, 15.38% sunt reprezentați de către stafilococi și streptococi. Diferențierea între formațiunile cocoide s-a efectuat pe baza examenului bacterioscopic, a testului catalazei și oxidazei, prezența micrococilor fiind exclusă în cazul probelor prelevate de la nivelul carcaselor de bovine refrigerate din unitatea A, deoarece testul oxidazei a fost negativ pentru toate coloniile suspecte.

Dintre bacteriile Gram negative, s-a constatat că predomină cele psihrotrofe, din care: genul Pseudomonas, cu 24.9%, genul Acinetobacter cu 10.62%, genul Psychrobacter cu 8.8%, genul Aeromonas, cu 7.68% și genul Yersinia cu 6.96%. Dintre reprezentanții familiei Enterobacteriaceae, s-au identificat, pe baza testelor API 20E, următoarele specii: E. coli (1.46%), Hafnia alvei (4.39%), Serratia fonticola, respectiv Serratia lignefaciens (6.95%) și Pantoea spp. 2 (1.09%). Precizăm că tulpinile de E. coli identificate de noi pe baza testelor API, nu s-au dovedit a fi enteropatogene, în urma efectuării testelor de aglutinare pe lamă cu ser anti E. coli polivalent. Restul speciilor fac parte din categoria germenilor psihrotrofi ai familiei Enterobacteriaceae, implicați frecvent în declanșarea proceselor alterative a cărnii, la nivele ale încărcăturii cuprinse între 6.0-7.0 log ufc/cm2 (Gram et al., 1999).

Majoritatea speciilor de bacterii psihrotrofe identificate pe baza kiturilor API fac parte din grupa microorganismelor de alterare, nepatogene pentru om, implicate însă în declanșarea proceselor alterative ale cărnii, cu câteva excepții: Aeromonas hydrophila (5.49%) și Yersinia enterocolitica (0.36%), ambele fiind încadrate în categoria germenilor patogeni, ultima identificată tot mai des în declanșarea unor toxiinfecții alimentare la om.

Configurația microbiană pentru probele recoltate de la suprafața carcaselor de bovine refrigerate din unitatea B este oarecum asemănătoare cu cea prezentată anterior pentru unitatea A. Din analizarea graficului din fig. 7 s-a constatat că bacteriile Gram negative reprezintă 78.64%, în timp ce bacteriile Gram pozitive au o pondere scăzută, de 21.36%, fiind reprezentate de stafilococi, micrococi și bacili Gram pozitivi neidentificați. Germenii Gram pozitivi au fost identificați doar pe baza examenului morfologic (bacterioscopic), a testului KOH, catalazei și oxidazei. Din grupul bacteriilor Gram negative, predomină germenii psihrotrofi, reprezentați de: genul Pseudomonas (25.79%), genul Aeromonas (11.95%), genul Psychrobacter (10.14%), genul Acinetobacter (7.24%), și genul Yersinia (6.51%). Reprezentanții psihrotrofi ai familiei Enterobacteriaceae identificați cu ajutorului kiturilor API 20E au fost reprezentați doar de germeni de alterare, după cum urmează: Hafnia alvei (3.98 %), Serratia lignefaciens (5.79%) și Pantoea spp. 2 (1.09%). Ca și în cazul rezultatelor obținute în unitatea A, majoritatea speciilor bacteriene identificate sunt reprezentate de bacterii psihrotrofe de alterare, însă prezența lui Aeromonas hydrophyla (8.33%) și Vibrio parahaemolyticus (0.72%), poate ridica întrebarea dacă respectivele carcase din care s-au identificați acești germeni, este sigură pentru consumatori ?

Comparând rezultatele în ceea ce privește configurația și incidența speciilor identificate de la suprafața carcaselor de bovine calde cu cele obținute pentru carcasele refrigerate putem constata că dacă microflora inițială era predominată de germeni Gram pozitivi (56.51%), germenii psihrotrofi având o pondere mai scăzută (37.17%), după păstrarea în condiții de refrigerare (48 ore), a avut loc o schimbare majoră a configurației microbiene, la nivelul noilor condiții din ecosistemul cărnii. Astfel microflora dominantă devine cea Gram negativă (73.98%), iar din cadrul acesteia bacteriile psihrotrofe reprezintă populația reprezentativă (71.39%), ca urmare a caracteristicilor acestor microorganisme de a se dezvolta rapid la temperatura de refrigerare, comparativ cu microflora mezofilă.

Aceste aspecte sunt asigurate și din punct de vedere statistic, pe baza analizei mono-factorială ANOVA (tab. 8), constatatându-se că s-au obținut diferențe foarte semnificative statistic (p≤0.001), în cazul bacteriilor Gram pozitive, Gram negative, și a germenilor din genul Yersinia, diferențe distinct semnificative pentru germenii din genurile Pseudomonas și Acinetobacter (p≤0.01) și semnificative în cazul germenilor din genul Aeromonas (p≤0.05).

Studii efectuate de Sutherland et al. (1975), Hanna et al. (1977), Ayres et al. (1980), Cousin (2000), au evidențiat că microflora inițiala a carcaselor de bovine este dominată de germenii Gram pozitivi reprezentați de stafilococi, micrococi, streptococi, germeni din genul Bacillus și Lactobacillus, în proporții variabile, cuprinse între 55-75%, în timp ce microflora bacilară Gram negativă reprezentată de microorganisme din genurile: Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Aeromonas, reprezintă aproximativ 25-45%. La temperatura de refrigerare, are loc o schimbare a configurației microbiene, astfel încât, germenii psihrotrofi, reprezentați de microorganisme din genurile Pseudomonas (54%), Moraxella (9%), Acinetobacter (10%), Aeromonas (9%), Psychrobacter precum și într-o măsură mai scăzută specii psihrotrofe din familia Enterobacteriaceae (Serratia, Enterobacter), devin populația dominantă (Robert, 1983 ; Cousin, 2000).

Evaluarea în dinamică a configurației microbiene

la nivelul carcaselor de bovine refrigerate

Pentru a aprecia în dinamică încărcătura și configurația microbiană la nivelul carcaselor de bovine, s-au recoltat probe de carne la 2 ore de la sacrificare, 24 ore, 120 ore (5 zile), 216 ore (9 zile) și 312 ore (13 zile). În vederea interpretării cât mai corecte a rezultatelor, din fiecare unitate au fost recoltate câte 3 probe pentru fiecare interval de timp, valoarea luată în lucru fiind reprezentată de media celor trei determinări. Deși durata limită de consum al semicarcaselor de bovine refrigerate, stabilit de către unitățile de sacrificare, este de 10 zile, am considerat că ar fi mai elocvent dacă această evaluare în dinamică s-ar efectua pe o perioadă mai îndelungată (13 zile), pentru a putea stabili dacă nivelul încărcăturii microbiene psihrotrofe se menține la nivele mai scăzute decât limita maxim recomandată pe durata de valabilitate, sau eventual și după această perioadă.

În graficul din fig. 8 este prezentată evoluția în dinamică a încărcăturii microbiene pentru carcasele de bovine refrigerate din unitatea A în intervalul luat în studiu. Din analiza acestui grafic se constată în privința încărcăturii totale de germeni psihrotrofi o evoluție ascendentă, de la 4.3±0.2 log ufc/cm2 la 8.13±0.25 log ufc/cm2 în ultima zi a experimentului, constatându-se depăsirea limitei maxime recomandate în ziua 8-a. S-a observat că la 24 ore de la prelevarea probelor a avut loc o ușoară descreștere a încărcăturii totale la 3.9±0.1 log ufc/cm2, probabil ca urmare a adaptării germenilor la noile condiții de microclimat.

Pentru germenii din genul Pseudomonas s-a remarcat aceeași tendință de creștere uniformă, observându-se imediat după sacrificare o valoare de 3.36±0.15 log ufc/cm2, pentru ca în ziua a 13-a numărul acestora să ajungă la 6.83±0.35 log ufc/cm2, limita maximă recomandată fiind depășită în ultima zi a duratei limită de consum a carcaselor. În cazul germenilor din genul Aeromonas, evoluția în dinamică prezintă o ușoară pantă descendentă la 24 ore, de la 3.86±0.15 log ufc/cm2 la 3.23±0.15 log ufc/cm2 (faza de lag), după care evoluția este ascendentă până în ziua 9-a, când încărcătura de aeromonade atinge 5.1±0.1 log ufc/cm2, după care scade constant până în ultima zi a experimentului, când nu mai sunt puși în evidență. Și pentru germenii din genul Yersinia se poate observa o tendință ascendentă a încărcăturii microbiene de la 3.43±0.20 log ufc/cm2 imediat după sacrificare, la 6.13±0.15 log ufc/cm2, în ultima zi a experimentului.

Germenii din familia Enterobacteriaceae au prezentat o evoluție uniformă de creștere, începând cu prima zi după recoltarea probelor, de la 1.73±0.15 log ufc/cm2 la 6.13±0.25 log ufc/cm2 în ziua 13-a a experimentului, depășind limita maxim admisă (2.5 log ufc/cm2) în ziua 3-a (fig. 8).

Bacterile acido-lactice prezintă o evoluție descendentă, de la 2.43±0.05 log ufc/cm2 imediat după sacrificare, la 2.13±0.15 log ufc/cm2 la 24 ore, pentru ca apoi să scadă constant, astfel încât în ziua 5-a nu au mai fost puse în evidență. Această scădere a bacteriilor acido-lactice poate fi explicată prin faptul că acestea predomină în condițiile de păstrare a cărnii în vacuum sau atmosferă modificată.

Evoluția în dinamică a germenilor psihrotrofi pentru probele prelevate din unitatea B este prezentată în fig. 9. Din analizarea rezultatelor obținute s-a constatat că evoluția în dinamică a microorganismelor psihrotrofe de alterare este asemănătoare cu cea descrisă în cazul probelor recoltate din unitatea A. astfel, se constată o evoluție ascendentă, uniformă atât în ceea ce privește încărcătura totală de germeni, cât și germenii din genurile Pseudomonas, Aeromonas, Yersinia și membrii familiei Enterobacteriaceae, începând din prima zi a experimentului și până în ziua 13-a. Încărcătura totală de germeni prezintă o evoluție ascendentă mai accentuată decât în cazul probelor prelevate din unitatea A, astfel că limita maximă recomandată este depășită începând cu ziua 6-a. Depășirea acestei limite s-a realizat și pentru germenii din genurile Pseudomonas și Yersinia din ziua a 9-a, când carcasele se erau încă în durata limită de consum. Germenii din genul Aeromonas prezintă o evoluție oarecum diferită, în sensul în care, aceștia începând din ziua 9 au o evoluție descendentă, ajungând ca la finalul experimentului să aibă valori de 2.43±0.45 log ufc/cm2, iar bacteriile acido-lactice au prezentat o evoluție ascendentă până in ziua 5-a, când au atins 3.2 log ufc/cm2, după care numărul acestora a scăzut, astfel încât, în a 13-a zi nu au mai fost identificați. Pe baza acestor rezultate, putem aprecia că evoluția în dinamică a numărului de germeni depinde într-o mare măsură de nivelul inițial al contaminării carcaselor. Cu cât acesta este mai crescut, cu atât microorganismele vor atinge mai rapid nivele ce depășesc 6.0 log ufc/cm2, declanșând apariția proceselor alterative.

La temperaturi cuprinse între 0…4ºC, cărnurile menținute în condiții aerobe sunt supuse procesului de alterare putrifică de către germenii psihrotrofi din genurile: Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, care au ca și compus principal de metabolism CO2, rezultat din metabolizarea carbohidraților. Abia după epuizarea acestui substrat, aceste microorganisme vor trece la metabolizarea compușilor pe bază de azot, determinând creșterea pH-ului și declanșarea proceselor alterative putrifice (Brown, 2000).

În cazul păstrării cărnii în condiții aerobe primele modificări organoleptice apar de regulă când populația microbiană depășește valori de 7.0 log ufc/cm2, când sunt perceptibile mirosurile străine (amoniac), stratul lipicios de mâzgă formându-se când nivelul încărcăturii microbiene depășește 8.0 log ufc/cm2. În continuare, micoorganismele vor continua să se multiplice, până vor atinge valori de 9.0 log ufc/cm2, când stratul de mâzgă atinge 1-2 mm (Brown, 1982; Dainty et al., 1992).

În vederea coroborării examenului bacteriologic cu cel senzorial s-au efectuat examene organoleptice ale eșantioanelor de carne concomitent cu efectuarea determinărilor microbiologice, constatându-se următoarele aspecte: proba de carne în momentul recoltării a prezentat caracteristici senzoriale corespunzătoare stării de carne proaspătă, primele modificări organoleptice apărând din ziua 9-a de la recoltare, când s-a observat o ușoară decolorare a cărnii la suprafață, puțină umezeală și zone cu modificări de culoare la suprafață reprezentate de zone de culoare cenușiu-roșietice, care alternează cu zone de culoare roșie-negricioasă, cu suprafața ușor uscată și evidențierea unui miros incipient de alterare putrifică; la 13 zile stratul de mâzgă de pe suprafața cărnii este evident, de culoare cenușiu-verzuie, cu miros puternic de alterare putrifică aceste modificările de culoare și miros s-au accentuat, fiind prezente și în profunzimea cărnii, iar prin compresiune, amprenta nu a revenit la forma inițială.

Coroborând rezultatele examenului bacteriologic cu cel al examenului senzorial, am apreciat că apariția mirosului străin de alterare putrifică s-a realizat la o încărcătură 7.12 log ufc/cm2, iar a stratului lipicios, de mâzgă, la o încărcătură de 8.13 ufc/cm2, rezultate comparabile cu cele din literatura de specialitate (Brown, 1982; Ayres, 1987; Dainty et al., 1992).

Concomitent cu recoltarea probelor de carne s-au efectuat amprente direct de la suprafața și din profunzimea carcaselor, colorate prin metoda Gram. Examenele bacterioscopice au fost negative în cazul probelor provenite imediat după sacrificare, la 24 și 120 ore, fiind pozitive din ziua a 9-a, corelat și cu depăsirea limitei maxime recomandate, când s-au pus în evidență bacili Gram negativi (peste 30 bacili/câmp convențional, media a 10 câmpuri). Cele mai elocvente rezultate s-au observat însă în ziua a 13-a, când s-a pus în evidență în frotiurile examinate o încărcătură foarte mare de formațiuni bacilare Gram negative, variate în ceea ce privește mărimea și modul de grupare, cu rare formațiuni cocoide, precum și prezența în număr redus a celulelor levurice, aspecte care pledează pentru carnea alterată, fapt confirmat de examenul organoleptic și bacteriologic descries anterior.

Din aspectele prezentate mai sus rezultă că pe măsură ce carcasele sunt depozitate perioade mai lungi de timp în spațiile de refrigerare, încărcătura bacteriană de la suprafață prezintă o evoluție ascendentă ajungând la valori de până la 8.0-9.0 log ufc/cm2, nivelul de creștere al populației bacteriene și configurația germenilor prezenți pe suprafața carcaselor fiind dependent de temperatura de refrigerare și umiditatea relativă spațiului de depozitare.

Ca urmare, putem aprecia că microorganismele psihrotrofe de alterare au o importanță și din punct de vedere economic în cazul în care populația microbiană depășește nivelul de 6.0 log ufc/cm2, ca urmare a producerii modificărilor senzoriale, respectiv a reducerii duratei limită de consum.

Încărcătura și configurația microflorei psihrotrofe la nivelul carcaselor de porcine

Datorită modului diferit de prelucrare a carcaselor de porcine față de cele de bovine, prin opărire-depilare-flambare (cel mai frecvent), decât prin jupuire, o mare parte din microflora de la suprafața tegumentului este îndepărtată. Însă după procesul de opărire, carcasele pot fi recontaminate în timpul operațiunii de depilare, în cazul în care aceste instalații nu sunt igienizate corespunzător. În urma procesului de flambare (opțional), se îndepărtează o mare parte din microflora reziduală de la suprafața carcaselor de porcine, doar în cazul în care această operațiune se efectuează în mod corespunzător. Datorită timpului scurt de aplicare (2-5 secunde), microorganismele care se pot găsi în straturile mai profunde ale carcasei nu sunt afectate de această etapă a fluxului tehnologic. Ca urmare a acestor particularități de procesare, suprafața carcaselor de porcine se va contamina în următoarele etape ale fluxului tehnologic, respectiv: eviscerare, tranșare, răcire, mai ales în cazul nu sunt respectate bunele practici de lucru și de igienă (GMP, GHP) (Davis și Board, 1998; Jackson et al., 1999). Datorită acestor aspecte, nivelul de contaminare al suprafeței carcaselor de porcine este mai scăzut cu aproximativ 1-2 log ufc/cm2 (Gill și Bryant,1992; Gill et al., 1997).

Aprecierea încărcăturii și configurației psihrotofe la suprafața carcaselor de porcine obținute imediat după sacrificare (carne caldă)

Din prelucrarea statistică a rezultatelor obținute s-a constatat că încărcătura microbiană medie de la suprafața carcaselor din unitatea A a prezentat valori valori diferite, cuprinse între 3.78±0.37 log ufc/cm2 în trim. I și 4.41±0.25 log ufc/cm2 în trim III, cu o valoare minimă de 3.36±0.25 log ufc/cm2 în luna ianuarie și maximă de 4.66±0.25 log ufc/cm2 în luna iulie. În cazul probelor prelevate din unitatea B media valorii încărcăturii totale psihrotrofe s-a încadrat în intervalul 4.12±0.28 log ufc/cm2 (trim. IV), 5.04±0.37 log ufc/cm2 în trim. III, cu o minimă de 4.1±0.26 log ufc/cm2 aferentă lunii februarie și 5.36±0.15 log ufc/cm2 în luna iulie. Analizând aceste rezultate, am constatat că nivelul de contaminare a fost mai crescut în cursul trimestrelor II și III, ușor mai ridicat în cazul probelor prelevate din unitatea B (p≤0.01). Studii efectuate de Zweifel et al. (2005) în cinci unități de sacrificare (Elveția), agreate de UE, au pus în evidență un nivel al încărcăturii totale de germeni cuprins între 2.18 log ufc/cm2 și 3.70 log ufc/cm2, valori mai scăzute decât cele obținute în studiul nostru, care nu fac altceva decât să demonstreze importanța respectării cu strictețe a normelor de igienă din aceste unități. De asemenea, Gill și Bryant (1992), Gill et al. (1997), Pearce et al. (2004), Pinto (2004), în diverse studii care au vizat încărcătura microbiană la nivelul carcaselor de porcine și metode de reducerea acesteia au relevat nivele relativ scăzute ale numărului de germeni, cuprinse între 3.05 log ufc/cm2 și 4.0 log ufc/cm2.

