Metode de Analiza a Beta Carotenului

CUPRINS

INTRODUCERE……………………………………………………………………………….

CAPITOLUL 1. Validarea metodelor analitice……………………………………………….

Considerații generale………………………………………………………………………

Considerații teoretice privind caracterizarea parametrilor de performanță ai unei metode analitice. Definiții importante…………………………………………………………………..

Selectivitate / specificitate………………………………………………………

Domeniul de concentrații de lucru…………………………………………….

Liniaritatea………………………………………………………………………

Precizia…………………………………………………………………………..

Exactitatea………………………………………………………………………

Limita de detecție și limita de cuantificare……………………………………

Robustețea………………………………………………………………………………………………

Sensibilitatea…………………………………………………………………………………………..

Variabilitatea………………………………………………………………………………………….

Studii de caz……………………………………………………………………………………………

CAPITOLUL 2. IMPORTANȚA β-CAROTENULUI ÎN ORGANISM…………………..

2.1. Studii de caz……………………………………………………………………………..

CAPITOLUL 3. METODE DE ANALIZĂ A β-CAROTENULUI………………………….

3.1. Metode cromatografice…………………………………………………………………

3.1.1. Determinarea β-carotenului prin HPLC…………………………………………

3.1.2. Determinarea β-carotenului prin cromatografia cu fluide supercritice………..

3.1.3. Studii de caz…………………………………………………………………………

3.2. Metode spectrometrice……………………………………………………………………

3.2.1. Determinarea β-carotenului prin spectrometria de absorbție moleculara în UV-Viz…………………………………………………………………………………………………………………………….

3.3. Tehnici cuplate……………………………………………………………………………

3.3.1. Studiu de caz pe tehnicile cuplate HPLC-NMR………………………………

CAPITOLUL 4. PARTEA EXPERIMENTALĂ…………………………………………….

4.1. Pregatirea probei………………………………………………………………………..

4.2. Trasarea curbei de etalonare……………………………………………………………

4.3. Caracterizarea parametrilor de performanța…………………………………………

4.3.1. Domeniul concentrației de lucru………………………………………………..

4.3.2. Precizia…………………………………………………………………………..

4.3.3. Limita de detecție și de cuantificare……………………………………………

4.3.4. Robustețea…………………………………………………………………………

CONCLUZII……………………………………………………………………………………..

BIBLIOGRAFIE………………………………………………………………………………….

INTRODUCERE

Beta-carotenul aparține grupului de compuși numiți carotenoide. Din punct de vedere istoric, beta-carotenul a fost asociat cu vitamina A, deoarece este transformat rapid în organism în vitamina A și spre deosebire de vitamina preformata, nu este toxică. Pentru aceste motivații, cercetătorii au început, cu mulți ani în urmă, utilizarea beta-carotenului ca supliment, iar astăzi este de departe cea mai cunoscută și cea mai cercetată carotenoidă.[1]

Carotenoidele includ: licopenul, luteină, α-carotenul și zeaxantiul, iar cercetări recente le dovedesc pe acestea că fiind la fel de importante că și β-carotenul în menținerea unei sănătăți optime, în prevenirea îmbolnăvirilor și chiar în tratamente. [1]

Prezența carotenoidelor este semnalată în toate fructele și legumele, participând la formarea culorii galbene, portocalii sau roșii. În rădăcinoase, în special în morcovi, se acumulează o cantitate însemnată de β-caroten. Soiurile care au o culoare portocalie mai intense au un conținut de carotene mai mare decât soiurile de culoare galbenă.[2]

Beta-carotenul, precursorul vitaminei A, se găsește numai în fructele și legumele verzi și galben-portocalii precum morcov, varză creata, guile, spanac, pătrunjel, caise și pepene galben. [1]

În fructe cantitatea de carotenoide crește de asemenea în paralel cu maturarea. De exemplu, ardeii la prematuritate au de 30 de ori mai puțini pigmenți carotenoidici decât cei la maturitate.[2]

Raportul între carotenoide diferă în funcție de organele plantei. Astfel în frunze predomină β-carotină față de α-carotină, pe când în fructe, raportul este invers. Este de remarcat faptul că soiurile mai bogate în vitamina C sunt bogate și în carotenoide.[2]

Vitamina A și carotenoidele pot fi distruse de căldură, de alcalii (de exemplu bicarbonatul de sodium, care este adăugat câteodată la gătitul legumelor pentru a le păstra verzi), de lumina și de aer. Sucul de morcovi este bogat în beta-caroten numai dacă este consumat imediat după preparare.[1]

Există mai mult de patru sute de carotenoide care sunt vitale în menținerea unei sănătăți optime.[1] Pentru păstrarea acestei sănătăți, doza zilnică de bază pentru vitamina A și beta-caroten este:

Vitamina A : 5 000 u.i.-25 000 u.i. pentru femei și bărbați

Beta-caroten: 11 000 u.i.-25 000 u.i. pentru femei și bărbați

Validarea unei metode de analiză este o metodologie de verificare, de confirmare sau de acreditare a validității științifice a unei metode de analiză. Această metodologie are drept scop să demonstreze că o metodă sau un procedeu analitic corespunde utilizării pentru care a fost prevăzut.[3]

Validarea unei metode stabilește prin studii sistematice de laborator, modul în care performanțele îndeplinesc specificațiile referitoare la scopul utilizării sistematice de laborator, modul în care performanțele metodei îndeplinesc specificațiile referitoare la scopul utilizării rezultatelor analitice. Caracteristicile de performanță includ: selectivitatea și specificitatea, exactitatea și precizia, domeniul liniar de aplicabilitate, liniaritatea, sensibilitatea, limita de detecție, limita de cuantificare și robustețea. Acești parametri trebuie clar stabiliți în documentarea metodei la necesitățile lor particulare. Este procesul prin care se stabilește, prin studiu de laborator, modul în care performanțele metodei coincid cu cerințele aplicațiilor analitice urmărite. Caracteristicile de performanță sunt exprimate sub forma parametrilor analitici.[3]

Lucrarea își propune validarea metodei spectrometrice de determinare cantitativă a totalului carotenoidic, folosind ca substanță de referință β-caroten soluție 2,5% în benzen, stabilind următorii parametrii de performanță ai metodei propuse: domeniul de lucru, limita de detecție și limita de cuantificare, repetabilitatea și robustețea. S-a urmărit validarea și aplicarea metodei pentru evaluarea conținutului de β-caroten din legume: morcov, ardei roșu, ardei galben.

CAPITOLUL 1

VALIDAREA METODELOR ANALITICE

1.1. Considerații generale

Performanțele unei metode de analiză trebuie validate, iar incertitudinea rezultatelor estimată la un anumit nivel de încredere.

Scopul unei metode de analiză este de a dovedi că ea dă rezultate fiabile, adică corespunde utilizării pentru care a fost prevăzută.

Validarea este o metodologie care are drept scop să demonstreze că o metodă de analiză corespunde utilizării pentru care a fost elaborată și că performanțele metodei, stabilite prin studii de laborator, satisfac cerințele de aplicabilitate în practica de laborator curentă.

Prin procedeu validat se înțelege acel procedeu sau metodă care au fost explorate și documentate exactitatea (acuratețea) și fidelitatea (precizia), dar pentru care s-a examinat: specificitatea, sensibilitatea și alți parametrii prin care se urmărește creșterea încrederii analitice, adică a încrederii în metodele și procedeele analitice. Prin creșterea încrederii se urmărește acceptarea metodelor de analiză de către întreaga comunitate științifică și de către diferitele organisme internaționale de specialitate.

Pentru validarea metodelor trebuie demonstrați următorii parametri de performanță ai metodei:

Exactitatea sau acuratețea,

Precizia (repetabilitatea și reproductibilitatea),

Linearitatea,

Selectivitate / specificitatea,

Sensibilitatea,

Robustețea

Procedeul de analiză (metoda) se definește ca fiind ansamblul operațiilor necesare pentru a efectua analiza unei substanțe de cercetat: prepararea (pregătirea) probei, materialele de referință și prepararea soluțiilor lor, reactivii necesari, aparatura de utilizat, etalonarea ei, numărul repetițiilor și modul de lucru pentru repetiție.

