Metode de Analiza a Polifenolilor din Vin
INTRODUCERE
Vinul este o bautură obținută exclusiv prin fermentația alcoolică a strugurilor sau a mustului de struguri, cu o importanță deosebită atât în consumul alimentar cât și în cercetările științifice, încă din cele mai vechi timpuri. Unul dintre motivele de interes îl reprezintă complexitatea compușilor ce îl formează. Aceștia oferă produsului finit numeroase proprietăți benefice organismului uman.
Astringența, culoarea, duritatea și savoarea sunt doar câteva dintre însușirile caracteristice vinurilor. Acestea sunt influențate de prezența compușilor fenolici, care, de altfel, sunt responsabilii pentru diferența dintre vinurile roșii și cele albe. Acești compuși au un rol important în metabolismul și dezvoltarea viței-de-vie (așa cum o au și glucidele, acizii organici, substanțele proteice precum și sărurile minerale), intervenind în unele transformări din timpul maturării și învechirii vinurilor. De asemenea, polifenolii acționează ca vitamina P și au efect bactericid. [1]
Validarea unei metode de analiză oferă o confirmare a procesului analitic și veridicității rezultatelor obținute, în urma unei verificări corespunzătoare. Scopul validării îl reprezintă demonstrarea faptului că metoda analitiă folosită, corespunde utilizării propuse. Validarea este confirmată prin criteriile de performanță: selectivitatea și specificitatea, exactitatea și precizia, domeniul liniar de aplicabilitate, liniaritatea, sensibilitatea, limita de detecție, limita de cuantificare și robustețea. [2]
Scopul lucrării este de a valida metoda cromatografică de determinare a polifenolilor din vin utilizând un cromatograf lichid de înaltă performanță cuplat cu detector cu rețea de diode, și de a aplica metoda validată pentru determinarea compușilor fenolici din trei vinuri albe provenite din diferite regiuni viticole spaniole.
CAPITOLUL 1
Clasificarea polifenolilor
Polifenolii sunt substanțe organice compuse din mai multe grupări fenolice, astfel, în structura lor intrând una sau mai multe grupări hidroxil care sunt legate de un radical aromatic. Acești compuși aromatici sunt principalul grup de metaboliți secundari și substanțe bioactive în plante. Metaboliții secundari joacă roluri diferite în metabolismul plantelor, în ceea ce privește creșterea, fotosinteza și reproducerea. [3]
Compușii fenolici și derivații acestora sunt componente esențiale ale strugurilor și implicit, ale produselor derivate din struguri, în special vinuri. Având în vedere varietatea de compuși chimici, această clasă constituie o familie numeroasă: acizi fenolici, taninuri, stilbeni, flavonoide, analogi ai feniletanolului, etc. [4]
Acest capitol evidențiază compușii fenolici prezenți în struguri și vin, printr-o scurtă clasificare. De asemenea, este prezentat și rolul polifenolilor asupra organismului uman.
Clasificarea polifenolilor prezenți în struguri și vinuri
Deoarece polifenolii reprezintă un ansamblu de substanțe în structura cărora intră diferiți fenoli, cercetătorii știintifici consideră dificilă clasificarea acestei clase de compuși chimici, cu atât mai mult identificarea tuturor metaboliților și evaluarea acestora din punct de vedere al activității lor biologice. [5]
În compoziția fenolilor non-volatili din struguri și vinuri intră:
Acizi fenolici: acizii hidroxibenzoici, acizii hidroxicinamici;
Flavonoide: flavonele, flavanonele, flavonolii, flavononolii, flavane, flavanoli (flavan-3-olii), calconele și dihidrocalconele, pigmenții antocianici;
Taninuri: taninurile hidrolizabile, taninurile condensate;
Stilbeni;
Cumarine;
Derivați ai feniletanolului;
Lignani și neolignani.
În tabelul 1.1. sunt enumerați principalii compuși fenolici din vin și structura chimică pentru fiecare component în parte. [1]
Compușii fenolici joacă un rol important pentru propietățile organoleptice ale strugurilor și vinurilor deoarece aceștia sunt responsabili de miros, culoare, aromă, amărăciune și astringență. De asemenea, compoziția compușilor fenolici face diferența dintre vinul alb și cel roșu.
Strugurii și vinurile prezintă o diversitate de compuși fenolici non-volatili. Aceștia se găsesc atât în forme conjugate cât și în forme libere: pot fi legate la una sau mai multe molecule de zahăr (și anume: glucoză, galactoză, manoză și zaharoză) rezultând mono-, di-, tri- sau tetraglicozide.
Acizi fenolici
Acizii fenolici sunt împărțiți în două grupe principale:
Acizi benzoici: conțin 7 atomi de carbon (C6 – C1);
Acizi cinamici: conțin 9 atomi de carbon (C6 – C3).
Acești compuși se regăsesc predominant ca acizi hidroxibenzoici și hidroxicinamici care pot apărea fie în forma lor liberă, fie în formă conjugată.
Acizii hidroxibenzoici (AHB) cei mai abundenți în stuguri și vin sunt: acidul parahidroxibenzoic, acidul vanilic, acidul siringic și acidul galic. Cel din urmă este cel mai important compus fenolic deoarece este precursorul tuturor taninurilor hidrolizabile.
Acizii hidroxicinamici (AHC) sunt unii printre cei mai reprezentativi; dintre aceștia fac parte: acizii para-cumaric, cafeic, ferulic și sinapic. Principalul acid hidroxicinamic găsit în struguri și vinuri este acidul caftaric (esterul acidului cafeic cu acidul tartric). Acizii hidroxicinamici sunt asociați procesului de rumenire și sunt precursorii compușilor fenolici volatili. Acizii trans-caftaric și trans-fertaric se găsesc în pulpa strugurelui, iar în timpul presării acestora, ei sunt eliberați repede în suc (sau vin). În schimb, izomerii cis și trans ai acidului p-coutaric sunt mai puțin extractibili deoarece aceștia sunt localizați în mare parte în pielița strugurelui. Acizii hidroxicinamici și esterii lor tartrici reprezintă clasa principală de fenoli în vinurile albe.
Tabelul 1.1. Compușii fenolici din vin
Flavonoide
Flavonoidele prezintă o structură de bază de 15 atomi de carbon, cuprinzând două inele aromatice legate de catena atomului de carbon 3 (C6-C3-C6). Această structură este responsabilă pentru diversitatea chimică a acestei familii de compuși. Flavonoidele cuprind diferite tipuri de compuși, cum ar fi flavone, flavonoli, flavanone, flavononoli, flavane, flavanoli, antocianidine și antociani, calcone și dihidrocalcone. Cele mai mari concentrații de flavonoli în struguri au fost găsite în perioada de înflorire, urmată de o scădere odată cu creșterea în dimensiune a strugurelui. Cea mai mare creștere în flavonoli în boabe poate fi observată cu 3-4 săptămâni după faza de pârgă.
Deși flavonele sunt larg distribuite în plante, ele nu sunt prezente în cantități semnificative în struguri.
Flavonolii sunt caracterizați de prezența legăturii duble dintre atomii C2 și C3, și o grupare hidroxil în C3, astfel fiind deseori numiți 3-hidroxiflavone. Aproximativ 90% din flavone sunt hidroxilate în C3, C5 și C7, astfel fiind desemnați ca derivați 3,5,7-trihidroxilati. În struguri, au fost identificate: quercetina (3′,4′-diOH), kaempferolul (4′-OH), miricetina (3′,4′,5′-triOH). În vinul alb, au fost detectate doar quercetina, kaempferolul și isoramnetina, lipsind miricetina, laricitrina și siringetina. [4]
Flavononolii sunt caracterizați prin absența dublei legături în inelul heterociclic, și de prezența unei grupări hidroxil în poziția C3, fiind numiți și 3-hidroxiflavonone sau dihidroflavonoli. Elementul cel mai important din această categorie este taxifolinul.
Flavanolii: atat flavan-3-olii cât și flavan-3,4-diolii pot fi găsiți în fructe. Flavan-3,4-diolii sunt adesea menționate ca leucoantocianidine. Acești compuși sunt prezenți în pielița și semințele de struguri, precum și în vin. Cei mai abundenți flavan-3-oli în natură sunt catechinele și epicatechinele. În vinurile albe catechina este cel mai abundent flavonoid, contribuind la gustul caracteristic al vinului.
Pigmenții antocianici sunt responsabili pentru culoarea strugurilor și vinului. În strugurii roșii și vin, au fost identificați șase antocianidine: cianidina (roșu portocaliu), peonidina (roșu), delfinidina (roșu albăstrui), pelargonidina (portocaliu), petunidina și malvidina (roșu albăstrui). Antocianinele sunt găsite doar în pielița strugurelui (uneori și în pulpă), în timp ce flavonoidele se găsesc atât în pieliță cât și în semințe. Cantitatea de antocianine și flavonoide extrase după vinificație depinde de durata procesului și de condițiile în care are loc acesta, cum ar fi temperatura sau gradul de perturbare a strugurilor.
Taninuri
Taninurile hidrolizabile sunt polifenoli complecși care pot fi degradați prin modificări ale pH-ului precum și prin hidroliza enzimatică sau neenzimatică, punând în libertate monoglucide (oze) sau acizi fenolcarboxilici. Unitatea de bază a taninurilor hidrolizabile este acidul galic și acidul hexahidroxidifenic și derivații acestora (de exemplu, acidul elagic). Taninurile hidrolizabile, au fost numite și galotaninuri (care hidrolizează în acid galic) sau elagitaninuri (care hidrolizează în acidul elagic).
Extracția compușilor fenolici este favorizată de învechirea vinului în butoaie de stejar. Cei mai importanți compuși din această clasă sunt miricetina și acidul elagic. Cel din urmă este cunoscut ca și component caracteristic format prin învechirea vinului în baric, motiv pentru care este considerat ca și “marker” de maturitate pentru acest tip de vin.
Taninurile condensate (sau proantocianidinele) sunt compuși polimerici care dau naștere antocianidinelor. Cantitatea, structura și gradul de polimerizare al taninurilor nehidrolizabile depinde de localizarea lor specifica în țesuturile strugurelui. Acești compuși sunt transferați în must în timpul operațiunilor de vinificație (precum zdrobirea, macerarea și fermentația). Taninurile condensate ce se găsesc în proporție mare în struguri și vinuri sunt procianidinele și prodelfinidinele, care hidrolizează la cianidină, respectiv delfinidină. Taninurile din semințele de struguri sunt polimeri ai flavan-3-olilor (catechină și epicatechină) și monomeri ai (-)-epigalocatechinei. Taninurile din pielița strugurilor conțin (-)-epigalocatechină și urme de (+)-galocatechină.
În cercetările științifice, proantocianidinele constituie un subiect important datorită influenței majore asupra caracteristicilor senzoriale ale vinurilor (culoare, gust, astringență și amărăciune). De asemenea, taninurile nehidrolizabile joacă un rol important în procesul de învechire a vinului, având în vedere capacitatea de oxidare, condensare și polimerizare a acestor compuși.
Stilbeni
Stilbenii sunt compuși fenolici care conțin două inele aromatice legate printr-o catenă trans-etenă. Unul dintre stilbenii cei mai studiați, din punct de vedere al prezenței în struguri și vin, este resveratrolul (3,5,4′-trihidroxistilbeni). Cercetătorii științifici au identificat acest compus chiar și în vița-de-vie și pielița strugurelui, observând o concentrație foarte mică la maturarea strugurilor. Aceste vinuri rezultate din perioade lungi de maturare au un conținut ridicat de resveratrol, concentrația acestui compus fiind de asemenea mai mare în vinurile roșii în comparație cu cele albe. Un procentaj mare de cis-resveratrol este prezent în vin, deși acest izomer se dovedește a fi prezent în struguri doar în urme.
Cumarine
Cumarinele au în structura lor 9 atomi de carbon, formula chimică fiind C9H6O2. Cumarina este o lactonă stabilă, ce se regăsește liber în fân și sulfină. Este utilizată pe scară largă în industria parfumeriei, datorită mirosului dulce, de fân și iarbă proaspăt cosită. De asemenea, aceasta se regăsește și în lemnul de stejar, astfel că din butoi, cumarinele trec în vinul maturat. Cantitățile prezente în vin sunt foarte mici însă detectabile organoleptic.
Cele mai multe cumarine prezente în struguri și vinuri sunt cele simple. În general, cumarinele naturale simple se caracterizează printr-o mare diversitate diferențiindu-se în principal prin gradul de oxigenare al fragmentului de benzopiran. Hidroxilarea în C7 este cea mai comună. Caracteristicile chimice ale cumarinelor simple sunt dependente de precursorii lor biosintetici: acidul para-cumaric eliberează 7-hidroxicumarina/umbeliferona, acidul cafeic eliberează esculina iar acidul ferulic scopoletina.
Derivați ai feniletanolului
Derivații feniletanolului sunt alcooli superiori ce se formează în timpul procesului de fermentație, prin transformarea microbiană a aminoacizilor. Tirozolul, de exemplu, este un alcool fenolic obținut din tirozină, datorită acțiunii unui anumit tip de drojdii. Cantitatea de tirozol din vin s-a dovedit a fi independentă de tipul sau de vârsta vinului.
Lignani și neolignani
Lignanii și neolignanii provin din plante, fiind derivați din fenilalanină prin dimerizarea acidului cinamic la dibenzobutan. În figura 1.1 sunt prezentate structurile chimice ale lignanilor și neolignanilor.
Fig. 1.1 Stanga: lignan; Dreapta: neolignan
Cea mai mare cantitate de lignani se găsește în semințele de in și susan, iar în vin variază între 70 și 91 µg/100ml vin roșu și 16-26 µg/100ml vin alb. [6]
Rolul polifenolilor asupra organismului uman
Factorul principal ce a atras atenția cercetătorilor este varietatea și complexitatea structurilor chimice ale polifenolilor, precum și efectul acestora asupra organismului uman în urma consumului produselor alimentare ce au în compoziție aceste structuri.
Mecanismul polifenolilor acționează în prevenirea anumitor boli.
