Celulele Stem Mezenchimale

=== 1f1452fd717cd90e2a821ea1eb9b8b731d2565f8_466630_1 ===

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

1

CELULE STEM MEZENCHIMALE

1

CUPRINS

INTRODUCERE

1.CELULE STEM

1.1.CARACTERIZAREA CELULELOR STEM

1.2.CLASIFICAREA CELULELOR STEM

1.2.1.CELULE STEM EMBRIONARE

1.2.2.CELULE STEM ADULTE

1.3.DIFERENȚIEREA CELULELOR STEM ADULTE

2.EVIDENȚIEREA CELULELOR STEM CU ANTICORPI, ANTIGENI ȘI A TEHNICII DE FLUX CONTINUU

2.1. ANTICORPII

2.1.1. CARACTERIZAREA ANTICORPILOR

2.1.2.ANTICORPI PRIMARI

2.1.3.ANTICORPI SECUNDARI

2.2. ANTIGENII

2.3. CITOMETRIA ÎN FLUX CONTINUU

3.REZULTATELE CERCETĂRILOR PRIVIND CULTURA DE CELULE STEM

3.1.SCOPUL SI OBIECTIVELE CERCETĂRII

3.1.1.SCOPUL CERCETĂRII

3.1.2.OBIECTIVUL CERCETĂRII

2

4.CERCETĂRI PRIVIND EVIDENȚIEREA CELULELOR STEM CU ANTICORPI MONOCLONALI

4.1.MATERIALE ȘI METODE

4.1.1.MATERIALE

4.1.2.METODE

5.TRANSPLANTUL DE CELULE STEM

6. TERAPIA CU CELULE STEM MEZENCHIMALE

7.STUDIU DE CAZ

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

3

INTRODUCERE

Celulele mezenchimale stem (MSC) sunt cunoscute ca celule medulare stromale sau celule progenitoare mezenchimale, definite ca celule progenitoare multipotente care se autoreînoiesc cu o capacitate de diferențiere într-o serie de linii celulare, cum ar fi țesut conjunctiv scheletal (osos, cartilaginos, stromă reticulară a măduvei osoase roșii, adipocite). Aceste date sugerează că MSC pot da naștere mușchiului striat cardiac și scheletic, celulelor endoteliale și celulelor de origine non mesodermală, cum sunt hepatocitele, celulele sistemului nervos (neuroni și neurogliei), celulele epiteliale. Astfel termenul de pluripotent și multipotent sunt reciproc utilizate în descrierea capacității de diferențiere a MSC într-un spectru larg de țesuturi.

Inițial MSC au fost identificate în măduva roșie osoasă și apoi în țesutul muscular, adipos și conjunctiv. Capacitatea de diferențiere a MSC se diminueaza cu creșterea vârstei. De aceea s-au căutat alte surse alternative de MSC, cum sunt lichidul amniotic, placenta sângele ombilical, venele ombilicale, țesutul conjunctiv al cordonului ombilical, mezenchima pulpară a dinților deciduali.

De asemenea au fost studiate și structurile fetale ca surse de MSC, astfel în perioada mijlocie de gestație s-au obținut grefe din splină, pulmoni, pancreas, rinichi. Unii autori confirmă că MSC sunt afiliate vaselor, fiind amplasate perivascular constituie un depou de MSC ce se extinde prin tot organismul și activeză cu rol de reparator tisular, stabilizează vasele sangvine și mențin homeostazia tisulară .

Având ca avantaj lipsa problemelor etice MSC se plasează ca cei mai promițători candidații în terapia celulară, bioinginerie și terapii cu celule stem pentru multe boli umane severe.

Celulele stem mezenchimale (MSC) din măduva osoasă au fost intens studiate pentru proprietățile lor regenerative și imunomodulatoare. Studiile pe modele animale au arătat că tratamentul cu MSC îmbunătățește funcția cardiacă în urma infarctului miocardic

4

prin scăderea apoptozei și producerea de factori angiogeni. Deoarece capacitatea de diferențiere a MSC în CMC este foarte scăzută și nu poate explica efectul benefic tranzitoriu al transplantului acestora la locul infarctului observat în studiile preclinice sau clinice, acest efect a fost pus pe seama efectului paracrin al acestor celule. Acestea sunt capabile să elibereze factori solubili (citokine, chemokine, factori de creștere) care să acționeze într-o manieră paracrină asupra celulelor miocardului lezat. Recent a fost demonstrat că MSC sunt capabile să comunice cu celulele învecinate prin intermediul unor fragmente membranare circulare, numite microvezicule. Astfel, MSC pot secreta diverse componente solubile, precum receptori, factori de creștere, lipide biologic active, dar și acizi nucleici, ARN mesager și microARN protejate de acțiunea agresivă a mediului extracelulular.

MSC prezintă o serie de avantaje pentru utilizarea lor în medicină regenerativă, deoarece ele pot fi izolate cu ușurință și propagate în cultură pentru a obține un număr mare de celule, adecvat pentru terapia celulară; au imunogenicitate scăzută, ceea ce le face potrivite și pentru transplantul alogen și datorită acestui fapt sunt evitate problemele de etică adiacente altor tipuri de celule stem utilizate pentru transplant, precum celulele stem embrionare.

Utilitatea celulelor stem mesenchimale a fost demonstrată în:

Patologia cardiovasculară. Injectarea celulelor stem în zona ischemică cardiacă a dus la diferențierea cardiomiocitelor, celulelor endoteliale și miocitelor. Ca efect în inima cu infarct miocardic s- a remodelat miocardul și s- au reparat vasele prin neoangiogeneză. MSC cu astfel de acțiuni, avea marcherul CD105 ce se preleva din sângele cordonului ombilical, țesut adipos și din măduva osoasă. Celulele stem și cele progenitoare cardiace rezidente sunt foarte asemănătoare atât fenotipic cât și genotipic.

Patologia osoasă și cartilaginoasă. Sunt aplicate cu succes în tratamentul osteogenezei imperfecte caracterizată cu fracturi multiple, cauzate de sinteza defectă a colagenului tip I . MSC fiind inoculate în zonele de reparație osoasă sau cartilaginoasă induc activitatea pericitelor, ca progenitori celulari care au posibilități modulatorii asupra

5

matricii exracelulare, potențial de migrație de proliferare, de re-diferenciere. O sursă de celule mezenchimale stem poate fi MSC din ”in situ” microfracturi, țesutul de granulație, țesutul adipos adiacent.

Patologia renală. Se încearcă să fie utilizate MSC în boli cu aspect inflamator, imunitar și autoimunitar. Sunt rezultate îmbucurătoare în tratarea patologiei glomerulare și tubulare renale. Studiile recente pun în evidență sugestia că celulele interstițiale pot fi considerate ca un depou de celule progenitoare stem mezenchimale extratubulare. Astfel în patologia renală restabilirea se petrece prin intermediul celulelor mezenchimale stem locale sau prin inocularea MSC allogene.

Patologia pielii. S-a observat un potențial mare de reparare a țesutului cutanat pe modele animale și la oameni în tratamentului plăgilor de origini diverse. În timpul cicatrizării cutanate se confruntă două procese de reparație și antiinflamator. Ambele sunt mediate de substanțele produse de celulele progenitoare locale, celule stem de provinință a. Recent s- au evidențiat ca celule stem mezenchimale, celulele stem ale foliculilor pieloși ai adulților. Celulele stem ale folicolului pielos sunt o nișă de celule progenitoare care duc la regenerarea părului, glandelor sudoripare, sebacee și a epidermisului.

Patologia nervoasă. Numeroase experimente se realizeaza în terapia patologiilor sistemului nervos central și periferic. Începând cu bolile neurodegenerative periferice și cele din CNS (boala demielinizantă, Huntington, Parkinson), până la patologii vasculare, ischemice, traume ale componentelor SNC și SNP. Se observă careva efecte pozitive, benefice în tratarea parezei infantile. MSC induc formarea factorului neuronal de creștere edndogen, descrește apoptoza, reduce nivelul radicalilor liberi, îmbunătățește conexiunea sinaptică a neuronilor afectați. Aceste acțiuni MSC le promovează prin activități paracrine producând factori trofici, care sunt insuficienți în cazul leziunilor nervoase, acești factori trofici neuronali și gliali induc regenerarea și supraviețuirea neuronilor locali în cazurile de ictus cerebral și maladiile neurodegenerative.

Patologia pulmonară. În sindromul de disstres respirator acut se observă o reducere dramatică a țesutului pulmonar, ca rezultat al procesului inflamator și de fibrozare.

6

Prin tehnici de transplant cu celule stem se încearcă stabilizarea țesutului pulmonar și chiar remodelarea acestuia. Celulele stem mezenchimale promovează repararea vasculară și regenerarea epitelială, de asemenea intervine la etapa de modulare a sistemului imunitar.

Diabetul zaharat. Studiile clinice demonstrează o reducere considerabilă a nivelului glucozei sangvine în diabetul zaharat juvenil tip I, după utilizarea SMC. Din celule mezenchimale stem din cordonul ombilical ”gelul Wharton” se formează celule producătoare de insulină în insulele formate de novo. Mediatorii imunoreglatori sintetizați de către SMC inhibă acțiunea pro- inflamatorie a citochinelor prezente în inlamațiile post transplant.

Boli autoimune. Multitudinea de nozologii autoimune din diferite sisteme ale organismului (scleroză multiplă, artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic) sunt ca rezultat al activității imperfecte a sistemului imunitar. Studiile recente arată acțiunea imunosupresoare a SMC în astfel de patologii. De asemenea sunt atestate rezultate pozitive în tratamentul maladiilor autoimune în combinație cu cele tradiționale, în special cu tehnicile manipulatorii de selecție a celulelor limfocitare T.

Pentru aceasta în perspectiva noilor tendințe științifice și aplicative este necesar de a pune în evidență majoritatea subtilităților structurare ale complexului ombilical placentar prin metode morfologice, histochimice și aprecierea posibilității utilizării lor în medicina practică.

Dezvoltând noi metode terapeutice sunt rezolvate multe probleme de asistență medicală. Transplantarea CMS într- un tratament complex are un dublu beneficiu, atât pacienților cât și economiei. Datorita cunoștințelor în domeniul grefărilor celulare cu MSC vor avansa strategiile de tratament ale multor boli în prezent incurabile.

7

1.CELULE STEM

O celulă stem deține două proprietăți principale: capacitate de autoreînnoire pe termen lung fără senescență si pluripotență si abilitatea de a se diferenția în mai multe categorii de celule specializate, care furnizeaza sursa de celule pentru transplant. Celulele totipotente stem dețin abilitatea de a genera toate categoriile de țesut, astfel acestea au un rol critic în dezvoltarea umană, furnizând materialul pentru dezvoltarea tuturor țesuturilor si organelor în embrion si în toate țesuturile extra embrionare.

Celulele stem specifice țesutului sunt de asemenea depozitate în diferite nise din corp, precum măduva osoasă, creier, ficat si piele, ca un mecanism pentru menținerea țesutului, cresterea acestuia si reînnoirea la maturitate. Conform cercetărilor, exista ipoteza că aceste celule stem adulte regenerau doar un set foarte restrâns de linii celulare, însă s- a demonstrat că au o plasticitate mare.

Bolile neurodegenerative sunt caracterizate de către deteriorările graduale si progresive sau pierderea celulelor nervoase si a țesutului neural. Bolile cunoscute sunt Alzheimer, Parkinson si Scleroza multiplă. Sunt afectați peste 22 milioane de oameni din lume de către disfuncțiile neurodegenerative, iar tratamentul complet al acestor boli nu s- a descoperit încă, deși există unele tratamente simptomatice.

Sclerozele multiple cauzează distrugerea treptată a creierului si a foiței de mielină protectoare a neuronilor coloanei vertebrale cu progres înspre boli ireversibile. Se estimează că peste 2,5 milioane de persoane din lume suferă de această boală. Acest număr include si pe cele 10000 de persoane din România. S-a dovedit că din celulele stem embrionare si din cele provenite din surse fetale se pot genera celule neuronale ce pot fi folosite pentru a înlocui neuronii pierduți. Celulele stem mezenchimale dau neuronilor capacitatea de a migra prin creier si măduva spinării la locurile din țesut unde sunt prezente disfuncții sclerotice.

8

1.1.CARACTERIZAREA CELULELOR STEM

Celulele stem sunt celule primare nediferențiate, care dețin abilitatea de a se diferenția în alte tipuri de celule. În această categorie intră atât celulele măduvei osoase si ale sângelui periferic, cât si celulele embrionare, a căror capacitate de diferențiere ajunge până la 200 de alte linii celulare diferite, proprietate denumită plasticitate evolutivă.

Cercetătorii sunt de părere că terapia cu celulele stem, numită si medicină regenerativă, are potențialul de a schimba fața bolilor întâlnite la om si animale prin utilizarea lor la înlocuirea unor țesuturi specifice sau dezvoltarea de organe. Terapia cu celule stem se experimentează, în prezent, în diverse centre medicale din lume, astfel există 10- 15 astfel de studii clinice în derulare. Cea mai importantă aplicație a celulelor stem umane este generarea de celule si țesuturi care pot fi folosite în asa numitele ,,cell- based therapies’’, tratamente pe bază de celule stem.

9

1.2.CLASIFICAREA CELULELOR STEM

1.2.1.CELULE STEM EMBRIONARE

Celulele stem embrionare provin din blastociști. Blastocistul constituie stadiul de dezvoltare embrionară preimplantațional, când embrionul murin este compus din 150 de blastomere compactate, dispuse sub formă sferică.1

În stadiul de blastocist, celulele embrionare se împart în celule care formează la interior embrioblastul si celule care formează la exterior trofoblastul. Celulele embrioblastului sunt celule stem pluripotente, dând naștere la toate categoriile de țesuturi ale organismului, cu excepția celor care alcătuiesc placenta și învelitorile fetale. Celulele trofoblastului pot da nastere doar la placentă si la învelitorile fetale.