De menționat este faptul că încărcătura microbiană de la suprafața carcaselor a prezentat valori comparabile cu cele întâlnite în literatura de specialitate pentru carnea proaspătă, doar în cazul în care în unitățile din care au fost prelevate probele, au fost respectate normele de igienă precum și cele de bune practici de lucru (Mayr et al., 2003). Aceste aspecte demonstrează că în unitățile luate în studiu se pot obține carcase cu nivele ale încărcaturii microbiene, comparabile cu cele obținute în abatoare agreate de UE.

Configurația microbiană psihrotrofă a carcaselor calde de porcine, a fost stabilită prin utilizarea mediilor de cultură selective menționate. Astfel, prin însămânțarea mediului selectiv GSP agar și incubarea la 20ºC, s-a reușit punerea în evidență a unor colonii de culoare roz-roșietice, bombate cu margini regulate, opace, lucioase, de aproximativ 1–3 mm diametru (fig. 4, pag. 78). La 8 dintre probe s-a observat și dezvoltarea unor colonii de culoare galbenă, bombate, opace, lucioase, cu margini regulate, netede, de aproximativ 1–2 mm diametru, considerate specifice pentru Aeromonas spp. (fig 42).

Fig. 42 Colonii specifice de Aeromonas spp. dezvoltate pe mediul selectiv GSP agar

Specific Aeromonas spp. colonies developed on GSP selective agar

Nivelul încărcăturii microbiană cu germeni din genul Aeromonas, este scăzut în ambele unități monitorizate, din totalul probelor examinate 22.22% fiind pozitive în unitatea A și 33.33% din unitatea B (fig. 39). Media încărcăturii cu aeromonade în unitatea A a fost de 1.53±0.68 log ufc/cm2, în trim. II, iar în unitatea B de 3.15±0.93 log ufc/cm2 în trim. II și 3.30±0.43 log ufc/cm2 în trim. III, nici o probă nedepășind limita maxim recomandată (Sutherland et al., 1975; Hanna et al., 1977; Ayres et al., 1980; Cousin, 2000). Studii efectuate de Gill et al., 1999, în unități de sacrificare a porcinelor și ovinelor a pus în evidență nivele de contaminare cu Aeromonas spp. de 3.26 log ufc/cm2, asemănătoare cu cele obținute de noi în unitatea B.

În schimb, Yu și Palumbo (2000), într-un studiu care a vizat nivelul încărcăturii cu aeromonade de-a lungul fluxului de procesare a porcinelor, a pus în evidență la suprafața carcaselor calde o încărcătură medie de 1.88 log ufc/cm2, mai scăzută decât cea obținută de către noi.

Încărcătura cu germeni din genul Pseudomonas a prezentat valori diferite în intervalul luat în studiu, cuprinse în cazul probelor prelevate din unitatea A între 2.7±0.72 log ufc/cm2 în trim. I și 3.45±0.67 log ufc/cm2 în trim. II, cu minim de 2.23±0.30 în luna ianuarie și maxim de 4.06±0.55 în luna aprilie, 83.33% din totalul probelor fiind pozitive (fig. 44). În unitatea B, nivelul contaminării cu pseudomonade a fost mai crescut față de cel din unitatea A (p≤0.01), fiind cuprins în intervalul 2.8±0.37 log ufc/cm2 în trim. I și 4.93±0.2 în trim. III, cu un minim de 2.46±0.35 log ufc/cm2 în luna februarie și maxim de 5.13±.032 log ufc/cm2 în luna iulie. Ca și în cazul probelor prelevate de la bovine, germenii din genul Pseudomonas au fost identificați în toate cele 36 probe recoltate, demonstrând astfel că reprezintă și pentru carcasele calde de porcine populația predominantă (Buys et al., 2000; Gill, 1996). Nell et al., 2004, studiind populația bacteriană asociată carcaselor de porcine a relevat nivele medii ale încărcăturii cu pseudomonade de 3.96 log ufc/cm2, asemănătoare cu cele obținute în studiul nostru. Nivelul încărcăturii și speciile de pseudomonade identificate la nivelul carcaselor sunt dependente în mare măsură de microflora din spațiul de prelucrare a carcaselor, ca urmare acestea diferă de la un abator la altul (Lowrie, 1998).

Pentru izolarea și identificarea germenilor din genul Yersinia s-au făcut însămânțări pe mediul selectiv CIN agar, observându-se după de 24 ore la 20˚C dezvoltarea unor colonii circulare, cu centrul violet și inel de culoare cenușiu-albicios, bombate, lucioase de 2–4 mm diametru, considerate a fi specifice pentru Yersinia spp. (fig. 7, pag. 81 ).

Încărcătura microbiană medie cu germeni din genul Yersinia, la suprafața carcaselor calde din unitatea A a fost cuprinsă între 2.78±0.63 log ufc/cm2 în trim. II și 2.87±.039 log ufc/cm2 în trim. III, 41.66% din totalul probelor fiind pozitive (fig. 45). Media încărcaturii cu yersinii din unitatea B a fost mai crescută, fiind cuprinsă între 3.82±0.15 log ufc/cm2 în trim II și 4.16±0.09 log ufc/cm2, între cele două unități nefiind diferente semnificative (p=0.42).

Pentru identificarea bacteriilor acido-lactice s-a utilizat mediul selectiv MRS agar, observându-se dezvoltarea unor colonii de culoare albă, opace, lucioase, bombate, cu margini regulate, de 1–2 mm diametru, însă în urma examenului bacterioscopic de la nivelul acestor colonii s-au pus în evidență levuri.

Pentru identificarea germenilor din familia Enterobacteriaceae am folosit atât mediul VRBD agar cât și mediul selectiv CMV agar. Aspectele morfologice ale coloniilor dezvoltate pe mediul selectiv VRBD agar au fost descrise în subcapitolul 6.1.3.1.1 (fig. 11, pag. 109). În cazul plăcilor Petri cu mediul CMV enteric agar, după 24 ore la temperatura de 30°C, s-au observat următoarele tipuri de colonii (fig. 42):

Fig. 46 Colonii de Proteus spp., Citrobacter spp. și E. coli dezvoltate

pe mediul selectiv CMV (ex. lupă x 40)

Proteus spp., Citrobacter spp. and E. coli colonies developed on

CMV selective agar ( x 40)

colonii galbene, cu centrul maroniu-negricios, cu inel cenușiu la periferie, netede, lucioase, bombate, de 1-2 mm diametru (caracteristice genului Citrobacter);

colonii galbene, cu centrul portocaliu, cu inel cenușiu la periferie, bombate, lucioase, de 1-2 mm diametru (caracteristice pentru E. coli);

colonii cu centru portocaliu, cu inel verzui-cenușiu la periferie, cu diametrul de 1-3 mm (caracteristice genului Proteus).

Încărcătura cu germeni din familia Enterobacteriaceae s-a situat la nivele scăzute, în ambele unități nefiind depășite limita maxim admisă (3.0 log ufc/cm2). În unitatea A, 16.66% din totalul probelor au fost pozitive, media încărcăturii cu Enterobacteriaceae fiind de 2.04±0.21 log ufc/cm2 în trim. II, iar în unitatea B 22.22% dintre probe au fost pozitive, nivelul mediu al încărcăturii fiind de 2.45±0.32 log ufc/cm2 în trim. III (fig. 43). Rezultatele obținute de Nell et al. (2004), Mayr et al. (2003) au relevat nivele medii ale încărcăturii cu Enterobacteriaceae, la suprafața carcaselor de porcine, de 4.15 log ufc/cm2, respectiv 3.56 log ufc/cm2, mai crescute decât cele obținute de noi.

Din analiza rezultatelor prezentate mai sus, se poate afirma că în condițiile în care prelucrarea carcaselor a fost efectuată cu respectarea strictă a normele de igienă de-a lungul întregului flux tehnologic, încărcătura microbiană a prezentat valori scăzute, nedepășind limitele maxim admise sau recomandate de legislația în vigoare, respectiv literatura de specialitate (Sutherland et al., 1975; Hanna et al., 1977; Ayres et al., 1980; Cousin, 2000; Ord. 91/2005 ANSVSA). Comparând rezultatele încărcăturii microbiene de la suprafața carcaselor de bovine calde, cu cea obținută la porcine putem aprecia că nivelul este mai scăzut în cazul porcinelor, diferențele fiind cuprinse între 0.4 log și 2.5 log. Aceste valori mai scăzute se pot datora proceselor tehnologice de opărire-flambare care reduc nivelul de germeni de la suprafața carcaselor la nivele foarte scăzute (1.0-1.6 log ufc/cm2), astfel încât în urma procesului de eviscerare și tranșare a carcasei, se realizează o contaminare a țesutului muscular doar prin intermediul instrumentelor de secționare, respectiv o contaminare cu conținut intestinal în cazul în care se secționează accidental tubul digestiv (3.2-3.7 log ufc/cm2) (Bolton et al. (2002 a, b); Warringen et al., (2002). Nivele mai scăzute ale încărcăturii microbiene la nivelul carcaselor de porcine comparativ cu cele de bovine pot fi explicate și prin aceea că nu se realizează secțiunea capului și implicit a esofagului,care în cazul în care nu este legat, poate duce la o contaminare masivă a zonei cervicale. De asemenea, prin faptul că eviscerarea masei gastro-intestinale se efectuează în bloc la porcine, pe când la bovine se efectuează eviscerarea separată a prestomacelor de masa intestinală, este necesară realizarea unei secțiuni suplimentare s-(la nivelul pilorului), care în cazul nerespectarii bunelor practici de lucru duce la creșterea nivelului de microorganisme, multe dintre ele din familia Enterobacteriaceae.

Confirmare morfologică și biochimică

Pentru stabilirea caracterelor morfologice ale microorganismelor, s-au efectuat examene bacterioscopice din coloniile dezvoltate pe mediile selective, frotiurile fiind colorate prin metoda Gram. În cazul în care examenul bacterioscopic nu a putut fi interpretat corespunzător, deoerece unii germeni au fost apreciați ca și Gram-variabili, s-a efectuat testul cu KOH 3% pentru diferențierea bacteriilor Gram-pozitive de cele Gram-negative, conform protocolului descris în subcapitolul 5.1.2.1.3.

Configurația microflorei psihrotrofe a fost determinată prin efectuarea testelor de confirmare biochimice (cu ajutorul kiturilor API), a coloniilor izolate de pe mediul SI și a mediilor selective pentru Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp., Yersinia spp. și grupa bacteriilor acido-lactice.

În urma prelucrării rezultatelor obținute pentru unitatea A, am constatat că microflora bacteriană de la suprafața carcaselor calde de porcine este heterogenă, fiind alcătuită atât din specii Gram pozitive cât și Gram negative. Microorganismele Gram pozitive au totuși o pondere ușor mai crescută (55.69%), comparativ cu cele Gram negative, fiind reprezentate de stafilococi (15.98%), micrococi (13.24%), streptococi (12.78%) și bacili Gram pozitivi neidentificați (13.69%). Identificarea speciilor Gram pozitive s-a efectuat pe baza examenului bacterioscopic, a testului cu KOH 3%, catalazei și oxidazei.

În ceea ce privește microflora Gram negativă, am constatat că predomină germenii din genul Pseudomonas (16.42%), urmați de reprezentanți din familia Enterobacteriaceae (15.49%), genul Acinetobacter (6.84%), respectiv Moraxella (4.10%), după cum se poate observa în graficul din fig. 48.

Dintre reprezentanții familiei Enterobacteriaceae, au fost identificați, pe baza testelor API 20 E, următoarele specii: E. coli (1.36%), Proteus vulgaris (1.82%), Citrobacter freundii (2.28%), Hafnia alvei (4.83%), Yersinia frederiksenii (5.93%). Dintre acestea, ultimele două specii fac parte din categoria germenilor psihrotrofi ai familiei Enterobacteriaceae implicați frecvent în declanșarea proceselor alterative a cărnii, la nivele de contaminare cuprinse între 106–107 ufc/cm2 (Gram et al., 1999). Probleme de sănătate pot fi determinate de către E. coli, care au tulpini patogene pentru om. În ceea ce privește germenii din genul Yersinia, nu s-au identificat germeni patogeni ci doar specii nepatogene pentru om, implicate însă în declanșarea proceselor alterative ale cărnii, cum sunt Y. ruckeri, respectiv Y. kristersenii (Feng P., 1994; Nesbakken T., 2000).

Configurația microbiană evidențiată la suprafața carcaselor calde din unitatea B este oarecum asemănătoare cu cea descrisă pentru unitatea A, fiind reprezentată de specii bacteriene diverse, atât Gram pozitive cât și Gram negative. S-a constatat că germenii Gram pozitivi au o pondere ușor mai mare (56.36%), în timp ce dintre germenii Gram negativi au predominat germenii din genul Pseudomonas (16.42%), Yersinia (6.6%), Moraxella (5.28%) și Acinetobacter (3.96%) (fig. 49). Ca și în cazul unității A, germenii din genul Aeromonas au avut o pondere scăzută (3.64%), din care A. hydrophila (3.52%), specie cu potențial patogen, incriminată uneori în declanșarea toxiinfecțiilor alimentare.

Studii efectuate de Zweifel et al. (2005), au pus în evidență la suprafața carcaselor calde de porcine din cinci unități de sacrificare o prevalență a germenilor din familia Enterobacteriaceae cuprinsă între 4% și 43%, ceea ce demonstrează diferențe majore în ceea ce privește modul de respectare a bunelor practici de lucru (GMP), respectiv bune practici de igienă (GHP). De asemenea, studiile efectuate de Mayr et al. (2003), au stabilit că microflora Gram negativă este dominantă de germenii din genul Pseudomonas și reprezentanți ai familiei Enterobacteriaceae, aspecte asemănătoare cu cele obținute în studiul nostru.

5.2.3.2. Aprecierea încărcăturii și configurația microbiene

din profunzimea carcaselor calde de porcine

Încărcătura microbiană din profunzimea carcaselor, din cele 36 probe recoltate din unitatea A, a relevat că un număr de 30 au fost negative (83.33%), iar pentru 6 probe, încărcătura microbiană medie a avut valori cuprinse între 2.03±.0.15 log ufc/g, în trim. I și 2.16±0.20 log ufc/g în trim. II, valorile obținute încadrându-se în limita maximă recomandată (fig. 50).

Media încărcăturii cu germeni pentru probele prelevate din unitatea B a fost cuprinsă între 2.2±0.20 log ufc/g în trim. I și 2.26±0.32 log ufc/g în trim. IV, 27 probe fiind negative (75%), iar 6 dintre ele au depășit limita recomandată de 2.2 log ufc/g (16.66%).

Germenii din genurile Pseudomonas, Aeromonas, Yersinia, grupul bacteriilor acido-lactice si reprezentanții familiei Enterobacteriaceae nu au fost identificați, atât din probele recoltate din unitatea A, cât și din unitatea B.

5.2.3.3. Aprecierea încărcăturii și configurației microbiene la suprafața

carcaselor refrigerate de porcine, în spațiile de răcire ale unităților de sacrificare

Așa cum am menționat anterior, materialul luat în studiu a fost recoltat în perioada ianuarie-decembrie 2004, de la două unități de sacrificare din județul Cluj (A și B), fiind reprezentat de 72 probe carne de porcine, carcasele fiind depozitate în spațiile de refrigerare ale abatorului (48 ore). După prelucrarea datelor, am constatat că încărcătura microbiană de la suprafața carcaselor refrigerate de porcine a prezentat valori diferite, mai scăzute în cursul trimestrelor I și IV, asociate și cu temperaturile din spațiile de refrigerare ale unităților de sacrificare A și B. Încărcătura microbiană medie totală pentru probele prelevate din unitatea A au fost curpinse în intervalul 3.86±0.59 log ufc/cm2 în trim. I și 6.01±0.30 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 3.33±0.20 log ufc/cm2 în luna ianuarie și 6.26±0.23 log ufc/cm2 în luna iulie (fig. 51). Din totalul probelor examinate, 8 au depășit limita maxim recomandată de 6.0 log ufc/cm2 (22.22%).

În privința unității B, din analizarea rezultatelor s-a constatat că media încărcaturii de germeni a fost mai ridicată decât în cazul unității A (p=0.02), ceea ce denotă condiții de igienă și practici de lucru mai precare, fiind cuprinsă între 5.64±0.41 log ufc/cm2 în trim. I și 6.05±0.30 log ufc/cm2 în trim. III, cu valori minime de 5.3±0.26 log ufc/cm2 în luna februarie și 6.46±0.30 log ufc/cm2 în luna iulie (fig. 46). După cum se poate constata, valorile încărcăturii microbiene au fost mai crescute în cursul lunilor de vară și mai scăzute în perioada toamnă-iarnă, corelate cu temperatura din spațiile de refrigerare ale unitătilor de sacrificare, datorită faptului că sistemele de răcire nu asigurau temperatura de 0-4ºC, decât atunci când temperatura mediul ambiant era mai scăzută.

