Compusi Bioactivi CU Activitate Antioxidantă

TEZA DE ABILITARE

COMPUȘI BIOACTIVI CU ACTIVITATE ANTIOXIDANTĂ ȘI APLICAȚII BIOMEDICALE

Conf. univ. dr. Simona Ioana Vicaș

Domeniul de doctorat

BIOLOGIE

ORADEA

2016

CUPRINS

SECȚIUNEA A

REZUMAT

În teza de abilitare sunt prezentate rezultatele activității mele științifice și academice postdoctorale desfășurate în cadrul Universității din Oradea din anul 2007 până în prezent, precum și planurile de dezvoltare și evoluție a carierei.

Partea I (Realizări științifice și profesionale) a tezei de abilitare cuprinde 3 capitole. În primul capitol intitulat Compușii bioactivii (acizi fenolici și flavonoide) și capacitatea lor antioxidantă și anticancerigenă din planta semiparazită Viscum album sunt prezentate cele mai relevante realizări personale în cercetarea științifică postdoctorală, descriind rezultatele semnificative obținute cu privire la compoziția chimică a plantei semiparazite, vâscul (Viscum album), in funcție de arborele gazdă pe care îl parazitează. Compușii bioactivi care au fost analizați sunt metaboliți secundari de tipul acizilor fenolici și flavonoide, metaboliți care la ora actuală sunt de mare interes datorită proprietăților lor biologice și farmaceutice (activitate antioxidantă și anticancerigenă). În prima partea a acestui capitol, sunt descrise caracteristicile morfologice ale plantei semiparazite în funcție de arborele gazdă pe care îl parazitează, precum și rezultatele obținute cu privire la conținutul în pigmenți asimilatori (clorofile și carotenoide) atât în funcție de solventul de extracție folosit precum și în funcție de arborele gazdă parazitat. În continuare, este descrisă metoda de extracție a compușilor bioactivi, și analiza cantitativă și calitativă a extractelor de vâsc prin metoda HPLC-PDA în funcție de arborele gazdă pe care îl parazitează. În următorul subcapitol sunt prezentate rezultatele obținute în urma studiului activității antioxidante a extractelor de văsc, atât în funcție de arborele gazdă parazitat cât și în funcție de perioada de recoltare (Mai, Iulie, Decembrie). Toate aceste date cu privire la activitatea biologică sunt corelate cu rezultatele obținute în cazul screening-ului de compuși polifenolici totali. În ultimile subcapitole, extractul de vâsc selectat în funcție de compoziția în compuși bioactivi și a capacității antioxidante a fost testat in vitro pe linii celulare tumorale pentru a evidența efectul lor citotoxic, dar și pentru a observa dacă sunt inductori ai enzimelor de Faza II (GST și QR).

Capitolul II, abordează un alt tip de metaboliți secundari, și anume glucozinolații (GLS) prezenți în special în legumele din familia Brassicaceae. Acești compuși prezintă un interes foarte crescut, deoarece produșii lor de hidroliză (izotiocianații) sunt compuși puternici anticancerigeni. Astfel au fost selectate 5 legume (broccoli, conopidă, guile, varză albă și roșie) crescute în sistem organic și convențional. După extracția lor și cuantificarea glucozinolaților prin HPLC-PDA, cu ajutorul analizei chemometrice s-a demonstrate că glucozinlații pot fi considerați biomarkeri de diferențiere a legumelor crescute în sistem organic, respectiv convențional. De asemenea legumele au fost evaluate și prin spectroscopia HATR/FT-MIR, o metodă rapidă, ieftină și neinvazivă care oferă informații valoroase cu privire la amprenta extractelor, cu scopul de a prezice și cuantifica glucozinolații. S-au optimizat metode de extracție a compușilor bioactivi din aceste legume, pentru că pe lângă glucozinolați, ele conțin și alți compuși bioactivi de tipul polifenolilor, evaluându-se capacitatea antioxidantă a acestora. În următorul subcapitol sunt prezentate rezultatele obținute în cazul cuantificării GLS în timpul procesului de fermentare lactică în cazul a 4 legume (broccoli, conopidă, varza alba și roșie) în funcție de două tratamente aplicate. În ultimul subcapitol sunt prezentate rezultatele obținute cu privire la dinamica GLS din stadiul de semințe la germeni, evidențiindu-se perioada optimă de recoltarea a acestora astfel încât să corespundă unui conținut cât mai ridicat în compuși bioactivi.

Capitolul III din teza de abilitare cuprinde rezultatele cercetărilor realizate cu colegii, atât din cadrul Universitatii din Oradea cât și cu colegii din alte centre universitare. Primul subcapitol abordează un alt compus bioactiv, și anume licopenul din mai multe varietăți de roșii, rezultatele obținute combinate cu chemometria au condus la obținerea unor informații valoroase cu privire la discriminarea diferitelor soiuri de tomate. O altă temă abordată este determinarea capacității antioxidante a extractelor obținute din semințe de la diferite varietăți de struguri. În următorul subcapitol am testat capacitatea antioxidantă a două plante medicinale (Salviae sp. și Plantago sp., recoltate din două zone diferite), și conținutul în compuși bioactivi de tipul polifenolilor și flavonoidelor totale. Rezulatetele obținute au fost evaluate prin chemometrie, iar informațiile obținute au demonstrat că aceste plante medicinale sunt surse bogate în antioxidanți, putând fi aplicate cu success în medicină și farmacologie. Următoarele subcapitole sunt axate pe testarea capacității antioxidante din biofluide (plasmă și lapte). Astfel în cazul experimentelor in vivo au fost testate diferite suplimente alimentare la șobolanii Wistar, si s-a evaluat statutul antioxidant al plasmei. În schimb, stabilitatea oxidativă a laptelelui de oaie a fost testată în urma suplimentării dietei oilor bazata pe siloz de iarba sau de porumb, suplimentată sau nu cu semințe de camelină (Camelina sativa).

Cu privire la realizările profesionale după obținerea titlului de doctor, am publicat 3 cărți ca unic autor, 14 lucrări științifice în reviste indexate ISI, 38 articole în reviste indexate în baze de date internaționale și multe studii prezentate la evenimente științifice internaționale. Un număr mare de citări (peste 100, Indice Hirsch = 6 conform Google Academic, Indice Hirsch = 4 conform Web of Science) demonstrează vizibilitatea internațională și interesul altor cercetători din întreaga lume pentru rezultatele cercetărilor abordate de colectivul nostru. De asemenea, am coordonat ca director, 3 proiecte de cercetare caștigate prin competiție națională, și am participat ca membru în proiecte de cercetare naționale și internaționale.

Cea de-a doua parte a tezei prezintă planurile de evoluție și dezvoltare științifică, profesională și academică. Planul de dezvoltare a carierei mele științifice are ca prim obiectiv creșterea calității științifice, vizibilității și recunoașterii naționale și internaționale prin valorificarea rezultatelor cercetării în jurnale ISI și BDI. Activitatea de cercetare va continua cu studiul compușilor bioactivi, lărgind studiile pe o gamă cât mai largă de compuși bioactivi, cu accent pe dinamica lor în funcție de dezvoltarea plantelor sau în urma diverselor tehnici de procesare, cu beneficii pentru sănătate. O abordare noua în activitatea mea de cercetare va fi axată pe domeniul nanobiotehnologiilor, încercând a găsi produse inovatoare cu aplicabilitate în industria alimentară și medicină.

Din punct de vedere al activității academice, voi corela rezultatele din cercetare cu sistemul educațional, promovarea inovării în domeniul cercetării aplicative în strânsă legătură cu nevoile mediului socio-economic.

Ultima parte a tezei cuprinde referințele bibliografice pe baza cărora s-a editat teza de abilitare, prezentate în ordine alfabetică.

ABSTRACT

This Habilitation Thesis present the results of my postdoctoral scientific and academic activities performed at University of Oradea, from 2007 to present, as well as my career evolution and development plans.

The first Part of Habilitation Thesis (The Scientific and Professional Achievements) consists in three chapters. In the first chapters, called Bioactive compounds (phenolic acid and flavonoids), antioxidant and anticancer effects of hemiparasite plant, Viscum album, the most relevant postdoctoral achievements in the research activities are described, related to the most semnificative results on the chemical composition of hemiparasitic plants, mistletoe (Viscum album) depending on the host trees. The bioactive compounds which were analysed are secondary metabolites from phenolic acids and flavonoids classes, metabolites that nowadays present very high interest due to their biological and pharmaceutical effects, such as antioxidant and anticancer effects. In the first part of this chapter, is described the morphological characteristic of mistletoe depending on the host trees, as well as the results regarding to the content in assimilatory pigments (chlorophylls and carotenoids) according to the type of solvent extraction and host trees. Then, the extraction method of bioactive compounds is presented along with qualitative and quantitative analysis of mistletoe extracts using HPLC-PDA related to host trees of this plant. In the next subchapter, the results obtained during the evaluation of antioxidant capacity of mistletoe extracts related to host trees and the harvest periods (May, July and December) are presented. All the data of biological activities obtained were correlated with the results obtained from the screening of total polyphenols content. In the next subchapters, the mistletoe extract selected according to the bioactive compounds composition and its antioxidant capacity, was tested in vitro on tumor cells to emphasize the cytotoxic effect, but also to see if this extract can be used as chemoprotective agents against cancer by induction of Phase II enzymes (GST and QR).

In the Chapter II, another type of secondary metabolites, glucosinolates (GLS), which are presents in generally in Brassicaceae family, were investigated. These compounds are of highest interest due to their hydrolysis products (isothiocyanates) which are powerful anticancer agents. Five vegetables belongin from Brassicaceae family (broccoli, cauliflower, kohlrabi, white and red cabbage) were selected, grown in the organic and conventional farmer. After the extraction and quantification of GLS using HPLC-PDA and by using chemometric analysis, it was demonstrated that these compounds are biomarkers that differentiate the vegetables grown under organic and conventional practices. Also, the Brassica extracts were evaluated from point of view of HATR/FT-Mir spectroscopy, fast, cheap and noninvasive method, which give use usefull information regarding to fingerprint, to predict and to quantify the glucosinolate composition of Brassica vegetables. The extraction method of bioactive compounds from Brassica vegetables has been optimised, as beside of GLS, there are some other bioactive compounds from polyphenolic class, their antioxidant capacity being also evaluated. In the next chapter were presented the results obtained by quantification of GLS during the lactic fermentation of 4 vegetables (broccoli, cauliflower, white and red cabbage) based on two different treatments. In the last subchapter, the research results regarding to the GLS dynamics starting from the seed to sprouts, highlighting the proper harvesting period in order to obtain the highest content of bioactive compounds.

The Chapter III is focused on other type of bioactive compounds, namely lycopen, from different tomato cultures, the results being combined with chemometric analysis and revealing useful information regarding to the discrimination of different tomate cultivars. Another topic was to evaluate the antioxidant capacity of grape seed from different grapes cultivars. In the next chapter, the antioxidant capacity of two different medicinal plants (Salviae sp.and Plantago sp.) related to the composition in bioactive compounds, like polyphenols and flavonoids, are investigated. The data obtained in relation to chemometric analysis give use useful information, showing that these plants are rich in antioxidants, and can be used successfully in medicine and pharmacology. The next subchapters are focused on the investigation of antioxidant capacity from different biofluids (plasma and milk). Thus, in the in vivo experiments, different food supplements were tested on Wistar rats, and then the antioxidant status of plasma was investigated. On the other hand, oxidative stability of ewe milk was investigated after the maize- and grass-silage diets of ewe was supplemented with camelina seed (Camelina sativa L.).

Regarding to professional achievements, after I finished the PhD thesis, I published 3 books as main author, 14 manuscripts in different ISI journals, 38 articles in BDI journals, and many papers presented at international scientific events. A high number of citation (over 100, Hirsch Index = 6 according to Google academic or Hirsh Index =4 according to Scopus) demonstrated the international visibility and the interest of researchers from the world for our topics and research results obtained in our team.

Also, I coordinated three national projects as manager, and I participated to other national and international projects as member.

In the second part of my Habillitation Thesis, I presented my plans for scientific, professional and academic evolution and development. The development plan of my scientific career has as main objective the increases of scientific quality, the visibility and the national and international recognition by valorization of my research results in ISI and BDI journals. My research activity will be continued with other studies on bioactive compounds, focused on their dynamic during different food processing. A new approach in my research activity will be focused on the nanobiotechnology areas, aiming to find innovative products with practical applicability on food industry and medicine.

From the point of view of my academic activity, I will correlate the research results with educational system, promoting the innovation and applicative research areas strongly related with the socio-economic needs.

The last part of Habilitation thesis includes the references presented in alphabetical order.

SECȚIUNEA B

REALIZĂRI ȘTIINȚIFICE, PROFESIONALE ȘI ACADEMICE

B1. I. REALIZĂRI ȘTIINȚIFICE

CAPITOLUL I

COMPUȘII BIOACTIVII (ACIZI FENOLICI ȘI FLAVONOIDE) ȘI CAPACITATEA LOR ANTIOXIDANTĂ ȘI ANTICANCERIGENĂ DIN PLANTA SEMIPARAZITĂ VISCUM ALBUM

În anul 2007, am finalizat teza de doctorat cu titlul ” Analiza biochimică și evaluarea activității unor compuși fitochimici din clasa flavonoidelor” sub conducerea d-nei Prof. dr. Carmen Socaciu, in specializarea Biotehnologii. Pe baza cunoștiințelor dobândite pe parcursul stagiului doctoral, am început o activitate de cercetare interdisciplinară pe care o prezint structurată în trei capitole. În primul capitol sunt sintetizate rezultatele obținute, având ca studiu planta semiparazită Viscum album, care crește pe diferiți arbori gazdă din punct de vedere al compușilor bioactivi de tipul acizilor fenolici și flavonoidelor, precum și activitatea lor antioxidantă și anticancerigenă. Acest studiu de cercetare s-a realizat în cadrul proiectului PN – II – ID – PCE – 2008 – 2, ”Evaluarea in vitro a efectelor antioxidante și anticancerigene a unor extracte de vâsc european (Viscum album) caracterizate prin markeri taxonomici”, cod CNCSIS 696, proiect câștigat prin concurs cu un punctaj de 93,93. Rezultatele obținute au fost valorificate prin publicarea in 3 articole ISI (din care un articol a fost premiat de CNCSIS la ”rezultatele cercetări tip articol”), 9 articole în jurnale indexate în baze de date internaționale, un capitol de carte în editura InTech și participări la 2 Congrese internaționale.

Articole ISI:

Vicaș S., Rugină D., Leopold L., Pintea A., Socaciu C., 2011 HPLC Fingerprint of Bioactive Compounds and Antioxidant Activities of Viscum album from Different Host Trees, Notulae Botanicae, 39(1), 48-57. (http://www.notulaebotanicae.ro/index.php/nbha/issue/view/159) (IF=0.652).

Vicas S., Rugina D., Socaciu C., 2011 Comparative Study about Antioxidant Activities of Viscum Album from Different Host Trees, Harvested in Different Seasons, Journal of Medicinal Plant Research, 5(11), 2237-2244. (http://www.academicjournals.org/journal/JMPR/article-abstract/4B70C8121233) (IF=0.224).

Vicas S., Prokisch J., Rugina D., Socaciu C., 2009, Hydrophilic and Lipophilic Antioxidant Activities of Mistletoe (Viscum album) as determined by FRAP method, Notulae Botanicae, 37 (2), 112-116. (http://www.notulaebotanicae.ro/ index.php/nbha/issue/ view/120) (IF=0).

Articole BDI:

Vicas S.I., Rugina D., Sconta Z., Pintea A., Socaciu C., 2011, The In Vitro Antioxidant and Anti-Proliferative Effect and Induction of Phase II Enzymes by a Mistletoe (Viscum album ) Extract, Bulletin UASVM, 68 (2), 482-491. (http://journals.usamvcluj.ro/index.php/agriculture/article/view/6603).

Ruginǎ D., Vicaș S.I, Petran M., Pintea A., Bunea A., Socaciu C., 2010, Preliminary Research Regarding The Antitumor Effects Of Mistletoe on A2780 Cells, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, Cluj-Napoca, 67 (1-2), 429-436. (http://journals.usamvcluj.ro/index.php/zootehnie/article/view/5336).

Vicas S.I., Laslo V., Pantea S., Bandici GE., 2010, Chlorophyll and Carotenoids Pigments from Mistletoe (Viscum Album) Leaves using Different Solvents, Analele Universitatii din Oradea, Fascicula Biologie, TOM XVII/2, 213-218. (http://doaj.org/toc/cf37ab550a47476ebb0849a9413aff4f/TOM%20XVII).

Vicas S., Rugina D.,Prokisch J., Socaciu C., 2009, In vitro evaluation of antioxidant activity of leaves and stems from European mistletoe (Viscum album), Lucrări Științifice, vol. 51, seria Agronomie, USAMV Iasi, 21-26. (http://www.revagrois.ro/index.php?lang=ro&pagina=pagini/revista_2009_1.html).

Vicas S., Rugina D., Pantea S., Socaciu C., 2009, The Morphological Features and UV-VIS Analysis of Some Taxonomic Markers of Genus Viscum, Bulletin UASVM, Agriculture, nr.66 (1-2)/2009, Cluj-Napoca 193-200. (http://journals.usamvcluj.ro/index.php/agriculture/article/view/3770).

Vicaș S., Rugina D., Socaciu C., 2008, Antioxidant activities of Viscum album’s leaves from various host trees, Bulletin UASVM, Agriculture, Cluj-Napoca, 65 (1), 327-332. (http://journals.usamvcluj.ro/index.php/agriculture/issue/view/47).

Vicaș S., Prokisch J., 2008, Ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay for the evaluation of antioxidant activity of mistletoe extracts, “Natural resources and sustainable development”of the Faculty of Agriculture University of Debrecen, Journal of Agricultural Sciences, 65-69 (ISSN 1588 – 8363).

Vicaș S., Socaciu C., 2007, The biological activity of european mistletoe (Viscum album) extracts and their pharmaceutical impact, Bulletin UASVM, Agriculture, Cluj-Napoca, 63-64, 217 -221. (http://journals.usamvcluj.ro/index.php/ agriculture/article/view/1344).

Vicaș S., Prokisch J., Socaciu C., 2007, Variation in antioxidant activity of fresh and dried leaves of Viscum album using automatic FRAP assay, Bulletin UASVM, Agriculture, Cluj-Napoca, 63-64, 367. (http://journals.usamvcluj.ro/ index.php/agriculture/issue/view/67).

Capitol de carte in editura In Tech

Vicas S. I., Dumitrita Rugina and Carmen Socaciu (2012). Antioxidant Activity of European Mistletoe (Viscum album), Phytochemicals as Nutraceuticals – Global Approaches to Their Role in Nutrition and Health, Dr Venketeshwer Rao (Ed.), ISBN: 978-953-51-0203-8, InTech. (http://www.intechopen.com/books/phytochemicals-as-nutraceuticals-global-approaches-to-their-role-in-nutrition-and-health/antioxidant-activity-of-mistletoe).

Participări la Congrese Internaționale

Vicaș S., Rugina D., Prokisch J., Socaciu C., 2009, Comparative antioxidant activity of European Mistletoe (Viscum album) from different host trees, The FEBS Journal –Life’s molecular interaction, vol.276 (1), p. 130 – 34 th FEBS Congress, July 4-9, 2009, Prague Czech Republic (P8-2972).

Vicaș S., Rugina D., Prokisch J., Pintea A., Socaciu C., 2009, Antioxidant activity of European Mistletoe (Viscum album) from different host trees, Romanian Journal of Biochemistry, vol. 46 Supplementa, p.138. SRBBM Congress 1-3 octombrie, Cluj-Napoca (P 68).

I.1 Caracterizarea morfologică, măsurători biometrice și determinarea pigmenților asimilatori (clorofila și carotenoide) din vâsc (Viscum album)

I.1.1. Context

Specia Viscum album face parte din Încrengătura Magnoliophyta, Clasa Magnoliopsida, Ordinul Santalales. Traditional, genul Viscum a fost plasat in familia Viscaceae, dar studiile genetice recente realizate de catre APG II (The Angiosperm Phylogeny Group, 2003) au incadrat aceasta planta in familia Santalaceae. Aria de distribuție a speciei Viscum album L., vâscul european este Europa Centrală (de la Africa de Nord până la sudul Angliei și sudul Scandinaviei), sud-vestul și estul Asiei până în Japonia.

Populația europeană de vâsc este împărțită în trei subspecii care au gazde diferite:

V. album L. ssp. album (ssp. platyspermum) care crește pe stejari, fagi, frasini, cireși, pruni, piersici, caiși, arțari;

V. album L. ssp abietis care crește pe speciile de pini;

V. album L. ssp laxum care crește pe pini, rar pe brazi.

În Asia de Est se întâlnește specia de V. album L. variația colaratum Ohwi (Becker H., 2004).

Distribuția în România. Vâscul este răspândit în toată țara mai ales în Transilvania (toate județele, dar în special Cluj, Sălaj, Bihor, Brașov, Mureș), Moldova (Suceava, Botoșani, Neamț, Iași, Vrancea, Vaslui), Delta Dunării, mai puțin în județele de deal din Muntenia și Oltenia (Crăciun F. și colab., 1991).

I.1.2. Obiective

În prima parte a acestui studiu, s-a urmărit dacă diferiți arbori gazdă (Acer campestre, Mallus domestica, Fraxinus excelsior, Populus nigra and Robinia pseudoacacia) înfluențează parametrii morfologici vegetativi și biometrici ai aceeași speciei de vâsc (V. album L. ssp. album). În partea a doua, cantitatea de clorofilă a și b, precum și conținutul în carotenoide a fost cuantificat din aceeași specie de vâsc, dar care crește pe arbori gazdă diferiți. Influența a trei solvenți (acetonă, dimetilformamidă și metanolul) asupra extracției pigmenților asimilatori a fost investigată.

I.1.3. Materiale și metode

Materialul vegetal

Vâscul (Viscum album) a fost prelevat în diferite luni (decembrie, mai, iunie, iulie, august, septembrie) pe parcursul anilor 2008 și 2009 din diferite locatitati din Nord-Vestul Transilvaniei (Borod – Gheghie region) din Romania. Probele au fost denumite in conformitate cu arborele gazdă pe care îl semi-parazitează, astfel: VAA, vâscul care parazitează jugastrul (Acer campestre); VAF vâscul care parazitează frasinul (Fraxinus excelsior); VAP vâscul care parazitează plopul (Populus nigra); VAM vâscul care parazitează mărul (Mallus domestica); VAR vâscul care parazitează salcâmul (Robinia pseudoacacia).

Studii morfologice

Studiile morfologice au cuprins atât partea vegetativă cât și florală a vâscului. Partea vegetativă a inclus tulpinița (stem), tipul ei de ramificare, culoarea și învelișul exterior. În cazul frunzelor (20 pentru fiecare variantă), textura, forma, lungimea, lățimea și aria au fost investigate cu ajutorul unui instrument, Area Meter AM 300 (ADC BioScientific Ltd.). De asemenea, tipul, culoarea, forma fructelor, precum și numărul de semințe a fost investigat.

Cuantificarea pigmenților verzi din vâsc și a catotenelor totale utilizând diferiți solvenți

Pentru extracția clorofilelor (a și b), 50 mg de frunze proaspete au fost omogenizate cu 5 ml de solvent, cu ajutorul unui omogenizator (SilentCrusher M instruments, Heidolph). S-au folosit următorii solvenți: acetonă 80%, dimetilformamida (DMF) și metanolul. Probele au fost apoi centrifugate la 12000 rpm, timp de 10 minute, la 40C. Supernatantul a fost separat și conținutul în pigmenți verzi a fost determinat prin măsurarea absorbanței extractelor la 663.6 nm, 663.8 nm, și 665.2 nm pentru clorofila a, 646.6 nm, 646.8 nm și 652.0 nm pentru clorofila b cu ajutorul unui spectrofotometru UV-Vis Shimadzu mini-1240 la 24, 48 și 72 de ore. Rezultatele obținute în urma măsurătorilor spectrofotometrice, au fost incluse în diferite relații matematice pentru cuantificarea pigmenților asimilatori, care s-au exprimat ca mg clorofilă/g țesut proaspăt. Ecuațiile matematice folosite, diferă în funcție de solvent și sunt prezentate în Tabelul I.1. Pentru determinarea carotenelor totale, s-au folosit alte relații matematice care sunt prezentate în Tabelul I.1.

Tabel I.1

Ecuații pentru determinarea clorofilei a si b și a carotenelor totale

I.1.4. Rezultate și discuții

Vâscul este un arbust semi-parazit, care poate atinge dimensiuni cuprinse între 15-80 cm lungime, si care crește și se dezvoltă pe tulpinile unor arbori pe care se fixează cu ajutorul haustorilor. Datele din literatură au pus în evidență că Viscum album poate parazita 452 de arbori gazdă diferiți (96 de genuri si 44 de familii). De exemplu, pentru V. album ssp. album au fost identificați 190 de arbori gazdă diferiți, pentru V. album ssp. abieties 10 arbori gazdă și pentru V. album ssp. austriacum 16 gazde sunt cunoscute (Barney și colab., 1998; Zuber, 2004). Tulpina este ramificată dichotomic, fiind de culoare verde-gălbui. Frunzele sunt persistente, sempevirescente, dispuse opus, groase, pieloase la pipăit de formă obovat-alungită, lungi de 2 până la 8 cm și late de 0,8-2,5 cm, cu marginile întregi, sesile și de culoare verde-gălbuie. Au vârful rotunjit iar pe partea inferioară se găsesc 4-5 nervuri vizibile. In frunzele tinere, nervurile sunt vizibile pe ambele laturi, în timp ce, în cele bătrâne se observă doar pe una din laturi (Bussing, 2000). Florile sunt mici (1-3 mm diametru), galbene-verzui, tetramere, unisexuat-dioice, dispuse câte 3-5 în inflorescențe cimoase dicaziale pe vârful ramurilor. Înflorește in lunile martie-aprilie. Fructul este o bacă falsă, de formă sferică și cca. 8 mm în diametru, de culoare albă, conține în interior o substanță cleioasă numită viscină și 1-2 semințe încastrate in pulpa gelatinoasă a fructului, care se maturizează în luna Decembrie.

Rezultatele investigațiilor au demonstrat că nu există diferențe semnificative între varietățile luate în studiu (Vicas și colab., 2009a). Din punct de vedere statistic nu au fost semnalate diferențe semnificative cu privire la lățimea și aria frunzelor. Singurele diferențe semnificative au fost înregistrate în cazul lungimii frunzelor de vâsc. De exemplu s-au inregistrat diferențe semnificative între frunzele de VaF vs. VaM, VaM vs. VaA, VaM vs. VaP, and VaM vs. VaR. Cea mai mare lungime a frunzelor s-a inregistrat în cazul frunzelor de vâsc care cresc pe măr (M. domestica, VaM) (75.58 ± 6.09 mm). Frunzele de vâsc care cresc pe salcâm (R. Pseudoacacia), au prezentat cea mai mică lungime a frunzelor (52.98 ± 9.05 mm). Aria frunzelor de vâsc, variază între 643.56 si 864.78 mm2, in timp ce lățimea frunzelor variază între 13.27 si 16.85 mm. Raportul dintre lungime/lățime variază între 3.11 pentru VAR si 5.68 pentru VAM (Vicas și colab., 2009a).

În paralel cu caracterizarea morfologică și biometrică a vâsc-ului s-a realizat și cuantificarea pigmenților verzi și a carotenoidelor totale din frunzele și tulpinița de vâsc (Vicas și colab., 2010), utilizând diverși solvenți organici (acetona 80%, DMF (N,N –dimethylformamide) si metanol). În Figura I.1 se prezintă spectrul UV-Vis (400-700 nm) a extractelor metanolice obținute din frunzele și tulpinițele de vâsc care cresc pe măr (VAM). Spectroscopia UV-Vis este o tehnică foarte simplă, ieftină și ușor de utilizat pentru a identifica și cuantifica principalele fitochimicale (de exemplu, carotenoide, antociani, clorofile, pigmenții flavonoidici, derivații fenolici) (Socaciu și colab., 2011). Așa cum se prezintă și în Figura I.1, atât în cazul frunzelor cât și a stem-ului de vâsc se observă absorbții în domeniul UV-Vis, specifice derivațiilor acizilor fenolici și flavonoidelor (280 nm și respective, 340 nm), precum și a clorofilelor (460 nm, 647, 663 nm) și carotenoidelor (410-470 nm).

Figura I.1. Spectrul UV-Vis a frunzelor și tulpinițelor de vâsc (extract metanolic, diluție 1:10, g/v)

În urma studiului cu privire la conținutul în pigmenți asimilatori din frunzele de vâsc, utilizând diverși solvenți s-a observat diferențe semnificative între toate variantele utilizate. Conținutul cel mai ridicat în clorofile totale (clorofila a +b) s-a înregistrat la 48 ore de extracție (Vicas și colab., 2010), în cazul vâscului care crește pe măr (VAM), în cazul tuturor celor 3 solvenți utilizați (21,92 mg/g frunze proaspete, in cazul metanolului; 20,45 mg/g frunze proaspete, in cazul acetonei and 16,00 mg/g frunze proaspete, in cazul DMF). Cea mai mică cantitate în pigmenți a fost obținută în cazul vâscului care crește pe plop (VAP), de exemplu, 15,23 mg/g frunze proaspete, în cazul extractului metanolic, comparative cu 6,71 mg/g frunze proaspete, în cazul DMF-ului. Toate probele au fost colectate în luna Februarie 2010, din aceeași locație (Nord-Vestul României, regiunea Borod-Gheghie), perioadă în care frunzele arborelui gazdă nu acoperă planta semi-parazită. De asemenea, conținutul în carotenoide totale (mg/g frunze proaspete), utilizând trei solvenți diferiți, la trei timpi diferiți a fost investigat (Tabelul I.2).

Tabelul I.2

Cantitatea de carotene totale (mg/g frunze) din frunzele de vâsc extrase în trei solventi (acetonă, metanol, DMF), la trei timpi diferiți (24, 48 și 72 de ore)(Vicas și colab., 2010)

Cea mai mare cantitate în carotene totale s-a înregistrat tot în cazul extractului de vâsc care parazitează mărul, dar utilizând acetona ca și solvent, 4,26 ± 0,14 mg/g frunze proaspete. În schimb, utilizând metanolul pentru extracția carotenoidelor, cantitatea în acești pigmenți a fost de aproximativ de 2 ori mai mică (1,86 ± 0,26 mg/g frunze proaspete).

I.1.5. Concluzii

În cazul studiului efectuat s-au găsit diferențe între probele luate în studiu cu privire la conținutul în pigmenți asimilatori ale plantei semiparazite, ceea ce demonstrează că aceste diferențe sunt datorate compoziției chimice a arborelui gazdă. Din punct de vedere al extracției pigmenților verzi, metanolul s-a dovedit a fi cel mai bun solvent, în timp ce în cazul carotenoidelor, acetona. Cunoașterea conținutului în pigmenți asimilatori este important în determinarea caracteristicilor fiziologice a diferite varietăți de vâsc (Vicas și colab., 2010).

I.2. Extracția compușilor bioactivi de tip acizi fenolici și flavonoidic din vâsc și caracterizarea chimică a extractelor prin HPLC

I.2.1. Context

Metabolomica este o tehnologie care s-a dezvoltat foarte mult în ultimii ani, și care poate explica și identifica diferențe între diferite seturi de organisme (diferențe în genotip, fenotip etc), elucidând factorii de mediu care pot influența parametrii biochimici (Socaciu și colab., 2011). Metabolomica este definită ca un studiu sistematic a unei amprente biochimice care conduce la elucidarea unui profil metabolic (a unor molecule mici) într-un matrix specific (vegetal, aliment, animal sau țesut uman sau celule). Metabonomica include măsurători cantitative pentru identificarea unui răspuns metabolic specific (de exemplu, unele molecule cheie ca pigmenți, compuși volatile, steroli, vitamine etc.). Metaboliții sunt produșii finali ai expresiei genelor și a activității enzimatice și reflectă anumite căi metabolice într-o manieră statică sau dinamică (Socaciu și colab., 2011). Calitatea plantelor medicinale prezintă fluctuații datorită condițiilor de mediu, standardizarea acestora fiind dificilă dar necesară pentru verificarea autenticității, purității și activității lor biologice.

I.2.2. Obiectiv

Viscum album este o plantă medicinală utilizată de mulți ani în medicina tradițională și în terapia complementară a cancerului. În cadrul acestui studiu, obiectivul principal a fost de a investiga influența a cinci arbori gazdă diferiți asupra compoziției în compuși bioactivi de tipul acizilor fenolici și flavonoidelor din frunzele și tulpinițele de vâsc, utilizând HPLC cu detecție UV-Vis.

I.2.3. Materiale și metode

Materialul vegetal

Frunzele, respectiv tulpinile de vâsc (Viscum album), de pe cinci arbori gazdă, recoltați în luna iulie 2009, au fost cântărite și rapid uscate (pentru a preveni acțiunea enzimelor) într-o etuvă la 900 C, timp de 48 de ore.

Metoda de extracție a compușilor bioactivi

Pentru extracția compușilor bioactivi s-a folosit metoda descrisă de Sakakibara și colab., 2003, cu unele modificări. Probele uscate, au fost cântărite și supuse extracției cu etanol 70%, într-un raport de 1:10 (g/v), timp de 24 de ore la întuneric, sub agitare. Probele au fost apoi centrifugate timp de 5 minute la 3000 rpm. După îndepărtarea etanolului din supernatant, cu ajutorul rotavaporului, extractul apos a fost eliberat de compușii cu polaritate scăzută (lipide, terpene, clorofile, xantofile etc.) prin extracție cu eter de petrol (5 ml) de 3 ori (Markham, 1982). Partea apoasă a probelor a fost liofilizată si apoi reluată în apă ultrapură într-un volum bine determinat. Apoi, 1 ml din probe au fost tratate cu 1 ml soluție de HCl 1 N, și menținute 2 h, la 800C (pentru realizarea reactiei de hidroliza). Extractia agliconilor s-a realizat cu acetatul de etil, intr-un raport volumetric de 1:1. Dupa agitare, probele au fost centrifugate 5 minute la 5000 rpm, iar supernatantul (faza organica) s-a adus la sec. Rezidul obținut a fost dizolvat in 300 µl apa ultrapura si filtrate printr-un filtru de 0,45 µm (Millex-LG, Millipore) iar 20 µl din extract a fost supus analizei cromatografice.

Separarea HPLC a compușilor fenolici

Pentru separarea compușilor bioactive din vâsc, s-a folosit un cromatograf HPLC Shimadzu, echipat cu o pompa solvent binară, un degazor, cuptor pentru coloana si un detector cu fotodioda DAD (diode array detector). Coloana cromatografică, de tip SUPELCOSIL TM LC-18 column, 5µm, 25 cm x 4.6 mm, a fost utilizată la 300C. Faza mobilă a fost formată din doi solvenți: solventul A format din metanol: acid acetic: apa bidistilată în raport de 10:1:88 (v/v/v) și solventul B format din metanol: acid acetic: apa bidistilată în raport de 90:3:7 (v/v/v). S-a lucrat în gradient, cu un debit al fazei mobile de 1 ml/minut , iar toți solvenții folosiți au fost în prealabil filtrați, prin filtre membranare de 0.45-μM (Millipore, U.S.A.). Cromatogramele obtinute au fost monitorizate la 280 nm și 360 nm.

Pentru cuantificarea rezultatelor s-au determinat curbele de etalonare a următoarelor standarde: acid betulinic, acid galic, acid protocatecuic, acid gentisic, acid clorogenic, acid p-hidroxi benzoic, acid cafeic, acid siringic, acid salicilic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid sinapic, acid trans-cinamic, naringina, quercetina, kaempherol si acid rosmarinic, a caror concentratie a variat între 0,48 și 500 µg/ml. Datele au fost prelucrate utilizând programul Origin, versiunea 7.0.

