Inmultirea In Vitro a Unor Specii Periclitate din Ariile Protejate din Bihor. Speciile Luate In Studii Arealul de Raspandire Si Incadrea Sozologica

CAPITOLUL III. ÎNMULȚIREA IN VITRO A UNOR SPECII PERICLITATE DIN ARIILE PROTEJATE DIN BIHOR. SPECIILE LUATE ÎN STUDII : AREALUL DE RĂSPÂNDIRE ȘI ÎNCADRAREA SOZOLOGICĂ

Capitolul cuprinde rezultatele ceretărilor privind înmulțire in vitro a unor specii din arii și sit-uri protejate din Bihor, încadrate sozologic: Campanula rotundifolia L (specie R și VU din Muntele Șes); Drosera rotundifolia Huds. (specie CR, din Muntele Șes); Dianthus spiculifolius (speciei CR, din sit-urile Valea Galbenei și Piatra Bulzului) și Narcissus poeticus L (VU din Alparea-Bihor). Speciile s-au conservat prin înmulțire in vitro, stabilindu-se cel mai bun explant, mediu, moment al inoculării etc. Rezultatele au stabilit comportamentul speciilor in vitro sub raport a capacității de rgenerare, multiplicare și conservare în aceste condiții. S-a remarcat că conservarea speciilor din flora spontană in vitro asigură manifestarea principiului de totipotențialitate a celulelor vegetale în aceste condiții, caracteristică manifestată funcție de vârsta explantului, natura organului etc., fiecare specie cu capacitatea proprie de regenerare și multiplicare. Manifestarea totipotenței favorizează conservarea speciilor rare, periclitate și vulnerabile, care înmulțite in vitro pot fi salvate și pot asigura popularea ariei de origine.

Dispariția treptată a speciilor din flora țării noastre, a determinat specialiștii să manifeste interes pentru conservarea elementelor rare și a celor pe cale de dispariție. Formele de conservare (de orice natură), încep să fie privite și analizate cu interes. Inventarierea și încadrarea speciilor în categoriile de periclitare, în funcție de rata pierderilor este asigurată prin întocmirea unor liste și cărți roșii. Pentru flora României sunt cunoscute astfel de lucrări, dar amintim cea mai recentă și completă Carte roșie a plantelor vasculare elaborată sub egida Academiei Române de Dihoru., Gh., Negrean., G. (2009), aceste lucrări stau la baza proiectelor de conservare ex situ și inițierea unor cercetări asupra taxonilor periclitați și vulnerabili urmărind obiectivele impuse de organismele europene și internaționale privind gestionarea mediului. CBD (Haga, 2002), din cadrul Convenției pentru Biodiversitate care susține cercetări în biologia conservării plantelor și importanța tuturor formelor de conservare a plantelor, inclusiv ex situ, care urmărește realizarea unor „rezerve” pentru a asigura și prin acest mod protecția plantelor periclitate (Cristea și Denaeyer, 2004). După raportul IUCN (2006) s-a stabilit că schimbările climatice au efect distructiv asupra speciilor de plante, ritmul dispariției lor este de 100 până la 1000 de ori mai mare decât ritmul natural (mai bine de 50% din specii au dispărut în ultimii 20 de ani), între anii 1996 și 2004 s-au introdus în listele roșii peste 8300 de specii vegetale cu diferite grade de vulnerabilitate (Sarasan et al., 2006).

Amintim acțiuni de ocrotire și protecție a naturii manifestate prin prezentarea unor cercetări minuțioase de teren asupra stării naturii (Cristea et al., 1996), prin constituirea de noi arii protejate speciale (Sârbu et al., 2007), prin evidențierea importanței rezervațiilor biogene pentru ocrotirea genofondului (Toniuc et al., 1994), care au la bază o mulțime de liste roșii ale plantelor din flora țării elaborate încă de la sfârșitul secolului trecut și până în zilele noastre, ținându-se cont de încadrarea sozologică a speciei (după categoriile IUCN), stabilindu-se statutul speciei, starea de periclitare la nivel global și al țării (Dihoru, 1994; Toniuc at al., 1992; Olteanu et al., 1994; Boșcaiu et al., 1994; Sîrbu și Chifu, 2003; Dihoru și Dihoru, 1994; Dihorul și Negreanu, 2009). Ideea conservării resurselor genetice prin orice formă nu poate fi decât benefică și este susținută de numeroși cercetători (Bajaj, 1986; Halmágyi și Butiuc-Keul, 2007; Cristea, 2010), natura acestor forme de conservare fiind privită și analizată cu mare interes (Fay, 1992; Bavaru et al., 2007; Laslo et al., 2011a).

În județul Bihor sunt cca 63 de arii protejate, botanice, speologice, faunistice, din zonele umede, geologice, peisagiste, rezervații de resurse genetice și mixte, număr stabilit până la data de 1 mai 2007 (Bavaru et al., 2007). Problema ariilor protejate din România și implicit a celor din județul Bihor este legată de modul cum sunt monitorizate, protejate și gestionate și nu de suprafața și de numărul lor, deci nu de valoarea cantitativă ci de valoarea calitativă a acțiunilor inițiate în aceste arii. Deși nu toate aceste arii de pe teritoriul țării au protecție efectivă, unele sunt în custodia primăriilor sau a Ocoalelor Silvice de unde este asigurată protecția, paza și gestionarea lor. Însă de cele mai multe ori protecția acestora lasă de dorit, fie din lipsă de fonduri, fie din lipsă de interes.

Speciile luate în studiu, arealul de răspândire și încadrarea sozologică. Speciile cercetate sunt: Campanula rotundifolia L. ssp. polimorpha, din Muntele Șes (sit SCI), specie R = rară și VU = vulnerabilă; Drosera rotundifolia Huds., din Muntele Șes (sit SCI), specie critic periclitată = CR; Dianthus spiculifolius, din Parcul Natural Muntii Apuseni specie critic periclitată = CR; Narcissus poeticus L din pădurea cu narcise (sat Alparea, com. Oșorhei), specie VU = vulnerabilă. Speciile fac parte din categoria elementelor floristice (rarități floristice) din unele rezervații de aceiași valoare din județul Bihor. Toate cele patru specii cercetate sunt cultivate in vitro în scopul multiplicării lor, stabilindu-se protocolul și tehnologia de înmulțire în relație cu epoca de inițiere a experimentului, natura și proveniența materialului vegetal și compoziția mediilor aseptice de cultură. Capitolele următoare redau cercetările legate de consevarea acestor specii.

3.1. Campanula rotundifolia L. ssp. polimorpha, rară (R) și vulnerabilă (VU)

În acest studiu s-a urmărit conservarea speciei Campanula rotundifolia L. care provine din sit-ul de importanță comunitară Muntele Șes, prin înmulțire in vitro, geoelement dacic întâlnit în Carpații Occidentali și împrejurimi (Harta 3 ANEXA I.), specie periclitată cu extincția (EN). Prin măsurile de conservare mai vechi specia a fost plasată în Parcul Național Munții Apuseni, în Carpați, în canalele din portul Hârșova, în recifele jurasice Cheia etc., dar și ex situ, în colecțiile Grădinilor Botanice, spațiu în care trebuie asigurat un control periodic al stării populației. Specia conservată de noi a provenit din Grădina Botanică a Universității din Cluj-Napoca (semințe și plante tinere). Campanula rotundifolia (syn. carpatica) ssp. polimorpha este prezentată pentru prima dată de Borza, 1923 și apoi descrisă de Morariu 1964, se întâlnește la limita a doua județe din Transilvania: Cluj si Bihor. Taxonomic este perenă (cu rizomi), genul Campanulaceae are câteva subspeci (subtaxoni): rotundifolia, carpatica, romanica (Flora RSR, 1952, Beldie, 1961, Rațiu și Ghergely, 1961, citați de Dihorul și Negreanu, 2009). Considerat geoelement cu populații sărace, dar în timp extins și în alte areale din țara noastră și din țările vecine se înmulțește din semințe dar și vegetativ prin despărțirea tufei mature după înflorire (spre toamnă), sau înainte de înflorire (primăvara timpuriu). Morfologic specia este un paleoendemit, element dacic (Toniuc, 1992, 1994), iar subspecia rotundifolia (Foto 3.1.a și b) studiată de noi pe lângă interes botanic are și valoare ornamentală, iar materialul peren se găsește și în colecțiile grădinilor botanice din unele țări europene .

Foto 3.1. Plante mamă de Campanula rotundifolia L, în diferite faze de vegetație și zone de protecție

a. b.

a= exemplar din Grădina Botanică; b= din rezervația bihoreană

Sursa: proprie

3.1.1. Tehnologia de înmulțire in vitro a speciei Campanula rotundifolia L

Conservare prin metode clasice a speciilor din flora spontană a întâmpinat unele greutăți datorate unor cauze, cum ar fi: catastrofe naturale, distrugerea colecțiilor de plante în urma atacului de boli etc. Astfel s-au căutat și alte metode de conservare (neconvenționale) cum ar fi cultura in vitro (în condiții controlate) pentru înmulțirea, stocarea și conservarea unor specii periclitate cu extincția (Witheres, 1990). Începuturile biotehnologiilor vegetale au avut implicație în multiplicare clonală rapidă a speciilor de importanță economică (Cachiță și Ardeleanu, 2009), mult mai târziu tehnica este privită ca mijloc de conservare a resurselor vegetale (Bajaj, 1986; Fay, 1992; Zăpârțan, 1995-1996; Cristea, 2010; Laslo et al., 2011b). Se știe că înmulțirea in vitro poate avea efecte traumatizante asupra celulelor și țesuturilor (Jain, 2001), cauzate de unii factori cum ar fi: metoda de cultură, natura balanței hormonală, tipul de explant, subculturile, natura speciei și starea ei fiziologică etc., pot să se implice în variabilitatea somaclonală (Larkin and Scowcroft , 1981).

Pot exista situații când aceiași factori nu sunt bariere în conservarea și înmulțirea materialului vegetal detașat de la speciile periclitate și nici piedică în stocarea materialului vegetal obținut in vitro (Cachiță et al., 2004), tehnica inițiază cultura in vitro și apoi găsește formula ideală (de mediu, de condiții de cultură etc.) pentru multiplicarea speciei in vitro (Butiuc-Keul și Zăpârțan , 1996; Zăpârțan, 2001), stabilind etapele unui protocol de lucru în conservare prin acest mod a speciilor din flora spontană. După analiza genomică a plantelor obținute in vitro și după aclimatizarea ex vitro se poate repopula habitatele periclitate, după o consultare prealabilă cu specialiștii din rezervațiile naturale și din ariile protejate (Primack, 2002; Bavaru et al., 2007).