Studii efectuate de Pinto (2004), privind nivelul contaminării la suprafața carcaselor refrigerate de porcine, au relevat încărcături medii de 3.82±0 log ufc/cm2 în unități de sacrificare porcine de medie capacitate. De asemena Gill et al., (1992; 2000), a pus în evidența nivele ale încărcăturii medii totale cuprinse între 1.9–3.8 log ufc/cm2, în funcție de unitatea de sacrificare iar Rho et al. (2001), a stabilit că după 24 ore de refrigerare nivelul mediu total de germeni are valori de 3.0 log ufc/cm2, valori semnificativ mai scazute decât cele obținute de către noi, care nu fac altceva decât să sublinieze importanța respectării normelor de igienă în unitățile de sacrificare. Aspectele morfologice observate pe mediul SI, după incubare timp de 24–48 ore la temperatura de 20ºC, au permis diferențierea coloniilor, după cum urmeazã:

colonii de culoare galbenă, opace, lucioase, cu margini regulate.

colonii de culoare bej, opace, lucioase, aplatizate cu diametrul de 3-4 mm.

colonii de culoare galben-portocaliu, opace, bombate, lucioase, margini regulate cu dimensiuni de 2–3 mm diametru.

Pe mediul selectiv GSP agar (Pseudomonas-Aeromonas), în urma însămânțării și incubării la temperatura de 20ºC timp de 24–48h s-a observat prezența unor colonii de culoare roz, bombate, cu margini regulate, opace, lucioase, de aproximativ 1–3 mm diametru considerate specifice pentru genul Pseudomonas (fig. 4, pag. 78).

De asemenea, în cazul a 21 probe, 9 pentru unitatea A și 12 pentru unitatea B, din cele 72 examinate, am observat și apariția unor colonii de culoare galbenă, bombate, opace, lucioase, cu margini regulate considerate specifice pentru genul Aeromonas (fig. 1, pag. 100). Încărcătura medie cu germeni din genul Pseudomonas în cazul probelor prelevate din unitatea A a fost cuprinsă între 3.12±0.48 log ufc/cm2 în trim. I și 5.11±0.97 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 2.63±0.15 log ufc/cm2 în luna ianuarie și maximă de 6.13±0.11 log ufc/cm2 în luna iulie, constatându-se depășirea limitei maxime recomandate la doar 2 probe (5.55%).

Pentru probele prelevate din unitatea B, nivelul mediu de contaminare cu germeni din genul Pseudomonas s-a situat între 3.77±0.48 log ufc/cm2 în trim. I și 5.6±0.61 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 3.1±0.15 log ufc/cm2 în luna ianuarie și maximă de 6.06±0.15 log ufc/cm2 în luna iulie, 4 dintre probe (11.11%) depășind limita maximă recomandată (fig. 52). Nivelul de contaminare în cele două unități nu a prezentat diferențe semnificative (p≥0.05) fiind variabil, dependent de condițiile de microclimat din abator, precum și de respectarea normelor de igienă. Liu et al. (2006), într-un studiu privind interacțiunile dintre microorganisme la nivelul carcaselor de porcine a pus în evidență nivele ale încărcăturii cu pseudomonade mai scăzute decât cele privind interacțiunile dintre microorganisme la nivelul carcaselor de porcine a pus în evidență nivele ale încărcăturii cu pseudomonade mai scăzute decât cele obținute în studiul nostru, de 2.65 log ufc/cm2 la 12 ore de la sacrificare. De asemenea, Mayr et al. (2003), a pus în evidență o încărcătură de pseudomonade de 3.91±0.14 log ufc/cm2 la 24 ore de la sacrificare.

Încărcătura medie cu germeni din genul Aeromonas a fost scăzută, fiind de 2.42±0.41 log ufc/cm2 în trim II, pentru probele prelevate din unitatea A și de 3.12±0.15 log ufc/cm2 în trim. II, respectiv 3.93±0.11 log ufc/cm2 în trim. III în cazul probelor recoltate din unitatea B,

între cele două unități nefind diferente semnificative (p=0.37) (fig. 53). Aceste rezultate sunt asemănătoare cu cele obținute de Gill et al. (1999), care a relevat valori la suprafața carcaselor de porcine refrigerate cuprinse între 2.5–3.26 log ufc/cm2.

Pentru izolarea și identificarea germenilor din genul Yersinia s-au făcut însămânțări pe mediul selectiv CIN agar, observându-se, după 24h de incubare la temperatura de 20ºC, apariția unor colonii circulare, cu centrul roșu și inel de culoare cenușiu–albicios, bombate, lucioase de 2–4 mm diametru, și a unor colonii circulare cu centrul roz pal bombate, lucioase de 2–4 mm diametru, considerate a fi specifice pentru Yersinia spp., în cazul a 17 probe prelevate din unitatea A și 18 din unitatea B (fig. 9, pag. 108). După cum se poate observa in graficul din fig. 54, la suprafața carcaselor din unitatea A, nivelul mediu al încărcăturii cu germeni din genul Yersinia a avut valori cuprinse între 3,86±0,37 log ufc/cm2 în trim. II și 4.18±0,81 log ufc/cm2 în trim. III, cu valori minime de 3,3±2,89 log ufc/cm2 în luna septembrie și maxime de 4,9±0,1 log ufc/cm2 în luna august, 47.22% din probe fiind pozitive. Între cele două unități nu s-au înregistrat diferențe semnificative în privința încărcăturii de germeni (p=0.58), deși în unitatea B încărcătura numărul de yersinii a fost mai crescut, fiind cuprins intre 5.01±0.05 log ufc/cm2 în trim. II și 5.14±0.03 log ufc/cm2 în trim III, 50% din probe examinate fiind pozitive.

Grupa bacteriilor acido-lactice a fost pusă în evidență prin însămânțare pe mediul selectiv pentru lactobacili (MRS agar), observându-se, în cazul a 8 probe, 3 pentru unitatea A și 5 pentru unitatea B, dezvoltarea coloniilor caracteristice de culoare alb-cenușie, opace, lucioase, bombate, cu margini regulate, de 1–2 mm diametru. În cazul probelor prelevate din unitatea A încărcătura medie cu bacterii acido-lactice a fost de 2.4±0.5 log ufc/cm2 în trim. II, iar în unitatea B de 4.0±0.16 log ufc/cm2 în trim. II și 4.16±0.15 log ufc/cm2 în trim. III (fig. 55). Rezultatele privind nivelul contaminării cu bacteriii acidolactice sunt asemănătoare cu cele obținute de Koutsoumanis et al. (2006), care a relevat nivele de 4.0 log ufc/cm2, însă mai crescute decât cele obținute de Liu et al. (2006), care a obținut valori de 1.14±1.50 log ufc/cm2, aspecte din care rezultă că există diferențe mari între diferitele unități de sacrificare, datorită diferențelor în ceea ce privește aplicarea bunelor practice de lucru și igienă (GMP, GHP).

Germenii din familia Enterobacteriaceae au fost identificați prin utilizarea mediiilor CMV enteric agar, respectiv VRBD (Merck). Din analizarea rezultatelor obținute în unitatea A, a reieșit faptul că nivelul mediu de contaminare cu Enterobacteriaceae a fost cuprins între 1.95±0.57 log ufc/cm2 în trim. I și 3.26±0.11 log ufc/cm2 în trim. III, constatându-se că din totalul probelor examinate, 24 au fost pozitive (66.67%), iar 9 au prezentat depășiri ale limitei maxime admise (3.0 log ufc/cm2). Nivelul mediu al încărcărcăturii cu Enterobacteriaceae în cazul unității B s-a încadrat între 2.4±0.2 log ufc/cm2 în trim. I și 3.58±0.13 log ufc/cm2 în trim. III, cu o valoare minimă de 2.33±0.41 log ufc/cm2 în luna decembrie și maximă de 4.73±.030 log ufc/cm2 în luna iulie (fig. 56).

Între cele două unități nu s-au evidențiat deferențe semnificative (p≥0.05), deși nivelul de contaminare a prezentat valori ușor mai crescute în unitatea B, la care s-au constatat 30 probe pozitive (83.33%), din care 14 au avut valori peste limita admisă (38.89%). Încărcătura cu Enterobacteriaceae pusă în evidență la suprafața carcaselor de porcine din unitatea A este asemănătoare cu cea stabilită de Mayr et al. (2003), Koutsoumanis et al. (2006), care au relevant valori cuprinse între 3.2 log ufc/cm2, respectiv 3.4 log ufc/cm2, însă mult mai crescută decât cea semnalată de Zweifel et al. (2005) la suprafața carcaselor de porcine refrigerate (max. 2.2 log ufc/cm2). De asemenea nivelul crescut al prevalenței germenilor din familia Enterobacteriaceae (66.67% în unitatea A și 88.33% în unitatea B), comparativ cu cel pus în evidență de Zweifel et al. (2005), cuprins între 4% și 41.3%, denotă diferențe majore în privința modului de respectare a normelor de igienă, respectiv a practicilor lucru în unitățile luate în studiu. Comparând rezultatele obținute în privința încărcăturii de germeni de la suprafața carcaselor de porcine calde cu cele de la suprafața carcaselor refrigerate din unitatea A prin analiza varianței unifactoriale (ANOVA) și a testului specific de comparație a două sau mai multe medii independente, s-au confirmat diferențe foarte semnificativ statistic (p≤0.001), în cazul reprezentanților din familia Enterobacteriaceae, diferențe distinct semnificativ statistic (p≤0.01), în ceea ce privește încărcătura totală de germeni psihrotrofi și a germenilor genul Pseudomonas, semnificative (p≤0.05), pentru germenii din genul Yersinia și nesemnificative (p≥0.05), pentru cei din genul Aeromonas (tab. 9).

Tabel 9

Semnificația statistică a diferențelor calculate între încărcătura cu germeni

psihrotrofi de la suprafața carcaselor calde de porcine comparativ

suprafața carcaselor refrigerate din unitatea A

Statistical semnification of calculated differences between psychrotrophic

plate count from the surface of warm pork carcasses compared with the

surface of refrigerated pork carcasses in A slaughterhouse

Tabel 10

Semnificația statistică a diferențelor calculate între încărcătura cu germeni

psihrotrofi de la suprafața carcaselor calde de porcine comparativ

suprafața carcaselor refrigerate din unitatea B

Statistical semnification of calculated differences between psychrotrophic

plate count from the surface of warm pork carcasses compared with the

surface of refrigerated pork carcasses in B slaughterhouse

În cazul unității B, s-au confirmat diferențe foarte semnificativ statistic (p≤0.001), în privința numărului total de germeni și reprezentanților din familia Enterobacteriaceae, diferențe distinct semnificativ statistic (p≤0.01), pentru germenii genului Aeromonas, semnificative statistic (p≤0.05), pentru germenii din genul Yersinia și nesemnificative (p≥0.05), în cazul celor din genul Pseudomonas (tab. 10).

Pentru bacteriile acido-lactice nu s-au efectuat calculele statistice deoarce în cazul probelor provenite de la carcase calde nu s-au pus în evidență aceste microorganisme. Aceste rezultate nu fac decât să confirme faptul că în condițiile păstrării carcaselor la temperaturi de refrigerare, în mediu aerob, germenii psihrotrofi vor deveni în scurt timp microflora predominantă, ajungând la nivele de contaminare crescute (6.0-7.0 log ufc/cm2), determinând apariția proceselor alterative la suprafața cărnii.

Confirmare morfologică și biochimică

Pentru stabilirea caracterelor morfologice ale microorganismelor, s-au efectuat examene bacterioscopice din coloniile dezvoltate pe mediile selective, frotiurile fiind colorate prin metoda Gram. Configurația microflorei a fost determinată prin efectuarea testelor de confirmare biochimice a coloniilor izolate de pe mediul SI și a mediilor selective pentru genurile Pseudomonas, Aeromonas, Campylobacter, Yersinia cu ajutorul kiturilor API 20E, respectiv 20 NE.

Pe baza prelucrării rezultatelor obținute în unitatea A, am constatat că microflora de la suprafața carcaselor de porcine refrigerate este foarte heterogenă, constituită atât din germeni Gram pozitivi (27.10%), cât și din germeni Gram negativi (72.90%) (fig. 57). Ca urmare a păstrării carcaselor la temperatura de refrigerare, a avut loc o schimbare a proporției în privința microflorei cărnii, astfel că dacă în cazul carcaselor calde incidența germenilor Gram pozitivi a fost mai ușor mai crescută, după 48 ore la temperatura de 4—6ºC, germenii Gram negativi predomină, în principal datorită dezvoltării microflorei psihrotrofe, capabile de creștere și multiplicare în aceste condiții.

Microflora Gram pozitivă a prezentat o evoluție descrescătoare, fiind reprezentată de germeni din genurile: Staphylococcus (8.55%), Micrococcus (6.41%), Streptococcus (4.27%) și Lactobacillus (1.46%), în timp ce microflora Gram negativă a prezentat o incidență mai crescută, fiind constituită din următoarele genuri: Pseudomonas (23.93%), Acinetobacter (9.4%), Moraxella (7.69%), Yersinia (7.26%), Serratia (6.35%), Hafnia (4.27%), Aeromonas (3.84%), Shewanella (3.42%), Escherichia (2.99%), Proteus (1.79%) și Enterobacter (2.14%). Ca urmare, putem afirma că microflora de la suprafața carcaselor refrigerate de porcine este dominată de germenii psihrotrofi (68.12% și 13 specii identificate), din care cea mai mare pondere o au cei din genul Pseudomonas. Ca urmare a prezenței acestor microorganisme cu potențial crescut de alterare, în principal proteolitic, și a numărului mare de germeni/cm2, procesele de alterare vor debuta rapid la suprafața carcaselor, cu apariția modificărilor de miros, culoare și consistență, ceea ce va duce la retragerea carcaselor din consum, probabil chiar în durata limită de consum a acestora (10 zile).

Rezultate asemănătoare s-au obținut și în cazul probelor prelevate din unitatea B, unde s-a constatat că microflora Gram negativă este dominantă (74.99%), fiind reprezentată de germeni din genurile Pseudomonas (26.30%), Yersinia (7.65%), Moraxella (6.47%), Aeromonas (5.17%), Shewanella (4.74%), Acinetobacter (4.31%), Serratia (6.35%), Hafnia (4.27%), Escherichia (2.59%), Proteus (2.59%) și Enterobacter (1.72%), (fig. 54). Ca și în cazul unității A, microflora psihrotrofă este dominantă (69.81%, 11 specii identificate), iar germenii din genul Pseudomonas au ponderea cea mai crescută (26.30%). De asemenea, am constatat că reprezentanții psihrotrofi ai familiei Enterobacteriaceae au pondere crescută (23.44% în unitatea A și 20.68% în unitatea B). Predominarea germenilor de alterare Gram negativi, în condițiile de păstrare a carcaselor la temperaturi de refrigerare, în mediu aerob, este explicat și de faptul că aceștia au o durata mult mai scurtă a fazei lag decât germenii Gram pozitivi (Upmann et al., 2000).

Aceste rezultate sunt în concordanță cu alte studii care au relevat că germenii din genul Pseudomonas au ponderea cea mai crescută, aceștia ajungând la proporții de până la 40% în primele 48-72 ore de la sacrificare (Gill, 1986; Dainty și Mackey, 1992; Borch et al. 1996; Nychas et al., 1998; Lacroix et al., 2000; Ellis et Goodacre, 2001; Mayr et al., 2003 a,b). În ceea ce privește configurația microbiana a carcaselor de porcine refrigerate, studiile efectuate de Liu et al. (2006) privind modificările configurației microbiene la nivelul carcaselor de porcine refrigerate au relevat prezența a 9 specii, aparținând următoarelor genuri: Staphylococcus, Lactobacillus, Brochotrix, Arthrobacter, Enterococcus, Acinetobacter, Moraxella, Aeromona și Pseudomonas. Pe baza acestor rezultate putem aprecia că microflora de la nivelul carcaselor de porcine refrigerate este variată, fiind dependentă de o serie de factori, cum ar fi: microflora inițială a carcaselor, modul de respectare a codului de bune practici de lucru și igienă, condițiile de microclimat din unitățile de sacrificare precum și modul de păstarare a carcaselor pe durata duratei limită de consum.

Interpretarea statistică a rezultatelor comparative privind incidența germenilor psihrotrofi la suprafața carcaselor de porcine refrigerate și calde din unitatea A, prin analiza varianței unifactoriale cu ajutorul testului statistic ANOVA și a testului specific de comparație a două sau mai multe medii independente, Bonferroni, confirmă diferențe foarte semnificative statistic (p≤0,001), în cazul bacteriilor Gram pozitive, Gram negative, a germenilor din genurile Moraxella, Acinetobacter și reprezentanților psihrotrofi din familia Enterobacteriaceae, distinct semnificative (p≤0.01), în cazul germenilor din genul Pseudomonas și semnificative (p≤0.05), pentru germenii din genurile Yersinia și Aeromonas (tab. 11).