I.2.4. Rezultate și discuții

Datele cantitative cu privire la conținutul în compuși fenolici a extractelor de vâsc sunt redate în Tabelul I.3. Cromatogramele HPLC a acizilor fenolici din frunzele și tulpinițele extractelor de vâsc, sunt redate in Figura I.2.

S-au identificat și cuantificat 17 compuși bioactivi din probele de vâsc: o triterpenă pentaciclică (acidul betulinic), 12 acizi fenolici (acid galic, acid protocatecuic, acid gentisic, acid clorogenic, acid p-hidroxibenyoic, acid cafeic, acid siringic, acid salicilic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid sinapic, acid trans cinamic) si 4 polifenoli (naringenina, quercetina, kaempherol si acid rosmarinic). Acești compuși au fost identificați în raport cu timpul lor de retenție, cu caracteristicile UV spectrale a picurilor, prin compararea lor cu standardele, precum și prin realizarea de co-cromatograme.

Compușii fenolici se găsesc în mod uzual în natură sub formă de esteri și foarte rar ca și glicozide sau sub formă liberă. Flavonoidele sunt de asemenea prezente în plante sub formă glicozilată. Fiecare flavonoidă se afla în plantă sub formă de mai multe combinații cu partea glucidică. Din acest motiv, s-a realizat hidroliza acida a extractelor, pentru eliberarea agliconilor, care ulterior au fost investigati prin HPLC.

Analiza HPLC cantitativă a extractelor de V. album evidențiază un conținut crescut în compuși bioactivi în frunzele de vâsc comparativ cu tulpinițele (Tabel I.3). În cazul extractelor din frunzele de V. album de pe Acer campestre (VAA), 7 acizi fenolici și 3 polifenoli au fost identificați, în timp ce în tulpinițele de vâsc este prezent doar un singur acid fenolic (acidul trans-cinnamic). Acidul cafeic a fost componentul predominant din frunzele de vâsc (13,61 µg/g s.u). Kaempherol-ul și acidul rosmarinic au fost prezenți atât in frunze cât și tulpinițe, în timp ce quercetina este prezentă doar in frunze.

Vâscul care parazitează Fraxinus excelsior (VAF) conține 9 acizi fenolici și 2 flavonoide. Concentrația acidului p-coumaric în probele de VAF a fost de 1,82 µg/g s.u., în timp ce în celelalte extracte de vâsc nu se regăsește. Acidul cafeic s-a aflat în cantitatea cea mai mare atât în frunze cât și în tulpinițe (13,98 µg/g s.u, respectiv 15,86 µg/g s.u.). Kaempherol-ul a fost prezent atât în frunze (7,30 µg/g s.u) cât și în tulpinițe (3,66 µg/g), în timp ce quercetina a fost prezentă numai în frunze (6,05 µg/g s.u.). Dintre toate probele de vâsc luate în studiu, extractul VAF a prezentat cea mai mare cantitate de acizi fenolici (108,64 µg/g s.u).

Figura I.2. Cromatogramele HPLC a acizilor fenolici din frunze și tulpinițe de V. album recoltate de pe 5 arbori gazdă: VAA –vâsc de pe Acer campestre, VAF – vâsc de pe Fraxinus excelsior , VAP vâsc de pe Populus nigra , VAM – vâsc de pe Mallus domestica și VAR- vâsc de pe Robinia pseudoacacia. Numărul pic-urilor sunt identificati în Tabelul I.3 (Vicas și colab., 2011a)

În cazul vâscului recoltat de pe Populus nigra (VAP), acidul ferulic a fost componentul dominant atât din frunze cât și din tulpinițe (11,52 µg/g s.u., respectiv 6,14 µg/g s.u.). Acidul salicilic a fost prezent atât în frunze cât și în tulpiniță (8,4 µg/g s.u., respectiv 2,3 µg/g s.u), în timp ce în celelalte extracte de vâsc s-a identificat numai în frunze.

Cromatograma HPLC a vâscului de pe Mallus domestica (VAM), a evidențiat prezența a 7 acizi fenolici. De asemenea, acidul betulinic a fost prezent numai în acest extract, atât în frunze cât și în tulpinițe (1,87 µg/g s.u., respectiv 2,05 µg/g s.u.). Ca și în cazul extractului VAP, acidul ferulic a fost componentul principal din frunze și tulpinițe (7,81 µg/g s.u., respectiv 6,88 µg/g s.u.).

Compusul predominant din vâscul de pe Robinia pseudoacacia (VAR) a fost acidul galic (39,93 µg/g s.u) care nu a fost prezent în celelalte extracte analizate.

Nu s-au identificat acidul gentisic si naringenina în nici un extract de vâsc, în timp ce quercetina a fost prezentă doar in frunze.

Acizii fenolici reprezintă fracția majoră de compuși bioactivi din V. album. O variabilitate ridicată între raportul dintre acizii fenolici din frunze și tulpinițe a fost observată. Dacă, VAA și VAR prezintă un raport ridicat (43,51:1 respectiv 34,41:1), un raport scăzut s-a inregistrat în cazul VAF și VAM (1,21:1; respectiv 1,44:1).

In urma acestui studiu, vâscul care are ca și arbore gazdă Fraxinus excelsior (VAF) este cel mai bogat în acizi fenolici (108,64 µg/g s.u.), urmat de VAR (71,19 µg/g s.u.), VAA (54,80 µg/g s.u.), VAP (45,15 µg/g s.u.) și VAM (39,37 s.u.).

Polifenolii totali din frunze și tulpinițe scad în ordinea: VAR VAF VAA VAP VAM.

Luczkiewicz și colab.. (2001), a analizat acizii fenolici prezenți în vâsc de pe 6 arbori diferiți. Autorii au prezentat că în vâscul care parazitează Mallus domestica, componentul predominant este acidul rosmarinic (17,48 mg%), în timp ce vâscul de pe plop (Populus nigra) prezintă ca și component predominant acidul clorogenic (12.34 mg %).

Condrat și colab., (2009) au investigat vâscul din punct de vedere al conținutului în flavonoide. Quercetina și kaempferolul au fost identificați în cantitate foarte mică (0,20 µmol/g s.u., respectiv 0,16 µmol/g s.u.).

În urma studiului experimental s-a observant că flavanona, naringenin, nu a fost prezentă în nici una din extractele analizate. Aceste rezultate sunt in concordanță cu Haas si colab., (2003), care nu au identificat naringenina în V.album, dar a fost identificată în peretele epicuticular din V. cruciatum. Autorii, de asemenea au identificat quercetina și derivați metilați ai acesteia precum și ocazional flavonolul kaempherol, împreună cu derivații săi metil în materialul epicuticular de V. album.

I.2.5. Concluzii

Rezultatele obținute au demonstrat că arborele gazdă joacă un rol cheie cu privire la compoziția chimică a văscului. Văscul care parazitează frasinul (VAF) este cel mai bogat în compuși fenolici (108.64 μg/g s.u) urmat de VAR (71.19 μg/g s.u), VAA (54.79 μg/g s.u), VAP (45.15 μg/g s.u) și VAM (39.37 μg/g s.u).

I.3. Evaluarea in vitro a capacității antioxidante a extractelor de vâsc și determinarea compușilor polifenolici totali

I.3.1. Context

Datele din literatura sunt puține în ceea ce privește efectul antioxidant al vâscului European. Până în anul 2009, exista un singur studiu (Onay-Ucar și colab., 2006) cu privire la efectul antioxidant al extractului metanolic de vâsc utilizându-se metoda DPPH, metoda tiocianatului feric și metoda acidului tiobarbituric. Autorii au demonstrat că efectul antioxidant al extractului de vâsc depinde atât de timpul de recoltare cât și de arborele gazdă pe care văscul crește. Leu și colab., 2006; Yao și colab., 2006, Shi și col., 2006 au studiat intens efectele antioxidante a extractului de vâsc aparținând speciei Viscum coloratum, activitate datorată în special flavonoidelor prezente în vâsc.

I.3.2. Obiectiv

În cadrul acestui studiu, obiectivul principal a fost de a investiga influența a cinci arbori gazdă diferiți asupra capacității antioxidante a extractelor de frunze și tulpinițe de vâsc, în diferiți solvenți utilizând diferite metode antioxidante bazate pe principii diferite.

I.3.3. Materiale și metode

Materialul vegetal

Frunzele, respectiv tulpinițele de vâsc (Viscum album), de pe cinci arbori gazdă (Acer campestre (VAJ), Mallus domestica (VAM), Fraxinus excelsior (VAF), Populus nigra (VAP) and Robinia pseudoacacia (VAS)), recoltați în luna Iulie 2009, au fost cântărite și prelucrate pentru evaluarea capacității antioxidante prin metodele DPPH, ORAC și ABTS.

Pentru evaluarea comparativă a activității antioxidante hidrofile și lipofile a vâscului prin metoda FRAP, planta semi-parazită a fost prelevată în luna Decembrie 2008, de pe 5 arbori diferiți: Acer campestre (VAJ), Mallus domestica (VAM), Fraxinus excelsior (VAF), Populus nigra (VAP) and Robinia pseudoacacia (VAS)

Prepararea extractelor de vâsc pentru determinarea capacității antioxidante prin metodele DPPH, ORAC și ABTS

S-a determinat activitatea antioxidantă a frunzelor și tulpinilor de vâsc, utilizând diverși solvenți. Pentru extracțiile apoase și etanolice de vâsc s-a procedat astfel: 2 g de frunze (respectiv tulpinițe) proaspete au fost omogenizate cu 10 ml apa distilată/respectiv etanol 98 % cu ajutorul unui omogenizator Ultra-Turax, timp de 1 minut. Omogenizatele au fost apoi centrifugate la 10000 rpm la 40C, timp de 10 minute, iar supernatantul obținut a fost utilizat pentru determinarea capacității antioxidante.

Prepararea extractelor de vâsc pentru determinarea capacității antioxidante prin metoda FRAP

Zece grame de frunze și tulpinițe de vâsc au fost omogenizate cu 25 ml metanol, și menținute la 40C timp de 12 ore. Probele au fost apoi centrifugate, timp de 20 de minute (10000 rpm), iar supernatantul a fost păstrat la -200C, înainte de determinarea activității antioxidante hidrofile (AAH). Reziduu rămas în urma centrifugării s-a redizolvat în acetonă, omogenizat și sonicat pentru evaluarea activității antioxidante lipofile (AAL). Etapele care s-au parcurs pentru prepararea extractelor de vâsc sunt prezentate în Figura I. 3 (Vicas și colab., 2009b).

Figura I.3. Figura I.4 Etapele de extracție în cazul probelor de vâsc pentru evaluarea activității antioxidante hidrofilice (AAH) și lipofilice (AAL) (Vicas și colab., 2009b)

Metode utilizate pentru evaluarea capacității antioxidante a extractelor de vâsc

Metoda DPPH (1,1,-difenil-2-picrilhidrazil), metoda spectrofotometrică, larg utilizată pentru a testa abilitatea compușilor de a îndepărta radicalii liberi sau capacitatea lor de a dona hidrogen. Este utilizată pentru cuantificarea antioxidantilor in sisteme biologice complexe (Miliauskas și colab., 2004). Protocolul de lucru folosit a fost conform metodei descrise de Brand-Williams și colab., (1995). Reactiie au fost realizate într-o placuță cu 12 godeuri, in fiecare godeu adaugându-se 200 µl probă sau standard și 1,4 ml solutie DPPH 80 µM. Ca și standard s-a utilizat Trolox-ul, la concentratii cuprinse intre 7,81 si 1000 µM. Absorbanțele s-au înregistrat la 515 nm. Procentul de inhibitie a DPPH-ului a fost calculat conform ecuației:

Metoda ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) este folosită pentru măsurarea capacității antioxidante a diferitelor probe. Principiul metodei constă în măsurarea degradării unei molecule fluorescente în prezența unui generator de radicali liberi de tip peroxil. Antioxidanții sunt capabili de a proteja molecula fluorescentă de degradarea oxidativă și gradul de protecție a antioxidanților poate fi cuantificat utilizând un fluorometru (Huang și colab., 2002). Metoda s-a realizat într-o placuță cu 96 de godeuri, astfel în fiecare godeu s-a adăugat:

150 µl solutie de fluoresceina (4×10-3 mM) preparată în tampon fosfat 75 mM, cu pH =7,4;

25 µl tampon fosfat 75 mM (pH = 7,4) în cazul blanc-ului; 25 µl standard pentru realizarea curbei de calibrare (Trolox cu concentrații cuprinse între 1,6 – 200 µM, ecuatia de regresie fiind y=0,053x+2,8656, iar coeficient de corelatie R2 = 1), sau 25 µl probe.

Plăcuța a fost apoi introdusă pentru echilibrare într-un cititor de microplaci de tip BioTek Synergy, la 370C, timp de 30 de minute. Reacția a fost apoi inițiată prin adăugarea a 25 µl de solutie AAPH, 153 mM. S-a măsurat intensitatea fluorescenței la fiecare minut, timp de 30 de minute, utilizând o lungime de undă de excitație de 485 nm și respectiv de emisie de 528 nm.

Valorile ORAC au fost apoi calculate conform procedurii descrise de Cao si Prior, (1999). Valorile AUC și Net AUC a standardelor și a probelor au fost determinate utilizând ecuațiile:

Unde, R1 este fluorescența înregistrată la reacția de inițiere, și Rn este ultima măsurătoare.

Curba standard a fost obținută prin trasarea Net AUC a standardului în funcție de diferite concentrații ale Trolox-ului. Valorile ORAC au fost apoi calculate automat, utilizând Microsoft Excell, prin interpolarea valorilor Net AUC obținute pe curba standard.

Metoda TEAC (Trolox Equivalents Antioxidant Capacity) se bazează pe abilitatea antioxidanților de a diminua viața radicalului cation (ABTS+), un cromofor albastru verde care absoarbe la 734 nm, comparativ cu Trolox-ul (Arnao și colab., 2001). ABTS+ se produce prin reacția dintre solutia stoc de ABTS (7mM) cu persulfatul de potasiu (2,45 mM) timp de 12-16 ore. Pentru studiul activității antioxidante, solutia ABTS+ se diluează cu etanol până când se obține o absorbanță de 0,70 ± 0,02 la 734 nm. După adăugarea a 17 µl probă la 170 µl solutie ABTS+, amestecul a fost monitorizat spectrofotometric la 734 nm. Curba etalon realizată cu standard de Trolox (de concentratii cuprinse intre 0,1 – 0,005 mM) a avut ecuația de regresie y = 952.94x+6.9573 și un coeficient de corelatie R2 = 0,995.

Metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) este o metodă simplă spectrofotometrică care testează puterea antioxidantă a probelor luate în studiu, și se bazează pe reducerea complexului tripiridiltriazina ferică (Fe(III)-TPTZ) la complexul tripiridiltriazina feroasă ((Fe(III)-TPTZ) de către un reductant la pH acid (Benzie si Strain, 1999). Solutia FRAP de lucru se prepară proaspăt prin amestecarea a 50 ml tampon acetat 300 mM cu 5 ml soluție Fe2(SO4)3·H2O și 5 ml TPTZ. Probele de vâsc (100 µl) au fost lăsate să reacționeze cu 500 µl soluție FRAP și 2 ml apă distilată pentru o oră, la intuneric, după care citirile la spectrofotometru s-au realizat la 595 nm. Ca și standard s-a folosit acidul ascorbic, curba standard s-a realizat cu concentratii cuprinse între 5 și 100 mg/L, având un coeficient de corelatie R2 = 0,9979. Rezultatele au fost exprimate in mg/L echivalenti acid ascorbic/g frunza/tulpiniță proaspătă.

I.3.4. Rezultate și discuții

Inhibarea radicalului DPPH de către extractele de vâsc

Capacitatea antioxidantă a frunzelor de V. album care a fost recoltat de pe cinci arbori diferiti, evaluați prin metoda DPPH este prezentată în Figura I.4. Diferențe semnificative (p < 0,001) din punct de vedere al indepărtării radicalului DPPH (%) de către extracte apoase și etanolice din frunze și tulpinițe au fost observate, cu excepția extractului apos din frunze și stem a VAA față de VAP.

Rezultatele au relevat că efectul de îndepărtare a DPPH (%) de către extractul din frunze de vâsc apos variază între 11.49% în cazul VAR și 2,22% în cazul VAM. Efectul cel mai ridicat de îndepărtare a radicalului DPPH (%) a fost observat în cazul extractului etanolic, valoriile variind între 77.19 % (în cazul extractului VAF) până la 50.47% (în cazul VAA).

Îndepărtarea radicalului DPPH (%) de către extractele din tulpinițele de vâsc a fost mai mic decât în cazul extractelor din frunze, extractele apoase de VAF si VAM pierzându-și activitatea antioxidantă. Extractul etanolic din tulpinița extractului VAF și-a pierdut activitatea antioxidantă cu 51.82% comparativ cu extractul din frunze, în timp ce cea mai mică activitate antioxidantă din tulpinițe a fost inregistrată în cazul extractului VAR.

Figura I.4. Efectul de îndepartare a DPPH (%) de către extractului apos (A) față de extractul etanolic (B) a frunzelor și tulpinițelor de vâsc recoltate în luna Iulie 2009, de pe cinci arbori gazdă. Datele sunt exprimate ca media ± deviația standard (n=3) și evaluate prin one-way ANOVA. Diferențele sunt considerate statistic semnificative dacă p < 0.05. ns – diferențe nesemnificative ; a p < 0.001; b p < 0.01 (Vicas și colab., 2011a)

Rezultate similare au fost obținute de Önay-Uçar et al.,(2006), care au investigat extractele metanolice de vâsc care parazitează diferiți arbori gazdă. Rezultatele autorilor au arătat ca vâscul care are ca și arbore gazdă Robinia pseudocacia (VAR) inhibă DPPH în procent de 73,44% în timp ce vâscul de pe Acer campestre (VAA) prezintă 59,52% inhibiția DPPH-ului. Modificări mici observate între rezultatele noastre și rezultatele autorilor se datorează solventului de extracție precum și factorilor de mediu. Roman și colab., (2009) au investigat eficacitatea procesului de ultrafiltrare asupra activității antioxidante a extractelor apoase de V. album. Valoriile obtinute în urma realizării metodei DPPH au variat între 66,2% și 88,2% procent de inhibitie a DPPH-ului, în cazul extractului de vâsc concentrat. Coeficientul de corelație dintre inhibarea DPPH-ului și conținutul proteic total a fost de 0,94, ceea ce confirmă că pe lângă compușii fenolici din extractele de vâsc, viscolectinele au o contribuție majoră cu privire la efectul de îndepărtare a radicalilor.

Într-un alt studiu de cercetare (Oluwaseun și Ganiyu, 2008), s-a investigat proprietățile antioxidante a extractelor de V.album recoltate de pe arborele de cacao și cashew din sud-vestul Nigeriei. Abilitatea de îndepărtare a radicalului DPPH de către V. album este dependentă de doză (0-10 mg/ml), extractul de vâsc de pe arborele de cacao find antioxidant mult mai puternic decât vâscul de pe arborele cashew, rezultat care este în concordanță și cu conținutul de fenoli totali din aceste extracte (182 mg /100 g, respectiv 160 mg /100 g).

Evaluarea activității antioxidante a vâscului prin metoda ORAC

Valorile capacității antioxidante obținute prin metoda ORAC sunt prezentate în Tabelul I.4, și variază între 10,73 ± 1,90 mM echivalenti Trolox /g materie prospată pentru extractul etanolic de frunze a VAP și 1,52±1,25 mM echivalenti Trolox /g materie prospată pentru extractul apos din tulpinițele VAM. Rezultatele obținute prin metoda ORAC, nu au prezentat diferențe semnificative între capacitatea antioxidantă a frunzelor și tulpinițelor pentru toate variantele de vâsc investigate, cu excepția extractelor din frunze de vâsc a VAA față de VAM (p < 0.01) și extractelor din tulpinițele apoase a VAA față de VAM (p < 0.05).

Tabelul I.4

Capacitatea antioxidantă (determinată prin metoda ORAC) din frunze și tulpinițe de vâsc (apoase și etanolice) exprimate în mM echivalenți Trolox /g materie prospată (Vicas si colab., 2011a)

*Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviația standard (n=3) și evaluate prin testul one-way ANOVA. Diferențele sunt considerate semnificative dacă p < 0.05. ns – diferențe nesemnificative; * – p < 0.05; **- p < 0.01.

Valori ridicate au fost înregistrate în cazul extractului de frunze apos VAA (6.33 mM echivalenti Trolox /g materie prospată) și a extractelor din frunze etanolice VAP (10.73 mM echivalenti Trolox /g materie prospată).

Rezultatele obținute au arătat că extractele etanolice prezintă o abilitate ridicată de inhibare a radicalului peroxil. Aceste rezultate sunt în concordanță cu datele obținute de Al-Duais și colab., (2009), care au raportat că extractele etanolice de frunze a Cyphostemma digitatum (Vitaceae) au prezentat 103,3 mmol echivalenți Trolox /100 g iar extractele apoase au prezentat 16,7 mmol echivalenți Trolox /100 g.

Evaluarea activitatii antioxidante a vâscului prin metoda TEAC

Pe baza cercetărilor efectuate, s-a pus în evidență că toate extractele de vâsc investigate (din frunze și tulpinițe, apoase și etanolice) au abilitatea de a indepărta radicalul cation ABTS*+ (Tabelul I.5). Conform rezultatelor obținute prin metoda TEAC, există diferențe semnificative (p < 0.001) între toate extractele investigate.

Tabelul I.5

Potențialul antioxidant (determinat prin metoda TEAC) a frunzelor și tulpinițelor de vâsc (apoase sau etanolice) exprimate în mM echivalenți Trolox/g materie proaspată

* Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviația standard (n=3) și evaluate prin testul one-way ANOVA. Diferențele au fost considerate statistic semnificative dacă p < 0.05. *** p < 0.001.

Nivele ridicate de îndepărtare a radicalului cation ABTS*+ l-au prezentat extractele apoase, în timp ce extractele etanolice au prezentat o activitate antioxidantă scăzută. Extractele de vâsc apoase de frunze și tulpinițe ce cresc pe Acer campestre (VAA) au prezentat valori TEAC ridicate (678,72 ± 0,00 mM echivalenti Trolox/g frunze proaspete, respectiv, 577,94 ± 0,01 mM echivalenti Trolox/g tulpinițe proaspete), în timp ce în cazul extractele etanolice valori ridicate s-au inregistrat în cazul frunzelor de VAF (461,09 ±0,11 mM echivalenti Trolox/g frunze proaspete) și tulpinițe de VAP (306,68 ± 0,01 mM echivalenți Trolox/g tulpinițe proaspete). Activitatea antioxidantă mai ridicată a extractelor apoase se datorează probabil prezenței în acestea a compușilor bioactivi hidrosolubili care prezintă proprietatea de a îndeparta radicalii cationi ABTS*+.

Când extractul apos de ceai verde a fost comparat cu extractul metanolic, Drużyńska și colab., (2007), s-a demonstrat că extractul apos a prezentat activitatea antioxidantă cea mai ridicată, din cauza prezenței catechinelor care sunt hidrosolubile.

Evaluarea activității antioxidante a vâscului prin metoda FRAP

Rezultatele obținute în urma metodei FRAP sunt exprimate ca echivalenți acid ascorbic/g frunze (sau tulpinițe) proaspete. Valorile FRAP obținute sunt prezentate în Tabelul I.6 (Vicas și colab., 2009b). S-au semnalat diferențe semnificative între capacitatea antioxidantă hidrofilă și lipofilă dintre frunze și tulpinițele de vâsc. Dintre extractele de vâsc selectate, extractele metanolice din frunze de V. album care cresc pe Mallus domestica au prezentat activitatea antioxidantă cea mai ridicată (0.14 ± 0.12 mg/l echivalenți vitamina C / g frunze proaspete). AAL este foarte mică comparativ cu AAH, aproximativ de 100 de ori.

Conținutul de polifenoli totali care contribuie la AAH și conținutul în carotenoide totale care contribuie la AAL din extractele metanolice, respectiv acetonice sunt prezentate in Tabelul 1.7.

Extractul metanolic prezintă un conținut ridicat de compuși fenolici (între 0,65 și 0,40 mg AGE/g greutate proaspată), care sunt de fapt antioxidanți hidrofilici naturali. Pe de altă parte, în extractul acetonic conținutul în compuși fenolici este de 100 de ori mai mic comparativ cu extractul metanolic (de la 0,015 la 0,002 mg AGE/g greutate proaspată).

Tabel I.6

Activitatea antioxidantă hidrofilă și lipofilă a extractelor din frunze și tulpinițe de vâsc

(Vicas și colab., 2009b)

*Datele reprezintă media ± deviația standard

Tabel I.7

Conținutul total de antioxidanți hidrofili și lipofili din extractele de vâsc

(Vicaș și colab., 2009)

Valorile FRAP hidrofilice sunt semnificativ corelate cu valorile obținute prin metoda Folin-Ciocalteu în cazul extractelor din frunze (R2 = 0.9363) și a extractelor din tulpinițe (R2 = 0.761) (Figura I. 5).

Figura I.5 Corelarea între valorile FRAP și Folin-Ciocalteu din frunze (A) și tulpinițe (B) (Vicas și colab., 2009b)

Activitatea antioxidantă hidrofilă este slab corelată cu conținutul în β-caroten total (R2 = 0,168), în timp ce valorile lipofilice FRAP de asemenea sunt slab corelate cu conținutul în β-caroten total (R2 = 0.6327) (Figura I.6), probabil pentru că β-carotenul nu este antioxidantul lipofilic majoritar din vâsc.

Figura I.6. A. Corelarea dintre valorile FRAP și β-carotenul total din extractul acetonic a frunzelor de vâsc. B. Corelarea dintre valorile FRAP și β-carotenul total din extractul metanolic de frunze de vâsc (Vicas și colab., 2009b)

Conținutul în compuși polifenolici totali a extractului apos și etanolic de vâsc determinat prin metoda Folin-Ciocalteu

Cantitatea de compuși fenolici totali din extractele apoase și etanolice de vâsc, determinată prin metoda Folin-Ciocalteu a fost exprimată in mg echivalenți acid galic / greutate proaspată (GAE/g FW). Rezultatele obținute sunt prezentate în Tabelul I.8. Diferențe semnificative (p < 0.001) în conținutul în compuși fenolici a extractelor etanolice și apoase au fost observate. În extractele apoase de frunze de vâsc, cel mai ridicat conținut în compuși fenolici a fost găsit în cazul extractului VAR (200,51 µg GAE/ g FW), în timp ce cel mai mic conținut s-a inregistrat la extractul VAM (176,87 µg GAE/ g FW). Valorile obținute pentru fenolii totali, atât în extractele apoase cât și în cele etanolice, descresc în ordinea: VAR > VAF > VAP > VAA > VAM. Extractele obținute din tulpinițele de vâsc au un conținut în compuși fenolici mult mai scăzut decăt extractele din frunze de vâsc. Cantitatea cea mai scăzută în compuși fenolici a fost inregistrată în extractele apoase de tulpinițe VAF și VAM (cu 58%, respectiv 54,97% mai puțin comparativ cu extractul de frunze). În alte extracte (VAM și VAR), diferențele dintre frunze și tulpinițe din punct de vedere al compușilor fenolici nu este semnificativ.

Pentru evaluarea capacității antioxidante a extractelor, un indice global s-a determinat prin atribuirea unei valori index de 100 la cea mai ridicată valoare a capacității antioxidantă determinată prin cele trei metode (DPPH, ORAC, TEAC) și la cea mai mare cantitate de compuși fenolici (determinată prin metoda Folin-Ciocalteu), și apoi s-a calculate un scor index pentru toate celelalte probe, după cum urmează: scor index antioxidant = [(scor probă / cel mai bun scor ) x 100] (Seeram et al., 2008). Media rezultată din cele 4 metode pentru fiecare extract de vâsc a reprezentat index-ul ce reflectă capacitatea antioxidantă globală a extractelor.

Datele prezentate în Tabelul I.9 arată că cel mai înalt scor al index-ului antioxidant a fost obținut în cazul extractelor etanolice, în particular în cazul frunzelor de VAF (97.85%), urmat de VAR (88.77%). Pentru extractele apoase, cel mai înalt scor al index-ului antioxidant a fost obținut în cazul extractului VAA (85.93%), urmat de VAR (80.47%). Atât extractele din tulpinițe cât și cele din frunzele de V. album prezintă capacitate antioxidantă, dar în general în frunze se înregistrează valoarea cea mai ridicată.

Tabel I.8

Conținutul fenolic total din frunze și tulpinițe de V. album (extracte apoase si etanolice) exprimate in µg GAE/g FW (Vicas și colab., 2011a)

** Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviația standard (n=3) și evaluate prin testul one-way ANOVA. Diferențele sunt considerate statistic semnificative dacă p < 0.05 și *** p < 0.001

Tabel I.9

Scorul index-ului antioxidant individual* si media scorul index-ului antioxidant** din extractele de frunze și tulpinițele de vâsc. Valorile sunt comparate cu cantitățile de fenoli totali determinate prin metoda Folin-Ciocalteu

*Scor index antioxidant = [(scorul probei/cel mai bun scor) x 100]

** Media indexului antioxidant prin cumularea scorurilor obținute din metodele DPPH, ORAC și TEAC

Potențialul antioxidant determinat prin metodele ORAC și TEAC au fost cumulate într-una singură, media index-ului antioxidant, și corelat cu concentrația de fenoli determinată prin metoda Folin-Ciocalteu. S-a inregistrat o slabă corelație (Figura I.7) între acest index și conținutul în fenoli pentru extractele apoase (R2 = 0.167) respectiv cele etanolice (R2 = 0.62).

Figura I.7. Corelația între scorul indexului antioxidant (determinat în extractele apoase și etanolice), cumulate cu metodele antioxidante (ORAC și TEAC) și concentrația fenolilor totali (µg GAE/ g FW) determinată prin metoda Folin-Ciocalteu

I.3.5. Concluzii

În concluzie, valorile obținute în cazul extractului metanolic de V. album, confirmă că acest extract este bogat în compuși fenolici și poate funcționa ca antioxidant, cu abilitatea de reducere ferică, abilitate care este dependentă de arborele gazdă.

În extractele de frunze apoase, cea mai mare cantitate de compuși fenolici s-a obținut în cazul VAR (200,51 µg GAE/ g FW), în timp ce cel mai mic conținut în compuși fenolici s-a înregistrat la extractul VAM (176,87 µg GAE/ g FW). Valorile obținute pentru fenolii totali, atât în extractele apoase cât și în cele etanolice, descresc în ordinea: VAR > VAF > VAP > VAA > VAM.

Diferențele obținute cu privire la capacitatea antioxidantă dintre frunzele și tulpinițele de vâsc recoltate de pe diferiți arbori poate fi atribuită și factorilor de mediu, care pot afecta semnificativ acumularea compușilor bioactivi în țesuturile plantelor.

I.4. Compararea capacitățiii antioxidante în funcție de perioada de recoltare și arborii gazdă

I.4.1. Context

Vâscul European (Viscum album L.) este o plantă semi-parazită, care crește pe o multitudine de arbori gazdă, pin, plop, măr, salcâm etc. Studiile din punct de vedere al efectelor biologice ale acestei plante au evidențiat efectul său anticancerigen (Melzer și colab., 2009), efectul de inducere a apoptozei în cazul liniilor celulare tumorale (Büssing și Schietzel., 1999), activități antivirale, antibacteriene și imunomodulatoare (Hajtó și colab., 2005). Nwanjo (2007) a demonstrat efectul hipoglicemiant și potențialul antioxidant a extractului apos de V. album la șobolanii de laborator Wistar la care li s-a indus diabetul. În cazul altui studiu in vivo (Ofem și colab., 2007), s-a demonstrat efectul extractului apos de vâsc de a reduce tensiunea arterială și pulsul la șobolanii Wistar

Compușii bioactivi din vâsc cu activitate antioxidantă sunt reprezentați de flavonoide, de exemplu, quercetina, esterii metil ai quercetinei, ocazional kaempferol și derivații lui metilici, și foarte rar naringenina (Haas și colab., 2003), dar și acizi fenolici (acidul digalic și o-cumaric, attain formă liberă cât și glicozilată (Luczkiewicz et al., 2001). Profilul fitochimic al vâscului depinde de arboreal gazdă (Luczkiewicz et al., 2001; Vicas și colab., 2011a). Vâscul este o plantă semiparazită, capabilă să își biosintetizeze proprii compuși, dar are nevoie și de nutrienții arborelui gazdă. Se sugerează că în cazul compușilor bioactivi cu proprietăți farmacologice, aceștia sunt preluați de la arborele gazdă de către plata semi-parazită (Büssing and Schietzel, 1999). Până în prezent studiile de literatură nu au determinat cu exactitate care sunt compușii care pot fi biosintetizați de către vâsc, și care sunt preluați de la arborele gazdă.

I.4.2. Obiective

Obiectivul acestui studiu a fost de a investiga influența perioadei de recoltare a vâscului (Mai, Iulie și Decembrie) asupra capacității antioxidante (determinată prin metodele DPPH, ORAC și TEAC) a probelor de V. album recoltate de pe 5 arbori diferiți, din Nord-Vestul României. De asemenea a fost investigat și influenta solventului de extracție (apă și etanol) asupra capacității antioxidante a vâscului.

I.4.3. Materiale și metode

Materialul vegetal

Frunzele, respectiv tulpinițele de vâsc (Viscum album), de pe cinci arbori gazdă (Acer campestre (VAJ), Mallus domestica (VAM), Fraxinus excelsior (VAF), Populus nigra (VAP) and Robinia pseudoacacia (VAS)), au fost recoltate în luna Decembrie 2008, Mai 2009 și Iulie 2009, cântărite și prelucrate pentru evaluarea capacității antioxidante prin metodele DPPH, ORAC și ABTS, descrise în Capitolul I.3.

I.4.4. Rezultate și discuții

Inhibarea radicalului DPPH de către extractele de vâsc

Capacitatea antioxidantă comparativă a frunzelor și tulpinițelor de vâsc, care parazitează diferiți arbori gazdă, în 3 perioade diferite (Mai, Iulie, Decembrie) a fost evaluată prin metoda DPPH și sunt prezentate in Tabelul I.10. În general, rezultatele obținute au arătat că efectul de îndepartare a radicalului DPPH (%) a fost ridicat în lunile Mai și Iulie, comparativ cu Decembrie, când unele extracte apoase și-au pierdut activitatea antioxidantă. De exemplu, cel mai înalt efect de îndepartare a radicalului DPPH (%) a fost înregistrat în cazul vâscului care parazitează Robinia pseudoacacia (VAR) (11,49 ± 0,04; 10,97 ± 0,01 si 2,72 ± 0,01 în Iulie, Mai, respectiv în Decembrie). De asemenea extractele apoase de tulpiniță prezintă capacitate antioxidantă, dar aceasta este mult mai scazută comparativ cu a extractele apoase de frunze de vâsc.

Tabel I.10

Efectul de îndepărtare a radicalului DPPH (%) de către extractele de vâsc (frunze și tulpinițe), apoase și etanolice, recoltate în trei perioade diferite (Decembrie 2008; Mai și Iulie, 2009) de pe diferiți arbori gazdă1(Vicas și colab., 2011b).

1 Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviația standard (n=2) și evaluate prin testul two-way ANOVA și Bonferroni post-test pentru a compara fiecare extract cu extractul VAA. Diferențele sunt considerate semnificativ statistic dacă: ** p< 0.001, *** p < 0.0001, ns – nesemnificativ.

Spre deosebire de extractele apoase, la extractele etanolice de vâsc, efectul de îndepartare a radicalului DPPH (%) s-a înregistrat în toate cele 3 luni luate în studiu, atât în frunze cât și în tulpinițe. Rezultatele privind efectul de îndepartare a radicalului DPPH (%) variază între 77,19 ± 0.00 % în cazul vâscului recoltat de pe Fraxinus excelsior în luna Iulie și 40,17 ± 0,03 în cazul aceleași probe dar recoltate în Decembrie. Efectul de îndepărtare a radicalului DPPH (%) în cazul extractelor etanolice de stem a fost mai scăzut comparativ cu a extractelor din frunze, dar diferențele înregistrate nu au fost atât de pronunțate ca și în cazul extractelor apoase.

