Corelatii Clinico Morfologice Prin Studiu Citologic Si Imunohistochimic In Diagnosticul Si Terapia Tumorilor de Tesuturi Moi Orale Si Periorale

TEZĂ DE DOCTORAT

CORELAȚII CLINICO-MORFOLOGICE PRIN STUDIU CITOLOGIC ȘI IMUNOHISTOCHIMIC ÎN DIAGNOSTICUL ȘI TERAPIA TUMORILOR DE ȚESUTURI MOI ORALE ȘI PERIORALE

CUPRINS

Lista abrevierilor și simboluri

aFGF – Acidic Fibroblast Growth Factor

AA – Albastru Alcian

ABC – Avidin-Biotin-Complex

ADN – Acidul dezoxiribonucleic

AEC – 3-amino-9-ethylcarbazole

AH – Acid hialuronic

AJCC – American Joint Committee on Cancer

APT – Albastru policrom-tanin

ARN – Acidul ribonucleic

ARK – Animal Research Kit

AT – Albastru de toluidine

bFGF – Basic Fibroblast Growth Factor

cAMP – Adenozin-monofosfatului

CA – Citoamprentaj

CBC – Carcinom bazocelular

CDK – Kinazele cyclin-dependente

CK – Citokine

Cr – Corp rezidual

CS – Condroitin sulfat

CSA – Catalyzed Signal Amplification

CSC – Carcinom scuamocelular

DAB – 3,3'-diaminobenzidina

DIV – Disc intervertebral

EBRT – Radioterapie prin iradiere externă (External Beam Radiation Therapy)

EB – Epstein-Barr

EBV – Epstein-Barr Virus

EGFR – Receptorul pentru factorul de creștere epidermică

FITC – Fluorescein isothiocyanate

G – Complex Golgi

GAG – Glicozaminoglicani

GI – Glicogen

GP – Glicoproteine

HE – Hematoxilină-eozină

HPV – Virusul Papiloma uman

HRP – Horse Radish Peroxidase

IF – Inel fibros

IHC – Imunohistochimia

KS – Keratan sulfați

LCA – Antigenul comun leucocitar (Leukocyte Common Antigen)

LOH – Loss of heterozygosity

LSAB – Labeled Streptavidin Biotin

ME – Microscopie electronică

MGM – May-Grünwald-Giemsa

EBRT – External beam radiotherapy or teletherapy

MO – Microscopie optică

MPZ – Mucopolizaharide

MUP – metastază la care nu se cunoaște localizarea primară a tumorii

NCCN – National Comprehensive Cancer Network

NK – Celule Natural Killer

NSE – Enolaza neuron specifica (Neuron Specific Enolase)

OMF – Oro-maxilo-facial

PAF – Puncție aspirativă cu ac fin

PAP – Papanicolaou/peroxidaza-antiperoxidaza

PAS – Periodic acid Schiff

PBS – Phosphate Buffered Saline

PCNA – Antigenul nuclear al proliferării celulare

PDGF – Factorul de creștere derivate din trombocite

PG – Proteoglicani

PVA – Polyvinyl alcohol

RER – Reticul endoplasmatic rugos

SC – Stromal Cells

SEM – Scan-electrono-microscopia

SF – Substanță fundamental

SMA – Smooth Muscle Actin

TBS – Tris Buffered Saline

TGF-α – Factorul de transformare /creștere tumorală alfa

TGF-β – Factorul de transformare/creștere tumorală beta

UICC – Union for International Cancer Control

vWF – Factorul VIII von Willebrandt

VEGF – Factorul de creștere a endoteliului vascular

VIM – Vimentina

ZEBRA- Z Epstein Barr Replication Activator

Lista tabelelor

Lista figurilor (imagini, grafice)

Introducere

În medicina modernă a ultimilor ani, cito- și histodiagnosticul reprezintă o prioritate în diagnosticul leziunilor tumorale și instituirea unor terapii țintite. Varietatea maladiilor, unele complet necunoscute sau apărute ca urmare a noilor metode terapeutice, ca și complexitatea maladiei canceroase, așează diagnosticul anatomo-patologic perioperator pe un loc central, adeseori alături de tehnicile imagistice medicale ca radiografiile de finețe, tomodensitometria, echotomografia, rezonanța magnetică nucleară, investigația radioizotopică.

Ca și în trecut, când clinicianul era și anatomo-patolog, descriind și interpretând leziunile, asistăm astăzi la o legare tot mai strânsă între momentul clinic al diagnosticului și conturarea sa în descrierea anatomo-patologică lezională. La interferență se află și alte domenii precum biologia moleculară și submoleculară sau imunologia. Definirea entităților biologice a neoplaziilor benigne și maligne prin imunofenotipizare tumorală, imprimă noi strategii terapeutice. Fiecare tip de terapie se bazează deci pe principiul interceptării aberațiilor specifice ale neoplaziei maligne. Așa de exemplu este imunoterapia prin antigene exprimate de anumite tumori, utilizarea agenților de stopare ai diferențierii (acidul retinoic all-trans) și îndepărtarea stimulului antigenic care conduce creșterea limfomatoasă.

Se conturează astfel o schimbare profundă a concepției și practicii medicale care vin să-și aducă tot mai mult contribuția la menținerea stării de sănătate și la introducerea terapiei cât mai adecvate în asanarea bolii.

În chirurgia orală și maxilo-facială asistăm la dificultatea deciziilor terapeutice legate de conservarea țesuturilor, atât în scop estetic cât și funcțional, fiecare pacient prezentând un caz unic de protocol terapeutic. De aici și necesitatea unui diagnostic orientativ, pertinent, care să delimiteze și să excludă leziunile cu potențial malign de cele tumorale, iar în cazul unui proces proliferativ, stabilirea liniei celulare tumorale. Conjugarea datelor citologice cu cele histopatologice și imunohistochimice în studiul tumorilor mai frecvent abordate chirurgical la nivel oral și perioral este o strategie de lucru cu implicare multidisciplinară, care permite înțelegerea progresiunii lezionale într-un teritoriu tisular complex, în care leziunile disontogenetice se intrică într-o mare măsură cu cele inflamatorii și nu în ultimul rând cu cele tumorale benigne și maligne.

Pornită din nevoia de a comunica o parte a experienței clinice în abordarea diversității lezionale la nivel oral și paraoral, șlefuită de-a lungul anilor de unele eșecuri, dar și de reale satisfacții profesionale în ceea ce privește screeningul și monitorizarea pacienților aferenți specialității noastre, am conturat o modalitate rapidă, modernă și tot mai uzitată de diagnostic pre-, intra- și postoperator prin cito-histo-imunohistochimie.

Devine evidentă o schimbare profundă a concepției și practicii medicale curente care vine să-și aducă tot mai mult contribuția la menținerea stării de sănătate și la introducerea unei terapii optimizate prin introducerea unui studiu fundamental bio-molecular în evaluarea microscopică a leziunilor. În elaborarea diagnosticului unei tumori endo- sau exoorale, anatomo-patologul trebuie să participe activ, alături de chirurgul maxilofacial, în aprecierea gradului de extensie tumorală și la activitatea pluridisciplinară pre- și postterapeutică. Aceasta presupune o bună experiență atât în macroscopie, microscopie, cât și în citopatologie. Cunoașterea topografiei și structurii histologice a organelor din regiunea laterocervicală este indispensabilă în interpretarea diagnosticului stabilit în etapa clinică sau preoperatorie. Studiul macroscopic complet al pieselor operatorii cu secțiunea tumorală în tranșe seriate, reperarea limitelor neoplazice, disecția ariilor ganglionare limfatice, unele după altele sunt momente importante în conturarea diagnosticului. De multe ori, datele clinice și histopatologice sunt în discordanță, fie din cauza expresiei histologice lezionale care este limitată, nepermițând un diagnostic precis, fie prin interpretare eronată a cupelor histologice, datorită incorectei integrări clinice a cazuisticii sau printr-un material biopsic insuficient evaluării histologice. Spiritul critic construiește totuși cunoașterea. De cele mai multe ori analiza rațională a unei erori de diagnostic poate aduce mai multă completare informațională și avantaje experienței decât cea mai detaliată interpretare.

În studiul de față am încercat să expunem rezultatele muncii practice, rod al colaborării multidisciplinare între Clinica de Chirurgie Orală și Maxilo-facială și Laboratorul de Anatomie Patologică a Spitalului Clinic de Urgență Municipal Timișoara.

Studiul de față este un studiu cumulativ, retro-prospectiv, cazuistica fiind selectată în perioada 2008-2013 și integrată clinic și evolutiv. Studiul este subâmpărțit într-un studiu retrospectiv clinico-statistic și într-un studiu cumulativ retro-prospectiv cito-histo-imunohistochimic, acestea vizând leziunile tumorale de părți moi orale și periorale din sfera oro-maxilo-facială, inclusiv regiunea latero-cervicală.

Studiul clinico-statistic este un studiu încrucișat, descriptiv, retrospectiv pe pacienții cu tumori de țesuturi moi orale și periorale internați în Clinica de Chirurgie Orală și Maxilofacială a Spitalului Clinic Municipal de Urgență din Timișoara, urmărind determinarea frecvenței și a tiparului de apariție a leziunilor tumorale de țesuturi moi orale și periorale, cu accent pe localizare și tipul histologic lezional, corelând datele anamnestice și evolutive consemnate în baza de date a spitalului, cu rezultatele examenelor histopatologice.

În cadrul studiului cumulativ retro-prospectiv cito-histopatologic, am efectuat o analiza corelativă între rezulatatele examenelor citologice ale leziunilor benigne, precursoare și maligne, ale tumorilor de părți moi orale și periorale, rezutatele examenului histopatologic și, într-un număr selectat de cazuri, cu rezulatatele imunohistochimice. Leziunile tumorale au fost investigate citologic preoperator prin puncție aspirativă, exfoliere, citoamprentaj, cu verificarea ulterioară a citodiagnosticului cu histodiagnosticul și aprofundare informațională prin imunohistochimie.

Leziunile investigate morfologic au cuprins răspunsul tisular al diferitelor organe și structuri din sfera orală și periorală, incluzând glandele salivare și limfonodulii în context inflamator, tumoral, dismetabolic, disontogenetic. Fiecare caz investigat a fost integrat clinic și paraclinic. Utilizarea unui mare număr de anticorpi, 26 la număr, capabili să evidențieze antigene tisulare pe secțiuni la parafină, permite o analiză morfologică de mare calitate.

Recidivele tumorale locale după extirpare chirurgicală, au putut fi explicate în majoritatea cazurilor, prin metode imunohistochimice de fenotipare tumorală și evaluarea potențialului agresiv al tumorii prin markerii ciclului celular și de proliferare.

Depistarea unor patternuri oncogenice prin tehnica imonohistochimică oferă informații importante nu numai cu rol de screening lezional ci și pentru diagnosticare, evaluarea prognosticului tumoral și planificarea terapiei.

.

1. PARTEA GENERALĂ

1.1 Carcinogeneza

Cancerul este produs prin apariția unor mutații la nivelul celulelor normale prin care se modifică echilibrul dintre proliferarea și moartea celulelor.[1] Diviziunea celulelor devine rapidă, necontrolată și generează tumori benigne sau maligne. Pierderea controlului proliferării celulare se produce prin mutații ale genelor care joacă un rol vital în diviziunea celulelor, în apoptoză (moartea celulelor) și în repararea ADN-ului modificat. Sunt cunoscute peste 20 de mutații care inițiază carcinogeneza, fiind necesare mai multe mutații la aceeași celulă pentru a deveni o celulă modificată genetic cu potențial neoplazic. Cancerul este în principal o boală a genelor care controlează creșterea celulară. [2][3][4][5][6][7][8]

Ciclul celular [9][10]

Ciclul celular normal cuprinde 4 faze:

Faza G1: celulele se măresc și se pregătesc pentru copierea ADN-ului.

Faza S (sinteza): cromozomii se replică, în celulă apărând copii complementare.

Faza G2: cromozomii se pregătesc să se separe în vederea diviziunii celulare.

Faza M (mitoza): din celula mamă rezultă două celule fiice, fiecare având un set complet de cromozomi identic cu al celulei mamă.

Celulele fiice pot intra în ciclul de diviziune imediat sau se pot întoarce în faza G0 (de repaus) în care celulele rămân în stadiul latent până la apariția unui nou semnal de recrutare. Celulele din faza G1, deși evoluează, pot reintra în faza G0 înainte de a ajunge la punctul R. Dezvoltarea lor dincolo de acest punct le obligă să intre în ciclul de diviziune.

Controlul ciclului de diviziune al celulelor se face prin cycline și cyclin-dependent kinază. Cyclin-D acționează ca factor de inhibare a creșterii celulare prin eliberarea pRb (proteina Rb) care face celula incapabilă să se dividă. 40% din cancerele la om au mutații genetice în gena Rb care, prin inactivarea acestei proteine, produce creșterea anormală a celulelor. Sunt cunoscute mai multe proteine inhibitorii ale progresiunii ciclului celular (p15,lar (p15, p16, p21, p53 etc). Inhibarea p53 permite celulelor cu ADN modificat genetic să supraviețuiască și să transmită aceste modificări celulelor fiice, care vor putea suferi în continuare noi mutații generatoare ale evoluției spre carcinogeneză. Proteina p53 prezintă modificări anormale la 50% din cancerele înregistrate la om.

Numeroase studii au demonstrat că supraexpresia p53 și a Ki-67 poate fi considerată indicator în confirmarea carcinogenezei orale[11][12][13] în timp ce supraexpresia Cyclin-D1poate fi corelată cu invazivitatea și agresivitatea tumorală locală.[13][14]. Există o corelație pozitivă între expresia Cyclin-D1 și Ki-67 în cancerele orale în stadiile avansate.[13][14]

În biologia cancerului au fost descrise mai multe etape succesive:

Modificarea ADN-ului sub acțiunea radiațiilor, hipoxiei, substanțelor chimice carcinogene, etc.

Dezvoltarea unei mutații genetice permanente.

Creșterea proliferării celulelor tumorale și dezvoltarea tumorii prin acțiunea unor factori de creștere specifici (substanțe cancerigene din tutun, droguri, hormoni, etc.).

Apariția unor modificări morfologice și creșterea potențialului malign al tumorilor urmate de invazie locală, metastazare și apariția rezistenței la tratament prin acțiunea continuă a unor agenți mutageni sau non-mutageni.[15][16][17]

Mecanismele carcinogenezei[18][19][10][20]

În inițierea și dezvoltarea creșterii tumorale a celulelor sunt implicate proto-oncogenele, genele supresoare ale tumorilor, mutațiile multiple, infecțiile bacteriene și virale, sistemul imunitar, cytokinele și mediatorii răspunsului inflamator, modificările apoptozei și factori de risc.

Proto-oncogenele sunt gene prezente normal pe cromozom care favorizează creșterea celulelor, codifică factorii de stimulare a creșterii, receptorii pentru factorii de creștere și proteinele implicate în căile de transmitere a semnalului de la suprafața celulei la nucleu și factorii de reglare ai transcripției. Mutațiile produse la nivelul proto-oncogenelor le modifică expresia și funcția transformându-le în oncogene adevărate. Celulele cu oncogene se divid excesiv și necontrolat și au o probabilitate mare de transformare în celule canceroase.

Genele supresoare ale tumorilor codifică proteinele care suprimă mitoza și creșterea celulară. În general, sunt factori de transcripție activați prin stresul celular și/sau prin modificări ale ADN-ului. Frecvent pot apărea fragmente de ADN defect, libere în celulă, care activează sinteza unor enzime ale căilor de activare a genelor supresoare. Funcția acestor gene este de a opri ciclul celular și de a repara ADN-ul pentru a nu fi transmis celulelor fiice. Mutațiile pot avea loc și la nivelul genelor supresoare sau în căile de semnalizare care inactivează aceste gene. În consecință, repararea ADN-ului este limitată sau inhibată și defectele ADN-ului se acumulează, evoluția spre cancerizare fiind inerentă.

Mutațiile multiple. Pentru apariția cancerului sunt necesare atât mutații ale proto-oncogenelor cât și ale genelor supresoare. Oncogenele sunt gene cu transmitere dominantă, iar genele supresoare ale tumorilor sunt gene cu transmitere recesivă. Pentru fiecare genă există 2 copii primite fiecare de la un părinte, deci mutația produsă la o genă de tip proto-oncogen este suficientă ca să devină oncogenă adevărată. La genele supresoare mutația trebuie să afecteze ambele gene pentru a deveni funcțională. Mutația unei gene supresoare se transmite la descendenți cu apariția fenotipului neoplazic.

Citokinele constituie un grup de peste 100 de molecule active cu rol în transmiterea informației privind creșterea celulelor. Exemple de citokine: interleukine, interferon, factor de necroză tumorală, factori de stimulare a creșterii coloniilor celulare, chemokine etc. Citokinele împreună cu hormonii și neuro-transmițătorii coordonează interacțiunea dintre celule, au rol în răspun-sul sistemului imunitar, în creșterea și dezvoltarea celulelor.[21][22][15][23]

Mediatorii răspunsului inflamator.

Clasa interferon (alfa, beta, gamma) au activitate anti-tumorală complexă asupra celulelor normale și neoplazice.

Limfokinele: activează limfocitele T killer.

Interleukinele modulează răspunsul imun și inflamator. IL2 stimulează producerea interferonului alfa, factorului de necroză tumorală și activează limfocitele NK.

Sistemul imunitar este activat chiar de apariția celulelor tumorale. Totuși, la nivelul tumorii există factori de supresie ai sistemului imunitar care în unele cancere poate progresa până la instalarea unei supresii generale a întregului sistemului imunitar uman.

Apoptoza (moartea celulelor) apare la celulele îmbătrânite după aproximativ 50-60 de diviziuni. Celulele își încetează creșterea, intră în senescență și mor, apoptoza fiind o parte naturală a ciclului celular. Celulele cu leziuni sunt de asemenea programate pentru apoptoză, ca o reacție de apărare a organismului pentru eliminarea propagării mutației neoplazice. Reducerea numărului de celule care intră în apoptoză și oprirea distrugerii celulelor modificate genetic sunt mecanisme de apariție a carcinogenezei.

Factorii de creștere se leagă de receptori specifici aflați la suprafața membranei celulei și inițiază fosforilări și activări în cascadă ale unor enzime intra-celulare pe căile de transmitere ale informației de la suprafața celulei la nucleu. Etapa finală constă în activarea factorilor de transcripție care se leagă de ADN și reglează genele transcripției și translocației pentru inițierea diviziunii celulare.

Factori mutageni necarcinogeni sunt cunoscuți pentru efectul stimulator al mitozelor celulare. Alcoolul și hormonii estrogeni cresc rata diviziunilor celulare și prin aceasta reduc posibilitatea enzimelor de a repara ADN-ul modificat, favorizând transmiterea modificării la celulele fiice și creșterea probabilității de transformare a acestora în celule neoplazice.

Rolul infecțiilor bacteriene și virale. Infecția cu Helicobacter Pylori este asociată statistic cu apariția cancerelor gastrice, dar mecanismul nu este încă descifrat în totalitate. Infecțiile virale sunt asociate in proporție de 15% cancerelor care apar la om. Virusurile care se modifică rapid au în genom o oncogenă activă care transformă malign celulele în momentul infectării. Virusurile care se modifică lent transformă proto-oncogenele unei celule normale în oncogene adevărate atunci când genomul viral se inseră în ADN-ul gazdei, lângă genele care reglează creșterea celulară.

Celulele care conțin oncogene virale inserate în apropierea genelor responsabile de controlul proliferării celulei, se divid mai rapid și suferă mai ușor mutații suplimentare sub acțiunea factorilor fizici, chimici sau virali. Se intră într-un cerc vicios în care celulele modificate se divid mai rapid, transmit mutațiile celulelor fiice, care vor forma grupuri de celule neoplazice. Acest model al carcinogenezei explică convingător creșterea tumorilor. Un alt model al carcinogenezei susține apariția cancerului la nivelul celulelor stem adulte. Acestea persistă în tumoră sau în afara tumorii și explică recăderile bolii canceroase după tratament și apariția metastazelor.[24][25][26][27][28][29][30] [31]

1.2 Generalități privind tehnica cito-histopatologică [32][33][34][35][36][37]

Principalele etape obligatorii pentru obținerea unor preparate histologi-ce de calitate, interpretabile microscopic sunt:

Recoltarea prin biopsie sau necropsie a unui fragment tisular cu grosimea de până la 1 cm și suprafața maximă de 2 cm2.

Fixarea întrerupe evoluția biochimică celular-tisulară, nu alterează structura, o conservă, prevenind degradarea prin precipitare a proteinelor, favorizează colorarea ulterioară a elementelor din constituția piesei histologice. Fixatorii sunt fizici (căldură, înghețare, uscare în vid), chimici simpli (formalina, alcool etilic 70 – 1000, etc.) și chimici compuși. Alegerea fixatorului este esențială pentru conservarea unor substraturi.

Incluzionarea pieselor în parafină sau omologi sintetici (Histoplast, Paraplast) este precedată de spălarea și îndepărtarea fixatorului, apoi deshidratare (cu alcool 70° – 80° – 90° – 1000) și clarefierea cu xilen sau alți solvenți ai parafinei. Incluzionarea la gheață permite secționarea imediată a piesei fără deshidratare sau clarefiere (fixarea se face la criostat, iar secționarea la criotom). Prin solidificare se obține un bloc paralelipipedic.

Secționarea blocului de parafină se realizează cu microtomul la 5-7 µm grosime. Parafina este suport fizic și împiedică deformarea celulelor în timpul secționării. Se obțin fâșii care conțin secțiunea ce urmează a fi colorată.

Colorarea se face cu coloranți naturali sau sintetici în soluție apoasă sau alcoolică. Colorarea este precedată de deparafinarea (prin solvenți organici) și apoi de rehidratarea secțiunilor în alcool (100° – 90° – 80° – 70° – 600) și apă. Colorațiile sunt morfologice, permițând recunoașterea țesuturilor și structurilor componente și histochimice care evidențiază doar anumite substraturi biochimice din secțiune.

Coloranții sunt bazici, reacționând cu substraturile bazofile (nucleii celulelor, citoplasmele celulelor tinere, ergastoplasma), acizi, ce colorează substraturile acidofile (citoplasmele celulelor adulte, fibrele de colagen) și neutri. Coloranți bazici mai folosiți sunt: hematoxilina, safranina, fuxina bazică, albastru de metilen, azurul. Coloranți acizi sunt: eozina, fuxina acidă, verdele lumină, oranj G. Substratele neutre cum ar fi granulațiile neutrofilului sanguin au afinitate pentru coloranții neutri, ca de exemplu eozinatul de albastru de metilen.

Evidențierea grăsimilor se face prin utilizarea coloranților liposolubili cum ar fi: Sudan III, Sudan IV, Sudan negru B, tetraoxidul de osmiu.

Preparatele histologice proaspete se colorează cu coloranți vitali: albastru de tripan, tușul de China, carminul litinat, roșu neutru, verde Janus, albastru de metilen.

Unii coloranți bazici (de exemplu, albastru de toluidină) evidențiază substratul într-o culoare diferită de cea pe care o are colorantul. Fenomenul se numește metacromazie (spre deosebire de ortocromazie în care substratul redă culoarea colorantului folosit), iar colorantul este metacromatic.

Metode de colorare selective alături de cele pentru grăsimi sunt: pentru evidențierea fibrelor elastice (rezorcin-fuxină, orceină), pentru fibrele de reticulină și membrane bazale (impregnarea argentică Gömöri).

Pentru studiul țesutului nervos se utilizează impregnări argentice, ca exemplu: metoda Golgi (evidențiază siluetele neuronale și gliale), metoda Ramon Y Cajal (evidențiază neurofibrilele). Impregnările metalice (cu argint, aur, crom) se bazează pe proprietatea unor săruri a acestor metale grele de a se reduce la nivelul substratului, dând un depozit de particule fine brune sau negre. În aceste metode se utilizează substanțe chimice pure.

Argirofilia semnifică reducerea sării de argint utilizate la impregnare datorită intervenției unui agent reducător (formol, hidrochinonă etc.).

Argentofilia (reacție argentafină) semnifică reducerea sării de argint datorită unor grupări chimice reducătoare, prezente la nivelul structurilor evidențiate, fără concursul unui agent reducător din afară. Metoda are deci semnificație histochimică.

După numărul coloranților folosiți, colorațiile histologice sunt: monocrome, bicrome, tricrome, policrome. Cea mai utilizată colorație în laboratoarele de histologie normală și patologică este colorația hematoxilină-eozină (HE). Timpii colorației cu HE pe secțiuni la gheață sunt aceiași ca după incluzionarea în parafină, exceptând deparafinarea și hidratarea.

6. Montarea secțiunii histologice are menirea de a o proteja în timp, de a conserva neschimbată colorația și de a asigura un mediu optic omogen, transparent. Substanța conservatoare folosită se numește mediu de montare și poate fi apoasă (glicerina, siropul Apathy) sau rășinoasă (balsamul de Canada, oleul de cedru, balsamul sintetic).

Montarea secțiunilor colorate cu medii de montare apoase se face între lamă și lamelă, după spălarea în apă distilată a secțiunilor colorate. Mediile de montare apoase se folosesc în cazul în care secțiunile nu au fost deshidratate (la gheață, de ex.). Secțiunea se acoperă cu o picătură de mediu de montare, apoi cu o lamelă de dimensiuni potrivite.

Montarea în medii rășinoase permite obținerea unui preparat ce poate fi păstrat ani de zile. Pentru aceasta, preparatul cu secțiunea colorată se va deshidrata în alcool etilic în concentrații crescânde 80°, 96°, 100° – durata 5-10 minute (se elimină apa din secțiune). Urmează clarificarea (eliminarea alcoolului din secțiune), în trei băi succesive de benzen, toluen sau xilen – durata 10-15 minute. După ultima baie de benzen, secțiunea devine clară, transparentă și va fi acoperită cu o picătură de balsam de Canada, apoi cu o lamelă. Preparatele histologice care se păstrează în colecție, se etichetează, notându-se fixatorul, colorația, diagnosticul ș.a.

Alte preparate sunt: frotiul, amprenta, preparatul extemporaneu etc.

1.2.1. Histochimia.[35][33][36][32]

Pentru decelarea substanțelor chimice și localizarea lor la nivelul structurilor celulare sau tisulare se folosește tehnica histochimică cu metode histochimice particulare substanței chimice de cercetare. În aceste metode, reacțiile au ca scop furnizarea unui semnal sub formă de culoare, de exemplu, indicând prezența unei substanțe sau grup de substanțe (aldehidele, grupările COOH-, SO4- -, PO4- -). Se evidențiază în majoritatea reacțiilor mai ales radicali sau funcții chimice ca: proprietatea reducătoare și oxidantă, bazofilia, metacromazia etc. Substanța cercetată poate fi prezentă sau absentă, în cantități mici, moderate, mari sau foarte mari. Pentru conservarea compoziției chimice din secțiunea de țesut se utilizează fixatori speciali.

Metodele cito- și histochimice au valoare practică deosebită pentru multiple domenii de cercetare și diagnostic: citofiziologie, morfofiziologie, toxicologie, medicină legală etc.

Metodele histochimice se bazează fie pe unele caracteristici fizice ale substanței de cercetat (indice de refracție, solubilitatea, proprietăți fluorescente etc.) sau pe proprietăți chimice (apariția culorii datorită fenomenului chimic produs între substrat și reactivul folosit). Reacțiile chimice sunt directe (în urma reacției substrat-reactiv iau naștere produși colorați) și indirecte (necesită demascarea substratului cu eliberarea unor grupări ce fac posibilă reacția de culoare; operațiunile preliminare pot fi hidroliza, oxidarea, precipitarea, sulfatarea).

1.2.2. Imunohistochimia (IHC).[38][39][40]

Conceptul utilizării anticorpilor marcați pentru a localiza antigene în secțiunile tisulare histologice a fost introdus în jurul anilor 1940, prin utilizarea anticorpilor marcați cu fluoresceină.

Tehnicile de IHC utilizează anticorpi monoclonali. Peroxidaza a fost prima enzimă conjugată cu anticorpii primari. După reacția antigen-anticorp, prin aplicarea metodei histochimice se identifică reoxidaza prin reacție de culoare (cu ajutorul unui cromogen). Metoda este analogă folosirii anticorpilor marcați fluorescent, dând însă rezultate mai bune și mai durabile pe secțiuni la parafină.

Anticorpii sunt specifici multor substraturi: componente structural-celulare, produse celulare (citokine, enzime, peptide, imunoglobuline) și receptorilor suprafețelor celulare sau ai celor nucleari. Anticorpii reacționează fie cu celulele tumorale și produsele lor, fie cu celulele normale.

Identificarea IHC a substanțelor specifice în țesuturi a deschis o eră nouă în histopatologie și histotehnologie. Frecvența utilizării tehnicilor speciale este însă invers proporțională cu experiența histopatologului. Datele obținute ca urmare a tehnicii IHC au importanță deosebită terapeutică și prognostică.

Numeroase studii subliniază rolul analizei imunohistochimice în stadializarea tumorală, în special în cazul leziunilor avansate care necesită tratament multimodal.[41]

La ora actuală, o mare parte a problemelor de diagnostic în patologia chirurgicală a tumorilor poate fi rezolvată doar prin conjugarea informațiilor tehnicii imunohistochimice (15-20% din cazuri). Testele sunt foarte specifice și permit decelarea substanței de cercetat când aceasta se găsește chiar în cantități foarte mici în fragmentul recoltat (sau la nivel celular) de ordinul nanogramelor, sau chiar molecular. În IHC, antigenul este chiar substanța pe care încercăm să o identificăm folosind anticorpi specifici sau proteine serice (imunoglobuline) produse ca răspuns direct la substanța specifică de cercetat.

Pentru a pune în evidență reacția antigen-anticorp în microscopia electronică, se pot utiliza anticorpi conjugați cu alte substanțe ca feritina (moleculă ce conține fier) sau particule de argint-aur.

Nu există un fixator ideal în IHC. Se utilizează formol 10% pentru fixarea pieselor biopsice, nu mai mult de 24 ore, pentru a nu denatura situsurile antigenice (formolul din comerț are cantități variabile de metanol, acid fornic și alte impurități care degradează antigenele). În unele cazuri, chiar la fixări de scurtă durată (ore), legarea încrucișată moleculară ajunge doar să mascheze epitopul (blocaj seric). De aceea, se face un pretratament cu proteaze la preparatele fixate cu formol care digeră „masca“ de legare încrucișată și redă epitopul ca imunoreactiv. Pentru frotiurile celulare se efectuează fixare cu alcool de 70° și 96° timp de 20 minute. Toate frotiurile trebuie colorate rapid în aceeași zi, sensibilitatea metodei fiind ameliorată prin alungirea timpului de incubație cu anticorpul primar și demascarea antigenică la microunde.[42][40][43]

1.2.3. Citologia clinică[32] se bazează pe examinarea morfologiei celulelor pe frotiuri exfoliative, de amprentaj, sediment din lichide biologice, material de puncție cu ac fin.[44] Modificările celulare pot fi reactive, displazice, metaplazice sau maligne. Sunt analizați mai mulți parametrii morfologici ai celulelor: raportul nucleu/citoplasmă, forma și dimensiunile nucleului, pattern-ul cromatinian, membrana nucleară, nucleolii, mitozele ș.a. Diagnosticul citologic are rol esențial în screening-ul leziunilor precursoare și maligne, mai ales în depistarea cancerului de col uterin. Frotiurile sunt fixate „la aer“ sau „umed“ cu alcool 95°. Se colorează prin tehnicile May-Grünwald-Giemsa (MGG), Papanicolaou (PAP), albastru-policrom-tanin (APT)-Drăgan sau alte metode. Colorația PAP este utilizată pentru clasificarea frotiurilor cervicovaginale în 5 clase (sistemul PAP) și mai recent sistemul Bethesda, în screening-ul leziunilor colului uterin. Se utilizează și pentru frotiuri non-ginecologice: de spută, aspirat sau periaj bronșic, sediment urinar din lichid de ascită, pleural, sinovial, puncții aspirative cu ac fin (PAF) din diferite formațiuni tumorale (ex. adenopatii, tumori solide, chistice) etc.

Avantajele citodiagnosticului sunt legate de costul redus al tehnicii, simplitatea și rapiditatea metodei. Limitele sunt legate de dificultățile de interpretare a frotiurilor intens hemoragice și inflamatorii, care induc o rată mare de rezultate fie fals-pozitive, fie fals-negative.[32][45][44]

1.3. Structura și compoziția chimică a țesuturilor orale [46][40][35][47][39]

Structurile orale sunt compuse în primul rând din țesuturi conjunctive și epiteliale și glande asociate. Înțelegerea acestor structuri și a compoziției lor chimice este importantă luând în considerare problemele biologice privind sănătatea orală. Constituenți chimici semnificativi ai acestor țesuturi sunt proteoglicanii, glicoproteinele, mucinele și enzimele.

1.3.1.Țesutul conjunctiv[48][49][50]

Țesutul conjunctiv derivă din mezenchim și este constituit din tipuri variate de celule și fibre care sunt conținute (fixate) într-o substanță funda-mentală amorfă, de consistență semigel, coloidală. Substanța fundamentală a țesutului conjunctiv este compusă preponderent din proteoglicani și glico-proteine. Proteoglicanii sunt molecule mari formate dintr-o grupare de proteine la care sunt atașate un număr mare de lanțuri de glicozaminoglicani (GAG) compuși din unități dizaharide repetitive. GAG pot fi nesulfatați (acid hialuronic), sau sulfatați (condroitin-sulfați, keratan-sulfați și heparan sulfați). Heparina, un GAG înalt sulfatat, este secretată de mastocitele țesutului conjunctiv. Acidul hialuronic se sintetizează sub forma unui GAG foarte mare, liber, nesulfatat, care nu necesită un grup de proteine și diferă față de condroitin sulfați, având ca și constituenți acetilglucozamine în loc de acetilgalactozamine. Acidul hialuronic leagă molecule de proteoglicani pe toată lungimea sa, formând polimeri de proteoglicani. Numărul și tipurile de GAG atașați lanțului proteic într-o moleculă de proteoglican, ca și stadiul polimerizat al proteoglicanilor determină vâscozitatea substanței fundamentale amorfe. Acidul hialuronic predomină în țesuturile conjunctive moi și, din cauza marii sale capacități de a lega apa, este primul răspunzător pentru transportul și difuziunea substanțelor metabolice la nivelul țesuturilor. Infecții bacteriale pot apărea ca rezultat al acțiunii hidrolitice a enzimei bacteriene hialuronidaza asupra integrității polimerice a acidului hialuronic. Condroitin sulfații predomină în proteoglicanii din cartilagiu și sunt în primul rând responsabili pentru textura rezistentă și într-o oarecare măsură plastică a acestui țesut. Condroitin sulfații constitute 1% din țesutul total osos, în timp ce numai 0,5% din această cantitate este prezentă în dentină. Alte componente organice ale oaselor sunt în proporție de aproximativ 93% colagen tip1 și 5% proteine noncolagene, incluzând fosfoproteine, glicoproteine, osteocalcina (proteina Gla) și osteonectina.

Glicoproteine prezente în substanța fundamentală a țesuturilor conjunctive sunt proteine macromoleculare, care conțin mai puține jumătăți (părți) asociate de carbohidrați decât sunt prezente în proteoglicani. De asemenea, carbohidrații nu sunt prezenți sub forma unor unități ce se repetă regulat. Un număr mare de glicoproteine secretate în țesuturile conjunctive de celule epiteliale și fibroblaști au fost identificate în ultimii ani. Dintre acestea, cele mai cunoscute sunt fibronectina (secretată de fibroblaști, celule ale țesutului muscular neted și numeroase alte celule); laminina (secretată de celule epiteliale și prezentă în toate membranele bazale); condronectina (secretată de condrocite) și osteonectina (secretată de osteoblaste).

Atât proteoglicanii cât și glicoproetinele din țesuturi conjunctive sunt supuse la alterațiilor în stadii patologice variate. În cazul unei inflamații sau în primele stadii de vindecare a rănilor se poate detecta histochimic o creștere a numărului proteoglicanilor și glicoproteinelor. Odată cu înaintarea procesului de vindecare, se înregistrează un declin gradual al cantității ambelor substanțe, până când se revine la valori normale. Nivelul fibronectinei și a receptorilor săi membranari scade în unele forme de cancer. Aceste valori reduse sunt corelate cu comportamentul alterat sau transformat al celulelor canceroase. Unii cercetători au sugerat că, celulele canceroase metastatice leagă preferențial colagenul de tip 4 prin laminină, ambele fiind componente a membranelor bazale. În contrast, a sugerat că celule tumorale nonmaligne nu folosesc laminina pentru legături.[47]

Fibroblaștii sunt tipul de celule cel mai comun din țesuturile conjunctive. Aceștia sunt responsabili pentru elaborarea glicoproteinelor ca fibronectina și proteoglicani ce formează substanța fundamentală amorfă. Ei elaborează de asemenea componentele fibroase ale substanței fundamentale, incluzând diferite tipuri de colagen (în special tipurile 1 și 3), fibre reticulate și elastice.

