Cercetări Privind Herpesviroza Caprină In Estul Romaniei

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

,,ION IONESCU DE LA BRAD” IAȘI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

PROIECT DE CERCETARE ȘTIINȚIFICĂ

CERCETĂRI PRIVIND HERPESVIROZA CAPRINĂ

ÎN ESTUL ROMÂNIEI

Domeniul de doctorat: MEDICINĂ VETERINARĂ

Specializarea: Boli infecțioase și Medicină Preventivă

Conducător științific, Doctorand,

Prof.Univ.Dr. Elena Velescu Dr. Iuliana Mihai

Iași, 2015

INTRODUCERE 3

CAPITOLUL 1 4

CARACTERIZAREA CADRULUI ÎN CARE SE VOR DESFĂȘURA CERCETĂRILE 4

1.1Cadrul natural 4

1.2Cadrul organizatoric și instituțional 4

CAPITOLUL 2 6

DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND INFECȚIILE CU CAPRINE HERPESVIRUS 6

2.1 Etiologie 7

2.2 Caractere epidemiologice 9

2.3 Patogeneză 9

2.5 Tablou anatomopatologic 10

2.6 Diagnostic 10

2.7 Profilaxie și combatere 10

CAPITOLUL 3 12

CERCETĂRI DIN ȚARĂ ȘI STRĂINĂTATE PRIVIND INFECȚIILE CU CpHV-1 12

CAPITOLUL 4 21

PROIECTAREA PROTOCOLULUI EXPERIMENTAL 21

4.1Scopul cercetărilor 21

4.2 Obiective și activități 21

4.3 Metode de cercetare 22

4.4. Rezultate preconizate – contribuția lor la dezvoltarea cunoașterii 23

4.5. Modalitatăți de validare și valorificarea rezultatelor 23

CAPITOLUL 5 24

CONCUZII GENERALE 24

BIBLIOGRAFIE 25

INTRODUCERE

Infecțiile provocate de herpesvirusuri sunt consemnate încă de acum 2000 de ani, când Herodot descria pentru prima dată o boală manifestată prin febră și bășicuțe în jurul gurii, pe care a numit-o ,,herpes febrilis”. Mai târziu a fost descrisă o boală asemanătoare, dar cu localizare genitală numită ,,herpes genitalis”.

Herpesviridae este o mare familie de virusuri ADN care cauzează boli atât la animale, cât și la om. Membrii acestei familii sunt cunoscuți și numiți ca herpesvirusuri. Numele de familie este derivat din cuvântul grecesc herpein ("să se strecoare"), referindu-se la latență, infecția tipică pentru acest grup de virusuri recurente. Herpesviridae poate provoca infecții latente sau litice.

Virusurile herpetice au co-evoluat cu gazdele lor de milioane de ani. Prin urmare, diferite specii gazdă pot fi contaminate cu diverse herpesvirusuri înrudite genetic. Există cel puțin 16 virusuri herpetice recunoscute care infectează natural bovine, ovine, caprine și diverse specii de cerb și antilope. Șase dintre virusuri sunt recunoscute ca alphaherpesvirusuri distincte și 9, gammaherpesvirusuri. Buffalo herpesvirus (BflHV) și Ovine herpesvirus-1 (OvHV-1) rămân oficial neclasificate. Virusurile din ambele subfamilii Alphaherpesvirinae și Gammaherpesvirinae provocă ușoare până la moderate și severe semne clinice gazdelor naturale sau secundare. Prin urmare, impactul economic și ecologic al virusilor este de asemenea variabil. Caracteristicile moleculare ale unor membri au fost investigate în detaliu. Acest lucru a dus la identificarea de gene de virulență asociate și construcția de virusuri recombinante. Unele dintre acestea din urmă au fost dezvoltate ca vaccinuri comerciale. Deoarece există 128 de specii de rumegătoare din familia Bovidae, este posibil ca unele virusuri herpetice să rămână nedescoperite.

Patogeneza acestei infecții este descrisă cu accent pe specificitatea de gazdă precum și pe trecerea barierei de specie. Într-adevăr, rumegătoarele care nu sunt sensibile la aceste alphaherpesvirusuri pot fi potențiale rezervoare pentru BoHV1.

Mai multe alphahepesvirusuri ale rumegătoarelor formează un grup de virusuri care au proprietăți antigenice comune și anume: Bovine herpesvirus 1 (BoHV1), Bovin herpesvirus 5 (BoHV5), Caprin herpesvirus 1 (CpHV1), Bubaline herpesvirus 1 (BuHV1), Cervide herpesvirus 1 și 2 (CeHV1, CeHV2), Elan herpesvirus 1. Aceste herpesvirusuri au proprietăți antigenice comune iar relațiile serologice dintre ele pot fi considerate un impediment în implementarea programelor de supraveghere și/sau eradicare a acestor boli.

În plus, datele epidemiologice disponibile sunt utilizate pentru a evalua potențialul de contaminare încrucișată în populațiile de rumegătoare. O mai bună cunoaștere a acestor infecții cu virusurile din familia Alphaherpesvirus la rumegătoare este esențială pentru a controla cu succes

Datorită similitudinii patogenezei și tropismului său pentru tractusul genital rezultatele cercetărilor cu privire la herpesviroza caprină sunt folosite în medicina umană unde se consideră că herpesvirusul genital (HSV2) în combinație cu Papilloma virus (CPV1) sunt precursori ai cancerului de col uterin. Mai mult, infecția determinată de Caprine herpesvirus 1 reprezintă un model valoros pentru virusul herpetic uman care induce boala genitală, exploatat pentru studii patogene, vaccinuri noi și testare de molecule antivirale.

CAPITOLUL 1 – CARACTERIZAREA CADRULUI ÎN CARE SE VOR DESFĂȘURA CERCETĂRILE

Cadrul natural

La noi în țară, până în prezent, literatura de specialitate nu a menționat date științifice cu privire la infecțiile cu Caprine Herpesvirus 1 (CpHV-1). Aceasta precum și faptul că tot mai mulți fermieri preferă creșterea caprelor a determinat derularea acestei cercetări și studiul patologiei bolii. Aceste cercetări și studii vor fi realizate în regiunea de est a Moldovei, respectiv în județele Suceava, Botoșani, Iași, Piatra Neamț, Bacău și Vaslui. Figura 1.1 ilustrează cadrul natural în care se vor desfășura cercetările.

Figura 1.1 – Harta fizică a României. (http://historymaps.ro)

Cadrul organizatoric și instituțional

Cercetările care urmează a fi efectuate pentru elaborarea tezei de doctorat vor fi realizate în cadrul următoarelor centre de cercetare:

Facultatea de Medicină Veterinară din cadrul Universității de Științe Agricole și Medicină Veterinară ,,Ion Ionescu de la Brad”, Iași.

Facultatea de Medicină Veterinară din Iași a fost înființată în 1961. Activitatea în cadrul facultății este structurată pe departamente de preclinici, clinici si de sănătate publică care împreună colaborează în vederea formării de specialiști. Facultatea oferă studenților diferite cursuri pentru licență, universitare și post-universitare. În afară de predare, facultatea este, de asemenea, axată pe cercetare științifică la nivel de doctorat.

Cercetările privind infecția cu CpHV-1 se vor desfășura în:

1.1 Laboratorul de cercetare Microbiologie – Boli infecțioase și Medicină Preventivă din cadrul Departamentului de Sănătate Publică al Facultății de Medicină Veterinară Iași; acesta are următoarea structură și dotare:

sala de Biologie Moleculară: hotă PCR; frigider și congelator (-20°C,-80°C); sistem de electroforeză orizontală; aparat vizualizare geluri Gell doc; Thermal Cycler Bio-Rad; aparat pentru apă ultrapură.

sala de Serologie: hotă tip II; frigider și congelator; microscop ranversat cu imunofluorescență; microscop optic; incubator de răcire; Bain-marie; centrifugă pentru tuburi de 15ml, 50ml x 4000rpm; centrifugă pentru tuburi de 15ml, 50ml x 13000rpm; agitator magnetic; vortex; balanță de laborator; bidistilator.

sala de Bacteriologie: incubator Binder; hotă chimică; autoclav orizontal cu capacitate de 90 litri; frigider; 2 hote flux laminar tip II; aparat de preparat medii de cultură; etuvă.

culturi celulare: hotă flux laminar tip II; incubator CO2 Sanyo; autoclav vertical cu capacitate de 110 litri; incubator Incucell.

Pentru confirmarea diagnosticului herpesvirozei caprine, în cadrul laboratorului de Microbiologie – Boli infecțioase se va folosi testul PCR (polymerase chain reaction).

1.2 Laboratorul de Anatomie Patologică și Laboratorul de Biologie Moleculară, unde vor fi efectuate examenele histopatologice din probele prelevate.

1.3 Laboratorul Clinicii de Medicală, în cadrul căreia se vor efectua examenele hematologice și biochimice sangvine.

2. Laboratorul de Virusologie al Facultății de Medicină Veterinară, Cluj, unde se va desfășura un stagiu de perfecționare pe durata a 2 săptămâni.

3. Laboratorul de Virusologie al Facultății de Medicină Veterinară din cadrul Universității Aldo Moro din Bari, Italia.

Universitatea din Bari a fost înființată în 1925. Este o universitate de stat, care cuprinde 12 facultăți. Fiecare facultate are propriile departamente care se concentrează pe științele artei, matematică, științe sociale, literatură, medicină, drept și educație.

Universitatea oferă studenților diferite cursuri pentru licență, universitare și post-universitare. În afară de predare, universitatea este, de asemenea, axată pe cercetare științifică la nivel de doctorat. Centrele de cercetare din cadrul Universității din Bari sunt extrem de interactive, având conexiuni între diferite departamente, universități și alte centre de cercetare.

Universitatea din Bari este una dintre cele mai prestigioase universități din sudul Italiei și este una dintre cele mai mari universități din Italia, cu aproximativ 60.000 de studenți. O schimbare de nume recentă se referă la omul de stat Aldo Moro (1916-1978 ), personalitate ce a studiat dreptul în cadrul Universității până în 1939, apoi a servit ca profesor obișnuit de filosofie de Drept și Politică Colonială (1941) și de drept penal (1942).

3.1 Laboratorul de Virusologie al Facultății de Medicină Veterinară din cadrul Universității ,,Aldo Moro" Bari, Italia, unde se va desfășura un stagiu de perfecționare pe durata a 5 luni.

4. Circumscripții Sanitar Veterinare de pe teritoriul României unde se vor desfășura investigații epidemiologice și se vor recolta probe biologice reprezentate de sânge, secreții nazale, oculare, genitale, ganglioni sacrali, fetuși avortați.