Pentru a stabili efectele consumului de polifenoli în sănătatea omului și pentru o mai bună identificare a celor ce oferă cea mai mare eficiență în prevenirea bolilor, cel mai important este să se determine natura și distribuția acestor compuși în alimentația umană și, de asemenea, să se cunoască biodisponibilitatea (cantitatea raportată la viteza de absorbție în organism, în care acești compuși ajung la locul de acțiune, manifestând efectul biologic).
Principalul rol il reprezintă capacitatea antioxidantă. Polifenolii, ca și antioxidanți, protejează celulele împotriva efectelor dăunătoare ale oxidării. Astfel, acești compuși, limitează riscul diferitelor boli.
Polifenolii previn bolile cardiovasculare, cancerul, osteoporoza, diabetul zaharat și bolile neurodegenerative. Polifenolii limitează dezvoltarea leziunilor de aterom, inhibând oxidarea lipoproteinelor cu densitate joasă, acțiune ce este considerată a fi un mecanism esențial în leziunile endoteliale ce apar în ateroscleroză. [6]
Un aport semnificativ de polifenoli este dat în principal de consumul de suc de fructe și produse derivate din fructe (în special ceaiul și vinul roșu). În general, se ajunge la concentrația maximă de polifenoli după 1-2 ore de la ingestie.
Massimo D’Archivio a urmărit biodisponibilitatea polifenolilor în organism, analizând diverse probe precum: suc de portocale, suc de struguri, suc cu extract de fructe, vin, ceai verde, ceai negru, semințe de struguri, mere, ceapă, ceai de hrișcă, boabe de soia, lapte de soia, cafea. Conceptul de biodisponibilitate integrează mai multe variabile precum: absorbția intestinală, metabolismul intestinal și hepatic, absorbția celulară, acumularea în țesuturi, excreția biliară și urinară. În urma studiului se observă că quercetina din ceapă prezintă cea mai mare concentrație în plasmă, însă în urma gătirii, ceapa și roșiile își pierd aproximativ 75% din conținutul inițial după fierbere, 65% după gătitul în cuptorul cu microunde și 30% după prăjire. [5]
CAPITOLUL 2
Metode de analiză a polifenolilor din vin
În ultimii ani, compușii fenolici au trezit un mare interes, mai ales în domeniul cercetării oenologice, aceștia contribuind la gustul amar al vinului, precum și la culoare (în cazul vinurilor roșii, polifenolii stabilizează culoarea în timpul depozitării). Un al motiv de interes îl reprezintă valoarea nutrițională a acestora. Polifenolii reduc riscul bolilor cronice și, în general, au un efect pozitiv asupra sănătății, acționând ca și antioxidanți, antiinflamatori, antitrombotici, antivirali și antibacteriali. Este dovedit faptul că un consum regulat de fructe, legume și produse derivate din acestea, bogate în polifenoli, reduce riscul anumitor tipuri de cancer și boli cardiovasculare.
Studiile epidemiologice au constatat că aportul regulat de vin cu conținut ridicat de polifenoli (vin roșu) are un efect pozitiv asupra sanătății umane. De aceea determinarea compoziției chimice, conținutului de polifenoli și a capacității antioxidante a vinului ar putea fi utilă pentru interpretarea studiilor epidemiologice.
Compoziția chimică a vinului și conținutul de polifenoli se poate determina prin diverse metode:
Metode electrochimice: voltametrie puls-diferențială (DPV), voltametrie ciclică (CV), amperometrie cu injecție în flux și detecție electrochimică (FIA-ED)
Metode electroforetice: electroforeza capilară (EC)
Metode cromatografice: cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), cromatografie pe strat subțire (CSS), cromatografie gazoasă(GC)
Metode spectrometrice: metoda Folin-Ciocâlteu
în combinație cu diferiți detectori:
UV-Vis
Detector cu fotodiode (PDA)
Detector cu rețea de diode (DAD)
Spectrometru de masă (MS)
Detector electrochimic (EC)
Detector cu fluorescență.
Cel mai utilizat este RP-HPLC (cromatograful lichid de întaltă performanță cu fază inversă, caz în care faza mobilă este reprezentată de un solvent polar, iar faza staționară este nepolară și hidrofobă) cu detecție UV-Vis și/sau spectrometrie de masă (LC-MS) sau în tandem (LC-MS/MS).
Unele analize nu necesită prepararea prealabilă a probelor de vin înainte de injectarea în HPLC, însă în cazul unor cromatograme complexe această etapă este necesară și foarte importantă. De aceea, cele mai utilizate metode pentru prepararea probelor sunt extracțiile lichid-lichid și extracțiile în fază solidă. [7], [8]
Metode electrochimice
Pentru caracterizarea polifenolilor din vin au fost propuse diverse metode electrochimice, deoarece toate moleculele de polifenoli din vin sunt active din punct de vedere electrochimic.
Analiza voltametrică se datorează variației de potențial și oferă informații despre analit prin înregistrarea curentului generat și analiza voltamogramei obținute. Voltametria ciclică (CV) a fost prima metodă electrochimică folosită pentru caracterizarea polifenolilor și pentru determinarea conținutului total de polifenoli din vinuri. Pentru aceasta se lucrează la temperatura camerei cu un potențiostat fixat la o anumită viteză de polarizare. Voltametria puls-diferențială (DPV) a fost utilizată de către diverși cercetători științifici pentru detecția polifenolilor din alimente, în special pentru caracterizarea flavonoidelor și acizilor fenolici din sucurile din fructe.
S-au mai folosit și metodele de analiză cu injecție în flux și detecție electrochimică (FIA-ED). Principiul metodei constă în măsurarea curentului la un potențial constant. De asemenea se folosește un potențiostat, sistemul fiind format și dintr-o pompă, o supapă de injecție și o celulă electrochimică. Semnalul produs în urma transferului de electroni este înregistrat și analizat. [7], [9], [10]
Metode spectrometrice
De obicei, polifenolii sunt determinați prin spectrometria de absorbție moleculară UV-VIS, prin utilizarea reactivului Folin-Ciocâlteu (FCR). Această procedură se folosește și în industria vinului, caz în care se ia ca standard acidul galic. Doar în anumite condiții specifice, FCR reacționează cu compușii fenolici (de exemplu, este necesar un mediu bazic). Determinarea conținutului total de polifenoli cu reactivul Folin-Ciocâlteu constă în reducerea complexului fosfowolframat-fosfomolibdat (H3PW12O40 – H3PM12O40 ) de către fenoli, la produși de reacție colorați în albastru (datorită formării ionului Mo4+). După această reacție, pentru realizarea determinării se folosește un spectrofotometru, iar absorbanța se poate măsura la lungimea de undă de 750 nm. Curba de calibrare obținută (absorbanța vs. concentrația standardului) a fost folosită pentru cuantificarea conținutului de polifenoli. Rezultatele se pot exprima fie prin mg echivalenți de catechine pe L de vin (mg CE/L) fie prin mg echivalenți de acizi galici pe L de vin (mg GAE/L). [9]
Un dezavantaj important al măsurătorilor spectrometrice ar putea fi lipsa de selectivitate corespunzătoare acestor metode, mai ales din cauza supraestimării conținutului fenolic. Chiar și așa, acest procedeu este convenabil, comod, simplu și reproductibil, fiind comun acceptat și utilizat în analizele de rutină din laboratoarele de pretutindeni. [7], [11]
Metode electroforetice
Electroforeza capilară constă în separarea electrochimică a analiților, pe o capilară cu soluție tampon. La aplicarea unui potențial electric, are loc migrarea electroosmotică (o deplasare a contraionilor, a ionilor electrolitului și a moleculelor de apă, de la anod la catod).
Electroforeza capilară zonală s-a aplicat și în combinație cu izotacoforeza pentru separarea și cuantificarea flavonoidelor și acizilor fenolici. Izotacoforeza se bazează pe migrarea diferită într-un camp electric, a ionilor componenților din proba de analizat. Proba introdusă între doi electroliți ce prezintă mobilități electroforetice diferite, se separă în zone, în urma aplicării câmpului electric.
În ultimul timp, electroforeza capilară s-a dezvoltat ca o alternativă pentru cromatografia lichidă, datorită eficacității ridicate, rapidității în analiză și consumului mic de reactivi. De asemenea, aceasta se poate cupla cu spectrometrul de masă (CE-MS). [12]
Cu toate acestea, cromatografia lichidă cu detecție UV sau cu detector spectrometru de masă rămâne tehnica cea mai utilizată pentru identificarea, caracterizarea și determinarea compușilor polifenolici. [13], [14]
Metode cromatografice
Cromatografia gazoasă, cromatografia pe strat subțire și cromatografia lichidă de înaltă performanță sunt tehnicile cromatografice pentru determinarea compușilor fenolici. HPLC s-a dovedit a fi cea mai precisă, selectivă și rapidă metodă. Cromatografia lichidă de înaltă performanță a devenit cea mai aleasă metodă pentru analiza compușilor fenolici din struguri și vinuri.
În funcție de natura compușilor fenolici care se doresc a fi determinați, cerințele generale în cazul unei metode de analiză HPLC, cuprind o etapă de purificare prin extracții lichid-lichid sau extracții în fază solidă (coloane cu gel de silice RP – C18 sau poliamidă), folosind pentru eluare diferiți solvenți în funcție de pH și/sau polaritate. Unele analize nu necesită prepararea prealabilă a probelor de vin înainte de injectarea în HPLC. În alcătuirea unui HPLC intră: recipientele pentru solvenți, sistemul de degazare, sistemul de pompare, sistemul de injecție, coloana cromatografică și detectorul.
Unii compuși fenolici din struguri și vinuri prezintă absorbanțe caracteristice în UV-Vis și de aceea, pot fi detectați cu ușurință prin HPLC de către un detector cu grup de fotodiode (PDA). Antocianii sunt de culoare roșie și arată un maxim de absorbanță la aproximativ 520 nm; flavonolii sunt de culoare galbenă și arată un maxim de absorbanță la aproximativ 360 nm; acizi hidroxicinamici pot fi detectați specific la aproximativ 320 nm. Flavan-3-olii nu au o absorbanță specifică și prezintă un maxim de aproximativ 280 nm. [7], [15]
De asemenea, LC-MS a fost folosită cu succes pentru identificarea compușilor fenolici din probele alimentare, însă acest echipament este foarte scump și de aceea, nu este comun în laboratoare. [16], [17]
Determinarea conținutului de polifenoli din vinul roșu prin metoda voltametrică puls-diferențială, metoda HPLC și metoda spectrometrică Folin-Ciocâlteu
Pentru această analiză au fost alese 11 probe de vin din Croația. Acestea sunt produse cunoscute în rândul consumatorilor. Sunt vinuri roșii obținute din soiuri de struguri din Vitis vinifera L., cultivate din trei regiuni viticole diferite din Croația (Dalmația, Istria și Slavonia). Vinurile sunt îmbuteliate în 2005-2006 și au fost cumpărate din supermarketuri locale, apoi păstrate la temperatura camerei până la analiză. După analiză, probele de vin au fost filtrate printr-un filtru de politetrafluoroetilena (PTFE) de 0,45µm.
Ca și standarde pentru măsurarea conținutului de polifenoli, s-au folosit (+)-catechina și acidul galic. S-au preparat în metanol (cu grad HPLC) soluții stock de 3 g/L (+)-catechina și 5 g/L acid galic. Acestea sunt stabile cel puțin o lună, protejate de lumină printr-o folie de aluminiu și ținute în frigider.
Analize statistice
Toate măsurătorile s-au realizat în triplicat, iar rezultatul s-a prezentat ca valoarea medie ± deviația standard (SD). Au fost facute analize de corelare și regresie cu ajutorul pachetelor software Statistica 7.1 și OriginPro 7.5. Direcția și magnitudinea corelației dintre variabile a fost cuantificată prin coeficientul de corelație, r. Corelațiile au fost considerate statistic semnificative la p<0,05.
Voltametria cu puls diferențial (DPV)
Pentru această analiză s-a utilizat un potențiostat, model 273A, folosind un software electrochimic, model 270/250. Măsurătorile voltametrice s-au efectuat într-o celulă electrochimică cu trei electrozi standard, un electrod de carbune sticlos (GC) cu un diametru de 3mm ca electrod de lucru, un electrod de calomel saturat (SCE) ca electrod de referință și unul de platină ca și contra electrod. Înaintea fiecarei măsurători, suprafața electrodului de lucru GC a fost curățată cu grijă cu pulbere de alumină de 0,3-0,05µm și apoi clătită bine cu apă bidistilată. Imediat după măsurătorile DPV, electrodul GC a fost curățat electrochimic prin voltametrie ciclică, scanând 5-10 cicluri în intervalul potențial -0,2 și 1,0 V, la o rată de scanare de 50 mVs-1, în electrolitul suportat (soluție tampon de acetat de sodiu-acid acetic, de 0,1 mol dm-3 cu pH 3,6). Probele din celula electrochimică au fost deaerate în timpul măsurătorilor electrochimice, prin purjare cu argon de înaltă puritate.
După curățarea electrochimică a electrodului GC, cu ajutorul unei micropipete s-a adăugat volumul necesar de probă (soluție de catechină sau vin) în interiorul electrolitul suportat, în celula electrochimică. S-au înregistrat voltamogramele cu puls diferențial, la absorbanța minimă a polifenolilor pe suprafața electrodului GC.
Condițiile de analiză DPV:
Intervalul de scanare de la 0,0 la +1,0 V
Amplitudinea pulsului 50 mV
Durata pulsului 70ms
Rata de scanare 5 mVs-1
Toate măsurătorile s-au realizat de cel puțin 3 ori (în triplicat).
Probele de vin au fost diluate astfel: 1/100, 1/200, 1/400, 1/600 și 1/800 (v/v) cu soluție tampon (pH 3,6) acetat de sodiu – acid acetic 0,1 mol dm-3, pentru a obține o corelație liniară între intensitatea curentului picului anodic și fracțiunea de volum a vinului. Diluțiile de 1/400 s-au dovedit a fi optime, iar parametrii electrochimici obținuți pentru această diluție au fost folosiți pentru cuantificarea conținutului de polifenoli.