Determinarea activității antioxidante a vâscului prin metoda ORAC

Rezultatele obținute în urma realizării metodei ORAC sunt prezentate in Figura I.8. În extractele apoase de frunze, valorile obținute variază între 9,64 ± 0,097 mM echivalenti Trolox/g materie proaspată pentru extractul VAM (recoltat în Decembrie) și 0,17 ± 0,66 mM echivalenți Trolox/g materie proaspată pentru vâscul care parazitează Acer campestre (VAA), recoltat în Mai. De asemenea, rezultatele obținute în cazul extractelor apoase din tulpinițe sunt similare cu cele obținute în cazul extractelor din frunze de vâsc, valorile ORAC variind între 9,13 ± 0,85 mM echivalenti Trolox/g materie proaspată pentru VAM (recoltat in Decembrie) și 0.37 ± 0.89 mM echivalenti Trolox/g materie proaspată pentru VAA, recoltat în Mai.

Extractele etanolice de vâsc prezintă o inhibiție ridicată a radicalului peroxil, indus de oxidarea fluoresceinei (principiul de baza a metodei ORAC). Valori ridicate au fost înregistrate în cazul extractelor din frunze ale VAP, recoltate în Iulie (10,73 ± 1,90 mM echivalenti Trolox/g materie proaspată) și VAP recoltate în Mai (10,42 ± 3,83 mM echivalenți Trolox/g materie proaspată). În general activitatea antioxidantă dintre extractele etanolice de frunze și tulpinițe nu diferă semnificativ din punct de vedere statistic.

Figura I.8. Capacitatea antioxidantă (determinată prin metoda ORAC) a extractelor de vâsc (apoase și etanolice) din frunze și tulpinițe, exprimată în mM echivalenți Trolox/g greutate proaspătă, recoltate în 3 perioade diferite. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviația standard (n=2) și evaluate prin testul two-way ANOVA și Bonferroni post-test pentru a compara fiecare extract cu extractul VAA. (Vicas și colab., 2011b).

Determinarea activității antioxidante a vâscului prin metoda TEAC

Pe baza rezultatelor obținute, s-a pus in evidență că toate extractele investigate (apoase sau etanolice, frunze și tulpinițe) recoltate în trei perioade diferite (Mai, Iulie și Decembrie) au abilitatea de a indepărta cationul radical ABTS*+ (Figura I.9).

Nivelul cel mai ridicat de îndepărtare a radicalului cation ABTS*+ l-au prezentat extractele apoase comparativ cu extractele etanolice. Extractele apoase din frunzele de vâsc care semi-paraziteaza Robinia pseudoacacia (VAR) au prezentat cea mai ridicată valoare TEAC (1,7 ± 0,04 mM echivalenti Trolox/g materie proaspată) în timp ce in cazul extractele etanolice nivelul cel mai înalt de indepărtare a radicalului ABTS*+ a fost inregistrat în cazul extractelor din frunze VAP și VAF (0,96 ±0,005, respectiv 0,95 ± 0,106 mM echivalenti Trolox/g materie proaspată), recoltate în Iulie.

Figura I.9. Potențialul antioxidant (determinată prin metoda TEAC) a extractelor de vâsc (apoase și etanolice) din frunze și tulpinițe, exprimată în mM echivalenți Trolox/g greutate proaspătă, recoltate în 3 perioade diferite. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviația standard (n=2) și evaluate prin testul two-way ANOVA și Bonferroni post-test pentru a compara fiecare extract cu extractul VAA. (Vicas și colab., 2011b).

Determinarea fenolilor totali prin metoda Folin-Ciocalteu

In Figura I. 10, este prezentat comparativ conținutul fenolic total din frunzele de vâsc, recoltate în trei perioade diferite (Mai, Iulie, Decembrie). În general, conținutul în compuși fenolici a fost mai ridicat în extractul apos comparativ cu extractul etanolic. În extractul apos de frunze, nivelul cel mai ridicat a fost inregistrat în cazul VAR (209,51 ± 0,01 µgGAE/ g materie proaspătă), recoltat în Mai, în timp ce valoarea scăzută a fost de 83,93 ± 0,001 µg GAE/ g materie proaspătă în cazul extractului VAF, recoltat în Iulie.

Figura I.10. Conținutul fenolic din extractele de frunze de vâsc (apos și etanolic) exprimat în µg GAE/g materie proaspătă recoltate în 3 perioade diferite (Mai, Iulie și Decembrie) de pe 5 arbori gazdă diferiți. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviația standard (n=2) și evaluate prin testul two-way ANOVA și Bonferroni post-test pentru a compara fiecare extract cu extractul VAA. (Vicas și colab., 2011b).

În extractele etanolice, conținutul fenolic total cel mai ridicat a fost înregistrat în cazul extractului VAM (58,97 ± 0,009 µg GAE/ g materie proaspată), recoltat în Decembrie, urmat de extractul VAA (51,96 ± 0,006 µg GAE/ g materie proaspată).

I.4.5. Concluzie

Arborele gazdă semiparazitat de V. album, precum și timpul de recoltare, poate avea un rol cheie în ceea ce privește compoziția în compuși fenolici din frunze și stem, precum și capacitatea antioxidantă a acestei plante.

Valorile diferite obținute, în urma metodelor antioxidante, depinde foarte mult de metodologia utilizată; în general nu se inregistrează corelații evidente între valorile obținute prin diferite metode antioxidante. Potențialul antioxidant este reflectat printr-un complex de molecule ce actionează sinergic, și nu este atribuit doar compușilor fenolici.

Diferențele înregistrate în cazul determinării activității antioxidante din frunze și tulpinițe de V. album de pe diferiți arbori gazdă, recoltați în trei perioade diferite, poate fi atribuită factorilor de mediu (climă și temperatură) care pot afecta semnificativ acumularea compușilor antioxidanți din țesuturile plantelor.

I.5. Evaluarea in vitro a efectului antiproliferativ asupra celulelor tumorale a extractului de vâsc

I.5.1. Context

Interesul științific pentru vâsc a fost trezit în secolul XX, când Gaultier în anul 1907, respectiv 1910 a studiat efectele administrării pe cale orală și subcutanată a unor extracte proaspete de vâsc (Viscum album L.) la animale și la om (Büssing, 2000).

Partea utilizată din vâsc sunt frunzele cu tulpinițele deoarece acestea conțin cantități mari de principii active: saponozide triterpenice, alcooli (viscoli), amine (colină, acetilcolină), aminoacizi, vitamine (C, E), glicozizi, polipeptide (viscotoxină). Vâscul se recoltează îndeosebi în perioada de iarnă, deoarece se distinge mai ușor din coroana arborilor și se evită ușor confuzia cu vâscul de stejar (Loranthus europaeus). Motivul real pentru care, în general, vâscul este recoltat iarna se datorează faptului că glicoproteina (lectina), considerată componentul bioactiv al vâscului, se sintetizează în cantitate mare în această perioadă a anului. Ca și acțiune farmacologică vâscul este un hipotensor accentuat, vasodilatator coronian, și periferic, antispasmodic și este recomandat în special în cazuri de hipertensiune. Vâscul mai este recomandat și în cazuri de ateroscleroză și tulburări circulatorii, crize de astm, tuse convulsivă, sughițuri persistente, migrene legate de creșterea tensiunii (Crăciun F. și colab., 1991).

În urma multor studii efectuate in vivo și in vitro s-a demonstrat că vâscul are o serie de efecte terapeutice precum: vasodilatator, sedativ, cardio-depresiv, diuretic, antiinflamator și imunostimulator (Hajtó și colab., 2005).

În fitoterapie, maceratul de vâsc este recunoscut ca unul dintre cele mai redutabile remedii în hipertensiunea arterială, dar este folosit și ca diuretic (datorită colinei și saponozidelor). În Evul Mediu a fost folosit ca medicament antiepileptic. S-a mai folosit și ca antitumoral, în papiloame, datorită proprietăților necrozante ale viscotoxinei. Vâscul de stejar are proprietăți antiepileptice demonstrate la cai.

I.5.2. Obiectiv

În cadrul acestui studiu de cercetare s-a testat efectul antiproliferativ a extractului de vâsc care parazitează mărul (Mallus domestica) asupra celulelor tumorale de ovar uman A2780.

I.5.3. Materiale și metode

Materialul vegetal

Frunzele și tulpinile de vâsc (recoltate în luna Februarie, 2010) au fost uscate, timp de 3 zile, în etuvă, la 600C, si apoi au fost măcinate. Pudra (41,9 g) obținută a fost tratată cu cloroform (în scopul îndepărtării părții lipofile din frunze) în raport de 1:4 (g/v), timp de 24 de ore la întuneric. După îndepartarea cloroformului, prin filtrare și uscare în aer cald, pudra uscată obținută a fost imersată într-o soluție de etanol 70%. Volumul soluției de etanol utilizat a fost de 10 ori greutatea probei. Soluția de etanol cu probele de frunze și tulpinițe, a fost menținută timp de 24 de ore sub agitare la temperatura camerei, în intuneric și apoi filtrată. Etanolul a fost îndepărtat cu ajutorul unui rotavapor, iar extractul apos a fost liofilizat cu ajutorul aparatului Freeze-Dryer. În urma procesului de liofilizare s-au obținut 7,43 g pudră pentru proba VAM, randamentul de obținere al extractului fiind de 17,75 % . Pudra obținută în urma procesului de liofilizare a fost păstrată la -200C, înainte de a fi utilizată pe culturi de celule. Pentru utilizarea extractului de vâsc în tratarea celulelor de ovar, s-a realizat o solutie stoc de vâsc (50 mg/ml) care a fost pastrată la -200C, înainte de a fi diluată.

Cultura de celule

Celulele aderente epiteliale tumorale de ovar uman A2780 (ECACC: 93112519) au fost cultivate în mediu RPMI suplimentat cu ser fetal 10%, la o temperatură de 37 0C, 5% CO2, și umditate relativă 90%. Linia A2780 a fost obținută dintr-un țesut tumoral al unei paciente netratate. Celulele cresc în monostrat sau în suspensie. A2780 este linia celulară parentală a liniei A2780 cis rezistente la cisplatină și a liniei A2780 ADR rezistente la adriamicină. După atingerea confluenței, celulele au fost tripsinizate și însămânțate în vase de cultură.

Vizualizarea celulelor tumorale tratate cu extract de vâsc la microscopul cu fluorescență

Celulele tumorale A2780 (1 x 104 celule / godeu) au fost tratate cu diferite concentrații de extract de vâsc (50 – 200 µg/ml) și incubate la 370C, timp de 24 de ore. După spălarea celulelor cu PBS, s-au fixat în metanol rece timp de 10 minute. Celulele au fost apoi colorate cu 0,1µg/ml soluție DAPI pentru 6 minute , după care au fost pălate de 3 ori cu PBS și apoi vizualizate la microscopul cu fluorescență (Zeiss, Germany), magnitude 40X.

Testarea viabilității celulare după tratamentul cu vâsc prin metoda MTT

Celulele tumorale A2780 au fost însămânțate în număr de 104 celule/godeu într-o placă cu 96 godeuri. După 24 h ore s-au tratat cu diferite concentrații de extract de vâsc (VAM). Soluția stoc a fost diluată în mediu pentru a obține urmatoarele concentrații: (50, 90, 110, 130, 150, 170 și 200 µg/ml).

Numărul celulelor viabile a fost determinat cu ajutorul reactivului de proliferare celulară MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide). MTT (200 µl, in concentratie de 0.5 mg/ml in tampon HBSS) traversează membrana celulară și trece în mitocondrie unde este redus la un produs colorat (violet), insolubil numit formazan, în timpul unei incubări la 37˚C, timp de 2 ore. Celulele sunt solubilizate într-un solvent organic (de exemplu, DMSO = dimetil sulfoxidul), 200 µl și reactivul, formazan, eliberat și solubilizat este măsurat spectofotometric la lungimea de undă de 550 nm, respectiv la 630 nm (pentru background) cu ajutorul unui cititor de placi HT BioTek Synergy (BioTek Instruments, USA). Dearece MTT poate pătrunde doar în mitocondria celulelor vii, active metabolic, poate fi utilizat în determinarea viabilității celulelor. Rezultatele s-au exprimat ca procent al viabilității celulare comparativ cu controlul

Determinarea speciilor reactive de oxigen (ROS) după tratamentul celulelor tumorale cu extract de vâsc

Celulele tumorale au fost incubate pentru 24 de ore cu diferite concentrații de vâsc, după care s-a determinat speciile reactive de oxigen. Principiul metodei constă în oxidarea 2’, 7’-diclorodihidro -fluoresceina diacetat (DCF-DA) de către peroxizii intracelulari, cu formarea compusului fluorescent diclorofluoresceina (DCF), a cărei fluorescență (excitația 485/10 nm și emisia 528/20nm) a fost monitorizată la un cititor de plăci (BioTek) timp de 4 ore la 370C.

I.5.4. Rezultate și discuții

Extractul de vâsc a fost caracterizat prin HPLC din punct de vedere al compoziției în compuși bioactivi de tipul acizilor fenolici și flavonoide. Interpretarea cromatogramelor s-a realizat pe baza timpilor de retenție și a spectrelor UV ale fiecărui standard de acid fenolic și flavonoid în parte. În Figura I.11, este prezentată cromatograma extractului de vâsc care parazitează mărul (VAM).

Acizii fenolici majoritari identificați în proba VAM au fost acidul gentisic, acidul clorogenic, acidul cafeic, acidul trans-cinamic și acidul rosmarinic. În proba VAM în cantitatea cea mai mare se regăsește acidul gentisic 489,97 μg/g și acidul clorogenic 648,93 μg/g. Acidul cafeic în proba VAM are o concentrație de 108,02 μg/g. Acizii rosmarinic și trans-cinamic sunt în concentrație de aproximativ 150 μg/g în vâscul ce parazitează mărul. Dintre flavonoide s-a identificat naringenina în proba de vâsc, în concentratie de 283.57 μg/g. Acizi fenolici ca protocatecuic, siringic, sinapic și flavonoidele: quercetina și kaemferol nu au fost identificate în acestă probă de vâsc.

Figura I.11 Cromatograma extractului de vâsc care parazitează mărul (VAM) recoltat în luna Februarie, 2010 (Rugina și colab., 2010)

Luczkiewicz și colab. (2001) au investigat calitativ și cantitativ compoziția în acizi fenolici a vâscului (Viscum album) care parazitează diferiți arbori gazdă, punând în evidență că există o corelație directă între conținutul compușilor bioactivi și arborele gazdă pe care îl parazitează vâscul.

Viabilitatea celulară (Figura I. 12) este exprimată ca procent din control, considerat 100%. Prin această metodă s-a demonstrat că incubarea celulelor tumorale de ovar cu extractul VAM determină o scădere a numărului de celule viabile, în intervalul de concentrații 90 µg/ml – 200 µg/ml. Concentratia extractului care a inhibat cu 50 % viabilitatea celulelor A2780 după 24 h de tratatament este 170 µg/ml.

Punând în evidență efectul antiproliferativ a extractului de vâsc (VAM), în următoarea etapă s-a trecut la investigarea mecanismelor celulare și moleculare prin care extractul își exercită acest efect în linia celulara tumorala A2780. Astfel, celulele A2780 au fost tratate cu diferite concentrații de extract de vâsc: 0 µg/ml, 50 µg/ml, 70 µg/ml, 90 µg/ml, 110 µg/ml, 130 µg/ml, 150 µg/ml, 170 µg/ml, 200 µg/ml pentru 24h, și s-a urmărit efectul extractului de vâsc asupra morfologiei celulelor tumorale prin tehnici de microscopie.

Utilizând microscopul cu inversie (Zeiss, Germany), magnitude 40X, în Figura I.13 se observă că celulele tumorale tratate cu diferite concentrații de vâsc își schimbă morfologia, în una caracteristică tipului de moarte celulară apoptotică, prin prezența corpilor apoptotici și a membranei celulare intacte (săgețile roșii indică existența celulelor apoptotice). Necroza celulară a fost observată doar la concentrația de 200 µg/ml ale extractului.

Figura I.12. Rezultatele testului MTT de proliferare celulară pentru celulele tumorale de ovar uman tratate cu vâscul care parazitează Mallus domestica

Cu ajutorul microscopului cu fluorescență s-au pus în evidență nucleii fragmentați prin colorare cu DAPI (Figura I.14). DAPI este un fluorofor care se atașează de ADN-ul dublu catenar. DAPI are o excitație maximă la 345 nm și o emisie maximă la 455 nm.

S-au luat în studiu celule tumorale de ovar netratate (control) și celule tratate cu diferite concentrații de vâsc pentru 24h. După cum se poate observa în Figura I.14, după 24 ore de tratament cu extract de vâsc de concentrație 70 μg/ml s-au identificat corpii apoptotici, însă schimbări majore ale morfologiei celulare (creștere nucleară, agregarea și condensarea a ADN-ului) s-au putut observa după tratamentul celulelor cu concentrații de 90 μg/ml, respectiv 110 μg/ml de extract de vâsc (VAM).

Figura I.13 Morfologia comparativă a celulelor tumorale de ovar netratate și tratate cu extracul VAM pentru 24 ore. Morfologia celulelor a fost imortalizată utilizând microscopia cu inversie, magnificație 40X (săgețile roșii indică existența celulelor apoptotice)

Figura I.14. Morfologia comparativă a celulelor tumorale de ovar netratate și tratate cu extracul VAM pentru 24 h. Morfologia celulelor a fost imortalizată utilizând microscopia cu fluorescență, magnificație 40X (săgețile roșii indică existența celulelor apoptotice)

Rezultatele obținute au demonstrat că extractul de vâsc induce apoptoza în celulele tumorale ovariene prin modularea producției de ROS. S-a investigat producerea de ROS intracellular atât în celulele netratate cât și în cele tratate cu diferite concentrații de vâsc (Figura I.15). O concentrație de 70 μg/ml de extract de vâsc, induce un efect semnificativ toxic, prin generare de ROS. În schimb, la concentrații de extract de vâsc de 90 și 110 μg/ml, cantitatea de ROS nu crește semnificativ comparative cu controlul.

Figura I.15. Extractul de vâsc induce apoptoza prin producerea de ROS în liniile celulare tumorale A 2780

I.5.5. Concluzii

Pe baza rezultatelor obținute cu privire la compoziția în compuși bioactivi și a capacității antioxidante testate pe extracte de vâsc care parazitează diferiți arbori gazdă, s-a selectat vâscul care crește pe măr (VAM) pentru evidenția efectul citotoxic asupra celulelor tumorale de ovar A 2780. Rezultatele obținute au demonstrat că extractul de vâsc investigat inhibă proliferarea celulelor tumorale și induce modificări morfologice nucleare celulelor, modificări corelate cu moartea celulară programată (apoptoza). În urma determinării speciilor reactive de oxigen, s-a evidențiat că mecanismul de inducere al apoptozei este prin producere de ROS.

I.6. Testarea in vitro a capacitatii de inducere a enzimelor de detoxifiere (Faza II) in culturi de celule a extractului de vâsc

I.6.1 Context

Majoritatea procarcinogenilor din alimente sau din mediul înconjurător necesită activare metabolică pentru a-și manifesta activitatea carcinogenică. Aceasta este realizată de către enzimele din Faza I care metabolizează procarcinogenii prin reacții de oxidare, reducere sau hidroliză, în metaboliți inactivi sau în metaboliți electrofili care se pot lega apoi covalent de situsuri specifice ale ADN-ului, inițiind astfel procesul de carcinogeneză. Produșii de reacție a enzimelor din Faza I devin substrate ale enzimelor din Faza II (Figura I.16). Aceste enzime inactivează metaboliții electrofili prin reacții de conjugare cu liganzi endogeni, având drept consecință obținerea de substanțe hidrosolubile, mai puțin toxice care pot fi ușor eliminate din organism. Astfel, mecanismul de detoxifiere a organismului nu presupune prezența numai a unei singure reacții chimice, ci reprezintă un proces complex ce implică multiple reacții enzimatice.

Figura I.16. Calea de metabolizare a xenobioticelor de către enzimele de Faza I și II

Inducerea enzimelor de detoxifiere și a enzimelor antioxidante de către agenți chimici naturali sau sintetici, constituie unul din mecanismele de protecție a organismului împotriva carcinogenezei (Surh, 1999). Carcinogeneza este un proces complex care implică trei etape distincte:

inițierea, care este asociată cu apariția unei modificări (se produce într-un timp foarte scurt) care trebuie să devină permanentă și transmisibilă ereditar la celulele fiice,

promoția, care este definită ca secvența de evenimente produse sub acțiunea unui cancerigen sau a unui promotor (agent chimic necancerigen) asupra celulelor inițiate pe care le transformă în celule preneoplazice,

progresia, care este un proces ireversibil, în care are loc producerea de noi clone a celulelor tumorale, caracterizate printr-o capacitate proliferativă crescută.

Agenții chimici de prevenire a cancerului (agenți de chimioprevenire) în funcție de modul în care acționează asupra etapelor carcinogenezei sunt clasificați în agenți de blocare și agenți antiproliferativi (Surh, 2003). Agenții de blocare (de exemplu, cumarinele, fenolii, flavonele, terpenele, indolii, izotiocianații) blochează etapa de inițiere fie prin inhibarea formării metabolițiilor reactivi din carcinogenii parentali, fie prin prevenirea interacției carcinogenului cu moleculele celulare țintă (ADN, ARN și proteine) (Giudice și Montella, 2006). În schimb, compușii antiproliferativi (de exemplu, retinoidele, vitamina E, carotenoidele, inhibitorii lipoxigenazei și ciclooxigenazei) inhibă etapele de promoție și progresie ale carcinogenezei, prin supresarea malignității.

Sistemele enzimatice implicate în detoxifierea cancerigenilor chimici (Enzime de faza II)

Sistemele enzimatice asociate fenomenelor de detoxifiere sunt reprezentate de către UDP-glucuronil transferaza (UGT), glutation S-transferaza (GST), acil-transferaze, metil-transferaze, sulfo-transferaze și NAD(P)H : chinon oxidoreductaza (QR). Aceste enzime prezintă câteva caracteristici generale care le diferențiază net de alte sisteme enzimatice. Aceste caracteristici sunt:

deoarece catalizează reacții de conjugare fac parte în marea lor majoritate din categoria transferazelor,

aproape fără excepție măresc considerabil, prin conjugare, hidrofilicitatea substratului făcându-l ușor excretabil,

sunt sisteme enzimatice inductibile, concentrația lor in vivo putând fi crescută de inductori.

Glutation-S-transferaza (GST)

GST, (EC 2.5.1.18), reprezintă un grup de izoenzime care catalizează conjugarea unor produși electrofili (de origine endogenă sau exogenă) cu glutationul (GSH) conform reacției:

RX + GSH → GS – R + HX

Această ecuație de reacție se aplică derivațiilor halogenați sau detoxifierii agenților alchilanți, proces care decurge printr-un mecanism de substituție nucleofilă bimoleculară. Conjugatele respective sunt metabolizate mai departe prin clivarea resturilor glutamil și glicil, fiind transformate prin acetilare, în acizi mercapturici, care apoi sunt excretați din organism.

GST este unul dintre sistemele enzimatice cele mai răspândite din regnul animal (nevertebrate și vertebrate). La mamifere enzima se găsește în special în ficat și constituie până la 10% din enzimele citosolice ce se pot extrage din acest organ.

Una din proprietățile cele mai importante ale acestei enzime este faptul că prezintă o specificitate redusă de substrat, proprietate necesară detoxifierii xenobioticelor celor mai diverse. Substanțele care pot servi ca substrat pentru această enzimă sunt (Voiculeț și Niculescu-Duvăz, 1991):

compușii halogenați aromatici sau alifatici (1-cloro-2,4-dinitrobenzenul (CDNB), 1,2-dicloro-4-nitrobenzenul, clorura de p-nitrobenzil, iodura de metil etc.),

nitroderivați aromatici (4-nitropiridin-N-oxizii),

compuși nesaturați (alcoolul alilic),

arenoxizii (primari și secundari rezultați din activarea HPA) și oxiranii alifatici (1,2-epoxi-3(p-nitrofenoxi)propan),

hidroperoxidul de cumen.

Spre deosebire de specificitatea redusă de substrat, specificitatea față de glutation este mult mai pronunțată. De exemplu, folosind trans-4-fenil-3-buten-2-onă, nici unul dintre compușii cu sulf luați în studiu (L-acetil-L-cisteină, 2-mercaptoetanol) în afară de GSH nu poate fi folosit ca agent de conjugare (Voiculeț și Niculescu-Duvăz, 1991).

O altă proprietate importantă a acestei enzime constă în faptul că are un caracter inductibil. Această proprietate a GST poate fi exploatată în vederea intensificării detoxifierii substanțelor cancerigene, putând fi deci utilă în chimioprofilaxia cancerului.

Chinon reductaza (NAD(P)H:chinon oxidoreductaza)

Enzima chinon reductaza (EC 1.6.99.2) este inclusă alături de GST și UDP-glucuronozil transferaza, în categoria enzimelor de Fază II, deși ea catalizează reacțiile din Faza I de biotransformare a xenobioticelor (Zhang și Gordon, 2004). Motivul principal care include enzima QR în Faza II este acela că acestă enzimă este indusă de o varietate de agenți chimici, prin intermediul elementului de răspuns antioxidant (ARE) la fel ca și celelate enzime de Faza II (Zhang și Gordon, 2004).

Enzima QR a fost pentru prima dată descrisă de Ernster și Navazio în 1955, când ei au identificat o enzimă neobișnuită din ficatul de șobolan care poate utiliza ca și cofactori atât nicotin adenin dinucleotidul (NADH) cât și nicotin adenin dinucleotid fosfatul (NADPH). Structural, QR este o flavoproteină formată din două subunități identice (Chen și col., 2000).

Enzima QR protejează organismul animal de efectele toxice ale quinonei, menține potențialul antioxidant al unor compuși, cum ar fi ubichinona (coenzima Q) și vitamina E. Ambele substanțe antioxidante sunt substrate ale QR. Coenzimele Q sunt distribuite pe membranele celulare în prezența unui stres oxidativ, devenind substrat al QR, care le transformă în unichinol, astfel prevenindu-se distrugerea fosfolipidelor (Nioi și Hayes, 2004). De asemenea, stabilizează proteina anti-tumorală p53 (proteină, destul de instabilă), care inhibă dezvoltarea tumorii prin inducerea apoptozei.

Natura protectoare a QR împotriva cancerului, a fost pentru prima dată pusă în evidență de Ross și col., 2000, care au observat creșterea activității enzimatice a acestei enzima în urma expunerii la o doză mică de carcinogen. Se postulează că această enzimă, alături de celelalte enzime de Faza II pot preveni apariția cancerului, în stadiul inițial al tumorii datorită potențialului lor de detoxifiere (Kinghorn și col., 2004).

Chinonele, sunt molecule înalt reactive care sunt prezente, fie în organismul uman (de exemplu, estrogenii), fie în mediu înconjurător (în fumul de țigară, gazele de eșapament). Chinonele sub acțiunea enzimelor din Faza I (de exemplu, reductazele P 450) pot fi transformate în intermediari semichinonici, care se pot reorganiza având ca rezultat apariția de radicali liberi, care sunt foarte distructivi pentru celulă. Enzima QR poate reduce chinonele prin intermediul a doi electroni (în loc de unul) la hidrochinone, produși mult mai stabili, care nu sunt distructivi pentru celule și pot fi mai ușor de eliminat din organism.

O altă proprietate importantă a acestei enzime constă în faptul că are un caracter inductibil. Această proprietate a enzimei QR poate fi exploatată în vederea intensificării detoxifierii substanțelor cancerigene, putând fi deci utilă în chimioprofilaxia cancerului.

Cercetările din ultimii ani se concentrează pe găsirea unor compuși naturali de origine vegetală care să poată inducă expresia genică a enzimelor de Fază II, și astfel să poată fi folosiți ca agenți de prevenire a cancerului.

Metabolizarea cancerigenilor chimici reprezintă un proces biochimic complex, în care sunt implicate numeroase sisteme enzimatice. Identificarea și cunoașterea acestor sisteme sunt de primă necesitate în înțelegerea fenomenelor care concură la inducerea leziunii biochimice primare ce constituie punctul de plecare al întregului proces de cancerizare.

În Europa, extractele obținute din Viscum album (vâscul European, cu bobul alb) sunt utilizate pe scară largă pentru tratatrea pacienților cu cancer, dar și cu artroză, hipertensiune arterială, diabet etc. Pâna în prezent, datele din literatura sunt foarte sărace cu privire la abilitatea extractului de vâsc de a fi utilizat ca și agent de prevenire a cancerului.

I.6.2. Obiective

Astfel, în cadrul acestui studiu experimental, s-a testat abilitatea unui extract de vâsc, bogat în compuși bioactivi (de tipul acizi fenolici si flavonoide) asupra inducerii in vitro a enzimelor de faza II in celulele tumorale de ovar A2780.

Pe baza rezultatelor obținute în urma altor studii (Vicas et al., 2011a,b; Rugina et al., 2010), s-a selectat extractul de vâsc care crește pe măr (Mallus domestica), codificat VAM, pentru investigarea modularii activității enzimatice a GST si QR în celulele tumorale de ovar A2780.

I.6.3. Materiale și metode

Prepararea materialului vegetal și extracția, cuantificarea compușilor bioactive

Frunzele și tulpinițele de vâsc (recoltate în luna Februarie, 2010) au fost uscate, timp de 3 zile, în etuvă, la 600C, si apoi au fost măcinate. Pudra (41,9 g) obținută a fost tratată cu cloroform (în scopul îndepărtării părții lipofile din frunze) în raport de 1:4 (g/v), timp de 24 de ore la întuneric. După îndepartarea cloroformului, prin filtrare și uscare în aer cald, pudra uscată obținută a fost imersată într-o soluție de etanol 70%. Volumul soluției de etanol utilizat a fost de 10 ori greutatea probei. Soluția de etanol cu probele de frunze și tulpinițe, a fost menținută timp de 24 de ore sub agitare la temperatura camerei, în intuneric și apoi filtrată. Etanolul a fost îndepărtat cu ajutorul unui rotavapor, iar extractul apos a fost liofilizat cu ajutorul aparatului Freeze-Dryer. În urma procesului de liofilizare s-au obținut 7,43 g pudră pentru proba VAM, randamentul de obținere al extractului fiind de 17,75 % . Pudra obținută în urma procesului de liofilizare a fost păstrată la -200C, înainte de a fi analizată prin HPLC și utilizată pe culturi de celule. Pentru utilizarea extractului de vâsc în tratarea celulelor de ovar, s-a realizat o solutie stoc de vâsc (50 mg/ml) care a fost pastrată la -200C, înainte de a fi diluată.

Cultura de celule

Celulele aderente epiteliale tumorale de ovar uman A2780 (ECACC: 93112519) au fost cultivate în mediu RPMI suplimentat cu ser fetal 10%, la o temperatură de 37 0C, 5% CO2, și umditate relativă 90%. Linia A2780 a fost obținută dintr-un țesut tumoral al unei paciente netratate. După atingerea confluenței, celulele au fost tripsinizate și însămânțate în vase de cultură. Pentru utilizarea extractului de vâsc în tratarea celulelor de ovar, s-a realizat o solutie stoc de vâsc (50 mg/ml) care a fost pastrată la -200C, înainte de a fi diluată.

Determinarea activității enzimatice a enzimelor de Fază II (GST și QR)

Determinarea activității enzimatice a GST

Determinarea activității enzimatice a GST-ului s-a realizat cu ajutorul kit-ului Cayman Glutation-S-transferaza assay, care măsoara activitatea totală a GST-ului. Metoda de determinare a activității GST se bazează pe reacția, catalizată de către enzimă, dintre glutation (GSH) și substratul 1-cloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB), substrat care prezintă un domeniu foarte larg pentru detectarea izoenzimelor GST (izoformele alpha, mu, pi și altele). Interacția dintre glutation și CDNB este total dependentă de prezența enzimei active. Produsul de reacție care se formează (CDNB-GSH) este un dinitrofenil tioeter care poate fi detectat spectrofotometric la 340 nm. Rezultatele obținute sunt apoi standardizate pe baza conținutului de proteine. Cantitatea de proteine s-a determinat prin metoda cu acid bicinchoninic utilizând ca standard albumina serică bovină (ASB).

Etapele care s-au parcurs pentru determinarea activiății enzimei GST din culturi de celule tratate cu extracte de vâsc au fost:

S-au colectat celulele tumorale de ovar A 2780 care au fost tratate cu diferite concentrații de extract de vâsc (VAM), prin centrifugare (1000 – 2000 x g pentru 10 minute la 40C). Apoi s-a realizat sonicarea celulelor recoltate în 1-2 ml de tampon de fosfat de potasiu 100 mM, rece cu pH 7,0 ce conține 2mM EDTA.

Urmează apoi centrifugarea la 10000 x g pentru 15 minute la la 40C.

Supernatantul rezultat s-a folosit pentru determinarea activității GST.

Determinarea activității enzimatice a GST-ului s-a realizat pe o plăcuță cu 96 de godeuri. Reacțiile s-au realizat în triplicat, conform Tabelului I.11.

Tabel I.11

Determinarea vitezei de reacție presupune următoarele etape:

S-a trasat absorbanța în funcție de timp, pentru obținerea pantei (viteza) a porțiunii liniare de pe curbă,

S-a selectat 2 puncte de pe porțiunea liniară a curbei și s-a determinat diferența în absorbanța pe acea perioadă, utilizând următoarea ecuație:

pentru determinarea activității enzimatice s-a folosit formula de mai jos:

Coeficientul de extincție a CDNB este 0,00503 μM-1.

O unitate a activității GST este definită ca și cantitatea de enzimă care produce 1 nmol de produs CDNB-GSH/min la 250C. Rezultatele obținute sunt apoi standardizate pe baza conținutului de proteine din celule.

Determinarea activității enzimatice a QR

Activitatea chinon reductazei (NAD(P)H:quinona oxidoreductaza) E.C.1.6.99.2, a fost determinată utilizând NADPH-ul ca donor de electroni și 2-metil -1,4-naftochinona (menadiona) ca acceptor de electron. Citocromul c este inclus în sistemul tehnicii pentru a re-oxida continuu menadiolul format (Figura I.18). Activitatea enzimatică a fost urmărită prin înregistrarea reducerii citocromului c la 550 nm, utilizând un coeficient de extincție de 18500 M-1cm-1.

Figura I.18. Reacția enzimatică catalizată de chinon reductaza

Activitatea enzimatică QR a fost măsurată conform metodei descrisă de Lind și col., (1990) cu mici modificări. Pentru determinarea activității enzimatice a QR din fracția citosolică s-a procedat în felul următor: s-a realizat o diluție a soluției Triton –X-100 astfel: la 5 ml Triton – X-100, 0,24% s-a adăugat 8 ml apă distilată, soluție care s-a păstrat pe o baie de apă la 370C pe parcursul întregii determinări. Determinarea activității enzimatice a QR s-a realizat pe o plăcuță cu 96 de godeuri. Reacțiile s-au realizat in triplicat, conform Tabelului I.12.

Tabel I.12

Schema de lucru pentru determinarea activității enzimatice aQR in culturile tumorale de ovar

Pentru calcularea activității enzimatice a enzimei QR s-au realizat următoarele etape:

– s-a trasat absorbanța în funcție de timp, pentru obținerea pantei (viteza) a porțiunii liniare de pe curbă ,

– s-a selectat 2 puncte de pe porțiunea liniară a curbei și se determină diferența în absorbanța pe o perioadă de un minut.

Activitatea enzimatică a QR s-a calculat conform formulei de mai jos

ΔAprobă – reprezintă absorbanța înregistrată timp de un minut în cazul probei (fracția citosolică),

ΔAblanc – reprezintă absorbanța înregistrată timp de un minut în cazul blanc-ului

0,003 – reprezintă volumul total din godeu, exprimată in litru,

10-6 – se utilizează pentru transformarea M în µM,

ε– coeficientul de extincție a citocromului c (18500 µM-1cm-1).