Validarea metodelor analitice cu ajutorul metodelor statistice, implică respectarea cu rigurozitate a cerințelor metodologiei analitice moderne, care includ la rândul ei următoarele aspecte:

coordonarea armonioasă a protocoalelor studiilor colaborative, interlaboratoare;

alegerea judicioasă a metodelor utilizate în studiile colaborative;

eșantionarea și prelevarea corectă a probelor de analiză;

asigurarea concentrației detectabile prin procedee de îmbogățire și preconcentrare, ceea ce face parte din pretratamentul probei înaintea executării analizei;

efectuarea măsurătorilor analitice privind determinarea speciilor chimice ce compun eșantionul și determinarea concentrației unui component sau dacă este necesar a tuturor componenților;

calcularea rezultatelor analitice și evaluarea acurateții (exactității) metodei de analiză utilizată;

evaluarea preciziei metodei utilizate;

analiza statistică a rezultatelor experimentale, inclusiv a celor din studiile colaborative, interlaboratoare;

prezentarea corectă și onestă a performanțelor metodelor analitice utilizate sau elaborate;

prezentarea datelor privind aplicarea criteriilor de accepătare a validării;

redactarea amănunțită a textelor metodelor analitice validate (standardizate).

La aceste aspecte se mai adaugă altele la fel de importante pentru asigurarea calității validării dintre care se pot menționa:

utilizarea unor materiale de referință corespunzătoare (de calitate garantată) și norme de certificare a conținutului lor;

controlul de calitate al prelevării probelor din eșantionul dat;

controlul intern de calitate, inclusiv a analizelor;

evaluarea externă a calității, prin inspecții și comparații interlaboratoare.

La toate acestea se mai adaugă unele date privind buna pregătire de specialitate a analiștilor care execută analize în laboratoarele de specialitate și care validează metode de analiză ca urmare se impune cunoașterea următoarelor date:

concepte de selectivitate, de specificitate, interferențele de reacție, modalități de rezolvare a interferențelor prin mascarea speciilor chimice interferente, agenți de mascare, factor de mascare, demascare etc;

conceptele de sensibilitate, limită de detecție, limită de diluție, factor care influențează sensibilitatea reacțiilor, zgomot de fond etc;

acuratețe, precizie (repetabilitate, reproductibilitate), liniaritate, robustețe etc,

surse de erori, erori sistematice, erori întâmplătoare, erori personale;

calcularea erorilor absolute și relative, a abaterii standard, a dispersiei, testul Student, Dixon și eliminarea rezultatelor îndoielnice;

Prin cunoașterea și respectarea celor de mai sus se urmărește creșterea încrederii în rigurozitatea științifică a rezultatelor experimentale și a conținutului metodei de analiză, asigurarea calității analitice prin creșterea continuă a necestității și responsabilității analistului.

De asemenea se urmărește optimizarea determinărilor analitice, adică a proceselor de separare, detecție și dozare, concomitent cu asigurarea unui echilibru între beneficiile analizelor și validării și prețul de cost, ca și aplicarea unor criterii unitare, obiective și unanim acceptate pe plan european și mondial, de evaluare a rezultatelor metodelor de analiză.

1.2. Considerații teoretice privind caracterizarea parametrilor de performanță ai unei metode analitice. Definiții importante

1.2.1. Selectivitate /specificitatea

Atât selectivitatea cât și specificitatea sunt parametri de performanță a metodei analitice care oferă o idee cu privire la soliditatea metodei analitice. Unii autori dau definiții diferite pentru acești termeni, în timp ce după alții aceștia par să fie identici. În unele cazuri termenii de selectivitate și specificitate sunt considerați interschimbabili, iar în alte situații specificitatea este considerată a fi 100% selectivitate.

Înainte ca o metodă analitică să fie utilizată într-o determinare analitică cantitativă este necesar să fie demonstrată specificitatea acesteia.

Selectivitatea este definită ca reprezentând abilitatea metodei analitice de a diferenția și a măsura analiții în prezența componenților care sunt așteptați a fi prezenți într-o probă.

Specificitatea este definită ca abilitatea de a evalua fără echivoc analitul în prezența componeneților care sunt așteptați a fi prezenți într-o probă.

Un procedeu analitic este specific dacă el permite detecția sau determinarea unui component dat, dintr-un amestec multicomponent, prin măsurarea cantitativă a unui parametru fizico-chimică caracteristic numai componentului de analizat.

Deoarece rar se poate vorbi de specificitatea unui procedeu analitic, trebuie să se cunoască și conceptul de selectivitate. Un procedeu analitic este selectiv dacă el permite detecția unui component în prezența altora, dacă în soluție se realizează anumite condiții experimentale de eliminare a interferențelor (sau de diminuare a acestora) prin reglarea pH-ului, prin utilizarea unor agenți de mascare, a unor solvenți etc.

Selectivitatea și specificitatea sunt mărimi care evaluează siguranța măsurătorilor. Dacă răspunsul se distinge printre toate celelalte răspunsuri, metoda se spune că este perfect capabilă să măsoare exact un analit în prezența interferențelor.. Din moment ce numai puține metode răspund la un analit, utilizarea termenului de selectivitate este recomandată în locul celui de specificitate.

1.2.2. Domeniul de concentrații de lucru

Domeniul de concentrații de lucru sau simplu, domeniul de lucru, este specific pentru fiecare analit de interes și se referă la setul măsurătorilor/determinărilor pentru care un aparat este omologat și se încadrează în limitele specificate în metoda de analiză.

El este stabilit pentru confirmarea că procedura analitică dezvoltată furnizează un grad acceptabil de liniaritate, exactitate și precizie când se aplică probelor care conțin specia de analizat în interiorul sau la extremitățile domeniului specificat. Testul de omogenitate al dispersiilor verifică și confirmă dacă există diferențe semnificative la limitele domeniului de lucru.

În domeniul concentrațiilor de lucru răspunsul analitic poate fi liniar sau nu și, pentru a demonstra acest lucru este necesară realizarea unei etalonări în mai multe puncte (mai mult de 6 concentrații diferite ale analitului, preferabil 10-11). În cazul în care relația între răspunsul instrumentului și concentrația analitului nu este perfect liniară (poate fi o relație exponențială) procedura analitică poate fi utilizată, dar curba de etalonare trebuie să fie refăcută de la o zi la alta.

1.2.3. Liniaritatea

Linearitatea reprezintă abilitatea unei metode de analiză de a obține rezultate proporționale cu concentrația analitului din probe. Proporționalitatea poate fi directă sau se stabilește statistic.

Liniaritatea nu poate fi exprimată, ea trebuie să fie demonstrată direct pe analit sau în probe îmbogățite utilizând cel puțin cinci concentrații pe domeniul de lucru.

Dincolo de evaluarea vizuală a valorii semnalului analitic în funcție de concentrație sunt recomandate calculele statistice corespunzătoare, cum ar fi regresia liniară. În această situație, parametrii statistici cum ar fi panta dreptei de etalonare și intersecția cu ordonata, suma pătratelor valorilor reziduale și coeficientul de corelare trebuie să fie neapărat raportați.

O metodă de analiză are o performanță satisfăcătoare, numai dacă concentrația obținută prin adăugarea analitului în probă este o funcție liniară. Pentru a stabili liniaritatea metodei, trebuie să se efectueze analiza varianței datelor analitice pentru fiecare analit în parte.

1.2.4. Precizia

Precizia exprimă capacitatea unei analize de a furniza o valoare egală sau foarte apropiată de valoarea reală (adevărată). Aceasta dovedește absența unei erori sistematice.

Precizia se exprimă, în primul rând, ca o abatere standard ( s, σ) sau ca o abatere standard relativă procentuală ( RSD %). Precizia poate fi luată în considerare la trei nivele: repetabilitate, precizie intermediară și reproductibilitate.

Precizia depinde numai de distribuția erorilor întâmplătoare și nu este legată de valoarea de încredere sau valoarea specificată, redă concordanța care există între rezultatul analizei și valoarea de referință acceptată. Rezultatele considerate ca răspunsuri analitice se pot exprima în % de regăsire.

