Referat Cercetare Stiintifica

=== f624ff346de7165b4b6e93ec1db59877451d9959_50563_1 ===

EXPERIMENT

CH este o sursă bogată de aminoacizi și cunoscută pentru a conținutul de cytokinins;1, prin urmare, acești doi compuși au fost mult timp folosiți ca aditivi pentru diferite scopuri biotehnologice .

In timpul vitro când plantele se propagă în metabolismul fenolic CH este foarte ramificat, iar în această cale este mediată de amoniac fenilalanină.

Aceasta este o enzimă cheie deoarece catalizează primul pas al căii fenilpropanoidice, deaminarea adică de

fenilalanină, ceea ce duce la formarea acidului trans-cinamic.

O corelație pozitivă între activitatea PAL și acumularea fenolicelor solubili și flavonoidelor a fost înregistrată în culturi în suspensie de rădăcină tratate cu cupru de Panax ginseng.

Studiile de față au ca scop determinarea acumulării polifenolilor în timpul propagării in vitro pe Planta ovata, împreună cu estimarea proprietăților lor antioxidante, folosind diferite tehnici analitice.

Testul de activitate al PAL si studiul de exprimare PAL au fost de asemenea, efectuate pentru a afla dacă există vreo relație pozitivă între inducția PAL și acumularea de polifenol în timpul culturii călușului.

Cuantificarea unor compuși polifenolici importanți cum ar fi acidul galic, acidul clorogenic, acidul cafeic, acidul cumaric,acidul cinamic, rutin și quercetină – a fost realizată utilizând o cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) în timpul callogenesis în Plata ovata.

Efectul CH și CW a fost studiat în continuare ,de literatura de specialitate pentru a se obține o idee despre rolul acestor instalații pe aditivi acumulate de polifenol și activitatea PAL .

Cultură de țesut

Semințe de P. ovata (soiul IG 2) au fost procurate de la Gujarat Agricole, Facultatea (Anand, Gujarat, India). Semințele au fost cultivate pe o suprafață sterilizata in 10 % soluție hipoclorit de sodiu (albire comerciala) pentru 20 min, agitata și s-au spălat de patru-cinci ori (fiecare cate 5 min) cu apă distilată sterilă pentru a spala excesul albire.

Semințele au fost apoi îmbibate peste noapte în apă distilată sterilă

apă.

În urma îmbibarii semințele au fost inoculate aseptic în mediu de germinare conținând 3% (g / v) zaharoză (Sisco Research Laboratories (SRL), Mumbai, India) și 0,9% (g / v) agar (SRL) fiind pastrate pentru germinare.

Aceste seminte au fost luate de Shootletswere in a 10-zi cand s-au transformat in răsaduri germinate fiind utilizate ca explante pentru inducerea calusului în P. ovata.

P. ovata călușului a fost indusa de MS mediu (Murashige și Skoog, 1962) conținând 1mgL-1 2, 4-D (2, acid 4-diclorofenoxiacetic) și 0,5 mg L-1 kinetină (6-furfurylaminopurine) ca regulatori de creștere a plantelor și incubate timp de 21 de zile (primul pasaj).

PH-ul mediului a fost ajustat între 5,6 și 5,8 (folosind 1 mol L-1 KOH) cand culturile au fost menținute într-o cameră de creștere a plantelor (GC-300 TLH, Lab

Companion, Coreea), la o temperatură de 22-250C și umiditate de 55-60 %, sub o intensitate a luminii artificiale de 1500 lux timp de 16/8 h (lumină / întuneric) fotoperioadei.

De calli au fost subcultivate pe același mediu cu o combinație similară și concentrare de regulatori de creștere a plantelor pentru încă 21 de zile (a doua trecere) la creșterea masei de calus. Calli al doilea pasaj au fost transferate MS mediu conținând 0,5mg L-1 NAA (α-naphthaleneacetic ) și acid 1mg L-1 BAP (6-benzilaminopurină) sub forma de creștere a plantelor regulatoare și incubate timp de încă 21 de zile (a treia trecere).