5. Cabinete veterinare particulare de unde se vor preleva probe biologice și vor fi efectuate investigații clinice și epidemiologice.

CAPITOLUL 2 – DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND INFECȚIILE CU CAPRINE HERPESVIRUS 1 (CpHV1)

În primul raport al International Committee Taxonomy of Viruses (ICTV) genul Herpesvirus cuprindea 23 de viruși și 4 grupe de virusuri. În al doilea raport al ICTV din 1976 acest gen a fost ridicat la nivel de familie – Herpetoviridae. Din cauza posibilei confuzii cu virusuri provenite de la reptile acest nume a fost schimbat în al treilea raport din 1979 în Herpesviridae. În acest raport familia Herpesviridae a fost împărțită în trei subfamilii și 5 genuri anonime: 21 de viruși neîncadrați. În 2009, familia Herpesviridae a fost ridicată la ordinul Herpesvirales. Această încadrare a fost impusă de descoperirea că herpesvirusurile la pești și moluște au fost doar înrudite cu virusurile herpetice ale păsărilor și mamiferelor. Au fost create două familii noi – familia Alloherpesviridae care include peștii și broaștele și familia Malacoherpesviridae care conține herpesvirusurile moluștelor.

Acest ordin este alcătuit in prezent din 3 familii, 3 subfamilii plus 1 neatribuită, 17 genuri, 90 specii și 48 de viruși încă neîncadrați . [21]

Familia Herpesviridae cuprinde trei subfamilii, numite Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae și Gammaherpesvirine. Subfamilia Alphaherpesvirinae cuprinde patru genuri: Simplexvirus, Varicellovirus, Mardiviruses și Iltoviruses. Această subfamilie include virusuri caracterizate printr-o gamă largă de gazde, un ciclu de replicare scurt și o capacitate de a induce infecții latente, în principal, dar nu exclusiv, în neuroni [14] având ca prototip Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1). BoHV-1 este agentul patogen asociat cu două sindroame majore, numite rinotraheita infecțioasă bovină (IBR) și vulvovaginita pustuloasă infecțioasă (VPI), și o varietate de semne clinice, cum ar fi conjunctivita, encefalita și avortul [91].

Membrii familiei Herpesviridae sunt virusuri ADN care prezintă un ciclu evolutiv spectaculos. Numele, derivat din greacă (herpein), "să se strecoare", se referă la leziunile caracteristice provocate de două herpesvirusuri umane comune: pustule mici pline cu lichid cauzate de virusul Herpes simplex (HSV), precum și varicelă și zona zoster induse de virusul Varicelo-zosterian (VZV). Există aproape două sute de virusuri izolate de la gazde diferite precum moluște, pești, amfibieni, reptile, păsări și mamifere [14]. În natură, cele mai multe virusuri herpetice sunt în strânsă legătură cu o singură specie gazdă la aproape toate gazdele de animale investigate până în prezent. Susceptibilitatea de gazdă a herpesvirusului indică faptul că virusurile au ales să co-evolueze cu gazdele lor, ceea ce a dus la o adaptare de specie.

Infecțiile provocate de herpesvirusuri sunt consemnate încă de acum 2000 de ani, când Herodot descria pentru prima dată o boală manifestată prin febră și bășicuțe în jurul gurii, pe care a numit-o ,,herpes febrilis”. Mai târziu a fost descrisă o boală asemănătoare, dar cu localizare genitală numită ,,herpes genitalis”.

Herpesviroza caprină a fost identificată ca entitate în California (Saito și col., 1974) și în Elveția (Metter și col., 1979). Tulpina americană a fost caracterizată în detaliu (Berrios și McKercher, 1975) și s-a dovedit a fi serologic înrudită cu virusul rinotraheitei infecțioase bovine – vulvovaginitei pustuloase infecțioasă (IBR / IPV) (Bovid herpesvirus 1, BHV-1). Din moment ce virusul nu a fost patogen pentru miei și viței, a fost denumit Caprine herpesvirus 1 (Berrios et al, 1975.). Observațiile clinice și patologice au confirmat că simptomele cauzate de izolatul elvețian sunt similare cu cele raportate pentru tulpina californiană, deși însușirile abortigene nu au putut fi dovedite (Waldvogel și colab., 1981). Într-un studiu sero-epidemiologic, 20 până la 30% din caprele din zonele de est și sud din Elveția au prezentat anticorpi specifici, în timp ce caprinele examinate în alte regiuni păreau a fi libere de infecție (Plebani et al., 1983).

Prezența infecției cu CpHV1 a fost semnalată în turmele de pe teritoriul Greciei în 1988 de Koptopoulos G. și col., în regiunea mediteraneană a Franței în 2008, cu o prevalență de 62% de către Thiry J. și col. și tot în 2008 Piper Kl. și col. raportează în Australian Veterinary Journal izolarea CpHV1 dintr-un focar de vulvovaginită la 200 de capre importate din Noua Zeelandă concluzionând că apariția bolii a fost determinată de reactivarea virusului aflat în stare de latență. În aprilie 2011 a fost confirmată prezența herpesvirusului caprin și în Mexic de către Irma Candanosa și col., iar în 2013 în Peninsula Iberică .

2.1 Etiologie

Caprine Herpesvirus 1 (CpHV-1), cunoscut înainte ca Bovine herpesvirus 6 (BHV-6) este un virus încadrat în genul Varicellovirus

subfamilia Alphaherpesvirinae

familia Herpesviridae

ordinul Herpesvirales.

Acest virus nu trebuie confundat cu Caprine herpesvirus 2 (CpHV2), recent încadrat în subfamilia Gammaherpesvirinae, care este înrudit cu Ovine herpesvirus 2 (OvHV2) și care este endemic pentru caprele domestice, determinând pentru unele specii de cerbi din SUA și Norvegia febra catarală malignă -MCF (Keel M.K. 2003).

Morfologic, herpesvirusurile sunt diferite, sunt virusuri complexe, cu anvelopă și alte învelișuri policapsidare suplimentare. Genomul liniar, alcătuit din AND dublu catenar de 125-250 kbp este conținut într-o capsidă icosaedrală de 100-110 nm formată din 162 capsomere. Capsida înconjurată de un înveliș amorf, o matrice de proteine, cu grosime variabilă, numită tegument, este la rândul ei acoperită de un înveliș care conține lipide trilaminare și proteine, aducând dimensiunea totală a virionului din 120 nm până la aproape 300 nm.

Fig.1 – BHV-1 vizualizat prin microscopie Fig.2. – Herpesvirus – reprezentare schematică electronică (www.vet.cornell.edu) a componentelor (microbewiki.kenyon.edu)

Fig. 3 – Herpesvirus – zona verde translucid reprezintă glicoproteinele ancorate în învelișul viral (verde) alcătuit din proteine. În mijlocul capsidei icosaedrale (mov) este genomul format din AND dublu catenar (roșu). (www.rkm.com.au)

Prezența lipidelor în anvelopă are implicatii practice, determinând distrugerea herpesvirusurilor cu ajutorul detergenților și solvenților pentru lipide. Glicoproteinele ce străbat învelișul sunt mai numeroase și mai scurte decât cele din alte familii de viruși. Variația dimensiunii genomul este într-o oarecare măsură atribuită prezenței repetate interne și terminale a glicoprpteinelor. Comun pentru toate herpesvirusuriles este că acestea sunt complexe și conțin gene pentru numeroase enzime necesare pentru replicarea lor, că sinteza ADN-ului viral și formarea capsidei are loc în nucleul celulei infectate, și că celulele infectate sunt distruse datorită replicării virusului și eliberării de noi viruși, împreună cu capacitatea de a stabili infecții latente. În timpul de latență nu sunt produși viruși iar genomul rămâne într-o formă circulară. Organizarea genomică a virusului CpHV1 este similară cu cea a BoHV1, existând mai multe tulpini diferite.

Pentru cultivarea herpesvirusului caprin se folosesc culturi celulare bovine (MDBK Cell line bovin), cu efect citopatic (rotunjirea celulelor, sincițilizarea, vacuolizarea, liza celulară). Ritmul de creștere este foarte rapid, la 12 ore post infecție va fi atins titrul maxim.

Fig.4 Efect citopatic (liza celulară) la 48 de ore de incubare în cultura celulara MDBK inoculată cu suspensie virală. (Săgețile indică liza celulară) (http://www.scielo.org).

Microscopia electronică și izolarea virusului au ajutat foarte mult pentru a descrie structura virusului.

2.2 Caractere epidemiologice

Caprine herpesvirus 1 a fost inițial izolat în 1975 în California din țesuturi ale unor iezi nou-născuți afectați de o formă enterică gravă, [41]. În 1979 virusul a fost izolat de la iezi într-o turmă din valea Bregaglia din Elveția [33]. Distribuția CpHV-1 ca infecție nu are fost studiată sistematic la capre, dar virusul a fost identificat în mai multe țări în Europa, inclusiv Grecia, Italia, Spania și Elveția, precum și în Australia, Canada, Noua Zeelandă și Statele Unite ale Americii [19, 47, 52, 63, 67, 75, 84, 96, 105, 41]. Aparent răspândirea este variabilă, în multe țări în care caprele joacă un rol economic s-a observant o prevalență ridicată: între 30 și 40% în sudul Italiei și peste 50% în Grecia (46) iar în estul și sudestul Elveției 20-30%. Infecția CpHV-1 nu a fost identificată în Belgia, Franța (Keuser și Thiry, rezultate nepublicate) sau Marea Britanie.

Boala afectează caprele de toate vârstele, iezii în vârstă de 1-2 săptămâni, mai sensibili, fac infecții septicemice, generalizate, cu un procent ridicat de morbiditate și mortalitate.

La animalele adulte boala se transmite lent și se manifestă predominant prin infecții genitale. Vițeii și mieii sunt sensibili la infecția experimentală.

Sursele de infecție sunt reprezentate de animalele bolnave cât și de cele cu infecție latentă, care elimină virusul prin secrețiile oculare, nazale, genitale și prin fecale (Perianu T. și col., 2005).

La iezi virusul se răspandește foarte repede, ceea produce o boală sistemică cu înaltă morbiditate. Transmiterea verticală de la mamă la făt de asemenea fiind posibilă. Infecția cu CpHV1 este asociată cu episoade de avort la caprele domestice, mai ales în a doua jumătate a sarcinii. (Tempesta M., și col – 2004)

Calea genitală considerată principala poartă de intrare a virusului este responsabilă pentru întreținerea infecției într-o turmă [50].