Precizia este o măsură a repetabilității și a reproductibilității rezultatelor analitice, furnizate de o metodă de analiză .

a. Repetabilitatea, exprimă apropierea strânsă care există între valorile analitice independente obținute prin aceeași metodă de analiză pe elemente identice analizate, în același laborator de către același operator, utilizând aceași echipament (instrumentar). Repetabilitatea măsoară valoarea analitică minimă sub care se situează cu o probabilitate specifică, valoarea absolută a diferenței dintre două rezultate analitice obținute în aceleași condiții de lucru (același laborator, același aparat, același operator). Se evaluează plecând de la 10 determinări din același eșantion în condiții de lucru concrete. Repetabilitatea se calculează cu ajutorul abaterii standard folosind relația:

S ==

în care: n=numărul de probe analizate;

xi=valorile măsurătorilor;

 =media aritmetică;

di=abaterea unei măsurări individuale de la medie;

b.Precizia intermediară este un termen ce reprezintă variabilitatea pe termen lung a procesului de măsurare atunci când probe identice sunt analizate / măsurate prin aceeași metodă, același laborator, utilizând două sau mai multe instrumente diferite, de către operatori diferiți, pe o perioadă mai lungă de timp și este determinată prin compararea rezultatelor unei metode pentru un singur laborator pentru un anumit număr de săptămâni.

O precizie intermediară a unei metode analitice poate reflecta discrepanța între rezultatele obținute pe operatori diferiți, pe instrumente diferite, cu etaloane și reactivi de la furnizori diferiți. Obiectivul preciziei intermediare este de a verifica că în același laborator metoda va oferi aceleași rezultate odată ce etapa de dezvoltare a metodei este terminată.

c. Reproductibilitatea reprezintă precizia obținută între laboratoare și exprimă strânsa legătură care există între rezultatele analitice obținute cu aceeași metodă, pe elemente identice, testate în laboratoare diferite, utilizând echipamente diferite (analiza colaborativă).

Obiectivul acesteia este de a verifica dacă metoda analitică dezvoltată și caracterizată va oferi aceleași rezultate în laboratoare diferite.

Reproductibilitatea măsoară valoarea sub care se situează, cu o probabilitate specifică, valoarea absolută a diferenței dintre rezultatele analitice individuale obținute de laboratoare diferite, operatori diferiți, prin aceeași metodă de analiză.

Reproductibilitatea unei metode analitice este determinată prin analliza unor părți alicote din loturi omogene în laboratoare diferite, analiști diferiți, dar se încadrează între parametrii specifici ai metodei. Valoarea reproductibilității este importantă dacă metoda analitică va fi utilizată în laboratoare diferite.

Reproductibilitatea furnizează o abatere standard SR care se calculează cu ajutorul relației:

SR= a=

în care: a=valoarea medie totală;

Sz=abaterea/deviația de la media totală;

Si= abaterea/deviația la primul laborator;

m= numărul de laboratoare;

N=numărul total de valori analitice;

ni= numărul de valori analitice la primul laborator.

Practic, reproductibilitatea poate fi admisă ca o expresie a incertitudinii de măsurare pentru o metodă de analiză folosită în cadrul unui laborator.

1.2.5. Exactitatea

Exactitatea unei proceduri analitice exprimă “ apropierea” între valoarea care este acceptată ca valoare de referință (valoare adevărată) și valoarea măsurată. În viziunea standardului ISO 3575-1, exactitatea exprimă “ apropierea rezultatelor măsurătorilor de valoarea adevărată”, iar în “Ghidul calității în chimia analitică” se arată că “ exactitatea reprezintă gradul de concordanță între rezultatele unei încercări și valoarea de referință acceptată (adevărată) a măsurandului”.

Exactitatea metodei analitice arată, deci, în ce măsură valoarea determinată pentru un analit într-o probă corespunde valorii adevărate. Aceasta reprezintă abaterea sistematică a rezultatelor măsurate față de rezultatul adevărat. Exactitatea metodei analitice este, de asemenea, un indicator cu privire la utilizarea și aplicabilitatea acelei metode l aprobe reale. Ea este un concept relativ.

În practica analitică exactitatea exprimă îngustimea acordului dintre valoarea care este acceptată ca o valoare convențional –adevărată (A, X, standard propriu al firmei) sau o valoare de referință acceptată și o valoare găsită cum este valoarea mediei aritmetice X, găsită sau obținută prin aplicarea metodei de analiză, de un număr oarecare de ori. Exactitatea oferă informații asupra erorilor sistematice.

În context este importantă valoarea de referință privitoare la un etalon 100% sau la o gamă de etalonare a principiului activ singur. Intervalul de concentrație ce se validează este acoperit de o serie de minimum 5 concentrații echidistante, de ex. 60, 80, 100, 120 și 140% în raport cu concentrația teoretică. Se efectuează cel puțin 3 serii independente pentru fiecare din cele 5 concentrații pentru substanța de analizat.

1.2.6. Limita de detecție și limita de cuantificare

Limita de detecție (LD) este cea mai mică concentrație de analit într-o probă care poate fi detectată cu a analitului care dacă este realmente prezent se poate detecta cu o certitudine statistică rezonabilă, dar nu neapărat cuantificată ca o caloare exactă în condițiile stabilite ale încercării.

Limita de cuantificare (LC) este cea mai joasă concentrație sau cantitate de analit care poate fi determinată cantitativ cu un nivel acceptabil de fidelitate a repetabilității și exactității.

1.2.7. Robustețea

Robustețea se referă la capacitatea unei metode de analiză de a da rezultate identice, în condiții de lucru diferite. O metodă de analiză se consideră robustă, când este insensibilă la unele variații, uneori incontrolabile, în timpul utilizării ei normale. Robustețea unei metode de analiză exprimă capacitatea acesteia de a conduce la obținerea unor rezultate valabile (exacte), chiar dacă se produc modificări limitate (slabe) ale condițiilor experimentale, la aplicarea unei metode de analiză. Studiul robusteții pentru ansamblul diferitelor categorii de determinări sau teste, permite definirea variațiilor (modificărilor sau a variabilității) admisibile ale oricăruia dintre parametrii operatori, variații care nu au efect asupra validității rezultatelor analitice ce se obțin. În acest context trebuie remarcat că robustețea permite analistului să valideze sau nu rezultatele determinării sale. Atunci când variațiile sunt mici, rezultatele se pot valida, iar când variațiile sunt mai mari (deci neacceptabile) rezultatele nu pot fi validate, de aceea rolul robusteții ca și criteriu de validare este foarte important.

1.2.8. Sensibilitatea

Sensibilitatea exprimă aptitudinea unei metode de a distinge diferențe mici între concentrațiile unui analit. Trebuie să se definească pentru un analit, cel mai mic interval de concentrație (ΔX) care dă două rezultate semnificative diferite denumite „puterea de rezoluție” a unei metode de analiză.

Teoretic, sensibilitatea este definită ca fiind panta dreptei tangențiale la curba de etalonare. Atunci când modelul matematic care descrie curba de etalonare este liniar, valorile de sensibilitate a metodei sunt pantele dreptelor de etalonare.

1.2.9 Variabilitatea

Variabilitatea este o măsură a erorilor întâmplătoare (aleatoare), care explică diferențele dintre rezultatele analitice obținute de doi analiști, pe același eșantion, prin urmare în obținerea rezultatelor analitice există o variabilitate; cu toate că nu pot fi controlați toți factorii ce pot influența rezultatele determinărilor, în interpretarea practică a rezultatelor analitice trebuie să se țină seama de această variabilitate și de numeroși factori ce o pot determina:

-analistul, cu pregătirea, calitățile și defectele sale;

-echipamentul utilizat;

-etalonarea echipamentului utilizat;

-condițiile de mediu din laborator (umiditate, temperatură, poluare, grad de curățenie);

-timpul;

-reactivi (grad de puritate, vechimea etc.)

Variabilitatea este mai mare când rezultatele ce se compară sunt obținute de analiști diferiți, sau de către un singur analist, dar cu instrumente (aparate) diferite.

1.2.10. Studii de caz

Philipp Kaiser și colaboratorii au aplicat o metodă binară metanol/terț-butil metil eter gradient de la polimer cu fază inversă C30. Evaluările de liniaritate, precizie și recuperare au fost combinate într-un singur set de experimente. Pentru evaluarea preciziei, coeficientul de variație (R.S.D) a fost calculat din datele domeniului de liniaritate [4].