Subculturingwas a făcut după 21 de zile pe același mediu cu similare

combinarea și concentrațiile de regulatori de creștere a plantelor.

Calli ,din toate cele patru treceri au fost luate pentru studii biochimice.

Suplimentarea cu aditiv

Pentru a studia efectul aditivilor asupra acumulării totale de polifenol în P. ovata în timpul propagării in vitro, a doua trecere (42 de zile) calusuri au fost tratate cu aditivi externi.

CH și CW au fost folosite ca aditivi în acest scop.

Calli (în vârstă de 42 de zile) au fost transferate pe mediu MS conținând 0.5mgL-1 NAA și 1mgL-1 BAP, împreună cu diferite concentrații de aditivi specifici.

Trei concentrații diferite ale fiecăruia dintre CH (1, 2 și 3 g L-1) și CW (5%, 10% și 15%) au fost utilizate în acest studiu.

Culturile au fost incubate timp de 21 de zile.

Prepararea extractului de plante

Extractele din plante au fost preparate prin 100 mg calus din fiecare dintre probe.

Țesuturile au fost măcinate fin în formă lichidă cu azot dizolvandu-se în 1 ml de etanol apos 50 % (HPLC calitate, Merck, Germania).

Amestecul a fost supus ultra sunetelor pentru 20min, urmat de centrifugare la 10 000 x g timp de 5 minute.

Supernatantul a fost colectat și volumul a fost făcută până la 1ml cu etanol apos 50%.

Extractele de plante au fost folosite pentru determinarea conținutului de polifenol si conținut de flavonoizi.

Activitatea antioxidantă se face in 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical purjat și analiza HPLC.

Determinarea conținutului total de polifenol

Conținut total de polifenol a fost determinat de Folin-Ciocalteu reactiv (FCR), cu putin extract de plante modificate de fiecare dintre probe (50 pl) s-au amestecate cu 250 pl FCR (Merck, Germania) și 750 pl de carbonat de sodiu 10 %, soluție (Na2CO3 SRL).

Amestecul a fost agitat bine și incubat la temperatura camerei timp de 30 min în întuneric. Absorbanța a fost apoi înregistrată la 760 nm într-un spectrofotometru UV-vizibil Hitachi (U-2800, Tokyo, Japonia).

Conținutul total de polifenoli a fost exprimată în grame de acid galic echivalenți (GAE) per kilogramfreshweight (FW) de țesut calus comparativ cu curba standard de acid galic.

Whichwas a preparat cu o gamă de acid galic standard (Sigma Aldrich, St Louis, MO,USA) Concentrațiile ce au pornit de la 0 la 100 μgmL-1.

Determinarea conținutului total de flavonoizi

Conținutul total de flavonoizi a fost determinat în funcție de aluminiu clorură (AICI3) colorimetricmetod, modificate cu 10 extracte de plante (1ml) din fiecare dintre mixture 0,1 ml de 10% (g / v) AICI3 (Merck, Germania), 0,1 ml de 1 mol L-1 acetat de potasiu (Merck, Germania) și 1,8 ml apă deionizată urmand a fi agitata bine.

După incubare ,40 minute la temperatura camerei se vor lua 415 nm substante.

Conținutul total a fost de flavonoizat exprimat în grame de echivalenți (RE) per kilogram FW de calusu prin compararea cu curba standard, preparat cu o gamă de rutina standard, (Sigma Aldrich), în concentrații de la 0 până la 120 μgmL-1.

Testul de activitate fenilalaninamonilliaza

PAL a fost extras iar activitatea sa a determinat folosirea HPLC

Metoda a fost descrisă de Dos Santos și colab.