2.3 Patogeneză

Patoegeneza CpHV1 este foarte asemănătoroare cu cea a altor alphaherpesvirusuri ale rumegătoarelor. Virusul poate pătrunde fie pe cale respiratorie, fie genitală, având ca urmare viremia, fiind detectat într-o varietate de organe.

Fig. 5 Model de transport axonal pentru BHV-1.

După infecția primară (1) virusul invadează un terminal neuronal sensorial (2), prin care urcă retrograd de-a lungul dendronului (3) fiind transportat la corpii celulari neuronali din ganglionul trigemen, care stabilește latență și numai expresia RL ORF_E (5) în timpul episoadelor de stres sau imunosupresie a reactivat virusul, care anterograd (6) ajunge la locul inițial de infecție cu producție mare de particule virale. (http://www.scielo.org.co)

Inițial, virusul se replică în celulele epiteliale de la poarta de intrare. Simptomele fazei acute sunt adesea asociate cu distrugerea acestor celule epiteliale. Cu toate acestea, ca și în cazul herpesvirusului bovin 1 (BHV-1), virusul se poate răspândi în corpul gazdei infectate prin viremie, avand accesul la țesuturi și organe, cauzând o varietate mai mare de simptome. Mai mult decât atât, multe virusuri herpetice sunt capabile de a pătrunde în celulele neuronale. Acolo, ele se pot reproduce, ceea ce poate conduce la boli neuronale, de exemplu, encefalita. În plus, virusurile herpetice pot stabili latență în celulele neuronale sau limfoide. În timpul de latență, aparent nu sunt sintetizate antigene virale dar genomul virusurilor latente sunt prezente în nucleii celulelor lungi, cum ar fi, de exemplu, neuronii ganglionilor corespunzătoari din siturile de replicare periferice. La reactivare, virusul restabilește ciclul litic de replicare. Ecranat de efectori ai sistemului imunitar, migrează înapoi în țesuturile periferice, unde sunt excretați (fig.5). Deși un răspuns imun puternic este provocat în timpul replicării virale primare, aceste mecanisme ajută herpesvirusul pentru a scăpa de supravegherea sistemului imunitar în timpul de latență și într-o măsură mai mică în timpul de reactivare.

Latența are loc la nivelul ganglionilor sacrali sau ai celor din tubul digestiv, și la reactivare (stres fiziologic), o re-excreție a virusului va fi posibilă prin secrețiile oculare, nazale, genitale. Reactivarea experimentală a CpHV1 a fost realizată cu succes doar în cazul administrării unor doze mari de dexametazonă.

Fig.6 Ciclul de replicare virală în celulele epiteliale (http://molbio.princeton.edu)

Calea infecției primare influențează locul de excreție virală, la reactivarea unui virus anterior pătruns pe cale intranazală reexcreția va fi prin secrețiile nazale și vaginale (49), iar reactivarea unui virus pătruns pe cale genitală va determina doar reexcreția prin secreții vaginale (45).

2.4 Tablou clinic

CpHv1 poate conduce la următoarele tipuri principale de manifestări clinice:

1) – o formă sistemică, de cele mai multe ori prezentă la iezii de 1-2 săptămâni, care prezintă enterită (fig.7), slăbiciune progresivă și dureri abdominale. Poate apare conjunctivită, secreții nazale prulente, eroziuni în cavitățile nazale și orale și edem al miocardului. Animalele mor, de obicei, în decurs de 2-4 zile de la debutul infecției (Mettler F., și col. – 1979).

Fig.7 Observații clinice și patologice la iezi bolnavi. A. Depresie, apatie, dureri abdominale; B. Ied cu diaree, blana din regiunea anusului acoperită cu fecale; C și D. Hemoragie și necroză în intestinul subțire și gros (săgețile negre). (http://www.virologyj.com/content)

2) – o formă genitală, mai ales la femelele adulte, în majoritatea cazurilor infecția evoluează subclinic. Sunt prezente leziuni la nivelul mucoasei genitale, uneori cu hiperemie, edem și apariția de papule, vezicule și ulcerații (Grewal A.S. și col., -1986), specifice de vulvovaginită (fig.8).

Fig.8 Leziuni pustuloase multifocale și ulcerative specifice vulvoaginitei produse de CpHV-1. Forma ușoară (1), moderată (2), severă (3). (http://www.scielo.org.)

La masculi evoluează în general fară semne clinice vizibile, sunt prezente papule, vezicule și ulcerații la nivelul prepuțului, leziuni caracteristice ale balanopostitei (fig.9).

Fig.9 Leziuni de balanopostită. Forma ușoară (1), moderată (2), severă (3). (http://www.scielo.org)

3) – o formă latentă, manifestată prin avort (fig.10), mai ales în a doua jumătate a gestației, fără semne clinice vizibile sau leziuni macroscopice la fătul avortat (Tempesta M. și col – 2004).

Fig.10 Avort în a doua parte a gestației (https://edenhills.wordpress.com)

4) – o formă respiratorie, în mod normal combinată cu infectii bacteriene secundare, caz în care animalele dezvoltă o pneumonie acută (Buddle B.M. și col., 1990).

2.5 Tablou anatomopatologic

Leziunile anatomopatologice sunt caracteristice fiecărei manifestări clinice. La iezii de 1-2 săptămâni sunt prezente leziuni ulcerative și necrotice (fig.7-C,D) distribuite în lungul tractului digestiv [33]. Histologic a fost detectată o enterită necrozantă severă, precum și îngroșarea septurilor alveolare cu leziuni necrotice în bronhii și alveole. Leziuni microscopice au fost de asemenea prezente în ficat, vezica urinară, splină, timus, noduli limfatici mezenterici și rinichi. La caprele adulte, infecția duce la vulvovaginită (prezența de papule, vezicule și ulcerații pe mucoasa genitală) sau balanopostită (fig.11) la masculi. Fetușii avortați nu prezintă leziuni macroscopice vizibile.

Fig.11 Formă moderată spre gravă de balanopostită, pustule multifocale și ulcerative la mascul din rasa Alpină franceză infectat cu herpesvirus. (http://www.scielo.org)

Histologic se poate observa hiperplazia țesutului subepitelial, edem intracelular, infiltrații limfoplasmocitare și prezența de incluzii intranucleare amfofile cu halou în celulele stratului spinos (fig,12).

infiltrații limfoplasmocitare subepiteliale și prezența incluziilor intranucleare.

Fig.12 Incluzii intranucleale în stratul epitelial vaginal pentru infecția cu herpesvirus. H.E. 40X (http://www.scielo.org)

2.6 Diagnostic

Confirmarea CpHV1 se realizează prin izolare virală sau detectarea ADN-lui viral prin PCR specific. Prezența virusului în leziuni poate fi demonstrată, de asemenea, cu ajutorul imunohistiochimiei sau microscopiei electronice.

CpHV1 este genetic și antigenic strâns legat de BoHV1 prin urmare testarea serologică ELISA de screening pentru BoHV1 va recunoaște anticorpi impotriva CpHV1 dar nu va distinge care dintre cele două virusuri au provocat infecția. Testele de seroneutralizare vot fi, în acest caz, un important instrument suplimentar de confirmare a diagnosticului.

Diagnosticul diferențial se impune față de următoarele boli: febra aftoasă – erupția veziculoasă este frecvent localizată la nivelul glandei mamare și mucoasei bucale la animalele adulte. În forma benignă, necropsic se constată eroziuni eruptive cu localizare bucală, mamară și podală, la mucoasa esofagiană, compartimentele gastrice și la căile respiratorii. La iezi sunt prezente leziuni septicemice, hemoragii pe mucoase și submucoase, leziuni de miocardită – cord tigrat.; ectima contagioasă – leziunile sunt prezente în jurul comisurilor bucale, glandei mamare și la nivelul pielii. Leziunile cutanate sunt crustoase, de culoare brună sub formă de placarde; complexul artrită-encefalită – la iezi se manifestă prin forme nervoase, la animalele adulte prin artrite (,, genunchi gras"), pneumonie interstițială și mamite; sindromul Maedi-Vișna – apare doar la animalele adulte (3-5 ani) și la iezii în vârstă de 2,5-5 luni cu semne respiratorii, o pneumonie progresivă; variola caprină – de obicei leziunile sunt localizate la tegumentul mamar sau numai la mameloane, fața internă a coapsei, perineu sau regiunea feței.

La iezi evoluează o formă generalizată cu enterită, exantem bucal, conjunctivită sau cu localizare la nivelul căilor respiratorii anterioare.

Diarea este cea mai frecventă cauză de boală și de moarte la iezii în vârstă de la 1 la 30 de zile de viață. Diareea este de obicei asociată cu creșterea caprelor în sistem intensiv în condiții de supraaglomerare si sanitație deficitară. Diareea provoacă o pierdere de apă și de electroliți și poate duce la deces dacă nu sunt tratate rapid.

Cauze majore de diaree pot fi de natură bacteriană – (E. coli, Clostridium perfringens tip C, Campylobacter jejuni, Salmonella); parazitară (coccide, cyrptosporidia, Giardia, Strongyloides); virală (coronavirus, rotavirus); și netransmisibile (înlocuitoare de lapte, antibiotice). In timp ce cauza este de multe ori presupusă a fi o anumită bacterie (E. coli), examenele paraclinice nu au reușit în mod constant identificarea cauzelor specifice în majoritatea cazurilor.

Fig.13 Ied rasa Saeen, în vârstă de 3 săptămâni cu o formă gravă de enterită. (http://www2.luresext.edu/goats/training/herdhealthII.html)

2.7 Profilaxie și combatere

Având în vedere potențialul de CpHV1 de a provoca boli fatale la iezi și, de asemenea, la animalele adulte, măsurile generale de igienă și de control preventiv, în cazul apariției unui focar sunt esențiale pentru a evita răspândirea rapidă a virusului. Sacrificarea animalelor seropozitive și a celor care sunt purtători este necesară pentru a preveni răspândirea bolii. Studiile vaccinale sunt în curs de desfășurare ca o măsură de controlul a bolii din focare. Asfel un studiu experimental recent a arătat că din punct de vedere comercial este disponibil un vaccine viu atenuat gE negativ BoHV-1 administrat intranasal la capre care confer numai parțial protecție.[132] ]. Imunitatea în această boală nu este sterilizantă, animalul vindecat rämâne purtător de virus și potențial eliminator, infecția și imunitatea persistând simultan.În prezent, unul dintre cele mai eficiente tratamente pentru combaterea herpesvirusului la caprine este administrarea vaginală a aciclovirului.