Curba de calibrare a standardului de catechină s-a realizat prin reprezentarea grafică a intensității curentului a primului pic anodic de catechină vs. concentrația corespunzatoare de catechină. Conținutul total de polifenoli în vin determinat prin metoda voltametrică cu puls diferențial, TPDPV, a fost calculat folosind curba de calibrare și s-a exprimat prin echivalenți de catechină pe litru de vin nediluat (mg CE/L).
Pentru exprimarea conținutului total de polifenoli din vinurile roșii analizate, s-a folosit ca și standard (+)-catechina. Curba de calibrare a fost construită prin trasarea intensității curentului electric vs. concentrația de (+)-catechină. Curba rezultată este liniară în intervalul de concentrație de 1-15 mg/L și este descrisă de ecuația: ip (µA cm-2) = 0,3637 x + 1,1025, unde ip este intensitatea curentului picului și x este concentrația de catechină exprimată în mg/L (coeficientul de corelație, R=0.9977). Limita de detecție (LOD) a fost calculată cu parametrii obținuți din curba de calibrare folosind formula: LOD = 3 Sa /b, unde Sa este deviația standard a interceptului y al liniei de regresie și b este panta curbei de calibrare. LOD a catechinei a fost 0,53 mg/L. De asemenea, s-a calculat și limita de cuantificare (LOQ) prin formula: LOQ = 10 Sa /b, iar valoare obținută a fost 1,77 mg/L.
În timpul pulsului diferențial, polifenolii din vin au fost oxidați. Potențialul de electrod este scanat în direcția pozitivă. Răspunsul curentului global este suma oxidărilor diferitelor specii de polifenoli din vin. Rezultatul este exprimat ca mg echivalenți catechină pe litru de vin (mg CE/L) ± SD (deviația standard) a trei analize independente.
Tabelul 2.1. arată că fiecare vin a avut un conținut mare sau chiar foarte mare de polifenoli. Vinurile roșii din Dalmația au avut cel mai mare conținut de polifenoli, în timp ce vinurile din Croația au avut un conținut de polifenoli destul de scăzut.
Tabelul 2.1. Conținutul total de polifenoli (TP) din vinurile roșii din Croația, măsurat prin voltametrie cu puls diferențială (DPV), Folin-Ciocalteu (FC) și HPLC
Determinarea spectrofotometrică a conținutului de polifenoli
Determinarea spectrofotometrică a conținutului de polifenoli s-a realizat prin metoda Folin-Ciocâlteu adaptată pentru analiza vinului, folosind ca standard acid galic sau catechină. Pentru cuantificarea conținutului TPFC s-a folosit curba de calibrare (absorbanța vs. concentrația standardului). Rezultatele s-au exprimat ca echivalenți de catechină în mg pe litru de vin (mg CE/L) sau mg echivalenți acid galic pe litru de vin (mg GAE/L).
În aceast studiu, conținutul total de polifenoli din vinuri a fost exprimat atât prin mg echivalenți catechină (mg CE/L) cât și mg echivalenți acid galic (mg GAE/L). Tabelul 2.1. oferă valorile obținute TPFC ± SD. Aceste valori cuprinse între 934-3013 mg CE/L sau 1012-3264 mg GAE/L, au fost cu 1-20% mai mari (în funcție de marca vinului) față de cele obținute prin metoda DPV. Aceste valori mari se explică prin faptul că reactivul FC nu este specific doar pentru compușii fenolici. Valorile pot fi reduse de prezența compușilor nefenolici, incluzând ascorbat, sulfit și zaharuri reducătoare.
În ciuda diferențelor dintre rezultatele celor două metode, s-a obținut o corelație bună între conținutul TP (mg CE/L) determinat prin metoda DPV și cel determinat prin metoda Folin-Ciocalteu: R=0,99872. În comparație cu alte articole științifice în care se folosește aceeași metodă, valorile obținute sunt asemănătoare. În schimb, un alt autor a identificat în 2004, un conținut mai mare de polifenoli în vinurile roșii din Croația, obținând valori între 2542-4979 mg GAE/L. [9]
Dacă se analizează rezultatele științifice din alte țări, se observă diferențe, chiar și foarte mari, și asta datorită faptului că vinurile provin din soiuri diferite de struguri, sunt urmate diferite procese de viticultură și vinificație, sunt cultivate pe diverse tipuri de sol, din diferite zone geografice și multe alte diferențe (uneori necunoscute) între procesul de creștere a strugurilor și cel de vinificație. [18]
Analiza compoziției vinului și conținutului de polifenoli prin HPLC
Pentru caracterizarea polifenolilor din vin s-au folosit standardele de polifenoli (acid galic, (+)-catechină, (-)-epicatechină, acid cafeic, acid p-cumaric și quercetină). Curbele de calibrare s-au realizat prin diluarea soluțiilor stock cu metanol, la concentrații ale standardului din intervalul 1-100 mg/L acid galic, (-)-epicatechină, acid cafeic, acid p-cumaric și quercetină, și 1-125 mg/L pentru (+)-catechină. Curbele de calibrare s-au realizat cu ajutorul ariilor picurilor din cromatograme vs. concentrația standardului. Toate standardele au dat curbe de calibrare liniare în intervalul de concentrații studiat (r = 0,9988 – 0,9990). Limitele de detecție (LOD) au fost calculate prin parametrii obținuți din curbele de calibrare, folosind formula LOD=3 x Sa/b, unde Sa este deviația standard a interceptului liniei de regresie (y) și b este panta curbei de calibrare. LOD a fost 1,3 mg/L pentru acidul galic, 0,3 mg/L pentru acidul cafeic, 0,6 mg/L pentru acidul p-cumaric, 0,5 mg/L pentru quercetină, 0,6 mg/L pentru (+)-catechină și 0,4 mg/L pentru (-)epicatechină.
Conținutul de polifenoli în vin (flavonoli, flavan-3-oli și acizi fenolici) a fost determinat prin metoda RP-HPLC. Acest aparat este format dintr-un sistem LC Varian (USA) echipat cu un modul de transport al solventului ProStar 230 și un detector PDA ProStar 230. Separarea conținutului de fenoli s-a efectuat printr-o coloană OmniSpher C18 (25cm x 4,6mm) atașată de o precoloană (1cm x 3mm).
Flavonolii, flavan-3-olii și acizii fenolici prezenți în vinuri au fost separați folosind acid fosforic 0,1% ca solvent A, iar ca solvent B s-a folosit metanol 100% (cu grad HPLC).
Condițiile de eluție:
0-30 min de la 5% la 80% B
30-33 min 80% B
33-35 min de la 80% B la 5% B
Debitul = 0,8 mL/min
Condițiile de operare: temperatura coloanei: 20oC, volumul injectat: 10 µL
Între analizele individuale s-a impus un interval de echilibrare de 10 min. Spectrele UV-Vis au fost înregistrate la lungimile de undă între 190 și 600 nm. Lungimile de undă ale detectorului au fost: 280 nm pentru acid galic, (+)-catechină și (-)-epicatehină, 320 nm pentru acid cafeic și p-cumaric și 360 nm pentru quercetină.
Probele de vin au fost fortificate cu standardele de fenoli, pentru identificarea adițională a polifenolilor individuali. Flavonolii, flavan-3-olii și acizii fenolici identificați, au fost cuantificați folosind curba de calibrare ale standardelor autentice. Conținutul de TP a fost determinat prin aria totală din cromatogramele RP-HPLC la 280 nm, și exprimat prin mg GAE/L de vin (TPHPLC).
De asemenea, în tabelul 2.1. sunt observate și conținuturile TP ale vinurilor roșii determinate prin ariile totale ale cromatogramelor HPLC la 280 nm și sunt exprimate prin mg GAE/L de vin ± SD (TPHPLC). Valorile sunt cuprinse între 1002 mg GAE/L și 2760 mg GAE/L. Diferențele în conținutul TP determinat prin HPLC și FC au fost de 14-17% în vinuri cu conținut polifenolic ridicat, în timp ce în alte vinuri roșii aceste diferențe au fost de 1-8%. Sunt polifenoli care nu s-au detectat prin RP-HPLC, însă, chiar și așa, s-a obținut un coeficient de corelație foarte bun, de 0,9923, între rezultatele obținute prin HPLC și cele prin FC.
În tabelul 2.2. sunt prezentate valorile obținute în urma determinării conținutului de polifenoli prin metoda HPLC exprimate cu ± deviația standard a determinărilor în triplicat.
Tabelul 2.2. Conținutul de polifenoli (mg L-1) determinat în unele vinuri roșii din Croația prin metoda HPLC
Vin acid galic acid cafeic acid p-cumaric (+)-catechină (-)-epicatechină quercetină
Cromatogramele obținute sunt prezentate în figura 2.1. În această imagine se regăsesc picurile polifenolilor determinați în vinurile roșii: (+)-catechină, (-)-epicatechină, quercetină, acidul galic, acidul cafeic și acidul p-cumaric. Se observă că principalul acid fenolic a fost acidul galic (cu valori cuprinse între 51,2 și 179,4 mg/L de vin), în timp ce principalul flavonoid a fost (+)-catechină (cu valori cuprinse între 31,0 și 138,0 mg/L). [9]
Fig. 2.1. Cromatogramele vinului roșu Dingač la 280, 320 și 360 nm. Identificarea picurilor: 1.acid galic; 2.(+)-catechină; 3.(-)-epicatechină, 4.acid cafeic, 5.acid p-cumaric, 6.quercetină
Rezultatele obținute de M. Šeruga în acest articol, sunt asemănătoare cu cele ale altor cercetători, în urma utilizării acestei metode pentru vinurile roșii. De asemenea, majoritatea au concluzionat același raport: principalii compuși fenolici din vinurile roșii sunt acidul galic și (+)-catechina, obținându-se valori pentru acidul galic de 37-108 mg/L și 26-223 mg/L pentru catechină, în Australia; vinurile roșii italiene au 47,21-325,48 mg acid galic/L de vin și 48,01-179,41 mg catechină/L de vin, iar unele vinuri din Ungaria au: 29,7-79,2 mg acid galic/L de vin și 62,1-103 mg catechină/L de vin. [19], [20]
În concluzie DPV s-a dovedit a fi o metodă sensibilă și selectivă pentru scopul ales. S-a obținut o bună corelație între conținutul TP măsurat prin cele trei metode, DPV, FC și HPLC. Prin analiza HPLC s-a concluzionat faptul că cei mai abundenți compuși fenolici din vinurile roșii analizate sunt acidul galic și (+)-catechina. Diversele variații se datorează culturilor diferite, regiunilor geografice și procedurilor diferite de vinificație din Croația. Vinurile roșii din Dalmația, regiune ce prezintă o climă mediteraneană, au conținutul cel mai ridicat de polifenoli și cea mai mare concentrație de antioxidanți importanți precum catechina, epicatechina, quercetina, acidul galic, acidul cafeic și acidul p-cumaric.
Determinarea polifenolilor din vin prin electroforeză capilară
Renato G. Peres și colaboratorii au realizat un studiu pentru determinarea simultană a polifenolilor și acizilor fenolici din vin, prin electroforeză capilară (resveratrol, patru acizi fenolici: siringic, cumaric, cafeic și galic; cinci flavonoizi: catechină, rutină, kaempferol, miricetină și quercetină).
În acest studiu, s-a utilizat un sistem de electroforeză capilară HP3DCE Agilent cu un detector DAD, setat la lungimea de undă de 280 nm. Temperatura este stabilizată la 25oC. Probele și soluțiile standard au fost injectate hidrodinamic (50 mbar la 3s) și la tensiunea constantă de 25 kV. Coloana capilară este de siliciu topit și are dimeniuni de 48,5cm ca lungime totală, 40,0cm lungime efectivă, 75mm diametru intern și 375mm diametru exterior.
Reactivii s-au folosit fără purificare anterioară, fiind toate cu grad cromatografic. Soluțiile standard stock a fiecărui compus fenolic au fost preparate la 1000 mg/L într-o soluție de apă/etanol 60:40 v/v. Soluțiile de lucru au fost preparate prin amestecarea volumelor de soluție stock necesare, cu soluția de apă/etanol 60:40 v/v. Soluțiile standard sunt stabile timp de trei luni.
S-au analizat 23 de probe de vinuri de diferite tipuri și mărci din Brazilia. Toate vinurile au fost ținute la întuneric, la 4oC. Conținutul a două sticle proaspăt deschise, a fost amestecat și s-a extras 1 ml cu 1,6 mL eter etilic, apoi s-a acidificat cu 100 mL HCl la un agitator magnetic timp de 15 min. Faza organică a fost separată de faza apoasă, uscată cu azot și dizolvată cu 2,5 mL soluție etanol/apă 60/40 v/v. Probele au fost filtrate printr-o membrană de 0,45 mm.
Analiții au fost identificați prin compararea timpilor de migrare ale standardelor cu cele ale vinurilor fortificate cu standarde în condiții identice, cu ajutorul spectrelor soluțiilor migrate, obținute cu un detector DAD.
În analiza prin electroforeză capilară, noile capilare au fost testate și condiționate în fiecare zi de analiză prin purjări de 20 psi (“pounds per square inch”) folosind o soluție de NaOH de 1 mol/L NaOH (5-30 min), urmată de apă ultrapură (5-30 min). Între execuții, capilara a fost purjată cu soluția de electrolit (1min). Soluția de electrolit se prepară zilnic și se filtrează printr-o membrană de 0,45 mm. Toate standardele și probele au fost injectate în triplicate.
Compoziția electrolitului și condițiile instrumentale în electroforeza capilară au fost optimizate iar variabilele cele mai influente au fost: tetraborat de sodiu (STB sau borax), metanolul și interacțiunea lor. Condițiile electroforetice optime au fost: 17 mmol/L STB (valoare stabilită având în vedere necesitatea de a menține pH-ul stabil în toate analizele) cu 20% metanol ca electrolit, tensiune constantă de 25kV, injecție hidrodinamică la 50 mbar la 3s și temperatura de 25oC.