Probe actuale biochimice, histochimice și ultrastructurale sugerează că colagenul este sintetizat inițial sub forma unor lanțuri polipeptidice de prepro-colagen mult mai mari. Componenta prepeptidică se îndepărtează în timpul său scurt după translocarea în reticulul endoplasmatic rugos. Schimbări post-transcripționale includ hidroxilarea reziduurilor de prolină și lizină, glicozilarea reziduurilor de hidroxilizină, formarea legăturilor disulfide între lanțuri adiacente și formarea triplu helixului caracteristic. Procolagenul este secretat la suprafața celulei, unde secvența polipeptidică este îndepărtată de o protează specifică. Acest lucru este urmat imediat de formarea microfibrilelor de colagen. Micro-fibrilele servesc ca o suprafață de inițiere și extensie a polimerizării și transformarea a unei mai mari cantități de tropocolagen monomeric proaspăt secretat în fibrile colagene. Etapele hidroxilării sunt facilități de vitamina C și sunt esențiali pentru stabilitatea și conformația helixului triplu. Deficiența de vitamina C are ca rezultat pierderea stabilității moleculare, având loc formarea colagenului anormal, imatur și cauzând boli colagene.

Fibrilele colagene nou elaborate, formate în timpul dezvoltării sau în procesul de vindecare a unor leziuni, sunt echivalente cu fibre reticulare în structura lor electronomicroscopică. Ambele tipuri de fibre se fixează în ceea ce privește glicoproteinele cu metoda PAS și colorație argentică. Aceste reacții indică prezența unui aport considerabil de glicoproteine între microfibrilele aliniate de tropocolagen macromolecular.

Fibrele elastice sunt elaborate de fibroblaști și posibil și de celule musculare netede din pereții vaselor sangvine. Ele sunt compuse de o componentă proteică caracterizată de prezența aminoacizilor desmocina și izodesmocina și glicozaminoglicanilor. Spre deosebire de colagen și fibrele de reticulină, fibrele elastice nu sunt considerate ca fiind constituenți importanți ai țesuturilor complet refăcute. Țesuturile elastice se fixează cu fuxina aldehidică, fuxina-rezorcina și se colorează specific cu orceina în preparatele histologice. O metodă fluorescentă de fixare, folosind sulfonat de tetrafenilporfină în combinație cu argint sau aur, a fost dezvoltată de Albert și Fleischer pentru vizualizarea electronomicroscopică a fibrelor elastice.

Pe lângă fibroblaști, celelalte elemente celulare ale țesutului conjunctiv sunt macrofagele, care se hrănesc cu componente alterate, mastocitele, care sunt bogate în înalt sulfatatul proteoglican heparina (anticoagulant) și histamina (vasodilatator); și celule plasmatice, care elaborează imunoglobuline. [26][29][47]

1.3.2.Țesuturile epiteliale și derivatele acestora[47]

Glandele salivare elaborează așa-numitele mucine sau mucoizi. Definiția acestor substanțe este din punct de vedere biochimic exclusiv chimică, dar din punct de vedere histochimic, definiția este parțial bazată pe reacții de colorație. Detectarea histochimică a mucinelor se bazează în general pe conținutul de glicozaminoglicani, care afectează anumite reacții de fixare. Natura acidă este atribuită prezenței acidului glucuronic sau acizilor sialici. Observații histochimice arată că un număr de mucine acide nu conțin sulfat esteri. Caracteristicile histochimice a epiteliului oral, componentele epiteliale ale nucleului dentar și glandele salivare sunt considerate o altă secțiune a acestui capitol.

Numeroase studii histochimice s-au efectuat pe baza proteinelor structurale ale leucitelor glandelor salivare sau așa numiților corpusculi salivari. Tehnicile histochimice sunt folosite de asemenea în citologia exfoliativă orală pentru detectarea cancerului oral. Identificarea carcinoamelor pulmonare prin intermediul analizei celulelor normale și anormale prezente în spută este metoda clinică uzuală.[47][39]

1.3.3.Enzimele și rolul lor în structurarea și funcția țesuturilor orale și periorale[35][47]

Histochimia a permis histologilor să poată demonstra actualele localizări ale activității celulare enzimatice. Distribuția topografica a enzimelor poate fi asigurată de tehnicile cantitative microchimice elaborate de grupul Linderstrom-Lang, sau de tehnici rezultate din formarea unor produși reactivi vizibili în secțiunile de țesut. Abordarea descrisă mai sus este folosită pe scară largă în demonstrația privind enzimele.[35]

Enzimele cel mai frecvent studiate sunt cele care au legătură cu transferul fosfat-esterilor (fosfataze specifice și nespecifice) în matricea orga-nică a osului, dentinei și smalțului (fosfataza alcalină) și cu resorbția osului și dentinei (fosfataze acide). Oxidaze și dehidrogenaze, reflectând activitatea metabolică a diferitelor structuri în țesuturi orale, au fost și ele studiate extensiv. Esterazele, asociate în general cu hidroliza esterilor carboxilici acizi din alcool, au fost studiate în glande salivare și papile gustative. Recent, s-au raportat studii efectuate asupra sulfatazelor lizozomale și adenil-ciclazelor implicate în formarea adenozin-monofosfatului (cAMP).[35]

1.4. Histochimia și imunohistochimia țesuturilor orale[35] [47][39]

Tehnicile histochimice sunt bazate pe rațiuni chimice precise privind capacitatea acestora de a identifica sau fixa diferite substanțe biochimice. Aceste tehnici necesită precauții mult mai mari pentru a prezenta integritatea chimică a țesuturilor decât se cer probabil într-un procedeu biochimic sau imunochimic. De asemenea, tehnicile histochimice asigură in situ informații care nu pot fi obținute prin metode biochimice. Aplicarea unor principii imunobiologice pentru localizarea histochimică a proteinelor specifice, glicoproteinelor și proteoglicanilor, permite detectarea unei multitudini de molecule biologice care joacă un rol important în țesuturi normale în timpul dezvoltării și în diferite condiții patologice. Numeroase tehnici inovative privind localizarea reziduurilor chimice diferite sau componentele unei molecule mari sunt de asemenea disponibile pentru aplicația histochimică. Un caz în acest sens este folosirea lectinelor din plante ca probe histochimice în caracterizarea componentelor glucidice (zaharoase) din interiorul moleculelor de glico-proteine. Uzul acestor probe a generat informații in situ mult mai specifice și mai semnificative decât s-au putut obține în urma unor procedee biochimice cu băi omogene de țesut.

Hibridizarea in situ este tehnica histochimică ultimativă, care permite identificarea unei gene (secvența nucleotidă de ADN) pe o secțiune de test. Tehnica se bazează pe principiile și metodele biologiei moleculare moderne și pe cele ale geneticii, în cadrul cărora se prepară probe de nucleotide sintetice, de ADN complementar sau de mesageri ARN și se permite hibridizarea unor situri moleculare corespondente/complementare într-o secțiune de țesut. Secțiunile de țesut sunt protejate împotriva degradării ADN/ARN, iar proteinele și lipidele acestor țesuturi se extrag și se îndepărtează înaintea hibridizării. Având în vedere că probele se radioetichetează în general cu P, H sau S, locurile în care s-a produs hibridizarea se vizualizează cu ajutorul procedurilor autoradiografice standard. Pentru a afirma că proba hibridizată (m-ARN) este un substrat adecvat pentru transformare, mARN poate fi transformat in vitro în produsul său proteic. Acest produs proteic poate fi analizat cu ajutorul anticorpului monoclonal corespunzător, folosind tehnici imunohistochimice standard. Hibridizarea in situ și metodele imunohistochimice se completează reciproc, asigură specificitate de ultimă oră și reprezintă probabil cele mai puternice unelte investigative și de diagnostic în biologie și medicină.

Majoritatea tehnicilor histochimice[35] au fost folosite în general pentru analize calitative ale substanțelor chimice în celule și țesuturi. Multe tehnici sofisticate sunt aplicabile în cadrul analizelor cantitative ale reacțiilor histo-chimice. Acestea includ uzul microfotonumărătorului de celule, înregistrarea microdensitometriei pe unda dublă și mai recent s-a recurs la scanarea și integrarea microdensitometriei. Această ultimă metodă a fost folosită cu succes de Chayen pentru măsurarea permeabilității membranei lizozomale, și de Stuart și Simpson la măsurarea activității enzimelor dehidrogenaze în celule izolate în cadrul unor biopsii de măduvă osoasă aparținând unor pacienți normali sau suferinzi de leucemie.

Multe tehnici noi, nu neapărat histochimice, sunt folosite frecvent de histochimiști pentru realizarea unor analize calitative și cantitative a unor substanțe tisulare, în special privind elementele minerale. Aceste tehnici includ razele X și microscopia interferențelor pentru măsurarea masei uscate (nete) a unei substanțe biologice sau a unui produs de reacție, difracția razelor X, spectofotometria cu raze X și electrono-microanaliza probei. Recent, scan-electrono-microscopia (SEM) a ajuns să ocupe un loc important în cercetări dentare. SEM a fost folosită în studiul morfologiei oaselor și în analiza schimbărilor (transformărilor) în arhitectura oaselor induse de prezența unor implanturi metalice introduse chirurgical.[47]

Neiders și colaboratorii săi au folosit SEM împreună cu proba de electron pentru a obține o imagine a texturii de suprafață a cimentului dentar analizat pentru conținutul mineral. Reith și Boyde au folosit de asemenea proba de electron împreună cu SEM într-un studiu cu privire la transportul Calciului la nivelul ameloblaștilor din organul smalțului. Tehnici cu lumina polarizată și analiza cu raze X au fost folosite pentru studiul smalțului. Fosforescența emisă ca rezultat al legării tetraciclinei de țesuturile mineralizate a fost folosită în microanaliza calitativă și cantitativă a componentelor anorganice a unor țesuturi calcificate. Tehnicile imunohistochimice folosind fluorescența au fost aplicate studiului țesuturilor orale.[38][47]

Tehnici histochimice de microscopie optică au fost adaptate tot mai mult uzului în electronomicroscopie histochimică. Vizualizarea carbohidraților, proteinelor specifice și fosfatazelor sunt exemple ale uzului adaptativ al acestor tehnici.[35]

Metode radioautografice au un rol vital în histochimie, deoarece au abilitatea de a elucida încorporarea unor substanțe chimice în căile metabolice a diferitelor țesuturi și în diferite regiuni ale citoplasmei. Secțiuni de țesut prelevate de la animale injectate cu un radioizotop se acoperă cu un film sau o emulsie fotografică și se lasă la întuneric. Unde radio emise de izotop ating firicelele argintate ale filmului, iar aceste înregistrări se developează mai târziu asemenea unui film fotografic. Radioizotopul apare sub forma unor granule de culoare închisă în lumina microscopului și sub forma unor unde liniare în autoradiograful electronomicroscopie.[35]

1.4.1. Tehnici histochimice și proceduri de fixare.[38][40][35]

Pentru studiul histochimic, o probă de țesut trebuie prezervat astfel încât să se producă schimbări minime în reactivitatea macromoleculelor citoplas-matice și extracelulare, spre exemplu enzime, proteine structurale, lipide și acizi nucleici. Acest lucru este realizat prin folosirea condițiilor osmotice optime, temperaturi joase, controlarea pH-ului soluțiilor fixatoare și expunerea minimă posibilă a secțiunii la fixator.

Formolul este considerat a fi unul din fixatorii ideali, în special pentru enzime și alte proteine. Aceasta, din cauza capacității de reacție cu grupuri reactive majore de proteine aparținând unor rețele polimerice sau macromoleculare, fără a le afecta reactivitatea nativă la proceduri histochimice. Formolul are un efect conservant asupra lipidelor prin întreruperea relației acestora cu proteinele. Uzul electroliților, spre exemplu Calciul sau Cadmiul în formol sau cromation aplicat pe o probă de țesut înaintea fixării previne dizolvarea fosfolipidelor. Formolul este folosit în general în soluții de l0% de pH 7 la temperaturi de 0 – 4 grade Celsius.

Acroleina și glutaraldehida sunt alți fixatori folosiți frecvent, ultimul mai ales în microscopia electronică. Alți fixatori folosiți pentru studiul glicogenului, glicoproteinelor, proteoglicanilor și acizilor nucleici sunt amestecuri de mai mulți compuși chimici:

– fluidul lui Rossman, folosit pentru vizualizarea glicogenului glico-proteinelor și proteoglicanilor conține formol, alcool, acid picric și acid acetic;

– amestecul lui Carnoy, cu uz în fixarea histochimică a acizilor nucleici, este compus din alcool etilic, acid acetic și cloroform;

– reactivul lui Feulgen, folosit pentru vizualizarea ADN-ului, necesită hidroliza acidă a polimerilor ADN pentru a expune reziduurile dezoxiribaze zaharate a moleculelor de ADN. Grupările aldehidice astfel formate se tratează chimic cu leucofuxina (reactivul lui Schiff) pentru a forma un produs de reacție roșu-purpuriu.

Unele sisteme enzimatice, ca de exemplu citocromoxidazele sunt foarte labile și nu pot fi păstrate prin fixare chimică. Vizualizarea unor astfel de enzime se face pe secțiuni congelate (criostatice). Pentru a preveni difuziunea și a prezerva statutul in vivo a macromoleculelor din țesut, probele trebuiesc fixate printr-o procedură de înghețare-uscare (deshidratare). Țesuturile se congelează rapid la temperaturi foarte joase, de obicei în nitrogen lichid și apoi se plasează într-un recipient congelat în vacuum, în care gheața care s-a format în țesuturi se îndepărtează prin sublimare (transformarea directă în vapori, fără a fi nevoie să parcurgă o fază lichidă). După aceea, țesutul se introduce în parafină și se secționează normal cu ajutorul unui microtom. Aceste preparate prezintă activitate optimă enzimatică și arată caracteristici histologice excelente. Metoda se folosește și pentru evidențierea fosfatazelor, dehidrogenazelor și pentru localizarea precisă a ionilor anorganici care altfel ar fi difuzat.

1.4.2. Imunohistochimia țesuturilor orale și periorale[40][38][47]

Localizarea precisă a unor molecule biologice specifice în diferite compartimente intracelulare, pe suprafețe celulare, sau în matrice extra-celulară este posibilă prin aplicarea unor principii fundamentale IHC. Tehnicile imunohistochimice se bazează pe premisa că antigeni sau imunogene bazate pe proteine se leagă în mod avid de antigenii lor specifici.

Anticorpi pentru antigeni specifici pot fi preparați prin injectarea anti-genului cunoscut într-un animal pentru a provoca un răspuns imun. Acest răspuns rezultă prin producția de imunoglobuline (anticorpi), acestea putând fi izolate din serul animalului injectat. Când o soluție care conține un anticorp este aplicată direct unei secțiuni de țesut care conține antigenul, anticorpul se leagă specific de respectivul antigen. Acest complex anticorp-antigen se va atașa de un al doilea anticorp, care este conjugal ori unei colorații fluorescente precum rhodamina sau FITC, ori unei enzime conjugate anticorpului ei, ca peroxidaza-antiperoxidaza (PAP).

Complexele antigen-anticorp care se evidențiază printr-o colorație fluorescentă se examinează la un microscop de fluorescență. Grupările anti-genice răspund unui fond negru și se fotografiază imediat pe un film de viteză mare.

Complexele antigen-anticorp legate de enzime se expun histochimic printr-un substrat enzimatic. Aceasta rezultă într-o colorație maro închis spre negru care se poate examina ulterior în ME. Feritina și aurul coloidal sunt de asemenea folosite frecvent ca markeri pentru aceste complexe din cauza densității electronilor și dimensiunii specifice a particulelor lor.

1.4.3. Histochimia țesuturilor orale moi: polizaharide, proteine și mucine[35][47]

Colorația roșu-carmin este folosită frecvent în demonstrația glicogenului, dar nu este la fel de specifică ca metoda PAS.

a. Glicogenul epitelial este cunoscut ca fiind crescut în inflamații și regenerarea țesuturilor lezate. Gingia umană prezintă variații în prelungirea keratinizării și această variabilitate se reflectă în conținutul de glicogen în țesut. Pe de altă parte, mucoasa alveolară nekeratinizată prezintă întotdeauna niveluri constante de glicogen.

b. Proteoglicanii împreună cu condroitin sulfații și acidul hialuronic formează o componentă intracelulară majoră a epiteliului gingival uman. Conformația moleculară și rata relativ rapidă de sinteză și secreție a acestor macromolecule în gingie pot explica de ce acest material nu are influențe asupra acțiunii de degradare a enzimelor specifice. Când țesuturile orale moi se fixează cu colorantul metacromatic albastru de toluidină, mastocitele devin vizibile în număr variat în țesutul conjunctiv neatașat, în special de-a lungul vaselor sangvine. Reacția metacromatică dată de granulele citoplasmatice a acestor celule este cauzată de prezența heparinei – un proteoglican sulfatat. Granulele citoplasmatice conțin de asemenea histamina – un vasodilatator, care poate fi demonstrat în microscopia de fluorescență. Mastocitele sunt prezente în număr mare în limba și gingie. Semnificativă este absența lor în gingivita necrozantă.

c. Proteine și grupări proteice

Keratinizarea este una din caracteristicile importante a epidermului. Cu toate că în condiții normale, apare numai în unele zone a epiteliului bucal, în condițiile patologice apare oriunde în cavitatea bucală. Mecanismul prin care celulele stratului malpighian se transformă producând keratină a fost numai parțial elucidat. Punțile disulfidice prezente în keratină rezultă din oxidarea grupărilor sufhidrilice a cistemei. Grupurile sulhidrilice sunt demonstrate histochimic prin metoda fericianidei ferice în care se colorează în albastru de Prusia – intensitatea culorii reflectă gradul de keratinizare.

d. Mucine

Sunt glicoproteine conținând 80% carbohidrați și 20% proteine, fiind eliminate din celule prin exocitoză. Pe suprafața epiteliilor, mucusul hidratează ca un gel protectiv, atenuând forțele abrazive și invazia bacteriană. Reacția PAS este o tehnică histochimică larg folosită pentru a demonstra grupările 1,2-glicol sau 1,2-aminoalcool prezente în mucus, glicogen și glicoproteine. Mucinele se prezintă cu grade variabile de heterogenitate biochimică. Astfel, se întâlnesc sialomucine evidențiate histochimic la pH 2,5 în albastru cu AA (albastru alcian), sulfomucine evidențiate în brun la pH1 și mucinele neutre colorate în roșu magenta cu reacția PAS.

Nivelule de glicozilare al mucinelor este variabil în unele afecțiuni și cancere, depinzând de sinteza unor oligozaharide. Mucusul are rol în sialo- și cholelitiază, promovând nucleerea (mucus+Ca+lipide=calculi de colesterol).

1.4.4. Considerații clinice

Tehnicile histochimice nu sunt numai o unealtă importantă în cercetarea mediului oral, ci sunt folosite frecvent în stabilirea diagnosticului histopatologic. Cu toate că probele de biopsie tisulară se fixează de obicei cu hematoxilina-eozina, în numeroase situații acest tip de colorație nu permite stabilirea unui diagnostic definitiv. În cazul unui diagnostic diferențial al unei tumori intra sau peri orale, este necesară o fixație pentru mucină, care ajută patologul în distingerea unei tumori a glandelor salivare originară dintr-o tumoră odontogenică, sau a unei tumori care provine din epiteliul nonglandular.

O varietate de bacterii (fungi) care sunt patogene umane conțin mucopoli-zaharide. Sporii acestor fungi sunt prezenți în țesuturile infectate, iar diagnosticul corect se poate stabili numai în urma unor tehnici de fixație histochimce speciale pentru mucină. Pentru diagnosticul de histoplasmoză, actinomicoză, blastomicoză și coccidioidomicoză în cavitatea bucală sunt necesare fixări complexe.

Fixările histochimice care evidențiază lipidele au mare valoare în diagnosticul corect al tumorilor care își au originea în țesutul adipos (lipom și liposarcom). Sunt de asemenea un ajutor important în stabilirea identității veziculelor care pot apare în celulele tumorale de leziuni variate, benigne și maligne. Având în vedere ca veziculele din citoplasmă pot reprezenta lipide, mucine și glicogen sau edeme intracelulare, adevărata lor identitate este uneori de valoare pentru diagnosticul și tratamentul corect.

1.5. Morfopatologia tumorilor benigne și maligne ale țesuturilor moi[48][8][47]

1.5.1.Tumorile țesutului conjunctiv

Tumori benigne:

• fibromul

• mixomul

Tumori maligne:

• sarcoamele:

fibrosarcomul

sarcomul fuzocelular

sarcomul polimorf

mixosarcomul.

Fibromul, tumora benignă a țesutului conjunctiv comun, se poate dezvolta subcutanat, în fascii, periost, ovare și practic oriunde se găsește țesut conjunctiv. Este o tumoră nodulară, bine delimitată, încapsulată, dură, albicioasă-sidefie, cu diametrul între câțiva mm și 10-15 cm.

Microscopic, fibromul este constituit din fibroblaste și fibrocite separate într-o cantitate variabilă de fibre colagene și de reticulină, dispuse sub formă de fascicule cu orientări diverse, dând suprafeței de secțiune macroscopica a tumorii un aspect în vârtejuri. Tumora conține vase sanguine cu pereți bine structurați. În funcție de predominanța celulelor sau a fibrelor, uneori se face separarea în fibroame moi și respectiv fibroame dure.

Ca tipuri particulare sunt recunoscute:

• dermatofibromul (fibromul cutanat);

• neurofibromul (fibromul tecilor nervilor);

• fibromul desmoid (locatizat in drepții abdominali).

Mixomul este o tumoră moale, cu aspect translucid, gelatinos, asemănător gelatinei Wharton din cordonul ombilical. Localizările sale obișnu-ite sunt țesutul subcutanat, fasciile intermusculare și aponevrozele, țesutul conjunctiv subperitoneal, oasele maxilare, inima, glanda mamară etc.

Macroscopic se prezintă ca o masă tumorală unică, rotunjită sau lobulată, uneori de dimensiuni apreciabile, în general slab delimitată și de obicei cu creștere infiltrativă în țesuturile vecine. Această creștere infiltrativă face dificilă exereza chirurgicală radicală a tumorii și explică frecvența recidivelor postoperatorii.

Histologic, tumora este alcătuită din celule stelate sau fuziforme, cu prelungiri lungi, subțiri, aparent anastomozate, dispersate într-o masă de substanță fundamentală amorfă, mucoidă, bogată în mucopolizaharide. In această substanță fundamentală se pot găsi de asemenea fibre colagene și de reticulină; vasele sanguine sunt rare. Uneori tumora are un aspect predo-minant mixomatos dar conține și alte elemente mezenchimale, ca mușchi, cartilaj și este denumită mezenchimom.

Sarcoamele sunt tumori maligne ale țesutului conjunctiv (și ale celor-lalte țesuturi mezenchimatoase), întâlnite cu o frecvență ceva mai redusă față de carcinoame, dar având o evoluție mai rapidă și un prognostic mai sever.

Ele se întâlnesc mai frecvent la tineri, dar pot fi observate la orice vârstă. Tumora este în general voluminoasă, cu creștere rapidă, este moale, de culoare roz-roșietică asemănătoare cu carnea de pește proaspăt („sarcos” = carne de pește), cu multiple focare de necroză și hemoragie.

Microscopic, se remarcă în general bogăția tumorii în elemente celulare față de stroma redusă sau absentă; caracteristică este mal ales prezența de lacune vasculare fără pereți proprii, mărginite chiar de celulele neoplazice și prin care se face circulația sângelui. Această particularitate structurală explică și metastazarea, în special pe cale hematogenă a sarcoamelor.

Fibrosarcomul este o varietate de sarcom cu evoluție ceva mal blândă. Tumora are consistență dură, crește încet, rămâne mult timp locali-zată, este curabilă prin excizie chirurgicală adecvată dar tinde să recidiveze.

Microscopic seamănă cu fibromul; caracterul malign este indicat însă de prezența monstruozităților nucleare și a mitozelor atipice (în general rare și trebuind căutate cu atenție).

Sarcomul fuzocelular, un sarcom cu prognostic sever, are consistență scăzută și creștere rapidă, infiltrativă. Microscopic este constituit din celule fuziforme, destul de uniforme, asemănătoare fibroblastelor dar cu monstruo-zități nucleare și mitoze atipice frecvente. Imaturitatea celulelor tumorale este indicată de absența fibrelor conjunctive între aceste celule sau de prezența lor în număr foarte redus. Lacunele vasculare mărginite de celule sarcomatoase și sufuziunile hemoragice sunt constante.

Sarcomul polimorf (anaplazic) are un grad înalt de malignitate și structural amintește foarte puțin sau deloc aspectul țesutului conjunctiv. Polimorfismul celular este deosebit de exprimat, monstruozitățile și bizareriile de formă ale nucleilor sunt numeroase, mitozele atipice frecvente, fibrele conjunctive foarte rare sau cel mai adesea absente, lacunele vasculare obișnuite. Tumora evoluează rapid, cu metastaze hematogene precoce.

Mixosarcomul se consideră că de cele mal multe ori s-ar dezvolta din mixoamele recidivate dar nu este exclusă nici existența unei malignități inițiale, mai slab exprimată histologic. Structural se deosebește de mixom prin celularitatea mult mai bogată, prin prezența de atipii celulare, monstruozități nucleare și mitoze atipice.

1.5.2.Tumorile țesutului adipos

Tumori benigne: – lipomul

– hibernomul

Tumori maligne: – liposarcomul

Lipomul, tumora benignă a țesutului adipos, are aspect rotunjit, nodular sau multilobulat, este unică sau multiplă, bine delimitată și de culoare galbenă. Se localizează în mod obișnuit subcutanat (pe spate, umeri, gât, coapse), retroperitoneal și perirenal, în mușchii scheletici ai extremităților și ai orbitei etc. Uneori se pot întâlni lipoame multiple, simetrice, mai ales în regiunea cervicală, axilară, pe torace, pe brațe, pe fese.

Deși în general tumori bine delimitate și încapsulate, lipoamele pot prezenta uneori prelungiri care se insinuează în țesuturile din jur, făcând extirparea chirurgicală dificilă sau incompletă și expunând la recidive locale.

Microscopic, lipomul este constituit din lobuli de celule adipoase inegale, cu nuclei mici, periferici, separați prin septuri conjunctive subțiri, sărac vascularizate. Uneori se pot întâlni forme combinate de lipoame: fibrolipom, mixolipom, angiolipom.

Hibernomul (lipomul brun sau lipomul embrionar) este alcătuit din lobuli de celule mari, rotunjite sau poligonale, cu nucleu rotund, central și cu citoplasmă spumoasă, incluzând numeroase granule lipidice mici, brune, bogate în lipocrom; tumora este în general bine vascularizată și are o culoare brună-gălbuie.

Liposarcomul, o tumoră malignă rară, se întâlnește aproape exclusiv la adulți și la vârstnici, localizându-se cu predilecție la nivelul extremităților, trunchiului și retroperitoneal.

Tumora, în general unică, este nodulară sau lobulată, aparent bine delimitată dar în realitate infiltrând întotdeauna țesuturile din jur; ea poate atinge dimensiuni gigante (mai ales în cazul localizărilor retroperitoneale). Pe secțiune are aspect pestriț cu zone albicioase-gălbui, zone roșietice-gelati-noase, focare de necroză și hemoragie.

Structura microscopică variază in funcție de gradul de diferențiere al celulelor lipoblasto-lipocitare constitutive. Astfel, în formele diferențiate, cu malignitate mai redusă, țesutul tumoral mai păstrează o oarecare asemănare cu țesutul adipos, fiind constituit predominant din celule cu conținut lipidic bogat, asemănătoare adipocitelor, printre care se găsesc însă și rare celule nediferențiate mici, rotunde sau fuziforme, fără conținut lipidic sau cu o canti-tate redusă de lipide și cu nuclei neregulați, hipercromi, pe alocuri în mitoză.

Liposarcoamele nediferențiate sunt formate în schimb mai ales din celule de tipul lipoblastelor, cu citoplasma slab vacuolizată sau spumoasă; polimorfismul și atipia celulară și nucleară sunt foarte exprimate. Se observă frecvente celule multinucleate și cu nuclei de forme bizare, iar mitozele atipice sunt frecvente. Colorația pentru grăsimi este adeseori utilă unui diagnostic de certitudine. Între cele două forme histologice extreme se găsesc liposarcoa-mele cu diferențiere intermediară.

Liposarcoamele diferențiate metastazează numai rareori și tardiv dar recidivează local, în timp ce liposarcoamele nediferențiate dau precoce și frecvent metastaze.

1.5.3. Tumorile țesutului muscular

Tumori benigne: – leiomiomul

– rabdomiomul

Tumori maligne: – leiomiosarcomul

– rabdomiosarcomul

Leiomiomul este tumora benignă a țesutului muscular neted și se dezvoltă mai frecvent în uter, tub digestiv, prostată, în derm și mai rar ovare, în vezica urinară etc. Volumul său este foarte variabil, are consistența fermă, este bine delimitată, albicios-sidefiu și pe secțiune cu un aspect caracteristic zis „în pânză de Damasc”.

Microscopic este constituit din fascicole de fibre musculare netede, cu nuclei ovalari cu capetele ușor rotunjite, orientate în diverse sensuri și pe care secțiunea le prinde sub diverse tangențe: longitudinal, oblic, transversal. Printre fibrele musculare proliferate tumoral și printre fasciculele de fibre musculare, se găsește o cantitate variabilă de țesut conjunctiv stromal alcătuit din fibrocite și fibre colagene. Bogăția acestei strome conjunctive, semnalată adeseori, a sugerat și denumirea de altfel incorectă a tumorii, de fibrom, fibroleiomiom sau tumoră fibroidă.

În masa neoplaziei sunt prezente vase cu pereți bine structurați. Stroma tumorii suferă adeseori modificări secundare hialine, mixoide, condroide. Transformarea sarcomatoasă este posibilă dar rareori întâlnită.

Rabdomiomul, tumoră mai puțin obișnuită, rezultă din proliferarea fibrelor musculare striate și se poate localiza în mușchii scheletici, în miocard, limbă; excepțional a fost semnalată în vezica urinară, în rinichi, ovare (pe fondul unor resturi embrionare).

Microscopic, rabdomiomul este alcătuit din fibre musculare striate, de cele mai multe ori incomplet diferențiate, care pot fi identificate însă prin evidențierea cu metode specifice de colorare (hematoxilină alcoolică Heidenheim) a striațiilor transversale caracteristice.

Leiomiosarcomul, tumora malignă a țesutului muscular neted se întâlnește foarte rar în contrast cu frecvența leiomiomului. El se poate dezvolta prin malignizarea unui leiomiom preexistent, dar de cele mai multe ori apare de la început ca o tumoră malignă, localizările obișnuite fiind cele digestive, uterine și retroperitoneale.

Microscopic, caracterul de malignitate este sugerat de prezența monstruozităților nucleare, a mitozelor atipice și a lacunelor vasculare fără pereți proprii, într-o tumoră cu aspect general de leiomiom.

Rabdomiosarcomul este tumora malignă a țesutului muscular striat. Cele mai importante localizări sunt mușchii striați scheletici, miocardul, limba, dar poate fi întâlnit și în organe care nu conțin mușchi striați: vezică urinară, uter ș.a.

Tumora crește infiltrativ și distructiv, are consistență moale și conține zone de necroză și hemoragie. Microscopic este caracterizată printr-un mare polimorfism celular, cu frecvente monstruozități celulare, mitoze atipice și celule gigante bizare, unele de tip sincițial, conținând miofilamente intracitoplasmatice, adesea cu caracter striat.

Rabdomiosarcomul este o tumoră cu un înalt grad de malignitate, cu metastaze limfohematogene precoce.

1.5.4. Tumorile vaselor sanguine

Principalele tumori ale vaselor sanguine sunt:

• hemangiomul: – capilar

– cavernos

– sclerozant

• glomangiomul (tumora glomică)

• hemangiopericitomul

• hemangioendoteliomul benign

• hemangioendoteliomul malign

• sarcomul Kaposi

Hemangiomul este o leziune benignă, constând dintr-un conglomerat de vase sanguine cu aranjament și dimensiuni neregulate sau atipice. Majoritatea hemangioamelor sunt considerate mai degrabă ca fiind hamartoame și nu ca tumori adevărate, adică leziuni situate la granița dintre malformațiile congenitale și tumori, leziuni prezente de la naștere (chiar dacă nu sunt întotdeauna vizibile). Ele se dezvoltă treptat pe măsura creșterii organismului și își încetează dezvoltarea odată cu încetarea creșterii organismului ajuns la maturitatea somatică; ele ar fi deci lipsite de tendința proliferării continue proprie tumorilor.

Hemangiomul capilar se dezvoltă de regulă pe tegumente (uneori însă și pe mucoase sau în organele interne) sub forma unor pete vasculare fără o delimitare precisă, de dimensiuni în general reduse, de culoare roșie violacee și cu suprafața plană sau tuberoasă. Tumora este constituită dintr-un ghem de vase de dimensiunea capilarelor, cu endoteliul mai proeminent, separate între ele printr-o stromă conjunctivă săracă. Formațiunea nu este încapsulată de unde și falsa impresie de invazie periferică.

Hemangiomul cavernos se localizează în țesuturile profunde și este format din spații vasculare largi, intercomunicante, pline cu hematii și separate prin trabecule conjunctive.

Hemangiomul sclerozant este o varietate mai neobișnuită, constituită din vase mici și medii separate prin septuri conjunctive mai groase, fibrozate, burate pe alocuri cu hemosiderină.

Adeseori hemangioamele sunt multiple; ele pot constitui uneori o componentă semnificativă în tabloul unor boli ereditare, ca de ex. telangiectazia ereditară hemoragică (hemangioame mici, multiple, cu tendință hemoragică, localizate pe piele și mucoase); boala Lindau (hemangioame cerebeloase și retiniene, chisturi hepatice și pancreatice), sindromul Sturge-Weber (hemangioame ale feței și meningelor) etc.

Glomangiomul (tumora glomică) poate fi observat la nivelul degetelor, feței, ca o tumoră rară, benignă, dezvoltată din corpusculii glomici, acele anastomoze arterio-venoase, cu arteriole încolăcite și inervație bogata, care controlează presiunea și temperatura sângelui. Se prezintă sub forma unui nodul mic, albăstrui, cu suprafața netedă.

Microscopic, tumora este constituită din ghemuri de arteriole și venule anastomozate, înconjurate de manșoane de celule rotunjite sau cuboidale, considerate ca celule musculare netede tranziționale și printre care se găsesc numeroase fibre nervoase.

Hemangiopericitomul se dezvoltă cel mai adesea subcutanat, mai rareori retroperitoneal, în pereții cavității bucale, în uter, oase, ficat, creier etc. Tumora, de dimensiuni variate este aparent bine delimitată și uneori chiar parțial încapsulată, dar în realitate, de cele mai multe ori, are limite imprecise și caracter infiltrativ.

Hemangiopericitomul este alcătuit din canale vasculare de tip capilar, înconjurate de plaje largi de celule rotunjite sau alungite, cu nucleu rotund voluminos și citoplasmă puțină, celule denumite pericite.

Evoluția clinică este uneori benignă iar alteori malignă, caracterul malign fiind sugerat de prezența mitozelor atipice în masa tumorii.

Hemangioendoteliomul benign se întâlnește târziu în viața adultă și se dezvoltă de obicei în țesutul subcutanat, splină, ficat, ca o formațiune rotunjită cu diametrul de 4-5 cm, în general bine definită dar neîncapsulată.

Microscopic este constituit din mase de celule de tip endotelial, dispuse în jurul și în lumenul unor canale vasculare mici, capilare, realizând pe alocuri imagini pseudoglandulare.

Hemangioendoteliomul malign (hemangiosarcomul) este o tumoră rară care se poate dezvolta din malformații vasculare preexistente sau din hemangioendotelioame benigne. Tumora a fost descrisă mai recent ca localizându-se în ficat cu o frecvență semnificativă la muncitorii din industria maselor plastice. Alte localizări posibile sunt țesuturile moi, glanda mamară, splina, măduva oaselor. Tumora este moale, cu aspect spongios, hemoragic, fără limite nete și este formată din lumene vasculare de tip capilar, mărginite de celule endoteliale atipice, cu frecvente monstruozități nucleare și mitoze, dispuse pe unul sau mai multe straturi și din plaje de celule sarcomatoase care delimitează fante vasculare.

Sarcomul Kaposi (sarcomul multiplu idiopatic hemoragic) este relativ frecvent în anumite zone din Africa Centrală, mai ales la bărbați. Clinic se manifestă prin limfedem, tumori cutanate multiple, unele ulcerate, prin adenopatii și afectări viscerale diverse (plămâni, tub digestiv, splină, ficat).

Tumorile cutanate sunt constituite inițial din elemente vasculare și celulare amintind structura țesutului de granulație; ulterior mugurii vasculari se înmulțesc progresiv, apar numeroase celule fuziforme, mitozele sunt abundente și leziunile iau caracter hemoragic, ulcerativ. În ciuda aspectului tumoral, unele leziuni se vindecă prin cicatrizare, în timp ce altele se extind.