I.6.4. Rezultate și discuții

Activitatea GST în celulele control (celule care nu au fost tratate cu extract de vâsc) a fost de 6,98 ± 0.17 nmol/min/mg proteina. O creștere slabă a activității enzimei GST (7,42 ± 0,17 nmol/min/mg protein), comparativ cu controlul, nesemnificativă din punct de vedere statistic (analizată prin testul t, Graph Prism) a fost înregistrată după 48 de ore de la tratamentul celulelor de ovar cu 60 μg/ml extract VaM. În schimb, în urma tratamentului cu o concentrație dublă de extract (120 μg/ml), s-a înregistrat o creștere distinct semnificativa (p < 0,05) comparativ cu controlul (9,66 ± 0,20 nmol/min/mg proteina). La o concentrație și mai mare de extract (240 μg/ml), activitatea enzimei GST a scăzut la valoarea de 6,5 ± 1,4 nmol/min/mg proteina (Figura I.17).

Figura I.17. Efectul diferitelor concentrații de extract de vâsc (VAM) asupra activității enzimatice a GST din celulele tumorale de ovar uman A 2780 (Vicas și colab, 2011c).

Activitatea enzimatică a QR din celulele tumorale de ovar A 2780 control (netratate cu extract de vâsc) a fost de 0,88 ± 0,56 U/mg protein. Adăugarea de 60 μg/ml extract VAM a avut ca rezultat o scădere a activitatii enzimatice (0,43 ± 0,39 U/mg protein), în timp ce dublarea respectiv 120 μg/ml au avut ca rezultat creșterea activității QR (1,35 ± 0,01, respectiv 1,01 ± 0,41 U/mg protein) (Figura I. 19)

Figura I.19. Efectul diferitelor concentrații de extract, VAM asupra activității enzimatice a QR din celulele tumorale de ovar uman A 2780 ((Vicas și colab, 2011c).

I.6.5. Concluzii

Rezultatele acestui studiu (Vicas et al., 2011c) au demonstrat că extractul de vâsc care parazitează mărul, în urma tratamentului pe celule tumorale de ovar A2780, la o concentrație de 120 μg/ml a indus creșterea semnificativă a activității enzimatice a glutation-S-transferazei (P < 0,05), în timp ce activitatea enzimei chinon-reductazei nu a inregistrat modificări semnificative.

Contribuții științifice la stadiul actual al cunoașterii

În Europa, extractele obținute din Viscum album (vâscul European, cu bobul alb) sunt utilizate pe scară largă pentru tratarea pacienților cu cancer, dar și cu artroză, hipertensiune arterială, diabet etc. Datorită diversității produselor de vâsc (de exemplu, Helixor și Isorel, sunt extracte de vâsc obținute prin extracție cu apă rece; Iscador este produs prin fermentarea vâscului; Eurixor și Lectinol sunt extracte apoase de vâsc proaspăt, recoltate de pe plop, în timpul iernii) și constituenților diferiți pe care îi conțin, interpretarea studiilor clinice este dificilă. Pornind de la acestea, unul din obiectivele temei de cercetare au prevăzut un studiu foarte amănunțit cu privire la caracterizarea extractelor de frunze dar si stem (tulpiniță) de vâsc din punct de vedere al conținutului în acizi fenolici și flavonoide. În general, s-a constatat conținutul în compuși bioactivi mult mai mare în frunze comparativ cu stem. Dintre flavonoidele luate în studiu, quercetina a fost prezentă in frunzele tuturor extractelor luate în studiu (cea mai mare cantitate depistându-se în vâscul care crește pe salcâm, 7.90± 0.01µg/g substanță uscată), în timp ce naringenina a lipsit cu desăvârșire, atât în frunze cât și în stem. Dintre acizii fenolici luati în studiu, acidul cafeic, ferulic, sinapic au fost prezenți în toate extractele investigate, în timp ce acidul galic nu a fost detectat. Un alt obiectiv a fost determinarea activității antioxidante a vâscului (folosind ca și solvent de extracție apa și etanolul) utilizand 4 metode complementare moderne (ORAC, TEAC, FRAP, DPPH, Folin-Ciocalteu), în funcție de arborele gazda și timpul de recoltare. Concluziile acestor cercetari (concretizate prin publicarea lor într-un articol ISI) au punctat influența arborelui gazdă și a timpului de recoltare asupra acumulării în vâsc de compuși bioactivi.

Rezultatul cel mai semnificativ obținut din proiect, este realizarea unui screening al diferitelor extracte de vâsc care cresc pe diferiți arbori gazdă, din punct de vedere al conținutului în acizi fenolici și flavonoide, precum și corelarea dintre activitatea antioxidanta și arborele gazdă, precum și a timpului de recoltare.

Originalitatea rezultatului constă în faptul că pentru prima dată in literatură s-a realizat un studiu amănunțit, comparativ între frunzele și tulpina vâscului, atât din punct de vedere al compoziției în compuși fenolici și flavonoide cât și din punct de vedere al capacității antioxidante. Aceste studii, pot sta la baza obținerii unui extract de vâsc cu cantitatea cea mai mare in compuși bioactivi de tipul acizilor fenolici și flavonoidelor și cu activitate antioxidantă înaltă, în funcție de arborele gazdă și perioada de recoltare.

Studiile de literatura cu privire la efectul anti-tumoral a vâscului s-a realizat cu extracte apoase de vâsc, obținute comercial, care conțin diferite tipuri de lectină (ML I, II, III) sau viscotoxină. Aceste proteine sunt considerate compușii cu efect citotoxic dar și imunomodulator asupra celulelor tumorale, ceea ce are ca rezultat utilizarea extractului de vâsc în terapia cancerului. Mecanismele efectelor antitumorale a lectinelor din vâsc nu sunt pe deplin elucidate. Studiile din literatura, au arătat că efectul citotoxic mai pronunțat îl prezintă extractele apoase de vâsc comparativ cu lectina pură, ceea ce sugerează că există și alți compuși (cu acțiune sinergică) care contribuie la efectul anti-tumoral al vâscului. Pe baza celor de mai sus, un alt obiectiv al temei de cercetare a fost de a testa efectul citotoxic și anti-tumoral al unui extract de vâsc, bogat în compuși bioactivi (de tipul acizi fenolici si flavonoide) asupra celulelor tumorale de ovar A2780. Pe baza rezultatelor obținute în prima etapă, s-a selectat extractul de vâsc care crește pe măr (Mallus domestica) pentru investigarea efectului antiproliferativ și antitumoral pe celulele tumorale de ovar A2780. Rezultatul cel mai semnificativ a fost evidențierea că extractul de vâsc bogat in compuși bioactivi a avut un efect citotoxic prin inducerea apoptozei în celulele tumorale de ovar A2780. Până în prezent, studii cu privire la efectul citotoxic al vascului asupra celulelor tumorale de ovar A2780 nu s-au raportat încă în literatură.

Datele din literatură sunt foarte sărace cu privire la abilitatea extractului de văsc de a fi utilizat ca și agent de prevenire a cancerului. Testarea abilității unui extract de vâsc, bogat în compuși bioactivi (de tipul acizi fenolici si flavonoide) asupra inducerii in vitro a enzimelor de Faza II in celulele tumorale de ovar A2780, a fost pentru prima dată raportat. În urma tratării celulelor tumorale de ovar A2780 cu extract de vâsc la o concentratie de 120 μg/ml a avut loc o creștere semnificativă (P<0,05) a activității enzimatice a glutation-S-transferazei, în schimb efectul extractului asupra enzimei chinon-reductazei nu a fost semnificativ din punct de vedere statistic. Originalitatea rezultatului constă în faptul că a fost testat pentru prima oară, abilitatea unui extract de vâsc de a induce in vitro enzimele de Faza II (GST and QR). Cercetarile vor fi extinse si pe studii in vivo, utilizând animale de laborator.

Rezultatele acestui studiu de cercetare au fost valorificate prin publicarea rezultatelor in 3 articole ISI, 9 articole în jurnale indexate în baze de date internaționale, un capitol de carte in editura InTech și participări la 2 Congrese internaționale. Până în prezent, rezultatele acestor publicații au fost citate în 46 de jurnale ISI cu factor de impact sau jurnale indexate în baze de date internaționale.

CAPITOLUL II

GLUCOZINOLAȚII DIN LEGUMELE APARȚINÂND FAMILIEI BRASSICACEAE

În anul 2011, am câștigat o bursă postdoctorală, în cadrul proiectul cofinanțat din Fondul Social European prin Programul Operațional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013, Axa prioritară: 1 “Educație și formare profesională în sprijinul creșterii economice și dezvoltării societății bazate pe cunoaștere”, Domeniul major de intervenție: 1.5 “Programe doctorale și postdoctorale în sprijinul cercetării”, cu titlu Programul Postdoctoral interdisciplinar ”Biotehnologii celulare și moleculare cu aplicații în medicină” (POSDRU/89/1.5/S/60746). Tema de cercetare a făcut parte din modulul 1-Genomică, Proteomică, Metabolomică și Bioinformatică / 1.6. Markeri moleculari pentru autentificarea produselor alimentare. Numele proiectului de cercetare în cadrul bursei postdoctorale a fost ”Glucozinolații, markeri moleculari pentru autentificarea legumelor din clasa Brassicaceae. Efectul procesării culinare aupra cantitații de glucozinolați din diverse legume”. Pe parcursul perioadei de desfășurare a bursei postdoctorale (aprilie 2011 până în aprilie 2013), rezultatele obținute au fost valorificate în 2 articole ISI (din care un articol ISI a primit premiu CNCSIS la ”rezultate cercetări tip articol”), 2 articole BDI, un capitol in cartea ”Green Education for a Green Economy” și participări la diferite Conferințe Internaționale.

Articole ISI

Vicas S.I., Teusdea A., Carbunar M., Socaci S., Socaciu C., 2013, Glucosinolates Profile and Antioxidant Capacity of Romanian Brassica Vegetables obtained by Organic and Conventional Agricultural Practices”, Plant Foods for Human Nutrition, 68 (3), 313-21. (http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11130-013-0367-8) (IF= 2.416).

Vicas SI, Teusdea AC, Carbunar M, Timofte A, Laslo V, Socaci S, Socaciu C., 2015, HPLC Fingerprinting of Glucosinolates during Fermentations Assisted by Chemometric Analysis,Romanian Biotechnological Letters, 20 (6), 11067-11075. (http://www.rombio.eu/rbl6vol20/Cuprins.html)(IF =0.412 ).

Articole BDI

Vicas S., Fetea F., Carbunar M., Socaciu C., 2012, Comparative Fingerprint of Glucosinolates from Brassica Vegetables using HATR/FT-MIR Spectroscopy, Bulletin UASVM, Cluj Napoca, 69 (2), 430-439. (http://journals.usamvcluj.ro/index.php /agriculture/article/ view/8795).

Vicas S.I., Socaci S., Socaciu C., 2012/B, Sinigrin Glucosinolate: Spectral and Chromatographic Characteristics before and after Enzyme-Assisted Sulphatase Hydrolysis, Fascicula Protectia Mediului, volXIX, 299-304.(http://protmed.uoradea.ro/facultate/anale /protectia_mediului/2012B/2012B.html).

Capitol in carte cu ISBN

Vicas SI., Teusdea A., Laslo V., 2015, The changes of some secondary metabolites from fruits and vegetables grown under organic and conventional agricultural practices, in Green Education for a Green Economy, Ed. Universitatii din Oradea, ISBN 978-606-10-1512-2 , pp.147-159.

Participări la Conferințe Internaționale

Vicas SI, Teusdea AC, Dzugan M., Socaciu C., 2014, HPLC screening of sprouts glucosinolates from commercial broccoli cultivars related to the germination time, Glucosinolates &Beyond, Proceeding/ 3rd International Glucosinolates Conference, Wageningen, The Netherlands, Poster 50, p115.

Vicas S.I., Socaciu C., 2013, Glucosinolates, molecular markers for authentification of Brassica vegetables,"The annual International Conference of the RSBMB & The Conference on “Cellular and Molecular Biotechnologies for Medical Applications” – Bucuresti, Rom. J. Biochem.

Vicas S.I., Grava A., 2013, The influence of fermentation conditions on level of glucosinolates content in the white cabbage, 4th International [anonimizat] „Human – Nutrition – Environment, University Rzeszow Iwonicz, Polonia, 29-30.

Vicas S.I., Carmen Socaciu, 2012, Fingerprint of glucosinolates from Brassica vegetables using HPLC chromatography and FT-MIR spectroscopy,"The annual International Conference of the RSBMB & The Conference on “Cellular and Molecular Biotechnologies for Medical Applications” – Bucuresti, Rom.J.Biochem., 49, Suppl.,46-47 (OP 22).

Vicas S.I., Filip C. M., 2012, Antioxidant activity of Brassica vegetables grown under organic and conventional agricultural practices from Romania, 3rd International student [anonimizat] “Human-Nutrition-Environment” – University Rzeszow Iwonicz, Polonia, 6-8.

Vicas S.I., Carmen Socaciu, 2011, Hplc Techniques used to Identify and Quantify Glucosinolates – A Class of S-Containing Phytochemicals from Brasicacee Sp, .The Annual International Conference of the RSBMB & The Conference on “Cellular and Molecular Biotechnologies on Medical Applications”, Sept 28th-30th, Craiova, Romania, (P24).

II.1. Separarea și identificare (cantitativă și calitativă) a glucozinolaților, prin HPLC, din diferite legume din familia Brassicaceae

II.1.1. Context

Fructele și legumele sunt surse bogate în micronutrienți și fibre alimentare, dar de asemenea ele conțin o varietate bogată de metaboliți secundari biologic activi, ce conferă plantelor culoare, aromă, uneori proprietăți antinutriționale sau toxice. Printre aceste substanțe se enumeră, carotenoidele, flavonoidele, saponinele, fitosterolii și glucozinolații (GLS).

În prezent au fost identificați mai mult de 120 de GLS (Verker, 2009). Legumele din genul Brassica care conțin glucozinolați în cantități mari, sunt: varza, varza de Bruxelles (verzișoare), brocoli, conopida și gulia.

GLS sunt un grup de metaboliți secundari sintetizați în plante, cu implicații importante pentru sănătatea umană.

GLS și produșii lor de degradare prezintă un interes particular în cercetările alimentare datorită: proprietăților nutritive și antinutriționale; efectelor adverse al unor GLS asupra sănătății; proprietăților anticarcinogene; conferă aromă și miros caracteristic legumelor Brassica.

În particular, unii produși de descompunere a GLS sunt toxici pentru unele insecte, și pot fi incluse ca și pesticide naturale. Pe de altă parte, un număr mic de insecte (de exemplu, afidele verzei) utilizează glucozinolații pentru a localiza plantele favorite pentru hrană și pentru a găsi un mediu potrivit pentru depunerea ouălelor. De asemenea s-a demosnstrat și rolul antifungic și antibacterian al acestor compuși .

Glucozinolatul, sinalbin, a fost izolat în anul 1831 de către Robiquet P.J. și Boutron C, din semințele de Sinapis alba (muștarul alb). Ulterior, Bussy A, în 1840, izolează compusul sinigrin din semințele de muștar negru (B. Nigra Koch). În anul 1956, Ettlinger și Lundeen, propune structura chimică a glucozinolațiilor (Figura II.1) și descrie prima sinteză chimică a acestora.

Figura II.1 Structura chimică generală a glucozinolațiilor

Toți glucozinolații posedă o structură chimică de bază comună formată din:

un grup de β-D-tioglucopiranoză,

un fragment de oximă sulfonatată,

o catenă laterală variabilă derivată de la metionină, triptofan, fenilalanină și lanțurile ramificate a unor aminoacizi.

S-au identificat peste 120 de GLS, care diferă unii de alții prin natura radicalului R, derivat de la unul din cei opt aminoacizi. Astfel, glucozinolații pot fi clasificați în funcție de aminoacizii precursori în alifatici (compuși derivați de la Ala, Leu, Ile, Met sau Val), aromatici (Phe, Tyr) sau indoli (Trp) (Tabelul II.1).

Cei mai numerosi GLS, sunt cei care conțin catene de carbon simple sau ramificate. Mulți dintre acești compuși conțin duble legături (olefine), grupări hidroxil sau carbonil sau legături cu sulf. Atomul de sulf poate exista în diverse stări de oxidare (de exemplu, metiltioalchil-, metilsulfinilalchil-, sau metilsulfonilalchil).

În cadrul familiei Brasiccaceae, fondul genetic al plantei reprezintă un factor hotărâtor în ceea ce privește concentrația de GLS, alături de condițiile de mediu și factorii fiziologici, care influențează expresia și acumularea de GLS. Datele din literatura (Hong și colab. 2011; McNaughton & Marks, 2003; Fahey și colab., 2001; Ciska și colab., 2000; Kushad și colab., 1999), arată că fiecare specie din cadrul familiei Brassicaceae are un profil distinct al GLS, și diferite specii aparținând aceluiaș gen, precum și diferiți cultivari aparținând aceleași specii prezintă o variabilitate mare în ceea ce privește concentrația în GLS.

În ultimii ani, numeroase studii de cercetare s-au concentrat pe studiul acestor compuși. Motivul acestui interes crescut este datorat corelației puternice dintre consumul legumelor crucifere și scăderea riscului de apariție a cancerului de pancreas, plămâni, stomac, colon, rectal și de prostată (Benito și colab., 1990; Cohen și colab., 2000; Le Marchand și colab., 1989; Olsen și colab., 1989; Van Pop-pel și colab., 1999).

GLS intacți prezenți în matricile vegetale sunt din punct de vedere biologic inactivi, dar după distrugerea celulelor vegetale, ei sunt rapid hidrolizați de către enzima glucozidază (mirozinaza, EC 3.2.3.1), cu formare de glucoză și agliconi instabili care în urma unor rearanjări moleculare se transformă în diferiți produși de hidroliză (Bones & Rossiter, 1996). De exemplu, izotiocianații, sunt produșii de hidroliză, și numeroase studii sugerează că aceștia ar fi responsabili de efectele de protecție a organismului împotriva cancerului (Figura II.2, A) (Faulkner și colab., 1998; Tawfiq și colab., 1995). Unul din mecanismele propuse prin care produșii de hidroliză a GLS iși exercită efectul anticarcinogen este modularea enzimelor de detoxifiere de FazăI și/sau Fază II (Das și colab., 2000). Glucoraphanin, în urma hidrolizei enzimatice, formează sulforaphan (Figura II. 2 B), izotiocianat cu activitate anticarcinogenă și cu un spectru larg anti-microbian, inhibând creșterea unor bacterii gram -pozitive și – negative, cum ar fi Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, și Cryptococcus neoformans (Fahey și colab., 2001; Johansson și colab., 2008).

Figura II. 2. A. Mecanismul de acțiune prin care GLS își exercită efectul anticancerigen; B.Hidroliza enzimatică a glucoraphanin-ului cu formare de sulforaphane, izotiocianat cu activitate anticancerigena (Vicas și colab., 2014)

În ultimii ani, cercetările științifice s-au focusat asupra influenței practicilor agricole (organice vs conventionale) asupra compoziției chimice, în special asupra metaboliților secundari, de exemplu, GLS sau compusi polifenolici, din diverse fructe și legume. Opiniile cu privire la influenta practiciilor agricole asupra profilului și a cantității de compuși bioactivi, sunt controversate. Astfel în cazul utilizării pesticidelor sintetice și fertilizanților minerali solubili, în agricultura convențională s-a modificat fingerprint-ul GLS (Brandt & Molgaard 2001; Meyer & Adam S, 2008), în schimb conținutul în polifenoli și activitatea antioxidantă a cinci cultivari de măr (Valavanidis A și colab., 2009) nu au fost influentati de practiciile agricole (organic vs conventional). Picchi și colab., 2012 au comparat conținutul în GLS din două genotipuri de conopidă, cultivate atât în sistem organic cât și convențional. Rezultatele au demonstrat că practiciile organice influentează pozitiv conținutul în GLS, fiind dependent și de genotip. Astfel de studii aduc informații utile cu privire la obtținerea unor varietăți de legume cu conținut ridicat în compuși bioactivi (Cartea și colab., 2011).

Alte studii, au relevant diferențe semnificative din punct de vedere al profilului de GLS (în special, cei indolici) în cazul legumei brocoli și varza roție crescute în sistem ecologic și convențional (Meyer & Adam S, 2008)

Studiile de cercetare (Vallejo și colab., 2003; De Pascale și colab., 2007; Li și colab., 2008; Cartea și colab., 2011) au demonstrate ca practiciile agricole pot modifica calitatea plantei (din punct de vedere al compozitiei chimice). Nutrienții cheie, cum sunt azotul și sulful, sunt implicați atât în controlul calității plantei dar și a producției, cât și în cazul biosintezei de metaboliți secundari (polifenoli și GLS). Alte studii de cercetare (Sousa și colab., 2005; Young și colab., 2005; Zhao și colab., 2009), au demonstrat că legumele cultivate în sistem organic duc la creșterea cantității de metaboliți secundari, deoarece aceste culturi sunt mult mai susceptibile atacului insectelor, un stress biotic ce contribuie la creșterea de compuși polifenolici și GLS, ca și molecule de apărare (Cartea și colab., 2011).

II.1.2. Obiectiv

Obiectivul acestui studiu a fost de a investiga profilul în GLS din cinci legume aparținând clasei Brassica (broccoli, conopida, gulie, varza alba și rosie) cultivate atât în sistem organic (org.) cât și convențional (conv.) din Nord-Vestul României. Utilizând metode biostatistice, ca Analiza Componentului Principal (PCA), am dorit sa punem în evidență dacă există discriminări semnificative din punct de vedere al cantității în GLS, între cele două practici agricole, organice și convenționale.

II.1.3. Materiale și metode

Materialul vegetal

Materialul vegetal a fost reprezentat de legumele din clasa Brassica: broccoli (cultivarul Groene Calabrese), conopidă (cultivarul Frisca F1), gulie (cultivarul Delikatess weisser), varza albă (cultivarul Leonard F1) și varza roșie (cultivarul CB10089 F1). Aceleași legume au fost cultivate atât în sistem convențional cât și organic în cadrul unei microferme (cerificată de către ECOCERT 007) din Nord-Vestul Romaniei (Localitatea Husasău de Tinca) (Figura II. 3). Suprafața totală a fermei este de 0.4 ha, din care 0.20 ha a fost utilizata pentru acest studiu. La o distanță de 20 de metri față de ferma organica, 0.1 ha au fost destinate pentru cultivarea acestor legume în sistem conventional. Pentru fiecare legumă în parte, s-au folosit două rânduri, fiecare cu câte 25 de plante. Distanța între rânduri și în interiorul rândurilor a fost specific pentru fiecare legume în parte. De exemplu, pentru broccoli și conopidă, rândurile au fost spațiate la 0.7 m și 0.35 m în cadrul rândului; la gulie distanța dintre rânduri a fost de 0.5 m și de 0.25 cm în interiorul rândului; pentru varza alba a fost de 0.7 m, respectiv 0.35m iar pentru varza roșie de 0.5 m, respective 0.3 m. În cazul cultivării legumelor în sistem organic, ferilizarea s-a realizat de două ori cu produsul Agriful (fertilizator natural), iar în cazul culturilor conventionale s-a utilizat un fertilizator complex (15%N-15%P2O5-15%K). Pentru controlul insectelor, s-a utilizat un macerat de urzica (Urtica dioica) în cazul legumelor organice, în timp ce în cazul celor conventionale s-a utilizat produsul Calypso (ce conține ca și compus bioactiv, thiacloprid). Părțile comestibile ale legumelor au fost recoltate la finalul lunii Octombrie 2011, rapid congelate și liofilizate (freeze dryer Alpha 1-2 Christ (Martin Christ, Osterode am Harz, Germany), iar pudra obtinută a fost păstrată la -20oC.

Figura II.3. Localitatea (cercul galben-Husasău de Tinca) din care s-au recoltat probele (broccoli, conopidă, guile, varză albă și roșie) cultivate atât în sistem organic cât și convențional

Extracția glucozinolațiilor din legumele Brassica

Extracția GLS s-a realizat după metoda oficiala EU (EEC regulation N1864/90). Pe scurt, aproximativ 200 mg de proba liofilizată (în duplicat) a fost extrasă de 2 ori, cu 5 ml de metanol 70%, fierbinte (pentru inactivarea enzimei mirozinaza), menținută pe o baie de apă la 80oC, timp ce 5 minute, apoi centrifugată la 5000 rpm pentru 20 de minute. Un mililitru din extract a fost introdus pe o minicoloană umplută cu 0,6 ml de rășină schimbătoare de anion DEAE-Sephadex A-25, care a fost în prealabil condiționată cu tampon acetat 25 mM, pH 5,6. După spălarea cu 3 ml de tampon, un volum de 200 µl de sulfatază purificată a fost încărcată pe minicoloană și lăsată peste noapte pentru a realiza reacția de hidroliză enzimatică a GLS prezenți în extract (Figura II.4). A doua zi, s-a realizat eluția GLS cu 3 ml de apă ultrapură și apoi probele au fost supuse analizei HPLC. O cantitate cunoscută de glucotropaeolin (200 µl de 1 mg/ml) a fost adăugat fiecărei probe de Brassica înainte de extracție pentru determinarea cantitativă a GLS.

Figura II.4. Reacție de hidroliză enzimatică a glucozinolațiilor cu obținere de desulfo-glucozinolați, compuși analizați prin HPLC

Analiza HPLC a glucozinolațiilor din extractele de Brassica

Analiza cromatografică s-a realizat cu ajutorul unui sistem HPLC (Shimadzu Corporation, Scientific Instruments, Kyoto, Japan) echipat cu un controller CBM-20A, o pompă LC-20AD, un degazor DGU-20A, un autosampler SIL-20AC, un cuptor pentru coloană CTO-20AC și un detector foto diode array (SPD-M20A, PDA). Coloana cromatografică folosită a fost Platinum (C18) 100Å, (250 x 4.6 mm, 5 μm), la 30oC, utilizând o viteza de scurgere de 0,5 ml/min și o injectare a probei de 20 µl. Datele obținute au fost procesate de programul Labsolution version 5.10.153 (Shimadzu). Faza mobilă a constat în eluentul A (apa) și eluentul B (acetonitril) utilizânt următorul program de gradient: 1 min 1%B; 22 min gradient linear pana la 22% B; 10 min gradient linear până la concentrația de 1% B. Eluția desulfo-GLS a fost monitorizată la 229 nm. Desulfo-GLS au fost identificați după timpul de retenție, utilizând standarde și după spectrul UV-Vis. Conținutul în glucozinolați a fost exprimat în μmol/g substanță uscată (s.u), utilizând ca și standard intern glucotropaeolin și luând în considerare și factorii de răspuns pentru fiecare desulfo-GLS.

Analiza statistica

Toate legumele au fost analizate de 2 ori independent, în duplicat. Pentru a compara rezultatele obținute s-a folosit testul ANOVA (one-way analysis of variance), testul Tukey. Principal component analyses (PCA) a fost utililizat pentru a stabili discriminarea dintre probe în raport cu practicile agricole, organice vs convenționale, în raport cu profilul GLS.

II.1.4. Rezultate și discuții

Amprenta HPLC a desulfo-GLS și conținutul lor în extractele Brassica sunt prezentate în Figura II.5 și Tabelul II.2

Figura II.5. Cromatogramele HPLC a desulfo-GLS din extractele legumelor de Brassica, crescute în sistem conventional (roșu) și organic (verde). Glucozinolații alifatici sunt eluați primii (pe zona hașurată portocaliu), iar cei indolici sunt eluati ultimii (zona hașurată cu roz)

Cromatogramele HPLC a extractelor de legume Brassica prezinta tipare diferite: în broccoli predomină GLS din clasa indol, atât în sistem organic (57.52%) cât și în cel convențional (70.62%) în timp ce în conopidă, GLS alifatici sunt cei predominanți (59.28% în cultura convențională, respectiv 66.40% în cea organică). În gulie, indolii GLS sunt cei predominanți (79.44% în Org, vs 79.27 % în Conv).

GLS predominanți prezenți în broccoli, atât sub cultura Org. cât și Conv. au fost GRA (2.860 μmol/g s.u , respectiv 1.966 μmol/g s.u), GBS (1.353 μmol/g s.u, respectiv 4.592 μmol/g s.u) și NGBS (3.526 μmol/g s.u, respectiv 3.761 μmol/g s.u), în timp ce SIN și GNA nu au fost detectați. Cantitatea de GRA și PRO au fost semnificativ mai mari în probele crescute în sistem organic (P <0.01). Rezultatele obținute au arătat că conținutul în GLS totali a fost mai ridicat în cazul culturii crescute în sistem convențional (14.27 μmol/g s.u) comparativ cu cel organic (9.19 μmol/g s.u). Datele obținute sunt asemănătoare cu cele obținute de Robbins și colab.,2005, care au arătat că practicile organice din agricultura au dus la scăderea de GLS în cazul culturii de broccoli. De asemenea, profilul de GLS este asemănător cu cel raportat de Barbieri și colab., 2008, care au găsit că GBS și NGBS sunt GLS majoritari din cultura de broccoli, urmați de GRA, în timp ce 4OM-GBS și 4OH-GBS, au fost prezenți în cantități mici. Practica agricolă organică a dus la scăderea conținutului în GBS de aproximativ 3 ori, comparativ cu aceași probă crescută în sistem convențional.

Tabel II. 2

Conținutul în GLS (μmol/g s.u) din cinci legume Brassica (broccoli, conopidă, guile, varză albă și roșie)

Opt tipuri de GLS, predominant alifatici, au fost identificați în conopida crescută atât în sistem organic cât și conventional. De exemplu, conținutul în SIN a fost de 1.471 μmol/g s.u, în timp ce conținutul în GIB a fost de 1,503 μmol/g s.u. Din clasa GLS indolici, sub ambele practice agricole, GBS a fost GLS predominant (0,76 μmol/g s.u în sistem Org și 0,73 în sistem Conv). Rezultate similare au obținut și Tian și colab., 2005, care au găsit ca GLS alifatici, SIN și GIB predominanți în conopidă, în timp ce din clasa indolici au predominat GBS și 4OM-GBS. Picchi și colab., 2012, au comparat conținutul în GLS dintre doăa genotipuri de conopidă (Emeraude și Magnifico) și au găsit diferențe în ceea ce privește conținutul de GLS , atât sub cultura organică cât și conventională.

Datele din literatură sunt puține cu privire la conținutul în GLS din gulie. În probele de gulie crescute în România atât sub cultură organică cât și convențională, au fost identificați următorii GLS: PRO, GIB și GRA (din clasa aliftica) și GBS, 4OH-GBS, NGBS (din clasa indol), în timp ce 4OM-GBS nu a fost identificat. Practica agricolă organică a dus la creșterea semnificativă a conținutului în PRO (P < 0,05), și GIB și GRA (P < 0,01). Conținutul în GBS și NGBS (2,77 și respectiv 3,72 μmol/g s.u) a fost de aproximativ 3 ori mai mare în probele organice. McNaughton and Marks, 2003, au dezvoltat o bază de date cu privire la conținutul în GLS din legumele Brassica. Conform bazei de date, conținutul de GLS din gulie variază între 19,07 la 109,30 mg/100 g.

Amprenta HPLC a arătat un model diferit în ceea ce privește conținutul în GLS atât din varza albă cât și din cea rosie. În general, GLS alifatici au predominat în varza alba, atât sub cultura organică cât și convențională (78,45%, respectiv 62,26%). GLS major a fost GIB (1,18 μmol/g s.u) în cultura de varză crescută în condiții convenționale. GRA și GIB, au fost GLS majoritari din varza roșie (1,40, respectiv 1,26 μmol/g s.u) crescută în sistem organic. Conținutul în GRA din probele analizate a fost în cantitate mult mai mică decât cea raportată de Meyer și Adam, 2008. Factorii climatici, de exemplu temperatura și ploile abundente, dar de asemenea deficitul în sulf a solului în timpul perioadei de creștere a legumelor Brasica, pot explica nivelul scăzut de GLS din aceste legume. Pe de alta parte, în condiții de secetă, o creștere a sintezei de aminoacizi și glucide are loc, ceea ce determină o creștere a precursorilor de GLS.

Pentru a determina care GLS imprimă un profil predominant în legumele din clasa Brassica, dar și pentru a stabili o discrimare între legumele crescute în sistem organic și conventional, s-a realizat analiza biostatistică, PCA (Figura II.6).

Analiza PCA în cazul culturii de broccoli și varza albă (Figura II.6, A și D) a generat o separare bună între cele două culturi. Cultura broccoli Conv este poziționată în cadranul pozitiv (F1, 85,63%) ceea ce reflectă o cantitate crescută în GLS comparativ cu cultura organică, pozitionată în cadranul negativ. Probele Conv în cazul culturii de broccoli au un continut ridicat în GIB, GBS, 4OH-GBS, 4OM-GBS comparativ cu proba organică, care contine PRO și GRA în cantitate mai mare. În cazul culturii de varză albă, cultura Org conține toți GLS în cantitatea cea mai scazută, cu exceptia GRA, care nu a fost detectat în cultura Conv. Celelalte trei culturi (conopida, gulie și varza roșie), au cultura Org pozitionată în cadranul pozitiv (Figura II.6, B,C, E), deci o cantitate mai mare de glucozinolați. Cultura Org de conopidă s-a poziționat în cadranul pozitiv, cu F1, 85.71%, în care SIN, PRO, GIB, GRA, GBS, NGBS, 4OHGBS și 4OMGBS, sunt în cantitatea cea mai mare. În cazul guliei, cultura Org conține în cantitate mai mare GIB, GRA GBS și NGBS, în timp ce în cultura Conv predomină PRO și 4OH-GBS. Cultura Org de varză roșie are un conținut ridicat de SIN, GNA,GIB GRA, GBS și NGBS, decât cea Conv în care predomină PRO, 4OH-GBS și 4OM-GBS.

Pentru a evidenția mai bine diferențele în ceea ce privește conținutul în GLS totali, dintre cele două practici agricole, s-a realizat raportul dintre GLS totali din cultura Org și Conv, rezultatele fiind reprezentate în Figura II.7.

Figura II.6. PCA bi-plots a profilului de GLS din broccoli (A), conopidă (B), gulie (C), varză albă (D) și varză roșie (E), obținute din practicile agricole Org și Conv. Triunghiurile reprezintă cultura organică, iar pătratele, cultura conventional (Vicas și colab., 2013).

Figura II.7 Influența practicilor agricole (Org vs Conv) asupra conținutului total în GLS

Dintre cele cinci legume luate în studiu, cantitatea totală de glucozinolații a fost mai mare în sistem Conv comparativ cu cel Org, în broccoli și varza albă, cu un raport de 0,65, respective 0,42.

II.1.5. Concluzii

Pentru prima dată în România este realizat un finger print din punct de vedere al GLS în cazul a cinci legume de Brassica autohtone crescute fie în sistem conventional, fie organic. Practica agricolă Org a determinat o creștere în conținutul de GLS în cazul culturilor de conopidă, gulie și varză roșie în timp ce în cazul culturii de broccoli și varză albă a determinat o scădere în acești compuși bioactivi. Analiza biostatistică PCA a generat din punct de vedere al conținutului în GLS, grupurile Conv și Org separate în cazul tuturor legumelor din clasa Brassica. Datele obtinute au dus la concluzia că GLS sunt markeri moleculari a legumelor din clasa Brassica, putând face discriminarea între cele două practici agricole, Org, respectiv Conv.

