Investigarea In Vivo a Mecanismelor Apărării Antibacteriene Celulare Nespecifice

Cuprins

Introducere

Sistemul imunitar reprezintă un ansamblu de interacțiuni complexe dintre diferite organe și structuri specializate din organism și are rolul de a proteja organismul de acțiunea microorganismelor patogene.

Mecanismele celulare antiinfecțioase sunt reprezentate de următoarele: sistemul fagocitar mononuclear (macrofagele) cât și sistemul fagocitar polimorfonuclear (în această lucrare vor fi prezentate atât neutrofilele cât și eozinofilele), celulele dendritice, celulele Natural Killer (NK) și nu în ultimul rând imunitatea celulara antiinfecțioasă reprezentată de: imunitatea antibacteriană, imunitatea antivirală, imunitatea antifungică și imunitatea antiparazitară.

În partea experimentală se va urmări acțiunea sistemului imunitar in vivo, prin injectarea unor animale de laborator cu suspensie bacteriană de tulpini de Stapylococcus aureus. Ceea ce se investighează în urma injectării animalelor de laborator este dacă sistemul imunitar va acționa într-un timp scurt și dacă în urma analizelor frotiurilor realizate din lichid intraperitoneal și organe vor fi observate elemente ale sistemului imunitar celular nespecific, în special macrofage.

Scopul lucrării este de a rezuma din punct de vedere teoretic modul în care mecanismele celulare antiinfecțioase acționează pentru protejarea organismului și de a investiga din punct de vedere practic acțiunea macrofagelor in vivo în cadrul unei infecții experimentale cu S. aureus.

Capitolul 1 – Aspecte teoretice

Sistemul imunitar este constituit dintr-o rețea coordonată și perfect integrată, în care celulele și moleculele organismului interacționează pentru a-i asigura o cât mai eficientă imunitate antiinfecțioasă.

Sistemul fagocitar mononuclear

Sistemul fagocitar mononuclear, ce oferă protecție împotriva infecțiilor este alcătuit din celule care înghit și digeră bacterii sau alte substanțe străine organismului. Supresia acestui sistem poate afecta eficacitatea acestuia de a curăța organismul de bacterii.

Macrofagele

Macrofagele, cele mai plastice celule ale sistemului hematopoietic se găsesc în toate țesuturile și manifestă o foarte mare diversitate funcțională. Acestea au rol în dezvoltarea organismului, în homeostazie, în repararea țesuturilor cât și în imunitate.

La mamiferele adulte, macrofagele se găsesc în toate țesuturile, unde manifestă o foarte mare diversitate anatomică și funcțională. În țesuturi sunt organizate în tipare bine definite, în care fiecare celulă ocupă locul ei, un fel de țesut într-un țesut.

Macrofagele adulte sunt definite ca celule aflate în stadiul final de dezvoltare, aparținând liniei sistemului mononuclear fagocitar, cu macrofage tisulare ce provin din monocitele circulante care își au originea în măduva osoasă. Totuși se cunoaște faptul că macrofagele au avut câteva origini de-a lungul ontogeniei și fiecare dintre acestea se regasește la maturitate unde manifestă o mare diversitate (Thomas A. Wynn și colab. 2013).

Macrofagele au rol important atât în homeostazie cât și în patologie și sunt caracterizate de o înaltă heterogenitate funcțională. Diferențierea, proliferarea și supraviețuirea majorității populațiilor de macrofage sunt dependente de un factor numit factorul 1 stimulator de colonii (CSF-1). Macrofagele obțin diferite forme fenotipice și funcționale pentru a răspunde citochinelor locale și a semnalelor microbiene, astfel rezultând clasificarea în M1 Și M2 a macrofagelor.

Macrofagele activate clasic (M1) mediază apărarea gazdei de diferite bacterii, protozoare și virusuri și au rol în imunitatea antitumorală. Macrofagele activate alternativ (M2) au acțiune antiinflamatoare și intervin în repararea și remodelarea tisulară ( Kylie A. Alexander și colab., 2014).

Macrofagele rezidente reglează homeostazia tisulară manifestându-se ca niște santinele și făcând față schimbărilor fiziologice cât și provocărilor venite din exterior.

În timpul reglării homeostatice, macrofage din fenotipuri diferite, pot de asemenea fi recrutate din rezervele de monocite din sânge, splină și măduva osoasă, chiar din progenitori tisulari rezidenți sau prin proliferare locală. Din păcate, în multe dintre cazuri, aceste funcții homeostatice și reparatorii, pot fi subminate prin insulte continue ce rezultă din asocierea macrofagelor cu stagiile bolii, cum ar fi fibroza, obezitatea și cancerul. Macrofagele reprezintă o serie de celule incredibil de diversificate, ce își schimbă constant statutul funcțional în funcție de schimbările fiziologice ale țesuturilor sau de provocările din mediul înconjurător (Thomas A. Wynn și colab. 2013) .

Recent, a devenit evident faptul că cele mai multe macrofage tisulare adulte provin din dezvoltarea embrionară și nu din monocitele circulante. Fiecare țesut are propria compoziție de macrofage derivate de la embrion și de la organismul adult, dar încă este neclar faptul că macrofagele cu origini distincte sunt din punct de vedere funcțional interschimbabile între ele sau au roluri unice. Intrigant este faptul că s-a descoperit că macrofagele tisulare ce au origini ontologice diferite coexistă și evaluate ca un grup, acestea au funcții specializate specifice organelor.

Unul dintre cele mai interesante lucruri legate de funcția macrofagelor este reprezentat de implicarea acestora în repararea și regenerarea tisulară. Este cunoscut faptul că ficatul este cel mai bine reprezentat organ adult de la mamifere capabil să se regenereze în urma secționării sau a rănirii. În urma unei răniri, macrofagele din ficat devorează debriurile din hepatocite și activează un program ce conduce la activarea unor liganzi, ceea ce direcționează formarea hepatocitelor din progenitori (Kylie A. Alexander și colab., 2014).

Pe parcursul gestației timpurii, macrofagele sunt primele observate și se extind în sacul extraembrionar vitelin în timpul așa numitei hematopoieze primitive. La acest stadiu al dezvoltării, macrofagele sunt singurele celule albe produse deoarece din progenitorii restricționați din sacul vitelin ies doar macrofage și celule roșii ale sângelui. Această diversitate limitată hematopoietică de celule este o rămășiță a sistemului imun de la Drosophila, și un indicator al conservării originii descendenței macrofagelor derivată din sacul vitelin. Potrivit cu rolul de reparare tisulară pe parcursul dezvoltării, s-a observat că macrofagele nou-născuților sunt utile pentru repararea cardiacă, după infarctul miocardic neonatal. După o rănire cardiacă, macrofagele neonatale, au fost recrutate pentru angiogeneză, fiind asociate cu un răspuns inflamator mai puțin viguros, când au fost comparate cu macrofagele dintr-o inimă adultă rănită (Slava Epelman și colab, 2014).

Macrofagele sunt prezente ca celule rezidente în țesutul adipos, iar monocitele din sânge sunt necesare într-un număr mare în locuri în care se acumulează lipidele în ateroscleroză, o formă modificată de inflamare a peretelui arterial.

Monocitele și macrofagele mature sunt proeminente în răspunsul gazdei la acumularea de lipide din arterele principale, în dezvoltarea plăcilor aterosclerotice și a complicațiilor acestora. Studii au demonstrat că un subgrup de monocite ce exprimă nivele mari de marker antigen domină în hipercolesterolemia asociată monocitozei ceea ce duce la o creștere de macrofage în ateroame.

Macrofagele încărcate cu lipide, au un rol esențial în patogeneza și repararea plăcilor aterosclerotice. Macrofagele sunt de asemenea implicate în vulnerabilitatea plăcilor la rupere cât și la formarea trombusului. Odată prezente în țesut, macrofagele mature prezintă un alt nivel de heterogenitate.

Dezactivarea macrofagelor este în mod egal complexă și caracterizată de o parțială și distinctă suprapunere a semnăturilor de exprimare a genelor . S-a manifestat un interes crescut în observarea posibilelor interacții dintre macrofage și adipocite ce implică citochine cum ar fi leptina, adiponectina și a efectelor acestora cât și al altor mediatori paracrini în răspunsul și semnalizarea insulinei ( Siamon Gordon, 2007).

Acumularea colesterolului în macrofagele încărcate cu lipide este un rezultat al aportului de apoBlipoproteine reținute și modificate ( Williams și colab., 1998).

Deși era de mult cunoscut faptul ca HDL și apolipoproteinele sale pot stimula ieșirea colesterolului din macrofagele spumoase (Oram și colab.,1981. ) și să reducă aterogeneza în cazul animalelor utilizate ca modele (Rubin și colab.,1991), aceast domeniu de cercetare a fost animat de elucidarea unui defect genetic în boala Tangier. Aceasta este o maladie în care există un defect al efluxului de colesterol mediat de apolipoproteine (Francis și colab.,1995) iar marcajul patologiei este reprezentat de acumularea de macrofage încărcate cu lipide în diferite țesuturi.

Sistemul fagocitar polimorfonuclear

Sistemul fagocitar polimorfonuclear are o acțiune asemănătoare cu cea a sistemului fagocitar mononuclear, și anume are rolul de a curăța spațiul extracelular de celulele nedorite. Acest sistem îl completează pe cel mononuclear prin faptul că intervine acolo unde acesta nu a putut face față.

Neutrofilele

Neutrofilele polimorfonucleare (PMN) reprezintă cea mai mare clasă de globule albe sanguine și primul tip de leucocite preluat la locurile inflamate. Se înțelege că neutrofilele au un rol important în lupta împotriva patogenilor prin faptul că trimit molecule antimicrobiene și intermediari de oxigen reactiv (Nathan C, 2006). Se cunoaște faptul că neutrofilele sunt foarte abundente în sistemul nervos central în timpul unei neuroinflamații cât și nespecifitatea componentelor citotoxice derivate din neutrofile, astfel s-a speculat că acțiunea antiinfecțioasă a neutrofilelor în apararea gazdei poate media distrugerea țesuturilor. Răspunsul inflamator este un proces complex care include producerea de mediatori antiinflamatori proveniți de la gazdă cât și apoptoza neutrofilelor. Astfel funcția neutrofilelor infiltrate poate fi reglată de celulele imune locale înăscute.

Neutrofilele reprezintă un component esențial al răspunsului inflamator acut la acțiunea patogenilor, în mod particular împotriva bacteriilor extrcelulare ce se găsesc pe suprafețele mucoaselor ( Kolaczkowska E, Kubes P. 2013). În mod obișnuit fiind primul dintre leucocite recrutat la locul de infecție, neutrofilul exercită o potentă activitate bactericidă, împiedicând propagarea microbiană de la barierele epiteliale și inhibă transmisiile bacteriene dintre gazde. Așa cum înțelegerea biologiei neutrofilelor a evoluat, acum este cert faptul că această capacitate bactericidă a neutrofilelor este reglată dinamic și local la locurile inflamate (Christopher B. Hergott și colab. 2015).

Streptococcus pneumoniae, a fost printre primii patogeni pentru care mecanismele de evaziune a neutrofilelor au fost propuse. Ca și cauză principală a pneumoniei bacteriene gram pozitive, a septicemiei și a meningitei, streptococul este răspunzător de 1 milion de morți anual, în lumea întreagă și se estimează că ar fi responsabil de peste 100 000 de spitalizări în Statele Unite, anual (Griffin MR și colab. 2013). Toate infecțiile cu pneumococi încep cu colonizarea asimptomatică a căilor superioare respiratorii, iar cu ajutorul studiilor clinice s-a observat că progresul de la un transport benign la o infecție invazivă se realizează de obicei în câteva zile de la infectarea căilor aeriene superioare. Acest lucru coincide cu vârful influxului de neutrofile în lumenul căilor aeriene și implică faptul că interacțiile dintre pneumococ și neutrofil în căile superioare stabilesc un echilibru între curățare și boală. Rezistența pneumococilor la neutrofile a fost pusă pe seama capsulei polizaharidice groase care-i servește ca un scut bacteriei la opsonizare sau pentru anticorpi care ar grăbi absorbția fagocitică (Christopher B. Hergott și colab. 2015).

Recrutarea leucocitelor în inflamații este necesară pentru apărarea gazdei, dar o acumulare excesivă a celulelor inflamatorii poate conduce la distrugerea țesuturilor. Serin proteazele derivate din neutrofile, cum ar fi : catepsina G (CG), neutrofil elastaza (NE) și proteinaza 3 (PR3) sunt exprimate specific în neutrofilele mature și se consideră că au un rol important în inflamații. Totuși enzimele proteolitice eliberate de neutrofile degradează componentele matrixului extracelular ducând la distrugerea tisulară cât și la inflamații cronice. Cu toate acestea, prevenirea migrării neutrofilelor și a acumulării acestora la locurile inflamate poate să le limiteze funcțiile ce produc distrugerea gazdei ( April M. Adkison si Colab., 2001).

Neutrofilele polimorfonucleare au un rol important în apărarea gazdei împotriva patogenilor proveniți din bacterii. Polimorfonuclearele eliberează un număr de proteaze ce sunt implicate în apărarea gazdei și de asemenea sunt capabile de acțiune bactericidă. De asemenea enzimele proteolitice secretate de PMN degradează componentele matrixului extracelular, conducând la degradarea țesutului și la inflamație cronică. De exemplu, PMN sunt caracteristica evidentă a inflamației comune în artrita reumatoidă, fiind considerate responsabile pentru distrugerea cartilajului în această boală. Prevenirea migrării PMN și adunarea la locurile inflamate ar putea limita funcțiile efectorilor acestora de distrugere a gazdei. PMN exprimă o familie de serin proteaze neutre în granulațiile lor azurofile. Aceste enzime specifice asociate granulațiilor PMN includ CG, NE, PR3. O altă proteină asociată de granulații legată structural este azurocidina, care nu are activitate enzimatică. Unele studii au evidențiat faptul că serin proteazele eliberate extracelular rămân catalitic active și pot modula recrutarea neutrofilelor. Inhibarea serin proteazelor derivate din PMN a demonstrat că reduce adeziunea PMN la numeroase suprafețe extracelulare acoperite de matrix și la straturile endoteliale ex vivo. La locurile inflamate, serin proteazele coincid temporar cu concentrații mari de citochine bioactive. Din acest lucru rezultă că serin proteazele derivate de la PMN ar putea controla procesul inflamator prin modificări proteolitice și prin eliberare de citochine (April M. Adkison și colab. 2002).

Moartea celulară programată este un termen larg, care cuprinde apoptoza, autofagia, moartea celulară programată mediată lizozomal și necroptoza. Moartea constitutivă a neutrofilelor este o formă de moarte celulară programată ce are un rol esențial în modularea homeostaziei neutrofilelor, în control și care este în mod normal înalt reglată pentru o echilibrare corectă a funcției imune cât și o curățire sigură. Moartea dereglată a neutrofilelor este implicată într-o serie de patologii inflamatorii, imunologice și infecțioase. Neutrofilele suferă o moarte constitutivă chiar în absența unor stimuli extracelulari ceea ce indică faptul că există o moarte programată spontană. În timp ce moartea spontană a neutrofilelor oferă atâtea caracteristici distinctive față de apoptoza clasică, posedă și câteva caracteristici unice, cum ar fi moartea rapidă, independența față de factorii de ser, ceea ce sugerează că moartea neutrofilelor este reglată de o rețea de semnalizare unică (Fabien Loison și colab. 2014).