Tabel 11

Semnificația statistică a diferențelor calculate privind incidența germenilor

psihrotrofi de la suprafața carcaselor calde de porcine comparativ

cu cele de la suprafața carcaselor refrigerate de porcine din unitatea A

Statistical semnification of calculated differences between psychrotrophic

plate count from the surface of warm pork carcasses compared with the

surface of refrigerated pork carcasses in A slaughterhouse

Tabel 12

Semnificația statistică a diferențelor calculate privind incidența germenilor

psihrotrofi de la suprafața carcaselor calde de porcine comparativ

cu cele de la suprafața carcaselor refrigerate de porcine din unitatea B

Statistical semnification of calculated differences between psychrotrophic

plate count from the surface of warm pork carcasses compared with the

surface of refrigerated pork carcasses in B slaughterhouse

Rezultate asemănătoare s-au obținut și în ceea ce privește analiza comparativă între incidența configurației microbiene a carcaselor refrigerate și calde din unitatea B, care au confirmat diferențe foarte semnificative statistic (p≤0,001), în cazul bacteriilor Gram pozitive, Gram negative, a germenilor din genurile Pseudomonas și reprezentanților psihrotrofi din familia Enterobacteriaceae, distinct semnificative (p≤0.01), în cazul germenilor din genul Moraxella și Yersinia, semnificative (p≤0.05), pentru germenii din genul Acinetobacter și nesemnificative (p≥0.05) în cazul celor din genul Aeromonas (tab. 12).

5.2.3.4. Aprecierea încărcăturii microbiene din profunzimea carcasele

refrigerate de porcine, în spațiile de răcire ale unităților de sacrificare

Din analizarea rezultatelor privind încărcătura microbiană din profunzimea carcaselor din unitatea A, s-a constatat că din cele 36 probe analizate 15 au fost negative (41.67%), iar restul au prezentat valori medii cuprinse între 2.23±0.15 log ufc/g în trim. I și 3.33±0.20 log ufc/g în trim. II, cu o valoare minimă de 1.96±0.15 log ufc/g în luna septembrie și maximă de 3.06±0.05 log ufc/g în luna august, 8 probe depășind limita maximă recomandată (fig. 55) (Gill și Penny, 1979; Shank et al., 1962).

Încărcătura microbiană din profunzimea carcaselor refrigerate de porcine din unitatea B a fost mai crescută comparativ cu cea înregistrată în unitatea A (p≤0.05), valorile medii fiind cuprinse între 2.08±0.01 log ufc/g în trim. I și 3.50±0.31 log ufc/g în trim. III, cu un minim de 2.06±0.15 log ufc/g în luna februari și maxim de 3.8±0.1log ufc/g în luna august. Din totalul probelor examinate, 10 au fost negative (27.78%), și 20 au prezentat valori ale încărcăturii mai crescute (55.56%), decât limita maxim recomandată (fig. 59). Se poate constata că valorile cele mai crescute au fost înregistrate în perioada din trimestrele II și III, corelate cu valorile mai crescute ale temperaturii din spațiile de refrigerare, ca urmare a funcționării deficitare a instalației de răcire. Germenii din genul Pseudomonas au fost identificați numai în cazul a 3 probe (8.33%) provenite din profunzimea carcaselor din unitatea B, nivelul mediu al contaminării fiind de 3.1±0.52 lof ufc/g în trim. II, toate probele depășind limita maximă recomandată.

Germenii din genul Yersinia au fost identificați numai din două probe (5.56%) prelevate din unitatea A, încărcătura medie fiind de 2.1±1.82 log ufc/g în trim. I, iar cei din genul Aeromonas și bacteriile acidolactice nu au fost identificați din probele prelevate din unitățile luate în studiu.

Enterobacteriaceaele au fost identificate în 6 probe prelevate din unitatea A (16.67%), încărcătura medie fiind de 1.58±0.16 log ufc/g în trim. II, în timp ce în unitatea B au fost identificate din 15 probe (41.67%), nivelul contaminării fiind cuprins în intervalul 2.06±0.20 lof ufc/g în trim. I și 2.46±0.11 log ufc/g în trim. III. Deși nivelul încărcăturii cu Enterobacteriaceae este relativ scăzut, în profunzimea carcaselor nu trebuia să fie identificate aceste microorganisme, fapt care demonstrează condiții precare de igienă și tehnici de procesare a carcasei deficitare, mai ales în cursul etapelor de eviscerare și despicare a carcasei. Din observațiile efectuate în unitățile de sacrificare studiate am constatat că nu erau aplicate ligaturi la nivelul cardiei, respectiv nu s-a protejat anusul prin intermediul unei pungi de plastic, în vederea reducerii contaminării carcasei cu germeni de la nivelul tubului digestiv, iar operațiile de igienizare a instrumentarului și mâinilor operatorilor n-au fost efectuate corespunzător.

5.2.3.5. Evaluarea în dinamică a încărcăturii microbiene psihrotrofe

la nivelul carcaselor de porcine refrigerate

În scopul aprecierii în dinamică a încărcăturii și configurației microbiene la nivelul carcaselor de porcine, au fost recoltate probe de carne, de la suprafață conform următorului protocol: imediat după sacrificare, la 24 ore, 96 ore (4 zile), 216 ore (9 zile) și 312 ore (13 zile). În vederea interpretării cât mai corecte a rezultatelor, din fiecare unitate s-au recoltate câte 3 probe pentru fiecare interval de timp, valoarea luată în lucru fiind reprezentată de media celor trei determinări. Ca și în cazul probelor prelucrate de la bovine, am apreciat configurația în dinamică pe o durată mai extinsă decât durata limită de consum a semi-carcaselor de porcine, cu scopul de a stabili dacă nivelul de contaminare se încadrează în limitele recomandate, respectiv maxim admise în acest interval de timp sau și după acesta.

Din analizarea rezultatelor obținute pentru probele prelevate din unitatea A s-a constatat în privința numărului total de germeni o evoluție ascendentă uniformă, începând de la valoarea de 4.43±0.40 log ufc/cm2 imediat după sacrificare, până la o încărcătură de 8.46±0.30 log ufc/cm2 în a 13-a zi, limita maximă recomandată fiind depășită în ziua 8-a, cu două zile înainte de expirarea duratei limită de consum a carcaselor (fig. 61). Germenii din genul Pseudomonas au înregistrat aceeași tendință de creștere, observându-se imediat după sacrificare o valoare de 3.12±.01 log ufc/cm2, pentru ca în ziua a 13-a numărul acestora să ajungă la 7.13±0.30 log ufc/cm2. În schimb, germenii din genul Aeromonas au o evoluție ascendentă moderată de la 2.1±0.26 log ufc/cm2, imediat după sacrificare, până în ziua 9-a, când ajung la 3.93±0.30 log ufc/cm2 după care nivelul acestora scade, astfel ca în ultima zi a experimentului nu au mai fost identificați. O evoluție în dinamică asemănătoare s-a constatat și în cazul bacteriilor acido-lactice, care prezintă o creștere uniformă până în ziua 9-a, când atins 3.8±0.20 log ufc/cm2, după care scad constant până în ziua 13-a a experimentului.

Pentru germenii din genul Yersinia s-a evidențiat o tendință de ascendentă a încărcăturii microbiene, de la 3.06±0.25 log ufc/cm2 imediat după sacrificare, 60.6±0.20 log ufc/cm2 în ultima zi a experimentului. Și pentru germenii din familia Enterobacteriaceae s-a observat aceeași tendință de creștere uniformă, de la 2.0±0.1 log ufc/cm2 la 6.2±0.20 log ufc/cm2 în ultima zi a experimentului, limita maximă admisă fiind depășită în ziua 4-a.

Rezultatele în dinamică pentru probele prelevate de la suprafața carcaselor din unitatea B sunt oarecum asemănătoare cu cele din unitatea A, cu precizarea că germenii din genul Aeromonas și bacteriile acido-lactice prezintă o evoluție descendentă din ziua 5-a a experimentului, acestea nemafiind identificate în ziua 9-a. Limita maximă recomandată a fost depășită în cazul încărcaturii totale de germeni din ziua 7-a, iar enterobacteriaceaele au depășit limita maximă admisă din ziua 3-a (fig. 62). Ca urmare, putem aprecia că încărcătura microbiană din ultima zi a experimentului este influențată evident de nivelul inițial de contaminare. Cu cât acesta este mai crescut, cu atât limitele maxime recomandate, respectiv cea maxim admisă vor fi atinse într-o perioadă mai scurtă, determinând astfel apariția precoce a proceselor alterative, încă din durata limită de consum a cărnii. Rezultate similare au fost obținute de Mayr et al. (2003), în studii privind evoluția în dinamică a configurației microbiene a cărnii de porc pe o perioadă de 12 zile, care a evidențiat o evoluție ascendentă a încărcăturii totale de germeni, de la 4.8 log ufc/cm2 după sacrificare la 8.5 log ufc/cm2 în ziaua 12-a. O evoluție asemnănătoare au prezentat și și germenii din genul Pseudomonas, care de la 4.5 log ufc/cm2 au ajuns la finalul experimentului la 8.36 log ufc/cm2. Germenii din familia Enterobacteriaceae au prezentat o evoluție ascendentă uniformă, de la valori de 3.7 log ufc/cm2 după sacrificare până la 6.43 log ufc/cm2. Bacteriile acido-lactice au prezentat o evoluție ascendentă moderată până în ziua 8-a, de la 3.6 log ufc/cm2 la 4.4 log ufc/cm2, după care au scazut la 3.7 log ufc/cm2 în ziua 12-a a experimentului. De asemenea, Liu et al. (2004), a evidențiat o evoluție ascendentă în privința încărcaturii totale de germeni, a germenilor din genul Pseudomonas și bacteriilor acido-lactice, care au atins după 15 zile valori de 6.47±0.495 log ufc/cm2, 7.271±0.467 log ufc/cm2, respectiv 4.893±0.294 log ufc/cm2. Evoluția în dinamică a microorganismelor de la suprafața carcaselor de porcine a constituit unul dintre obiectivele importante urmărite de diferite echipe de cercetători, rezultatele obținute menționând același aspect: majoritatea speciilor bacteriene prezintă o evoluție ascendentă, mai mult sau mai puțin evidentă, în funcție de nivelul inițial al contaminării și de interralațiile dintre acestea (Gill, 1986; Dainty et Mackey, 1992; Jay, 1996; Sorheim et al., 1999; Lacroix et al., 2000; Mano et al., 2000; Tsigarida et al., 2000; Nissen et al., 2001; Blixt et Borch, 2002).

Concomitent cu efectuarea determinărilor microbiologice, s-au efectuat examene organoleptice ale eșantioanelor de carne constatându-se următoarele aspecte: proba de carne în momentul recoltării a prezentat caracteristici senzoriale corespunzătoare stării de carne proaspătă, primele modificări organoleptice apărând din ziua 8-a de la recoltare, când s-a observat o ușoară decolorare a cărnii la suprafață, din ziua 9-a s-a constat apariția unor zone de culoare cenușiu-roșietice, care alternează cu zone de culoare roșie-vișinie, cu suprafața ușor uscată și evidențierea unui miros neplăcut, de stătut, la 11 zile suprafața cărnii este acoperită cu o peliculă subțire de mâzgă cenușiu, cu miros neplăcut, ușor putrific iar în profunzime culoarea cărnii este roșie-cenușie; la 13 zile stratul de mâzgă de pe suprafața cărnii este evident, de culoare cenușiu-verzuie, cu miros puternic de alterare putrifică, iar în urma compresiunii, amprenta nu a revenit la forma inițială, modificările de culoare și miros fiind prezente și în profunzimea cărnii.

Coroborând rezultatele examenului bacteriologic cu cel al examenului senzorial, am apreciat că apariția mirosului străin de alterare putrifică s-a realizat la o încărcătură 7.0 log ufc/cm2, iar a stratului lipicios, de mâzgă, la o încărcătură de 8.23 ufc/cm2, rezultate comparabile cu cele din literatura de specialitate (Brown, 1982; Ayres, 1987; Dainty et al., 1992).

În vederea stabilirii unei corelații între examenul bacteriologic și cel bacterioscopic concomitent cu recoltarea probelor de carne s-au efectuat și amprente direct de la suprafața carcaselor, colorate prin metoda Gram. Rezultatul examenele bacterioscopice au fost negative în cazul probelor provenite imediat după sacrificare, la 24 și 120 ore (5 zile), fiind pozitive din ziua a 9-a, corelat și cu depăsirea limitei maxime recomandate, când s-au pus în evidență bacili Gram negativi (peste 30 bacili/câmp convențional, media a 10 câmpuri). Modificări marcante s-au evidentiat în frotiurile efectuate din probele prelevate în ziua a 13-a, când s-a pus în evidență o încărcătură foarte mare de bacili Gram negativi, cu rare formațiuni cocoide, precum și prezența unor formațiuni levurice, aspecte caracteristice stării de carne alterată, fapt de altfel confirmat de examenul organoleptic și bacteriologic descries anterior.

Din aspectele prezentate mai sus rezultă că pe măsură ce carcasele sunt depozitate perioade mai lungi de timp în spațiile de refrigerare, încărcătura bacteriană de la suprafața prezintă o evoluție ascendentă ajungând la valori ce depășesc valorile maxime admise. Nivelul de creștere al populației bacteriene și configurația germenilor psihrotrofi prezenți pe suprafața carcaselor de porcine este dependent de temperatura de refrigerare, umiditatea relativă spațiului de depozitare, dar și de perioada de timp în care acestea au fost depozitate în spațiile respective.

EVALUAREA RISCULUI MICROBIOLOGIC REPREZENTAT DE MICROFLORA PSIHROTROFĂ DIN UNELE PREPARATE DE CARNE DE BOVINE ȘI PORCINE

6.1.1. Obiective propuse

Preparatele din carne au o pondere importantă în alimentația populației din majoritatea țărilor. După I. Rășenescu și I. Oțel, (1988), preparatele din carne sunt produse alimentare obținute din prelucrarea cărnii, slăninii și subproduselor comestibile, cu adăugarea de substanțe adjuvante pentru gust, aromă, culoare, care favorizează legarea diverselor componente între ele și prelungesc astfel durata limită de consum. Ele se obțin fie din carne și subproduse tocate, introduse în membrane, purtând denumirea de mezeluri, cârnați sau salamuri, fie din anumite părți anatomice și organe netocate. Prin mezeluri, în sensul mai restrâns al cuvântului, după aceiași autori, ar trebui înțelese produsele fabricate din carne tocată și condimentată, introduse în membrane naturale sau artificiale și supuse unor prelucrări termice, putând fi folosite în alimentație ca atare, fără alte prelucrări culinare. În mod obișnuit sub această denumire ar trebui incluse numai prospăturile, preparate prin fierbere și afumare la cald sau numai prin fierbere. Termenul de salam definește preparatele din carne tocată de la diferite specii furnizoare de carne, sortiment unic sau în amestec, în care cele două componente principale sunt bradtul și șrotul, care sunt introduse după malaxare în membrane artificiale sau naturale. Din categoria celor mai consumate preparate din carne din grupa prospăturilor fac parte cremvurștii și parizerul, iar din categoria salamurilor, salamul cu șuncă Victoria reprezintă unul din sortimentele cele mai apreciate, fapt care ne-a determinat să le includem în cadrul cercetărilor din lucrarea de față (Banu și col. 2002; Rotaru și Mihaiu, 2004; Roth, 2004).

Datorită proceselor la care sunt supuse preparatele din carne de-a lungul fluxului tehnologic, acestea capătă o serie de proprietăți noi, ca urmare, procesele alterative debutează mai tardiv decât în cazul cărnii proaspete. Stabilitatea și siguranța lor se bazează pe interacțiunea microflorei proprii cu nutrienții și factorii de conservare, cum sunt temperatura de procesare și depozitare, activitatea apei (factorul aw), pH-ul, aditivii alimentari folosiți, modul de ambalare. În urma proceselor tehnologice o fracțiune importantă a microflorei inițiale va fi inactivată, o altă parte va fi inhibată și va permite dezvoltarea fracțiunii microbine care a supraviețuit. Dezvoltarea și activitatea metabolică a microflorei reziduale poate provoca alterarea alimentului, în timp ce multiplicarea sau doar supraviețuirea celei patogene poate cauza apariția îmbolnăvirilor la consumator (Brown, 2000). Ca urmare a faptului că procesele tehnologice la care sunt supuse preparatele de carne nu le conferă calitatea de produse sterilizate, este nevoie de păstrarea acestora în condiții de refrigerare, pentru a preveni sau a încetini procesele alterative, cauzate de microflora de alterare, și de a preveni dezvoltarea microorganismelor patogene (Day, 2000).

Aceste produse conțin o varietate de microorganisme, care pot proveni din diferite surse: de la nivelul carcasei sau semicarcasei animalelor furnizoare de carne, alcătuind microflora inițială sau ca urmare a contaminării materiei prime (bradt și șrot), în cursul etapelor de procesare și depozitare a preparatelor de carne. Reducerea nivelului de contaminare cu aceste microorganisme poate fi realizată doar prin respectarea unor măsuri, după cum urmează: o bună proiectare igienică a unității de procesare, implementarea și respectarea codul de bune practici de lucru și de igienă (GMP, GHP), a procedurilor de lucru standard pentru igienizare (SSOPs) și analiza riscurilor în punctele critice de control (HACCP).

Datorită faptului că din categoria preparatelor de carne care se păstrează la temperatura de refrigerare, cele mai frecvent consumate sunt parizerul, crenvurștii iar din categoria salamurilor, salamul cu șuncă, în cercetarea noastră am considerat oportun alegerea acestor sortimente de mezeluri. Pe baza acestor considerente, în studiul nostru am încercat să realizăm o evaluare privind gradul de contaminare microbiană cu germeni psihrotrofi de alterare și potențial patogeni implicați în procesele de alterare ale acestor preparate, după cum urmează: Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Moraxella spp., Aeromonas spp., Yersinia spp., bacterii acido-lactice etc., la nivelul unor preparate din carne, păstrate la temperaturi de refrigerare, produse în cadrul a două unități de procesare a cărnii de pe raza județului Cluj. Obiectivele propuse în cadrul acestui studiu sunt următoarele:

aprecierea încărcăturii și configurației microbiologice la produsul salam Victoria;

aprecierea încărcăturii și configurației microbiologice la produsul parizer extra;

aprecierea încărcăturii și configurației microbiologice la produsul crenvurști;

evaluarea în dinamică a încărcăturii și configurației microbiene pentru sortimentele de mezeluri luate în studiu;

evaluarea riscului microbiologic pentru microflora psihrotrofă cercetată.