Fig. 14 Mecanismul de acțiune al aciclovirului în celulele infectate cu virus herpetic. (http://www.uspharmacist.com)

Tratamentul este costisitor și necesită o manipulare excesivă. Unele tratamente preventive sunt încă experimentale, cum ar fi folosirea vaccinului viu atenuat BHV-1 folosit pentru limitarea infecției naturale cu herpesvirus la capre și care asigură o bună protecție împotriva infecției respiratorii și, de asemenea și a infecției genitale.(27)

Nu există un program de prevenție și/sau supraveghere cu privire la problemele de sănătate asociate cu acest virus. CpHV1 a fost folosit în infecția experimentală și pentru a stabili latența la viței, dar reactivarea nu a avut success, semnele clinice fiind absente (Engels M – 1992).

Impactul acestui virus la alte specii ale subfamiliei Caprinae rămâne necunoscut.

CAPITOLUL 3 – CERCETĂRI DIN ȚARĂ ȘI STRĂINĂTATE PRIVIND INFECȚIILE CU CpHV-1

3.1 Istoricul cercetărilor

Cercetări din țară

Literatura de specialitate din România nu dispune de cercetări și studii științifice cu privire la herpesviroza caprină.

Din acest considerent, se va recurge la realizarea unor cercetări și studii aprofundate în ceea ce privește infecția cu herpesvirus la caprele din județele Suceava, Botoșani, Iași, Neamț, Bacău și Vaslui.

Rezultatele obținute în urma cercetărilor efectuate vor contribui la actualizarea informațiilor despre herpesviroza caprină, permițând extinderea cercetărilor pe viitor.

Cercetări din străinătate

Studii preliminare anterioare au arătat că virusul herpetic caprin există în multe țări unde caprele joacă un important rol economic. În Europa au raportat acest virus, sau anticorpi împotriva sa, la capre domestice: Italia, Spania, Norvegia, Grecia, Germania și Franța (Corsica) precum și Australia, Noua Zeelenadă, Canada și S.U.A. Câteva studii au fost efectuate în populații sălbatice din Alpii francezi pentru (Capra ibex), capra neagră (Rupicapra rupicapra ), Cerb (Cervus elaphus) și țapul roșu (CapreolusCapreolus) în care au fost depistați seropozitiv pentru CpHV1 (37).

Agentul etiologic a fost izolat prima dată de la antilopa gnu albastră în anul 1960 de către cercetătorul englez Walter Plowright.

În 1974 boala a fost identificată ca entitate în California de Saito și col., și în Elveția de Metter și col. în 1979. Tulpina americană a fost caracterizată în detaliu de Berrios și McKercher în 1975 și s-a dovedit a fi serologic înrudită cu virusul rinitraheitei infecțiose bovine – vulvovaginită pustuloasă (IBR / IPV) (Bovid herpesvirus 1, BHV-1). Waldvogel și colab. în 1981 constată prin observațiile clinice și patologice, precum și prin simptomele cauzate de izolatul elvețian, că rezultatele obținute sunt similare cu cele raportate pentru tulpina californiană, deși însușirile abortigene nu au putut fi dovedite. Într-un studiu sero-epidemiologic, 20 până la 30% din caprele din zonele de est și de sud ale Elveției au prezentat anticorpi specifici, în timp ce caprinele din alte regiuni păreau a fi libere de infecție (Plebani et al., 1983).

Cercetătorii australieni Grewal, A.S. și Wells, R. în anul 1986 publică în Junalul Veterinar Australian observațiile lor cu privire la vulvovaginita la capre determinate de un herpesvirus. Două focare simultane de boli genitale la capre au fost asociate cu infecția cu un virus herpetic, care a fost izolat din leziuni vulvare si vaginale afectate sau nu. Serul anticorpilor neutralizanți ai virusului a fost prezent atât în capre cu boala clinică cât și la câteva capre neafectate. Din cele 19 turme de caprine examinate numai 4 au prezentat anticorpi neutralizanți. Virusul izolat a fost caracterizat ca un virus herpetic datorită caracteristicior sale morfologice și fizico-chimice. Acesta conținea ADN și a fost inactivat la pH scăzut și prin tratarea cu solvenți lipidici și tripsină. Particulele de virus aveau formă icosaedrală, nucleocapsida fiind înconjurată de o membrană și măsurând apoximativ 150 nm în diametru.

În 1988 Koptopoulos G., Papanastasopoulou M, Papadopoulos O. și Ludwg H. au realizat investigații cu privire la prezența infecției cu CpHV 1 în cadrul turmelor de capre de pe teritoriul Greciei. Testele serologice efectuate arată că infecția virală este larg răspândită, deoarece mai mult de 50% din efective au prezentat anticorpi, care au fost evidențiați la un număr mai mare de masculi comparativ cu femelele. Iezii care posedau anticorpi maternali, au devenit seronegativi la vârsta de 4 luni și noii anticorpii au apărut la vârsta de 7-8 luni. Observațiile realizate în două turme de capre izolate una față de cealată au arătat că virusul nu se răspândește în perioada de împerechere și în perioada de lactație. Creșterea titrului de anticorpi la animalele seronegative sau cu infecții noi a avut loc după trecerea verii, după perioada de împerechere. Virusul este prezent într-o stare latentă, infecțiile recurente fiind posibile. Virusul nu a putut fi izolat, chiar și după inducerea imunosupresiei experimentale (Koptopoulos G. și col. 1988).

O anchetă preliminară asupra latenței herpesvirusului caprin BHV-6 a fost realizată de Papanastasopoulou M., Koptopoulos G., Lekkas S., .Georgakopoulou E. și Papadopoulos O. în 1990 în Grecia. Experimentul a fost efectuat în două etape. În prima etapă, virusul a fost inoculat la șase iezi și controlul, a arătat o infecție ușoară și eliminarea virusului la 4-12 zile post infecție. Etapa a doua a început la o lună după încetarea tuturor simptomelor și izolare a virusului din prima etapă. Imunosupresia și, prin urmare, o reactivare a virusului nu a putut fi realizată după opt injecții administrate zilnic de dexametazonă (0.15 – 0.50 mg / kg greutate corporală), așa cum a rezultat din efectuarea testelor hematologice, virusologice, patologice și serologice. (Papanastasopoulou M. și col. 1990)

Patogenitatea Caprine herpesvirus de tip 1 (CpHV-1) la iezi și miei a fost studiată în 1991 de către Papanastasopoulou M, Koptopoulos G, Lekkas S, Papadopoulos O, Ludwig H. Au fost efectuate două experimente. În primul experiment s-au folosit doi iezi Saanen și patru miei de o rasă locală care au fost infectate intravenos cu tulpina elvețian E / CH a virusului. Reacție clinică a fost severă la iezi, dar a fost foarte ușoară la miei. Virusul a fost eliminat de la iezi în titruri mai mari și mai mult timp decât la miei. Virusul a fost, de asemenea, izolat nu doar din probele de țesut, ci și de la un ied care a murit la 4 zile după inoculare. Leziunile vizibile și histopatologice au fost mai severe la iezi. In al doilea experiment s-au folosit numai miei. Ei au fost tratați dexametazona si apoi inoculați cu același virus. O infecție foarte ușoară a fost dezvoltată. Mieii nu au eliminat virusul, virusul nu a fost izolat din țesuturile colectate la necropsie. Cu toate acestea, au fost observate leziuni histopatologice. În ambele experimente, la toate animalele s-a constatat seroconversie la 10 zile post infecție. (Papanastasopoulou M. și col. 1991)

,,Interacțiunile virusului bovin sau caprin cu gazda heterologă și omologă”, este articolul publicat în 1992 de Monika Engels, Monica Palatinia, Alfred E. Metzlera, Urs Probstb, Ueli Kihmc, Mathias Ackermann care prezintă rezulatele interacțiunii virus-gazdă, precum și patogenitatea și latența, atunci când se compară rezultatul infecției în gazdele heterologe și gazdele omologe pentru Bovine herpesvirus 1 (BHV-1) și Caprine herpesvirus 1 (CpHV 1). Analizele moleculare și seroepidemiologice au arătat că cele mai importante interferențe de anticorpi au fost induse de glicoproteina IG (analog gB), de proteinele majore de capsidă și de proteinele nonstructurale, întrucât răspunsul cel mai specific a fost dezvoltat de glicoproteine gIII și gIV. Aceste glicoproteine, mai ales gIII (gC analog), s-ar putea, prin urmare, să joace un rol important în interacțiunea virus-gazdă. Ca bază pentru continuarea studiilor, s-au reevaluat observațiile privind infecțiile experimentale cu BHV-1 și CpHV1 la gaze heterologe și gazde omologe. Toți parametrii au indicat că ambele tipuri de virus au fost capabile de a infecta gazda, dar că patogenitatea a fost limitată la gazda naturală.

Virusul în stare latentă nu a putut fi reactivat doar pentru vacile infectate cu BHV-1, fiind posibilă reactivarea BHV-1 la capre, pentru ambele specii nu a fost posibilă reactivarea CpHV1. Experimentele arată că rezultatul infecției la gazda naturală și gazda străină este depedent de gazdă și factorii virali, prin care gIII este doar o componentă importantă a virusului implicat.

În septembrie 1996 Buonavoglia C., Tempesta M. și col. au prezenat un raport de cercetare cu privire la reactivarea Caprine herpesvirus 1 la capre cu infecție latentă dintr-o fermă din Italia. Autorii raportului au luat în studiu două femele adulte tratate cu dexametazona (DMS) (4:40 mg / kg) timp de 6 zile. Virusul a fost izolat din probele prelevate din secrețiile vaginale în a 3-a și a 12-a zi post-tratament cu DMS si din secrețiile nazale pentru zilele 6 și 7 post-tratament. Totodată s-a înregistrat un titru crescut al anticorpilor neutralizanți (SN) pentru CpHV1 la 13 săptămâni de la terminarea tratamentului cu DMS. (Buonavoglia C. și col. 1996)

În aprile 1999 un studiu cu privire la patogenitatea unei tulpinii de Caprine herpesvirus-1 a fost publicat de Tempesta M., Pratelli A., Corrente M. și Buonavoglia C.Tulpina BA-1 de Caprine herpesvirus-1 (CpHV-1), izolată de la capre cu infecție latentă, a fost inoculată intranazal la trei capre în vârstă de cinci ani. Animalele au prezentat febră și leucopenie. Semnele au apărut în ziua a 4-a după inoculare și au durat 7 zile. La o capră s-au constat leziuni herpetice – apărute pe zona vulvară la 7 zile de la inoculare. Virus a fost în mod constant izolat din prelevatele nazale și vaginale obținute de la cele trei capre. Virusul nu a fost prezent în probele oculare și rectale. Cu toate acestea, rezultatul a fost pozitiv pentru ADN-ul viral detectat prin reacția de polimerizare în lanț (PCR). Toate izolatele de la caprele infrctate experimental sunt identice cu modelele lor de restricție originale BA-1 și similare cu tulpina de referință E de CpHV-1. (-Tempesta M, și col. 1999a)