S-a observat faptul că apoptoza celulara este dependenta de un set de cistein proteaze denumite caspaze. Principalul efector caspazic este caspaza 3, care are un prodomeniu scurt și execută apoptoza după proteoliză, cu ajutorul caspazelor inițiatoare, caspaza 8 și caspaza 9. Caspaza 3 există ca o proenzimă inactivă de 32 kDa, procaspaza 3, cunoscută și sub denumirea de zimogen, care suferă procese proteolitice, la resturile conservate de aspartat, pentru a se produce o subunitate mare de 17 kDa și o subunitate mică de 12 kDa, ce dimerizează, pentru a forma enzima activă. Caspaza 3 se activează în timpul apoptozei neutrofilelor fiind necesară pentru moartea spontană a acestora (Fabien Loison și colab. 2014).

Fagocitoza multor bacterii de către PMN umane normale, are ca finalitate moartea microorganismelor. Generarea metaboliților oxidativi și eliberarea conținutului granulelor din ambele tipuri de granule, specifice și primare în fagozomi în timpul fagocitozei sunt responsabile de uciderea organismelor captate de PMN. Aceleași substanțe sunt eliberate în mediul extracelular de către PMN în timpul fagocitozei și în timpul interacției cu stimuli nefagocitozomali. Această eliberare de substanțe extracelular a fost utilizată în studii in vitro pentru deteriorarea sau chiar distrugerea fungului Candida albicans de către PMN, pentru distrugerea celulelor tumorale de către PMN și s-a presupus ca acestea să aibă un rol în câteva tipuri de răniri tisulare mediate imun (Peter Densen și Gerard L Manden 1978).

Eozinofilele

Eozinofilele sunt leucocite granulare, descoperite inițial de Heinrich Caro în 1874 și descrise de către Paul Ehrlich în 1879 (Kay, 2014). Acestea reprezintă aproximativ 1-4 % din totalul de globule albe circulante și se disting fenotipic prin nucleii bilobați și prin acidofilia mare a granulelor citoplasmatice (Rosenberg și colab., 2007).

Eozinofilele derivă din celele progenitoare stem hematopoietice pluripotente, CD34+, ce se găsesc în mod normal în măduva osoasă. Diferențierea apare în fazele timpurii sub influența unui factor stimulator de colonii de granulocite-monocite (GM-CSF) si interleuchina 3 (IL 3), iar în fazele târzii ale acesteia, sub influența IL 5. (Denburg, 1998). Eozinofilele mature sunt eliberate din măduvă în circulație, acest lucru făcându-se initial sub acțiunea IL 5. Eozinofilele sunt transformate de la starea pasivă la starea de hipersensibilitate de către IL 3, IL 5, și GM-CSF ( Luijk și colab., 2005).Procesul initial nu activează în totalitate celula dar îi crește sensibilitatea la chemotaxie, degranulare și producerea de citochine (Fulkerson și Rothenberg, 2013).

Eozinofilele au patru proteine de bază specifice : proteina de bază majoră (MBP), proteina cationica eozinofilă (ECP), eozinofil peroxidaza (EPO) și neurotoxina derivate eozinofilă (EDN), care sunt păstrate în granulele secundare. S-a descoperit că ECP atacă membrana celulară, alterându-i permeabilitatea, dar și crește producția de specii reactive de oxygen. (Navarro și colab., 2008).

MBP produce liza celulei epiteliului alveolar, permițând pătrunderea antigenelor inhalate. (Ayars și colab., 1985). Combinate, aceste granule au efect citotoxic și distrug bariera epitelială pulmonară protectivă, permițându-le unor răspunsuri inflamatorii ulterioare să apară. (Frigas și colab., 1991). Inflamarea eozinofilică dirijată de către sensibilizarea alergică și răspunsul imun mediat de limfocitele T helper 2 (Th2) este un marcaj al unei infamații de-a lungul traseului aerului în astm. Cu toate acestea, inflamația eozinofilică poate apărea independent de alergie, iar prezența unei astfel de inflamații nu afecteaza dezvoltarea astmului (Eltboli, O., Brightling, C. ,2013).

Eozinofilele au fost de asemenea caracterizate de abilitatea de a stoca mediatori preformați, așa cum sintetizează și secretă citochine pro-inflamatorii, chemochine și factori de creștere incluzând: IL 2, IL 3, IL 4, IL 5, IL 10, IL 12, IL 13, IL 16, IL 25, factor tumoral de necroză, transformarea factorilor de creștere α/β (TGF) (Davoine și Lacy, 2014).

Eozinofilele sunt rezidente în numeroase organe, cum ar fi tractul gastrointestinal, glandele mamare și măduva osoasă și pot avea roluri în homeostazia imună și tisulară a acestor organe. În răspunsul imun mediat de leucocitele Th2, eozinofilele sunt recrutate la locurile inflamate, unde produc o mulțime de citochine și de mediatori glucidici și eliberează granule proteice toxice. Aceste molecule pot regla răspunsurile imune, să provoace deteriorări tisulare, cât și facilitarea reparării țesuturilor. Eozinofilele pot fi prezentatoare de antigene la celulele T de memorie și cele naive și inițiază sau amplifică răspunsul imun antigen specific

Ciclul de viață al eozinofilelor este împărțit între măduva osoasă, sânge și fazele tisulare. Eozinofilele sunt produse de către celulele stem pluripotente din măduva osoasă. Celulele stem se diferențiază dintr-un progenitor care este capabil să crească diverse colonii de bazofile și eozinofile, colonii pure de bazofile, sau colonii pure de eozinofile. Producerea de eozinoifile include o cascadă de evenimente de reglementare interdependente care aparțin a cel puțin trei clase de factori de transcripție, incluzând GATA-1, PU.1 și membri C/EBP. În special PU.1 determină diferite destine din seria celulelor, cu nivele joase, ce induc celule limfocite, cât și mari nivele de diferențiere mieloidă. GATA-1 și PU.1 induc în mod sinergic diferențierea liniei eozinofilelor. Dintre acești factori de trancriere, GATA-1 este cel mai important pentru descendența eozinofilelor, deoarece a fost evidențiat faptul că la șoarecii cu deleția vizată a înaltei afinități a locului de legare al factorului GATA, este evidențiată o pierdere a activității eozinofilelor.

Printre alți factori hematopoietici, cei care sunt importanți pentru proliferarea eozinofilelor și pentru diferențierea acestora, sunt IL 3, factorul stimulator al coloniilor de macrofage granulare (GM-CSF) și IL 5. IL 3 și GM-CSF sunt nespecifice și stimulează proliferarea neutrofilelor, bazofilelor și eozinofilelor, pe când IL 5 stimulează specific producerea de eozinofile (Hirohito Kita, M.D.,2011).

Deși eozinofilele reprezintă elemente formate din circulația periferică, este o celulă, care în mod normal locuiește în țesuturi. La indivizii sănătoși, cele mai multe eozinofile se găsesc în intestin, în glandele mamare, uter, timus și măduva osoasă. Populația predominantă de eozinofile se găsește în tractul gastro-intestinal. La bază, eozinofilele sunt prezente în tractul gastro-intestinal independent de imunitatea adaptativă și flora interioară, iar nivelele de eozinofile sunt reglate de expresia constitutivă a eotaxinei-1 și a receptorului de chemochine eozinofilice (CCR3). Eozinofilele de asemenea sunt găzduite în timus, glandele mamare și uter, acest lucru fiind controlat de eoaxina-1. Eozinofilele au evoluat la menținerea integrității barierei epiteliale și sau apărarea înnăscută a gazdei în tractul gastro-intestinal. Alt rol al eozinofilelor la bază, poate include menținerea homeostaziei sistemului imunitar. Eozinofilele din timus exprima CMH de clasă I și molecule co-stimulatoare cum ar fi CD86 și CD30L. Eozinofilele din timus sunt pozitive pentru CD11b/CD11c și prezintă o expresie scăzută a CD62L iar o expresie crescută pentru CD25 și CD69, acest lucru sugerând faptul că eozinofilele au un fenotip activ. Aceste eozinofile pot fi incluse in deleția timocitelor restricționată de CMH de clasă I, datorită localizării anatomice a acestora în compartimentele discrete ale timusului, ce coincide cu selecția negativă a timocitelor dublu pozitive.

Un număr crescut de eozinofile timice, asociate cu corpi apoptotici, au fost descoperite în antigenul restricționat de la receptorul celulelor T la CMH de clasă I de la masculi transgenici de șoareci ce urmează un tratament cu anticorpi înrudiți. Eozinofilele au rol în menținerea pe termen lung a celulelor plasmei în măduva osoasă a șoarecilor. În măduvă, eozinofilele se găsesc împreună cu celulele plasmei. Eozinofilele susțin supraviețuirea celulelor plasmei prin secretarea unui ligand inductor al proliferării și IL 6, iar epuizarea eozinofilelor induce apoptoza în celulele plasmatice de termen lung din măduva osoasă. Numărul celulelor plasmei a scăzut la șoarecii cu deficit de eozinofile, acest defect fiind corectat prin restaurarea eozinofilelor (Hirohito Kita, M.D.,2011).

Eozinofilele au capacitatea de a procesa, de a internaliza și de a prezenta peptide antigenice, în contextul exprimării de suprafață a CMH de clasă II, capacitatea de a produce semnale co-stimulatoare pentru celulele T prin expresia de suprafață a moleculelor cum ar fi CD80, CD86 și CD40, cât și abilitatea de a interacționa fizic cu celulele T CD4+. Eozinofilele impulsionate de antigen, administrate intra-traheal șoarecilor, migrează spre drenajul ganglionilor limfatici, fiind în principal localizați în zonele celulelor T.

La oameni, deși eozinofilele circulante de la donatorii sănătoși sunt în general lipsite de expresia de suprafață a CMH de clasă II, le sunt induse exprimarea CMH de clasă II și a moleculelor co-stimulatoare, împreună cu o stimulare corespunzătoare a citochinelor și ulterior transmigrarea prin monostratul de celule endoteliale. Eozinofilele umane de asemenea exprimă constitutiv un ligand, ceea ce sugerează capacitatea acestora de a produce un semnal de polarizare pentru celulele T CD4+ naive (Hirohito Kita, M.D.,2011).

Celulele Natural Killer (NK)

Celulele NK sunt membri fondatori ai unui grup specializat de leucocite care recent au fost denumite celule limfoide înnăscute (ILC) ( Spits H si colab. 2013). ILC se deosebesc de limfocitele B și T prin faptul că le lipsesc rearanjările somatice ale imunoglobulinei și ale genelor receptorilor limfocitelor T. Se consideră că toate ILC provin dintr-un precursor al ILC comun.

Exista trei subclase de ILC și anume ILC1, ILC2 și ILC3 și sunt descrise pe baza expresiei diferite a factorilor de trencripție cheie cât și a profilelor funcționale diferite. Celulele NK fac parte din una din cele doua subclase de ILC1 iar caracteristicile lor de bază cuprind: producerea de citochine, mai ales interferonul gamma (IFNy) și o largă gamă de chemochine cum ar fi medierea complexului major de histocompatibilitate (CMH), citotoxicitatea celulară independentă sau anticorp dependentă (Jianhua Yu și colab.,2013). Aceste caracteristici le permit celulelor NK să supraviețuiască în organism în timpul căutării celulelor infectate cu patogeni sau celor maligne și să protejeze gazda prin omorârea directă a acestora cât și prin stimularea și recrutarea altor celule imune. NK sunt cunoscute pentru importanța lor într-o varietate de setări clinice, cum ar fi infecțiile virale, transplanturile de celule stem (SCT) și de organe, în timpul sarcinii și altele (Viviver E. Și colab. 2011).

Celulele NK umane , intră în limfocitele sângelui periferic în proporție de 5-15 % și de asemenea sunt prezente abundent și în măduva osoasă, ficat, uter, splină și plămâni, dar în cantități mai mici în țesuturile limfoide secundare (SLT), țesuturi limfoide asociate mucoaselor (MALT) și în timus. Ca toate populațiile de leucocite, celulele NK provin din auto-reînnoirea celulelor stem hematopoietice pluripotente care se găsesc în măduva osoasă.

Dezvoltarea celulelor NK este asemănătoare cu cea a altor leucocite, acestea trcând printr-o serie de diferențieri și maturări progresive. Astfel celulele NK se dezvoltă din celule stem hematopoietice derivate din măduva osoasă, printr-un progenitor limfoid comun (CLP), capabil să dea naștere tuturor subclaselor de limfocite (Kondo M și colab. , 2001).

Celulele NK migrează din măduvă la ganglionii limfatici unde sunt activate în urma interacțiunii cu celulele dendritice. Interleuchina 15 este o moleculă esențială, care activează celulele NK mature. Celulele NK au roluri importante în sistemul imunitar înnascut și în sistemul imunitar adaptativ, prin mecanisme unice de activare pe parcursul apărării timpurii a gazdei contra virusurilor și tumorilor, prin utilizarea a două mecanisme : citotoxicitatea dependentă de contact și producerea de citochine pentru modularea sistemului imunitar. Apoptoza celulelor țintă e mediată de perforină și căile mediate de granzima B, iar reglarea răspunsului imun e mediată de secreția de citochine, cum ar fi interferonul-y și factorul de necroză tumorală α 1-3. Activarea celulelor NK este controlată de echilibrul dinamic dintre semnalele pozitive și negative asigurate de două mari tipuri de receptori ( Vivier E și colab., 2012)

În mod caracteristic, celulele NK prezintă o largă gamă de receptori, dintre care unii sunt mai degrabă specifici în exprimare. Aici sunt incluși receptori care induc atât semnale activatoare cât și inhibitoare iar activitățile celulelor NK de recunoaștere a țintei sunt accesate după ce balanța se înclină favorabil spre semnalele activatoare ( Lanier LL., 2008)

Activarea celulelor NK este controlată de o balanță dinamică dintre semnalele pozitive și cele negative oferite de către două mari tipuri de receptori. Acești receptori, NKG2D, NKp46, NKp30, NKp44, reprezintă forma activată a receptorului celulei ucigașe imunoglobulin-like (KIR) cunoscut ca KIR-S și CD16, care aduce semnale pozitive, țintele acestuia fiind citotoxicitatea și producerea de citochine. Unii dintre receptorii acestor celule de suprafață activatoare, stimulează căile dependente de protein tirozin kinaza, prin asociații reversibile cu adaptorii semnalizatori transmembranari. Această proteină adaptoare adăpostește motivele activării imunoreceptorului citoplasmatic, ce constau într-o secvență consens de aminoacizi cu tirozine și leucine împerecheate. Aceste motive sunt în mod normal localizate în domeniile citoplasmatice ale ligandului și receptorul transmembranar de legare cum ar fi receptorul celulelor T și receptorul imunoglobulinei E de mare afinitate, și mediază interacțiile dintre complexul receptorilor transmembranari și protein tirozin kinaze care sunt cerute pentru inițierea evenimentelor de semnalizare timpurii și târzii. Receptori de pe suprafața celulară suplimentari care nu sunt cuplați direct cu motive ale imunoreceptorilor bazate pe tirozină, de asemenea participă la activarea celulelor NK. Acestea includ NKG2D, care este bine asociat cu adaptorul de semnalizare transmembranar DAP10 cât și cu integrine și receptori de citochine. Descoperirea liganzilor NKG2D, sugerează că asemenea receptori recunosc molecule care sunt mai rar prezenți în celulele normale dar sunt stimulate în timpul infecțiilor sau a carcinogenezei ( Vivier E și colab., 2012).