6.1.2. Material și metodă

Materialul de cercetat a fost reprezentat de trei sortimente de preparate din carne, păstrate la temperaturi de refrigerare: crenvurști, parizer extra și salam cu șuncă Victoria, recoltate în intervalul ianuarie 2005–decembrie 2005 de la două unități de prelucrare a cărnii de pe raza județului Cluj, numite în continuare C și D. Din fiecare sortiment au fost recoltate lunar câte 4 probe (batoane), din loturi diferite, precum și din zile diferite ale săptămânii de lucru, astfel încât rezultatele acestei evaluări microbiologice să reflecte cât mai exact nivelul și configurația microbină existentă în produsele luate în studiu (Rotaru și col., 2006). Ca urmare, pentru fiecare sortiment au fost recoltate câte 48 probe, media încărcăturii lunare fiind reprezentat de media aritmetică a celor 4 probe individuale (total 288 probe). După prelevare, probele de cremvurști au fost introduse în plăci Petri sterile, cu diametrul de , iar batoanele de parizer și salam în pungi de plastic noi, fiind transportate în laboratorul disciplinei de Igiena Produselor de Origine Animală și Sănătate Publică din cadrul Facultății de Medicină Veterinară Cluj-Napoca, unde au fost introduse în lucru imediat. Prelucrarea probelor s-a efectuat în conformitate cu tehnicile de lucru descrise în subcapitlul 5.1.2.2 (pag. 73-75), iar rezultatele au fost exprimate și interpretate din punct de vedere statistic conform metodelor descrise în subcapitolul 5.1.2.3 (pag. 75-76), cu precizarea că media lunară a încărcăturii microbiene a fost reprezentată de media aritmetică, calculată în funcție de deviația standard a 4 probe.

6.1.3. Rezultate și discuții ale cercetărilor cu privire la microflora psihrotrofă

din produsul salam cu șuncă Victoria

Salamul cu șuncă Victoria este un produs obținut prin fierbere și afumare din carne de porc și slănină, introdus în membrane artificiale, necomestibile. Conform datelor menționate de producători pe etichetă, materia primă auxiliară este reprezentată de condimente, sare, conservant E250 (nitrit de sodiu), stabilizator E450 (difosfați), antioxidant E301 (ascorbat de sodiu), potențiator de gust E621 (glutamat monosodic), colorant E120 (carminal), proteină vegetală (soia). Produsul are un termen de valabilitate de 14 zile. Se prepară prin tocarea cărnii de porc prin sita cu ochiurile de . Pulpa de porc se curăță de grăsime și flaxuri, se taie în bucăți de circa 3-4 mm, se sărează cu amestec de sare (în proporție de 2,5 la carne) și se maturează timp de două zile. Bradtul se obține din carnea porc lucru, la care se adaugă polifosfații și amestecul de condimente, care se malaxează până la omogenizare. Umplerea membranelor se face cu ajutorul șprițului cu vacuum, având grijă să nu se formeze goluri în interiorul batoanelor, după care se leagă sau se clipsează. Zvântarea se efectuează la 50–60°C timp de 25–30 minute iar afumarea caldă se realizează la o temperatură de 75–85°C timp de 30 minute, când membranele capătă o culoare cărămizie-roșietică. Fierberea se face la temperatura de 72–75°C timp de 1,5–3 ore, în funcție de grosimea batoanelor până la în centrul batonului. Imediat după fierbere, batoanele de salam sunt răcite prin aspersare cu apă rece (Roth, 2004).

6.1.3.1. Aprecierea încărcăturii și configurației microbiologice

la produsul salam cu șuncă Victoria

Pentru determinarea încărcăturii totale de germeni s-a folosit mediul Standard I (Merck), plăcile fiind incubate la 20ºC timp de 24-48 ore, diferențiindu-se din punct de vedere morfologic următoarele tipuri de colonii:

colonii de culoare alb-cenușie, cu dimensiuni de 1–2 mm, margini regulate, netede, lucioase;

colonii cenușii, cu dimensiuni de 1–3 mm, margini regulate, plate, rugoase, opace;

colonii de culoare bej, cu dimensiuni de 2–3 mm, margini regulate, netede, lucioase;

colonii galbene, cu dimensiuni de 2–3 mm, margini regulate, netede, lucioase;

colonii portocalii, cu dimensiuni de 3–5 mm, margini regulate, netede, lucioase (fig. 11, pag. 84).

Încărcătura microbiană medie a probelor de salam Victoria prelevate din unitatea C, a fost variabilă, având valori cuprinse între 2.53±0.31log ufc/g în trim. I și 4.1±0.13 log ufc/g în trim. II, cu valori minime de 2.16±0.20 log ufc/g în luna februarie și maximă de 4.23±0.25 log ufc/g (fig. 67). Din totalul probelor analizate, 5 (10.42%), au prezentat depășiri ale limitei maxime recomandate stabilită la 4.0 log ufc/g. Precizăm faptul că legislația țării noastre, respectiv cea a UE, nu prevede, cel puțin deocamdată, determinarea numărului total de germeni pentru categoria de preparate de carne tratate termic. Această valoare a limitei maxime recomandate am întâlnit-o în unele studii care au vizat evaluarea încărcăturii și configurației microbiologice a preparatelor de carne supuse tratamentelor termice din categoria prospăturilor și semiafumatelor (Borch et al., 1991; Von Holy et al., 1991; Borch et al., 1996; Lee et al., 1997; Samelis și Georgiadou, 2000; Samelis et al., 2000). Mai mult, deoarece legislația actuală prevede că limita maximă a numărului total de germeni este de 104 ufc/g pentru preparatele pe bază de carne și organe (piftii, pate de carne și ficat), produse care se pot consuma ca atare, nefiind necesară o pregătire termică înainte de consum, am considerat că putem extrapola această valoare și în cazul produselor luate în studiul nostru, deoarece și acestea se pot consuma fără a fi necesară o pregătire termică suplimentară (Rotaru și col., 2006). De asemenea, în urma tratamentelor termice la care sunt supuse preparatele din carne, încărcătura de germeni scade de aproximativ 100 de ori (10 log), carnea refrigerata având limita maxim recomandată de 6.0 log ufc/cm2.

În cazul probelor prelevate din unitatea D, nivelul mediu al încărcăturii a fost cuprins între 2.36±0.14 log ufc/g în trim. I și 3.47±0.15 log ufc/g în trim. III, cu o valoare minimă de 2.2±0.26 log ufc/g în luna februarie și maximă de 3.76±0.57 log ufc/g în luna octombrie, 3 probe depășind limita maximă recomandată (6.25%).

Pentru identificarea germenilor din genurile Pseudomonas și Aeromonas s-a utilizat mediul selectiv GSP agar (Merck). După însămânțare și incubare la temperatura de 20ºC, am pus în evidență două tipuri de colonii (fig. 4, pag. 78):

colonii de culoare roz, cu o zonă de culoare roșie-violetă în jur, cu dimensiuni de 2–3 mm, margini regulate, netede, lucioase;

colonii roșii-violet, rugoase, cu dimensiuni de 2–3 mm, margini regulate.

Germenii din genul Aeromonas nu au fost identificați în probele de salam Victoria prelevate din ambele unități luate în studiu. Încărcătura microbiană medie pentru probele de salam Victoria din unitatea C cu germeni din genul Pseudomonas a fost variabilă, fiind cuprinsă între 1.45±0.12 log ufc/g în trim. IV și 2.96±0.25 log ufc/g în trim II, cu valori minime de 1.36±0.20 log ufc/g în luna decembrie și maxime de 3.2±0.1 log ufc/g în luna iunie. Din totalul probelor examinate, 9 (18.75%) au fost negative (fig. 68).

Aceste rezultate sunt comparabile cu cele obținute de Khalafalla et al. (1993), care au pus în evidență germeni din genul Pseudomonas, în preparate din carne tratate termic, nivelul mediu de contaminare fiind de 3.0 log ufc/g.

Pentru punerea în evidență a germenilor din genul Yersinia s-a utilizat mediul CIN (Merck), pe care, după incubare la 20ºC timp de 48 ore, nu s-au dezvoltat colonii specifice. Aceste rezultate confirmă cercetările lui Nesbakken et al., (2000), care precizează faptul că yersiniile sunt sensibile la temperatura de pasteurizare, fiind inactivate de tratamentele termice la care au fost supuse aceste preparate.

Germenii din familia Enterobacteriaceae au fost identificați cu ajutorul mediului VRBD (Merck), doar în cazul a 3 probe (6.25%) prelevate din unitatea C. Coloniile dezvoltate pe mediul VRBD agar, s-au diferențiat în 2 tipuri (fig. 18, pag. 88):

colonii de culoare violet, cu dimensiuni de 1–3 mm, margini regulate, netede, lucioase;

colonii de culoare violet, cu inel alb în jur, cu dimensiuni de 1–2 mm, margini regulate, netede, luciose.

Încărcătura microbiană medie cu Enterobacteriaceae în cazul salamului Victoria a fost relativ scăzută (2.2±0.26 log ufc/g), însă prezența acestor microorganisme în acest sortiment denotă fie un nivel crescut de contaminării a materie prime (carne), sau mai grav o contaminare în cursul procesului tehnologic prin intermediul operatorilor, purtători și eliminatori de enterobacterii (fig. 69). Alte studii care au vizat stabilirea încărcăturii cu Enterobacteriaceae din preparatele de carne tratate termic, au pus în evidență valori de 3.6 log ufc/g, valori asemănătoare cu cele obținute în studiul nostru (Jay et al, 1978; Khalafalla și El-Sherif, 1993; Khalafalla et al.,1993). În schimb Garcia et al. (2000), într-un studiu ce a vizat populația microbiană pentru șuncă, a evidențiat enterobacteriile doar în cazul produsului alterat, nivelul de contaminare fiind de 6.5 log ufc/g.

Pentru identificarea bacteriile acido-lactice s-a utilizat mediul MRS (Merck), însă după incubare la 20ºC, timp de 48 ore, în condiții de microaerofilie, nu s-au dezvoltat colonii specifice de lactobacili, ceea ce semnifică lipsa acestor bacterii din probele de salam Victoria prelucrate. Din datele preluate din literatura de specialitate, s-a constatat că aceste microorganisme preferă condiții de dezvoltare cu o concentrație scăzută de O2, cazul cărnii sau preparatelor din carne ambalate în vid (Prabhakar et al., 2000).

Din analiza rezultatelor prezentate mai sus, se poate afirma că în condițiile în care procesarea salamului Victoria a fost efectuată cu respectarea strictă a normelor de igienă de-a lungul întregului flux tehnologic, încărcătura microbiană a prezentat valori scăzute, situându-se sub nivelul maxim recomandat.

Confirmarea morfologică și biochimică

Pentru aprecierea caracterelor morfologice ale microorganismelor, s-au efectuat examene bacterioscopice din coloniile dezvoltate pe mediile selective, frotiurile fiind colorate prin metoda Gram. În cazul examenului bacterioscopic efectuat din coloniile galbene de pe mediul Standard I s-au pus în evidență coci grupați în ciorchine, caracteristic germenilor genului Staphylococcus (testul pentru oxidază a fost negativ, permițând diferențierea de bacteriile genului Micrococcus (fig. 13, pag. 85), iar din coloniile de culoare bej s-au evidențiat coci, grupați în tetrade, caracteristici germenilor din genul Micrococcus (fig. 12, pag. 85).

Din coloniile roz, netede de pe mediul GSP s-au evidențiat, în urma colorației Gram, germeni Gram-negativi, de formă bacilară, cu dimensiuni de aproximativ 1–4/0,5–1 μm, grupați în perechi sau izolați (fig.70).

Fig. 70 Aspecte caracteristice ale bacteriilor din genul Pseudomonas (col. Gram, x 1000)

Characteristical aspects of bacteria from Pseudomonas genus (Gram stain, x 1000)

Din coloniile bej-cenușiu s-au evidențiat formațiuni de formă cocobacilară, cu dimensiuni de aproximativ 1–2/1 μm, izolate sau grupate în perechi, care în urma testelor de confirmare biochimică (API 20NE), s-au dovedit a fi Acinetobacter calcoaceticus, var. lwofii (fig. 71).

Fig. 71 Aspecte caracteristice ale bacteriilor din genul Acinetobacter (col. Gram, x 1000)

Characteristical aspects of bacteria from Acinetobacter genus (Gram stain, x 1000)

Din analiza datelor obținute în urma examenelor de confirmare biochimică (teste API 20E, 20 NE), am constatat că în cazul probelor de salam Victoria provenite din unitatea C, configurația microflorei psihrotrofe este dominată de germenii Gram negativi (72.59%), din genurile Pseudomonas (51.32%), Moraxella (7.96%), Acinetobacter (6.19%) și reprezentanți psihrotrofi ai familiei Enterobacteriaceae (6.16%). Microorganismele Gram pozitive au o pondere mai redusă (27.41%), fiind reprezentați de germeni din genurile Staphylococcus (13.27%), Streptococcus (7.07%) și bacili Gram pozitivi neidentificați (7.07%) (fig. 68).

În unitatea D, incidența germenilor este asemănătoare cu cea prezentată în unitatea C, germenii Gram negativi fiind dominanți (77.86%), reprezentați în principal de germenii psihrotrofi din genul Pseudomonas (50.53%), (fig. 73).

Bacteriile Gram pozitive neidentificate, care pe baza examenului bacterioscopic s-au dovedit a avea formă bacilară, nu au fost ulterior identificate prin teste biochimice suplimentare, deoarece în studiul de față am urmărit identificarea germenilor psihrotrofi din preparatele de carne, reprezentați în principal de bacili Gram-negativi.

Rezultatele nostre sunt asemănătoare cu cele efectuate de către Gardner et al., (1983), pentru stabilirea configurației microbiene a unor preparate din carne tratate termic, care au pus în evidență că microflora acestora a fost foarte variată, fiind reprezentată de următoarele genuri: Micrococcus, Staphylococcus, Brochotrix, Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Aeromonas, Pseudomonas, Achromobacter și germeni psihrotrofi din familia Enterobacteriaceae.

6.1.3.2. Evaluarea în dinamică a încărcăturii microbiene psihrotrofe

pentru produsul salam cu șuncă Victoria

Pentru aprecierea încărcăturii microbiene în dinamică, probele de salam Victoria, recoltate în ziua obținerii de la unitatea producătoare, au fost păstrate timp de 14 zile (durata limită de consum), la temperatura de refrigerare. În vederea aprecierii încărcăturii și configurației microbiene în acest interval de timp, probele au fost prelucrate în ziua obținerii, la 24 ore, la 5 zile, la 9 zile, respectiv la 14 zi (în ultima zi a duratei limită de consum).

Din analiza rezultatelor s-a constatat, în privința numărului total de germeni psihrotrofi, o evoluție ascendentă, începând de la valoarea de 3.26±0.30 log ufc/g în ziua obținerii, până la o încărcătură de 5.86 log ufc/g în ultima zi a experimentului, limita maximă recomandată fiind depășită în ziua 8-a (fig. 74).

Aceeași tendință s-a pus în evidență și pentru germenii din genul Pseudomonas, care au înregistrat o evoluție ascendentă uniformă, în intervalul 1-9 zile, suprapusă cu cea a numărului total de germeni, pentru ca în ziua 14-a sa atingă valoarea de 5.46±0.41 log ufc/g (fig. 74). Germenii din familia Enterobacteriaceae au fost identificați doar în cazul probelor prelevate din unitatea C, prezentând în dinamică o tendință de creștere, de la 1.43±0.15 în ziua 0, la 4.8±.026 în ziua 14-a.

Din cercetările în dinamică efectuate de Gardner (1983), privind încărcătura și configurația microbiană pentru produsul bacon, într-un interval de 14 zile, a rezultat că încărcătura microbiană totală a atins la sfârșitul experimentului valori cuprinse între 6.0-7.0 log ufc/g, iar microflora a fost dominată de bacterii Gram pozitive, respectiv micrococi și stafilococi, aspecte diferite de cele obținute de noi în studiul nostru.

6.1.4. Rezultate și discuții ale cercetărilor cu privire la

microflora psihrotrofă din produsul parizer extra

Parizerul extra este un preparat din categoria prospăturilor, fabricat prin fierbere, din carne de porc, de vită și slănină, prezentându-se sub formă de batoane în membrană artificială necomestibilă. În conformitate cu datele menționate de producător pe etichetă, materiile auxiliare sunt reprezentate de condimente, sare, conservant E250 (nitrit de sodiu), stabilizator E450 (difosfați), antioxidant E300 (acid ascorbic), potențiator de gust E621 (glutamat monosodic), colorant E120 (carminal), proteină vegetală (texturat de soia). Termenul de valabilitate al produsului este de 14 zile. Bradtul folosit pentru producerea parizerului este obținut din carne refrigerată sau congelată, conservată prin sărare și maturare. Slănina moale conservată se toacă la Wolf prin sita cu ochiurile de 2–3 mm. Bradtul maturat și fabricat din carne rece se prelucrează în cutter împreună cu slănina tocată, până când se albește iar structura devine foarte fină. În timpul prelucrării în cutter se adaugă Staro P (mixtură de condimente și aditivi alimentari), condimentele și fulgii de gheață sau apa bine răcită pentru a preîntâmpina încălzirea pastei. Prelucrarea în cutter se consideră terminată când s-a obținut o pastă omogenă, cu aspect lucios și adezivă la mână. Membranele sunt umplute cu ajutorul șprițului cu vacuum, apoi se clipsează sau se leagă la celălalt capăt și se face un inel pentru înșirat pe bețe. Afumarea la cald se face numai când pasta a fost introdusă în membrane artificiale permeabile. Batoanele umplute în membrane poliamidice nu se pun la afumare caldă, ci se fierb direct în celulele cu abur la 80ºC. Se scade apoi temperatura la 73–75°C, temperatură la care se fierbe produsul timp de 1,5–3 ore în funcție de grosimea batoanelor, până când ajunge la 69–70°C în centrul produsului. Imediat după fierbere produsul se răcește prin aspersare de apă rece. Produsul gata răcit se înșiră pe bețe și se introduce în depozitul de preparate prospături la o temperatură de 3–5°C până când se livrează (Roth, 2004).