1.5.5. Tumorile vaselor limfatice

• limfangiomul

• limfangiosarcomul

Limfangiomul, tumora benignă a vaselor limfatice, se localizează subcutanat, în limbă, intestin, mezenter, orbită, mai rar în regiunea cervicală sau retroperitoneal.

Tumora este compusă din numeroase vase limfatice de tip capilar (limfangiomul plexiform), dar mai frecvent are aspect cavernos (cavități mari intercomunicante) sau de chiste multiloculare ramificate (ex. limfangiomul cervical și cel retroperitoneal). Cavitățile conțin limfă clară și ocazional limfocite; prezența hematiilor poate face dificil diagnosticul diferențial cu unhemangiom. Limfangiomul determină mărirea in volum a unor porțiuni de organe sau organe întregi (ex. macroglosia).

Limfangiosarcomul este o entitate îndoielnică. A fost descris la nivelul limfaticelor membrelor superioare după mastectomie și iradiere pentru cancer mamar. Structural seamănă cu hemangiosarcomul dar vasele conțin limfă. Nu se poate afirma cu certitudine dacă este vorba de o proliferare malignă propriu-zisă a vaselor limfatice sau mai degrabă acestea sunt obliterate de către celule maligne provenite din cancerul glandei mamare (prin permeație limfatică).

1.6. Clasificarea TNM și stadializarea tumorilor maligne oro-maxilo-faciale

Clasificarea TNM joacă un rol esențial în medicina actuală și în cea a viitorului. Definirea stadiului tumoral din momentul depistării bolii este un element de prognostic important, un limbaj standardizat care descrie formațiunea tumorală la bolnavi comparabili și rămâne un factor cheie în aprecierea ratei de supraviețuire, rezultatelor terapeutice și a evoluției bolii.

Noua viziune a medicinii personalizate creează oportunități fără precedent în definirea standardelor de prognosticare în oncologie. Astfel, ar trebui validați algoritmi de prognostic care să încorporeze atât informații despre stadiul cantitativ al bolii cât și informații moleculare despre tipul de boală. Asemenea algoritmi ar menține contribuția distinctă și importantă a stadializării în timp ce ar permite creșterea gradului de predicție individual pentru fiecare bolnav.

Sistemul TNM este unul din cele mai folosite sisteme de clasificare utilizat de medici ca un instrument de a stadializa diferite tipuri de cancer pe baza unor criterii standard: extinderea tumorii primare (T), diseminarea în limfonodulii locoregionali (N) și metastazele în afara ariei de drenaj limfatic (M). Acest sistem a fost recomandat și dezvoltat în permanență de American Joint Committee on Cancer (AJCC) și de International Union Against Cancer(UICC).

Fiecare tip de cancer are propriul sistem de clasificare, astfel încât literele și numerele nu au întotdeauna aceeași semnificație. Stadiul I, II, III și IV este stabilit după determinarea și combinarea T cu N și M. În general, stadiul I și II tumoral definesc o tumoră primară de dimensiuni relativ mici, fără adenopatie. Stadiile III și IV tumorale includ tumori de dimensiuni crescute, care pot invada țesuturile învecinate și subiacente și/sau se extind la ganglionii regionali.[51]

Stadiul cancerului nu se modifică în timp, chiar dacă acesta progresează. Un cancer care recidivează sau diseminează este încadrat în același stadiu care i-a fost stabilit inițial la diagnostic. În caz de recidivă, cancerul poate fi restadializat, înregistrându-se cu „r” înaintea noii încadrări.

1.6.1. Indici descriptivi pentru clasificarea TNM[54]

cTNM reprezintă clasificarea clinică (preterapeutică) care se bazează pe datele obținute înaintea stabilirii sau inițierii unui tratament (examen clinic, investigații paraclinice);

pTNM reprezintă clasificarea bazată pe confirmarea histopatologică postchirurgicală;

rTNM reprezintă indicele de reclasificare (clinică sau histopatologică) a recidivelor, după un interval asimptomatic.

1.6.2. Indicatori suplimentari sistemului TNM[53]

1.6.2.1. Gradul de diferențiere a tumorii maligne (G)

Pe lângă tipul histopatologic tumoral, gradul de diferențiere al tumorii maligne este considerat un indice suplimentar de stadializare și evaluare a prognosticului bolii:

Tabel 3: Gradul de diferențiere tumoral

Este cunoscut faptul că o tumoră bine diferențiată sau moderat diferențiată (G1-G2) are un prognostic mai bun decât una slab diferențiată sau nediferențiată (G3-G4).

1.6.2.2. Indicele de tumoră reziduală (R)

Absența sau prezența tumorii reziduale în marginile de rezecție după tratament chirurgical este un indice suplimentar, care se suprapune într-o oarecare măsură peste clasificarea rTNM, dar care totuși a fost menținut:

1.6.2.3. Indicele de prezență tumorală în vasele limfatice (L)

Exprimă prezența sau absența celulelor tumorale (singulare sau grupuri) în vasele limfatice de mici dimensiuni (tapetate în mod evident de endoteliu) de la marginea tumorii primare.

Tabel 5: Indicele de prezență tumorală în vasele limfatice

1.6.2.4. Indicele de invazie tumorală venoasă (V)

Exprimă invazia tumorală în peretele vascular venos cu sau fără prezența celulelor tumorale în lumenul vascular venos. Nu există o clasificare pentru prezența tumorală în artere, aceasta fiind rară și trebuie menționată separat.

Tabel 6: Indicele de invazie tumorală venoasă

1.6.2.5. Indicele de invazie tumorală perineurală (Pn)

Exprimă prezența invaziei tumorale în tracturile nervoase, acest indicator fiind un factor de pronostic al evoluției tumorale, influențând decizia terapeutică adjuvantă sau chirurgicală.[55]

1.7. Tratamentul cancerului în sfera oro-maxilo-facială

Tratamentul cancerului în sfera oro-maxilo-facială constă în manage-mentul tumoral printr-un abord unic chirurgical, radioterapie (radioterapie externă (EBRT) și/sau brahiterapie), sau prin terapie adjuvantă sistemică (chimioterapie și/sau agenți țintă) sau diferite combinații ale acestora. Alegerea între terapia unică sau combinată ia în considerare o serie de factori care includ probabilitatea de control a afecțiunii, rezultatul funcțional și estetic preconizat, rezecablitatea tumorală, statusul general al pacientului, accesul și disponibilitatea mijloacelor tehnice și a expertizei.[56]

Cazurile pacienților oncologici oro-maxilo-faciali necesită o abordare interdisciplinară care să clarifice o serie de probleme: evaluarea cazului, integrarea diferitelor terapii disponibile, stabilirea rezecabilității chirurgicale tumorale, extirparea tumorii primare, stabilirea marginilor de rezecție, managementul chirurgical al nervilor cranieni (VII, X-XII), managementul laterocervical, managementul recidivelor și evaluarea ulterioară.[56]

Scopul ultim al tratamentului oncologic se traduce prin posibilitatea asigurării unui grad cât mai ridicat al calității vieții pacientului. Acesta este indicatorul subiectiv și personal fiecărui individ prin care își evaluează atât statusul sănătății (posibilitățile și limitările fizice, psihologice, emoționale și sociale) cât și funcționalitatea și performanțele în a-și îndeplini anumite activități, roluri și scopuri. Complexitatea și dificultatea atingerii acestui deziderat sunt date de faptul că tumorile oro-maxilo-faciale alterează o serie de funcții fiziologice importante (ex: capacitatea de a mesteca, înghiții, respira, comunica), senzoriale (gustul, mirosul, auzul) și anumite caracteristici esențiale individualității (ex: aspect, voce).[56]

În ultimii ani s-au înregistrat succese deosebite în terapia nonchirurgicală a cancerului oro-maxilo-facial. Acestea se referă la: a) modalitatea de iradiere tumorală pentru a se obține o diminiuare a toxicității asupra țesuturilor sănătoase, în timp ce augmentează nivelul iradierii țesuturilor țintă; b) evidențierea superiorității asocierii dintre radioterapie și chimioterapia asupra terapiei unice, atât în tratamentul definitiv cât și adjuvant, și c) identificarea unor procese biologice moleculare care descriu etiologia, evoluția ontogenezei și care au dus la dezvoltarea unor terapii inovatoare, care modulează aceste procese. (Nutting, Lee, Guerrero, Bhide citați de Staffieri)[1]

1.7.1. Tratamentul chirurgical

Chirurgia ca metodă terapeutică inițial este preferată în cazul tumorilor rezecabile[56] în situația în care statusul general al pacientului permite trauma operatorie.

Principiile tratamentului chirurgical curativ în tumorile oro-maxilo-faciale după Langdon citat din Bucur[54] sunt:

1) etapele intervenției chirurgicale de extirpare tumorală cuprind:

– extirparea tumorii primare cu margini libere

– plastia reconstructivă a defectului postoperator

– conduita terapeutică cervicală

2) metoda reconstructivă post intervențională se va alege anterior extirpării tumorale, deoarece posibilitățile reconstructive vor influența tiparul extirpării

3) se va prefera reconstrucția imediată a defectului operator pentru a se putea iniția tratamentul radioterapic cât mai precoce și pentru a se putea asigura o calitate a vieții și o reintegrare socială cat mai rapidă

4) nu se vor face compromisuri excizionale în favoarea plastiei reconstructive

Recomandările NCCN 2013 pentru excizia chirurgicală a cancerelor de cap și gât cuprind: [51]

– extirparea în bloc a tumorii primare trebuie efectuată de câte ori este posibil

– disecția laterocervicală în continuitatea exciziei tumorale este necesar a fi efectuată de câte ori tumora primară se extinde la nivelul gâtului

– limitele extirpării tumorale se stabilesc în funcție de extensia tumorii primare stabilită pe baza examenului clinic și interpretării corecte a imagisticii medicale

– în cazul tumorilor cavității orale riscul metastazelor regionale și necesitatea evidării ganglionare laterocervicale selective crește direct proporțional cu grosimea leziunii

– invazia perineurală tumorală trebuie suspectată în situațiile în care tumora primară se găsește în vecinătatea unui trunchi nervos motor sau senzitiv. În situația suspiciunii invaziei perineurale, nervul trebuie îndepărtat atât proximal cât și distal de tumoră pentru a se obține clearance-ul tumoral. Examinarea histopatologică a capetelor nervoase rezecate proximal și distal va certifica existentă marginilor de rezecție libere.

– rezecția parțială sau segmentară de mandibulă poate fi necesară pentru a se asigura margini de siguranță libere în cazul tumorilor aderente la periostul mandibular sau în cazul evidențierii imagistice a implicării osoase tumorale. Extinderea rezecției mandibulare se va decide intraoperator în funcție de extensia clinică a tumorii.

1.7.1.1. Marginile de rezecție tumorală

Unul dintre scopurile principale ale chirurgiei oncologice este obținerea extirpării tumorale complete, certificată prin absența infiltrării tumorale la nivelul marginilor de rezecție. Examinarea marginilor de rezecție poate fi efectuată extemporaneu, pe secțiuni înghețate sau fixate. Absența marginilor libere de rezecție tumorală va crește riscul recidivei tumorale și va conduce la necesitatea instaurării terapiei oncologice adjuvante. Reintervenția chirurgicală în vederea obținerii unor noi margini de rezecție libere crește riscul recidivelor locale și este supusă interpretărilor, datorită existenței riscului neconcor-danțelor între țesuturile rezecate ulterior din patul tumoral și regiunea fără margini de siguranță din blocul tumoral inițial.

Examinarea marginilor tumorale pe secțiuni înghețate se va efectua de obicei în timpul intervenției chirurgicale, extirparea tumorală fiind considerată satisfăcătoare atunci când permite obținerea unor secțiuni înghețate clare și continue (de obicei 1.5-2 cm de mucoasă normală la inspecție și palpare). Marginile de rezecție pot fi stabilite fie din specimenul tumoral, fie din examinarea patului tumoral cu orientarea corectă.

Marginea de rezecție liberă, exprimă existența a cel puțin 5mm de țesut sănătos până la frontul de invazie tumorală; existența a mai puțin de 5 mm fiind numită margine de rezecție la limită cu tumora. Marginile de rezecție pozitive exprimă existența carcinomului „in situ” sau a unui carcinom care invadează marginile de rezecție.

Blocul adenopatic laterocervical trebuie orientat sau secționat și individual, pentru a se identifica nivelele ganglionilor limfatici incluși în specimen.[51]

După Bucur, intervențiile chirurgicale se pot clasifica în extirparea curativă, în care scopul principal este extirparea tumorii primare în bloc, cu margini libere, sau paleativă în scopul îmbunătățirii calității vieții prin dimi-nuarea durerii, reducerea dimensiunii tumorii astfel limitându-se la tulburările funcționale induse de aceasta.[54]

În cazul tumorilor de părți moi orale și periorale, localizarea, dimen-siunea și elasticitatea tumorii vor determina limita de excizie. În cazul tumorilor de dimensiuni mici, în care se va realiza închiderea primară a defectului, liniile de incizie se vor masca în cutele naturale pentru obținerea unor rezultate fizionomice bune. Totuși se va urmări în primul rând controlul local în detrimentul rezultatului fizionomic. Astfel în cazul imposibilității închiderii primare a defectului, se va recurge la o alta metodă de plastie a defectului printr-un lambou de vecinătate, grefă liberă de piele sau lambou liber vascularizat anastomozat microchirurgical.[54] Decizia tehnicii de reconstrucție a defectului postoperator este la latitudinea chirurgului, acesta putând opta pentru lambouri de vecinătate sau regionale, lambouri libere, grefă liberă de piele despicată sau alte tipuri de grefe.

Unele studii din România au raportat o rată de supraviețuire post chirurgicală în cazul cancerelor oro-maxilo-faciale la un an de 86.36%, 49.43% la 3 ani, 30.68% la 5 ani și 3.41% la 10 ani, supraviețuirea după tratamentul chirurgical fiind semnificativ mai bună comparativ cu cea după alte tipuri de tratament, fiind semnificativ mai ridicată în cadrul femeilor, independent de mediul de proveniență.[57]

1.7.1.2. Atitudinea față de managementul nervilor cranieni VII, X, XI, XII

Decizia intraoperatorie față de nervii importanți cranieni (inclusiv față de nervul facial) în timpul extirpării tumorii primare sau a evidării ganglionare este influențată de funcționalitatea clinică preoperatorie a acestora. Când funcționalitatea nervoasă este prezentă, operatorul trebuie să depună efortul de a menține integritatea și funcționalitatea normală nervoasă chiar atunci când aceasta implică obținerea unor margini de rezecție tumorală nesatisfăcătoare, fără a lăsa totuși țesut tumoral restant important. Atunci când se suspectează persistența microscopică de țesut tumoral rezidual, este indicată terapie adjuvantă postoperatorie radioterapică sau chimioradio-terapică. Invazia tumorală a nervului și/sau pareza nervoasă preoperatorie recomandă rezecția nervoasă și uneori neurorafia, posibilitatea obținerii marginilor de rezecție libere rămânând la latitudinea operatorului.[51]

1.7.1.3. Managementul laterocervical (limfonodulii regionali)

Decizia managementului chirurgical al gâtului se stabilește în funcție de stadiul inițial al tumorii primare. În intervențiile chirurgicale curative pentru tumorile din regiunea oro-maxilo-facială, trebuie să se ia în considerare adenopatia regională.[54] În general, pacienții supuși tratamentului chirurgical de excizie a tumorii primare vor fi supuși disecției gâtului ipsilateral deoarece la acest nivel riscul de metastaze este cel mai ridicat. În cazul tumorilor în regiunile care au drenaj limfatic bilateral (ex: baza limbii, palatul) sau a tumorilor care se apropie de linia mediană (ex regiunea anterioară a limbii, planșeul oral etc), este indicată evidarea cervicală bilaterală. Nu este recomandată evidarea cervicală selectivă a gâtului în cazul preconizării radioterapiei postoperatorii.

Cel mai bun indicator pentru invaziile metastatice oculte este adâncimea invaziei tumorii primare, indicator care trebuie luat în evidență pentru nivelul cervical care necesită abordare chirurgicală și evidare. Pentru adâncimi mai mari de 4 mm, este recomandată efectuare evidării cervicale selective dacă nu este indicată radioterapia postoperatorie. Pentru adâncimi ale invaziei între 2-4 mm, chirurgul va decide asupra oportunității efectuării evidării selective, iar sub 2 mm, evidarea cervicală este limitată la un număr foarte redus de situații.[51]

Definirea tipului de evidare cervicală (radicală sau selectivă) se face în funcție de stadializarea clinică preoperatorie. Astfel, în cazurile N0, evidarea ganglionară cervicală selectivă în cancerul oral va include cel puțin nivelele I-III. Pentru N1-N2a-c se recomandă evidare cervicală selectivă sau radicală, iar pentru N3, este recomandată evidarea cervicală radicală. Chiar și în prezent, evidarea cervicală radicală reprezintă standardul de aur în evidarea terapeutică (cN+).[54]

1.7.2. Radioterapia tumorilor de parți moi orale și periorale

Radioterapia se poate utiliza în cadrul tratamentului multimodal al cancerului din sfera oro-maxilo-facială ca unic mijloc terapeutic curativ (radioterapie radicală) sau în asociere cu celelalte modalități de tratament în diverse etape ale tratamentului tumoral.

Metodele de aplicare a radioterapiei la nivelul formațiunii tumorale sunt radioterapia cu rază de iradiere externă (EBRT) și brahiterapia.

Radioterapia prin iradiere externă se utilizează în 3 situați:

– ca metodă terapeutică adjuvantă tratamentului chirurgical al tumorii primare, în vederea îmbunătățirii controlului loco-regional în cazurile de tumori cu caracteristici nefavorabile (ex: adenopatii metastatice cu efracție capsulară, margini de rezecție pozitive, invadare vasculară sau perineurală etc)

– ca și terapie primară în cazurile în care o intervenție chirurgicală nu este recomandată, fie datorită statusului local (tumori inoperabile), fie datorită statusului general al pacientului

– ca tratament de salvare în cazul tumorilor reziduale sau recidivelor tumorale[52]

Alegerea regiunii țintă și doza optimă de iradiere necesită o interpretare competentă a imagisticii capului și gâtului, precum și o înțelegere a tiparului de diseminare tumoral. Standardele de definire a teritoriului țintă, alegerea dozelor, fracționarea, asocierea sau nu a chimioterapiei, precum și rigorile conservării țesuturilor sănătoase învecinate, necesită o evoluție continuă a tra-tamentului radioterapic. Alegerea unei anumite tehnici de iradiere, fracționării, asocierii chimioterapiei, se decide pe baza stadiului tumoral, locației tumorale, experienței operatorului, existând un număr crescut de variante combinatorii cu repercusiuni asupra toxicității și controlului tumoral.[52]

Ca moment al introducerii radioterapiei în tratamentul tumoral, aceasta se poate clasifica în:

– radioterapie preoperatorie, ca primă etapă in tratamentul multimodal complex al cancerului, in scopul de a limita posibilitatea diseminării intraoperatorie a celulelor maligne din periferia tumorală[54]

– radioterapie postoperatorie: după excizia radicală a tumorii primar. Prin aceasta abordare se distrug focarele tumorale restante sau apărute prin diseminarea intraoperatorie

– radioterapia paliativă: utilizată în cazul tumorilor inoperabile în vederea diminuării simptomatologiei locale[54], neexistând un consens asupra protocolului radioterapeutic paliativ.[52] Aceasta variantă se adresează acelor pacienți care nu sunt apți din punct de vedere al statusului general pentru un tratament radioterapic standard sau care prezintă multiple metastaze.[52]

Unii autori recomandă utilizarea radioterapiei ca tratament încă din stadiile incipiente ale tumorilor sau în asociere cu chimioterapia în formele mai avansate de boală, urmate ulterior de tratamentul chirurgical sau ca singură variantă terapeutică în cazul pacienților cu risc operator crescut .[52]

Indicațiile generale pentru radioterapia postoperatorie sunt:

– tumori în stadiul T3, T4

– margini de rezecție tumorală compromise (mai mici de 5mm)

– invazie limfatică, vasculară sau perineurală

– adenopatie confirmată cu sau fără efracția capsulei[52]

Brahiterapia (radioterapia interstițială) constă în introducerea unor surse radioactive în interiorul sau în apropierea tumorii, surse care admini-strează o doză mare de radiație în volumul tumoral, reducând totodată expune-rea țesuturilor învecinate sănătoase la radiații. Brahiterapia poate fi luată în considerare ca și opțiune terapeutică în cazul tratamentului primar al tumorilor de mici dimensiuni, ca și tratament adjuvant chirurgiei în cazul exciziilor tumo-rale cu margini de rezecție pozitive sau în reiradierea tumorilor reziduale, reci-divelor tumorale sau a tumorilor secundare într-un teritoriu deja iradiat prin radioterapie externă.[52]

Indicațiile brahiterapiei sunt :

– tratament definitiv pentru tumorile incipiente

– tratament complementar chirurgiei

– în asociere cu radioterapia externă pentru a crește doza de iradiere în regiunea țintă

– opțiune de salvare în cazul unor tumori reziduale sau recidive de mici dimensiuni.[58]

1.7.3. Chimoterapia

Chiar dacă inițial chimioterapia a fost rezervată pacienților cu recidive sau metastaze tumorale, în prezent ea este utilizată frecvent ca și componentă a terapiei inițiale multimodale în scop curativ. În asociere cu radioterapia, chimioterapia îmbunătățește eficacitatea radiațiilor, crescând agresivitatea lor împotriva celulelor tumorale. Agenții chimioterapici își găsesc utilitatea și în tra-tamentul paliativ al carcinomului scuamocelular în regiunea maxilofacială. [59]

Mecanismul de acțiune al chimioterapicelor este reprezentat de interferarea diviziunii celulare, fiind activi împotriva celulelor cu diviziune rapidă. Agenții chimioterapici acționează prin alterarea funcției enzimelor sau substratului acestora de acțiune. Aceste enzime țintă aparțin sistemului de sinteză sau funcție a ADN-ului, sinteză mult crescută în celulele tumorale comparativ cu celulele normale.

În contextul actual, chimioterapia este utilizată în asociere cu radioterapie postoperatorie la pacienții cu caracteristici tumorale nefavorabile, studiile de specialitate arătând o îmbunătățire prin această asociere a contro-lului loco-regional și a supraviețuirii. [52][60]

Utilizarea chimioterapiei în asociere cu radioterapia ca și tratament unic, fără chirurgie nu este o practică de rutină. Situațiile în care se poate apela la această asociere sunt limitate la:

– cancere în stadii incipiente, pentru a se evita deficiențele funcționale și estetice

– cancere inoperabile

– recidive tumorale multiple care nu mai beneficiază de posibilități teh-nice pentru o nouă reintervenție

– opțiunea pacientului

Concluziile meta-analizelor sugerează că o asociere a chimioterapiei cu radioterapia în cazul pacienților care nu pot beneficia de tratamentul chirurgical poate fi luată în considerarea ca și variantă terapeutică.[52]

1.7.4. Terapia biologică a cancerului oral

1.7.4.1. Biologia moleculară a cancerului oral

Noile achiziții în domeniul înțelegerii carcinogenezei la nivel molecular, au schimbat într-un mod fundamental paradigma dezvoltării noilor terapii oncologice. Boala canceroasă este o boală genetică apărută atunci când apare o aberație la nivelul informației genetice, fie prin codificarea ei la nivelul ADN-ului celular, fie prin alterarea procesului de decodarea a ei. S-au depistat alterări în funcționalitatea normală a proteinelor codificate de gene alterate la nivelul celulelor tumorale. O explicație schematică a modificărilor genetice ce duc la apariția transformării canceroase este perturbarea echilibrului între activitatea expresiei genelor care stimulează diviziunea celulară și diminuarea acțiunii genelor care limitează acest proces. Astfel, celulele tumorale dezvoltă proprietăți de diviziune într-un mod necontrolabil, invadează țesuturile învecinate normale, determină formarea unui pat vascular aberant care să satisfacă necesitățile nutriționale crescute prin stimularea angiogenezei, meta-stazează la distanță și dezvoltă rezistență la terapiile anticanceroase.[1]

Procesul tumoral malign apare ca o consecință a alterării echilibrului între genele oncogene și genele supresoare tumorale.[1] Oncogenele sunt mutații ale genelor normale (numite proto-oncogene), care codifică proteine implicate în controlul proliferării celulare, supraviețuirii și răspândirii. Alterarea controlului asupra proto-oncogenelor aberante duce la o multiplicare necontrolată, modifică procesul apoptotic celular prelungind viața celulelor aberante și determină răspândirea acestor celule în alte țesuturi. Oncogenele sunt dominante fenotipic, astfel o singură copie mutantă a unei oncogene după o proto-oncogenă este suficientă în dezvoltarea cancerului.

O astfel de mutație în genele care codifică EGFR (factorul de creștere epidermal) explică capacitatea crescută de dezvoltare și supraviețuire a celulelor tumorale ale CSC la nivel oral față de țesuturile învecinate. Acesta este un exemplu clasic al oncogenezei legată de EGFR, care este calea dominantă de semnalizare responsabilă de caracteristicile maligne ale afecțiunii, supraexpresia ei fiind dovedită a se corela cu prognosticul prost al maladiei. Numeroase studii au arătat legături între supraexpresia EGFR,. oncogeneza și evoluția cancerului oro-maxilo-facial. Prezența în număr crescut a receptorilor c-erB în celulele tumorale au condus la două abordări terapeutice anticanceroase biologic selective: anticorpi monoclonali direcționați împotriva componentei extracelulare a receptorului și inhibitorii ai activității receptorilor tirozin-kinazei (TK1) cu masă moleculară mică.[1]

1.7.4.2.Terapia cu anticorpi monoclonali anti-EGFR

În ciuda dezvoltării terapiei anticanceroase a cancerului oral prin îmbunătățirea metodelor de iradiere și chimioterapie, este nevoie de terapii noi. Avântul biologiei moleculare a pus bazele dezvoltării unor noi terapii țintă. Se pare că următoarea clasă de medicamente va conține agenți inhibitori ai EGFR cu masă moleculară mică (și inhibitori ai altor membri ai familiei de receptori c-erB), agenți anti-angiogenici și medicamente care să stimuleze apoptoza în celula canceroasă. Aceste noi medicamente își vor găsi utilitatea în terapiile combinate alături de terapiile standard anticanceroase.[1]

Primele rezultate notabile s-au înregistrat prin utilizarea anticorpilor monoclonali anti EGFR (cetuximab) care s-a dovedit, în combinație cu radio-terapia, a îmbunătăți rata de control local și a prelungi supraviețuirea în cazul recidivelor tumorale (asociat cu chimioterapia). Acest medicament este primul dintr-o nouă serie de agenți care să acționeze selectiv la nivelul defectelor din celulele tumorale ale cancerului oral.

Studiile asupra CETUXIMAB (Erbitux) au demonstrat in vitro activitate antitumorală prin efecte antiproliferative și citotoxicitate directă, prin potențarea efectelor chimio și radioterapiei (după Barnes citat de Staffieri) iar in vivo au demonstrat activitate antiangiogenică.[1]

Studiile au demonstrat utilitatea asocierii terapiei cu CETUXIMAB cu radioterapia în cancerul OMF cu îmbunătățirea controlului local și a supraviețuirii, crescând semnificativ durata medie de viață.[1] De asemenea s-au demonstrat beneficiile Cetuximab-ului în îmbunătățirea rezultatelor tratamentului paliativ chimioterapic (Vermorken citat de Staffieri)[1] prin creș-terea ratei de supraviețuire și a duratei de viață în cazurile recidivelor și metastazelor cancerului oromaxilofacial.

Alți exponenți ai terapiei anticanceroase cu agenți biologici din grupul anticorpilor monoclonali sunt ZALUTUMUMAB și PANITUMUMAB.

O alta clasă de medicamente ale terapiei moleculară a cancerului sunt inhibitorii tirozin-kinazei (TK) EGFR. Reprezentanții acestei noi clase de medicamente sunt GEFITINIB și ERLOTINIB, care sunt inhibitori de tirozin-kinaza cu masa moleculară mică și cu o mare specificitate pentru EGFR, cu efect antiproliferativ. S-a demonstrat că asocierea gefitinib chimioterapiei inhibă creșterea tumorală și stimulează apoptoza celulară (după Besalga citat de Staffieri)[1]

Alte abordări noi terapeutice se adresează imortalității celulare dată de reactivarea expresiei telomerazei în celulele tumorale, astfel permițând acestora să-și refacă porțiunile telomerilor pierdute la fiecare diviziune, pierzându-si astfel proprietatea de a intra în faza replicativă, ieșind din numărul finit al diviziunilor celulare a unei celule normală.[61]

Altă direcție de acțiune a noilor terapii este împotriva angiogenezei aberante induse de tumori prin alterarea echilibrului dintre factorii pro-angiogenetici și anti-angiogenetici. Cancerele induc angiogeneza prin stimularea producției factorilor pro-angiogenici: VEGF, bFGF, aFGF, TGF-β, TGF-α, PDGF, TNF-α sau prin inhibarea producției de proteine anti-angiogenetice: angiostatinei, endostatinei, trombospondin-1 și 2, inteleukinelor (IL-1β, Il12, IL-18), antitrombina III, celulele endoteliale tumorale având receptori pentru ambele tipuri de factori[1]. Medicamentele care țintesc angiogeneza se clasifică în două mari grupe: agenți de perturbare vasculară- produc o disfuncție rapidă și selectivă a vascularizației tumorale ducând la moartea tumorală, și agenți antiangiogenici – inhibă neoangiogeneza.[1]

2. PARTEA SPECIALĂ

2.1 SCOPUL STUDIULUI

În studiul nostru am încercat să identificăm prin citodiagnostic orientativ leziuni precursoare carcinomului cu celule scuamoase din sfera orală și periorală, corelând datele clinice cu cele cito-histopatologice. Pe de altă parte, am încercat să apreciem care este relativa frecvență a displaziilor convenționale de grad/risc scăzut versus grad/risc crescut, față de carcinomul scuamocelular invaziv adiacent pe secțiuni la parafină, având in prealabil o apreciere citodiagnostică a leziunilor investigate. De asemenea, am încercat să apreciem dacă diferitele grade de displazie sunt asociate cu tipuri speciale de carcinoame și dacă displazia severă are un rol în progresia leziunilor spre carcinomul scuamocelular invaziv.

Bazându-ne pe o bogată cazuistică comparativă în ceea ce privește depistarea, supravegherea lezională și diagnosticul diferențial cito-histo-patologic al carcinomul scuamocelular cu alte localizări, am încercat să încadrăm fiecare leziune carcinomatoasă orală și paraorală prin extensia și compararea datelor cito-histopatologie și imunohistochimice cu echivalentele lezionale evaluate anterior sau simultan.

Astfel, studiul nostru reprezintă o angajare progresivă în dezvoltarea abilităților medicale de cito-histodiagnostic calcate pe date clinice solide, în evaluarea leziunilor precursoare malignității sau cert maligne din sfera orală și periorală.

Problemele ridicate de citodiagnostic sunt:

prezența a numeroase leziuni chistice în sfera maxilo-facială;

carcinomul scuamocelular (fie primar sau metastatic) este o leziune frecvent întâlnită în regiunea cap-gât, astfel că este greu interpretabil materialul celular provenit din spații chistice cu material necrotic și celulele scuamoase maligne vs. celulele reactive vs. celule de tip sarcomatos sau limfomatos.

Motivația studiului interacțiunilor celulare. Competiția între sistemul imunitar, patogeni și celulele tumorale. Evoluția în timp a unei celule este reglată de genele conținute în nucleul acesteia. Aceste gene pot fi activate sau suprimate atunci când celula recepționează, prin intermediul receptorilor aflați la nivelul membranei, semnale externe care sunt transmise nucleului. Recepționarea unui anumit semnal poate modifica modalitatea în care se comportă în mod obișnuit o celulă. În situații extreme, un semnal poate induce celulei un comportament caracterizat prin proliferare excesivă, aceasta dând naștere unor descendenți identici; fenomenul numindu-se expansiune sau mitoză clonală. Există însă și posibilitatea ca, din cauza recepționării unui semnal, celula să-și înceteze existența; acest proces este denumit apoptoză.

Unele teorii enunță că schimbările genetice, modificările apărute în cadrul ciclului celular și pierderea capacității celulei de a-și înceta existența prin procesul de apoptoză sunt legate de denaturarea ADN-ului, eveniment care poate fi cauzat și de factori externi, care nu țin de activitățile interne ale organismului. De aceea, interacțiunile și competiția la nivel celular trebuiesc analizat din punctul de vedere al modalității în care sistemul imunitar inhibă sau întreține desfășurarea anumitor procese. Dacă numărul de celule afectate de mutații crește semnificativ, apar alte fenomene, precum condensarea într-o tumoră solidă, difuzia și formarea vaselor capilare în interiorul tumorii, desprinderea unor celule din masa tumorii prin metastază și invadarea altor regiuni.

Atunci când celulele își pierd diferențierea, începe competiția între acestea și sistemul imunitar. Această competiție este un fenomen complex care implică interacțiunea între celule sau particule care au invadat gazda și diverse populații ale sistemului imunitar al gazdei. Interacțiunile apar la mai multe niveluri: dinamica celulară depinde esențial de interacțiunile subcelulare. Capacitatea de proliferare a tumorii și cea de apărare a sistemului imunitar sunt principalele elemente ale acestei competiții. În plus, capacitatea tumorii de a inhiba recunoașterea celulelor ce o compun de către sistemul imunitar joacă un rol semnificativ în această competiție.

La nivel celular, modelele își propun să simuleze efectul eșecului apoptozei și pierderea diferențierii celulelor. Indiferent dacă o celula este recunoscută sau nu de către sistemul imunitar, începe o competiție care se poate finaliza fie cu distrugerea celulelor care compun tumora fie cu inhibarea activității sistemului imunitar. Interacțiunile celulare sunt reglate de semnale emise sau recepționate de celule prin intermediul unui dialog biologic complex. De aceea, legătura cu nivelul subceluar este evidentă. Pe de altă parte, dacă dezvoltarea celulelor tumorii nu este suprimată de către sistemul imunitar, tumora tinde să se condenseze într-o formă solidă și, din acest moment, relevante devin principiile modelării la nivel macroscopic. În particular, de la nivelul celular trebuiesc preluate proprietăți macroscopice care sunt observabile numai atunci când tumora devine solidă. La nivel macroscopic, celulele ce compun tumora se vor condesa într-o entitate cvasi-fractală care interacționează cu mediul înconjurător. Aceste interacțiuni au loc la suprafață și în zonele în care angiogeneza, procesul prin care sunt generate vase sanguine, indus de factori de creștere generați de tumoră, se desfășoară. Aici se suprapun fenomenele care apar la nivel celular cu acelea specifice comportamentului macroscopic, precum difuzia sau, mai general, fenomene care legate de conservarea sau evoluția variabilelor macroscopice, precum dimensiunea tumorii. Descrierea la nivel celular poate fi obținută prin studiul evoluției distribuției de probabilitate a stării microscopice a celulelor, mai degrabă decât prin analiza dinamicii tuturor celulelor ce compun această entitate. Un astfel de model poate fi dezvoltat utilizând metode de teoria cineticii. Acest tip de modelare reduce complexitatea ce o implică analiza unui număr foarte mare de celule, însă nu rezolvă în totalitate problema modelării unui sistem caracterizat de variabile mecanice și biologice. Soluția acestor probleme generează rezultate ce se referă la cantitățile macroscopice ce descriu evoluția unei tumori.

Prin studiul citologic al frotiurilor de exfoliere, amprentaj și puncție aspirativă putem avea acces la evaluarea tuturor parametrilor morfologici celulari care să explice manifestările macro-și microscopice ale multor procese tumorale din țesuturile deosebit de complexe la nivelul oral și paraoral. În multe procese cum ar fi vindecarea plăgilor, inflamația și progresia cancerului, citoskeletul modifică și influențează formele și mobilitatea celulară.

Analizând frotiurile celulare comparativ cu aspectele histo-imunohistochimice, într-un context clinic dat, putem explica multiplele manifestări biologice și evoluții clinice ale leziunilor orale și paraorale.

Recidivele unor leziuni, prognosticul și conduita terapeutică a altora, par să fie direct legate de particularitățile structurale ale celulelor și țesuturilor orale și paraorale, a căror interconectare morfo-funcțională debutează din primele etape ale embriogenezei și se menține de-a lungul întregii evoluții ontogenetice a individului.

Dacă unele componente citoscheletale cum ar fi microtubulii și actina sunt bine investigate, proteinele filamentelor intermediare nu sunt cercetate în diferite contexte lezionale, așa cum se întâlnesc în patologia diversă la nivelul capului și gâtului. Abundența epiteliilor cu tendință la keratinizare sau keratinizate fiziologic sau patologic din această regiune anatomică a corpului, impactul mucoaselor cu antigene variate, conferă studiului citologic o semnificație diagnostică deosebit de importantă, incluzând și evaluarea predictiv-prognostică și de orientare a tratamentului mult mai rapid implementate decât în studiul citologic al altor localizări lezionale. Slaba keratinizare sau anaplazia celulară descrisă pe frotiuri conferă date asupra prognosticului și evoluției biologice a țesuturilor.