Celulele NK exprimă de asemenea și receptori celulari inhibitori de suprafață care sunt în antagonism activând căi prin protein tirozin fosfataze. Receptorul tipic inhibitor, KIR, recunoaște moleculele self și aduce semnale negative pentru a suprima activarea celulelor NK, prin inhibiția căii stimulatorii de semnalizare. Ligandul pentru KIR este CMH de clasă I, moleculele self care sunt prezente la celulele normale. Acești receptori de suprafață inhibitori, sunt caracterizați prin motivele de inhibiție ale imunoreceptorului citoplasmatic bazat pe tirozină. După asocierea ligandului, motivele de inhibiție ale imunoreceptorului itoplasmatic bazate pe tirozină, sunt fosforilate la resturile acestuia de tirozină, fiind recrutate lipide sau tirozin fosfataze. Starea de tirozină fosforilată a diferitor componente de semnalizare care sunt substrate pentru protein tirozin kinaze cât și pentru protein tirozin fosfataze, care reprezintă molecule cheie pentru propagarea căilor efectoare ale celulelor NK. Citochinele reprezintă semnale importante pentru reglarea proliferării, supraviețuire, starea de activare și funcțiile efectorului sistemului imunitar ( Vivier E și colab., 2012).

Citochinele reprezintă semnale importante pentru reglarea proliferării, supraviețuirii, starea de activare, și funcțiile efectoare ale sistemului imunitar. Dezvoltarea celulelor NK ,supraviețuirea și funcțiile acestora necesită prezența citochinelor iclusiv a interleuchinelor IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 și IL-21 ( Romee R. Și colab.,2014). S-a dovedit faptul că IL 15 are un rol important în dezvoltarea celulelor NK și în pregătirea acestora pentru activare, studiile prin care s-au demonstrat acestea fiind realizate pe IL 15 sau pe observarea efectelor în lipsa receptorului pentru IL 15 de la șoareci.

Celulele canceroase și celulele sistemului imunitar comunică între ele și se influențează reciproc. Deși celulele sistemului imunitar pot inhiba creșterea celulelor canceroase, celulele tumorale pot evita această inhibare prin mecanisme imune de scăpare. Celulele Natural Killer elimină celulele canceroase prin secretarea de perforine și granzime. În momentul în care celulele NK iau contact cu celulele tumorale , acestea formează niște sinapse imune, cu ajutorul cărora trimit lovitura letală ( Suk Ran Yoon și colab., 2015).

Ca și la alte celule ale sistemului imunitar, funcțiile efectorului celular al majorității celulelor NK, necesită contactul direct celulă-celulă. Legarea celulelor țintă este acompaniată de formarea unui complex structural la interfața celulă-celulă, de obicei considerată sinapsă imună. S-a demonstrat că sinapsele imune ale celulelor NK sunt principalele locuri în care apare o înaltă reglare a activității complexului acestor celule. Sinapsa imună a celulelor NK este reprezentată de interfața dinamică formată dintre celule și țintele acestora. . Formarea sinapselor implică parcurgerea unor etape, pornind de la inițierea contactului cu celula țintă, până la trimiterea directă a componentelor granulei litice pentru liza celulelor țintă. Înaintarea prin aceste stadii este reglată, iar această reglare evidențiază precizia cu care celulele NK selecționează și omoară celulele țintă susceptibile, incluzând celulele transformate virale, sau celulele tumorale pe care le întâlnesc pe parcursul supraviețuirii în organism ( Vivier E și colab., 2012).

Celulele dendritice

Celulele dendritice au o importanță majoră în răspunsul imun, fac parte din sistemul imunitar înnăscut și joacă rol de santinele împotriva patogenilor la potențialele locuri de invazie. Odată ce au recunoscut patogenii, acestea îi prind și procesează respectivele structuri antigenice. Proteinele sunt transformate în peptide, care sunt ulterior prezente în moleculele complexului major de histocompatibilitate (CMH) și recunoscute de limfocitele T (R. M. Steinman și J. Banchereau, 2007).

Celulele dendritice provin dintr-un progenitor hematopoietic de celule (HPC) și contribuie la imunitate prin recunoașterea semnalelor patogene. În timpul activării, migrează de la periferie la ganglionii limfatici printr-un proces de maturare ( H. Ueno și colab., 2007).

Originea celulelor dendritice este în măduva osoasă, dintr-un progenitor mieloid comun (CMP). CMP se diferențiază în macrofage restricționate progenitoare de celule dendritice (MDP). MDP se ramifică pentru a crea doua descendențe de celule dendritice: monocitele și progenitorul comun de celule dendritice (CDP). Monocitele circulă la periferie și în timpul inflamațiilor se diferențiază în CD11c+, CD11b+, CMHII+ moDC. CDP se diferențiază în măduva osoasă în celule dendritice plasmocitoide și în pre-celule dendritice, care vor crește în celule dendritice convenționale în țesuturile periferice. Singurele celule dendritice care nu își au originea în măduva osoasă sunt celulele Langerhans. Subclasele Langerhans derivă dintr-un precursor mielocit local Ly6C+, din piele, care își are originea în macrofage, în timpul dezvoltării embrionare timpurii (Jacques Mbongue și colab.,2014).

Celulele dendritice sunt cele mai profesionale celule prezentatoare de antigene și au rol important în menținerea homeostaziei imune în organism. Acestea conduc la un răspuns imun în funcție de tipul de antigen pe care l-au preuat. În cazul în care gazda are nevoie de protecție împotriva unui patogen invaziv, celulele dendritice vin cu antigenele peptidice către celulele T CD8+ citotoxice și celulele T helper (Th1) CD4+ proinflamatorii, activându-se limfocitele prin contact direct (M. Moser și K. M. Murphy, 2000).

Celulele dendritice mature sunt imunogene. Ele sunt celule prezentatoare de antigene pe suprafață și inițiază și activează răspunsurile imune adaptative (Steinman, R. M. 2012).

Celulele dendritice imature au o slabă prezență a antigenului de suprafață cât și a abilităților celulelor T, ceea ce duce la o toleranță a celulelor T. Toleranța periferică mediată de celulele dendritice imature este cunoscută a fi indusă de către „tăcerea” unor celule T antigen specifice diferențiate (Steinman,R.M., și M. C. Nussenzweig. 2002).

S-a demonstrat că celulele dendritice parțial sau semi-maturate sunt de asemenea capabile să inducă toleranțe. Potențialul tolerogenic al celulelor dendritice semi-maturate ar putea fi asociat cu eliberarea citochinelor imunosupresive cum ar fi IL 10 (Voigtlander și colab., 2006).

Celulele dendritice reprezintă linia primară de apărare a organismului față de patogenii și de toxinele care îl invadează. Aceste celule recunosc și distrug bacteriile invadatoare, patogenii virali, fungici și protozoarele, cât și molecule străine care scapă din apărarea pasivă a organismului. Răspunsul celulelor dendritice comprimă secreția de TNF-α și de NO pentru a ajuta la curățarea de patogeni. Citochinele inflamatorii TNF-α se pot lega la receptorii de pe suprafața bacteriei Gram negative facilitând fagocitoza de către macrofage. Celulele dendritice pot activa celulele NK atât prin mecanisme dependente de contact cât și prin mecanisme independente de contact. Când sarcina patogenului devine excesivă celulele dendritice acționează întâi ca celule prezentatoare de antigen, migrând la splină sau la ganglionii limfatici periferci și trimițând porțiuni de patogeni la limfocite sau la sistemul imunitar adaptativ, în vederea amplificării răspunsului sistemului imunitar.

O conștientizare crescută a relației complicate dintre celulele dendritice și alte celule ale sistemului imun adaptativ sunt esențiale pentru înțelegerea modului în care este procurată și menținută homeostazia imunologică. La toleranța centrală, celulele dendritice rezidente în timus prezintă antigene pe CMH de clasă II, încrucișând prezenții receptori de antigene self de pe CMH de clasă I cu celulele T derivate din măduva osoasă pentru a stimula apoptoza potențialelor celule T autoreactive. S-a arătat că celulele dendritice periferice migrează la timus pentru a induce deleția clonelor celulelor T sau dezvoltarea celulelor T reglatoare.

S-a luat în considerare faptul că celulele dendritice au o mare contribuție pentru toleranța periferică prin ușurarea inducției sau păstrării celulelor T reglatoare periferice. Celulele dendritice au rol în inducerea autoimunității, reînnoind noțiunea că statutul de activare al celulelor dendritice este în mare parte responsabil de inducerea autoimunității sau a toleranței (Jacques Mbongue și colab.,2014).

Celulele dendritice convenționale sunt o subclasă înalt specializată, care își exercită eficiența în procesarea și prezentarea de antigen. Acest mare grup de celule dendritice poate fi introdus atât în categoria celulelor migratoare cât și în cea a celulelor tisulare rezidente. Celulele dendritice migratoare se dezvoltă din precursori atât în țesuturi liomfoide cât și nelimfoide, dar nu se găsesc în splină. După preluarea și procesarea antigenelor din țesuturile rezidente, celulele dendritice circulante migrează la drenarea periferică a ganglionilor limfatici, prin vasele limfatice aferente, pentru a le prezenta antigenele sechestrate celulelor T naive. La activare, durata de viață a tuturor subclaselor de celule dendritice, este relativ similară, opus față de durata în care celulele dendritice stau în țesuturi, în timpul stagiului imatur al acestora.

Subclasele de celule dendritice diferă în funcție de specializările acestora, care includ localizarea activității, profilele de citochine, tipurile de antigene detectate, migratoare, sau rezidente în țesuturi și prezența acestora în timpul homeostaziei imunologice sau a inflamației. Funcția comună a acestor subclase de celule dendritice este comunicarea semnalelor inflamatorii sau imunosupresive de-a lungul celulelor înăscute și adaptative, ale sistemului imunitar. Această funcție necesită parcurgerea a doi pași importanți. Primul este reprezentat de identificarea antigenelor. Al doilea pas este przentarea antigenelor de-a lungul semnalelor secundare corespunzătoare, necesare pentru inducerea unui răspuns adaptativ al celulelor T.

Celulele dendritice identifică patogenii prin intermediul modelelor moleculare asociate patogenilor (PAMP) sau a modelelor moleculare asociate deteriorărilor (DAMP). Cuprinzând molelcule comune de la o varietate de organisme, dar absente în gazdă, PAMP reprezintă semnale exogene către celulele dendritice pentru infecție. Spre exemplu, proteinele anvelopei virale și ADN ul de la virusuri, lipopolizaharidele și flagelina de la bacterii, zimosanul de la fungi și profilina de la Taxoplasma gondii, sunt PAMP care sunt recunoscute de receptorii specifici ai celulelor dendritice. DAMP reprezintă semnale de pericol endogene, din cadrul celulelor. Eliberarea de ATP, ADN sau acid uric, poate reprezenta un semnal de avertizare pentru celulele dendritice, pentru stres, invazie microbiană, sau moarte celulară prin necroză, ca în cazul cancerului. Celulele dendritice detectează PAMP și DAMP, cu ajutorul câtorva clase de receptori de suprafață sau intracelulari denumiți receptori de recunoaștere model (PRR) (Jacques Mbongue și colab.,2014).

Odată ce o celulă dendritică a întâlnit un antigen, procesează și transferă informația celulelor T. Celulele dendritice mature interacționează cu celulele T prin: CMH de clasă II al celulelor dendritice/ interacțiuni ale complexului antigen cu receptorii celulelor T, costimularea celulelor T CD 28 cu celulele dendritice CD86/ CD80 și citochinele celulelor dendritice semnalizează celulele T. Deoarece extinderea activării celulelor dendritice determină dacă interacția cu o celulă T va induce toleranță sau imunitate, prezentarea de antigen în prezența semnalelor inflamatorii, rezultă în imunitate, în timp ce prezentarea de antigene în timpul etapei echilibrate, după rezultă în toleranță. În timpul inflamației, celulele dendritice pot induce diferențierea celulelor T naive, sau activarea celulelor T de memorie. La maturarea celulelor dendritice, celulele T CD4 naive, se pot diferenția în celule de memorie și în celule efectoare Th1, Th2 și Th17 asociate cu autoimunitatea. Celulele T CD8 naive se diferențiază în limfocite T citotoxice și celule de memorie CD8. În timpul homeostaziei imunologice, interacțiunea celulelor dendritice cu celulele T, generează și menține o populație de celule Treg. În general, rolul celulelor dendritice în timpul dezvoltării autoimunității este de a induce diferențierea autoreactivă a celulelor T proinflamatorii CD4+ și CD8+ decât dezvoltarea celulelor Treg imunosupresive sau autoreglarea anergiei celulelor T (Jacques Mbongue și colab.,2014).

Imunitatea celulară antiinfecțioasă

Eficiența protecției antiinfecțioase, asigurată de sistemul imunitar, este reprezentată de o înaltă selectivitate a acestuia. Această selectivitate are o importanță deosebită în evoluție, la o populație naturală, alcătuită din indivizi eterogeni din punct de vedere genetic (Guido Biozzi și colab. 1984).

Imunitatea antibacteriană

Sistemul imunitar a evoluat pentru a proteja organismul de microorganismele infecțioase. Barierele fizice din piele, din sistemul gastro-intestinal și din tractul respiratoriu reprezintă o primă linie în apărarea organismului și în prevenirea invaziilor bacteriilor care colonizează suprafața corpului. Bacteriile care străpung barierele nu se confruntă doar cu o densă rețea de macrofage, localizate în țesuturile mucoase din piele, ci și cu macrofagele provenite de la ficat sau splină, care aduc o supraviețuire imună împotriva bacteriilor circulante din fluxul sanguin. Populațiile de celule fagocitare, cum ar fi granulocitele, monocitele și macrofagele rezidente în țesuturi sunt echipate cu modele de receptori de recunoaștere (PRR) a liniei de germeni codată, care detectează bacteria conducând la inducerea unui răspun imunitar înnăscut. PRR recunosc PAMP și DAMP care reprezintă stres celular, distrugere, sau moarte celulară ascociată infecțiilor.

Legarea și fagoitoza bacteriei urmată de inducerea inflamaței sunt importante pentru controlul macrofagelor asupra diseminării bacteriene în țesuturi sau sânge. Chiar după facgocitoză, unele bacterii cum ar fi Helycobacter pylori trimit produși de degradare celulară ai peptidoglicanilor din peretele celular în citosolul celulelor epiteliale și activează semnalizarea citosolică indusă de PRR. PRR nu sunt în mod exclusiv exprimați de macrofage fiind de asemeni găsiți în populații celulare neimune, rezidente în organe, cum ar fi celulele endoteliale și cele epiteliale, ceea ce permite acestor celule să se angajeze în supraviețuirea imună și în inducerea de inflamații. Eliminarea prin fagocitoză a bacteriilor sau a debriurilor bacteriene este în principal realizată de macrofage și granulocite dar poate fi realizată și de celulele epiteliale (Zeinab Abdullah și Percy A Knolle, 2014).