Tabelul nr.1. Secvențele primelor de gene PAL

Pe scurt, țesutul calus a fost măcinat separat la 40C în 0.1molL-1 tampon borat de sodiu (pH 8,8).

Omogenitatea a fost centrifugata (15 000 x g) la 40C timp de 15 minute și supernatantul a fost folosit ca extract de enzimă. Amestecurile de reacție, constând din sodium tampon borat și extracte enzimatice (500 pl), au fost pre-incubate la 400 C (5min) și reacția a fost inițiată prin adăugarea a 300 pl de 50 mmol L-1 L-fenilalanină (Sigma-Aldrich, Germania).

Amestecul a fost incubat la 40° C timp de 1 oră0 C și reacția a fost stopată prin adăugarea de 5mol L-1 HCI (50 pl).

HPLC a fost realizată într-o HPLC Shimadzu serie proeminenta.

Sistemul (Phenomenex, Torrance, CA, SUA) a fost echipat cu detector UV.

Separarea a fost efectuată într-o coloană Luna C18 5 RP (250 x 4,6 mm dimensiune a particulelor) de la Phenomenex (Torrance, CA).

Faza mobilă a fost de 57 % acetonitril, cu un debit de 0.5mLmin-1.

Detectarea acidului trans-cinamic (t-CA) a fost făcut intr-un timp de retenție (12,5 min) și realizată la 275 nm.

Paralel controalele fără adaos L-fenilalanina au fost analizate pentru a determina plantele endogene cu conținut t-CA și au scăzut din probe incubate de L-fenilalanină-înainte de calcularea PAL.

Activitatea și rezultatele au fost exprimate ca pmoli t-CA pe minut per gram FW a călușului.

Primul aranjament

Primele aranjamente au fost proiectate din secvențele de aminoacizi raportate de PAL în NCBI (Centrul National pentru Biotehnologie Information).

Bază de date. Domeniul conservat a fost identificat in secvențe prin Clustal W2 și primele proiectate folosite a fost Primer 3 plus Software.

Primele secvențe primerilor prezentate în tabelul 1

Extracția ADN-ului genomic și reacția în lanț a polimerazei (PCR)

Genomic DNA extras prin metoda lui Edward et al., 13 cu putin prin amplificarea genei modificata.14 PAL a fost realizată prin PCR folosind primele specificari de gene (Tabelul 1).

Reacțiile PCR au fost efectuate cu un start fierbinte la 940 C pentru 5min.

Condițiile de reacție sunt prezentate în tabelul 2.

Produsele PCR au fost supuse la 1,5 % (g / v) gel de agaroză.

Electroforeza la tensiune constantă și se colorează cu etidium bromură de (EtBr) și vizualizate utilizând sistemul de documentare Gel (BioRad Molecular Imager, GelDoc XR, Milano, Italia).

Produsul PCR a fost secvențiat și supus GenBank.

Extracția ARN total și transcripție inversă PCR (RT)

ARN-ul total a fost extras utilizând Qiagen RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,New Delhi, India) în conformitate cu instrucțiunile producătorului.

Puritatea și integritatea ARN au fost verificate.

La determinarea modelului expresiei genei PAL la ARNm nivelul, RT-PCR a fost efectuată cu primeri specifici de genă (Tabelul 1) folosind Qiagen One Step Kit RT-PCR.

Fiecare amestec de reacție conține 2 pg ARN total. Condițiile de reacție sunt prezentate în Tabelul 3.

Produsele RT-PCR au fost rulate pe 1,5 % gel de agaroză și se colorează cu EtBr și vizualizate în sistemul de documentare cu gel BioRad.

Profilul relativ de exprimare a ARNm a fost analizată densitometric din intensitatea banda gelurilor cu ajutorul software-ului ImageJ.

Profilul de exprimare a fost comparat cu controlul endogen (Β-actina).

Analiza HPLC

HPLC a fost realizată într-o serie HPLC Shimadzu Prominence

Sistemul (Phenomenex, Torrance, CA) este echipat cu detector UV.