II.2. Analiza extractelor de Brassica utilizând spectroscopia HATR/FT-MIR

II.2.1. Context

Cuantificarea glucozinolaților totali și individuali din diferite matrixuri vegetale se realizează prin metoda HPLC, o metodă care implică un consum foarte mare de reactivi de puritate înaltă, un timp îndelungat de analiză și personal înalt calificat (Font și colab., 2005). În schimb, spectroscopiei în infraroșu este o tehnică analitică rapidă, neinvazivă care prezintă o multitudine de avantaje: timp scurt de analiză, un raport cost/probă mic și neutilizarea solvenților toxici. Există studii de cercetare în care spectroscopia IR, în special NIRS (near-infrared spectroscopy) a fost utilizată pentru analiza calitativă și cantitativă a glucozinolaților din semințele aparținând specie Brassica (Biston și colab., 1998; Velasco și Becker, 1998; Font și colab., 2004), frunze (Font și colab., 2005). Font și colab., (2005) au testat potențialul spectroscopiei NIRS pentru screening-ul conținutului în glucozinolați totali din frunzele de rapiță (1.06 – 49.18 μmol/g), unde acești compuși sunt prezenți în concentrație foarte scăzută, comparativ cu semințele.

Spectroscopia Mid-IR, în special ATR-FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) este o metodă pentru măsurarea eliberării izotiocianaților din glucozinolații prezenți în plante, având o regiune specific între 2174-2041 cm-1, specific grupării funcționale –N=C=S (Li-Chan et al., 2010)

II.2.2. Obiectiv

Obiectivul acestui studiu de cercetare a fost de a analiza comparativ, prin spectroscopia HATR/FTMIR, o amprentă a legumelor din familia Brasicaceae (broccoli, conopidă, gulie) din zona de Nord-Vest a României și a 9 glucozinolați puri (desulfo-sinigrină și sinigrină, desulfo-gluconapina, desulfo-progoitrina, desulfo-glucoiberina, desulfo-glucoraphanina, desulfo-glucotropeolina și glucotropeolina, desulfo -glucobrassicina).

II.2.3. Materiale și metode

Materialul vegetalși standardele de glucozinolați

Legumele din familia Brassicaceae analizate au fost broccoli, conopida și gulia, care au fost recoltate în toamna anului 2011, în octombrie de la o fermă ecologică din nord-vestul României. După recoltare, probele au fost rapid congelate și liofilizate utilizând freeze dryer Martin Christ Alpha 1-2 GmbH.

Standardele pure a desulfo-glucozinolaților (sinigrina, gluconapina, progoitrina, glucoiberina, glucoraphanina, glucotropaeolin și glucobrassicin) și a glucozinolațiilor intacți (sinigrina și glucotropaeolina) au fost primite cadou de la dr. Renato Iori, Director a Research Industrial Crop Research Centre Agricultural Research Council, Italy.

Extracția glucozinolaților din legume

Extracția GLS s-a realizat după metoda oficiala EU (EEC regulation N1864/90). Pe scurt, aproximativ 200 mg de proba liofilizată (în duplicat) a fost extrasă de 2 ori, cu 5 ml de metanol 70%, fierbinte (pentru inactivarea enzimei mirozinaza), menținută pe o baie de apă la 80oC, timp ce 5 minute, apoi centrifugată la 5000 rpm pentru 20 de minute. Un mililitru din extract a fost introdus pe o minicoloană umplută cu 0,6 ml de rășină schimbătoare de anion DEAE-Sephadex A-25, care a fost în prealabil condiționată cu tampon acetat 25 mM, pH 5,6. După spălarea cu 3 ml de tampon, un volum de 200 µl de sulfatază purificată a fost încărcată pe minicoloană și lăsată peste noapte pentru a realiza reacția de hidroliză enzimatică a GLS prezenți în extract. A doua zi, s-a realizat eluția ds-GLS cu 3 ml de apă ultrapură și apoi probele au fost supuse analizei FT-MIR.

Analiza FT-MIR

Spectrul Mid-Infraroșu Fourier-Transform (FT-MIR) a fiecărui extract de legume Brassica și a standardelor pure a fost înregistrat între 4000 până la 900 cm-1. Un număr de 64 de scanari a fost acumulat pentru fiecare spectru utilizând dispozitivul Horizontal Attenuated Total Reflection (HATR), în cadrul spectrometrului Shimadzu Prestige 2 FTIR (with apodization Happ-Genzel ). Datele spectrale au fost procesate utilizând IR solution Software Overview (Shimadzu) și OriginR 7SR1 Software (OriginLab Corporation, Northampton, USA). Spectrul FT-MIR a fost înregistrat pe extractele evaporate. Un fingerprint a GLS totali din 3 extracte diferite de Brassica (broccoli, conopida și gulie) a fost determinat prin metoda FTIR, utilizând intensitatea peak-ului de la 1058 cm-1 și 800 cm-1 sau prin determinarea ariei din regiunile 1100-1000 cm-1, 1300-1160 cm-1 și 1300-1000 cm-1. Curba de calibrare s-a realizat cu standardul glucotropaeolin (de la concentrații cuprinse între 0,3 până la 1,5 mg/ml) pentru evaluările cantitative.

II.2.4. Rezultate și discuții

Spectrele HATR/FT-MIR (3500 – 900 cm-1) a nouă glucozinolați standard (alifatici, aromatici și indolici) și a 3 extracte de legume aparținând clasei Brassica au fost înregistrate. Trei regiuni, marcate cu A, B și C au fost identificate în domeniul HATR/FT-MIR, de la 900 to 1680 cm-1:

Regiunea A (1100 -1000 cm-1), care corespunde vibrațiilor de întindere a legăturilor C-O în cazul monoglucidelor (Vodnar și colab.,2012; Zavoi și colab., 2011; Chis și colab., 2011), cu un semnal principal la 1035 cm-1 pentru glucoză și 1058 cm-1 pentru zaharoză;

Regiunea B (1300-1100 cm-1), corespunde vibrațiilor de întindere a legăturilor –SO-;

Regiunea C (1550-1638 cm-1), corespunde heterociclurilor indol (cu un maxim la 1590 cm-1).

Alte regiuni, la mai mult de 1700 cm-1 corespund lipidelor, derivatiilor ceto- și grupărilor OH, incluzând și apa (>3276 cm-1).

Identificarea GLS intacți vs de cei desulfo-GLS prin amprenta HATR/FT-MIR

În Figura II.8 se prezintă comparativ amprenta standardului aromatic glucotropaeolin (GTL) înainte și după desulfatare (ds-GTL). Modificările majore sunt vizibile în regiunile A și B. O scădere puternică a absorbanței în regiunea B indică de-sulfatarea.

În Figura II.9 se prezintă comparativ amprenta ds-GTL și a unui amestec între standardele ds-GTL și ds-GBS. Modificări majore sunt vizibile în regiunea C, prin o creștere puternică a absorbanței dată de gruparea indol.

În Figura II.10 se prezintă comparativ amprenta standardului alifatic SIN înainte și după de-sulfatare. Modificări majore sunt vizibile în regiunea A și B, modificări care s-au înregistrat și în cazul standardului aromatic GTL. O scădere puternică a absorbanței în regiunea B indică de-sulfatarea. Regiunea C pentru standardele alifatice este mult mai puțin complexă comparative cu cei aromatici.

În Figura II.11 se prezintă amprenta FT-MIR a standardului pur GTL (0.3 – 1.5 mg/ml), utilizat pentru realizarea curbei de calibrare

Pe baza ariei FTIR a următoarelor regiuni: 1100-1000 cm-1, 1300-1160 cm-1, 1300-1000 cm-1, glucozinolații totali din legumele Brassica (broccoli, conopida, gulie) au fost determinați utilizând curba de calibrare cu standardul GTL (Figura II.11). Curba de calibrare a fost determinată prin regresie liniară, și ecuațiile au fost: y = 0,3357x – 0,1301 (R2 = 0,9571) pentru regiunea 1100-1000 cm-1 (Regiunea A), y = 0,8954x – 0,2639 (R2 = 0,9758) pentru regiunea B (1300 – 1160 cm-1) și y = 0,4421x – 0,3231 (R2 = 0,9659) pentru regiunea 1300-1000 cm-1, unde x reprezintă aria regiunilor respective și y concentrația GLS, exprimată în mg/ml. De asemenea curba de calibrare a fost determinată și prin înregistrarea intensității absorbanței peak-ului la 1058 cm-1 și 800 cm-1.

În Figura II.12 se prezintă amprenta a trei extracte Brasica (broccoli, conopida și gulie) după reacția de de-sulfatare enzimatică. Se observă dispariția peak-urilor în regiunea B, ceea ce indică desulfatarea. Complexitatea regiunii C indică prezența GLS aromatici. Modificări majore sunt vizibile în regiunile A și B.

Evaluarea cantitativa a GLS totali prin determinarea ariei peak-urilor HATR/FT-MIR

Pe baza curbei de calibrare, GLS totali a extractelor vegetale de Brassica au fost exprimate în mg GTL echivalenți (eq)/100 g greutate proaspătă, pentru a permite compararea cu baza de date realizată de McNaughton and Marks (2003). Rezultatele sunt prezentate în Tabelul II.3

Tabel II.3

GLS totali din extractele de Brassica (mg GTL eq/100 g greutate proaspătă)

Din datele din Tabelul II. 3 se observă că broccoli este cea mai bogată sursă de GLS, aproximativ de 2 ori mai mult decât în conopidă și de 1,2 mai mult decât în gulie. Din baza de date (McNaughton and Marks, 2003) care include rezultatele mai multor lucrări științifice, conținutul în GLS totali din legumele Brassica se situează între: 19,3-127,5 mg/100 g greutate proaspătă pentru broccoli, 19,7-109,3 mg/100 g greutate proaspătă pentru gulie și 11,7-78,6 mg/100 g greutate proaspătă pentru conopidă.

Determinarea ariei peak-ului la 800 cm-1 sau a ariei din regiunea 750-900 cm-1 poate fi utilizată pentru cuantificarea GLS totali. Cuantificarea GLS din regiunea 1300-1000 cm-1, poate conduce la valori mai mari decat cele reale, fiind regiunea de absorbtie a glucidelor.

II.2.5. Concluzii

Prin spectroscopia HATR/FT-MIR se poate măsura rapid și nedistructiv extractele înainte și după reacția enzimatică, evaluând dacă reacția de hidroliză este completă sau nu, informație necesară pentru analiza extractelor prin HPLC. Spectroscopia HATR/FT-MIR aduce informații valoroase în urma realizării unui screening rapid a extractelor vegetale, punându-se în evidență dacă reacția de desulfatare a avut loc. Desi, HPLC rămâne metoda “de aur” prin care se determină GLS, spectroscopia IR rămâne o alternativă de a investiga mai multe extracte într-un timp foarte scurt și relativ ieftin. Pe baza datelor obținute considerăm ca absorbția IR la 800 cm-1 sau în regiunea 750-900 cm-1 este cea mai potrivită pentru cuantificarea GLS.

II.3. Evaluarea capacității antioxidante a legumelor din familia Brassicaceae

II.3.1. Contex

Alături de glucozinolați, în legumele Brassica sunt prezenți și un alt grup de metaboliți secundari, compușii fenolici, cei mai răspândiți fiind flavonoidele. Acești compuși prezintă activitate antioxidantă și de asemenea pot induce expresia a diverse gene ce codifică enzimele metabolice, scăzând astfel riscul apariției diverselor boli. Alături de glucozinolați, compușii fenolici prezintă efecte benefice asupra sănătății și efecte sinergice pot să apară între cele două clase de metaboliți. Recent, Francisco și colab., 2009, au dezvoltat o metode de extracție și identificare a acestor compuși în acelaș timp, din diverse varietăți de B. rapa utilizând LC-UV cu detecție photodiode array (PDA)– ESI (electrospray ionization).

Kusznierewicz și colab., 2008, au caracterizat varza albă, din diferite regiuni ale Europei (Anglia, Belgia, Germania și Polonia) din punct de vedere al cantității în glucozinolați și al activității antioxidante. Rezultatele obținute au demonstrat că, nivelul de compuși bioactivi depinde de mai mulți factori, cum ar fi zona geografică și factorii climatici. În cazul varzei din Belgia, s-a obținut cea mai mare cantitate în glucozinolați, dar a prezentat și cea mai înaltă activitate antioxidantă.

II.3.2. Obiectiv

În studiul de cercetare, s-a urmărit capacitatea antioxidantă prin trei metode diferite (TEAC, DPPH și FRAP), compușii polifenolici totali, a legumelor din familia Brassicaceae crescute fie în sistem organic, fie convențional.

II.3.3. Materiale și metode

Materialul vegetal și extracția compușilor bioactivi

Extractele vegetale liofilizate au fost dizolvate atât în metanol cât și în apa distilată (20 mg/ml solvent), sonicate pentru 15 minute, centrifugate la 5000 rpm, timp de 20 de minute, iar supernatantul obținut a fost utilizat pentru determinarea capacității antioxidante.

Determinarea capacității antioxidante a legumelor

În toate cazurile, ca și standard s-a folosit o soluție Trolox (0-400 µM) pentru realizarea curbei de calibrare.

Metoda TEAC (Trolox Equivalents Antioxidant Capacity)

Principiul metodei constă în abilitatea antioxidanților de a neutraliza radicalul cation 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS). Pe scurt, modul de lucru constă din: dizolvarea în apa a reactivului ABTS pentru obținerea unei concentrații de 7 mM. ABTS+ este produs în urma reacției cu o soluție de persulfat de potasiu 2,45 mM. Acest amestec este păstrat la întuneric, la temperatura camerei, timp de 12-16 ore înainte de utilizare. Această soluție stoc de ABTS este diluată cu etanol până la obținerea unei absorbante de 0,07 ± 0.02 la 734 nm. După adăugarea extractului (100 μl) la 2900 μl soluția ABTS diluată, reacția este monitorizată timp de 6 minute, la 734 nm (Shimadzu mini UV-Vis, Japan). Rezultatele sunt exprimate în µmoli echivalenți Trolox/g s.u.

Metoda DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)

O metodă rapidă, simplă și relativ ieftină pentru a măsura capacitatea antioxidantă a extractelor vegetale, implică utilizarea radicalului liber 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). DPPH este larg utilizat pentru a testa abilitatea compușilor de a acționa ca neutralizatori a radicalilor liberi sau ca donori de hidrogen. Reacția implică modificarea culorii de la violet la galben, reacție care poate fi ușor monitorizată cu ajutorul spectrofotometrului la lungimea de undă de 515 nm (Shimadzu mini UV-Vis, Japan). Metoda DPPH a fost determinată conform metodei descrisă de Vicas și colab., 2011. Pe scurt, 2,8 ml de soluție DPPH, de concentrație de 80 μM a fost introdusă în cuva spectrofotometrului. 200 μl de extract a fost adăugat peste reactiv, iar reacția a fost monitorizată la 515 nm, timp de 5 minute. Procentul de neutralizare a radicalului de către extract, a fost calculat utilizând următoarea ecuație:

Unde, A0 este absorbanța blancului, și As este absorbanța probei.

Curba de calibrare s-a realizat cu ajutorul Trolex-ului și s-a exprimat ca și procent de inhibare a radicalului DPPH.

Metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

Această metodă s-a determinat conform metodei prezentată de Vicas și colab., 2009, cu mici modificări. Principiul metodei constă în reducerea complexului tripiridyltriazina ferica -TPTZ) la complexul tripyridyltriazine feros (Fe(II)-TPTZ), în prezența unui antioxidant, la pH acid. Soluțiile stoc constau în: 300 mM tampon acetat; 250 mg Fe23 · H2O dizolvat în 50 ml apă distilată; 150 mg TPTZ și 150 µl HCl, dizolvat în 50 ml apă distilată. Soluția FRAP de lucru este preparată proaspăt prin dizolvarea a 50 ml tampon acetat, 5 ml soluție Fe2(SO4)3 · H2O și5 ml soluțieTPTZ. Extractele obținute atât în apă cât și în metanol sunt mixate cu 500 μl soluție FRAP de lucru și cu 2000 μl apă distilată. Probele sunt lăsate să interacționeze la întuneric, la temperatura camerei timp de 1 oră. Complexul colorat obținut este cuantificat prin absorbție la 595 nm, cu ajutorul spectrofotometrului Schimatzu UV-Vis. Curba de calibrare s-a realizat cu Trolox, pe un domeniu de concentrație cuprins între 25-400 µM. Rezultatele s-au exprimat în μmoli echivalenți Trolox (TE)/g s.u.

Determinarea compușilor polifenolici totali din legume

Metoda Folin-Ciocâlteu

Compușii polifenolici totali au fost determinați prin metoda Folin-Ciocâlteu (Singleton și colab., 1999, Vicas și colab., 2011). Probele extrase în diferiți solvenți (100 μl), au fost mixate cu 1700 μl de apă distilată și 200 μl reactiv Folin-Ciocâlteu (diluat 1:10, v/v). După aproximativ 3 minute, s-a adăugat 1 ml carbonat de sodiu 15%. Probele au fost apoi incubate la temperatura camerei, la întuneric timp de 2 ore, după care s-a măsurat absorbanța la 765 nm, cu ajutorul spectrofotometrului Schimatzu UV-Vis. Curba de calibrare s-a realizat față de acidul galic pe un domeniu cuprins între 0,05 – 0,3 mg/ml, iar rezultatul a fost exprimat în mg echivalenți acid galic (EAG)/g s.u.

II.3.4. Rezultate și discutii

Capacitatea antioxidanta a extractelor metanolice

Având în vedere că legumele din clasa Brassica, prin compoziția lor în compuși bioactivi, contribuie semnificativ la sănătatea umană, s-au utilizat patru metode pentru evaluarea capacității antioxidante atât a legumelor crescute în sistem organic cât și a legumelor din sistemul conventional (Tabel II.4).

Capacitatea antioxidantă determinată prin metoda TEAC, a variat între 6,004 to 20,266 µmol TE./g s.u, o valoare semnificativ ridicată fiind înregistrată în cazul extractului de broccoli (P < 0.05) cultivat în condiții conventionale. În schimb, gulia din sistemul Org a prezentat o capacitate antioxidantă înalta comparativ cu cea crescuta în sistem Conv.. În general, valoriile TEAC sunt mult mai ridicate comparativ cu cele obținute prin metoda DPPH. Prin ambele metode, varza roșie, atât în sistem Org cât și în sistem Conv prezintă un potențial antioxidant înalt comparativ cu celelalte legume din clasa Brassica (19,177 și 20,266 μmol TE/g s.u în conditii Org și Conv (ABTS), 9,720 μmol TE/g s.u și 5,798 μmol TE/g s.u în conditii Org și Conv (DPPH)). În urma experimentelor, s-a observat că majoritatea extractelor a prezentat o capacitatea antioxidantă slabă sau nedetectabilă prin metoda DPPH. În general, probele crescute în sistem organic prezintă o activitate antioxidantă înaltă, în special în cazul culturii de broccoli și varza roșie (P<0.01), conopidă (P<0.05). Picchi și colab., 2012, au evidențiat că practicile agricole afectează capacitatea de îndepărtare a radicalului DPPH în cazul a două genotipuri de conopidă, Emeraude și Magnifico. Valorile raportate de Kusznierewicz și colab., 2008, pentru varza albă, utilizând metoda DPPH a fost de 1,60 μmol TE/g s.u (în conditii Org), și 1,36 μmol TE./g s.u (în conditii Conv).

Capacitatea antioxidantă determinată prin metoda FRAP a fost înaltă în probele Org, comparativ cu cele Conv, în special pentru conopidă și gulie (P<0.01). Fenolii totali determinati prin metoda Folin-Ciocalteu, în cazul legumelor din clasa Brassica, cultivate atât în conditii Org, cât și Conv sunt prezentate în Tabelul II.4. Valoriile au variat între 0.947 to 3.170 mg GAE/g s.u, cea mai ridicată valoare fiind inregistrată în cazul verzei roții, atât din sistem Org cât și Conv (3,173 respectiv 3,170 mg GAE/ g s.u). Diferențe nesemnificative au fost notate între fenolii din legumele Brassica din sistem Org și Conv, cu excepția extractului de gulie, unde concentrația de fenoli a fost semnificativ mai înaltă în cultura Org comparativ cu cea Conv (P<0,05).

În acest studiu (Vicas și colab., 2013), relația dintre capacitatea antioxidantă și fenolii totali din legumele Brassica a fost evaluată și prezentată în Tabelul II.5. O corelație semnificativă din punct de vedere statistic a fost găsita între fenolii totali și metodele FRAP (P < 0.001), DPPH (P < 0.01) and TEAC (P < 0.05) în cazul extractului de gulie. În cazul extractului de broccoli, o corelatie semnificativa a fost înregistrată între conținutul total în fenoli și metoda FRAP (P < 0.05), în timp ce, între fenoli și metoda DPPH și ABTS nu s-au inregistrat corelații semnificative.

Tabel II. 4

Fenolii totali (mg GAE/g s.u) și capacitatea antioxidantă (μmol TE/g s.u) a legumelor Brassica crescute în sistem Org sau Conv

Media valorilor a 2 replicate (± deviatia standard) a probelor analizate independent. Diferentele semnificative au fost testate prin testul Tukey(* P < 0.05; **P < 0.01; ns- nesemnificativ, P > 0.05) . nd- nu s-a detecta

Tabel II. 5

Corelații între capacitatea antioxidantă determinată prin 3 metode (ABTS, DPPH și FRAP) și compușii polifenolici totali determinați prin metoda Folin-Ciocalteu

Analiza regresiei liniare a fost utilizată pentru testul de corelare (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, ns not significant)

Capacitatea antioxidanta a extractelor apoase

Capacitatea antioxidantă a extractelor de legume din clasa Brassica a fost evaluată și în mediul apos. Rezultatele obținute sunt prezentate în Tabelul II.6.

Abilitatea de neutralizare a radicalului cation ABTS de către extractele Brassica a fost crescută în cazul legumelor cultivate în sistem convențional, cu excepția guliei. Comparativ cu celelalte metode antioxidante, activitatea de îndepărtare a radicalului DPPH a fost scăzută. Valorile înregistrate în cazul determinării activității antioxidante prin metoda FRAP a fost mult mai ridicate în cazul culturii organice comparativ cu cea convențională. Dintre toate legumele de Brassica investigate, cea mai mare capacitate antioxidantă determinată s-a inregistrat în cazul extractului de varză roșie, cultivată fie în sistem Org fie Conv.

Extractele apoase ale legumelor aparținând clasei Brassica, cultivate în conditii Org conțin nivele ridicate de compuși polifenolici comparativ cu legumele cultivate în sistem Conv, cu excepția extractului de conopidă (Figura II.13).

Figura II.13. Polifenolii totali (mg GAC/g s.u) din extractele apoase de Brassica cultivate atât în sistem Org cât și Conv.

Tabel II. 6

Capacitatea antioxidantă (μmol Trolox equivalent/g s.u) a legumelor Brassica*

*Media valorilor a 2 replicate (± deviatia standard) a probelor analizate independent.

II.3.5. Concluzii

O concluzie generală care se poate desprinde în urma studiului de cercetare (Vicas și colab., 2013) este, capacitatea antioxidantă a extractelor de Brassica (broccoli, conopida, gulie, varza alba și rosie) depinde de practiciile agricole, în general în favoarea sistemului organic, deși din punct de vedere statistic nu s-au înregistrat diferențe semnificative.

II.4. Efectul procesului de fermentare asupra conținutului în glucozinolați din legumele familiei Brassicaceae (broccoli, conopida, varză albă și roșie)

II.4.1. Context

Studiile epidemiologice au pus în evidență o corelație inversă între consumul de legume Brassica și riscul apariției cancerului. Efectele benefice ale acestor legume se datorează prezenței compușilor bioactivi, de tipul glucozinolatiilor (Abbaoui și colab., 2012; Devi & Thangam, 2012; Razis &Noor, 2013; Watson și colab., 2013)

Legumele din familia Brassicaceae, înainte de a fi consumate sunt supuse diferitelor procedee de procesare, ceea ce afectează conținutul în GLS. Mărunțirea (tocarea) legumelor, crează condiții optime pentru eliberarea mirozinazei, având loc astfel degradarea GLS. Verkerk și colab., 2001, au demonstrat că mărunțirea legumelor Brassica, a avut ca rezultat o creștere a indol glucozinolațiilor. Astfel, în varza albă, 4-metoxi- și 1-metoxi-3-indolil-metil glucozinolații a crescut de 15 ori, după mărunțirea și stocarea acestora timp de 48 de ore. Mărunțirea și stocarea legumei brocoli, a dus la o descreștere semnificativă a glucozinolațiilor, cu excepția 4-hidroxi și 4-metoxi-3 indolilmetil glucozinolați, care au crescut de 3,5, respectiv 2 ori. Se presupene, că inducerea sintezei de novo a acestor indol glucozinolați, după distrugerea țesuturilor vegetale, ar prezenta un mecanism de apărare a legumelor împotriva dăunătorilor.

Stocarea legumelor la temperaturi scăzute, poate altera metabolismul GLS. Song și Thornalley, 2007, au demonstrat o pierdere de 33 % a GLS totali, din diferite legume, în urma procesului de congelare-decongelare.

De asemenea, fermentarea legumelor, are o influența asupra degradării GLS. În timpul fermentației, în urma reacțiilor de hidroliză enzimatică, glucorafanin-ul este convertit la sulforafan (Alvarez-Jubete și colab., 2014), în timp ce glucobrasicin-ul la indol-3 –carbinol. În mediul acid, indol-3-carbinol-ul reacționează neenzimatic cu acidul ascorbic cu formare de ascorbigen (Figura II.14) (Ciska și Pathak, 2004). Până în prezent datele experimentale, cu privire la efectul fermentației asupra GLS sunt puține și incomplete, fiind necesare investigații suplimentare. Studiile în vivo (Martinez-Villaluenga și colab., 2009) au relevat, ca ascorbigenul, produsul final al fermentării verzei, prezintă proprietăți anticarcinogenice împotriva tumorilor de colon și sân.

II.4.2. Obiectiv

Scopul acestui studiu a fost de a investiga impactul fermentației lactice asupra conținutul în GLS individuali și totali, din patru legume Brassica (broccoli, conopidă, varză albă, varză roșie), utilizînd HPLC-PDA ca metodă de separare și cuantificare, asistată de analiza chemometrică.

Figura II. 14. Sinteza ascorbigenului. Acesta se formeaza între indol-3-carbinol (care este produsul de hidroliza enzimatica (mirozinaza) a glucobrasicinului) și vitamina C. Aceasta reacție este neenzimatica.

II.4.3. Materiale și metode

Materialul vegetal și procesul de fermentare

Toate legumele Brassica utilizate în acest studiu experimental au fost procurate de la o microfermă din Nord-Vestul Romaniei. Legumele au fost recoltate la sfârșitul lunii Octombrie 2012. Fiecare legumă în parte (100 g) a fost liofilizată cu ajutorul liofilizatorului Alpha 1-2 Christ (Martin Christ, Osterode am Harz, Germany), iar pudra obținută a fost stocată la -200C înainte de realizarea extracției GLS. Probele au fost etichetate astfel: BRCL_FRH, CLF_FRH, WHITE CBG_FRH și RED CBG_FRH, pentru broccoli, conopidă, varză albă și roșie nefermentată. Un kilogram din fiecare legumă a fost apoi supusă fermentației lactice utilizând două tratamente tradiționale. În primul tratament s-a utilizat pentru fermentație sare (1,5%) și acid acetic (8%), zahăr (0,5%) alături de condiment ca mărar uscat, țelină, hrean, Frunze de dafin, piper, muștar. Al doilea tratament a fost aplicat doar în cazul conopidei și varzei albe, utilizând în cazul fermentației doar sarea (1,5%). Fermentația a avut loc 6 săptămâni, primele 2 săptămâni la 19-200C, iar ultimile 4 săptămâni la 6-100C. Pentru fiecare legumă în parte s-a folosit vase de sticlă, cu excepția verzei albe a cărei fermentare a avut loc în butoi de lemn. La finalul tratamentelor, probele au fost spălate și liofilizate și etichetate astfel: BRCL_FM_SL_AC,

CLF_ FM_SL_AC, WHITE CBG_ FM_SL_AC și RED CBG_ FM_SL_AC, în cazul primului tratament și CLF_ FM_SL, WHITE CBG_ FM_SL pentru cel de al doilea tratament.

Extracția, separarea și cuantificarea glucozinolaților din legumele proaspete și fermentate

Extracția, separarea și cuantificarea GLS s-a realizat conform protocolului descris la Capitolul II. 1.

Analiza statistică

Toate probele au fost analizate în duplicat, utilizând testul Bonferroni, diferențele semnificative dintre probe fiind considerate dacă P < 0.05. Analiza componentului principal (The Principal Component Analysis, PCA) și analiza variabilei canonical (The Canonical Variable Analysis, CVA) au fost utilizate pentru o interpretare cât mai corectă a rezultatelor.

II.4.4. Rezultate și discuții

În Tabelul II.7 sunt prezentate cantitățile de GLS atât din probele nefermentate cât și din cele fermentate în urma celor două tratamente. Nouă tipuri de GLS diferiți au fost detectați în cele patru legume Brassica, acestea fiind: glucoiberin (GIB), progoitrin (PRO), sinigrin (SIN), glucoraphanin (GRA), gluconapin (GNA), 4-hydroxy glucobrassicin (4-OHGBS), glucobrassicin (GBS), 4-methoxy glucobrassicin (4-MeGBS) and neoglucobrassicin (N-GBS). În broccoli nefermentat, principalii GLS fac parte din clasa alifatică (59%), major fiind reprezentat de PRO și GRA (1,51 μmol/g s.u., respectiv 1,37 μmol/g s.u.). GLS indolici reprezintă 41% din totalul GLS, GBS fiind predominant (1,44 μmol/g s.u.). În conopidă predomină GLS alifatici (87%), predominant fiind SIN SIN (0.60 μmol/g s.u.). De asemenea, în varza albă GLS alifatici sunt predominanți (96%), în timp ce în varza roșie procentul de GLS alifatici și indolici este aproximativ egal (52%, respectiv 48%). Rezultatele obținute cu privire la prezența GLS in cele patru legume Brassica sunt asemănătoare cu cele raportate de alte studii (Wennberg și colab., 2006; Martinez-Villaluenga și colab., 2009; Kusznierewicz și colab., 2008; Fernández-León și colab., 2013; Picchi și colab., 2012; Vicas si colab., 2013).

Procesul de fermentare a legumelor a modificat cantitățile de GLS din legume, majoritatea GLS individuali scad semnificativ, cu excepția GIB în broccoli, N-GBS în conopidă, PRO și 4-OHGBS în varza albă, SIN și GRA în varza roșie. Per global, cantitatea de GLS totali scad semnificativ (P<0.001) în toate legumele luate în studiu (Tabel II.7). Pentru a evidenția care GLS este cel mai afectat de procesul de fermentație, un raport relative pentru fiecare GLS în parte a fost calculate, între probele nefermentate și cele fermentate. S-a considerat o scădere drastic a conținutlui în GLS, dacă raportul relativ a fost mai mare de 50%. De exemplu, în broccoli după fermentația cu sare și acid acetic (primul tratament), în ordine descrescătoare cei mai afectați GLS au fost: GBS (91%) > 4-OH GBS (83%) > GRA (73%) > 4-MeGBS (69%) > N-GBS (68%), iar în varza roșie, N-GBS (100%) > GBS (92%) > 4-Me GBS (89%) > PRO (76%) > 4-OH GBS (54%). La conopidă în urma fermentației cu sare (tratamentul 2) cei mai afectați au fost GLS alifatici: SIN (87%) > GIB (79%) > PRO (58%), în timp ce la varza albă are loc o descreștere a GLS alifatici în ordinea: GIB (81%) > GRA (69%) for FM_SL_AC and GRA (70%) > GIB (68%) > SIN (62%). Surprinzător, în cazul ambelor fermentații, la varza albă s-a înregistrat o slabă creștere, semnificativ statistic (P < 0.01) a 4-OH GBS (Figura II.15, a,b). Concentrația de 4OH GBS crește cu 27%, respectiv cu 39% în cazul fermentației FM_SL_AC și FM_SL. Dintre GLS alifatici, numai PRO a crescut cu 14%.

Tabel II.7

Conținutul în GLS (µmol/g s.u.) separați din legumele Brassica nefermentate (FRH) și fermentate, utilizând două tratamente diferite (FM_SL_AC and FM_SL)

Notă: Valoriile reprezintă media ± SD exprimate ca μmol/g s.u. Litere diferite ca și exponent pe linie reprezintă diferențe semnificative între probe (P < 0.05). Pentru interpretarea statistic a datelor s-a folosit testul post-hoc Bonferoni.

Figura II.15 Raportul relativ a GLS la varza albă: a. probele fermentate cu sare față de probele nefermentate (WHITE CBG_FM_SL / WHITE CBG_FRH); b. probele fermentate cu sare/acid acetic față de probele nefermentate(WHITE CBG_FM_SL_AC / WHITE CBG_FRH).

Utilizând analiza statistică multivariată, PCA și CVA (Figura II.16, a,b) a profilului de GLS pentru probele nefermentate și fermentate, s-a ajuns la concluzia ca acești biocompuși pot fi considerați ca și markeri ai fermentației.

II.4.5. Concluzii

Rezultatele acestui studiu (Vicas și colab., 2015) au demonstrat că în urma fermentației lactice cu sare sau sare și acid acetic, conținutul in GLS, atât alifatici cât și indolici, scade. Conținutul în GLS totali este mai afectat în conopidă și varza roșie în urma fermentației acide (73%, respectiv 70%), în schimb în broccoli s-a înregistrat o scădere de numai 49%. Utilizarea sării în procesele de fermentație are ca rezultat creșterea presiunii osmotic, acesta fiind unul din factorii care duc la pierderea GLS din legume. În schimb, creșterea concentrației de 4-OH GBS în varza albă, după procesul de fermentare se poate datora condițiilor de stres cauzate de lipsa de oxigen, datorită imersării varzei în soluția salină.

Figura II.16 Analiza PCA pe grupul de legume prospete și grupele fermentate după două tratamente; b – Analiza CVA

II. 5. Amprenta HPLC a glucozinolaților din germenii de broccoli în funcție de timpul de germinare

II.5.1. Context

În ultimii ani, studiile de cercetare sunt axate pe a găsirea de resurse vegetale bogate în fitonutrienți cu rol în prevenirea cancerului. O astfel de resursă vegetală o reprezintă broccoli, utilizat în dietă în forma matură dar și sub formă de germeni. Alături de alți fitonutrienți, ca vitamina C, compuși fenolici, glucozinolații sunt componenții principali care se găsesc în broccoli, iar produșii lor de hidroliză sunt inductori ai enzimelor care metabolizează diferite xenobiotice și astfel previn diferite mecanisme celulare care pot induce dezvoltarea cancerului.

II.5.2. Obiectiv

Obiectivul studiului de cercetare a fost de a realiza o amprentă a glucozinolaților din germenii de broccoli obținuți de la 2 producători diferiți (BRC1-firma Lobelia II, Chrzanów Poland și BRC2 -firma PlantiCo,Zielonki Poland) în funcție de timpul de germinare cu scopul de a determina timpul potrivit de germinare/recoltare astfel încât să se obțină cea mai mare cantitate de compuși bioactivi.

II.5.3.3. Materiale și metode

Semințele de broccoli au fost introduce într-un germinator, iar germenii au fost recoltați în a 3,5,7, și a 9 zi de germinare în cazul probei BRC1, și în a 7 și a 9 zi de germinare în cazul probei BRC 2, liofilizați și păstrați pentru cuantificarea GLS.

Metoda de extracție a GLS, separarea și cuantificarea lor s-a realizat conform protocolului descries în subcapitolul II.1.