În același an, Tempesta M., Pratelli A., Greco G., Martella V., Buonavglia C. în cadrul

experimentului de detecție prin PCR a Caprine Herpesvirus 1 în ganglionii sacrali la capre cu infecție latentă, rezultatele obținute oferă o dovadă în plus că CpHV 1 are un tropism selectiv pentru tractul genital al caprei, deoarece site-urile de latență ale virusului au fost descoperite doar în ganglionul sacral corespunzător. Identificarea siturilor de latență oferă informații suplimentare despre patogeneza infecției CpHV 1 și duc la concluzia că tractul genitalar ar putea fi calea cea mai importantă de răspândire a bolii. Rezultatele acestui studiu, de asemenea, sunt interesante din punctul de vedere al patologiei comparate: tropismul genital al CpHV 1, leziunile (necroză și ulcere) vulvare și latența în ganglionul sacral sunt caracteristici tipice, de asemenea, observate în infecția cu herpesvirusul de tip 2 la oameni. Rezultatele sugerează că infecția cu CpHV 1 ar putea reprezenta un model animal util de infecție genitală cu herpesvirus. (Tempesta M, și col. 1999b)

În mai 2000, Roperto F1, Pratelli A, Guarino G, Ambrosio V, Tempesta M, Galati P, Iovane G, Buonavoglia C. studiază infecția naturală cu CpHV-1 la iezi. Au fost luați în studiu douăzeci și șapte de iezi cu vârsta cuprinsă între 5-7 zile dintr-un efectiv de 200 de capre în care s-a înregistrat o rată mare de avorturi. Toți au prezentat hipertermie, dureri abdominale și anorexie. Doi dintre iezi au fost examinați post-mortem – au constatat leziuni ulcerative și necrotice fiind afectat întreagul intestin. Modificări macroscopice au fost observate, de asemenea, în plămâni, vezica urinară și ficat. Histologic, a fost detectată o enterita necrozantă severă, precum și îngroșarea septurilor alveolare și leziuni necrotice în bronhii și alveole. Leziunile microscopice au fost de asemenea prezente în ficat, vezică urinară, splină, timus, noduli limfatici mezenterici și rinichi. Macrofagele conțin eozinofile intranucleare, prezența celulelor inflamatorii fiind semnalată în toate organele examinate. Virusul a fost izolat în culturi de celule de la toate organele examinate de la cei doi iezi. S-au observat efectul citopatopatic (rotunjirea celulelor, sincițilizarea, vacuolizarea, liza celulară) și incluziuni intranucleare acidofile tipice de infecție a virusului herpetic. Virusul a fost identificat drept Caprine herpesvirus 1 (CpHV-1), prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) și tehnici de seroneutralizare. (Roperto, F și col., 2000)

Aprilie 2000 – Tempesta M, Pratelli A, Normanno G, Camero M, Buonavoglia D, Greco G, Buonavoglia C publică noi informații legate de infecția experimentală intravaginală la capre cu Caprine herpesvirus 1. Au fost luate în studiu trei capre adulte, seronegative la Caprine herpesvirus 1 (CpHV-1) care au fost inoculate intravaginal cu tulpina BA.1 de CpHV-1. Animalele au fost ținute sub observație timp de 1 lună și zi cu zi s-au efectuat examene clinice și de laborator (urmărirea numărului de leucocite). Zilnic au fost prelevate probe din secrețiile oculare, nazale, tampoane rectale și vaginale și probe de sânge heparinizate apentru a încerca izolarea virusului pe culturi de celule și detectarea ADN-ului viral prin reacția în lanț a polimerazei (PCR). Virusul a fost izolat și detectat prin PCR numai din tampoane vaginale timp de 5-7 zile post-infecție. Animalele au prezentat febră tranzitorie și leucopenie și leziuni necrotice tipice la nivelul vulvei și vaginului. (Tempesta M și col. 2000)

În 2001, Six A, Banks M., Engels M., Ros Bascunana C., Ackermann M. au prezentat rezultatele experimentale obținute pentru latența și reactivarea Bovine herpesvirus 1 (BHV-1) la caprine și Caprine herpesvirus 1 (CpHV-1). Cele două virusuri, bovin și caprin sunt membri ai aceleași familii. Deoarece gazdele lor naturale sunt adesea ținute în contact strâns unele cu altele, a apărut preocuparea de a putea fi fi stabilită prezența virusului în gazda heterologă și gazda omologă. Pentru a investiga această posibilitate au fost efectuate experimente încrucișate cu BHV-1 la capre și cu CpHV-1 la viței. Caprinele infectate cu BHV-1 au dezvoltat boala cu ușoare semne ale infecției acute, pe când CpHV-1 a determinat la viței o infecție subclinică. Cu toate acestea, virusul era prezent în excreții și producerea de anticorpi a fost prezentă. Reactivarea BHV-1 a fost realizată în 5 din 8 capre demonstrează că în infecția recurentă crește excreția de virus și titrul de anticorpi. În constrast CpHV-1 la viței nu putut fi reactivat experimental. Cu toate acestea, PCR-ul a arătat că ambele virusuri au stabilit latență în ganglionul trigeminal heterolog al gazdei. Pe baza acestor rezultate putem concluziona că la capre BHV-1, într-adevăr să fie considerat ca un potențial rezervor, care trebuie să fie luat în considerație în timpul programelor de eradicare.

Numeroase avorturi au fost raportate în Quebec la o fermă de creștere a caprelor în 2004, iar prezența Caprine herpesvirus-1 (CpHV-1) a fost confirmat prin PCR în mai multe țesuturi prelevate de la 3 fetuși avortați. Acesta este primul raport al CpHV-1 în Canada. Autorii raportului Chénier S1, Montpetit C, Helie P. recomandă practicienilor să ia în considerare această boală atunci când vor face un diagnostic diferențial pentru avorturi.(29)

În 2007, Julien Thiry, Maria Tempesta, Michele Camero, Elvira Tarsitano, Benoît Muylkens, François Meurens, Etienne Thiry și Canio Buonavoglia luând în considerare proprietățile biologice partajate ale CpHV-1 și BHV-1 au decis în studiul actual să evalueze protecția glicoproteinei viu atenuate E (gE) din vaccinul BoHV-1 împotriva infecției genitale cu CpHV-1 la capre. Vaccinul a fost inoculat intranasal de două ori timp de trei săptămâni. Pentru a analiza siguranța și eficacitatea acestui vaccine marker s-au folosit două grupuri a câte trei capre: unul imunizat cu un inoculat virulent de CpHV-1 și unul neinoculat. Caprele au fost monitorizate clinic și s-au efectuat toate procedurile de prelevare de probe în orb. Vaccinul nu a indus reacții locale sau sistemice nedorite. După provocarea infecției a fost observată la caprele imunizate o reducere semnificativă în severitate a bolii.  În plus, caprele imunizate fie cu gE-negativ BoHV-1 sau CpHV-1 expuse infecției au prezentat o scădere semnificativă a cantității și a timpului excreției virale. Titrul de anticorpi  neutralizanți de BHV-1 CpHV-1 a fost mai ridicat la caprele imunizate. Aplicarea intranazal a unui vaccin viu atenuat gE-negativ BoHV-1 este capabil de a permite o protecție clinică și o reducere a excreției de virus la caprele cu o infecție genitală produsă de CpHV-1.

Tempesta M și col. în 2007 prezintă efectul antiviral și eficiența cidofovir (CDV) împotriva infecției cu CpHV1 la caprine. Caprine herpesvirus 1 (CpHV-1) este un virus capabil de a provoca infecție genitală conducând la vulvovaginită sau balanopostită la caprele adulte. CpHV1 prezintă multe similitudini biologice cu Herpes simplex tip 2 (HSV-2), cum ar fi tropismul genital, tipul și locul leziunilor tipice și ar putea oferi un model animal pentru studierea unor medicamente antivirale pentru HSV-2 în cazul infecției la om. Din acest punct de vedere eficacitatea cidofovir (CDV) a fost testată pentru șase capre care au fost infectate intravaginal cu tulpina BA.1 de CpHV-1. La trei capre li s-au administrat intravaginal 3 ml dintr-un preparat CDV 1% după 4 ore post infecție și apoi la fiecare 12 ore, timp de cinci zile consecutive. Trei capre au fost păstrate ca martori netratați. Caprele au fost examinate zilnic pentru semne clinice de infecție și excreție virală. CDV a fost capabil să protejeze împotriva progresiei bolii și a inhibat debutul leziunilor locale care apar ca urmare a replicării CpHV-1. Animalele tratate au excretat virusul pentru o perioadă mai scurtă (cu trei zile mai puțin) și la titruri mai mici decât animalele de control.

CpHV-1 poate reprezenta un excelent model animal pentru studiul de strategii noi în tratamentul genital al HSV-2 în infecția primară la om. (49)

În 2008 Thiry J, și col. aduce dovezi serologice ale prezenței CpHV1 în zona mediteraneană a Franței. Studiul a fost efectuat ca urmare a confirmării prezenței CpHV1 în țări mediteraneene din Europa, cum ar fi Italia, Spania și Grecia, geografic apropiate de Franța. Studiul a fost realizat în regiunea mediteraneană (Corse-du-Sud) și în regiunile continentale (Dordogne și Vendée) din această țară. Având în vedere înrudirea antigenică și genetică între (BoHV-1) și CpHV-1, detectarea serologică a fost realizată prin utilizarea BoHV-1 glicoproteine ​​B (GB) și E (GE) și a reacției ELISA de blocare. Analiza a 2548 de probe de ser într-un BoHV-1 GB prin testul ELISA de blocare a relevat faptul că o infecție cu alphaherpesviruse BoHV-1 a fost larg răspândită în Corse-du-Sud în timp ce nici un animal pozitiv nu a fost detectat în Dordogne și Vendée. Mai mult decât atât au fost evaluate specificitatea și sensibilitatea BoHV-1 gB ELISA pentru detectarea unei infecții legate BoHV-1 la capre. O analiză ulterioară de către un BoHV-1 gE testul ELISA de blocare a demonstrat că 22,6% dintre probele de ser gB- au fost pozitive , de asemenea pozitive și pentru gE. Testul Cross de seroneutralizare a permis identificarea anticorpilor împotriva CpHV-1 la caprele gB-pozitive. Prezența probabilă a CpHV-1 în Corse-du-Sud este confirmată de o prevalență ridicată (61,9%) în toate efectivele investigate, extinzând numărul de țări infectate cu CpHV-1. Mai mult decât atât, diferența observată între Corse-du-Sud și Dordogne și Vendée sugerează că CpHV-1 este mai răspândită în țările sau regiunile mediteraneene decât în Europa centrală și de nord.(50)

Piper KL și col. descriu în Australian Veterinary Journal în aprilie 2008 un focar de vulvovaginită pustuloasă infecțioasă cauzată de Caprine herpesvirus 1 (CpHV1) într-o turmă de aproximativ 200 capre, în vârstă de 8 luni care au fost importate în Victoria din Noua Zeelandă. CpHV1 a fost izolat în culturi de celule de la tampoane vaginale. Identitatea virusul ca un virus herpetic a fost confirmată prin electronomicroscopie negativă. Analiza amprentelor ADN cu ajutorul endonucleazei de restricție a arătat că amprentele ADN au fost similare, dar nu identice, cu cele descrise anterior pentru CpHV1 izolate în Noua Zeelandă, New South Wales, și în alte părți ale lumii. Pentru diagnosticarea infecției cu CpHv1 s-au folosit serurile de fază acută și de convalescență. Cel mai probabil că boala a fost prezentă datorită reactivării virusului aflat în stare de latență. Acesta este primul raport al prezenței CpHV în vulvovaginita pustuloasă infecțioasă la caprinele din Victoria și pare a fi unul dintre cele mai mari focare înregistrate oriunde.