În timp ce izolarea rapidă a infecției bacteriene și potenta inducere a răspunsurilor imune sunt relevante în controlul infecțiilor locale și pentru prevenirea unei ulterioare extinderi, este în egală măsură important să se prevină patologia imună ce provine din devierea imunității. Celulele mieloide ale sistemului imunitar au dublă funcție, în oprirea timpurie și în eliminarea directă a bacteriilor invadatoare, cât și în simțirea și în măsurarea amenințării infecției bacteriene și în montarea răspunsurilor imune corespunzătoare împotriva bacteriilor patogene. Bacteriile intracelulare cum ar fi Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes și Legionella pneumophila, persistă în celulele gazdă, prin prevenirea maturării fagozomale, prin rezitarea la funcțiile microbicide efectoare ale celulei gazdă sau prin scaparea din fagolizozomi în citosol. Evadarea din compartimentul fagolizozomal, este un semn clar al virulenței bacteriene, fiind cauzat de factori de virulență, cum ar fi listeriolizina în cazul Listeria monocytogenes. Odată ajunsă în citosol, Listeria monocytogenes poate scăpa de detecția prin suprafață și de PRR fagozomali/ endozomali prin migrare rapidă și prin infectarea celulelor vecine, evitând mediul extracelular și detectarea cu ajutorul PRR la suprafața celulară sau compartimentele fagozomale. Bacteriile intracelulare pot modifica funcțiile celulare. De exemplu, Salmonella cât încă se află în campartimentele fagozomale, injectează molecule pro apoptotice, prin sistemul ei de secreție de tip III, în macrofagele infectate, și cauează o îndepîărtată diseminare a infecției bacteriene prin eliberarea bacteriilor din macrofagele care sunt pe moarte. Micobacteria care persistă în compartimntele fagozomale din macrofage, reglează metabolismul celular în avantajul propriu, pentru a-i susține supraviețuirea intracelulară cum ar fi inducerea acumulării de colesterol și reglarea autofagiei (Zeinab Abdullah și Percy A Knolle, 2014).

Mediatorii pro inflamatorii eliberați din macrofage ca și consecință a activării PRR, inițiază un răspuns inflamatoriu local, prin inducția de chemochine recrutează celule imune din depărtare, la locul infectat. Numeroase populații de celule cum ar fi neutrofilele, monocitele inflamatorii, celulele NK, celulele dendritice, sunt implicate în apărarea locală de bacteriile infecțioase. Imediat după infecție, neutrofilele migrează prin locul infectat atrase de IL 6 și IL 8 și de chemochine care sunt secretate de celulele infectate. Neutrofilele amplifică răspunsul inflamator, prin secretarea ulterioară a mediatori inductori de inflamație și de chemochine pentru recrutarea monocitelor inflamatorii și a celulelor dendritice. Asemenea recrutări de populații imune celulare, au rolul de a îngloba rapid și de a elimina bacteriile invazive, la locul inițial de infecție și să le permită celulelor dendritice prelevarea de probe de antigen iar monocitele/ macrofagele să conducă la o curățare sterilă și la memorie imună protectivă.

Macrofagele localizate în sinusoidele din ficat sunt cele mai proeminente în eliminarea bacteriilor circulante din sânge, printr-o acțiune aranjată care implică granulocite care prind în capcană bacteria și trombocite îmbunătățind legarea macrofagelor și curățarea de bacterii. Activarea macrofagelor de către PRR, orchestrează mai departe un complex răspuns imun anti bacterian. Uciderea bacteriilor captivate printr-o îmbunătățire a activității bactericide, mediată de citochine, în celule fagocitare cum ar fi macrofagele și granulocitele, constituie o pozitivă buclă de alimentare redirecționată pentru a câștiga un control rapid asupra bacteriilor care infectează. Detectarea infecției bacteriene intracelulare, are loc în contextul replicării bacteriene și prin represia mediată bacterian a PRR, care necesită o rapidă și totuși sensibilă și specifică detectare cu ajutorul PRR. Dacă bacteria intracelulară a scăpat de distrugerea fagolizozomală și a ajuns în citosol, detectarea acestor bacterii trebuie să aibă loc imediat. Detectarea citosolică a acizilor nucleici ai bacteriilor s-a descoperit a fi un eveniment cheie pentru descoperirea bacteriilor intracelulare viabile. Cum acizii nucleici derivați de la bacteriile moarte nu au ca țintă detectarea imună citosolică, eliberarea activă a acizilor nucleici în citosol în timpul infecției cu bacterii Gram pozitive sau Gram negative intracelulare a condus la un termen ce indică atât viabilitatea cât și virulența bacteriilor intracelulare (Zeinab Abdullah și Percy A Knolle, 2014).

Speciile bacteriene Gram negative ale ale genului Chlamydia, sunt obligat patogeni intracelulari, ce se replică în limitele vacuolei, denumit și incluziune. Speciile de Chlamydia au un spectru îngust de gazde și cauzează o mare varietate de boli în gazdele umane și animale. Două specii de Chlamydia și anume C pneumoniae și C trachomatis sunt patogeni adaptați la om. C pneumoniae infectează celulele epiteliale alveolare și macrofagele, cauzând boli respiratorii acute cât și cronice. C trachomatis invadează predominant celulele epiteliale și este responsabil de multe manifestări de boli care depind de tulpina bacteriană specifică, cât și de locul de infecție. Tulpinile de C trachomatis oculare înfectează celulele epiteliale ale conjunctivei rezultând trichiază, opacifierea corneei, orbire; tulpinile genitale ale bacteriei infectează celulele epiteliale cervicale și poate cauza boli inflamatorii pelviene, cât și infertilitate. Din cauza faptului că infecțiile cu C trachomatis la femei sunt de cele mai multe ori asimptomatice sau cauzează doar simptome blânde sau nespecifice, de multe ori sunt neobservate și netratate. Un număr substanțial al acestor infecții se pot croniciza, fiind asociate cu numeroase complicații incluzând dureri pelviene cronice, salpingooforită, fibroză și ocluzii tubare.

Complexele inflamazomilor constau dintr-o proteină senzor din amonte, din efectorii din aval ai proteazei-caspazei-1, caspazei-11 sau caspaza-8 și o proteină adaptoare, de axemplu ASC. Asamblarea inflamazomilor și activarea apar în răspuns la PAMP și DAMP. Majoritatea proteinelor senzor se asamblează cu caspaza-1 pentru a forma inflamazomi canonici. Odată asamblați, inflamazomii canonici pot procesa citochinele, IL 1β și IL 18 și execută piroptoza, un tip ce moarte celulară proinflamatorie. Caspaza-11 proinflamatorie este unică datorită rolului dublu, atât ca proteină senzor cât și ca proteină efectoare, a inflamazomilor necanonici. S-a demonstrat că, caspaza-11 se leagă la lipopolizaharide, induce piropoptoza, activând inflamazomul. Efluxul de potasiu din citosol, acidifierea lizozomală și eliberarea catepsinei B din lizozomii deteriorați au fost identificați ca moele asociate infecției cu Chlamydia, care contribuie la activarea inflamazomului (Ryan Finethy, Ine Jorgensen, 2015).

IL 10 este o citochină imunoreglatoare ce limitează răspunsurile imune ale mucoaselor și minimizează imunopatologia. Multe tipuri celulare pot produce IL 10, iar printre acestea se numără: limfocitele, monocitele, macrofagele, cheratinocitele și celulele epiteliale intestinale. S-a observat faptul ca la șoarecii care prezentau o deleție a IL 10 în celulele T CD4+ s-a dezvoltat o inflamare spontană a intestinului, față de cei care prezentau deleția în celulele T reglatoare (Treg). În situația în care este vorba despre infecții acute ale mucoaselor,lipsa IL 10 poate avea rol protector, din cauza unui răspuns inflamator, cu creșterea IL 12, a factorului de necroză tumorală (TNF) și a altor citochine. Cu toate acestea, absența IL 10 poate conduce la inflamații excesive.

Pentru a se putea evidenția influența IL 10 în timpul unei infecții bacteriene, s-au realizat studii pe gazde infectate cu o serie de bacterii, astfel observandu-se că: datorită lipsei de IL 10 s-a realizat o curățare a gazdei de patogeni, dar, cu toate acestea s-a observat ca depinde de tipul de patogeni cu care este infectată gazda, întrucat la o infecție cu bacterii ce aparțineau altor familii față de cele introduse inițial, lipsa de IL 10 a dus la inflamații excesive, uneori letale. Astfel s-a ajuns la concluzia că IL 10 are un rol important în apărarea organismului împotriva infecțiilor bacteriene.

IL 10 este un inhibitor potent al TNF, IL 1, IL 6 și IL 12 in vitro și este bună pentru limitarea inflamației excesive, în mucoasa intestinală. În contextul bolilor infecțioase ale mucoasei, studii utilizând Salmonella choleraesuis, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Candida albicans, au raportat o creștere în curățarea patogenilor din cauza lipsei de citochine pro inflamatorii îmbunătățite IL 10. În aceste situații, lipsa IL 10 a fost benefică pentru gazdă. Pe de altă parte, în timpul infecției cu Toxoplasma gondii și Trypanosoma cruzi, infectarea în absența IL 10 a dus la răspunsuri inflamatorii excesive și deseori letale. Macrofagele IL 10 sunt indispensabile pentru menținerea balanței răspunsurilor sistemului imunitar adaptativ, în mucoasă. Totuși este posibil ca producerea de macrofage intestinale de către IL 10 să dobândească o serie de caracteristici inflamatorii în timpul infecției bacteriene, sau, alternativ, mai multe macrofage intestinale să poată dobândi rapid capacitatea de a produce IL 10 (Petra Krause și colab., 2015).

Infecția simultană cu HIV-1 și Mycobacterium tuberculosis (Mtb) reprezintă o majoră problemă de sănătate. Unele cercetări au evidențiat faptul că fiecare patogen accelerează infectarea cu celălalt, prin compromiterea sistemului imunitar. Este cunoscut faptul că cei doi patogeni sunt replicați și păstrați în macrofage. S-a demonstrat că atât infecția cu Mtb cât și cea cu HIV-1 induc expresia protein fosfatazei 1A, dependentă de Mg2+/Mn2+ (PPM1A) în monocitele/macrofagele umane, și în celulele THP-1. O creștere a expresiei PPM1A suprimă abilitatea celulelor THP-1 de a le răspunde stimulilor bacterieni cu secreții corespunzătoare de citochine/chemochine, blocându-le răspunsul chemotactic și slăbindu-le capacitatea de a fagocita bacteriile. Astfel s-a demonstrat că PPM1A guvernează răspunsul antibacterial al macrofagelor, sau cel puțin în infecția cu Mtb și de asemenea are un rol important în răspunsul imun înnăscut al macrofagelor, gazda fiind implicată direct în terapiile care vizează PPM1A, care pot fi foarte benefice, mai ales petru pacienții cu infecție simultană HIV/Mtb (Jim Sun și colab., 2016).

Staphylococcus aureus reprezintă una dintre cauzele principale ale infecției oaselor. Aceste infecții deseori sunt cronice, greu a fi eradicate și cu o înaltă rată de mortalitate. S aureus se poate infiltra adânc în os și în țesutul neted ca rezultat al unei traume severe sau implanturi chirurgicale. Deși S aureus a fost considerat un patogen extracelular, s-a observat că această bacterie poate invada și supraviețui într-o mare varietate de celule, cum ar fi neutrofilele, macrofagele, limfocitele T, celulele epiteliale, celulele endoteliale, fibroblastele și osteoblastele. Rolul osteoblastelor este de a sintetiza componentele osului și de a induce mineralizarea osului. Osteoblastele nu sunt considerate celule ale sistemului imunitar, dar cu toate acestea recent s-a demonstrat că osteoblastele pot induce sinteza unor citochine inflamatorii și a unor chemochine la internalizarea S aureus (Therwa Hamza și Bingyun Li, 2014).

Imunitatea antivirală

Imunitatea antivirală intrinsecă reprezintă prima parte a sistemului imunitar care intervine atunci când este vorba de apărarea organismului de infcțiile virale. Acest tip de apărare este mediat de proteine celulare exprimate constitutiv ce acționează în mod cooperativ pentru a încetini progresul infecției. În timpul infecției cu HSV-1 exprimarea genelor virale apare sub forma unei cascade fin reglate temporal care constă în produși ai genelor imediați timpurii (IE), timpurii (E) și târzii (L). Proteinele IE au rol de pivot în modularea mediului intracelular pentru a ușura replicarea virusului, incluzând inactivarea imunității gazdei, care ar putea restricționa progresul infecției (Arvin A și colab.,2007).

Modificatorii mici ubiquitin-like, sunt utilizați de răspunsul imun antiviral intrinsec, pentru restricția patogenilor virali, cum ar fi herpes simplex virus 1 (HSV-1).

Căile modificatorilor mici ubiquitin-like mediază recrutarea factorilor de restricție asociați PML-NB. Modificarea post-translațională a proteinelor cu acești modificatori, reglează numeroase procese celulare, inclusiv multiple aspecte asociate cu infecția virală și imunitatea gazdei.

Un aspect esențial al imunității intrinsece față de infecția cu HPV-1, este reprezentat de recrutarea rapidă a factorior de restricție exprimați constitutiv, la locurile din nucleu asociate cu genomul viral, urmărind intrarea acestora în nucleu. Recrutarea unor asemenea factori este suficientă pentru restricția expresiei genelor HSV-1 și pentru a ușura transcripția în tăcere a genomului viral și pentru a bloca replicarea litică. Factorii de restricție recrutați la genomul viral care infectează conțin proteine cu miez constitutiv ale corpilor nucleari ai leucemiei promielocitice (PML-NB); de asemeni cunoscute ca și proteine ale domeniului nuclear 10, implicate în răspunsul ADN lezat cât și senzorul patogen nuclear ADN IF116 (Glass M, Everett RD. 2013).

Macrofagele au un rol important în imunitatea înăscută, cât și în imunitatea adaptativă, ca răspuns la microorganisme, reprezentând o importantă țintă celulară în timpul infecției cu HIV-1.

Macrofagele activate clasic, sau cele de tip1, sunt induse în general de IFN-y, afișează un profil pro inflamator. În plus, citochinele pro inflamatorii modulează replicarea HIV-1 în macrofage și poate depinde de stadiile de maturare și sau activare ale monocitelor sau macrofagelor. Nivele înalte de citochine pro inflamatorii, cum ar fi factorul α al necrozei tumorale, (TNFα), IL 1β și IL 6 atât în plasmă, cât și în ganglionii limfatici, pot fi observate încă din stadiile timpurii ale infecției cu HIV-1. Secreția de chemochine, cum ar fi proteina inflamatorie a macrofagelor (MIP)-1α, MIP-1β, sunt crescute la pacienții infectați. Activarea imună reflectă montarea imunității antivirale, cu o îmbunătățire a activității celulelor Th și nivele crescute de IFN y, IL 12, IL 2 și IL 18, în special în ganglionii limfatici ai pacienților infectați. În plus, aceste citochine și receptorii lor, validează importanța acestei căi în imunitatea celulară, sindromurile de imunodeficiență, răspunsul întârziat al hipersensibilității și distrugerea tisulară.