II.5.3.4. Rezultate și discuții

Amprenta HPLC a GLS din cele două probe luate în studiu sunt prezentate în Figura II. 18 a,b. Conținutul total în GLS (Figura II.19 a,b) precum și a GLS individuali diferă între cele 2 probe, și în funcție de timpul de germinare. Glucorafanin-ul (GRA), precursorul sulforafan-ului, compus anticancerigen, a fost predominant în ambele probe (Figura II.20 a,b). Cantitatea cea mai mare de GRA în proba BRC1 a fost înregistrată în a 3 zi de germinare (1,20µmol/g s.u), după care scade semnificativ în timpul germinării, astfel în a 9 zi s-a obținut o scădere de 49,24%. Între a 7 și a 9 zi de germinare, în cazul probei BRC 2, concentrația de GRA scade cu 32,25%. Glucozinolații alifatici sunt predominanți în ambele probe, cea mai mare cantitate de GLS fiind obținută în proba BRC1 comparativ cu proba BRC2. Deși, GLS indolici predomină în broccoli matur (70,76% față de 29,24%, GLS indoli respectiv alifatici) (Vicas si colab., 2013), în germeni predomină GLS alifatici, care descresc pe măsură ce avansează germinarea (84,25% față de 75,98% după a 3 zi, respective a 9 zi de germinare). Rezultatele noastre sunt în concordanță cu datele din literatură recente (Kusznierewicz și colab., 2013; Bellostas și colab., 2011; Pérez-Balibrea și colab., 2007).

II.5.5. Concluzii

Rezultatele obținute demonstrează că recoltarea germenilor de broccoli în primele zile de germinare (a 3-zi pentru proba BRC 1 și a 7-zi pentru proba BRC 2) sunt cele mai indicate pentru a furniza concentrații înalte de GLS, care sunt precursori ai compușilor anticarcinogeni.

Figura II.18. a. Profilul HPLC a GLS identificați în proba BRC 1. B. Profilul HPLC a GLS identificați în proba BRC 2

Figura II.19 a. Conținutul de GLS totali în funcție de timpul de germinare în proba BRC1 b. Conținutul de GLS totali în funcție de timpul de germinare în proba BRC1

Figura II.20 a. Conținutul în glucorafanin în funcție de timpul de germinare în proba BRC 1. b. Conținutul în glucorafanin în funcție de timpul de germinare în proba BRC 2

Contribuții științifice la stadiul actual al cunoașterii

Până în 2011, în România, legumele din familia Brassicaceae nu au fost caracterizate din punct de vedere al conținutului în glucozinolați individuali. Astfel, în urma studiilor noastre de cercetare cu privire la conținutul în glucozinolați din 5 legume Brassica (broccoli, conopidă, guile, varză albă și roșie), pentru prima dată în România este realizat un finger print din punct de vedere al GLS în cazul legumelor de Brassica autohtone, crescute fie în sistem conventional, fie organic. Practica agricolă Org a determinat o creștere în conținutul de GLS în cazul culturilor de conopidă, gulie și varză roșie în timp ce în cazul culturii de broccoli și varză albă a determinat o scădere în acești compuși bioactivi. Analiza biostatistică PCA a generat din punct de vedere al conținutului în GLS, grupurile Conv și Org separate în cazul tuturor legumelor din clasa Brassica. Datele obținute conduc la concluzia că GLS sunt markeri moleculari a legumelor din clasa Brassica, putând face discriminarea între cele două practici agricole, Org, respectiv Conv. Pentru prima dată în literatura de specialitate s-a demonstrat că glucozinolații sunt markeri moleculari care pot diferenția legumele din familia Brassicaceae crescute în sistem organic de cel convențional.

În urma rezultatelor obținute, se poate realiza o bază de date cu privire la conținutul în glucozinolați din legumele autohtone. Din datele de literatură, se cunoaște că acești compuși sunt puternic influențați, atât de fondul genetic cât și de factorii de mediu, astfel în urma rezultatelor noastre se poate realiza o comparație din punct de vedere al compoziției in glucozinolați din legumele autohtone cu legumele aparținând familiei Brassicaceae din alte tări.

Spre deosebire de fructe, legumele din familia Brassicaceae, pentru a putea fi ingerate necesită o prelucrare termică, prelucrare care conduce la diminuarea drastică a conținutului in glucozinolați, precum și o inhibare totală a enzimei mirozinaza. Studiile noastre legate de dinamica glucozinolațiilor în timpul procesului de fermentare, aduce rezultate valoroase cu privire la conținutul în acești compuși din broccoli, conopidă (pentru prima dată studiați din punct de vedere al fermentației), varză albă și roșie. Conținutul în GLS totali este mai afectat în conopidă și varza roșie în urma fermentației acide, în schimb în broccoli s-a înregistrat o scădere de numai 49%. Utilizarea sării în procesele de fermentație are ca rezultat creșterea presiunii osmotic, acesta fiind unul din factorii care conduc la pierderea GLS din legume. Surprinzător s-a observant o creștere a concentrației de 4-OH GBS în varza albă, după procesul de fermentare, care probabil s-ar datora condițiilor de stres cauzate de lipsa de oxigen, datorită imersării verzei în soluția salină. Din acest punct se pot desprinde noi teme de cercetare pentru a evidenția dinamica glucozinolațiilor în țesutul legumelor, supuse unui stres de prelucrare a alimentelor, care nu necesită tratament termic.

Capitolul III

Compuși bioactivi antioxidanți prezenți în diferite matrici vegetale și biofluide

În cadrul acestui capitol vor fi prezentate noi abordări cu privire la diverși compuși bioactivi (licopen, polifenoli, flavonoide) din diferite matrici vegetale (tomate, struguri, plante medicinale) și biofluide (plasmă, lapte) care prezintă capacitate antioxidantă. Aceste cercetări sunt interdisciplinare, și derivă în urma colaborării cu cadrele didactice universitare de la USAMV Cluj Napoca, de la Facultatea de Medicină și Farmacie, Facultatea de Protecția Mediului din Universitatea din Oradea. Rezultatele acestor studii s-au concretizat în publicarea a 4 lucrări ISI, 1 lucrare BDI și participare la Congrese Internaționale.

Lucrări ISI

Socaci S., C Socaciu, C Mureșan, A Fărcaș, M Tofană, Vicaș S.I., A Pintea, 2014, Chemometric Discrimination of Different Tomato Cultivars Based on Their Volatile Fingerprint in Relation to Lycopene and Total Phenolics Content", Phytochemical Analysis, 25 (2), 161-169. (http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pca.2483/ abstract) (IF =2.45)

Rugina D., Vicaș S.I, Momeu C., Socaciu C., 2008, Antioxidant activity of flavanols from grape seed extracts, Chemické listy, 99, 1234-35 (IF: 0.683),

Vicaș L, Teușdea A, Vicaș SI*, Marian E, Jurca T, Mureșan M, Gligor F, 2015, Assessment of Antioxidant Capacity of Some Extracts for Further Use in Therapy, Farmacia, 63 (2), 267-274 (http://www.revistafarmacia.ro/issue.html) (IF=1.005)

Mierlita D., Vicas S.I, 2015, Dietary effect of silage type and combination with camelina seed on milk fatty acid profile and antioxidant capacity of sheep milk, South African Journal of Animal Science, 45 (1), 1-11 (http://www.ajol.info/index.php/sajas) (IF=0.412)

Articole BDI

Socaci S., M. Tofană, C. Socaciu, C. Mureșan, E. Mudura, A. Pintea, A. Păucean, S.I Vicaș, 2012/B, Eco-Friendly Technique for Tomatoes Volatile Fingerprint Determination, Fascicula Protectia Mediului, vol. XIX, pg.271-279. (http://protmed.uoradea.ro/facultate/anale/protectia_mediului/2012B/2012B.html).

Participări la Congrese Internationale

Vicas S., Teusdea Alin, Timar Adrian, Czirjak Tibor Zsolt, Laslo Vasile, Bisboaca Simona, 2014, Changes in plasma antioxidant activityof wistar rats after ingestion of four different food supplements, The annual International Conference of the RSBMB, Romanian Journal of Biochemistry 51 (Supplementa), Poster 52, pg.99 (http://journal.biochim.ro/)

III.1. Licopenul, fenolii totali și compușii volatili din diferite specii de tomate

III.1.1. Context

Tomatele (Solanum lycopersicum) sunt plante erbacee care fac parte din familia Solanaceae. Se cultivă peste tot în lume, fiind una din cele mai consumate legume (http://faostat.fao.org).

Tomatele atât în formă proaspătă cât și procesată reprezintă o sursă excelentă de vitamine, minerale, metaboliți secundari (carotenoide, antocianine, flavonoide și alți compuși fenolici), (Luthria și colab., 2006; Odriozola-Serrano și colab., 2008). În plus, tomatele reprezintă o sursă excelentă de licopen, care este carotenoidul roșu predominant în tomate. Acest biocompus posedă capacitate antioxidantă înaltă comparativ cu alte carotenoide, de exemplu, astaxantin și beta-carotenul. Studiile epidemiologice au demonstrat o corelație pozitivă între diete bogate în licopen și reducerea incidenței apariției cancerului de prostată, precum și alte beneficii legate de sănătatea umană (Giovannucci și colab., 1995).

Aroma caracteristică tomatelor este dată de un amestec complex de zahăr, acizi, minerale și compuși volatili. Cantitatea dar și prezența anumitor fitochimicale din tomate sunt dependente de genotip, stadiul de maturitate a fructului la recoltare precum și de condițiile de mediu și practicile agricole (Luthria și colab., 2006).

Compușii volatili din tomate au fost subiectul a numeroase studii de cercetare, peste 400 de compuși volatile au fost identificați, dar numai un număr limitat din aceștia contribuie la aroma tomatelor, dintre aceștia se menționează: acetaldehida, acetona, metanolul, etanolul, penten-3-ona, hexanal, cis-3-hexanal, 2-metil butanol, 3-metil butanol, trans-2-hexanal, trans-2-heptanal, 6-metil-5-hepten-2-ona, cis-3-hexenol, geranilacetona, 2-izobutiltiazolul și β-ionona (Tandon și colab., 2000; Krumbein și colab., 2004).

III.1.2. Obiective

Obiectivul principal al studiul de cercetare a fost de a evalua posibilitatea utilizării profilului de substanțe volatile pentru a discrima diferiți cultivari de tomate, utilizând analiza chemometrică (PCA și analiza cluster-ului). De asemena, conținutul în licopen și compuși fenolici totali a fost determinat din toți cultivarii de tomate utilizați în studiu.

III.1.3. Materiale și metode

Materialul vegetal

Zece cultivari de tomate au fost luați în studiu:

Cinci fructe de tomate au fost recolatate la maturitate deplină din serele aparținând Departamentului de Științe Agricole din cadrul USAMV-ului Cluj Napoca (Tolstoi (TOL), Balet (BAL), Marisa (MAR), Tamaris (TAM), Cronos (CRO)).

Cinci fructe de tomate au fost din cultivarii importați, procurați comercial (din supermarket Cluj Napoca), (San Mazzo din Olanda (SM), Chica din Olanda (CHI), Kumado din Belgia (KUM), cherry din Spania (CHE-ES), cherry din Turcia (CHE-TK)).

Toate tomatele au fost colectate/procurate în aceeași perioadă (Mai, 2012) și aproximativ 200 g din legume au fost omogenizate cu ajutorul unui blender, și păstrate la -200C înainte de extracție.

Extracția compușilor volatile și analiza GS-MS

Extracția compușilor volatili a fost realizată utilizând technica ITEX, descrisă de Socaci și colab., 2013. Cinci grame de tomate omogenizate au fost plasate într-un tub headspace. Tubul sigilat a fost incubat la 600C timp de 20 de minute, sub agitare continuă. După incubare, cu ajutorul unei siringi headspace, compușii volatile din faza gazoasă au fost adsorbiți repetat într-un polimer poros (ITEX-2TRAPTXTA, Tenax TA 80/100 mesh). Desorbția termică a compușilor volatili a fost realizată direct în GC-MS (GCMS QP-2010, Shimadzu Scientific Instruments, Kyoto, Japan), echipat cu un autosampler (CombiPAL AOC-5000). Coloana utilizată pentru separarea compușilor volatili a fost Zebron ZB-5ms (50mx0,32 mm, i.d.). Gazul purtător a fost heliu, 1 ml/min, și temperatura injectorului de 2500C.

Determinarea conținutului în licopen

Conținutul în licopen total din fiecare tomată a fost determinat utilizând o technică spectrometrică, propusă de Davis și colab., 2003. 0,6 g de tomate omogenizate au fost introduse într-un tub de centrifugă care conține butilat hidroxitoluen (BHT) 0,05% (w/v, în acetonă), 5 ml de etanol 95% și 10 ml hexan. Probele au fost centrifugate la 180 rpm pentru 15 minute și apoi 3 ml de apă deionizată a fost introdusă în fiecare tub de centrifugă și agitate. După separarea fazelor, absorbanța stratului superior (hexan) a fost măsurată la 503 nm utilizând spectrometru Shimadzu UV-1700 PharmaSpec. Conținutul în licopen total a fost exprimat ca mg licopen/kg tomate.

Determinarea conținutului în compuși polifenolici totali

Conținutul în fenoli totali a fost determinat utilizând metoda Folin-Ciocalteu. Solventul de extracție utilizat a fost metanol:apă (80:20, v/v). Probele au fost centrifugate la 6000 rpm pentru 20 de minute și filtrate. 0,1 ml din extract a fost mixat cu 6 ml apă și 0,5 ml reactiv Folin-Ciocalteu. După 4 minute, se adaugă 1,5 ml soluție de Na2CO3 7,5%, după care probele se lasă 2 ore în repaus, la temperatura camerei. Se măsoara absorbanța la 725 nm utilizând spectrometru Shimadzu UV-1700 PharmaSpec. Curba de calibrare s-a realizat cu ajutorul standardul de acid galic, iar rezultatele sunt exprimate în mg acig galic echivalenți/kg probă proaspătă.

III.1.4. Rezultate și discuții

În urma analizelor calitative și cantitative din punct de vedere al compușilor volatili din 10 cultivari de tomate se pot desprinde câteva trăsături distincte. Proliful substanțelor volatile din cultivarii BAL, CRO și MAR sunt foarte similare. Componentul principal determinat din acești cultivari a fost 1-hexanol (25,05-27,34%). O caracteristică a acestor probe a fost identificarea în cantitate mare a cis-3-hexanol-ului, 3-metilbutanol și 2-metilbutanol, compuși care sunt responsabili de gustul dulce al roșiilor și semnificativ contribuie la aroma specifică tomatelor (Baldwin și colab., 1998). La alți doi cultivari indigeni (TAM și TOL), hexanalul a fost compusul majoritar (54%), conținând în cantități mari și trans-2-hexenal (21,71% și 13,51%) comparativ cu celelalte probe luate în studiu. Acești doi compuși sunt derivați de la lipide și sunt responsabili de aroma proaspătă a roșiilor (Buttery și Ling, 1993; Tandon și colab., 2000). O caracteristică generală a cultivariilor de tomate indigene este conținutul în cantitate mare de compuși care conțin azot, în special 1-nitropentan și 2-izobutil tiazolul, acesta din urmă fiind identificat în cultivarii indigeni BAL, CRO, MAR și TAM și în alți doi cultivari din import, CHE-TK și SM. Acești compuși sunt specifici fructelor de tomate și pot contribui la discriminarea cultivarilor (Farneti și colab., 2012).

În cazul cultivarilor din import, proba CHI, conține cantități mari de sabinen (30,84%), 2-metil butanol (12,28%) și terpinolen (12,25%). Și alte monoterpene, de exemplu α-pinen, α-phellandren sau o-cymen, sunt caracteristice acestui tip de cultivar.

Acești compuși volatile biogenici sunt rezultatul acțiunii enzimelor monoterpen și sesquiterpen sintetaza care au ca și substrat geranyl difosfatul sau nerildifosfatul. Unele tomate sunt lipsite de astfel de terpene volatile, probabil datorită programelor de cultivare axate pe obținere de fructe mari, care au ca rezultat scăderea terpenoidelor defensive din partea vegetativă a plantei (Falara și colab., 2011)

Probele de tomate cherry, originare din Spania și Turcia au prezentat o amprentă a substanțelor volatile similară cu unele mici diferențe calitative și cantitative (Figura III.1, a și b).

Componentul volatil predominant din tomatele cherry atât din Spania cât și din Turcia a fost hexanal-ul (45,7% respectiv 62,59%), deși au fost identificați și alți compuși volatili predominanți, dar prezenți doar în una dintre probe. De exemplu, în cazul roșiilor cherry din Spania, substanțele volatile majoritare au fost 3-pentenona (13,48%) și trans 2-hexenal (10,35%), în timp ce roșiile cherry din Turcia sunt bogate în α-pinene, β-pinene, 2-metilbutanol, 3-metillbutanol și metilsalicilat. În afară de roșiile cherry, metil -salicilatul a mai fost identificat și în cultivarul CRO.

Figura III.1 Cromatogramele ITEX/GC-MS a compușilor volatili din cultivarii de tomate cherry din Spania (a) și Turcia (b) (Socaci și colab., 2013)

Tikunov și colab., 2005, sugerează că acest compus fenolic este unul dintre cele mai variabile volatile a tomatelor și astfel poate fi utilizat ca și biomarker de discriminare a cultivariilor de tomate. β-Ionona și compușii de aromă derivați de la β-caroten au fost prezenți numai în tomatele cherry din Spania. Aceste cetone sunt responsabile de aroma dulce sau nota florală a roșiilor (Tandon și colab., 2000).

Cultivarul de tomate Kumato a prezentat un profil al substanțelor volatile distinctiv. Aceste tomate conțin cantități mari de pentanal (19,60%) precum și 3-pentenonă (6,03%) și 6-metil-5-hepten-2-ona (7,16%), compuși responsabili de aroma tomatelor proaspete (Buttery și Ling, 1993). În timp ce pentanal-ul conferă o aromă de verde, miros de ”iarbă”, 6-metil-5-hepten-2-ona contribuie la notele florale și proaspete ale tomatelor (Tandon și colab., 2000; Farneti și colab., 2012).

Cantitatea de licopen a variat între 36,78 și 73,18 mg/kg probă proaspătă (fw), în funcție de cultivarul utilizat. Cea mai mare cantitate de licopen s-a obținut în cazul cultivariilor Mazzo și Chica (73,18 mg/kg fw, respectiv, 73,14 mg/kg fw), ambii importați din Olanda. În cazul cultivarilor indigeni concentrația de licopen a variat între 45,35 mg/kg fw și 69,68 mg/kg fw. Cea mai scăzută cantitate în licopen a fost înregistrată la cultivarii cherry (36,78 mg/kg fw la cei din Spania și 42,15 mg/kg fw la cei din Turcia). Studiile de cercetare au demonstrat că nu numai factorii genetici influențează conținutul în licopen a tomatelor ci și factorii extrinseci ca: mediul de creștere, tratamentul post-recoltare, stagiu de maturitate a fructului, intensitatea luminii, temperaturiile de zi/noapte, sistemul de irigare sau fertilizare (Kuti & Konuru, 2005; Helyes și colab., 2012).

Concentrația în fenoli totali din cei 10 cultivari de tomate a variat între 119,4 (MAR) și 253,7 mg GAE/kg fw (CHI). În plus față de activitatea antioxidantă a polifenolilor, aceștia sunt și precursori a unor compuși volatili în fructele de tomate prin calea fenilpropanoidului. Unul din acești compuși este metilsalicilatul detectat doar în trei probe de tomate (CHE-ES, CHE-TK și CRO). Acești cultivari au o cantitate mare de compuși fenolici. Un alt derivat fenolic volatil este 2-fenilacetaldehida care a fost detectat doar în proba SM la o concentrație de 0,32%. În urma unui studiu metabolomic complex, Tikunov și colab., 2010 au demonstrat abilitatea fructelor de tomate de a elibera substanțele volatile derivate din calea fenilpropanoidului în urma distrugerii țesuturilor. Detecția în cantitate mică a volatilelor fenilpropanoidice în fructele de tomate poate fi explicată prin ipoteza ca aceste substanțe volatile care se găsesc în diferite forme conjugate, predominant glicozidice sunt forme de rezervă a volatilelor aromatice (Tikunov și colab., 2010).

Rezultatele cantitative obținute au fost supuse analizei multivariate, PCA și analizei clusterelor. Analiza PCA este un instrument util pentru a stabili interrelații între diferite variabile, permițăndu-ne să detectăm și interpreta probele, similaritățile și diferențele dintre ele (Lo Feudo și colab., 2011). Atunci când datele cromatografice au fost supuse analizei PCA, s-au observant corelații între compoziția compușilor volatili și cultivarii de tomate, punându-se în evidență o discrimare bună între cultivarii de tomate. Deși cei doi cultivari de tomate cherry din Spania și Turcia au fost bine diferențiați, alți cultivari nu s-au diferențiat suficient (Figura III.2,A). Pe lângă datele cromatografice obținute în cazul substanțelor volatile, conținutul total în licopen și compușii fenolici au fost supuse împreună analizei PCA în cazul tuturor celor 10 cultivari de tomate. Rezultatul obținut a arătat o discriminare mult mai bună între cultivari (Figura III.2,B). Pentru a evidenția mult mai clar importanța fiecărei variabile, a fost realizat ”The Correlation Loadings Plot”(Figura III.3). Compușii din interiorul eclipsei indică 50 % din varianță, în timp ce, compușii care se regăsesc în afara eclipsei explică 100% din varianță. Este cazul următorilor compuși: hexanal, 2-metil-butanol, 1-nitropentan, o-cymen, terpinolen, sabinen, fenoli. Farneti și colab., 2012, au evidențiat că compusul 1-nitropentan contribuie semnificativ la discriminarea cultivarilor de tomate. Rolul crucial în diferențierea cultivarilor de tomate l-au avut fenolii, rezultate care sunt în concordanță cu rezultatele obținute și de alți autori (Tikunov și colab., 2010).

Figura III.2. A. Analiza PCA considerând ca și variabile compușii volatili din cei 10 cultivari de tomate luate în studiu. B. Analiza PCA considerând ca și variabile compușii volatile, conținutul în licopen total și cantitatea de fenoli totali, din cei 10 cultivari de tomate luate în studiu (Socaci și colab., 2013)

Figura III.3. ” The Correlation Loadings Plot” pentru tomatele luate în studiu (Socaci și colab., 2013)

III.1.5. Concluzii

Rezultatele obținute în cadrul acestui studiu au demonstrat că în cazul cultivarilor de tomate, aceștia se pot ușor diferenția pe baza caracteristicilor substanțelor volatice în urma analizei PCA, obținându-se astfel informații valoroase cu privire la diferențierea cultivarilor.

III.2. Capacitatea antioxidantă a semințelor din diferite soiuri de struguri

III.2.1. Context

Numeroase studii de cercetare sunt concentrate pe investigarea diferiților antioxidanți naturali, proveniți de la fructe și legume, datorită efectului lor de a reduce riscul bolilor cardiovasculare și a diverse tipuri de cancer. Semințele de struguri sunt o sursă foarte bogată în flavanoli, conținând atât monomerii catechin, epicatechin, epicatechin-3-o-galat, precum și dimeri, trimeri, tetrameri (Shi et al. 2003).

III.2.2. Obiectiv

Obiectivul acestui studiu de cercetare (Rugină și colab., 2008) a fost de-a evalua capacitatea antioxidantă prin trei metode diferite (ORAC, DPPH, ABTS) a extractelor de semințe de struguri proveniți de la patru varietăți de struguri recoltați din Romania (Recaș): Merlot, Mustoasă, Fetească și Chasla. De asemenea, conținutul în compuși fenolici totali a fost determinat utilizând metoda Folin-Ciocâlteu.

III.2.3. Materiale și metode

Metode de extracție a compușilor bioactive din sâmburii de struguri

Sâmburii de struguri au fost măcinați, iar pudra obținută a fost tratată cu hexan (1:10, g/v) cu scopul de a se îndepărta fracția lipofilă din sâmburi. Compușii bioactivi hidrofili din pudra de semințe de struguri degresată (1:10, g/v) au fost extrași cu un amestec de solvenți formați din metanol:apă:acid acetic (70:29,5:0,5, v/v/v) și sonicați timp de 15 minute. Amestecul a fost apoi centrifugat la 4000 rpm timp de 30 de minute. Din supernatantul obținut s-a îndepărtat metanolul cu ajutorul rotavaporului, iar proba a fost eluată într-un volum determinat de metanol astfel încât să se obțină 1 g probă/ml metanol.

Determinarea capacității antioxidante a probelor și a compușilor fenolici totali

Pentru determinarea capacității antioxidante a extractelor din sâmburi de struguri, s-au folosit 3 metode diferite (ORAC, DPPH și ABTS) a căror principiu și mod de lucru a fost descris în Capitolul I. Conținutul în compuși polifenolici totali a fost determinat prin metoda Folin-Ciocalteu, descrisă în Capitolul I.

III.2.4. Rezultate și discuții

Rezultatele obținute cu privire la capacitatea antioxidantă a extractului din sâmburi de struguri sunt prezentate în Tabelul III.1.

Extractele din sâmburi de la patru varietăți de struguri au fost analizate și caracterizate și prin HPLC-UV. Semințele cele mai bogate îm compuși flavonoidici a fost cele provenite de la strugurii Merlot (80%), urmate de Feteasca (50%), Mustoasa (40%) și Chasla (20%).

Capacitatea antioxidantă a probelor, determinată prin metoda TEAC și ORAC a prezentat o bună corelație (R2 = 0,99). De asemenea o bună corelație s-a obținut și între valorile obținute în urma analizei ORAC și DPPH (R2 =0,97).

Tabel III.1

Capacitatea antioxidantă determinată prin 3 metode diferite (ORAC, DPPH, TEAC) și conținutul în compuși polifenolici totali din extractele de semințe de struguri (Rugina și colab., 2008)

III.2.5. Concluzie

Dintre probele luate în studiu, cea mai mare capacitate antioxidantă și cea mai mare cantitate de compuși polifenolici a fost obținută în cazul semințelor de struguri proveniți de la varietatea Merlot, urmată de Feteasca, Mustoasă și Chasla.

III.3.Capacitatea antioxidantă a două plante medicinale (Salviae sp. și Plantago sp)

III.3.1. Context

Speciile de Salviae sp. și Plantago sp. sunt plante medicinale, cunoscute ca având proprietăți antioxidante. Până în prezent sunt puține studii cu privire la capacitatea antioxidantă in vitro a acestor plante medicinale.

III.3.2.Obiective

Scopul acestei studiu a fost de a evalua capacitatea antioxidantă a două plante medicinale (Salviae sp. și Plantago sp.) provenite din două zone diferite din România (Bihor și Arad).

III.3.3. Materiale și metode

Extracția compușilor bioactivi

Extractele din cele 2 plante medicinale s-au obținut prin repercolare, utilizându-se alcoolul etilic 70% ca și solvent. Extractul a fost standardizat astfel încât conținutul în polifenoli să fie de 0,25% exprimat față de acidul clorogenic, după metodele descrise în Farmacopeea Română, ediția a X-a, 2008.

Determinarea capacității antioxidante

Extractele plantelor medicinal au fost testate in vitro din punct de vedere al capacității antioxidante prin trei metode DPPH, FRAP, ABTS, principiul și modul de lucru fiind descris in Capitolul I.

Determinarea compușilor bioactivi de tipul polifenolilor și flavonoidelor totale

Din extractele plantelor medicinal, s-au cuantificat spectrofotometric compușii polifenolici totali și flavonoidele totale, după protocolul descris în Capitolul I.

III.3.4. Rezultate și discuții

Înainte de determinarea capacității antioxidante a extractelor, s-a realizat o amprentă UV-Vis cu ajutorul spectrofotometrului Shimadzu UV-VIS 1700 PharmaSpec, Shimadzu Corp. Kyoto, Japan. Rezultatele obținute sunt prezentate în Figura III.4, A și B.

Analiza spectrofotometrică este o technică foarte utilă pentru a evidenția calitativ principalii compuși bioactivi. Lungimea de undă maximă specifică acizilor fenolici este 280 nm, a flavonoidelor la 280 nm și 340 nm,a carotenoidelor între 410-470 nm, a antocianinelor între 520-535 nm. Amprenta UV-Vis a celor două plante medicinal arătă absorbții în domeniul 280-375 nm, ceea ce indică că aceste plante medicinal sunt bogate în compuși de tip acizi fenolici și flavonoide.

Figura III.4. Amprenta UV-Vis spectrofotometrică a extractelor de Plantago (P1-Bihor, P2-Arad) și Salviae (S1-Bihor, S2-Arad)

Rezultatele cu privire la cantitatea de polifenoli totali și flavonoide și raportul relativ dintre aceleași probe, dar locație diferită, determinate prin metode spectrofotometrice în cazul celor două plante medicinale sunt prezentate în Figura III.5, a și b. Capacitatea antioxidantă a speciile de Salviae sp. și Plantago sp. determinate prin trei metode diferite, FRAP, DPPH și ABTS, precum și raportul relativ dintre probe este prezentată în Figura III.5, c,d și e.

Analiza multivariată a fost aplicată rezultatelor obținute cu scopul de a identifica relațiile dintre variabile și probe și de a stabili diferențe sau similarități între probele luate spre studiu. Analiza PCA a luat ca și variabile, valorile obținute în cazul polifenolilor totali, flavonoidelor, a metodelor de evidențiere a capacității antioxidante (FRAP, DPPH, ABTS). PC1 și PC2 (first two principal components) explică 90,215% din totalul varianței, ceea ce semnifică că discriminarea între cele 2 plante (Salviae sp. și Plantago sp.) este statistic semnificativ. Capacitatea antioxidantă determinată prin ABTS și DPPH este pozitiv poziționată față de primul component principal (PC1), în timp ce variabila FRAP este negativă față de PC1. Aceste variabile au o contribuție ridicată și realizează discriminarea între probele S1, P1, P2 și S2 care este poziționată negativ față de PC1 (Figura III.6).

Figura III.5. Raportul relativ între valorile obținute în cazul plantelor medicinale din cele două locații (județul Bihor, indexat cu 1 și Arad cu 2) pentru a) polifenolii totali; b) flavonoide; și capacitatea antioxidantă determinată prin 3 metode: c) FRAP; d) DPPH și e)ABTS (Vicaș și colab., 2015)

Figura III.6. Analiza PCA (PC1 și PC2) în cazul celor 4 probe de plante medicinale din două locații diferite (Bihor-S1,P1 și Arad-S2, P2) (Vicaș și colab., 2015)

Variabilele, conținutul de polifenoli totali sunt incadrate în cadranul pozitiv, în timp ce flavonoidele totale sunt încadrate negativ față de PC 2 (Figura III.6). Aceste variabile au o contribuție ridicată și realizează discriminarea dintre proba S1 (care este poziționată pozitiv față de PC 2), probele P1 și P2 (poziționate negativ față de PC 2) și proba S2. Cea mai mare cantitate de polifenoli totali și cea mai înaltă capacitate antioxidantă a fost detectată în proba S1. În probele P1 și P2, flavonoidele predomină comparativ cu probele S1 și S2. De asemenea, capacitatea cea mai înaltă de a reduce complexul Fe3+-TPTZ a fost realizată de probele S1 și S2. Toate aceste rezultate sunt validate în urma analizei PCA.

III.3.5. Concluzii

Rezultatele obținute în cazul plantelor medicinale studiate (Salviae sp. și Plantago sp.) demonstrează că sunt surse bogate în antioxidanții, putând fi aplicate cu succes în medicină și farmacologie. Cunoscând compușii bioactivi și activitatea lor biologică, plantele medicinale pot fi utilizate în direcția dorită cu o eficiență maximă pentru îmbunătățirea calității vieții pacienților.

III.4. Modificarea capacității antioxidante a plasmei șobolanilor Wistar după ingerarea a patru suplimente alimentare diferite

III.4.1. Context

Această temă de cercetare a rezultat în urma câștigării proiectului PN-II-IN-CI-2012-1-0295 cu titlul Optimizarea unui supliment alimentar cu proprietăți antioxidante și antitumorale, în colaborare cu Societatea Phenalex SRL, Oradea. Prin proiectul câștigat, Societatea a solicitat Universității din Oradea, testarea unui produs inovator, atât din punct de vedere al conținutului în compuși bioactivi cât și din punct de vedere al efectului acestuia asupra capacității antioxidante a plasmei (utlizând șobolani Winstar).

III.4.2. Obiective

Obiectivul studiului de cercetare a fost de a se investiga atât in vitro cât și in vivo capacitatea antioxidantă a 4 suplimente alimentare diferite (Antioxivita, Propolis, Mistletoe și Viprovi).

III.4.3. Materiale și metode

Suplimentele alimentare luate în studiu au fost :

Antioxivita un extract din sâmburi, pielițe și rahis de struguri (Vitis vinifera). Produsul este realizat după o tehnologie brevetată, care a obținut medalia de Aur la Salonul Internațional de Inventica de la Varșovia IWIS 2011 și Premiul Special din partea Korea Invention News în cadrul aceluiasi eveniment.

Propolis, solutie apoasa. Produsul este realizat după o tehnologie brevetată, care a obținut medalia de Argint la Salonul International de Inventică de la Varsovia IWIS 2011 și Premiul Special din partea Asia Invention Creativity Association, in cadrul aceluiasi eveniment.

Extract din vâsc (Viscum album) – un extract experimental, conține apă distilată, extract văsc.

Viprovi – conține apă distilată, extract de propolis apos, extract din sâmburi, pielițe și rahis de struguri, extract din văsc. In cadrul studiului s-a urmărit cu precădere optimizarea acestui produs și investigarea efectelor antioxidante.

Determinarea conținutului de polifenoli totali din suplimentele alimentare

Determinarea conținutului de compuși polifenolici totali s-a realizat prin metoda Folin-Ciocalteu. Absorbanța a fost înregistrată la lungimea de undă 765 nm. Conținutul total de fenoli a fost exprimat în mg echivalenți de acid galic/ ml produs.

Determinarea conținutului de flavonoide totale din suplimentele alimentare

Pentru determinarea continutului în flavonoide s-a folosit metoda cu clorura de aluminiu. Pe scurt, metoda constă în tratarea extractului (0.1 ml) cu 0,1 ml AlCl3, 10%, 0.1 ml tartrat de sodiu si potasiu si 2.7 ml apă distilată. Se amestecă viguros cu ajutorul vortex-ului și absorbanta se citește la 415 nm dupa 30 de minute de incubare. Curba de calibrare s-a realizat cu o soluție de quercetină de concentrații cunoscute (0.1-0.5 mg/ml), iar concentrația de flavonoide din extracte a fost calculată din ecuația de regresie și exprimată în mg echivalenți quercetină/ml produs.

Evaluarea in vitro a capacității antioxidante a suplimentelor alimentare

Toate cele patru extracte luate in studiu au fost caracterizate din punct de vedere al capacității antioxidante, folosind metode cu principii diferite.