B. Stephen Inbaraj și colaboratorii au aplicat o metodă pentru a discerne varietatea și conținutul de carotenoizi în microalga Chlorella pyrenoidosa. Intreaga extracție a fost efectuată sub o lumină difuză și azot gazos. Extractul a fost spălat în flacoane pentru a evita izomerizarea și degradarea carotenoidelor [5].

Carla M. Stinco și colaboratorii au aplicat o metodă prin care a dezvoltat și validat determinarea a nouă compuși de carotenoide ( violaxantina, luteina, zeaxantina, β-cryptoxantin, α-caroten, β-caroten, licopen, phytoene, phytofluene). Metoda poate reduce timpul analizei în comparație cu alte metode HPLC convenționale [6].

CAPITOLUL 2

IMPORTANȚA β-CAROTENULUI ÎN ORGANISM

2.1. Studii de caz

β-carotenul este cel mai frecvent detectat carotenoid în țesutul uman și plasmă. După trecerea β-carotenului în peretele intestinal , este scindat de vitamina A și metaboliți, revine la lumenul intestinal prin bilă , sau este absorbit în întregime în circulație.[17]

β-carotenul, aparține grupului de carotenoide, este un micronutrient important pentru care au fost atribuite anumite proprietăți legate de sănătate. Ca rezultat al structurii sale moleculare specifice, constând dintr-un lanț de poliene cu 11 legături duble conjugate și un β-inel la fiecare capăt al lanțului. β-carotenul are provitamina A și activitate antioxidantă. β-carotenul este prezent în diverse produse alimentare pe baza de plante. În dieta umană, morcovii sunt surse comune de β-caroten și sunt adesea consumate ca produse prelucrate (de exemplu: supe, sucuri, piureuri).

Un scop major al prelucrarii produselor alimentare este conservarea alimentelor. Perioada de valabilitate a produselor alimentare pot fi îmbunătățite prin distrugerea microorganismelor patogene și inactivarea microorganismelor de alterare și enzime. Prelucrarea ar putea afecta, de asemenea, β-carotenul în moduri diferite.[18]

Jouni Karppi și colaboratorii săi au examinat dacă concentrațiile serice ale carotenoidelor sunt legate de riscul de moarte subita de cauza cardiaca la barbati de varsta mijlocie. Concentrațiile serice de carotenoide au fost măsurate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță . Raporturile de pericol, de ser β-caroten , licopen și acarotene au fost estimate prin utilizarea modelului de risc proporțional Cox, după ajustarea pentru varsta si alți factori de confuzie potențiali. Descoperirile sugerează că scăderea concentratiilor de β-caroten ser poate crește riscul de moarte subită de cauză cardiacă la barbații de varsta mijlocie . Mai mult, concentrațiile reduse de β-caroten ser pot fi legate de riscul de boli cardiovasculare si a mortalității totale.[19]

Datele din Organizatia Mondială a Sănătății a sugerat că erau 37 milioane de oameni din întreaga lume orbi în 2002 și cataracta este una din cauzele majore.

Dacă vitamina A si β-carotenul ca nutrienți sunt factori de protecție împotriva cataractei rămâne neclar . Pentru a evita riscul de cataractă, scopul acestui studiu a fost de a rezuma dovezile din studiile epidemiologice de vitamina A si β-caroten.

Descoperirile facute de Aimin Wang M.D. și colaboratorii săi din aceasta meta -analiză indică faptul că cel mai mare nivel de β-caroten ser sunt asociate cu un risc redus de cataractă , în special în studii prospective . Cu toate acestea , nici o asemanare semnificativă nu a fost gasită între nivelurile serice de β-caroten.[20]

Diabetul de tip 2 este o boală majoră legată de stilul de viata. Organizația Mondială a Sănătății a raportat ca prevalența diabetului de tip 2 a fost de 6,4 % în 2010 și este de așteptat să crească la 7,7% până în 2030.

Deși legumele verzi și galbene au efecte benefice împotriva diabetului de tip 2 , relația conținutului lor nutritiv cu rezistenta la insulină este prost înteleasă . Scopul acestui studiu a fost de a examina asocierile de ser β-caroten și concentrațiile de retinol cu glicemie și insulină.

Descoperirile Kana Higuchi M.S. și colaboratorilor săi sugerează că nivelurile mari de β-caroten ser, asociate cu aport mai mare de legume verzi si galbene , conferă efecte benefice împotriva rezistenței la insulină.

Serul a fost separat de sângele integral în eprubete cu EDTA – 2 Na prin centrifugare ( 3000 g timp de 15 min la 4 ° C ) și congelat imediat la 80 ° C până la analiză .

Studii anterioare au raportat concentrații de retinol din plasmă și carotenoizi depozitate la 70°C care sunt stabile timp de 4 ani . Concentrațiile serice de β-caroten și retinol au fost măsurate prin HPLC cu detectare de fotodiode . Detectorul de fotodiode a fost ajustat la 325.6 nm pentru retinol si 451.5 nm pentru β-caroten ca în standarde. Coeficientul de variație a fost 9,3% pentru retinol și 6,3% pentru β-caroten.[21]

Studiul lui Sławomir Kasperczyk și colaboratorilor săi a fost de a determina dacă administrarea de β-caroten reduce stresul oxidativ si influentele antioxidante, în sistemele de apărare a lucrătorilor expuși cronic de a conduce.

Tratamentul cu β-caroten, a dus la scăderea semnificativă a activitatii peroxidazei.În ciuda controverselor asupra proprietăților antioxidante ale beta-carotenului, rezultatele au aratat o scădere cantitativă a stresului după suplimentarea cu β-caroten.[22]

CAPITOLUL 3

METODE DE ANALIZĂ A β-CAROTENULUI

3.1. Metode cromatografice

Cromatografia reprezintă o metodă analitică de separare simultană pentru indentificarea și determinarea cantitativă a analitilor din probe complexe. Principiul cromatografiei se bazează pe repartiția diferențiată a componenților unui amestec între două faze nemiscibile între ele aflate în contact și care se situează într-un raport de mișcare relative una față de cealaltă, denumite prin termenii de faza staționară și faza mobilă.

Faza staționară trebuie să fie într-o stare de agregare “compactă”, adică poate să fie solidă sau lichidă. Faza staționară solidă sau suportul solid pot fi granulare, aranjate sub formă de pat într-o coloana, sau dispuse tubular, direct pe pereții coloanei.

Faza mobilă trebuie să fie într-o stare de agregare “fluidă”, adică poate fi un lichid, un gaz sau un fluid supercritic, nemiscibile cu faza staționară. Dacă se utilizează o fază mobilă gazoasă tehnică se numește cromatografie gazoasă (GC), dacă se utilizează o fază mobilă lichidă tehnică se numește cromatografie lichidă (LC), iar dacă este un fluid supercritic, tehnică se numește cromatografie cu fluide în stare supercritică (SFC).

Figura 3.1. Schema unui cromatograf: 1- sursă de eluent; 2-regulator de debit; 3-sistem de injecție; 4-coloană; 5-detector; 6-termostat; 7-computer cu soft specializat; 8-imprimantă

Faza mobilă sau eluentul are rolul de a transporta proba prin coloana cromatografică și asigura mediul de repartiție diferențială.

Regulatorul de debit are rolul de a controla debitul eluentului(gazos sau lichid) în regim izobar sau cu gradient. Este un debitmetru în cazul cromatografiei gazoase sau o pompă în cazul cromatografiei lichide.

Sistemul de injecție a probei permite introducerea manuală (seringă) sau automată (injector) a probei direct în eluent. Injectoarele sunt dispozitive cu construcție diferită pentru cromatografia gazoasă și cea lichidă. Injectarea automată asigură reproductibilitatea cantității de probă introdusă în coloană. Eficiența separării și calitatea rezultatelor depind în mare măsură de etapa de introducere a probei.

Coloana cromatografică este sediul fazei staționare și conține cele două faze cromatografice și amestecul de compuși, fiind locul unde se realizează separarea componenților porbei.