HIV-1 infectează monocitele/ macrofagele prin interacția glicoproteinei gp120 cu CD4. Glicoproteina de anvelopă gp120 a HIV-1 reglează în jos atât suprafața cât și expresia CD4 în macrofagele umane primare la nivel de transcripție. Inhibarea intrării HIV-1 în macrofagele primare de către TNF α, implică TNFR2 de 75 kDa. TNF α țintește eliberarea factorului de stimulare de colonii de macrofage granulocite (GM-CSF). Această inhibare poate fi mediată prin secreția de chemochine C-C (Georges Herbein, Audrey Varin, 2010).

Macrofagele activate alternativ, sau cele de tip 2, este indusă de citochinele Th2, exprimarea anti-inflamatorie și proprietățile de reparare tisulară. Activarea alternativă a macrofagelor este indusă de IL 4 și de IL 3, citochine care sunt produse în timpul unui răspuns de tipul Th2, în mod particular în timpul răspunsurilor alergice, celulare și umorale față de paraziți și infecții patogene selecționate.

Activarea alternativă a macrofagelor este mediată de IL 4 și de IL 13 acționând printr-un lanț receptor comun. IL 4 este o citochină pleiotropică produsă de subpopulații de celule T CD4+, desemnate celule Th2 și de catre bazofile și celule catarg. IL 4 modulează alte activități ale celulelor limfoide cum ar fi reglarea diferențierii limfocitelor T stimulate de antigen și controlul claselor de imunoglobulină schimbate în limfocite B. IL 13 este o citochină secretată de celule T activate, ce au fost arătate a fi un potent modulator in vitro al monocitelor umane și funcțiilor celulelor B. Printre activitățile pleiotropice IL 13 induce schimbări semnificative în fenotipul monocitelor umane crescând reglarea expresiilor multiplelor molecule de suprafață celulară și crescându-le capacitățile de a prezenta antigene. IL 4 și IL 13 reglează expresia receptorului de manoză și moleculele CMH de clasă II de către macrofage care stimulează endocitoza și prezentarea de antigen și induc expresia chemochinelor derivate din macrofage. IL 4 și IL 13 sporesc expresia receptorului momeală IL 1 iar lanțul α al receptorului IL 1 in vitro și in vivo, astfel contracarând acțiunile proinflamatorii ale IL 1.

La infecția celulelor cu HIV-1, revers transcriptaza copiază ARN genomic pentru a genera ADN proviral flancat. IL 13 s-a demonstrat că inhibă replicarea HIV-1 în monocitele derivate din sânge, cât și în macrofagele mature din plămâni, dar nu în celulele T (Georges Herbein, Audrey Varin, 2010).

Integrarea ADN proviral al HIV-1 în genomul gazdei, este premisă pentru patogeneză favorabilă virală. La intrarea HIV-1 în celulă, ARN HIV-1 este revers transcris la ADN și ulterior asamblat într-un complec pre-integrare (PIC). PIC cuprinde proteine virale și ADN dublu catenar. Ulterior PIC este transportat la nucleu, unde poate fi integrat în genomul gazdă. Pre-integrarea latenței poate fi o consecință a unei slabe eficiențe a revers transcrierii și a inhibiției transportului nuclear al PIC. Această formă de latență a fost bine descrisă la celulele T CD4+, fiind cunoscut faptul că pre-integrarea latenței este foarte întâlnită in vivo.

Pe de altă parte, macrofagele pot susține o cantitate mare de ADN HIV-1 neintegrat, pentru perioade lungi de timp, de cel puțin 30 de zile. În plus, expresia genelor virale persistente selectiv și inducerea de chemochine, au fost semnalate în macrofagele care adăposteau ADN viral neintegrat. S-a observat ca ADN HIV-1 neintegrat în macrofage poate contribui semnificativ la patogeneza virală a indivizilor infectați.Ceea ce este important este reprezentat de faptul că sunt numai câteva rapoarte în care ADN viral neintegrat a fost integrat în macrofagele derivate de la probele pacienților. De exemplu, câteva studii arată că ADN HIV neintegrat este prezent în creierul pacienților infectați. În plus, o limitată unificare a deoxinucleotidelor și câțiva factori de restricție ai gazdei prezintă un cec în replicarea HIV-1 în descendența celulară a monocitelor/ macrofagelor și poate contribui la pre integrarea latenței.

Latența post-integrare este stabilită cu integrarea ADN proviral HIV-1 în cromatina gazdei, fiind urmat de reducerea la tăcere a expresiei genelor HIV-1. Câteva mecanisme, incluzaând reducerea la tăcere epigenetică a genelor, cea transcripțională și post transcripțională, au fost descrise pentru a explica stabilirea și menținerea latenței în celulele țintă. Latența post integrare reprezintă latența adevărată, responsabilă de persistența, de activarea și de diseminarea HIV-1 (Amit Kumar și colab., 2014).

Macrofagele sunt un important rezervor de HIV ele având capacitatea de a adăposti virusurile și să producă infecții cu virioni pentru perioade lungi de timp cu o neglijabilă moarte celulară. Replicarea HIV-1 în macrofage este reglată de citochine și de alți stimuli extracelulari. Bazându-se pe profilele citochinelor, macrofagele pot fi polarizate atât în M1 cât și în M2. Macrofagele rezidente în SNC, în special celulele microgliale cât și macrofagele perivasculare au semnificații clinice importante întrucât inducția și infecția acestora sunt responsabile în mare parte pentru patogeneza demenței asociate cu HIV-1. Populațiile de microglii sunt un potent rezervor de HIV-1 la pacienții infectați. În țesutul creierului pacienților infectați cu HIV-1 s-a găsit de zece ori mai mult ADN viral neintegrat comparativ cu ADN integrat (Amit Kumar și colab., 2014).

Imunitatea antifungică

Fungii sunt omniprezenți în mediul înconjurător, ei reprezentând factori frecvenți ce cauzează infecții oamenilor și animalelor, chiar dacă aceștia au un sistem imunitar care funcționează corespunzător. A fost evidențiat faptul că răspunsul imun la patogenii micotici se realizează în funcție de specie și de morfologia fungului. Cu toate acestea, este cunoscut faptul că întotdeauna în răspunsul imunitar antifungic, sunt implicate mecanismele înnăscute, cât și mecanisme ale imunității adaptative, care cooperează pentru a elimina patogenii. Principalele elemente ale imunității antifungice sunt barierele fizice ale organismului, fagocitoza, citotoxicitatea, și o posibilă trogocitoză a celulelor polimorfonucleare , a mononuclearelor, precum și a celulelor T, iar într-o proporție mai mică, celulele B, a căror proporție este relaționată de produșii acestora de activare a proceselor celulelor polimorfonucleare și a celulelor mononucleare (Alicja Trzeciak-Ryczek și colab., 2015).

Fungii patogeni, cum ar fi: Cryptococcus, Candida, Aspergillus și Pneumocystis,sunt considerați a fi patru genuri mari de patogeni fungici umani. Un mare factor de risc pentru gazdă care ajută la dezvoltarea acestor infecții fungice este incompetența imunologică, întrucât acestea sunt întâlnite la pacienții care suferă de boli imunodeficiente cât și la cei care au tratamente imunosupresive (Shimodaira K și colab., 2012).

Pentru ca gazdele să inițieze răspunsul imun antifungic, fungii trebuie să fie detectați de către receptorii de recunoaștere al modelului. Neutrofilele și macrofagele inflamatorii sunt primele celule inflamatorii recrutate la locurile infecate și de asemenea sunt și principalii distrugători de fungi, încă din stadiile primare ale infecțiilor.Celulele dendritice au un rol important ca și celule profesioniste prezentatoare de antigen, și conectează sistemul imunitar înnăscut de cel adaptativ, prin prezentarea antigenelor fungice la celulele T prime, naive. Defecte ale sistemului imun adaptativ reprezintă bine cunoscuții factori de risc în infecțiile fungice. Limfocitele T, odata activate, activează la rândul lor și produc citochine inflamatorii, care care ulterior recrutează celulele sistemului imunitar înnăscut, spre locurile infectate și ușurează fagocitoza ( Marodi L. și colab., 1993).

Ceulele B sunt de asemenea implicate în curățarea organismului de fungi, prin producerea de anticorpi, care să opsonizeze sporii fungilor, anticorpii legându-se de spori și facilitând fagocitoza, prin stimularea unui anumit receptor de pe fagocite.

Când este evaluată și analizată prezența receptorilor PRR în sistemul imunitar ca urmare a legării de fungi, trebuie afirmat faptul că acest lucru conduce la o puternică activare a celulelor fagocitare, denumite polimorfonucleare și mononucleare, care rezultă în urma stimulării fagocitozei, dar se afirmă de asemenea faptul că stimulează citotoxicitatea, iar ipotetic trogocitoza, ce are ca urmare eliminarea fungilor.

A fost evidențiat faptul că activarea celulelor PMN și a celor MN și mecasnismele lor efectoare care participă în imunitatea antifungică, sunt afectate de citochine și de mulți alți factori solubili care întăresc procesul, cum ar fi IFN-y, sau factori inhibitori, cum ar fi IL 10. S-a demonstrat faptul că PMN, MN și celulele denditrice, au capacități diferite de ucidere a celulelor fungice, în funcție de specie. S-a înregistrat faptul că neutrofilele au un potențial fungicid mai puternic, față de Candida albicans ,decât monocitele, macrofagele și celulele dendritice.

În schimb, celulele dendritice prezintă o mai mare activitate fungicidă față de Histoplasma capsulatum, care nu este observat de către celulele PMN. Mai mult, numeroase celule fagocitare, răspund infecțiilor fungice într-o ordine diferită; de exemplu macrofagele sunt primele și principalele celule care participă în imunitatea împotriva Cryptococcus sp. și Pneumocystis sp. pe când celulele PMN sunt principalele celule efectoare care iau parte în infecții cauzate de Candida albicans și Aspergillus fumigatus. S-a demonstrat că celulele PMN și MN pot de asemenea distruge hifele ciupercilor care sunt prea mari pentru a putea fi fagocizate, prin secreția de radicali liberi și compuși cidali, independenți de oxigen, cum ar fi lizozimul, defensina, sau enzime proteolitice către spațiul extracelular (Alicja Trzeciak-Ryczek și colab., 2015).

S-a observat că moartea Candida albicans apare în urma utilizării capcanei de neutrofile extracelulară (NET), ce reprezintă o structură extracelulară antimicrobiană, cu cromatină combinată și granule proteice eliberate din celulele PMN. A fost evidențiat de asemenea faptul că rețeaua NET conține proteina 3 legată de pentraxină (PTX3) și receptori solubili PRR, păstrați în granulele neutrofilelor, care reprezintă elementul de bază în mecanismul de recunoaștere și de ucidere al Aspergillus fumicatus. Mai mult, ca rezultat al activării celuleor PMN, monocitelor și macrofageor mai multe citochine sunt secretate, incluzând TNF-α, IL 1, IL 6, IL 12, care sunt angajate și activate în procesul de formare al noilor celule PMN, MN ce conduc la efectul lor de intrare și de intensificare al infecțiilor.

S-a demonstrat faptul că prezentarea de antigene micotice la celulele imunității adaptative, celulele T și parțial celulele B, au loc în principal la celulele dendritice, dar și de asemenea la celulele PMN și MN activate. Asemenea celule profesioniste prezentatoare de antigen și anume celulele dendritice, se desprind de migrare pentru a înconjura ganglionii limfatici, unde prezintă antigenele micotice, la celulele T de memorie și cele virgine, secretă citochine ca IL 12, IL 18 și IFN y, care întăresc mediul înconjurător pro inflamatoriu (Alicja Trzeciak-Ryczek și colab., 2015).

S-a evidențiat faptul că, in functie de forma morfologică recunoscută, celulele dendritice pot indica profile diferite ale sintezei de citochine și să afecteze răspunsul celulelor T în două feluri. În cazul absorbirii unei drojdii de la Candida albicans, celulele dendritice sunt activate spre a sintetiza IL 12, ceea ce duce la activarea unui răspuns celular din partea celulelor Th1, întrucât absorbția unei hife a fungului poate duce la inhibarea producerii de IL 12 și inducerea IL 4, ceea ce are ca rezultat dezvoltarea unui răspuns dependent de Th2.

Mai frecvent, în timpul degradării unor frungi ca Histoplasma capsulatum sau Aspergillus fumigatus, celulele dendritice stimulează proliferarea celulelor T și B. Rezultatul este o secreție intensivă a IL 2 de către celulele T, ceea ce activează proliferarea celulelor T (CD8+, CD4+), precum și proliferarea celulelor B. Celulele T activate migrează la focarul de infecție, unde celuelele Th CD4+ polarizează în direcția limfocielor Th1, producătoare de IFN y sau de IL 22 ceea ce conduce la stimularea migrației, aderenței saub absorbției celulelor PMN și MN, în cazul IFN y și activarea imunității locale a membranelor mucoaselor în cazul IL 22. Asemenea imagine a dominației celulelor Th1, sprijină fagocitoza, prin care întărește imunitatea antifungică.

De asemenea, celulele B formatoare de imunitate adaptativă, după activare ca rezultat al infecției fungice, secretă imunoglobuline, în principal IgG, care opsonizează și fac celulele micotice mai gustoase pentru PMN și MN, astfel facilitând fagocitoza, precum și citotoxicitatea. A fost descris faptul că tulburările funcționale și cantitative ce au loc, la nivelul celulelor PMN și MN, fac dificilă dezvoltarea mediului înconjurător pro inflamator, prin contribuirea la polarizarea celulelor T prin intermediul celulelor Th2 sintetizatoare de IL 4, IL 5, IL 10, IL 25, IL 33 ce conduc la activarea celulelor B și sintetizarea de Ig, cât și la inhibarea fagocitozei (Alicja Trzeciak-Ryczek și colab., 2015).

Imunitatea antiparazitară

Eozinofilia reprezintă o consecință a imunității celulelor Th2, montate în răspunsul infecțiilor cauzate de helminți paraziți. Efectele citotoxice ale eozinofilelor sunt mediate de granule proteice cationice și au fost considerate a fi principala influență în infecțiile cauzate de viermi (Rosenberg Hf și colab., 2013 ).

Investigații recente, care vizează rolurile eozinofilelor atât în menținerea sănătății, cât și în timpul bolilor, au evidențiat versatilitatea acestor celule. Astfel, pe studii realizate pe șoareci, eozinofilele influențează rezistența la insuină, promovează răspunsul regenerativ asupra rănirilor toxice ale mușchilor sheletici, ale ficatului și sunt necesare pentru recrutarea celulelor Th2 la plămâni, în timpul alergiilor (Walsh ER,și colab., 2011).

Eozinofilele exprimă constitutiv IL 4 și producerea de IL 4 și IL 3 este responsabilă de rolurile eozinofilelor în acest context. De asemenea eozinofilele reglează și imunitatea adaptativă, prin producerea de citochine, iar această proprietatea a fost testată prin intermediul unor experimente care sunt relevante pentru rezultatele unei infecții cauzate de viermi. Spre exemplu, eozinofilele servesc ca o sursă timpurie de IL 4, promovând polarizarea celulelor Th2, când ouă de Schistosoma mansoni sunt injectate în cavitatea peritoneală a șoarecilor (Sabin EA și colab, 1996).