Confirmarea imunohistochimică a diferențierilor celulare poate fi direct legată de particularitățile evolutive și posibilitățile de diagnostic și tratament ale leziunilor orale și paraorale.

Frecventele leziuni cu tranziție epitelio-mezenchimală sau cu diferențiere epi-mioepitelială din sfera orală și paraorală, sunt dependente de dereglările unor componente citoscheletale cum ar fi keratinele, contribuind la potențialul invaziv și migrator accentuat al celulelor tumorale din sfera orală și maxilo-facială. Procesele de remodelare a citoskeletului sunt implicate în adeziunea intercelulară și a celulelor la matricea extracelulară, evenimente tisulare care pot fi studiate citologic pe frotiuri și histopatologic.

Deși abundente, studiile moleculare nu au fost descrise interconectate cu datele clinice și histopatologice pe țesuturile orale și paraorale. În aceeași măsură, convergența studiului citologic pe frotiuri cu cel histopatologic, într-un context clinic specific, poate orienta atitudinea terapeutului chirurg, oncolog, hematooncolog, orelist sau chiar stomatolog. Studiul nostru poate aduce contribuții importante în evaluarea mecanicii și morfologiei celulare din leziunile complexe ale capului și gâtului.

Exista puține studii citologice corelate cu date histopatologice și variate contexte clinice în patologia orală și periorală. În plus, citologia mucoaselor căilor digestivă și respiratorie superioară, mai ales a mucoasei orale, nu este uzitată constant în evaluările clinico-prognostice și de diagnostic ambulator sau extemporaneu, din practica oncologică a sferei orale și maxilo-faciale, lăsând multiple spații de cunoaștere medicală neexplorate.

2.2. Material și metode

2.2.1. Studiul clinico-statistic: Determinarea frecventei și a tiparului de apariție al leziunilor tumorale de țesuturi moi orale și periorale[62][63]

Am efectuat un studiu încrucișat descriptiv retrospectiv pe pacienții cu tumori de țesuturi moi orale și periorale internați în Clinica de Chirurgie Orală și Maxilofacială a Spitalului Clinic Municipal de Urgență din Timișoara între anii 2008-2010. În studiu au fost incluși 1355 de pacienți cu vârste cuprinse între 1 și 94 ani, de sex masculin și feminin, din mediu rural și urban. Au fost analizate date din fișele medicale ale pacienților și rezultatele examenelor histopatologice. Din baza de date a spitalului am obținut informații despre pacienții internați în perioada ianuarie 2008-decembrie 2010, diagnosticați cu leziuni tumorale de țesuturi moi în regiunea orală și periorală. Diagnosticele pacienților s-au codificat în baza de date utilizându-se versiunea a X a Clasificarii Internationale a Bolilor pentru codificarea diagnosticului (ICD-10). Codificarea acestui sistem se bazează pe tipul și localizarea anatomică a leziunii.[64] (în anexe tabelul 8). Aceste informații au fost corelate cu rezultatele examenelor histopatologice pentru toate tumorile benigne si maligne.

S-a realizat un raport ce include următorii parametri pentru fiecare pacient: sex, vârsta, mediu social, localizarea tumorii, diagnostic histo-patologic, iar in cazul unei tumori maligne confirmate histopatologic, prezența adenopatiilor neoplazice sau reactive, metastazele, recurentele, invazia perineurală sau perivasculară, aspectul marginilor chirurgicale si terapiile oncologice adjuvante sau paliative.

Pacienții au fost supuși intervenției de biopsiere în cadrul Clinicii de Chirurgie Oro-maxilo-facială – Timișoara. Diagnosticul a fost confirmat în urma examenului histopatologic al mostrelor, efectuat în Laboratorul de Anatomie Patologică a Spitalului Clinic Municipal de Urgență din Timișoara.

Prelucrarea statistică a datelor a fost realizată în programul IBM SPSS Statistics 20 în cadrul Disciplinei de Informatică Medicală a UMFT „V. Babeș”.

2.2.2. Studiul cito-histopatologic

Am efectuat un studiu cumulativ, retro-prospectiv în perioada 2008-2013 în care am analizat citologic un număr de 678 de pacienti investigați, de amblele sexe cu vârsta curpinsă între 2 și 78 de ani și am selectat 96 de cazuri investigate imunohistochimic. Patologia studiată a cuprins leziuni de țesuturi moi de la nivel oral și perioral incluzând lojile laterocervicale. Analiza citologică și imunohistochimică s-a efectuat în cadrulul Laboratorul de Anatomie Patologică a Spitalului Clinic Municipal de Urgență din Timișoara, materialul bioptic și citologic provenind din clinicile de Chirurgie oro-maxilo-facială (peste 80% din cazuri), ORL, hematologie, chirurgie generală, chirurgie toracică și oncologică din cadrul aceluiași spital.

În cadrul studiului imunohistochimic am analizat selectiv la cele 96 de cazuri o serie de 26 de markeri.(tabel 9)

Dintre markerii amintiți, nu toți sunt implementați în diagnosticul curent histopatologic (Cyclina D1, Podoplanina (D2-40), EBV).

2.2.2.1 Tehnica de prelucrare a materialului citologic[32][33][44]

Modificări celulare produse în timpul prelucrării frotiului. Prin aspirare sau amprentare, celulele sunt extrase din țesut. Asemenea unui „ou care se sparge“, celula se „lățește“ prin etalare, fenomen care nu este identic pentru toate celulele și care depinde de „rigiditatea“ nucleului și citoplasmei. Nucleii mari, veziculoși, sunt mai modificați decât cei mici, picnotici. Fixarea frotiului are de asemenea importanță. Uscarea celulelor la aer (metoda APT-Drăgan, metoda Giemsa) poate modifica destul de mult aspectul celulelor mai ales pentru nucleii mari și citoplasmele abundente, hidratate. Celulele fixate în alcool etilic sunt protejate, în parte, de denaturare prin acțiunea de „indurare“ și deshidratare dată de alcool (se va lua deci în considerare concentrația alcoolului: 40°, 70°, 80°, 96°, alcool pur și adaosul de polietilen-glicol la amestecul fixator). Denaturarea celulară prin etalare este influențată și de „micromediul“ celulei (materialul bogat în mucus și proteinele având rol protector în ceea ce privește întinderea celulară). Etalarea celulei izolate este diferită de cea a grupelor celulare compacte. Astfel, pe frotiul uscat, nucleii și chiar celulele pot să pară mai mari datorită unei „întinderi“ – etalări maximale.

Există o relație strânsă între etalarea celulelor, a nucleilor lor și rezultatele colorației metodei APT-Drăgan, Giemsa, Papanicolaou. Când materialul „de fond“ este mucinos sau bogat proteic, etalarea celulară nu este optimă și apare necesar a se utiliza fixatori speciali sau „spălarea“ materialului celular cu Cytospin. În cazul unelor aspirate, presupuse a fi sărac celulare, pentru creșterea aderenței celulelor pe lamă se folosește fixarea la aer (prin uscare). Celulele prefixate (ca în metoda Papanicolaou) se etalează și aderă mai puțin.

Fixarea la aer „prin uscare“ prin metoda APT-Drăgan și Giemsa.[32] Este rapidă în prima metodă și cuprinde o post-fixare cu metanol în metoda Giemsa. „Uscarea“ trebuie făcută rapid. Această fixare nu se recomandă materialului bogat în mucine și proteine. Poate fi făcută și la microunde sau cu aeroterma.

Fixarea umedă prin metoda Papanicolaou. Alcoolul etilic folosit ca fixator în această metodă desface structura secundară și terțiară a proteinelor, făcând proteinele insolubile. Alcoolul etilic are și un efect deshidratant. Ca rezultat, celulele fixate se colorează mai bine cu coloranți proteici. În plus, alcoolul etilic face membrana celulară permeabilă pentru coloranți.

De asemenea, se expun situs-urile reactive ale ADN-ului. Astfel, hematoxilina se leagă de cromatină și nucleul se colorează albastru în metoda Papanicolaou.

Colorarea frotiurilor. La cazurile investigate, pentru colorarea frotiurilor au fost utilizate următoarele metode:

Metoda APT-Drăgan [32] – metodă introdusă în circuitul citologic de prof. Maria Drăgan de la Disciplina de Histologie a U.M.F.-Timișoara în anul 1968. Metoda este mai puțin cunoscută, fiind aplicată mai frecvent în ultimii ani. Ea prezintă o serie de avantaje incontestabile:

este rapidă (se execută în maxim un minut).

utilizează un singur colorant, fiind o metodă cu preț de cost scăzut.

nu necesită fixarea preparatelor.

realizează o bună colorare a nucleului, permițând studiul cromatinei nucleare și al nucleolilor (fapt deosebit de important pentru stabilirea diagnosticului de malignitate).

nu colorează hematiile, ceea ce reprezintă un avantaj în cazul frotiurilor hemoragice.

Redăm mai jos timpii tehnicii APT-Drăgan:

1. Colorare cu soluție albastru-policrom 15 sec.

2. Spălare în două băi de apă distilată sau de robinet 15 sec.

3. Diferențiere în soluție tanin 1% 15 sec.

4. Spălare în apă distilată sau de robinet 15 sec.

5. Uscarea frotiului și montarea (necesară numai în cercetare)

Am utilizat metoda APT-Drăgan la toate frotiurile obținute prin citoamprentaj.

Metoda Papanicolaou[33][39][44] – a fost utilizată pentru studiul frotiurilor orale obținute prin citoamprentaj și citologie exfoliativă. Comparativ cu metoda APT-Drăgan este mai laborioasă, mai scumpă și necesită o prealabilă fixare a frotiurilor. Este însă metoda clasică de studiu care realizează cea mai bună diferențiere a nucleilor și citoplasmelor. Printr-un examen citologic atent se poate, în cele mai multe cazuri, să se facă diagnostic diferențial între displazii, carcinoame intraepiteliale și carcinoame invazive.

Timpii tehnicii:

1. După fixare foarte rapidă se trec direct frotiurile în etanol 80%, 70%, 50% până la apă distilată.

2. Colorare cu hematoxilină Harris 15 sec.

3. Spălare în 3 băi de apă distilată, în recipiente separate. Spălarea se face blând pentru a nu dezlipi frotiurile.

4. Spălare în 50% etanol.

5. Soluție 1,5% hidroxid de amoniu în 70% etanol, 1 min.

6. Spălare în 70% etanol, apoi imersie în 80% și respectiv 95% etanol.

7. Colorare cu orange-G (OG) 15 sec.

8. Spălare în 3 băi de 95% alcool.

9. Colorare cu eozină A-65 3 min.

10. Spălare de 3 ori în 95% etanol, în 3 băi separate.

11. Deshidratare și clarefiere în: alcool absolut, mixtură părți egale de alcool-xylol și apoi xylol.

2.2.2.1.1. Tehnica PAF.[44] Se efectuează cu ac subțire (22G), după anestezie locală minimă (fig. 2, în anexe fig. 3). Acul ar trebui să fie prevăzut cu mandren pentru a nu se preleva celule de pe traiectul de puncție. Manevra este repetabilă fără complicații locale. Aspiratele depuse pe lame degresate, sunt fixate prin uscare la temperatura camerei (unele sunt fixate cu alcool etilic imediat după recoltare pentru a fi colorate Papanicolaou), colorate apoi cu una dintre metodele specifice investigației citologice (May-Grünwald-Giemsa, APT-Drăgan, Papanicolaou). Examinarea pe lamă umedă sau cu imersie se poate efectua imediat. PAF poate precede puncția-biopsie sau este singura investigație care se practică, orientând procedura terapeutică.

CA, spre deosebire de citologia aspiratelor care se obțin prin PAF din organe parenchimatoase (cu etalare celulară fără a se mai păstra, decât parțial, arhitectonica tisulară), permite conservarea organizării structurii de examinat și aprecierea tipului și extensiei leziunii. CA permite interpretarea participării complexe celulare intra- și perilezional. Este o metodă utilă mai ales intraoperator, pentru diagnosticul tumorilor ce nu-și elimină celulele prin secreție decât rareori. Din partea examinatorului se cere o bună cunoaștere a texturii și compoziției tisulare din zona anatomică investigată.

Utilitatea citodiagnosticului prin amprentare în unele leziuni superficiale (piele și mucoasă) ulcerate, cu evoluție trenantă, greu de încadrat clinic este cu atât mai mare cu cât poate orienta terapia pre-excizională (asanarea unei infecții, radioterapie, ș.a.).

2.2.2.1.2. Recoltarea materialului citologic și prelucrarea amprentei de organ[39][50]

Intraoperator sau imediat după recoltare, de preferință chiar în sala de operație, piesa se taie cu un cuțit bine ascuțit (pentru păstrarea structurii capsulei) de-a lungul axului mare. În mod convențional, nu se folosesc fixatori speciali, transportul se va face cu atenție și rapid între sala de operație și labo-rator, pentru a nu produce denaturări ireversibile ale structurilor de examinat.

Piesa se amprentează prin apăsarea ei ușoară pe o lamă bine degresată. Apăsarea nu trebuie să fie brutală, pentru a nu se denuda nucleii de citoplasmă, care la unele celule, mai ales tumorale maligne, este friabilă și laxă. Uscarea frotiului se face la aer, cu aeroterma, în câteva minute sau prin poziționare pe stativ timp de 10-15 minute.

Fixatori de tip Cytostat, Cytospin sunt necesari pentru prelucrare prin metode imunocitochimice. Pentru a se obține o bună colorație a compo-nentelor celulare, amprenta se prelucrează imediat după uscare sau fixare cu fixatori speciali (alcool etilic, Cytostat), evitându-se învechirea preparatului. Se vor respecta timpii colorației, Ph-ul din băile de spălare, iar dosul lamei după terminarea colorării se va șterge, și lama se usucă în poziție înclinată, pentru a se evita pătarea frotiului.

Examinarea se face în funcție de tehnica folosită prin montare cu balsam de Canada, pe preparat umed sau cu imersie.

Dacă preparatul conține aglomerări mari celulare, identificarea elementelor pe CA este dificilă. Densitatea prea mare a celulelor de același fel (ca în afecțiuni tumorale primare ale sistemului limfoid) face dificilă identifi-carea tipului celulelor. Un alt impediment pentru colorare și interpretare îl reprezintă revărsările citoplasmei din aglomerările celulare care dau un fond cenușiu sau albăstrui.

2.2.2.2. Tehnica histopatologică.[33][35]

Orice interpretare corectă a structurilor țesuturilor moi depinde de calitatea tehnicii histologice și de activitatea histotehnicianului. Materialele prelucrate se interpretează atât în scop diagnostic, cât și de cercetare.

Fixarea și fixatorii au ca scop oprirea evoluției celulelor și țesuturilor într-o stare cât mai apropiată de statusul lor funcțional. Prin fixare, piesele trebuie să reziste procedurilor tehnice ulterioare, să lege coloranții pentru a putea fi examinate microscopic. În timpul fixării intervin multiplii factori fizici și chimici care pot influența mecanismul fixării. Fixarea trebuie să servească conservării unor substraturi celulare și tisulare care se cer păstrate în vederea stabilirii diagnosticului de leziune. Trebuie să permită:

păstrarea naturii biochimice particulare a substratului;

observarea în microscopie optică (după caz, în microscopie electronică);

menținerea volumului piesei;

desfășurarea metodologiei histochimice și imunohistochimice în stabilirea diagnosticului de leziune sau al studiului histologic al piesei.

Fixarea frotiurilor în citologie se poate face prin imersarea lamelor în alcool 95° timp de 30 minute;

Înainte de a fi incluzionate, este necesară spălarea pieselor fixate.

Incluzionarea este un proces care permite infiltrarea pieselor cu un material elastic, semidur, cu punct de topire fix, care poate fi secționat după solidificare.

Cel mai cunoscut mediu de incluzie este parafina histologică care are un punct de topire de 560 C.

Regula generală: se toarnă parafina prima și apoi se introduce piesa de incluzionat. Piesa se orientează cu ajutorul unor instrumente preîncălzite.

Orientarea piesei: este utilă marcarea marginilor și suprafețelor piesei cu tuș de China sau alte substanțe colorante (acești coloranți se vor dizolva în timpul rehidratării și nu interferează cu colorația). Se practică marcajul marginilor atunci când nu putem aprecia tipurile tisulare ce compun piesa sau atunci când nu suntem atenționați de clinician asupra compoziției piesei

Incluzionarea la parafină a fost pusă la punct de Krebs în anul 1869. Parafina este o mixtură de hidrocarburi solide derivate din petrol, incoloră, albă și uneori translucidă. Există parafine moi cu punct de topire 45°C și parafine dure cu punct de topire 56°-60°C. Alegerea tipului de parafină ține cont de consistența țesuturilor, condițiile de ambient ale laboratorului și de păstrarea blocului. La parafină se pot adăuga polimeri plastici care îi cresc consistența și elasticitatea, prevenind astfel comprimarea și distorsionarea secțiunilor. La parafină se poate amesteca ceară de albine în proporție de 10-20%, îmbunătățindu-i calitățile și permițând secționarea uniformă a piesei.

Secționarea. Este o operație simplă, presupunând însă o mare îndemânare pentru obținerea secțiunilor din blocul de parafină cu diferite grosimi. Secțiunile sunt apoi lipite pe lame în vederea colorării.

Deparafinarea și hidratarea secțiunilor în vederea colorării este o operațiune care se desfășoară fie în truse sau automatizat.

Colorarea și coloranții. [33][35][45]

Metode de colorare: Definiția, scopul și regulile generale de colorare.

În tehnica histologică coloranții sunt utilizați sub formă de soluții apoase sau alcoolice în diferite concentrații. Elementele componente ale țesuturilor și organelor au aproape același indice de refracție ceea ce îngreunează studiul lor și de aceea, în vederea diferențierii lor optice, se recurge la colorare. Imaginile care se produc prin absorbția luminii în preparatele colorate sunt mai ușor de observat și interpretat, decât imaginile de difracție date de preparatele necolorate.

Transmiterea electivă a colorației substraturilor se realizează prin diferite mecanisme de absorbție a colorantului pe substrat, prin solvirea lui în substrat, prin reacții chimice de tipul reacțiilor dintre acizi și baze. Colorațiile trebuie înțelese, de fapt, ca fenomene în care acțiunile fizice și chimice sunt sinergice, cu predominanța însă a celor chimice.

Colorația poate să fie progresivă, atunci când colorantul acționează până se obține o colorație optimă și poate fi regresivă, când secțiunea se supracolorează și apoi se înlătură excesul de colorant prin spălare până la obținerea rezultatului dorit. Spălarea excesului de colorant este operațiunea numită diferențiere.

Colorarea secțiunilor histologice se poate face cu un singur colorant (hematoxilina ferică, tionina) în care caz colorația este simplă, sau se utilizează combinații de doi sau mai mulți coloranți, obținându-se colorații combinate.

Dintre colorațiile combinate, cea mai utilizată, atât în histologie cât și în histopatologie, este colorația bicromă hematoxilină – eozină. Altă combinație este cea tricomă care utilizează mai mulți coloranți simplii, ca exemplu colo-rația tricomă Masson, în care se folosește hematoxilina, fuxina acidă, oranj G.

Afinitatea tinctorială a substraturilor din materialul biologic se caracterizează prin:

acidofilie când substratul se colorează cu reactivi acizi (eozinele, verde lumină);

bazofilie când substratul se colorează cu reactivi bazici (hematoxilină, albastru de metilen);

metacromazie caracteristică reactivilor tiazidici (albastru de toluidină, tionină, albastru policrom, azur A); un substrat se colorează meta-cromatic când ia altă culoare decât aceea a substanței colorante, de exemplu granulele mastocitelor, substanța fundamentală a matricei cartilaginoase, mucinele complexe sau acide.

O serie de coloranți bazici (albastru de toluidină în soluție apoasă) este utilizată pentru examenul morfologic de rutină, chiar în condiții rapide, prin examen extemporaneu. În aceste condiții descriem o bazofilie ortocromatică (în general la pH-uri mari de 5 sau 6) și bazofilie metacromatică (roșu-violet) proprie de obicei substraturilor fosfatate, sulfatate, mai puțin carboxilate (la pH sub 4). Astfel, nu se evidențiază substraturile acidofile asupra cărora nu putem face nici un fel de referire. Nu se recomandă folosirea exclusivă a coloranților tiazidici pe preparate de sânge și măduvă hematogenă.

Desemnarea afinității unui substrat pentru un anumit colorant folosește denumirea reactivului la care se adaugă sufixul „-filie“ (substratul colorat cu Albastru Alcian = alcianofilie; substratul colorat cu Sudan = sudanofilie).

2.2.2.2.1. Colorații topografice și histochimice. [33][35][45]

Redăm în continuare tipuri de colorații, metode histochimice pentru evidențierea substraturilor în celule și țesuturi:[33][35]

Colorația cu hematoxilină-eozină (HE):

Principiu : hematoxilină (H) fiind un colorant bazic, acționează asupra substraturilor cu grupări acide (anionice, electronegative) libere. Eozina, colorant acid, asociată colorantului bazic, acționează asupra substraturilor încărcate pozitiv. Cele mai multe proteine citoplasmatice se comportă la pH acid ca baze, expunând grupările NH3+, care reprezintă locul de atașare pentru colorantul acid-eozină.

Tehnica de colorație hematoxilină-eozină (HE): în trusa de colorație se folosește soluția 1 de hematoxilină (Harris) care se filtrează după colorarea a 25-30 de secțiuni; soluția 2 de eozină.

Timpii tehnicii: secțiunile sunt deparafinate și hidratate, colorarea se face cu soluția 1 timp de 5 min, apoi spălare cu apă curentă 5 min și spălare cu apă distilată 5 min; urmează colorarea cu eozină timp de 5 min și spălarea cu apă distilată 5 min; deshidratere, clarefiere, montare în balsam de Canada.

Rezultate : structurile bazofile (cromatina, citoplasma bogată în ribozomi sau ergastoplasmă, unele mucine și granule de secreție, precum și SF conjunctivă bogată în GAG) se colorează în nuanțe de albastru. Citoplasma celulelor mature, fibrele colagene mature, eritrocitele, unele granulații citoplasmatice și matricea osoasă se colorează în roz-roșu.

B Colorațiile tricrome sunt utilizate pentru a face distincția dintre fibrele de colagen și țesutul muscular, fapt însemnat în interpretarea unor leziuni inflamatorii și tumorale. Aceste colorații utilizează coloranți nucleari, citoplasmatici și fibrilari în soluții care conțin mordant (acid fosfotungstic sau fosfomolibdic). Prima metodă tricromă de colorare a fost introdusă de Mallory, ulterior modificată de Masson și Gömori.

C. Reacția PAS (periodic acid Schiff) (după Lison, 1960).[49]

Principiu: oxidarea grupelor alcoolice (R-OH) ale substratului până la stadiul de aldehidă: evidențierea grupelor aldehidice printr-o reacție de culoare specifică în mediu acid la un pH apropiat de 2; acidul periodic (HIO4. 2H2O) oxidează grupările 1,2 glicoli, transformându-le în aldehide: – CHO – CHO. Al doilea timp important al reacției PAS urmărește evidențierea grupărilor aldehidice prin oxidare cu ajutorul soluției Schiff. Mecanismul de colorare este controversat, dar se admite că ar fi vorba de un proces de adiție și condensare într-o moleculă de leucofuxină și 2 de aldehidă.

Rezultate : Reacția PAS pozitivă se relevă printr-o culoare roșu-magenta. Intensitatea reacției nu este proporțională cu cantitatea de substanță decât atunci când toate grupele reactive sunt libere și oxidate. Dintre homopolizaharide, singura substanță PAS reactivă decelabilă în organismul uman este glicogenul. În consecință, extracțiile cu amilază trebuie obligatoriu efectuate atunci când se urmărește evidențierea histochimică a glicoproteinelor, materialul heteropolizaharid evidențiat în mod specific prin reacția PAS. În ceea ce privește glicolipidele ele pot constitui substanțe reactive importante îndeosebi în anumite condiții.

D. Reacția amilază salivară – PAS.[49]

Reacția PAS este aplicată pe secțiuni după extragerea glicogenului pe cale enzimatică, folosind saliva umană la temperatura de 37°C, timp de 30 minute; materialul PAS pozitiv amilazo-rezistent indică prezența glicopro-teinelor (GP) în celule sau în structurile extracelulare. Încercările făcute după diferiți fixatori și după prelungirea acțiunii enzimatice până la 3 ore, au arătat că fixarea formol-calciu îngreunează extracția enzimatică comparativ cu cea în formol 10%. Saliva umană conține, pe lângă alfa amilază și alte enzime ca ribonucleaza, o enzimă similară hialuronidazei și lizozim. Ea poate acționa mai rapid decât amilaza sintetică. Saliva poate descompune acidul ribonucleic, făcând să dispară bazofilia citoplasmei celulei hepatice (Lillie, 1954).

E. Colorația cu albastru alcian – PAS (AA-PAS) (după Velican C., 1963).[49]

În majoritatea țesuturilor și organelor, glucidele complexe acide și neutre pot fi decelate histochimic pe aceeași secțiune. Se pot evidenția simultan GP și GAG, stabilindu-se pe baza aceleiași tehnici o corelație cantitativă și topografică în țesut. Printre metodele folosite se mai numără și colorația combinată AA-PAS prin care se evidențiază simultan și constant la AA (pH 2,8 și 0,5) GAG cu grupări carboxil respectiv sulfat în albastru, iar GP în roșu-magenta.

Principiu: albastru alcian este un colorant cu caracter bazic care face parte din grupa ftalocianinelor cuprinse; în mediul alcalin ftalocianina precipită sub formă de Monostral Fast Blue; caracterul cationic al reactivului îi conferă capacitatea de a lega grupări polianionice de tipul polizaharidelor; sunt susceptibile de a reacționa cu AA substraturile care posedă în structura chimică aldehide capabile să se transforme în carboxili sau sulfați; alcianofilia grupărilor carboxil și sulfat este suprimată de procedeele de metilare; glucidele slab acide sunt de asemenea pozitive la AA, dar pot fi eliminate prin reducere cu H2SO4 a pH sub 1.

Rezultate: nuanța colorației pozitive este albastru ultramarin; metoda cu AA identifică la pH acid numeroase substanțe dintre care sialo- și sulfomucinele; nuanța colorației poate deveni metacromatică verde dacă se efectuează colorație de fond cu eozină sau se asociază galbenul alcian; substanțe evidențiate: heparina, dermatansulfatul, keratansulfatul, acidul hialu-ronic, condroitinsulfații și mucinele intens sulfatate patologice cu compoziție biochimică incomplet cunoscută; AA-PAS se aplică în ideea diferențierii componentelor glicoproteice de cele mucopolizaharidice sulfatate.

F. Colorația cu albastru policrom-tanin (APT) metoda standard (Drăgan, 1968) (Lungulescu – Drăgan 1970).[49]

Principiu: substanțele cu diferite grupări acide sunt evidențiate prin reacția bazofilă orto- și metacromatică condiționată de pH-ul apei folosite pentru spălarea în timpul tehnicii, cât și de diferențierea în soluție de tanin 1% (acidă și oxidantă).

Rezultate: evidențierea substraturilor bazofile ortocromatice în nuanțe de albastru, cele bazofile metacromatice în violet de tipul nucleoproteinelor, mucopolizaharidelor cu grupări carboxilice, iar în roșu, cele cu grupări puternic acide (sulfatate, fosfatate).

G. Colorația cu albastru de toluidină (AT) la pH 5 și 2,8 (după Velican C.; 1963).[49]

Principiu: colorația se bazează pe proprietatea metacromatică a albastrului de toluidină, identificând în funcție de pH 5 sau 2,8, GAG mai slab sau mai puternic acide. Variații ale reacției metacromatice pot fi date atât de cantitatea de cromotrop care intră în contact cu colorantul cât și de calitatea substraturilor componente, de structura lor biochimică, de numărul și poziția grupelor reactive (tabelul 11).

Rezultate: substraturile nucleare cu ADN (ortocromatice) se evidențiază în nuanțe de albastru la pH-ul AT de 5. GAG cu grupări carboxilice care dispar la extracția cu hialuronidază sunt indicați prin culoarea violet – metacromazie beta a acidului hialuronic, la pH 5. Față de spectrul normal al colorantului, metacromazia se traduce prin deplasarea absorbției maxime în regiuni cu lungimi de undă mai mică. Virarea culorii spre nuanța roșie definește metacromazia gama, semnificând prezența în substrat a grupărilor sulfat ale GAG (keratan – sulfații sau heparina intens sulfatată), la pH-ul AT de 2,8.

Secțiunile au fost deparafinate și hidratate, apoi colorate cu soluțiile enumerate, spălate în apă distilată, deshidratate, clarefiate și montate în balsam de Canada.

2.2.2.2.2. Metodologia IHC de identificare a leziunilor [38][46][33][40][42] [43][65]

Identificarea imunohistochimică (IHC) sau imunocitochimică a substanțelor specifice în țesuturi sau celule a deschis o eră nouă în histopatologie și histotehnologie. Frecvența utilizării IHC și a altor tehnici speciale este însă invers proporțională cu experiența histopatologului. Utilizarea în cazuistica studiată a tehnicii de IHC a fost indicată pentru confirmarea unui diagnostic deja prezumptiv.

În toate cazurile, datele obținute ca urmare a tehnicii imunohistochimice au avut o importanță deosebită terapeutică și prognostică. La ora actuală, cea mai mare parte a problemelor de diagnostic în patologia chirurgicală poate fi însă rezolvată doar prin conjugarea informațiilor tehnicii imunohistochimice cu cea imunocitochimică într-un consens de explorări destul de vaste.

Imunohistochimia are o tehnică precisă, folosind anticorpi selectați pentru a identifica antigene specifice.

Testele sunt foarte specifice, permițând decelarea substanței de cercetat când aceasta se găsește chiar în cantități foarte mici în fragmentul recoltat (sau la nivel celular) de ordinul nanogramelor, sau chiar molecular. Metoda folosită de noi a fost cu peroxidază-antiperoxidază (PAP). În IHC, antigenul este chiar substanța pe care încercăm să o identificăm folosind anticorpi specifici sau proteine serice (imunoglobuline) produse ca răspuns direct la substanța specifică de cercetare.

Nu există un fixator ideal pentru imunohistochimie. Noi am utilizat formol 10% pentru fixarea pieselor biopsice nu mai mult de 24 ore pentru a nu denatura situsurile antigenice (formolul din comerț are cantități variabile de metanol, acid formic și alte impurități care degradează antigenele). În unele cazuri, chiar la fixări de scurtă durată (ore), legarea încrucișată moleculară ajunge doar să mascheze epitopul (blocaj steric). De aceea se face un pretratament cu proteaze la preparatele fixate cu formol care digeră „masca“ de legare încrucișată și redă epitopul ca imunoreactiv. Pentru frotiurile obținute prin CA am efectuat fixare cu alcool de 70° și 96° timp de 20 minute.

Redăm în tabelul 12 sistemele de vizualizare folosite în investigația IHC. La cazurile studiate, rezultate am obținut prin tehnica EPOS și LSAB2. Am folosit cromogenul DAB care a precipitat la locul de reacție antigen-anticorp într-o culoare brună, permițând vizualizarea reacției IHC.

Descrierea procedurii operaționale în imunohistochimie (IHC) la cazuistica proprie în laboratorul Spitalului Clinic Municipal de Urgență Timișoara

Validarea tehnicii IHC s-a realizat pe controale cunoscute a fi pozitive, respectiv negative pentru fiecare anticorp (cu găsirea diluției optime, acolo unde este cazul) în combinație cu sistemul de detecție folosit (tabel 11). Toți pașii tehnicii IHC s-au desfășurat la temperatura camerei 25ºC.

Secțiunile la parafină se aplică pe lame special tratate (încărcate electrostatic sau silanate)

Lamele se pun la deparafinat în toluen -1h la termostat.

Se trec prin băi de alcooli de concentrație descrescândă (100%, 96%, 80%) câte 5 min;

Se aduc lamele la apă distilată, 2 băi câte 5 min;

În funcție de tipul anticorpului și specificațiile tehnice ale producătorului este necesară sau nu (se trece la punctul 8) pretratarea enzimatică (tripsină 5 min, apoi se trece la punctul 8) sau termică a secțiunilor;

Pretratarea termică presupune imersionarea secțiunilor în soluție de recuperare antigenică Target Retrieval (ph=6 sau 9) prealabil încălzită în cuptorul cu microunde la 98-99 ºC se controlează cu termometrul de laborator) 20 min;

Se lasă la răcit 20 min la temperatura camerei;

Se scot și se spală în apă distilată

Se șterg lamele de excesul de apă, se marchează secțiunea cu un creion special;

Se pun într-un mediu umed și se acoperă fiecare secțiune cu o picătură de peroxid – pentru blocarea peroxidazei endogene 5 min;

Se spală în tampon curat TBS 2 băi câte 5 min;

Incubarea lamelor cu anticorpul primar RTU sau diluat între 10 și 30 min, în funcție de instrucțiunile producătorului;

Se scurg de anticorp și se spală în tampon TBS, 2 băi câte 5 min;

Se tratează lamele cu Post Primary Block pentru intensificarea penetrării polimerului;

Se spală în tampon TBS, 2 băi câte 5 min;

Se tratează lamele cu polimer, 30 min;

Se spală în tampon TBS, 2 băi câte 5 min;

Se aplică DAB (cromogenul) peste secțiunile încercuite cu markerul special, lamele se mențin în mediu umed 5 min;

Se spală în apă distilată 5 min;

Se contracolorează cu hematoxilină 5 min;

Se spală în apă distilată 5 min

Secțiunile se deshidratează obișnuit (alcooli de concentrație crescătoare 80%, 96%, 100%) 5 min fiecare

Se clarifică în toluen 5 min

Se montează și se examinează la microscop.

Diagnosticul imunohistochimic al unei tumori nediferențiate (fig. 4) a cuprins mai multe etape în care s-au folosit următorii anticorpi: anticitokeratina, antigenul epitelial membranar, vimentina, antigenul comun leucocitar și anticorpi de secundă intenție (S100, factor VIII von Willebrand).

Tehnicile imunohistochimice își aduc aportul în diagnosticul și tipizarea histologică a tumorilor și în stabilirea originii metastazelor. Studiile imunohistochimice se fac prin tehnica PAP (Peroxidază-Antiperoxidază), ABC (Avidin-Biotin-Complex) sau fosfataza alcalină – anti-fosfataza alcalină, folosind anticorpi primari mono- sau policlonali pentru numeroase antigene.

Anticorpii se leagă covalent de antigenele din structurile studiate. Sensibilitatea și specificitatea metodelor imunohistochimice permit identificarea chiar a unor molecule de substanță din țesuturi (fig. 5 ).

Redăm în tabelul 13 panelul de anticorpi monoclonali utilizați în imunofenotipizarea diferitelor leziuni sarcomatoase.

Identificarea originii diferențierii sarcomatoase este cea mai dificilă; uneori sunt necesare tehnici imunohistochimice cu markeri specifici de țesut sau organ (tab. 14 în anexă). Prezentăm în figura 6 și în anexe în tabelul 15 markerii utilizați și numărul probelor investigate IHC

Contracolorarea și montarea: se face cu hematoxilină (nu atunci când se caută și antigenele nucleare); montarea se face în funcție de sistemele de revelare; PVA – glicerină pentru fluorescență; pentru sistemele enzimatice și revelare cu DAB în Eukitt, balsam de Canada, iar în cazul în care se folosește fosfataza alcalină ca marker, secțiunea se montează în gelatină

Conservarea preparatelor imunocolorate: ferite de lumină, se pot conserva mai mulți ani; în cazul fluorocromilor doar 15 zile până la 3 săptă-mâni, la întuneric, mediu uscat.

Tampoane: Tris-NaCl pentru diluție și spălare (pH 7,6 la soluția mamă, iar soluția fiică cu albumină bovină 30% +H2O2; Tris -HCl (pH 7,6) ca tampon pentru diluarea DAB; PBS soluție mamă și fiică.