Detectorul are rolul de a pune în evidență componenții care părăsesc coloana cromatografică antrenați de faza mobilă, fiind capabil să perceapă o anumită proprietate specifică componenților probei, pe care să nu o posede eluentul. Detectorul este piesa cea mai importantă a unui cromatograf după coloana cromatografică. Există două categorii de detectori: universali și specifici. Cei universali pot evidenția un număr mare de componenți, iar cei specifici pot detecta numai anumiți componenți.

Termostatul asigura temperatura uniforma pe intregul traseu al probei, indifferent daca se opereaza in conditii izocratice sau cu un gradient.[7]

Cromatografie

Gaz Fluid supercritic Lichid

Solidă Lichidă Solidă Lichidă Solidă Lichidă

(GSC) (GLC) (SFC) (SFC) (LSC) (LLC)

Adsorbție Repartiție Adsorbție Repartiție Adsorbție Repartiție

Fază normală Schimb Perechi Excluziune Permeație

sau inversă ionic de ioni sterică prin geluri

Figura 3.2. Clasificarea metodelor cromatografice

3.1.1. Determinarea β-carotenului prin HPLC

A.I. Olives Barba și colaboratorii au optimizat metoda HPLC pentru determinarea lycopenului și β-carotenului în legume și comparația ei cu o metodă standard spectrofotometrică.

Monstrele considerate pentru analize au fost: roșia, morcov, ardei iute, pepene roșu, curmal japonez și moșmon. (UV detection) [8]

J.P. Chen și colaboratorii au dezvoltat o metodă HPLC pentru a determina diverșii carotenoizii din mango taiwanez. Inițial, coaja și semințele de mango au fost îndepărtate, pulpa a fost tăiată în bucăți, liofilizate, măcinate în praf, extras și supus analizei HPLC.

Extracția carotenoidelor din mango uscat : un gram de mango uscat a fost amestecat cu 30 ml hexan-etanol-acetonă-toluen (10: 6: 7: 7, v / v / v / v) într-un balon cotat de 100 mL. După agitare timp de 1 oră, 2 ml de 40% KOH în methanol a fost adăugat și soluția a fost supusă saponificării la 25 ° C în întuneric timp de 16 ore. Apoi, 30 ml de hexan a fost adăugat pentru partiție de carotenoide, agitat timp de 1 minut , 10% soluție de sulfat de sodiu a fost adăugată și diluată la volum, iar după agitare timp de 1 minut, stratul superior a fost colectat. Stratul apos a fost extras în mod repetat de două ori și supernatantul a fost, de asemenea, colectat. Extractele superioare s-au comasat, evaporate la sec, dizolvate în 1 ml metanol-metilen clorură-izopropanol (89: 1: 10, v / v / v) și se filtrează printr-un filtru de 0,2µm cu membrană pentru analiza HPLC. [9]

Compoziția chimică a uleiului de măsline variază foarte mult în funcție de soiul de fructe, studii de maturitate al fructelor, condițiile de mediu, regiunea de creștere și tehnici de prelucrarea și păstrare. Acești factori influențează culoarea uleiului, care este una dintre caracteristicile de bază de calitate ale uleiurilor de măsline virgine. Culoarea verde-gălbui se datorează diverșilor pigmenți, adică clorofilelor, pheophytins și carotenoidelor.

Angelo Cichelli, Gian Pietro Pertesana evaluează posibilitatea de a obține de la determinarea calitativă-cantitativă a pigmenților conținuți în uleiurile de măsline monovarietal(clorofile, carotenoide și pheophytins) și din analiză statistică multivariata a acestor măsuri, parametrii capabili să distingă soiurile.[10]

C.H. Lin, B.H. Chen a dezvoltat o metoda HPLC pentru a determina diferitii carotenoizi în sucul de roșii. Licopenul sa dovedit a fi prezent în cea mai mare cantitate în suc de roșii, urmată de β-caroten si luteina.[11]

3.1.2. Determinarea β-carotenului prin cromatografia cu fluide supercritice

Cromatografia cu fluide supercritice este o tehnică hibridă care prezintă caracteristici comune atât cu cromatografia gazoasă, cât și cu cromatografia lichidă. Astfel, folosind această tehnică se pot separa și determina compuși care nu se pot analiza în mod adecvat nici prin cromatografia gazoasă, nici prin cea lichidă.Temperatura supercritică a unei substanțe este temperatura peste care, indiferent de presiune, substanța nu mai poate exista în fază lichidă.

Deoarece presiunile și temperaturile necesare producerii de fluide supercritice din gaze și lichide obișnuite se găsesc în limitele de funcționare a echipamentelor utilizate în HPLC, echipamentele pentru cromatografia cu fluide supercritice sunt asemănătoare cu aceste echipamente.Totuși pentru a controla cu precizie temperatura fazei mobile este necesar un cuptor de termostatare a coloanei asemănător celor folosite în cromatografia gazoasă.

În cromatografia cu fluide supercritice se folosesc mai mult coloane capilare, dar pot fi folosite și coloane cu umplutură. Coloanele capilare sunt asemănătoare coloanelor de silice fuzibilă și au peretele interior acoperit cu diverși siloxani reticulate, grosimea filmului de fază staționară variind între 0,05 și 1 µm. Lungimea acestor coloane este de 10-20 m, iar diametrele lor interioare sunt cuprinse între 0,05-0,10 µm.

Ca detector în cromatografia de fluide supercritice se folosesc detectorul de ionizare în flacăra, spectrometrele de masă, detectorii de absorbție în ultraviolet și în infraroșu, de emisie prin fluorescent și cei termoionici.

Cea mai folosită fază mobilă în cromatografia de fluide supercritice este dioxidul de carbon. Nu este toxic, este inodor, ușor de obținut și mult mai ieftin în comparație cu alte faze mobile cromatografice. Mai pot fi utilizate ca faze mobile: amoniacul, monoxidul de azot, etanul, butanul, pentanul, dietileterul.[7]

3.1.3. Studii de caz

M. Careri și colaboratorii a folosit o procedură de proiectare experimentală pentru a investiga efectele unor parametrii de funcționare pe extracția de fluide supercritice a carotenoizilor β-caroten, β- criptoxantina și zeaxantina din algele Spirulina Pacifică, un produs alimentar bogat în carotenoizi. Variabilele testate au fost de temperatură și presiune a fluidului supercritic, timp de extracție dinamic și procentaj de etanol adăugat ca modificator. Analizele extractelor au fost efectuate prin HPLC cu UV-vis cu detector cu șir de diode.

Carotenoidele au fost extrase din Spirulina Pacifică pulbere în urma unei proceduri raportate în literatura de legume. După filtrare pe membrane de 0,2 µm, extractele au fost injectate în sistemul HPLC fără nici un alt tratament cu excepția diluării standardelor adecvate.[12]

Scopul acestui studiu a fost de a stabili influența presiunii, temperatura și timpul de extracție cu fluide în stare supercritică de β-caroten din uleul de palmier brut. Condițiile de operare au fost prezentate după cum urmează: presiuni de 75, 125 și 175 bari; temperaturi de 80, 100 și 120℃ și timp de extracție de 1, 3 și 5 ore. Extractele au fost analizate utilizând spectroscopia UV la o lungime de undă de 450 nm. Apoi datele experimentale au fost comparate cu datele obținute folosind o metodă statistică. Rezultatele de la model au arătat o bună concordonanță cu datele experimentale. Rezultatele (obținute de la modelul statistic) demonstrează că sunt necesare o presiune de 140 bari, temperatura de 102℃ și timp de extracție de 3,14 ore pentru a obține randament optim de β-caroten (1.028 × 10-2%) din procesul de extracție, totuși randamentul maxim al β-carotenului (1.741 × 10-2%) a fost obținut experimental la o presiune de 75 bari, o temperatura de 120℃ și timp de extracție de 1 oră. Aceste date au fost obținute de R. Davarnejad și colaboratorii. Probele au fost analizate utilizând un spectrofotometru (modelul UV-120-020, Shimadzu, Tokyo, Japonia) după extracția în faza lichidă. Acestea au fost diluate într-un amestec de solvenți format din 70% n-hexan și 30% acetonă (v / v) și absorbanța a fost citită la lungimea de undă de 450 nm. [13]

3.2. Metode spectrometrice

Spectrometria de absorbție moleculară în ultraviolet-vizibil se bazează pe absorbția radiațiilor luminoase din domeniul UV-Viz de către molecule.