În aplicarea metodei de înmulțire in vitro a unor plante vasculare, s-a ținut cont de avantajele metodei pentru conservarea lor. Inițierea culturii la unele specii din flora spontană a fost posibilă folosind aproape toate țesuturile sau părțile din plantă sau noi tipuri de explante. La alte specii, inițierea culturii in vitro a fost posibilă doar din germoplasmă, din semințe germinate in vitro, din care se dezvoltă plantule de la care se detașează diferite explante (apex, meristem, nod, frunză, rădăcină etc.), de cele mai multe ori germinația in vitro necesită unele operații preliminare: tratarea semințelor (mecanic, chimic, fizic) pentru a favoriza germinația, tratament aplicat în funcție de natura seminței și vârstă. Fiecare tip de explant cultivat in vitro diferențiază prin propria capacitate de regenerare și multiplicare, afirmație susținută de rezultatele obținute la specii de plante spontane, de cercetători străini și de la noi (Cachiță, 1987; Zăpârțan et al., 1993; Fay, 1992; Zăpârțan, 2001; Laslo, 2013).

Asupra formulei de mediu adoptate și modificate funcție de familia botanică și chiar funcție de diferite specii de plante, pentru creșterea țesuturilor in vitro au existat foarte multe preocupări și serioase contribuții la obținerea celei mai bune formule de mediu pentru reușita metodei. Amintim în tabelul 3.1., câteva astfel de formule de mare uzanță în timp, rețetele de mediu sunt utilizate la experimente de micromultiplicare, dar și la alte scopuri de utilizare a biotehnologiilor, la alte specii.

Tabelul 3.1. : Formule de mediu pentru impunerea „creșterii lente” a țesuturilor in vitro

Sursa : proprie

Mediul de cultură se alege funcție de natură speciei, de starea fiziologică a materialului vegetal, având o utilitate mai largă sau specifică, dar alese funcție de scopul urmărit. Medii mai frecvent utilizate sunt legate de anii 1942, 1956, 1971, în zilele noastre apărând formule cu compoziție îmbunătățită și cu specificitate pentru fiecare grup, gen sau familie de plante.

La mediile de bază după Murashige-Skoog-1962, Schenk-Hildebrandt-1972, Heller, White etc., se adaugă diferite balanțe hormonale funcție de specie și reacția ei in vitro. Pentru germinarea semințelor in vitro s-a folosit mediul MS1/2 (cu microelementele și macroelementele înjumătățite), cu sau fără cărbune vegetal (care favorizează alungirea neoplantulelor germinate in vitro). Sunt de asemenea specii care se comportă foarte bine in vitro pe medii simple MS1/2 cu regenerarea și multiplicarea lor. Prezența unor fitohormoni în mediul de cultură a dus la organogeneză, caulogeneză, multiplicare și chiar inițierea organelor de înmulțire in vitro (Butiuc-Keul, et al., 1996; Agud et al., 2013), evoluția depinzând de natura și concentrația fitohormonilor, precum și de epoca de prelevare.

3.1.2. Metodă, material și medii folosite în cultura in vitro a specie Campanula rotundifolia

Materialul vegetal poate fi alcătuit din organe de plantă sau părți din organe: frunze, porțiuni din frunză (teacă, limb, nervură, pețiol), tulpină, din care s-a detașat nod sau internod, rădăcină, inflorescență, organe de floare etc., luându-se în calcul încadrarea botanică a speciei. Sunt specii care se comportă foarte bine in vitro pe medii simple, cum este cazul speciei cercetate de noi (Campanula rotundifolia L): mediu MS1/2 (Mt.) cu concentrația microelementelelor și macroelementelelor înjumătățite sau pe MS cu concentrațiile întregi (V1) și pe care a avut loc regenerarea și multiplicarea satisfăcătoare sau chiar bună, funcție de natura țesutului și epoca de inoculare. La Campanula materialul vegetal a constat din boboc juvenil, detașat de la plantă matură, recoltat de la exemplare din liber (Foto 8.). Explantul, bobocul floral tânăr a avut dimensiunea de cca 0,5 cmØ, care după sterilizare prealabilă s-a inoculat întreg sau secționat longitudinal în 2 sau 4 secțiuni și s-a cultivat pe mediile specificate în tabelul 3.2.

Mediul de bază (MB) a fost format din macroelemente, microelemente și FeEDTA după SH (Shenk-Hildebrandt, 1972) și vitamine după MS (Murashige-Skoog, 1962). La acest mediu de bază s-au conceput variantele din tabelul 12, la care pe lângă mediu de bază s-a folosit o auxină (AIB = acid β indolil butiric, în două concentrație 0,5 și 1,0mg/l) și două citochinine (2iP = 2izopentiladenina; BA = benzilaminopurina, fiecare în trei concentrații: 0,5, 1,5 și respectiv 2,0 mg/l). Pentru un experiment corect și rezultate concludente s-au folosit două variante considerate oarecum de control: Mt = martorul, în comopoziția căruia a intrat doar macroelemente și microelemente după SH1/2 (dar înjumătățite) și FeEDTA + vitamine după MS și fără hormoni; V1 = considerat tot un mediu de control, format doar din mediul de bază (SH + vitamine MS) dar în concentrație întreagă a macroelementelor și microelementelor din mediu SH, mediu care de-a lungul experimentelor noastre, la alte specii de plante s-a dovedit satisfăcătoare; V2 = SH + vitamine MS + 0,5 mg/l AIB + 1,5mg/l 2iP, cu valori apropiate de V3; V3 = SH+vit. MS+ 1,05mg/lAIB + 2,0mg/lBA; V4 = SH + vitMS +0,5mg/l AIB + 0,5mg/l BA; V5 = SH + vit. MS +0,5mg/l AIB + 1,5mg/l BA ; V6 = SH + vit. MS + 1,0mg/l AIB + 2,0mg/l BA (după perioada de incubație s-a constat că explantul de boboc de clopoței pe variantele cu BA are evoluție superioară).

Tabel 3.2 Compoziția mediilor de cultură pentru înmulțirea in vitro a speciei Campanula rotundifolia L

Sursa : proprie

În multe experimente s-au folosit medii de cultură simple, în ideea de-a face cultura economicoasă, prin înlăturarea definitivă a regulatorilor de creștere din mediu, ori reducerea concentrației lor. S-a mai recurs la reducerea dozei de zaharoză și agar, ori la înlocuirea unor hormoni sintetici (scumpi), cu substanțe sintetizate la noi în țară, sau cu extracte naturale din plante sau organe de plante cu proprietăți stimulatoare (extract din germeni de porumb) care substituie prezența zeatinei (Butiuc-Keul și Zăpârțan, 1996); sau extract din laptele de cocos care favorizează alături de alți hormoni regenerarea plantulelor in vitro și embriogeneza somatică (Cachiță et al., 2004; 2009). Adausul de hormoni face ca succesul experimentului să fie asigurat (funcție de concentrație) dar tehnica de cultură in vitro să fie mai costisitoare economic, în această idee am folosit în experimentul de multiplicare in vitro a speciei din flora spontană Campanula rotundifolia L, concentrații mici care uneori s-au dovedit eficiente.

3.1.3. Rezultate și concluzii privind cultura in vitro a speciei Campanula rotundifolia

Tehnologia propagării și înmulțirii in vitro a speciilor spontane urmărește nu doar stabilirea unei tehnici de înmulțire ci și aspecte legate de procesele de creștere și dezvoltare in vitro a noilor plantule, deci organizarea completă a lor. Acest lucru se realizează prin urmărirea fazelor de organogeneză in vitro: caulogeneza, rizogeneza și filogeneza, corelația dintre aceste faze și evoluția plantulelor in vitro.

Tabelul 3.3. Capacitatea regenerativă in vitro a bobocului de Campanula rotundifolia L (după 50 zile)

Sursa : proprie

Observațiile privind reacția in vitro a explantului constând din boboc de Campanula rotundifolia L, s-au făcut după 50 de zile de incubare in vitro, iar media rezultatelor obținute este redată în tabelul 3.3., din care desprindem valoarea neo-plantulelor: media numărul de plant/explant și media lungimii plantulelor (cm); diferențierea sistemul radicular prin media numărului de rădăcini/ explant și media lungimii rădăcinilor (în cm); procentul de plantule regenerate, multiplicate și înrădăcinate in vitro.

Evoluția oricărui tip de explant sau specie, sub raportul organogenezei, a ratei de înmulțire in vitro și a procentului de aclimatizare a noilor plantule ex vitro, depinde de natura speciei, de compoziția mediului de cultură, tipul de explant, faza fiziologică a țesutului (vârsta plantei-mamă donatoare), perioada din an când are loc prelevarea țesutului etc. (Cachiță, 1987), fapt evidențiat în experimentele la Campanula rotundifolia. Procentul și capacitatea de regenerare a bobocului juvenil de campanula este situat între 12% și 88% funcție de compoziția variantelor de mediu, de lipsa, prezența și concentrația fitohormonilor.

Urmărind graficul 3.1. remarcăm capacitatea regenerativă care este de abia 12% pe Mt, probabil datorită înjumătățirii macro și microelementelor din mediu, și 45 % (un procent mai mare de trei ori) pe V1, cu macroelementele și microelementele în doze normale, ambele variante fără fitohormoni. Asocierea MB după SH cu vitamine MS duce la un procent bun de regenerare (cca. 45%), doza întregă de macro, microelemente și FeEDTA: pe celelalte variante cu fitohormoni, este între 60% și 88% (tabelul 3.3.): în prezența auxinei (AIB) și a benzilaminopurinei (BA) regenerarea este de peste 80%, pe concentrația mare atinge 90%; pe variantele cu 2 – izopentiladenină (2iP) regenerarea este mai mică dar ajunge și pe aceste variante la 70% pe V3 (SH+ vitamine MS+2 mg/l 2iP+ 1,0mg/lAIB).

Graficul 3.1. : Capacitatea regenerativă (%) a bobocului de Campanula rotundifolia L (după 50 zile)

Sursa : proprie

Capacitatea de multiplicare și regenerarea au în cazul bobocului de Campanula cultivat in vitro o evoluție asemănătoare (funcție de formula de mediu), cu diferențe valorice nesemnificative. Graficul 3.2. redă media procentuală a capacității regenerative, comparativ cu capacitatea de multiplicare a bobocului juvenil de Campanula rotundifolia L., după 50 de zile de cultură in vitro. Multiplicare cea mai bună are lor la concentrația mare de citochinine: de 83% în prezența a 2,0mg/l BA (pe V6), 72% pe mediul cu concentrație medie de 1,5mg/lBA (V5) și 70% pe mediul cu 2mg/l 2iP (V3). La doze mici de citochinine, multiplicarea este de 47 – 57%: iar pe variantele fără adaos fitohormonal de abia 15%. (graficul 3.2.). Considerăm că prezenta citochininelor în doză de 2mg/l este benefică pentru regenerare și multiplicarea boboc floral de Campanula cultivat in vitro obținându-se cel mai mare procent de plantule bine conformate și viguroase.