Liniaritatea a fost evaluată prin injectarea a 5 soluții standard ale fiecărui compus la concentrații ce au variat între 2,5 și 220 mg/L. LOD și LOQ au fost calculate prin folosirea unor soluții a căror concentrații dau raporturi semnal/zgomot de 3 respectiv 10. Precizia timpilor de migrare și a picurilor a fost evaluată prin 10 injecții consecutive ale soluțiilor standard. Recuperarea a fost studiată la trei niveluri, fiecare nivel injectat în triplicat.
La intervalul de concentrații analizat, de 2,5-220 mg/L, metoda este liniară, obținându-se valori bune ale coeficientului de corelație. Valorile R2 au variat între 0,994 și 0,999; LOD și LOQ au fost 0,1-0,3 mg/L și 0,4-0,8 mg/L. Valorile RSD obținute pentru timpii de migrare și ariile picurilor de la 10 injecții consecutive au fost mai mici decât 2% și recuperările au variat de la 97 la 102%.
Electroforegramele obținute în acest studiu sunt prezentate în figurile 2.2, 2.3 și 2.4. În figura 2.2 sunt identificate picurile standardelor de compuși fenolici din amestecul injectat în condițiile descrise anterior. În figura 2.3 sunt identificate picurile compușilor fenolici din vinurile roșii analizate. În figura 2.4 sunt identificate picurile compușilor fenolici din vinurile albe analizate.
Fig. 2.2. Electroforegramă – standarde: 1. Resveratrol; 2. Catechină; 3. Rutină; 4. Acid siringic; 5.Kaempferol; 6. Acid p-cumaric; 7. Miricetină; 8. Quercetină; 9. Acid cafeic; 10. Acid galic
Fig. 2.3. Electroforegramă – vin roșu: 1. Resveratrol; 2. Catechină; 3. Rutină; 4. Acid siringic; 5.Kaempferol; 6. Acid p-cumaric; 7. Miricetină; 8. Quercetină; 9. Acid cafeic; 10. Acid galic
Fig. 2.4. Electroforegramă – vin alb: 1. Resveratrol; 2. Catechină; 3. Rutină; 4. Acid siringic; 6.Acid p-cumaric; 8. Quercetină; 9. Acid cafeic; 10. Acid galic
În analiza compușilor fenolici din toate vinurile testate au fost determinați doi acizi: acidul galic (15,0-69,9 mg/L în vinurile roșii, 1,6-2,9 mg/L în vinurile albe) și acidul cafeic (11,7-17,9 mg/mL în vinurile roșii, 1,8-4,4 mg/L în vinurile albe).
German și Walzem au găsit miricetină (2-45 mg/L) și quercetină (5-53 mg/L) doar în vinurile roșii analizate de aceștia, însă Peres și colaboratorii au identificat în vinurile din Brazilia, miricetină în toate vinurile roșii (11,1-12,8 mg/L) și într-un vin alb (1,6 mg/L), iar quercetina a fost găsită de asemenea, în toate vinurile roșii (1,0-15,9 mg/L) și într-un vin alb (1,7 mg/L). [21]
Acidul siringic a fost găsit decât în 7 din 11 vinuri roșii analizate (4,4-4,9 mg/L) și doar într-un singur vin alb (1,3 mg/L). În acest caz, German și Walzem au obținut valori între 4,2 și 5,9 mg/L pentru vinurile roșii, fiind în același interval de valori ca și cel pentru vinurile roșii din Brazilia analizate de Peres și colaboratorii. [14], [21]
Acidul cumaric s-a identificat în 5 vinuri roșii (10,0-13,6 mg/L), dar nu și în celălalte 6 vinuri. German și Walzem au obținut valori similare însă pentru toate vinurile analizate de aceștia.
Resveratrolul, unul dintre cei mai importanți compuși fenolici din vin, a variat între 1,0 și 3,7 mg/L în vinurile roșii. Din gama vinurilor albe analizate, doar într-unul s-a găsit resveratrol, obținându-se o concentrație scăzută de 0,9 mg/L. Souto, un alt cercetător științific, a obținut o valoare de 0,82-5,75 mg/L resveratrol în 8 vinuri roșii din Brazilia. Valorile identificate de Peres sunt similare cu cele ale lui Souto, însă mai mari comparativ cu cele obținute de German și Walzem în vinurile analizate de aceștia (0,1-2,3 mg/L pentru vinurile roșii). [22]
Catechina a fost identificată cu valori cuprinse între 44,3 și 183,2 mg/L pentru vinurile roșii și 13,6-23,4 mg/L pentru vinurile albe. German și Walsen au obținut: 27-191 mg/L în vinurile roșii și 3-35 mg/L în vinurile albe. Rutina s-a regăsit într-un interval de 12,5-32,4 mg/L în vinurile roșii din Brazilia, mai mult decât au determinat German și Walzem (0,5-10,8 mg/L). Peres a identificat acest compus și în două vinuri albe la 8,9 și 3,2 mg/L. Kaempferol a fost găsit într-un vin roșu analizat de German și Walzen, la 18 mg/L, valoare ce se regăsește în intervalul de 12,1-19,2 mg/L obținut de Peres pentru 9 vinuri roșii analizate în acest studiu științific. Kaempferolul nu a fost găsit în niciunul dintre vinurile albe analizate în aceste studii. [14], [21]
Având în vedere rezultatele obținute de Peres și colaboratorii, această analiză s-a dovedit a fi o metodă simplă și potrivită pentru scopul propus. Optimizarea compoziției electrolitice și condițiile electroforezei capilare au condus la o selectivitate foarte bună. Metoda a obținut valori bune pentru LOD și LOQ, dar și o liniaritate bună. De asemenea, ariile picurilor și timpii de migrare au reflectat o repetabilitate foarte bună, ca și recuperările obținute pentru nivelurile de concentrații studiate. Această metodă, aplicată pe vinurile din Brazilia, arată variația ridicată a valorilor obținute pentru compușii fenolici din vin, ceea ce indică necesitatea unui control de calitate mai bun în producția acestor vinuri. Metoda studiată de Peres și colaboratorii, s-a dovedit a fi foarte potrivită pentru acest tip de determinări. [14]
CAPITOLUL 3
Validarea metodelor analitice
Considerații generale
Validarea unei metode analitice este procesul prin care se stabilește, prin studiile de laborator, dacă metoda este potrivită scopului utilizării (atunci când caracteristicile de performanță ale metodei îndeplinesc cerințele pentru metoda analitică intenționată).
Conform ISO 17025, validarea semnifică confirmarea prin examinare și furnizare de evidențe obiective, că sunt îndeplinite anumite cerințe specifice pentru o utilizare intenționată.
Unul dintre motivele pentru care se obțin rezultate greșite în urma unei analize, îl reprezintă utilizarea unor metode analitice incorecte sau insuficient dezvoltate sau studiate. De aceea, metodele analitice trebuie să fie în primul rând dezvoltate și adaptate în conformitate cu domeniul de aplicabilitate cerut. După ce metoda este dezvoltată, este foarte important ca aceasta să fie imediat validată pentru a se face dovada că este adecvată pentru scopul propus.
Pentru validarea metodelor se disting următoarele etape care trebuie parcurse în procesul de validare a metodelor analitice de încercare:
Exactitatea sau acuratețea,
Precizia (repetabilitatea și reproductibilitatea),
Linearitatea,
Specificitatea,
Sensibilitatea,
Robustețea.
Procedeul de analiză (metoda) se definește ca fiind ansamblul operațiilor necesare pentru a efectua analiza unei substanțe de cercetat: prepararea (pregătirea) probei, materialele de referință și prepararea soluțiilor lor, reactivii necesari, aparatura de utilizat, etalonarea ei, numărul repetițiilor și modul de lucru pentru repetiție.
Validarea metodelor analitice implică respectarea cerințelor metodologiei analitice moderne, care includ la rândul ei următoarele aspecte:
coordonarea armonioasă a protocoalelor studiilor colaborative, interlaboratoare;
alegerea judicioasă a metodelor utilizate în studiile colaborative;
eșantionarea și prelevarea corectă a probelor de analiză;
asigurarea concentrației detectabile prin procedee de îmbogățire și preconcentrare (pretratamentul probei înaintea executării analizei);
efectuarea măsurătorilor analitice privind determinarea speciilor chimice ce compun eșantionul și determinarea concentrației unui component sau dacă este necesar a tuturor componenților;
calcularea rezultatelor analitice și evaluarea acurateții (exactității) metodei de analiză utilizată;
evaluarea preciziei metodei utilizate;
analiza statistică a rezultatelor experimentale, inclusiv a celor din studiile colaborative, interlaboratoare;
prezentarea corectă și onestă a performanțelor metodelor analitice utilizate sau elaborate;
prezentarea datelor privind aplicarea criteriilor de accepătare a validării;
redactarea amănunțită a textelor metodelor analitice validate (standardizate);
utilizarea unor materiale de referință corespunzătoare (de calitate garantată) și norme de certificare a conținutului lor;
controlul de calitate al prelevării probelor din eșantionul dat;
controlul intern de calitate, inclusiv a analizelor;
evaluarea externă a calității, prin inspecții și comparații interlaboratoare.
În multe situații optimizarea parametrilor de operare a echipamentului ar putea fi necesară pentru a obține parametrii optimi de performanță pentru matricea probei analizate. De aceea, optimizarea parametrilor presupune:
alegerea unei metode de compensare a zgomotului de fond;
alegerea unui algoritm de etalonare;
utilizarea unor standarde analitice cu o compoziție (matrice) apropiată de a probei.
Optimizarea determinărilor analitice, adică a proceselor de separare, detecție și dozare, se urmărește concomitent cu asigurarea unui echilibru între beneficiile analizelor și validării și prețul de cost, precum și aplicarea unor criterii de evaluare a rezultatelor metodei de analiză, unanim acceptate pe plan european și mondial.
Caracterizarea parametrilor de performanță ai unei metode analitice
Specificitatea exprimă aptitudinea metodei de analiză de a măsura cu exactitate și în mod specific un parametru anume, independent de toți ceilalți care îl însoțesc, pe o matrice de probă, în condiții de lucru bine stabilite.
Un procedeu analitic este specific dacă el permite detecția sau determinarea unui component dat, dintr-un amestec multicomponent, prin măsurarea cantitativă a unui parametru fizico-chimică caracteristic numai componentului de analizat.
Selectivitatea este definită ca reprezentând abilitatea metodei analitice de a diferenția și a măsura analiții în prezența componenților care sunt așteptați a fi prezenți într-o probă.
Un procedeu analitic este selectiv dacă el permite detecția unui component în prezența altora, dacă în soluție se realizează anumite condiții experimentale de eliminare a interferențelor (sau de diminuare a acestora) prin reglarea pH-ului, prin utilizarea unor agenți de mascare, a unor solvenți etc.
Domeniul de concentrații se referă la setul măsurătorilor/determinărilor pentru care un aparat este omologat și se încadrează în limitele specificate în metoda de analiză.
În domeniul concentrațiilor de lucru răspunsul analitic poate fi liniar sau nu. De aceea, pentru a demonstra acest lucru este necesară realizarea unei etalonări în mai multe puncte.
Liniaritatea reprezintă aptitudinea unei metode de analiză de a da rezultate proporționale cu concentrația analitului. Proporționalitatea poate fi directă sau se stabilește statistic.
Pentru a stabili liniaritatea metodei, trebuie să se efectueze analiza varianței datelor analitice pentru fiecare analit în parte.
Precizia exprimă capacitatea unei analize de a furniza o valoare egală sau foarte apropiată de valoarea reală (adevărată). Aceasta dovedește absența unei erori sistematice. Precizia depinde numai de distribuția erorilor întâmplătoare și nu este legată de valoarea de încredere sau valoarea specificată, redă concordanța care există între rezultatul analizei și valoarea de referință acceptată. Rezultatele considerate ca răspunsuri analitice se pot exprima în % de regăsire.
Precizia se exprimă, în primul rând, ca o abatere standard (s, σ) sau ca o abatere standard relativă procentuală (RSD%). Precizia poate fi luată în considerare la trei nivele: repetabilitate, precizie intermediară și reproductibilitate.
Precizia este o măsură a repetabilității și a reproductibilității rezultatelor analitice, furnizate de o metodă de analiză.
a) Repetabilitatea exprimă apropierea strânsă care există între valorile analitice independente obținute prin aceeași metodă de analiză pe elemente identice analizate, în același laborator de către același operator, utilizând aceași echipament (instrumentar). Repetabilitatea măsoară valoarea analitică minimă sub care se situează cu o probabilitate specifică, valoarea absolută a diferenței dintre două rezultate analitice obținute în aceleași condiții de lucru (același laborator, același aparat, același operator). Se evaluează plecând de la 10 determinări din același eșantion în condiții de lucru concrete. Repetabilitatea se calculează cu ajutorul abaterii standard.
b) Reproductibilitatea exprimă strânsa legătură care există între rezultatele analitice obținute cu aceeași metodă, pe elemente identice, testate în laboratoare diferite, utilizând echipamente diferite (analiza colaborativă). Reproductibilitatea măsoară valoarea sub care se situează, cu o probabilitate specifică, valoarea absolută a diferenței dintre rezultatele analitice individuale obținute de laboratoare diferite, operatori diferiți, prin aceeași metodă de analiză.
De asemenea, reproductibilitatea furnizează o abatere standard SR. Practic, reproductibilitatea poate fi admisă ca o expresie a incertitudinii de măsurare pentru o metodă de analiză folosită în cadrul unui laborator.
c) Precizia intermediară este un termen ce reprezintă variabilitatea pe termen lung a procesului de măsurare atunci când probe identice sunt analizate / măsurate prin aceeași metodă, același laborator, utilizând două sau mai multe instrumente diferite, de către operatori diferiți, pe o perioadă mai lungă de timp și este determinată prin compararea rezultatelor unei metode pentru un singur laborator pentru un anumit număr de săptămâni.
Obiectivul preciziei intermediare este de a verifica că în același laborator metoda va oferi aceleași rezultate odată ce etapa de dezvoltare a metodei este terminată.
Exactitatea, exprimă concordanța dintre valoarea adevărată și rezultatul analitic obținut în urma măsurătorii sau îngustimea acordului dintre valoarea adevărată și cea măsurată.