Un număr mare de avorturi a avut loc la sfârșitul anului 2010 în localitatea Almeria din sud-estul Spaniei la o fermă de creștere intensivă a caprelor de lapte din rasa Murciano Granadina. Un numar mare de avorturi a avut loc la sfârșitul anului 2010 la caprinele din rasa Murciano Granadina. Aproape 10% au avortat într-un interval de 45 de zile. În turmă au fost observați iezi născuți morti și mortalitate neonatală, în timp ce leziunile genitale la caprele adulte lipsesc. Probele de creier, plămâni, ficat, rinichi și placentă au fost obținute de la 3 fetuși avortați. La examenul microbiologic nu au fost detectați agenți comuni ai avortului la capre. Examinarea histologică a relevat necroze de coagulare multifocale cu infiltrarea inflamatorie ușoară la periferia focarelor din ficat, plămâni și rinichi. Dimensiunea leziunilor a variat între 50 și 200 micrometri. Leziuni similare, dar mai mici, și înconjurate de o ușoară strgliosis răspuns, au fost de asemenea împrăștiate în țesuturile creierului. Cariorrexis și cariolisis au fost observate în centrul petelor necrotice, cu unele incluzii intranucleare amfofilic. ADN-ul Caprine herpesvirus tip 1 (CpHV -1) ADN a fost detectat în real time PCR și Antigenele CpHV-1 au fost detectate utilizând tehnici imuno-enzimatice.Aceste constatări sugerează faptul că CpHV1 poat fi implicat în focare de avort la capre și că virusul circulă și în Peninsula Iberică, aceasta fiind prima descriere de avorturi provocate de infecția naturală cu acest agent viral.(18)

Colectivul din Centrul de Cercetare din cadrul Facultății de Medicină Veterinară și Zootehnie condus de Irma Candanosa confirmă în 2011 prezența CpHV1 în Mexic. Într-un efectiv de 244 de capre de lapte și carne au fost efectuate examene fizice atât la femele cât și la masculi fiind prezente leziuni vulvare și leziuni prepuțiiale. Au fost efectuate necropsii la patru animale (un mascul și două femele) și un ied mort. Pentru examenele de imunohistochimie (IHC) s-a folosit Herpesvirus bovin 1 (BHV-1) și anticorpi din probe prelevate din mucoasa vulvară și din prepuț. Au fost colectate biopsii prepuțiale pentru microscopie electronică si izolare virală. Macroscopic, a fost observată o formă moderată până la severă de vulvovaginită cu multiple focare pustuloase și/sau ulcerative precum și balanopostită cu multiple focare pustuloase / ulcerative. Microscopic au fost prezente leziuni inflamatorii de diferite grade cu prezența de eozinofile intranucleare, a corpilor amfolitici de incluziune. În microscopie electronică, probele prepuțiale și cultura de celule MBDK au arătat mai multe particule virale intranucleare de dimensiuni 150-230 nm. Prin microscopie electronică în izolatul viral a fost observat un efect citopatic și prezența de particule virale, virusul herpes. Acesta este primul raport documentat sugerând prezența unui focar pentru virusul herpetic în Mexic, în efectivele de caprine.( Irma Eugenia Candanosa Aranda și col., 2011)

În 2013 Donofrio G. și col. folosește ca vector BoHV4 pentru a induce protecție clinică împotriva CpHV1 cu administrarea subcutanată de recombinant BoHV-4, administrarea a fost testată pentru prima dată in vivo / ex vivo. Apoi, un studiu de imunizare și siguranță a fost realizat cu două recombinante de BoHV-4, BoHV-4-A-GD (cp) GD (106) ΔTK sau BoHV-4-CMV-IgK-gE2gD-TM. În ambele cazuri, semnele clinice nu au fost evidente, dar un titru de anticorpi serici neutralizanți a fost produs la toate animalele inoculate. După utilizarea unei doze înalt patogene de CpHV-1 pentru a induce infecția într-un nou grup de capre, toate caprele vaccinate cu BoHV-4-A-gD (cp) gD (106) ΔTK au fost protejate față de infecția genitală indusă de CpHV-1, față de cele nevaccinate care au prezentat leziuni tipice vaginale cu un grad ridicat de scor clinic, precum și purtători de virus de lungă durată. Pe scurt, datele obținute în studiul de față validează BoHV-4 ca un vector viral sigur și eficient pentru vaccinarea impotriva bolilor genitale la capră induse de CpHV-1.(Donofrio 52)

A) Diagrama la scară a BoHV-4LucΔTK, caseta de expresie CMV-Luc. Promotor CMV este reprezentat de cutia albastră, ORF luciferază de caseta galbenă în timp ce semnalul de poliadenilare de cutie albă. B) imagine a locului de injectare BoHV-4LucΔTK, sub coada capră (sageata rosie), și analiza imaginii in vivo C) imagine reprezentând flacoane care conțin culturi celulare de piele de capră infectate/ neifectate cu BoHV-4LucΔTK și vizualizate prin în analiza imaginii vivo. Formă moderată spre gravă de balanopostită, pustule multifocale și ulcerative la mascul din rasa Alpină franceză infectat cu herpesvirus. (http://www.scielo.org.)

Un studiu transversal a fost efectuat pentru a determina seroprevalența la nivel de turmă pentru Caprine herpesvirus 1 (CpHV-1) și Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) și a doi factori (BoHV-2) de risc asociați cu CpHV-1 la turmele de capre de lapte într-o regiune semiaridă din nord-estul Braziliei de Silva ML ;I col. Un total de 1034 probe de ser de la 110 turme au fost colectate din martie 2009 până în martie 2010. Chestionare structurate, concentrate asupra variabilelor legate de factorii de risc pentru infecția indusă de CpHV-1 au fost date fiecărui agricultor în momentul de colectare a sângelui. Anticorpii împotriva CpHV-1, BoHV-1, și BoHV-2 au fost detectați prin teste de neutralizare. La nivel de turmă prevalențele de CpHV-1, BoHV-1, și BoHV-2 au fost 89,1% (98/110; interval de încredere de 95% [CI]: 81.7 – 94.2), 80% (88/110; 95% CI: 71.3-87), și 4,5% (5/110, 95% CI: 1.5 – 10.3), respectiv. Frecvența animalele seropozitive au fost de respectiv 36,6% (379/1034), 25,8% (267/1034), și 0,6% (6/1034) pentru CpHV-1, BoHV-1, și BoHV-2. Utilizarea împerecherii naturale a fost identificată ca un factor de risc asociat cu prevalența CpHV-1în turmă (P = 0,001). Se sugerează că ar trebui să fie inițiată adoptarea de servicii veterinare și supravegherea activă a riscului pentru turmele din regiunea studiului pentru a reduce prevalența infecțiilor cu herpesvirusul caprin. (41)

În mai 2014, Camero M și col, confirmă proprietățile antivirale ale latexului de Ficus carica Linn. (Moraceae) împotriva unor virusuri umane. Pentru a determina capacitatea de F. carica latex (F-latex) de a interfera cu infectarea Caprine herpesvirus-1 (CpHV-1) in vitro, F-latex a fost resuspendat în mediu de cultură conținând 1% etanol și a fost testat pentru potențialul său antiviral împotriva CpHV-1. Titrarea CpHV-1 în prezența sau în absența F-latex a fost realizată pe monostraturi din celule de Madin Darby de Rinichi de Bovine (MDBK). Prezența simultană a F-latex și CpHV-1 în monostraturile de celule MDBK a dus la o reducere semnificativă a titrului de CpHV-1 la 3 zile postinfecție, acest efect a fost comparabil cu cel indus de aciclovir. Studiul sugerează că F-Latexul este capabil să interfereze cu replicarea CpHV-1 in vitro pe celule MDBK.

Elia G. și Camero M. au publicat în aprilie 2015 rezultatele cu privire la efectul antiviral al Mizoribin și Aciclovir testat împotriva CpHV-1 in vitro. Infecția cu Caprine herpesvirus 1 (CpHV-1) la capre induce leziuni veziculare ulcerative genitale-care identice cu leziunile induse de herpesvirus 2 în gazda umană. Medicamentul Mizoribin (MIZ), imunosupresor, a fost folosit pentru a potența activitatea antivirală a Aciclovir (ACV) împotriva infecțiilor cu virusuri herpetice, În acest studiu a fost caracterizat anti-CpHV-1 Activitatea in vitro a monoterapiei sau în combinație cu MIZ ACV. Atunci când este aplicat singur la concentrații netoxice, ACV a avut un efect slab asupraîn timpul replicării CpHV-1 în timp ce în combinație cu MIZ o inhibare dependentă de doză a fost observată în producția de virus cu un IC50 de ACV de 28.5 pM. Aceste constatări sugerează faptul că terapia combinată a ACV și MIZ crește potențialul vindecării în tratamentul infecției genitale cu virusuri herpetice.(24)

CAPITOLUL 4 – PROIECTAREA PROTOCOLULUI EXPERIMENTAL

Scopul cercetărilor

Cercetările ce urmează a fi realizate vor avea drept scop:

stabilirea incidenței CpHV1la caprinele din regiunea Moldovei;

Descrierea paticularităților epidemiologice și anatomoclinice ale herpesvirozei caprine;

Punerea în evidență a agentului viral prin reacția de polimerizare în lanț PCR și sau prin imunohistochimie.