Graficul 3.2. : Capacitatea regenerativă comparactiv cu cea de multiplicare la Campanula rotundifolia( după 50zile)

Sursa : proprie

Media numărului de plante formate dintr-un explant de boboc atinge valorile cele mai mari pe variantele cu benzilaminopurină (BA): pe V6 = SH+vit.MS + 1,0mg/lAIB + 2,0mg/lBA cca. 31 de plantule/explant și pe V5 = SH+vit.MS +0,5mg/lAIB + 1,5mg/lBA, cca. 18 neoplantule/explant: pe variantele cu 2iP pe V3 (2,0mg/l2iP+ +1,0mg/lAIB+2mg) se formează numărul cel mai mare cca. 15 neo-plantule/explant (tabelul 3.3); pe variantele fără fitohormoni numărul este doar de 1-2 neo-plantule/explant (Mt, V1). Înrădăcinarea neoplantulelor de Campanula este condiționată de prezenta auxinei acidul β indolil butiric (AIB) în ambele concentrații. Pe variantele cu concentrație maximă de AIB (V3 și V6), procentul de înrădăcinare ajunge la 70% respectiv 92% (graficul 3.3.), asocierea dintre doza mare de citochinine (BA și 2iP/2mg/l) și doza mare de auxină(AIB-1mg/l) se dovedește benefică. Pe celelalte variante procentul de înrădăcinare este de 20-48%; pe proba martor (Mt.) neo-plantulele nu înrădăcinează de loc, iar pe V1 procentul de înrădăcinare ajunge la abia 8%.

Graficul 3.3. : Procent de înrădăcinare a neo-plantulelor de Campanula diferențiate in vitro(%, după 50 zile)

Sursa : proprie

Media numărului de rădăcini/explant cea mai mare, s-a obținut pe variantele cu auxină și citochinine: 2mg/l BA și 1mg/l AIB (V6 și V3). Graficul 3.4. redă media numărului de rădăcini de pe cele șapte variante din care se remarcă următoarele: pe V3 (MB+1,0mg/lAIB+2,0mg/l2iP) cu cca. 6 rădăcini/plantule, iar V6 (MB+1,0mg/lAIB+2,0mg/lBA) media numărului de rădăcini/explant crește de trei ori (cca. 17 rădăcini/plantulă): pe V5 (MB+0,5mg/lAIB+1,5mg/lBA) la 8 rădăcini/plantulă, pe celelalte variante media numărului de rădăcini este mult mai mici. Remarcăm efectul favorabil al combinației dintre dozele mari de BA și AIB asupra mediei numărului de rădăcini/plantulă. Pentru înrădăcinarea neo-plantulelor in vitro este necesară o auxine în concentrație modică (0,5 -1,0 mg/l), care va duce la obținerea unui număr mare de rădăcini viguroase, dispuse în mănunchi cu rol de-a mări capacitatea de aclimatizare ex vitro a neo-plantulelor.

Graficul 3.4. : Media numărului de rădăcini la Campanula după 50 zile de cultură in vitro

Sursa : proprie

Concluzionăm următoarele:

1. Conservarea in vitro a speciilor din flora spontană asigură obținerea unui număr mare de plante, în timp scurt, identice fenotipic și genotipic cu planta mamă: în inițierea culturii in vitro se pleacă de o singură plantă, sămânță, frunză, celulă, un apex, meristem, etc. (un explant), fără a compromite plantele din natură și așa puține, avantaj pentru protejarea plantelor în arealele lor;

2. Înmulțirea speciei Campanula rotundifolia L., ssp. polimorpha in vitro depinde de natura speciei, de compoziția mediului (natura și concentrația firohormonilor), vârsta plantei mamă, tipul de explant, faza fiziologică a țesutului și perioada când este prelevat explantul. Plantule complet organizate cu sistem radicular bun s-au obținut după cca. 50 de zile de cultură in vitro pe V3, V5 și V6, medii cu citochinine (BA, 2iP – 1,5 – 2 mg/l) și o auxină (AIB – 0,5 -1,0mg/l);

3. Bobocul de Campanula rotundifolia L a dovedit capacitatea regenerativă in vitro de 90% și de multiplicare de 80% pe medii cu doze mari de fitohormoni: după etapele premergătoare (protecție sub un clopot de sticlă, reglarea temperaturii, umidității și luminii funcție de speciei), plantele s-au aclimatizat în procent de 80% asigurând un material valoros cantitativ și calitativ;

4. Recomandăm conservarea plantelor de Campanula rotundifolia L, prin înmulțite in vitro, urmată de reconstrucția și popularea zonelor de unde specia a dispărut sau este periclitată, sau conservarea speciei prin menținerea ei într-un spațiu științific și peisagist (exp. Grădina Botanică).

Foto 3.2., 3.3., 3.4., 3.5., 3.6., 3.7. : Boboc de Campanula regenerat și multiplicat in vitro după 50 de zile

Foto. 3.2. Foto. 3.3.

Foto. 3.4. Foto. 3.5.

Foto.3.6. Foto.3.7.

Sursa : proprie

3.2. Înmulțirea in vitro a speciei DROSERA rotundifolia Huds. critic periclitată(CR)

Studiul are drept scop înmulțirea și conservarea in vitro a speciei Drosera rotundifolia Huds., din județul Bihor, aria protejată Muntele Șes (SCI= sit de importanță comunitară) din cadrul R.N.M.A. Genul Drosera cuprinde elemente circumboreale, geoelemente europene în habitat cenologic cu turbă, la noi este relict glaciar întâlnit numai în zone din Transilvania (unde devenit rară în urma amenajării unor pășuni). Arealul taxonilor de drosera se restrânge la limita de sud-est a Europei, iar în România în populații concentrate în Munții Gilău și împrejurimi, ca elemente izolate și în Rezervației Naturală Munții Apuseni (Boșcaiu et al., 1994). Speciile periclitate cu extincția din Transilvania au fost conservate ex situ: din Masivul Piatra Craiului (Blându și Holobiuc, 2007) și din Munții Gilău (Cristea et al., 2004), dar chiar și unii taxoni de drosera (alții decât rotundifolia, experimentată de noi) din Muntele Șes (jud. Bihor), inclusă în RNMA (Laslo, 2013). Se urmărește în final reconstrucția zonei de origine a Drosera rotundifolia, prin replantarea de plante viguroase, bine înrădăcinate în urma aclimatizării.

Amintim câteva cauze ale dispariției speciilor de plante, cum ar fi: diminuarea habitatelor, reducerea rezervelor naturale, degradarea mediului, scăderea potențialului biologic al populațiilor de plante etc.. Dispariția speciilor de plante pe glob, în ultimul timp s-a intensificat între 100 până la 1000 de ori (una din opt specii este amenințată cu extincția), datorită în principal activității antropice (Flora României, 1952-1974; IUCN, 2006). Statistica ultimilor cinci decenii a stabilit că au dispărut cca. 300.000 de plante (cca. 20-40% din flora de pe Glob este în declin). Nici în Europa situația speciile de plante amenințate nu este într-o stare bună, dar acestea sunt incluse în programe de restaurare și conservare in situ și ex situ, iar majoritatea taxonilor se află într-un program de minimă protecție (De Langhe, 1984).

În habitatele României numărul de specii vulnerabile și rare este mare datorită arealului continuu sau a limitei de areal (Cristea et al., 1996). Conservarea in situ presupune, planuri de monitorizare-protecție a habitatelor unde se găsesc speciile de plante periclitate (Cristea și Denaeyer, 2004), planuri de recuperare și chiar a unei singure specii prin activități de conservare ex situ (Bajaj, 1986). Acțiunile de conservare a florei autohtone sunt semnalate prin apariția unor publicații de interes național (Bavaru et al., 2007) și internațional privind conservarea biodiversității (Primack, 2002). În țara noastră informațiile asupra stării sozologice a speciilor îl asigură listele și cărțile roșii (Boșcaiu et al., 1994; Olteanu et al., 1994; Dihoru și Dihoru, 1994, etc.), care cuprind speciile periclitate din întreaga țară, elemente endemice pentru țară sau unele semnalate ca unicate (Opriș, 1990). La începuturile ei tehnica de micromultiplicare in vitro era folosită pentru clonarea unor specii economice și în obținerea unui material vegetal liber de boli și dăunători (Cachiță și Ardelean, 2009). Conservarea speciilor vulnerabile prin metode in vitro prezintă interes și a capătat amploare în ultimul timp (Engelman, 1997), experimentată inițial la speciile horticole și de curând speciile de plante din flora spontană (Fay, 1992). Avantajele sunt numeroase: pentru inițierea culturii este necesară o singură plantă, o sămânță, un singur explant (apex, meristem, boboc, porțiune din frunză, tulpină etc.), astfel exemplarele de plante nu vor fi afectate prin recoltare masivă (Agud, 2014). Conservarea in vitro la speciile rare, periclitate și endemice din țară a fost aplicate la un număr mare de taxoni care se înmulțesc clasic cu dificultate, la culturile fotoautotrofe in vitro, recoltate de la specii periclitate (Cristea, 2010) și chiar la unele endemite amenințate cu extincția (Zăpârțan, 2001).

Drosera rotundifolia Huds., este întâlnită numai în Transilvania (Harta 4 ANEXA I), în Munții Gilău, Muntele Mare, Izvoarele Șoimului în mlaștini din RNMA. Preocupările noastre legate de conservarea speciilor vulnerabile din ariile protejate ale județului Bihor au în vedere mai multe specii, considerate endemite pe teritoriul țării întâlnite doar în R.N.M.A, amintim specia Campanula carpatica (syn. Campanula rotundifolia), periclitată din Munții Apuseni (Agud, 2014). Rezultatele cercetărilor noastre au fost prezentate la conferințe și simpozioane, unde s-au ridicat aspecte legate de ariile protejate ale județului Bihor și modul cum am reușit conservarea ex situ unele elemente botanice periclitate cu extincția (Agud, 2015).

Metoda și materialul experimental la cultura in vitro a speciei Drosera rotundifolia Hunds.