Exactitatea metodei analitice arată, în ce măsură valoarea determinată pentru un analit într-o probă corespunde valorii adevărate. Aceasta reprezintă abaterea sistematică a rezultatelor măsurate față de rezultatul adevărat.
Limita de detecție (LOD) este cea mai mică concentrație a analitului care dacă este realmente prezent se poate detecta cu o certitudine statistică rezonabilă. Reprezintă concentrația minimă de analit dintr-o probă care poate fi măsurată la nivelul de încredere, dar nu neapărat cuantificată ca o valoare exactă.
Limita de cuantificare (LOQ) este cea mai mică cantitate dintr-o substanță de analizat ce poate fi determinată dintr-un eșantion, cu o exactitate și o precizie acceptabile în condiții experimentale stabilite, descrise.
Robustețea este unul dintre parametrii cei mai importanți în validarea unei metode analitice, deoarece aceasta se referă la capacitatea metodei de a da rezultate identice, în condiții de lucru diferite. Studiul robusteții pentru ansamblul diferitelor categorii de determinări sau teste, permite definirea variațiilor (modificărilor sau a variabilității) admisibile ale oricăruia dintre parametrii operatori, variații care nu au efect asupra validității rezultatelor analitice ce se obțin.
Conform ghidului ICH, robustețea unei metode analitice este o măsură a capacității acesteia de a rămâne neafectată de variații mici, dar deliberate ale parametrilor metodei și oferă o indicație privind siguranța metodei pe parcursul unei utilizări în condiții normale. [23]
Sensibilitatea exprimă aptitudinea unei metode de a distinge diferențe mici între concentrațiile unui analit. Trebuie să se definească pentru un analit, cel mai mic interval de concentrație (ΔX) care dă două rezultate semnificative diferite denumite „puterea de rezoluție” a unei metode de analiză. Teoretic, sensibilitatea este definită ca fiind panta dreptei tangențiale la curba de etalonare.
Recuperarea este adesea tratată ca un parametru de validare separat, însă este necesară evaluarea eficienței metodei în detectarea întregului analit prezent. Studiile de recuperare sau îmbogățire trebuie să fie făcute pentru diferite tipuri de matrice sau pentru fiecare tip de matrice la diferite nivele de concentrație ale analitului.
Pentru determinarea recuperării este necesară analiza unui număr de 6 probe oarbe, iar apoi acestea să fie fortificate fiecare cu aceleași concentrații și analizate din nou. Se calculează mediile valorilor, atât a probelor oarbeă cât și a celor fortificate, și se stabilește recuperarea cu ajutorul ecuației (3.1), prin raportare procentuală. [24]
(3.1)
Studiu de caz: Determinarea unor flavon-3-oli și antociani din semințe de struguri roșii și din extractele pieliței strugurilor prin metoda HPLC-DAD
În acest studiu, Susanna Munoz a utilizat ca aparat un cromatograf lichid de înaltă performanță Hewlett-Packard 1100 cuplat cu un detector cu rețea de diode. Separarea a fost realizată utilizând o coloană C18 100 Kromasil (250 mm x 3 mm, 5µm) termostatată la 20◦C.
Faza mobilă folosită a fost:
solvent A: 0,2% TFA (acid trifluoroacetic) în apă Milli-Q;
solvent B: 0,2% TFA (acid trifluoroacetic) în acetonitril.
Soluțiile și reactivi utilizați au fost:
Acetonitrilul și etanolul cu grad de calitate pentru HPLC, acidul tartric, metabisulfitul de sodiu și acidul clorhidric au fost furnizate de Scharlau (Barcelona, Spania).
Acidul trifluoroacetic (TFA) și azida de sodiu (NaN3) au fost cumpărate din Fluka (Madrid, Spania). În analiză s-a folosit de asemenea apă ultra pură de calitate Milli-Q ( Millipore, Bedford, MA, USA )
Standarde de (+)catechină, (-)-epicatechină, procianidele B1 și B2, cianidin-3-glucozidele, peonidin-3-glucozide și malvidin-3-glucozide au fost obținute din Fluka (Madrid, Spain ). Delfinidin-3-glucozide și petunidin-3-glucozide au fost asigurate de către Polyphenols Laboratory AS (Sandness, Norvegia). Toate standardele au fost de o puritate de >90%.
O soluție stock individuală al fiecărui standard (ce variază de la 1 la 400 mg L-1), a fost preparată, sub abur N2 prin dizolvarea analitului în etanol și păstrată la întuneric la temperaturi de -18oC.
Boabele de struguri au fost obținute din podgoria experimentală a Facultății de Oenologie din Tarragona (Universitatea Rovira i Virgili, Spania).
La prelevarea probelor se iau în considerare:
Poziția fructului pe cluster,
Poziția clusterului pe vița de vie,
Poziția viței de vie în podgorie,
Expunerea la soare,
Ciclul biologic complet.
Astfel, s-au prelevat probe o dată pe săptămână, de la începutul maturității până la culesul viilor.
Compușii fenolici au fost extrași din pielița și semințele de strugure, folosind o simplificare a metodei dezvoltata de Di Stefano și colab., astfel: pielițele și semințele a 50 boabe de struguri au fost separate manual și macerate separat la 30oC pentru 48h în vin sintetic adăugat cu 40 mgL-1 metabisulfit de sodiu și 50 mgL-1 azidă de sodiu. Ulterior, probele au fost filtrate la vid prin hârtie de filtru Whatman 41 de 20-25µm. Extractele au fost obținute în duplicat.
Setările cromatografice au fost:
Gradient:
0 min: 0% B
10 min: 9% B
25 min: 18% B
40 min: 26% B
Debit: 1 ml/min
Volum de injectare: 10 µL
Lungimea de undă pentru detectare și cuantificare:
280 nm pentru flavan-3-oli
520 nm pentru antociani
Toți compușii au fost eluați în 36 min.
Compușii fenolici din probe au fost identificați în funcție de ordinea de eluție și comparând timpii de retenție obținuți cu timpii de retenție corespunzători standardelor pure.
S-a evaluat precizia în ceea ce privește repetabilitatea în cadrul unei zile și repetabilitatea între zile (precizia intermediară). Rezultatele au fost exprimate în procente ale deviației standard relative (RSD%):
Primul parametru a fost calculat prin injectarea de 6 ori a două soluții standard (concentrații mici și mari) pentru fiecare analit individual. S-a obținut RSD <5,2% pentru repetabilitate;
Al doilea a fost calculat pe baza rezultatelor obținute la injectarea de 12 ori, în zile alternative, aceleași soluții standard, dar în ordine diferită. S-a obținut RSD<8,1% pentru precizia intermediară.
Aceste valori scăzute ale RSD permit confirmarea faptului că standardele prezintă o bună stabilitate în condițiile menționate (cel puțin o lună) și, de asemenea, că precizia metodei cromatografice dezvoltată este adecvată.
În procesul de validare a fost urmărită și selectivitatea metodei. Aceasta a fost evaluată prin compararea de cromatograme ale extractelor probelor reprezentative cu cele ale soluțiilor standard. Pentru a detecta eventualele interferențe, au fost luate în considerare formele picurilor, timpii de retenție și puritatea spectrală a picului cromatografic. Nu se observă niciun pic cromatografic de interferență cu cromatogramele probelor blanck, la lungimile de undă de cuantificare și, în toate cazurile, factorul de concordanță între picul standardului pur și picul probei a fost ≥ 99,5.
Linearitatea răspunsurilor detectorului pentru compușii studiați a fost evaluată cu ajutorul analizei de regresie liniară privind cantitățile din fiecare standard injectat și aria varfului corespunzator pe cromatogramă (tehnica standardului extern). Astfel, pentru fiecare analit separat, au fost analizate prin cromatografie trei repetări ale soluției de vin sintetic cu șase concentrații diferite (la intervale de concentrații obisnuite). Graficele de calibrare au fost construite prin trasarea ariei fiecarui pic cromatografic față de concentrația corespunzatoare. În urma acestei analize s-a obținut R2> 0,997 la flavan-3-oli și R2> 0,981 la antociani.
Limitele de detecție (LOD) și cele de cuantificare (LOQ) au fost calculate în funcție de raportul semnal/zgomot de 3:1 respectiv 10:1. Limitele de detecție au variat de la 1,0 la 2,5 mgL-1 pentru flavan-3-oli și de la 0,5 la 3,0 mgL-1 pentru antociani. Limitele de cuantificare au variat de la 3 la 6,5 mgL-1 pentru flavan-3-oli și de la 1,0 la 8,5 mgL-1 pentru antociani. Aceste valori demonstrează că metoda propusă este destul de sensibilă pentru determinarea compușilor fenolici studiați din semințele și pielița de struguri.
Recuperarea (%) s-a calculat prin scăderea concentrației de polifenol constatată în extract folosind graficele de calibrare și a concentrației de polifenol prezent în mod natural în extract, și raportând această valoare la concentrația de polifenol îmbogățită. În acest fel, recuperarea de antociani a variat între 80% și 110% cu RSD <15%, iar pentru flavan-3-oli între 95% și 110% cu RSD <7%.
Aceste valori au demonstrat că standardele de polifenoli în vin sintetic s-au comportat în mod similar cu extractele de probă (semințe sau pielițe) astfel, metoda este potrivită pentru cuantificarea polifenolilor din probe reale.
Metoda propusă a fost aplicată pe probe reale și s-au obținut cromatogramele din fugurile 3.1 și 3.2.
Fig. 3.1. Cromatograma obținută pentru extractul de semințe de Syrah. (1) procianidina B1; (2) catechina; (3) procianidina B2; (4) epicatechina.
Fig. 3.2. Cromatograma obținută pentru extractul de pieliță de Merlot. (1) delfinidina-3-glucozida; (2) cianidin 3-glucozida; (3) petunidina-3-glucozida; (4) peonidin-3-glucozida; (5) malvidina 3-glucozida
Evoluția conținutului de polifenoli din două soiuri de struguri de-a lungul coacerii este prezentată în figura 3.3, fiind exprimată în mgL-1. Fiecare extract a fost obținut în duplicat și injectat în HPLC-DAD, de asemenea, în dublu exemplar.
Fig. 3.3. Evoluția conținutului de polifenoli: B1 (procianidină B1), CAT (catechină), B2 (procianidină B2), EPI (epicatechină),
DELP (delfinidină-3-glucozidă), CYA (cianidină-3-glucozidă), Petu (glucozidă petunidină), PEO (peonidină- 3-glucozidă), MALV (malvidină-3-glucozidă)
Rezultatele obținute arată că în timp ce conținutul de antociani în pielița de struguri crește cu gradul de maturare, cantitatea de flavan-3-oli din semințele de struguri scade.
Pe de altă parte, după cum se poate vedea, pentru soiul Merlot, data recoltării a coincis cu cel mai ridicat conținut de antociani și cel mai scăzut conținut de flavan-3-oli.
În schimb, relația între data recoltării și conținutul de compuși fenolici nu a fost ideală pentru soiul Tempranillo. În acest caz, conținutul de antociani a fost semnificativ mai mic la data recoltării decât în săptămâna 4. Astfel că, din punct de vedere al maturității fenolice, culesul viilor a fost efectuat mai târziu decât ar fi trebuit.
În concluzie, metoda HPLC-DAD propusă permite cuantificarea precisă a principalilor antocianii și flavan-3-oli din struguri roșii. Într-o singură etapă și în mai puțin de 40 min, se cuantifică extractele conform standardului fără a utiliza malvidina-3-glucozida ca referință în cazul antocianilor. Metoda prezentată are o aplicabilitate rapidă și precisă, reprezentând o opțiune potrivită pentru a cuantifica fără erori polifenolii din probele de struguri din timpul maturării. [25]
CAPITOLUL 4
Partea experimentală
Scopul lucrării este de a valida o metodă cromatografică de determinare a polifenolilor din probe de vin, folosind un cromatograf lichid de înaltă performanță (HPLC) cu un detector cu rețea de diode (DAD). Pentru aceasta, s-au stabilit parametrii de performanță ai metodei: liniaritatea, precizia (repetabilitate și precizia intermediară), limita de detecție, limita de cuantificare și robustețea.
Studiul a fost efectuat pe diverse standarde de polifenoli și aplicat pe 3 vinuri albe obținute direct de la diferiți producători din Spania. Au fost alese vinurile albe spre analiză deoarece polifenolii se găsesc în concentrații mai mici în vinurile albe decât în cele roșii și este cu atât mai important de utilizat o metodă care să îi poată detecta [26].
Probe, reactivi și echipamente
S-a folosit dimetilsulfoxid (DMSO), (CH3)2SO, ca solvent pentru prepararea soluțiilor standard de polifenoli. În această lucrare s-au analizat 33 polifenoli: protocatechina, (+)-catechina, (-)-epicatechina, acidul ferulic, acidul salicilic, arbutina, acidul homovanilic, acidul p-cumaric (sau acidul p-hidroxicinamic), acidul cinamic, miricetina, acidul neoclorogenic, quercitina, 2-4 hidroxifenil etanol (tirozol), quercetina, fisetina, toxifolină, acidul veratric, acidul 4-hidroxibenzoic, 3-4 dihidroxibenzaldehida (protocatechualdehida), rutina, acidul siringic, acidul vanilic, acidul galic, kaempferolul, acidul gentisic, acidul cafeic, polidatina, acidul clorogenic, acidul homogentisic, resveratrolul, galatul de etil, acidul sinapic și morinul.
Vinurile analizate sunt: Marfil Alella, Blanc Pescador și Penedés. Acestea sunt prezentate în figura 4.1.
Aparatura utilizată constă într-un cromatograf lichid de înaltă performanță (HPLC) Agilent 1100 cu pompă cuaternară, cu un detector cu rețea de diode (DAD). HPLC-ul este prevăzut cu autosampler și sistem de degazare. Presiunea maximă poate ajunge la 400 bar. Aparatura completă este prezentată în figura 4.2.
Fig. 4.1. Vinurile analizate
Fig. 4.2. HPLC-DAD utlizat în acest studiu
Separarea compușilor fenolici a fost efectuată de o coloană cromatografică Kinetex 2,6µ C18 100A (100 x 4.6 mm). Pentru aceasta, s-au folosit ca faze mobile, următorii solvenți:
A: acid formic 0,1%;
B: metanol 100%, cu grad HPLC.