Separarea a fost realizată utilizând o coloană Luna C18 5 RP (250 dimensiune a particulei x 4,6mm; Fenomenex).

Faza mobilă a fost compusa dintr-un sistem de gradient de doi solvenți: soluție A (apă-acid fosforic-metanol (grad HPLC, Merck, Germania),89,7: 0,3: 10 (v / v / v)); și soluția B (acetonitril).

Soluție a fost filtrată cu un filtru de 0,2 um (Acrodisc, India) și se păstrează la -200 C până la utilizare.

Debitul a fost setat la 1mLmin-1 și fiecare probă a fost administrata timp de 20 de minute.

Coloana a fost menținută la o temperatură de 25 ± 20 C.

Concentrațiile de fenolic constituenți au fost determinate din curbele standard, cu privire la compușii fenolici standard, prin compararea cu retenție timp la lungimi de undă specifice.

Acidul galic, acidul clorogenic, acidul cumaric, acidul cafeic, acidul cinamic, rutin și quercetinwere utilizate ca standarde (Sigma) au fost analizate la lungimi de undă specific ,de 270,15 325,16 340,17 321,18 270,19 35020 și 370 nm, 20 respectiv.

Testul total de antioxidant

Metoda de testare phosphomolybdenum, descrisă de Prieto și colab., 21 a fost utilizata pentru a studia activitatea antioxidantă a extractelor din plante.

Testul se bazează pe reducerea Mo (VI) -Mo (V) de către extracte și formarea ulterioară a unui fosfat-Mo (V) verde complex, la un pH acid de absorbție maximă la a da 695 nm.

Extractele etanolice din fiecare probă (0,3 ml) au fost amestecate cu 3 ml soluție de reactiv (0,6 mol L-1 acid sulfuric (Merck, Germania), 28 mmol fosfat L-1 de sodiu (Merck, Mumbai, India) și 4 mmol L-1 molibdat de amoniu (Himedia, Mumbai, India).

Amestecul de reacție a fost incubat la 95°C timp de 90 min și absorbanța a fost luată la 695 nm împotriva soluției de reactive fără nici un fel de extract).

Activitatea antioxidantă a fost exprimată în grame de echivalent acid ascorbic (AAE) per kilogram FW calusului prin compararea cu calibrarea de acid ascorbic.

Curba de calibrare a acidului ascorbic a fost preparat prin luarea a 0-200 μgmL-1 acid ascorbic etalon (Sigma Aldrich) concentrații.

Testul de captare a radicalilor DPPH

Testul de captare a radicalilor DPPH a fost realizată în conformitate cu metoda de brand-Williams și colab. cu unele modificări.

DPPH este un radical liber stabil, de culoare roșie.

Antioxidanții reacționează cu DPPH și reduce la DPPH-H, care este de culoare galbenă.

Gradul de potențialul indică decolorarea de absorbție a referinței antioxidante la capacitatea lor de donor de hidrogen.

Soluția stoc de DPPH a fost preparată prin dizolvarea a 24 mg DPPH în 100 ml metanol și se depozitează la -20° C până la -100C utilizare.

Soluția de lucru a fost obținuta prin amestecarea a 10 ml soluție stoc cu 45 ml de metanol.

Fiecare probă a fost lăsată să reacționeze cu 2.850 ml soluție de DPPH și se menține timp de 1 oră la întuneric.

Absorbanța a fost făcută la 517 nm.

Acumulare de polifenol in timpul vitro Cultura în călușului în Plantago ovata Forsk

Tabelul 2. Condițiile de PCR al genelor PAL

Tabelul 3.Condițiile PCR RT-PCR

Capacitatea de antioxidant a fost calculată folosind următoarea formulă:

DPPH activitate = radical de eliminare (Control – Proba) / A de control

× 100 %

unde controlul este absorbanta controlului (fără nici un extract) și o probă este absorbanta extractului.