Genul drosera prezintă interes științific ca raritate biologică și didactică, specii insectivore, la noi sunt conservate in situ în RNMA, din Carpații Occidentali și aclimatizate în grădini botanice cu un controlat periodic, gemoplasma și alte tipuri de țesuturi sunt stocată în bănci de gene (ca majoritatea speciilor periclitate). Cercetările noastre au urmărit conservarea și a altor taxoni de Drosera (anglica, intermedia,), folosind ca material vegetal semințe, sau porțiuni din plante, provenite de la Grădini Botanice din Cluj, de pe teren din M-ții Gilău (RNMA) . Drosera rotundifolia, s-a înmulțit in vitro din inflorescență tânără, boboc floral juvenil de 0,3-0,4mm Ø, recoltat de la plante mature din rezervație și cultivat pe mediu de bază MS (Murashige and Skoog, 1972) în variantele din tabelul 3.4. , cu doze moderate, chiar mici de fitohormoni și adausuri suplimentare pentru a realiza o tehnică economicoasă (fitohormonii sunt costisitori). Vo=MS1/2 cu macro. și micro.

Tabelul 3.4. : Mediu pentru înmulțirea in vitro a speciei Drosera rotundifolia Huds.)

Sursa : proprie

(MB=MS = Muraschige- Skoog; ANA = acid α naftil acetic; BA = benzil adenină; Z = zeatină

Elemente la jumătate: V1=MS (doză completă) +3g/lCV+825mg/lVH4NO3 (CV = cărbune vegetal), formulă eficienta la micropropagarea altor specii din flora spontană (Zăpârțan, 1994): V2= MS+0,5mg/lANA+1mg/lBA; și V3= MS+0,5mg/lANA+ 1mg/lZ, (cu aceiași auxină în aceiași doză și două citochinine): V4 = MS+0,5mg/lANA+5mg/lEP (extract germeni de porumb).

S-a urmărit micromultiplicarea in vitro a speciei via explant – boboc floral. După inocularea explantelor din boboc, flacoanele s-au păstrat în condițiile camerei de creștere, la o temperatură de 26oC și umiditateă de cca. 85%: durata iluminării a fost de 16ore lumină/ 24 de ore, iar intensitatea a variat funcție de natura explantului. În cazul explantului format din boboc floral juvenil se administrează întuneric în primele 4-5zile de la incubare pentru a favoriza inducția florală (la drosera este favorabil acest regim) și a induce organogeneza. Sunt specii care au nevoie în perioada de incubare de alt regim de lumină, temperatură și umiditate, caz în care se folosesc dulapuri climatizate capabile să asigure condițiile de temperatură și de fotoperioadă cerute.

3.2.3.Rezultate privind evoluția bobocului de Drosera rotundifolia in vitro

Evoluția speciei Drosera rotundifolia in vitro după 60 de zile de la cultura in vitro este prezentată în tabelul 3.5., care redă valorile procentuale și medii ale: capacității regenerative a explantelor (%), media numărului de plante/explant, % de înrădăcinare a neo-plantulelor, % de multiplicare și % de aclimatizare ex vitro a neo-plantulelor. Alte specii de drosera, pe variantele cu doze mari de citochinice (2 până la 5mg/l) au diferențiat calus embriogen care subcultivat a generat plantule, via-calus pentru obținerea de neo-plantule (metodă mai îndelungată): la unele variante însă calusul diferențiat la începutul culturii a stagnat un timp, apoi s-a precultivat pe medii proaspete și a diferențiat plantule (Laslo et al., 2013). În conservarea speciei Drosera rotundifolia in vitro am recurs la medii de cultură simple cu doze moderate de fitohormoni care au favorizat obiectivul urmărit de noi micromultiplicare (obținerea unui număr de plante), in vitro via – explant.

Tabelul 3.5. : Valorile parametrilor analizați după 60 de zile de cultură in vitro

Sursa : proprie

Din tabelul 3.5. remarcăm evoluția explantului de Drosera rotundifolia și diferențele valorice ale parametrilor funcție de compoziția mediului. Capacitatea de regenerare și multiplicare in vitro: atinge valorile maxime pe variantele cu fitohormoni dar și în prezența extractului de porumb: procentul de regenerare este situat între 35 -30% iar de multiplicare între 60-49%, valorile cele mai mari sunt atinse pe mediul cu zeatină (Z) pe V3, evoluția este redată semnificatv și în graficul 3.5.

Graficul. 3.5. :Capacitatea de regenerare și multiplicare a Bobocului (%) de Drosera rotundifolia Huds, cultivat in vitro

Sursa : proprie

Capacitatea de înrădăcinare și de aclimatizare este prezentată comparativ și desprindem concluzia că o neoplantulă cu un sistem radicular bine diferențiat are și capacitate superioară de aclimatizare (graficul 3.6.). Valoarea cea mai bună și în acest caz este pe mediu cu zeatină (V3): procentul de înrădăcinare de 35% iar de aclimatizare dublu (60%). Pe V2 cu BA valorile sunt bune de 30-45%, iar în prezența extractului din germeni de porumb (V4) sunt remarcabile de 30-40%. Procente de 20 – 30% se obține și pe martor (Vo și V1). Procentul și numărul de înrădăcinare mai mic/neo-plantulă influențează nefavorabil capacitatea de adaptare la trecere ex vitro.

Graficul. 3.6. :Capacitatea de înrădăcinare și aclimatizare a Bobocului de Drosera rotundifolia Huds cultivat in vitro

Sursa : proprie

Media numărului de neo-plantule/explant ajunge la 22 – 35 plantule/explant pe variantele cu citochinine (V2. V3) și de cca. 22 plantule/explant pe mediu cu EP (V4), procent bun, datorat efectului de citochinină naturală a extractului din germeni de porumb. Diferențiază 2 plantule/explant la Vo și de cca. 8 plantule/explant pe varianta cu adausuri suplimentare (V1). Graficul 3.7 redă media numărului de plantule de Drosera neoformate pe variantele experimentate.

Graficul 3.7. : Media numărului de neo-plantule de Drosera rotundifolia Huds, cultivat in vitro( după 60 de zile)

Sursa : proprie

3.2.4. Concluzii și recomandări

S-a urmărit conservarea speciei Drosera rotundifolia Huds., prin înmulțire in vitro, critic periclitată (CR), întâlnită doar în Transilvania, raritate și importanță științifico-didactic și decorativ. În micromultiplicarea in vitro a speciei Drosera rotundifolia Huds. via explant s-a urmărește obținerea plantulelor pe medii fără sau cu doze mici de fitohormoni, în prezența EP (extract de porumb), la un preț de cost convenabil.

Concluzii:

Evoluția bobocului de drosera este favorizată de prezența citochininelor în mediu în doză moderată: 1mg/l(BA și Z), combinată cu o auxină în doză mică 0,5mg/l (ANA): după 60 de zile de la inoculatea bobocul in vitro are loc: regenerarea după cum urmează: pe Vo, 25%: pe V1, 45%: iar pe V2 și V3 între 85% și 100% , iar pe V4(EP) este de 80% (graficul 3.5.).

Media numărului de neo-plantule ajunge la 22 – 35plantule/explant (pe variantele cu EP și citochinine, V2,3,4), pe Vo,1, în lipsa hormonilor, 2-8plantule/ explant (Fig. 13): un sistem radicular bine format se obține pe variantele cu citochinine (V2, V3) o masă de cca. 40-50 rădăcini/neo-plantulă, cu un procent de înrădăcinare de 30-35%, neoplantele bine înrădăcinate se aclimatizează în procent de 45- 60%. (graficul 3.6.)

Recomandăm pentru multiplicarea in vitro la Drosera rotundifolia prezența citochininelor în mediu, în doză moderată 1 mg/l (mai favorabilă este zeatina) și auxină în doză mică (0,5mg/l), pe care se formează un număr remarcabil de plantule complet organizate, bine înrădăcinate și care se aclimatizează 60%. Se recomandă de asemenea pentru o cultură economicoasă înlocuirea fitohormonilor cu EP (V4), cu evoluție bună la toți parametrii (80% -regenerare; 90% multiplicarea; 40% aclimatizare și obținerea unei medii de 22plantule/explant). După perioada de aclimatizare, plantulele pot fi plantate în aria de origine și urmărite periodic (în ideea reconstrucției ariei protejate de unde provine specia critic periclitată). Succesul tehnicii este asigurat prin obținereade neo-plantule via-explant, pe medii cu doze echilibrate de fitohormoni (sau fără), la un preț de cost scăzut. Obiectivul este atins și pe medii fără hormoni. (Foto.3.8.a-d, plante complet organizate), cu sistem radicular viguros care asigură aclimatizarea ex vitro în procent bun. În timp s-a monitoriza periodic evoluția plantulelor pe teren : procent de supraviețuire, aspect general, forma tufei a rozetei de frunze, formarea inflorescenței și legarea semințeșor etc. (Zăpârțan et al., 2014). Monitorizarea periodică a ”ariei reconstruite ecologic” asigură succesul conservării ex situ prin tehnici in vitro.

Foto 3.8. a-d: Imagini privind multiplicarea in vitro a speciei

Drosera rotundifolia Huds

a. b.

c. d.

3.3. Înmulțirea in vitro a speciei Dianthus spiculifolius , specie critic periclitată (CR)

Factorii de mediu acționează asupra plantelor și face ca acestea să supraviețuiască și să se echilibrează reciproc, însă dacă un factor devine predominant poate avantaja unele specii sau populații și dezavantaja altele (Dihoru și Negreanu, 2009), unele specii de plante devenind astfel rare sau sporadice fapt pentru care acestea prezintă mai mult interes pentru cercetători chiar dacă nu sunt endemite. Numărul de specii rare din România este mare (datorită arealului continuu) unele dintre ele aflându-se la limită de areal (Cristea et al., 1996, Bleahu, 2004, Baciu et al., 2006). Acțiunea de coservare a speciilor de plante aflate în pericol este de interes pentru societățile specializate non-guvernamentale, dar și pentru specialiștii conservatoriști din alte domenii, cum ar fi în cazul nostru prin biotehnologiile vegetale (Conferința ONU, 1992; Cachiță și Ardeleanu, 2009; Primack, 2002). Prin convenția de la Berna (1979) s-au luat măsuri de prevenire a unor pericole (de ecofilaxie) precum și unele privind dezvoltarea băncilor de gene (IBPGR, 1986; Bavaru et al., 2007). După IUCN, 2006 ritmul dispariției speciilor de plante pe glob este de 100 până la 1000 de ori mai intensificat, omul și activitatea lui fiind cauza principală a extincției lor (după IUCN una din 8 specii de plante este amenințată cu extincția). Se estimează că în ultimii 50 de ani au dispărut cca. 300.000 specii, iar un procent cuprins între 20-40% din flora mondială este în declin (Farusworth și Sahotra, 2008). La nivel european cca. 100 de specii din cele amenințate sunt incluse în programe de restaurare in situ, cu măsuri apoi de conservare și ex situ, iar cca. 35% din taxoni se află într-un program de minimă protecție (De Langhe, 1984). Conservarea in situ presupune, planuri de monitorizare-protecție a habitatelor unde se găsesc speciile de plante periclitate (Cristea, 2006; Domuța et al., 2013). Există planuri de recuperare chiar și a unei singure specii periclitate, precum și activitate de conservare ex situ (Bajaj, 1986; Halmagyi și Butiuc-Keul, 2007; Holobiuc, 2006).