Tabelul 13.Anticorpii monoclonali utilizați în diagnosticul IHC al tumorilor

2.3. Rezultate

2.3.1. Determinarea frecvenței și a tiparului de apariție a leziunilor tumorale de țesuturi moi orale și periorale[62][63]

Pe parcursul perioadei celor 3 ani, 1355 de pacienți cu leziuni de țesuturi moi orale și periorale au fost internați în cadrul clinicii, 541 de pacienți in 2008, 393 în 2009 și 421 în 2010. Vârsta pacienților este cuprinsă între 1 și 95 de ani, cu o medie de vârstă de 56.43± 19.46. Un procent de 5.4% (n=73) dintre pacienți aparțin grupului de vârsta 1-20 ani, 13.9%(n=188) de pacienți grupului de vârsta 20-39 ani, 31.8%(n=431) dintre ei între 40-59 de ani, 39.3%(n=532) între 60-79 de ani și 9.6%(n=130) au avut peste 80 de ani. În ceea ce privește distribuția pe sexe, 716 pacienți (52.8%) au fost de sex masculin, iar 639(47.2%) de sex feminin. Vârsta medie a pacienților de sex masculin (55.1±18.8) s-a dovedit a fi mai mică decât cea a pacienților de sex feminin (57.8±20.0). 70.7% din subiecți au avut peste 50 de ani (tabelul 16, fig. 7 – distribuția pacienților pe sexe si grupe de vârsta). Distribuția pacienților pe medii sociale este: 754 de pacienți (55.59%) cu o vârstă medie de 55.50±18.97 provin din mediul urban, iar 601 (44.4%) din mediu rural, cu o vârsta medie de 57.59±20.03.(Tabel 17, fig. 8)

Tabel 16: Distribuția pacienților pe sexe și grupe de vârstă

Tabel 17:Distribuția pacienților pe sexe și mediu social

Din punct de vedere al rezultatului examenului histopatologic al leziunilor tumorale, 597 au fost de natură malignă (44.1%) și 758 de natură benignă (55.9%) (Tabel 18). Cei 1355 de pacienți care au fost incluși în studiu au reprezentat 72.7% din totalul de 1863 de pacienți cu leziuni tumorale ale regiunii oro-maxilo-faciale biopsiați în clinica noastră pe parcursul perioadei de 3 ani.

Analiza statistică a celor 597 de pacienți (vârstă medie 65.53±14.04) cu leziuni tumorale maligne de țesuturi moi orale și periorale a concluzionat că 362 (60.6%) dintre pacienți sunt bărbați iar 235 (39.4%) sunt femei. Vârsta medie a pacienților de sex masculin (62.69±13.28) a fost semnificativ mai mică decât cea a celor 235 de paciente (69.91±14.09). Distribuția pe medii de proveniență a pacienților cu leziuni tumorale maligne a evidențiat faptul că 264 de pacienți (44.2%) proveneau din mediul urban, cu o vârstă medie de 65.39±14 ani și 333 de pacienți (55.8%) din mediul rural, cu o vârstă medie apropiată, de 65.64±14.09 ani.(Tabel 19, 20, Fig. 9)

În ceea ce privește localizarea leziunilor maligne, 229 pacienți (38.4%) au prezentat tumori tegumentare, acestea având cea mai mare incidență, urmate de 84 de cazuri cu localizare la nivelul buzei (14.1%), 74 la nivelul limbii (12.1%), 41 tumori de planșeu oral (6.9%), 37 în mucoasa orală (6.2%) 31 tumori de glande salivare (5.2%) (21 în glanda parotidă), 30 de tumori ganglionare (5%), 29 de țesut conjunctiv (4.9%), 17 la nivelul gingiei (2.8%), 13 la nivelul palatului (2.2%) și 15 cazuri cu alte localizări.(Tabel 21)

Table 21 : Distribuția pacienților cu tumori maligne în funcție de localizare,

vârstă medie, sex și mediul social

În cadrul studiului nostru, tipurile histologice ale leziunilor tumorale maligne au fost următoarele: 334 pacienți cu carcinom scuamocelular (SSC) (56%), 190 pacienți cu carcinom bazocelular (31.9%), 12 pacienți cu melanom malign (2%), 10 pacienți cu limfom (1.7%), 9 pacienți cu carcinom mucoepidermoid (1.5%), 7 pacienți cu adenocarcinom (1.2%), 5 pacienți cu carcinom adenoid chistic (0.8%), 4 pacienți cu carcinom anaplastic (0.7%), 5 pacienți cu adenom pleomorf malignizat (0.8%), 2 pacienți cu carcinom sebaceu (0.3%), 2 pacienți cu carcinom cu celule mici albastre (0.3%), 2 pacienți cu mioepiteliom (0.3%), 2 pacienți cu histiocitom fibros malign (0.3%) și câte un caz de carcinom cu celule Merkel, carcinom acinar, un carcinom metatipic, un sarcom pleomorf, un condrosarcom, un carcinom papilar tiroidian, un pacient cu mielom multiplu și un pacient cu hemangiopericitom.(Tabel 22)

În cazul tumorilor benigne, distribuția pe medii de proveniență a pacienților cu leziuni tumorale benigne a arătat următoarele: 505 pacienți (64.4%) proveneau din mediul urban, cu vârsta medie de 50.51±19.33 ani; 279 de pacienți (35.6%) proveneau din mediul rural, cu vârsta medie de 48.17±21.97. În ceea ce privește localizarea, 186 de subiecți prezentau tumori ale mucoasei orale (27 dintre acestea, leziuni chistice), acestea având incidența cea mai mare, urmate de 117 tumori ale mucoasei gingivale, 113 tumori ale buzelor, 100 de tumori ale tegumentului facial, 89 de tumori de glande salivare (57 în glanda parotidă), 81 de tumori ale țesutului conjunctiv, 44 de tumori ale limbii, 18 tumori lipomatoase, 12 tumori benigne ganglionare si 5 nevi melanocitici la nivelul feței.(Tabel 23)

Dintre cei 758 de pacienți raportați clinic cu leziuni tumorale benigne ale regiunilor orale și periorale, 68 au avut rezultate neconcludente ale examenelor histopatologice sau aceste examene nu s-au efectuat, acești pacienți fiind excluși din statistica noastră efectuată pe diagnosticele histopatologice. Rezultatele examenelor histopatologice ale celor 690 de pacienți cu leziuni tumorale benigne, confirmate histopatologic, ale țesuturilor orale și periorale sunt următoarele: 116 pacienți cu leziuni chistice, 27 de pacienți cu leziuni dermatologice premaligne, 69 pacienți cu leziuni infecțioase și inflamatorii, 150 de pacienți cu leziuni reactive și inflamatorii tumor-like, 210 tumori epiteliale benigne și 118 tumori mezenchimale benigne. (Tabel 24)

Distribuția celor 116 de pacienți cu leziuni tumorale chistice este următoarea: 49 chisturi mucoase ale mucoasei orale (mucocel) dintre care 2 ranule, 44 de pacienți au prezentat chisturi epidermoide, 20 au prezentat chisturi brahiale, un chist trichilemal, un chist dermoid și un chist de canal tireoglos.

În categoria leziunilor dermatologice s-au aflat 27 de pacienți cu vârsta medie de 63.07±14.30 (60.85 ±15.20 pentru femei și 69.43±9.55 pentru bărbați), care au prezentat: 12 keratoze actinice, 9 leucoplazii, 3 cheilite actinice, 2 hiperkeratoze și un lichen plan.

Numărul pacienților cu leziuni infecțioase și inflamatorii a fost de 69, dintre care 62 au fost diagnosticați cu leziuni inflamatorii nespecifice, 6 cu leziuni tuberculoase și unul cu actinomicoză.

Între cei 150 de pacienți cu leziuni reactive și inflamatorii „tumor-like” cu vârsta medie de 54.51±18.40 (53.69±18.87 pentru persoanele de sex feminin și 55.93±17.63 pentru persoanele de sex masculin), granulomul piogen (n=64) s-a dovedit a fi cea mai frecventă leziune, urmat de epulifissuratum (n=40) și granulom periferic cu celule gigante (n=18).

În studiul nostru 61 de pacienți au prezentat hemangioame, cu următoarea distribuție: 29 hemangioame de buză, 17 hemangioame localizate la nivelul tegumentului facial, 7 hemangioame ale limbii, 4 hemangioame ale planșeului bucal, 3 hemangioame ale mucoasei orale și un hemangiom parotidian infantil. Incidența fiecărui tip histologic de tumoră vasculară benignă este următoarea: hemangiom capilar prezent la 15 pacienți, hemangiom cavernos la 20 de pacienți, 6 pacienți au prezentat hemangioame venoase, 12 pacienți cu hemangiom arteriovenos, 5 pacienți au fost diagnosticați cu hemangiom nodal primar, un pacient cu hemangiom parotidian infantil și un pacient cu limfangiom.

Cea mai comună tumoră benignă a glandelor salivare a fost adenomul pleomorf (46 de pacienți), urmată de tumora Warthin (adenomul monomorf) prezentă la 16 pacienți.

Distribuția leziunilor tumorale benigne in funcție de sex, mediu de proveniență, numărul de pacienți și vârsta medie. (Tabel 25 în anexe).

2.3.1.1. Carcinomul scuamocelular[62]

În acest subcapitol am determinat frecvența și tiparului de apariție, în cadrului studiului nostru, a carcinomului scuamocelular (CSC) în leziunile tumorale de țesuturi moi orale și periorale, cu punerea accentului pe localizare și tipul histologic al leziunilor.

Numărul pacienților cu carcinom scuamocelular internați în fiecare an al studiului a fost: 136 de pacienți în 2008, 93 de pacienți în 2009 și 105 pacienți în 2010. În cei 3 ani ai studiului, 87 de pacienți au fost de sex feminin (26%) cu o vârstă medie 69.97±14.71, iar 247 de pacienți de sex masculin cu o vârstă medie de 61.91±11.30 ani, în timp ce media generală de vârstă a fost de 64.08±12.80. Distribuția pacienților cu CSC în funcție de mediul de proveniență: 137 pacienți (41%) din mediul urban (62.66±12.49) și 197 de pacienți (59%) din mediu rural (64.95±12.89) (tabel 26, fig. 10).

Fig. 10. Distribuția pacienților cu CSC pe sex si mediul de proveniență

Distribuția cazurilor în funcție de localizare a CSC a fost: 73 la nivelul limbii, (21.9%) (vârstă medie 59.05±10.83), 65 de pacienți (19.5%) au prezentat CSC labial (vârstă medie 69.26±9.79), 64 de cazuri la tegument (19.2%) (vârstă medie 71.64±11.13), 40 de cazuri în planșeu (12%) (vârstă medie 58.88±10.13), 29 de localizări în mucoasa orală (8.7%) (61.25±11.23) (12 fiind la nivel gingival – 3.7%), 11 cazuri în glandele salivare (3.3%) (72.27±11.59), 19 localizări în ganglioni (5.7%) (56.74±12.77), 11 în țesutul conjunctiv (3.3%) (60.27±9.11) și 7 în palat (2.1 %) (58.71±13.16). S-a aplicat testul t nepereche pentru datele din tabelul 25, rezultând că vârsta medie a femeilor este semnificativ mai mare în cazul CSC de piele (cu nivel de semnificație 0.01) și în CSC de planșeu (cu nivel de semnificație 0.05) (tabel 27)

În studiul nostru, distribuția cazurilor de CSC din punct de vedere al gradingului tumoral a evidențiat: 21.6% (n = 72) dintre pacienți prezentau CSC bine diferențiat (vârstă medie 62.06±15.64), 67.1% (n = 224) dintre pacienți (vârstă medie 63.83±11.69) au avut CSC moderat diferențiat și 10.2% (n = 34) dintre pacienți (vârstă medie 69.32±12.26) au avut CSC slab diferențiat, 2 cazuri de carcinom scuamocelular verucos și 2 pacienți cu CSC anaplazic (Tabel 28, fig. 11).

2.3.1.2. Carcinomul bazocelular[63]

În acest subcapitol am determinat frecvența și tiparului de apariție, în cadrului studiului nostru, a carcinomului bazocelular (CBC) în leziunile tumorale de țesut moale oral și perioral, punându-se accentul pe localizare și varianta histologică de CBC.

Numărul pacienților cu CBC în fiecare an al studiului a fost: 93 de pacienți în 2008, 52 de pacienți în 2009 și 45 de pacienți în 2010, cu vârste cuprinse între 24 și 92 de ani. În perioada celor 3 ani, 113 pacienți au fost femei (59.5%) cu o vârsta medie de 72.34±9.92 ani și 77 au fost bărbați (40.5%) cu o vârsta medie de 67.58±13.13 ani, în timp ce media de vârstă generală a fost 70.41±11.68 de ani. Distribuția pacienților cu CBC a fost următoarea: 89 de pacienți (46.8%) din mediul urban (71.51±10.52) și 101 pacienți (53.2%) din mediul rural (69.45±12.58) (tabel 29, fig. 12).

Fig. 12: Distribuția pacienților cu CBC pe sexe si mediul de proveniență

În ceea ce privește localizarea CBC în studiul nostru, distribuția a fost următoarea: 175 în tegumentul perioral (92.11%) (vârsta medie de 70.58±11.87 ani) având incidența cea mai crescută, 13 în țesutul conjunctiv (6.8%) (vârsta medie de 68.92±9.66), un caz de CBC la nivelul gingiei (0.5%) (61 ani) și unul la nivelul palatului (0.5%) (70 ani). (Tabel 30)

Când s-a aplicat testul t nepereche pentru datele din tabelul 3, a rezultat că vârsta pacienților de sex feminin este semnificativ mai mare pentru cazurile de CBC în general (0.01 nivel de semnificație), pentru cele de BCC tegumentar (nivel de semnificație 0.01) și pentru cele de CBC al țesutului conjunctiv (0.05 nivel de semnificație).

Distribuția cazurilor de CBC tegumentar a fost: 58 în tegumentul nasului (33.1%) (71.34±9.92 ani), 39 în tegumentul obrazului (22.3%) (70.25±11.72 ani), 24 la nivelul pleoapelor (13.7%) (64.54±16.41 ani), 20 la nivelul buzelor (11.4%) (77.15±10.81 ani), 11 în tegumentul regiunii frontale (6.3%) (73.91 ±8.03 ani), 8 în tegumentul regiunii temporale (4.6%) (72.75±7.67 ani), 8 în tegumentul ce acoperă urechile (4.6%) (65.13±15.35 ani), 4 în tegumentul bărbiei (2.3%) (65±8.76 ani) și 3 în tegumentul regiunii zigomatice (1.7%) (68±3.61 ani). (Tabel 31)

În studiul nostru s-au găsit următoarele subtipuri histologice de CBC: carcinom bazocelular subtipul nodulochistic la 100 de pacienți (52.6%) (70.03±10.16), carcinom bazocelular subtipul difuz (infiltrativ) la 49 de pacienți (25.8%) (73.39±12.13 ani), carcinom bazocelular superficial la 30 de pacienți (15.8%) (67.77±15.8 ani) și 11 cazuri de carcinom bazocelular pigmentat (5.8%) (67.82±11.23 ani).(tabel 32, fig. 13)

2.3.2.Citodiagnosticul prin puncție aspirativă cu ac fin (PAF) și citoamprentaj (CA) în leziunile țesuturilor moi orale și periorale[66]

Ca studiu independent, am corelat diferitele tipuri celulare întâlnite în cazuistica de PAF cu leziunile histopatologice, unele investigate suplimentar prin IHC și integrate în contextul clinico-imagistic evolutiv și pronostic al pacienților. Redăm aceste rezultate in anexă, fig. 15-20

2.3.3 Markerii tumorali endocelulari. Markerii nucleari de proliferare celulară și antioncogena p53 – markeri asociați ciclului celular.

Necesitatea unui diagnostic precoce și stabilirea riscului degenerativ al leziunilor cu potențial de malignizare sunt susținute în studiul nostru prin corelațiile cito-histopatologice și clinico-paraclinice, preoperator și intraoperator pentru marginile lezionale ale carcinoamelor și a altor tumori de țesuturi moi. Chiar dacă detectarea markerilor tumorali nu poate constitui o metodă diagnostică primară, rolul lor este de a susține diagnosticul clinic.[67]

Validitatea unor analize cu caracter predictiv se bazează pe studii combinate de genetică, biochimie și cinetică celulară, descriindu-se diverși markeri tisulari cu valoare prognostică fiabilă pentru diferitele leziuni premaligne și maligne.[68][69] Dintre markerii endocelulari luați în studiu, am selectat markerii nucleari ce exprimă capacitatea de proliferare celulară.

Markerii de proliferare celulară. Hiperproliferarea celulară este un eveniment care apare timpuriu în cadrul displaziilor. Studiul markerilor de proliferare a furnizat rezultate încurajatoare privind evoluția leziunilor premaligne și maligne de cap și gât (Shin, Huber, Silverman cit. de Țovaru și colab)[47].Dintre markerii de proliferare celulară studiați mai sunt: PCNA, Mib-1(Ki-67) și Ciclina D. Ei au fost utilizați ca posibili indicatori ai anomaliilor genetice ce însoțesc premalignitatea și oncogeneza, detectează diferite proteine cu rol fundamental în diferite faze ale mitozei și au importanță crescută în aprecierea comportamentului biologic și al prognosticului unei tumori maligne.

Există un număr ridicat de studii care au confirmat supraexpresia markerului Ki-67 în oncogeneza.[70][71][72][73] După Derka et al.[74] citat de Sticht et al.[75], expresia markerul antiapoptotic Bcl-2 scade semnificativ în leziunile displazice[76] și în fazele inițiale ale invaziei tumorale, sugerând rolul acestei oncoproteine[77][78][79], în timp ce expresia Ki-67 crește semnificativ în fazele inițiale ale carcinogenezei orale, dar scade în fazele avansate. [80][81][82]

Antigenul Ki-67 este o proteină nucleară non-histonică legată de ADN, un dublet proteic cu greutate moleculară de 345 respectiv 395 kD, care este parte integrantă a învelișului cromozomial. Este exprimată în fazele G1, S, G2 și M ale ciclului celular, dar este absentă în faza G0. Numărul celulelor Ki-67 pozitive este direct proporțional cu rata celulelor în diviziune activă (fig. 20,21 în anexe fig. 22-34). Indicele Ki-67 reprezintă proporția procentuală a celulelor care exprimă acest marker. În cazul tumorilor maligne, un indice Ki-67 mare înseamnă o activitate proliferativă crescută și un prognostic mai rezervat[83]. În țesuturile normale și majoritatea tumorilor există o corelație între activitatea mitotică și indicele Ki 67.[84]

2.3.3.1. p53

Este o antioncogenă aflată pe Cr 17p cu rol de ”gardian” al ciclului celular, care ”arestează” celula cu mutații ADN în faza G1. Face parte din genele supresoare ale malignității, având rol fundamental în stabilitatea genomului și în reglarea ciclului celular. P53 poate bloca proliferarea celulară și poate induce apoptoză în celulele alterate genetic. De asemenea, poate inhiba angiogeneza, proces absolut indispensabil proliferării celulare. Activitatea genei p53 este abolită în majoritatea tumorilor maligne umane și a leziunilor premaligne ale mucoasei orale. Prezența p53 în straturile suprabazale ale leziunilor premaligne este un marker cu caracter predictiv, fiabil, pentru o dezvoltare ulterioară a malignității(fig. 34). În afară de p53 și alte gene supresoare, cum ar fi Rb și p16NK4A pot fi inhibate în leziunile premaligne (Zoltan et al, 2004[83]; Cruz et al, 2002, cit de Țovaru, 2008[47]). Proteina supresoare tumorală anti-p53 recunoaște o fosfoproteină de 53 kD, identificată ca un produs al genei supresoare p53 în diferite leziuni tumorale orale și laterocervicale (fig. 36, în anexe 37-38). Aceasta reacționează cu forma mutantă a p53. Imunomarcarea pozitivă nucleară cu acest anticorp este un marker de prognostic rezervat pentru multe carcinoame (sân, plămân, colo-rectal, urotelial) printre care și cele din sfera orală și periorală, așa cum o precizează și studiul nostru (anexe fig. 39-42) .

2.3.3.2. Cyclina D1

Cyclinele și kinazele cyclin-dependente (CDK) sunt proteine importante reglatoare ale ciclului celular, utilizate în primul rând pentru aprecierea activității proliferative a celulelor tumorale. Cyclinele guvernează trecerea prin fazele distincte ale ciclului celular prin reglarea activității CDK-urilor.

Cyclina A poate fi evidențiată în faza S a ciclului celular.

Cyclinele B (B1 și B2) apar în celulele cu capacitate proliferativă crescută și reprezintă un subset al celulelor Ki-67 pozitive.[14]

Cyclina E reduce faza G1 și accelerează progresia ciclului celular în faza S.

Cyclinele D (D1, D2, D3) reglează activitatea kinazelor cyclin-depen-dente în faza G1 a ciclului celular. Supraexpresia lor în unele tumori maligne prognozează o evoluție mai rapidă. Cyclina D1 joacă un rol cheie în reglarea ciclului celular, fiind o proto-oncogenă supraexprimată într-o mare varietate de neoplasme la om.[14] În faza G1 mijlocie-spre târzie a ciclului celular, cyclina D1 are o expresivitate maximă ca urmare a stimulării factorului de creștere. Anti-cyclin D1 a fost folosită cu succes în studiul biologiei ciclului celular și în anomaliile asociate cancerelor. Permite în special diferențierea limfoamelor cu celulele mantalei (cyclin D1 pozitive) de alte limfoame incluzând limfomul folicular (cyclin D1 negative). Leucemia cu celule păroase și mielomul plasmocitic exprimă intens cyclina D1.

Având în vedere comportamentul expansiv, pseudomalign și pseudolimfomatos al tumorii Warthin, am identificat intensa imunomarcare a celulelor epiteliale din contingentul tumoral cu anti-Cyclina D1(Fig. 43-44, în anexe fig. 45-48).

Se poate afirma că expresia a 3-4 tipuri de biomarkeri este asociată cu un risc crescut de malignizare (excepție făcând tumora Warthin): creșterea prezenței p53 în stratul parabazal, însoțită și de LOH la nivelul cromozomilor 3p ori 9p, după unele studii (Lee et al, 2000, cit. de Țovaru)[47]. Combinarea sumată a trei markeri are după unele studii o valoare prognostică incomparabil mai mare în evaluarea riscului de malignizare decât luați individual. Astfel, pentru aprecierea gradului de risc de transformare a leziunilor cu potențial de malignizare, cel mai complex mod de investigare este coroborarea examenului histologic cu biomarkerii descriși mai sus. [47]

2.3.4 Decelarea virusului Epstein-Barr cu metoda IHC

Am analizat prezența inecției cu virus Epistei-Barr prin metoda IHC în 9 cazuri: 2 leziuni precursoare (lichen oral), 3 carcinome orale și în 4 cazuri de limfonoduli metastazați. Un caz de leziune precurosare imunomarcată pozitiv pentru EBV sa tansformat în carcinom analplazic EBV+, limfonodul pozitiv cu leziune mononucleoză.

Anticorpii anti-Epstein-Barr virus(Ebv) depistează proteina membranară latentă de 60 kDa (LMP-1) codată de gena BNLF-1 a virusului Epstein-Barr (EBV). Are loc o reacție încrucișată cu celulele Reed-Sternberg ale maladiei Hodgkin.

Virusul Epstein-Barr este o cauză importantă a mononucleozei infecțioase și a fost asociat cu cancerul oral.[85] Expresia genelor de latență (CD21) și de replicare este analizată prin tehnici imunohistochimice, permițând vizualizarea și cuantificarea celulelor care exprimă antigene. În studiul nostru 2 cazuri au fost pozitive pentru EBV (receptorul virusului Epstein Barr CD21). Evoluția clinică a acestor carcinoame nu a fost influențată însă de pozitivitatea la infecția virală, contrar evoluției nefavorabile constatate la limfoamele non-hodgkin pozitive la virusul EB așa cum este semnalat în literatură.

Virusul EB posedă proprietăți antigenice, de transformare oncogenică, interferând cu creșterea și maturarea limfocitelor B în contextul pierderii supravegherii imune eficiente.

În studiul nostru, rare celule pozitive la virusul EB intraepitelial au fost observate în leziunile precursoare malignității cu aspect lichenoid (n=2 cazuri), cu bogat infiltrat limfo-plasmocitar în lamina propria a mucoasei orale, având posibilă implicare în conturarea aspectelor polimorfe ale hiperplaziilor limfoide din sfera ORL și maxilofacială (fig. 49-50).

Decelarea unui virus monoclonal în carcinoamele orale sugerează participarea sa activă la dezvoltarea tumorii[85] (în anexe fig. 51-54). Noi am identificat formele latente ale infecției virale în limfocitele intraepiteliale și peritumorale, susținând ideea că la dezvoltarea acestora participă și alți agenți oncogeni.

2.3.5. Bazele moleculare în interpretarea expresiei podoplaninei (D2-40) în unele carcinoame orale și în leziunile precursoare malignității, în leziuni glandulare salivare tumorale și pseudo-tumorale

Podoplanina este o glicoproteină transmembranară tip sialomucin-like (38kD), identificată prima dată în podocitele glomerulare. A fost utilizată ca unul din cei mai fideli markeri pentru endoteliul limfatic.[86] Este recunoscută de anticorpul monoclonal D2-40. Noi semnalăm prezența expresiei pozitive la celulele carcinoamelor scuamoase orale cu dispoziție bazală în epiteliile neoplazice, la diferite scoruri de pozitivare și în leziunile precursoare malignității de grad redus și crescut, în dependență de proliferarea miofibroblastică stromală și de tipul de stromă tumorală. Prezența podoplaninei în celulele mioepiteliale este explicată prin localizarea acestor celule între celulele epiteliale salivare și membrana bazală sau la interfața cu mediul extracelular.[87]

Studii bio-moleculare recente au identificat podoplanin ca un marker de celule stem în carcinoamele cu celule scuamoase.[86] Studiul nostru evaluează expresia distribuției podoplaninei în țesuturile orale și periorale maligne și în leziunile precanceroase orale, în corelație cu alți markeri epitelio-mezenchimali și de ciclu celular, expresia podoplaninei fiind observată la toate carcinoamele scuamocelulare cu aspect bazaloid (100%), în 78% din tumorile investigate la nivel oral, în corelație invers proporțională cu gradul de keratrinizare si direct proporțional cu gradul de exfoliere, asociind ulcerația și inflamația tumorii (fig. 55-56, în anexe fig. 57-68).

Markerii corelativi moleculari în studiul nostru au fost CyclinD1, Ki67, p53. La 98% din tumorile podoplanin pozitive studiate, am evidențiat expresia intens pozitivă a celulelor (scor 3) la periferia cuiburilor tumorale, comparativ cu procentul de 95% întâlnit în literatura de specialitate, atrăgând atenția asupra caracterului invaziv-infiltrativ al tumorilor cu expresie pozitivă a acestui marker. Astfel, expresia Ki 67 este de 90,3% până la 100% la frontul tumoral infiltrativ, iar p53 pozitiv la 25,2-40,8% din celulele tumorale.

În studiul glandelor salivare, expresia podoplaninei a prezentat o localizare celulară mioepitelială la toate cazurile de adenoame pleomorfe investigate imunohistochimic cu acest marker (n=5) și la mioepitelioame (n=2), fiind considerat astfel, ca un marker important în tumorile glandelor salivare, prezentând localizare bazală, dar și difuză în diferențierea celulară mioepitelială.

Histopatologic, se disting 2 tipuri de aranjamente celulare tumorale în adenomul pleomorf: a) structuri glandulare compuse din celule epitelial-like ductal intern și celule periferice mioepitelial-like și b) celule stelate/fusiforme difuze într-o stromă mixocondroidă.

Prezența podoplaninei în celulele mioepiteliale este explicată prin localizarea acestor celule între celulele epiteliale salivare și membrana bazală sau la interfața cu mediul extracelular așa cum am găsit în tumora Warthin (în anexe fig. 69-75).

În ceea ce privește expresia podoplaninei în leziuni precursoare carcinomatoase, cum ar fi displazia lichenoidă și leukoplazia orală, am găsit o corelație strânsă între imunomarcarea vaselor limfatice din suportul conjunctiv (lamina propria) cu creșterea densității rețelei vasculare în leziunile înalt displazice și în carcinomul in situ.

Leucoplazia orală este o leziune orală heterogenă cu o incidență crescută de malignizare, leziune de risc major pentru cancerul oral. Parametrii clinici convenționali nu pot fi predictivi asupra transformării maligne la pacienții cu displazii epiteliale sau leuccoplazii orale. Podoplanina este un marker endotelial limfatic, cu expresie crescută in cancerul oral, dar și în leziuni premaligne.[88][89] Ar putea fi implicată și ca factor predictiv în dezvoltarea cancerului oral la pacienții cu leziuni leucoplazice și lichenoide.[90][91][92]

În studiul nostru, pe leziuni epiteliale displazice severe, de tip lichenoid și leucoplzii orale asociate carcinoamelor, am găsit o pozitivare a expresiei podoplaninei în straturile bazal și parabazal la 42,7 % din cazuri, clasificându-le ca podoplanin pozitive. Rezultatele pozitive imunohistochimic au fost corelate direct proporțional cu vârsta pacienților), mai frecvente la sexul feminin și în leziunile displazice. În cadrul leziunilor displazice podoplanin-pozitive, incidența asocierii lor cu carcinoamele scuamoase ulcerate și inflamate este mai ridicată comparativ cu leziunile displazice podoplanin negative. În analiza multivariabilă folosind tehnica histologică, citologică și podoplanina drept cofactori, podoplanina a fost doar un factor independent pentru evaluarea dezvoltării cancerului oral. Riscul de cancer oral poate fi evaluat prin utilizarea conjugată a datelor histologice și a informațiilor exprimate de podoplanină.

În studiul glandelor salivare, expresia podoplaninei a prezentat o localizare celulară mioepitelială la toate cazurile de adenoame pleomorfe investigate imunohistochimic cu acest marker (n=16) și la mioepitelioame (n=2), fiind considerat astfel, ca un marker important în tumorile glandelor salivare, prezentând localizare bazală, dar și difuză în diferențierea celulară mioepitelială.

2.3.6. Particularități biomoleculare ale celulelor epiteliale din leziunile orale și periorale.

Forma celulară și integritatea tisulară depind de citoschelet care la mamifere este format din filamente de actină, microtubuli și filamente intermediare (Seltmann)[93]. Aceste componente conferă rezistență la forțe mecanice, coordonează motilitatea celulară, mediază mișcările intracelulare și sunt implicate în semnalizarea celulară[94][95][96][97][98][99][100][101][102]. Rezistența mecanică este de mare importanță pentru integritatea întregului țesut, iar pentru traversarea celulelor dintr-o zonă tisulară în alta mai densă, celula trebuie să fie deosebit de deformabilă[103][104][105][106][107].

Participarea citokeratinelor (CK) la proprietățile mecanice ale celulelor epiteliale este majoră. Pe frotiurile studiate am apreciat reperele morfologice ale celulelor epiteliale și le-am corelat cu dinamica țesutului din care au fost exfoliate, aspirate și amprentate. Am găsit o strânsă corelație între plicaturările celulare, aranjamentul discoeziv/coeziv, citoliză, maturare nucleo-cito-plasmatică, dominanța celulelor scuamoase pe frotiu și expresia diferitelor citokeratine exprimate imunohistochimic pe secțiuni la parafină în biopsiile recoltate pre- și post citodiagnostic. Diferitele fenotipuri celulare epiteliale sunt concordante cu biologia locală și maturarea epiteliului normal, iar la cel lezional, cu gradul de displazie, asocierea cu alți markeri citoskeletali în celulele modificate fenotipic și diferențierea celulelor tumorale[108][95][109] [110][111]. Având în vedere variabilitatea celulară a frotiurilor, am analizat minimum 300 celule epiteliale pentru fiecare frotiu. Markerii epiteliali cei mai importanți și mai des folosiți sunt anticorpii anti-citokeratine. Ele formează filamentele intermediare ale celulelor epiteliale și sunt reprezentate de 20 de tipuri de polipeptide[112][71][113][114][115].

După natura și greutatea lor moleculară CK sunt de 2 tipuri: CK acide tip I cu GM 36-64 kD, numerotate de la 9 la 20 și CK bazice tip II cu GM 52-67 numerotate de la 1 la 8. CK se exprimă de obicei în pereche: 1 și 10 (epiteliul stratificat keratinizat); 4 și 13 (epiteliul stratificat nekeratinizat); 6 și 16 (celule cu turnover rapid); 5 și 14 (celule bazale); 7 și 19 și 8 /18 sau 20 epiteliile simple. CK cu greutate moleculară mică 7 și 8 bazice și 17,18,19,20 acide sunt exprimate în majoritatea tumorilor epiteliale. În țesuturile epiteliale normale expresia lor este diferită. În studiul nostru pe biopsiile mucoasei orale cu topografie diferită expresia CK este diferită în funcție de straturile și de caracterul keratinizat sau nekeratinizat al epiteliului (fig. 76-77, în anexe fig. 78-102).

2.3.7. Leziuni cu celule glandulare

Citodiagnosticul leziunilor glandelor salivare se realizează prin puncție aspirativă cu ac fin sau amprentarea fragmentelor de biopsie excizională, mai frecvent în tumorile glandelor parotide și submaxilare în studiul nostru. Complexitatea tisulară a lojelor laterale și latero-cervicale face citodiagnosticul de leziune foarte dificil (Seifer)[116].

Gândirea diagnostică trebuie să ia în calcul componenta celulară, dar și materialul de fond sau diateza cu celule inflamatorii și să analizeze calitativ-cantitativ aceste componente.

În cazuistica noastră, cele mai dificile puncții citologice cu posibilitate de interpretare eronată le-au constituit diatezele inflamatorii cu material necrotic și citolizat. (21% din cazuri). Analizarea materialului celular provenit prin PAF sau citoamprentaj s-a efectuat în toate cazurile prin corelații clinico-imagistice și inventarierea datelor de laborator, stabilindu-se diferite grade de dificultate interpretativă a frotiurilor (tabel 33).

Examinarea și interpretarea frotiurilor din leziunile țesuturilor orale și periorale (tab 34 și 35):

Pentru cazurile cu suspiciune clinică de malignitate investigate prin citodiagnostic s-au urmărit indicatorii sensibilității și specificității metodei citologice [117]. Evaluarea am efectuat-o pe o serie selectată de 75 de cazuri din perioada 2011-2014, cu grad de dificultate mediu și înalt de citodiagnostic.

Categoria citologiei pozitive include:

Rezultate adevărat pozitive (AP)

Rezultate fals negative (FN)

Categoria citologiei negative include:

Rezultate adevărat negative (AN)

Rezultate fals pozitive (FP)

Sensibilitatea = AP/Total pozitive

Specificitatea = AN/Total negative

Valoarea predictivă pozitivă= Total pozitive (TP)/TP+FP

Valoarea predictivă negativă= Total negative (TN)/TN+ FP

Exactitatea citodiagnosticului se măsoară prin rata cazurilor fals-pozitive și fals–negative.

2.3.7.1. Leziuni cu dificultate redusă (ușor de evaluat):

Leziunile inflamatorii – sialadenitele acute sau cronice (fig. 103, fig. 104-108 în anexe) prezintă pe frotiu celule acinare sau ductale mici, în grupuri sau cordoane, limfocite, fibroblaste, macrofage și granulocite în microfocare supurative. În sialadenitele cronice, obstructive, se remarcă pe lamă mucină, celule scuamoase metaplaziate și celule cilindrice. Majoritatea tumefacțiilor glandelor salivare sunt de natură non-neoplazică, atât inflamații acute cât și cronice. În unele cazuri cu remanieri și reparare tisulară exagerată, se pot întâlni celule ductale atipice, metaplazice.

Leziunile glandelor salivare cu conținut limfoid bogat sunt: limfadenitele intraparotidiene, leziuni benigne limfoepiteliale, tumora Warthin, iar dintre neoplaziile maligne, limfomul malign, carcinomul mucoepidermoid și cel nediferențiat. Imunofenotipizarea celulară în corelație cu date clinice și imagistice pot orienta diagnosticul.

Redăm în fig. 109 și în anexe fig. 110 corespondentul histopatologic al leziunilor examinate:

2.3.7.2. Leziuni cu dificultate medie: Chistadenomul papilar limfomatos – tumora Warthin (fig. 111-112, în anexe fig. 113-122)prezintă pe frotiu numeroase oncocite cu aspect poliedric, talie medie, citoplasme granulare, prin numărul mare de mitocondrii, nuclei rotunzi nucleolați, cromatină granulară. Citoplasmele se colorează în portocaliu deschis (PAP) sau albastru închis (Diff Quick). Oncocitele formează plaje sau mai rar aranjamente papilare sau papiliforme. Celule singulare sunt puține. Apar însă și în carcinomul mucoepidermoid și adenomul pleomorf în care alcătuiesc populația celulară dominantă, lipsind limfocitele și precipitatele proteinacee. În tumora Warthin se remarcă o asociere limfocitară importantă pe frotiu, impunând și diagnostic diferențial cu leziunile inflamatorii ale glandelor salivare, sindromul Sjögren sau chiar o leziune limfonodală, intrând în discuție un anumit tip de limfom. Limfocitele din tumora Warthin sunt în stadii diferite de maturare, inclusive celule de centru folicular și macrofage cu tingible bodies (corpi fagocitați). Se evidențiază numeroase mastocite, recunoscute după granule citoplasmatice metacromatice. Prin puncționarea tumorii Warthin se obține o cantitate variabilă de lichid, ceea ce reprezintă una din cheile de diagnostic. Lichidul este de culoare maro/verzuie și are un aspect granular sau mucoid. În tabloul citologic, fondul frotiului este granular, amorf, mucoid și metacromatic, uneori apar cristale de colesterol, macrofage, celule gigante și corpi amilacei. Oncocitele degenerate cu aspect atipic sau celule metaplazice de tip scuamos, atipice, pot sugera un carcinom scuamocelular.