6.1.4.1. Aprecierea încărcăturii și configurației microbiologice

la produsul parizer extra

Încărcătura microbiană medie pentru probele de parizer prelevate din unitatea A, a fost în general scăzută, fiind cuprinsă între 2.26±0.14 în trim I și 3.2±0.14 log ufc/g în trim III, cu valori minime de 2.1±0.1 log ufc/g în luna februarie și maxime de 3.3±0.23 log ufc/g în luna octombrie, toate probele încadrându-se în limitele maxim recomandate (4.0 log ufc/g).

În unitatea D, deși nivelul de contaminare mediu este mai crescut comparativ cu cel înregistrat în unitatea C, între mediile valorilor încărcăturii totale de germeni din cele două unități nu s-au evidențiat diferențe semnificative statistic (p≥0.05). Ca și în cazul unității C, nivelul încărcăturii microbiene a fost relativ scăzut, nici una dintre probe nedepășind limitele maxime recomandate (fig. 76). Aceste diferențe dintre cele două unități pot avea diverse cauze: calitatea materiei prime utilizate, respectarea bunelor practici de lucru și igienă în fiecare etapă a fluxului tehnologic, precum și condițiile tehnologice din unitățile respective. Având în vedere că nivelul încărcăturii cu germeni este mai crescută în cursul trimestrelor II și III, putem face o corelație directă cu nivelul încărcăturii de germeni a cărnii refrigerate de bovine, ținând cont de faptul că ambele unități au procesat carcase de bovine din unitățile A și B, care au prezentat un univel al contaminării mai crescut în perioada mai caldă a anului (cap. 5).

Pe mediul selectiv GSP agar (Merck) s-au dezvoltat colonii de culoare roșu-violet, cu dimensiuni de 2–4 mm, margini regulate, netede, lucioase, doar în cazul a 5 probe, din cele 96 prelucrate din unitățile C și D. Încărcătura microbiană medie cu germeni din genul Pseudomonas, a fost scăzută atât în cazul probelor prelevate din unitatea C (2.14±0.25 log ufc/g), cât și în cazul probelor recoltate din unitatea D (2.7±0.62 log ufc/g), după cum se poate observa în fig. 77.

Germenii din genurile Aeromonas, Yersinia, cei din familia Enterobacteriaceae, precum și bacteriile acido-lactice nu au fost izolați în cazul probelor de parizer extra prelevate din cele două unități luate în studiu.

Confirmarea morfologică și biochimică

Configurația microflorei psihrotrofe a fost determinată prin efectuarea testelor de confirmare biochimice (cu ajutorul kiturilor API), pentru coloniile izolate de pe mediul SI și a mediilor selective pentru Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Yersinia spp. și grupa bacteriilor acido-lactice.

În ceea ce privește configurația microflorei bacteriene izolată din probele de parizer prelevate din unitatea C, am constatat după analizarea rezultatelor, că germenii Gram-pozitivi (Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., bacili Gram-pozitivi neidentificați), reprezintă 42.2%, în timp ce microflora Gram negativă (57.8%), este dominată de reprezentanții genului Pseudomonas (32.16%) (fig. 78).

În cazul probelor prelevate din unitatea D, microflora Gram pozitivă a prezentat valori ușor mai crescute (54.24%), în timp ce germenii Gram negativi au reprezentat 45.76% (fig. 79). Ca și în cazul probelor recoltate din unitatea C, pseudomonadele au constituit microflora dominantă (35.16%).

6.1.4.2. Evaluarea în dinamică a încărcăturii microbiene psihrotrofe la produsul parizer

În vederea evaluării în dinamică a încărcăturii și configurației microbiene, probele de parizer extra, păstrate timp de 14 zile (durata limită de consum), la temperatura de refrigerare, au fost prelucrate în ziua obținerii, la 24 ore, la 5 zile, la 9 zile, respectiv la 14 zi (în ultima zi de valabilitate a produsului).

În cazul probelor prelevate din unitatea C s-a constatat o evoluție ascendentă în privința numărului total de germeni psihrotrofi, începând de la 2.93±0.11 log ufc/g, în ziua obținerii până în ziua 14-a, când au ajuns la 5.12±0.45 log ufc/g, limita maximă recomandată fiind depășită în a 7-a zi a experimentului (fig. 80).

Încărcătura medie cu germeni din genul Pseudomonas a prezentat aceeași tendință de creștere, de la valoarea de 1.96±0.39 log ufc/g în ziua obținerii, pâna la 4.21±0.45 log ufc/g în ultima zi a experimentului (fig. 80).

Pentru probele prelevate din unitatea D, evoluția în dinamică a încărcăturii și configurației microbiene este asemănătoare cu aspectele menționate în cazul unității C (fig. 81), cu deosebirea că depășirea limitei maxim recomandate s-a realizat în ziua 5-a a duratei limită de consum. Germenii din genul Yersinia, familia Enterobacteriaceae și bacteriile acido-lactice, nu au fost evidențiate în cazul probelor prelevate din cele două unități luate în studiu.

6.1.5. Rezultate și discuții ale cercetărilor cu privire la

microflora psihrotrofă din produsul cremvurști

Cremvurștii sunt produse obținute din carne de porc, carne de vită și slănină, prin fierbere și afumare la cald. Materia primă auxiliară este reprezentată de condimente, sare, conservant E250 (nitrit de sodiu), stabilizator E450 (difosfați), antioxidant E300 (acid ascorbic), potențiator de gust E621 (glutamat monosodic), colorant E160 (extract de paprika), proteină vegetală (texturat de soia). Sunt introduse în membrane artificiale comestibile, având termenul de valabilitate de 10 zile. Bradtul se fabrică din carnea conservată și maturată. Slănina moale se trece prin sita cu ochiurile de . În timpul fabricării bradtului în cutter, se adaugă condimentele, Staro P (mixtură de condimente și aditivi alimentari) și apa rece sau fulgii de gheață. După obținerea bradtului, se adaugă slănina și se amestecă până când pasta se albește, devine luciosă și aderentă la mână. Umplerea membranelor se efectuează cu ajutorul șprițului cu vacuum. Se formează batoane prin răsucire la distanțe egale de cca. , aranjându-se apoi pe bețe. Înainte de introducerea cremvuștilor în afumătoare, aceasta se va încălzi până la temperatura de 45–50°C la care se va face zvântarea. Afumarea la cald se realizează la temperatura de 70–85°C timp de 20–30 minute, până când produsul capătă o culoare roșiatică. După afumare cremvurștii se leagă în ciorchine. Fierberea cremvurștilor se efectuează la temperatura de 72–75°C timp de 20–25 minute, în funcție de grosimea lor. După terminarea fierberii, aceștia se răcesc prin aspersare de apă rece și se depozitează la temperatura de 2–4°C până la livrare (Roth, 2001).

6.1.5.1. Aprecierea încărcăturii și configurației

microbiologice la produsul cremvurști

Din prelucrarea datelor înregistrate s-a constatat că încărcătura microbiană medie în cazul probelor prelevate din unitatea C a fost situată între 2.52±0.52 log ufc/g în cursul trim. I și 4.69±1.20 log ufc/g în trim. IV, cu o valoare minimă de 2.06±0.15 log ufc/g în luna ianuarie și maximă de 6.6.±0.30 log ufc/g în luna octombrie (fig. 82). Din totalul probelor examinate, 4 au prezentat valori ce au depășit limita maximă recomandată (8.33%).

Valoarea crescută a deviației standard (1.30) în cursul trim. IV se datorează faptului că în luna octombrie s-au stabilit la 3 din cele 4 probe prelevate, valori ale încărcăturii totale de germeni psihrotrofi cuprinse între 5.8-6.4 log ufc/g, cu mult mai mari decât media celorlalte probe prelevate. Această situație s-a datorat probabil unei încărături totale de germeni foarte mari, cu mult peste 6.0 log ufc/g a cărnii materiei prime. Media încărcăturii totale de germeni pentru probele prelevate din unitatea D s-a situat între 2.46±0.75 log ufc/g în trim. I și 3.85±0.74 log ufc/g în trim. III, cu un minim de 1.93±0.45 log ufc/g în luna februarie și maxim de 4.36±0.37 log ufc/g în luna iulie (fig. 82), depășirea limitei maxime recomandate fiind constatată în cazul a 7 probe (14.58%).

Pentru identificarea germenilor din genurile Pseudomonas și Aeromonas s-a utilizat mediul selectiv GSP agar (Merck). După incubarea plăcilor Petri la 20ºC, s-a constatat dezvoltarea coloniilor specifice doar pentru germenii din genul Pseudomonas spp. (fig. 4, pag. 78).

Din totalul probelor prelevate din unitatea C, s-au identificat pseudomonade în 28 probe (58.33%), încărcătura medie fiind cuprinsă între 2.26±0.40 log ufc/g în trim. II și 2.98±0.45 log ufc/g în trim. IV, cu o valoare minimă de 2.0±0.2 log ufc/g în cursul lunii aprilie și maximă de 3.3±.036 log ufc/g în luna octombrie. În unitatea D, din totalul probelor examinate, s-au identificat germeni din genul Pseudomonas doar în cazul a 11 probe, respectiv 22.91%, nivelul de contaminare fiind mai scăzut decât cel din unitatea C, deși din punct de vedere statistic nu s-au consemnat diferențe semnificative (p≥0.05) (fig.83).

La toate probele luate în lucru nu s-au identificat germeni din genul Aeromonas, fapt ce pledează pentru o rezistență scăzută a acestor microorganisme la tratamentele termice la care sunt supuse aceste preparate din carne sau la efectul conservant al amestecului de sărare utilizat. Spre deosebire de studiul nostru, Palumbo et al. (2000), au identificat Aeromonas hydrophila, A. sobria și A. caviae, în șuncă, respectiv cârnăciori afumați tratați termic, cu o încărcătură cuprinsă între 1.0, respectiv 2.0 log ufc/g, observând că numărul acestora crește în funcție de durata de depozitare, cel mai probabil prezența lor fiind datorată unor recontaminări a produselor, după etapa de pasteurizare.

Pentru identificarea germenilor din genul Lactobacillus s-a utilizat mediul selectiv MRS (Merck). După incubare în condiții de atmosferă scăzută în concentrația O2, la temperatura de 20ºC, în cazul a 18 probe (37.5%), s-au dezvoltat colonii specifice de 0,5-1 mm, de culoare alb-cenușie, regulate, netede, lucioase (fig. 84).

Fig. 84 Aspecte caracteristice ale germenilor din genul Lactobacillus (mediul MRS)

Characteristic aspects of germs from Lactobacillus genus (MRS selective agar)

Încărcătura microbiană medie cu bacterii acido-lactice pentru probele recoltate din unitatea C a fost cuprinsă între 2.77±0.61 log ufc/g în trim. IV și 3.54±0.55 log ufc/g în trim. III, cu valori minime de 2.13±0.32 log ufc/g în luna decembrie și maxime de 4.16±0.28 log ufc/g în lunaseptembrie, 43.75% din probele examinate fiind pozitive. Rezultatele obținute în cazul probelor recoltate din unitatea D, au prezentat valori ale încărcăturii cu bacterii acido-lactice mai scăzute decât în unitatea C (p≤0.05), nivelul de contaminare fiind cuprins între 3.13±0.7 log ufc/g în trim. II și 3.16±1.0 log ufc/g în trim. IV, din totalul probelor examinate 27.08% fiind pozitive. S-a constatat că nivelul încărcăturii cu aceste microorganisme nu a depășit valoarea de 6.0 log ufc/g, considerată de mulți autori ca fiind nivelul de la care se poate produce alterarea fermentativă, relevând faptul că aceasta debutează când numărul bacteriilor acido-lactice ajunge la nivele de 6.0-7.0 log ufc/ gram, fiind determinată de metaboliții produși din degradarea componentelor preparatelor de carne (acid lactic) (Ayres et al., 1980; Egan și Roberts, 1987; Guererro et al., 2000).

Pentru izolarea enterobacteriilor s-a utilizat mediul selectiv VRBD (Merck), observându-se dezvoltarea coloniilor specifice (fig. 18, pag. 88), în cazul a 3 probe prelevate din unitatea C (6.25%). Încărcătura microbiană medie a germenilor din familia Enterobacteriaceae a fost de 3.13±0.49 log ufc/g în trim. IV (fig. 86).

Ca și în cazul celorlalte sortimente de preparate de carne analizate, germenii din genul Yersinia n-au fost identificați din probele de cremvurști prelevate din unitățile luate în studiu, aspect care relevă faptul că aceste microorganisme sunt probabil sensibile la acțiunea tratamentelor termice la care sunt supuse aceste produse. De asemenea, putem aprecia că în general, nivelul încărcăturii cu germeni din produsele supuse examenelor microbiologice în acest studiu, a prezentat valori relativ scăzute, aspect care sugerează că în urma tratamentelor termice, precum și ca urmare a acțiunii unor substanțe conservante (nitrit de sodiu și potasiu, clorură de sodiu, etc), aceste microorganisme sunt reduse cu 2.0 – 3.0 log ufc/g față de nivelul inițial din carnea materie primă (Sharpe et al., 1984; Jay et al., 1998; Mossel et al., 1999; Prabhabar et al., 2000; Hanse și Bautista, 2000; Hamasaki et al., 2003).

Confirmarea morfologica și biochimică

Ca și în cazul celorlalte sortimente de preparate de carne, stabilirea configurației microbiene a produsului cremvurști, s-a efectuat pe baza colorației Gram, testelor catalazei, oxidazei, API 20NE, respectiv API 20E.

Din analiza rezultatelor obținute în urma determinărilor efectuate, am constatat că microflora bacteriană în cazul probelor de crenvurști prelevate din unitatea C a fost reprezentată de germeni Gram pozitivi (47.35%), aparținând genurilor Streptococcus, Lactobacillus, Micrococcus și bacili Gram-pozitivi neidentificați, precum și din germeni Gram negativi (52.65%), din genurile Pseudomonas, Moraxella, Ochrabactrum, și reprezentanți ai familiei Enterobacteriaceae (Serratia, Pantoea) (fig. 87).

Dintre bacteriile Gram pozitive s-a constatat că predomină lactobacilii (18.42%), în timp ce dintre cele Gram negative predomină Pseudomonas spp. (38.59%), microorganisme încadrate în categoria psihrotrofelor, aspecte comparabile cu studiile efectuate de alți cercetători (Guerrero et. al., 1999; Gardner et al., 1983).

Microflora bacteriană pentru probele prelevate din unitatea D, a fost reprezentată atât de bacterii Gram pozitive cât și Gram negative, în proporții asemănătoare cu cele descrise pentru unitatea C, însă configurația a prezentat unele diferențe, reprezentate de absența germenilor din familia Enterobacteriaceae și genul Moraxella, respectiv identificarea speciei Acinetobacter lwofii.

6.1.5.2. Evaluarea în dinamică a încărcăturii microbiene

psihrotrofe la produsul crenvurști

În vederea aprecierii încărcăturii și configurației microbiene a produsului cremvurști s-au efectuat 5 determinări din momentul recoltării: în prima zi, la 24 ore, la 5 zile, 7 zile, respectiv în ultima zi de valabilitate (la 10 zile).

Încărcătura totală de germeni pentru probele prelevate din unitatea C, a prezentat în dinamică o evoluție ascendentă, de la 2.8±0.26 log ufc/g în momentul procesării până la 5.5±0.42 log ufc/g în ultima zi a experimentului, limita maximă recomandată fiind depășită în ziua 5-a. O evoluție similară s-a evidențiat și în cazul germenilor din genul Pseudomonas, care de la 2.03±0.20 log ufc/g au ajuns în ziua 10-a la 4.4±0.45 log ufc/g.

Germenii din grupul bacteriilor acido-lactice au prezentat o evoluție ascendentă uniformă, de la 3.16±0.20log ufc/g până la 4.83±0.20log ufc/g în ziua 10-a a experimentului. În cazul enterobacteriilor s-a evidențiat o evoluție ascendentă până în ziua 7-a când au atins 4.2±0.26 log ufc/g, după care ritmul de dezvoltare a mai lent, ajungând ca în ziua 10-a să atingă 4.36±0.32 log ufc/g (fig 89).

Încărcătura microbiană în dinamică pentru probele prelevate din unitatea D a prezentat o evoluție similară cu cea evidențiată în cazul unității C, numărul total de germeni psihrotrofi cât și a germenilor din genul Pseudomonas și bacteriile acido-lactice având o tendință constantă de creștere din momentul obținerii până în ziua 10-a a experimentului (fig. 90). La toate sortimentele examinate nu s-au pus în evidență modificări senzoriale, pe întreaga durată a determinărilor efectuate (durata limită de consum).