4.2 Obiective și activități

Proiectarea protocolului experimental pentru realizarea temei propuse:

Anul 2014-2015

Obiectiv Documentare privind infecția cu Caprine Herpesvirus 1 din țară și străinătate

Activități documentare, recoltare de probe de la animalele suspecte sau bolnave, condiționarea și păstrarea probelor în vederea examenelor de laborator, elaborarea proiectului de cercetare științifică

Anul 2015-2016

Obiectiv 1. Stadiul cunoașterii privind infecția cu Herpesvirus la caprine în țară și străinătate. 2. Cercetări seroepidemiologice privind incidența și prevalența infecției cu Caprine

herpesvirus 1 în estul României.

Activități documentare, recoltare de probe de la animalele suspecte sau bolnave, condiționarea și păstrarea probelor în vederea examenelor de laborator, investigații epidemiologice și anatomoclinice privind infecția cu herpesvirusul caprin, publicarea unei lucrări într-o revistă de specialitate națională și/sau internațională, participarea la un simpozion/conferință.

Anul 2016-2017

Obiectiv 1. Diagnosticul clinic și anatomopatologic în infecția cu Herpsvirus la caprinele din estul României.

2.Confirmarea infecției determinate de Caprine herpesvirus 1 prin examene de laborator.

Activități documentare, recoltare de probe de animalele suspecte sau bolnave, condiționarea și

păstrarea probelor în vederea examenelor de laborator, detecția herpesvirusului caprin din probele recoltate, caracterizarea virusului caprin, participarea la un simpozion/conferință.

Anul 2017-2018

Obiectiv 1. Izolarea și caracterizarea tulpinilor virale isolate din focarele de herpesviroză caprină.

2.Strategia de profilaxie și combatere a infecțiilor cu CpHV1 la caprinele din estul României.

Activități distribuția seroepidemiologică a herpesvirozei caprine pe teritoriul Moldovei, validarea rezultatelor obținute, concluzii, susținerea publică a tezei de doctorat.

4.3 Metode de cercetare

Pentru realizarea obiectivelor propuse, metodologia de cercetare a prezentului proiect va presupune:

– realizarea unei documentații științifice temeinice, din țară și din străinătate, cu privire la herpesviroza caprină, prin accesarea bazelor de date naționale și internaționale;

– studii epidemiologice pe teren, pentru a stabili prevalența bolii în efectivele de caprine;

– prelevarea de probe biologice și conservarea lor în vederea determinărilor de laborator;

– efectuarea examenelor histopatologice și virusologice pentruconfirmarea diagnosticului;

– colectarea și prelucrarea datelor obținute;

– formularea concluziilor;

– publicarea rezultatelor și validarea acestora.

Studiile epidemiologice și investigațiile clinice vor fi efectuate în cadrul fermelor de creștere a caprinelor, gospodăriilor individuale de pe teritoriul Moldovei.

Probele ce urmează a fi recoltate pentru stabilirea diagnosticului vor fi reprezentate de sânge, secreții oculare, nazale, genitale, avortoni, porțiuni din ganglionii ce deservesc intestinal subțire, ganglionii sacrali si trigemen.

Confirmarea diagnosticului se va face prin examene de laborator, utilizând examenul de seroneutralizare și prin reacția de polimerizare în lanț pentru evidențierea agentului viral.

Examenul histopatologic. După recoltare, probele vor parcurge 5 etape:

Fixare în formol 10% tamponat timp de 48 ore;

Spălare;

Parafinare;

Secționare;

Colorare;

Vizualizare.

Pentru a putea stabili natura leziunilor, probele vor fi examinate la microscopul optic.

Examenul imunohisochimic. În secțiunile histologice, pentru a demonstra prezența viral în țesuturile afectate, se va folosi sistemul de imunodetectare streptavidin-biotina (ABC) și anticorpul primar împotriva BHV-1, diluat 1: 200. Este de remarcat faptul că nu există un produs comercial anti CpHV-1, așa că se va utiliza anticorpul menționat ca urmare a apropierii genetice și antigenice dintre BHV-1 și CpHV-I. Probele din leziuni pustuloase și ulcerative, vor fi fixate cu glutaraldehidă 2,5%, s-a spălat cu soluție tamponată cacodilat la pH 7,2, 0,1 M, apoi fixate cu tetraoxid de osmiu 1%, deshidratat cu acetonă și impregnat în rășină epoxidică. După prelucrarea fragmentelor cu semithin 0.15 vim vor fi montate pe lamele și se colorează cu albastru de toluidină, apoi se vor efectua tăieturi fine de 60 nm montate pe rețelele de cupru și colorat cu acetat de uranil și citrat de plumb. Probele se vor observa pe un microscop electronic cu transmisie.

Pentru izolarea virusului în cultură celulară proba biopsică a fost depozitată la -20 ° C până când se va prelucra. Odată dezghețată, proba a fost macerată în soluție salină tamponată pentru a realiza o concentrație de 10%, care este ulterior centrifugată la 873.43 g / 10 min; Supernatantul obținut se filtrează pe o membrană de 0,45 microni și plăcile cu mediu bacteriologic (Triptoză agar și tioglicolat bulion 0,1 ml) au fost incubate la 37 ° C timp de 48 ore pentru a verifica absența contaminării bacteriene. Au fost luate 0,5 ml de inocul adauga la 25 cm2 sticle conținând celule MDBK în monostrat și incubate la 37 ° C timp de o oră. Apoi inoculul a fost îndepărtat și s-a adăugat mediu esențial minim (MEM) suplimentat cu ser 10% fetal bovin (FBS). Celulele inoculate și cele neinoculate (celule luateca martor negativ) au fost incubate la 37 ° C într-un incubator cu CO2 și observate zilnic pentru a determina apariția leziunilor. La cinci zile de la inoculare, celulele au fost lizate prin congelare și decongelare, pentru a face o a doua trecere, acest lucru a fost realizat prin centrifugarea probei anteriore pentru a inocula un alt strat de celule monostrat MBDK. Ulterior, reinfectarea a fost efectuată pe culturi celulare MDBK unde a apărut arată efectul citopatic la 48 ore; la 72 de ore monostratul a fost luat și fixat cu 2,5% glutaraldehidă pentru evaluare în microscopie electronică de transmisie.

Reacția de polimerizare în lanț (PCR) – este o metodă de diagnostic foarte des utilizată în ultimii ani pentru confirmarea diagnosticului. Probele constau în porțiuni de piele cu leziuni, sânge, avortoni.

4.4. Rezultate preconizate – contribuția lor la dezvoltarea cunoașterii

Datorită puținelor informații cu privire la herpesviroza caprină pe teritoriul țării noastre rezultatele acestor cercetări vor trebui să îmbunătățească calitatea cercetării, să contribuie la dezvoltatrea cunoașterii cu privire la tema cercetată și să deschidă accesul altor cercetători la informație.

4.5. Modalitatăți de validare și valorificarea rezultatelor

Rezultatele obținute în urma cercetărilor personale vor fi comparate cu datele existente în literatura de specialitate și vor fi prezentate prin rapoartele de cercetare anuală. Rezultatele vor fi valorificate prin comunicarea și publicarea de articole științifice în publicații de specialitate, în cadrul simpozioanelor și conferințelor de specialitate.

CAPITOLUL 5 – CONCUZII GENERALE

Proiectul tezei de doctorat ,,Cercetări privind herpesviroza caprină în estul României” constă în realizarea unor studii și cercetări științifice referitoare la infecția cu Caprine herpesvirus 1 la capre.

Teza are ca și motivație principală lipsa cercetăriilor cu privire la această boală, precum și necesitatea de noutate și originalitate, utile în progresul medical veterinar.

Pentru realizarea obiectivelor propuse, metodologia de cercetare a prezentului proiect va implica următoarele: realizarea documentării știițifice, anchete epidemiologice și investigații anatomoclinice, prelevarea de probe biologice și conservarea lor în fincție de metodologia de diagnostic propusă, efectuarea examenelor de laborator, colectarea și analiza datelor obținute, publicarea rezultatelor în scopul validării, formularea concluziilor.

Este important să se ia în considerare posibila prezență a acestui virus în turmele de capre din România, pentru punerea în aplicare a unui test de confirmare a bolii cât șipentru a fi inclus în diagnosticul diferențial al problemelor de reproducere și genitale la animalele adulte și al mortalității neonatale.

Rezultatele obținute în urma cercetării vor contribui la dezvoltatrea cunoașterii privitor la această temă și vor deschide accesul altor cercetători la informație, permițând extinderea cercetărilor pe viitor.

BIBLIOGRAFIE

Buddle B.M., Pfeffer A., Cole D.J., Pulford H.D., Ralston M.J. _ A caprine pneumonia outbreak associated with caprine herpesvirus and Passteurella haemolytica respitratory infection. New Zeeland Veterinary Journal. 1990; 38:28-31.

Buonavoglia C1, Tempesta M, Cavalli A, Voigt V, Buonavoglia D, Conserva A, Corrente M.- Reactivation of caprine herpesvirus 1 in latently infected goats -1996 Sep; 19(4):275-81. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8894377

Camero M, Marinaro M, Lovero A, Elia G, Losurdo M, Buonavoglia C, Tempesta M. – In vitro antiviral activity of Ficus carica latex against caprine herpesvirus-1. Nat Prod Res. 2014 May22:1-5

Chenier S., Montpetit C., Helie P., Caprine herpesvirus-1 abortion storm in a goat herd in Quebec, Can. Vet. J. 45 (2004) 241–243.

Dolores Gavier-Widén, J. Paul Duff, and Anna Meredith. – Infectious Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe, Prima ediție. Editura Blackwell

Donofrio G, Franceschi V, Lovero A, Capocefalo A, Camero M, Losurdo M, Cavirani S, Marinaro M, Grandolfo E, Buonavoglia C, Tempesta M. – Clinical protection of goats against CpHV-1 induced genital disease with a BoHV-4-based vector expressing CpHV-1 gD. PLoS One. 2013;8(1):e52758. doi: 10.1371/journal.pone.0052758. Epub 2013 Jan 3.

Engels , M. , Palatini , M. , Metzler , A.E. , Probst , U. , Kihm , U. și Ackermann , M. – Interactions of bovine and caprine herpesviruses with the natural and the foreign hosts ., Veterinary Microbiology . 1992 ; 33 : 69 – 78 .

Engels M., Hans G., GHolamreza D., Hanns L., – Goat Herpesviruses: Biological and Physicochemical Proprities. J.gen.Virol. 1993;64:2237-2247. Printed in Great Britain

Engels M., Papaltini M., Metzler A.E., Probst U., KIhm U., Ackermann M.- Interactions of bovine and caprine herpesviruses with the natural and the foreign hosts. Veterinary Microbiology. 1992; 33:69-78.