Celulele stem embrionare [ES], similare celulelor embrionare germinale [EG], provin din celule germinale primordiale din care se formează ovulele si spermatozoizii, putând fi izolate si cultivate in vitro unde se multiplica si îsi mențin capacitatea de diferențiere.

1.2.2.CELULE STEM ADULTE

Celula stem adultă este nediferențiată, dar se află într- un țesut diferențiat, fiind capabilă să se reînnoiască pe durata de viață a organismului și generează precursori ai țesutului diferențiat. Sunt celule pluripotente care crează toate categoriile de țesuturi, exceptând placenta si învelitoarele fetale.

Celulele stem adulte sunt greu de izolat din diferitele organe si țesuturi, au o durată mică de viață, nu dezvoltă tumori, iar respingerea de către organism este redusă, în cazul pacienților care primesc celule recoltate din organe si țesuturi proprii.

1 D. Gottlieb, A pathway from embryonic stem cells to neurons, Cells Tissue Organs, 1999: 165.

10

1.3.DIFERENȚIEREA CELULELOR STEM ADULTE

În ceea ce privește celulele stem embrionare, sursa o reprezintă embrionul în stadiul de blastocist. Pot fi obținute din blastocisti (ne)clonați, o sursă importantă fiind embrionii rezultați prin fecundare ,,in vitro”. A doua sursă o reprezinta celulele rezultate din fecundarea ,,in vitro’’a ovulelor cu spermatozoizi aflați în băncile de fertilitate. Cercetătorii nu sunt nevoiți să creeze embrioni din spermatozoizi si ovule, obținuți de la clinicile de fertilizare. Cuplurile care încearcă să aibă un copil crează mai mulți embrioni, dar nu sunt toți utilizați, astfel se pot dona pentru cercetare. A treia sursă o reprezintă celulele stem embrionare create prin transfer nuclear de la celule somatice, SCNT, Somatic Cell Nuclear Transfer. Ultima sursă o constituie fetușii proveniți din avorturi în primul trimestru de sarcină.

Acesta constituie procesul prin care materialul genetic al unei celule din corp este transferat la un ovul enucleat, rezultând un embrion obținut fără fertilizarea cu un spermatozoid. Se presupune că este o tehnică de clonare care reprezintă dezvoltarea embrionilor în scopul utilizării acestora în tratamentul bolilor. Metoda presupune ca sursa genetică a unei celule somatice, din piele, să fie transferată într- un ovul fără ADN. Când ovulul e plasat într-un mediu de cultură, se multiplică, la stadiul de blastocist, cercetătorii izolează si cultivă celulele stem din masa interioară.

Recoltarea celulelor stem adulte este practicată în lumea medicală de peste 30 de ani, privind recoltarea lor de la nivelul măduvei osoase. Aproximativ 200 x 109 de hematii sunt create în fiecare zi în corpul uman din celulele stem hematopoetice.2

Doar 1 din 10.000- 15.000 de celule din măduva osoasă este celula stem hematopoietică, care formează sângele. Recoltarea de la nivel sanguin are unele avantaje față de recoltarea de la nivel medular, în sensul că se poate recolta un număr suficient

2 E. Mezey, Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow, Science, 2000: 290.

11

de celule stem, care susțin sedințe de chimioterapie.

De asemenea, în cazul daunelor localizate, celulele stem mezenchimale primesc semnale, din țesuturile distruse, care activeaza mecanismele reparatorii.3

Celulele stem mezenhimale si hematopoietice au fost găsite în sângele din cordonul ombilical. Conform studiilor experimentale, în timpul cultivării mononuclearelor din sângele ombilical, celulele endoteliale- predecesori sub acțiunea citochinelor formează în cultură colonii de fibroblaste.

3 F. Tavasolli, C. Alvarado, C. Alvarez, Metastases to the breast, Science, 2003: 29.

12

2.EVIDENȚIEREA CELULELOR STEM CU ANTICORPI, ANTIGENI ȘI A TEHNICII DE FLUX CONTINUU

2.1. ANTICORPII

2.1.1. CARACTERIZAREA ANTICORPILOR

Anticorpii reprezintă o categorie de molecule proteice, care au denumirea de imunoglobuline. Există 5 tipuri de imunoglobuline: IgG, IgA, IgD, IgE si IgM. Anticorpii sunt produsi de limfocitele B pe calea naturală a exocitozei în ambele forme: plasma membranară integrală si secretorie. Ei formează receptorul specific antigenului celulelor B. Anticorpii se găsesc în plasmă si lipiți de receptorii specifici ai regiunii invariabile ai imunoglobulinei sau în fluide secretori, cum sunt mucusurile si laptele. Anticorpii sunt molecule având forma literei Y fiind formați din câte 2 lanțuri grele si 2 lanțuri usoare de polipeptide, unite prin legături covalente si necovalente.

2.1.2.ANTICORPI PRIMARI

Anticorpi primari sunt anticorpi formați împotriva antigenilor de interes, cum ar fi proteinele, peptidele, glucidele sau de alte molecule mici, neconjugați. Anticorpii primari se leagă de epitopii unici. Anticorpii primari specifici utilizați în experimentele sunt: Synaptophisin, NPT II, DsRed murin, CD 31 murin si Cytokeratina 20 murină.

13

2.1.3.ANTICORPI SECUNDARI

Un anticorp secundar este un anticorp care se leagă de anticorpul primar sau de fragmente de anticorpi; anticorpii secindari sunt detectați cu sonde, fiind usor de folosit pentru purificarea sau sortarea celulelor.

Anticorpii secundari specifici sunt de utilizați în diferite aplicații de laborator. Sunt selectați în funcție de anticorpii primari folosiți, clasa de anticorpi primari, de exemplu, IgG sau IgM, precum si de tipul de sondă care este de preferat. Identificarea anticorpilor secundari optimi se realizează prin mai multe încercări.

Anticorpii secundari specifici utilizați în experimente sunt: Alexa Flor 488 atât capră anti murin cât si capră anti iepure, Alexa Flor 633 atât capră anti murin cât si capră anti iepure si Alexa Flor 594 capră anti murin.

2.2. ANTIGENII

Antigenul provine din limba greacă: anti= contra si geano= a naste, a genera, fiind termenul care defineste orice substanță de origine endogenă sau exogenă, care nu este recunoscută ca proprie de organism si determină apariția unui răspuns imun, ce vizează neutralizarea si eliminarea ei.

2.3. CITOMETRIA ÎN FLUX CONTINUU

Citometria în flux continuu este o tehnică de numărare si de examinare a particulelor microscopice, cum ar fi celule si cromozomi, prin suspendarea lor într- un curent de fluid si trecerea lui printr- un aparat electronic de detectare. Aceasta permite analiza

14

simultană a caracteristicilor fizice si chimice a mii de particule pe secundă.

Citometria în flux este utilizată în mod curent în diagnosticul unor tulburări de sănătate, în special în cazurile de cancer de sânge, dar are multe alte aplicații, atât în cercetare cât si în practică clinică.4

Un fascicul de lumină laser, dintr- o singură lungime de undă este direcționat pe un flux de lichid concentrat hidrodinamic. O serie de detectori sunt îndreptați înspre punctul în care fluxul trece prin fascicul de lumină: unul, în conformitate cu fascicul de lumină cu dispersia pe direcția înainte, Forward Scatter si fasciculul de lumină cu dispersia perpendiculară, Side Scatter. Fiecare particulă de dimensiuni de la 0.2 – 150 micrometri ce trece prin fasciculul de lumină si substanțele chimice fluorescente găsite în particule sau atasate de particule pot fi excitate să emită lumină la o lungime de undă mai mare decât sursa de lumină. Această combinație de lumină fluorescentă si lumină dispersată este preluată de către detectoare si prin analizarea fluctuațiilor de luminozitate, la fiecare detector, după care este posibilă obținerea diferitelor tipuri de informații despre structura fizică si chimică a fiecărei particule individuale. FSC este corelat cu volumul celulelor si SSC depinde de complexitatea interioară a particulei.

4 D. Recktenwald , H. Gross, B. Verwer, D. Houck, Detection of rare cells at a frequency of one per million by flow cytometry, Cytometry, 14, 1993: 519.

15

3.REZULTATELE CERCETĂRILOR PRIVIND CULTURA DE CELULE STEM

CERCETĂRI PE PLAN NAȚIONAL

Prima bancă publică de sânge placentar din țara noastră, la care au acces gratuit toți cetățenii români, funcționează la Cluj- Napoca, cu ajutorul Fundației Eurocord România. O altă bancă privată de sânge placentar a fost deschisă în Bucuresti, de către Centrul Medical Unirea, în colaborare cu Stem-Health Grecia.

Cercetări s-au efectuat si de către Groza în lucrarea cu titlul Cercetări experimentale privind comportamentul in vitro si in vivo al celulelor stem în reproducerea umană, din 2009. Scopul acestei lucrari este reprezentat de aplicarea în practică a cunostințelor actuale privind celulele stem din anexele fetale si sângele cordonului ombilical precum si de cercetarea experimentală a izolării, diferențierii si transplantării in utero a celulelor stem umane obținute pe model animal, utilizând biotehnologii complexe.

CERCETĂRI PE PLAN INTERNAȚIONAL

Din 1989, o nouă etapă în utilizarea celulelor stem adulte o constituie descoperirea si utilizarea ca sursă a celulelor stem, prima dovada fiind sângele extras din cordonul ombilical, care reprezinta sursa de celule stem adulte.

În America s- a efectuat un astfel de experiment, din celulele stem ale unei vaci au obținut un rinichi funcțional pe care l- au transplantat în animal, acesta funcționând similar cu cel original.

16

3.1.SCOPUL SI OBIECTIVELE CERCETĂRII

3.1.1.SCOPUL CERCETĂRII

Studiile internaționale efectuate în domeniul celulelor stem demonstreaza caracteristicile acestora, devenind un instrument important al medicinii regenerative. În România, există doar câteva studii care urmăresc această direcție de cercetare, acestea fiind axate pe elucidarea particularităților celulelor stem adulte. Studiul a fost întreprins în vederea testării capacității următorilor anticorpi monoclonali primari Synaptophisin, NPT II, DsRed murin, CD 31 murin si Cytokeratina 20 murină, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 atât capră anti murin cât si capră anti iepure, Alexa Flor 633 atât capră anti murin cât si capră anti iepure si Alexa Flor 594 capră anti murin. Acestia sunt citați de literatura de specialitate și sunt utilizați cu scopul de a evidenția celulele stem umane existente în creierul fetusului ovin.

Incidența frecventă a unor boli de gravitate mare, cu consecințe severe asupra vieții sociale umane, cum ar fi boala Parkinson, Alzheimer si sclerozele multiple, constituie pentru cercetători o provocare în descoperirea soluțiilor curative eficiente. Desi există cercetări în acest domeniu care implică utilizarea celulelor stem, rezultatele obținute nu sunt satisfăcătoare.

3.1.2.OBIECTIVUL CERCETĂRII

Obiectivul cercetării a constat în identificarea celei mai adecvate metode de evidențiere a celulelor stem umane migrate în creierul fetal ovin. Obiectivele metodologice au vizat testarea mai multor seturi de anticorpi monoclonali si policlonali în vederea identificării posibilității acestora de a fi utilizați în evidențierea celulelor stem umane în

17

creierul fetal ovin. În acest scop, a fost întocmit planul experimental al cercetării, luându-se în studiu 8 seturi de anticorpi monoclonali si policlonali, a căror eficiență a fost testată pe creier provenit de la fetus ovin. S-a practicat aceeeasi metodologie de testare, bazată pe principiul emisiei de fluorescență specifică, respectiv colorație rosie în cazul celulelor nervoase ovine si dublă rosu – verde, în cazul neuronilor umani. Prin tehnica citometriei în flux continuu, s- a determinat care dintre anticorpi se pretează la identificarea celulelor stem umane.

18

4.CERCETĂRI PRIVIND EVIDENȚIEREA CELULELOR STEM CU ANTICORPI MONOCLONALI

4.1.MATERIALE ȘI METODE

4.1.1.MATERIALE

Materiale biologice:

Ca si materiale biologice sunt folosite: celule stem provenite din linii celulare existente în banca de celule, anticorpi, antigeni, markeri.

Materiale chimice:

Soluții de PBS (Phosphate Buffered Saline); soluție de blocare (bloking buffer), etanol, metanol, alcool de diferite concentrații (100, 95 si 75 %), soluție de recuperare a antigenului (antigen retrival); DAPI, colorant fluorescent ce se leagă de ADN; hoecst; medii Dako, Dulbeco, DMEM (Dulbeco Modified Eagle medium); apă sterilă, spirt medicinal si soluții pentru dezinfecții.

Aparatura de laborator:

Aparatura utilizată în vederea realizării experimentelor a fost: microtom, microscop electronic, microscop confocal, microscop Olympus Bx 60, aparate PCR, lămpi UV, centrifugi, agitator ultraturax (Helidolph), aparat pentru produs gheață, autoclav, baie marină (Fisher Bioblock Scientific polystat), balanța analitica, containere Biohazard pentru deseuri, deionizator de apă, etuvă, frigidere, congelatoare, hotă pentru chimicale, Hotă PCR, microcentrifuge, pH – metru (InoLab), spectrofotometru, vortex (Schimadzu).

Materiale consumabile de laborator:

Sticlăria de laborator, lamele, lame, eprubete, bisturie, mănusi, pipete Eppendorf cu volume reglabile de la 0,2-5 μl, 5-10 μl, 50-100 μl si 100-1000 μl, tuburi Eppendorf de 1,5 ml, vârfuri de pipete de dimensiuni si volume diferite.