Informația asupră stării sozologice a speciilor o dă elaborarea și reactualizarea „Listelor roșii” și a „Cărții roșii” (Olteanu et al., 1994; Dihoru și Dihoru, 1994; Boșcaiu et al., 1994; Dihoru și Negrean, 2009), care cuprind speciile periclitate din întreaga țară. Conservarea acestor specii prin metode neconvenționale, de exemplu in vitro prezintă un mare interes și are viitor (Engelman, 1997). Metoda a fost experimentată la speciile horticole dar și la elementele botanice cu valoare științifică din flora spontană (Engelman, 1991b; Fay, 1992; Laslo et al., 2011b). Avantajele acestei metode sunt numeroase dar insistăm asupra acelui avantaj că în inițierea culturii este necesară o singură plantă (Cachiță, 1987), o sămânță, un singur explant (vârful lăstarului, boboc floral, porțiune din frunză și tulpină etc.), astfel plante și așa puține, nu vor fi afectate de recoltarea lor din locul de origine (Zăpârțan, 1996; Zăpârțan și Butiuc. Keul , 2002). Cercetările privind tehnicile in vitro la speciile rare, periclitate și endemice din România, în scopul conservării lor au fost aplicate la un număr mare de specii (Zăpârțan, 2001), unele rezultate obținute au fost prezentate la simpozioane în țară și internaționale. Implicarea biotehnologiilor vegetale în înmulțirea unor specii de plante care se înmulțesc cu dificultăți prin metoda clasică, sunt mai vechi și continuate până în zilele de azi (Laslo, 2013). Domeniul s-a extins cuprinzând culturile fotoautotrofe in vitro la specii vulnerabile și periclitate (Cristea, 2010) și chiar la unii taxoni de Dianthus, rari și endemici (Cristea et al., 2004) amenințați de asemenea cu extincția.

Habitatul, arealul, biologia și taxonomia speciei Dianthus spiculifolius, luată în studiu pentru a fi conservată, a fost semnalată în flora României în 1953 (Prodan 1953), acum prezentă sporadic de-a lungul Someșului și a altor râuri, dar și în câteva puncte din Transilvania (PNMA), cele mai multe sit-uri în Bihor (sit-ul Valea Galbenei, Valea Sighiștelului și sit-urile denumite Piatra Bulzului, din jud. Bihor); dar și în Alba și Cluj: sit-urile Pietrele Albe, Platoul carstic Ocoale-Ghețari (Coldea et al., 2008). Geoelement cu statut sozologic de plantă critic periclitată, importanță științific prin faptul că este endemit daco – pontic cu areal restrâns și populații foarte sărace. Factorul limitativ este însăși arealul cu populații foarte sărace, protejată acolo unde se găsește în rezervații (Râpa Roșie) dar și conservată ex situ, în grădini botanice sau ca germoplasma în bănci de gene.

Conform documentelor legislației române Dianthus spiculifolius se găsește în asociații saxicole în sit-ul Piatra Bulzului (Bihor), ca specie rară de interes național în asociație cu alte specii (Oltreanu et al., 1994). De asemenea specia se afla și în sit-ul Valea Galbenei (com. Pietroasa jud. Bihor) cu diferite cenoze ierboase specifice etajului montan unde specia este rară și traiește în asociații cu alte specii rare și vulnerabile (Coldea et al., 2008). Habitatul din care face parte specia este de interes comunitar (Natura 2000), un habitat din pajiști calcifile alpine și subalpine, cu suprafețe restrânse la baza versanților stâncoși. Se aplică conservarea sitului calcaros în forma sa actuală și monitorizarea periodică a speciilor rare și vulnerabile din perimetrul sit-ului (Coldea et al., 2008), un management privind vulnerabilitatea la presiunea antropică cauzată de turismul necontrolat și datorat exploatării economice a calcarului.

3.3.1.Tehnologia de înmulțire in vitro a speciei Dianthus spiculifolius.

Material și metodă

Specia Dianthus spiculifolius, din flora spontană a României, critic periclitată (CR), s-a conservat și protejat prin înmulțire in vitro, raritate floristică de interes științifc, endemit daco – pontic, cu areal restrâns și populații sărace. Localizată în câteva sit-uri din PNMA (în județul Bihor, dar și Cluj, Alba). Exemplarele folosite pentru multiplicare provin din sit-urile Valea Galbenei si Piatra Bulzului din Bihor (PNMA). Unele speciile periclitate din Bihor și alte zonele învecinate au fost conservate in vitro cu succes , rarități din Piatra Craiului, Gilău (Cristea at. al., 2004; Blându și Holobiuc, 2007).

Materialul vegetal folosit pentru înmulțire in vitro a speciei Dianthus spiculifolius a fost format din țesut meristematic – apex: desprins de la lăstarii unei plante de garofiță (plantă mamă-donatoare) din aria protejată, aleasă cu mare grijă pentru a nu afecta zona, prezente sporadic în populații sărace. Detașarea lăstarului (de la planta din aria respectivă) s-a făcută în ziua momentului experimentului : pentru păstrarea proprietăților țesutului (Laslo et al., 2011a). Tipul de explant perioada din an când s-a inițiat experimentul și durata lui sunt cuprinse în tabelul 3.6.

Tabelul 3.6. : Explantul și mediile de cultură utilizate în muntiplicarea in vitro a speciilor luate în studiu

Sursa: proprie

După sterilizare materialul, apexul de Dianthus a fost inoculat pe medii echilibrate: mediu de bază MS (Murashige – Skoog, 1962), concepându-se câteva formule de mediu cu adaus hormonal și suplimentat cu alte substanțe specificate în tabelul 3.7.

Tabelul 3.7. : Formule de mediu utilizate pentru înmulțirea in vitro a speciei

Sursa: proprie

(MS = Muraschige-Skoog; AIB = acid indolil butiric; BA = benzil adenină; Z = zeatină)

Condițiile de incubare a culturilor in vitro. Meristemele apicale după inoculare pe mediile aseptice s-au păstrat în condițiile camerei de creștere, la intensitate luminoasă de 16 ore lumină din 24 de ore, la temperatură de cca. 260C și umiditate cca. 80%. Lumina și intensitatea ei variază în funcție de scop și specie, utilizându-se lumină fluorescentă difuză cu intensitate de 2-10 klux, funcție de etapa de dezvoltarea a neoplantulelor, apoi se mai folosește lumină continuă sau amestecuri de lumină fluorescentă cu roșu-violet, necesară unor tipuri de inoculi pentru a induce organogeneza.

3.3.2. Rezultate și discuții

Flacoanele cu țesutul inoculat au fost păstrate în condițiile camerei de creștere și s-au făcut măsurători și observații privind: evoluția explantelor după cca. 45 – 50 zile de cultură in vitro, privind procentul de regenerare, multiplicare, înrădăcinare și aclimatizare, dar și numărul de plantule diferențiate/explant țesut apical (apex) de Dianthus. Tabelul 3.8. cuprinde valorile parametrilor: media numărului de plante, procent de regenerare, multiplicare și aclimatizare.

Tabelul 3.8. : Valorile parametrilor analizați la specia Dianthus cultivat in vitro (după 40-50 zile)

Sursa: proprie

Procesul de regenerare in vitro a țesutului detașat de la specia Dianthus spiculifolius, urmează ciclul biologic natural al speciei. Perioada favorabilă înmulțirii clasice a plantelor este primăvara timpuriu pentru perene sau anuale și toamna târziu pentru bulboase (Encyclopédie universelle, 1999), perioadă favorabile și evoluției culturii in vitro, dovedită la majoritatea speciilor din flora spontană cultivate in vitro (Zăpârțan, 2001).

Evoluția explantului din țesut apical (apex) de Dianthus spiculifolius la cultura in vitro. Regenerarea apexului are loc în procent de 98% (în prezența zeatinei) multiplicarea 98% chiar 100%. Graficul 3.8. prezintă comparativ capacitatea de regenerare și multiplicare in vitro după 45 – 50 de zile de cultură in vitro (remarcăm valorile ridicate pe mediile cu citochinine (V2 și V3), chiar în cadrul acestor variante există diferențe funcție de natura citochininei). În prezența zeatine (V3) valorile procentuale sunt foarte bune (regenerare de 98% și de multiplicare de chiar 100%), rezultatele justifică recomandarea noastră de a utiliza o citochinină în doze moderate (1,0mg/l): buna regenerare și multiplicare are loc pe toate variantele, funcție doza și natura fitohormonului.

Graficul 3.8. : Capacitatea de regenerare și multiplicare (%) a apexului de Dianthus spiculifolius (după 50 de zile)

Sursa: proprie

Aclimatizarea ex vitro este analizată în raport cu valoarea sistemului radicular diferențiat in vitro, cu cât sistemul radicular este mai viguros și procentul de aclimatizare este mai mare. Procentul bun de înrădăcinare de 23 – 25%, pe variantele cu citochinine (V2 și V3) aduce după sine și cel mai bun procent de aclimatizare de peste 50% (graficul 3.9.): constatăm relația direct proporțională dintre prezența auxinei chiar în doză mică de 0,5mg/l (auxina fiind implicată în formarea rădăcinilor) și valoarea sistemului radicular. Prezența și doza de citochinine, asociată cu capacitatea de formare a sistemului radicular, duce la un procentul superior de aclimatizare.

Graficul 3.9. : Procentul de aclimatizare a plantelor funcție de

valoarea sistemului radicular

Sursa: proprie

Media numărului de plantule diferențiate dintr-un explant apical de Dianthus este cuprinsă între 16 – 28 plantule/apex (graficul 3.10.) și la această specie, evoluția acestui parametru depinde de prezența sau absența citochininelor (de formula de mediu utilizată).