După Registrul de Glande Salivare din Hamburg (2000) aproximativ 65% din tumorile glandelor salivare sunt benigne.[118] Tumora Warthin de glandă parotidă reprezintă aproximativ 15% din totalitatea tumorilor epiteliale ale acestei glande[118].

Așa cum este descrisă și în literatură, cu asocieri tisulare epitelio-limfoide și constituirea de arii chistice, patogenia leziunii rămâne controversată. Nici chiar nomenclatura nu este standardizată. Se utilizează peste 20 de termeni care o definesc sau o descriu. Inițial a fost descrisă de Hildebrand în 1895 care a considerat-o un tip special de chist latero-cervical.

În 1910 Albrecht și Arzt au raportat 2 tumori din regiunea superioară a capului și gâtului pe care le-au interpretat ca fiind ”confused tissue”, disontogenetică cu interesarea glandelor salivare și a limfonodulilor. Au denumit tumorile chistadenoame papilare în limfonoduli. În clasificarea WHO, leziunea se definește ca tumoră Warthin după numele patologului care a raportat în 1929 două cazuri în literatura americană (Warthin A.S.,1929, cit. de Teymoortash)[118]. Warthin a descris tumora cu denumirea de chistadenom papilar limfomatos și a considerat-o ca o heterotopie de mucoasă a trompei lui Eustachio. Pentru a nu fi confundată cu limfomul malign, s-a trecut la denumirea de tumoră Warthin.

Tumorile Warthin sunt leziuni bine delimitate, încapsulate cu arii chistice și solide. Apar la polul caudal al glandei parotide. Sunt alcătuite dintr-o componentă celulară epitelială oncocitară cu aranjament bistratificat, care realizează chisturi și proiecții papilare, stromă cantitativ variabilă cu țesut limfoid. Doar 8% din tumorile Warthin prezintă arii de metaplazie scuamoasă și modificări regresive.

Din punct de vedere clinic, tumorile Warthin au prezentat o creștere asimptomatică, de lungă durată, cu afectarea dominant a sexului masculin, raport de 5/3 față de sexul feminin în cazuistica noastră. Media de vârstă a fost de 56.25±06.37 de ani, încadrându-se în decadele 5-6 de viață după raportările din literatură (vezi tabelul 23 în anexe). Au fost semnalate foarte rar la populația africană. În 4-10% din cazuri au o dezvoltare bilateral, de obicei metacron. În 4% din cazuri se pot observa tumori Warthin multiple în aceeași glandă parotidă. Se pot dezvolta simultan cu adenomul pleomorf variate tipuri de carcinoame și limfomul malign[118].

Aceste observații sunt importante deoarece ultimele entități nu sunt comune glandelor salivare, astfel că ne putem forma o părere generală asupra patogeniei acestei tumori. După cele mai numeroase păreri, tumora Warthin se dezvoltă din proliferarea celulelor ductale ale glandelor salivare care au fost incluse în limfonodulii limfoizi în cursul vieții embrionare. Dacă acest fapt este corect, se pare că lipsa recurențelor, ca și absența transformării maligne susține acest punct de vedere, tumora Warthin este corect clasificată în grupul de leziuni tumoral-like, nefiind un adenom monomorf (fig. 123-124, în anexe fig. 125-129).

Tumora Warthin este clasificată histologic astfel:

Tipică, în care proporția stromă/component epitelială este aproximativ egală

Stromă săracă (>70% componentă epitelială)

Stromă abundentă ( componenta epitelială < 30%)

Varianta metaplazică sau infarctată fără valoare prognostică

Studiul nostru imunohistochimic în cazul tumorii Warthin aduce date noi privind imunoreactivitatea acesteia cu markerii epiteliali, limfoizi și moleculele de adeziune exprimate de tumoră (fig. 130-131, în anexe fig. 132-136)

În studiul nostru, am remarcat că ariile stromale limfoide se asociază frecvent cu focare de metaplazie scuamoasă a epiteliului oncocitar, fără a influența aspectul evolutiv sau prognostic al pacienților investigați. În fig. 137-138 și în anexe fig. 139-144 redăm diferite aspecte ale intricării stromei cu componenta epitelială în tumora Warthin.

În literatura de specialitate[119], este consemnat că celulele luminale exprimă CK7, CK8 CK18 asemenea epiteliilor ductale și glandulare. Expresia CK 6 în celulele luminale din ariile metaplazice susține comportamentul tumoral al leziunii. În celulele bazale au fost descrise expresiile CK 5/14, CK 17 și AE1/AE3 atât pentru celulele luminale cât și pentru cele bazale.[120]

Redăm în fig. 145 expresia pancitokeratinei în epiteliul tumorii Warthin.

Studii imunohistochimice ale diferiților autori consemneză că CK 10/13 și Ck 1/2/11/12 și 20 sunt negative la nivelul epiteliului tumoral. Alți markeri studiați au fost vimentina, proteina S100 și amilaza care au fost negative pentru celule bazale și luminale.[121]

În ceea ce privește expresia markerilor limfoizi, studiul nostru se suprapune altor investigații imunohistochimice ale stromei tumorii Warthin care arată că aceasta este asemănătoare unui limfonodul reactiv (fig. 146-148, în anexe fig. 149-155).

Adenomul pleomorf benign se recunoaște citologic printr-un fond metacromatic stromal conținând celule cu aspect alungit, fusiform și celule cu nuclei mici, într-un material fibrilar, adesea mixoid (fig. 156-159, în anexă fig. 160-161). Apar placarde de celule epiteliale cu izonucleoză, izocromie, nucleu rotund sau ovoid, polarizat, în limite de benignitate. Totuși, posibilul pleomorfism celular în tumorile mixte este bine cunoscut. Pot să apară și celule atipice izolate. Elementele stromale de tip celular în tumora malignizată dispar așa încât tranșarea diagnosticului de malignitate poate fi precizat pe frotiu în cele mai multe cazuri. Diagnosticul diferențial este uneori dificil și se face cu carcinomul adenoid-chistic.[122]

Adenoamele sunt citologic reprezentate prin mase de celule glandulare cu nucleu rotund, excentric, egale ca talie, mici.

Redăm în fig. 162-165, în anexă fig. 166-176 corespondentul histologic al citodiagnosticului de adenom pleomorf benign sau metastazant.

2.3.7.3. Leziuni cu dificultate ridicată:

Carcinomul cu celule acinare prezintă pe frotiu celule granulare, cu citoplasme uneori clare sau vacuolizate. Pot fi găsite incluziuni intranucleare.

Carcinomul adenoid-chistic cu aspect citologic ”liniștit”, celule mici de tip bazaloid, în grupuri coezive sau dispuse pseudo-glanduliform, delimitând microchisturi cu prezența de globule extracelulare de aspect hialin. Globulele creează confuzii cu adenomul pleomorf.

Carcinomul scuamos primar, cel mai frecvent metastază limfonodală sau parotidiană de carcinom scuamocelular, prezintă celule scuamoide, lipsindu-i mucina (fig. 177)

Carcinomul mucoepidermoid prezintă celule glandular mucoase, celule intermediare de tip ductal și celule scuamoase asemănătoare celulelor metaplazice de tip bazaloid. Pentru tumora cu grad scăzut de malignitate se consemnează prezența mucusului (fig. 178-180, în anexe fig. 181-189).

Carcinomul epidermoid pleomorf, prezintă celule mai mici, cu citoplasmă minim reprezentată, cu nuclei nucleolați, celule aranjate în rozetă-like, cuiburi sau izolate pe un fond dominat de material globulos, mucoid sau material acelular omogen abundent.

Tumori epi- mioepiteliale prezintă celularitate duală: celule epiteliale ductale în agregate și celule mioepiteliale cu citoplasmă clară, frecvenți nuclei liberi alungiți, alături de material hialin globulos asemănător carcinomului adenoid-chistic.

Deoarece patologia glandelor salivare este complexă, tratamentul se bazează pe patodiagnosticul corect. Tumorile maligne sunt rare, iar diagnos-ticul preoperator este extrem de important, bazat la majoritatea cazurilor pe informațiile citodiagnosticului, așa cum o arată studiul nostru. PAF este o modalitate utilă de apreciere lezională preoperator la nivelul de evaluare a tumorilor orale și periorale, ca una din tehnicile adiționale cele mai eficiente. Dacă experiența proprie se împletește cu perfecționarea cunoștințelor și colaborarea multidisciplinară, eficiența diagnosticului pre-, intra- și post-operator este deosebit de ridicată.

Toate tipurile de tumori maligne de glandă salivară pot recidiva după aproximativ 5 ani, în peste 25% din cazurile investigate de noi, incluzând și tumora mixtă malignă.

Cele mai mari dificultăți de citodiagnostic le ridică celulele epiteliale mici sau clare, prezența materialului hialin stromal, impunând diagnosticul de adenom/carcinom mioepitelial, tumora cu celule bazale, metastaza cu celule clare și carcinomul adenoid-chistic, conducând la recomandarea insistentă de biopsiere a tumorii.

Cele mai frecvente diagnostice diferențiale prin citoevaluare le-am realizat între următoarele leziuni: adenomul pleomorf, oncocitom/tumora Warthin, carcinoamele mucoepidermoide cu grade diferite de malignitate, tumorile mioepiteliale și metastazele carcinomatoase din regiunea latero-cervicală.

În studiul nostru, tumorile maligne cu celule mioepiteliale reprezintă mai puțin de 2% din tumorile maligne ale glandelor salivare, asemănător altor studii întâlnite în literatură [116][87][123]. Rata mitotică înaltă descrisă prin evaluarea indicelui Ki 67 în studiul nostru este asociată cu invazia tumorală în prezența unui contingent celular de tip fusiform, epitelioid, plasmocitoid și cu celule clare (fig. 181-182, în anexe fig. 192, 185-194).

Diagnosticul leziunilor lojei parotidiene încadrabile la leziuni cu grad ridicat de dificultate diagnostică.

Puncția aspirativă cu ac fin (PAF) a maselor tumorale sau pseudotumorale din loja parotidiană se practică în scop diagnostic de mai bine de 40 ani. Ca diagnostic procedural, PAF este superioară diagnosticului combinat clinico-radiologic care nu poate preciza natura benignă sau malignă a leziunilor. În plus, PAF este relativ facilă, rapidă și economică. Totuși, această tehnică este privită cu rezervă în evaluarea cancerelor prin rata de rezultate fals pozitive sau fals negative care implică reconsiderări ale diagnosticului oncologic. Majoritatea pacienților cu diagnostic de leziune malignă a lojei parotidiene ridică problema de suspiciune a unei metastaze (peste 50% din cazurile investigate citologic). În acest caz, se impune o evaluare orientativă diagnostică înainte de abordarea chirurgicală a leziunii (fig. 204-209, în anexe fig. 210-224), cea mai frecventă tumoră malignă parotidiană fiind carcinomul epidermoid.[124]

Acestea au fost clasificate într-unul din cele 3 grade histologice, pe baza următoarelor criterii:

-numărul de chiste formate,

-gradul de atipie celulară,

– numărul relativ de celule mucoase, epidermoide și intermediare.

Tumorile cu grad scăzut prezintă numeroase chisturi, atipie celulară minimă și o proporție relativ mare de celule mucoase.

Tumorile cu grad înalt au insule de celule scuamoase cu pleomorfism celular marcat și activitate mitotică. Tumora se diferențiază greu de carcinomul cu celule scuamoase.

Tumorile cu grad intermediar pot prezenta chiste, dar puține, predomină celulele intermediare, iar atipiile celulare sunt variabile. Gradul de diferențiere nu se corelează cu prognosticul.

Redăm în tabelul 36 parametrii morfologici și gradul de diferențiere.

Tratamentul diferă în funcție de localizare, gradul histologic și stadiul clinic.

Am investigat de asemenea pacienți cu mase parotidiene dar cu un context lezional inflamator sau diferite forme de limfoame în cadrul maladiilor de sistem. În aceste situații, mai ales la pacienți tineri sau copii, PAF a reprezentat o provocare de diagnostic. Investigații asemănătoare am utilizat și în abordarea preoperatorie a maselor tumorale sau pseudotumorale din regiunea submandibulară.

În studiu au fost incluși 75 pacienți de ambele sexe: 42 bărbați și 33 femei, vârsta între 3-82 ani, cu o medie a vârstei de 42 ani. Aproximativ 1/3 dintre pacienții puncționați și apoi operați au prezentat sau au fost suspectați cu neoplazie de glandă salivară (parotidă) sau cu patologie non-glandulară. Au fost confirmate histologic 60 de tumori maligne și 7 leziuni benigne. Nu au putut fi diagnosticate 8 cazuri, datorită viciilor de recoltare sau materialului inadecvat pentru interpretare citologică. Citodiagnosticul a fost adevărat pozitiv în 60 cazuri (92% sensibilitate) și adevărat negativ în 7 cazuri (63% specificitate), valorile predictive pozitivă și negativă, au fost de 92% și respectiv 73%.

2.3.8. Citomorfologia unor leziuni frecvent întâlnite în PAF din cazuistica proprie.

Pentru inventarierea și evaluarea integrativă a leziunilor investigate, am efectuat o clasificare cito-histopatologică a cazuisticii.

2.3.8.1. Leziuni cu celule scuamoase încadrate cito-histopatologic

Originea leziunilor precursoare ale carcinomului scuamocelular (CSC) de cavitate orala și faringe, clasificarea tumorală și gradingul tumoral sunt controversate. Nu aceeași situație se descrie la precursorii lezionali în cancerul vulvar și penian care sunt legați de papilomavirus sau de inflamația cronică. Aceste leziuni sunt descrise prin clasificarea din sistemul VIN 1-3 (neoplazia vulvara intraepitelială) sau dVIN (neoplazia vulvara intraepitelială diferențiată).[128] Etiologia leziunilor precursoare carcinomatoase scuamocelulare orale și faringiene este mult mai diversă, iar spectrul lezional este mult mai larg. Nu există un consens internațional în ceea ce privește clasificarea tipurilor histologice ale precursorilor carcinomului scuamocelular sau semnificația diferitelor tipuri lezionale.

In studiul nostru, pe piese revizuite și biopsii excizionale la 155 pacienți cu carcinom scuamocelular al cavității orale si țesuturilor periorale, am identificat 5 patternuri arhitecturale ale carcinomului scuamocelular sau ale leziunilor precursoare: 1) pleomorfic (22/155), 2) bazaloid (5/155), 3) diferențiat (63/155), 4) mixt (42/155) și 5) verucos (12/155). Keratinizarea a fost un aspect constant în cazul CSC, dar variabil in displazia diferențiată, mixtă și verucoasă. La 11/155 pacienți nu am putut consemna leziuni precursoare.

Progresia displaziei diferențiate (de la câteva luni la câțiva ani) a putut fi urmărită la 13/155 (8%) din pacienți. Datele noastre sugerează că displazia severă a tipurilor pleomorfe sau bazaloide este prezentă în <20% din carcinoamele scuamocelulare orale, identificarea lor prin citologie-puncție aspirativă cu ac fin (PAF) sau citologie exfoliativă fiind dificilă, cu rezultate fals pozitive sau fals negative (aproximativ 60% din cazuri).

Cel mai frecvent precursor sau leziune in situ, pe lângă tipurile anterior amintite, este displazia diferențiată. Dificultăți în recunoaștere acesteia este subdiagnosticarea multor pacienți cu risc pentru carcinomul invaziv. Aceste rezultate indică necesitatea redefinirii criteriilor de diagnostic diferențial între displazie și leziunile lichenoide relaționate morfologic.

La peste 2/3 din cazurile studiate (n=411), prima examinare morfologică a constat în interpretarea citologică a leziunii/leziunilor. Frotiurile din cavitatea bucală sunt, în mod frecvent, bogat celulare. Celulele epiteliale nu diferă față de cele din alte teritorii anatomice tapetate de epiteliu stratificat scuamos (epiderm, mucoasă vaginală, mucoasă exo-cervicală, ano-rectală). Celulele exfoliate sau amprentate au aspecte poligonale sau alungite, unele plicaturate cu citoplasmă cromofilă după gradul de maturare al celulei. Nucleul este rotund unic, mic și întunecat (picnotic la celulele superficiale). În unele regiuni (labiale, mucoasa jugală, palatul moale, epiteliul crevicular, mucoasa alveolară, mucoasa sublinguală), stratul granulos lipsește și se întâlnește parakeratoza fiziologică formată din keratinocite nucleate. În alte arii (gingie, palatul dur, fața dorsală a limbii), ca și în cadrul pielii, stratul granulos este prezent și pot exfolia la suprafață celule anucleate. Pe frotiu mai apar leucocite neutrofile, uneori histiocite și frecvent contaminare prin fungi și bacterii.

Redăm în tabelul 37 aspectele citologice frecvente în leziunile investigate.

Deoarece mai mult de 90% din neoplasmele maligne orale sunt carcinoamele scuamocelulare, am încercat să aplicăm citodiagnosticul pre-, intra- și postoperator în regim de screening lezional la toate leziunile suspecte de malignizare investigate. Asemănător datelor din literatură (Ruocco)[126] am întâlnit 38% carcinoame scuamocelulare la nivelul buzelor și aproximativ 32% cu localizare linguală, sedii comune intraorale. Cea mai frecventă localizare a carcinomului scuamocelular este marginea laterală a limbii și/sau planșeul oral, din motive încă neelucidate. Mai semnalăm în studiul nostru și investigarea citologică a vestibulului oral, mucoasa obrajilor, creasta alveolară, palatul moale și dur, pilierii amigdalieni, amigdalele palatinale, baza limbii, și mucoasa oro-faringiană. În 94% din cazuri, leziunea carcinomatoasă propusă pentru examinare citologică prezintă aspecte clinice încadrate în variate tipuri de leucoplazie, lichen plan eroziv, fibroză a submucoasei sau eritoplazie (fig. 225-226, în anexe fig. 227-230)

Cele mai demonstrative aspecte citologice sunt exprimate în leziunile nodulare, ulcerate și nekeratinizate. Aspectul citologic al carcinomului scuamo-celular este celularitatea redusă, absența placardelor celulare și pleomorfismul celular. La obiective măritoare, celulele carcinomatoase prezintă alterări nucleare (hipertrofii, hipercromazii, nuclei lobulați sau multipli, mitoze ano-rmale), citoplasmele fiind intens bazofile. Citodiagnosticul carcinomului scua-mocelular este întotdeauna preliminar fiind doar orientativ în conduita clinică, și fiind verificat prin histodiagnostic.

Gradingul carcinomului scuamocelular invaziv a fost stabilit de Broders, iar gradingul leziunilor precursoare CSC de către Papanicolaou[127]. Progresia displaziei ușoare spre medie și severă la nivelul joncțiunii sccuamocilindrice din colul uterin a fost considerată o paradigmă. Aceasta influențează și actualmente conceptele leziunilor precursoare in variate epitelii.

Recunoașterea și gradarea leziunilor precursoare în tractul aerodigestiv este controversată. Multe fațete par să fie influențate de paradigma leziunilor precursoare cancerului cervical uterin, iar concepte noi reflectate in schemele de clasificare internațională acceptate sunt limitate. Aria conceptuală este complicată de un spectru larg de agenți etiologici cum ar fi HPV, inflamația (lichenul plan oral), fumatul, consumul de alcool și substanțe de supt de tipul areca nut și betel.

Pentru carcinoamele scuamoase orale și periorale, leziunile histologice precursoare nu pot fi încadrate în paradigma unidimensională a progresiei leziunilor carcinomatoase cervicale uterine. În plus, un spectru larg de leziuni clinice cum ar fi leucoplazia, eritroplazia, leziunile lichenoide și leucoplazia verucoasă proliferativă, nu sunt strâns corelate cu leziuni precursoare histologice și risc de cancer oral.

Actualmente, în sistemul de gradare a cancerului oral, se consideră displazia medie și severă cu atipii nucleare severe drept leziuni de risc înalt pentru dezvoltarea carcinomului scuamocelular invaziv. Leziune de risc scăzut se consideră displazia ușoară cu atipii nucleare moderate sau ușoare. Displazia medie poate fi încadrată cu risc crescut/grad înalt dacă atipia este semnificativă bazal/suprabazal.[128] Alte leziuni sunt definite prin caracteristici clinice cum ar fi leucoplazia verucoasă proliferativă și displazia lichenoidă.

Citodiagnosticul prin puncție aspirativă cu ac fin și prin exfoliere aduce un surplus informațional în aprecierea pre- intra- și post operator a leziunilor maligne carcinomatoase, în special în carcinoamele cu celularitate scuamoasă și cu eventuală diferențiere keratinizantă care au un aspect celular caracteristic(fig. 231-233).

Citodiagnosticul a fost confirmat histopatologic (fig. 234).

Frotiurile tumorale din carcinomul scuamocelular cuprind o celularitate bogată. Celulele scuamoase maligne sunt izolate sau în placarde. Citoplasma este bazofilă în colorația Papanicolaou sau oranjofilă, dacă celulele sunt cheratinizate. Nucleii sunt nucleolați, cromatina în grunji, colorată neregulat. Se poate întâlni material necrotic cu celule tumorale degenerate, cu detalii celulare sărace în leziunile metastatice întinse, în tumorile agresive. Sediul primar al tumorii cu adenopatie cervicală este intraoral sau laringian, dar și rinofaringian, pulmonar sau glandele salivare, așa cum am întâlnit în studiul nostu. Adenopatia supraclaviculară este mai frecventă în carcinoamele scuamoase pulmonare. Redăm în fig. 235-236 și în anexe fig. 237-240 corespondentul histopatologic al leziunilor investigate prin citodiagnostic.

Leziuni benigne diagnosticate având fond diatezic inflamator.

Tipuri de inflamație diagnosticată prin tehnica citologică

inflamația acută

abcesul

inflamația cronică

sialoadenozele

cicatrici

reacție de corp străin

fistula

sarcoidoza

inflamația TBC

2.3.8.2 Leziuni cu celule gigante

Frotiurile cu celule gigante pot include: celule gigante epiteliale, histiocite sincițializate sau celule de origine necunoscută. Aceste frotiuri prezintă fie un precipitat de fond proteinaceu sau hematic lizat, orientând spre o leziune chistică intraosoasă (de tipul granulomului cu celule gigante central sau granulomul periferic, dacă interesează mucoasa masticatorie) sau este un fond diatezic inflamator și permite suspiciunea unei inflamații granulomatoase (fie nespecifice, de tip reparativ – granulom reparativ, sau o reacție de corp străin cu prezența celulelor gigante multinucleate pleomorfe și a numeroase celule endoteliale). În general am descris fonduri ale frotiurilor de tip granular, necrotic sau supurativ. Reacția granulomatoasă alergică la corp străin prezintă un pattern tuberculoid, în care celulele endoteliale/epitelioide sunt numeroase, iar macrofagele sunt rare sau chiar absente. Redăm în fig. 241-242 și în anexe fig. 243-244 aspectul unor frotiuri cu celule gigante și în fig. 242 aspectele histopatologice ale unei leziuni inflamatorii cu celule gigante.

În fig. 245-248 și în anexe fig. 249-255, fig. 240-246 redăm identificarea imunohistichimică a contingentului celular studiat în leziunile cu celule gigante ale sferei orale și periorale.

2.3.8.3. Leziuni cu celule mici sau de tip limfomatos

Frotiurile cu celularitate omogenă de tip limfoid (fig. 256-261, în anexe fig. 262-273) reprezintă o provocare diagnostică, deoarece pot exprima leziuni diferite, dar și topografie de organ diferită, intrând în discuție: limfonodulii puncționați, chistele branhiale, tumora chistică Warthin, sialadenitele obstructive cu marcată componentă inflamatorie sau alte leziuni glandulare salivare, nu în ultimul rând tumori care pot da invazii locale periorale, orale sau limfonodale.

Citodiagnosticul limfonodulului. Celularitatea acestui organ prin amprentaj și PAF cuprinde 3 tipuri de populații celulare: celule existente în condiții fiziologice normale, celule apărute în condiții patologice benigne sau maligne și celule străine migrate în limfonoduli. Limfocitele domină în câmpul microscopic fiind de talie medie și mică, alături de puține limfoblaste, celule macrofage și reticulare, granulocite, plasmocite, monocite, eozinofile (foarte rare). Această populație celulară se modifică în anumite leziuni, transformându-se prin anaplazie, metaplazie sau/și se adaugă celule prin invazie malignă.

Mărirea în volum a limfonodulilor din regiunea cervicală și supraclaviculară se pune ușor în evidență clinic, fiind rapid sesizabilă atât de către pacient cât și de către medic. PAF, biopsia și citoamprentajul pot însă orienta apartenența leziunii, fie în cadrul neoplaziilor maligne, fie în afara acestora. Unii autori au descris la 100 de cazuri PAF pe tumori latero-cervicale mai mult de 2/3 carcinoame metastatice sau limfoame.[39][129]

Având în vedere că atât leziunea limfoepitelială benignă cât și sialadenitele cronice severe se însoțesc pe frotiu de populație limfoidă abundentă și insule epimioepitelilale, diagnosticul se stebilește prin corelații clinice și de laborator. În limfadenopatiile intraparotidiene epiteliul glandular este de obicei normal. Limfoamele și tumora Warthin pot fi interpretate greșit drept leziune limfoepitelială benignă.

2.3.8.4. Carcinoamele metastatice sau extensiile limfoamelor în țesuturile orale și periorale

Într-un procent de 8% în studiul nostru, pacienții au prezentat o origine nedeterminată, procentaj apropiat de al altor studii[130][131]. Frecventa asociere cu procesele inflamatorii cu diateză supurativă îngreunează citodiagnosticul și impune corelații clinico-paraclinice amănunțite. Celulele maligne pot fi adeseori confundate cu histiomacrofage sau cu celule din tractul nazofaringian atunci când se interpretează PAF din leziuni paranazale sau maxilare. Cel mai adesea orientarea de diagnostic în carcinoamele slab diferențiate din sfera orală este hipocromazia celulară a celulelor carcinomatoase. De asemenea modificările reactive ale keratinocitelor epiteliilor scuamoase stratificate pot mima malignitatea, reprezentând sursa de eroare în studiul nostru, așa cum am arătat mai sus. Cele mai frecvente metastaze în țesuturile orale și periorale au punctul de plecare sfera ORL, glandele salivare, plămânul, tiroida, glanda mamară, prostate ș.a. (fig. 274-283, în anexe fig. 284- 300).

2.3.8.5. Depozite tumorale în țesuturile moi periorale și laterocervicale

Depozite mici tumorale cu dimensiuni de 1-3 mm adiacent atmosferei celulo-adipoase din spațiile periorale și laterocervicale pot fi asigurate cu nutriție prin difuziune, așa cum am remarcat în cazuistica noastră. Pentru creșterea diametrelor are loc un fenomen care implică angiogeneza. De aceea la toate contingentele tumorale solide am remarcat o bogată neoangiogeneză, cu referire în special la carcinomul scuamocelular de țesuturi moi orale și periorale care induce factori de creștere vasculari. Sunt bine documentate studiile care explică intervenția factorului de creștere al endoteliului vascular (VEGF), dar și a altor factori inductor ai angiogenezei patologice. Acesta crește permeabilitatea vasculară, fiind responsabil de edemul și degenerarea mixoidă a stromei tumorale atât de frecvent modificată în carcinoamele scuamocelulare orale examinate de noi. S-au identificat 6 membri ai familiei VEGF: VEFG-A, placental growth factor, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D și VEGF-F. VEGF, anumite integrine și metaloproteinaze sunt responsabile pentru extensia carcinoamelor orale în țesuturile învecinate și pentru metastazare.[132] Creșterea turnoverului matriceal atât de important în invazia și metastazarea carcinoamelor orale poate explica variatele aspecte celulare și matriceale în carcinogeneza tumorilor orale și periorale întâlnită în cazuistica noastră. La 1 din 10 cazuri de carcinoame orale semnalăm prezența depozitelor tumorale la mică distanță de tumoră (<sau = cu 3mm) fenomen semnalat în literatură doar la carcinoamele colorectale.[133] Pentru tumorile solide din sfera orală, acest fenomen poate fi un criteriu important de apreciere macroscopic a extensiei și de cercetare microscopic prin PAF sau secțiuni la parafină a limitelor de clearance chirurgical.

Studii au demonstrat corelația directă dintre pozitivarea VEGF-ului prin determinare imunohistochimică și un nivel crescut al gradingului tumoral al CSC. De asemenea, s-a demonstrat expresia Cox-2 și VEGF în leziunile premaligne și în CSC oral: Cox-2 având un rol în etapele timpurii ale tumorogenezei, în timp ce VEGF poate fi determinat în stadiile avansate ale CSC.[134]

2.3.8.6. Leziuni tumorale cu celularitate fusiformă

Prezența celulelor fusiforme pe frotiurile aspirate din sfera orală și maxilofacială a impus totdeauna o verificare a citodiagnosticului prin biopsie incizională sau excizională. Cele mai mari dificultăți chiar pe secțiuni la parafină le-au ridicat proliferările fibroblasice și histiocitare cu componentă vasculară importantă cum este angiofibromul celular care poate prezenta atipii celulare, deși este încadrat în tumorile benigne (fig. 301-306, în anexe fig. 307-311).

Citodiagnosticul tumorilor vasculare prin PAF se confruntă cu fondul hematic abundent cu puține elemente de diagnostic. Uneori pot fi aspirate grupuri mici de celule endoteliale mici, fusiforme sau ovale, cu citoplasmă moderată și nucleu ovalar. De aceea diagnosticul final a fost stabilit pe secțiuni la parafină (în anexe fig. 312- 314)

2.4. Discuții

2.4.1. Studiul clinico-statistic al tumorilor de țesuturi moi orale și periorale[62][63]

În cadrul studiului nostru retrospectiv ce s-a întins pe o perioadă de 3 ani, numărul leziunilor tumorale maligne a fost de 597, 44.05% din totalul leziunilor tumorale de țesuturi moi orale și periorale.

Datele științifice arată că incidența cancerului în regiunea orală și maxilofacială este relativ ridicată, cancerul scuamocelular fiind cotat pe locul 6 la nivel mondial. Cancerul scuamocelular este unanim acceptat ca și una dintre cele mai frecvente leziuni neoplazice în regiunea capului și gâtului. Incidența carcinoamelor maxilofaciale variază semnificativ în diferite regiuni ale lumii[135] și chiar în diferite regiuni ale aceleași țări[136]. Chiar în aceeași țară sau regiune, incidența localizării tumorilor primare variază în timp[137]. Incidența cancerului în regiunea orală și maxilofacială este mai cescută la pacienții mai în vârsta deoarece, așa cum arată studiile, odată cu înaintarea în vârsta, crește riscul dezvoltării cancerului cavității orale și a regiunii perioarale prin însumarea efectelor nocive ale carcinogenilor. În momentul de față, toți cercetătorii au căzut de acord asupra ideii conform căreia expunerea cronică la carcinogeni poate duce la apariția aberațiilor genetice în celulele mucoasei orale, caracterizate prin activarea pro-oncogenelor și inhibarea genelor de supresie tumorală.[135]

2.4.1.1. Carcinomul scuamocelular[62]

Analiza histopatologică a tumorilor maligne în cadrul studiului nostru a arătat că cel mai frecvent tip de cancer în sfera orală și periorală este carcinomul scuamocelular cu un procent de 56%, urmat de carcinomul bazocelular (31.9%), melanomul malign (2%), limfoamele, adenocarcinomul și carcinomul mucoepidermoid fiind prezente într-o proporție mai mică. În studiul nostru, vârsta medie a pacienților cu carcinom scuamocelular de țesuturi moi orale și periorale a fost de 64.08±12.80.

Haq et al. a raportat în studiul său asupra frecvenței și patternurilor carcinoamelor orale și maxilofaciale că cel mai frecvent tip de carcinom a fost carcinomul scuamocelular într-un procent de 84.3% iar cele mai rare ca și frecvență a fost carcinomul bazocelular și carcinomul verucos[136].

Un alt studiu desfășurat în țara noastră asupra aspectelor clinice și patologice ale carcinomului scuamocelular al cavității orale a raportat un procent foarte ridicat al CSC de 92% cu un grading bine diferențiat în 53.05% din cazuri, moderat diferențiat în 31.30% și slab diferențiat în 15.65% dintre cazurile de cancer oral.[135]

Conform altor autori, carcinomul cu celule scuamoase reprezintă 90% din totalitatea tumorilor maligne ale regiunii orale și maxilofaciale, adeseori cu caracter agresiv, de obicei invadând țesuturile adiacente sau vasele limfatice.[138] Carcinomul scuamocelular poate afecta orice regiune a cavității orale, inclusiv palatul, limba, planșeul oral, glandele salivare, regiunile gingivobucală și maseterină și se poate extinde la mandibula sau maxilarul subiacent.[139]

Rezultatele noastre sunt comparabile cu alte studii care raportează carcinomul scuamocelular ca fiind cea mai importantă și frecventă formă de neoplazie a cavității orale, însă noi am raportat o incidență mai scăzută în regiunea orală și periorală. Diferențele procentuale pot fi explicate prin includerea în studiul nostru a țesuturilor moi orale precum și a tegumentului și a țesuturilor moi periorale. Din punct de vedere al gradingului tumoral, incidența CSC cu diferențiere moderată a fost foarte crescută în studiul nostru în comparație cu celelalte grade de diferențiere ale acestei tumori și în comparație cu raportările altor autori. Diverse studii au concluzionat că șansele de metastazare ale acestei tumori sunt direct proporționale cu gradingul tumoral și invers proporționale cu diferențierea celulară.[127] Haq et al. au raportat un procent de 39% carcinom cu celule scuamoase slab diferențiat[136], Fronie et al. un procent de 53% a tipului cu celule bine diferențiate și 31% pentru cel cu celule moderat diferențiate.[135] În studiul nostru, vârsta medie pentru CSC bine diferențiat a fost cea mai scăzută (62.06±15.64) în timp ce pentru cel slab diferențiat a fost cea mai ridicată (69.32 ±12.26), semnificativ mai crescută decât pentru cel moderat diferențiat (testul t nepereche: p=0.012, α=0.05) cât și față de cel bine diferențiat (testul t nepereche: p=0.019, α=0.05), în timp ce vârsta medie a CSC bine diferențiat este nesemnificativ mai mare decât cea a CSC moderat diferențiat (testul t nepereche: p=0.307, α=0.05).

Pentru tumorile maligne, în studiul nostru raportul bărbați: femei a fost de 1.54:1, în timp ce același raport pentru CSC a fost 2.84:1. Raportul bărbați: femei pentru tumorile maligne variază larg în literatură între 1.3:1 și 3.27:1, iar Howell et al. a observat că acest raport crește de-a lungul timpului, tendință confirmată și de Ariyoshi Y et al, cu un raport bărbați:femei de 1.45:1.[137] Proportia crescândă de cazuri de tumori maligne apărute la femei este corelată cu creșterea incidenței fumatului la persoanele de acest sex, pe când în rândul persoanelor de sex masculin, incidența fumatului este în cădere.[135]

În studiul nostru, vârsta medie a bărbaților cu CSC este mai mică față de cea a femeilor cu aproximativ 7 ani. Incidența CSC la pacienții din mediul rural este mai ridicată decât la pacienții din mediu urban, dar vârsta medie a pacienților este egală. Localizarea primară a cancerului oral variază în funcție de regiunea geografică. Unele studii raportează limba ca fiind sediul primar, in timp ce altele raportează buza și mucoasa bucală ca localizări cu incidențele cele mai crescute. Conform lui Tarvainen et al, incidența cancerului de buză a scăzut recent, iar printre factorii implicați în acest proces se enumeră scăderea ratei fumatului și a numărului de muncitori în aer liber.[137]

În ceea ce privește sediul CSC, noi am observat că localizarea cea mai frecvent implicată a fost limba (21.9%), urmată de buză (19.5%) și tegument (19.2%), iar cea mai scăzută incidență a CSC a fost la nivelul palatului (2.1%). Rezultatele noastre sunt aproximativ identice cu cele ale lui Midion et al. și Haq et al.[136] referindu-ne la incidența cancerului oral, acesta având ca localizări predilecte mucoasa orală, buza și limba, iar palatul fiind cel mai puțin afectat.

Conform literaturii de specialitate, cancerul de buză tinde să apară mai frecvent la bărbați în timp ce neoplasmul gingival sau al glandelor salivare e mai des întâlnit la femei.[140] În studiul nostru raportul tumoral bărbați:femei este crescut în toate localizările cu excepția cancerului de glande salivare în care incidența este egală.