Una din metode a fost Metoda DPPH (1,1,-difenil-2-picrilhidrazil) care este o metoda spectrofotometrică, larg utilizată pentru a testa abilitatea compușilor de a îndeparta radicalii liberi. Este utilizată pentru cuantificarea antioxidanților în sisteme biologice complexe (Miliauskas și colab., 2004). Absorbanțele s-au înregistrat la 515 nm. Procentul de inhibiție a DPPH-ului a fost calculat conform ecuației 1:

% Inbibiție = [(Abs. blanc – Abs. probă) x 100 ] / Abs. blanc (ecuația 1)

O altă metodă utilizată pentru determinarea capacității antioxidante a fost metoda FRAP (ferric reducing antioxidant power), o metodă simplă spectrofotometrică care testează puterea antioxidantă a probelor luate în studiu și se bazează pe reducerea complexului tripiridiltriazina ferică (Fe(III)-TPTZ) la complexul tripiridiltriazina feroasă ((Fe(III)-TPTZ) de către un reductant la pH acid (Benzie si Strain, 1999). Soluția FRAP de lucru se prepară proaspăt prin amestecarea a 50 ml tampon acetat 300 mM cu 5 ml solutie Fe2(SO4)3·H2O și 5 ml TPTZ. Probele de vâsc (100 µl) au fost lăsate să reacționeze cu 500 µl solutie FRAP și 2 ml apă distilată pentru o oră, la întuneric, după care citirile la spectrofotometru s-au realizat la 595 nm. Curba de calibrare s-a realizat cu o solutie de Trolox de concentratii cunoscute (0-400 µM), iar capacitatea antioxidanta din extracte a fost calculata din ecuația de regresie și exprimată în µmoli echivalenti Trolox (TE)/ml produs

Evaluarea in vivo a capacității antioxidante a plasmei după ingerarea de suplimente alimentare

Toate tratamentele pe șobolani utilizate în acest studiu au fost în concordanță cu legislatia impusă de Uniunea Europeană referitoare la Protecția Animalelor de Laborator. Animalele folosite în acest tip de experiențe au fost șobolani masculi albi de tip Winstar, cu o greutate corporală medie de 200 g, în vărstă de 6 săptămâni procurați de la Universitatea de Farmacie și Medicină, Cluj Napoca. Pe toată durata experimentului șobolanii au fost ținuți în cuști de plastic, într-o încăpere cu o temperatură de 25 ± 40C, cu o umiditate de 60 ± 5% și un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore. Șobolanii au fost alimentați cu o dietă specifică procurată comercial, furaj complet pentru șoareci, șobolani și hamsteri utilizați în scopuri științifice sau experimentale (nutret combinat granulat, Institutul Cantacuzino, Bucuresti), iar apa de băut a fost administrată ad libitum. După 9 zile de la procurarea șobolanilor a început experiența propriu-zisă. Aceasta perioadă a fost necesară pentru aclimatizarea șobolanilor. Un total de 42 de șobolani au fost divizați în 6 grupuri (câte 7 șobolani pe grup): grupul apă (L1), grupul propolis (L2), grupul struguri (L3), grupul vâsc (L4), grupul mix (L5) și grupul controlul pozitiv (L6) (care au primit intravenos 20mg/kg corp 6-fluorouracil din 2 in 2 zile pe parcusul intregului experiment) (Figura III.7). La grupurile apă și control pozitiv li s-au administrat apă de robinet, grupul L2 a primit o solutie de propolis (0.35 g extract/șobolan/zi), grupul L3 a primit o solutie de struguri de 0.2g extract/șobolan/zi), grupul L4 a primit o solutie de 0.12 g extract de vasc/șobolan/zi iar grupul L5 a primit 0.66 g extract mix/șobolan/zi). Cantitatile de extract au fost testate anterior, stabilindu-se concentratiile optime necesare șobolaniilor pentru a le putea ingera. Durata experimentului a fost de 15 zile. Șobolanilor li s-a administrat zilnic apă proaspătă, iar extractele din plante au fost preparate zilnic. Pe întreaga perioadă a experimentului, șobolanii au fost căntăriți de 3 ori, și de asemenea au fost monitorizate cantitatea de apă, respectiv a extractelor consumate. După sacrificare, sângele a fost recoltat pe heparină și centrifugat. Plasma a fost îndepărtată și congelată înainte de utilizare. Capacitatea antioxidantă a plasmei a fost evaluată prin metoda TEAC.

III.4.4. Rezultate și discuții

În prima etapă s-a testat compoziția în compuși bioactivi de tipul polifenolilor totali și flavonoide, prin metode spectrofotometrice, precum și capacitatea antioxidantă a suplimentelor utilizând două metode diferite (DPPH, FRAP). Rezultatele obținute sunt prezentate în Figura III.7. Datele obținute au fost analizate din punct de vedere statistic (testul ANOVA, testul Tukey și Duncan) pentru a evidenția diferențele semnificative între produsul inovator Viprovi și celelalte suplimente. Astfel în Figura III.7, a sunt prezentate rapoartele dintre conținutul în compuși polifenolici totali din extractele de vâsc, propolis și struguri și produsul innovator (Viprovi). Din punct de vedere statistic s-au înregistrat diferențe semnificative între suplimentul Viprovi și celelalte extracte (p<0.001). Din punct de vedere al compușilor polifenolici totali se observă că produsul Viprovi conține o cantitate mai mare de astfel de compuși, comparativ cu extractul de vâsc și propolis (raport de 0.46, respectiv 0.39), în timp ce produsul comercial Antioxivita conține cea mai mare cantitate de compuși polifenolici (raport de 2.65). Din punct de vedere al flavonoidelor totale se observă că produsul Viprovi conține o cantitate aproximativ egală de flavonoide cu cea existentă în extractul de vâsc și propolis (raport 1,11, respectiv 0,95), în timp ce produsul comercial Antioxivita conține o cantitate mult mai mare de flavonoide (raport de 2,05).

Dintre toate suplimentele testate, activitatea cea mai mică de îndepărtare a radicalului DPPH a avut-o extractul de vâsc urmat de extractul de propolis (6.31%, respectiv 11.79%). Cea mai mare capacitate antioxidantă s-a inregistrat în cazul extractului de struguri (54.64%). În schimb prin combinarea extractului de vâsc, propolis și struguri se obtine un produs cu o activitate de îndepartare a radicalului DPPH de 39.88%. Din punct de vedere statistic, s-au inregistrat modificări semnificative între produsul Viprovi și celelalte extracte. Raportul dintre cele trei extracte și produsul inovator sunt prezentate in Figura III.7,c.

Cea mai mică capacitate antioxidantă determinată prin metoda FRAP s-a inregistrat în cazul extractului de propolis (59,96 µmol TE/ml), iar cea mai înaltă s-a obținut in cazul extractului de struguri (307.36 µmol TE/ml). Raportul dintre produs inovator (Viprovi) și celelalte trei suplimente este prezentat in Figura III.7, d.

Figura III.7 a. Rapoartele dintre cantitatea de compusi polifenolici totali din produsul innovator si extractele de vasc, propolis si struguri; b. Rapoartele dintre cantitatea de flavonoide totale din produsul inovator și extractele de vâsc, propolis și struguri; c. Rapoartele dintre capacitatea de îndepărtare a radicalului DPPH din produsul inovator și extractele de vâsc, propolis și struguri; d. Rapoartele dintre valorile obținute în urma metodei FRAP ale suplimentului Viprovi raportat la suplimentele de vâsc, propolis și Antioxivita.

Al doilea obiectiv al studiului a fost de a evalua capacitatea antioxidantă a plasmei șobolaniilor masculi albi de tip Winstar, după îngerarea suplimentelor alimentare. Cantitățile de extracte au fost testate anterior, stabilindu-se concentrațiile optime necesare șobolaniilor pentru a le putea ingera. La finalul experimentului, șobolanii au fost sacrificați, și capacitatea antioxidantă a plasmei a fost investigată utilizând metoda TEAC (Figura III. 8). Rezultatele obținute au arătat că după ingestia suplimentelor alimentare, Viprovi, Propolis și Vâsc, capacitatea antioxidantă a plasmei a crescut cu 7,82% (P > 0,05), 19,35% (P < 0,05) și respectiv 18,37% (P < 0,05), comparativ cu grupul control (L1). În schimb grupul care a primit soluția de Antioxivita (L3) a prezentat o scădere a capacității antioxidante cu 4,72% (P > 0,05) comparativ cu controlul (L1).

Figura III. 8.Capacitatea antioxidantă in vivo a plasmei șobolanilor Winstar după ingerarea suplimentelor alimentare timp de 15 zile.

III.4.5. Concluzii

Rezultatele obținute demonstrează că în urma ingerării suplimentelor alimentare, capacitatea antioxidantă a plasmei șobolanilor Wistar se îmbunătățește, cea mai înaltă valoare fiind obținută în cazul suplimentului alimentar Propolis (L2), urmat de extractul de vâsc (L4) și Viprovi (L5).

III.5 Efectul dietei de tip siloz în combinație cu semințe de camelină asupra profilului de acizi grași și a capacității antioxidante a laptelui de oaie

III.5.1. Context

Laptele de oaie este bogat în acizi grași saturați (SFA), în principal acizii grași C12:0, C14:0 și C:16, care prezintă un efect negative asupra sănătății umane (Williams, 2000). În schimb, acizii nesaturați, oleic (C 18:1), acidul α-linolenic (C18:3, ALA), acidul eicosapentaenoic (C20:5, EPA) acidul docosahexaenoic (C22:6, DHA) și acidul linoleic conjugat (C18:2, CLA) au efecte pozitive asupra sănătății umane, prin reducerea riscului cardiovascular, efect anticarcinogenic, având și proprietăți anti-scleroză (Massaro et al., 1999; Lopez-Huertas, 2010).

Modificarea compoziției în acizi grași din lapte poate fi indusă prin manipularea dietei, de exemplu hrănirea animalelor cu pășune, furaje conservate, concentrate de amidon și diete suplimentate cu semințe ale legumelor oleaginoase (Ferlay et al., 2011). Suplimentarea dietelor cu ulei (floarea-soarelui, soia, canola, in) la rumegătoare a avut un efect negativ asupra digestiei fibrelor, metabolismului rumenal și a acizilor grași din lapte comparativ cu o dietă pe bază de semințe (Chilliard et al., 2003; Andrade et al., 2006). Utilizarea semințelor ca și sursă de acizi grași este o practică mult mai convenabilă decât utilizarea uleiurilor, datorită limitării hidrogenării acizilor grași la nivel ruminal (Chilliard et al., 2001).

Semințele de camelină conțin o cantitate mare de acizi grași nesaturați cu catenă lungă (total PUFA, 65,8%, acid linoleic 22,1%, acid α-linolenic 43,7%) (Mierliță et al., 2011). Uleiul de camelină conține și cantități mari de tocoferoli, ceea ce îl face foarte stabil din punct de vedere oxidativ (Budin et al., 1995).

Studiile de cercetare au pus în evidență, că dietele pe bază de semințe bogate în acid linoleic pot influența profilul acizilor C18:1 și CLA din lapte, în timp ce semințele bogate în acid α-linolenic afectează concentrația acizilor C18:3 din lapte (Chilliard et al., 2003; Gomez-Cortes et al., 2009; Mierlita et al., 2011).

Un lapte bogat în acizi grași nesaturați este susceptibil oxidării, astfel încât prezența antioxidanților este necesară pentru menținerea calității laptelui (Slots et al., 2009). În lapte, concentrația α-tocoferolului și carotenoidelor, reprezintă un factor important pentru stabilitatea oxidativă. O cantitate ridicată din acest tip de antioxidanți în lapte se poate obține dacă în dieta animalelor se introduce o cantitate mare de pășune sau furaje pe bază de trifoi (Havemose et al., 2004; Renobales et al., 2012). Studiile de literatură cu privire la capacitatea antioxidantă/stabilitatea oxidativă a laptelui de oaie sunt puține, majoritatea fiind realizate pe lapte de vacă, probabil datărită importanței economice, fiind cel mai mult consumat de populație (Chilliard & Ferlay, 2004).

III.5.2. Obiective

Scopul lucrării a fost de a determina dacă dietele pe bază de porumb și iarbă-siloz cu sau fără suplimentare de semințe de camelină (Camelina sativa L.) îmbunătățește profilul acizilor grași și stabilitatea oxidativă în cazul laptelui de oaie. Acest studiu de cercetare s-a realizat în cadrul proiectului CNCSIS–UEFISCDI, project number PN II – IDEI 679/2008, proiect în care am avut funcția de membru.

III.5.3. Materiale și metode

S-au luat în studiu 40 de oi Turcană, care au fost împărțite în patru grupuri omogene. La debutul studiului producția de lapte a fost de 744,7 ± 148,5 g / zi cu un conținut în grăsime de 66,8± 11,2 g/L. Cele patru grupuri de oi au fost repartizate aleatoriu la unul din cele patru tipuri de diete aranjate după modelul 2×2 factorial. Factorul principal a fost dieta pe bază de siloz (iarbă sau porumb), iar al doilea factor a fost suplimentarea/nesuplimentarea dietei cu semințe de camelină. Semințele de camelină conțin 37,65 g grăsime brută și o concentrație mare de acizi grași polinesaturați, de exemplu, acidul linoleic (22,1%) și acid α-linolenic (43,7%). Dietele repartizate celor 4 grupuri de oi au fost:

Dieta bazată pe siloz tip iarbă fără supliment de semințe de camelină (GS/-CS),

Dieta bazată pe siloz tip iarbă cu supliment de semințe de camelină (70 g/kg) (GS/+CS),

Dieta bazată pe siloz tip porumb fără supliment de semințe de camelină (MS/-Cs),

Dieta bazată pe siloz tip porumb cu supliment de semințe de camelină (70 g/kg) (MS/+Cs).

Capacitatea antioxidantă atât a dietelor preparate pentru nutriția oilor cât și stabilitatea oxidativă a laptelui a fost determinat prin metoda TEAC (Trolox Equivalents Antioxidant Capacity) conform protocolului descris de Renobales et al. (2012). Principiul metodei constă în capacitatea probelor de a îndepărta radicalul cation ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid). Reactivul ABTS a fost dizolvat în apă distilată astfel încât să se obțină o concentrație de 7 mM. Pentru producerea radicalului cation ABTS+., soluția de ABTS a fost mixată cu persulfat de potasiu 2,45 mM și lăsat să reacționeze la temperature camerei în întuneric timp de 12-16 ore. Soluția obținută a fost ulterior diluată cu tampon fosfat salin (0,15M, pH 6,7) până la obținerea unei absorbanțe de 0,70 ± 0,02 la 730 nm. La probele de lapte s-a ajustat pH-ul la 6,7 și au fost diluate de 10 ori înainte de analize. Un volum de 0,5 ml de probă (lapte) s-a adaugat soluției de ABTS diluată, iar absorbanța a fost citită exact la 10 minute la 730 nm. O probă blanc s-a utilizat pentru a corecta turbiditatea reziduală. Curba de calibrare (Figura III.9) s-a realizat cu standardul Trolox, în domeniul de concentrație de 0-20 µM. Stabilitatea oxidativă a laptelui s-a exprimat ca μmol echivalenți Trolox/g proteină. Capacitatea antioxidantă a dietelor s-a exprimat ca μmol echivalenți Trolox/100 g dietă.

Figura III. 9. Curba de calibrare cu Trolox (0-20µM) prin metoda TEAC

III.5.4. Rezultate și discuții

Dietele bazate pe siloz tip iarbă conțin o cantitate mai mare de acizi grași polinesaturați (PUFA), în special acizi de tip ω-3 comparativ cu dietele tip porumb, în care predomină acizii grași de tip ω-6. Suplimentarea dietelor oilor cu semințe de camelină, aduce un aport suplimentar de acizi grași și îmbunătățește profilul acizilor grași de tip ω-3 și descrește proporția acizilor grași saturați. Semințele de camelină conțin o cantitate mare de PUFA, în special acid α-linolenic (C18:3, ω-3) (Hurtaud & Peyraud, 2007; Cieslak et al., 2010). Din punct de vedere al capacității antioxidante a dietelor, cea mai înaltă valoare s-a obținut în cazul dietelor tip porumb comparativ cu a dietelor tip iarbă (P < 0,05) (Figura III.10), probabil datorită faptului că în timul procesului de formare a fânului compușii bioactivi de tipul carotenoidelor și tocoferolilor sunt distruși (Chauveau-Duriot et al., 2005). Suplimentarea dietelor cu semințe de camelină, are ca rezultat creștere ușoară a capacității antioxidante (P > 0,05), datorită conținutului ridicat de tocoferol, compus bioactiv cu activitate antioxidantă înaltă (Budin et al., 1995).

Figura III.10. Capacitatea antioxidantă (µmol TE/100g dietă) a dietelor de tip iarbă și porumb cu sau fără supliment de semințe de camelină (+/- Cs)

Îmbunătățirea dietelor oilor cu semințe de camelină a avut ca rezultat creșterea valorii TEAC în lapte cu 44,2% în cazul dietei cu siloz tip porumb +Cs și cu 84,5% în cazul dietei cu siloz tip iarbă +Cs (P < 0.001) (Figura III.11). Creșterea stabilității oxidative a laptelui s-a datorat conținutului ridicat de tocoferoli și fitosteroli din semințele de camelină (Budin et al., 1995; Zubr & Matthaus, 2002). Rezultate similar au fost obținute de Pippel și colab., 2012, în cazul suplimentării dietei vacilor cu ulei de pește și semințe de in.

Figura III.11. Stabilitatea oxidativă a laptelui (µmol TE/g protein) recoltat de la oi după suplimentarea dietelor de tip iarbă și porumb +/- Cs

III.5.5. Concluzii

Studiul experimental a demonstrate că dieta de tip porumb a oilor are ca rezultat creșterea concentrației de cis-9, trans-11 CLA și trans-11 C18:1 în lapte, precum și o descreștere a acizilor C18:3, ω-3. Suplimentarea dietelor cu semințe de camelină îmbunătățește profilul în acizi grași a laptelui, în special cu acid α-linolenic. Profilul în acizi grași a laptelui a fost cel mai puternic îmbogățit în cazul suplimentării dietelor de tip iarbă cu semințe de camelină, atât din punct de vedere al îmbogățirii profilului de acizi grași cu efecte benefice asupra sănătății umane dar și din punct de vedere al stabilității oxidative a laptelui, prin aportul de antioxidanți de tipul tocoferolilor. Astfel, calitatea nutrițională dar și siguranța laptelui pot fi îmbunătățite evitându-se reacțiile de oxidare a acizilor grași nesaturați, care ar avea ca rezultat formarea de produși de reacție nedoriți, care imprimă laptelui un miros și o aromă de nedorit.

Gradul de noutate a acestui studiu (Mierliță & Vicas, 2015) constă în obținerea unui lapte de oaie bogat în acizi grași polinesaturați și cu o stabilitate oxidativă înaltă prin introducerea în rația animalelor a siluzurilor pe bază de porumb și iarbă suplimentate cu semințe de camelină (Camelina sativa L).

B2. Planuri de evoluție și dezvoltare a propriei cariere profesionale, științifice și academice, respectiv direcții de cercetare/predare/aplicații practice și moduri probabile de acțiune pentru punerea în practică a acestora

B.2.1. Planuri de evoluție și dezvoltare a carierei științifice

În anul 2007 am finalizat teza de doctorat cu titlul ” Analiza biochimică și evaluarea activității unor compuși fitochimici din clasa flavnoidelor”, sub coordonarea d-nei Prof. Carmen Socaciu, la USAMV Cluj Napoca, în domeniul Biotehnologii.

Pe baza abilităților dobândite pe parcursul stagiului doctoral, dar și în cadrul unei burse de cercetare, obținute prin competiție la Universitatea Kobe, Departamentul de Chimie Biofuncțională, Japonia, planul meu de evoluție și dezvoltare a carierei științifice a fost marcat de două perioade importante.

Prima perioadă, care s-a derulat între anii 2008-2011, a fost marcată de câștigarea proiectului PN – II – ID – PCE – 2008 – 2, Evaluarea in vitro a efectelor antioxidante si anticancerigene a unor extracte de vasc european (Viscum album) caracterizate prin markeri taxonomici, cod CNCSIS 696 (punctaj 93,93). În cadrul proiectului, rezultatele obținute au fost valorificate în:

3 articole ISI,

9 articole BDI

Un capitol de carte în Phytochemicals/Book 4, Book edited by: Prof. Dr. A. Venketeshwer Rao, INTECH (ISBN 979-953-307-611-8)

Participarea la cel de-al 34th FEBS Congress, July 4-9, 2009, Prague Czech Republic

Participarea la Congresul Internațional Anual al Societății de Biochimie și Biologie Moleculară, desfășurat la Cluj –Napoca (2009)

De asemenea pe parcursul perioadei de desfășurare a proiectului am participat la următoarele cursuri de perfecționare:

Biomolecular Interactions by Experimental Methods, 2-6 Noiembrie 2009, Brno

Transylvania Summer School in Chromatography, 14-20 July 2010, Cluj Napoca

Pe baza publicațiilor legate de topica proiectului, am fost invitată de către dr. Henning Schram, să-mi prezint rezultatele la Institutul Hiscia din Elveția, în anul 2014. În urma discuțiilor purtate, s-au desprins idei noi care vor fi concretiza in viitor.

A doua perioadă marcantă în cadrul evoluției mele științifice (2011-2013) a fost câștigarea bursei postdoctorale în cadrul programului "Biotehnologii celulare si moleculare cu aplicatii în medicină", pe tema: Markeri moleculari pentru autentificarea produselor alimentare. Rezultatele obținute în cadrul bursei postdoctorale au fost valorificate în:

2 articole ISI

2 articole BDI

Participare la a 3 editie a Conferinței Internaționale ” Glucosinolates &Beyond”, Wageningen, Olanda, 2014

Participări la Congresul Internațional Anual al Societății de Biochimie și Biologie Moleculară (Craiova -2011; București -2012, 2013)

Participare la Conferința Știintifică Internațională „Human – Nutrition – Environment, University Rzeszow Iwonicz, Polonia.

Pe perioada 2012-2014, am câștigat 2 proiecte ca și director de proiect:

PN-II-IN-CI-2012-1-0295 Optimizarea unui supliment alimentar cu proprietati antioxidante si antitumorale;

PN-II-IN-CI-2012-1-0327 Obtinerea unor ceaiuri din surse neconventionale de origine vegetala bogate in compusi bioactivi)

și 4 proiecte ca și membru:

PN-II-IN-CI-2013-1-0015 Realizarea unor suplimente nutritive din produse vegetale ce contin produsi bioactivi cu efect antioxidant

PN-II-IN-CI-2013-1-0080Tehnologii inovative de furajare a puilor broiler de curca bazate pe utilizarea unor surse alternative de proteine libere de substante antinutritive

PN-II-IN-CI-2012-1-025 Stabilirea tehnologiei de obtinere a unor sucuri din fructe cu proprietati antioxidante inalte

PN-II-IN-CI-2012-1-0257 Studiul eficientei cultivarii si utilizarii in alimentatia pasarilor a unor soiuri de lupin libere

În cadrul proiectelor câștigate s-au realizat studii experimentale care s-au orientat în special spre partea aplicativă a cercetării, în funcție de cerințele mediului socio-economic. Rezultatele obținute s-au concretizat prin obținerea a două brevete, participări la Congrese Internaționale și publicații în jurnale indexate în baze de date internaționale.

În anul 2014, în cadrul Universității din Oradea,s-a câștigat proiectul PN-II-PT-PCCA-2013-4-2225 ”Electromagnetic methods for improving processes winery”, în care sunt membră, proiect care abordează o topică interdisciplinară. Prim îmbinarea noțiunilor de inginerie electrică cu cea a cunoștiințelor în domeniul alimentar, se urmărește obținerea unui vin de calitate superioară în care compușii bioactivi de interes să se regăsească în cantitatea cea mai mare.

Planul meu de dezvoltare a carierei științifice se bazează pe următoarele obiective:

Îmbunătățirea strategiei de cercetare, prin abordarea unor teme inovative și deschiderea unor noi direcții de studiu interdisciplinare;

Recunoașterea națională și internațională a activității mele de cercetare prin diseminarea rezultatelor cercetării în jurnale ISI și BDI, capitole de cărți în edituri de prestigiu;

Realizarea unei echipe de cercetare interdisciplinară performantă, formată atât din cadrele didactice de la Universitatea din Oradea, dar și din colegii de la alte Instituții din țară sau străinătate;

Menținera și dezvoltarea colaborărilor cu mediu socio-economic pentru orientarea cercetării spre partea aplicativă și dezvolare de produse inovatoare;

Lărgirea competențelor mele în domenii adiacente cu scopul de a aprofunda mecanismele biochimice care au loc în diferite matrici vegetale, biofluide;

Accesarea fondurilor naționale și internaționale pentru susținerea și promovarea cercetării;

Cercetările mele viitoare sunt focusate pe 2 direcții principale:

Compuși bioactivi cu diferite activități biologice (activitatea antioxidantă, activitate antimicrobiană, activitate anticancerigenă, activitate de inducere/inhibare a enzimelor de detoxifiere a organismului) din resurse vegetale diferite. Identificarea mecanismelor de biosinteză/degradare a compușilor bioactivi în diferite situații (procesare alimentară, factori de mediu, prezența elicitorilor etc.).

Obținerea de nanoparticule prin metode chimice și biotechnologice cu aplicații în industria alimentară și medicală (nanobiotechnologie)

În cazul primei direcții de cercetare, cu privire la compușii bioactivi de tipul flavonoidelor, acizilor fenolici, glucozinolațiilor din diferite surse vegetale, se vor aprofunda rezultatele obținute (prezentate în teza de abilitare) prin următoarele abordări:

Se vor utiliza diferite surse vegetale, începând de la germeni la produs finit, și reziduuri derivate din agricultură și industria alimentară, cu scopul fie de a cuantifica și observa sursele cele mai bogate în compuși bioactive, dar și de a recupera acești compuși și de ai valorifica.

Până în momentul de față, au fost luate spre studiu ca matrice vegetală vâscul, plantă semiparazită care crește pe diferiți arbori gazdă, legumele din familia Brassicaceae (germeni și produs finit) și diverse plante medicinale. Voi exploata în continuare văscul de pe alți arbori gazdă (pin, brad, păr etc), diverse plante medicinale autohtone, dar și reziduurile din agricultură (cocenii de porumb, de exemplu) sau din industria alimentară (pulpa de fructe care rămâne în urma obținerii sucurilor, tescovina etc.)

Utilizarea unor metode moderne de extracție a compușilor bioactivi (microunde, pulsuri electrice, ultrasonicări etc) cu scopul de obține produse bogate în principii bioactivi cu efect benefic asupra sănătății.

În cadrul ultimului proiect câștigat (PN-II-PT-PCCA-2013-4-2225), în colaborare cu colegii de la Departamentul de Inginerie Electrică, am testat efectul microundelor și a impulsului electric asupra boabelor de struguri (pielița și semințe) cu scopul de a obține o difuzie mai bună a compușilor bioactivi din matrice în produsul final, vinul. Aceste metode moderne neconvenționale de extracție vor fi aplicate și pe alte matrici pentru a pune la punct o metode de extracție cât mai eficientă a compușilor de interes.

Dezvoltarea și validarea metodelor analitice utilizând Cromatografia de Lichide de Înaltă Performanță cu detecție UV-Vis (HPLC-PDA) dar și mass spectrofotometrică (HPLC-MS/MS), FTIR cu scopul de a identifica și a cuantifica a varietate cât mai mare de compuși prezenți în diferite matrici vegetale, dar și de a observa eventualele modificări pe care le pot suferi în diferite situații (procesare, stress etc.).

În cadrul proiectului MEC (2006-2008)- Laborator interdisciplinar pentru analiza factorilor de risc în agricultură, silvicultură și mediul înconjurător s-a achiziționat un HPLC cu detecție PDA (Shimadzu Corporation, Scientific Instruments, Kyoto, Japan) cu ajutorul căruia putem identifica și cuantifica compușii bioactivi din sursele vegetale, doar în cazul existenței standardelor, pe baza timpului de retenție, a spectrului UV-Vis și eventual prin realizarea co-cromatogramelor. HPLC-MS/MS este un instrument analitic sensibil și performant care permite identificarea și cuantificarea tuturor compușilor separați. În momentul de față, in cadrul Universității din Oradea nu există un astfel de instrument dar pe baza colaborărilor foarte bune cu ”Centrul de Cercetare în Biochimie și Biotehnologie Agroalimentară” din cadrul USAMV Cluj Napoca, având astfel posibilitatea de a aprofunda activitățile de cercetare.

Testarea activității microbiene pe o varietate mare de microorganisme cu risc pentru industria alimentară sau sănătatea umană.

Până în prezent nu am implementat și dezvoltat o metodă care să evidențieze efectul antimicrobian al diferitelor extracte obținute. Aceasta rămâne o direcție nouă în cadrul colectivului nostru de cercetare, având în prezent infrastructura, reactivii și tulpinile de microorganisme necesare.

Testarea in vitro a extractelor sau a compușilor bioactive puri pe diferite linii tumorale pentru evidențierea efectului citotoxic. Încercarea găsirii mecanismului prin care acești biocompuși au efect anticancerigen.

În momentul de față, la Universitatea din Oradea, în cadrul laboratorului de Biotehnologie și Culturi Celulare (http://fmforadea.ro/laborator-de-biotehnologie-si-culturi-celulare-03-03) s-a achiziționat echipamente specifice pentru testarea efectului citotoxic a diverse extracte:

hota de protectie biologica clasa II Biohazard Aquaria (model Bioactiva 90. Afisaj LCD, monitorizare automată a debitului de aer, filtre HEPA, Bec Bunsen Phoenix cu pedala și senzor, Lampa UV 30W);

incubator pentru culturi celulare SANYO MCO-5AC, cu flux de CO2, lampă germicidală UV și control automat al temperaturii;

microscop optic monocular pentru determinarea numărului de celule.

Microplate reader cu incubator inclus (Stat Fax 2100) adaptat pentru plăcute cu 96 de godeuri, la 4 lungi de undă.

Microscopul inversat  CKX41 OLYMPUS pentru contrast de faza, epifluorescenta si câmp luminos, cu sistem de achiziție a imaginilor și soft de prelucrare.

Testarea extractelor vegetale in vivo utilizând animale de experiență cu scopul a de observa dacă sunt potențiator de inducer a enzimelor de Fază II, devenind astfel agenti de prevenire a cancerului.

Toate tratamentele pe animalele de experiență vor fi în concordanță cu legislatia impusă de Uniunea Europeană referitoare la Protecția Animalelor de Laborator. Experiențele se vor derula în cadrul biobazei care aparține Centrului de Cercetări de Medicină de Înaltă Performanță, din Universitatea din Oradea. În cadrul proiectului (PN-II-IN-CI-2012-1-0295), am realizat studii cu privire la potențialul unor suplimente alimentare de a induce enzimele de Fază II, glutation –S-transferaza și quinon-reductaza din ficatul șobolanilor masculi albi de tip Winstar. Se vor realiza în continuare astfel de studii, dar vor fi completate cu metode noi de analiză cu privire la efectul extractelor asupra statutului antioxidant al plasmei și cu diferite metode histologice de evidențiere a posibilelor modificări la nivel celular.

Aplicarea metodelor biostatistice moderne pentru evidențierea unor markeri specifici plantelor, dar și de a identifica aportul fiecărui compus la diferite efecte biologice.

Determinarea markerilor biochimici din diferite plante sau alimente este doar un început în abordarea metabolismului. Doar prin combinarea acestor date chimice, obținute prin diferite tehnici, simple sau complexe, cu informațiile furnizate de chemometrie, clusterizarea grupurilor semnificative pe baza componenților principali se pot obține informații valoroase pentru aprofundarea profilului metabolic. Astfel, metabolomica este integrată în tot sistemul biologic, de la selecția plantelor și controlul calității culturilor, evaluarea calității și siguranței alimentelor, dezvoltarea de noi produse farmaceutice, îmbunătățirea randamentului culturilor și fermentațiilor, etc. Metabolomica a devenit o știință puternică prin caracterizarea moleculelor minore (fitochimicale) din plante sau alimente ca și markeri ai autenticității, trasabilității sau calității plantelor sau alimentelor, cu implicații în nutrițe și sănătate.

În cadrul celei de a doua direcție de cercetare se va urmări obținerea de nanoparticule cu ajutorul microorganismelor cu aplicații în industria alimentară și medicală.

La nivelul colectivului nostru de cercetare s-au demarat astfel de cercetări, reușind până în prezent dezvoltarea unor metode chimice și biotechnologice (utilizând Lactobacillus casei) de transformare a seleniului anorganic (NaHSeO3) în nanoseleniu. Determinarea dimensiunii nanoparticulelor s-a realizat utilizând analizatorul de particule Malvern Mastersizer 2000, iar pentru determinarea concentrației de nanoseleniu s-a determinat prin spectrometria de emisie în flacără (Thermo ICE 3000). Această infrastructură necesară caracterizării nanoparticulelor s-a realizat în colaborare cu Universitatea din Debrecen, Ungaria, Prof. J. Prokisch. Până în prezent s-a realizat incorporarea nanoseleniului obținut în diferite matrici (celuloză, agaroză, chitisan, alginat), care ulterior au fost caracterizate prin spectroscopia FTIR (Perkin Elmer BX II), difracția în raze X (RigakuMiniflex, cu radiație Cu-Kα) și SEM (JEOL JSM 7000F). De asemenea, s-a studiat și gradul de eliberare a nanoseleniului din aceste matrici într-un lichid gastrointestinal simulat (la diferite pH-uri). Rezultatele obținute pe acestă direcție au fost diseminate la Seminarul Internațional de Biomateriale și Medicină Regenerativă, 2015 și sunt în curs de publicare. Această nouă direcție de cercetare din cadrul Universității din Oradea, deschide noi oportunități de studiu dar și de aplicabilitate a nanoparticulelor. Se va incerca formarea unor filme de nanoparticule cu efect antimicrobian, cu aplicabilitate atât în industria alimentară cât și în medicină.

B.2.2. Planuri de evoluție și dezvoltare a carierei profesionale și academice

În același timp, în paralel cu derularea proiectelor câștigate, am fost constant și permanent implicată și în activitatea didactică, imbunătățindu-mi calitatea cursurilor, modalitatea de abordare a temelor prin actualizarea lor la ultimile cercetări în domeniu. În anul 2013, am participat la proiectul ”Școală universitară de formare inițială și continuă a personalului didactic și a trainerilor din domeniul specializărilor tehnice și inginerești-DidaTec” (POSDRU/87/1.3/S/60891), ceea ce mi-a permis însușirea și aplicarea tehnicilor și tehnologiei moderne în educație. Astfel în ultimii ani, am trecut de la procesul de predare tradițional, bazat pe materiale didactice tipărite, la un proces colaborativ, interactiv centrat pe nevoile studentului și pe procesul de învățare. Din acest motiv, mi-am creat și o pagina personală (www.simonavicas.ro) de unde studenții își pot descărca cursurile sub forma prezentările Power Point susținute în cadrul fiecărui curs. Pentru a avea un feed –back cât mai bun cu studenții, la finalul fiecărui curs aplic un test scurt de 5 minute de evaluare a cunoștințelor dobândite pe parcursul celor 2 ore. În acest fel, realizez dacă noțiunile din curs au fost însușite corect sau există subiecte pe care trebuie să mai insist.

De asemenea, în urma câștigării proiectelor am dotat laboratoarele cu echipamente moderne, în momentul de față reușind să realizez studii experimentale complexe și interdisciplinare.

De la terminarea tezei de doctorat (2007), rezultatele mele didactice au fost concretizate în publicarea unei cărți de specialitate (Vicaș S., Biochimie: structura și funcțiile bioconstituenților vegetali, Ed. AcademicPres Cluj-Napoca, 2008, pg.183, ISBN 978-973-744-098-3), a unui curs (Vicas S.I., Elemente de chimie organica si biochimie: aplicatii in stiinta alimentelor, Ed. Univ. Oradea, 2012, pg. 346, ISBN 978-606-10-0926-8) și a unui caiet de laborator (Vicaș S., Chimie organică și biochimie –lucrări practice, Ed. AcademicPres Cluj-Napoca, 2008,pg.160, ISBN 978-973-744-119-5).

Planul de dezvoltare a carierei profesionale include:

Îmbunătățirea cursurilor și actualizarea conținutului cu ultimile rezultate în domeniu;

Îmbunătățirea continuă a tuturor aspectelor legate de procesul de predare în cadrul programelor de licență și master;

Introducerea de noi cursuri pe teme de actualitate, aplicând metode moderne de predare-învățare-evaluare.

Coordonarea tezelor de doctorat, proiectelor de licență și master pe teme apropiate activității mele de cercetare. Pe viitor, dacă voi obține titlul de abilitare, îmi voi folosi experiența de a ajuta doctoranzii, începând de la primele etape (organizare, studierea bibliografiei, alcătuirea și aplicarea planului experimental), continuând cu partea experimentală, asigurându-i infrastructura și materialele necesare pentru obținerea de rezultate originale și asistându-l pe parcursul procesului de publicare în jurnale de prestigiu din domeniu.

Voi incerca să găsesc fonduri de finanțare pentru studiile doctorale,

Voi incuraja doctoranzii să aplice pentru diferite proiecte de cercetare, burse de cercetare, și să participe la diferite Conferințe naționale și internaționale pe tema studiată.

Vor avea sprijinul meu și îi voi ajuta în cariera academică sau profesională pe care și-au ales-o.