Optimizarea metodei
Având la dispoziție patru coloane cromatografice Kinetex 2,6 µ C18 100A (100 x 4,6 mm), a fost necesară alegerea coloanei cele mai eficiente. De asemenea, pe parcurusul optimizării, a fost atașată o precoloană.
Eficiența separării cromatografice reprezintă capacitatea sistemului cromatografic de a elua analiții supuși separării cu o dispersie cât mai mică în coloană (picuri cât mai înguste). Sunt urmărite și variațiile timpilor de retenție, pentru a obține rezultate sigure. [27], [28]
Pentru aceasta, s-a calculat numărul de talere teoretice, N, care reprezintă numărul de echilibre de repartiție între faza mobilă și cea staționară. Conform formulei, N se definește ca fiind pătratul timpului de retenție al picului considerat, eluat cu o dispersie unitară σ2. Calculul numărului de talere teoretice se face cu ajutorul uneia dintre următoarele formule:
N = (4.1)
N = (4.2)
N = (4.3)
N = (4.4)
unde: σ2 reprezintă dispersia picului exprimată în unități de timp (în funcție de diferite expresii ale lărgimii picului – w). [29]
Pentru acest calcul, s-a format un mix: s-au luat câte 10 µL din soluțiile: galat de etil, acid ferulic, rutină și fisetină (cu concentrații de 1000 ppm) și s-au adus la 1000 µL cu apă ultra pură. Acest mix s-a injectat pentru fiecare coloană cromatografică disponibilă. Lungimile de undă selectate au fost: 280 nm și 310 nm. De-a lungul timpului, s-a analizat influența injectării directe a vinului în HPLC, însă cromatogramele obținute au fost mult prea complexe, fiind dificilă identificarea și cuantificarea analiților. [28]
Mai jos este prezentat gradientul de eluție folosit în analiza eficienței coloanei cromatografice:
minutul 0 – 5% B
minutul 3 – 5% B
minutul 23 – 90% B
minutul 25 – 90% B
minutul 26 – 5% B
minutul 30 – 5% B
Nu este necesară selectarea unui timp după analiza, Posttime, deoarece gradientul este ales așa fel încât să cuprindă câteva minute după eluție, necesare trecerii fazei mobile B de la valoarea finală a injectării în curs, la valoarea inițială a injectării urmatoare. Debitul a fost de 1 ml/min iar volumul injectat de 10µL.
S-au urmărit timpii de retenție, lățimea picului la bază și simetria picurilor, valori rezultate automat prin softul utilizat (ChemStation Rev.A.10.02 Agilent Technologies for LC systems). Plecând de la ecuația (4.2) s-au obținut valorile talerelor teoretice, prezentate în tabelul 4.1.
Tabelul 4.1. Analiza eficienței coloanelor cromatografice
Se observă o simetrie bună pentru toate coloanele, dar mai ales pentru prima coloană folosită. Toate valorile talerelor teoretice (N) obținute au fost mai mari de 2000, ceea ce înseamnă că eficiența cromatografică este foarte bună. Cu cât valoarea N este mai mare, cu atât coloana realizează separarea mai eficient. De aceea, pentru analiza ulterioară a polifenolilor, s-a ales folosirea primei coloane.
Aplicarea metodei în analiza vinurilor
S-au preparat soluții de 1000 ppm prin cântărirea a câte 25 mg polifenol și aducerea la semn cu dimetilsulfoxid (DMSO) la balon cotat de 25 ml. În această etapă, s-au analizat 26 polifenoli, injectând 10 µL din fiecare soluție preparată astfel: 10 µL din soluția stoc de 1000 ppm + 990 µL DMSO. Concentrația finală de polifenol din flacon va fi de 10 ppm.
Pentru analiza vinurilor s-au pregătit soluțiile de vin : DMSO în raport v/v 1:1. DMSO nu permite formarea microorganismelor sau a unor compuși nedoriți, menținând soluțiile stabile. Astfel se pot păstra în siguranță la rece (aprox. 5oC) pentru analizele ulterioare.
În urma analizei s-a observat întârzierea formării primelor picuri, fiind necesară grăbirea absorbției prin eliminarea celor 3 minute inițiale. Astfel, s-a stabilit următorul gradient:
minutul 0 – B% 5
minutul 23 – B% 95
minutul 25 – B% 95
minutul 26 – B% 5
minutul 30 – B% 5.
Valoarea maximă de B% a fost de 95% deoarece s-a dorit o curățare eficientă a coloanei, utilizând mai mult metanol. Gradientul de eluție inițial este prezentat în figura 4.3. iar primul gradient de eluție optimizat este prezentat în figura 4.4.
La acest gradient optimizat, s-au analizat soluțiile de vinuri (Alella, Penedes, Pescador) și de standard de polifenoli. Cromatogramele obținute la lungimile de undă: 280 nm, 310 nm, 370 nm și 520 nm sunt prezentate în anexa 1. În urma acestei analize s-au identificat picurile corescunză toare polifenolilor analizați prin suprapunerea cromatogramelor respective și s-a verificat prezența acestora în cele 3 vinuri.
Fig. 4.3. Gradientul de eluție inițial Fig. 4.4. Gradientul de eluție optimizat 1
În decursul acestor zile, aparatul HPLC a fost solicitat pentru diverse analize nereușite, cu alți analiți de interes și alte matrici. Prin precipitarea acestor analiți în precoloană, sistemul s-a blocat, motiv pentru care această precoloană s-a deteriorat. Deoarece presiunea a crescut cu mult peste 400 bar, precoloana a eliminat lichid iar aparatul HPLC a oprit analiza automat. În acest caz, a fost necesară curățarea precoloanei prin injectarea probei blank (ce conține doar apă ultrapură și DMSO).
Precoloana deja deteriorată nu a mai oferit condiții de lucru optime. Chiar și după spălări repetate, aceasta a eliminat lichidul cu fazele mobile și analiții de interes. Din acest motiv, precoloana a fost eliminată din sistem.
Păstrând aceleași condiții de eluție, s-au realizat 10 injectări pe zi ale soluției de vin Alella, în 3 zile diferite. În anexa 2 sunt prezentate rezultatele obținute în urma injectărilor din a treia zi. S-a observat că în decursul analizei, timpii de retenție nu diferă foarte mult, precum și în cazul ariilor, unde deviația standard are valori mai mici de 1.
Având în vedere faptul că picurile apăreau destul de înghesuite în prima parte a cromatogramei, a fost necesară o a doua schimbare a gradientului, după cum urmează:
minutul 0 – 3% B
minutul 3 – 8% B
minutul 28 – 28% B
minutul 45 – 80% B
minutul 46 – 80% B
minutul 47 – 3% B
minutul 50 – 3% B
Această aglomerare a picurilor ar putea împiedica identificarea exactă a analitilor și implicit obținerea unor rezultate reale. În figura 4.5. este prezentat gradientul 2 optimizat care va fi folosit în validarea acestei metode.
Fig. 4.5. Gradientul de eluție optimizat 2
De asemenea, se observă că nu mai este necesară creșterea concentrației de metanol până la 95%, deoarece această creștere a fost destul de mare și prea rapidă, iar toate picurile erau înregistrate în cromatogramă până ca faza B să ajungă la 90%. În acest caz, s-a revenit de la minutul 5 la minutul 3, însă s-a încetinit separarea până în minutul 28, pentru o despărțire mai clară a picurilor. S-a modificat și concentrația solventului B, trecând de la 5% la 3%, atât în faza inițială cât și în cea finală, deoarece în urma acestor analize repetate (implicit curățări repetate) nu sunt prezente impurități.
Mod de lucru: condiții cromatografice și pregătirea probei
Debitul este de 1µL/min. Se are în vedere păstrarea temperaturii coloanei la aproximativ 20oC. Volumul injectat este de 10 µL.
Pentru setarea detectorului, se selectează lungimile de undă: 280 nm, 310 nm, 370 nm și 520 nm. Se activează lampile UV pentru lungimile de undă mai mici de 400 nm și Vis pentru lungimile de undă mai mari de 400 nm. [30]
În urma optimizarii, s-a stabilit eliminarea precoloanei și utilizarea coloanei 1 analizate, cu condițiile de eluție reprezentate grafic în figura 4.5.
Probele de vin sunt aduse la v/v 1:1 cu DMSO, iar polifenolii sunt pregătiți conform punctului 4.3 al lucrării prezente. La aceste soluții, s-au adăugat încă 7 polifenoli față de cele deja existente, în final analizându-se 33 de polifenoli.
Trasarea curbei de etalonare
Având în vedere numărul mare de analize, acestea s-au simplificat, formând 3 amestecuri (mixuri) de câte aprox. 10 polifenoli. Astfel, se consumă mai puțin timp pentru analiza polifenolilor aleși.
Cele 3 mixuri cuprind:
Mix 1: protocatechină, (+)-catechină, (-)-epicatechină, acidul ferulic, acidul salicilic, arbutină, acidul homovanilic, acidul p-cumaric (sau acidul p-hidroxicinamic), acidul cinamic, miricetină, acidul neoclorogenic, quercitină;
Mix 2: fisetină, 2-4 hidroxifenil etanol (tirozol), quercetină, toxifolină, acidul veratric, acidul 4-hidroxibenzoic, 3-4 dihidroxibenzaldehidă (protocatechualdehida), rutina, acidul siringic, acidul vanilic, acidul galic;
Mix 3: kaempferolul, acidul gentisic, acidul cafeic, polidatina, acidul clorogenic, acidul homogentisic, resveratrolul, galatul de etil, acidul sinapic și morinul.
În flaconul etichetat “Mix 1” se adaugă 450 µL DMSO. Având în vedere soluțiile standard disponibile la concentrații diferite, s-au pipetat pe rând următoarele volume pentru a aduce standardul la o concentrație finală de 10 ppm, în acest flacon (la volum de 1000 µL):
Din protocatechină, (-)-epicatechină și acidul ferulic (fiecare la 1000 ppm), se iau câte 10µL;
Din (+)-catechină, arbutină, acidul homovanilic, acidul p-cumaric, acidul cinamic și miricetină (fiecare la 200 ppm), se iau câte 50 µL;
Din acidul salicilic disponibil la 500 ppm, se iau câte 20 µL;
Din acidul neoclorogenic și quercitină (fiecare la 100 ppm), se iau câte 100 µL.
În flaconul etichetat “Mix 2” se adaugă 610 µL DMSO. Având în vedere soluțiile standard disponibile la concentrații diferite, s-au pipetat pe rând următoarele volume pentru a aduce la o concentrație finală de 10 ppm, în acest flacon (la volum de 1000 µL):
Din fisetină, 2-4 hidroxifenil etanol (tirozol), quercetină, toxifolină, acidul veratric, acidul 4-hidroxibenzoic și 3-4 dihidroxibenzaldehidă (fiecare la 200 ppm), se iau câte 50 µL;
Din rutină, acidul siringic, acidul vanilic și acidul galic (fiecare la 1000 ppm), se iau câte 10µL.
În flaconul etichetat “Mix 3” se adaugă 530 µL DMSO. Având în vedere soluțiile standard disponibile la concentrații diferite, s-au pipetat pe rând următoarele volume:
Din kaempferol, disponibil la 2000 ppm, se iau 100 µL și se ajunge la o concentrație finală de 200 ppm, fiind adus la vial de 1000 µL cu DMSO;
Din acidul gentisic și acidul cafeic (fiecare la 100 ppm), se iau câte 10 µL și se ajunge la o concentrație finală de 10 ppm, fiind adus la vial de 1000 µL cu DMSO;
Din polidatină, acidul clorogenic, acidul homogentisic, resveratrol, galatul de etil, acidul sinapic și morină (fiecare la 200 ppm) se iau câte 50 µL și se ajunge la o concentrație finală de 10 ppm, fiind adus la vial de 1000 µL cu DMSO.
Din aceste soluții se prepară concentrațiile de 0,1 ppm, 0,2 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm, 2 ppm și 5 ppm. În cazul soluțiilor etalon de kaempferol s-au obținut concentrații de 2 ppm, 4ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm respectiv 100 ppm. În tabelul 4.2 este evidențiat modul de preparare al acestor soluții.
Prin analiza acestora la HPLC-DAD, rulând setările menționate anterior, se obțin cromatogramele. Se notează ariile corespunzătoare fiecărui pic. Se reprezintă grafic ariile în funcție de concentrații. Acestea reprezintă curbele de etalonare pentru fiecare component în parte. Pentru verificarea statistică a linearității s-au urmărit coeficientul de determinare, R2 (pătratul coeficientului de corelare, r). Rezultatele obținute sunt prezentate în anexa 3, unde se poate observa că toate valorile coeficienților au fost între 0,965 și 0,999.
Funcția liniară de etalonare este dată de ecuația (4.5):
y = a + bx (4.5)
unde b este panta funcției de etalonare sau panta dreptei de regresie (reprezintă o măsură a sensibilității), iar a reprezintă intersecția cu ordonata.
Tabelul 4.2. Calculul volumului necesar pentru a ajunge la concentrațiile etaloanelor folosite pentru curba de etalonare
În anexa 5 sunt reprezentate cromatogramele celor 3 mixuri de polifenoli suprapuse, la valoarea domeniului de concentrație cea mai mare, 5 ppm.
În figura 4.6 este prezentată cromatograma compușilor la 5ppm. Polifenolii analizați au fost identificați în funcție de ordinea de eluție și comparând timpii de retenție obținuți cu timpii de retenție corespunzători standardelor pure.
4.6. Caracterizarea parametrilor de performanță
4.6.1. Liniaritatea
Liniaritatea reprezintă aptitudinea unei metode de analiză de a da rezultate proporționale cu concentrația analitului. Proporționalitatea poate fi directă sau se stabilește statistic.