Mai mult, eozinofilele exprimă CMH II, și moleculele costimulatoare, CD80 și CD86, de pe suprafața celulară și sunt capabile să prezinte alergeni și antigeni de helminți la celulele T. Este mai probabil ca eozinofilele să-și manifeste potențialul activator al celulelor dendritice decât să sporească răspunsul imun, antigen specific al Th2 (Yang D și colab., 2008).

În timpul infecției cu Trichinella spiralis, eozinofilele promovează creșterea și supraviețuirea larvelor de T.spiralis cât colonizează mușchiul scheletic, dar cu trecerea timpului s-a observat că larvele au fost omorâte de oxidul nitric. Astfel s-a constatat că eozinofilele ar putea regla în mod direct expresia sintazei de oxid nitric prin intermediul macrofagelor și al neutrofilelor locale (Beiting DP și colab., 2007).

Protozoarul parazit Leishmania donovani este unul dintre principalii agenți cauzatori ai leismaniozei viscerale, care este pe locul doi în lume ca cea mai provocatoare boală infecțioasă cu aproape 500 000 de noi cazuri și aproape 60 000 de morți anual (Das A, Ali N. 2012).

În timpul ciclului de viață intracelular, paraziții supraviețuiesc ca obligat patogeni ce infectează celulele hematopoietice ale descendenței monocitelor/ macrofagelor, în care intră prin fagocitoză și stabilesc infecția prin vacuole parazito-poroase. Macrofagele, principalele celule efectoare responsabile pentru uciderea paraziților Leishmania sunt heterogene, afișând o combinație de funcții inflamatorii și anti inflamatorii. Aceste două extremități în spectrul funcțiilor macrofagelor sunt reprezentate de macrofagele activate clasic fenotipice, care prezintă activitate leismanicidă, cât și de macrofagele activate alternativ, ce expun o activitate anti inflamatorie care favorizează supraviețuirea parazitului. Paraziții Leishmania au evoluat cu mecanisme complexe pentru a se sustrage de funcțiile antimicrobiene ale macrofagelor. Inducerea de disfuncții în macrofage de către Leishmania a fost corelată în principal cu epuizarea moleculelor microbicide și cu evenimente semnalizatoare modificate ce rezultă prin facerea oblică a celulelor Th către subclasa de celule Th2 antiinflamatorii promovatoare de boală.

Îmbunătățirea răspunsului Th2 în timpul infecției cu parazitul conduce la o îmbunătățire a activității arginazei în macrofagele infectate, care ulterior suprimă producerea de NO și îmbunătățește producția de poli amină pentru a facilita supraviețuirea parazitului.

Mai mult, un nivel ridicat de inducere de citochine Th2 în timpul infecției cu Leishmania, inhibă activitatea microbicidă a macrofaglor prin atenuarea generării de oxid nitric, cât și de citochine proinflamatorii. În plus, infecția cu acest parazit înlocuiește colesterolul din membrana macrofagelor, conduce la o îmbunătățire a fluidității membranare și îi inhibă capacitatea de a prezenta antigene parazite altor celule ale sistemului imunitar. Împreună aceste procese complexe îi permit parazitului să evadeze din calea răspunsului imun înnăscut și să se replice în compartimentele fagolizozomale ale macrofagelor infectate (Parna Bhattacharya și colab., 2015).

În contrast cu activarea alternativă, activarea clasică a macrofagelor (CAM) este caracterizată de inducerea de mediatori antimicrobieni, cum ar fi NO și alte specii reactive de oxigen, care sunt critice pentru curățarea de patogeni. CAM implică secreția unei baterii de citochine inflamatorii, cum ar fi TNF α, IL 1β, IL 12, care ajută la orchestrarea și amplificarea răspunsului imun al Th1. În mod specific, IL 12 este o citochină critică, necesară pentru dezvoltarea celulelor Th CD4+ și pentru producerea de IFN y, făcând legătura între sistemul imunitar înnăscut și în dezvoltarea unui răspuns imun adaptativ, antigen specific.

Macrofagele au un rol crucial în protecția organismului față de infectarea cu Leishmania. O curățare eficientă a paraziților, de către macrofage, depinde de activarea unui răspuns imun corespunzător, care în mod normal este inițiat de către celulele dendritice.

Separat de celulele dendritice, macrofagele clasice, participă de asemenea la inducerea unui răspuns din partea celulelor Th1 polarizate, ce a fost asociat cu rezistența la patogenii intracelulari (Parna Bhattacharya și colab., 2015).

Capitolul 2 – Titlul lucrării – Investigarea in vivo a mecanismelor apărării antibacteriene celulare nespecifice

2.1 Scopul și obiectivele lucrării

Scopul acestei lucrări este de a arăta rapiditatea sistemului imunitar de a răspunde unei infecții cu tulpini bacteriene de Staphylococcus aureus.

Obiectivele lucrării presupun obținerea unui răspuns imun celular nespecific din partea sistemului imunitar al animalelor de laborator injectate cu tulpinile bacteriene. Mai exact, ceea ce se urmărește a se evidenția, este dacă în urma analizei frotiurilor de organe din splină și din intestin se vor observa pe lame macrofage, adică dacă a avut loc într-un timp scurt un răspuns imun celular nespecific.

2.2 Materiale și Metode

2.2.1 Tulpini bacteriene

În această lucrare au fost analizate un număr de 4 tulpini bacteriene de Staphylococcus aureus prelevate din răni cutanate, la Spitalul Elias din București, secția de Dermatologie.

2.2.2 Model animal experimental

Au fost utilizați șoareci nuzi, proveniți de la Institutul de Virusologie Ștefan Nicolau din București. Șoarecii nuzi sunt șoareci care nu au timus din cauza faptului că nu se dezvoltă suficient în perioada intrauterină, astfel că la acest tip de șoareci nu se produc celule limfoide. Numărul de limfocite circulante este redus; acești șoareci au capacitatea de a accepta grefele de piele. Șoarecii au fost menținuți în condiții corespunzătoare, în cuști, câte un șoarece în cușcă, hrăniți cu mâncare specială pentru rozătoare și pentru băut au avut la dispoziție apă. Cuștile au fost ținute într-o cameră specială in care s-au asigurat conditii de lucru sterile.

2.2.3 Materiale utilizate

– Mediu Chapman (agar hiperclorurat solid)

– Bulion de cultura

– Plasmă bovină fetală 50%

– TFS (tampon fiziologic steril)

– Alcool metilic

– Colorant May-Grunwald

– Soluție Giemsa

– Apă distilată neutră

– Ulei de imersie

– Standard McFarland

– Tuburi Eppendorf

– Ansă metalică

– Seringă cu ac

– Lame de sticlă

– Foarfecă

– Pipetă automată

– Microscop optic

– Lampă de gaz

– Incubator

– Centrifugă

2.2.4 Metode

Tulpinile bacteriene reprezentate de tulpini de Staphyloccocus aureus au fost pasate pe mediu Chapman (agar hiperclorurat solid) și ulterior lăsate la incubat timp de 24 de ore, la 37ºC. Dupa incubare, bacteriile au fost trecute în suspensie. S-au realizat atât probe cât și martori. Pentru probe, bacteriile au fost suspendate în bulion amestecat cu plasmă bovina fetală 50%, iar martorii au fost reprezentați de bacteriile în suspensie de bulion. Atât probele cât și martorii fost lăsați la incubat timp de 24 de ore la 37ºC. Ulterior s-a realizat o centrifugare timp de 7 minute la 1200 de rotații pe minut. După centrifugare, sedimentul bacterian a fost resuspendat în suspensie cu TFS si ajustat la un standard de densitate de 0.5 McFarland .

În continuare, atât probele cât și martorii de suspensie bacteriană au fost injectați în șoareci, iar un șoarece a fost injectat cu TFS, ca referință. După 6 ore de la injectare, șoarecii au fost eutanasiați prin dislocare cervicală . După eutanasiere, pielea din dreptul cavității peritoneale a fost tăiată cu atenție și îndepărtată pentru a se putea lucra cu ușurință. S-au injectat în interiorul fiecăruia dintre șoareci, câte 1 ml de TFS, care ulterior a fost recoltat în tuburi Eppendorf. Injectarea și recoltarea s-au realizat cu mare grijă pentru a nu fi înțepat din greșeală niciunul dintre organe. Peritoneul a fost masat ușor pentru a favoriza mobilizarea celulelor si resuspendarea acestora in TFS pentru a fi recoltate. Pentru recoltarea fluidului s-a utilizat o pipetă automată de 1000 µl. Dupa recoltare s-a efectuat o centrifugare la 1200 rotații pe minut timp de 7 minute.

Pentru a se observa prezența macrofagelor în lichidul recoltat s-au realizat frotiuri pentru martori și pentru probe. S-au realizat și frotiuri cu amprente de organe pentru a se putea observa dacă a avut loc un răspuns imun celular, într-un timp scurt. Astfel s-au realizat frotiuri cu amprente de organe atât din șoarecii în care s-au injectat probele, martorii cât și din cel în care a fost injectat doar TFS, pentru referință. Pentru realizarea frotiurilor, au fost tăiate din splină și din intestin, bucăți mici și întinse ulterior cu grijă pe lame pentru a putea fi observate cu ușurință celulele de interes.

Pentru colorarea frotiurilor s-au respectat următorii pași: fixarea cu alcool metilic, timp de 3 minute; colorare cu un amestec 1/1 format format din soluția May- Grunwald și apă distilată neutră timp de 3 minute. (Apa neutră se obține prin fierberea apei distillate și neutralizarea ei cu Na2Co3 1% în prezența roșului neutru ca indicator pH. Apa acidă e roșie iar cea galbenă gălbuie.); colorare cu soluție Giemsa, diluată extemporaneu (1-4 picături Giemsa + 1 ml apă distilată neutră), timp de 15 minute; spălare și uscare. Pentru observarea macrofagelor s-a realizat examinarea lamelor la microscop, la obiectivul cu imersie (100x).

2.3 Rezultate și Discuții

Această lucrare practică are ca scop evidențierea răspunsului imun celular, in vivo, pe animale de laborator.

Astfel, în urma analizei la microscopul optic, la obiectivul cu imersie, pentru frotiurile cu lichid peritoneal recoltat de la fiecare dintre șoareci, atât probele cât și martorii, s-a observat prezența macrofagelor, așa cum este expus în figurile 1 și 2.

Figura 1 – Frotiu din lichid peritoneal recoltat de la șoarece nud injectat cu suspensie în TFS din tulpina bacteriană de Staphylococcus aureus. Se observă un infiltrat celular bogat în macrofage (cu albastru), celule bacteriene (roșu închis) și detritus de fibrină

Figura 2 – Frotiu din lichid peritoneal recoltat de la șoarece nud injectat cu suspensie în TFS din tulpina bacteriană de Staphylococcus aureus. Se observă un infiltrat celular bogat în eritrocite (cu roșu), macrofage (albastru) și celule bacteriene (cu bleu)

În urma numărării a câte 100 de macrofage de pe fiecare lamă, realizată atât cu probele cât și cu martorii injectați și recoltați de la fiecare șoarece, s-a observat, așa cum reiese din Tabelul 1, faptul că, în probe se află mai multe macrofage care au bacterii în interiorul lor comparativ cu martorii.

Tabel 1 – Indicele de activare al macrofagelor (%)-calculat prin raportul dintre numărul de macrofage activate și numărul total de macrofage, acest raport înmulțindu-se cu 100.

În figurile 3 și 4 sunt reprezentate fragmente de splină și de intestin, recoltate de la șoarecele injectat cu TFS. În nici unul dintre organele analizate nu au fost observate macrofage.

Figura 3 – Frotiu amprentă din splină de șoarece nud, injectat cu TFS. Nu sunt prezente macrofagele. Se pot observa numeroase celule splenice cât și hematii (cu alb).

Figura 4 – Frotiu amprentă din intestin de șoarece nud, injectat cu TFS. Nu sunt prezente macrofage. Se observă celule epiteliale intestinale zdrobite.

În figurile 5 și 6 sunt prezentate frotiuri cu amprente din splină și din intestin, recoltate de la șoarecii injectați cu probe.

Figura 5 – Frotiu amprentă splină, șoarece nud injectat cu probă. Se pot observa câteva macrofage activate (celule mari albastre) cât și numeroase celule splenice și eritrocite (cu alb)

Figura 6 – Frotiu amprentă intestin, șoarece nud injectat cu probă. Se observa celule epiteliale zdrobite și celule întregi cu alb.

În figurile 7 și 8 sunt prezentate frotiuri cu amprente din splină și intestin, recoltate la șoareci injectați cu martori.

Figura 7 – frotiu amprentă splină, șoarece nud injectat cu martor. Se pot observa cu albastru celule mari, reprezentate de macrofage, numeroase celule splenice, și eritrocite cu alb.

Figura 8 – Frotiu amprentă de intestin de șoarece nud, injectat cu martor. Nu se observa macrofage. Ceea ce se vede în figură sunt celule intestinale.

Se poate observa că în imaginile cu frotiurile din splină sunt prezente foarte rar macrofage , pe cand în imaginile provenite de la frotiurile din intestin nu s-a observat prezenta macrofagelor. Acest lucru se întâmplă din cauza timpului scurt de lăsare până la eutanasiere, astfel încat sistemul imunitar nu a avut suficient timp pentru a da un răspuns imun nespecific.

Martina Selle și colab. au realizat experimente pentru evidențierea răspunsului imun umoral, prin injectarea in vivo de animale de laborator cu Staphyococcus aureus. Au fost injectați șoarecii cu câte trei doze de S. aureus, fie intravenos, fie intramuscuar. Întâi șoarecii au fost vaccinați cu o doză neletală de bacterii, iar după ce și-au revenit, li s-a administrat o doză mai puternică, subletală de 2 x 10 6 UFC de S aureus în mușchi. Au fost injectate 40 de tupini, iar la 2 zile dupa injectarea primelor 30 și la 12 zile dupa injectarea ultimelor 10, s-au recoltat serurile pentru analiză. În urma analizelor, s-a observat faptul că, concentrația de imunoglobulină era în creștere, și s-a identificat prezența unor anticorpi puternici pentru S.aureus, atât la șoarecii injectați intravenos, cât și la cei injectați intramuscular. Pentru a se verifica intensitatea răspunsului imun, s-a realizat un calcul bazat pe intensitatea relativă a semnalului, care a fost măsurată pentru fiecare antigen și fiecare șoarece la câte două diluții.

În experimentul realizat de Hwan Keun Kim și colab, s-au utilizat șoareci și tulpini bacteriene de S aureus. Tulpinile bacteriene au fost pregătite astfel: culturile bacteriene au fost lăsate peste noapte la incubat, ulterior realizându-se din acestea o diluție de 1:100 în bulion triptic de soia și lăsate 2 ore să crească. Ulterior stafilococii au fost spălați, sedimentați și suspendați în PBS la concentrația dorită. Șoarecii au fost anesteziați cu ajutorul injecțiilor cu chetamină și xalizină, ulterior fiind infectați prin injectare cu tulpini de S aureus de diferite concentrații, în sinusul periorbital al ochiului drept. În zilele 5, 12, 14, 19 și 26 de la injectare șoarecii au fost anesteziați și le-a fost recoltat sânge fie prin tuburi capilare acoperite cu heparină, din sinusul venos periorbital din ochiul drept, fie prin puncție cardiacă. Epuizarea celulelor T CD8-, CD4- a fost obținută prin injectarea de anticorpi monoclonali purificați de șoarece. Epuizarea acută a celulelor T a fost obținută prin injectarea șoarecilor 3 zile consecutiv. Rezultate pentru inocularea intravenoasă cu tulpini bacteriene de S aureus, sunt reprezentate de formarea de abcese în toate țesuturile animalului injectat. Pentru a se observa dacă este prezent un răspuns imun, șoarecilor li s-a recoltat sânge în zilele 5, 12, 19 și 26 și ulterior analizat serul. S-au observat amplificări ale răspunsului imun în primele 5 zile, o stare latentă până în zilele 12, apoi o scădere a intensității răspunsului sistemului imunitar.