Măsurarea peroxidării lipidelor

Metoda descrisă de Heath și Packer23 a fost luată și modificata pentru a estima peroxidarea lipidelor.

Cantitatea de malondialdehidă (MDA) – substanța reactivă de acid tiobarbituric (TBARS) produsa a fost estimata pentru a studia peroxidarea lipidelor.

Tesuturile calus din fiecare probă au fost zdrobite în 0,1 ml de 0,1% (W / v) de acid tricloracetic (TCA, SRL) și se centrifughează la 15 000 rpm pentru 10min.

Supernatantul (1ml) a fost colectat și amestecat cu acid 4mL TCA-tiobarbituric soluție (TBA) conținând 0,5% (W / v) TBA (SRL) în 20% TCA (g / v).

Amestecul a fost încălzit la o baie de apă care fierbe timp de 30 minute și apoi s-a răcit rapid pe gheață.

Absorbanța la 532 nm a fost înregistrată față de un martor (TCA-TBA soluție) și corectată pentru absorbția de bază non-specifică la 600 nm.

Cantitatea de peroxidarea lipidelor a fost exprimată ca echivalenți MDA în micromoli per litru per gram FW.

Coeficientul de extincție MDA este de 155 mmol L-1 cm-1.

Analize statistice

Toate rezultatele experimentale au fost reprezentate de o valoare cu medie ± standard de eroare a mediei (SEM).

Datele au fost analizate printr-o analiză a variantei (ANOVA) și mijloacele au fost comparate prin testul t al lui Student folosind KyPlot (versiunea 2.0).

Toate experimentele au fost triplicate.

Diferențele în datele de la P ≤0.05 au fost considerate statistic semnificativ.

REZULTATE

Determinarea conținutului total de polifenol

Conținut total de polifenol al călușului

În acest studiu, conținutul total de polifenoli a fost determinat în timpul diferitelor stadii de cultură în vitro calus în P. ovata (Fig. 1 a).

Sa observat că în timpul fazei inițiale (primul pasaj) din țesuturi calogenesis s-a acumulat o cantitate relativ mică de polifenoli (0,11 ± 0,005 g GAE kg-1 FW). Cu toate acestea, o treptată de creștere în conținutul de polifenol a început al doilea pasaj constituit din cultura călușului ,cea mai mare sumă a fiind observată în călușul celui de al treilea pasaj (0,25 ± 0,01 g GAE kg-1 FW).

La a patrulea pasaj, conținutul total de polifenol a scăzut brusc (0,19 ± 0,006 g GAE kg-1 FW).

Conținut total de polifenol în aditiv suplimentat călușului

Caracteristicile superioare conținutului de polifenoli prin aditiv suplimentari s-au realizat cu al treilea pasaj al călușului, deoarece călușul celui de al treilea pasaj s-a dovedit a fi îmbogățit maximal cu polifenoli (0,25 ± 0,01 g GAE kg-1 FW).

CH și CW au fost utilizate ca aditivi externi.

Aditivii îmbunătățiti în mod eficient au fost acumulati de polifenol în țesuturi calus (Fig. 1b, c).

Toate trei concentrațiile de CH și CW au fost eficiente pentru îmbunătățirea capacității acumulare de polifenol în P. ovata călușului.

Cu toate acestea, 2 g L-1 CH și 5% CW au arătat cea mai mare eficacitate în sporirea conținutului de polifenoli.

Valoarea totală de probe de polifenol în 2 g L-1 CH- și 5% CW-tratați au fost 0,32 ± 0,003 și 0,39 ± 0,007 g GAE kg-1 FW, respectiv.

O concentrație mai mică de polifenol CH (1 g L-1), a îmbunătățit conținutul dar într-o măsură mai mică (0,28 ± 0,004 g GAE kg-1 FW).