19

4.1.2.METODE

Se utilizează metodica specifică testării anticorpilor si pentru a ajunge la etapa de colorare sunt parcurse următoarele etape:

a.Prelevarea materialului biologic

Recoltarea este operațiunea de prelevare a fragmentelor de țesut sau organ, din organismul viu sau de la cadavre, care reprezintă una din cele mai importante etape ale efectuării preparatului permanent. Părțile de țesuturi sau organe se păstrează în blocuri de parafină sau gheață.

b.Includerea materialului biologic în blocuri de parafină

Efectuarea unui preparat permanent necesită o procedură complicată în comparație cu preparatul proaspăt. Pentru executarea lui trebuie parcurse un anumit număr de etape sau timpi de lucru, cu influență hotărâtoare asupra calităților preparatului. În cele mai multe cazuri aceste etape sunt: recoltarea, fixarea, spălarea sau decalcificarea, includerea, secționarea, colorarea si montarea. Modul de realizare a acestor etape este adaptat la necesitățile pieselor prelucrate, astfel timpii de lucru pot fi scurtați sau prelungiți, simplificați sau complicați în funcție de situație.

Pentru studiul histologic nu este suficient ca proba de examinat să fie transparentă si să posede un contrast optic adecvat, deoarece celulele si țesuturile sunt instabile din punct de vedere fizic si chimic. Celulele si materialele extracelulare trebuie conservate astfel încât modificările structurale si de compoziție chimică ale pieselor prelucrate histologic să fie minime. Fixarea are ca scop întreruperea fenomenelor vitale din celule si țesuturi, cu păstrarea structurii acestora.

Formaldehida este un gaz, însă în histologie este folosită sub formă de soluție 37 – 40 % formaldehidă în apă, care are denumirea de formalină. În cazul în care formalina este utilizată ca un fixator în soluții simple, necesită diluare, dacă se foloseste ca formalină neutralizată poate fi utilizată imediat.

20

După încheierea fixării acțiunea fixatorului trebuie stopată prin îndepărtarea acestuia din piese, în caz contrar fixatorul va denatura componentele pieselor biologice. Singurul fixator în care piesele pot fi păstrate un timp mai îndelungat fără să determine modificări majore, este formalina. Pentru spălarea fixatorului din piese se utilizează apă sau alcool, în funcție de compoziția fixatorului. După fixare cu bicromat, acid cromic sau tetraoxid de osmiu, spălarea trebuie făcută obligatoriu în apă; se utilizeaza recipiente speciale cu pereții perforați si astupate cu un dop mare de plută.

După spălare, apa din piese este extrasă (deshidratare) si înlocuită cu solvenți ai parafinei (clarificare), iar în final piesa este infiltrată cu parafină topită (parafinare). Procedura standard este valabilă pentru piesele cu o grosime de 3–5 mm. Timpii de deshidratare, clarificare, infiltrare cu parafină pot fi scurtați sau prelungiți, după cum piesele sunt mai mari sau mai mici. Pentru procedură, volumul de lichid trebuie să fie de 10 – 20 ori mai mare decât volumul piesei.

c.Secționarea

După solidificarea blocurilor de parafină ale pieselor biologice, se poate trece la secționarea acestora. Operațiunea se execută cu un microtom rotativ, microtoame basculante sau culisante. Secțiunile se obțin sub formă de felii subțiri, cu o grosime medie de 6 – 7 μm, care se lipesc pe lame de sticlă cu ajutorul unui strat subțire de albumină Mayer.

d.Deparafinizarea

Se înlătură parafina, folosindu-se xylenă. Se lasă lamele în această soluție 10 minute, la temperatura camerei. Dacă este necesar se repetă pâna la îndepartarea totală a parafinei.

e.Colorarea

Histologii utilizează soluții colorante la temperatura camerei. Procedeul de extragere a colorantului este numit diferențiere sau decolorare. Succesul ambelor metode de colorare depinde de faptul că în general coloranții au o mai mare afinitate față de anumite structuri. Colorația poate fi simplă când se utilizează un singur colorant, de exemplu

21

albastru de metilen; dublă când se folosesc două soluții colorante, cum ar fi hematoxilină-eozină și tricromică când se folosesc trei soluții colorante, de exemplu tricrom Masson. Cea mai utilizată metodă de colorare a secțiunilor histologice este colorația dublă cu hematoxilină (hemalaun) si eozină.

f.Montarea

După colorare, secțiunile sunt montate într-o substanță care protejează secțiunea si nu influențează contrastele. Cel mai utilizat mediu de montare este balsamul de Canada, rășină a speciei Abies balsamea. Balsamul de Canada natural este un lichid vâscos galben, care se înmoaie prin încălzire, iar prin uscare devine solid.

22

5. TRANSPLANTUL DE CELULE STEM

Transplantul de celule stem este terapia standard cu intenție curativă pentru leucemii acute și cronice, limfoame maligne inclusiv mielom multiplu și sindroame de insuficiență medulară dobândite sau înnăscute. Transplantul de celule stem este definit de EBMT (Grupul European de Transplant de Măduvă și Sânge) drept perfuzia de celule stem administrată unui pacient după un regim de condiționare cu intenția de a înlocui hematopoieza existentă de către celulele injectate. În arsenalul terapeutic actual al multor afecțiuni ale celulei stem hematopoietice procedura de transplant este considerată cea mai bună opțiune terapeutică, nefiind o procedură excepțională. Transplantul de celule stem (TCS) este un tratament fundamental pentru o serie de boli severe congenitale sau dobândite, ca și pentru boli maligne chimio sau radiosensibile. Indicațiile majore ale transplantului de celule stem (TCS), după coeficientul de variație (CV) a numărului de TCS efectuate la 10 milioane de locuitori în ultimul deceniu, conform ultimului raport al EBMT sunt: leucemii acute și cronice, boala Hodgkin, limfoame nonhodgkiniene și mielomul multiplu.

Procedura de transplant de celule stem presupune un regim terapeutic mieloablativ sau nonmieloablativ urmat de administrarea grefonului, a transplantului. Regimul de condiționare mieloablativ conține agenți chimioterapici convenționali utilizați în doze mari, combinați cu radioterapie, care are drept scop eradicarea bolii maligne și crearea spațiului în care celulele stem administrate din grefon să se formeze, iar prin diviziuni succesive și dezvoltare să refacă hematopoieza pacientului respectiv. Toate combinațiile terapeutice mieloablative determină o imunodeficiență celulară și umorală a primitorului. Această imunodeficiență persistă până când celulele stem și limfocitele mature din grefon repopulează și reconstituie sistemul limfopoietic și hematopoietic al primitorului. Regimul de condiționare nonmieloablativ conține agenți cu acțiune puternic imunosupresoare, utilizați în doze convenționale și are drept scop crearea unui spațiu “imunologic” care să permită celulelor stem din grefon să se multiplice și să se dezvolte fără a trezi reacții imune ca urmare a diferențelor antigenice între grefon și gazda care să ducă la compromiterea transplantului.

23

Caracteristica fundamentală a TCS în raport cu transplantul de organe este aceea că grefa este un concentrat de celule progenitoare obținut prin tehnici specifice, care trebuie menținute vii și perfect funcționale până la administrarea lor bolnavului. Administrarea grefonului de celule stem hematopoietice se poate face la câteva zile, la câteva luni sau câțiva ani de la recoltare. Dacă administrarea grefonului se face mai târziu de 24 – 48 de ore de la recoltare, grefonul este congelat programat în vapori de azot și păstrat în azot lichid la –1800C. Inghețarea celulelor stem fără riscul distrugerii lor prin cristalizarea apei din compoziție constituie elementul tehnic cel mai important și mai sensibil al programului de transplant.5

După decongelare, celulele progenitoare colectate se administrează bolnavului în perfuzie. Pentru reușita grefei este necesară perfuzarea a minimum 2,5 milioane de celule progenitoare vii pentru fiecare kilogram de greutate corporală.

În bolile hematologice maligne, utilizarea TCS convențional permite oncohematologilor să administreze bolnavului doze foarte mari de medicamente citostatice, asociate sau nu cu iradierea totală corporală, în intenția de a eradica infimul procentaj de celule tumorale care au supraviețuit tratamentului inițial al bolii (“boala minimă reziduală”) și care pot conduce la recădere. Aceste tratamente ar fi fatale în absența unei grefe reușite de celule progenitoare și, de aceea, calitatea biologică a grefonului reprezintă cheia procedurii. În procedura de TCS nonmieloablativ, eradicarea bolii minime reziduale este realizată prin distrugerea celulelor tumorale restante în urma reacțiilor imune de citotoxicitate față de celulele gazdei ale limfocitelor donatorului infuzate odată cu grefonul, celulele tumorale exprimă antigenele gazdei.

După tipul donatorului, TCS poate fi realizat prin două modalități tehnice de grefare: cu celule recoltate de la un donator compatibil în ceea ce privește antigenele tisulare majore de histocompatibilitate (HLA) realizându- se allogrefa sau allotransplantul și cu celule prelevate chiar de la bolnav, într-un moment de remisiune a bolii maligne, realizându-se autogrefa sau transplantul autolog. Fiecare din aceste metode are indicații specifice, beneficii, avantaje și riscuri. În comparație cu allogrefa, în transplantul

5 W. Peters, Cryopreservation and Use of Pheripheral Blood Progenitor Cells, editors R. Sacher & J. AuBuchon, American Association of Blood Banks Bethesda, Maryland 1992, p.51 – 67

24

autolog, complicațiile inerente care apar până la revenirea la normal a funcțiilor măduvei osoase, riscul de hemoragii, infecțiile severe, anemia sunt mai puțin grave și durează mai puțin, ceea ce conduce la o mortalitate mai scazută.

În privința bolnavilor care pot fi supuși procedurii de TCS, aceștia pot fi copii și adulți până la vârsta de 55 de ani, cu condiția ca aceștia să nu aibă infecții active și să prezinte o stare fizică bună, care să le asigure depășirea complicațiilor legate de transplant. Este obligatoriu pentru includerea în procedură, ca boala de bază să fi fost în prealabil bine controlată de terapia convențională cu medicamente anticanceroase, citostatice, sau boala să fie în remisiune completă.

Celulele stem prezintă trei valențe biologice: capacitate de autoreplicare, capacitate de diferențiere și capacitate de migrare și “homing” în structurile care oferă condiții optime de multiplicare și diferențiere. Celulele stem care constituie grefonul de celule stem sunt o minoritate de celule din măduva osoasă, mai puțin de 1% din numărul total al celulelor din acest organ. Ele pot fi identificate prin markerul de suprafață care reacțioanează cu anticorpii anti-CD34. La individul normal, celulele stem asigură formarea și menținerea în funcție a tuturor celulelor care compun sângele : eritrocite, leucocite, trombocite și celule ale seriei limfocitare. Prin capacitatea de autoreplicare, celulele stem hematopoietice sunt diferite de progenitorii hematopoietici comutați care păstrează doar un potențial restricționat de dezvoltare. Migrarea se face prin pasaj sanguin, ocazie cu care celulele stem pot fi identificate în sângele periferic în fracțiunea celulelor mononucleare, de unde pot fi recoltate prin citafereză. În condiții bazale doar un număr mic de celule stem circulă în sânge (0,5 – 5 celule CD34+/mmc). În 1976, Richman a observat fenomenul de creștere a numărului de celule circulante formatoare de colonii (CFC) în timpul refacerii din leucopenia indusă de ciclofosfamidă.6 S-a demonstrat ulterior o creștere a numărului celulelor CD34+ din sângele periferic după chimioterapie de 14 ori. Astfel a apărut ideea mobilizării celulelor stem mediată de chimioterapie. Administrarea de citochine cum ar fi factorul de creștere al coloniilor granulocitare (G-CSF) duce la o creștere a numărului de celule stem circulante. Față de metoda stimulului unic: chimioterapia, factori de creștere, metoda care combină

6 C. Richman, Increase in circulating stem cells following chemotherapy in man, Blood 1976: 47.

25

stimularea prin chimioterapie în tandem cu factori de creștere hematopoietici, crește de 278 de ori numărul celulelor stem circulante din sângele periferic și, implicit, cantitatea recoltată. În plus, în oncohematologie, concentratul de celule stem hematopoietice periferice obținut după stimulare combinată cu chimioterapie și factori de creștere este mai puțin contaminat cu celule tumorale. Colectarea celulelor stem circulante se face prin citafereza celulelor mononucleare din sânge cu ajutorul unui separator celular în flux continuu sau discontinuu. Citafereza poate fi repetată zilnic, cu condiția administrării zilnice a factorului de creștere hematopoietic.

Calitatea materialului biologic obținut prin citafereză este apreciată prin: conținutul de celule mononucleare, conținutul de celule pozitive și prin conținutul de celule capabile să formeze in vitro unități granulo-monocitare, fiabilitatea parametrilor enumerați fiind progresivă.

Procedura utilizată în Centrul de Hematologie și Transplant Medular din Institutul Clinic Fundeni constă în următoarele etape:

1. Administrarea unui regim de polichimioterapie (Dexametazonă + Cytosar + Cisplatin sau Endoxan în doză mare sau Ifosfamida + Epirupicină + Dexametazonă) urmat de factori de creștere (G-CSF) pentru mobilizarea celulelor stem CD34+ de la pacienți, în vederea recoltării autogrefonului pentru transplant. Pentru recoltarea grefonului de la donatorul sănătos în vederea allotransplantului se utilizează un program de mobilizare doar cu factori de creștere (G-CSF).

2. Monitorizarea mobilizării celulelor stem în sângele periferic prin urmărirea zilnică a numărului de leucocite. Obișnuit, după chimioterapie, pacientul prezintă o scădere progresivă a numărului de leucocite prin scăderea numărului de neutrofile, cu un nadir între zilele 7–12, în funcție de durata chimioterapiei din programul de mobilizare utilizat în ziua 5 – 8 de administrare de factori de creștere. Ieșirea din această neutropenie se face exploziv cu leucocitoză în ziua 11 – 14 a programului de mobilizare, ziua 8 – 10 de administrare de factori de creștere.