Graficul 3.10. : Media numărului de plante de Dianthus spiculifolius

diferențiate din apex (după cca. 50 de zile)

Sursa: proprie

Concluzii și recomandări

Conservarea prin înmulțire in vitro a speciilor din flora spontană, asigură manifestarea principiului de totipotențialitate a celulelor vegetale in vitro, caracteristică manifestată funcție de vârsta explantului (cu cât țesutul donator este mai tânăr și totipotența este mai mare): de natura organului (sămânță sau parte din plantă: rădăcină, frunză, etc.), fiecare cu capacitatea proprie de regenerare și multiplicare. Manifestarea totipotenței are loc și la celulele plantelor din flora sălbatică, fenomenul favorizând conservarea acelor specii rare, periclitate și vulnerabile și care înmulțite in vitro pot fi salvate și pot asigura extinderea lor în arealele de origine. La specia Dianthus spiculifolius în urma culturii in vitro s-au desprins câteva concluzii și recomandări, dar inițial rebuie stabilită cronologia și aria de proveniență a speciei pe care dorim să o înmulțim in vitro și păstrarea variabilității genetice a populației, apoi categoria sozologică în care se încadrează, asigurând în acest fel succesul reconstrucției habitatului de origine a speciei.

Foto 3.9. a-d Dianthus spiculifolius generat in vitro

a. b .

c. d.

Sursa: proprie

Concluzionăm că:

Cultura in vitro depinde de specie, de capacitatea de adaptare la condițiile in vitro, de capacitatea celulei de reluare a metabolismului, de natura, proveniența, vârsta explantului, capacitatea regenerativă a țesutului și perioada din an când se inițiază cultura;

Multiplicarea in vitro a speciei Dianthus este determinat de prezența citochininelor (Z și BA) în doză moderată (1mg/l, poate chiar mai mare) și o doză foarte mică de AIB-0,5mg/l;

Se recomandă urmărirea etapei finale, aclimatizarea ex vitro care este asigurată de valoarea neo-plantulele, de capacitatea lor de a diferenția un sistem radicular viguros, de parcurgerea etapele intermediare, care aduc un procent de supraviețuire bun în condițiile de libere.

3.4. Conservarea in vitro a speciei Narcissus poeticus L, specie vulnerabilă (VU)

Generalități privind biologia și răspândirea speciei în țara noastră. Genul Narcissus cuprinde plante cu bulbi, peste 40 de specii spontane răspândite în Sudul Europei (în regiunea mediteraneană) dar și în Caucaz, Asia până în China, Japonia: cu flori frumos colorate, port elegant, speciile au valoare decorativă și sunt cultivate și în parcuri și grădini (Săvulescu, 1966). La noi este răspândită în Cluj, Bihor, Brașov, Hunedoara etc., ca formă subspontană (Harta 5 ANEXA I.). Narcisuss poeticus L, narcisa albă (fam. Amarylidaceae), se găsește în arii denumite „poiene cu narcise” (cum este cea din Alparea, jud. Bihor, experimentată de noi). Cunoscută din antichitate are largă amplitudine ecologică la sol și amfitolerantă la Ph-ul lui (vegetează pe sol reavăn) și cerinte moderate la căldură (izoterme de 4,5oC-7,5oC). Bulbul ovoidal-sferic, florile albe tivite cu roșu, solitare, odorate (Fig.17), înflorește în aprilie-mai, fructul este o capsulă (Pârvu, 2004).

Importanță ca plantă meliferă, utilizată și în medicină, narcisa se cultivă și ca plantă ornamentală (rabate, rondouri solitarea sau în aranjamenajări florale). Tehnologia de cultură a speciilor rustice, speciei poeticus este asemănătoare tuturor bulboaselor (zambile, lalele etc.), care necesită plantarea în toamnă (pentru trecerea perioadei de vernalizare), la sfârșit de septembrie într-un sol fertil, la semi-umbră și într-o climă moderat-caldă.

Foto 3.10.Floare de narcisă albă

Sursa : Pârvu, 2004

Vegetează până primăvara, înflorește în aprilie, apoi organul de înmulțire, bulbul intră în repaus (se scoat din sol, în condiții de repaus până toamna când se replantează la loc dorit). Specia luată spre conservare ex situ datorită stării sozologice de vulnerabilă (Olteanu et al., 1994; Boșcaiu et al., 1994), Narcissus poeticus L provine din aria protejată „Pădurea cu narcise din Alparea (com Oșorhei)” jud. Bihor și s-a conservat prin înmulțire in vitro.

3.4.1.Considerații generale privind regenerarea și tuberizarea in vitro la speciile bulboase periclitate și vulnerabile

La speciile bulboase obținerea materialului vegetal de înmulțire, bulbii, joacă rol esențial în perpeturarea speciei. Pentru realizarea unor bulbi de calitate cu capacitate de înflorire, chiar și la cultura clasică specia trebuie să parcurgă o perioadă de temperaturi scăzute : etapa de vernalizare (Tampsett, 1980). Durata vernalizării ca factor major pentru desfășurarea procesului de creștere și înflorire, poate fi substituit prin tratamente chimice, fitohormoni, implicați în procesul diferențierii bobocilor florali (exp. GA3). Tratamentul cu giberelină (GA3) are scopul de-a înlocui vernalizarea și de a întrerupe repausul speciei (Yamagishi, 1993) pentru a induce înflorirea, GA3 a dat rezultate remarcabile aplicat bulbilor de Narcissus și Hyacinthus, forme horticole ( Zăpârțan, 1990).

Explantele din bulbi au indus diferențierea de bulbili in vitro la diferite specii de bulboase (din Liliaceae, Iridaceae, etc.), urmărindu-se regenerarea de bulbi. Rezultatele privind regenerarea la Lilium (Zăpârțan et al., 2000) și Fritillaria cultivate in vitro au dus la o cantitate sporită de material biologic (bulbili), față de metoda clasică pentru propagarea speciei (Zăpârțan, 1996c). Obținerea materialului săditor in vitro pornind de la lăstari crescuți din tuberculi de cartof ca o tehnică de mare interes pentru această specie de importanță economică, rezultatele depinzând de perioada din an când se face prelevarea, de cultivar, de balanța hormonală : de prezența unei citochinine (Agud et al., 2010), toate asigurând obținerea tuberculilor săditor la un preț de const scăzut, tehnica in vitro dovedindu-se economicoasă (Agud, 2011). În Europa un număr mare din speciile de plante amenințate sunt incluse în programe de monitorizare și conservare in situ, cu măsuri apoi de conservare și ex situ: cca. 35% din speciile rare, vulnerabile sau periclitate cu extincția se află într-un program de minimă protecție, incluse în planuri de recuperare, chiar și a unei singure specii, cu un anume statut sozologic și conservate ex situ ( Bajaj, 1986; Dihoru și Dihoru, 1994).

3.4.2. Tehnologia de multiplicare in vitro a speciilor bulboase și periclitate din flora sponatană

Biodiversitatea Terrei a suferit un declin de neimaginat între anii 1996 – 2004, fiind introduse în lista roșie peste 8.300 de specii de plante cu diferite grade de periclitare(Sarasan et al., 2006). Numeroase habitate naturale și populații de plante, datorită în principal activității omului au scăzut puternic ca număr. După unele date schimbările climatice au efect distructiv asupra biodiveristății, ritmul de dispariție al speciilor este de 100 până la 1000 de ori mai mare decât ritmul natural (IUCN, 2006), diversitatea biologică fiind permanent afectată (cca. 50% din specii au dispărut în ultimii 20 de ani) . Strategia Globală pentru Biodiversitatea Plantelor (CBD) elaborată la Haga în 2002, în cadrul Convenției pentru Biodiversitate a stabilit măsurile de conservare a patrimoniului natural vegetal, susține cercetări în domeniul ecologiei, sistematicii, taxonomiei, biologia conservării plantelor etc., stabilind protocoale de conservare a speciilor.

Metoda de înmulțire in vitro a unor plante are o mulțime de avantaje: se obține un număr mare de exemplare, identice sau aproximativ identice cu planta mamă, în timp relativ scurt și cu preț de cost scăzute; metoda, este unica metodă de înmulțire a plantelor care se înmulțesc numai asexuat; etc. Dezavantajul tehnicii îl constituie faptul că există pericolul reducerii diversității genofondului populației deoarece în refacerea populației se pornește de la un număr mic de genotipuri, apoi tehnica este mult mai costisitoare, necesită o dotare corespunzătoare și formare de specialiști. Metoda clasică de conservarea ex situ (colecții pe teren), are unele deficiențe care au făcut să crească interesul pentru conservarea in vitro, metoda devenind o certitudine, făcând legătură între metoda clasică și modernă, ambele completându-se reciproc. Deși la începuturile ei metoda era considerată doar o cale de multiplicare clonală rapidă a speciilor economice, după 1990 este privită ca mijloc de conservare a resurselor vegetale.

Pericolul dispariției specii sălbatice din România, a mărit interesul pentru conservarea lor prin orice forme, privite și analizate cu deosebită atenție și bazându-se pe liste și cărți roșii (Olteanu et al., 1994; Boșcaiu et al., 1994; Moldovan et al., 1994; Dihoru, 1992; Dihoru și Negrean, 2009), în care s-a ținut cont de categoria reală de periclitate, de rata pierderilor, de lărgirea ariilor protejate și de proiectele de conservare ex situ (cercetarea taxonilor considerați dispăruți și obiectivele impuse de organismele europene privind gestionarea resurselor naturale).

3.4.3. Materialul și metoda de înmulțire in vitro a speciei Narcissus poeticus L

Narcissus poeticus L, din aria protejată Alparea (com Oșorhei), Bihor, specie vulnerabilă (VU) a fost conservată prin înmulțire in vitro în laboratorul de Biotehnologii al Facultății de Protecția Mediului din Oradea.

Materialul vegetal utilizat la înmulțirea in vitro a speciei Narcissus poeticus L a constat dintr-o secțiune longitudinală de solz din bulbul, cu o porțiune de disc (porțiune, considerată zona cu cea mai mare capacitate de proliferare). După sterilizare explantele se inoculează pe mediile de cultură în poziție culcat.