Pe de altă parte, o scădere semnificativă a polifenolului total (0,3 ± 0,004 g GAE kg-1 FW) a fost observată la 3 g L-1 CH-tratate calus.

O tendință inversă a fost găsită în cazul CW, care a arătat o scădere treptată a conținutului total de polifenol cu ​​creșterea concentrație CW.

Cantități de polifenol totale în 10 % și calus 15 % CW-tratate au fost 0,35 ± 0,005 g GAE kg-1 FW și 0,33 ± 0,007 pg GAE kg-1 FW, respectiv, care au fost mult mai mici comparativ cu 5 % calus tratați cu CW (0,39 ± 0,007 g GAE kg-1 FW).

Comparație între conținutul total de polifenol retragere și calusul

În acest studiu, conținutul total de polifenoli a fost determinat în timpul diferitelor stadii de cultură în vitro de calus în P. ovata și în comparație cu conținutul total de polifenoli de țesut P. ovata.

Sa observat că conținutul de polifenoli în faza inițială a formării călușului a fost mai mică decât cea a retragerilor, dar, pe măsură ce vârsta calusului a crescut conținutul de polifenoli a țesutului de calusu a fost îmbunătățită și a fost mai mult în al doilea, pasajul al treilea și al patrulea de calus în comparație cu cea de retrage (Fig. 2).

Determinarea conținutului total de flavonoizi

Conținut total de flavonoizi al călușului

Ca și polifenoli, de asemenea, conținutul în flavonoide a crescut cu vârsta călușului până la al treilea pasaj, dar cel de-al patrulea pasaj suma de flavonoid brusc a scăzut la o valoare de 0,65 ± 0,02 g RE kg-1FW (Fig. 3a).

În stadiile inițiale alecolagenoze , suma flavonoizilor în prima și al doilea pasaj de calus a fost de 0,26 ± 0,05 și 0,51 ± 0,07 g RE kg-1 FW, respectiv.

A treia trecere a călușului a acumulat cea mai mare cantitate de flavonoidă (0,75 ± 0,07 g RE kg-1 FW).

Agregarea flavonoid în țesutul călușului a urmat o structură similara tendinței cu cea a polifenolilor.

Figura 1.

Conținutul total de polifenoli în P. ovata în timpul culturii în vitro călușului:

(A) conținutul de polifenoli din extract de calus în diferite stadii ale culturii;

(B) Efectul CH asupra acumulării de polifenol în timpul culturii in vitro a călușului

P. ovata; (C) efectul CW asupra acumulării de polifenol in timpul in vitro a călușului in cultura P. ovata.

Date sunt reprezentate asmenea ± cu eroarea standard.

Asteriscurile indică niveluri de semnificație: * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.

Conținut total de flavonoizi în aditivi suplimentat călușului

Călușul la a treia trecere a fost luată pentru tratamentul cu aditivi.

Determinarea conținutului total de flavonoizi a relevat o creștere dependentă de concentrație în cantitatea de flavonoizi, în cazul ambelor CH și CW (fig. 3b, c).

La o concentrație mai mică CH (1 g L-1), creșterea conținutului de flavonoizi s-a dovedit a fi foarte putina.

O creștere bruscă a conținutului de flavonoizi la 2 g L-1 CH concentrația indica efectul pozitiv al CH în îmbunătățirea flavonoidelor.

Cantitatea de flavonoidă totală a fost găsită

Pentru a fi de 1.13 ± 0,09 g RE kg-1 FW în 2 g L-1 călușului CH-tratat. CH la 3 g concentrație L-1 a fost mai puțin eficace în inducerea flavonoidelor.

Acumularea de 2 g L-1 concentrație CH.

În călușul tratat cu CW o scădere considerabilă a conținutului de flavonoizi a fost observată cu creșterea concentrației de CW.

Concentrația mai mică de CW (5%) indusă de producție maximă de flavonoizi este de (1,19 ± 0,09 g RE kg-1