Spectrele de absorbție moleculară se datorează tranziției unor electroni din orbitalii moleculari de legătură sau nelegătură, aflați în stare fundamentală în orbitalii moleculari de antilegatură, ce corespund unor stări excitate.

Energiile electronilor din stările moleculare fundamentale și stările excitate sunt determinate de structura moleculei.

Peste tranzițiile electronice se suprapun tranziții între stări energetice de vibrații și rotații, spectrele obținute au maxime de absorbție largi. Spectrul va fi determinat de întreaga structură a moleculei și mai puțin de prezența unor anumite legături.

Figura 3.3. Schema bloc a unui spectrometru monofascicul

Figura 3.4. Schema bloc a unui spectrometru dublu-fascicul

Aplicații ale spectrometriei de absorbție moleculară în UV-Vizibil

Spectrometria de fluorescență moleculară se bazează pe emisia de lumină de către moleculele aduse în stare electronică excitată (reemisia de energie radiantă), prin absorbție de radiații din domeniul UV-VIZ. În cazul soluțiilor diluate, intensitatea fluorescenței este proporțională cu intensitatea luminii absorbite.

Se aplica în analiza biochimică, în cercetări biomedicale pentru analizele chimice obișnuite ale unor probe de origine biologică. Se pot determina astfel tiamina, riboflavina și metaboliții lor, aflați în urme în țesuturile și fluidele biologice.

Se mai poate aplica în controlul de calitate din industria medicamentelor, se determină cu succes hidrocarburile policiclice aromatice din probe de apă datorită proprietăților lor luminiscente (au un grad înalt de conjugare și prezintă fluorescență).[14]

3.2.1. Determinarea β-carotenului prin spectrometria de absorbție moleculara în UV-Viz

Cationii radicali, dicationii și speciile intermediare oxidate de trei carotenoide, anume, β-caroten, licopen și norbixina, au fost generate în soluțiile CH2Cl2 prin oxidare chimică folosind FeCl3 anhidru. UV-Vis, fluorescent și studiile spectroscopice fluorescente-excitante au fost efectuate pentru a înțelege și compara natura speciilor intermediare generate în timpul procesului de oxidare chimică și degradare ulterioară. Emisia intensă observată la 550 nm, poate fi atribuită la S2→S0 (11Bu→11Ag) tranziția moleculelor de carotenoide. Excitația 350 nm din timpul procesului de oxidare pentru β-caroten, licopen și norbixina, prezintă vârfuri de fluorescență intense la 492 nm, 493 nm și respectiv 500 nm. Aceste vârfuri sunt atribuite pentru a intermedia compușii peroxi/epoxi din cele trei molecule care sunt formate cu oxigen molecular prealabil la formarea de compuși stabili oxidați cu lanț scurt. Acest studiu de caz a fost efectuat de D.D.D.H Alwis și colaboratorii săi.

Spectrele de absorbție au fost înregistrate cu ajutorul unui dispozitiv electronic Labomed , Inc. , Spectro UV -vis spectrofotometru dublu- fascicul model UVD2960. Experimentele fluorescente au fost efectuate la 25° C folosind un spectrometru cu lumină fluorescentă ThermoScientific .

Lungimea de undă de excitare utilizată în această lucrare a fost 350nm . Lungimile de undă de sondare ale fluorescenței de excitare au fost înregistrate la 550nm. S-a utilizat cuva titulară cu încălzitorul Peltier pentru obținerea spectrelor la diferite temperaturi în intervalul de 10-40 °C. Randamente cuantice de fluorescență din zonele I – III au fost măsurate utilizând sulfat de chinină. FeCl3 în CH2CI2 și toți solvenții folosiți în această lucrare au fost scanați pentru a confirma că aceștia nu prezintă impurități fluorescente .[15]

3.3. Tehnici cuplate

Limitele tehnicilor de separare analitică constau în capacitatea redusă a acestora de a oferi informații de identificare de încredere. Identificarea compușilor bazată doar pe timpi de retenție în cromatografie nu este întotdeauna suficientă, necesitând sisteme care să ofere informații structural suplimentare.

Din combinarea celor două mari grupe de metode analitice (de separare și spectrometrice), fiecare reprezentând surse de informații complementare, se pot obține informațiile necesare unor evaluări calitative și cantitative corecte, s-au dezvoltat tehnicile cuplate (tandem), care constau în combinarea unor sisteme de separare analitică cu sisteme analitice de determinare calitativă, capabile să furnizeze informații structurale.

Cuplarea HPLC-MS este mai complexă, datorită faptului că faza mobilă este un lichid, care trebuie adus în condițiile de transfer în camera de ionizare a spectrometrului de masă.

Cuplarea TLC-MS și CE-MS sunt realizabile și utilizate în analize complexe, dar cu aceleași condiții impuse cumplajului HPLC-MS: prezența sărurilor de amoniu în faza mobilă a TLC, respectiv în electrolitul CE.

Pe lângă sistemele disponibile comercial, există și sisteme tandem dezvoltate doar la scară de laborator, dar care au fost testate în practică și și-au demonstrat utilitatea și aplicabilitatea: HPLC-NMR; HPLC-RAMAN; HPLC-FLD. Prezentarea acestor exemple de tehnici cuplate ilustrează complexitatea, dar și avantajul abordării multidisciplinare în analiza probelor reale, prin posibilitatea de a obține informații rapide, cu grad mare de certitudine.[7]

3.3.1. Studiu de caz pe tehnicile cuplate HPLC-NMR

Dezvoltarea sistemelor despărțite miniaturizate ca un lichid capilar cromatografic de înalta performanță și nuclear magnetic de rezonanță spectroscopică (HPLC-NMR) rămâne o provocare în elucidarea domeniului structural. În combinate cu o proba selectivă specifică, tehnica de preparare, matricea în fază solidă de dispersie (MSPD), și o fază inversă C30 foarte selective HPLC-NMR permite identificarea de mici cantități de compuși naturali. Aici, cercetarea de cinci carotenoizi într-o soluție standard și două carotenoide dintr-o probă de spanac, demonstrează potențialul acestei dezvoltări noi. Separarea carotenoizilor se realizează cu condensate silice auto ambalate capilare cu un gradient de solvent binar format din aceotona și apă. Sistemul miniaturizat permite utilizarea de solvent deuterați compleți pentru cuplare în linie HPLC-NMR. Spectrele 1H NMR a diferiților carotenoizi obținuți în modul flux oprit, a dat un mare semnal-zgomot raport cu o cantitate de probă în intervalul nanogram scăzut. Toți parametrii necesari pentru a elucida structura multiplet, cuplare constantă și valorile de integrare pot fi detectate fără ambiguitate.

Toate separările au fost efectuate pe o capilară C30 auto ambalată cu Bischoff Prontosil (Bischoff Cromatografie, Leonberg, Germania), cu o particula de 3 µm și o lățime a porilor de 200 Å. Suspensia tehnică introdusă de Boughtflower et al. [22] a fost utilizată pentru ambalare. 20 mg de fază staționară au fost suspendate în 300 µl tetraclorură de carbon și plasat într-o baie cu ultrasunete timp de 5-10 minute. Suspensia rezultată a fost transferată într-o cameră de suspensie și forțată în jos într-o capilară de silice cu o pompă pneumatică HPLC (Knauer, GmbH, Berlin-Zehlendorf, Germania). Începând de la 400 bari presiunea a fost crescută continuu până la 650 bar, pe o perioadă de 5 min. Această presiune finală a fost menținută timp de 30 min.

S-a folosit un amestec binar de acetonă și apă.Separarea începe izocratic cu acetonă. Cantitatea de probă injectată a fost de 100 nl pentru capilare HPLC-UV.

Pentru capilara HPLC-NMR complet deuterat s-au folosit solvenți cu același gradient.Volumul injecției a fost crescut de la 100 la 500 nl pentru investigația NMR. Acest articol a fost redactat de Karsten Putzbach și colaboratorii săi.[16]

CAPITOLUL 4

PARTEA EXPERIMENTALĂ

Lucrarea își propune validarea metodei spectrometrice de determinare cantitativă a totalului carotenoidic, folosind ca substanță de referință β-carotenul soluție 2,5% în benzen, stabilind următorii parametrii de performanță ai metodei propuse: domeniul de lucru, limita de detecție și limita de cuantificare, repetabilitatea și robustețea.