B.2.3. Moduri de acțiune

Pentru îndeplinirea obiectivelor propuse voi realiza următoarele activități:

actualizarea materialelor didactice (curs și laborator) conform noilor tendințe naționale dar și internaționale, și realizarea conexiunilor cu alte discipline înrudite;

coroborarea conținutului disciplinelor cu cerințele de pe piața muncii (angajatorii) și de a eficientiza procesul de dobândire a competențelor profesionale a studenților;

aplicarea metodelor moderne de învățare, prin implementarea noilor tehnologii ale informatiei si comunicatiilor, astfel încât studenții să fie implicați și motivați, asumându-și responsabilitatea pentru studiile urmate și cunoștințele însușite;

participarea regulată la conferințe, workshop-uri, seminarii sau întâlniri cu mediu socio-economic, pentru a fi la zi cu noutățile în domeniul studiat, de a realize diferite contacte cu cercetătorii în domeniu și de a afla cerințele mediului privat pentru a reuși să ne adaptam cercetările către o cercetare aplicativă;

Informarea studenților cu rezultatele cercetării, fie prin introducerea lor în disciplinele de predare, fie prin organizarea de seminarii pe tema respectivă (in special pentru masteranzi și doctoranzi);

Modernizarea laboratoarelor de cercetare prin includerea de noi metode de studiu, și permiterea studenților de a lucra cu echipamentele de cercetare pentru a dobândi abilități practice necesare fie în domeniul cercetării, fie pentru industrie;

Dezvoltarea și extinderea activității de cercetarea prin implicarea atât a colegilor cât și a studenților;

Încurajarea studenților de a participa la mobilitățile Erasmus sau de a lucra în alte echipe din țară sau din străinătate;

Susținerea conferinței studențești Innovativa (http://www.innovativa.ro/) prin implicarea studenților în activitatea de cercetare, și încurajarea lor de a participa la Conferințe internaționale studențești (Polonia, Slovacia, România)

Publicarea de cărți de specialitate împreună cu colegii sau cu alți cercetători din țară sau străinătate

B3. BIBLIOGRAFIE

***The Angiosperm Phylogeny Group, 2003, An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean Society,141(4), 399 436.

Abbaoui B., K.M. Riedl, R.A. Ralston, J.M. Thomas-Ahner, S.J. Schwartz, S.K. Clinton, A. Mortazavi, 2012, Inhibition of Bladder Cancer by Broccoli Isothiocyanates Sulforaphane and Erucin: Characterization, Metabolism and Interconversion. Mol Nutr Food Res 56, 1-20.

Al-Duais, M., L. Müller, V. Böhm, G. Jetschke, 2009, Antioxidant capacity and total phenolics of Cyphostemma digitatum before and after processing: use different assays. Eur. Food Res. Technol 228, 813-821.

Alvarez-Jubete L., T.J. Smyth, J. Valverde, D.K. Rai, C. Barry-Ryan, 2014, Simultaneous Determination of Sulphoraphane and Sulphoraphane Nitrile in Brassica Vegetables using Ultra Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry. Phytochemical Analysis 25 (2), 141-146.

Andrade, P.V.D. & Schmidely, Ph., 2006, Influence of percentage of concentrate in combination with rolled canola seeds on performance, rumen fermentation and milk fatty acid composition in dairy goats. Livest. Sci. 104, 77-90.

Arnao M.B., A. Cano, J.F.Alcolea, M. Acosta, 2001, Estimation of free radical quenching activity of leaf pigment extracts, Phytochem Anal., 12, 138-143.

Baldwin E.A, Scott JW, Einstein MA, Malundo TMM, Carr BT, Shewfelt RL, Tandon KS, 1998, Relationship between sensory and instrumental analysis for tomato flavor. J Amer Soc Hort Sci 123, 906–915.

Barbieri G, Pernice R, Maggio A, De Pascale S, Fogliano V, 2008, Glucosinolates profile of Brassica rapa L. subsp. Sylvestris L. Janch. var. esculenta Hort. Food Chem 107,1687–1691.

Barney, C.W., F.G. Hawksworth, B.W.Geils , 1998, Hosts of Viscum album.European Journal of Forest Pathology 28, 187-208.

Becker K., J. Exner, 1980, Vergleichende Untersuchungen von Misteln verschiedener Wirtsbäume and Hand der Flavonoide und Phenolcarbonsäuren. Z. Pflanzenphysiol 97: 417-428.

Bellostas N, Kachlicki P, Sørensen JC, Sørensen H, 2007, Glucosinolate profiling of seeds and sprouts of B. oleracea varieties used for food, ScientiaHorticulturae, 114 (4), 234-242.

Benito, E., Obrador, A., Stiggelbout, A., Bosch, F. X., Mulet,M.,Munoz, N., et al., 1990, A population-based case-control study of colorectal cancerin Majorca. I. dietary factors. International Journal of Cancer, 45, 69–76.

Benzie I.F., J. J. Strain, 1996, The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of ''antioxidant power'': The FRAP assay. Anal. Biochem, 239, 70-76.

Benzie IF., Strain J.J., 1999, Ferric reducing/antioxidant power assay: direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration Methods Enzymol. 1999; 299,15-27.

Biston R, Dardenne P, Cwikowski M, Marlier M, Severin M, Wathelet JP ,1998, Fast analysis of rapeseed glucosinolates by near infrared reflectance spectroscopy. J.Am. Oil. Chem.Soc. 65: 1599-1600.

Bones, A. M., & Rossiter, J., 1996, The myrosinase-glucosinolate system, its organization and biochemistry. Plant Physiology, 97, 194–208.

Brandt K., Molgaard, JPM, 2001, Organic agriculture: does it enhance or reduce the nutritional value of food plants. J. Sci Food Agric 81, 924-931.

Brand-Williams, W., M.E. Cuvelier, C. Berset, 1995, Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity, Lebensmittel-Wissenschaft und -Technologie/Food Science and Technology, 28, 25-30.

Budin, J.T., Breene, W.M. & Putnam, D.H., 1995. Some compositional properties of camelina (Camelina sativa L. Crantz) seeds and oils. J. Am. Oil Chem. Soc. 72, 309-315.

Büssing A, Schietzel M., 1999, Apoptosis-inducing properties of Viscum album L. extracts from different host trees, correlate with their content of toxic mistletoe lectins. Anticancer Res., 19: 23-28.

Büssing, A. ,2000, Mistletoe. The genus Viscum, 2nd ed. Harwood Academic Publishers.

Buttery RG, Ling LC. 1993. Volatile components of tomato fruit and plant parts: relationship and biogenesis. In Bioactive Volatile Compounds from Plants. American Chemical Society: Washington, DC; 22–33.

Cao, G., R.L. Prior, 1998, Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin. Chem. 44, 1309-1315.

Cartea M.E., Francisco M., Soengas P., Velasco P., 2011, Phenolic Compounds in Brassica Vegetables, Molecules, 16, 251-280.

Cartea ME, de Haro A, Obregón S, Soengas P, Velasco P ,2012, Glucosinolate variation in leaves of Brassica rapa crops. Plant Foods Hum Nutr 67:283–288.

Chen J., Halls S.C., Alfaro J.F., Zhou Z., Hu M., 2004,Potential beneficial metabolic interactions between tamoxifen and isoflavones via cytochrome P450-mediated pathways in female rat liver microsomes, Pharm. Res., 21, 2095-2104.

Chilliard, Y. & Ferlay A., 2004, Dietary lipids and forage interactions on cow and goat milk fatty acid composition and sensory properties. Reprod. Nutr. Devel. 44, 467-492.

Chilliard, Y., Ferlay, A., Doreau, M., 2001, Effect of different types of forages, animal fat or marine oils in cow’s diet on milk fat secretion and composition, especially conjugated linoleic acid and polyunsaturated fatty acid. Livest. Prod. Sci. 70, 31-48.

Chilliard, Y., Ferlay, A., Rouel, J. & Lambere, G., 2003, A review of nutritional and physiological factors affecting goat milk synthesis and lipolysis. J. Dairy Sci. 86, 1751-1770.

Chiș A, Fetea F, Matei H, Socaciu C, 2011, Evaluation of hydrolytic activity of different pectinases on sugar beet (Beta vulgaris) substrate using FT-MIR spectroscopy. Not Bot Horti Agrobo39:99-104.

Ciska, E., Martyniak-Przybyszewska, B., Kozlowska, H., 2000, Content of glucosinolates in cruciferous vegetables grown at the same site for two years under different climatic conditions, J. Agric. Food Chem., 48, 2862 –2867.

Ciska, E., Pathak, D. R., Glucosinolate derivatives in stored fermented cabbage, 2004, J. Agric. Food Chem. 52, 7938 –7943.

Cohen, J. H., Kristal, A. R., & Stanford, J. L., 2000, Fruit and vegetable intakes and prostate cancer risk. Journal of the National Cancer Institute, 92, 61–68.

Condrat D., M.R. Szabo, F. Crisan, A-X.Lupea. ,2009, Antioxidant activity of some phanerogam plant extracts. Food Science and Technology Research, 15 (1), 95-98.

Crăciun F., Alexan M., Alexan C., 1991, Ghidul plantelor medicinale uzuale, București, 38-39.

Das, S., Tyagi, A. K., & Kaur, H., 2000, Cancer modulation by glucosinolates: A review. Current Science, 79, 1665–1671.

Davis AR, Fish WW, Perkins-Veazie P., 2003, A rapid spectrophotometric method for analyzing lycopene content in tomato and tomato products. Postharvest Biol Technol 28: 425–430.

De Pascale S, Maggio A, Pernice R, Fogliano V, Barbieri G, 2007, Sulphur fertilization may improve the nutritional value of Brassica rapa L. subsp sylvestris. Europ J Agronomy 26:418–424.

Dere, Ș., Güneș, T., Ridvan, S., 1998, Spectrophotometric Determination of Chlorophyll – A, B and Total Carotenoid Contents of some Algae Species Using Diffent Solvents. Turkish Journal of Botany, 22: 13-17.

Devi J.R., E.B. Thangam, 2012, Mechanisms of Anticancer Activity of Sulforaphane from Brassica oleracea in HEp-2 Human Epithelial Carcinoma Cell Line. Asian Pac J Cancer Prev, 13, 2095-2100.

Drużyńska, B., A. Stępniewska, R. Wołosiak ,2007, The influence of time and type of solvent on efficiency of the extraction of polyphenols from green tea and antioxidant properties obtained extracts. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment. 6 (1): 27-36.

Fahey JW, Haristoy X, Dolan PM, et al., 2002, Sulforaphane inhibits extracellular, intracellular, and antibiotic-resistant strains of Helicobacter pylori and prevents benzo[a]pyrene-induced stomach tumors. Proc Natl Acad Sci;99:7610-7615.

Fahey, J.W., Zalcmann, A. T., Talalay, P., 2001,The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants, Phytochemistry, 56, 5–51.

Falara V, Akhtar TA, Nguyen TTH, Spyropoulou EA, Bleeker PM, Schauvinhold I, Matsuba Y, Bonini ME, Schilmiller AL, Last RL, Schuurink RC, Pichersky E., 2011, The tomato terpene synthase gene family. Plant Physiol 157: 770–778.

Farneti B, Cristescu SM, Costa G, Harren FJM, Woltering EJ., 2012, Rapid tomato volatile profiling by using proton-transfer reaction mass spectrometry (PTR–MS). J Food Sci 77: C551–C55.

Faulkner, K., Mithen, R., & Williamson, G.,1998, Selective increase of the potential anticarcinogen 4 methylsulfphinylbutyl glucosinolate in broccoli. Carcinogenesis, 19, 605–609.

Fernández-León M.F., A.M. Fernández-León, M. Lozano, M.C. Ayuso, D. González-Gómez, 2013, Altered commercial controlled atmosphere storage conditions for ‘Parhenon’ broccoli plants (Brassica oleracea L. var. italic). Influence on the outer quality parameters and on the health-promoting compounds. LWT-Food Science and Technology, 50, 665-672.

Font R, Del Rio M, Fernandez-Martinez JM, De Haro A, 2004, Use of near –infrared spectroscopy for screening the individual and total glucosinolate content in Indian mustard seed (Brassica juncea L. Czern&Coss.) J. Agri.Food Chem., 52: 3563-3569.

Font R, Del Rio-Celestino M, Cartea E, de Haro-Bailon A, 2005, Quantification of glucosinolates in leaves of leaf rape (Brassica napus ssp. pabularia) by near-infrared spectroscopy, Phytochemistry, 66: 175-185.

Francisco M., Moreno D.A., Cartea M.E., Ferreres F., García-Viguera, Velasco P., 2009, Simultaneous identification of glucosinolates and phenolic compounds in a representative collection of vegetable Brassica rapa, Journal of Chromatography A, 1216, 6611-6619.

Giovannucci E, Ascherio A, Rimm EB, Stampfer MJ, Colditz GA, Willett WC.,1995, Intake of carotenoids and retinol in relation to risk of prostate cancer. J Natl Cancer Inst 87: 1767–1776.

Giudice A., Montelella M., 2006,Activation of the Nrf2-ARE signaling pathway: a promising strategy in cancer prevention, BioEssays, 28, 169-181.

Haas K, Bauer M, Wollenweber E., 2003, Cuticular waxes and flavonol aglycones of mistletoes. Z. Naturforsch, 58c: 464-470.

Hajtó T, Hostanska K, Berki T, Pálinkás L, Boldizsár F, Németh P.,2005, Oncopharmacological perspectives of a plant lectin (Viscum album Agglutinin-I): overview of recent results from in vitro experiments and in vivo animal models, and their possible relevance for clinical applications. Evid Based Complement. Alternat. Med., 2, 59–67.

Havemose, M.S., Weisbjerg, M.R., Bredie, W.L.P., Poulsen, H.D. & Nielsen, J.H., 2006, Oxidative stability of milk influenced by fatty acids, antioxidants, and copper derived from feed. J. Dairy Sci. 89, 1970-1980.

Hong E., Kim S-J., Kim G-H., 2011, Identification and quantitative determination of glucosinolates in seeds and edible parts of Korean Chinese cabbage, Food Chemistry, doi: 10.1016/j.foodchem.2010.11.102.

Huang D., B. Ou, M. Hampsch-Woodill, J.A.Flanagan, R.L. Prior, 2002, High-throughput assay of oxygen radical absorbance capacity (ORAC) using a multichannel liquid handling system coupled with a microplate fluorescence reader in 96-well format, J. Agric Food Chem, 50 (16), 4437-44.

Johansson NL, Pavia CS, Chiao JW., 2008, Growth inhibition of a spectrum of bacterial and fungal pathogens by sulforaphane, an isothiocyanate product found in broccoli and other cruciferous vegetables. Planta Med;74:747-750.

Krumbein A, Peters P, Brückner B., 2004, Flavour compounds and a quantitative descriptive analysis of tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.) of different cultivars in short-term storage. Postharvest Biol Technol 32: 15–28.

Kushad, M. M., Brown, A. F., Kurilich, A. C., Juvik, J. A., et al., 1999. Variation of glucosinolates in vegetable crops of Brassica oleracea, J. Agric. Food Chem., 47, 1541–1548.

Kusznierewicz B, Iori R, Piekarska A, JacekNamie´snik J, Bartoszek A, 2013, Convenient identification of desulfoglucosinolates on the basis of mass spectra obtained during liquid chromatography–diode array–electrospray ionization mass spectrometry analysis: Method verification for sprouts of different Brassicaceae species extracts, Journal of Chromatography A, 1278, 108– 115.

Kusznierewicz B., A. Bartoszek, L. Wolska, J. Drzewiecki, S. Gorinstein, J. Namieśnik, 2008, Partial characterization of White Cabbages (Brassica oleracea var. capitata f. alba) from different regions by glucosinolates, bioactive compounds, total antioxidant activities and proteins. LWT-Food Science and Technology 41, 1–9 .

Kuti OJ, Konuru HB., 2005, Effect of genotype and cultivation environment on lycopene content in red-ripe tomatoes. J Sci Food Agric 85: 2021–2026.

Le Marchand, L., Yoshizawa, C. N., Kolonel, L. N., Hankin, J. H., & Goodman, M. T., 1989, Vegetable consumption and lung cancer risk: A population-based case-control study in Hawaii. Journal of the National Cancer Institute, 81, 1158–1164.

Leu Y-L., T-L. Hwang, Y-M. Chung, P-Y. Hong, 2006, The inhibition of superoxide anion generation in human neutrophils by Viscum coloratum, Chem. Pharm. Bull, 54, 1063-1066.

Li-Chan E, Chalmers JM, Griffiths P, 2010, Applications of Vibrational Spectroscopy in Food Science, Wiley, Vol.1., pg. 405.

Lind, C., Cadenas, E., Hochstein, L., Ernster, L.,1990, DT-diaphorase: purification, properties and functions, Method in enzymology, 186: 287-301

Lo Feudo G, Macchione B, Naccarato A, Sindona G, Tagarelli A., 2011, The volatile fraction profiling of fresh tomatoes and triple concentrate tomato pastes as parameter for the determination of geographical origin. Food Res Int 44: 781–788.

Lopez-Huertas, E., 2010, Health effects of oleic acid and long chain omega-3 fatty acids (EPA and DHA) enriched milks. A review of intervention studies. Pharmacol. Res. 61, 200-207.

Luczkiewicz M., W. Cisowski, P. Kaiser, R. Ochocka, A. Piotrowski., 2001, Comparative analysis of phenolic acids in mistletoe plants from various hosts. Acta Poloniae Pharmaceutica-Drug Research, 58 (5), 373-379Markham K.R., (1982). Techniques of Flavonoid Identification, Academic Press, p.15-16

Luthria DL, Mukhopadhyay S, Krizek DT., 2006, Content of total phenolics andphenolic acids in tomato (Lycopersicon esculentumMill.) fruits as influenced by cultivar and solar UV radiation. J Food Comp Anal 19: 771–777.

Martinez-Villaluenga C., E. Pe˜Nas, J. Frias, E. Ciska, J. Honke, M.K. Piskula, H. Kozlowska, C. Vidal-Valverde, 2009, Influence of Fermentation Conditions on Glucosinolates, Ascorbigen, and Ascorbic Acid Content in White Cabbage (Brassica oleracea var. capitata cv. Taler) Cultivated in Different Seasons. J Food Sci 74, C62-C67.

Massaro, M., Carluccio, M.A. & de Caterina, R., 1999, Direct vascular antiatherogenic effects of oleic acid: a clue to the cardioprotective effects of the Mediterranean diet. Cardiologia 44, 507-513.

Mata-Greenwood E., Song L., Jang M., Pezzuto J.M., 2004, Natural inhibitors of carcinogenesis, Planta Med., 70, 691-705

McNaughton, S. A., Marks, G. C., 2003, Development of a food composition database for the estimation of dietary intakes of glucosinolates, the biologically active constituents of cruciferous vegetables, Br. J. Nutr., 90, 687 –697.

Melzer J, Iten F, Hostanska K, Saller R., 2009, Efficacy and safety ofmistletoe preparations (Viscum album) for patients with cancer diseases. A systematic review. Forsch Komplementmed, 16(4): 217- 226.

Meyer M., Adam S., 2008, Comparison of glucosinolate levels in commercial broccoli and red cabbage from conventional and ecological farming, Eur Food Res Technol, 226, 1429-1437.

Mierlita D., Vicas SI., 2015, Dietary effect of silage type and combination with camelina seed on milk fatty acid profile and antioxidant capacity of sheep milk, South African Journal of Animal Science, 45 (1), 1-11.

Miliauskas, G., P.R. Venskutonis, T.A. vanBeek , 2004, Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chem. 85, 231-237.

Moran, R., 1982, Formulae for determination of chlorophyllous pigments extracted with N,Ndimethylformamide. Plant Physiology, 69(6): 1376-1381

Nioi P., Hayes J.D., 2004,Contribution of NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 to protection against carcinogenesis, and regulation of its gene by the Nrf2 basic-region leucine zipper and arylhydrocarbon receptor basic helix-loop-helix transcription factors, Mutation Research., 555, 149-171

Nwanjo HU, 2007, Free Radicals Scavenging Potential of the AqueousExtract of Viscum album (Mistletoe) Leaves In Diabetic Wistar Rats Hepatocytes. Internet J. Nutr. Wellness., 3, 2.

Odriozola-Serrano I, Soliva-Fortuny R, Martin-Belloso O., 2008, Effect of minimal processing on bioactive compounds and color attributes of fresh-cut tomatoes. LWT 41, 217–226.

Ofem OE, Eno AE, Imoru J, Nkanu E, Unoh F, Ibu JO, 2007, Effect of crude aqueous leaf extract of Viscum album (mistletoe) in hypertensive rats. Indian J. Pharmacol., 39: 15-19.

Olsen, G., Mandel, J. S., Wattenberg, L. W., & Schuman, L. M., 1989, A case-control study of pancreatic cancer and cigarettes, alcohol, coffee and diet. American Journal of Public Health, 79, 1016–1019.

Oluwaseun, A.A., O. Ganiyu, 2008, Antioxidant properties of methanolic extracts of mistletoes (Viscum album) from cocoa and cashew trees in Nigeria. African Journal of Biotechnology 7 (17): 3138-3142Onay-Ucar E., A. Karagoz, N.Arda, 2006, Antioxidant activity of Viscum album ssp. album, Fitoterapia 77, 556-560.

Pérez-Balibrea S, Moreno DA, García-Viguera C, 2011, Genotypic effects on the phytochemical quality of seeds and sprouts from commercial broccoli cultivars, Food Chemistry, 125 (2), 348-354.

Picchi V., C. Migliori, R. Lo Scalzo, G. Campanelli, V. Ferrari, L.F. Di Cesare, 2012, Phytochemical content in organic and conventionally grown Italian cauliflower. Food Chemistry 130, 501– 509.

Porra, R.J., 2002, The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of clorophylls a and b. Photosynthesis Research, 73: 149-155.

Razis A.F.A., N.M. Noor, 2013, Cruciferous Vegetables: Dietary Phytochemicals for Cancer Prevention. Asian Pac J Cancer Prev, 14, 1565-1570.

Renobales, M., Amores, G., Arranz, J., Virto, M., Barrón, L.J.R., Bustamante, M.A., Ruiz de Gordoa, J.C., Nájera, A.I., Valdivielso, I., Abilleira, E., Beltrán de Heredia, I., Pérez- Elortondo, F.J., Ruiz, R., Albisu, M. & Mandaluniz, N., 2012, Part-time grazing improves sheep milk production and its nutritional characteristics. Food Chem. 130, 90-96.

Robbins R, Keck AS, Banuelos G, Finley JW, 2005, Cultivation conditions and selenium fertilization alter the phenolic profile, glucosinolate and sulforaphane content of broccoli. J Med Food 8(2):204–214.

Roman, G.P., E. Neagu, G.L. Radu, 2009, Antiradical activities of Salvia officinalis and Viscum album L. Extracts concentrated by ultrafiltration process. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment 8 (3): 47-58.

Ross D., Kepa J.K., Winski S.L., Beall H.D., Anwar A., Siegel D., 2000, NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1): chemoprotection, bioactivation, gene regulation and genetic polymorphisms, Chemico-Biological Interactions, 129, 77-97.

Rugina D., Vicaș S., Momeu C., Socaciu C., 2008, Antioxidant activity of flavanols from grape seed extracts, Chemické listy, 99, 1234-35.

Ruginǎ D., Vicaș S., Petran M., Pintea A., Bunea A., Socaciu C., 2010, Preliminary Research Regarding The Antitumor Effects Of Mistletoe on A2780 Cells, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, Cluj-Napoca, 67 (1-2), 429-436.

Sakakibara H., Y. Honda, S.Nakagawa, H.Ashida, K. Kanazawa., 2003, Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits, and tea, J. Agric. Food Chem., 51, 571-581.

Seeram NP, Aviram M, Zhang Y, Henning SM, Feng L, Dreher M, Heber D., 2008, Comparison of antioxidant potency of commonly consumed polyphenol-rich beverages in the United States. J. Agric. Food Chem 56, 1415-1422.

Shi J, Yu J, Pohorly JE, Kakuda Y., 2003, Polyphenolics in grape seeds-biochemistry and functionality. J Med Food., 6(4), 291-9.

Shi, Z-M.; Feng, P.; Jiang, D-Q.; Wang X-J., 2006, Mistletoe alkali inhibits peroxidation in rat liver and kidney. World Journal Gastroenterology Vol.12, pp. 4052-405.

Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM, 1999, Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol299:152–178.

Slots, T., Butler, G., Leifert, C., Kristensen, T., Skibsted, L.H. & Nielsen, J.H., 2009. Potentials to differentiate milk composition by different feeding strategies. J. Dairy Sci. 92, 2057-2066.

Socaci S., C Socaciu, C Mureșan, A Fărcaș, Ma Tofană, Vicaș SI., A Pintea, 2014, Chemometric Discrimination of Different Tomato Cultivars Based on Their Volatile Fingerprint in Relation to Lycopene and Total Phenolics Content", Phytochemical Analysis, 25 (2), 161-169.

Socaci SA, Socaciu C, Tofană M, Rați IV, Pintea A., 2013, In-tube-extraction and GC-MS analysis of volatile components from wild and cultivated sea buckthorn (Hippophae rhamnoides ssp. Carpatica) berry varieties and juice. Phytochem Anal 24, 319–328.

Socaciu C., Fetea F., Ranga F., Pop R., Zavoi S., 2011, Metabolomics-Based Systems Biology Needs Chemometrics – Former Experience and Case Studies, Bulletin UASVM Agriculture, 68(2), 430-438.

Song și Thornalley, 2007, Effect of storage, processing and cooking on glucosinolate content of Brassica vegetables, Food Chem Toxicol. 2007 Feb;45(2):216-24.

Sousa C, Valentao P, Rangel J, Lopes G, Pereira JA, Ferreres F, Seabra RA, Andrade PB, 2005, Influence of two fertilization regimens on the amounts of organic acids and phenolic compounds of tronchuda cabbage (Brassica oleracea L. var. costata DC). J Agric Food Chem 53, 9128–9132;

Surh Y.J., 1999,Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic substances, Mutation Research, 428, 305-327.

Surh Y.J., 2003,Cancer chemoprevention with dietary phytochemicals, Nature Reviews Cancer, 3, 768-780.

Tandon KS, Baldwin EA, Shewfelt RL., 2000, Aroma perception of individual volatile compounds in fresh tomatoes (Lycopersicon esculentum, Mill.) as affected by the medium of evaluation. Postharvest Biol Technol 20: 261–268.

Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R., &Williamson, G., 1995, Dietary glucosinolates as blocking agents against carcinogenesis- Breakdown products assessed by induction of quinone reductase activity in murine hepa1c1c7 cells. Carcinogenesis, 16, 1191–1194.

Tian Q, Rosselot RA, Schwartz SJ., 2005, Quantitative determination of intact glucosinolates in broccoli, broccoli sprouts, Brussels sprouts, and cauliflower by high-performance liquid chromatography– electrospray ionization–tandem mass spectrometry. Anal Biochem 343:93–99.

Tikunov Y, Lommen A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Bino RJ, Hall RD, Bovy AG., 2005, A novel approach for nontargeted data analysis for metabolomics. Large-scale profiling of tomato fruit volatiles. Plant Physiol 139: 1125–1137.

Tikunov Y, Ric de Vos CH, González Paramás AM, Hall RD, Bovy AG., 2010, A role for differential glycoconjugation in the emission of phenylpropanoid volatiles from tomato fruit discovered using a metabolic data fusion approach1[W][OA]. Plant Physiol 152, 55–70.

Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Psomas, A., Zovoili, A., & Siatis, V., 2009, Polyphenolic profile and antioxidant activity of five apple cultivar grown under organic and conventional agricultural practices. International Journal of Food Science and Technology, 44, 1167–1175.

Vallejo, F.; Tomas-Barberan, F.A.; Garcia-Viguera, C. 2003, Effect of climatic and sulphur fertilisation conditions, on phenolic compounds and vitamin C, in the inflorescences of eight broccoli cultivars. Eur. Food Res. Technol. 216, 395-401.

Van Poppel, G., Verhoeven, D. T., Verhagen, H., & Goldbohm, R. A., 1999, Brassica vegetables and cancer prevention. Epidemiology and mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology, 472, 159–168.

Velasco P, Francisco M, Moreno DA, Ferreres F, García-Viguera C, Cartea ME, 2011, Phytochemical fingerprinting of vegetable Brassica oleracea and Brassica napus by simultaneous identification of glucosinolates and phenolics. Phytochemical Analysis, 22(2):144-152.

Verkerk R., Schreiner M., Krumbein A., Ciska E., Holst B., Rowland I., De Schrijver R., Hansen M., Gerhäuser C., Mithen R., Dekker M., 2009, Glucosinolates in Brassica vegetables:The influence of the food supply chain on intake,bioavailability and human health, Mol. Nutr. Food Res., 53, S219 –S265.

Verkerk, R., Dekker, M., 2004,Glucosinolates and myrosinase activity in red cabbage (Brassica oleracea L. var. Capitata f.rubra DC.) after various microwave treatments, J. Agric. Food Chem. 52, 7318 –7323.

Verkerk, R., Dekker, M., Jongen, W. M. F., 2001. Post-harvest increase of indolyl glucosinolates in response to chopping and storage of Brassica vegetables, J. Sci. Food Agric.,81, 953–958.

Vicaș S., Rugină D., Leopold L., Pintea A., Socaciu C., 2011a, HPLC Fingerprint of Bioactive Compounds and Antioxidant Activities of Viscum album from Different Host Trees, Notulae Botanicae, 39 (1), 48-57.

Vicas S., Prokisch J., Rugina D., Socaciu C., 2009b, Hydrophilic and Lipophilic Antioxidant Activities of Mistletoe (Viscum album) as determined by FRAP method, Notulae Botanicae, 37 (2), 112-116.

Vicas S., Rugina D., Pantea S., Socaciu C., 2009a, The Morphological Features and UV-VIS Analysis of Some Taxonomic Markers of Genus Viscum, Bulletin UASVM, Agriculture, nr.66 (1-2)/2009.

Vicas S., Rugina D., Socaciu C., 2011b Comparative Study about Antioxidant Activities of Viscum Album from Different Host Trees, Harvested in Different Seasons, Journal of Medicinal Plant Research , 5(11), 2237-2244.

Vicas S., Teusdea Alin, Timar Adrian, Czirjak Tibor Zsolt, Laslo Vasile, Bisboaca Simona, 2014, Changes in plasma antioxidant activityof wistar rats after ingestion of four different food supplements, Romanian Journal of Biochemistry 51 (Supplementa), Poster 52, pg.99

Vicas S.I, Fetea F., Carbunar M., Socaciu C., 2012a, Comparative Fingerprint of Glucosinolates from Brassica Vegetables using HATR/FT-MIR Spectroscopy, Bulletin UASVM, Cluj Napoca, 69 (2), 430-439.

Vicas S.I., Carmen Socaciu, 2012b, Fingerprint of glucosinolates from Brassica vegetables using HPLC chromatography and FT-MIR spectroscopy,"The annual International Conference of the RSBMB & The Conference on “Cellular and Molecular Biotechnologies for Medical Applications” – Bucuresti, Rom.J.Biochem., 49, Suppl.,46-47.

Vicas S.I., A. Teusdea, M. Carbunar, S. Socaci, C. Socaciu, 2013, Glucosinolates Profile and Antioxidant Capacity of Romanian Brassica Vegetables obtained by Organic and Conventional Agricultural Practices. Plant Foods Hum Nutr, 68:313-321.

Vicas S.I., Carmen Socaciu, 2011, Hplc Techniques used to Identify and Quantify Glucosinolates – A Class of S-Containing Phytochemicals from Brasicacee Sp, .The Annual International Conference of the RSBMB & The Conference on “Cellular and Molecular Biotechnologies on Medical Applications”, Sept 28th-30th, Craiova, Romania, (P24).

Vicas S.I., Filip C. M., 2012d, Antioxidant activity of Brassica vegetables grown under organic and conventional agricultural practices from Romania, 3rd International student [anonimizat] “Human-Nutrition-Environment” – University Rzeszow Iwonicz, Polonia, 2012

Vicas S.I., Laslo V., Pantea S., Bandici GE., 2010, Chlorophyll and Carotenoids Pigments from Mistletoe (Viscum Album) Leaves using Different Solvents, Analele Universitatii din Oradea, Fascicula Biologie, TOM XVII/2, 213-218.

Vicas S.I., Rugina D., Sconta Z., Pintea A., Socaciu C., 2011c, The In Vitro Antioxidant and Anti-Proliferative Effect and Induction of Phase II Enzymes by a Mistletoe (Viscum album ) Extract, Bulletin UASVM, 68 (2), 482-491.

Vicas S.I., Socaci S., Socaciu C., 2012/B,c, Sinigrin Glucosinolate: Spectral and Chromatographic Characteristics before and after Enzyme-Assisted Sulphatase Hydrolysis, Fascicula Protectia Mediului, XIX, 299-304.

Vicas ȘI, Teusdea A, Carbunar M, Socaci S, Socaciu C, 2013, Glucosinolates Profile and Antioxidant Capacity of Romanian Brassica Vegetables obtained by Organic and Conventional Agricultural Practices, Plant Foods for Human Nutrition, 68 (3), 313-321.

Vicas SI, Teusdea AC, Carbunar M, Timofte A, Laslo V, Socaci S, Socaciu C., 2015, HPLC Fingerprinting of Glucosinolates during Fermentations Assisted by Chemometric Analysis, Romanian Biotechnological Letters, 6-in press.

Vicas SI, Teusdea AC, Dzugan M., Socaciu C., 2014, HPLC screening of sprouts glucosinolates from commercial broccoli cultivars related to the germination time, Glucosinolates &Beyond, Proceeding/ 3rd International Glucosinolates Conference, Wageningen, The Netherlands, Poster 50, p115.

Vodnar D, Pop O, Socaciu C, 2012, Monitoring Lactic Acid Fermentation in Media Containing Dandelion (Taraxacum officinale) by FTIR Spectroscopy, Not Bot Horti Agrobo 40 (1):65- 68.

Voiculeț N., Niculescu-Duvăz I., 1991,Mecanisme moleculare în cancerogeneza chimică, Editura Științifică, București, p.143-169.

Watson G.W., L.M. Beaver, D.E. Williams, R.H. Dashwood, E. Ho, 2013, Phytochemicals from Cruciferous Vegetables, Epigenetics, and Prostate Cancer Prevention. The AAPS Journal 15, 951-961.

Wennberg M., J. Ekvall, K. Olsson, M. Nyman, 2006, Changes in carbohydrate and glucosinolate composition in white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) during blanching and treatment with acetic acid. Food Chemistry 95, 226-236.

Williams, C.M., 2000, Dietary fatty acids and human health. Ann. Zootech. 49, 165-180.

Yao H., Z-X Liao, Q. Wu, G-Q Lei, Z-J. Liu, D-F. Chen, J-K. Zhou., 2006, Antioxidative flavanone glycosides from the branches and leaves of Viscum coloratum, Chem. Pharm. Bull, 54, 133-135.

Young JE, Zhao X, Carey EE,Welti R, Yang SS,Wang WQ, 2005, Phytochemical phenolics in organically grown vegetables. Mol Nutr Food Res 49:1136–1142.

Zavoi S, Fetea F, Ranga F, Pop R, Baciu A, Socaciu C., 2011, Comparative Fingerprint and Extraction Yield of Medicinal Herb Phenolics with Hepatoprotective Petential, as Determined by UVVis and FT-MIR spectroscopy, Not Bot Horti Agrobo 39 (2):82-89.

Zhang Y., Gordon G.B., 2004,A strategy for cancer prevention: Stimulation of the Nrf2-ARE signaling pathway, Mol. Cancer Ther., 3, 885-893.

Zhao X, Nechols JR, Williams KA, Wang WQ, Carey EE, 2009, Comparison of phenolic acids in organically and conventionally grown pak choi (Brassica rapa L. chinensis). J Sci Food Agric 89:940–946.

Zuber, D., 2004, Biological flora of Central Europe: Viscum album L., Flora – Morphology, Distribution, Functional Ecology of Plants. 199 (3), 181-203.