În experimentul realizat de Yi-Guo Chen și colab., șoarecii utilizați au fost femele lipsite de microorganisme patogene. Șoarecii au fost ținuți într-o cameră curată, fără patogeni, hrăniți corespunzător, într-un ciclu zi-noapte a câte 12 ore fiecare. Animalele au fost transportate cu grijă și conform normelor de protecție. Pentru a fi feriți de suferință, șoarecii au fost anesteziați înaintea injectării cu tulpini de S aureus. Stafilococii au fost cultivați pe TSB, ținuți la 37ºC, apoi suspendați în PBS. Șoarecii au fost anesteziați intraperitoneal, li s-au administrat tulpinile bacteriene, ulterior fiind monitorizați. La 12 ore după infecție, șoarecii au fost eutanasiați, fiindu-le prelevați plămânii și fixați în paraformaldehidă, încorporați în parafină, secționați și colorați cu hematoxilină și eozină. După infecția cu S aureus s-au observat acumulări de neutrofile la locurile infectate, fapt ce demonstrează că sistemul imunitar a reacționat corespunzător. În urma analizei la microscop și a unor numărători realizate s-a observat fatpul că procentul de neutrofile din plămâni era diferit la șoarecii eutanasiați după 6 ore, față de cei eutanasiați după 12 ore.

In studiul realizat de Fan Zhao și de colab., creșterea și prelucrarea tulpinilor de S. aureus s-a realizat în felul următor: bacteriile au fost crescute pe TSA la temperatura de 37ºC , iar în ziua următoare au fost inoculate în TSB și lăsate peste noapte tot la aceeași temperatură. Ulterior s-a realizat o diluție de 1:100 în TSB proaspăt, apoi s-au realizat diluții seriale. Șoarecii utilizați au fost reprezentați de femele în vârstă de 7 săptămâni. În dimineața inoculării, cultura bacteriană a fost diluată, și lăsată să crească până la faza exponențială a creșterii. Ulterior s-a realizat o spălare a bacteriilor cu PBS. Șoareci au fost sedați și injectați, iar după 8 săptămâni procesul s-a repetat, șoarecii fiind injectați în locul opus față de locul primei injectări. La 4 săptămâni după cea de-a doua inoculare, șoarecii au fost eutnasiați, sângele fiind recoltat prin puncție cardiacă. În urma analizelor, rezultatele obținute au ajutat la înțelegerea procesului prin care sistemul imunitar apără organismul de infecțiile recurente cu S aureus. Mai exact, răspunsul imun a fost evidențiat pentru grupuri mici de colonii bacteriene, acest lucru contribuind la ajustarea vaccinurilor realizate pentru infecțiile recurente cu S aureus.

Christopher P. Montgomery și colab., au realizat un experiment pentru determinarea răspunsului imun in vivo. Pentru experiment s-au utilizat tulpini bacteriene de S aureus și șoareci. Tulpinile bacteriene au fost crescute pe un mediu nutritiv la temperatura de 37ºC. După acest proces, tulpinile bacteriene au fost inoculate in TSB, tot la aceeași temperatură. S-a realizat o diluție, și au fost lăsate să crească până la atingerea fazei de creștere utilă pentru experiment. După creștere, bacteriile au fost centrifugate, peletul fiind spălat de 2 ori apoi resuspendat în PBS steril pentru a se ajunge la concentrația necesară. Șoarecii în vârstă de 6 săptămâni, au fost sedați intraperitoneal, bacteriile fiind introduse intranazal. După 6 ore, animalele au fost eutanasiate. Plămânul stâng a fost prelevat și prelucrat astfel încât din lichidul rezultat în urma prelucrărilor să se realizeze numărători ale bacteriilor. Plămânul drept, după prelevare a trecut printr-o serie de pregătiri histologice de fixare și colorare, pentru analize ulterioare. În urma analizelor, s-a constatat că erau prezente colonii bacteriene, dar și fenomenul de necroză. Dacă animalele ar fi fost lăsate un timp mai îndelungat, din cauza faptului că au fost injectate cu o doză crescuta de suspensie bacteriană, acestea ar fi murit, nemaiputând fi observate efectele sistemului imunitar.

Elin Ronnberg și colab. au realizat experimente utilizând tulpina baceriană de S aureus și modele animale experimentale. Tulpina bacteriană a fost izolată de la șoareci care au murit în urma dobândirii unei infecții cu S aureus și congelată. Ulterior a fost lăsată să crească la temperatură potrivită pe un mediu pe bază de sânge de cal, în urma acestui proces tulpinile bacteriene fiind inoculate în TSB. Șoarecii au fost injectați intraperitoneal, cu 100 µl de TSB ce conținea tulpina bacteriană. Greutatea corporală a șoarecilor a fost monitorizată zi de zi. După 4 ore, 1 zi sau 3 zile, șoarecii au fost omorâți și s-a realizat o spălătură peritoneală. După spălare și în urma recoltării lichidului, s-au realizat numărători pentru celulele care s-au infiltrat în lichid. Pentru a putea fi numărate, celulele au fost colorate, apoi centrifugate și sedimentul a fost înghețat. În urma analizelor s-a observat că: in celulele recoltate la 4 ore de la infecție era crescut numărul de celule peritoneale față de animalele neinfectate, acest fapt datorându-se creșterii numărului de neutrofile. La celulele recoltate la 3 zile de la infecție s-a observat că numărul de neutrofile a scăzut aproape de bază, dar acest declin s-a realizat pentru că a crescut numărul de macrofage. În concluzie, sistemul imunitar celular acționează în timp, cu implicarea treptată a elementelor componente.

În experimentul realizat de Marios Arvanitis și colab., au fost utilizați șoareci ca model experimental și tulpini bacteriene de S aureus rezistent la meticilină. Șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu doze letale de tulpini bacteriene fiind eutanasiați la scurt timp; pentru a putea fi observate efectele inoculării au fost prelevați rinichii și ficatul acestora. Înainte de eutanasiere unii șoareci au fost injectați cu vancomicină, pentru a ajuta la supraviețuire și pentru a le stimula sistemul imunitar. Șoarecii injectați cu această substanță au murit în 24 de ore. În urma analizei microscopice, în rinichii șoarecilor injectați s-au găsit tubulii dilatați, acumulări de proteine eozinofile și nefrotoxicitate, concluzia fiind că această substanță nu e utilă pentru supraviețuirea unei asemenea infecții.

Sunjun Yin și colab., au realizat experimente in vivo pentru testarea imunității antibacteriene. Șoarecii au fost ținuți în condiții bune și hrăniți corespunzător. Șoarecii au fost împărțiți în 4 grupuri, a câte 17 animale fiecare, urmând a fi anesteziați intraperitoneal și apoi injectați cu suspensia bacteriană, intravenos. După acest pas șoarecii au fost amestecați pentru a fi injectați cu 3 antibiotice, o data pe zi, timp de 2 zile. La 8 ore, 5 șoareci din fiecare grup au fost luați și eutanasiați și li s-a recoltat sânge. Ulterior s-au realizat numărări ale bacteriilor pentru stabilirea procentului cu care a avut loc răspunsul imun celular. Restul șoarecilor au fost atent monitorizați timp de o săptămână pentru a se realiza procentul de supraviețuire. În urma numărătorilor s-a observat că numărul de bacterii a scăzut în urma tratamentelor cu antibiotice dar cu performanțe diferite în funcție de antibioticul utilizat.

În experimentul realizat de Francesca Mancini și colab., s-au utilizat tulpini bacteriene de stafilococi, crescute pe mediu nutritiv la 37ºC . Bacteriile au fost centrifugate și splălate în PBS apoi realizându-se diluție în PBS pentru a se obține doza necesară pentru infectarea șoarecilor. Șoarecii au fost înjectați intravenos cu 100 µl de doză subletală de suspensie bacteriană. După 4 zile șoarecii au fost eutanasiați și li s-au prelevat rinichii, au fost omogenizati în PBS si s-au realizat diluții seriale pentru a se efectua numărări. Alți șoareci au fost injectați intraperitoneal și au fost puși sub observație timp de 15-30 de zile, iar șoarecii care au supraviețuit au fost eutanasiați, li s-au prelevat rinichii care au fost prelucrați pentru a se efectua numărări. În urma analizelor s-a realizat faptul că toate componentele sistemului imunitar au fost mobilizate pentru apărarea organismului, cu trecerea timpului și în funcție de doza de tulpini bacteriene injectată.

În experimentul realizat de Sun Hee Ahn și colab., s-a urmărit evidențierea răspunsului imun antibacterian in vivo. S-au utilizat ca modele experimentale animale și tulpini bacteriene de S aureus. Tulpinile bacteriene au fost lăsate la incubat, pe un mediu nutritiv, până în momentul în care au ajuns la faza de creștere logaritmică. Ulterior au fost centrifugate și resuspendate sedimentele în PBS, fiind urmat de diluarea soluțiilor. Injectarea bacteriilor s-a realizat intraperitoneal. Unul dintre obiectivele acestui experiment a constat în observarea vitezei de răspândire a infecției în organismul animalelor. Șoarecii au fost eutanasiați în zilele 0, 2, 4 și 6 de la injectare. Datorită dozei mari de bacterii, infecția s-a răspândit rapid. Astfel sistemul imunitar nu a putut face față fără ajutor prin intermediul vaccinurilor.

2.4 Concluzii

În experimentul prezentat, șoarecii au fost injectați cu suspensia bacteriană de tulpini de Staphylococcus aureus, lăsați 6 ore, apoi eutanasiați. S-a recoltat lichidul peritoneal care conținea macrofagele si s-au realizat numărători pentru observarea cantității de macrofage cu conținut bacterian. Pentru observarea răspunsului imun celular s-au făcut amprente de splină și intestin pe lamă, s-au analizat ,după colorare, la microscopul optic. De abia s-au observat câteva macrofage, pe un frotiurile cu amprentă de splină deci, răspunsul imun celular a avut loc, dar nu a fost timp suficient astfel încât să se poată observa macrofage și în intestin.

În urma studierii experimentelor realizate de diverși cerecetători, s-au putut observa variate metode de injectare a animalelor de laborator, de la injectare intraperitoneală la injectare intravenoasă, intramusculară și chiar injectare intranazală. Timpii de lăsare a șoarecilor până la eutanasiere variază în funcție de dozele de suspensii bacteriene administrate, astfel că pentru doze slabe, șoarecii trebuie lăsați mai multe ore, sau zile până la eutanasiere, iar pentru doze puternice, timpul se limitează la câteva ore, deoarece dacă sunt lăsați prea mult timp aceștia pot muri din cauza infecțiilor iar rezultatul obținut nu va mai avea relevanță. Rezultatele obținute în urma acestor studii au fost satisfăcătoare și utile pentru dezvoltarea ulterioară a vaccinurilor.

În concluzie, pentru obținerea de rezultate satisfăcătoare, trebuie luați în considerare factorii care au capacitatea de a influența decursul experimentului, de exemplu: timpul fiind foarte important întrucât de acesta depinde în mare parte succesul experimentului, doza suspensiei bacteriene injectate, modul de inoculare al bacteriilor, cât și modul de administrare la animalele de laborator .

Bibliografie

Alan R. Tall, Philippe Costet, and Nan Wang, 2002, Regulation and mechanisms of macrophage cholesterol efflux, The Journal of Clinical Investigation, Volume 110, Number 7, 110:899–904.

Alicja Trzeciak-Ryczek , Beata Tokarz-Deptuła , Wiesław Deptuła,2015, Antifungal immunity in selected fungal infections, Postepy Hig Med Dosw, 69: 469-474.

Amit Kumar, Wasim Abbas, Georges Herbein, 2014, HIV-1 Latency in Monocytes/Macrophages, Viruses, 1837-1860.

April M. Adkison, Sofia Z. Raptis, Diane G. Kelley, and Christine T.N. Pham, 2002, Dipeptidyl peptidase I activates neutrophil-derived serine proteases and regulates the development of acute experimental arthritis, J. Clin. Invest. 109:363–371

Arvin A, Campadelli-Fiume G, Mocarski E, Moore PS, Roizman B, Whitley R, Yamanishi K. 2007. Human herpesviruses: biology, therapy, and immunoprophylaxis. Cambridge University Press, Cambridge,United Kingdom.

Ayars, G., Altman, L., Gleich, G., Loegering, D. And Baker, C. ,1985 Eosinophil-and eosinophil granulemediated pneumocyte injury. J Allergy Clin Immunol 76: 595–604.

Beiting DP, Gagliardo LF, Hesse M, Bliss SK, Meskill D, Appleton JA. 2007; Coordinated control of immunity to muscle stage Trichinella spiralis by IL-10, regulatory T cells, and TGF-beta. J Immunol. 178:1039–1047.

Christopher B. Hergott, Aoife M. Roche, Nikhil A. Naidu, Clementina Mesaros, Ian A. Blair, and Jeffrey N. Weiser, 2015, Bacterial exploitation of phosphorylcholine mimicry suppresses inflammation to promote airway infection, The Journal of Clinical Investigation,125(10):3878–3890.

Das A, Ali N. 2012. Vaccine development against Leishmania donovani. Front Immunol 3:99.

Davoine, F. and Lacy, P. 2014, Eosinophil cytokines, chemochines, and growth factors: emerging roles in immunity. Front Immunol 5: 570.

Denburg, J. 1998, The origins of basophils and eosinophils in allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol 102: S74–S76.

Elin Ronnberg, Carl-Fredrik Johnzon, Gabriela Calounova, Gianni Garcia Faroldi, Mirjana Grujic, Karin Hartmann, Axel Roers, Bengt Guss, Anders Lundequist and Gunnar Pejler, 2014, Mast cells are activated by Staphylococcus aureus in vitro but do not influence the outcome of intraperitoneal S. aureus infection in vivo, Immunology, 143, 155–163.

Eltboli, O. and Brightling, C. 2013, Eosinophils as diagnostic tools in chronic lung disease. Expert Rev Respir Med 7: 33–42.

Fabien Loison, Haiyan Zhu, Kutay Karatepe, Anongnard Kasorn, Peng Liu, Keqiang Ye, Jiaxi Zhou, Shannan Cao, Haiyan Gong, Dieter E. Jenne,Eileen Remold-O’Donnell, Yuanfu Xu and Hongbo R. Luo, 2014, Proteinase 3–dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation, J Clin Invest.;124(10):4445–4458.

Fan Zhao, Brian L. Cheng, Susan Boyle-Vavra, Maria-Luisa Alegre, Robert S. Daum, Anita S. Chong, Christopher P. Montgomery, 2015, Proteomic Identification of saeRS-Dependent Targets Critical for Protective Humoral Immunity against Staphylococcus aureus Skin Infection, Infection and Immunity, 3712-3721.