S-a urmărit validarea și aplicarea metodei pentru evaluarea conținutului de β-caroten din legume: morcov, ardei roșu, ardei galben.

4.1 Pregătirea probei

10 g produs mărunțit s-au extras cu 100 mL eter, prin refluxare pe cuib electric. Peste soluția eterică s-au adăugat 10 mL KOH 10% în metanol și s-au supus saponificării prin fierbere pe cuib electric timp de o oră. Extractul s-a răcit și s-au adăugat 2-3 volume de apă, după care s-au efectuat 5-6 extracții succesive cu câte 10 mL eter. Soluțiile eterice reunite s-au adus la balon cotat la 100 mL. Citirile s-au făcut la un spectrofotometru Jasco V 550.

4.2 Trasarea curbei de etalonare

Pentru a trasa curba de etalonare au fost efectuate numeroase încercări până când s-au stabilit condițiile optime de lucru.

S-au determinat experimental absorbantele soluțiilor la lungimea de undă 460 nm. S-a lucrat cu o soluție stoc de β-caroten, care s-a preparat prin dizolvarea a 0,0025 μg/mL β-caroten în 100 mL benzen, într-un balon cotat de 100 de mL. Pentru prepararea soluțiilor de lucru s-au măsurat volume corespunzătoare din soluția stoc de β-caroten, respectiv 0,1 mL; 0,2 mL; 0,3 mL; 0,4 mL; 0,5 mL și 0,6 mL.

În baloane cotate de 10 mL s-au adăugat volumele corespunzătoare de soluție stoc de β-caroten aduse la semn cu apă distilată. Absorbanțele soluțiilor preparate s-au citit la lungimea de undă λ=460 nm, față de o probă martor.

În tabelul 4.1. sunt prezentate datele experimentale obținute pentru trasarea curbei de etalonare.

Tabelul 4.1 Date experimentale pentru trasarea curbei de etalonare utilizată la determinarea cantitativă a totalului carotenoidic

În fig. 4.1 este prezentată curba de etalonare obținută.

Fig. 4.1. Curbă de etalonare pentru determinarea determinarea cantitativă a totalului carotenoidic cuprinsă în domeniul de lucru: 0,25- 1,50 µg/mL, λ = 460 nm.

4.3. Caracterizarea parametrilor de performanță

4.3.1. Domeniul concentrației de lucru

Domeniul concentrației de lucru este intervalul dintre concentrația inferioară și superioară a analitului din proba, stabilit pentru confirmarea că procedura analitică dezvoltată furnizează un grad acceptabil de liniaritate, exactitate și precizie când se aplică probelor care conțin specia de analizat în interiorul sau la extremitățile domeniului specificat. Testul de omogenitate a dispersiilor verifică și confirmă dacă există diferențe semnificative la limitele domeniului de lucru.

Se stabilește un domeniu de lucru preliminar, prin realizarea a 10 măsurări ale absorbantei, astfel s-au realizat câte 10 replici pentru cea mai mică și cea mai mare concentrație.

În tabelul 4.2 sunt prezentate rezultatele obținute pentru demonstrarea testului de omogenitate, prin efectuarea de măsurători pe 10 probe identice, pentru cea mai scăzută și cea mai ridicată concentrație ( x1 și x10), obținându-se astfel câte 10 valori de informare yi,10.

Tabelul 4.2. Date de etalonare pentru stabilirea domeniului de lucru pentru determinarea cantitativă a totalului carotenoidic cuprinsă în domeniul de lucru: 0.25- 1.50 µg/mL, λ = 460 nm.

În continuare s-a realizat testul de omogenitate a dispersiilor, în care sunt utilizate pentru calculul dispersiilor s12 și s102, cele două nivele de concentrație, x1 și x10 în conformitate cu relația 4.1.

si= cu media: ȳi= (4.1)

Se calculează valoarea de încercare PG pentru i=1 și i=10 pornind de la relațiile: 4.1 și 4.2

PG = pentru s102>s12 (4.2)

PG = pentru s12 >s102 (4.3)

În urma aplicării relației 4.2 se observă că valoarea PG = 3.36.

Dispersiile obținute au fost testate cu ajutorul testului F pentru a examina diferențele semnificative la limitele domeniului concentrației de lucru

În tabelul 4.3 sunt prezentate valorile obținute pentru parametrii testului de omogenitate al dispersiilor.

Tabelul 4.3. Parametrii testului de omogenitate al dispersiilor

S-a comparat apoi valoarea PG obținută cu valorile tabelate ale distribuției F (F= 5.35), se poate observa că s102>s12 , PG <F, adică 3.36<5.35, deci se poate spune că abaterea dispersiilor s12 și s102 nu este semnificativă rezultând că domeniul de lucru este ales corect.

4.3.2. Precizia

Precizia exprimă concordanța tuturor rezultatelor obținute, între ele, respectiv gradul de dispersie (de împrăștiere) între rezultatele unei serii de măsurători, care provin din probe multiple luate din același produs, în condiții experimentale precis stabilite. Ea aceasta se exprimă în primul rând ca o abatere standard relativă procentuală (RSD%).

Precizia poate fi luată în considerare la trei nivele: repetabilitate, precizie intermediară și reproductibilitate, însă în lucrarea de față vor fi prezentate repetabilitatea și precizia intermediară.

a) Repetabilitatea reprezintă măsură a variabilității măsurării când se execută de același analist, în aceleași condiții de lucru, pe un interval scurt de timp (între încercări / măsurări și în timpul acestora). Astfel repetabilitatea se obține atunci când încercarea/măsurarea se realizează într-un singur laborator, de către un singur operator, folosind un singur tip de echipament și aceeași metodă pe o perioadă scurtă de timp

Repetabilitatea a fost demonstrată prin prelucrarea a 6 probe identice de soluție etalon de β-caroten, 6 probe identice din aceeași probă de extract de morcov, respectiv de ardei rosu și ardei galben.

Rezultatele experimentale obținute și valorile RSD-ului calculate sunt prezente în tabelele 4.4 – 4.5.

În cazul extractelor de ardei rosu si ardei galben nu s-au obținut rezultate satisfăcătoare. Rezultatele obținute în urma măsurătorilor au arătat diferențe mari, vizibile și fără a se calcula valoarea RSD-ului, deci se poate spune că metoda propusă pentru evaluarea conținutului carotenoidic nu este repetabilă.

Tabelul 4.4. Rezultatele experimentale obținute pe 6 probe identice de soluție etalon de β-caroten in experimentul de demonstrare a repetabilității

Tabelul 4.5. Rezultatele experimentale obținute pe 6 probe identice de morcov în experimentul de demonstrare a repetabilității.

Rezultatele obținute (RSD%) pentru 6 probe identice de soluție etalon și 6 probe de extract de morcov sunt mult mai mici decât cele prevăzute în ecuația lui Horwitz: RSD<pentru domeniul de concentrații stabilit (0,25-1,5 µg/mL). RSD% prevăzut de ecuația lui Horwitz este cuprins între 16- 22,6%. (vezi tabelul 4.6).

Tabelul 4.6. Nivelul acceptat al preciziei în funcție de nivelul de concentrație al analitului (RSD% calculat pe baza ecuației lui Horwitz, dar și valorile propuse de AOAC).

4.3.3. Limita de detecție și limita de cuantificare

Limita de detecție (LOD) reprezintă cea mai mică concentrație de analit dintr-o probă care poate fi detectată cu certitudine statistică rezonabilă, dar nu neapărat cuantificată ca o valoare exactă în condițiile stabilite ale încercării.

Limita de cuantificare (LOQ) este cea mai joasă concentrație sau cantitate de analit care poate fi determinată cantitativ cu un nivel acceptabil al repetabilității și exactității.