La donatorul sănătos sau pacient, în primele 24 – 48 de ore de la administrarea primei doze de factori de creștere se constată o leucocitoză importantă cu

26

neutrofilie, ca urmare a efectului secundar al G-CSF de demarginație și mobilizare din depozite a neutrofilelor. La donatorul sănătos, leucocitoza datorată mobilizării celulelor stem hematopoietice din măduvă în sângele periferic nu apare mai devreme de ziua 4 – 5 de administrare a factorului de creștere granulocitar. Odată cu mobilizarea celulelor stem hematopoietice din măduvă în sângele periferic, mononuclearele din formula leucocitară (limfocite + monocite) sunt în procent de 40 – 50%. O ușoară creștere a numărului de reticulocite din sângele periferic este inconstantă și fără semnificație. Switch-ul formulei leucocitare corespunde concentrației maxime în sângele periferic a celulelor stem hematopoietice mobilizate și momentului celui mai potrivit pentru o afereză cu randament maxim de recoltare. În zilele următoare, în sângele periferic sunt identificate, pe criterii morfologice, celulele precursoare granulocitului neutrofil (mieloblast, promielocit, mielocit, metamielocit) cu reducerea treptată a procentului de mononucleare.

3. La depășirea pragului de 1000 leucocite/ mmc, monitorizarea mobilizării celulelor stem în sângele periferic prin numărarea celulelor CD34+ în sânge cu ajutorul citometrului în flux;

4. Recoltarea grefonului de celule stem CD34+ începe atunci când numărul de celule CD34+ din sângele periferic depășește 10 – 15 x 106/L. Procedura de recoltare constă în afereza cu separator Haemonetics MCS+. Pentru un randament adecvat al procedurii, pacientul trebuie să prezinte o cale venoasă de acces cu un debit de cel puțin 30ml/min (vena jugulară internă, vena femurală sau vena subclavie). Pacientul este conectat la aparat prin intermediul unui sistem închis de tuburi de unică utilizare. Obișnuit, volumul prelucrat zilnic este de 10 litri de sânge (30-80ml/min), utilizând drept anticoagulant soluție de citrat ACD-A, în proporție de 1:12. În funcție de numărul de celule stem CD34+ recoltate printr-o afereză, procedura se repetă până la obținerea grefonului dorit. La 8 pacienți și la 5 donatori sănătoși s-a obținut un grefon de > 3 x 106 celule CD34+/kg dintr-o singură afereză.

5. Prelucrarea produsului recoltat. Aceasta constă în:

a. standardizarea volumului la 150 ml suspensie celulară per pungă prin adaos de DMSO și albumină 4% până la o concentrație finală de DMSO de 10%;

27

b. prepararea eșantioanelor de control din produsul recoltat. Din aceste eșantioane se realizeaza următoarele determinări:

– numărarea celulelor CD34+/kgc prin citometrie în flux (metodele ISHAGE și PROCOUNT). Valorile obținute pentru o afereză au variat între 0,04 și 19,24 x 106/kgc primitor celule CD34+ la recoltare;

– teste de viabilitate directă cu albastru de tripan 0,4%. Valorile obținute au fost 97 – 99% la recoltare;

– teste de capacitate funcțională a celulelor mononucleare recoltate prin cultivarea lor în agar moale pentru determinarea numărului de CFU-GM. Din eșantionul recoltat, celulele mononucleare se separă în gradient de densitate, într-un amestec Ficoll-Hypaque cu densitate de 1.077g/ml. După două spălări succesive, celulele se resuspendă în mediul de cultură și se numără într-o cameră de numărat (hemocitometru). Se calculează numărul de celule pentru o plăcuță de cultură și apoi se cultivă celulele în monostrat de metilceluloză, în prezența factorilor de creștere hematopoietici. Culturile sunt incubate timp de 12-14 zile la 37oC în atmosferă de CO2 5% și umiditate maximă. Pentru citirea coloniilor care apar în acest interval de timp se folosește un microscop inversat. Aglomerările de mai mult de 40 de celule se consideră colonii, iar acelea formate din mai puțin de 40 de celule se consideră grupuri sau clusters.

– control bacteriologic (hemocultură) pentru germeni aerobi și anaerobi și fungi.

6. Congelarea programată în congelator cu azot lichid MiniDigitCool până la temperatura de -196oC;

7. Stocarea în azot lichid în cuve ESPACE 200;

În Centrul de Hematologie și Transplant Medular din Institutul Clinic Fundeni au fost efectuate din 2001 până în decembrie 2005, 43 de transplanturi de celule stem hematopoietice.

Grefoanele administrate au dus la refacerea hematopoiezei într-un interval

28

de 7 – 20 zile de la administrare. TCSH nu este o procedură chirurgicală. Este o perfuzie de produs sanguin labil (PSL) obținut prin procedură specială, prelucrat după protocoale specifice pentru obținerea unui grefon de calitate. Obținerea unui grefon de calitate implică o monitorizare susținută a donatorului în perioada de dinaintea recoltării și în timpul recoltării și determinări convenționale de bacteriologie sau de înaltă performanță, cum ar fi citometria în flux, culturi de celule stem hematopoietice din concentratul de celule care urmează a fi transplantat.

29

6. TERAPIA CU CELULE STEM MEZENCHIMALE

Organismul uman are capacitatea de a se autorepara, de a regenera țesuturile deteriorate, proces în care un rol important îl dețin celulele stem, acestea determinând formarea diferitelor țesuturi în caz de necesitate. Efectuarea cercetărilor îi aparține savantului rus A. Fridenștein, care în 1960 a inițiat studierea acestor elemente ca celule predecesorii hematopoietice și stabilirea rolului lor în regenerarea altor țesuturi.

În prezent, terapia cu celule stem constituie o direcție nouă în medicina modernă, numită medicina regenerativă, care include transplantarea celulară pentru tratamentul diverselor maladii. Strategiile de bază ale medicinei regenerative sunt terapia celulara, terapia genică și ingineria tisulară.

Medicina regenerativă este un domeniu în plină afirmare al biotehnologiei, reprezentată de tehnicile de top care vizează refacerea anatomică a țesuturilor deteriorate sau degenerate și reechilibrarea lor funcțională. În ultimul deceniu, se acordă atenție utilizării materialelor embrionare, culturilor celulare pentru optimizarea și activizarea proceselor de regenerare suprimate sau înlocuirea defectelor tegumentare ca rezultat al eliminării pe cale chirurgicală sau al unui traumatism de țesuturi, cum sunt oasele, pielea și mușchii. În prezent, transplantologia clinică se confruntă cu probleme de ordin etic, costul major al intervențiilor chirurgicale legate de obținerea materialului pentru transplantare, organe sau grefe transplantate.7

Descoperirile de la sfârșitul secolului XX, realizate în biologia moleculară și celulară, deschid noi perspective pentru dezvoltarea biotehnologiilor noi, care va permite tratamentul patologiilor greu de vindecat. O direcție promițătoare constituie cultivarea celulelor stem pluripotente și a celulelor predecesorii ale diferitelor structuri tisulare, separate din țesuturi embrionare, fetale și din organismul matur. Diferențierea celulelor stem in vitro permite obținerea materialului biologic necesar pentru tratamentul de substituție a diferitelor maladii. Este necesară elaborarea tehnologiilor de obținere a unui material celular cu

7 P. Ciobanu, G. Ghidirim, V. Nacu, I. Sroit, Optimizarea regenerării reparatorii a țesuturilor și imunogenezei locale în contextul funcționării nanosistemelor naturale. Chișinău. „Tipografia Centrală”, 2011: 336.

30

capacitate de regenerare și fără efecte antigenice pronunțate, care conduce la rejetul grefei transplantate.8

Numeroase cercetări evidențiază faptul că celulele din măduvă osoasă, crescute în laborator în condiții specifice, se dezvoltă în celule osoase, cartilaginoase, adipoase și musculare. Astfel, celulele măduvei osoase sunt o sursă pentru celulele hematopoietice și pentru cele mezenchimale, a căror dezvoltare poate fi direcționată în formarea in vitro a celulelor necesare. După modificarea corespunzătoare și vaccinarea în mediul respectiv, aceste celule restabilesc integritatea morfologică și funcțională a țesuturilor în regiunea administrării.

Scopul studiilor este de a cerceta proprietățile materialelor biologice, monocomponente și compozite cu substrat celular ca remedii pentru restabilirea defectelor țesuturilor și organelor afectate.

Obiectivele de cercetare:

1. Studierea posibilităților de obținere a celulelor din măduvă osoasă, sânge ombilico- placentar și periferic; studiul in vitro al capacităților de diferențiere în diverse tipuri de celule caracteristice diferitelor țesuturi.

2. Evaluarea capacităților de proliferare a celulelor mononucleate și elucidarea duratei viabilității celulelor din măduvă osoasă și din sângele ombilico- placentar in vitro.

3. Elaborarea unei grefe compozite celulare și matrice osoasă demineralizată pentru optimizarea procesului de consolidare osoasă dereglat.

4. Studiul comparativ al capacității grefelor celulare din măduvă osoasă, celulelor ombilico- placentare, autoos morselat și grefe compozite, celulare cu Matrice Osoasă Demineralizată de recuperare.

5. Stabilirea indicațiilor și contraindicațiilor utilizării grefelor celulare și celor de țesuturi în tratamentul defectelor tisulare.

8 H. Mizuno, M. Tobita, Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine, Stem Cells, 2012.

31

6. Determinarea proprietăților antigenice și influenței celulelor embrionare osteomedulare implantate în organism asupra reactivității imunologice în cazuri de fracturi experimentale.

Celulele predecesorii pot fi :

1.Totipotente

Celulele totipotente sunt celulele din care se poate dezvolta orice tip de celule prezente în organismul uman. După fecundarea ovulului, zigotul se divide, formând celule identice, iar fiecare din ele, dacă ar fi implantate în uter separat, ar putea da naștere unui embrion. În aproximativ 4 zile de la fecundare, se formează blastocitul cu stratul extern, din care se dezvoltă placenta, iar din masa celulară plasată intern se dezvoltă organele și țesuturile embrionului.

2. Pluripotente

Celulele pluripotente sunt descendente ale celulelor totipotente. Celulele pluripotente se obțin din masa celulară internă a blastocitului sau de la embrionul, din regiunea în care se dezvolta gonadele sau celulele fetale. Acest tip de celule se numesc embrionare. O altă metodă de obținere a celulelor pluripotente poate fi efectuată prin inocularea nucleului unei celule somatice în ovul denucleat, din care poate să se dezvolte un embrion – clonarea.

3. Multipotente

Celulele multipotente sunt cele care produc celule dintr- o singură familie, progenitoare ale celulelor din diferite țesuturi, cum ar fi celulele stem hematopoietice, responsabile de înnoirea continuă a celulelor sangvine, din care se dezvoltă eritrocitele, limfocitele, leucocitele. Celulele stem sunt prezente nu numai în țesuturile embrionului, dar și în ale nou- născutului și ale celui matur.

Surse pentru obținerea celulelor stem

Autocelulele, considerate unul dintre cele mai importante materiale pentru

32

terapia cu celule și inginerie tisulară. O sursă sigură de celule predecesorii este măduva osoasă, bogată în celule progenitoare, astfel se cercetează posibilitatea utilizării lor în optimizarea procesului reparator în diferite țesuturi în caz de afectare.9 Concomitent, există tehnologii de obținere a celulelor stem din sângele periferic, după administrarea prealabilă a preparatelor hematopoetice, ce stimulează exodul celulelor stem din mâduva osoasă în patul sangvin, apoi, folosind utilajul special, are loc separarea și utilizarea lor pentru transplantare. Avantajele utilizării autocelulelor sunt evidente prin lipsa conflictului imun (rejecția grefei); este redusă posibilitatea de contaminare a pacientului cu maladii hematotransmisibile, această utilizare fiind favorabilă din considerente etice. Dezavantajul constituie limita de vârstă la care este rezonabil de cultivat autocelule. Se consideră că la făt unei celule stem îi revin 10 000 celule sangvine, la vârsta de 15 ani – 1:100 000, la 50 de ani 1:500 000. Exista studii despre posibilitatea obținerii celulelor stem din țesut adipos, mucoasa nazală.

La autocelule pot fi atribuite celulele din sângele cordonului ombilical, amnion, țesuturile ombilico- placentare, lichidul amniotic care se colectează la nașterea fătului, din care se separă celulele stem și se crioconservează, pâstrându- se la temperaturi joase timp îndelungat.

Grefele celulare alogene – sunt grefele obținute de la donator de aceeași specie. În acest tip de celule se includ celulele din măduvă osoasă, din sângele cordonului ombilical, care reprezintă celulele compartimentelor hematopoietic și limfopoietic ale măduvei osoase, celule sușe pluripotente și celule adulte eritrocitare, granulocitare, trombocitare, monocitare, limfocitare, plasmatice. Transplantarea celulelor alogene hematopoietice se utilizează pentru tratamentul unor maladii sangvine – anemii congenitale, leucemii, maladii cu dereglări de metabolism sau insuficiență imunitară. O cerință dificil de asigurat în efectuarea acestei transplantări, este compatibilitatea între HLA a recipientului și a donatorului. Din cauză polimorfismului sistemului HLA sunt create bănci de țesut prin care se face selectarea pacienților și donatorilor, însă nu întotdeauna este posibila găsirea donatorului.

9 P. Ciobanu , G. Lavrișceva, Stimularea osteogenezei prin celule osteomedulare în complicațiile la fracturi. Chișinău, 1989: 200.

33

Celulele fetale au atras atenția transplantologilor prin faptul că țesuturile embrionare nu au un sistem imun format care micșorează posibilitatea complicațiilor după transplantare. O parte din celulele ce constituie acest țesut sunt slab diferențiate, dispun de un grad mare de proliferare fiind capabile să formeze colonii de celule care participă la regenerarea organului. Aceste capacități ale țesutului fetal și sistemul imun imatur asigură un efect terapeutic adecvat, fără agresivitate imună a celulelor transplantate față de recipient. De obicei, aceste celule sunt obținute din materialul embrionilor umani de 9- 12 săptămâni.

Culturi celulare ombilico- placentare umane.