După Llewellyn et al, printre factorii de risc ce duc la apariția cancerului oral la pacienții de sex maculin cu vârsta sub 45 de ani, se enumeră începerea fumatului la o vârsta tânără (16 ani sau mai puțin) și consumul excesiv de alcool, iar la femei, predispoziția ereditară, infecțiile virale și activitatea sexuală.[137]

În studiul nostru, vârsta medie a bărbaților cu CSC a fost mai mică decât cea a femeilor, atât per total cât și în ceea ce privește unele localizări specifice. Vârsta medie a pacientelor a fost semnificativ mai mare decât a bărbaților pentru localizarea tegumentară a CSC (67.44 ani la 75.84 ani) (nivel de semnificație 0.01) cât și pentru localizarea CSC la nivelul planșeului (57.26 de ani față de 68 de ani) (nivel de semnificație 0.05). În cazul CSC de țesuturi conjunctive, diferența dintre media de vârstă a bărbaților și femeilor poate fi explicată prin numărul mic de pacienți (n=11). Vârsta medie a pacienților cu carcinom “in situ” a fost mai scăzută pentru femei față de cea a bărbaților, în timp ce pentru CSC de glande salivare, vârsta medie a fost egală între cele două sexe. Aceste rezultate sunt discutabile datorită numărului redus de pacienți afectați de aceste patologii.

2.4.1.2. Carcinomul bazo-celular[63]

Tumorile de părți moi reprezintă mai puțin de 1% din numărul total de tumori, incidența anuală a fiind de aproximativ 300 la 100 000 persoane.[141]

CBC este cel mai comun tip de cancer tegumentar la populația din rasa albă [142][143][144][145][146], reprezentând aproape jumătate din toate tipurile de cancer și aproximativ 80% din toate tipurile de cancer nonmelanomic.[147] Incidența CBC este în creștere în lumea întreagă, anual descoperindu-se 850 000 de cazuri noi doar în SUA. [142][144][147]

În ciuda prevalenței sale foarte ridicate, CBC este în general un neoplasm cu grad mic de malignitate[145], asimptomatic, cu creștere lentă[144], o tumoră epidermală malignă ce invadează țesuturile din jur, afectând în special caucazienii. Tumora infiltrează țesuturile intr-o manieră tridimensională, datorită creșterii subclinice neregulate a prelungirilor sale digitiforme ce rămân atașate de masa tumorală principală. Metastazarea este extrem de rară, iar morbiditatea este rezultatul invaziei tumorale locale și a distrucției, mai ales la nivelul feței, capului și gâtului. [146]

Creșterea semnificativă a incidenței acestei tumori în ultimele două decenii se poate datora creșterii expunerii recreaționale la soare. Se preconizează o creșterea și mai mare în viitor datorită îmbătrânirii populației și a expunerii și mai intense la radiațiile solare ultraviolete, ce sunt o consecință a distrugerii stratului de ozon.[144]

În studiul nostru retrospectiv pe 3 ani am descoperit că un număr de 190 de pacienți au prezentat CBC al regiunii orale și periorale. Examenul histologic al tumorilor maligne a evidențiat faptul că CBC s-a clasat pe locul doi ca frecvență în ceea ce privește tipurile de cancer din regiunea orală și periorală, afectând un procent de 31.9% din cei 597 pacienți cu leziuni tumorale maligne de țesut moale din regiunea orală și periorală. Cel mai frecvent s-a întâlnit CSC, în procent de 56% din totalul proliferărilor maligne analizate în acest studiu. Pacienții cu CBC de țesut moale din regiunea orală și periorală incluși în studiul nostru au avut o vârsta medie de 70.41±11.68 ani, mai ridicată decât cea pentru CSC (64.08±12.80 ani).

Procentajul relativ scăzut al cazurilor de CBC în comparație cu cele de CSC poate fi explicat prin faptul că studiul nostru s-a concentrat pe tumori ale mucoasei orale, ale tegumentului și țesuturilor moi din regiunea periorală.

În cadrul studiului nostru, 175 de pacienți au avut CBC tegumentar, ceea ce reprezintă 76.42% din cei 229 de pacienți cu tumori maligne ale tegumentului regiunii periorale.

Femeile au fost mai afectate decât bărbații (raport 1: 0.68) de această patologie, atât în zonele rurale cât și în cele urbane, în comparație cu raportul bărbați:femei de 1.54:1 pentru totalitatea tumorilor maligne. Multe studii au raportat o incidență mai crescută a CBC în rândul bărbaților, deși femeile tinere sunt din ce în ce mai susceptibil afectate. [147][148]

Vârsta medie de apariție a CBC la bărbați a fost semnificativ mai mică decât cea la femei, 67.58 față de 72.34 (nivel de semnificație de 0.01). În grupul pacienților cu CBC tegumentar, vârsta medie a pacienților de sex feminin este semnificativ mai mare decât cea a pacienților de sex masculin (72.43 ani respectiv 67.93 ani) (nivel de semnificație 0.01). Acest lucru este valabil în aproape toate localizările specifice, cu excepția CBC apărut la nivelul auricular și a celui apărut la nivelul tegumentului temporal, situație în care vârsta medie a bărbaților este nesemnificativ mai mare decât cea a pacienților de sex feminin (p>0.05).

Cei mai importanți factori de risc pentru apariția CBC sunt predispoziția genetică și expunerea la radiațiile ultraviolete.[146] Radiațiile ultraviolete care induc modificări în urma expunerii la soare au fost acceptate ca fiind principalul factor etiologic în apariția CBC[143][144]. Multe studii au concluzionat faptul că persoanele care au părul și ochii de culoare deschisă, nord-europenii și persoanele cu pielea sensibilă la soare, care se bronzează greu, în condițiile unei expuneri recreaționale la soare intermitentă la vârsta copilăriei sau a adolescenței, caracterizată prin arsuri solare, prezintă un risc de apariție a CBC mai mare decât dacă aceeași doză de radiații ar acționa în mod continuu[144][147].

Alți factori de risc cunoscuți includ expunerea la radiații ionizante, vârstă înaintată, sexul masculin, tipurile de piele I și II, imunodepresia, expunerea la substanțe chimice carcinogene (ex. arsenicul), o dietă ce include un consum crescut de grăsimi și posibil infecția cu HPV[143][146][148], în timp ce fumatul nu este un factor de risc pentru CBC. [10]

În studiul nostru, incidența CBC la pacienții din mediul rural (53.2%) a fost mai mare decât în mediul urban, cu o vârsta medie mai mică, de 69.45±12.58 ani în comparație cu 71.51±10.52 ani. Incidența mai crescută în zonele rurale împreună cu apariția CBC la vârste mai mici pot fi corelate cu expunerea prelungită la soare în timpul activităților agricole.

Cea mai frecventă localizare, în studiul nostru, a CBC tegumentar este în regiunea nazală (33.19%), urmată de obraz (22.3%), pleoape (13.7%), incidența cea mai scăzută fiind în regiunea zigomatică(1.7%). Rezultatele sunt similare cu cele ale altor studii, nasul, obrazul, pleoapele și regiunea temporală fiind zone cu risc crescut de dezvoltare a CBC.[148]

Deși CBC poate invada și distruge țesuturile învecinate, metastazează rar și se pretează exciziei chirurgicale[145], apărând predominant la nivelul capului și gâtului[149], CBC reprezintă o problemă mai ales datorită implicațiilor estetice pe care le ridică.[143][145][148]

CBC localizat în etajul mijlociu al feței sau la nivelul urechii este clinic mai agresiv. Rata de recurență semnificativ crescută se datorează proximității tegumentului cu osul și cartilajul învecinat în regiunea nazală și orbitală.[148] Caracteristicile clinice și morfologice ale diferitelor subtipuri de CBC sunt diverse. Acestea includ varianta nodulară, chistică, superficială, morfeiformă (sclerozantă), keratotică și cea pigmentată.[146] Formele morfologice infiltrativă și sclerozantă tind să fie agresive, recurente sau să aibă margini pozitive la excizie.[142]

În ceea ce privește subtipurile histologice de CBC, în studiul nostru varianta nodulochistică a avut incidența cea mai ridicată (52.6%), urmată de cea difuză (infiltrativă) (25.8%) și cea superficială (15.8%), în timp ce varianta pigmentată a avut incidența cea mai scăzută, de doar 5.8%. Vârsta medie a pacienților suferind de CBC superficial a fost cea mai scăzută în comparație cu toate celelalte variante (67.77±15.8 ani). Aceste rezultate sunt comparabile cu cele ale altor studii care atestă că variantele nodular, superficial și infiltrativ sunt, în ordinea descrescătoare a prevalenței lor, cele mai des întâlnite tipuri de CBC[145]. CBC nodular apare cu predominanță la nivelul capului și gâtului, iar pacienții cu CBC superficial sunt semnificativ mai tineri decât cei ce prezintă alte subtipuri de CBC.[143] Variantele de CBC nodulară și superficială tind să fie mai puțin agresive.[148]

Excizia chirurgicală cu evaluarea histologică a marginilor de siguranță, fie intra- sau postoperator, este un tratament foarte eficient pentru CBC primar, cu o rată de recurență mai mică de 2% în urma exciziei chirurgicale complete sau de 30% până la 41% în urma exciziei chirurgicale incomplete.[137] Din cauza faptului că CBC al capului și gâtului are una dintre cele mai mari rate de recidivă dintre toate CBC, este esențială stabilirea unui diagnostic și a unei terapii corespunzătoare.[145] Tratamentul chirurgical al CBC al tegumentului perioral este o adevărată provocare datorită localizării, a ratei crescute de recidivă și a tiparului de diseminare, motiv pentru care este necesar un compromis între excizia în margini de rezecție negative și obținerea unui rezultat estetic satisfăcător.[145][150] Această regiune este sensibilă din punct de vedere estetic, fapt ce poate duce la un tratament inițial inadecvat[148]. Chirurgul trebuie să păstreze maximum de țesut înconjurător sănătos dar, în același timp, să îndepărteze tumora cu marginile chirurgicale standard de 4 mm. O altă opțiune este chirurgia micrografică Mohs pentru controlul histologic al marginilor, pentru a evita reintervențiile și recidiva în regiunile anatomice sensibile.[149][150]

Atunci când excizia chirurgicală și plastia defectului sunt efectuate de către un chirurg experimentat, rezultatele cosmetice sunt în general satisfăcătoare.[146]

2.4.2.Citologia exfoliativă și de aspirație cu ac fin (PAF)

Citologia prin puncția aspirativă cu ac fin este o metoda alternativă de diagnostic, rapidă, ieftină, fiabilă, facilă care poate elimina necesitatea efectuării biopsierii deschise, grevate de riscul efectelor secundare nedorite.[151] Rolul citologiei/biopsiei (FNAC/FNAB) prin puncție aspirativă cu ac fin a crescut într-un mod semnificativ în diagnosticul leziunilor neoplazice și neneoplazice în multe specialități medicale și chirurgicale.[152][153]

Am acordat o atenție deosebită studiului citologic în principal deoarece mucoasa orală este ușor de investigat prin citodiagnostic, din rațiuni anatomice și prin marea complianță a bolnavilor vis-a-vis de prelevarea neinvazivă cu accesibilitate imediată a unui material biologic deosebit de valoros în stabilirea diagnosticului lezional la granița benign-malign.

Principalul obiectiv al diagnosticului citologic este diferențierea leziunilor maligne de cele noninvazive și, dacă este posibil, diferențierea malign – benign in cadrul leziunilor neoplastice, diagnosticul final fiind stabilit prin examen histopatologic.[154]

Deși tehnica a fost elaborată în urmă cu 150 de ani, fiind utilizată pentru regiunea oro-maxilo-facială pentru prima dată de către Martin la începutul anilor 1930[153], doar în ultimii 20 de ani s-a demonstrat în mod repetat adevărata sa utilitate, siguranță și acuratețe diagnostică.[152]

Diverse studii recomandă utilizarea PAF în diagnosticarea tumorilor din sfera orală și maxilo-facială pe baza acurateței ridicate și a numărului scăzut de rezultate fals pozitive. Citologia prin puncție aspirativă cu ac fin este metoda de elecție pentru diagnosticul inițial al tumorilor regiunii oro-maxilo-faciale prezentând multe avantaje dar având totuși o utilizare restrânsă.[155] Există un număr relativ mare de articole care documentează eficacitatea PAF în tumorile glandelor salivare. Totuși sunt puține studii cu privire la potențialul PAF în diagnosticul tumorilor intraorale și regiunii maxilofaciale.[152][66]

Tehnica citologiei prin PAF poate fi utilizată pentru diagnosticarea unei formațiuni tumorale palpabile sau vizibile printr-o metodă imagistică, pentru diagnosticul diferențial între tumorile benigne și maligne, atât în cazul leziunilor chistice cât și solide,[156] determinarea gradului de malignitate, evaluarea metastazelor în nodulii limfatici suspicionați sau măriți, diagnosticarea tumorilor multiple, analiza recidivelor, documentarea malignității în cazul pacienților ce suferă de afecțiuni inoperabile, identificarea microorganismelor si obținerea materialului de cultură din masele infecțioase și leziunile tumor-like.[153][157]

Această metodă poate fi utilizată în stabilirea unui diagnostic în tumorile radiotransparente ale maxilarelor. Suflarea sau resorbția osului cortical permite utilizarea acelor fine pentru a puncționa si aspira aceste formațiuni.[152]

Există mulți factori care afectează acuratețea diagnosticului tumorilor acestei regiuni prin citologie prin puncție aspirativă cu ac fin. Cei mai importanți dintre aceștia sunt experiența clinicianului în a efectua procedura de prelevare, precum și necesitatea existenței unui histopatolog experimentat, capabil să analizeze probele. Problemele diagnostice ale citologiei prin puncție aspirativă cu ac fin sunt dezbătute de diverși autori, pe baza unui număr mare de cazuri[158][159][160], varietatea histologică tumorală și aspiratul insuficient fiind principalii factori incriminați de îngreunarea diagnosticului.

Citologia prin PAF este o tehnică care permite un diagnostic rapid și, dacă este necesar, o reaspirare se poate efectua imediat, chiar în ședința prelevării inițiale.[161] Cauza principală a unui diagnostic eronat este imposi-bilitatea obținerii unei mostre reprezentative. Acest lucru se poate întâmpla dacă acul este poziționat în afara țesutului țintă, în zonele de necroză centrală, hemoragică sau de degenerescență chistică a tumorii.[162] Diagnosticul aspirativ al formațiunilor chistice este mai puțin specific decât cel al tumorilor solide datorită absenței de celule tumorale specifice precum și a infecției supraadăugate.[152]

Brennan et al.[155] afirmă că repetarea PAF este utilă în acele cazuri în care aspiratul inițial nu oferă suficiente informații sau când un diagnostic nu se poate stabili. Chiar și atunci când se stabilește un diagnostic citologic, distincția malign/benign nu trebuie să se bazeze în exclusivitate pe examenul citologic, rezultatul trebuind coroborat cu alte mijloace de investigație și raționamentul clinic pentru managementul tumorii.

Prelevarea materialului citologic în studiul de față s-a făcut atât prin abord endooral exfoliativ, cât și prin puncție aspirativă cu ac fin a leziunilor endo-și exo-orale, incluzând regiunea latero-cervicală. Turnover-ul continuu al mucoasei orale, prezența salivei ca mediu de dispersie fiziologic, acceptarea de către pacienți a procedurilor de recoltare a materialului citologic, au stat la baza strategiei de diagnostic și management a leziunilor benigne și maligne investigate pe parcursul a mai mulți ani. Verificarea diagnosticului citologic s-a realizat pentru majoritatea cazurilor investigate (p<0,002) și confirmarea acestuia a demonstrat că echipa multidisciplinară chirurg-cito-histopatolog-oncolog-radiolog-chimio-radioterapeut asigură bazele reale de tratament atât în prevenție cât și curativ prin selectarea gravității leziunilor și monitorizarea lor.

În decursul anilor de studiu, am îmbunătățit în primul rând tehnicile de recoltare sau prelevare a materialului citologic sau biopsic, deoarece am constatat că cele mai multe erori sau rezultate fals-pozitive/fals-negative au survenit din pricina primilor timpi ai investigațiilor noastre. Am adaptat astfel metodele de prelevare respectând condițiile impuse de starea bolnavului, tipul de intervenție operatorie și condițiile de screening lezional care s-au impus.

Este general acceptat că citologia prin puncție aspirativă cu ac fin este utilă in diagnosticul preoperator, dar acuratețea acestei tehnici depinde considerabil atât de experiența operatorului cât și de abilitatea histopatologului de a interpreta proba. Rezultatele obținute trebuiesc interpretate în context global preoperator, corelate cu rezultatele examenului clinic și ale investigațiilor radiologice. [154]

Înainte de prelevarea frotiurilor din leziuni ulcerative, mucoasa orală a fost aseptizată cu substanțe non-iritante, pentru leziuni keratozice sau leucoplazice s-au folosit tamponări cu bicarbonat de sodiu (3%) cu efect keratolitic, deoarece am constatat că prelevarea superficială a materialului citologic în carcinoamele scuamoase este mai bine interpretat după asigurarea unei suprafețe ”curățite” de detritus fibrino-leucocitar, colonii microbiene sau detritus celular care pot limita interpretarea citologică. Prelevările citologice s-au efectuat din zonele cele mai caracteristice ale leziunii. Pentru carcinoame infiltrative și leziuni profunde s-a practicat PAF.

Puncția aspirativă a fost mai des folosită în diagnosticul preoperator în tumorile glandelor salivare, incluzând leziunile parotidiene care au fost investigate citologic în peste 90% din cazuri. Utilizarea PAF a înlăturat intervenția chirurgicală la 38% din pacienți. La restul pacienților, PAF a furnizat informații preoperative benefice cu rol deosebit în determinarea extensiei chirurgicale și adaptarea tehnicii operatorii propuse, necesitatea biopsiei sau a unei intervenții chirurgicale.

La cazuistica luată în studiu, am găsit o acuratețe a diagnosticului prin PAF de 92%. În plus, la 84% din tumorile maligne și 95% din tumorile benigne, încadrarea lezională a corespuns cu descrierea citologică a tipului tumoral. Aceste rezultate sunt apropiate de cele descrise în literatură (Ruocco ) și subliniază utilitatea citodiagnosticului în managementul leziunilor de glandă salivară.

În cazul tumorilor de glande salivare, această metodă furnizează un diagnostic citologic preoperativ sigur. Acest lucru este extrem de important pentru planul terapeutic, mai ales la pacienții cu comorbidități semnificative, unde riscul chirurgical este crescut. Astfel, puncția aspirativă cu ac fin este un test folosit la scară largă pentru diagnosticul si planul de tratament chirurgical al tumorilor de glandă salivară. În consecință, citologia prin PAF asigură o interacțiune îmbunătățită medic-pacient, oferind oportunitatea unei discuții despre opțiunile terapeutice și încurajând o decizie mai documentată în această direcție.[154][66]

Rolul de screening lezional prin PAF și CA a permis în studiul nostru precizarea naturii mezenchimale a proliferării maligne în 84% din cazuri. Subgruparea leziunilor sarcomatoase poate fi deosebit de utilă, pe baza citodiagnosticului putându-se orienta în faze inițiale terapia și prognosticul (în sarcoamele cu grad înalt de malignitate, chirurgia radicală este adesea combinată pre-și post-operator cu tratamentul complex chimio- și radioterapic).[66]

Studiul nostru a comparat diagnosticul prin PAF cu cel histopatologic corespunzător, pe secțiuni la parafină, în colorații uzuale, intraoperator efectuându-se cele două colorații citologice APT-Drăgan și PAP, la unele cazuri selectate punându-se și diagnostic extemporaneu pe secțiuni la gheață colorate HE și cu albastru de toluidină. S-a putut astfel confirma acuratețea citodiagnosticului și avantajele PAF. În studiile numeroaselor colective de cercetare și diagnostic sunt descrise atât aspectele citologice ale neoplasmelor benigne și maligne de glande salivare[163][162], cât și limitele și indicațiile PAF din mase tumorale parotidiene, unele cu evoluție silențioasă. Am constatat pe parcursul studiului nostru că diagnosticele fals-negative și fals-pozitive s-au redus semnificativ (p< 0,001) prin utilizarea ”triplului test” clinic/radioimagistic/citologic, mai ales în PAF din masele tumorale parotidiene.

PAF și informațiile datorate citodiagnosticului sunt cotate astăzi ca fiind foarte valoroase în conturarea aspectului lezional din sarcoame. După unii autori, acuratețea diagnosticului citologic bazat pe date clinico-radiologice se estimează a fi între 74-92%. Alte studii menționează o acuratețe a metodei ce variază între 90-97%, în funcție de sediul anatomic al formațiunii tumorale.[153] Goncalvcs et al.[151] au raportat o sensibilitate de 87.9% și specificitate de 85.7% în cazul diagnosticului tumorilor benigne prin citologia aspirativa cu ac fin, iar în cazul tumorilor maligne o sensibilieate de 42.5% și o specificitate de 98.3%. Alte studii retrospective ale citologiei prin puncție aspirativă cu ac fin în diagnosticul malignității glandelor salivare au semnalat o senibilitate de 74% și o specificitate de 99%[164]. Un studiu publicat de Behzatoghi et al.[165], referitor la acuratețea acestei metode folosită în tumorile de glandă parotidă, afirmă o sensibilitate de 91% și specificitate de 98%.

Pentru a evalua PAF ca test diagnostic, am aplicat strict criteriile de diagnostic citologic. Efectele folosirii acestor criterii de citodiagnostic s-au oglindit mai ales în rezultatele fals-pozitive, deoarece la 1/3 din cazuri (4/11) au fost incluse diagnostice diferențiale incluzând posibilitatea unei proliferări tumorale maligne. În această categorie pot fi incluse și rezultatele adevărat-negative deoarece diagnosticul histologic final a fost inclus în diagnosticul diferențial histologic. Un număr nesemnificativ de cazuri (p<0.013) au fost diagnosticate ca suspect maligne. În aceeași categorie au fost incluse frotiurile nediagnosticabile prin material celular redus.

Din cazurile fals-pozitive, 1/3 au fost diagnosticate cu chist limfoepitelial sau tumoră Warthin, deoarece citologic au fost încadrate ca tumori maligne de tip carcinom mucoepidermoid cu grad scăzut de malignitate. Diagnosticul citologic a fost bazat pe prezența celulelor mucoase și a mucusului extracelular de fond, situații întâlnite în ambele leziuni și raportate ca rezultate fals-pozitive pentru malignitate și de alți autori [116][118][125][166]. Totuși, pe frotiurile cu celularitate destul de redusă și în absența placardelor tridimensionale, se ridică problema diagnosticului de carcinom mucoepidermoid de grad redus, care reprezintă leziunea cea mai dificil de diagnosticat citologic [118][125][166]

Cazurile noastre fals-pozitive includ de asemenea adenomul pleomorf care a fost diagnosticat drept carcinom chistic adenoid prin PAF deoarece a prezentat celule balonizate într-o matrice mixoidă de fond, aspecte descrise și în alte studii[48][39][50].

Adenomul pleomorf a reprezentat un dignostic fals-pozitiv într-o metastază limfonodală latero-cervicală cu punct de plecare un carcinom ductal infiltrativ mamar la o pacientă neinvestigată oncologic.

Alte diagnostice fals-pozitive au fost oncocitomul diagnosticat citologic drept un carcinom cu celule acinare sau adenocarcinom bine diferențiat. Dificultatea de diagnostic s-a datorat citoplasmelor vacuolizate și granulare, modificări comune întâlnite în aceste leziuni. În oncocitom, granulele sunt mai mari și citoplasma mai densă. Celulele prezintă frecvent nucleoli proeminenți, caracteristică rar întâlnită în carcinoamele cu celule acinare, dar frecvent găsită în adenocarcinom. Reacția PAS diastazo-rezistentă orientează spre carcinomul cu celule acinare. Unii autori[44][50] descriu dificultăți interpretative cu colorația PAS în diagnosticul diferențial celule acinare maligne versus oncocite. Doar investigația electronomicroscopică poate face diferențierea leziunilor deoarece oncocitele prezintă numeroase mitocondrii în timp ce celulele seroase din carcinomul acinar conțin granule secetorii.

Interpretarea fals-negativă a leziunilor metastatice din sfera orală, în studiul nostru, a fost datorată insufucientelor date clinice, imagistice sau lipsei invastigațiilor oncologice la unii pacienți.

Diagnosticul tumorilor țesuturile orale și periorale deseori prezintă o provocare atât pentru histopatolog cât și pentru chirurg. Diagnosticul preoperator al tumorilor este de o importanță deosebită, dar complexitatea anatomică a regiunii, heterogenitatea patologiei tumorale benigne și maligne și a leziunilor tumor-like și absența patternurilor arhitecturale specifice îngreu-nează acest proces.[153][167][168][152] Cu toate acestea, în cazul în care criteriile diagnostice stabilite sunt prezente și strict observate, se poate atinge un nivel înalt de acuratețe diagnostică.[163]

2.4.3. Studiul expresiei stabilității și variabilității filamentelor citokeratiniene.

Atunci când s-au comparat profilurile de expresie a Ck în condiții normale cu cele care apar în condiții patologice non-neoplazice și neoplazice, am identificat în studiul nostru 3 din cele 4 modalități evolutive descrise în literatură.[169]

Astfel, păstrarea expresiei Ck cu stabilitate remarcabilă este întâlnită în epiteliul stratificat scuamos oral chiar și după transformarea malignă, dar cu intensitate mai slabă față de epiteliul oral displazic sau de acoperire adiacent, pierderea intensității expresiei fiind direct proporțională cu scăderea gradului de diferențiere. Ck bazale 5/6 tipice pentru epiteliul stratificat scuamos rămân exprimate în carcinoamele acestui tip de epiteliu și în formele slab diferențiate.[36] Rezultă că, în ciuda modificărilor profunde ale proprietăților celulare de bază, întregul program de expresie al Ck se poate desfășura în continuare nemodificat, chiar și în cazul în care caracteristicile de diferențiere morfologică sunt aproape neevidențiate.

Am constatat câștigarea unor Ck noi tipice stratului bazal al epiteliului stratificat scuamos în epiteliul oncocitar al tumorii Warthin, supraexprimat în focarele de epitelioză.

Pierderea expresiei Ck de tip bazal (rezultate din diferențierea funcțională în epiteliul stratificat scuamos al mucoaselor) se produce în carcinoamele mucoasei bucale și oro-faringiene în stadii avansate clinic, fiind mai rapidă în evoluția carcinomului scuamos de limbă.

Diferențierile carcinomatoase și metastazele carcinomatoase în sfera orală și paraorală incluzând regiunile latero-cervicale, orbitare, geniene și submandibulare au pus probleme reale de diagnostic pentru stabilirea originii tumorii primare, nedecelată la momentul respectiv (tumoră metastatică la care nu se cunoaște localizarea primară a tumorii-MUP). Tumorile prezintă adesea aspecte care pretează la confuzii. Citodiagnosticul anterior biopsiei a oferit o încadrare de suspiciune a tipului tumoral cu o sensibilitate de 92% și o specificitate de 63% în cazuistica investigată. Utilizând un grup de anticorpi la 41 pacienți, van der Gaast și colab. (cit. Suciu)[169] au concluzionat că imunohistochimia este utilă pentru descoperirea originii metastazei, în special pentru bolnavi care beneficiază de tratamentul chimioterapic. Imunohistochimia elucidează originea în cazul MUP în proporție care variază între 5% și 70%. Concluzia este că pentru pacient descoperirea originii tumorii primare este binevenită și poate fi utilă în protocolul terapeutic.

Așa cum este precizat și în literatura de specialitate[169], majoritatea MUP pe care le-am investigat (18% din cazuri) au fost carcinoame nedife-rențiate. Huebner și colab. (cit de Suciu)[169], pe o serie de 343 de pacienți cu metastaze, a găsit 40% adenocarcinoame, 28% carcinoame nediferențiate, 14% carcinoame scuamocelulare și 3% carcinoame cu celule mici, restul fiind tumori slab definite. Alături de acestea, trebuie ținut cont și de localizarea metastazei, așa cum am procedat în studiul nostru.

Astfel, pentru metastazele de adenocarcinom la nivelul capului și gâtului, am identificat procentual 12 metastaze pulmonare la pacienții de sex masculin și 3 metastaze de carcinom ductal invaziv de glandă mamară la femei cu adenopatie laterocervicală și supraclaviculară. Un caz de metastază ganglionară cervicală stângă la un pacient în vârsta de 68 de ani s-a datorat unui adenocarcinom prostatic cu evoluție subclinică timp de 3 ani. Așa cum am găsit în cazuistica proprie, metastazele de la nivelul ganglionilor cervicali sunt în cele mai multe cazuri localizarea primară chiar a carcinoamele capului și gâtului (97% din cazuri), majoritatea fiind de tip scuamocelular (87%).

Depistarea citologică a celulelor carcinomatoase pe frotiurile recoltate prin exfoliere sau prin PAF depinde în mare măsură de corectitudinea recoltării dar și de gradul de exfoliere tumoral. Am găsit o strânsă corelație între bogata celularitate malignă de tip scuamos pe frotiuri prelevate de la pacinenți cu carcinoame scuamoase mediu și slab diferențiate la care imunomarcarea pe secțiuni la parafină a filamentelor intermediare de CK a indicat un grad crescut de exfoliere a celulelor tumorale din straturile superficiale ale epiteliului stratificat, pleomorfe, ”rigide”, deformabile, cu citoskelet alterat. Așa ne explicăm faptul că în carcinoamele scuamocelulare keratinizate cantitatea celulelor pe frotiuri nu este întotdeauna satisfăcătoare, pretând la diagnostice diferențiale cu leziuni benigne și constituind sursa de rezultate fals-negative.

Citoscheletul din celule eucariote este compus dintr-o rețea complexă de filamente interconectate, care este importantă într-o mare varietate de funcții celulare, inclusiv modificări ale formei celulei, motilitatea celulară, mitoza, o creștere dependentă de ancorare, și localizarea organitelor celulare, cum ar fi mitocondriile, poliribozomii și granule secretoare. Diferitele proteine care cuprind citoscheletul includ actina din microfilamente, tubulina în microtubuli, iar grupul heterogen de proteine din filamente intermediare care sunt asociate cu diferite tipuri de celule (de keratină în celulele epiteliale, vimentina în fibroblaste, desmina în celulele musculare, proteine din filamente gliale în celulele gliale și subunități proteice asociate neurofilamentelor în neuronii din țesut nervos).[107]

Multe alte proteine sunt strâns asociate cu citoscheletul și influențează organizarea sa. În celulele neoplazice, expresia acestor diferite proteine citoskeletale, în special a proteinelor filamentelor intermediare, reflectă morfologia și diferențierea funcțională a celulei. Carcinoamele conțin keratină, identificarea keratinelor individuale poate permite clasificarea carcinoamelor, care este în concordanță cu țesutul lor de origine embriologic. Tumorile maligne de origine musculară conțin desmină. Vimentina se găsește în principal în celulele de origine mezenchimală, dar poate coexista cu alte proteine ale filamentelor intermediare în diferite tumori[107]. Un exemplu este coexistența keratinei și vimentinei în mezoteliom sau tumori derivate din celule epiteliale de origine embrionară. Proteina glială fibrilară acidă este markerul cel mai specific pentru tumorile gliale. Tumorile de origine neuronală sunt caracterizate prin prezența de subunități ale neurofilamentelor.

 Prin urmare, analiza compoziției citoscheletului ar fi utilă în diagnosticul de probe clinice și ajută în studiile relațiilor de filiație ale neoplasmelor. Deși există diferențe mari în structura citoskeletală dintre celulele neoplazice și normale care au fost identificate până în acum, prezența de modificări biochimice mai subtile în structura citoskeletală a celulor neoplazice care contribuie la un comportament malign nu a fost exclusă. Având în vedere că rețeaua citoscheletală joacă un rol important in forma și locomoția celulelor, ele sunt considerate a fi implicate în controlul creșterii, invaziei, și a metastazelor. Analiza este îndreptată în identificarea diferitelor modificari in arhitectura citoscheletal care pot influența comportamentul malign a celulelor neoplazice.

Filamentele de actină, microtubulii și filamentele citokeratiniene îndeplinesc un rol important în calitățile conformaționale și funcționale ale celulelor epiteliilor scuamoase. S-a studiat recent[93] contribuția filamentelor intermediare, codate de o familie de gene cu peste 70 membri la om și șoarece în ceea ce privește deformabilitatea, migrația și semnalizarea celulară.

2.4.4. Studiul imunohistochimic al tumorii Warthin în explicarea etiopatogeniei leziunii.

Deși au existat multe teorii explicative ale dezvoltării tumorii Warthin, doar două au rămas valabile. Prima teorie menține ipoteza heterotopiei tisulare, în timp ce secunda teorie consideră tumora ca un adenom cu infiltrare limfoidă. În sprijinul celei de-a doua teorii, vin datele evolutive clinice și morfologice: Tumorile Warthin mici, cu evoluție recentă, prezintă în principal componentă epitelială, în timp ce tumorile mari au pe lângă componenta epitelială și stromă limfoidă. Această teorie a fost infirmată de Honda et al, 2000, cit. de Teymoortash printr-un studiu al clonalității componentei epiteliale din tumora Warthin.[118] Autorii mai sus citați au demonstrat că atât componenta epitelială cât și cea limfoidă sunt policlonale. Deoarece neoplazia este privită ca un proces monoclonal, această tumoră nu este un neoplasm adevărat. Se pare că ipoteza după Albrecht și Artz din 1910, susținută și de studii ulterioare, consemnează că tumora se dezvoltă din heterotopia glandei salivare în limfonodulul intraparotidian.

2.4.5. Studiul imunohistochimic al podoplaninei.

Date din literatură [170][87][171] au documentat expresia podoplaninei în tumori benigne și maligne cum ar timoame, osteosarcoame, sacom Kaposi, subseturi de angiosarcoame cu diferențiere probabil limfatică, în carcinoame scuamoase de laringe. Imunolocalizarea acesteia a fost comunicată și în tumori odontogene, în carcinoamele in situ și carcinoamele cu celule scuamoase ale mucoasei orale. Podoplanina mai este exprimată în mezotelioame epitelioide, hemangioblastoame și seminoame. Funcția podoplaninei este cea de comunicare a celulelor cu moleculele matricei extracelulare. De asemenea, ea are rol și în legarea celulelor carcinomatoase din carcinomul scuamocelular oral la matricea extracelulară bogată în acid hialuronic, în colaborare cu CD44. În serii de investigații, se apreciază că podoplanina este exprimată în condiții neoplazice în celulele tumorale pentru adeziune la matricea extracelulară, care poate afecta secundar proliferarea celulară.[171][172]

Găsită inițial în podocitele normale, podoplanina a fost de asemenea găsită în celulele mioepiteliale normale ale glandelor submandibulare de șoa-rece[173][170][87].

Astfel, unii autori au evidențiat prezența podoplaninei în celulele tumorale salivare cu diferențiere mioepitelială, cum ar fi adenomul pleomorf și mioepiteliom.[174] Ca markeri mioepiteliali, mai pot fi folosiți în completarea studiului și actina, S-100 proteina, calponina și proteina p63, majoritatea fiind descriși în studiul de față. Totuși, sensibilitatea anticorpilor pentru aceste molecule variază de la o moleculă la alta și nu este totdeauna clar dacă lozalizarea acestor molecule este datorată caracterului mioepitelial al celulelor sau caracterului lor bazal.[121]

În studiul nostru, podoplanina a fost exprimată în celulele externe, pozitive și la S100 proteina și actină, nefiind exprimată în celulele interne, care se pozitivează la pan-citokeratine si conform altor studii, la keratina 19 (Masayuki Tsuneki, 2013)[87]. Celulele tumorale stelate/fusiforme au fost pozitive la podoplanină și S-100 proteina. În literatură, acestea sunt descrise ca pozitive la CD44)[87], receptor important pentru acidul hialuronic din stroma tumorală. Stroma condromixoidă cu celule stelate/fusiforme podoplanin+/ CD44+, prezintă aceleași celule pozitive și la perlecan și la acidul hialuronic, după aceleași studii. În adenomul pleomorf, podoplanina este specific exprimată pentru diferențierea mioepitelială.[87]

În glanda salivară submaxilară și în glandele salivare minore obținute în biopsie alături de țesutul tumoral prelevat, podoplanina a prezentat expresie caracteristică pentru localizarea mioepitelială. Aceste celule au fost identificate adiacent celulelor epiteliale ductale ale ductelor intercalate sau celulelor acinare. Unele studii [87] arată că localizarea podoplaninei este similară proteinei p63, fiind markeri pentru mioepitelii.

În literatură sunt evaluate expresiile histologice conjugate ale podoplaninei cu CD44, p63 ca markeri de celule stem și interrelația lor cu datele clinico-patologice în carcinoamele scuamocelulare, incluzând rata de supraviețuire.[171][87] După acești autori, expresia podoplaninei a fost observată în 66% din tumori, CD 44 la 89,5% și p63 în 93,2%. Localizarea periferică a fost observată la 55,9% din tumorile CD44 pozitive și 43% din tumorile p63 pozitive. La 88,8% din tumorile podoplanin pozitive, celulele pozitive au fost localizate mai spre periferia tumorii față de celulele CD44 sau p63 pozitive, iar în tumorile podoplanin pozitive, stratul p63 pozitiv s-a dispus mai marginal comparativ cu stratul celular pozitiv CD44. Aceste date sugerează aliniamentul de ‚,pattern de distribuție ierarhizat sau stratificat’’ în concordanță cu cei trei markeri studiați.