Dispersia coeficientului b (abaterea pantei) s-a calculat conform ecuației 3.4, dispersia întregii populații a valorilor y (abaterea standard ptr.intreaga populatie a valorilor y) s-a calculat conform ecuației 3.5 și dispersia coeficientului a (abaterea intersecției cu ordonata) s-a calculat conform ecuației 3.6.

sb2 = (4.4)

s02 = (4.5)

sa2 = (4.6)

LOD s-a calculat conform ecuației 4.7 și s-a obținut valoarea 0.09 µg/mL. Limita de cuantificare (LOQ) s-a calculat conform ecuației 4.8, doar pentru extractul de morcov, deoarece în urma evaluării parametrilor de performanță s-a constatat că metoda propusă poate fi validată corespunzător doar pentru extractul de morcov, obținându-se o valoare a LOQ de 0.3015 µg/mL

LOD = = 0.09 µg/mL (4.7)

LOQ = = 0.3015 µg/mL (4.8)

4.3.4. Robustețea

Evaluarea robusteții metodei dezvoltate în acest studiu trebuie să demonstreze încrederea în analiză, în acest scop se urmărește stabilitatea soluțiilor.

S-a verificat stabilitatea soluției etalon de β-caroten de concentrație 1,00 μg/mL precum și stabilitatea soluției unei probe de extract de morcov cu concentrația 1,48 µg/mL pe parcursul unei zile, la interval de ½ oră, executându-se 12 citiri. În tot acest timp, soluțiile au fost ținute la temperatura camerei în baloane cotate de 10 mL. Rezultatele obținute sunt prezentate grafic în figurile 4.2 și 4.3.

După cum se observă din tabelul 3.7, s-a obținut concentratia medie x‾, egală cu 1,0725 μg/mL, abaterea standard relativă egală cu 0,053 μg/mL și un RSD% egal cu 4,94% pentru demonstrarea robusteții pentru soluția etalon de β-caroten.

CONCLUZII

În prezentul studiu s-a urmărit validarea metodei spectrometrice de determinare cantitativă a totalului carotenoidic, folosind ca substanță de referință β-carotenul soluție 2,5% în benzen.

Metoda spectrometrică de determinare a beta-carotenului îndeplinește condițiile de validare prin: domeniul de lucru, precizie (repetabilitate, precizie intermediară), limita de detecție și limita de cuantificare și robustețe.

Domeniul de concentrație 0,25- 1,50 µg/mL, cu un coeficient de corelație r2=0,997 este bine ales, lucru dovedit prin realizarea testului de verificare a omogenității dispersiilor, deoarece PG<F; adică 3,36<5,35, abaterea între dispersiile s12 și s102 nu este semnificativă;

Metoda este precisă, fapt ce rezultă din demonstrarea repetabilității analizelor. Precizia a fost evaluată prin calcularea abaterii standard relative procentuale. În urma studiului de repetabilitate s-a observat că RSD% calculat pentru extractul din morcov se încadrează în valorile date de ecuația lui Horwitz (16-22,6%).

Rezultatele obținute în urma măsuratorilor efectuate pentu extractele din ardei rosu si ardei galben au arătat că metoda propusă nu este precisă.

Metoda este robustă, acest parametru fiind demonstrat prin urmărirea stabilității soluției etalon de beta-caroten și extract din morcov pe parcursul unei zile. Din datele obținute se observă că cele două soluții sunt stabile pe parcursul unei zile de studiu.

Metoda propusă a fost validată și aplicată cu succes pentru determinarea conținutului de beta-caroten din extractul de morcov.

BIBLIOGRAFIE

S. Lieberman , N. Bruning, Biblia vitaminelor si a mineralelor esentiale p. 93-105

Br. Segal, Biochimia produselor alimentare, Ed. Tehnica, 1971, p. 84-88

I. Ghe.Tănase, Al. Pană, G. L. Radu, M. Buleandră, Validarea metodelor analitice –Principii teoretice și studii de caz, Editura Printech (S.C. Andor Tipo S.R.L.), 2007.

Philipp Kaiser , Peter Surmann , Gerald Vallentin , Herbert Fuhrmann , A small-scale method for quantitation of carotenoids in bacteria and yeasts, 2007.

B. Stephen Inbaraj, J.T. Chien, B.H. Chen, Improved high performance liquid chromatographic method for determination of carotenoids in the microalga Chlorella pyrenoidosa, 2006.

Carla M. Stinco, Ana M. Benítez-González, Dolores Hernanz, Isabel M. Vicario,Antonio J. Meléndez-Martínez, Development and validation of a rapid resolution liquidchromatography method for the screening of dietary plantisoprenoids: Carotenoids, tocopherols and chlorophylls, 2014.

Camelia DRAGHICI, Simona DOBRINAS, Elisabeta CHIRILA, Metode analitice de separare, Ovidius University Press, 2010.

A.I. Olives Barba ,M. Ca´mara Hurtado , M.C. Sa´nchez Mata , V. Ferna´ndez Ruiz ,

M. Lo´pez Sa´enz de Tejada, Application of a UV–vis detection-HPLC method for a

rapid determination of lycopene and b-carotene in vegetables.

J.P. Chen, C.Y. Tai, B.H. Chen, Improved liquid chromatographic method for determination of carotenoids in Taiwanese mango (Mangifera indica L.).

Angelo Cichelli, Gian Pietro Pertesana, High-performance liquid chromatographic analysis of chlorophylls, pheophytins and carotenoids in virgin olive oils: chemometric approach to variety classification.

C.H. Lin, B.H. Chen, Determination of carotenoids in tomato juice by liquid chromatography.

M. Careri, L. Furlattini, A. Mangia, M. Musci , E. Anklam, A. Theobald, C. von Holst, Supercritical fluid extraction for liquid chromatographic determination of carotenoids in Spirulina Pacifica algae: a chemometric approach.

R. Davarnejad, K.M. Kassim, A. Zainal , Suhairi A. Sata, Supercritical fluid extraction of β-carotene from crude palm oil using CO2

Simona DOBRINAS, Analiza instrumentala, cursuri

D.D.D.H Alwis , U.G.Chandrika , P.M.Jayaweera, Spectroscopic studies of neutral and chemically oxidized species of β-carotene,lycopene and norbixininCH2Cl2: Fluorescence from intermediate compounds.

Karsten Putzbach, Manfred Krucker, Marc David Grynbauma, Petra Hentschel, Andrew G. Webb, Klaus Albert, Hyphenation of capillary high-performance liquid chromatography to microcoil magnetic resonance spectroscopy—determination of various carotenoids in a small-sized spinach sample.

S. Aisling Aherne, Trevor Daly, Marvin A. Jiwan, Laurie O’Sullivan, Nora M. O’Brien, Bioavailability of b-carotene isomers from raw and cooked carrots using an in vitro digestion model coupled with a human intestinal Caco-2 cell model

Griet Knockaert, Lien Lemmens, Sandy Van Buggenhout, Marc Hendrickx, Ann Van Loey, Changes in β-Carotene During Processing of Carrots

Jouni Karppi , Jari A. Laukkanen , Timo H. Mäkikallio , Kimmo Ronkainen , Sudhir Kurl, Serum β-carotene and the risk of sudden cardiac death in men:A population-based follow-up study

Aimin Wang M.D. , Jing Han M.D. , Yunxia Jiang M.D. , Dongfeng Zhang M.D. , Association of vitamin A and β-carotene with risk for age-related cataract: A meta-analysis

Kana Higuchi M.S. , Isao Saito M.D., Ph.D. , Koutatsu Maruyama Ph.D. , Eri Eguchi M.P.H., Ph.D. , Hiromi Mori Ph.D. , Sakurako Tanno M.D., Ph.D. , Susumu Sakurai Ph.D. , Taro Kishida Ph.D. , Wataru Nishida M.D., Ph.D. , Haruhiko Osawa M.D., Ph.D. , Takeshi Tanigawa M.D., Ph.D., Associations of serum β-carotene and retinol concentrations with insulin resistance: The Toon Health Study

Sławomir Kasperczyk , Michał Dobrakowski , Janusz Kasperczyk , Alina Ostałowska , Jolanta Zalejska-Fiolka, Ewa Birkner Sławomir Kasperczyk, Michał Dobrakowski, Janusz Kasperczyk, Alina Ostałowska, Jolanta Zalejska-Fiolka, Ewa Birkner, Beta-carotene reduces oxidative stress, improves glutathione metabolism and modifies antioxidant defense systems in lead-exposed workers