Pentru a stabili liniaritatea metodei, trebuie să se efectueze analiza varianței datelor analitice pentru fiecare analit în parte. [24]
Fig. 4.6. Cromatograma polifenolilor la 5 ppm
S-au selectat din soluțiile standard preparate, cele cu concentrația de 2 ppm și s-au analizat prin 6 injectări consecutive. Coeficienții de variație au fost cu mult sub 0,1, iar deviația standard relativă sub 1,5%. Rezultatele obținute sunt prezentate în anexa 4. Se observă că atât în cazul analizei repetabilității aplicate pe soluțiile etaloanelor cât și pe vinul Alella (anexa 2), s-au obținut valori foarte bune ale SD și RSD.
Precizia
Precizia arată gradul de dispersie între rezultatele unei serii de măsurători. Sunt realizate mai multe măsurători pe același standard și aceeași probă analizată, în condiții de repetabilitate sau reproductibilitate. Precizia se analizează ca: repetabilitate, precizie intermediară și reproductibilitate, exprimându-se ca o abatere standard relativă procentuală, RSD%.
Repetabilitatea
Repetabilitatea se obține atunci când analiza se realizează într-un singur laborator, de către un singur operator, folosind același echipament și aceeași metodă pe o perioadă scurtă de timp.
Repetabilitatea a fost demonstrată prin prelucrarea a 6 injectări pe probe identice de vin și a 6 injectări de probe de soluții etalon a polifenolilor analizați.
Rezultatele experimentale obținute și valorile RSD-ului calculate sunt prezente în anexa 6. Un exemplu de calcul este prezentat în tabelele 4.3 și 4.4, unde sunt luate în considerare valorile ariilor obținute pentru acidul galic din soluția etalon și, de asemenea, din vinul Alella analizat.
Tabelul 4.3. Calculul deviației standard relative a rezultatelor obținute în urma celor 6 injectări de soluție etalon de acid galic de 2 ppm
Valorile RSD% obținute pentru cele 6 injectări de soluție etalon a tuturor polifenolilor analizați, sunt cuprinse între 0,04% și 1,45%, iar în cazul celor 6 injectări ale vinului Alella valorile RSD% sunt cuprinse între 0,97% și 10,45%.
Comparând rezultatele obținute cu cele prevăzute în ecuația lui Horwitz: RSD<, pentru domeniul de concentrații stabilit (0,1 – 5 mg/L, adică 100 ppb – 5 ppm), se observă că s-au obținut rezultate bune, mai mici decât RSD% prevăzute de ecuația lui Horwitz (11,3% – 22,6%). În tabelul 4.5 se regăsesc valorile RSD% calculate pe baza ecuației lui Horwitz.
Tabelul 4.4. Calculul deviației standard relative a rezultatelor obținute în urma celor 6 injectări ale vinului Alella, pentru compusul de acid galic identificat
Tabelul 4.5. Nivelul acceptat al preciziei în funcție de nivelul de concentrație al analitului
Precizia intermediară
Precizia intermediară se obține atunci când analiza se realizează într-un singur laborator prin aceeași metodă, utilizând instrumente diferite, de către operatori diferiți, pe o perioadă lungă de timp. Precizia intermediară este determinată prin compararea rezultatelor unei metode pentru un singur laborator pentru un anumit număr de săptămâni.
Pentru obținerea preciziei intermediare s-au efectuat 5 injectări de probe etalon de polifenoli și 5 injectări de probe de vin Alella, timp de 3 zile neconsecutive.
Anexa 7 cuprinde rezultatele preciziei intermediare. Un exemplu de calcul este prezentat în tabelele 4.6 și 4.7, unde sunt luate în considerare valorile ariilor obținute pentru acidul galic din soluția etalon și, de asemenea, din vinul Alella analizat, din prima zi de studiu. De asemenea, în tabelele 4.8 și 4.9 sunt calculate deviațiile standard relative între cele 3 zile de analiză cu ajutorul mediei mediilor ariilor picului obținut în fiecare zi de analiză.
Tabelul 4.6. Rezultatele celor 5 injectări din proba etalon de acid galic; ziua 1 de analiză
Tabelul 4.7. Rezultatele obținute în urma celor 5 injectări din proba de vin; ziua 1 de analiză
Tabelul 4.8. Rezultatele celor 5 injectări din proba etalon de acid galic în cele 3 zile
Tabelul 4.9. Rezultatele celor 5 injectări din proba de vin în cele 3 zile
Valorile RSD% ale fiecărei zi de lucru, dar și cele obținute prin însumarea rezultatelor din cele 3 zile diferite (neconsecutive), atât pentru soluțiile standard cât și pentru vin, sunt cuprinse între 4,003% și 10,456%, respectiv 1,22% și 7,93%. Rezultatele obținute indică o bună precizie intermediară, datorită valorilor mult mai mici decât cele prevăzute de ecuația Horwitz (11,3% – 22,6%). (vezi tabelul 4.5).
Limita de detecție și limita de cuantificare
Limita de detecție (LOD) reprezintă cea mai mică concentrație de analit dintr-o probă care poate fi detectată cu certitudine statistică rezonabilă, dar nu neapărat cuantificată ca o valoare exactă în condițiile stabilite ale încercării.
Limita de cuantificare (LOQ) este cea mai joasă concentrație sau cantitate de analit care poate fi determinată cantitativ cu un nivel acceptabil al repetabilității și exactității.
Pentru determinarea limitelor de detecție și cuantificare, s-au injectat de 6 ori consecutiv etaloanele în intervalul 0,1 – 5 ppm (2 – 100 ppm în cazul soluției de kaempferol). S-au obținut ariile picurilor prin integrarea acestora manual, cu ajutorul softului disponibil. Valorile obținute, precum și calculele aferente sunt prezentate în anexa 8, unde se pot observa etapele urmărite în vederea calculării limitelor de detecție și cuantificare.
De asemenea, aceste valori sunt obținute și din ecuația curbei de etalonare corespunzătoare etalonului respectiv. Acestea sunt prezentate împreună cu graficele, în anexa 3.
Pentru calculul pantei curbei de etalonare s-a folosit ecuația (4.6), iar deviația standard a valorilor ariilor s-a calculat conform ecuației (4.7),
(4.6)
(4.7)
unde: xi reprezintă concentrația etalonului la detecția respectivă (i),
x- : media aritmetică a valorilor concentrațiilor etalonului, notat în calcule cu x med,
yi : aria corespunzătoare picului la detecția respectivă (i),
y- : media aritmetică a valorilor ariilor, notat în calcule cu y med,
n : numărul detecțiilor (n=6).
Având în vedere ecuația (4.5), valoarea intersecției cu ordonata (a) s-a calculat astfel:
(4.8)
Limita de detecție a instrumentului (lLOD) s-a calculat conform ecuației (4.9), iar valorile obținute au fost între 0,003884 mg/L (pentru arbutină) și 0,668 mg/L (pentru kaempferol).
(4.9)
Limita de cuantificare a instrumentului (LOQ) s-a calculat conform ecuației (4.10), iar valorile obținute au fost între 0,01298 mg/L (pentru arbutină) și 2,2268 mg/L (pentru kaempferol).
(4.10)
Robustețea
Pentru a evalua robustețea acestei metode dezvoltate, se demonstrează încrederea în analiză prin urmărirea stabilității soluțiilor.
S-a verificat stabilitatea soluției etalon de polifenoli de concentrație 2 μg/mL precum și stabilitatea soluției unei probe de vin (DMSO:vin Penedes, în raport 1:1, v/v) pe parcursul unei zile, executându-se 6 citiri.
S-a dorit analiza robusteții pe cele 3 vinuri disponibile, Alella, Penedes și Pescador. Pentru acestea, în următoarea zi, s-au realizat câte 3 citiri pentru fiecare soluție (DMSO:vin, 1:1).
Până la efectuarea încercării, când soluțiile au fost aduse la temperatura camerei, acestea au fost păstrate în frigider, la aproximativ 4oC. În tot acest timp, soluțiile au fost ținute în vialuri din sticlă colorată, de 1 ml.
Rezultatele celor 6 citiri ale soluțiilor etalon de 2 μg/mL sunt prezentate în anexa 4. Valorile obținute sunt foarte bune, deviația standard fiind apropiată de 0, iar deviațiile standard relative având valori între 0,004% și 1,45%.
Cromatogramele obținute în urma celor 6 citiri ale vinului Penedes, au fost suprapuse pentru observarea unor posibile variații (vezi figura 4.7). De asemenea, sunt prezentate și cromatogramele suprapuse obținute din cele 3 citiri ale vinurilor Alella, Penedes și Pescador, în figurile 4.8, 4.9 și 4.10.
După cum se poate observa din datele obținute (fig. 4.7 – 4.10 și anexa 4), soluțiile etalon de polifenoli și soluțiile de vinuri sunt stabile pe parcursul unei zile.
Fig. 4.7. Cromatogramele suprapuse obținute din cele 6 citiri ale vinului Penedes
Fig. 4.8. Cromatogramele suprapuse obținute din cele 3 citiri ale vinului Alella
Fig. 4.9. Cromatogramele suprapuse obținute din cele 3 citiri ale vinului Penedes
Fig. 4.10. Cromatogramele suprapuse obținute din cele 3 citiri ale vinului Pescador
Aplicarea metodei în determinarea polifenolilor din vin
Concentrația analitului s-a determinat în funcție de aria picului obținută în urma citirii soluției de vin și aria obținută în urma citirii soluției etalon de 2 ppm corespunzătoare analitului respectiv. [20]
Astfel, concentrația polifenolului în vinuri a fost determinată cu ajutorul ecuației (4.11.)
(4.11.)
unde: Cv reprezintă concentrația polifenolului în vinul analizat;
Cp reprezintă concentrația polifenolului din soluția etalon;
Ap reprezintă aria polifenolului în vinul analizat;
Av reprezintă aria polifenolului din soluția etalon.
În urma citirilor efecuate pe cele trei vinuri, conform metodei optimizate, se observă că vinul Morfil Alella a prezentat cea mai mare gamă de polifonoli analizați.
Analiza vinului Alella
În figura 4.11 sunt prezentate cromatogramele suprapuse ale soluțiilor etalon (colorate în roșu, verde și roz) cu cea a vinului Alella (colorată în albastru). S-au luat în considerare cele 3 citiri ale vinului și cele ale soluțiilor etalon de 5 ppm.
Fig. 4.11. Cromatogramele soluțiilor etalon de 5 ppm și vinului Alella
Tabelul 4.10 prezintă valorile obținute în analiza polifenolilor din vinul Alella. În această analiză, concentrația cea mai mare de polifenol este dată de miricetină, având 31,48 mg/L, iar cea mai scăzută este de 0,11 mg/L dată de tirozol.
Concentrația de resveratrol este mult prea mare față de valorile obținute de majoritatea cercetătorilor și față de informațiile oferite de literatura de specialitate. Cu toate acestea, Martin S. susține că soiul strugurelui și anul de recoltă sunt factori care modifică semnificativ cantitatea de resveratrol din vin, precum și alți compuși fenolici. [20]
Tabelul 4.10. Analiza polifenolilor din vinul Alella
De aceea, este posibil ca picul acesui compus din cromatograma vinului, sa fi prezentat o valoare a timpului de retenție apropiată de un alt compus neidentificat. Pentru siguranța că valoarea obținută este reală, este necesară lărgirea gradientului spre sfârșitul acesteia (aproximativ la minutul 33,8), pentru a despărți eventualul pic îmbinat cu cel corespunzător resveratrolului. Dacă valoarea ar fi aproximativ egală cu cea obținută în lucrarea prezentă, atunci aceasta ar fi corectă. În caz contrar, ar fi necesar modificarea atât a gradientului de eluție, cât și a altor condiții de lucru, pentru evitarea eventualelor interferențe.
Rodrighez Bernaldo a analizat câteva vinuri albe, tot din regiunea spaniolă, utilizând HPLC cu detector cu fluorescență și UV. În acel studiu, s-a obținut, de asemenea, o concentrație ridicată de resveratrol față de concentrațiile raportate în literatură pentru vinurile albe. Chiar și asa, concentrația resveratrolului în vinurile analizate de acesta este mai mică decât cea obținută în lucrarea prezentă. [17]
De exemplu, Massimo Castellari a identificat o concentrație de doar 0,32 mg resveratrol/L de vin alb și 15 mg resveratrol/L în vinul roșu. Valorile cele mai mari au fost date de (+)-catechină și acidul galic. În acea lucrare, probele au fost diluate cu solventul B utilizat (metanol:apă ultra pură, 50:50, v/v) și filtrate printr-un filtru cu membrană PTFE. El a utilizat același tip de aparatură, însa o altă coloană, a cărei temperatură a fost controlată și menținută la 30±1oC. [31]
Analiza vinului Penedes
În analiza polifenolilor din vinul Penedes se ia în considerare cromatogramele obținute în urma celor șase citiri ale vinului. S-a selectat câte una din fiecare grup și s-au reprezentat cromatografic, în figura 4.12, unde diferitele colorații au următoarea semnificație:
cu albastru sunt reprezentați polifenolii mixului 1 de concentrație 2 ppm;
cu roșu sunt reprezentați polifenolii mixului 2 de concentrație 2 ppm;
cu verde sunt reprezentați polifenolii mixului 3 de concentrație 2 ppm;
cu roz sunt reprezentate picurile vinului Penedes.
În această imagine se observă prezența mare a compușilor analizați, fapt demonstrat și în urma cuantificării acestor componenți.
În vinul Penedes nu s-au găsit următorii compușii: acidul homogentisic, 3-4-difidroxibenzaldehidă, acidul neoclorogenic, acidul homovanilic, acidul ferulic, kaempferolul și toxifolina. Compușii identificați și concentrațiile obținute sunt prezentate în tabelul 4.11.
Valorile obținute sunt asemănătoare cu cele ale vinurilor roșii din Italia și Ungaria, unde concentrațiile de polifenoli sunt foarte mari. [20], [32]
Din tabelul 4.11 se observă că valoarea cea mai ridicată a concentrației de polifenol este atribuită miricetinei, quercetinei, acidului vanilic și galatului de etil.