Studii efectuate de Samelis și Georgiadou (2000), asupra încărcăturii microbiene în dinamică a unor sortimente de cârnăciori, au pus în evidență faptul că, numărul de lactobacili a prezentat o tendință crescătoare, ajungând de la 4.58 log ufc/g în prima zi la 7.0 log ufc/g în a 12-a zi a cercetărilor, valori mai crescute decât cele obținute în cercetările noastre, explicabile însă datorită nivelului crescut al microorganismelor în momentul obținerii. Spre deosebire de cercetările noastre, încărcătura cu germeni din genul Pseudomonas s-a situat pe întreaga durată a experimentului, la valori de 2.0 log ufc/g. Încărcătura totală de germeni a prezentat o evoluție ascendentă, de la 4.29 log ufc/g în prima zi, la 8.14 log ufc/g în a 12-a zi a experimentului, rezultate care indică un nivel mai crescut al contaminării atât în etapa inițială cât și finală a experimentului. Aceste diferențe între studiile diverșilor cercetători sunt explicabile, pe de o parte datorită materie prime și auxiliare care prezintă un grad variabil de contaminare, precum și datorită diversității substantelor conservante, precum și a cantității în care acestea sunt utilizate.

BIBLIOGRAFIE

*** 1996 – Microorganisms in Foods, vol.5, Microbial Ecology of Food Commodities, Blackie Academic & Proffesional, London.

*** 1998 – Microorganisms in Foods, vol.6, Microbial Ecology of Food Commodities, Blackie Academic & Proffesional, London.

Andrew Davies, 1998, The microbiology of meat and poultry, Blackie academic & professional, Chapman & Hall, London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras.

Ayres J.C., 1987, Microbiology of Foods, W.H. Freeman & Company, San Francisco

Bărzoi D., 1987 – Microbiologia produselor alimentare de origine animală, Ed. Ceres, București.

Bărzoi D., 1987 – Microbiologia produselor alimentare de origine animală, Ed. Ceres, București.

Bărzoi D., S. Apostu, 2002 – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Bărzoi D., S. Apostu, 2002 – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Bărzoi D., S. Meica, M. Neguț 1999 – Toxiinfecțiile alimentare, Ed. Diacon Coresi, București.

Bărzoi D., S. Meica, M. Neguț 1999 – Toxiinfecțiile alimentare, Ed. Diacon Coresi, București.

Bell R.G., Sandra M. Moorhead, D.M. Broda, 2001 – Influence of heat shrink treatments on the onset of clostridial “blown-pack”, spoilage of vacuum packed chilled meat, Food Researh International, 34, pp.271-275.

Bjorkroth K.J., P. Vandamme, H.J. Korkeala, 1998 – Identification and characterization of Leuconostoc carnosus, asociated with production and spoilage of vacuum-packeged, sliced, cooked ham, Applied and Environmental Microbiology, vol.64, nr. 9, sept., pp. 3313-319.

Blankenship L.C., S.E. Craven, R.G. Leffler, C. Custer, 1998 – Growth of Clostridium perfringens in cooked chili during cooling, Applied and Environmental Microbiology, vol 54, nr. 5, May, pp. 1104-1008.

Boers, R.H., Dijkmann, K.E. and Wijngaards, G., 1994 – Shelf-life of vacuum-packaged wild boar meat in relation to that of vacuum-packaged pork: relevance of intrinsic factors. MeatSci., 37, 91-102. 44,347-50.

Borch, E., Berg, H. and Holst. 0., 1991 – Heterolactic fermentation by a homofermentative Lactobacillus sp. during glucose limitation in anaerobic continuous culture with complete cell recycle. J. Appl. Bacteriol., 71, 265-9.

Borch, E., Kant-Muermans, M.L. and Blixt, Y., 1996 – Bacterial spoilage of meat and cured meat products. Int. J. Food Microbiol, 33. 103-20.

Brian P.F., 2000, Chilled storage of foods, Encyclopedia of Food Microbiology, vol. I, Academic Press, San Diego, California.

Broda M.D., D.J. Saul, P.A. Lawson, R.G. Bell, D.R. Musgrave, 2000a – Clostridium gasogenes sp.nov., a psychrophile causing spoilage of vacuum-packed meat, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, pp.107-118.

Broda M.D., D.J. Saul, R.G. Bell, D.R. Musgrave, 1999 – Clostridium frigidicarnis sp. nov., a psychrotolerant bacterium associated with “blown-pack” spoilage of vacuum-packed meats, International Journal of Systematic Bacteriology, 49, pp. 1539-1550.

Broda M.D., D.J. Saul, R.G. Bell, D.R. Musgrave, 2000 – Clostridium algidixylanolyticum sp. nov., a psychrotolerant, xylan-degrading spore-forming bacterium, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, pp. 623-631.

Broda M.D., D.R. Musgrave, R.G. Bell, 2000 b – Use of restriction fragment length polymorphism analysis to differentiate staruns of psychrophilic and psychrotrophic clostridia associated with “blown-pack” spoilage of vacuum-packed meats, Journal of Applied Microbiology, 88, pp 107-116.

Broda M.D., Karen M. DeLacy, R.G. Graham, T.J. Braggins, R.L. Cook, 1996 – Psychrotrophic Clostridium spp. associated with “blown-pack” spoilage of chilled vacuum-packed red meats and dog rolls in gas-impermeable platic casings, International Journal of Food Microbiology, 29, pp.335-352.

Brown H.M., 2000 – Processed meat products, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.I, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Brown M.H., 1982 – Meat Microbiology, Applied Science PublishersLTD, London & New York.

Chynoweth R.W., J.A. Hudson, K. Thom, 1998 – Aerobic growth and survival of Campylobacter jejuni in food and stream water, Letters in Applied Microbiology, 27, pp. 341-344.

Cousin M.A., 2000 – Pseudomonas, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Dainty, R.H., Edwards, R.A., Hibbard, C.M. and Ramantanis, S.V., 1986 – Bacterial sources of putrescine and cadaverine in chill stored vacuum-packaged beef. J. Appl. Bacteriol., 61, 117-23.

Dainty. R.H. and Mackey. B.M., 1992 – The relationship between the phenotypic properties of bacteria from chill-stored meat and spoilage processes. J. Appl. Bacteriol.. Symp. Suppl., 73, 103s-114s.

Day B.P.F., 2000 – Chilled storage of food, Encyclopedia of Food Microbiology, Vol.I, Academic Press, San Diego, California.

De Lacy, D.M. Broda, R.G. Bell, 1998 – In vitro assessment of psychrotrophic Clostridium spp. as possible causative agents of bone-taint in beef, Food Microbiology, 15, pp. 583-589.

Donnelly W. Catherine, 1994 – Listeria monocytogenes, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, vol.I Marcel Dekker, Inc, New York.

Drosinos. E.H.,1994 – Microbial associations of minced lamb and their ecophysiological attributes.

Egan A.F., T.A. Roberts, 1987 – Microbiology of Meat and Meat products, Essays in Agricultural and Food Microbiology, John Wiley & sons LTD.

Farber M.J., P.I. Peterkin, 2000 – Listeria monocytogenes, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Feng P., S.D. Weagant, 1994 – Yersinia, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, vol.I., Marcel Dekker, Inc, New York.

Finlay W.J.J, N.A. Logan, A.D. Sutherland, 2000 – Bacillus cereus produces most emetic toxin at lower temperatures, Letters in Applied Microbiology, 31, pp. 385-389.

Franco D.A., C.E. Williams, 1994 – Campylobacter jejuni, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, vol I., Marcel Dekker, Inc, New York.

Garcia Lopez Maria-Luiza, M.P. Maradona, 2000 – Flavobacterium; Psychrobacter, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Garcia-Lopez M.L., M. Prieto, A. Otero, 1998, The physiological attributes of Gram negative bacteria associatted with spoilage of meat and meat products, Microbiology of meat and poultry (ed. Andrew Davies).

Giesendorf B.A.J., W.G.V. Quint, M.H.C. Henkens, H. Stegeman, F.A. Huf, H.G.M. Niesters, 1992 – Rapid and sensitive detection of Camylobacter spp. in chicken products by using the polymearse chain reaction, Applied and Environmental Microbiology, vol58, nr. 12, Dec., pp. 3804-3808.

Gill, C.O., 1976 – Substrate limitation of bacterial growth at meat surfaces. J. Appl. Bacteriol. 41,401-10.

Gill. C.O., 1986 – The control of microbial spoilage in fresh meats, in Advances in Meat Research: Meat and Poultry Microbiology, (eds A.M. Pearson and T.R. Dutson), MacMillan, New York, pp. 49-88.

Gram L., A.B. Christensen, L. Ravn, S. Molin, M. Givskov, 1999 – Production of acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated from foods, Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, nr. 8, aug., pp.3458-3463.

Gram L., A.B. Christensen, L. Ravn, S. Molin, M. Givskov, 1999 – Production of acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated from foods, Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, nr. 8, aug., pp.3458-3463.

Gram L., Vogel F.B., 2000 – Shewanella, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Granum P.E., 1997 – Bacillus cereus, Food microbiology, Fundamentals and Frontieres, ASM Press, Washington D.C.

Hansen M.J. Karen, D.A. Bautista, 2000 – Spoilage problems, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Holley R.A., 2000 – Brochotrix, Encyclopedia of Food Microbiology, vol I, Academic Press, San Diego, California.

Jackson T.C., G.R Acuff, J.S. Dickson, 1997 – Meat, poultry and seafood, Food microbiology, Fundamentals and Frontieres, ASM Press, Washington D.C.

Jay M.J., 1998 – Modern Food Microbiology, Ediția a V-a, Chapmann & Hall, International Thomson Publishing.

Jay, J.M., 1986a – Microbial spoilage indicators and metabolites, in Foodhorne Microorganisms and their Toxins: Developing Methodology (eds M.D. Pierson and N.J. Sterm). Marcel Dekker, Basel. pp. 21940.at chill temperatures. J. Appl. Bacteriol., 43, 189-95.

Kakouri, A. and Nychas, G.J.E., 1994 – Storage of poultry meat under modified atmospheres or vacuum packs: possible role of microbial metabolites as indicators of spoilage. J Appl. Bacteriol. 76, 163-72.

Kampfer P., 2000 – Acinetobacter, Encyclopedia of Food Microbiology, vol I, Academic Press, San Diego, California.

Kandler, 0., 1983 – Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 49: 209-24.

Kotula L. Kathryn, A.W. Kotula, 2000 – Fresh read meats, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.I, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Labbe R.G., 2000 – Clostridium perfringens, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Lasta, J.A.. Pensel. N., Masana. M., Rodriguez. H.R. and Garcia. P.T., 1995 – Microbial growth and biochemical changes on naturally contaminated chilled-beef subcutaneous adipose tissue stored aerobically. Meat Sci.. 39. 149-58.

Lawrie, R.A., 1985 – Meat Science. 3rd edn. Pergamon Press, Oxford.

Lowry P.D., C.O.Gill, 1985 – Floras of carcass meats, Microbiology of frozen meat and meat products, Elsevier Applied Science Publishers, Londra & New York.

Lund M.Barbara, M.W. Peck, 2000 – Clostridium botulinum, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Maijala, R.L., 1994 – Histamine and tyramine production by a Lacrobacillus strain subjected to external pH decrease. J. Food Prorecr. 57. 259-62.

Maijala. R.L.. Eerola. S.H., Aho. M.A. and Hirn. J.A., 1993 – The effect of GDL-induced pH decrease on the formation of biogenic amines in meat. J. Food Prefect. 56, 125-9.

Membre J.M., t. Ross, T. Mcmeeken, 1999 – Behaviour of Listeria monocytogenes under combined chilling processes, Letters in Applied Microbiology, 28, pp.216-220.

Molin, G., 1985 – Mixed carbon source utilization of meat-spoiling Pseudomonas fragi 72 in relation to oxygen limitation and carbon dioxide inhibition. Appl. Environ. Microbiol., 49.

Moorhead S.M., R.G. Bell, 1999 – Psychrotrophic clostridia mediated gas and botulinal toxin production in vacuum packed chilled meat, Letters in Applied Microbiology, 28, pp. 108-112.

Mossel D.A.A., Ganet E.L. Corry, C.B. Struijk, Rosamund M. Baird, A.C.Baird-Parker, 1999 – Essentials of the Microbiology of Food, a Textbook for Advanced Studies, John Willey & Sons, Chichester, New York.

Napravnikova E., L. Vorlova, L. Malota, 2002 – Changes in hygienic quality of vacuum packed pork during storage, Acta vet. Brno, 71, pp. 255-262.

Nesbakken T., 2000 – Yersinia species, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Nychas G.J.E., E.H. Drosinos, 2000– Meat and poultry, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Nychas, G.J., Dillon, V.M. and Board. R.G., 1988 – Glucose the key substrate in the microbiological changes occurring in meat and certain meat products. Biotechnol Appl. Blochem., 10, 203-3 1.

Nychas, G.J., Robinson, A. and Board, R.G., 1992 – Microbiological and physico-chemical evaluation of ground beef from retail shops. Fleischwirtsch. Int., 1, 49-53.

Nychas, G.J.E. and Arkoudelos, J.S., 1991 – The influence of Brochothrix thermosphacta on the quality of minced meat. Agric. Res., 15, 103-15 (in Greek).

Nychas, G.J.E. and Tassou, C.C., 1997 – Spoilage processes and proteolysis in chicken as detected by HPLC. J. Sci. Food Agric. 74, 199-208.

Nychas, G.J.E., E.H. Drosinos, 2000 – Meat and poultry, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Nychas, G.J.E., Gibbs, P.A., Board, R.G. and Sheridan, J.J., 1994 – Improving the safety and quality of meat and meat products by modified atmosphere and assessment by novel methods. FLAIR proposal No 89055, Contract No AGRFi0024 (SCP), Final Report, EU, DGXII, Brussels, Belgium.

O’Connor R.E., V.G. Reyes, 2000 – Use of modified-atmosphere packaging, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Palombo S., G.N. Stelma, C. Abeyta, 2000 – The Aeromonas Hydrophila Group, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Piette J.P.G., Idziak S.E., 1992 – A model study of factors involveed in adhesion of Pseudomonas fluorescent to meat, Applied and Environmental Microbiology, vol. 28, nr. 9, sept., pp.2783-2791.

Rafii F., 2000 – Serratia, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Răpuntean Gh, E. Boldizsar, 2001 – Practicum de bacteriologie specială, Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca.

Răpuntean Gh., S. Răpuntean, 1999 – Bacteriologie specială veterinară, Tipo Agronomia, Cluj-Napoca.

Rawles, D.D.. Flick, G.J. and Martin, R.E., 1996 – Biogenic amines in fish and shellfish. Adv. Food Nutrition Rex, 39, 329-65.

Rod A.H., Jane P. Sutherland, 2000 – Chill storage, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.I, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Rotaru O., M. Mihaiu, 2001 – Igiena veterinară a produselor alimentare – Inspecția cărnurilor, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Rotaru O., M. Mihaiu, 2002 – Igiena veterinară a produselor alimentare – Patologia prin alimente, Ed. Todesco, Cluj-Napoca.

Santos J.A., Garcia Lopez Maria-Luiza, A. Otero, 2000 – Moraxella, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Schillinger U., F.K. Luke, 1989 – Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat, Applied and Environmental Microbiology, vol. 55, nr. 8, aug. pp. 1901-1906.

Schmitt, R.E. and Schmidt-Lorenz, W., 1992a – Formation of ammonia and amines during microbial spoilage of refrigerated broilers. Lehensmittel- Wissenschaft urzd- Technologie, 25.

Schmitt. R.E. and Schmidt-Lorenz, W., 1992b – Degradation of amino acids and protein changes during microbial spoilage of chilled unpacked and packed chicken carcasses. Lehensmittel- Wissenschafr und-Technlogie, 25, 11-20.

Schroll G., H.J. Busse, G. Parrer, Sabine Rölleke, W. Lubitz, E. B.M. Denner, 2001, Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis subsp. nov., a Bacterium Accumulating Poly-β-hydroxybutyrate from Acetone-butanol Bioprocess Residues, System. Appl. Microbiol. 24, 37–43.

Schultz F.J., J.L. Smith, 1994 – Bacillus: recent advances in Bacillus cereus food poisoning research, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, Marcel Dekker, Inc, New York.

Seymour. I.J.. Cole. M.B. and Coote. P.J., 1994 – A substrate-mediated assay of bacterial proton effludinflux to predict the degree of spoilage of beef mince stored at chill temperatures. J. Appl. Bacteriol., 76, 608-15.

Sheridan, J.J., 1995 – The role of indicator systems in HACCP operations. J. Food Safety, 15, 157-80.

Skerman, V.B.D., Vicki Mcgowan, P.H.A. Sneath, 1980, Approved Lists of Bacterial Names International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol. 30 (1): 225-400.

Stamer J.R., 1980 – Lactic acid bacteria, Food Microbiology: Public Health and Spoilage Aspects, The Avi Publishing Company, Inc, Westport, Connecticut.

Stern N.J., J.E. Line, 2000 – Campylobacter, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Thomas P., B. Gross Lansana, L. C. Kamara, Hatheway Patricia Powers, P. J. Libonati, Stanley M. Harmon, Ebenezer Israel, 1989, Clostridium perfringens Food Poisoning: Use of Serotyping in an Outbreak Setting, Journal of clinical microbiology, Apr. 1989, 27 (4): 660-663.

Vasiu C., 2001 – Bacterioze la animale, Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca.

Venugopal, V., 1990 – Extracellular proteases of contaminant bacteria in fish spoilage, a review. J. Food Protect., 53. 341-50.

Wakabayashi H., G. J. Huh, N. Kimura, 1989, Flavobacterium branchiophila sp. nov., a Causative Agent of Bacterial Gill Disease of Freshwater Fishes, International journal of systematic bacteriology, 39: 213-216.

*** Regulamentul (CE) nr. 1441/2007 al comisiei din 5 decembrie 2007 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare.