Pacienții cu tumori podoplanin pozitive și cu pattern de distribuție ierarhizat au totuși o rată de supraviețuire mai bună decât cei cu tumori podoplanin-negative (P=0.043). Astfel, expresia podoplaninei, ar sugera statusul imatur în procesul de diferențiere al carcinomului scuamocelular, ceea ce demonstrează și studiul nostru, iar carcinoamele cu expresie ierarhică ar constitui un grup tumoral bine organizat cu agresivitate biologică mai mică bazat pe conceptul de celulă stem tumorală. Utilizarea indicilor proliferativ-mitotici Ki67 si p53 la frontul tumorii cu expresie intensă a podoplaninei susțin această teorie.[171]

S-a consemnat expresia anormală a podoplaninei în tumorigeneză, fiind întâlnită la 70% din leziunile premaligne orale în unele celule bazale.[127][90] Așa cum o precizează multiplele studii clinico-morfologice, expresia izolată a podoplaninei nu este suficientă pentru a promova tumorigeneza, deoarece aceasta este întâlnită doar în stratul bazal. Alți factori sunt implicați în expansiunea clonală a celulelor anormale. Prezența podoplaninei în leziunile cu expansiune clonală sugerează un risc mai mare de devoltare a cancerului oral. Abilitatea de a decela celulele proliferate din stratul bazal ne permite vizualizarea potențialului clonal de expansiune, posibil din clone de celule stem în cursul tumorigenezei. Sunt necesare studii adiționale pentru a compara leziunile cu expansiune clonală determinate și de alți markeri și pattern-ul de expresie al podoplaninei pentru a înțelege proliferarea clonală.

Nu este complet înțeleasă funcția biologică a podoplaninei, studiile amintite sugerând că aceasta este implicată în tumorigeneză și progresia malignă. A fost demonstrat că antigenul PA2.26, un omolog al podoplaninei, este dereglat în cursul remodelării epidermului la rozătoare și în carcinogeneză. Expresia acestui antigen în celulele epidermale de șoarece și în celulele tumorale este asociată cu o creștere a migrației celulare și cu transformarea malignă. În carcinoamele scuamoase, expresia podoplaninei este restricționată la frontul de invazie al tumorii, așa cum am arătat în studiul nostru. Este sugerat că podoplanina promovează invazia celulelor tumorale prin inducerea migrării celulare colective via dereglării activităților GTP-azelor Rho. De asemenea, podoplanina poate reduce adeziunea celulă-celulă și expresia E-cadherinei[175][171]. Aceste constatări reprezintă un suport pentru rolul podoplaninei în tumorigeneză și în progresia tumorală. La fel ca și în alte studii, cazuistica noastră descrie expresia podoplaninei în aproape toate carcinoamele scuamoase investigate (>90%), expresia fiind asociată cu metastaze limfonodale și prognostic rezervat. La aproximativ 1/3 din cazurile investigate, leziunile scuamoase precursoare malignității au exprimat patternul podoplaninei similar leziunilor carcinomatoase. Expresia imunohistochimică a acestui marker este corelată cu gradul displaziei în concordanță cu gravitatea acesteia și cu riscul crescut de dezvoltare al cancerului oral.[132] Podoplanina are un rol posibil de inițiere și de progresie tumoral.

Ca biomarker, utilitatea interpretării expresiei podoplaninei depinde de modalitatea de interpretare corelativă cu valorile unor repere clinice și patologice. Unele studii[90][91][92][171] devansează valoarea de predicție pozitivă a podoplaninei pentru dezvoltarea carcinogenezei orale din leziuni precursoare de risc crescut care exprimă acest marker. Astfel, la 54% din pacienți cu cancer oral nu se asociază displazia după studiile amintite. Dar dacă cei doi factori independenți, displazia și podoplanina, sunt asociați, se poate evalua riscul de malignizare.

Ca și alte cercetări, cea actuală arată că leziunile orale multifocale pot avea origine monoclonală sau se pot dezvolta independent. De aceea, carcinoamele orale dezvoltate într-un teritoriu pot reprezenta o mixtură de leziuni derivate din clonele originale a leziunilor precursoare care pot evolua independent. Studii recente[170][173][171] arată că pacienții cu leziuni pre-cursoare maligne podoplanin-negative rareori dezvoltă cancer oral la același sediu de biopsiere, posibil prin apariția sau dezvoltarea unor leziuni subclinice la momentul examinării și astfel neexplorate. Sugerăm că expresia podoplaninei poate fi cercetată în evaluarea histologică de rutină a leziunilor precursoare orale și o țintă de elecție pentru chemoprevenție.

2.4.6.Particularități biomoleculare ale celulelor epiteliale din leziunile orale și paraorale.

Keratinele cu greutate moleculară mare (HMW) sunt întâlnite în epiteliile stratificate, nefiind în general găsite în epiteliile simple. Uneori, celulele bazale ale epiteliului glandelor prostatei și celulele mioepiteliale conțin citokeratine HMW tipul II și citokeratine cu greutete moleculară mică (LMW) tipI.[114]

Utilitatea citokeratinelor este de a identifica celulele bazale și mioepiteliale în diferite organe, în studiul nostru pentru epiteliile stratificate scuamoase și epiteliile glandulare. Celulele mioepiteliale sunt pozitive pentru CK 14 și negative pentru CK 5, 4, 13, 15, 16, 18, 19, 7, 20.

Pancitokeratina este o combinație a tipurilor 5, 6, 8 și 18. Este pozitivă în toate epiteliile investigate și în tumorile epiteliale din cazuistică. Am utilizat acest marker pentru diagnosticul diferențial al tumorilor anaplazice (n=28) și pentru evidențierea recidivelor tumorale sau recunoașterea tumorii reziduale (n=4).

CK6 este prezentă în celulele suprabazale ale epiteliilor stratificate și exprimată la 2/3 din carcinoamele scuamocelulare investigate, expresia fiind dependentă de gradul de diferențiere a tumorii.[98]

Studii de specialitate consemnează o pozitivare a epiteliilor stratificate astfel: stratul bazal al epidermului exprimă CK5/14 și 15, iar stratul spinos 1,2,10/11. Carcinomul scuamocelular prezintă o reducere a expresiei CK 1,11, dar o expresie CK 6/16 și 17 intensă [169]. În studiul nostru am remarcat o pozitivare a CK 5 în toate celulele stratului bazal. De asemenea, CK 5 este prezentă la periferia insulelor tumorale.

Carcinomul scuamocelular are următoarea expresie: în cazul celui bine diferențiat, lobulii tumorali sunt pozitivi la CK5 periferic, poțiunea centrală este pozitivă la CK 16 și câteva celule la CK13, iar reacția pentru CK 18 este negativă. În varianta slab diferențiată, CK 5 și 17 sunt bine reprezentate, iar CK 10/11 sunt foarte slab exprimate, și se poate exprima CK 18 specifică epiteliilor simple. Pot fi pozitive și rare celule la CK 20.

CK AE1 și AE3 sunt o combinație a mai multor tipuri de CK cuprinzând tipurile 1,2,3,4,5,6,8,10,11,15,16,19. Anticorpii AE1 și AE3 sunt markeri pozitiv intens în epiderm, epiteliul stratificat scuamos nekeratinizat, epiteliul celulelor glandular excretoare, imunomarcând și epiteliul digestiv, uroteliul, mezoteliul, epiteliul glandei mamare.[169]

2.4.7. Discuții privind carcinogeneza prin acțiunea virusurilor oncogene.

Este estimat că 15% din cancere au legătură etiologică cu infecția virală (Jacinto). Anual se înregistrează peste 1,5 milioane de cazuri noi pe mapamond. Unul dintre cele mai implicate virusuri în carcinogeneză este virusul Epstein Barr (EB), fiind un herpes virus comun cu ADN bicatenar de 172kb în întregime clonat și secvențializat, asociat cu o varietate de tumori epiteliale și limfoide cum ar fi carcinomul nasofaringian și chiar carcinomul gastric[9][25][42][45]. 90% din populația globului este infectată cu acest virus, el fiind persistent la marea majoritate a indivizilor ca infecție asimptomatică cu limfocite B (13) pe toată durata vieții.

Virusul Epstein-Barr își ia numele după M. Anthony Epstein și Yvone Barr, care au descoperit și documentat acest virus.[176] Acest virus, numit și virusul herpes uman tip4, a fost încadrat de către UICC ca și un virus oncogen de categoria I încă din 1997.[176]

Numeroase studii au analizat supraexpresia și rolul EBV în carcinogeneza orală.[177][178][179]

S-a constatat frecventa asociere a virusului EBV cu proliferările limfoide în cursul deficitului imun congenital sau dobândit. Cel mai bine documentat este rolul patogenic al virusului EB în limfoproliferările B la imuno-deprimați[38][40][44]. Limfocitele B sunt infectate via moleculele CD21 sau CR2, receptor pentru fracțiunea C3d a complementului prin legarea de glicoproteina gp350/220 a membranei virale. În limfocite infecția este latentă fără replicare sau formare de virioni, cu excepția instalării deficitului imun[48][42]. În timpul fazei de latență doar 10 gene virale sunt exprimate, ducând la producerea a 6 proteine nucleare denumite proteine de latență: EBNA-1, 2, 3A, 3B, LP (Leader Protein) și 3C, trei proteine membranare LMP (Latent Membran Protein LMP-1, LMP-2A, LMP-2B și doi ARN nucleari EBER-1 și 2 ( EBV encoded small RNAs) care intervin în menținerea latenței virale [42][45]. În celulele limfoide, LMP-1 transactivează oncogena bcl-2 al cărei rol de protecție contra apoptozei este cunoscut.[180][181] Din faza de latență și organizare circulară a genomului viral, virusul EB poate intra în ciclul litic printr-un determinant major, rezultant al transcripției genei BZLF-1 ce codează proteina). Asfel este indusă expresia altor gene virale și permisivitatea inițierii ciclului replicativ viral. După exprimarea antigenelor precoce EA (Early Antigen) genomul viral linearizat se replică pornind de la secvențele de origine replicativă litică (Orilyt). După replicarea genomului viral, antigenele tardive MA (Membran Antigen), VCA (Virus Capsid Antigen) și BCRF-1 sunt prezente. Gena tardivă bcf-1 posedă asemănare în procent de 70% cu interleukina 10, sugerând rolul ZEBRA (Z Epstein Barr Replication Activator) proteinei virale în creșterea și maturarea limfocitelor B și în pierderea supravegherii imune. Pacienții cu defect imun congenital, cu sindrom Purtilo caracterizat prin alterarea supravegherii imune la virusul EB legată de cromozomul X, dezvoltă fie mononucleoză infecțioasa uneori fatală, fie proliferări limfoide policlonale sau monoclonale și limfoame non-Hodgkin cu grad înalt de malignitate cu celule mari, sau mai rar limfom de tip Burkitt [5][8][119].

A fost precizat rolul patogenic al virusului EB și implicarea sa în dezvoltarea limfoproliferărilor și a limfoamelor la pacienții trasplantați. Aceste proliferări limfoide sunt frecvent extraganglionare, o localizare fiind în SNC (sistemul nervos central), 80% dintre cazuri fiind de natură limfocitară B unde virusul EB este practic prezent în toate celulele infectate. Celulele B infectate viral persistă în organism în compartimentul hematopoietic într-o minimă fracțiune a populației limfocitare cu o frecvență de 10-5 până la 10-7 celule infectate[46]. Celulele sunt strict controlate de celulele T citotoxice prin complexul major de histocompatibilitate clasa I. Ruperea echilibrului gazdă – virus permite dezvoltarea necontrolată a unei populații de celule B infectate cu virusul EB. Toate proteinele de latență cu excepția EBNA-1 posedă epitopi recunoscuți de celulele limfoide citotoxice specifice virusului EB. În celulele din limomul Burkitt cu latență tip I, diminuarea sau absența unor alele ale complexului HLA clasa I favorizează omiterea celulelor infectate de la controlul sistemului imun [33][6][10][45]. Pornind de la controversatele date cu privire la limfomogeneza virală în contextul infecției cu virus EB, am luat în studiu diferite limfoame difuze non-Hodgkin și Hodgkin, cu grade variate de malignitate, în diferite stadii evolutive, aflate sub diferite scheme de tratament, pe care le-am evaluat morfologic integrativ și la care am cercetat expresia antigenică pentru infecția virală cu virus EB.

Răspunsul imun antigenic la pacienții cu infecți viral EB latentă sau în ciclul litic este variat, putând fi crescut la unii și scăzut la alții [42][45]. Se incriminează nivelul de încărcare cu ADN viral a sângelui pacientului, fie nivele diferite de anticorpi specifici sau activarea celulelor T specifice virusului EB secretoare de interferon.

Deși structura genomului viral și expresia genelor virale este cunoscută, totuși mai persistă necunoscute în ceea ce privește modalitatea persistenței genomului viral în menținerea fenotipului malign al celulelor tumorale. Virusul nu este necesar creșterii continue a celulelor tumorale. În afara regiunilor endemice, există numeroase cazuri de tumori histologic identice în care nu se identifică AND-ul viral EB. De asemenea, există limfoame Burkitt EB+ și EB- cu aceeași translocație cromozomială. Recente rapoarte au confirmat aspectul inductiv al superantigenului retrovirusului uman endogen HERV-K-18 care interacționează cu infecția virală EB. Secvențele HERV și EBV pot interesa 8% din genomul gazdei[45]. S-au identificat microARN-urile HERV și s-au studiat limfoblastele infectate cu virus EB, ca și celulele limfoide B negative la virusul EB. Nivele crescute de microARN HERV au fost găsite în limfoame negative la virusul EB, dar nu și în alte limfoame și leucemii. Infecție primară antrenează răspuns indus CD8+ la antigenele ciclului litic și latent și apoi persistă toată viața în gazda imunocompetentă[45]. Mai scăzut este răspunsul celular CD4 indus de virusul EB. Există diferențe ale implicării imunodominanței la antigenele ciclului litic tardiv și la antigenele EBNA1, EBNA3 ale ciclului latent. Celulele din limfomul Burkitt au expresie antigenică virală restricționată (de obicei doar EBNA1) și au defect al MHC clasa I ceea ce previne recunoașterea celulelot T CD8+. Își mențin însă funcția de procesare a MHC clasa a II-a și capacitatea de a prezenta unele antigene endogene la celulele T CD4+. De aici se desprind 2 atitudini terapeutice[42][45]. Una este de a administra celule CD4+ specifice epitopilor EBNA1, iar a 2-a de a induce o populație celulară T CD4+ care să recunoască celule B transformate viral autologe, dar care nu sunt specifice EBV. Aceste celule efectoare sunt sensibilizate direct împotriva antigenelor țintă celulare care sunt supra-reglate în celulele B infectate viral (dar nu activate mitogen) și sunt de asemenea exprimate în liniile celulare ale limfomului Burkitt endemic sau sporadic[45]. Evadarea de la reacția imună a celulelor din limfomul Burkitt în contact cu antigenele virale este mediată prin 2 mecanisme: acțiunea de imunosupresie a c-myc care este exprimată în celulele limfomului Burkitt, virusul acționând mai mult ca antiapoptotic decât ca promotor al creșterii, iar al 2-lea mecanism este lipsa răspunsului celulelor limfomului Burkit la interferonul IFNγ și la acțiunea celulelor NK. C-myc reglează negativ calea NF-kB (nuclear factor kappa B) și răspunsul la IFN contribuind la scăparea de sub controlul imun al celulelor T citotoxice. Celulele infectate viral sunt rezistente la IFNγ, dar susceptibile la IFNα/β [45].

Cercetările ultimilor ani se îndreaptă spre evaluarea diferitelor forme de infecție virală EB persistentă și identificarea mecanismelor comune ale creșterii tumorale influențate sau nu de virusul EB.

3. Concluzii

Cercetarea multidisciplinară medicală cuprinzând specialitățile clinice și cito-histopatologia se înscrie în arealul modern de evaluare a stării de sănătate.

La o populație expusă tot mai mult la factori de risc ambientali, unii dintre aceșstia profund legați de patologia cancerului sferei orale și maxilo-faciale, studiul de față devine cu atât mai important, cu cât asociază specialități de vârf în abordarea diagnosticului și terapiei neoplaziilor benigne și maligne.

Metodele de cercetare expuse sunt pe de altă parte relativ ușor de aplicat, integrate rapid în circuitul diagnostic și în relaționarea flexibilă cu bolnavii, dintre care unii în faze avansate de boală sau cu indicații de tratament paliativ.

Bazată pe un algoritm de diagnostic, tratament și supraveghere medicală, abordarea multidisciplinară a neoplaziilor orale și din sfera periorală a devenit în doar câțiva ani, în cadrul clinicilor noastre, o modalitate eficientă de cuantificare a probității profesionale medicale, apreciată nu doar de bolnavi, ci și de specialiști în domeniu medical și paramedical implicați activ.

Rolul investigațiilor citologice:

Primul pas în diagnosticul unor neoplazii ale regiunilor investigate a fost realizat de citodiagnostic cu rezultate concludente sau sugestive, având o relevanță pozitivă, specificitatea fiind de 63% și sensibilitatea de 92%.

Prelevarea citologică pentru identificare leziunilor a avut un corespondent macroscopic lezional în 92% din cazuri, demonstrând pe de o parte necesitatea unor date paraclinice indispensabile completării diagnosticului clinic în sfera orală și paraorală, pe da altă parte evaluarea rezecțiilor în limite histologice, și nu în ultimul rând evaluarea predictiv-prognostică a leziunilor cu risc crescut de dezvoltare a cancerului oral.

Diagnosticul citologic specific al tumorilor de țesuturi moi este foarte dificil de efectuat și necesită un specialist histopatolog experimentat.

Subgruparea leziunilor sarcomatoase poate fi deosebit de utilă, pe baza citodiagnosticului putându-se orienta în faze inițiale terapia și prognosticul.

Cooperarea dintre chirurg și histopatolog este deosebit de importantă în vederea obținerii și evaluării materialului citologic necesar pentru punerea unui diagnostic precis. Citodiagnosticul oral este dependent de furnizarea exactă a topografiei lezionale, având în vedere complexitatea planurilor tisulare care structurează cavitatea orală și organele arondate ei (limfonodulii, amigdalele, glandele salivare); atunci când rezultatele citologice sunt corelate cu planul de tratament, rezultatele terapeutice sunt satisfăcătoare.

Studiul nostru conturează un concept modern de evaluare lezională în patologia orală și maxilo-facială. Rezultatele fals-negative și fals pozitive au putut fi reconsiderate după interpretarea histologică a leziunilor;

Precizarea tipului de celulă malignă proliferată este un element important de stabilit (tip scuamos, glandular secretor, metaplazică, de tip oncocitic, limfoidă, stromală ș.a.), deoarece răspunsul la terapia iradiantă este corelat cu tipul histologic al tumorii;

Conceptul de citologie orală este aprofundat în cercetarea de față prin corespondențele lezionale investigate histo-imunohistochimic în ceea ce privește exfolierea, keratinizarea, adezivitatea, proliferarea carcinoamelor orale ca și a evaluărilor de screening evolutiv și prognostic în majoritatea leziunilor cercetate;

Citodiagnosticul oral corelat cu markerii imunohistochimici oferă indirect date asupra adaptării biomecanicii mucoasei orale în condiții normale, dar și în leziuni precursoare malignității, având o utilitate în plus de apreciere a extinderii leziunilor de displazie sau lichenoide adiacente carcinomului oral;

Citologia exfoliativă orală poate fi o metodă importantă pentru depistarea leziunilor premaligne și maligne orale și periorale, dacă medicul clinician înțelege limitele și apreciază avantajele metodei. Algoritmul de citodiagnostic a fost îmbunătățit prin extrapolarea datelor obținute prin investigația histo-imunohistochimică

Citodiagnosticul rămâne una din cele mai rapide și puțin costisitoare metode de diagnostic și în patologia atât de complexa a patologiei orale și paraorale;

Citologia mucoasei orale în adevăratul sens nu poate fi pur exfoliativă, ci de abraziune, explicând unele rezultate fals-pozitive sau fals- negative din studiul nostru; populațiile celulare studiate sunt de tip bazal, parabazal, intermediar și superficial, interrelația dintre diferitele grupuri celulare fiind dependentă de particularitățile anatomice ale regiunii; prezența a numeroase scuame anucleate în frotiurile de planșeu oral sugerează foarte probabil malignitatea, așa cum am evaluat prin corelațiile datelor citologice cu cele imunohistochimice pentru studiul citokeratinelor;

Histogeneza și progresia leziunilor orale cu potențial de malignizare și a carcinomului oral pot fi comparabile cu leziunile cervicale uterine; aspectele citologice ale carcinomului ”in situ” și invaziv fiind foarte asemănătoare, influența micromediului oral modificând unii parametri citologici și de diateză a frotiurilor;

Puncția aspirativă a neoplaziilor capului și gâtului are importante restricții. Frotiurile sunt limitate, unele insuficiente pentru diagnostic. Există și frotiuri nesatisfăcătoare pentru a diferenția leziunile benigne de cele maligne, valoarea predictivă pozitivă calculată în studiul nostru fiind de 92%, iar valoarea predictivă negativă de 73%, indicând utilitatea tehnicii citologice în diagnosticul pre-, intra- și postoperator a leziunilor sferei orale și periorale;

Examinarea citologică nu poate oferi certitudinea gradingului tumoral, în special în neoplasmele cu celule fusiforme, datele citomorfologice trebuind să fie corelate cu cele histologice și de biologie moleculară (imunohistochimice);

Avantajele PAF depășesc totuși dezavantajele prin prelevarea facilă, manevrarea și prelucrarea rapidă a materialului citologic, mult mai ușor comparativ cu procedurile de rutină în tehnica histologică;

Citodiagnosticul se perfecționează printr-o strânsă colaborare a clinicianului cu citopatologul, prin furnizarea datelor clinico-imagistice caracteristice cazului cercetat;

Citologia exfoliativă a leziunilor orale nu înlocuiește biopsia, dar citodiagnosticul permite selectarea ariilor lezionale sau a locului de prelevare a biopsiilor. Citodiagnosticul are o valoare ridicată potrivit studiului nostru în precizarea recidivelor sau tumorii reziduale.

Poziția și rolul investigațiilor histologice :

Reperele histologice ale marginilor tumorale sunt de o deosebită importanță, acestea putând fi fi interpretate intraoperator și prin citodiagnostic;

Examenul biopsic al leziunilor orale și periorale este frecvent laborios, prin necesitatea prelevării unor fragmente mici, limitarea ariilor lezionale depinzând de topografia leziunii, vascularizație și inervația locului biopsiat;

Sunt preferate biopsii de exereză în mucoasa clinic normală pentru aprecierea marginilor microscopice;

Aprecierea tipului de celulă malignă în majoritatea neoplaziilor de țesuturi moi orale și periorale se realizează prin investigațiile histo-imunohistichimice;

Frecvența infecțiilor asociate leziunilor orale și periorale conduce la interpretări dificile atât de citodiagnostic cât și de histodiagnostic;

Nu este de neglijat prezența unor leziuni pseudo-tumorale întâlnite mai frecvent în regiunea investigată în studiul nostru, necesitând o maximă responsabilitate în evaluarea diagnostică atât la nivel clinic cât și paraclinic.

Rolul investigațiilor imunohistochimice:

Înțelegerea procesului de keratinizare în diferitele arii ale mucoasei orale, amănuntele istoricului clinic, localizarea și descrierea macroscopică a leziunilor sunt esențiale în interpretarea corectă a leziunilor carcinomatoase și precursoare de risc asociate cancerului oral;

Expresia podoplaninei poate reprezenta un factor independent în carcinogeneză și poate juca un rol deosebit de important în transformarea malignă a mucoasei orale; podoplanina este frecvent exprimată în leziunile premaligne orale, iar în conjuncție cu aspectul citologic și histologic poate reprezenta un biomarker predictiv pentru riscul de dezvoltare al cancerului oral;

Markerii ciclului celular folosiți în studiul nostru, respectiv Ki-67, p53, Cyclina D1 permit aprecierea potențialului invaziv al tumorilor, fiind factori independenți, de prognostic;

În studiul nostru, informația prognostică pentru clinician s-a bazat în special pe factorii prognostici: dimensiunile tumorii, staging-ul limfonodal și dimensiunile limfonodulilor extirpați; grading-ul histotipic evaluat imunohisto-chimic, comportamentul biotisular tumoral prin factori adiționali (necroza tumorală, fibroza, angio- și limfangiogeneza tumorală) ca factori independenți;

În carcinoamele orale, necroza este un fenomen comun întâlnit la peste 70% din cazuri, asociată cu un prognostic rezervat, fiind un factor independent;

Rata recurenței locale a scăzut după ce histologic s-a identificat invazia vasculară; factorii predictivi de răspuns la chimio-radioterapie sunt în studiul nostru p53 și bcl-2;

Există o interrelație între răspunsul la chimioterapie și fracțiunile fazei S în stadiul II și III de boală, activitatea proliferativă fiind apreciată prin indexul Ki 67.

Rolul virusului EB implică mai ales rolul proteinelor de latență ale virusului, în special CD21/ LMP1 ale căror proprietăți de imortalizare și transformare asupra celulelor limfoide sunt cunoscute. În carcinoamele orale se adaugă coparticiparea și a altor oncogene activate de diferiți cofactori implicați în carcinogeneză, mai ales tutunul și alcoolul, prin dezvoltarea unui fond inflamator cronic cu diskeratoză veruciformă sau displazii de diferite grade ale epiteliului oral. În cazurile examinate de noi, am constatat leziuni displazice de diferite grade intraepitelial la periferia tumorală sau leziuni precursoare leucoplazice sau lichenoide cu limfocite B infectate viral adiacente epiteliului oral.

În cursul carcinogenezei asociate cu infecție virală EB, se dezvoltă o populație clonală în sânul unei expansiuni policlonale de celule B infectate viral. De aici se deduce complexitatea variațiilor moleculare ale virusului EB infectant al celulelor limfoide.

Studiul nostru atrage atenția asupra asocierii infecției virale cu Ebv în leziuni non-neoplazice ale mucoasei orale fie de tip lichenoid sau hipeplazic pseudoepiteliomatos. Prezența limfocitelor infectate în migrare intraepitelial asociate cu alți cofactori carcinogeni poate sugera un risc crescut de inițiere a carcinomului oral la acești pacienți.

Un grup selectat de pacienți expuși la factori exogeni pot dezvolta leziuni precanceroase și canceroase orale, putând fi investigați prin screening citologic oral.

În studiul nostru CSC este cea mai frecventă tumoară malignă în regiune orală și periorală, afectând cu predilecție limba, buza și tegumentul, palatul fiind localizarea cea mai rar întîlnită. Incidența cancerului scuamocelular la bărbați este semnificativ mai mare în toate localizările față de incidența acestuia la femei, vârsta medie a pacienților la prima prezentare la medic fiind mult mai scăzută.

În cadrul studiului nostru, CBC s-a aflat pe locul doi ca frecvență în cadrul leziunilor tumorale maligne ale regiunii orală și periorală, având cea mai mare incidență dintre toate proliferările maligne tegumentare. Incidența CBC a fost mai crescută în mediul rural și semnificativ mai crescută la pacienții de sex feminin, femeile fiind afectate la o vârsta mai înaintată decât bărbații. Cele mai afectate structuri anatomice sunt tegumentul nasului, obrazului și pleoapele. Cel mai frecvent subtip în regiunea periorală este varianta nodulochistică, varianta superficială a CBC afectând cu predilecție tinerii.

Bibliografie

ANEXA 1

2.3.2. (continuare) Tipurile celulare identificate

pe preparatele citologoce de PAF și CA[66]

gigante multinucleate:

monomorfe:

– de tip histiocitic cu sau fără incluziuni de hemosiderină; celule tip Touton; histiocite mononucleare, ovalare sau celule alungite, fusiforme, cu nuclei uniformi; aceste celule se întâlnesc în unele histiocitoame fibroase benigne

– non-histiocitare: populație mixtă de celule de tip rotund, de dimensiuni mici; se pot întâlni în rabdomiosarcoame alveolare

pleomorfe: – cu aspect „histiocitic“, cu citoplasmă palidă, cu granulații și detritusuri intracitoplasmatic, cu nuclei ovalari, unele cu aspect de celulă alungită, fusiformă, atipii nucleare doar în formele tumorale de histiocitoame fibroase maligne de grad III și IV; prezența matricei mixoide poate sugera un fibromixosarcom

– celule gigante fără aspect caracteristic „histiocitic“: se întâlnesc și în sarcoame de înaltă malignitate (liposarcoame, leiomiosarcoame, rabdomiosar-oame); uneori diagnosticul diferențial al celularității cu prezența de celule gigante aduce în discuție un diagnostic diferențial cu melanomul malign.

Celule mici rotunde:

cu corpi limfoglandulari: – în proliferările limfoide

rabdomioblaste (celule rotunde cu citoplasmă acidofilă și nucleu excentric; nuclei neregulați și cromatină densă); se pot întâlni în rabdomiosarcoame

matrice în matrice mixoidă: – se face diagnosticul diferențial între condrosarcomul extrascheletal mixoid și rabdomiosarcomul botrioid

în pseudorozete: – se face diagnosticul diferențial între neuroblastom și PNET

PAF celule mici rotunde, monomorfe: se face diagnosticul diferențial cu un sarcom Ewing, cu rabdomiosarcomul slab diferențiat și neurobastomul, de asemenea cu tumora cu celule mici rotunde de tip desmoplazic

Celule fusiforme:

fie în grupuri sau izolate – de tipul fibroblastelor cu asociere de filamente matriciale, colagen, detritusuri celulare, fragmente mici capilare, celule musculare striate atrofice; se pot întâlni în tumora desmoidă; uneori, în fasciita nodulară apare o matrice mucoidă sau fibrilară pe frotiu, conținând celule asemănătoare celulelor ganglionare, limfocite, plasmocite, macrofage încărcate cu grăsime

de tip fibrobalst-like se asociază cu histiocite încărcate cu grăsime sau hemosiderină, pot fi numeroase și se întâlnesc în histiocitomul fibros benign; când au aspect bipolar, monomorf, sugerează dermatofibrosarcomul protuberans; pot fi și cu aspect monomorf bipolar asociate cu mastocite, calcificări și cordoane de celule „epitelial like“ în sarcomul sinovial; unele sarcoame slab diferențiate pot avea celule fibroblast like cu nuclei polimorfi, impunându-se diagnosticul diferențial între fibrosarcomul pleomorf, schwannom-ul malign și leiomiosarcomul

celule non-fibroblastice: au citoplasmă granulară, margini celulare nete în rabdomiom sau neregulate în tumora cu celule granulare

grupuri de celule fusiforme

fie de tip ramificat, sincițial-like cu margini fibrilare, nuclei în palisadă și corpi Verocay, întâlnite în scwanomul bening

fie în grupuri cu margini bine delimitate citoplasma celulelor fiind acidofilă, iar nucleii monomorfi, aspecte întâlnite în leiomiosarcomul cu grad scăzut de malignitate

celule epitelioide sunt:

– celule mari, fin vacuolare:

cu citoplasmă bine conservată, corpul celular este trapezoid, nucleu veziculos cu nucleol, iar matricea extracelulară cu aspect mucoid sugerează cordomul

citoplasma fragilă și nucleul veziculos cu nucleol poate sugera un sarcom alveolar de părți moi

celule de talie medie, omogene

cu citoplasmă conservată, în grupuri compacte, unele celule seamănă cu fibroblastele, intercelular poate exista o matrice mucoidă redusă, aspect întâlnit în sarcomul epitelioid; alteori celulele sunt poligonale libere sau în grupuri, cu nuclei neregulați, în angiosarcom

sinciții, cu citoplasme fragile, nuclei liberi și nucloli slab vizibili, se pot întâlni în paragangliom

tumori mixoide nu cuprind celule adipoase, gigante, mici rotunde sau epitelioide; au matrice mixoidă cu macrofage ocazional (chistul ganglionar); celule stelate sau fusiforme rare cu nuclei uniformi (mixomul intramuscular); celule fusiforme mari în număr mic sau moderat cu nuclei ovoizi și fragmente capilare (fibromixosarcomul de grad I); celule fusiforme mari în număr moderat cu nuclei polimorf (fibromixosarcom de grad II); celule fusiforme mici în număr moderat cu nuclei monomorfi (sarcomul sinovial mixoid).

Bibliografie

ANEXA 1

2.3.2. (continuare) Tipurile celulare identificate

pe preparatele citologoce de PAF și CA[66]

gigante multinucleate:

monomorfe:

– de tip histiocitic cu sau fără incluziuni de hemosiderină; celule tip Touton; histiocite mononucleare, ovalare sau celule alungite, fusiforme, cu nuclei uniformi; aceste celule se întâlnesc în unele histiocitoame fibroase benigne

– non-histiocitare: populație mixtă de celule de tip rotund, de dimensiuni mici; se pot întâlni în rabdomiosarcoame alveolare

pleomorfe: – cu aspect „histiocitic“, cu citoplasmă palidă, cu granulații și detritusuri intracitoplasmatic, cu nuclei ovalari, unele cu aspect de celulă alungită, fusiformă, atipii nucleare doar în formele tumorale de histiocitoame fibroase maligne de grad III și IV; prezența matricei mixoide poate sugera un fibromixosarcom

– celule gigante fără aspect caracteristic „histiocitic“: se întâlnesc și în sarcoame de înaltă malignitate (liposarcoame, leiomiosarcoame, rabdomiosar-oame); uneori diagnosticul diferențial al celularității cu prezența de celule gigante aduce în discuție un diagnostic diferențial cu melanomul malign.

Celule mici rotunde:

cu corpi limfoglandulari: – în proliferările limfoide

rabdomioblaste (celule rotunde cu citoplasmă acidofilă și nucleu excentric; nuclei neregulați și cromatină densă); se pot întâlni în rabdomiosarcoame

matrice în matrice mixoidă: – se face diagnosticul diferențial între condrosarcomul extrascheletal mixoid și rabdomiosarcomul botrioid

în pseudorozete: – se face diagnosticul diferențial între neuroblastom și PNET

PAF celule mici rotunde, monomorfe: se face diagnosticul diferențial cu un sarcom Ewing, cu rabdomiosarcomul slab diferențiat și neurobastomul, de asemenea cu tumora cu celule mici rotunde de tip desmoplazic

Celule fusiforme:

fie în grupuri sau izolate – de tipul fibroblastelor cu asociere de filamente matriciale, colagen, detritusuri celulare, fragmente mici capilare, celule musculare striate atrofice; se pot întâlni în tumora desmoidă; uneori, în fasciita nodulară apare o matrice mucoidă sau fibrilară pe frotiu, conținând celule asemănătoare celulelor ganglionare, limfocite, plasmocite, macrofage încărcate cu grăsime

de tip fibrobalst-like se asociază cu histiocite încărcate cu grăsime sau hemosiderină, pot fi numeroase și se întâlnesc în histiocitomul fibros benign; când au aspect bipolar, monomorf, sugerează dermatofibrosarcomul protuberans; pot fi și cu aspect monomorf bipolar asociate cu mastocite, calcificări și cordoane de celule „epitelial like“ în sarcomul sinovial; unele sarcoame slab diferențiate pot avea celule fibroblast like cu nuclei polimorfi, impunându-se diagnosticul diferențial între fibrosarcomul pleomorf, schwannom-ul malign și leiomiosarcomul

celule non-fibroblastice: au citoplasmă granulară, margini celulare nete în rabdomiom sau neregulate în tumora cu celule granulare

grupuri de celule fusiforme

fie de tip ramificat, sincițial-like cu margini fibrilare, nuclei în palisadă și corpi Verocay, întâlnite în scwanomul bening

fie în grupuri cu margini bine delimitate citoplasma celulelor fiind acidofilă, iar nucleii monomorfi, aspecte întâlnite în leiomiosarcomul cu grad scăzut de malignitate

celule epitelioide sunt:

– celule mari, fin vacuolare:

cu citoplasmă bine conservată, corpul celular este trapezoid, nucleu veziculos cu nucleol, iar matricea extracelulară cu aspect mucoid sugerează cordomul

citoplasma fragilă și nucleul veziculos cu nucleol poate sugera un sarcom alveolar de părți moi

celule de talie medie, omogene

cu citoplasmă conservată, în grupuri compacte, unele celule seamănă cu fibroblastele, intercelular poate exista o matrice mucoidă redusă, aspect întâlnit în sarcomul epitelioid; alteori celulele sunt poligonale libere sau în grupuri, cu nuclei neregulați, în angiosarcom

sinciții, cu citoplasme fragile, nuclei liberi și nucloli slab vizibili, se pot întâlni în paragangliom

tumori mixoide nu cuprind celule adipoase, gigante, mici rotunde sau epitelioide; au matrice mixoidă cu macrofage ocazional (chistul ganglionar); celule stelate sau fusiforme rare cu nuclei uniformi (mixomul intramuscular); celule fusiforme mari în număr mic sau moderat cu nuclei ovoizi și fragmente capilare (fibromixosarcomul de grad I); celule fusiforme mari în număr moderat cu nuclei polimorf (fibromixosarcom de grad II); celule fusiforme mici în număr moderat cu nuclei monomorfi (sarcomul sinovial mixoid).