González, J., Mechelli,L, Esnal, A, García-Vera, JA, Sáez, A, Ruiz, C, García Marín, JF, Tempesta, M – An outbreak of abortion in goats associated with type 1 Caprine herpesvirus infection in the Iberian Peninsula, I Iberic Meeting of Veterinary Pathology, 1, 2 and 3 June 2011 – (http://www.uco.es/grupos/seapv/2011/actas2011.pdf)

Grewal A.S., Wells R., Vulvovaginitis of goats due to a herpesvirus, Aust. Vet. J. 63 (1986) 79–82.

Horner G.W., Hunter R., Day A.M., An outbreakof vulvovaginitis in goats caused by a caprine herpesvirus, N. Z. Vet. J. 30 (1982)

http://biblioteca.universia.net/html_bura/ficha/params/title/isolation-of-caprine-herpesvirus-type-1-in-spain/id/53016376.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Walter_Plowright

http://historymaps.ro/?p=1588

http://jcm.asm.org/content/37/5/1598.full?sid=923c45cd-0fac-4e7d-ab3a-249456ea3fdd

http://jcm.asm.org/content/42/3/1228.full.pdf

http://media.johnwiley.com.au/product_data/excerpt/59/14051990/1405199059-143.pdf

http://ro.wikipedia.org/wiki/Herpesviridae

http://www.biomedcentral.com/1746-6148/3/33

http://www.rkm.com.au/VIRUS/HERPES/herpes-virion.html

http://www.scieo.org.co

http://www.uspharmacist.com/content/d/feature/i/2844/c/48416/ – acyclovir

http://www.unboundmedicine.com/medline/citation/25660402/In_vitro_inhibition_of_caprine_herpesvirus_1_by_acyclovir_and_mizoribine

http://www.vet.cornell.edu/Zweig/projects/osterrieder03.cfm

https://microbewiki.kenyon.edu/images/thumb/a/a0/Herpes.diagram.jpg/180px-Herpes.diagram.jpg

Irma Eugenia Candanosa Aranda* Mayra Sierra García* Alejandra Sánchez Cervantes* Gerardo Salas Garrido** Adriana Méndez Bernal** Laura Cobos Marín*** Lorenzo Álvarez Ramírez*- Pustular vulvovaginitis and balanoposthitis suggestive of caprine herpesvirus–1 infection in goats (Queretaro, Mexico), Vet. Méx vol.42 no.3 México jul./sep. 2011 – http://wwwscielo.org.mx/scielo.php?script+sci_arttext&pid

Keel M.K., Patterson J.G., Noon T.H., Bradley G.A., Collins J.k Caprine herpesvirus -2 in association with naturally occurring malignant catarrhal fever in captive sika deer (Cervus Nippon). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2003; 15:179-83.

Keuser V., Espejo-Serrano J., Schynts F., Georgin J.P., Thiry E., Isolation of caprine herpesvirus type 1 in Spain, Vet. Rec. 154 (2004) 395–399.

Koptopoulos G., Papanastasopoulou M., Papadopoulos O., Ludwig H., The epizootiology of caprine herpesvirus (BHV-6) infections in goat populations in Greece, Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 11 (1988) 199–205

Luigi Bertolotti, Alfonso Rosamilia, Margherita Profiti, Emiliana Brocchi, Loretta Masoero, Valentina Franceschi, Maria Tempesta, Gaetano Donofrio, Sergio Rosati – Characterization of caprine herpesvirus 1 (CpHV1) glycoprotein E and glycoprotein I ectodomains expressed in mammalian cells – Veterinary Microbiology Volume 164, Issues 3–4, 28 June 2013, Pages 222–228

Mariarosaria Marinaro,1 Anna Lucia Bellacicco, Elvira Tarsitano, Michele Camero, Valeriana Colao, Maria Tempesta, Canio Buonavoglia – Detection of Caprine herpesvirus 1–specific antibodies in goat sera using an enzyme-linked immunosorbent assay and serum neutralization test -http://vdi.sagepub.com/content/22/2/245.full.pdf

Mettler F., Engels M., Wild P., Bivetti A., Herpesvirus infection in kids in Switzerland, Schweiz. Arch. Tierheilkd. 121 (1979) 655– 662 (in German).

Muluneh A., Liebermann H., Occurrence of caprine herpesvirus (BHV-6) infection in goat population of the GDR, Arch. Exp. Veterinarmed. 44 (1990) 254–257.

Papanastasopoulou M, Koptopoulos G, Lekkas S, Papadopoulos O, Ludwig H- An experimental study on the pathogenicity of the caprine herpesvirus type 1 (CpHV-1). Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1991; 14(1): 47-53. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1647931

Papanastasopoulou M, Koptopoulos G, Lekkas S, Georgakopoulou E, Papadopoulos O. – A preliminary investigation on the latency of the goat herpesvirus BHV-6., Zentralbl Veterinarmed B. 1990 Dec; 37(10):781-4. – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1964526

Piper KL, Fitzgerald CJ, Ficorilli N, Studdert MJ.- Isolation of caprine herpesvirus 1 from a major outbreak of infectious pustular vulvovaginitis in goats.Aust Vet J. 2008 Apr;86 (4):136-8. doi: 10.1111/j.1751-0813.2008.00273.

Plebani G.F., Engels M., Metzler A.E., Wyler R., Caprine herpesvirus in Switzerland: distribution, incidence and latency of infection, Schweiz. Arch. Tierheilkd. 125 (1983) 395–411 (in German).

Roperto F., Pratelli A., Guarino G., Ambrosio V., Tempesta M., Galati P., Iovane G., Buonavoglia C., Natural caprine herpesvirus 1 Ruminant alphaherpesviruses related to BoHV-1 189 (CpHV-1) infection in kids, J. Comp. Pathol. 122 (2000) 298–302.

Roperto, F., Pratelli, A., Guarino, G., Ambrosio, V., Tempesta, M., Galati, P., Iovane, G. and Buonavoglia, C., – Natural caprine herpesvirus 1 (CpHV-1) infection in kids., 2000, Journal of Comparative Pathology, 122, 298-302 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10805983

Saito J.K., Gribble D.H., Berrios P.E.,Knight H.D., Mc Kercher D.G., A new herpesvirus isolate from goats: Preliminary report, Am. J. Vet. Res. 35 (1974) 847–848.

Silva ML, Pituco EM, Nogueira AH, Martins MS, Lima MS, de Azevedo SS. – Serological evidence and risk factors associated with Caprine herpesvirus 1 in dairy goat flocks in a semiarid region of northeastern Brazil. J Vet Diagn Invest. 2013 Jan;25(1):125-8. doi: 10.1177/1040638712470946.

Tempesta M, Camero M, Bellacicco AL, Thiry J, Crescenzo G, Neyts J, Thiry E, Buonavoglia C. -Cidofovir is effective against caprine herpesvirus 1 infection in goats.Antiviral Res. 2007 May; 74(2):138-41. Epub 2006 Dec 4.

Tempesta M, Pratelli A, Corrente M, Buonavoglia C. – A preliminary study on the pathogenicity of a strain of caprine herpesvirus-1. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1999 Apr; 22(2):137-43- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10051183

Tempesta M, Pratelli A, Normanno G, Camero M, Buonavoglia D, Greco G, Buonavoglia C. – Experimental intravaginal infection of goats with caprine herpesvirus 1. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 2000 Apr; 47(3):197-201-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829574 Tempesta M., Camero M., Greco G.,

Pratelli A., Martella V., Buonavoglia C., A classical inactivated vaccine induces protection against caprine herpesvirus 1 infection in goats, Vaccine 19 (2001) 3860–3864. [124]

Tempesta M., Cavalli A., Voigt V., Buonavoglia D., Presenza di anticorpi per caprine herpesvirus 1 (CapHV.1) in allevamenti caprini dell’Italia meridionale, Atti. SIPAOC 11 (1994) 121–122. [119]

Tempesta M., Greco G., Pratelli A., Buonavoglia D., Camero M., Martella V., Buonavoglia C., Reactivation of caprine herpesvirus 1 in experimentally infected goats, Vet. Rec. 150 (2002) 116–117.

Tempesta M., Pratelli A., Greco G., Martella V., Buonavoglia C., Detection of caprine herpesvirus 1 in sacral ganglia of latently infected goats by PCR, J. Clin. Microbiol. 37 (1999) 1598–1599. http://jcm.asm.org/content/37/5/1598.ful [122]

Thiry J, Saegerman C, Chartier C, Mercier P, Keuser V, Thiry E.- Serological evidence of caprine herpesvirus 1 infection in Mediterranean France. Vet Microbiol. 2008 Apr 30;128 (3-4):261-8. Epub 2007 Oct 18.

Thiry J., Tempesta M., Camero M., Tarsitano E., Bellacicco A.L., Thiry E., Buonavoglia C., – A live attenuated glycoprotein E negative bovine herpesvirus 1 vaccine induces a partial cross-protection against caprine herpesvirus 1 infection in goats, Vet. Microbiol. (2005) in press. [132]

Uzal F.A., Woods L., Stillian M., Nordhausen R., Read D.H., Van Kampen H., Odani J., Hietala S., Hurley E.J., Vickers M.L., Gard S.M., Abortion and ulcerative posthitis associated with caprine herpesvirus-1 infection in goats in California, J. Vet. Diagn. Invest. 16 (2004) 478–484. [136]

Véronique Keuser, Frédéric Schynts, Bruno Detry, Alfred Collard, Béatrice Robert, Alain Vanderplasschen, Paul-Pierre Pastoret and Etienne Thiry – Improved Antigenic Methods for Differential Diagnosis of Bovine, Caprine, and Cervine Alphaherpesviruses Related to Bovine Herpesvirus 1 – J. Clin. Microbiol. Mar; 42(3): 1228-1235.( http://jcm.asm.org/content/42/3/1228)

Wenliang Li1, Li Mao1, Yongqian Zhao1, Yinhua Sun2, Kongwang He1 and Jieyuan Jiang1 – Detection of border disease virus (BDV) in goat herds suffering diarrhea in eastern China , Li et al. Virology Journal 2013 10:80 doi:10.1186/1743-422X-10-80 (http://www.virologyj.com/content/10/1/80)

Williams N.M., Vickers M.L., Tramontin R.R., Petrites-Murphy M.B., Allen G.P., Multiple abortions associated with caprine herpesvirus infection in a goat herd, J. Am. Vet. Med. Assoc. 211 (1997) 89–91[145]

www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113510000908