Ideea creării unor bănci de sânge ombilical a apărut din mai multe considerente: colectarea sângelui ombilical este ușor de efectuat, astfel nu afectează donatorul, iar părinții pot stoca la nașterea copilului celule stem hematopoietice, care pot fi păstrate un timp îndelungat, nelimitat. Transplantarea celulelor stem, obținute din sângele ombilical de la soră, a fost efectuată în 1988 la un copil de 6 ani cu anemie Fanconi. Până în prezent au fost efectuate peste 3000 de transplantări celulare din sângele cordonului ombilical la copii și la maturi.

Culturi celulare xenogene.

Este un aspect mai puțin cercetat în lume în ceea ce privește utilizarea lor în terapie. Aceste culturi sunt utilizate în procesul de cercetare în virusologie, bacteriologie. În Republica Moldova au fost efectuate cercetări experimentale privind eficacitatea utilizării celulelor osteomedulare obținute din embrionii de pasăre, găină sau prepeliță și utilizate în tratamentul pacienților cu deficiențe ale aparatului locomotor, marcând succese considerabile.

Direcțiile de cercetare privind utilizarea celulelor stem în terapia celulară

În ultimii ani, datorită unor cercetări fundamentale de succes care permit cultivarea diferitelor tipuri de celule, se dezvoltă transplantarea celulară în scopul cercetărilor fundamentale și a utilizării în terapia patologiilor organismului uman. In prezent se studiază procesul de diferențiere a țesuturilor și a celulelor; elucidarea

34

mecanismelor în embriogeneza țesuturilor și a organelor; studierea interacțiunii diferitelor celule; formarea organelor in vitro; modelarea bolilor genetice umane; studierea mecanismelor de îmbătrânire și posibilitatea întineririi țesuturilor; obținerea himerelor genetice pentru studierea mecanismelor imunității, rejetelor tisulare imune.

Domeniile posibile de utilizare a celulelor stem sunt: hematologie; cardiologie; endocrinologie; dermatologie; oncologie; patologii ale sistemului nervos central și periferic; hepatologie; oftalmologie; otorinolaringologie; ortopedie și traumatologie.10

Funcția specifică morfogenetică a celulelor stem permite reglarea proceselor reparatorii în diferite organe – rinichi, ficat în afecțiuni toxice, ateroscleroză, osteoartroze, pseudoartroze, distrofii osoase. Sunt efectuate cercetări pentru creșterea dinților prin metoda ingineriei tisulare, care se realizează prin dentogeneză directă, când de la embrion se colectează mugurele dentar si dentogeneză indirectă, când formarea dintelui se realizeaza extraalveolar.

În pofida cu privire la eficacitatea, siguranța și oportunitatea utilizării celulelor stem în terapia umană, se lărgește spectrul lor în clinică: tratamentul bolilor sangvine, cum sunt leucemiile, anemiile, bolile metabolice; tratamentul bolilor congenitale imunodeficiente; corecția stărilor imunodeficitare după chimioterapie și radioterapie; tratamentul maladiilor genice metabolice sau degenerative; tratamentul insuficienței hepatice acute, cirozei maladiilor congenitale metabolice ale fi catului; tratamentul miodistrofiilor; tratamentul maladiilor degenerative ale sistemului nervos, ictusului cerebral, parchinsonismului; tratamentul maladiilor genetice și degenerative ale sistemului reproductiv; tratamentul diabetului insulinodependent; tratamentul bolilor degenerative ale pielii, mucoasei, cartilajului.

Firma biotehnologică Osiris Therapeutics a obținut tulpini de celule stem mezenchimale din bioptate ale măduvei osoase de la donatori. Din bioptat se obțin

10 G. Ferrari, F. Mavilio, Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science, 1998.

35

aproximativ 1 mil. de celule stem care se multiplică prin cultivare până la 500 mil., ulterior aceste celule sunt administrate în fluxul sangvin al pacienților după radio, chimioterapie, pentru a stimula formarea coloniilor de celule progenitoare în măduva osoasă a pacientului, întru restabilirea hematopoezei și rezervelor de celule stem în măduva osoasă.

Mecanismul de acțiune

În mare măsură, mecanismul de acțiune a celulelor transplantate rămâne neelucidat până la sfârșit, iar folosirea practică a metodei anticipează argumentarea științifică. S-a observat că după transplantarea celulară se activizează proliferarea celulelor lojei recipiente și restabilirea parțială sau integrală a structurii și funcției organului. Acțiunea morfoinductivă se argumentează prin eliminarea citochinelor de către celulele transplantate și interacțiunea intercelulară cu celulele gazdă. Astfel, celulele embrionare de la donator formează colonii în organele afectate ale recipientului și înlocuiesc celulele deteriorate ale organismului formând țesut funcțional morfologic corespunzător regiunii afectate.11

In 1998, cercetătorii Tompson și Gherhard au obținut tulpini imortale de celule stem, iar un an mai târziu revista Sciens a apreciat această descoperire ca fiind a treia după importanță, după descifrarea spiralei ADN și genomului omului. Numai 10-20% din cei care necesită transplant de organ se tratează, 70-80% decedează fără a obține tratamentul necesar, fiind pe lista de așteptare a transplantelor. Este în interesul milioanelor de oameni efectuarea investigațiilor în acest domeniu.

Ideea utilizării culturilor celulare osteomedulare embrionare în tratamentul diferitelor afecțiuni ale aparatului locomotor a fost lansată în țara noastră în anul 1971 de către profesorul Pavel Ciobanu împreună cu conferențiarul Nicolae Cereș. Ei și-au propus utilizarea celulelor embrionare în calitate de stimulatori ai procesului de consolidare a fracturilor. În anul 1975, problema a fost examinată la Consiliul științific al Institutului de Cercetări Științifice în Traumatologie și Ortopedie din Moscova, fiind evaluată ca metodă de perspectivă, recomandându- se continuarea cercetărilor în cadrul USMF „Nicolae

11 V. Nacu, Optimizarea regenerării osoase posttraumatice dereglate, Chișinău: „Tipografia Sirius”, 2010.

36

Testemițanu”. Au fost efectuate experimente, in vitro și in vivo pe animale. Ulterior, a fost utilizată în clinică la pacienții cu consolidare lentă a fracturilor, pseudoartroze și osteomielită post- traumatică a oaselor lungi.

Un alt aspect al transplantării celulare a fost promovat de profesorul Șroit și colaboratorii, care au propus utilizarea autolimfocitelor activate în tratamentul afecțiunilor inflamatorii în Otorinolaringologie, Ginecologie, Oftalmologie.

În urma studiilor fundamentale și aplicative au fost elaborate mai multe publicații științifice, 13 monografii, 206 articole publicate în reviste internaționale și naționale recenzate, dintre care 16 în reviste cu factor de impact, Pubmed. Autorii au fost citați în reviste internaționale de 136 de ori, au obținut 121 de brevete de invenții. Rezultatele cercetărilor au fost apreciate în cadrul Expozițiilor Naționale și Internaționale cu 24 medalii de aur, 18 medalii de argint, 14 medalii de bronz și 12 diplome de excelență.

Cercetările efectuate pe parcursul celor 30 de ani au condus la crearea Laboratorului „Inginerie tisulară și culturi celulare”, în anul 2007, și a unui obiect nou de studiu „Medicină regenerativă”, în cadrul USMF „Nicolae Testemitanu” în anul 2011.

Progresele în cercetările biomedicale și mediile stricte de reglementare contribuie la dezvoltarea de trialuri clinice pentru terapia bazată pe celule stem. Oamenii de știință și clinicienii nu trebuie să aibă o perspectivă hematocentrică pentru utilizarea celulelor din sângele cordonului ombilical și din țesutul cordonului ombilical, deoarece studiile clinice recente lărgesc potențialul celulelor stem neonatale pentru aplicații clinice în afara hematopoezei.

Diabet de tip 1

Diabetul de tip 1 este o afecțiune autoimunitară ce provoacă distrugerea celulelor pancreatice beta producătoare de insulină prin celule T. Această afecțiune este ținută sub control de pacienți prin administrarea de insulină exogenă pe întreaga durată a vieții. În urma unor studii in vitro și in vivo pe animale, a avut loc un test clinic sub supravegherea dr. Haller de la Universitatea din Florida, SUA, în cadrul cărora 15 copii au primit infuzii din propriile celule extrase din sângele cordonului ombilical.

37

La trei-șase luni după infuzie, toți pacienții au demonstrat încetinirea pierderii producției de insulină endogenă si doze de insulină mai scăzute, nivele HbA1c îmbunătățite și o creștere a celulelor T, sugerând un potențial efect imuno- modulator ca mecanism de acțiune pentru acest tratament. Deși evaluarea realizată după 1 an de la infuzie a confirmat securitatea terapiei autologe cu sânge din cordonul ombilical pentru diabetul de tip I, nu s- au observat îmbunătățiri semnificative ale producției endogene de C- peptide, a necesarului de insulină, nivelurilor HbA1c sau modificari ale rapoartelor fenotipurilor de celule T sau titrului de anticorpi. S- a sugerat că doza de celule și multiplele infuzii de celule din sângele cordonului ombilical ar putea fi necesare pentru a îmbunătăți echilibrul glicemic la pacienții cu diabet de tip I .

Lupus eritematos sistemic

Lupusul eritematos sistemic (SLE) este o afecțiune autoimună cronică provocată de producerea de anticorpi împotriva țesuturilor conjunctive, care inflameaza pielea, articulațiile și rinichii, dar si alte organe. La Universitatea de Medicină din Nanjing, China, s- a raportat recent efectuarea unui test clinic eficient pe 16 pacienți cu SLE rezistenți la terapia standard, la primirea transplantului alogeneic de MSCs derivate din cordonul ombilical. La 15 luni după transplant, toți pacienții au experimentat o ameliorare semnificativă a afecțiunii, înregistrată de indexul activității afecțiunii SLE și a funcțiilor renale, rezultate serologice îmbunătățite, anticorpi antinucleari, anticorpi anti- ADN dublu catenari, complement C3, albumină, creșterea celulelor T și stabilizarea citochinelor pro-inflamatorii. Aceste rezultate inițiale încurajatoare vor fi urmate de un test clinic controlat aleatoriu.

Epidermoliza buloasă

Epidermoliza buloasă (EB) este o afecțiune mutativă genetică, ce provoacă un deficit al pielii în colagen, laminină, integrină sau plachină. Pacienții suferă de erupții veziculare la nivelul tegumentelor și mucoaselor. Un studiu clinic efectuat de Wagner și colegii săi de la Centrul de Cercetare al Universității din Minnesota au vizat pacienții cu transplant de celule stem din măduva osoasă și din cordon ombilical. Rezultatele preliminare

38

ale acestui studiu au arătat că pacienții au experimentat o ameliorare a afecțiunii cu reducerea veziculelor și producerea de piele sănătoasă.

Afecțiuni metabolice ereditare

Mulți pacienți cu afecțiuni metabolice ereditare experimentează degenerarea progresivă a sistemului nervos central. Transplantul de celule stem recoltate din sângele cordonului ombilical, măduva osoasă și sângele periferic, este utilizat pentru a trata pacienții cu afecțiuni metabolice ereditare cu tulburări de depozitare peroxisomală și lizozomală. Câteva studii preclinice și clinice au confirmat faptul că celulele derivate din sângele cordonului ombilical care conțin un nivel normal de enzime au un potențial ridicat de a migra către organe non- hematopoietice și de a declanșa corecția încrucișată a celulelor cu deficit de enzime ale beneficiarului și au o relevanță mare pentru regenerarea neurală.

Asfixia neonatală și paralizia cerebrală

Paralizia cerebrală este un termen generic care se referă la afecțiunile aparute în copilăria timpurie, afectând coordonarea mușchilor și mișcările corpului. Asfixia fetală, neonatală și cea post- natală realizeaza afecțiuni ale paraliziei cerebrale, din cauza leziunilor neurologice provocate. Pe lângă îmbunătățirile neurologice observate la pacienții tratați pentru afecțiuni metabolice ereditare, câteva studii preclinice au demonstrat că celulele stem derivate din sângele cordonului ombilical pot induce procese endogene de reparare neurală. Deși mecanismele precise ale acțiunii nu sunt confirmate încă, infuzia de celule din sângele cordonului ombilical după ischemia cerebrală a arătat că poate induce neurogeneză și aduce factorii trofici cu efecte neuroprotectoare la locul leziunii.

Un studiul clinic pilot efectuat la Universitatea Duke, SUA, evaluează în prezent siguranța celulelor din sângele cordonului ombilical la nou-născuți cu encefalopatie hipoxi- ischemică. Celulele stem din sângele cordonului ombilical au fost furnizate de 14 bănci private și în prezent 188 de pacienți cu vârsta între 1 săptămână și 9 ani au fost infuzați cu celule autologe din sângele cordonului ombilical cu o doză celulară minimă de 1 x 107 celule/kg. Infuziile au fost tolerate bine și nu s-au raportat încă efecte clinice adverse. Acești copii vor fi monitorizați pentru rezultate neuroevolutive și de imagistică funcțională

39

MRI, conform comunicatului de la Simpozionul Internațional Anual privind Transplanturile din San Francisco, iunie 2010.

Într- un studiu suplimentar a fost inițiat un test clinic al Colegiului Universității din Georgia, SUA, pentru copiii diagnosticați cu paralizie cerebrală, ai căror părinți au prelevat sânge din cordonul ombilical. Pacienții incluși au vârsta între 2 și 12 ani și prezintă dovezi clinice de dizabilități motorii non- progresive.