Francesca Mancini, Elisabetta Monaci, Giuseppe Lofano, Antonina Torre, Marta Bacconi, Simona Tavarini, Chiara Sammicheli, Letizia Arcidiacono, Bruno Galletti, Donatello Laera, Michele Pallaoro, Giovanna Tuscano, Maria Rita Fontana, Giuliano Bensi, Guido Grandi, Silvia Rossi-Paccani, Sandra Nuti, Rino Rappuoli, Ennio De Gregorio, Fabio Bagnoli, Elisabetta Soldaini, Sylvie Bertholet, 2016, One Dose of Staphylococcus aureus 4C-Staph Vaccine Formulated with a Novel TLR7-Dependent Adjuvant Rapidly Protects Mice through Antibodies, Effector CD4+ T Cells and IL-17A, Plos One 1-18.

Francis, G.A., Knopp, R.H., and Oram, J.F. 1995. Defective removal of cellular cholesterol and phospholipids by apolipoprotein A-I in Tangier disease.J. Clin. Invest. 96:78–87.

Frigas, E., Motojima, S. and Gleich, G. 1991, The eosinophilic injury to the mucosa of the airways in the pathogenesis of bronchial asthma. Eur Respir J Suppl 13: 123s–135s.

Fulkerson, P. and Rothenberg, M. 2013, Targeting eosinophils in allergy, inflammation and beyond. Nat Rev Drug Discov 12: 117–129.

Georges Herbein, Audrey Varin, 2010, The macrophage in HIV-1 infection: From activation to deactivation?, Retrovirology, 7:33.

Glass M, Everett RD. 2013. Components of promyelocytic leukemia nuclear bodies (ND10) act cooperatively to repress herpesvirus infection. J Virol 87:2174–2185

Griffin MR, Zhu Y, Moore MR, Whitney CG, Grijalva CG. 2013 U.S. hospitalizations for pneumonia after a decade of pneumococcal vaccination. N Engl J Med.;369(2):155–163.

Guido Biozzi, Denise Mouton, Claude Stiffel, Yolande Bouthillier, 1984, A major role of macrophage in quantitative genetic regulation of imunoresponsiveness and antiinfectious immunity, Advances in Immunology, Frank J. Dixon, Academic Press INC,189-190.

H. Ueno, E. Klechevsky, R.Morita et al.,2007, Dendritic cell subsets in health and disease, Immunological Reviews, vol. 219, no. 1,pp.118–142.

Hirohito Kita, M.D, EOSINOPHILS: MULTIFACETED BIOLOGIC PROPERTIES AND ROLES IN HEALTH AND DISEASE, 2011, Immunol Rev., 242(1): 161–177

Hwan Keun Kim, Fabiana Falugi, Dominique M. Missiakas, and Olaf Schneewind, 2016, Peptidoglycan-linked protein A promotes T cell dependent antibody expansion during Staphylococcus aureus infection, PNAS, 5718–5723.

Jacques Mbongue, Dequina Nicholas, Anthony Firek și William Langridge, 2014, The Role of Dendritic Cells in Tissue-Specific Autoimmunity, Hindawi Publishing Corporation Journal of Immunology Research, 1-17.

Jianhua Yu, Aharon G. Freud, and Michael A Caligiuri,2013, Location and cellular stages of NK cell development, Trends Immunol. 34(12).

Jim Sun, Kaitlyn Schaaf, Alexandra Duverger, Frank Wolschendorf, Alexander Speer, Frederic Wagner, Michael Niederweis and Olaf Kutsch, 2016, Protein Phosphatase, Mg2+/Mn2+-dependent 1A controls the innate antiviral and antibacterial response of macrophages during HIV-1 and Mycobacterium tuberculosis infection, Oncotarget. 15394

Jordan S. Orange, MD, PhD,2013, Natural killer cell deficiency, J Allergy Clin Immunol. 132(3): 515–526.

Kay, A. 2014, The early history of the eosinophil. Clin Exp Allergy 45: 575–582.

Kolaczkowska E, Kubes P.2013, Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol.13(3):159–175.

Kondo M, et al. 2001, Lymphocyte development from hematopoietic stem cells. Curr Opin Genet Dev.; 11:520–526.

Kylie A. Alexander, Ryan Flynn, Katie E. Lineburg, Rachel D. Kuns, Bianca E. Teal, Stuart D. Olver, Mary Lor, Neil C. Raffelt,Motoko Koyama, Lucie Leveque, Laetitia Le Texier, Michelle Melino, Kate A. Markey, Antiopi Varelias,Christian Engwerda,Jonathan S. Serody, Baptiste Janela, Florent Ginhoux, Andrew D. Clouston,Bruce R. Blazar, Geoffrey R. Hill and Kelli P.A. MacDonald, 2014, CSF-1–dependant donor-derived macrophages mediate chronic graft-versus-host disease, J Clin Invest.;124(10):4266–4280.

Lanier LL. 2008, Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. Nat Immunol.; 9:495–502

Leena George and Christopher E. Brightling, 2016, Eosinophilic airway inflammation: role in asthma and chronic obstructive pulmonary disease, Therapeutic Advances in Chronic Disease, Vol. 7(1) 34–51.

Luijk, B., Lindemans, C., Kanters, D., van der Heijde, R., Bertics, P., Lammers, J. et al. 2005, Gradual increase in priming of human eosinophils during extravasation from peripheral blood to the airways in response to allergen challenge. J Allergy Clin Immunol 115: 997–1003.

Luokun Xie, Ethan C Poteet, Wenjun Li, Amanda E Scott, Ran Liu, Yi Wen, Anuja Ghorpade, James W Simpkins, Shao-Hua Yang, Xie et al. 2010, Modulation of polymorphonuclear neutrophil functions by astrocytes, Journal of Neuroinflammation, 7:53.

M. Moser andK. M. Murphy,2000, Dendritic cell regulation ofTH1-TH2 development, Nature Immunology, vol. 1, no. 3, pp. 199–205.

Marios Arvanitis, Gang Li1, De-Dong Li1, Daniel Cotnoir, Lisa Ganley-Leal, Daniel W. Carney, Jason K. Sello4, Eleftherios Mylonakis,2016, A Conformationally Constrained Cyclic Acyldepsipeptide Is Highly Effective in Mice Infected with Methicillin-Susceptible and -Resistant Staphylococcus aureus, PLOS ONE, 1-10.

Marodi L, Schreiber S, Anderson DC, MacDermott RP, Korchak HM,Johnston RB Jr.1993, Enhancement of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma. Increased phagocytosis, killing, and calcium signal mediated by a decreased number of mannose receptors. J Clin Invest 91:2596–601.

Martina Selle, Tobias Hertlein, Babett Oesterreich, Theresa Klemm, Peggy Kloppot, Elke Müller, Ralf Ehricht, Sebastian Stentzel, Barbara M. Bröker, Susanne Engelmann și Knut Ohlsena, 2016, Global antibody response to Staphylococcus aureus live-cell vaccination, Scientific reports, 6, 24754.

Md. Selim Ahmed and Yong-Soo Bae, 2016, Dendritic Cell-based Immunotherapy for Rheumatoid Arthritis: from Bench to Bedside, IMMUNE NETWORK Vol. 16, No. 1: 44-51.

Nathan C, 2006, Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.Nature Rev Immunol 6:173-182.

Navarro, S., Aleu, J., Jimenez, M., Boix, E.,Cuchillo, C. and Nogues, M. 2008, The cytotoxicity of eosinophil cationic protein/ribonuclease 3 on eukaryotic cell lines takes place through its aggregation on the cell membrane. Cell Mol Life Sci 65: 324–337.

Oram, J.F., Albers, J.J., Cheung, M.C., and Bierman, E.L. 1981. The effects of subfractions of high density lipoprotein on cholesterol efflux from cultured fibroblasts. Regulation of low density lipoprotein receptor activity. J. Biol. Chem. 256:8348–8356.

Parna Bhattacharya, Ranadhir Dey, Pradeep K. Dagur, Michael Kruhlak, Nevien Ismail, Alain Debrabant, Amritanshu B. Joshi, Adovi Akue, Mark Kukuruga, Kazuyo Takeda, Angamuthu Selvapandiyan, John Philip McCoy, Jr., Hira L. Nakhasi, 2015, Genetically Modified Live Attenuated Leishmania donovani Parasites Induce Innate Immunity through Classical Activation of Macrophages That Direct the Th1 Response in Mice, Infection and Immunity, 3800-3815.

Peter Densen,Gerard L Manden, 1978, Gonococcal Interactions with Polymorphonuclear Neutrophils, J. Clin. Invest, Volume 62, 1161-1171.

Petra Krause, Venetia Morris, Jason A. Greenbaum, Yoon Park, Unni Bjoerheden Zbigniew Mikulski, Tracy Muffley, Jr-Wen Shui, Gisen Kim, Hilde Cheroutre, Yun- Cai Liu, Bjoern Peters, Mitchell Kronenberg, and Masako Murai, 2015, IL-10 producing intestinal macrophages prevent excessive antibacterial innate immunity by limiting IL-23 synthesis, Nat Commun. ; 6: 7055.

R. M. Steinman and J. Banchereau, 2007. Taking dendritic cells into medicine, Nature, vol. 449, no. 7161, pp. 419–426,

Romee R, Leong JW, Fehniger TA. 2014 Utilizing cytokines to function-enable human NK cells for the immunotherapy of cancer. Scientifica (Cairo); 2014: 205796.

Rosenberg, H., Phipps, S. and Foster, P. 2007, Eosinophil trafficking in allergy and asthma. J Allergy Clin Immunol 119: 1303–1310.

Rosenberg HF, Dyer KD, Foster PS.,2013 Eosinophils: changing perspectives in health and disease. Nat Rev Immunol. 13:9–22

Rubin, E.M., Krauss, R.M., Spangler, E.A., Verstuyft, J.G., and Clift, S.M.1991. Inhibition of early atherogenesis in transgenic mice by human apolipoprotein AI. Nature. 353:265–267.

Ryan Finethy, Ine Jorgensen, Arun K. Haldar, Marcel R. de Zoete, Till Strowig, Richard A. Flavell, Masahiro Yamamoto, Uma M. Nagarajan, Edward A. Miao and Jörn Coers, 2015, Guanylate Binding Proteins Enable Rapid Activation of Canonical and Noncanonical Inflammasomes in Chlamydia-Infected Macrophages, Infect. Immun, 4740-4749.

Sabin EA, Kopf MA, Pearce EJ. 1996 Schistosoma mansoni egg-induced early IL-4 production is dependent upon IL-5 and eosinophils. J Exp Med.; 184:1871–1878

Sandra Winning and Joachim Fandrey, 2016, Dendritic Cells under Hypoxia: How Oxygen Shortage Affects the Linkage between Innate and Adaptive Immunity, Hindawi Publishing Corporation Journal of Immunology Research, Article ID 5134329, 8 pages

Shimodaira K, Okubo Y, Nakayama H, Wakayama M, Shinozaki M, Ishiwatari T, et al.,2012, Trends in the prevalence of invasive fungal infections from an analysis of annual records of autopsy cases of Toho University. Mycoses 55:435–43.

Siamon Gordon, 2007, Macrophage heterogeneity and tissue lipids, : J. Clin. Invest. 117:89–93 .

Slava Epelman, Kory J. Lavine, and Gwendalyn J. Randolph, 2014,Origin and Functions of Tissue Macrophages, Immunity; 41(1): 21–35.

Spits H, et al. 2013, Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol.;13:145–149.

Steinman, R. M. 2012. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30: 1-22.

Steinman, R. M., and M. C. Nussenzweig. 2002. Avoiding horror autotoxicus: the importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 351-358.

Suk Ran Yoon, Tae-Don Kim and Inpyo Choi,2015, Understanding of molecular mechanisms in natural killer cell therapy, Experimental & Molecular Medicine 47, e141.

Sun Hee Ahn ,Ephraim L. Tsalik ,Derek D. Cyr,Yurong Zhang,Jennifer C. van Velkinburgh,Raymond J. Langley,Seth W. Glickman,Charles B. Cairns,Aimee K. Zaas,Emanuel P. Rivers,Ronny M. Otero,Tim Veldman,Stephen F. Kingsmore,Joseph Lucas,Christopher W. Woods,Geoffrey S. Ginsburg ,Vance G. Fowler Jr, 2013, Gene Expression-Based Classifiers Identify Staphylococcus aureus Infection in Mice and Humans, Plos One, 1-16.

Sunjun Yin, Gaoxiong Rao, Jin Wang, Liyang Luo, Gonghao He, Chengying Wang, Chaoyu Ma, Xiaoxing Luo, Zheng Hou, Guili Xu, 2015, Roemerine Improves the Survival Rate of Septicemic BALB/c Mice by Increasing the Cell Membrane Permeability of Staphylococcus aureus, Plos One 1-13.

Therwa Hamza și Bingyun Li, 2014, Differential responses of osteoblasts and macrophages upon Staphylococcus aureus infection, Microbiology, 14:207.

Thomas A. Wynn, Ajay Chawla, and Jeffrey W. Pollard.2013 Origins and Hallmarks of Macrophages: Development,Homeostasis, and Disease. Nature.; 496(7446): 445–455.

Vivier E, et al. 2011; Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science.331:44–49.

Vivier E, Ugolini S, Blaise D, Chabannon C, Brossay L. 2012 Targeting natural killer cells and natural killer T cells in cancer. Nat Rev Immunol; 12: 239–252

Voigtlander, C., S. Rossner, E. Cierpka, G. Theiner, C. Wiethe,M. Menges, G. Schuler, and M. B. Lutz. 2006. Dendritic cells matured with TNF can be further activated in vitro and after subcutaneous injection in vivo which converts their tolerogenicity into immunogenicity. J. Immunother. 29: 407-415.

Walsh ER, Thakar J, Stokes K, Huang F, Albert R, August A. 2011; Computational and experimental analysis reveals a requirement for eosinophil-derived IL-13 for the development of allergic airway responses in C57BL/6 mice. J Immunol. 186:2936–2949

Wen Jing Sim, Patricia Jennifer Ahl and John Edward Connolly, 2016, Metabolism Is Central to Tolerogenic Dendritic Cell Function, Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation , Article ID 2636701, 10 page

Williams, K.J., and Tabas, I. 1998. The response-to-retention hypothesis of atherogenesis reinforced. Curr. Opin. Lipidol. 9:471–474.

Yang D, Chen Q, Su SB, Zhang P, Kurosaka K, Caspi RR, Michalek SM, Rosenberg HF, Zhang N, Oppenheim JJ. 2008 Eosinophil-derived neurotoxin acts as an alarmin to activate the TLR2-MyD88 signal pathway in dendritic cells and enhances Th2 immune responses. J Exp Med.; 205:79–90.

Yi-Guo Chen, Yong Zhang, Lin-Qiang Deng, Hui Chen, Yu-Juan Zhang, Nan-Jin Zhou, Keng Yuan, Li-Zhi Yu, Zhang-Hua Xiong, Xiao-Mei Gui, Yan-Rong Yu,Xiao-Mu Wu, Wei-Ping Min, 2016, Control of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Pneumonia Utilizing TLR2 Agonist Pam3CSK4, PLOS ONE, 1-16.

Zeinab Abdullah și Percy A Knolle, 2014, Scaling of immune responses against intracellular bac terial infection, EMBO J, 2283–2294.