Tabelul 3.9. Variantele de medii concepute pentru fiecare mediu de bază

Sursa: proprie

(MB = mediu de bază: A = aminoacidul glicină: MS = Murashige-Skoog; MSM=MS modificat: He = Heller; B5 = Gamborg)

Mediile de cultură utilizate pentru stimularea diferențierii de minibulbili in vitro la specia Narcissus poeticus L sunt prezentate în tabelul 3.9. și cuprind patru medii de bază (MB): MSModificat = după Murashige-Skoog +180mg/l glicină (Vom), din care s-a conceput variantele: V1m și V2m; MS = Murashige Skoog (Vo) cu variantele V1 și V2; He = după Heller + vit. MS (Ho), cu variantele H1, H2 și H3; B5 = după Gamborg(B5) + vit. MS (Bo), cu care s-au preparat aceleași variante de mediu ca în cazul MB după Heller (tabelul 3.9.). Prezența citochininelor în mediu în doză de 1,0 – 2,0 mg/l s-a dovedit eficiente la tuberizarea in vitro a unor soiuri de cartof autohtone și străine cultivate in vitro, în sensul obținerii unui material săditor de calitate și cantitate superioară (Agud et al., 2008). Asocierea unei concentrați mici de auxină (0,5mg/lAIB) cu o doză medie sau mai mare de citochinină, favorizează formarea unui sistem radicular viguros la specii de plante din flora spontană (Agud, 2014), iar la speciile cu bulbi amestecul de hormoni induce diferențierea bulbililor in vitro.

Bulbii donatori de explante s-au tratat cu frig în scopul substituirii perioadei de vernalizare. Durata tratamentului și valorile de temperatură aplicate sunt prezentate în tabelul 3.10., remarcăm patru perioade de tratament de 1, 2, 3 și 4 luni cu temperatură care descrește periodic de la 6oC până la 2-3oC, aplicate bulbililor și o apreciere subiectivă legată de capacitatea regenerativă, relevantă sub aspectul necesității unui tratament mai îndelungat cu frig (de peste trei luni). Condițiile de incubare in vitro: solzilor detașati din bulb și inoculați pe medii sunt menținuți o perioadă (4-5 zile) la întuneric, pentru stimularea diferențierii de minibulbili in vitro( Laslo et al., 2011b ) și pentru declanșarea inducția florală (Zăpârțan, 1992).

Tabelul 3.10.. Durata tratamentului cu frig (vernalizarea) și perioada din an când s-a prelevat apexul de Narcissus poeticus L

Sursa: proprie

Rezultate privind comportamentul in vitro a speciei Narcissus poeticus L

Observațiile s-au făcut după 3-4 luni de la inocularea in vitro a explantelor de Narcissus poeticus L și s-a urmărit evoluția explantului constând din secțiune de solz cu porțiune de disc, funcție de durata tratamentului cu frig, perioada din an când se aplică tratamentul, natura mediului de bază și a variantelor prezentate în tabelul 3.11.

La experiențele cu unele soiuri de Narcissus și Hyacinthus hybridus, tratamentul cu frig aplicat bulbilor într-o anume perioadă din an, s-a dovedit eficient în stimularea inducției florale și de substituire a frigului prin injectarea în bulb a unei soluții de GA3, ceea ce va înlocui frigul și va stimulat inducția florală, asigurând înflorirea soiurilor de bulboase (Zăpârțan, 1990). Evoluția explantului se poate raporta la perioada de frig aplicată, la doza de fitohormoni și mai puțin la natura mediului de bază.

Tabelul 3.11. Ritmul regenerării in vitro a speciei Narcissus poeticus L și evoluția explantului de Narcissus poeticus L, funcție de epoca de prelevare și inoculare

Sursa: proprie

Capacitatea regenerativă după o lună de frig la 5-6oC este modestă, 2-4% (pe V1mșiV2m), cu diferențierea a 1-2 frunze. Aminoacidul din mediu poate fi favorabil doar cu o durată mai mare de tratament cu frig la o temperatură mai scăzută. După 2 luni de tratament la cca. 4oC capacitatea regenerativă crește la 8-12% (graficul 3.11.), pe mediu cu 2,0mg/l BA (V2) unde apare și caulogeneza.

Graficul 3.11. Capacitatea regenerativă in vitro a explantului de Narcissus poeticus L, după cele patru perioade de tratament cu frig

Sursa: proprie

Evoluția explantului in vitro este în creștere după 3 luni de tratament a bulbilor cu frig la 2-3oC, capacitatea regenerativă ajungând la 30-40% pe mediile cu fitohormoni (H1 și H2), diferențindu-se cca. 2-3 bulbili/explant. Pe mediu pentru diferențierea calusului (H3) are loc formarea unui manșon de calus în jurul explantului de 2-3mm. După 4 luni de tratament la aceiași temperatură capacitatea regenerativă a explantului ajunge la 40-50% iar bulbificarea se intensifică. Graficul 3.11. prezintă evoluția explantului după cele patru perioade cu frig, din care remarcăm capacitatea regenerativă superioară pe variantele menținute la frig 3-4 luni și în prezența benziladeninei (H1, H2, B1 și B2).

Foto 3.11. a = diferențierea slabă după 2 luni de tratament cu frig; b = caulogeneza; c = diferențierea de calus; d = începe diferențiere de bulbili; e și f = diferențierea de bulbili după tratament 3-4 luni cu 2-3oC

a . b. c.

d. e. f.

Sursa: proprie

Concluzii și recomandări

Menționăm necesitatea tratamentului cu întuneric aplicat explantelor detașate din bulb și inoculate in vitro, în scopul stimularea diferențierii organelor de reproducere sau înmulțire (bulbi) în cazul speciilor din familiile tunbero-bulboase. Tratamentul cu frig la specia Narcissus poeticus L, reduce sau chiar elimină repausul profund al speciei (obligatoriu pentru inducția florală).

O lună de tratamentul cu frig este insuficientă, evoluție este lentă și doar în prezența fitohormonilor (Foto 3.11. a ). După 2 luni la 4oC capacitatea de regenerare crește, fiind semnală ușor și caulogeneza (Foto 3.11.b = formarea de funzulițe adevărate).

Tratamentul cu 2-3oC aplicat trei-patru luni, stimulează capacitatea regenerativă, care ajunge la 30-50%, cu diferențierea de cca. 3-4 bulbili/explant (Foto 3.11.c, d și f). Multiplicarea in vitro a speciei Narcissus poeticus L, după parcurgerea perioadei normale de vernalizare (natural sau tratament cu frig).

Experiențele trebuie să continue după parcurgerea vernalizării normale a bulbilor (în sol), cu testarea altor formule de mediu și cu alți fitohormoni (Z, 2iP, ANA etc.), chiar extracte naturale, pentru obținerea bulbilor in vitro, la un preț de cost redus.

Recomandăm perioadă mai mare de vernalizare sau tratament cu temperaturi scăzute, peste trei luni, doze mai ridicate de citochimnine, atât pentru proliferarea masei de calus embriogen cât și pentru diferențierea microbulbilor in vitro.

Bibliografie

Agud, E., (2014), "Vulnerable and protected endemic species from the protected areas of Bihor County. Their conservation through in vitro multiplication", Internati. Symp. "Risk factors for environment and food safety" & "Natural resources and sustainable development", în: Analele Universității din Oradea, Fascicula: Protecția Mediului,vol.XXIII, Ed. Univ. Oradea; pp.553-565,

Agud E., (2014) " Campanula rotundifolia L. species endangeres with extinction, conserved through in vitro techniques ", în: Analele Universității din Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XXIII, Ed. Universității din Oradea ,pp.565-577,

Agud, E.M., Laslo, V., Zăpârțan, M., (2013), Factors with diferentiated implication in the in vitro minituberizațion at some potato varieties (Solanum tuberosum L.), în: Book of Abst., UAB-B.E.N.A. Intern. Congres Environmental Engineering and Sustainable Development, Alba-Iulia,

Agud, E., Zăpârțan, M., and Laslo V., (2013), The influence of the moment of sampling of the potato meristem over the in vitro regeneration and differentiation capacity, in: The XII International Symposium Prospects for the 3-rd. millennium Agriculture, Cluj-Napoca, la 26-28 September Abstract vol II, 102,

Agud Eliza, Cap Z., Zăpârțan M.,(2010), " The aspects concerning in vitro tuberring at the potatoe varieties", în: Analele Universității din Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XV, Ed. Universității din Oradea, pp. 7-13,

Agud, E., Savatti M., Zăpârțan M., (2008), "The Growth Hormones Involved in the In Vitro Tuberisation of Some Potato Cultivars", în : Analele Univ. Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XIII, Ed. Univ. din Oradea, pp. 1-5,

Bajaj. YPS., (1986), In vitro preservation of genetic resources. IAEA-SM-282/66 Vienna,

Banciu, C., A. Brezeanu, M. Paucă-Comănescu., (2006), Reactivitatea in vitro a speciei vulnerabile Crocus flavus Weston, Micropropagarea speciilor vegetale, în: Lucrările celui de al XV lea Simp. Nați. de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale, Iași, p. 50-59,

Bavaru A., Godeanu S., Butnaru G și Bogdan A., (2007), Diversitatea și ocrotirea naturii, Editura Academiei Române București,

Blându, R., I. Holobiuc, (2007), Contributions in ex situ conservation of rare plants from Piatra Craiului massif using biotechnology, Conference Proceedings The 1st International Conferance Enviironment – Natural Sciences – Food Industrx in European Context Ensfi 2007, 1st edition, p. 483-788,

Bleahu M., (2004), Arca lui Noe în sec. XXI. Ariile protejate și protecția naturii, Ed. Național, București,

Boșcaiu, N., Gh. Coldea, C. Horeanu, (1994), Lista roșie a plantelor vasculare dispărute, periclitate, vulnerabile și rare din flora României, Ocrot. Nat. Med. Înconj., 38 (1); p. 56,

Butiuc-Keul, A, Zăpârțan, M., (1996), Influence of natural maize extract upon the organogenesis in vitro in some flowery species, Iliev I., Zhelei, P., Aleksandrov, P (eds). IPPS in Bulgaria – Sec. Scientific Confer. Sheek and Share, Ed. Sofia, pp. 19 – 27,

Cachiță, C.D, (1987), Metodele in vitro la plantele de cultură, Ed. CERES, Cluj – Napoca, pp. 30-42,

Cachiță, D., Deliu, C., Racosz, L., (2004). Tratat de biotehnologii vegetale, Vol I, Ed. Dacia, Cluj-Napoca,

Cachiță., D.. Ardeleanu, A., (2009), Tratat de biotehnologie vegetală, Vol. II., Ed. Dacia, Cluj,

Coldea, Ghe., Fărcaș, S., Ciobanu, M., Hurdu, B., Ursu, T., (2008), Diversitatea floristică și fitocenotică a principalelor situri protejate din Parcul Natural Apuseni,

Cristea M., (2006), Biodiversitatea, Ed. CERES, București,

Cristea V., (1995), La conservation de la nature en Roumanie, Univ. degli Studi Camerino (Macerata) Italia,