40

7.STUDIU DE CAZ: CELULE STEM PROVENITE DIN LICHIDUL AMNIOTIC

Medicina regenerativă care are ca bază studierea celulelor stem reprezintă noua ramură a medicinii contemporane. Obiectivul acestui domeniu de cercetare este de a identifica sursele de celule stem sau celule precursoare, fără dificultăți etice întîlnite în cercetarea celulelor stem embrionare. Medicina regenerativă este cea care revolutionează și continuă speranța de viață și calitatea acesteia. Dovada evoluției și progresului acestei ramuri esențială pentru viitor este Premiul Nobel pentru Medicină și Fiziologie din 2012, acordat unui medic japonez, Shinya Yamanaka și unui cercetător britanic, Sir John Gurdon în cercetarea celulelor stem, pentru descoperirea faptului că celulele mature pot fi reprogramate pentru a deveni pluripotente.12 Progresele din ultimii ani privind izolarea, caracterizarea și diferențierea celulelor stem, contribuie la dezvoltarea de terapii celulare utilizate în tratamentul unor boli considerate incurabile. Datorită faptului că testele genetice de rutină cu lichid amniotic sunt indicate frecvent, cunoștințele actuale privind compoziția și proprietățile acestuia sunt încă limitate.13

Celulele stem sunt celule nediferențiate sau nespecializate, având capacitatea de a se divide la infinit, aceasta proprietate fiind folosită ca pilon în căutarea unor noi metode de tratament pentru unele boli anterior incurabile. Sursele de celule stem pot fi utilizate la organismul adult, celulele embrionare, celulele canceroase, celulele de la nivelul cordonului ombilical, lichidul amniotic. Funcția biologică a celulelor stem adulte este de a contribui la procesul de vindecare, un exemplu îl reprezintă procesul de înlocuire a celulelor sangvine îmbătrânite cu celule stem hematopoietice din măduva osoasă. Astfel, în funcție de organele unde vor fi implantate acestea se pot transforma în celule osoase, hepatice, musculare, pulmonare, celule ale creirului, sangvine. Aceste celule au un ritm foarte alert de creștere, iar uneori evoluția lor nu poate fi ținută sub control. Lichidul amniotic este o sursa bogată de celule mezenchimale, iar celulele stem derivate sunt similare celulelor stem

12 L. Thadikkaran, D. Crettaz, S. Barelli, D. Gallot, V. Sapin, J. Tissot, Analyse proteomique du liquide amniotique, Immuno-analyse & Biologie Specialisee, 2007 : 359.

13 P. Bossolasco, T. Montemurro, L. Cova, Molecular and phenotipic characterization of human amniotic fluid cells and their differentiation potential, Cell Research , 2006: 329.

41

embrionare și adulte, care se diferențiaza în mai multe tipuri de celule. Celulele stem din lichidul amniotic pot fi stocate în bănci similar celulelor stem din sângele ombilical. Acestea dețin rata mare de multiplicare și pot fi exploatate fără pierderea integrității cromozomiale.

Cercetarea în domeniul utilizării celulelor stem adulte cu obiectiv terapeutic are un trecut de aproximativ 4 decenii. În anul 1978, Donall Thomas a descoperit introducerea intravenoasă a celulelor stem extrase din maduva osoasă asupra pacienților cu leucemie pentru care a primit Premiul Nobel. Această descoperire a fost revoluționară în tratamentul pacienților cu forme grave de boală, astfel încât metoda a început să înlocuiască în unele cazuri transplantul de măduvă osoasă. Celulele stem sunt utilizate ca bază pentru creșterea de organe, factor important pentru transplantologie, unde problema principală o constituie insuficiența permanentă a materialului de transplantat.

Cercetarile din ultimii ani au demonstrat faptul că celulele stem derivate din placenta umană au proprietăți de diferențiere multipotentă și imunogenitate slabă, astfel se explorează mecanismele prin care celulele stem din lichidul amniotic sunt utilizate în tratarea fibrozei pulmonare.

Celulele stem originare din lichidul amniotic au o capacitate de proliferare mai mare decît celulele stem din măduva osoasă. În componența citologică a lichidului amniotic se găsesc toate tipurile elementelor sangvine și celulele progenitoare tinere conform schemei hematopoiezei.

Celulele stem originare din lichidul amniotic prezintă un avantaj și anume modul de recoltare. Celulele embrionare sunt recoltate dintr- un embrion ce urmează să trăiască, celulele stem se recoltează din lichidul amniotic, care urmează a fi eliminat. Astfel este necesara studierea celulelor stem din fluidul amniotic pentru a studia particularitățile de proliferare și diferențiere pentru noi metode de tratament și evitarea erorilor terapeutice.

Studiul de caz reprezintă baza științifică pentru recomandarea stocarii la naștere a celulelor stem amniotice, alături de cele din sângele placentar, care vor fi utilizate pe parcursul vieții individului privind tratarea prin terapie celulară a unor boli considerate incurabile.

42

7.1.LICHIDUL AMNIOTIC

Lichidul amniotic sau fluidul amniotic a fost pentru prima dată studiat la începutul secolului XX, iar în anii ’60-’70 a existat un interes crescut în cultivarea și caracterizarea celulelor din lichidul amniotic. De altfel, lichidul amniotic era studiat pentru a determina starea fătului pe perioada sarcinii, dar începînd cu anii ’90 a aparut un interes deosebit față de celulele stem din lichidul amniotic.14

Lichidul amniotic reprezintă conținutul în care se află embrionul și fătul. Cavitatea amniotică este delimitată de membrana amniotică (amnios) , membrana corială și caducă, care se formează din luna a II-a de sarcină.

Lichidul amniotic înconjoară fătul pe parcursul dezvoltării intrauterine și creează condiții favorabile pentru dezvoltarea normală a fătului, protejează fătul, placenta și cordonul ombilical de traumatismele externe, menține temperatura constantă, permite acomodarea fătului în cavitatea uterină, protejează fătul de infecția ascendentă; funcționează ca sursă a lichidului și substanțelor nutritive pentru făt. De asemenea, cantitatea moderată a lichidului amniotic este necesară pentru dezvoltarea și maturizarea plămînilor fetali. În travaliu lichidul amniotic contribuie la deschiderea colului uterin, lubrefiază tractul genital, previne compresiunea cordonului ombilical și asigură repartizarea uniformă a contracțiilor asupra fătului. Modificările calitative și cantitative ale acestuia reflectă starea intrauterină a fătului și dezvoltarea copilului.

Hippocrate afirma ca lichidul amniotic iși are originea în urina fetală, mai tîrziu, Harvey studiază circulația lichidului amniotic, iar Bernard emite ipoteza ca lichidul amniotic iși are originea din surse materne, deoarece lichidul amniotic și serul sanguin sunt medii interne.15

14 K. Hartmann, O. Raabe, S. Wenisch, S. Arnold, Amniotic fluid derived stem cells give rise to neuron-like cells without a further differentiation potential into retina-like cells, Stem Cells, 2013 :108.

15 V. Cirigliano, G. Voglino, M. Canadas, Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR, Mol Hum Reprod, 2004: 839.

43

Lichidul amniotic este derivat atît din urina fetală cît și în rezultatul activității de perfuzie maternă a corioamnionului, în al doilea și al treilea trimestru fiind constituit în principal de urina fetală .(Figura 1)

Figura 1, Lichid amniotic.

Fiziologia lichidului amniotic.

Exista 5 mecanisme :

a. urina fetală;

b. deglutiția;

c. plămînii fetali;

d. membranele coriale și placenta;

44

e. derivatele epiblastului: pielea și straturile cordonului ombilical.

Contribuția urinei fetale:

Contribuția urinei fetale la formarea lichidului amniotic reprezintă sursa majoră de lichid amniotic, primele urini formându- se aproximativ în săptămâna a 11-a de amenoree, cea mai mare cantitate de urină se formează în a doua jumătate a sarcinii.

Participarea deglutiției :

Deglutiția se declanșează odată cu primele urini, la termen se deglutează aproximativ 700 ml/24 h, în momentul respirației și are un rol important în a doua parte a sarcinii.

Participarea plămânilor:

Plămânii reprezintă a doua sursă de lichid amniotic, fiind important în al doilea trimestru de sarcină, aproximativ 200- 400 ml/24 h.

Participarea pielii:

Pielea fătului are un rol important în reglarea volumului lichidului amniotic pe parcursul sarcinii. Importanța acestei căi este demonstrată de piederea transcutană înaltă a lichidului la copiii prematuri. Lichidul amniotic este în dinamică constantă și se reînnoiește la fiecare 3 ore, asigurând hidratarea fătului și nutriția acestuia.

Rolul lichidului amniotic :

mecanic;

senzorial;

nutrițional.

Volumul:

De obicei sarcina are o durata de 41 săptămîni de amenoree. Exista 2 etape în modificarea volumului:

45

pâna la 20 de săptămîni: creșterea progresivă a lichidului amniotic care este în corelație cu masa fătului.

după 20 de săptămîni: volumul rămâne constant până la săptămîna 33- 34 după care scade în jurul celei de a 39- a săptămâni.

După 34- 36 de săptămâni determinarea volumului de lichid amniotic devine dificilă din cauza că fătul înghite mai mult fluid. Limita superioară admisă în cursul unei gravidități normale este de 2000 ml pentru o limită inferioară la 250 ml, iar volumul lichidului amniotic este calculat ecografic.16

Căile de pasaj al lichidului amniotic:

Exista 2 surse primare și 2 rute primare de pasaj a lichidului amniotic începând cu al II- lea trimestru de sarcină. Sursele primare sunt constituite din urina fetală și lichidul pulmonar, cu o contribuție mică a secretului cavității bucale și nazale, iar rutele primare le constituie deglutiția de către făt și absorbția în sângele fetal.

Calea finală a schimbului, denumită transmembranară este cea între lichidul amniotic și sângele matern din peretele uterului, iar calea între lichidul amniotic și sângele fetal de pe suprafața fetală a placentei este denumită intramembranară, care include toate schimburile pasive între lichidul amniotic și sângele fetal din alte structuri anatomice: pielea fătului și cordonul ombilical.

Compoziția LA:

96,4 % apă; densitatea 1,006; pH 7,10- 7,20; vîscozitate 1; pH-ul este metoda de diagnostic privind starea fătului intrauterin, iar pHul 6,9-7,0 ne avertizează că fătul este în hipoxie.

16 R. Bartl, L. Thomas, Blood Cell Differential Count. In Clinical Laboratory Diagnostics, Frankfurt/ Main, 1998: 509.

46

Compoziția biochimică:

Analiza biochimică a lichidului amniotic oferă informații unice privind starea fătului. În prima jumătate a sarcinii chimia fluidului extracelular al fătului se menține, iar în a doua jumătate acesta reflectă dezvoltarea funcției renale.

Elemente minerale: Na, K, Ca, Mg, Cl, P, bicarbonați, oligoelemente (Fe, Cu, Zn, Bi) .

Pe parcursul sarcinii cantitatea de anioni și cationi este diferită. Na este responsabil de menținerea a 99 % a osmolarității, astfel pînă în săptămîna a 20- a osmolaritatea scade. Începînd cu săptămîna a 20- a procesul de keratinizare este dificil datorită traversării libere a lichidului prin pielea fătului, iar producția urinară devine preponderentă în componența lichidului amniotic. Rinichiul fetal are o concentrare a urinei slabă, astfel urina fetală este hipoosmolară în raport cu plasma maternă și fetală. Prin urmare, exista un deficit osmotic constant de 30 mOsm/kg în raport cu serul maternal sau fetal.

Elemente organice : acizii aminați: alanina, glutamina, prolina, valina, lizina, treonina, glicina. În primul trimestru al sarcinii, compoziția aminoacidică a lichidului amniotic este comparabilă cu cea a urinei și sângelui fetal, iar în al doilea trimestru, compoziția este independentă de profilul urinar sau sângele fetal .

Enzimele :

Există mai multe tipuri de enzime:

1. diaminoxidaza se observă într- o concentrație ridicată dacă este crescută și în sângele mamei. Diaminoxidaza este o enzimă hepatică a degradării aminoacizilor, nivelul fetal fiind net superior celui matern, iar prezența acesteia în secreția cervico- vaginală realizează diagnosticul în formele atipice ale ruperii premature a membranelor pungii amniotice.

2. colinesterazele sunt formate din butilcolinesteraze și acetilcolinesteraze.

47

Butilcolinesteraza este prezentă în lichidul amniotic, acetilcolinesteraza fiind absentă în lichidul amniotic, însă prezența acesteia indică la un defect de închidere a tubului neural la făt.

3. enzimele digestive, prezența acestora depinde de fiziologia digestiei fetale. Săptămâna a 10- 13- a de sarcină este momentul deschiderii membranei anale și se realizează inundarea lichidului amniotic de către secrețiile acumulate în tubul digestiv.

Hormonii:

– corticosuprarenali : catecolaminele se observă la sfârșitul sarcinii, iar cortizolul este în concentrații variabile.

– prolactina: este secretată de celulele deciduale cu receptori doar la dopamină. Nivelul acesteia este scăzut până la 14 săptămîni, crescând între a 18- a și a 28- a săptămînă, aproximativ -3750 ng/ml, după care scade până la a 36- a săptămînă și rămâne constantă pînă la termen, de -500 ng/ml.

– pancreatici: insulina și glucagonul, care provin din urina fetală.

– tiroidieni: se observă la a 10- a săptămînă de sarcină.

– fetoplacentari: gonadotropina corionică, somatotropina, estrogenul, progesteronul sunt variabile în funcție de concentrația lor în serul matern și net inferioare.

Lipidele:

Originea lor nu este complet studiată, cu excepția fosfolipidelor tensioactive. Nivelul acestora crește în timpul sarcinii, fiind inferior valorii serice. Prostaglandinele au o valoare net superioară celei serice materne, fiind maxime la debutul travaliului. Pentru diagnosticarea patologiilor membranelor hialine sunt studiate lecitinele tensioactive. Acestea reflectă compoziția surfactantului pulmonar fetal secretat de pneumocitele de tip II, fiind constituite 75 % din acid palmitic, substanță biologic fundamentală care determină proprietățile fizice ale surfactantului pulmonar. Concentrația lipidelor tensioactive crește progresiv și atinge nivelul maxim la 35 săptămîni de sarcină. Acestea reflectă maturitatea

48

pulmonilor fetali.