Fig. 4.12. Cromatogramele soluțiilor etalon de 2 ppm și vinului Penedes
Concepcion Betes-Saura a identificat în câteva vinuri din regiunea Penedes, diverși polifenoli, însă cei mai abundenți s-au dovedit a fi tirozolul, (+)-catechina și (-)-epicatechina. În acest articol, flavonoidele au fost găsite în concentrații scăzute, iar acizii benzoici au fost minoritari. Saura susține că în vinurile albe se întâlnesc cantități mai mari de quercetină și acid vanilic (față de unele vinuri roșii în care quercetina este absentă), fapt observat și în rezultatele obținute în prezenta lucrare. [33]
Analiza vinului Pescador
În analiza polifenolilor din vinul Pescador se ia în considerare cromatogramele obținute în urma celor trei citiri ale vinului. Imaginea cromatogramelor este prezentată în figura 4.13, unde colorația în albastru reprezintă cromatograma vinului Pescador, celălalte culori reprezentând cele 3 mixuri de polifenoli.
Tabelul 4.11. Analiza polifenolilor din vinul Penedes
În urma calculului concentrațiilor compușilor identificați, s-au obținut valorile redate în tabelul 4.12. Se observă că vinul Pescador conține mai puțini polifenoli față de vinurile analizate. Acesta este bogat în acid siringic (14,7 mg/L) dar are un conținut scăzut de arbutină și acid homogentisic (0,1 – 0,2 mg/L).
În studiul prezent, concentrațiile de polifenoli sunt mai mici decât în cazul celorlalte două vinuri analizate, dar mai apropiate de vinurile albe studiate în alte articole. Acidul galic prezintă aproximativ 6,5 mg/L de vin Pescador.
Fig. 4.13. Cromatogramele soluțiilor etalon de 5 ppm și vinului Pescador
Dimitris P. Makris a arătat în lucrarea sa, că cel mai mare conținut de polifenoli în vinurile albe și, de asemenea, cel mai important pentru sănătatea omului, este dat în prim plan de acidul galic. Acesta a analizat câteva vinuri din Grecia, concluzionând pe baza datelor oferite, că un consum moderat de vin alb (două pahare pe zi, 2 x 200 ml) ar asigura 21 mg de acid galic și alți compuși fenolici, ajungându-se la o sumă totală de 152 mg de compuși fenolici. [34]
Miguel-Angel Rodrıguez a realizat un studiu în care arată variația polifenolilor din vinuri, în diferite țări. În urma informațiilor din diverse articole din domeniu, acesta a concluzionat faptul că vinurile din Spania și Franța au cea mai mare concentrație de polifenoli (ajungându-se chiar la 71,3 mg/L în cazul catechinei, epicatechinei sau quercetinei), în comparație vinurile altor țări, precum, Portugalia, Italia, Ontario, California și Insulele Canare. În schimb, vinurile din țările enumerate au prezentat valori mai mari pentru acidul galic, acid protocatechic, miricetină și chiar și acid cafeic. Astfel, se explică cazul vinurilor Alella și Penedes analizate în studiul prezent, care au arătat un conținut ridicat de polifenoli. [35]
Tabelul 4.12. Analiza polifenolilor din vinul Pescador
CONCLUZII
În prezentul studiu s-a urmărit optimizarea și validarea unei metodei analitice cromatografice de determinare a polifenolilor prin tehnica HPLC-DAD și aplicarea acestei metode pe diferite vinuri.
Metoda cromatografică propusă pentru determinarea polifenolilor îndeplinește condițiile de validare prin: liniaritate, precizie la nivel de repetabilitate și precizie intermediară, limită de detecție, limită de cuantificare și robustețe.
Liniaritatea este dată de valorile foarte bune ale SD și RSD, în urma analizei varianței datelor analitice pentru fiecare analit în parte, obținându-se valori ale deviației standard mult mai mici de 1.
Metoda este precisă, fapt ce rezultă din demonstrarea repetabilității analizelor și din studiile de precizie intermediară. Aceasta s-a demonstrat prin calcularea deviației standard relative procentuale. În urma studiului de repetabilitate și precizie intermediară s-a observat că RSD% calculat pentru soluțiile de vin au valori cuprinse între 0,97% și 10,45% și sunt mai mici decât cele prevăzute de ecuația lui Horwitz (11,3% – 22,6%). Valorile RSD% ale fiecărei zi de lucru, atât pentru soluțiile standard cât și pentru vin, sunt cuprinse între 4,003% și 10,456%, respectiv 1,22% și 7,93%. Rezultatele obținute indică o bună precizie intermediară, datorită valorilor mult mai mici decât cele prevăzute de ecuația Horwitz pentru nivelul de concentrații studiate (11,3% – 22,6%).
Metoda este robustă. Acest parametru este demonstrat prin urmărirea pe parcursul unei zile, a stabilității soluțieiilor etalon de polifenoli și a soluției de vin Alella. Din datele obținute se observă că aceste soluții sunt stabile pe parcursul unei zile de studiu.
Metoda a fost validată și aplicată cu succes pentru determinarea polifenolilor din cele trei tipuri de vinuri albe studiate.
BIBLIOGRAFIE
[1] Valeriu D. Cotea, Tratat de oenologie – Vinificația și biochimia vinului, Volumul I, Editura CERES, București, 1985, capitol 4, p.224-250;
[2] N. A. Épshtein, structure of chemical compounds, methods of analysis and process control validation of hplc techniques for pharmaceutical analysis, Pharmaceutical Chemistry Journal, Vol. 38, No. 4, 2004;
[3] Annalaura Restivo, Ilaria Degano, Erika Ribechini, Maria Perla Colombini, Development and Optimisation of an HPLC-DAD-ESI-QToF Method for the Determination of Phenolic Acids and Derivatives, Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale, Universita` di Pisa, Pisa, Italy; PLoS ONE, February 14, 2014, Volume 9, Issue 2, e88762, p.1-10;
[4] Jorge Garrido, Fernanda Borges, Wine and grape polyphenols — A chemical perspective, Food Research International 54 (2013) p.1844–1858;
[5] Massimo D’Archivio, Carmela Filesi, Roberta Di Benedetto, Raffaella Gargiulo, Claudio Giovannini and Roberta Masella, Polyphenols, dietary sources and bioavailability, Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy, Ann Ist Super Sanità 2007, Vol. 43, No.4: 348-361;
[6] Ivon E. J. Milder, Ilja C. W. Arts, Betty van de Putte, Dini P. Venema and Peter C. H. Hollman, Lignan contents of Dutch plant foods: a database including lariciresinol, pinoresinol, secoisolariciresinol and matairesinol, British Journal of Nutrition (2005), 93, 393–402
[7] Esra Porgalı, Ebru Büyüktuncel, Determination of phenolic composition and antioxidant capacity of native red wines by high performance liquid chromatography and spectrophotometric methods, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of İnönü, 44280 Malatya, Turkey, Food Research International 45 (2012) 145–154
[8] Raul Marti, Mercedes Valcarcel, Jose Manuel Herrero-Martinez, Jaime Cebolla-Cornejo, Salvador Rosello, Fast simultaneous determination of prominent polyphenols in vegetables and fruits by reversed phase liquid chromatography using a fused-core column, Food Chemistry 169 (2015) 169–179
[9] Marijan Šeruga, Ivana Novak, Lidija Jakobek, Determination of polyphenols content and antioxidant activity of some red wines by differential pulse voltammetry, HPLC and spectrophotometric methods, Department of Applied Chemistry and Ecology, Faculty of Food Technology, University of Osijek, Franje Kuhača 20, HR 31000 Osijek, Croatia, Food Chemistry 124 (2011) 1208–1216
[10] Andrei Florin Dănuț, Analiză Instrumentală – Partea I, Editura Universității din București, 2010, p.3-5
[11] Vesna Weingerl, A Comparative Study of Analytical Methods for Determination of Polyphenols in Wine by HPLC/UV-Vis, Spectrophotometry and Chemiluminometry, University of Maribor, Faculty of Agriculture and Life Sciences, Hoče, Slovenia, Macro to Nano Spectroscopy, Edited by Dr. Jamal Uddin, June, Publisher InTech, 2012, p.357-370
[12] Helena Franquet-Griell, Antonio Checa, Oscar Núñez, Javier Saurina, Santiago Hernández-Cassou, Determination of Polyphenols in Spanish Wines by Capillary Zone Electrophoresis. Application to Wine Characterization by Using Chemometrics, Department of Analytical Chemistry, University of Barcelona, Martí i Franquès 1-11, E-08028 Barcelona, Spain, American Chemical Society, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60, 8340-8349
[13] Meritxell Navarro, Oscar Núñez, Javier Saurina, Santiago Hernández-Cassou, Luis Puignou, Characterization of Fruit Products by Capillary Zone Electrophoresis and Liquid Chromatography Using the Compositional Profiles of Polyphenols: Application to Authentication of Natural Extracts Department of Analytical Chemistry, University of Barcelona, Martí i Franquès 1-11, E-08028 Barcelona, Spain, American Chemical Society, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62, 1038-1046
[14] Renato G. Peres, Gustavo A. Micke, Marina F. M. Tavares, Delia B. Rodriguez-Amaya, Multivariant optimization, validation, and application of capillary electrophoresis for simultaneous determination of polyphenols and phenolic acids in Brazilian wines, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, J. Sep. Sci 32 (2009), 3822–3828
[15] Sergio Gomez-Alonso, Esteban Garcıa-Romero, Isidro Hermosın-Gutierrez, HPLC analysis of diverse grape and wine phenolics using direct injection and multidetection by DAD and fluorescence, Journal of Food Composition and Analysis 20 (2007), 618–626
[16] A. Rodríguez-Bernaldo de Quirós, M.A. Lage-Yusty, J. López-Hernández, HPLC- nalysis of polyphenolic compounds in Spanish white wines and determination of their antioxidant activity by radical scavenging assay, Food Research International 42 (2009) 1018–1022
[17] Ang Zhang, Li Wan, Cuiyun Wu, Yulin Fang, Guomin Han, Hua Li, Zhenwen Zhang and Hua Wang, Simultaneous Determination of 14 Phenolic Compounds in Grape Canes by HPLC-DAD-UV Using Wavelength Switching Detection, Molecules 18 (2013), 14241-14257
[18] Marica Medić-Šarić, Mirza Bojić, Vesna Rastija and Josipa Cvek, Polyphenolic Profiling of Croatian Propolis and Wine, Food Technol. Biotechnol. 51 (2) 159–170 (2013)
[19] Martin S. Pour Nikfardjam, László Márk, Péter Avar, Mária Figler, Robert Ohmacht, Polyphenols, anthocyanins, and trans-resveratrol in red wines from the Hungarian Villa´ny region, Food Chemistry 98 (2006), 453–462
[20] A. M. Tarola, F. Milano, V. Giannetti, Simultaneous Determination of Phenolic Compounds in Red Wines by HPLC-UV, Analytical Letters, 40 (2007), 2433–2445
[21] German J. B., Walzem R. L., The health benefits of wine, Annu Rev Nutr 2000; 20:561-593
[22] Souto XC Prasongsidh, B.C.; Skurray, G.R., Capillary electrophoresis analysis of trans- and cis-resveratrol, quercetin, catechin and gallic acid in wine, Food Chemistry, Volume 62, Number 3, July 1998, pp. 355-358
[23] ICH-Q2A Guideline for industry: text on validation of analytical procedures
[24] I. Ghe.Tănase, Al. Pană, G. L. Radu, M. Buleandră, Validarea metodelor analitice –Principii teoretice și studii de caz, Editura Printech, București, 2007.
[25] Susanna Munoz, Montserrat Mestres, Olga Busto, Josep Guasch, Determination of some flavan-3-ols and anthocyanins in red grape seed and skin extracts by HPLC-DAD: Validation study and response comparison of different standards, ANALYTICA CHIMICA ACTA 628 (2008) 104–110
[26] S. Kallithraka, E. Tsoutsouras, E. Tzourou, P. Lanaridis, Principal phenolic compounds in Greek red wines, Food Chemistry, 99 (2006) 784–793
[27] Joseph J. Dalluge, Bryant C. Nelson, Jeanice Brown Thomas, Lane C. Sander, Selection of column and gradient elution system for the separation of catechins in green tea using high-performance liquidchromatography, Journal of Chromatography A, 793 (1998) 265–274
[28] D.A. Guillen, C.G. Barroso, J.A. Perez-Bustamante, Selection of column and gradient for the separation of polyphenols in sherry wine by high-performance liquid chromatography incorporating internal standards, Journal of Chromatography A, 724 (19961 117-124)
[29] Camelia Drăghici, Simona Dobrinaș, Elisabeta Chirilă, Metode analitice de separare, Ovidius University Press, Constanta, 2010, p.80
[30] David C. Manns, Anna Katharine Mansfield, A core–shell column approach to a comprehensive high-performance liquid chromatography phenolic analysis of Vitis vinifera L. and interspecific hybrid grape juices, wines, and other matrices following either solid phase extraction or direct injection, Journal of Chromatography A, 1251 (2012) 111– 121
[31] Massimo Castellari, Elisa Sartini, Alessandra Fabiani, Giuseppe Arfelli, Aureliano Amati, A nalysis of wine phenolics by high-performance liquid chromatography using a monolithic type column, Journal of Chromatography A, 973 (2002) 221–227
[32] A. M. Tarola, V. Giannetti, Determination by LC of Polyphenols in Italian Red Wine, Chromatographia 2007, 65, March (No. 5/6), 367 – 371
[33] Concepcion Betes-Saura, Cristina Andres-Lacueva, Rosa M. Lamuela-Raventos, Phenolics in White Free Run Juices and Wines from Penedes by High-Performance Liquid Chromatography: Changes during Vinification, J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 3040-3046
[34] Dimitris P. Makrisa, Eleni Psarra, Stamatina Kallithrakac, Panagiotis Kefalasa, The effect of polyphenolic composition as related to antioxidant capacity in white wines, Food Research International 36 (2003) 805–814
[35] Miguel-Angel Rodrıguez-Delgado, Guillermo Gonzalez-Hernandez, Jose-Elıas Conde-Gonzalez, Juan-Pedro Perez-Trujillo, Principal component analysis of the polyphenol content in young red wines, Food Chemistry 78 (2002) 523–532
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Metode de Analiza a Polifenolilor din Vin (ID: 122259)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.