*** SR ISO 21528-2/2007. Metoda orizontală pentru enumerarea germenilor din familia Enterobacteriaceae;

*** SR EN 11290/1/2/2005. Metoda orizontală pentru detectarea și numărarea Listeria monocytogenes;

*** SR EN ISO 10272/2/2007. Metoda orizontală pentru izolarea și identificarea Campylobacter spp.

*** SR EN ISO 10273/2003. Metoda orizontală pentru detecția Yersinia enterocolitica prezumtivă.

BIBLIOGRAFIE

*** 1996 – Microorganisms in Foods, vol.5, Microbial Ecology of Food Commodities, Blackie Academic & Proffesional, London.

*** 1998 – Microorganisms in Foods, vol.6, Microbial Ecology of Food Commodities, Blackie Academic & Proffesional, London.

Andrew Davies, 1998, The microbiology of meat and poultry, Blackie academic & professional, Chapman & Hall, London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras.

Ayres J.C., 1987, Microbiology of Foods, W.H. Freeman & Company, San Francisco

Bărzoi D., 1987 – Microbiologia produselor alimentare de origine animală, Ed. Ceres, București.

Bărzoi D., 1987 – Microbiologia produselor alimentare de origine animală, Ed. Ceres, București.

Bărzoi D., S. Apostu, 2002 – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Bărzoi D., S. Apostu, 2002 – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Bărzoi D., S. Meica, M. Neguț 1999 – Toxiinfecțiile alimentare, Ed. Diacon Coresi, București.

Bărzoi D., S. Meica, M. Neguț 1999 – Toxiinfecțiile alimentare, Ed. Diacon Coresi, București.

Bell R.G., Sandra M. Moorhead, D.M. Broda, 2001 – Influence of heat shrink treatments on the onset of clostridial “blown-pack”, spoilage of vacuum packed chilled meat, Food Researh International, 34, pp.271-275.

Bjorkroth K.J., P. Vandamme, H.J. Korkeala, 1998 – Identification and characterization of Leuconostoc carnosus, asociated with production and spoilage of vacuum-packeged, sliced, cooked ham, Applied and Environmental Microbiology, vol.64, nr. 9, sept., pp. 3313-319.

Blankenship L.C., S.E. Craven, R.G. Leffler, C. Custer, 1998 – Growth of Clostridium perfringens in cooked chili during cooling, Applied and Environmental Microbiology, vol 54, nr. 5, May, pp. 1104-1008.

Boers, R.H., Dijkmann, K.E. and Wijngaards, G., 1994 – Shelf-life of vacuum-packaged wild boar meat in relation to that of vacuum-packaged pork: relevance of intrinsic factors. MeatSci., 37, 91-102. 44,347-50.

Borch, E., Berg, H. and Holst. 0., 1991 – Heterolactic fermentation by a homofermentative Lactobacillus sp. during glucose limitation in anaerobic continuous culture with complete cell recycle. J. Appl. Bacteriol., 71, 265-9.

Borch, E., Kant-Muermans, M.L. and Blixt, Y., 1996 – Bacterial spoilage of meat and cured meat products. Int. J. Food Microbiol, 33. 103-20.

Brian P.F., 2000, Chilled storage of foods, Encyclopedia of Food Microbiology, vol. I, Academic Press, San Diego, California.

Broda M.D., D.J. Saul, P.A. Lawson, R.G. Bell, D.R. Musgrave, 2000a – Clostridium gasogenes sp.nov., a psychrophile causing spoilage of vacuum-packed meat, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, pp.107-118.

Broda M.D., D.J. Saul, R.G. Bell, D.R. Musgrave, 1999 – Clostridium frigidicarnis sp. nov., a psychrotolerant bacterium associated with “blown-pack” spoilage of vacuum-packed meats, International Journal of Systematic Bacteriology, 49, pp. 1539-1550.

Broda M.D., D.J. Saul, R.G. Bell, D.R. Musgrave, 2000 – Clostridium algidixylanolyticum sp. nov., a psychrotolerant, xylan-degrading spore-forming bacterium, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, pp. 623-631.

Broda M.D., D.R. Musgrave, R.G. Bell, 2000 b – Use of restriction fragment length polymorphism analysis to differentiate staruns of psychrophilic and psychrotrophic clostridia associated with “blown-pack” spoilage of vacuum-packed meats, Journal of Applied Microbiology, 88, pp 107-116.

Broda M.D., Karen M. DeLacy, R.G. Graham, T.J. Braggins, R.L. Cook, 1996 – Psychrotrophic Clostridium spp. associated with “blown-pack” spoilage of chilled vacuum-packed red meats and dog rolls in gas-impermeable platic casings, International Journal of Food Microbiology, 29, pp.335-352.

Brown H.M., 2000 – Processed meat products, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.I, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Brown M.H., 1982 – Meat Microbiology, Applied Science PublishersLTD, London & New York.

Chynoweth R.W., J.A. Hudson, K. Thom, 1998 – Aerobic growth and survival of Campylobacter jejuni in food and stream water, Letters in Applied Microbiology, 27, pp. 341-344.

Cousin M.A., 2000 – Pseudomonas, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Dainty, R.H., Edwards, R.A., Hibbard, C.M. and Ramantanis, S.V., 1986 – Bacterial sources of putrescine and cadaverine in chill stored vacuum-packaged beef. J. Appl. Bacteriol., 61, 117-23.

Dainty. R.H. and Mackey. B.M., 1992 – The relationship between the phenotypic properties of bacteria from chill-stored meat and spoilage processes. J. Appl. Bacteriol.. Symp. Suppl., 73, 103s-114s.

Day B.P.F., 2000 – Chilled storage of food, Encyclopedia of Food Microbiology, Vol.I, Academic Press, San Diego, California.

De Lacy, D.M. Broda, R.G. Bell, 1998 – In vitro assessment of psychrotrophic Clostridium spp. as possible causative agents of bone-taint in beef, Food Microbiology, 15, pp. 583-589.

Donnelly W. Catherine, 1994 – Listeria monocytogenes, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, vol.I Marcel Dekker, Inc, New York.

Drosinos. E.H.,1994 – Microbial associations of minced lamb and their ecophysiological attributes.

Egan A.F., T.A. Roberts, 1987 – Microbiology of Meat and Meat products, Essays in Agricultural and Food Microbiology, John Wiley & sons LTD.

Farber M.J., P.I. Peterkin, 2000 – Listeria monocytogenes, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Feng P., S.D. Weagant, 1994 – Yersinia, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, vol.I., Marcel Dekker, Inc, New York.

Finlay W.J.J, N.A. Logan, A.D. Sutherland, 2000 – Bacillus cereus produces most emetic toxin at lower temperatures, Letters in Applied Microbiology, 31, pp. 385-389.

Franco D.A., C.E. Williams, 1994 – Campylobacter jejuni, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, vol I., Marcel Dekker, Inc, New York.

Garcia Lopez Maria-Luiza, M.P. Maradona, 2000 – Flavobacterium; Psychrobacter, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Garcia-Lopez M.L., M. Prieto, A. Otero, 1998, The physiological attributes of Gram negative bacteria associatted with spoilage of meat and meat products, Microbiology of meat and poultry (ed. Andrew Davies).

Giesendorf B.A.J., W.G.V. Quint, M.H.C. Henkens, H. Stegeman, F.A. Huf, H.G.M. Niesters, 1992 – Rapid and sensitive detection of Camylobacter spp. in chicken products by using the polymearse chain reaction, Applied and Environmental Microbiology, vol58, nr. 12, Dec., pp. 3804-3808.

Gill, C.O., 1976 – Substrate limitation of bacterial growth at meat surfaces. J. Appl. Bacteriol. 41,401-10.

Gill. C.O., 1986 – The control of microbial spoilage in fresh meats, in Advances in Meat Research: Meat and Poultry Microbiology, (eds A.M. Pearson and T.R. Dutson), MacMillan, New York, pp. 49-88.

Gram L., A.B. Christensen, L. Ravn, S. Molin, M. Givskov, 1999 – Production of acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated from foods, Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, nr. 8, aug., pp.3458-3463.

Gram L., A.B. Christensen, L. Ravn, S. Molin, M. Givskov, 1999 – Production of acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated from foods, Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, nr. 8, aug., pp.3458-3463.

Gram L., Vogel F.B., 2000 – Shewanella, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Granum P.E., 1997 – Bacillus cereus, Food microbiology, Fundamentals and Frontieres, ASM Press, Washington D.C.

Hansen M.J. Karen, D.A. Bautista, 2000 – Spoilage problems, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Holley R.A., 2000 – Brochotrix, Encyclopedia of Food Microbiology, vol I, Academic Press, San Diego, California.

Jackson T.C., G.R Acuff, J.S. Dickson, 1997 – Meat, poultry and seafood, Food microbiology, Fundamentals and Frontieres, ASM Press, Washington D.C.

Jay M.J., 1998 – Modern Food Microbiology, Ediția a V-a, Chapmann & Hall, International Thomson Publishing.

Jay, J.M., 1986a – Microbial spoilage indicators and metabolites, in Foodhorne Microorganisms and their Toxins: Developing Methodology (eds M.D. Pierson and N.J. Sterm). Marcel Dekker, Basel. pp. 21940.at chill temperatures. J. Appl. Bacteriol., 43, 189-95.

Kakouri, A. and Nychas, G.J.E., 1994 – Storage of poultry meat under modified atmospheres or vacuum packs: possible role of microbial metabolites as indicators of spoilage. J Appl. Bacteriol. 76, 163-72.

Kampfer P., 2000 – Acinetobacter, Encyclopedia of Food Microbiology, vol I, Academic Press, San Diego, California.

Kandler, 0., 1983 – Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 49: 209-24.

Kotula L. Kathryn, A.W. Kotula, 2000 – Fresh read meats, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.I, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Labbe R.G., 2000 – Clostridium perfringens, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Lasta, J.A.. Pensel. N., Masana. M., Rodriguez. H.R. and Garcia. P.T., 1995 – Microbial growth and biochemical changes on naturally contaminated chilled-beef subcutaneous adipose tissue stored aerobically. Meat Sci.. 39. 149-58.

Lawrie, R.A., 1985 – Meat Science. 3rd edn. Pergamon Press, Oxford.

Lowry P.D., C.O.Gill, 1985 – Floras of carcass meats, Microbiology of frozen meat and meat products, Elsevier Applied Science Publishers, Londra & New York.

Lund M.Barbara, M.W. Peck, 2000 – Clostridium botulinum, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Maijala, R.L., 1994 – Histamine and tyramine production by a Lacrobacillus strain subjected to external pH decrease. J. Food Prorecr. 57. 259-62.

Maijala. R.L.. Eerola. S.H., Aho. M.A. and Hirn. J.A., 1993 – The effect of GDL-induced pH decrease on the formation of biogenic amines in meat. J. Food Prefect. 56, 125-9.

Membre J.M., t. Ross, T. Mcmeeken, 1999 – Behaviour of Listeria monocytogenes under combined chilling processes, Letters in Applied Microbiology, 28, pp.216-220.

Molin, G., 1985 – Mixed carbon source utilization of meat-spoiling Pseudomonas fragi 72 in relation to oxygen limitation and carbon dioxide inhibition. Appl. Environ. Microbiol., 49.

Moorhead S.M., R.G. Bell, 1999 – Psychrotrophic clostridia mediated gas and botulinal toxin production in vacuum packed chilled meat, Letters in Applied Microbiology, 28, pp. 108-112.

Mossel D.A.A., Ganet E.L. Corry, C.B. Struijk, Rosamund M. Baird, A.C.Baird-Parker, 1999 – Essentials of the Microbiology of Food, a Textbook for Advanced Studies, John Willey & Sons, Chichester, New York.

Napravnikova E., L. Vorlova, L. Malota, 2002 – Changes in hygienic quality of vacuum packed pork during storage, Acta vet. Brno, 71, pp. 255-262.

Nesbakken T., 2000 – Yersinia species, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Nychas G.J.E., E.H. Drosinos, 2000– Meat and poultry, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Nychas, G.J., Dillon, V.M. and Board. R.G., 1988 – Glucose the key substrate in the microbiological changes occurring in meat and certain meat products. Biotechnol Appl. Blochem., 10, 203-3 1.

Nychas, G.J., Robinson, A. and Board, R.G., 1992 – Microbiological and physico-chemical evaluation of ground beef from retail shops. Fleischwirtsch. Int., 1, 49-53.

Nychas, G.J.E. and Arkoudelos, J.S., 1991 – The influence of Brochothrix thermosphacta on the quality of minced meat. Agric. Res., 15, 103-15 (in Greek).

Nychas, G.J.E. and Tassou, C.C., 1997 – Spoilage processes and proteolysis in chicken as detected by HPLC. J. Sci. Food Agric. 74, 199-208.

Nychas, G.J.E., E.H. Drosinos, 2000 – Meat and poultry, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Nychas, G.J.E., Gibbs, P.A., Board, R.G. and Sheridan, J.J., 1994 – Improving the safety and quality of meat and meat products by modified atmosphere and assessment by novel methods. FLAIR proposal No 89055, Contract No AGRFi0024 (SCP), Final Report, EU, DGXII, Brussels, Belgium.

O’Connor R.E., V.G. Reyes, 2000 – Use of modified-atmosphere packaging, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Palombo S., G.N. Stelma, C. Abeyta, 2000 – The Aeromonas Hydrophila Group, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Piette J.P.G., Idziak S.E., 1992 – A model study of factors involveed in adhesion of Pseudomonas fluorescent to meat, Applied and Environmental Microbiology, vol. 28, nr. 9, sept., pp.2783-2791.

Rafii F., 2000 – Serratia, Encyclopedia of Food Microbiology, vol III, Academic Press, San Diego, California.

Răpuntean Gh, E. Boldizsar, 2001 – Practicum de bacteriologie specială, Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca.

Răpuntean Gh., S. Răpuntean, 1999 – Bacteriologie specială veterinară, Tipo Agronomia, Cluj-Napoca.

Rawles, D.D.. Flick, G.J. and Martin, R.E., 1996 – Biogenic amines in fish and shellfish. Adv. Food Nutrition Rex, 39, 329-65.

Rod A.H., Jane P. Sutherland, 2000 – Chill storage, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.I, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Rotaru O., M. Mihaiu, 2001 – Igiena veterinară a produselor alimentare – Inspecția cărnurilor, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Rotaru O., M. Mihaiu, 2002 – Igiena veterinară a produselor alimentare – Patologia prin alimente, Ed. Todesco, Cluj-Napoca.

Santos J.A., Garcia Lopez Maria-Luiza, A. Otero, 2000 – Moraxella, Encyclopedia of Food Microbiology, vol II, Academic Press, San Diego, California.

Schillinger U., F.K. Luke, 1989 – Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat, Applied and Environmental Microbiology, vol. 55, nr. 8, aug. pp. 1901-1906.

Schmitt, R.E. and Schmidt-Lorenz, W., 1992a – Formation of ammonia and amines during microbial spoilage of refrigerated broilers. Lehensmittel- Wissenschaft urzd- Technologie, 25.

Schmitt. R.E. and Schmidt-Lorenz, W., 1992b – Degradation of amino acids and protein changes during microbial spoilage of chilled unpacked and packed chicken carcasses. Lehensmittel- Wissenschafr und-Technlogie, 25, 11-20.

Schroll G., H.J. Busse, G. Parrer, Sabine Rölleke, W. Lubitz, E. B.M. Denner, 2001, Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis subsp. nov., a Bacterium Accumulating Poly-β-hydroxybutyrate from Acetone-butanol Bioprocess Residues, System. Appl. Microbiol. 24, 37–43.

Schultz F.J., J.L. Smith, 1994 – Bacillus: recent advances in Bacillus cereus food poisoning research, Foodborne Disease Handbook, disease caused by bacteria, Marcel Dekker, Inc, New York.

Seymour. I.J.. Cole. M.B. and Coote. P.J., 1994 – A substrate-mediated assay of bacterial proton effludinflux to predict the degree of spoilage of beef mince stored at chill temperatures. J. Appl. Bacteriol., 76, 608-15.

Sheridan, J.J., 1995 – The role of indicator systems in HACCP operations. J. Food Safety, 15, 157-80.

Skerman, V.B.D., Vicki Mcgowan, P.H.A. Sneath, 1980, Approved Lists of Bacterial Names International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol. 30 (1): 225-400.

Stamer J.R., 1980 – Lactic acid bacteria, Food Microbiology: Public Health and Spoilage Aspects, The Avi Publishing Company, Inc, Westport, Connecticut.

Stern N.J., J.E. Line, 2000 – Campylobacter, The Microbiological safety and Quality of Food, vol.II, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland.

Thomas P., B. Gross Lansana, L. C. Kamara, Hatheway Patricia Powers, P. J. Libonati, Stanley M. Harmon, Ebenezer Israel, 1989, Clostridium perfringens Food Poisoning: Use of Serotyping in an Outbreak Setting, Journal of clinical microbiology, Apr. 1989, 27 (4): 660-663.

Vasiu C., 2001 – Bacterioze la animale, Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca.

Venugopal, V., 1990 – Extracellular proteases of contaminant bacteria in fish spoilage, a review. J. Food Protect., 53. 341-50.

Wakabayashi H., G. J. Huh, N. Kimura, 1989, Flavobacterium branchiophila sp. nov., a Causative Agent of Bacterial Gill Disease of Freshwater Fishes, International journal of systematic bacteriology, 39: 213-216.

*** Regulamentul (CE) nr. 1441/2007 al comisiei din 5 decembrie 2007 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare.

*** SR ISO 21528-2/2007. Metoda orizontală pentru enumerarea germenilor din familia Enterobacteriaceae;

*** SR EN 11290/1/2/2005. Metoda orizontală pentru detectarea și numărarea Listeria monocytogenes;

*** SR EN ISO 10272/2/2007. Metoda orizontală pentru izolarea și identificarea Campylobacter spp.

*** SR EN ISO 10273/2003. Metoda orizontală pentru detecția Yersinia enterocolitica prezumtivă.