Proteinele:

Nivelul maxim se observă la 24 de săptămâni după care scade pînă la 2,5 g/l către perioada nașterii. Una dintre cele mai importante fracții este 1α-fetoproteina, marker fetal produs de ficatul fetal, cu nivel ridicat în serul fetal, de 1000 de ori mai mare decât în lichidul amniotic și de 1 000 000 mai mult decât în serul mamei. Aceasta se observă începând cu a 10- a săptămînă de gestație, iar nivelul maxim îl atinge la 14- 15 săptămâni de sarcină, după care se diminuează progresiv. Fenomenul este explicat prin faptul că aceasta pătrunde în lichidul amniotic prin rinichii fetali imaturi, iar în momentul maturizării glomerulară această filtrație este blocată.17

Factorii de creștere:

Factorii de creștere epidermică EGF, IGF cresc progresiv pe parcursul sarcinii. Fibronectina se găsește în cantități mari în corion și lichidul amniotic, prezența acesteia în secrețiile vaginale este un marker că se scurge lichidul amniotic și se realizeaza ruptura membranelor.18

Citologia LA

Celulele prezente în lichidul amniotic au origine atît embrionică cît și extraembrionică. În urmă cu 40 de ani cercetătorii au încercat să caracterizeze aceste celule, astfel se disting 4 grupuri de celule:

1.celule eozinofile mari;

2.celule bazofile mari;

17 V. Cirigliano, G. Voglino, M. Canadas, A. Marongiu, Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on 18 000 consecutive clinical samples. Mol Hum Reprod. 2004: 840.

18 H. Hoehn, D. Salk, Morphological and biochemical heterogeneity of amniotic fluid cells in culture. Methods in Cell Biology, 1982 :11.

49

3.celule eozinofile mici;

4.celule bazofile mici.

Majoritatea celulelor lichidului amniotic sunt derivate din piele, tract digestiv, căile urinare, sistemul pulmonar al fătului și amnion. De asemenea unele celule sunt derivate de la mamă prin traversarea barierei feto- placentare. Există o diferențiere în evoluția compoziției citologice a lichidului amniotic chiar și după termenul de 20 săptămâni de sarcină.

Pe parcursul primelor 20 de săptămîni .

Nivelul maxim de celule se observă în perioada 16- 20 săptămâni de sarcină. La examinarea acestora se găsesc doua feluri de celule : fibroblastice și epiteliale, care își au originea din descuamarea amniotică sau cutanată.

Ultimele 20 de săptămîni:

Începînd cu săptămâna a 24- a, cantitatea de celule se diminuează, în special cele de descuamare. În această perioadă se observă o intensificare a celulelor care au structuri similare cu kerato- hialina și conținut dens cu membrana foarte fină. La microscopia electronică se observă că celulele din această perioadă sunt similare cu cele de origine fetală : epiderm, cavitate bucală, partea superioară a tractului respirator și epiteliul cordonului ombilical.

În cursul studiilor citologice au fost utilizate mai multe metode de colorare, în special: Papanicolau și Harris- Schorr. La colorarea cu sulfat de bleu de Nil 0,1 % în soluție apoasă se observă doua tipuri de celule colorate: celule oranj, determinate de prezența lipidelor neutre și celule albastre- deschis, datorate prezenței structurilor cu reacție acidă.

Raportul acestor celule în dependență de vârsta gestațională:

până la 34 săptămâni, de < 1%;

34-38 săptămâni, de 1-10 %;

50

după 38 de săptămâni, de 10-50 %.

Celulele moarte sau scuame sunt colorate cu sulfat de bleu de Nil, unele celule se colorează în oranj deoarece la suprafața lor există o peliculă fină de lipide neutre sau sebacee sau lecitina din componența surfactantului pulmonar. Astfel, aceste celule demonstreaza maturitatea sistemului pulmonar al fătului.

51

7.2.CELULELE STEM

Ființa umană, ca organism pluricelular este alcătuit din celule diferențiate, diferite prin formă, capacități, proteine exprimate, având aceeași origine: celula stem. Celulele mezenchimale sunt celule nediferențiate sau nespecializate și au capacitatea de a se diviza la infinit, producând cele 220 specii de celule umane. Aceste celule nu formeaza singure organismul uman, deoarece au pierdut omnipotența, devenind pluripotente.

Celulele stem sunt progenitori nediferentiati care au abilitatea de a se diviza si dezvolta în alte tipuri de celule specializate, capabile sa formeze țesuturi. (Figura 2)

Figura 2, Celule stem.

Tipurile de celule stem:

totipotente, celule din care se dezvoltă orice categorie de celule care sunt prezente în organismul uman;

52

pluripotente, celule descendente celulelor totipotente. Acestea se diferențiaza în toate categoriile celulare, excepție fiind celulele totipotente, care formează țesuturi din foițele embrionare, cum sunt endodermul, mezodermul și ectodermul. Celule pluripotente se obțin din masa celulară a blastocitului sau de la embrion, din locul dezvoltării gonadelor. Tulpinile celulare care se obțin prin cultivarea acestor celule se numesc embrionare și sunt identice.

multipotente, celule progenitoarele celulelor din diverse țesuturi.

oligopotente, celule care se diferențiaza în cîteva categorii de celule, cum sunt celulele limfoide sau mieloide.

unipotente, celule care produc o singura categorie de celule și au proprietatea de a se reînnoi, ceea ce le diferențiază de celulele non- stem.

Surse de celule stem :

organism adult;

celule embrionare;

celule canceroase;

celule de la nivelul cordonului ombilical;

lichid amniotic.

Funcția biologică a celulelor stem adulte :

În cazul în care un organ este lezat, celulele stem adulte se îndreaptă spre organ și contribuie la procesul de vindecare. În general, organismul uman depinde de celulele stem, de exemplu, eritrocitele trăiesc aproximativ 120- 130 de zile, după care îmbătrânesc și nu mai pot transporta suficient oxigen, astfel necesită înlocuire. Funcția de înlocuire este asigurată de celulele stem hematopoietice din măduva osoasă.

Limitele capacității de regenerare :

53

După un timp, celulele stem sunt supuse procesului de îmbătrânire, deținând un potențial de regenerare mai mare comparativ cu celulele diferențiate din organism; acest potențial este epuizabil abia după 130 de ani de viață. Până în prezent, cea mai în vârstă femeie din lume a trăit 122 ani, în Franța. Procesul de îmbătrânire nu poate fi oprit, însă medicina contemporană oferă posibilitatea extragerii celulelor stem din organism, selectării, concentrării și administrării în țesutul, organul sau pe suprafața afectată. În majoritatea cazurilor, procesul fiziologic de recuperare poate fi intensificat.

Posibilitățile curative ale celulelor stem adulte de diferite proveniente sunt studiate de o nouă ramură a științei, medicina regenerativa. Cercetările și aplicarea acestora include prepararea corespunzatoare a tesuturilor provenite din celulele stem embrionare și izolarea celulelor stem adulte din tesuturi. Popularitatea cercetarilor privind celulele stem adulte se datoreaza faptului că specialiștii prevăd posibilități terapeutice în tehnica cultivării țesuturilor si organelor în scopuri terapeutice.19

19 J. Wallach, Afecțiuni hematologice. În Interpretarea testelor de diagnostic, Ed VII, Trad. R. Ionescu, M. Dragomir, Ed. Științelor Medicale, Bucuresti, 1998: 462.

54

7.3.METODE DE CERCETARE

Materialul de studiu este lichidul amniotic, care a fost prelevat de către secția de Maternitate. De asemenea studiul se bazează pe analizarea rezultatelor altor studii științifice în acelasi domeniu.

Metode de colectare a lichidului amniotic

a. Amniocenteza.

b. Amniotomia.

c. Colectarea lichidului amniotic la expulzia fătului din camera posterioară.

d. Colectarea lichidului amniotic în timpul cezarienei.

a.Amniocenteza.

Amniocenteza a fost inclusă pentru prima dată în practică de către Bavis, în 1952 și Lilley, în 1961. Amniocenteza este o procedură invazivă realizata cu scopul efectuării testelor genetice. Aceasta se realizeaza la 16- 20 săptămâni de sarcină și constă în punctarea transabdominală a cavității amniotice după aprecierea localizării placentei.

Indicații:

antecedente obstetricale complicate;

izoimunizări severe, cum ar fi incompatibilitatea Rh dintre mamă și făt;

feți morți în antepartum;

prezența malformațiilor;

depășirea termenului nașterii;

suferință fetală;

55

diabet zaharat la mamă;

suspecție la boli genetice;

mame care au vîrsta mai mare de 35 de ani , fiind la prima sarcină.

Tehnica amnniocentezei:

Pacienta este informată despre etapele procedurii, inclusiv despre beneficii și riscuri. Amniocenteza se realizeaza în condiții de strictă sterilitate cu mănuși și instrumente sterile.

Pacienta este informată că înaintea procedurii vezica urinară trebuie golită în prealabil.

Pacienta se așează în poziția Trendelenburg.

Se analizează ecografic localizarea placentei, se aseptizează regiunea investigației în conformitate cu localizarea acesteia, plasarea uterului și contactul cu peretele abdominal. Aseptizarea se face cu alcool iodat sau betadina.

Se realizează anestezia locală cu xilină.

Se utilizeaza un ac special, prevăzut cu un obturator care evita încorporarea țesutului matern în cursul traversării straturilor abdomenului gravidei. Lungimea acului variază între 18 cm și 22 cm, iar grosimea de 0,8 mm, dar pot fi folosite și ace mai groase.

Se introduce acul pe linia mediană si se monitorizează trecerea fiecărui strat tactil și ecografic.

Când vârful acului ajunge în punga amniotică, se extrage obturatorul acului împreună cu 1ml de lichid amniotic care se aruncă, astfel se evita contaminarea cu țesut matern care ar putea ramîne pe ac, apoi se extrage o cantitate de lichid amniotic între 5 și 40 de ml.

56

Lichidul extras este apoi centrifugat și analizat.

Complicații posibile:

– Amniotită 1%;

– Scurgere de lichid amniotic 1-2%, de obicei se rezolvă în 2-3 zile;

– Avort spontan, procent care depinde de priceperea doctorului, datele raportate variind între 0,5% și 5%;

– Lezarea fătului;

– Lezarea placentei cu sîngerare intraamniotică;

– Izoimunizare Rh;

– Bradicardie fetală sau tranzitorie.

b.Amniotomia.

Amniotomia sau ruperea sacului amniotic reprezintă o procedură obstetricală efectuată unei femei în travaliu în sala de nașteri. Punga amniotica se sparge singură la deschiderea colului uterin de 4- 6 cm, în cazul în care colul uterin este deschis mai mult de 6 cm și punga nu se rupe se recurge la amniotomie.

Indicații :

pînă la naștere:

– sarcină după termen;

– toxicoza tîrzie;

– incompatibilitate Rh;

– contracții neefective de naștere.

57

după declanșarea nașterii:

– contracțiile de naștere slăbite;

– sacul amniotic rezistent;

– hidramnios;

– placenta inserată prea jos;

– tensiunea arteriala la mamă prea ridicată;

– colul uterin este deschis de 6-7 cm, ceea ce îngreunează avansarea căpușorului copilului în jos.

Tehnica:

Amniotomia se efectueaza când medicul este sigur că căpușorul copilului a coborît în bazinul mic, astfel fiind exclusă căderea cordonului care poate aluneca dacă amniotomia se face când capul copilului nu este angajat în bazinul mic. Amniotomia se realizează cu ajutorul amniotomului, care are forma unui cârlig de croșetat, de unică folosință sau reutilizabil. În calitate de amniotom poate fi folosită și pensa Kocher. În prezent în unele țări ca America,Germania, Franța se folosesc amniotoamele localizate care are forma unui degetar cu o pioneză.20

c.Colectarea lichidului amniotic din camera posterioară în timpul expulziei fătului:

În cazul în care apa s- a rupt la domiciliu se stabilește colectarea din camera posterioară când are loc expulzia fătului. Însă este necesară monitorizarea vaginului

20 M. Breton, Pratique actuelle de l’Amniotomie et Influence sur le déroulement du travail, etude comparative, au sein d’hôpitaux de niveau I, II et III , ecole de Sages-femmes de Metz, Université Henri Poincaré, 2010.

58

în prealabil de a nu contamina lichidul amniotic cu floră vaginală la expulzie. Acesta este colectat într- o tăviță pregătită în prealabil, iar mai apoi colectată în eprubetă și trimisă la laborator.

d.Colectarea lichidului amniotic în timpul cezarienei.

În timpul cezarienei se colectează o probă de lichid amniotic cu volumul de 5 ml, cu o eprubetă de unică folosință sterilizată.

Protocol de prelucrare a lichidului amniotic.

Se plasează în centrifugă eprubeta care conține lichid amniotic, paralel se pune o eprubetă cu apă distilată cu același volum.

Se centrifughează timp de 5 min la 18.000 rotații.

Se înlătură supernatantul.

Se înlătură din nou supernatantul, astfel încât să rămînă numai sedimentul.

Din acest sediment se pregătesc frotiuri.

Frotiurile se efectuează în picatură groasă cu pipeta și în strat subțire cu lamela.

Frotiurile sunt lăsate să se usuce la temperatura camerei, fiind în prealabil studiate la microscop ca material nativ.

Cînd sunt aproape uscate sunt puse în termostat la temperatura de 370 C timp de 10 min.

După aceasta frotiurile pot fi utilizate pentru colorații specifice sau native.

Pregatirea frotiurilor

Mai întâi se pregătesc frotiurile native, fără coloranți, care sunt studiate proaspete, de preferat umede, astfel se exclude folosirea uleiului de imersie și se observă mișcarea acestora în câmpul microscopic. Pentru a evidenția celulele se recurge la colorarea

59

acestora și în dependență de tip acid sau bază acestea primesc anumite culori. Prima data frotiurile se fixeaza cu alcool de 96 %, lamela este cufundată în alcool timp de 5 min, după care se usuca prin evaporare, iar ulterior se recurge la colorare.