Cristea, V., S. Denaeyer., J.P. Herremans., I, Goia., (1996), Ocrotirea naturii și Protecția Mediului în România, Ed. University Press., Cluj – Napoca, p. 365,

Cristea, V., Denaeyre (2004), De la Biodiversitate la OGM-uri, Ed. EIKON, Cluj-Napoca, pp. 66-57,

Cristea, Victoria., M. Miclăuș, M. Pușcaș., C. Deliu, (2004), Conservative micropropagation of some endemic or rare species from the Dianthus L. genus. In: In vitro Cult. and Hortic. Breeding, Fifth IV CHB Symposium Biotehnology, as therorz and Practice in Horticulture, p. 3-13,

Cristea, Victoria., M. Miclăuș, M. Pușcaș., C. Deliu, A. Halmagyi., (2004), The micropropagation of some endemic or rare taxa from Gilău, M-tele Mare massif. Contrib. Bot., XXXIX, Cluj – Napoca, p. 201-209,

Cristea, Victoria, 2010, Culturi in vitro fotoautotrofe la speciile de Dianthus endemice și periclitate din România, Ed. Todesco, Cluj – Napoca;

De Langhe, EAL., (1984), The rol of in vitro techniques in germoplasm conservation. In: Holden, JHW., Williams, JT., (eds.), Crop Genetic Resources: Conservation and Evaluation, Allen and Unwin, London, pp. 131-137,

Dihoru, Ghe., Alexandrina, Dihoru, (1994), Plante rare, periclitate și endemice din flora României – Lista roșie. Acta Bot. Hort. București, pp. 173-197,

Dihoru, Gh., Negranu, G., (2009), Lista roșie a plantelor vasculare din România, Ed. Acad. Ro.,

Domuța, C. (coord.), Brejea, R., Șandor, Maria, Domuța, Cr., Borza, Ioana, Timar, A., Vușcan., A., Ciobanu, Gh., Csep, N., Ciobanu, Cornelia., Bucureanu, Elena, Zăpârțan, Maria, Curilă, M., Romocea, Tamara, Sarca, Gh., Laslo, V., Pantea, Emilia, Samuel, Alina, Oneț, Aurelia, Oneț, C., Șerban, Eugenia, Costea, Monica, Gîtea, M., Agud, Eliza, Bodog, Marinela, Jude, E., Cozma, Alina (2013), "Monitoringul mediului: lucrări practice", Ed. Universității din Oradea, Oradea ISBN : 978-606-10-0993-0, 607p.,

Engelman, F., (1997), In vitro conservation methods. În: Callow, JA., FordțLoyd BV, Nrwbury, HJ., (eds.) Biotehnology and Plant Genetic Resources, pp. 120-160,

Farusworth, E., (Lead Author), Sahotra Sarkar (Topic Editor). (2008), Conservation and management of rare plant species. in: Encyclopedia of Earth. Eds. Culter J. Cleveland (Washington, D.C., Environmental Information Coalition, National Council for Science and the Environment).Published in the Encyclopedia of Earth Ahgust 28, 2007; Retrieved January 16,

Fay, M.F., (1992), Conservarea of rare and endagered plants using in vitro methods. In vitro cell. Dev. Biol., 28, pp. 1-4,

Halmágyi A., Butiuc-Keul, (2007),Conservarea resurselor genetice vegetale, Ed. Todesco, Cluj-Napoca, 2-4,

Holobiuc, I., Blîndu, R., (2006), Improvement of the micropropagation and in vitro medium – term preservation of some rare Dianthus species, Contribuții Botanice, 42 (2)Cluj, pp. 143-151,

Jain, S., (2001), Tissue culture-derived variation in crop improvement, Euphytica, 118,

Larkin PJ., and Scowcroft, WR., (1981), Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. Appl. Genet., 60, 190-200,

Laslo, V., Vicaș, S., Agud, E., Zăpârțan, M., (2011a), "Methods of conservation of the plant germplasm. In vitro techniques", în: Analele Univ. Oradea, Fas. P.M, vol.XVI B, Ed. Univ. Oradea,

Laslo, V., Zăpârțan, M., Agud., E., (2011b), "In vitro conservation of certain endangered and rare species of Romanian spontaneons flora", în: Analele Univ. din Oradea, Fasc. P. M.,vol. XVI A, Ed. Univ. Oradea,

Laslo, V., (2013), Biotehnologii vegetale și aplicațiile lor. Editura Universității din Oradea,

Laslo, V. Zăpârțan, M. Agud, E., (2013), "The in vitro reaction of the Drosera intermedia Hayne species, a critically endangered species of Romanian flora", International Symposia "Risk factors for environment and food safety" & "Natural resources and sustainable development", în: Analele Univ. Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XXI, Ed. Univ. Oradea, 23-31,

Murashige, T., Skoog, F., (1962), a revised medium for rapid growth and bioassay with tabacco tissue culture, Pysiol. Plant., 15, 374-497,

Oltean M., Negrean, G., Popescu, A., Roman, N., Dihoru, G., Sandală, V., Mihăilescu, S., (1994), Lista roșie a plantelor superioare din România, Studii Sinteze Documentații de Ecologie, Academia Română, Institutul de Biologie București, pp.16, 24, 28, 31,

Opriș., T., (1990), Plante unice în peisajul rămânesc, Editura Sport-Turism, București,

Pârvu, C., (2004), Enciclopedia plantelor- plante din flora României, Vol. III, Ed. Thenică. București, pp. 496-503,

Primack, R.H., (2002),Conservarea diversității biologice, Ed. tehnică, București (traducere),

Sarasan, V., Cripps, R., Ramsay, MM., Atherton, C., McMichen, M., Prendergast, G., Rowntree, J.K., (2006), Conservation in vitro of threstened plants – progress în the past decade. In vitro Cellular and Developmental Biol. – Plant, 42, 206-214,

Sârbu A (coord.), (2007), Arii speciale pentru protecția și conservarea plantelor din România, Ed. Victor, B., București,

Sârbu, I., Chifu, T., (2003), Lista roșie a plantelor vasculare din Moldova, Memoriile Secș. Șt., Acad Română, 4 (24), 131-151,

Schenk, R., Hidebrandt, AC., (1972), Medium and techniques for education growth of monocotyledonous and dicocotyledonous plant cell cultures., Can., Ju., Bot., 50,199-204,

Tampsett, A.A., (1980), Advancing and retarding flowering of narcissus Grand Soleil, in: Acra Hort., 109, pp. 57-63,

Toniuc N., Oltean, M., Romanca, G., Zamfir, U., (1992) List of protected areas in Romania (1932-1991), Revista: Ocrotirea Naturii Mediului Înconjurător, nr.36, 1,

Toniuc, N., Purcelean, L., Boșcaiu, N., (1994), Rezervații biogenetice și importanța lor pentru conservarea genofondului, Ocrot. Nat. Med. Înconj., 38, 2: 107-113,

Withers, LA.,(1990a), In vitro tehnic for the conservation of crop germoplasm. National Conference on Plant and Animal Biotechnology, Nairobi, Kenya, 5-27,

Withers, LA., (1990b), Tissue culture in the conservation of plant genetic resources. International workshop on tissuew culture for the conservation of biodiversity and plant genetic resources, Kuala-Lumpur, pp. 1-25,

Yamagishi,M., (1993), Effects of in vitro culture temperature and cold treatment on breakage of dormancy in bulblets of Lilium japonicum., Bull., RIAR, Ishikawa Agr. Coll., 3,

Zăpârțan, M., (1995), Specii endemice rare și ocrotite, conservarea prin tehnici in vitro (Dianthus spiculifolis Scur), Analele Univ. Oradea, Biologie, an II, 42-49,

Zăpârțan, M., (1996), Rolul culturii de țesuturi in conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură, în: Contribuții Botanice, 1995-1996, p. 217-221,

Zăpârțan, M., (1996), „In vitro regeneration and organogenesis in the species Fritillaria imperialis (L) „Aurora” in: Intrenational plant propagatiors Society, IPPS in: Bulgaria – Second Scientific Conferice, 57. Octombr Ed. Seek Y Share., p.120-127,

Zăpârțan, M, (1996), Rolul culturilor de țesuturi în conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură, Contrib. Bot. Cluj – Napoca,

Zăpârțan, M, (2001), Conservarea florei spontane prin înmulțire in vitro. Ed. ALC MEDIA GROUP, Cluj,

Zăpârțan M., Butiuc. Keul A., (2002), „ In vitro multiplication and callus induction of Syringa josikaea Jacq. endemic taxa from Romanian flora, în Contribuții Botanice, XXXVII, 2002, Grădina – Botanică „Alexandru Borza” Cluj – Napoca,

Zăpârțan, M., Laslo, V., Agud, E., (2014), Ariile protejate formă de conservare a biodiversității, Ed. EIKON / CARTEA ARDELEANĂ, Cluj-Napoca,

***IBPGR (International Broard for Plant genetic resources),1986, Design, planning and operation of in vitro genebanks, IBPGR, Rome;

*** IUCN: International Union for the Conservation of Nature;

*** Flora, R. P. R., T. Săvulescu, (ed.), Vol. I-XIII din 1952-1974;

*** BOTANICA – Encyclopédie de botanique et d`horitculture, plus de 10.000 plantes du monde entier (Ed. Könemann) Cologne, 1997, pp. 184-186 ;

*** Conferința ONU de la Rio de Janeiro, 1992;

***Convenția asupra biodiverstsității; Rețeaua ecologică „Natura 2000”,

*** IUCN: International Union for the Conservation of Nature,

*** UNEP:United Nation Environmental Programme;

*** WWF: World Wildlife;

***Legea nr. 5/2000 privind aprobarea planului de amenajare a teritoriului național,

*** Lista Roșie UICN (http://www.iucnredlist.org)

*** Lista roșie a plantelor vasculare dispărute, periclitate, vulnerabile și rare din flora România: după Boșcaiu, N., Gh. Coldea, C. Horeanu, 1994, , Ocrot. Nat. Med. Înconj.,38 (1);

*** Cartea roșie a plantelor vasculare, Digoru Ghe., Negreanu G., Ed. Academiei Ro., 2009,

*** Encyclopédie universelle des 15.000 de plantes, 1999, Editor Christopher Brickell, en association avec la Royal Hort. Soc., Editura LAROUSSE-BORDAS, 1999,

(http://www.natureserve.org/aboutUs/PressReleases/IUCN_Red_List_release.pdf).

(http://www.bgci.org.uk/files/7/0/global_strategy.pdf).

http://www.iucnredlist.org/info/2007RL_Stats_Table%202.pdf