Colorația după Romanovski- Giemsa:

Frotiul este fixat cu alcool de 96 % după care este colorat cu soluția pregătită. Soluția are următoarea compoziție: 1 ml colorant lichid+ 2 ml soluție de diluție de bază +47 ml de apă distilată. Timpul de colorare variază între 40 și 150 de minute, în dependență de frotiu. Se utilizează diluant fosfat, pH-ul acestuia depinde de obiectul cercetării: frotiu LCR 5,8- 6,0; frotiu sînge, LA 6,4-6,5. După aceasta frotiul este spălat sub jet de apă distilată și studiat la microscop cu ulei de imersie.

Colorația cu albastru de metilen:

Se folosește colorantul albastru de metil după fixarea cu alcool în prealabil. Se cunosc 2 metode de colorare: plasarea colorantului direct pe frotiu si plasarea unei hîrtii de filtru uscată, imbibată cu albastru de metil la care se adauga câteva picături de apă distilată. Colorantul se spală atent sub jet de apă și se usucă cu hîrtie de filtru, apoi se studiază cu ulei de imersie la microscopul optic.

60

7.4.REZULTATELE STUDIULUI

Celulele stem din lichidul amniotic prezintă un imunofenotip specific celulelor stem mezenchimale prin exprimarea markerilor CD29 , CD90 și CD73. Imunofenotipul CD29+/ CD90+/ CD105+/ CD133+/ CD146+ acestor celule, ne sugerează prezența unor markeri specifici și altor tipuri de celule, precum CD105 specific celulelor endoteliale și CD133 prezent pe suprafața celulelor stem hematopoietice și a celulelor endoteliale progenitoare. Datorita capacității ridicate de proliferare a celulelor din lichidul amniotic, imunofenotipul acestora se modifică după 10 zile în cultură, devenind CD29+/CD90-/CD105-/CD133-/CD146+.

La nivel molecular AFC- urile prezinta markeri de celule stem mezenchimale, ACAN, BGLAP, COL2A1 si PPARG si markeri transcriptomici specifici celulelor stem embrionare, cum ar fi OCT4, REX1 sau SOX2. Însă există și markeri specifici celulelor stem hematopoietice, precum CD3D, CD4, CD8A sau MME si a celulelor stem neurale, cum ar fi NCAM1, SIGMAR1 si S100B. Aceste rezultate ne conduc spre ipoteza prezentei unui numar limitat de markeri specifici tuturor liniilor celulare la nivelul celulelor stem. Acest fenomen ar putea fi corelat cu potentialul de diferentiere, ca rapuns la stimuli externi prin existenta unor molecule care conduc diferentierea în functie de stimulul aplicat. Totodata, AFC- urile prezinta capacitatea de diferentierea catre linia endoteliala. Acestea se pot diferentia în celule cu imunofenotip specific celulelor endoteliale mature asa cum a fost demonstrat prin tehnica citometriei de flux, de prezenta markerilor endoteliali CD31, CD105 si CD144. Un element de noutate îl reprezintă analiza ultrastructurală a AFC- urilor diferentiate care a demonstrat prezența structurilor intracelulare specifice celulelor endoteliale precum veziculele plasmalemale și corpusculii Weibel- Palade.

Astfel, aceste celule au capacitatea de a fi ghidate către o linie endotelială, devenind celule endoteliale mature cu structurile necesare unei posibile îndepliniri a funcțiilor acestora, cum sunt veziculele plasmalemale implicate în procesele de transcitoză.

S- au obținut 15 culturi de celule stem din lichidul amniotic, la 14 culturi

61

primare din probele independente în ziua a 3- a s- au numărat între 4 și 8 celule aderate într-o zonă distinctă. După aceasta fiecare celulă a fost notată ca ,,celulă de pornire’’ pentru extinderea coloniilor celulare. Au fost lăsate să crească timp de 48 h, astfel fiecare colonie conținea aproximativ 100- 300 de celule. Fiecare celulă a rămas echidistant de la alte celule din cadrul aceleeași colonii, cele mai multe celule fiind în perioada de metafază, iar morfologic aceste celule sunt similare cu celulele fibroblastice. Mai apoi fiecare cultură a fost separată și reînsămînțate într-o cultură cu 24 godeuri. La 3- 4 zile de la însămânțare cultura clonală a crescut la 70 % astfel că se numărau 30.000- 35.000 de celule. Prin urmare, utilizand această metodă, dintr- o celulă Hafs clonală se pot obține 1010 celule, populația fiind derivată în câteva săptămâni.

Astfel această metodă de rastartare a celulelor este o abordare simplă pentru a oferi celule stem de calitate care corespund cerințelor terapeutice.

62

CONCLUZII

Celulele mezenchimale stem (MSC) sunt cunoscute ca celule medulare stromale sau celule progenitoare mezenchimale, definite ca celule progenitoare multipotente care se autoreînoiesc cu o capacitate de diferențiere într-o serie de linii celulare, cum ar fi țesut conjunctiv scheletal (osos, cartilaginos, stromă reticulară a măduvei osoase roșii, adipocite). Aceste date sugerează că MSC pot da naștere mușchiului striat cardiac și scheletic, celulelor endoteliale și celulelor de origine non mesodermală, cum sunt hepatocitele, celulele sistemului nervos (neuroni și neurogliei), celulele epiteliale. Astfel termenul de pluripotent și multipotent sunt reciproc utilizate în descrierea capacității de diferențiere a MSC într-un spectru larg de țesuturi.

Inițial MSC au fost identificate în măduva roșie osoasă și apoi în țesutul muscular, adipos și conjunctiv. Capacitatea de diferențiere a MSC se diminueaza cu creșterea vârstei. De aceea s-au căutat alte surse alternative de MSC, cum sunt lichidul amniotic, placenta sângele ombilical, venele ombilicale, țesutul conjunctiv al cordonului ombilical, mezenchima pulpară a dinților deciduali.

De asemenea au fost studiate și structurile fetale ca surse de MSC, astfel în perioada mijlocie de gestație s-au obținut grefe din splină, pulmoni, pancreas, rinichi. Unii autori confirmă că MSC sunt afiliate vaselor, fiind amplasate perivascular constituie un depou de MSC ce se extinde prin tot organismul și activeză cu rol de reparator tisular, stabilizează vasele sangvine și mențin homeostazia tisulară .

Având ca avantaj lipsa problemelor etice MSC se plasează ca cei mai promițători candidații în terapia celulară, bioinginerie și terapii cu celule stem pentru multe boli umane severe.

Celulele stem mezenchimale (MSC) din măduva osoasă au fost intens studiate pentru proprietățile lor regenerative și imunomodulatoare. Studiile pe modele animale au arătat că tratamentul cu MSC îmbunătățește funcția cardiacă în urma infarctului miocardic

63

prin scăderea apoptozei și producerea de factori angiogeni. Deoarece capacitatea de diferențiere a MSC în CMC este foarte scăzută și nu poate explica efectul benefic tranzitoriu al transplantului acestora la locul infarctului observat în studiile preclinice sau clinice, acest efect a fost pus pe seama efectului paracrin al acestor celule. Acestea sunt capabile să elibereze factori solubili (citokine, chemokine, factori de creștere) care să acționeze într-o manieră paracrină asupra celulelor miocardului lezat. Recent a fost demonstrat că MSC sunt capabile să comunice cu celulele învecinate prin intermediul unor fragmente membranare circulare, numite microvezicule. Astfel, MSC pot secreta diverse componente solubile, precum receptori, factori de creștere, lipide biologic active, dar și acizi nucleici, ARN mesager și microARN protejate de acțiunea agresivă a mediului extracelulular.

MSC prezintă o serie de avantaje pentru utilizarea lor în medicină regenerativă, deoarece ele pot fi izolate cu ușurință și propagate în cultură pentru a obține un număr mare de celule, adecvat pentru terapia celulară; au imunogenicitate scăzută, ceea ce le face potrivite și pentru transplantul alogen și datorită acestui fapt sunt evitate problemele de etică adiacente altor tipuri de celule stem utilizate pentru transplant, precum celulele stem embrionare.

64

BIBLIOGRAFIE

1.Adamson TM, Brodecky V, Lambert TF. The production and composition of lung liquid in the in-utero foetal lamb. In Comline RS, Cross KW, Dawes GS (eds): Foetal and Neonatal Physiology. Cambridge University Press, 1973.

2.Amendola D, Nardella M, Guglielmi L, Cerquetti L, Carico E, Alesi V, Porru M, Leonetti C, Bearzi C, Rizzi R, D’Agnano I, Stigliano A, Novelli G, Bucci B, Human placenta-derived neurospheres are susceptible to transformation after extensive in vitro expansion. Stem Cell, 2014.

3. Bachi Modena Alberto ,Fieni Stefania, Amniotic fluid dynamics, Acta Bio Medica Ateneo Parmense 2004.

4. Bartl R, Thomas L. Blood Cell Differential Count. In Clinical Laboratory Diagnostics, First Edition, Frankfurt/Main, 1998.

5. Beall M.H, Van den Wijngaard JPHM, Van Gemert MJC, Ross MG. Regulation of Amniotic Fluid Volume. Placenta. Aout-septembre 2007.

6. Breton Marie, Pratique actuelle de l’Amniotomie et Influence sur le déroulement du travail, etude comparative, durant l’année 2010, au sein d’hôpitaux de niveau I, II et III , ecole de Sages-femmes de Metz, Université Henri Poincaré, Nancy I ,2010.

7.Bossolasco Patrizia, Montemurro Tiziana, Cova Lidia et al.,Molecular and phenotipic characterization of human amniotic fluid cells and their differentiation potential, Cell Research, 2006.

8.Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W., Weber J.M., Olson D.P., Knight M.C., Martin R.P., Schipani E., Divieti P., Bringhurst F.R., Milner L.A., Kronenberg H.M., Scadden D.T., Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche, Nature ,2003.

9. Carraro Gianni, Garcia H Orquidea., Perin Laura, Roger De Filippo and David Warburton Amniotic Fluid Stem Cells, Embryonic Stem Cells – Differentiation and Pluripotent Alternatives ,25.

10. Castro H., Gay R.E., Resnick G., Kapoor N., Meyers P., Chiarieri D., McKenzie S., Broxmeyer H.E., Moore M.A., Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny, Blood, 1980.

11. Cirigliano V, Voglino G, Canadas MP, Marongiu A, Ejarque M, Ordonez E, Plaja A, Massobrio M, Todros T, Fuster C, Campogrande M, Egozcue J, Adinolfi M. Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Mol Hum Reprod. 2004.

12. Codaccioni X, Vaast P, Therby D, Baalbaky I, Puech F. Physiologie du liquide amniotique. Encyclopedie Medico-Chirurgicale : Gynecologie-Obstetrique. 1995.

13. Cross Nick , White Helen, National Genetics Reference Laboratory (Wessex) , November 2004.

14. De Coppi Paolo, Bartsch Georg et al., Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy,Nature byotechnology, 2007.

15. Ding C, Chiu RW, Lau TK, Leung TN, Chan LC, Chan AY, Charoenkwan P, Ng IS,Law HY, Ma ES, Xu X, Wanapirak C, Sanguansermsri T, Liao C, Ai MA, Chui DH,Cantor CR, Lo YM. MS analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleicacids: Application to noninvasive prenatal diagnosis. Proc Natl Acad Sci U S A.2004;

16. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S., The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea- pig bone marrow and spleen cells, Cell Tissue Kinet., 1970.

17. Friedenstein A.J., Osteogenetic activity of transplanted transitional epithe lium, Acta Anat. (Basel), 1961.

18. Gerdes T, Kirchhoff M, Lind AM, Larsen GV, Schwartz M , Lundsteen C. Computer –assisted prenatal aneuploidy screening for chromosome 13,18,21,X and Y based on multiplex ligation–dependent probe amplification (MLPA). Eur J Hum Genet . 2004.

19. Giemsa G. «Eine Vereinfachung und Vervollkommnung meiner Methylenazur-Methylenblau-Eosin-Färbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nochtschen Chromatinfärbung.». Centralbl f Bakt, 1904.

20. Gilbert WM, Brace RA. The missing link in amniotic fluid volume regulation: Intramembranous absorption. Obstet-Gynecol 1989;

21. Hartmann K., Raabe O., Wenisch S., Arnold S.,Amniotic fluid derived stem cells give rise to neuron-like cells without a further differentiation potential into retina-like cells, Am J Stem Cells 2013;

22. .Hoehn H., Salk D.: Morphological and biochemical heterogeneity of amniotic fluid cells in culture. Methods in Cell Biology, 1982;

23. Hoffmann-Cucuz Pascale, Cours: Membranes foetales ,cordon ombilical et liquide amniotique, Universite Joseph Fourier de Grenoble, 2010/2011.

24. Janowska-Wieczorek A., Majka M., Ratajczak J., Ratajczak M.Z., Autocrine/paracrine mechanisms in human hematopoiesis, Stem Cells, 2001.

25. Jiang P, Rushing SN, Kong CW, Fu J, Lieu DK, Chan CW, Deng W, Li RA, Electrophysiological properties of human induced pluripotent stem cells. Am J Physiol Cell Physiol, 2010.

26. Kang NH, Hwang KA, Kim SU, Kim YB, Hyun SH, Jeung EB, Choi KC, Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther, 2012.

27. Kavianni A, Perry T., Dzakovik A. et al.: The amniotic fluid as a source of cells for fetal tissue engineering, J Ped Surgery, 2001;

28. Koller M.R., Manchel I., Palsson B.O., Importance of parenchymal:stromal cell ratio for the ex vivo reconstitution of human hematopoiesis, Stem Cells, 15, 1997.

29. Lipinski MJ, Biondi-Zoccai GG, Abbate A, Khianey R, Sheiban I, Bartunek J, Vanderheyden M, Kim HS, Kang HJ, Strauer BE, Vetrovec GW, Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. J Am Coll Cardiol, 2007.

30. Mann K, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Ogilvie CM. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy. Eur J Hum Genet. 2004;

31. Walker A, Harting T, Shah K, Day C, El Khoury R, Savitz I, Baumgartner J, Cox S, Progenitor cell therapy for the treatment of central nervous system injury: a review of the state of current clinical trials. Stem Cells Int, 2010.